( PDF ) Estudo da imunomodulação induzida por PAS-1 (proteína imunossupressora de Ascaris suum) na inflamação alérgica pulmonar

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Claudia Andréa Alves de Araújo

ESTUDOS DA IMUNOMODULAÇÃO INDUZIDA POR PAS-1

(PROTEÍNA IMUNOSSUPRESSORA DE Ascaris suum) NA

INFLAMAÇÃO ALÉRGICA PULMONAR

Tese apresentada ao Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade de

São Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências (Imunologia)

Orientadora: Dra. Maria Fernanda de Macedo Soares

São Paulo

2007

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Claudia Andréa Alves de Araújo

ESTUDOS DA IMUNOMODULAÇÃO INDUZIDA POR PAS-1

(PROTEÍNA IMUNOSSUPRESSORA DE Ascaris suum) NA

INFLAMAÇÃO ALÉRGICA PULMONAR

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade de

São Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências (Imunologia)

Orientadora: Dra. Maria Fernanda de Macedo Soares

São Paulo

2007

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AGRADECIMENTOS

À Dra. Maria Fernanda de Macedo Soares, pela sua orientação, incentivo e confiança e

por ter acreditado na realização deste projeto.

À Dra. Adenir Perini, do Laboratório de Terapêutica Experimetal I (LIM-20), da

Faculdade de Medicina da USP, pelo auxílio nos experimentos de hiperreatividade das

vias aéreas.

Aos membros da banca de Qualificação (Dra. Maria Notomi Sato, Dra. Hiro Goto e Dra.

Dunia Del Carmen Rodríguez Soto) pelas críticas e sugestões a este trabalho.

À Cristina Satomi Enobe pelo companheirismo e amizade durante a realização deste

trabalho.

À todos os funcionários do Laboratório de Imunopatologia do Instituto Butantan pelo

apoio técnico.

E, finalmente, à todos que participaram direta ou indiretamente, física ou

espiritualmente, para a realização deste trabalho.

SUMÁRIO

RESUMO

1 INTRODUÇAO 15

2 OBJETIVOS 32

3 MATERIAL E MÉTODOS 34

3.1 Animais 35

3.2 Obtenção do extrato de Ascaris suum 36

3.3 Obtenção da proteína PAS-1 36

3.4 Remoção de endotoxinas 37

3.5 Protocolos de imunização e transferência adotiva 38

3.6 Purificação de linfócitos B e linfócitos T (CD8

CD4

, CD4

CD25

CD4

CD25

) 39

3.7 Parâmetros de avaliação da asma alérgica experimental 41

3.7.1 Determinação dos níveis séricos de anticorpos 41

3.7.2 Reação de anafilaxia passiva (PCA) 42

3.7.3 Obtenção do lavado broncoalveolar e do homogenato pulmonar 43

3.7.4 Contagem de células 44

3.7.5 Determinação da atividade de EPO 44

3.7.6 Determinação dos níveis de citocinas e quimiocina 44

3.8 Medida de parâmetros de mecânica de ventilação pulmonar 46

3.9 Análise estatística 36

4 RESULTADOS 48

4.1 Efeito da administração de PAS-1 na asma murina experimental induzida por

OVA em camundongos C57Bl/6 selvagens 49

4.1.1 Avaliação da resposta imune humoral 49

4.1.Análise da celularidade do lavado broncoalveolar 52

4.1.3 Determinação da atividade de EPO 54

4.1.4 Determinação do perfil de citocinas e quimiocina 56

4.1.5 Reatividade das vias aéreas 58

4.2 Papel de IL-12, IFN-γ e IL-10 na ação imunomodulatória de PAS-1 61

4.2.1 Avaliação da resposta imune humoral 61

4.2.2 Quantificação da celularidade do lavado broncoalveolar 64

4.2.3 Determinação da atividade de EPO 66

4.2.4 Determinação do perfil de citocinas e quimiocina 68

4.2.5 Reatividade das vias aéreas 72

4.3 Papel de células CD19

, B220

, CD3

, CD4

, CD8

, CD4

CD25

, CD4

CD25

(células T regulatórias) na ação modulatória de PAS-1 75

4.3.1 Avaliação da resposta imune humoral 75

4.3.2 Quantificação da celularidade do lavado broncoalveolar 78

4.3.3 Determinação da atividade de EPO 80

4.3.4 Determinação do perfil de citocinas e quimiocina 86

4.3.5 Reatividade das vias aéreas 86

DISCUSSÃO 89

6. CONCLUSÕES 109

REFERÊNCIAS 111

ABREVIATURAS

AID activation-induced cytidine deaminase

AP-1 activator protein-1

APAS-3 proteína alergênica de Ascaris suum

APC célula apresentadora de antígeno

Bcl-2 B-cell CLL/lymphoma 2

CD cluster of diferentiation

ELISA enzyme linked immunosorbent assay - ensaio imunoenzimático

EPO peroxidase endógena de eosinófilos

HBSS Hanks balanced salt solution

HP homogenato pulmonar

Ig imunoglobulina

IL interleucina

LBA lavado broncoalveolar

MAIP-1 anticorpo monoclonal contra a proteína imunossupressora de

Ascaris suum (PAS-1)

MHC major histocompatibility complex

mRNA RNA mensageiro

NFAT nuclear factor of activated T cells

OPD ortofenileno diamina

OVA ovalbumina

PAS-1 proteína imunosupressora de Ascaris suum, reconhecida por MAIP-

PCA anafilaxia cutânea passiva

PBS phosphate buffered saline - salina tamponada com fosfato

RAG recombination activacting genes

SFB soro fetal bovino

STAT signal transducers and activactors of transcription

Th1 célula T helper 1

Th2 célula T helper 2

Tc1 célula T citotóxica tipo 1

Tc2 célula T citotóxica tipo 2

TMB 3,3´,5,5´tetrametilbenzidina

RESUMO

A asma é uma doença inflamatória crônica pulmonar complexa, caracterizada por

hipereatividade e inflamação das vias aéreas, com presença de infiltrado de eosinófilos,

síntese de elevados níveis de IgE e produção aumentada de IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. As

doenças alérgicas, como a asma, podem ser moduladas por infecções helmínticas. Isso

deve estar associado à presença de fatores produzidos pelos parasitas que devem

atuar, suprimindo a resposta inflamatória associada às atopias. Resultados de nosso

laboratório têm mostrado que o fracionamento do extrato de Ascaris suum contém uma

proteína de 200 KDa, denominada PAS-1, que possui ação modulatória na inflamação

alérgica pulmonar por diminuir a inflamação eosinofílica, a produção de citocinas Th2 e

aumentar a síntese de IFN-γ e IL-10, indicando que PAS-1 deve agir por mecanismos

dependentes destas citocinas. Contudo, ainda não foram elucidados estes

mecanismos. Neste trabalho, investigamos o papel das citocinas IFN-γ e IL-10

utilizando camundongos deficientes das mesmas. Além disso, investigamos os tipos

celulares envolvidos com esta modulação. Para tanto, camundongos deficientes de IL-

12, IFN-γ ou IL-10 foram imunizados e desafiados com OVA ou PAS-1 ou OVA + PAS-

1. Também, camundongos C57BL/6 foram imunizados e desafiados com OVA e,

depois, receberam transferência adotiva de linfócitos B CD19

, linfócitos B B220

linfócitos T CD3

, T CD4

, T CD8

, T CD4

CD25

e T CD4

CD25

(células T

reguladoras). Nossos resultados demonstraram que os camundongos IFN-γ

-/-

ou IL-10

-/-

que foram imunizados e desafiados com OVA + PAS-1 apresentaram produção de IgE

total, inflamação eosinofílica e produção de IL-4, IL-5, IL-13, eotaxina semelhantes ao

obtidos em camundongos deficientes imunizados e desafiados com OVA, mas diferente

daqueles obtidos em camundongos IL-12

-/-

. Estes dados mostram que o efeito

modulatório de PAS-1 ocorre devido a mecanismos dependentes de IFN-γ e IL-10, mas

independente de IL-12, pois nos animais IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

, não houve supressão do

quadro alérgico pulmonar induzido por OVA. Nos experimentos de transferência

adotiva, demonstramos que camundongos que receberam células T CD8+ produziram

níveis significativos de IFN-γ e animais que receberam células T CD4+CD25+

produziram elevados níveis de IL-10 e TGF-β. Então, sugerimos que o efeito

imunomodulatório de PAS-1 é mediado por células T CD8+ produtoras de IFN-γ e por T

CD4+CD25+ (células T regulatórias) secretoras de IL-10 e TGF-β.

Palavras-chave: imunomodulação, asma, Ascaris suum, linfócitos T , citocinas

ABSTRACT

Asthma is a chronic lung inflammatory disease, which is characterized by airway

inflammation and hiperesponsiveness, caused by infiltration of eosinophils, production of

high levels of IgE and cytokines (IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13). Allergic diseases, e.g.

asthma, can be modulated by helminthic infections. This must be associated with

secreted factors produced by these parasites that can act, suppressing the inflammatory

response related to allergy. We have demonstrated that a 200 kDa protein, called PAS-

1, can be isolated from Ascaris suum crude extract by affinity chromatography. This

protein has an immunomodulatory role in the lung allergic inflammation due to its ability

on the down-regulation of the eosinophilic inflammation, Th2 cytokine production, and

up-regulation of the IL-12, IFN-γ and IL-10 production, suggesting that PAS-1 exert its

immunomodulatory effect by cytokine-dependent mechanisms. However, they were not

elucidated yet. In this present work, we investigated the role of IL-12, IFN-γ and IL-10

using knock-out mice for these cytokine as experimental model. Moreover, we

investigated the cell types involved on this modulation. Then, IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

and IL-10

-/-

mice were immunized and challenged with OVA or PAS-1 or OVA + PAS-1. In addition,

C57Bl/6 wild type mice (recipient mice) were immunized and challenged with OVA and,

afterwards, they were adoptively transferred with PAS-1-primed B CD19+, B B220+, T

CD3+, T CD8+, T CD4+, T CD4+CD25-, T CD4+CD25+ lymphocytes. Our results

demonstrated that IFN-γ

-/-

and IL-10

-/-

mice, which were immunized and challenged with

OVA + PAS-1, had high levels of IgE, eosinophilic inflammation and IL-4, IL-5, IL-13 and

eotaxin production compared to the mice OVA-immunized and challenged, but these

results were different in comparison with IL-12

. These data showed that the modulatory

effect induced by PAS-1 is due to IFN-γ and IL-10-dependent mechanisms, but not IL-

12-dependent inasmuch as it was not observed suppression of the allergic inflammation

on IFN-γ

-/-

and IL-10

-/-

mice. In the adoptive transference experiments, we demonstrated

that mice adoptively transferred with CD8+ cells produced significant levels of IFN-γ and

those transferred with CD4+CD25+ cells produced high levels of IL-10 and TGF-β.

Based on these evidences, we suggest that the immunomodulatory effect induced by

PAS-1 is mediated by IFN-γ-producing CD8+ cells and IL-10- and TGF-β-producing

CD4+CD25+ cells.

Key words: immunomodulation, asthma, Ascaris suum, T lymphocytes, cytokines

1 INTRODUÇÃO

A asma é uma doença inflamatória crônica pulmonar caracterizada por

hipereatividade e inflamação das vias aéreas, com presença de infiltrado eosinofílico,

síntese de elevados níveis de IgE e produção aumentada de IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13

(Busse e Lemanske, 2001). É uma doença multifatorial, que envolve vários elementos e

múltiplas vias de desencadeamento, sendo todas elas influenciadas por fatores

genéticos e ambientais. Os fatores ambientais, tais como exposição a alérgenos e

infecções, influenciam indivíduos geneticamente predispostos. Além disso, vários genes

polimórficos regulam a asma, controlando a resposta inflamatória, a produção de IgE, e

de citocinas e quimiocinas (Cookson, 1999), além de controlar a reatividade e o

remodelamento das vias aéreas (van Eerdewegh et al., 2002; Fahy et al., 2000).

A hiperreatividade das vias aéreas é uma das características da asma que está

relacionada à obstrução do fluxo aéreo decorrente de vários estímulos e resulta do

estreitamento das vias aéreas. As células residentes (mastócitos, macrófagos

alveolares, células epiteliais e endoteliais), bem como células inflamatórias (neutrófilos,

eosinófilos, linfócitos Th2, mastócitos) que migram para o local (Kaminuma et al., 2001)

e secretam vários mediadores, tais como citocinas, histamina, leucotrienos (LTC4,

LTD4, LTE4), prostaglandina D2, PAF, que agem aumentando a permeabilidade

vascular e contraindo os músculos lisos dos brônquios (Orange, 1973).

A inflamação das vias aéreas contribui significativamente para muitos sintomas

desta doença, incluindo a obstrução do fluxo aéreo, a hipereatividade brônquica e o

remodelamento do tecido pulmonar. O processo inflamatório inclui denudação do

epitélio das vias aéreas, obstrução da mucosa dos brônquios segmentais e dos

bronquíolos, deposição de colágeno abaixo da membrana basal, edema da submucosa,

infiltração de células (neutrófilos e eosinófilos), hipertrofia/hiperplasia das células dos

músculos lisos (Lemanske e Brusse, 2003).

Recentes evidências têm demonstrado que alguns pacientes com asma

apresentam uma obstrução do fluxo de ar, decorrente, dentre outros fatores, do

remodelamento do tecido das vias aéreas (Vignola et al, 2000). O remodelamento das

vias aéreas na asma é resultante da interação de mediadores inflamatórios com as

células estromais ou da injúria tecidual. Vários eventos estão envolvidos no

remodelamento, como por exemplo, a hipertrofia dos músculos lisos das vias aéreas e

das glândulas de muco, das células globosas, a angiogênese (hiperplasia vascular) e a

deposição de colágeno.

Os eventos iniciais responsáveis pelo desenvolvimento das doenças alérgicas,

incluindo a asma, é a geração de células Th2 alérgeno-específicas (Romagnani, 2004;

Gavett et al., 1994; Brusselle et al., 1994). Estas células estão presentes em grande

número nas vias aéreas de asmáticos, sendo responsáveis pelo início e perpetuação da

inflamação pulmonar (Corrigan et al., 1988; Walker et al., 1991). Foi descrito por Huang

et al. (1995) que os níveis de mRNA para IL-4, IL-5 e IL-13 e suas respectivas proteínas

estão aumentados nas células do LBA e em biópsias de pacientes asmáticos,

mostrando a participação de células Th2 na inflamação alérgica pulmonar. Outras

evidências importantes do estabelecimento do fenótipo Th2 na asma foram fornecidas

por Nakamura et al. (1999) e Finotto et al. (2002). Uma delas é a elevada expressão do

fator de transcrição GATA-3, que está presente especificamente em células Th2

diferenciadas, em células T CD4

presentes nas vias aéreas de pacientes asmáticos

(Nakamura et al., 1999) e a outra evidência é a não detecção do fator de transcrição t-

bet, específico de células Th1 diferenciadas, em células Th2 (Finotto et al., 2002).

Em modelos animais, nos quais células Th2 não se desenvolvem, por exemplo,

em camundongos deficientes do receptor α de IL-4 ou de STAT-6, a inflamação alérgica

não é induzida (Wills-Karp, 1999), indicando a participação de células Th2 no

desenvolvimento da resposta inflamatória. Zhang et al. (1999) demonstraram que

camundongos transgênicos, expressando mutante negativo de GATA-3, apresentam

diminuição na produção de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), da eosinofilia, da produção

de muco e da síntese de IgE, indicando que o bloqueio da atividade de GATA-3 é

suficiente para bloquear a resposta Th2 in vivo. Por outro lado, camundongos

transgênicos expressando IL-13, IL-9 e IL-5 apresentaram hipereatividade e deposição

de colágeno nas vias aéreas, indicando que a exposição crônica às citocinas Th2

poderia também induzir o remodelamento das vias aéreas (Lee et al., 1997; Temann et

al., 1998; Zhu et al., 1999). Finotto et al. (2002) demonstraram que camundongos

deficientes de t-bet desenvolvem espontaneamente inflamação eosinofílica, metaplasia

das células produtoras de muco, deposição de colágeno, hipertrofia dos miofibroblastos

e reatividade das vias aéreas. Além disso, estes animais naïve produzem níveis

aumentados de IL-4, IL-5 e IL-13 no LBA e possuem um número aumentado de células

T CD4+ efetoras/memória nos pulmões, indicando que as células Th2 estão

cronicamente ativadas nas vias aéreas.

Outro fator que contribui para a manutenção do processo inflamatório em

indivíduos asmáticos é a perpetuação de linfócitos T CD4+. Células T CD4+ isoladas de

sangue periférico de pacientes asmáticos e estimuladas in vitro apresentaram uma

diminuição na capacidade de apoptose mediada por Fas (Jayaraman et al., 1999;

Spinozzi et al., 1998). A capacidade limitada de se submeter à apoptose pode ser um

marcador de ativação de células T, já que recentemente células T CD4

estimuladas

são resistentes à morte induzida por Fas e apresentam níveis aumentados de Bcl,

moléculas anti-apoptóticas (van Parijs et al., 1998).

Em biópsias das vias aéreas de pacientes asmáticos, linfócitos T produtores de

IL-4 apresentaram menor freqüência de apoptose que linfócitos secretores de IFN-γ

(Cormican et al., 2001; Akdis et al., 2003), possivelmente pela capacidade do receptor

de IFN-γ de fosforilar o fator de transcrição nuclear STAT-1, que por sua vez ativa

caspase-8 (Refaeli et al., 2002). A morte celular ativada por IFN-γ permite a geração e a

persistência de células Th2 de memória (Wu et al., 2001). Camundongos deficientes do

receptor de IFN-γ, imunizados e desafiados com ovalbumina, apresentam aumento na

eosinofilia e na produção de citocinas Th2, indicando que a ausência da sinalização

mediada por IFN-γ aumenta a resposta Th2 (Coyle et al., 1996). IL-4 também prolonga

a sobrevivência de células T ativadas devido à expressão de Bcl-2, via que independe

de caspase-8 (Vella et al., 1998). Camundongos deficientes do receptor de IFN-γ que

receberam células Th2 e foram expostos à inalação do alérgeno apresentaram aumento

de cinco vezes no número de eosinófilos em comparação com os camundongos

selvagens, que receberam as mesmas células Th2 (Cohn et al., 2001). Estes dados

também explicam a presença de inflamação crônica em camundongos deficientes de t-

bet, que apresentam aumento de células T CD4+ efetoras/memória nas vias aéreas e

no LBA com elevados níveis de IL-4 e baixos níveis de IFN-γ (Finotto et al., 2002).

A produção de IgE antígeno-específica é outro evento que influencia diretamente

a inflamação alérgica. Geha et al. (2003) têm revisado os mecanismos de regulação da

síntese de IgE. Nas reações de hipersensibilidade imediata, a ligação cruzada de

moléculas de IgE com alérgenos em seus receptores de alta afinidade (FcεRI) na

superfície de mastócitos e basófilos induz a liberação de mediadores vasoativos,

transcrição de citocinas e síntese de prostaglandinas e leucotrienos. Nas vias aéreas,

estes mediadores rapidamente promovem o edema da mucosa bronquial, produção de

muco e constrição dos músculos lisos e recrutam um infiltrado inflamatório. Em

pacientes asmáticos submetidos à inalação de alérgenos, estes eventos moleculares e

celulares resultam na obstrução aguda das vias aéreas (Howarth et al., 1987). Em

modelos animais, a transferência passiva de anticorpos IgE podem resultar em

respostas pulmonares de fase imediata e tardia aos desafios alergênicos (Schamapain

et al., 1982).

A produção de IgE por células B é desencadeada por vários sinais moleculares e

celulares. As citocinas IL-4 e IL-13 são suficientes para promover a transcrição da

cadeia ε em cultura de células B humanas (Vercelli et al., 1989; Defrance et al., 1994).

Outra interação importante para a síntese de IgE é a ligação de CD40 com CD40L.

Pacientes com a síndrome da hiper-IgM ligada ao cromossomo X são deficientes de

CD40L, como conseqüência, as células B destes pacientes não produzem IgG, IgA ou

IgE (Allen et al., 1993). Além disso, camundongos deficientes dos genes de CD40L (Xu

et al., 1994) ou CD40 (Kawabe et al., 1994) apresentam o mesmo defeito na produção

de anticorpos. Molecularmente, a síntese de IgE também requer a expressão da enzima

AID (activation-induced cytidine deaminase), que está expressa em células B

esplênicas e nos centros germinativos dos linfonodos, sendo que camundongos

deficientes desta enzima produzem elevada quantidade de IgM e baixa ou nenhuma

produção de IgA (Muramatsu et al., 1999 e 2000).

Outro evento importante na patogênese da asma é a eosinofilia das vias aéreas.

Vários estudos correlacionam o aumento do número de eosinófilos com a reatividade

das vias aéreas e com a severidade da doença (Walker et al., 1991; Bousquet et al.,

1990, Foster et al., 1996). A eosinofilia das vias aéreas depende de IL-5 e da

sinalização mediada por STAT-6 (Rothenberg, 1999; Nakajima et al., 1992). Em

camundongos deficientes de IL-5, há uma diminuição significativa dos eosinófilos no

sangue ou no LBA, em relação aos animais selvagens (Mattes et al., 2002). Por outro

lado, em camundongos deficientes de IL-4 e IL-13, também se observa poucos

eosinófilos nas vias aéreas ou LBA em resposta a ativação de células Th2, apesar da

capacidade destes camundongos de produzirem e liberarem eosinófilos da medula

óssea (Mattes et al., 2001). Uma vez ativados, os eosinófilos secretam vários fatores,

entre eles a proteína básica principal, proteína catiônica, peroxidade (EPO), citocinas

(TNF-α, GM-CSF, IL-4, IL-13 e IL-5) e quimiocinas, como RANTES e eotaxina

(Rothenberg, 2001). Estes fatores são danosos para as células epiteliais, estimulam a

secreção de muco e fibrose e induzem broncoespasmos e hiperreatividade das vias

aéreas. As citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 promovem o recrutamento de eosinófilos para as

vias aéreas, e por outro lado, IL-5, GM-CSF e IL-13 aumentam a sobrevivência dos

eosinófilos por aumentar as proteínas anti-apoptóticas bcl-2 e bcl-xL (Dewson et al.,

1999; Dibbert et al., 1998). Deste modo, os eosinófilos são importantes na amplificação

das respostas imunes locais, além de promover os danos teciduais e a fibrose.

Vários autores têm investigado estratégias para modular a resposta inflamatória

na asma. Tem sido amplamente relatado que parasitas ou seus produtos secretados

podem modular vários dos mecanismos que são desencadeados na resposta

inflamatória pulmonar. Além disso, têm se associado diretamente o aumento das

infecções parasitárias adquiridas pelo hospedeiro com a diminuição dos casos de

asma. Mao et al. (2000) descreveram que, na população Chinesa, a prevalência de

infecções causadas por Ascaris lumbricoides diminuiu, enquanto que a incidência de

atopia aumentou. Além disso, foi descrito que infecções crônicas por helmintos

suprimem a resposta alérgica (Lynch et al, 1983; Lynch et al, 1987). Corroborando com

estes relatos, estudos epidemiológicos, conduzidos por Cooper (2004), também

investigaram a relação inversa entre helmintos e alergias. Outras evidências têm sido

fornecidas por estudos realizados por Lynch et al. (1993) e van den Bigelaar et al.

(2004), que mostraram um aumento na prevalência ou no risco de atopia após o

tratamento de parasitoses em crianças infectadas.

Baseado, nesta correlação inversa, parece que o sistema imune tem evoluído na

presença de infecções helmínticas e devem funcionar como um mecanismo protetor do

hospedeiro contra as doenças alérgicas. Isto pode ser exemplificado pelo fato da

presença de variantes genéticas de STAT-6, um fator de transdução de sinal importante

para a sinalização mediada por IL-4, predizer o aumento da resistência à infecções por

Ascaris em crianças chinesas que viviam em área endêmica (Peisong et al., 2004),

mostrando que o aumento da resistência à infecções parasitárias deve estar associado

com uma das origens da asma. A relativa ausência de infecções parasitárias, como as

helmintíases são capazes de induzir fortes sinais imunomodulatórios que contribuem

para o desenvolvimento da desrregulação na imunidade à antígenos exógenos, tais

como aeroalérgenos que podem causar doenças inflamatórias.

Outras evidências da imunomodulação exercida por helmintos podem ser

observadas em ocasiões em que o sistema imune é estimulado. Por exemplo, pacientes

com esquistossomíase e filaríase apresentam uma reposta diminuída à antígenos do

próprio parasita infectante (Grogan et al., 1998; Yazdanbakhsh et al., 1993). As

infecções helmínticas também estão associadas com respostas atenuadas à antígenos

heterológos (Greene et al., 1983), à vacinações (Cooper et al, 1998; Sabin et al, 1996)

ou à transplantes alogenêicos (Liwski et al., 2000). As helmintíases também podem

reduzir doenças inflamatórias causadas por Helicobacter pylori (Fox et al., 2000) e

Plasmodium falciparum (Nacher et al., 2001). Além disso, crianças infectadas com

Schistosoma apresentam baixos níveis de reatividade cutânea à alérgenos, indicando

que o sistema imune deve ser influenciado pela presença de parasitas (Van den

Biggelaar et al., 2004).

Nosso laboratório tem contribuído, desde a década de 80, no estudo da

modulação da resposta imune por diferentes componentes do extrato bruto de vermes

adultos de A. suum (Soares et al., 1985, 1986, 1987, 1988, 1989, 1991, 1992). Nossos

estudos têm demonstrado que o extrato bruto obtido de vermes adultos suprime a

produção de anticorpos heterólogos em camundongos. Macedo e Mota (1980)

demonstraram que camundongos A/Sn imunizados com ovalbumina e extrato de

Ascaris suum apresentavam uma intensa supressão na produção de anticorpos anti-

OVA. Esta atividade inibitória também foi verificada por Soares et al. (1987), que

observaram que o extrato bruto de A. suum, além de inibir a síntese de anticorpos da

classe IgE, também suprimia a produção de IgG1 e IgG2a. Ferreira et al. (1995)

demonstraram que camundongos DBA/2 imunizados na base da cauda com

ovalbumina e extrato de A. suum e desafiados no coxim plantar com ovalbumina

apresentavam supressão da reação imediata (pico de 3 horas após o desafio) e da

reação tardia (pico de 24 horas) de hipersensibilidade, além de apresentar inibição

significativa da produção de IgE, IgG1 e IgG2a anti-OVA.

O isolamento de frações protéicas do extrato de A. suum foi realizado por

cromatografia de gel filtração por Soares et al. (1992). Neste trabalho, foi constatado

que os componentes eluídos no primeiro pico (PI), assim como o extrato bruto (ASC),

suprimiam intensamente a produção de anticorpos IgE anti-OVA em camundongos

imunizados com OVA + PI ou OVA + ASC. Entretanto, quando os animais foram

imunizados com OVA + PIII (componentes eluídos no terceiro pico) apresentaram níveis

de IgE anti-OVA semelhantes ao grupo de animais imunizados somente com OVA.

Além disso, PIII induziu a produção de anticorpos IgE anti-ASC. Estes resultados

demonstraram que o efeito supressivo do extrato é devido a componentes do PI,

correspondentes a proteínas de alto peso molecular, enquanto a estimulação da

produção de anticorpos IgE é devido aos componentes do PIII, correspondentes a

proteínas de baixo peso molecular.

As frações PI e PIII obtidas do extrato bruto do verme adulto foram utilizadas em

nosso laboratório para obtenção de anticorpos monoclonais contra componentes

específicos de cada fração. Assim, foram obtidos os anticorpos MAIP-1 e MAC-3, que

reconhecem respectivamente, a proteína imunosupressora PAS-1 (200 kDa) (Oshiro et

al., 2004) e a proteína alergênica APAS-3 (29kDa) (Pires et al., 2001). Os anticorpos

monoclonais MAIP-1 e MAC-3, assim como as proteínas por eles reconhecidas (PAS-1

e APAS-3) são ferramentas importantes nos estudos da imunomodulação induzida por

Ascaris suum.

Foi demonstrado por Oshiro et al. (2005) que PAS-1 suprime a migração

leucocitária induzida por LPS em bolsas de ar na parte dorsal de camundongos; além

disso, inibe a secreção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β, IL-6) no exsudato

de bolsa de ar estimuladas com LPS e em sobrenadante de cultura de macrófagos

peritoneais, mas estimula a secreção de IL-10 e TGF-β. Estes dados mostram que

PAS-1 apresenta uma potente atividade anti-inflamatória, provavelmente devido à

secreção de IL-10 e TGF-β que inibem a secreção de citocinas pró-inflamatórias.

Além disso, Oshiro et al. (2006) também demonstraram que PAS-1 exerce seus

efeitos modulatórios na resposta imune humoral e celular induzida por OVA. Neste

trabalho, esta proteína inibiu a produção de anticorpos (IgM, IgG1, IgG2b, IgE e IgG1

anafilático) contra antígenos T-dependentes, mas não T-independentes, de maneira

dose-dependente. Além disso, inibiu a reação de hipersensibilidade tipo IV OVA-

específica em patas de camundongos injetadas com carragenana. Estes dados

mostram que PAS-1 possui uma potente atividade supressora tanto nas respostas Th1

e como nas respostas Th2.

Recentemente, Itami et al. (2005) demonstraram que a presença da proteína

imunossupressora PAS-1 reverte o quadro alérgico da asma alérgica induzida por

APAS-3 (proteína alergênica de A. suum), diminuindo a eosinofilia pulmonar, a

produção de anticorpos anafiláticos e de citocinas Th2 (IL-4 e IL-5) e aumentando a

produção de IFN-γ e IL-10. Estes resultados indicam a capacidade de helmintos em

produzir e secretar diferentes fatores, com atividade modulatória sobre o sistema imune

do hospedeiro.

Além dos resultados provenientes de nossas investigações, outros autores têm

demonstrado que os helmintos secretam quantidades consideráveis de proteínas e

glicoproteínas, que são capazes de modular a resposta imune (Falcone et al., 2004;

Maizels et al., 2004). Estas moléculas interferem com estágios cruciais dos parasitas no

sistema imune do hospedeiro, tais como o bloqueio das selectinas endoteliais por

lectinas e glicanas do parasita, impedindo o extravasamento celular; liberação de

proteases capazes de degradar eotaxina; inibição de proteases do hospedeiro por

serpinas dos parasitas; inibição dos intermediários reativos do oxigênio e nitrogênio por

proteínas anti-oxidantes dos helmintos, como glutationa-S-transferase.

Várias moléculas de parasitas podem interferir com o processamento do

antígeno. Antígenos de helmintos são apresentados por moléculas de MHC de classe

II, com envolvimento de algumas proteases intracelulares. O nematódeo Brugia malayi

secreta um inibidor de cisteína proteinase (cistatina, Bm-CPI2), que interfere com duas

classes de proteases da via de processamento de MHC de classe II: catepsinas B, L e

S e asparagina endopeptidase. Inibidores semelhantes têm sido descritos em produtos

secretados por Onchocerca volvulus (Schonemeyer et al., 2001) e Nippostrongylus

brasiliensis. (Dainichi et al., 2001). As cistatinas de nematodes são homólogas à

cistatina C de mamíferos, que são altamente expressas por células dendríticas

imaturas, estando diminuídas durante o processo de maturação de células dendríticas

para permitir o transporte de moléculas de classe II maduras para a superfície da célula

(Pierre e Mellaman, 1998). As cistatinas de parasitas também mantêm as células

dendríticas em estado imaturo, comprometendo a apresentação de antígenos por estas

células (Schonemeyer et al., 2001), além de modular a proliferação de células T e

estimular a produção de IL-10 (Schonemeyer et al., 2001; Hartmann et al., 1997).

Outros produtos de helmintos afetam a atividade das células apresentadoras de

antígeno. ES62, um produto secretado de filárias, tem efeito na desensibilização de

macrófagos peritoneais à produção de IL-12 induzida por LPS, inibindo a resposta Th1

(Goodridge et al., 2001). Além disso, foram descritas duas glicanas derivadas de ovos

de Schistosoma, lacto-N-fucopentose III e lacto-N-neotetraose, que induzem

macrófagos a produzirem IL-10, suprimindo a proliferação de célula T (Attochina et al.,

2001, Terrazas et al., 2001). Silva et al. (2006) demonstraram que componentes de alto

peso molecular de A. suum inibem a expressão de moléculas coestimulatórias (CD80,

CD86, CD40) e MHC classe II em células dendríticas, mostrando que estes

componentes modulam negativamente a capacidade de apresentação de antígeno por

células dendríticas.

Deste modo, os helmintos têm a capacidade de modular resposta imune do

hospedeiro por vários mecanismos, entre eles, a ativação dos processos regulatórios,

que envolve células T e células acessórias reguladoras (células dendríticas e

macrófagos), responsáveis pela manutenção do estado de homeostasia do sistema

imune.

A existência de uma subpopulação de células T especializadas na supressão da

resposta imune foi originalmente postulada por Gershon (1975). Contudo, os

mecanismos celulares e moleculares responsáveis por este efeito supressor nunca

foram claramente caracterizados. Cerca de 20 anos após, as células T supressoras

ressurgiram como células T reguladoras, com a observação feita por Sakaguchi et al.

(1995) que a transferência adotiva de células T depletadas de CD25+ induzia

autoimunidade em vários órgãos do animal recipiente.

Muitos estudos da regulação das alergias indicam que células CD4+ têm uma

importante função e vários fenótipos celulares têm sido descritos: (1) Células T

CD4+CD25+ naturais e induzíveis, cujos efeitos são mediados por mecanismos

dependentes do contato célula-célula, tais como via inibição de IL-2Rα (Akdis et al.,

2005; Chatila, 2005), (2) células Tr1, que são induzidas na presença de IL-10 e estão

associadas com a supressão da imunidade por meio de mecanismos dependentes de

citocinas (IL-10 e TGF-β) (Harwrylowicz, 2005; Harwrylowicz e O´Garra, 2005) e (3)

células Th3, que secretam TGF-β e são induzidas após inoculação mucosa de antígeno

e medeia a tolerância oral (Moncayo e Cooper, 2006; Faria e Weiner, 2005).

As células T reguladoras têm um papel importante na supressão das alergias

mediada por helmintos. Estudos de populações infectadas com esquistossomíase têm

mostrado uma relação do aumento da produção de IL-10 na proteção contra atopia

(Van den Bigelaar et al., 2000) e asma (Araújo et al., 2004). A fonte de IL-10 não está

clara e deve ser derivada de macrófagos ou células T reguladoras. Populações de

células B também são importantes, pois IL-10 produzida por células B pode proteger

contra a anafilaxia sistêmica em um modelo de esquistossomíase murino (Mangan et

al., 2004).

Células Tr1 são importantes na regulação das respostas antiparasitárias. As

primeiras observações de clones Tr1 induzíveis foram feitas durante infecções usando

camundongos infectados com Bordetella pertussis (McGuirk et al., 2002) e humanos

infectados com o vírus da hepatite C (MacDonald et al., 2001) ou O. volvulvus

(Satoguina et al., 2002; Doetze et al., 2000) e devem tem efeitos semelhantes no

controle da imunidade por mecanismos dependentes de IL-10. Os estudos envolvendo

B. pertussis mostraram evidências diretas da supressão de células Th1 específicas para

antígenos bacterianos e os estudos em humanos mostraram evidências indiretas da

função de Tr1 pela produção aumentada de IFN-γ na presença de anticorpos anti-IL-10.

Na malária, a infecção é persistente e está associada com resposta imune

supressora. A depleção de células T CD4

CD25

protege camundongos contra a

infecção letal com Plasmodium yoelli (Hisaeda et al., 2004) e reduz a carga parasitária

em camundongos infectados com P. berghei (Long et al., 2003). Além disso, o

tratamento com anti-TGF-β e anti-IL-10 de animais infectados com P. yoelli aumenta a

sobrevivência (Omer et al., 2003). Da mesma forma, a infecção de camundongos

deficientes de IL-10 com Leishmania major resulta em um clearance mais rápido da

infecção (Noben-Trath et al., 2003). A produção de IL-10 por células regulatórias tem

uma função importante na persistência da infecção de L. major nestes camundongos

(Sacks et al., 2002 e Noben-Trauth, 2002). Além disso, células T reguladoras

CD4

CD25

se acumulam rapidamente em sítios na derme. Estas células suprimem a

capacidade de células T efetoras de eliminar os parasitas do hospedeiro.

Outras células envolvidas com mecanismos reguladores são células acessórias

reguladoras, como os macrófagos e as células dendríticas. Células supressivas

aderentes foram identificadas em humanos (Piessens et al., 1980) e em animais

(Lammie e Katz, 1983) infectados com B. malayi. O mecanismo que explica o efeito

supressor destas células aderentes é a produção de IL-10 por macrófagos (Osborne e

Devaney, 1999; Flores-Villanueva et al., 1994). Um importante avanço foi a descoberta

de um tipo de macrófago que é recrutado durante a infecção por nematóides e age

como um mecanismo independente de IL-10. Estas células foram primeiramente

encontradas no peritônio de camundongos infectados com B. malayi; mas também

ocorrem em animais infectados com outros nematóides ou seus produtos (MacDonald

et al., 1998). Estes macrófagos são maiores, apresentam o citoplasma mais

vacuolizados e têm perfil de expressão gênica diferente de outros macrófagos (Loke et

al., 2002). Além disso, eles possuem aumento da expressão de YMI, que é atua como

um fator quimiotático de eosinófilos, explicando a razão do infiltrado eosinofílico quando

os macrófagos são recrutados (Nair et al., 2003); são citostáticos, impedindo a

proliferação de células não-linfóides e de linfócitos T por mecanismos dependentes de

contato celular, mas independentes de óxido nítrico, prostaglandina e citocinas como IL-

10 e TGF-β (Loke et al., 2000); e induzem a diferenciação de células naïve de

camundongos em células Th2 (Gordon, 2003).

Outro tipo celular que possui efeitos supressivos é as células dendríticas. As

células dendríticas encontram com o parasita e elaboram uma resposta específica ou

libera sinais para polarizar a resposta de célula T (Reis e Sousa, 2001). Células

dendríticas derivadas da medula óssea e estimuladas por helmintos mostram uma

diminuição da expressão de CD80, CD86 e MHC de classe II em comparação àquelas

induzidas por produtos bacterianos (MacDonald et al., 2001). As células dendríticas,

sob certas condições, se diferenciam em fortes indutores de células T reguladoras

(McGuirk et al., 2002). Por exemplo, se frações lipídicas de S. mansoni estiverem

presentes durante a maturação de células dendríticas humanas, estas induzem

atividade reguladora, tais como estimulação de populações de células T para secreção

de IL-10 (Van der Kleij et al., 2002).

Baseado no exposto, os helmintos persistem no hospedeiro por mecanismos

imunomodulatórios, estimulando a produção de citocinas anti-inflamatórias e ativando

células T reguladoras naturais ou induzidas, diretamente ou pela ativação de células

apresentadoras de antígenos. Neste sentido, torna-se importante o esclarecimento dos

mecanismos de imunomodulação induzida por helmintos, visando não apenas a

intervenção terapêutica mais assertiva no controle das infecções helmínticas, mas

também para melhor compreensão do sistema de controle das respostas imunes.

Assim, neste trabalho, nos propomos a estudar os mecanismos responsáveis pela

acentuada imunossupressão da resposta imune induzida por PAS-1 (proteína de

Ascaris suum) na inflamação alérgica pulmonar em modelo murino.

2 OBJETIVOS

Baseado na evidência que PAS-1 inibe a formação do quadro alérgico pulmonar,

investigamos alguns mecanismos efetores, pelos quais PAS-1 desempenha sua ação

imunomodulatória na inflamação pulmonar induzida por ovalbumina. Assim, o principal

objetivo deste trabalho é investigar os mecanismos envolvidos na imunomodulação

induzida por PAS-1 na inflamação alérgica pulmonar, levando-se em consideração:

1) o perfil de resposta imune OVA e PAS-1-específica;

2) o efeito da imunização simultânea com PAS-1 sobre a resposta inflamatória

pulmonar induzida por OVA (anticorpos, migração leucocitária, secreção de

citocinas e quimiocina);

3) o papel das citocinas IL-12, IFN-γ e IL-10 estimuladas por PAS-1 na atividade

imunossupressora, utilizando camundongos deficientes das mesmas;

4) o papel de linfócitos CD19

, B220

, CD3

, CD8

, CD4

CD25

CD4

CD25

(células T reguladoras) purificados com partículas magnéticas a

partir de células linfóides de animais imunizados com PAS-1.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Para os protocolos de imunização, foram utilizados camundongos C57BL/6

selvagens e camundongos deficientes de IL-12, IFN-γ e IL-10, machos, 6 a 10 semanas

de idade, provenientes do Biotério de Camundongos Isogênicos do Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo.

Nos protocolos de reação de anafilaxia cutânea passiva (PCA), foram utilizados

ratos Wistar, machos, pesando de 250 a 300g, provenientes do Biotério Central da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, para avaliar a produção de IgE

anti-OVA, e camundongos BALB/c, machos, pesando de 20 a 22g, provenientes do

Biotério Central do Instituto Butantan, para avaliar IgG1 anafilática anti-OVA.

Todos os animais em experimentação foram mantidos no biotério do Laboratório

de Imunopatologia do Instituto Butantan submetidos a ciclos claro/escuro de 12 horas,

tendo sido fornecida água e ração ad libitum.

Os protocolos experimentais realizados neste trabalho estão de acordo com os

Princípios Éticos de Experimentação Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA), e foram aprovados pela Comissão de Ética em

Experimentação Animal (CEEA) do Instituto de Ciências Biomédicas (protocolo n° 117)

e pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan (CEUAIB) (protocolo

n° 203/05).

3.2 Obtenção do extrato de Ascaris suum

O extrato de Ascaris suum foi preparado de acordo com protocolo modificado de

Williams & Soulsby (1970). Vermes adultos de A. suum foram obtidos de intestinos de

porcos recentemente abatidos. Os vermes foram lavados em solução salina (NaCl

0,15M), triturados e homogenizados em tampão PBS pH 7,2. O material foi centrifugado

por 60 minutos a 10000 rpm e o precipitado foi ressuspendido em tampão PBS e

mantido sob agitação constante por 18 horas a 4°C. O extrato bruto de A. suum foi

centrifugado por 90 minutos a 10000 rpm. O sobrenadante obtido foi dialisado contra

água destilada, aliquotado e liofilisado.

3.3 Obtenção da proteína PAS-1

A partir do extrato bruto de A. suum, a proteína PAS-1 foi purificada por

cromatografia de afinidade, utilizando Sepharose 4B acoplada ao anticorpo MAIP-1

(IgM anti-PAS-1) (Oshiro et al., 2004). A proteína PAS-1 foi eluída com tampão glicina

0,2M/NaCl 0,15M e PBS/azida 0,1%. Os picos protéicos eluídos foram monitorados,

utilizando Econo Monitor UV (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) e registrados

por meio do Econo Recorder modelo 1327 (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

Em seguida, PAS-1 foi concentrada, dialisada contra PBS pH 7,2 e quantificada

utilizando reagente de Bradford (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, EUA). As proteínas

purificadas foram acondicionadas a -20°C até o momento do uso.

3.4 Remoção de endotoxinas

A contaminação da proteína PAS-1 com endotoxina foi removida utilizando Triton

X-114 (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, EUA), de acordo com protocolo modificado de

Aida e Pabst (1990). Um volume de 100 µL de Triton X-114 10%, previamente incubado

na geladeira durante 18 horas, foi adicionado a 1 mL de PAS-1 1mg/mL em tubos de

microcentrífuga e misturado cuidadosamente com uma pipeta e, em seguida, agitados

vigorosamente. Os tubos foram, então, incubados durante 30 minutos em banho de

gelo e agitados vigorosamente a cada 10 minutos. Depois, foram incubados a 37°C

durante 5 minutos para permitir a formação de duas fases na solução de proteína. As

proteínas foram então centrifugadas a 13000 g por 10 minutos à temperatura ambiente

e a fase aquosa foi recuperada cuidadosamente para não haver contaminação com a

fase oleosa, que fica no fundo do tubo. Foram realizados 15 ciclos para remoção da

endotoxina de PAS-1 à níveis abaixo da sensibilidade do teste (< 0,125 EU por mg de

proteína).

A presença de endotoxina nas amostras de PAS-1 foi avaliada pelo teste de LAL

(Limulus Amebocyte Lysate) de acordo com as instruções do fabricante do kit Multi-test

Limulus amebocyte lysate pyrogent Plus



(BioWhittaker Inc., Walkersville, MD, EUA). A

dosagem de endotoxina foi realizada após adição de 1 mL de amostra de PAS-1 diluída

em série (1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80) em tubos de vidro. A curva padrão foi feita com

endotoxina de Escherichia coli O55:B5 diluída, na base 2, de 1 EU/mL até 0,03125

EU/mL. Cada diluição foi agitada durante 1 minuto antes da próxima diluição ser

procedida. O controle negativo do teste foi uma amostra de água despirogenizada

presente no kit. Em seguida, foram adicionados 100µL de lisado de amebócitos de

Limulus polyphemus nos tubos contendo as diluições de PAS-1, a endotoxina padrão e

a água. Após a adição do lisado, os tubos foram imediatamente agitados e incubados a

37°C durante 60 minutos. Em seguida, a leitura foi realizada após observação

macroscópica da reação. A reação positiva foi indicada pela formação de um gel firme

no fundo do tubo que permanece intacto quando este é inclinado. A concentração de

endotoxina foi determinada pela multiplicação da sensibilidade do teste (=0,125 EU/mL)

e do inverso do antilog

da diluição em que o gel se formou.

3.5 Protocolos de imunização e transferência adotiva

Grupos de camundongos C57BL/6 selvagens ou deficientes de IL-12, IFN-γ ou

IL-10 (5 animais por grupo experimental) foram imunizados por via intraperitoneal com

50 µg de OVA ou 300 µg de PAS-1 ou 50 µg de OVA + 300 µg de PAS-1 adsorvidos em

7,5 mg Al(OH)

, nos dias 0 e 7. Os animais receberam também dois desafios

antigênicos com OVA ou PAS-1 ou OVA + PAS-1 (nos dias 14 e 21), por via intranasal,

com as mesmas doses de antígenos. Os grupos-controle consistiram de animais que

receberam PBS, seguindo o mesmo protocolo anterior. No dia 23, os animais foram

sacrificados para a obtenção do sangue, LBA e pulmões.

Para os experimentos de transferência adotiva com células PAS-1-primadas, os

animais doadores (camundongos C57BL/6) foram imunizados com 300 µg de PAS-1

adsorvidos em Al(OH)

, por via intraperitoneal (dia 0) e subcutânea (dia 7), e 300 µg de

PAS-1 por via endovenosa (dia 14). No dia 21, o baço, os linfonodos inguinais e

mesentéricos foram removidos para a separação de diferentes tipos celulares. Os

animais receptores foram previamente imunizados, por via intraperitoneal, com duas

doses de 50 µg de OVA adsorvida em 7,5 mg Al(OH)

, em um intervalo de 7 dias. Os

animais receberam também dois desafios antigênicos (nos dias 14 e 21), por via

intranasal, com as mesmas doses de antígenos. No dia 0, 5 x 10

linfócitos purificados/

animal foram transferidos para animais receptores por via endovenosa. No dia 23, os

camundongos foram sacrificados para remoção de sangue, lavado broncoalveolar

(LBA) e pulmões.

3.6 Purificação de células linfócitos B e linfócitos T (CD8

, CD4

CD25

CD4

CD25

) PAS-1 primados

As células purificadas foram: linfócitos B CD19

, linfócitos B B220

, linfócitos T

CD3

, linfócitos T CD4

, linfócitos T CD8

, células T CD4

CD25

e células T CD4

CD25

(células T reguladoras), a partir dos órgãos linfóides (baço, linfonodos inguinais e

mesentéricos) de camundongos previamente imunizados com PAS-1.

Os linfócitos B CD19

, B B220

, T CD3

, T CD4

e T CD8

foram purificados por

seleção positiva, utilizando partículas magnéticas acopladas, respectivamente, a

anticorpos anti-CD19, anti-B220, anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 (Dynal A.S, Oslo,

Noruega). As partículas magnéticas (4 x 10

partículas) foram lavadas três vezes com

1 mL de HBSS contendo 1% de SBF. Em seguida, 1 x 10

células totais foram

adicionadas às partículas magnéticas, misturadas e incubadas por 20 minutos na

geladeira, sob agitação a cada 5 minutos. Os tubos contendo as células ligadas às

partículas magnéticas foram colocados no campo magnético por 2 minutos e, em

seguida, o sobrenadante foi removido com os tubos presentes no campo magnético.

Foi adicionado 1 mL de tampão HBSS contendo 1% de SBF e os tubos foram

novamente colocados no campo magnético por 2 minutos. Esta etapa foi repetida mais

duas vezes para retirar as células que não se ligaram às partículas magnéticas. As

células purificadas foram removidas das partículas magnéticas por incubação por 18

horas a 37°C em estufa com atmosfera contendo 5% de CO

. As células foram

separadas das partículas magnéticas após várias pipetagens suaves para não causar

danos às células. Os tubos foram colocados novamente no campo magnético e o

sobrenadante foi removido (células purificadas).

A purificação de células T CD4

, CD4

CD25

e CD4

CD25

foi feita a partir da

suspensão de células de baço e linfonodos mesentéricos de animais imunizados com

PAS-1, de acordo com as instruções do fabricante do kit de separação magnética

(MiltenyiBiotec, Auburn, CA, EUA). Assim, uma suspensão de células (1 x 10

células)

foi obtida, marcada com 10 µL de um coquetel contendo anticorpos anti-CD8a, anti-

CD11b, anti-CD45R, anti-CD49b e anti-Ter-119 ligados com biotina e incubada por 10

minutos na geladeira. Em seguida, foi adicionado à suspensão de células 20 µl de

partículas magnéticas anti-biotina e 10 µL de anticorpo anti-CD25-PE. A mistura foi

incubada novamente por 15 minutos na geladeira. Após a incubação, as células foram

lavadas com 1 mL de tampão PBS pH 7,2 suplementado com 0,5% de BSA e 2mM de

EDTA e aplicada à uma coluna situada em um campo magnético para proceder à

separação das células. As células foram eluídas após duas lavagens da coluna com

tampão PBS pH 7,2 suplementado com 0,5% de BSA e 2mM de EDTA e as células

contidas no eluato obtido no campo magnético foram as células T CD4+. As células T

CD4+ isoladas foram marcadas com partículas magnética anti-PE e incubadas por 15

minutos na geladeira. Em seguida, esta mistura foi lavada com 1 mL de tampão PBS pH

7,2 suplementado com 0,5% de BSA e 2mM de EDTA e as células foram aplicadas à

uma coluna presente em um campo magnético. O primeiro eluato recolhido da coluna,

após duas lavagens com tampão, foram as células CD4+CD25-. Já aquelas eluídas fora

do campo magnético foram as células CD4+CD25+.

3.7 Parâmetros de avaliação da asma alérgica experimental

3.7.1 Determinação dos níveis séricos de anticorpos

Os níveis de anticorpos foram determinados em amostras de soro dos animais

selvagens ou deficientes de citocinas, imunizados e desafiados com OVA ou PAS-1 ou

OVA + PAS-1 ou animais imunizados com OVA que receberam transferência adotiva de

linfócitos PAS-1 específicos. As amostras de soro foram coletadas antes da primeira e

após a última imunização e utilizadas para quantificar os anticorpos por ensaio

imunoenzimático (ELISA).

Os anticorpos da classe IgE foram dosados por ELISA captura. Placas de 96

poços foram adsorvidas com 1 µg/mL de anticorpo LOME-2 de rato (anti-IgE de

camundongo) e incubadas a 4°C durante 18 horas. Para quantificar IgG1, as placas

foram sensibilizadas com OVA e incubadas a 4°C por 18 horas. As placas foram

bloqueadas com 200 µL de PBS/Tween 20 0,05% contendo 5% de leite desnatado, em

cada poço. As placas foram incubadas a 37°C por 2 horas. As amostras de soro (100

µL) foram adicionadas, após diluição seriada na base 2, de 1:5 até 1:640. Em seguida,

foram incubadas durante 1 hora a 37°C, 100 µL dos anticorpos anti-IgG1 ou anti-IgG2a

ou anti-IgE ligados à peroxidase, diluídos 1:1000, respectivamente, para dosagem de

IgG1, IgG2a ou IgE. A reação foi revelada com 100 µL de uma solução de OPD (OPD

5,52 mM e H

29,4 mM em tampão citrato (ácido cítrico 100mM e citrato trissódico

100 mM)) por 5 minutos a temperatura ambiente sob a proteção da luz. A reação foi

bloqueada com 50 µL de H

30% e a leitura das placas foi realizada em leitor de

ELISA a 492 nm Multiskan Ex (Labsystems). Os anticorpos monoclonais utilizados

foram gentilmente cedidos pelo Prof Dr Hervé Bazin (IMEX/UCL Bruxelas, Bélgica).

3.7.2 Reação de anafilaxia passiva (PCA)

A reação de anafilaxia passiva foi realizada conforme a técnica descrita por Mota

e Wong (1969). Para dosagem de IgE, foram utilizados ratos da linhagem Wistar

previamente depilados no dorso. Um volume de 100 µL de soros diluídos de 1:10 a

1:160 (base 2), foram injetados por via intradérmica. Dezoito horas após a

sensibilização, os animais foram desafiados por via endovenosa com 500 µg de OVA

em 1 mL de azul de Evans 0,25%. Os animais foram sacrificados 30 minutos após o

desafio antigênico, para realizar a leitura da reação, por observação do diâmetro de

reação na pele invertida dos ratos.

Para dosagem de IgG1 anafilática, foram utilizados camundongos BALB/c

injetados por via intradérmica, no dorso previamente depilado, com diferentes diluições

dos soros previamente inativados por 1 hora a 56°C. Após 2 horas da sensibilização, os

animais foram desafiados com 250 µg de OVA em 0,5 mL de azul de Evans 0,25%. A

leitura foi realizada 30 minutos depois do desafio antigênico, por medição do diâmetro

da reação na pele invertida dos camundongos.

Os títulos de anticorpos foram expressos como a recíproca da maior diluição do

soro que produziram uma reação igual ou maior que 5 mm de diâmetro. Os testes

foram realizados em triplicatas e foram consideradas significativas diferenças maiores

que duas vezes (Fox et al., 1976; Ishizaka et al., 1966).

3.7.3 Obtenção do lavado broncoalveolar e do homogenato pulmonar

Dois dias após o segundo desafio antigênico, os animais foram anestesiados

com hidrato de cloral 10% (CIRQ, Diadema, São Paulo, Brasil). As traquéias foram

canuladas e 1 mL (2 x 500 µL) de HBSS foi injetado para obtenção do LBA, que foi

coletado após 30 segundos de massagens torácicas. O LBA foi centrifugado a 100 g e

o sobrenadante foi utilizado para investigar a presença de citocinas e de EPO e o

precipitado foi usado para contagem total e diferencial das células.

Após a obtenção do LBA, a artéria pulmonar foi canulada e 10 mL de solução

salina 0,85% foram injetados. Os pulmões foram então excisados, submergidos em

tampão HBSS e macerados, em um volume correspondendo a 5% do peso do pulmão,

em banho de gelo. Posteriormente, foram centrifugados a 1900 g durante 10 minutos a

10°C. As hemácias foram lisadas com choque hipotônico (1 mL de PBS, 3 mL de H

destilada, 1 mL de solução salina 3%) e a suspensão celular foi submetida a

centrifugação a 1900 g durante 10 minutos a 10°C. O precipitado foi ressuspendido em

HBSS/HTAB (5% do peso do pulmão) e submetido ao choque térmico (congelamento

em nitrogênio líquido e descongelamento em banho maria a 37°C) por três vezes. As

células lisadas foram centrifugadas a 1900 g durante 10 minutos a 10°C e o

sobrenadante foi recuperado para dosagem de EPO e citocinas.

3.7.4 Contagem de células

A contagem total e diferencial de células foi realizada com o precipitado de

células obtidas no LBA após centrifugação. A contagem total é realizada com células

diluídas em Azul de Trypan 0,1% por exclusão deste corante. A contagem diferencial foi

feita em células depositadas em lâminas a 600 rpm durante 5 minutos. As lâminas

foram coradas pela coloração Giemsa-Wright (Kit Hema 3, Fischer Sci Co LLC,

Kalamazoo, MI, EUA) e observadas em microscópio ótico.

3.7.5 Determinação de EPO

A presença de EPO foi avaliada por um ensaio colorimétrico, de acordo com o

método de Strath et al. (1985). Assim, 75 µL de amostras de LBA e de homogenato

pulmonar (HP) foram incubadas durante 30 minutos a temperatura ambientes sob a

proteção da luz, com 150 µL de uma solução contendo OPD 1,5 mM, H

6,6mM,

diluídos em tampão Tris-HCl 0,05M pH 8,0. A reação foi bloqueada com 75 µL de

30%. A leitura foi realizada a 492 nm em leitor de ELISA Multiskan Ex

(Labsystems).

3.7.6 Determinação dos níveis de citocinas e quimiocinas

Os níveis das citocinas IL-4, IL-5, IL-13, IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β e da

quimiocina eotaxina foram avaliados por ELISA (BD Biosciences PharMingen, San

Diego, CA, EUA) no LBA e no HP de camundongos dos diferentes grupos

experimentais. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (BD

Biosciences PharMingen, san Diego, CA, EUA). Placas de 96 poços ½ área (Costar

Corning Inc, Corning, NY, USA) foram sensibilizadas com 50 µL/poço dos anticorpos

purificados anti-IL-4 ou anti-IL-5 ou anti-IL-13 ou anti-IL-12 ou anti-IFN-γ ou anti-IL-10 ou

anti-TGF-β ou anti-eotaxina, diluídos 1:250 em tampão carbonato 0,1M, pH 9,6 e

incubadas a temperatura ambiente por 18 horas. Depois, as placas foram lavadas 3

vezes com PBS/ Tween 20 0,05% para remover o excesso de anticorpo. As placas

foram então bloqueadas com 100 µL de PBS contendo 10% de soro bovino fetal, à

temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida, as placas foram lavadas novamente.

Um volume de 50 µL de amostra do LBA ou do HP foi adicionado à placa. As

respectivas curvas-padrão foram feitas utilizando as citocinas recombinantes purificadas

IL-4, IL-5, IL-13, IL-12, IFN-γ, IL-10, TGF-β, eotaxina, diluídas na base 2, em tampão

PBS contendo 10% de soro bovino fetal. As placas foram incubadas à temperatura

ambiente por 2 horas e em seguida foram novamente lavadas. Um volume de 50 µL da

mistura de anticorpos biotinilados anti-IL-4 ou anti-IL-5 ou anti-IL-13 ou anti-IL-12

ou anti-IFN-γ ou anti-IL-10 ou anti-TGF-β ou anti-eotaxina diluídos 1:250 e

estrepatavidina-peroxidase diluída 1:250 em tampão PBS contendo 10% de soro bovino

fetal foi adicionada às placas. As placas foram incubadas por 1 hora a temperatura

ambiente, sob a proteção da luz, e, em seguida, novas lavagens foram realizadas. A

reação colorimétrica foi revelada com 50 µL de tetrametilbenzidina (Sigma Chemical

Co, St Louis, MO, EUA) e bloqueada com 25 µL de H

30% A absorbância foi

determinada a 405 nm em leitor de ELISA Multiskan Ex (Labsystems). O limite de

detecção para a dosagem de IL-4, IL-5, IL-13, IL-12, IFN-γ, IL-10, TGF-β e eotaxina

foram, respectivamente, 7,8 pg/mL, 15,6 pg/mL, 31,2 pg/mL, 62,5 pg/mL, 62,5 pg/mL,

31,3 pg/mL, 31,3 pg/mL, 62,5 pg/mL e 15,6 pg/mL.

3.8 Medida de parâmetros de mecânica de ventilação pulmonar

Os estudos de mecânica pulmonar foram baseados no método descrito por

Martin et al. (1989). A avaliação dos parâmetros foi realizada no dia 23 após o início

das imunizações. Os camundongos foram anestesiados com pentabarbital sódico 3%,

via intraperitoneal (70 mg/Kg) e traqueostomizados. A veia jugular foi canulada para

infusão de metacolina. Os animais foram conectados a um ventilador (Harvard 683,

Harvard Apparatus CO, South Natik, MA, EUA), à freqüência de 100 ciclos/minuto e

volume corrente de 8 mL/Kg e acomodados em um pletismógrafo de corpo inteiro

para camundongos, conectado à um transdutor de volume. A pressão traqueal foi

medida por um transdutor de pressão (Validyne DP 45-28-2114, Validyne Corp.,

Northridge, CA, EUA) acoplado à cânula traqueal no animal.

Para o estabelecimento da curva dose-resposta à metacolina, solução salina foi

administrada pela veia jugular para captar os sinais de pressão traqueal e volume

após 0,5, 1, 2 e 3 minutos. Estes dados foram considerados basais. Em seguida,

metacolina (3 µg/Kg de peso) foi infundida e, novamente, os sinais de pressão

traqueal e volume foram captados após 0,5, 1, 2 e 3 minutos. Após 3 minutos, a

captação continuou sendo armazenada até a estabilização dos sinais de mecânica

(retorno aos sinais basais). Doses crescentes de metacolina (10, 30, 100, 300, 1000,

3000 e 10000 µg/Kg de peso) foram infundidas consecutivamente e a captação dos

sinais de pressão traqueal e volume foi feita nos tempos citados anteriormente.

Os dados obtidos foram simultaneamente enviados a um polígrafo (Gould) por

meio de uma placa conversora que transmitiu os valores de pressão traqueal (Ptr),

volume (V) e fluxo (∆) a um computador. Cada dado fornecido correspondeu à média

de 16 ciclos respiratórios consecutivos, sendo que os resultados finais foram

correspondentes à média aritmética de três medidas (de 16 ciclos cada) executadas

consecutivamente nas mesmas condições.

A partir dos valores obtidos para cada um desses parâmetros foram calculadas

as doses de metacolina que reduziram a condutância (Grs) do fluxo de ar e a

complacência (Crs) do tecido pulmonar em 50% e 40%, respectivamente, utilizando-se

a equação proposta por Fredberg e Stamenovic (1989).

3.9 Análise estatística

Os dados foram analisados, empregando-se a análise de variância ANOVA,

seguida do teste de Tukey, um teste não-paramétrico, que compara os grupos

experimentais entre eles e com o grupo controle. Um limite de confiança de 95% foi

estabelecido para significância dos resultados. Desse modo, os resultados analisados

foram considerados significantes quando o valor de p foi menor que 0,05 (p < 0,05).

4 RESULTADOS

4.1 Efeito da administração de PAS-1 na asma murina experimental

induzida por OVA em camundongos C57Bl/6 selvagens

O efeito de PAS-1 no nosso modelo de asma experimental foi investigado pela

determinação dos níveis de anticorpos IgG1 OVA-específicos e IgE total por ensaio

imunoenzimático e dos anticorpos anafiláticos IgE e IgG1 anti-OVA por anafilaxia

cutânea passiva, contagem total e diferencial da celularidade do LBA, presença de EPO

no LBA e no HP e quantificação dos níveis das citocinas IL-4, IL-5, IL-13, IL-12, IFN-γ,

IL-10, TGF-β e da quimiocina eotaxina.

Assim, os animais receberam duas injeções intraperitoneais e dois desafios por

via intranasal com 50 µg de OVA e/ou 300 µg de PAS-1, tendo um intervalo de 7 dias

entre cada dose de antígeno(s). Dois dias depois do último desafio (no dia 23), os

animais foram sacrificados e o sangue, LBA e os pulmões foram obtidos.

4.1.1 Avaliação da resposta imune humoral

O efeito de PAS-1 na resposta imune humoral induzida por OVA foi avaliado pela

determinação dos níveis de anticorpos IgG1 anti-OVA e IgE total por ELISA e dos

anticorpos anafiláticos IgG1 anti-OVA e IgE anti-OVA no soro de camundongos

imunizados com PBS (controle), OVA, PAS-1 e OVA + PAS-1.

Os animais imunizados com OVA produziram níveis significativos de IgG1 anti-

OVA (Figura 1A) e IgE total (Figura 1B) em relação ao controle (PBS). Como era de se

esperar, não houve produção de IgG1 anti-OVA e IgE total nos animais imunizados com

PAS-1; além disso, a produção de anticorpos da classe IgE no soro destes animais foi

comparada ao grupo controle (PBS). Os animais imunizados com OVA + PAS-1

apresentaram uma redução significativa nos níveis de IgG1 anti-OVA e de IgE total em

relação ao grupo OVA.

Para verificar se PAS-1 seria capaz de interferir na produção de anticorpos

anafiláticos, IgG1 anti-OVA e IgE anti-OVA foram investigados por anafilaxia cutânea

passiva (PCA) em ratos Wistar e em camundongos, respectivamente, utilizando soros

diluídos dos animais imunizados com OVA, PAS-1 e OVA + PAS-1. Os animais

imunizados com OVA produziram quantidades significativas de anticorpos IgG1

anafilático (Figura 1C) e IgE (Figura 1D) em comparação com o grupo PBS. Quando

PAS-1 foi co-administrado com OVA, observou-se uma diminuição significativa da

produção de IgE e IgG1 anafilático, indicando que PAS-1 modula negativamente a

produção destes anticorpos. Os animais imunizados com PAS-1 não produziram

anticorpos anafiláticos em níveis significativamente diferentes do controle (PBS).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

gG1 anti-OVA

(absorbância a 492 nm)



Imunização e desafio:

PBS

OVA

PAS-1

OVA + PAS-1

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

IgE total

(absorbância a 492 nm)



0 25 50 75 100

IgG1 anti-OVA

(Título de PCA)

Imunização e desafio:

PBS

OVA

PAS-1

OVA + PAS-1

0 10 20 30 40

IgE anti-OVA

(Título de PCA)

Figura 1 – Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na produção de anticorpos por

camundongos C57Bl/6 selvagens.

Os níveis séricos de IgG1 anti-OVA (A), IgE total (B), anticorpos anafiláticos IgG1

anti-OVA (C) e IgE anti-OVA (D) foram detectados em amostras de soros de

camundongos C57Bl/6 imunizados com duas doses de OVA (50 µg) e/ou PAS-1

(300µg) por via intraperitoneal e desafiados por via intranasal com as mesmas doses de

antígeno. No dia 23 após o início da imunização, o soro dos animais foi obtido para

pesquisa dos anticorpos. Os anticorpos IgG1 e IgE total foram dosados por ensaio

imunoenzimático (ELISA) e os resultados das absorbâncias apresentadas nos gráficos

foram expressos como média ± desvio padrão das absorbâncias obtidas na diluição

sérica de 1:20 (n= 5 animais por grupo experimental). Os anticorpos anafiláticos IgG1

pool de soros por grupo experimental. O grupo controle consistiu de camundongos não

imunizados, que receberam apenas PBS.

(

) p < 0,001 em relação ao controle (PBS).

(♦) p < 0,001 em relação ao grupo OVA.

(+) significativo em relação ao controle (PBS).

(#) significativo em relação ao grupo OVA.

4.1.2 Análise da celularidade do lavado broncoalveolar

A celularidade do LBA foi analisada pela contagem total e diferencial dos tipos

celulares que foram removidos após a obtenção do LBA, dois dias depois do último

desafio antigênico.

Pelos resultados apresentados na tabela 1, observamos que os animais

imunizados com OVA apresentaram uma intensa migração celular no LBA em

comparação com o grupo controle (PBS) (aumento de 96,35%). Os animais imunizados

com PAS-1 não tiveram aumento no infiltrado de células, comparando-se ao controle

(PBS), indicando que PAS-1 não apresenta propriedades alergênicas como a OVA. Por

outro lado, a celularidade no LBA dos animais imunizados simultaneamente com OVA e

PAS-1 foi significativamente suprimida, apresentando redução do infiltrado celular no

LBA (redução de 91,48% em relação ao infiltrado leucocitário encontrado no grupo

OVA).

Para investigar os diferentes tipos celulares presentes no LBA, foi realizada a

contagem diferencial das células coradas pela coloração de Giemsa-Wright. Os animais

imunizados com OVA apresentaram quantidades significativamente maiores de

macrófagos, linfócitos e eosinófilos em relação ao controle (PBS). Os animais

imunizados com OVA + PAS-1 apresentaram uma diminuição significativa do número

de macrófagos, linfócitos e eosinófilos em relação ao grupo OVA.

Tabela 1 – Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na migração leucocitária no LBA de

camundongos C57Bl/6 selvagens.

PBS

OVA

PAS-1 OVA + PAS-1

Células

totais

6,17 ± 0,58

169,19 ± 53,36

* 5,01 ± 3,25 14,40 ± 3,85



Macrófagos

3,63 ± 0,12

64,44 ± 15,19

* 2,93 ± 0,18 7,22 ±1,27



Neutrófilos

0,11 ± 0,04 0,41 ± 0,23 0,55 ± 0,42 0,68 ± 0,39

Linfócitos

2,40 ± 0,92

82,11 ± 28,58

* 1,52 ± 0,14 6,25 ± 1,47



Eosinófilos

22,71 ± 13,67

* NI NI

Camundongos C57Bl/6 (n = 5 animais por grupo experimental) foram imunizados com duas

doses de OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via intraperitoneal e desafiados por via

intranasal com as mesmas doses de antígeno e, no dia 23, o LBA foi recuperado para

contagem celular. A migração celular foi avaliada pela contagem total e diferencial de leucócitos

e o número de células expresso é multiplicado por 10

células/mL.

NI – não foi encontrada nenhuma célula nos campos observados.

(

) p< 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

()

p< 0,05 em relação ao grupo OVA

4.1.3 Determinação da atividade de EPO

Para investigar se PAS-1 seria capaz de interferir na quantidade de eosinófilos

efetores, foi determinada a presença da enzima peroxidase de eosinófilo (EPO) no LBA

e no homogenato pulmonar (HP) por uma reação colorimétrica usando H

como

substrato e OPD como agente cromógeno.

Como podemos observar pelos resultados apresentados na Figura 2, a

imunização com OVA aumentou significativamente a atividade de EPO, tanto no LBA

(Figura 2A) como no HP (Figura 2B). Quando os animais foram imunizados com OVA +

PAS-1, a atividade de EPO foi diminuída a níveis que não diferiram do controle (PBS),

indicando uma modulação negativa de PAS-1 nos eosinófilos recrutados por OVA para

os pulmões. Os animais imunizados apenas com PAS-1 não apresentaram níveis de

EPO significativamente diferentes do controle (PBS).

0 1 2 3 4 5

EPO

(absorbância a 492 nm)



Imunização e desafio:

PBS

OVA

PAS-1

OVA + PAS-1

0 1 2 3 4

EPO

(absorbância a 492 nm)



Figura 2 – Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na atividade de EPO em

camundongos C57Bl/6.

A presença de EPO foi avaliada no lavado broncoalveolar (A) e no

homogenato pulmonar (B) de camundongos C57Bl/6 imunizados com duas

doses de OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via intraperitoneal e

desafiados por via intranasal com as mesmas doses de antígeno. No dia 23

após o início da imunização, o LBA e o HP foram obtidos para pesquisa da

atividade de EPO. Os resultados foram expressos como média ± desvio-

padrão das absorbâncias medidas a 492 nm (n= 5 animais por grupo

experimental). O grupo controle consistiu de camundongos não

imunizados, que receberam apenas PBS.

( * ) p < 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

(



) p < 0,001 em relação ao grupo OVA.

4.1.4 Determinação do perfil de citocinas

Para verificar o efeito de PAS-1 na secreção de citocinas por células do sistema

imune, os níveis de IL-4, IL-5, IL-13, IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β e da quimiocina

eotaxina foram quantificadas por ensaio imunoenzimático (ELISA) no LBA e no HP.

Pelos resultados representados na tabela 2, observa-se que os animais

imunizados com OVA produziram elevados níveis de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina, tanto

no LBA quanto no HP, em relação ao controle (PBS). Em contrapartida, a imunização

com OVA não foi capaz de induzir a produção de IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β, nas

amostras testadas (LBA e HP).

Por outro lado, o inverso foi observado nos animais que receberam apenas PAS-

1. Nestes animais, os níveis de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina não diferiram dos animais

controle (PBS), entretanto, as citocinas IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β estavam

significantemente aumentadas, tanto no LBA quanto no HP.

Nos animais imunizados com ambos os antígenos (OVA+PAS-1), os valores de

IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina foram semelhantes àqueles obtidos no grupo controle (PBS),

demonstrando uma supressão total dos níveis destas citocinas quando comparado com

o grupo imunizado apenas com OVA. Por outro lado, nestes animais (grupo OVA +

PAS-1) foram detectados níveis elevados de IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β, tanto no LBA

como no homogenato pulmonar, comparado com o grupo controle. Estes resultados

indicam que, quando são administradas em conjunto, o efeito supresssivo de PAS-1 se

sobrepõe ao efeito alergênico de OVA na resposta inflamatória pulmonar.

Tabela 2 – Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na produção de citocinas e

quimiocinas por camundongos C57Bl/6 selvagens.

IL-4

LBA

8,14 ± 0,81

8,34 ± 0,68

62,37 ± 18,33 *

39,88 ± 8,75 *

6,46 ± 1,22

7,08 ± 1,44

3,45 ± 2,45

7,15 ± 1,08

IL-5

LBA

9,22 ± 0,51

8,55 ± 0,28

79,63 ± 15,31 *

45,83 ± 7,61 *

6,59 ± 2,67

8,80 ± 0,98

5,71 ± 2,24

7,58 ± 3,59

IL-13

LBA

4,67 ± 1,89

2,91 ± 3,78

232,29 ± 132,11*

153,91 ± 10,67 *

5,32 ± 3,55

4,35 ± 2,28

5,03 ± 2,96

4,06 ± 2,23

PBS

OVA PAS-1 OVA + PAS-1

eotaxina

LBA

2,49 ± 1,43

5,14 ± 3,19

505,56 ± 112,36 *

172,97 ± 75,65 *

4,32 ± 1,6

2,82 ± 2,13

2,76 ± 2,34

3,64 ± 3,09

IL-12

LBA

3,47 ± 1,00

3,39 ± 1,46

4,29 ± 1,08

2,87 ± 0,56

72,74 ± 24,39 *

79,62 ± 16,02 *

79,55 ± 19,19 *

72,59 ± 17,20 *

IFN-γ

LBA

3,96 ± 2,67

4,04 ± 2,15

2,22 ± 0,67

2,20 ± 0,49

187,17 ± 89,63 *

99,69 ± 11,71 *

237,40 ± 135,64 *

165,98 ± 77,21 *

IL-10

LBA

2,16 ± 0,40

2,52 ± 2,71

2,95 ± 2,24

1,48 ± 0,33

336,60 ± 100,02 *

168,62 ± 63,68 *

369,58 ± 162,39 *

157,42 ± 49,66 *

TGF-β

LBA

2,00 ± 0,19

3,32 ± 1,14

3,46 ± 1,19

3,13 ± 0,96

356,63 ± 98,69 *

189,66 ± 100,00 *

317,46 ± 79,63 *

158,45 ± 71,42 *

Perfil de citocinas e quimiocinas produzidas por células do lavado broncoalveolar (LBA) e do

homogenato pulmonar (HP) de camundongos C57Bl/6 imunizados com duas doses de OVA (50

µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via intraperitoneal e desafiados por via intranasal com as mesmas

doses de antígeno. No dia 23 após o início da imunização, o LBA e o HP foram obtidos para

dosagem das citocinas. Os resultados foram expressos como média + desvio-padrão em pg/mL

de citocina (n = 5 animais por grupo experimental).

O grupo controle consistiu de camundongos

não imunizados, que receberam apenas PBS.

(

) p < 0,01 em relação ao grupo controle (PBS)

() p < 0,01 em relação ao grupo OVA

4.1.5 Reatividade das vias aéreas

Para investigar o efeito de PAS-1 na reatividade das vias aéreas, os parâmetros

de mecânica ventilação pulmonar (condutância das vias aéreas (Grs) e complacência

do tecido pulmonar (Crs)) foram avaliados em camundongos C57BL/6 selvagens

imunizados e desafiados com OVA e/ou PAS-1, 48 horas após o último desafio

antigênico.

Os camundongos foram anestesiados, canulados e submetidos à ventilação

mecânica após acomodação em pletismógrafo de corpo inteiro. Os dados de pressão e

volume foram obtidos após infusão intravenosa com solução salina e concentrações

crescentes de metacolina e, em seguida, utilizados para os cálculos de condutância

(Grs) e complacência (Crs) do sistema respiratório.

A figura 3 representa o logaritmo da dose de metacolina necessária para reduzir

a condutância e a complacência pulmonar em 50% e 40%, respectivamente, em

relação aos valores basais (dados obtidos após infusão de solução salina). O

requerimento de doses diminuídas do broncoconstritor tem como conseqüência a

redução nos valores de condutância (ou aumento da resistência) ao fluxo aéreo. Da

mesma maneira, a redução nos valores de complacência (Crs) do sistema respiratório

(ou aumento da elastância do tecido pulmonar) pode ser entendida como resultado de

maior rigidez do tecido pulmonar, devido ao processo inflamatório.

Observa-se, então, na figura 3A, que o logaritmo da dose de metacolina

requerida por animais imunizados e desafiados com OVA + PAS-1 para diminuir a

condutância (Grs) em 50% foi significativamente maior em relação à dose requerida por

animais imunizados e desafiados com OVA (p < 0,001) e semelhante à dose requerida

pelos animais controle (PBS).

Em contrapartida, não foram encontradas diferenças entre as doses de

metacolina necessárias para que camundongos que receberam OVA + PAS-1

apresentasse diminuição de 40% da complacência do sistema respiratório (Crs) em

comparação com as doses necessárias por animais imunizados e desafiados com OVA

(Figura 3B).

Em conjunto, os resultados obtidos com relação à reatividade das vias aéreas

demonstram que PAS-1 aumentou a condutância do fluxo aéreo, que está diminuída

pela inflamação induzida por OVA. Entretanto, PAS-1 não apresentou nenhum efeito

sobre as propriedades elástica do tecido pulmonar.

0 1 2 3 4

Grs

ED50%

Imunização e desafio:

PBS

OVA

PAS-1

OVA + PAS-1

0 1 2 3 4 5

Crs

ED40%

Figura 3 – Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na reatividade das vias

aéreas em camundongos C57Bl/6.

Os parâmetros condutância (Grs) aérea (A) e complacência (Crs) do tecido

pulmonar (B) foram medidos em camundongos C57Bl/6 imunizados com duas doses de

OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via intraperitoneal e desafiados por via intranasal

com as mesmas doses de antígeno (n= 5 animais por grupo experimental). No dia 23

após o início da imunização, os dados de volume e pressão traqueal foram medidos

após infusão de doses crescentes de metacolina. O gráfico apresenta a média dos

valores do logaritmo da dose de metacolina necessária para reduzir os valores basais

(obtidos após infusão de solução salina) de condutância (Grs) e complacência (Crs),

respectivamente, em 50% e 40%. O grupo controle consistiu de camundongos não

imunizados, que receberam apenas PBS.

(*) p < 0,001 em relação ao grupo controle (PBS).

4.2 Papel de IL-12, IFN-γ e IL-10 na ação modulatória de PAS-1

Como foi demonstrado anteriormente, PAS-1 promove a secreção de IL-12, IFN-γ

e IL-10 e apresenta um potente efeito imunomodulatório na inflamação alérgica

induzida por OVA. Assim, para verificar o papel destas citocinas na ação

imunossupressora de PAS-1, utilizamos camundongos deficientes destas citocinas.

A importância de IL-12, IFN-γ e IL-10 no efeito modulatório foi analisado em

animais imunizados e desafiados com OVA e/ou PAS-1, pela quantificação de

anticorpos IgG1 anti-OVA por ELISA e de anticorpos anafiláticos IgE e IgG1 anti-OVA

por PCA, pela contagem total e diferencial de células no LBA e no homogenato

pulmonar, pela determinação da presença de EPO e do perfil das citocinas IL-4, IL-5,

IL-13, IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β e de eotaxina no LBA e no homogenato pulmonar.

4.2.1 Resposta imune humoral

A resposta imune humoral foi avaliada pelos níveis de anticorpos IgG1 anti-OVA

e IgE total produzidos no soro de camundongos deficientes de IL-12, IFN-γ e IL-10

imunizados com OVA ou PAS-1 ou OVA + PAS-1. Também, foi investigada a produção

de anticorpos anafiláticos IgE e IgG1 anti-OVA no soro destes animais.

Os animais deficientes de IL-12, IFN-γ e IL-10 imunizados com OVA produziram

níveis estatisticamente significativos de IgG1 (Figura 4A) e IgE total (Figura 4B), IgG1

anafilática anti-OVA (Figura 4C) e também IgE anti-OVA (Figura 4D) em relação ao

grupo PBS (controle). Por outro lado, como era de se esperar, não foi observado

anticorpos IgG1 ou IgE anti-OVA nos animais que receberam apenas PAS-1. Além

disso, observamos que PAS-1 também não alterou os níveis séricos de imunoglobulinas

da classe IgE (Figura 4B e 4D), comparado com o grupo controle (PBS). Estes

resultados são muito semelhantes aos obtidos com camundongos C57BL6 selvagens

(Figura 1). A imunização simultânea com OVA e PAS-1 induziu diferentes efeitos com

relação à produção de anticorpos, nas linhagens utilizadas. Quanto aos animais IL-12

-/-

observamos uma supressão significativa (praticamente total) da produção destes

anticorpos, quando comparado com o grupo imunizado apenas com OVA (em níveis

praticamente iguais aos animais selvagens). Em contrapartida, nos animais deficientes

de IFN-γ e IL-10 os níveis de IgG1 anti-OVA e IgE total continuaram elevados não

diferindo do grupo OVA, apesar da imunização simultânea com PAS-1.

Em conjunto, estes dados sugerem que IFN-γ e IL-10, mas não IL-12, são

importantes nos mecanismos reguladores induzidos por PAS-1 na inflamação alérgica

pulmonar, no que se refere à produção de anticorpos.

0 1 2 3

pbs

IgG1 anti-OVA

(absorbância 492 nm)



Imunização e desafio:

OVA +PAS-1

PAS-1

OVA

PBS

0 1 2 3

pbs

IgE total

(absorbância a 492 nm)



0 25 50 75 100

pbs

IgG1anti-OVA

(Título de PCA)

Imunização e desafio:

OVA +PAS-1

PAS-1

OVA

PBS

0 10 20 30 40

pbs

IgE anti-OVA

(Título de PCA)

Figura 4 –

Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na produção de anticorpos por

camundongos C57BL/6 deficientes de IL-12, IFN-

e IL-10.

Os níveis séricos de IgG1 anti-OVA (A), IgE total (B) e anticorpos anafiláticos

IgG1 anti-OVA (C) e IgE anti-OVA (D) em amostras de soros de camundongos

selvagens ( ), IL-12

-/-

( ), IFN-γ

-/-

( ) e IL-10

-/-

( ) imunizados com duas doses de

OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via intraperitoneal e desafiados por via intranasal

com as mesmas doses de antígeno. No dia 23 após o início da imunização, o soro dos

animais foi obtido para pesquisa dos anticorpos. Os anticorpos IgG1 e IgE total foram

dosados por ensaio imunoenzimático (ELISA) e os resultados das absorbâncias

apresentadas nos gráficos foram expressos como média ± desvio padrão das

absorbâncias obtidas na diluição sérica de 1:20 (n= 5 animais por grupo experimental).

Os anticorpos anafiláticos IgG1 (C) e IgE (D) foram dosados por PCA em camundongos

ou ratos, respectivamente, em pool de soros por grupo experimental. O grupo controle

consistiu de camundongos não imunizados, que receberam apenas PBS.

(

) p < 0,001 em relação ao controle (PBS).

(♦) p < 0,001 em relação ao grupo OVA.

(+) significativo em relação ao controle (PBS).

(#) significativo em relação ao grupo OVA.

4.2.2 Quantificação da celularidade no LBA

A quantificação da celularidade no LBA dos animais deficientes de IL-12, IFN-γ e

IL-10 está mostrada na tabela 3. Os camundongos imunizados com OVA apresentaram

intenso infiltrado inflamatório, composto principalmente por macrófagos, linfócitos e

eosinófilos, quando comparado ao grupo controle (PBS), independente das

características genéticas dos animais. Por outro lado, os animais IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

IL-10

-/-

imunizados apenas com PAS-1 não apresentaram uma migração celular

pulmonar significativa, sendo o número de leucócitos encontrados no LBA destes

animais comparável ao grupo controle. Quando os animais deficientes de IL-12 foram

imunizados simultaneamente com OVA e PAS-1, houve uma redução intensa no

número de células no LBA, incluindo macrófagos (86,80%), neutrófilos (85,59%),

linfócitos (92,86%) e eosinófilos (94,35%), quando comparado com o grupo que

recebeu apenas OVA. Estes resultados são semelhantes aos obtidos com animais

selvagens (Tabela 1), sugerindo que IL-12 não desempenha papel significativo no efeito

supressivo de PAS-1 com relação à formação do infiltrado inflamatório pulmonar. Já nos

animais deficientes de IFN-γ e IL-10, imunizados e desafiados com OVA e PAS-1,

observamos uma intensa migração leucocitária, incluindo macrófagos, linfócitos e

eosinófilos, em quantidades comparáveis ao grupo OVA, ao contrário dos animais

selvagens (Tabela 1), nos quais a presença de PAS-1 suprimiu intensamente a

migração inflamatória pulmonar. Nestes animais deficientes de IL-12, IFN-γ e IL-10, o

recrutamento de neutrófilos não diferiu do grupo controle (PBS), mostrando que o

esquema de imunização utilizado não favorece a migração deste tipo celular.

Tabela 3 - Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na migração leucocitária no LBA de

camundongos C57Bl/6 IL-12

-/-

, IFN-

-/-

e IL-10

-/-

PBS

OVA PAS-1 OVA + PAS-1

Células

totais

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-

-/-

IL-10

-/-

6,17 ± 0,58

4,55 ± 3,59

8,32 ± 0,15

4,53 ± 1,45

160,19 ± 19 *

168,80 ± 78,27 *

125,81 ± 55,07 *

117,32 ± 78,27 *

5,01 ± 3,25

6,24 ± 4,55

5,08 ± 3,15

5,53 ± 2,55

14,40 ± 3,85



22,24 ± 4,11



107,60 ± 51,72

96,64 ± 2,37

Macrófagos

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-

-/-

IL-10

-/-

3,63 ± 0,12

1,25 ± 1,25

1,89 ± 1,41

2,25 ± 1,21

64,44 ± 15,19 *

56,48 ± 23,03 *

38,54 ± 13,46 *

44,69 ± 18,31 *

2,93 ± 0,18

3,20 ± 1,74

2,47 ± 1,96

2,29 ± 1,47

7,22 ± 1,27



8,14 ± 2,16



41,62 ± 11,51

40,14 ± 21,69

Neutrófilos

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-

-/-

IL-10

-/-

0,11 ± 0,04

0,18 ± 0,15

2,91 ± 1,56

0,17 ± 0,10

0,41 ± 0,23

1,85 ± 1,06

4,60 ± 3,56

1,84 ± 0,89

0,55 ± 0,42

0,21 ± 0,15

0,79 ± 1,37

0,37 ± 0,15

0,68 ± 0,39

0,97 ± 0,57

3,96 ± 3,66

2,98 ± 0,48

Linfócitos

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-

-/-

IL-10

-/-

2,40 ± 0,92

3,12 ± 0,37

3,52 ± 0,55

2,11 ± 0,37

82,11 ± 28,58 *

91,70 ± 26,67 *

70,74 ± 17,30 *

60,10 ± 26,60 *

1,52 ± 0,14

2,83 ± 2,06

1,82 ± 22,79

2,87 ± 1,00

6,25 ± 1,47



6,54 ± 0,18



43,01 ± 20,31

36,96 ± 0,69

Eosinófilos

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-

-/-

IL-10

-/-

22,71 ± 13,67 *

18,76 ± 4,91 *

11,93 ± 4,13 *

10,69 ± 0,96 *

1,06 ± 0,29



19,00 ± 1,25

16,56 ± 9,58

Camundongos C57BL/6 selvagens, IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

(n = 5 animais por grupo

experimental) foram imunizados com duas doses de OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via

intraperitoneal e desafiados por via intranasal com as mesmas doses de antígeno e, no dia 23,

o LBA foi recuperado para contagem celular. A migração celular foi avaliada pela contagem total

e diferencial de leucócitos e o número de células expresso é multiplicado por 10

células/mL.

NI – não foi encontrada nenhuma célula nos campos observados.

(

) p< 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

()

p< 0,05 em relação ao grupo OVA

4.2.2 Determinação da atividade de EPO

A presença de EPO foi investigada em amostras de LBA e de HP de animais

deficientes de IL-12, IFN-γ e IL-10, imunizados e desafiados com OVA, PAS-1 ou OVA

+ PAS-1.

Nos animais imunizados com OVA, a atividade de EPO foi significativamente

maior em relação ao controle (PBS), tanto no LBA quanto no HP (Figura 5). Os animais

imunizados com PAS-1 não apresentaram aumento da atividade de EPO, nem no LBA

nem no HP, mostrando que a proteína PAS-1 não induz a migração eosinofílica

pulmonar. Quando os animais deficientes de IL-12 receberam simultaneamente OVA e

PAS-1, foi observada uma acentuada diminuição da atividade de EPO em relação ao

grupo OVA, apresentando níveis semelhantes ao grupo controle (PBS). Estes

resultados foram também obtidos com animais selvagens (Figura 2), indicando que IL-

12 não desempenha papel relevante na atividade supressiva de PAS-1 em relação à

migração eosinofílica, tanto no tecido pulmonar quando no lavado broncoalveolar. Já

nos animais IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

, ao contrário dos animais selvagens (Figura 2) observamos

que a imunização simultânea com OVA e PAS-1 não alterou a atividade de EPO em

relação ao grupo OVA, mostrando que estas citocinas (IFN-γ e IL-10) desempenham

papel relevante na atividade imunomodulatória de PAS-1.

0 1 2 3 4 5

EPO

(absorbância a 492 nm)



Imunização e desafio:

OVA +PAS-1

PAS-1

OVA

PBS

0 1 2 3 4



EPO

(absorbância a 492 nm)

Figura 5 – Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na atividade de EPO em

camundongos C57Bl/6 IL-12

-/-

, IFN-

-/-

e IL-10

-/-

A presença de EPO foi avaliada no lavado broncoalveolar (A) e no

homogenato pulmonar (B) de camundongos C57BL/6 selvagens ( ) IL-12

-/-

( ), IFN-γ

-/-

( ) e IL-10

-/-

( ) imunizados com duas doses de OVA (50 µg)

e/ou PAS-1 (300µg) por via intraperitoneal e desafiados por via intranasal

com as mesmas doses de antígeno. No dia 23 após o início da imunização, o

LBA e o HP foram obtidos para pesquisa da atividade de EPO. Os resultados

foram expressos como média ± desvio-padrão das absorbâncias medidas a

492 nm (n= 5 animais por grupo experimental). O grupo controle consistiu de

camundongos não imunizados, que receberam apenas PBS.

( * ) p < 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

(



) p < 0,001 em relação ao grupo OVA.

4.2.3 Determinação do perfil de citocinas e quimiocinas

Para verificar a participação de IL-12, IFN-γ e IL-10 no efeito modulatório de

PAS-1 com relação à produção de citocinas, os níveis de IL-4, IL-5, IL-13, eotaxina,

IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β foram quantificados por ensaio imunenzimático (ELISA)

utilizando amostras de LBA e HP de animais deficientes de IL-12, IFN-γ e IL-10

imunizados com OVA, PAS-1 ou OVA+PAS-1.

Pelos resultados apresentados nas Tabelas 4 e 5, observamos que independente

das características genéticas dos animais, os níveis de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina

foram significativamente maiores nas amostras do LBA e no HP de animais imunizados

com OVA, comparados ao grupo controle. Por outro lado, não observamos a indução

da produção de IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β, cujas concentrações foram semelhantes ao

grupo controle (PBS), tanto no LBA (Tabela 4) quanto no HP (Tabela 5). Estes

resultados são muito semelhantes aos observados com animais selvagens (Tabela 2).

Nos animais deficientes de IL-12, imunizados com OVA e PAS-1, houve uma

supressão acentuada dos níveis de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina com relação ao grupo

OVA (chegando a níveis comparáveis ao grupo controle). Contudo, com relação à

produção de IFN-γ, IL-10 e TGF-β, observamos que a presença de PAS-1 induziu um

aumento significativo da concentração destas citocinas, tanto no LBA (Tabela 4) quanto

no HP (Tabela 5), comparando-se ao grupo OVA ou grupo controle (PBS), sendo estes

valores semelhantes ao grupo imunizado apenas com PAS-1. Estes resultados também

se assemelharam aos observados com animais selvagens (Tabela 2).

Nos animais deficientes de IFN-γ e IL-10, que foram imunizados com OVA +

PAS-1, os níveis de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina foram significativamente maiores em

comparação com o controle (PBS), não diferindo do grupo OVA. Entretanto, nos

animais IL-12

-/-

, estes valores foram significantemente inferiores comparados ao grupo

OVA e semelhantes aos grupos que receberam somente PAS-1 ou PBS. Com relação

às concentrações de IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β, observamos um aumento significativo

em relação ao controle ou ao grupo OVA (valores semelhantes ao grupo PAS-1), com

exceção das respectivas citocinas correspondentes à deficiência genética dos animais.

Estes resultados foram observados tanto no LBA (Tabela 4) quanto no HP (Tabela 5).

Em conjunto, estes dados indicam que o efeito modulador de PAS-1 na secreção

de IL-4, IL-5, IL-13, eotaxina deve ser mediado por IFN-γ e IL-10, mas depende de IL-

12. Os animais deficientes de IL-12, IFN-γ e IL-10, quando co-administrados com OVA +

PAS-1, apresentaram aumento na produção de IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β, exceto nos

animais deficientes destas citocinas, mostrando que PAS-1 age aumentando a

secreção destas citocinas, como observado nos animais selvagens.

Tabela 4 - Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na produção de citocinas no LBA

IL-4

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-γ

-/-

IL-10

-/-

8,14 ± 0,81

29,99 ± 6,11

2,87±4,11

8,32±0,83

62,37 ± 18,33*

212,08± 7,57 *

154,86 ± 21,56 *

79,69 ± 2,92 *

6,46 ± 1,22

2,31± 2,1

5,91± 2,96

7,18 ±1,50

3,45 ± 2,45



26,27 ± 31,18



139,38 ± 29,65

71,00 ± 16,92

IL-5

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-γ

-/-

IL-10

-/-

9,22 ± 0,51

5,37±0,71

6,66±1,00

9,50±0,32

79,63 ± 15,31*

131,37 ± 97,55 *

130,49 ± 18,03 *

95,54 ± 3,01 *

6,59 ± 2,67

5,6 ± 0,69

4,14 ± 1,93

9,68 ± 0,11

5,71 ± 2,24



5,4 ± 2,13



148,53 ± 21,92

93,42 ± 4,04

IL-13

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

4,67 ± 1,89

3,09±1,22

3,36±2,30

2,98±3,19

232,269 ± 132,11*

236,39 ±128,22 *

160,39 ± 11,43 *

127,91 ± 38,66 *

5,32 ± 3,55

2,99 ± 0,54

2,61 ± 0,70

4,46 ± 3,81

5,03 ± 2,96



3,66 ± 0,52



141,54 ± 19,79

126,22 ± 16,19

eotaxina

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

2,49 ± 1,43

2,61±0,64

1,45±0,42

6,77±3,98

505,56 ± 112,36*

183,59 ± 80,84 *

107,76 ± 37,81*

146,98 ± 30,12 *

4,32 ± 1,60

1,84 ± 0,73

4,04 ± 3,89

6,54 ± 3,78

2,76 ± 2,34



1,66 ± 0,94



83,19 ± 39,02

89,35 ± 42,53

IL-12

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

3,47 ± 1,00

< 3,19

3,21±3,29

2,49±0,76

4,29 ± 1,08

< 3,19

3,59 ± 2,19

6,67 ± 8,24

72,74 ± 24,39*

< 3,19

105,69 ±7,79 *

74,38 ± 23,04 *

79,55 ± 19,19

< 3,19

103,67 ± 6,03

99,56 ± 0,52

IFN-γ

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

3,96 ± 2,67

4,68±3,62

< 3,19

4,76±2,57

2,22 ± 0,67

6,22 ± 2,72

< 3,19

3,49 ± 2,27

187,17 ± 89,63

507,91 ± 313,93 *

< 3,19

199,37 ± 37,85 *

237,40 ± 135,64

356,23 ± 12,36

< 3,19

184,27 ± 48,06

IL-10

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

2,16 ± 0,40

3,51±0,56

3,89±0,54

< 3,19

2,95 ± 2,24

3,49 ± 0,15

3,82 ± 0,61

< 3,19

333,60 ±

100,02*

258,36 ±

31,88 *

263,67 ±

97,83 *

< 3,19

369,58 ±

162,39

189,63 ± 52,29

276,33 ± 139,23

< 3,19

TGF-β

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

2,00 ± 0,19

2,61±2,04

2,91±0,85

3,38±1,19

3,46 ± 1,19

2,81 ± 0,99

4,28 ± 3,89

6,18 ± 2,39

356,63 ±

98,69*

314,71 ±

173,73 *

148,37 ±

61,49 *

220,85 ±

317,46 ± 79,63

302,57 ± 113,80

141,06 ± 46,79

183,96 ± 22,39

PBS OVA PAS-1 OVA + PAS-1

44,86 *

de animais C57Bl/6 IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

e IL-10

Perfil de citocinas e quimiocinas produzidas por células do lavado broncoalveolar (LBA)

e do homogenato pulmonar (HP) de camundongos C57Bl/6 selvagens, IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

IL-10

-/-

imunizados com duas doses de OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via

intraperitoneal e desafiados por via intranasal com as mesmas doses de antígeno. No

dia 23 após o início da imunização, o LBA e o HP foram obtidos para dosagem das

citocinas. Os resultados foram expressos como média + desvio-padrão em pg/mL de

citocina (n = 5 animais por grupo experimental). O grupo controle consistiu de

camundongos não imunizados, que receberam apenas PBS.

(*) p < 0,01 em relação ao grupo controle (PBS) e () p < 0,01 em relação ao grupo

OVA.

Tabela 5 - Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na produção de citocinas no

HP de animais C57Bl/6 IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

PBS OVA PAS-1 OVA + PAS-1

IL-4

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-γ

-/-

IL-10

-/-

8,34 ± 0,68

0,78 ± 0,53

1,14 ± 0,02

5,71 ± 2,78

39,88 ± 8,75*

10,24 ± 0,92 *

79,82 ± 24,84

73,32 ± 9,87 *

7,08 ± 1,44

0,78 ± 0,52

2,86 ± 2,78

8,03 ± 0,73

7,15 ± 1,08

0,92 ± 0,11

90,78 ± 0,27

80,42 ± 5,03

IL-5

Selvagem

IL-12

-/-

IFN-γ

-/-

IL-10

-/-

8,55 ± 0,28

2,03 ± 1,26

1,62 ± 0,17

9,13 ± 0,39

45,83 ± 7,61*

25,22 ± 11,14

91,32 ± 6,92 *

96,09 ± 1,72 *

8,80 ± 0,98

2,04 ± 0,54

2,76 ± 0,53

9,22 ± 0,44

7,58 ± 3,59

2,35 ± 0,38

82,63 ± 10,03

81,39 ± 18,85

IL-13

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

2,91 ± 3,78

6,27 ± 7,68

6,06 ± 1,25

4,79 ± 3,39

153,91 ±

10,67

156,38 ±

98,56 *

37,49 ± 16,56

120,94 ±

13,49 *

4,35 ± 2,28

2,99 ± 1,89

5,43 ± 0,11

4,75 ± 1,66

4,06 ± 2,23

4,17 ± 1,99

31,61 ± 16,34

99,75 ± 25,89

eotaxina

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

5,14 ± 3,19

3,33 ± 2,53

0,99 ± 0,73

3,22 ± 1,55

172,97 ±

75,65*

35,04 ± 18,28

44,41 ± 15,28

141,47 ±

28,89 *

2,82 ± 2,13

5,04 ± 3,69

3,45 ± 2,41

3,43 ± 3,29

3,64 ± 3,09

2,23 ± 1,10

56,04 ± 7,27

99,92 ± 53,67

IL-12

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

3,39 ± 1,46

< 3,19

3,56 ± 3,93

3,02 ± 0,14

2,87 ± 0,56

< 3,19

4,68 ± 3,39

3,83 ± 1,15

79,62 ±

16,02*

< 3,19

76,72 ± 25,44

57,43 ± 28,45

72,59 ±

17,20

< 3,19

94,41 ± 8,01

45,49 ± 8,92

IFN-γ

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

4,04 ± 2,15

2,82 ± 1,90

< 3,19

3,23 ± 3,46

2,20 ± 0,49

4,93 ± 4,14

< 3,19

4,60 ± 2,88

99,69 ± 11,71*

274,52 ±

68,45 *

< 3,19

171,18 ±

21,47 *

165,98 ±

77,21

258,78 ±

112,58

< 3,19

136,87 ±

33,83

IL-10

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

IL-10-/-

2,52 ± 2,71

2,88 ± 1,16

3,86 ± 0,69

< 3,19

1,48 ± 0,33

3,43 ± 0,73

4,13 ± 0,32

< 3,19

168,62 ±

63,68*

178,55 ±

82,09 *

164,40 ±

98,11 *

< 3,19

157,42 ±

49,66

248,79 ±

145,09

249,33 ±

125,92

< 3,19

TGF-β

Selvagem

IL-12-/-

IFN-γ-/-

3,32 ± 1,14

4,32 ± 0,99

1,49 ± 0,37

3,13 ± 0,96

3,47 ± 1,84

1,88 ± 1,37

189,66 ±

100,00*

270,83 ±

138 35 *

158,45 ±

71,42

236,07 ±

Perfil de citocinas e quimiocinas produzidas por células do lavado broncoalveolar (LBA)

e do homogenato pulmonar (HP) de camundongos C57Bl/6 selvagens, IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

IL-10

-/-

imunizados com duas doses de OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via

intraperitoneal e desafiados por via intranasal com as mesmas doses de antígeno. No

dia 23 após o início da imunização, o LBA e o HP foram obtidos para dosagem das

citocinas. Os resultados foram expressos como média + desvio-padrão em pg/mL de

citocina (n = 5 animais por grupo experimental). O grupo controle consistiu de

camundongos não imunizados, que receberam apenas PBS.

(*) p < 0,01 em relação ao grupo controle (PBS) e () p < 0,01 em relação ao grupo

OVA.

4.2.5 Reatividade das vias aéreas

Para verificar a participação de IL-12, IFN-γ e IL-10 no efeito modulatório de

PAS-1 referente aos parâmetros da reatividade das vias aéreas (condutância e

complacência), camundongos deficientes destas citocinas foram imunizados e

desafiados com OVA e/ou PAS-1. Os animais foram anestesiados, canulados e

submetidos à ventilação mecânica em um plestismógrafo. Os dados de volume e

pressão traqueal foram obtidos em diferentes períodos de tempo após a infusão das

doses de metacolina. Estes dados foram utilizados para calcular a condutância (Grs) e

a complacência (Crs).

Na figura 6, está representado o logaritmo da dose de metacolina necessária

para promover uma redução de 50% e 40% nos valores basais (obtidos após infusão de

solução salina) de condutância (Grs) e complacência (Crs), respectivamente.

Observa-se que o logaritmo da dose de metacolina que reduz em 50% dos

valores basais da condutância (Figura 6A) foi significativamente menor para o grupo

de animais deficientes de IL-12, imunizados e desafiados com OVA + PAS-1, em

comparação com os animais que receberam somente OVA (p < 0,001). Estes

resultados se assemelham àqueles referentes aos animais selvagens. Por outro lado,

o logaritmo da dose de broncoconstrictor capaz de reduzir os valores basais da

condutância nos animais deficientes de IFN-γ e IL-10, imunizados e desafiados com

OVA e/ou PAS-1 não diferiu dos animais imunizados com OVA.

Em relação à complacência, o logaritmo da dose de metacolina que reduz em

40% os valores da complacência (Crs) nos camundongos deficientes de IL-12, IFN-γ e

IL-10 que receberam OVA + PAS-1 não foi significativamente diferente dos valores da

dose de metacolina requerida pelos animais imunizados e desafiados com OVA.

Em conjunto, estes resultados referentes à reatividade das vias aéreas indicam

que PAS-1 foi capaz de aumentar a condutância das vias aéreas dos animais

deficientes de IL-12, diminuindo assim a resistência de condutividade do fluxo aéreo, o

que caracterizou os animais que receberam OVA. Entretanto, em relação aos animais

deficientes de IFN-γ e IL-10, a condutância do ar estava aumentada, indicando a

participação destas citocinas diminuição da resistência à passagem do ar nos

bronquíolos. Em relação à complacência, a proteína PAS-1 não interferiu nas

propriedades elásticas do tecido pulmonar em nenhum dos modelos animais utilizados

neste estudo.

0 1 2 3 4

Grs

ED50%

Imunização e desafio:

OVA +PAS-1

PAS-1

OVA

PBS

0 1 2 3 4 5

Crs

ED40%

Figura 6 – Efeito da imunização com OVA e/ou PAS-1 na reatividade das vias

aéreas em camundongos C57BL/6 IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

Os parâmetros condutância (Grs) aérea (A) e complacência (Crs) do

tecido pulmonar (B) foram medidos em camundongos C57BL/6 selvagens (

), IL-12

-/-

( ), IFN-γ

-/-

( ) IL-10

-/-

( ) imunizados com duas doses de

OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg) por via intraperitoneal e desafiados por via

intranasal com as mesmas doses de antígeno (n= 5 animais por grupo

experimental). No dia 23 após o início da imunização, os dados de volume e

pressão traqueal foram medidos após infusão de doses crescentes de

metacolina. O gráfico apresenta a média dos valores do logaritmo da dose de

metacolina necessária para reduzir os valores basais (obtidos após infusão

de solução salina) de condutância (Grs) e complacência (Crs),

respectivamente, em 50% e 40%. O grupo controle consistiu de

camundongos não imunizados, que receberam apenas PBS.

(*) p < 0,001 em relação ao grupo controle (PBS).

4.3 Papel de células CD19+, B220+, CD3+, CD8+, CD4+, CD4+CD25- e

CD4+CD25+ (células T regulatórias) na ação modulatória de PAS-1

O papel de células CD19

, B220

, CD3

, CD8

, CD4

CD25

e CD4

CD25

(células T reguladoras) na ação modulatória de PAS-1 foi investigado em animais

C57BL/6 selvagem, previamente imunizados com OVA que receberam por transferência

adotiva, tipos diferentes de linfócitos isolados de órgãos linfóides de camundongos

imunizados com PAS-1. A participação destas células na modulação da resposta imune

foi avaliada pela produção sérica de anticorpos IgG1 anti-OVA, IgE total por ELISA e

IgG1 anafilático anti-OVA e IgE anti-OVA por PCA, contagem total e diferencial de

células (LBA), presença de EPO (LBA e HP), perfil das citocinas IL-4, IL-5, IL-13, IL-12,

IFN-γ, IL-10, TGF-β e da quimiocina eotaxina (LBA e do HP).

4.3.1 Resposta imune humoral

A resposta imune humoral foi investigada pela produção de anticorpos IgG1 anti-

OVA e IgE total por ELISA e de anticorpos anafiláticos IgG1 e IgE anti-OVA pela técnica

de PCA no soro de animais C57Bl/6 imunizados com OVA e que receberam por via

endovenosa, linfócitos purificados PAS-1-primados.

Pelos resultados apresentados na figura 7, observamos, como já relatado,

que animais imunizados e desafiados com OVA produzem quantidades

significativas, não apenas de anticorpos anti-OVA (IgE e IgG1), mas também há

um aumento substancial dos níveis séricos de imunoglobulinas da classe IgE (IgE

total).

Com relação à transferência de células PAS-1 primadas, observamos que

das células testadas somente os linfócitos CD8+ ou CD4+CD25+ foram capazes

de suprimir totalmente a produção dos anticorpos. Os animais que receberam os

demais tipos celulares (CD19+, B220+, CD3+, CD4+ ou CD4+CD25-) apresentaram

concentrações séricas de anticorpos anti-OVA (Figura 7A, C e D) e IgE total

(Figura 7B) estatisticamente significantes em relação ao controle (PBS), mas não

diferiram dos animais apenas imunizados com OVA.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0



IgG1 anti-OVA

(absorbância a 492 nm)

Imunização Transferência adotiva

PBS -

OVA -

OVA CD19

OVA B220

OVA CD3

OVA CD8

OVA CD4

CD25

OVA CD4

CD25

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50



IgE total

(absorbância a 492 nm)

0 25 50 75 100

IgG1 anti-OVA

(Título de PCA)

Imunização Transferência adotiva

PBS -

OVA -

OVA CD19

OVA B220

OVA CD3

OVA CD8

OVA CD4

CD25

OVA CD4

CD25

0 10 20 30 40 50

IgE anti-OVA

(Título de PCA)

Figura 5 – Efeito da transferência adotiva de células na produção de anticorpos

por camundongos C57BL/6 selvagens imunizados com OVA.

Os níveis séricos de IgG1 anti-OVA (A), IgE total (B) e anticorpos anafiláticos

IgG1 anti-OVA (C) e IgE anti-OVA (D) em soros de camundongos imunizados com OVA

(50 µg) que receberam diferentes clones de linfócitos PAS-1-primados (conforme

indicado na figura). No dia 23 após o início da imunização, o soro dos animais foi obtido

para pesquisa dos anticorpos. Os anticorpos IgG1 e IgE total foram dosados por ensaio

imunoenzimático (ELISA) e os resultados das absorbâncias apresentadas nos gráficos

foram expressos como média ± desvio padrão das absorbâncias obtidas na diluição

sérica de 1:20 (n= 5 animais por grupo experimental). Os anticorpos anafiláticos IgG1

pool de soros por grupo experimental. O grupo controle consistiu de camundongos não

imunizados, que receberam apenas PBS.

(*) p < 0,001 em relação ao controle (PBS).

(♦) p < 0,001 em relação ao grupo OVA.

(+) significativo em relação ao controle (PBS).

(#) significativo em relação ao grupo OVA.

4.3.2 Quantificação da celularidade do LBA

O efeito de diferentes tipos celulares PAS-1-primados (CD19

, B220

, CD3

CD8

, CD4

CD25

, CD4

CD25

) sobre a inflamação alérgica pulmonar

induzida por OVA foi analisada pela quantificação da migração celular

(quantitativa e qualitativa) no lavado broncoalveolar.

Os resultados apresentados na Tabela 6 mostram, como já demonstrado

anteriormente (Tabela 1), que a imunização com OVA induz uma intensa inflamação

alérgica pulmonar, caracterizada pelo acúmulo leucocitário no LBA, composto

principalmente de eosinófilos, linfócitos e macrófagos, mas não neutrófilos.

Com relação à participação dos diferentes tipos celulares na imunomodulação

induzida por PAS-1 observamos que, de todas as células testadas, apenas os linfócitos

TCD8

e TCD4

CD25

foram capazes de induzir uma significativa supressão (redução

de 87,42% e 86,31%, respectivamente) da migração celular comparado com o grupo

apenas imunizado com OVA (OVA / -). PAS-1 também suprimiu o influxo de

macrófagos, linfócitos e eosinófilos nos animais que receberam células T TCD8

(respectivamente, redução de 86,40%, 87,10% e 100%) e TCD4

CD25

(respectivamente, redução de 82,99%, 86,87%, 100%).

O número de células (com exceção de neutrófilos) no LBA de animais que

receberam transferência adotiva de linfócitos CD19

, B220

, CD3

, CD4

CD25

foi significativamente maior que no grupo controle (PBS / -), mas não diferiu do grupo

OVA (OVA / -).

Tabela 6 - Efeito da transferência adotiva de células na migração leucocitária no

LBA de camundongos C57BL/6 selvagens imunizados com OVA

Células

totais

Macrófagos Neutrófilos Linfócitos Eosinófilos

PBS / -

9,02 ± 0,92 4,47± 0,17 0,06 ± 0,04 4,49 ± 2,32 NI

OVA / - 99,18 ± 6,85 * 41,11 ± 11,84 *

0,41 ± 0,23

47,37 ± 8,03 * 10,29 ± 2,37

OVA / CD19

100,09 ± 12,5 * 40,96 ± 1,55 * 0,23 ± 0,12 47,67 ± 14,74 * 11,23 ± 1,29

OVA / B220

83,82 ± 10,56 * 35,82 ± 8,79 * 0,57 ± 0,47 35,49 ± 5,75 * 11,94 ± 1,56

OVA / CD3

74,87 ± 0,54 * 35,16 ± 6,63 * 0,21 ± 0,18 29,76 ± 15,21 * 9,74 ± 1,75

OVA / CD8

12,47 ± 1,16 5,59 ± 2,34

0,77 ± 0,71

6,11 ± 2,46 NI

OVA / CD4

61,49 ± 7,45 * 30,23 ± 2,55 * 0,32 ± 0,16 20,89 ± 17,39 * 10,05 ± 1,03

OVA/

CD4

CD25

84,83 ± 0,75 * 41,49 ± 14,81 * 0,47 ± 0,37 31,72 ± 20,66 * 11,15 ± 1,22

OVA/

CD4

CD25

13,58 ± 1,58 6,99 ± 5,96

0,37 ± 0,42

6,22 ± 1,05 NI

Camundongos C57BL/6 (n = 5 animais por grupo experimental) foram imunizados com

duas doses de OVA (50 µg) por via intraperitoneal e desafiados por via intranasal com a

mesma dose de antígeno. Os animais receberam por transferência adotiva, diferentes

tipos celulares obtidos de animais imunizados com PAS-1. No dia 23, o LBA foi

recuperado para contagem celular. A migração celular foi avaliada pela contagem total

e diferencial de leucócitos e o número de células expresso é multiplicado por 10

células/mL.

NI – não foi encontrada nenhuma célula nos campos observados.

(*) p< 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

()

p< 0,05 em relação ao grupo OVA

4.3.3 Investigação da presença de EPO

A presença de eosinófilos também foi verificada pela quantificação de EPO no

lavado broncoalveolar (Figura 8A) e no homogenato pulmonar (Figura 8B), através de

sua atividade enzimática. Observamos que a imunização com OVA induz um aumento

da atividade de EPO, tanto no LBA quanto no HP comprovando, de maneira indireta, a

presença de eosinófilos nestes dois compartimentos, como já demonstrado

anteriormente (Figura 2). Nos animais que receberam transferência adotiva de

linfócitos CD19+, B220+, CD3+, CD4+, CD4+CD25-, foi verificado um aumento na

quantidade de EPO em comparação com controle (PBS) (p < 0,001), mas não diferente

dos animais imunizados e desafiados com OVA (grupo OVA/-), tanto no LBA quanto no

homogenato pulmonar. Por outro lado, nos animais que receberam linfócitos TCD8+ ou

células T CD4+CD25+, a quantidade de EPO não foi diferente do controle (PBS/-), ou

seja, foi significantemente suprimida em relação ao grupo OVA.

0 1 2 3 4



EPO

(absorbância a 492 nm)

Imunização Transferência adotiva

PBS -

OVA -

OVA CD19

OVA B220

OVA CD3

OVA CD8

OVA CD4

CD25

OVA CD4

CD25

0 1 2 3 4



EPO

(absorbância a 492 nm)

Figura 8 – Efeito da transferência adotiva na atividade de EPO em

camundongos C57BL/6 selvagens imunizados com OVA.

A presença de EPO foi avaliada no lavado broncoalveolar (A)

e no homogenato pulmonar (B) de camundongos C57BL/6

imunizados com duas doses de OVA (50 µg) e por via

intraperitoneal e desafiados por via intranasal com a mesma

doses de antígeno. Os animais receberam por transferência

adotiva, diferentes tipos celulares obtidos de animais

imunizados com PAS-1. No dia 23 após o início da

imunização, o LBA e o HP foram obtidos para pesquisa da

atividade de EPO. Os resultados foram expressos como

média ± desvio-padrão das absorbâncias medidas a 492 nm

(n= 5 animais por grupo experimental). O grupo controle

consistiu de camundongos não imunizados, que receberam

apenas PBS.

( * ) p < 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

() p < 0,001 em relação ao grupo OVA.

4.3.4 Determinação do perfil de citocinas

A participação de diferentes tipos de linfócitos (CD19

, B220

, CD3

, CD4

CD4

CD25

, CD8

, CD4

CD25

) na modulação induzida por PAS-1 sobre a reação

anafilática pulmonar foi também avaliada pelo perfil de citocinas e eotaxina

secretadas por células do LBA e HP de animais previamente imunizados com

OVA e transferidos com células PAS-1-primadas.

Pelos resultados apresentados na Tabela 7, observamos que os níveis de

IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina foram significativamente maiores tanto no LBA quanto

no HP dos animais que receberam transferência de linfócitos CD19

, B220

, CD3

CD4+, CD4

CD25

em comparação com o controle (PBS/-), valores estes que não

diferiram dos animais imunizados e desafiados com OVA, que não receberam

células (OVA/-). Estes resultados mostram que estes tipos celulares não

participam dos mecanismos modulatórios de PAS-1. Por outro lado, as células

TCD8

e TCD4

CD25

, provenientes de animais imunizados com PAS-1, induziram

uma acentuada supressão nos níveis de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina, tanto no LBA

quanto no HP, comparado com os animais também imunizados com OVA, mas

que não receberam células (grupo OVA/-), demonstrando a participação destas

células na imunomodulação induzida por PAS-1.

De uma maneira geral, os resultados encontrados no LBA e HP para um

mesmo grupo experimental, foram muito semelhantes, com exceção de IL-4 onde

alguns grupos apresentaram valores inferiores no HP quando comparado com

LBA (PBS/-; OVA/-; OVA/CD19

; OVA/CD3

; OVA/CD8

; OVA/CD4

CD45

OVA/CD4

CD45

Com relação às citocinas IL-12, IFN-, IL-10 e TGF-Tabela 8, observamos,

conforme já mostrado anteriormente (Tabela 2), que o protocolo de imunização

utilizado (OVA+hidróxido de alumínio) não favorece a produção e secreção destas

citocinas no LBA e HP, visto que os resultados encontrados no grupo OVA/- não

foram diferentes dos resultados encontrados no grupo controle (PBS/-) (Tabela 8).

O mesmo efeito foi observado nos animais imunizados com OVA que receberam

células CD19

, B220

, CD3

, CD4

CD25

, ou seja, não foram encontradas

quantidades significativas de IL12, IFN-, IL-10 e TGF- no LBA e HP destes

animais. Em contrapartida, os animais que receberam linfócitos T CD8

apresentaram quantidades de IFN-, no LBA e HP, aproximadamente 10 vezes

superiores comparado com os demais grupos. A transferência de células T

reguladoras CD4+CD25+ de animais imunizados com PAS-1 para animais

imunizados com OVA levou a um aumento substancial na concentração de IL-10 e

TGF-, tanto no LBA quanto no HP, comparado com os demais grupos.

Tabela 7 – Importância de diferentes tipos celulares PAS-1-primados na

modulação da produção de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina no LBA e HP de

camundongos imunizados com OVA.

IL-4 IL-5 IL-13 eotaxina

PBS / -

LBA

25,14 ± 11,43

3,74 ± 1,69

20,8 ± 10,71

17,28 ± 2,71

19,06 ± 11,47

18,58 ± 6,12

14,96 ± 9,11

25,6 ± 2,50

OVA / -

LBA

42,37 ± 36,46*

79,03 ± 13,79 *

146,3 ± 49,16 *

145,83 ± 56,53 *

65,62 ± 54,35 *

90,58 ± 49,69 *

197,13 ± 44,40 *

152,33 ± 17,62 *

OVA / CD19

LBA

60,21 ± 45,82*

82,66 ± 23,75 *

141,75 ± 2,63 *

145,77 ± 10,00 *

80,21 ± 53,75 *

185,33 ± 5,84 *

135,06 ± 8,84 *

128,67 ± 35,00 *

OVA / B220

LBA

142,8 ± 46,48 *

92,11 ± 11,67 *

123,2 ± 23,10 *

135,43 ± 20,04 *

82,84 ± 19,67 *

62,24 ± 12,77 *

176,3 ± 50,39 *

139,56 ± 15,24 *

OVA / CD3

LBA

140,8 ± 28,43 *

98,95 ± 1,87 *

128,00 ± 37,28 *

149,57 ± 5,93 *

180,80 ± 47,73 *

196,11 ± 5,88 *

106,99 ± 86,59 *

157,33 ± 45,53 *

OVA / CD8

LBA

24,61 ± 8,44

1,79 ± 0,68

37,85 ± 55,49

19,29 ± 6,24

24,65 ± 12,71

22,03 ± 2,28

67,50 ± 90,53

20,19 ± 8,58

OVA / CD4

LBA

75,97 ± 64,33 *

68,56 ± 18,59 *

139,92 ± 77,16 *

161,39 ± 15,61 *

55,97 ± 38,55 *

165,06 ± 21,38 *

183,85 ± 19,96 *

145,67 ± 37,54 *

CD25

LBA

147,8 ± 24,22 *

82,03 ± 26,81 *

133,6 ± 53,34 *

135,43 ± 19,34 *

71,50 ± 58,63 *

175,06 ± 26,10 *

160,5 ± 97,19 *

126,33 ± 25,69 *

CD25

LBA

37,13 ± 14,09

3,92 ± 1,49

42,60 ± 61,19

19,42 ± 4,04

17,36 ± 2,70

22,47 ± 2,83

14,73 ± 5,02

17,33 ± 6,81

Camundongos C57BL/6 selvagens, IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

(n = 5 animais por grupo

experimental) foram imunizados com duas doses de OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg)

por via intraperitoneal e desafiados por via intranasal com as mesmas doses de

antígeno. Os animais receberam por transferência adotiva, diferentes tipos celulares

obtidos de animais imunizados com PAS-1. No dia 23, o LBA foi recuperado para

contagem celular. A migração celular foi avaliada pela contagem total e diferencial de

leucócitos e o número de células expresso é multiplicado por 10

células/mL.

100

NI – não foi encontrada nenhuma célula nos campos observados.

(*) p< 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

()

p< 0,05 em relação ao grupo OVA.

Tabela 8 – Importância de diferentes tipos celulares PAS-1-primados na modulação da

produção de IL-12, IFN-, IL-10 e TGF- de animais imunizados com OVA.

IL-12

IFN-γ

IL-10

TGF-β

PBS / -

LBA

21,57 ± 0,70

23,45 ± 2,49

28,33 ± 30,04

17,25 ± 5,82

12,18 ± 3,77

14,81 ± 4,7

10,39 ± 6,39

24,18 ± 1,28

OVA / -

LBA

21,97 ± 2,3

19,25 ± 7,44

18,22 ± 13,52

23,56 ± 6,96

22,95 ± 2,24

15,53 ± 3,72

18,59 ± 2,87

19,73 ± 6,83

OVA / CD19

LBA

18,69 ± 6,02

13,86 ± 3,12

21,25 ± 6,89

15,28 ± 0,97

16,13 ± 3,87

19,86 ± 6,04

17,06 ± 0,72

13,66 ± 2,25

OVA / B220

LBA

12,79 ± 1,92

14,26 ± 0,26

18,19 ± 4,92

17,78 ± 6,76

24,40 ± 5,77

15,98 ± 8,19

9,48 ± 7,02

13,56 ± 2,18

OVA / CD3

LBA

14,92 ± 4,47

13,48 ± 4,77

18,79 ± 5,15

17,35 ± 1,92

20,20 ± 6,26

16,12 ± 3,99

14,87 ± 14,16

11,91 ± 2,31

OVA / CD8

LBA

14,34 ± 4,13

10,61 ± 3,52

171,8 ± 26,9

150,19 ± 2,51

19,12 ± 18,16

17,34 ± 5,79

12,03 ± 6,17

17,15 ± 5,40

OVA / CD4

LBA

16,88 ± 3,07

11,13 ± 5,94

16,09 ± 2,19

26,54 ± 6,96

20,48 ± 6,09

19,96 ± 1,16

14,18 ± 3,71

14,02 ± 1,49

CD25

LBA

13,93 ± 2,37

8,29 ± 2,34

14,40 ± 1,94

17,42 ± 6,96

21,60 ± 16,49

23,29 ± 2,69

20,94 ± 50,90

8,88 ± 3,69

CD25

LBA

14,22 ± 1,76

15,32 ± 5,86

21,29 ± 5,23

22,85 ± 12,04

179,2 ±

58,93

141,46 ±

13,37

169,39 ±

42,19

162,30 ±

16,69

Camundongos C57BL/6 selvagens, IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

(n = 5 animais por grupo

experimental) foram imunizados com duas doses de OVA (50 µg) e/ou PAS-1 (300µg)

por via intraperitoneal e desafiados por via intranasal com as mesmas doses de

antígeno. Os animais receberam por transferência adotiva, diferentes tipos celulares

obtidos de animais imunizados com PAS-1. No dia 23, o LBA foi recuperado para

101

contagem celular. A migração celular foi avaliada pela contagem total e diferencial de

leucócitos e o número de células expresso é multiplicado por 10

células/mL.

NI – não foi encontrada nenhuma célula nos campos observados.

(*) p< 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

()

p< 0,05 em relação ao grupo OVA.

4.3.5 Reatividade das vias aéreas

Para investigar o efeito dos diferentes tipos celulares PAS-1 primados (CD19

B220

, CD3

, CD4

CD25

, CD8

, CD4

CD25

) na reatividade das vias aéreas

induzida por OVA, animais que receberam transferência adotiva destas células foram

anestesiados, canulados e mantidos sob ventilação mecânica em um pletismográfo. Os

dados de volume e pressão traqueal foram obtidos após a infusão de metacolina e

foram em seguida usados para calcular a condutância (Grs) e a complacência (Crs).

Na figura 9, está representado o logaritmo da dose de metacolina necessária

para reduzir a 50% da condutância e 40% da complacência em relação aos valores

basais (obtidos após a infusão de solução salina).

O logaritmo da dose de metacolina capaz de reduzir 50% da condutância foi

significativamente maior nos animais que receberam transferência adotiva de células

CD8+ e CD4+CD25+ em relação aos animais que receberam PBS (OVA/-). Por outro

lado, o logaritmo da dose de metacolina que reduz 40% da complacência não diferiu em

nenhum dos grupos de animais estudados.

Desta maneira, estes resultados demonstram que somente as células T CD8+ e

CD4+CD25+ (células T reguladoras) PAS-1 primadas foram capazes de aumentar a

102

condutância do fluxo aéreo nos bronquíolos, mas não interferiram com a complacência

do tecido pulmonar.

0 1 2 3 4



Grs

ED50%



Imunização Transferência adotiva

PBS -

OVA -

OVA CD19

OVA B220

OVA CD3

OVA CD8

OVA CD4

CD25

OVA CD4

CD25

0 1 2 3 4

Crs

ED40%

Figura 9 – Efeito da transferência adotiva de células PAS-primadas na

reatividade das vias aéreas em camundongos C57BL/6.

Os parâmetros condutância (Grs) aérea (A) e complacência (Crs) do tecido

pulmonar (B) foram medidos em camundongos C57BL/6 imunizados com

duas doses de OVA (50 µg) por via intraperitoneal e desafiados por via

intranasal com a mesma dose de antígeno (n= 5 animais por grupo

experimental). Os animais receberam por transferência adotiva, diferentes

tipos celulares obtidos de animais imunizados com PAS-1. No dia 23 após

o início da imunização, os dados de volume e pressão traqueal foram

103

medidos após infusão de doses crescentes de metacolina. O gráfico

apresenta a média dos valores do logaritmo da dose de metacolina

necessária para reduzir os valores basais (obtidos após infusão de solução

salina) de condutância (Grs) e complacência (Crs), respectivamente, em

50% e 40%. O grupo controle consistiu de camundongos não imunizados,

que receberam apenas PBS.

(*) p < 0,001 em relação ao grupo controle (PBS)

5 DISCUSSÃO

A asma alérgica é uma doença inflamatória crônica, caracterizada por

hiperresponsividade das vias aéreas e broncoconstrição decorrentes de vários

estímulos (Bousquet et al., 1990). Por outro lado, infecções causadas por helmintos

podem modular a resposta imune, incluindo a inflamação alérgica pulmonar, pela ação

de fatores secretados por estes parasitas.

Em nosso laboratório tem-se estudado, desde o início da década de 80,

componentes do extrato bruto de Ascaris suum que modulam a resposta imune. Dentre

esses componentes, foram caracterizadas duas proteínas com atividade biológica sobre

o sistema imune do hospedeiro: a proteína alergênica APAS-3 (Pires et al., 2001), e a

proteína PAS-1 (Oshiro et al., 2005), que tem potente atividade imunossupressora,

inclusive sobre a inflamação alérgica pulmonar induzida por APAS-3 (Itami et al., 2005).

Neste trabalho, investigamos os mecanismos envolvidos na ação modulatória de

PAS-1, estabelecendo, inicialmente, o modelo de asma alérgica murina em

camundongos C57BL/6, utilizando o antígeno OVA, e o efeito da imunização simultânea

OVA+PAS-1 sobre os principais eventos da inflamação alérgica pulmonar.

104

Os resultados obtidos demonstraram que OVA induz uma elevada produção de

anticorpos anafiláticos anti-OVA (IgG1 e IgE), e leva à um aumento das concentrações

de imunoglobulinas da classe IgE circulantes (IgE total). Têm sido demonstrado por

vários autores, que a imunização de camundongos com OVA e hidróxido de alumínio

estimula uma resposta imune tipo Th2, com a produção de anticorpos,

preferencialmente das classes IgG1 e IgE anti-OVA, em torno do 10º dia, e no 14º dia

observa-se uma elevada produção de anticorpos IgE policlonais (Beck & Spiegelberg,

1989). Nossos resultados corroboram com estes, demonstrando a predominância de

uma resposta Th2, incluindo um aumento da concentração sérica de IgE.

Em contrapartida, nossos estudos demonstram também que PAS-1 suprime a

produção de IgG1 anti-OVA, IgE total e anticorpos anafiláticos (IgG1 e IgE), indicando

que PAS-1 é capaz de modular negativamente não apenas a produção de anticorpos

anti-OVA, mas também de IgE policlonal.

Na reação inflamatória que ocorre na asma, a contribuição de anticorpos está

diretamente associado com a capacidade deles desencadearem uma reação

anafilática. Pelos nossos resultados, OVA estimulou a produção de anticorpos

anafiláticos (IgG1 e IgE) (Figura 1), que foram detectados por anafilaxia cutânea

passiva (ACP). Esta técnica se fundamenta na capacidade de anticorpos se fixarem a

receptores do fragmento Fc dos anticorpos, que estão expressos em mastócitos e

basófilos, e degranularem estas células, após ligação cruzada dos receptores com o

antígeno, liberando mediadores que causam vasodilatação e extravasamento do

corante azul de Evans, que é preparado juntamente com a solução de antígeno. Foi

demonstrado, em trabalhos anteriores do nosso grupo, que a inibição da síntese de

anticorpos anafiláticos da classe IgE resultava em uma diminuição da intensidade da

105

inflamação alérgica pulmonar em camundongos (Itami et al., 2005). Corroborando com

estes dados, em nosso modelo experimental, PAS-1 foi capaz de inibir a síntese de

anticorpos anafiláticos IgE e IgG1 anti-OVA.

A capacidade de anticorpos IgE estimularem uma reação anafilática foi descrita

por Ishizaka et al (1966), quando o fator sérico chamado reagina foi identificado como

sendo uma nova classe de imunoglobulinas, então denominada IgE. Anticorpos da

classe IgE desencadeiam reação anafilática após se ligarem nos receptores FcεRI

presentes na superfície de mastócitos e basófilos (Dearon et al., 1980; Minard e Levy,

1972).

A capacidade de anticorpos IgG1 desencadear reação anafilática ocorre por

meio da ligação a receptores de baixa afinidade para IgG em camundongos (FcγRIII)

(Becker, 1971; Miyagima et al., 1997). A existência de atividades biológicas distintas

para anticorpos IgG1, dependente ou não de IL-4, foi constatada por Faquim-Mauro et

al. (1999), que demonstraram que IgG1 IL-4-dependentes apresentavam atividade

anafilática, enquanto que aqueles independentes de IL-4 não tinham nenhuma

capacidade anafilática.

Dentre os anticorpos anafiláticos murinos, IgE se distingue de IgG1 por serem

termolábeis, heterocitotrópicos e por permanecerem ligados aos receptores dos

mastócitos por mais tempo (Ishizaka et al., 1966; Nussenzweig et al., 1964). Em

contrapartida, IgG1 é homocitotrópico, se ligando somente à mastócitos murino para

desencadear a reação anafilática (Mota et al., 1968).

Portanto, em camundongos, os anticorpos IgE e IgG1 são fundamentais para o

desencadeamento de uma reação anafilática, e em nossos experimentos

106

demonstramos que PAS-1 inibe acentuadamente a produção destas duas classes de

anticorpos.

Com relação à migração leucocitária, a imunização com OVA aumenta a

migração de macrófagos, linfócitos e eosinófilos para vias aéreas (lúmen e tecido

pulmonar). Em contrapartida, PAS-1 inibe significativamente este infiltrado leucocitário,

principalmente com relação à eosinófilos, que teve uma redução de 100%, mostrando

que PAS-1 tem potente atividade supressora na formação do infiltrado inflamatório

característico dos processos asmáticos.

A importância do eosinófilo na asma tem sido descrita por vários autores. Seu

papel é devido, sobretudo, à ação efetora exercida por estas células, em particular, na

asma humana. A ação efetora envolve a participação de proteínas dos grânulos dos

eosinófilos, que tem efeito tóxico para o epitélio respiratório quando estão presentes

nas secreções pulmonares de pacientes asmáticos (Frigas et al., 1981). A toxicidade

destas proteínas promove descamação de células epiteliais, altera a ciliaridade e a

secreção epitelial (Gleich et al., 1979), podendo, ainda, induzir hiperreatividade das vias

aéreas (Gundel et al., 1990).

Um dos principais componentes dos grânulos dos eosinófilos é a peroxidase

endógena (EPO), uma proteína catiônica que representa aproximadamente 25% do

conteúdo total granular e que é específica para os eosinófilos (Carlson et al., 1985), de

modo que medir sua presença da atividade enzimática é uma forma indireta de se

avaliar a presença de eosinófilos. Nos resultados demonstraram que a proteína PAS-1

também é capaz de inibir significantemente as concentrações de EPO, tanto no tecido

pulmonar quanto no lavado broncoalveolar, indicando que PAS-1 impede a migração de

eosinófilos para o lúmen das vias aéreas bem como para o tecido pulmonar.

107

A produção de anticorpos, assim como a migração leucocitária, são eventos que

dependem de fatores secretados por células do sistema imune, como citocinas e

quimiocinas. Na asma, clones de células T predominantemente secretam citocinas Th2

(Kay, 1991). No nosso modelo de asma experimental, observamos OVA estimula

significativamente a produção de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina). Por outro

lado, PAS-1 diminui significativamente a secreção de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina

induzida por OVA. As citocinas IL-4, IL-5, IL-13 e IL-9 são preferencialmente produzidas

por linfócitos Th2, em oposição à secreção, por exemplo, de IL-12 e IFN-γ, que é

característica de linfócitos Th1 (Mossman et al., 1986). A diminuição da produção de IL-

5 por linfócitos Th2 no lavado broncoalveolar e nos pulmões está correlacionada com a

diminuição do acúmulo de eosinófilos (Collins et al., 1995). IL-5 tem papel importante no

recrutamento de eosinófilos para as vias aéreas, aumentando a inflamação eosinofílica

e promovendo o desenvolvimento da hipereatividade das vias aéreas superiores

(Foster, 1996; Hamelmann et al., 1999). O processo de maturação de eosinófilos na

medula óssea até a sua ativação no tecido infiltrado é dependente de IL-5 (Hogan et al.,

2000).

IL-4 promove a inflamação das vias aéreas por indução de resposta Th2

(Brussele et al., 1994; Colley et al., 1995). Apesar da intensa exposição ao alérgeno, na

ausência de IL-4, células Th2 não se desenvolvem nem podem sobreviver in vivo (Corry

et al., 1997). IL-4 é também criticamente importante para promover a sinalização de

células B para produção e secreção de IgE e IgG1 (Finkelman et al., 1988; Lebmann e

Coffman, 1988). IL-4 estimula a produção de anticorpos IgE, em combinação com a

ligação de CD40/CD40L, promovendo a transcrição da cadeia ε em células B (Vercelli,

108

1993; Vercelli e Geha, 1992). Em nossos experimentos, a diminuição da produção de

anticorpos IgE provavelmente está relacionada à capacidade de PAS-1 em suprimir a

síntese de IL-4.

IL-13, recentemente, emergiu como uma molécula efetora importante durante o

estabelecimento da inflamação alérgica. Foi demonstrada, em vários estudos, a

participação de IL-13 na expulsão de nematódeos no trato gastrointestinal. A

inflamação das vias aéreas é similar àquela observada no intestino. Contudo, enquanto

o intestino é contraído e o excesso de muco expulsa o parasita, sendo benéfico para o

hospedeiro, ocorrem várias alterações nos pulmões em resposta aos alérgenos, como

hiperreatividade das vias aéreas e superprodução de muco, que resultam na obstrução

das vias aéreas, prejudicando o hospedeiro. Estas respostas das vias aéreas são

amplamente determinadas por IL-13 (Grunig et al., 1998; Wills-Karp et al., 1998). IL-13

também participa da inflamação eosinofílica, aumentando o infiltrado de eosinófilos, em

combinação com IL-5 e IL-4 (Wynn, 2003).

A eotaxina, um membro das C-C quimiocinas, é um potente e rápido indutor do

recrutamento de eosinófilos para os pulmões (Rottenberg, 1999). É um fator estimulado

pela produção de IL-4 e IL-13, que apresenta ação na eosinofilopoese e quimiotaxia de

eosinofilos (Conroy e Williams, 2001). Níveis aumentados de eotaxina foram

observados no LBA de pacientes asmáticos (Lamkhioued et al., 1997) e no LBA e

pulmão de camundongos sensibilizados com OVA (Scheerens et al., 2002). A atividade

quimiotática de eotaxina sobre eosinófilos foi também observada em ensaios in vitro,

em que eosinófilos marcados com radiação migram para o sítio de inoculação

intradérmica com LBA de cobaias sensibilizadas e desafiadas com OVA. A separação

cromatográfica resultou no isolamento e identificação de eotaxina como fator

109

quimiotático (Griffiths- Johnson et al., 1993). Assim, a capacidade de PAS-1 em suprimir

intensamente a migração eosinofílica pulmonar, muito provavelmente é devido à

inibição da síntese e/ou secreção de IL-5 e eotaxina.

Em nossos estudos demonstramos que PAS-1, além de modular

negativamente a produção de IgE e IgG1, a eosinofilia pulmonar e a síntese de IL-4, IL-

5, IL-13 e eotaxina, estimula a produção e secreção de IL-12, IFN-γ, IL-10 e TGF-β.

A presença de IFN-γ ou IL-12 inibe a resposta Th2 (Maggi et al., 1992; Wang et

al., 1994). IL-12 induz a liberação de IFN-γ e atenua o fenótipo da asma, quando

administrada em camundongos com inflamação alérgica pulmonar (Gavett et al., 1995;

Kips et al., 1996). Certas seqüências de DNA derivadas de bactérias, motifs de CpG

não metilados, promovem a liberação de IL-12 endógena (Krieg e Kline, 2001) e

atenuam a asma experimental (Metzger e Nyce, 1999; Kline et al., 1998). A IL-12 foi

identificada como um fator solúvel que poderia estimular células NK a produzir IFN-γ

(Kobayashi et al., 1989); é também produzida por células dendríticas, macrófagos e

células B (Trinchieri e Gerosa, 1996).

IFN-γ é uma citocina crucial na diferenciação Th1. É responsável por

induzir/manter a expressão da cadeia β do receptor de IL-12 (IL-12Rβ2) pela ativação

de t-bet, caracterizando uma importante função de IFN-γ nos efeitos mediados por IL-12

(Mullen et al., 2001, Afkarian et al., 2002). Estudos com células T CD4+ de

camundongos C57BL/6 mostraram uma participação direta de IFN-γ como um indutor

da polarização Th1 por um mecanismo autócrino, independente de IL-12 (Bradley et al.,

1996). A produção deficiente de IFN-γ predispõe o indivíduo ao desenvolvimento de

doenças alérgicas e pacientes com asma severa apresentam quantidades

110

significativamente reduzidas de IFN-γ em resposta aos alérgenos quando comparadas

com indivíduos controle (Leonard et al., 1997). Além disso, a resolução das alergias

parece não estar relacionada com a redução da produção de citocinas Th2, mas com a

normalização dos níveis de IFN-γ (Smart et al., 2002). Foi descrito que existe uma

relação inversa entre as respostas imune mediadas por IFN-γ contra patógenos na

infância e a incidência de asma (Shirakawa et al., 1997). Estes resultados enfatizam o

caráter inibitório de IFN-γ na resposta contra os alérgenos.

O efeito supressor de IFN-γ nas doenças alérgicas é mediado por vários

mecanismos, tais como (1) a regulação da apresentação do alérgeno às células T,

bloqueio da capacidade de apresentação de antígenos por mastócitos (Frandji et al.,

1995); (2) a diferenciação de células T naïve para o fenótipo Th1 e/ou inibição do

recrutamento/diferenciação de células Th2; (3) a supressão das citocinas Th2 liberadas

das células T ativadas; (4) a inibição do recrutamento de células efetoras para o sítio de

inflamação, como os eosinófilos, por diminuir a expressão do receptor de eotaxina

(CCR3), que é um importante indutor da diferenciação de células progenitoras

hematopoéticas (Lamkhioued et al., 2003); (5) a indução de apoptose nas células T e

eosinófilos por mecanismos dependentes de caspase e CD95/Fas, respectivamente

(Luttman et al., 2000; Refaeli et al., 2002); (6) o bloqueio da mudança de isótipo nas

células B, que é um importante mediador de alergias induzido por citocinas Th2 (Boehm

et al., 1997) e (7) indução da produção de óxido nítrico, por induzir iNOS, uma enzima

óxido nítrico sintase (Boehm et al., 1997), que age como um broncodilatador (Högman

et al., 1993), inibe a proliferação e a síntese de DNA nas células musculares lisas e

diminui a hiperplasia e a hipertrofia das células musculares lisas (Patel et al., 1999).

111

O aumento de IL-10 induzido por PAS-1, assim como a produção de IL-12

e IFN-γ, funciona como um mecanismo de feed-back negativo, para controlar a

inflamação alérgica pulmonar. IL-10 foi originariamente descrita como uma citocina

produzida por células Th2 (Fiorentino et al., 1989). Contudo, esta citocina também é

produzida por outros tipos celulares como células Th1, macrófagos e células dendríticas

(Moore et al., 2001). Isto é surpreendente porque IL-10 é um inibidor da produção de

citocinas Th1, por meio de sua ação nas células dendríticas e macrófagos, que resulta

na inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias e IL-12 (Trinchieri et al., 2001;

Moore et al., 2001) e na inibição da expressão de moléculas de MHC de classe II e

moléculas co-estimulatórias (Moore et al., 2001; De Waal Malefyt, 1991). Contudo,

macrófagos e células dendríticas podem produzir IL-10 sob certas condições, como

ligação dos receptores Fc expressos na superfície destas células e estimulação com

produtos microbianos, tais como zimozan e hemaglutinina filamentosa de B. pertussis

(Edwards et al., 2002; McGuirk et al., 2002). Além disso, IL-10 tem importante função na

regulação da resposta alérgica (Akbari et al., 2002; Grunig et al., 1997).

IL-10 modula negativamente muitas células e funções efetoras que estão

associadas com doenças alérgicas, incluindo ativação de células Th2, função biológica

de mastócitos e eosinófilos e produção de IgE (Arock et al., 1996; Takanaski et al.,

1994; Jeannin et al, 1998), além de ter um papel importante na regulação homeostática

nos pulmões (Akbari et al., 2001). A transferência de IL-10 para os pulmões (Stampfi et

al., 1999) e a transferência adotiva de células transfectadas com IL-10 (Oh et al., 2002)

demonstra que esta citocina bloqueia a inflamação alérgica. Os estudos realizados por

Akbari et al. (2001; 2002) demonstraram que a tolerância, em um modelo de doença

112

alérgica, induzida pela exposição a elevadas doses de alérgeno injetado por via

intranasal inibiu o desenvolvimento da hiperreatividade aérea e estimulou células

dendríticas pulmonares a ativarem células T reguladoras secretoras de IL-10. Este

processo requereu a expressão de ICOS por células dendríticas e a produção de IL-10.

O efeito inibitório de IL-10 foi observado no recrutamento de eosinófilos para as vias

aéreas de camundongos sensibilizados que receberam IL-10 recombinante por via

intranasal ou intratraqueal, bem como sobre os níveis de IL-4, IL-5 e IFN-γ (Zuany-

Amorim et al., 1995; Van Scott et al., 2000). Além disso, IL-10 inibe a degranulação de

mastócitos (Royer et al., 2001), reduz a proliferação de células T antígeno-específicas

em infecções por helmintos (Doetze et al., 2000).

Em nossos experimentos demonstramos que PAS-1 aumenta a produção de IL-

12, IFN-γ e IL-10 e quando administrado juntamente com OVA suprime

acentuadamente a resposta alérgica pulmonar, em todos os parâmetros testados

(produção de anticorpos, citocinas Th2, migração leucocitária e atividade de EPO),

sugerindo que a atividade imunossupressora de PAS-1 seja mediada por um

mecanismo misto, que envolveria a presença de células supressoras (IL-10) e células

Th1 (IFN- e IL-12).

Para avaliar a papel de cada uma destas citocinas (IL-12, IFN-γ e IL-10) na

atividade modulatória de PAS-1, utilizamos camundongos IL-12

-/-

, IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

que

por manipulação gênica tornaram-se incapazes de produzir estas proteínas.

Os resultados obtidos demonstram que nos camundongos IL-12

-/-

, assim como

nos animais selvagens, PAS-1 suprime a secreção de anticorpos IgG1 e IgE, a

113

inflamação eosinofílica, a produção de EPO, a produção de IL-4 , IL-5, IL-13 e eotaxina,

mas estimula a secreção de IFN-γ, IL-10 e TGF-β.

Por outro lado, nos camundongos deficientes de IFN-γ e de IL-10, ao contrário

dos animais selvagens, PAS-1 não altera a produção de anticorpos, a migração

leucocitária pulmonar, a atividade de EPO, a secreção de IL-4, IL-5, IL-13 e eotaxina,

mas induz um aumento significativo da produção de IL-12, IFN-γ (exceto para

camundongos IFN-γ

-/-

), IL-10 (exceto para camundongos IL-10

-/-

) e TGF-β.

Estes resultados demonstram que o efeito inibitório de PAS-1 na inflamação

alérgica pulmonar é mediado por IFN-γ e IL-10, mas não por IL-12, uma vez que os

camundongos IFN-γ

-/-

e IL-10

-/-

, ao contrário dos animais IL-12

-/-

, não apresentaram a

supressão do quadro alérgico pulmonar. Uma vez definido que estas citocinas (IFN- e

IL-10) são as responsáveis pelo efeito modulatório de PAS-1, investigou-se quais os

tipos celulares envolvidos neste processo.

Experimentos realizados por Mangan et al. (2004) demonstraram que

células B secretoras de IL-10 protegem camundongos de reações anafiláticas.

Também, sabe-se que linfócitos TCD4

+

secretam IFN-, IL-10 e TGF-β e TCD8

+

produz IFN-. Assim, em nossos experimentos utilizamos linfócitos de animais

previamente imunizados com PAS-1, separados conforme os seguintes marcadores:

CD19

+

, B220

+

, CD3

+

, CD8

+

, CD4

+

, CD4

+

CD25

, CD4

+

CD25

+

(células T reguladoras).

Os resultados obtidos demonstram que somente células TCD8

+ 

(célula

citotóxica) e células T CD4

+

CD25

+

(células T reguladoras) participam do

imunossupressão induzida por PAS-1 (caracterizada pela diminuição da síntese de

114

anticorpos, do acúmulo de eosinófilos no lúmen alveolar, de EPO, da produção de IL-4,

IL-5, IL-13 e eotaxina).

Além da supressão da inflamação alérgica pulmonar, nossos resultados mostram

que nos animais transferidos com as células T CD8

+

houve um aumento de IFN-γ no

lavado broncoalveolar e homogenato pulmonar. Vários autores têm relatado o papel

das células T CD8

, produtoras de IFN-, como células supressoras em reações

alérgicas (Stock et al., 2004, Renz et al., 1994; McMenamin e Holt, 1993). Além disso,

a transferência de células T CD8+ de camundongos sensibilizados reduz a produção de

IgE alérgeno-específica e o desenvolvimento da hiperreatividade das vias aéreas

(Thomas et al., 2001). Hansen et al. (2000) demonstraram que Listeria morta pelo calor

tem efeito protetor mediado por células T CD8+, suprimindo o desenvolvimento da

inflamação das vias aéreas e a hiprreatividade após a sensibilização e o desafio com o

alérgeno. Em contraste, alguns autores mostram que linfócitos T CD8+ aumentam a

resposta imune mediada por alérgeno. A depleção de células T CD8+ antes da

sensibilização com o alérgeno previniu o desenvolvimento da inflamação eosinofílica e

a hiperreatividade in vitro por reduzir a produção de IL-5 por células dos linfonodos

peribronquiais (Hamelmann et al., 1996). Estes dados controversos são em parte

explicados pelo fato de células T CD8+ poderem ser divididas em duas subpopulações

de acordo com o perfil de citocinas secretado. Enquanto que a maioria das células T

CD8+ secreta IFN-γ (células Tc1), uma pequena fração da população produzem IL-4,

IL-5 e IL-10 (células Tc2) (Seder e Le Gros, 1995; Noble et al., 1995).

Além disso, células T CD8+ podem ser separadas em subpopulações, de

acordo com sua capacidade de migrar para determinados sítios (Weninger et al., 2001).

115

As células T CD8+ na presença de IL-15 parecem migrar, principalmente, para os

linfonodos e placas de Peyer e representam um fenótipo de memória. Em contraste, as

células T CD8+ na presença de IL-2 apresentam um fenótipo citotóxico e migram,

principalmente, para os sítios de inflamação.

Então, baseando-se nestes dados, as células T CD8+ induzidas por PAS-1, que

foram transferidas para camundongos imunizados com OVA são do tipo Tc1, pois há

elevada produção de IFN-γ nos camundongos que receberam estas células. Deste

modo, a produção significativa de IFN-γ nos camundongos que receberam PAS-1 é

decorrente de células T CD8+.

Além de células T CD8+, as células T CD4+CD25+ (células T reguladoras)

também são elementos importante no papel imunomodulatório de PAS-1 no modelo de

asma experimental. Pois, como demonstrado, a transferência adotiva de células T

CD4+CD25+ suprime o quadro alérgico pulmonar, aumentando a secreção de IL-10 e

TGF-β no lúmen dos alvéolos pulmonares (LBA) e para o parênquima pulmonar.

Recentes estudos têm enfocado que parte da população de células T

CD4+ expressa constitutivamente IL-2Rα (CD25). Estas células (CD4+CD25+)

compreendem aproximadamente 5 a 10% do total de células T da periferia e

apresentam propriedades imunossupressoras in vivo e in vitro. As células CD4+CD25+

são fontes importantes de IL-10. Como demonstrado recentemente, as células T

CD4+CD25+ deficientes de IL-10 não suprimem a inflamação intestinal induzida por

Helicobacter hepaticus (Kulberg et al., 2005) nem a imunidade anti-Leishmania (Belkaid

et al., 2002). Recentes estudos demonstraram que células T CD4+CD25+ naturais e

induzíveis e células T regulatórias secretoras de IL-10 tem um papel fisiológico na

116

proteção contra doenças alérgicas. Uma mutação rara no gene codificante de FOXP3

resulta em uma doença chamada IPEX, que é caracterizada por desregulação da

resposta imune. Indivíduos que sofrem desta doença várias doenças alérgicas

incluindo eczema, níveis séricos de IgE, eosinofilia e alergias à alimentos (Ramsdell,

2003; Maloy e Powrie, 2001). Células mononucleares do sangue periférico de pacientes

atópicos ou alérgicos geralmente proliferam mais e produzem mais citocinas Th2 em

resposta ao alérgeno do que células mononucleares de indivíduos não atópicos.

Quando as células T CD4+CD25+ são depletadas das culturas de células

mononucleares de indivíduos não atópicos, a resposta Th2 é significativamente

aumentada (Ling et al., 2004). Estes estudos, coletivamente, sugerem que a supressão

mediada por células T regulatórias ocorre também em indivíduos saudáveis.

Várias evidências mostram o papel fisiológico de células T reguladoras

secretoras de IL-10 na inflamação alérgica. Um recente estudo de Akdis et al. (2004)

mostrou que a freqüência de células T secretoras de IL-10, alérgeno específicas foi

significativamente aumentada em indivíduos não-atópicos comparados com os

indivíduos alérgicos, enquanto que estes pacientes alérgicos produziram quantidades

significativas de citocinas Th2.

Estudos conduzidos por Lewkowich et al. (2005) investigaram o impacto de

células T CD4+CD25+ na sensibilização com alérgenos em linhagens de camundongos

susceptíveis e resistentes ao desenvolvimento de alergias, mostrando que estas células

têm papel importante no controle do desenvolvimento da asma. Além disso, Kearley et

al. (2005) demonstraram que células T CD4+CD25+ transferidas para camundongos

sensibilizados com o alérgeno antes do desafio alergênico protegem os camundongos

do desenvolvimento da inflamação eosinofílica pulmonar e da hiperreatividade das vias

117

aéreas. Estes trabalhos mostram que células T regulatórias (CD4+CD25+) naturais

podem controlar a asma.

As células T CD4+CD25+ também secretam TGF-β. Recentes estudos

sugeriram que o efeito autócrina de TGF-β1 por células T reguladoras é essencial para

a manutenção de sua função supressora, pois células T CD4+CD25+ deficientes de

TGF-β1 não suprimem a colite quando são transferidas para os camundongos que

apresentam esta doença (Nakamura et al., 2004). TGF-β é importante para a geração e

ação de células T regulatórias CD4+ e CD8+ (Horwitz et al., 2002).

Com referência à reatividade das vias aéreas constatamos que, no modelo

experimental adotado, os animais imunizados apenas com OVA apresentaram uma

expressiva redução na complacência (Crs) e condutância pulmonar (Grs). Isso significa

que tanto a elasticidade do tecido pulmonar como o fluxo de ar pelas vias aéreas

desses animais foram comprometidos com as imunizações e desafios com OVA,

levando a um estado de hiperreatividade das vias aéreas.

A condutância pulmonar representa o inverso da resistência à passagem do ar,

sendo a diminuição da condutância do fluxo aéreo conseqüência de uma redução no

calibre das vias aéreas. O estreitamento das vias aéreas pode ser resultante de ação

de eosinófilos nos bronquíolos. A associação entre eosinófilos e hiperreatividade na

asma tem sido amplamente descrita (Bousquet et al. 1990; Foster et al. 1996,

Rosenberg et al., 2007). Os produtos secretados pelos eosinófilos podem ser os

elementos que contribuem com a hiperreatividade pulmonar, como por exemplo, a EPO,

cuja atividade estava aumentada, tanto no tecido pulmonar como no lavado

brônquioalveolar,no nosso modelo experimental. Foi demonstrado que a instilação de

118

EPO ou da proteína básica principal (MBP) na traquéia de primatas resulta em um

aumento da reatividade das vias aéreas de maneira dose-dependente (Gundel et al.

1991). Além disso, a neutralização de MBP endogenamente secretada utilizando

anticorpos anti-MBP previne a hiperreatividade das vias aéreas em cobaias

sensibilizadas e desafiadas com OVA (Lefort et al., 1996).

Além dos eosinófilos, outros fatores contribuem para o aumento da reatividade

pulmonar, como a citocina IL-13, que aumenta a produção de muco e portanto a

obstrução das vias aéreas. A deficiência do gene codificante de IL-13 em camundongos

interfere diminuindo o estado de hiperreatividade das vias aéreas, (Walter et al. 2001).

Além disso, a transferência de anticorpos IgE e IgG1 alérgeno-específicos também

induzem um estado de hiperreatividade das vias aéreas em camundongos, além de

estimular a hipersensibilidade imediata (Oshiba et al. 1996), de modo que a estimulação

destes anticorpos pela imunização com OVA em nosso modelo experimental pode ter

participado do aumento da reatividade pulmonar.

Com relação ao efeito da proteína PAS-1 sobre o estado de hiperreatividade das

vias aéreas induzido por OVA, observamos que apenas o parâmetro de condutância, (e

não a complacência) foi drasticamente afetado, chegando a valores próximos aos

basais (controle negativo – PBS). Observamos ainda, nos experimentos com animais

transgênicos, que este efeito inibitório de PAS-1 sobre a condutância pulmonar se deve

a mecanismos mediados por IFN-γ e IL-10. Estes dados foram comprovados nos

experimentos de transferência adotiva de linfócitos, uma vez que apenas os animais

que receberam células CD8+ (produtoras de IFN-) e CD4+CD25+ (produtoras de IL-

10), primadas com PAS-1, apresentaram uma diminuição do estado de hiperreatividade,

119

com relação ao parâmetro de condutância. Sendo a condutância pulmonar o inverso da

resistência, e portanto relacionada com o fluxo de ar pelas vias aéreas (pressão),

nossos resultados indicam que PAS-1 age nas vias aéreas distais, revertendo a

obstrução do fluxo aéreo induzida pela inflamação causada pela imunização com OVA.

Por outro lado, em relação à complacência do tecido pulmonar, PAS-1 não foi

capaz de aumentar a capacidade elástica do tecido, em nenhum dos grupos de animais

imunizados com OVA e PAS-1. A complacência pulmonar significa o inverso da

elastância, um parâmetro associado com a capacidade elástica do tecido pulmonar.

Portanto, a diminuição da complacência está diretamente associada à diminuição da

elasticidade, ou seja, a rigidez do tecido pulmonar (vias aéreas proximais). Alterações

na elasticidade do tecido pulmonar, assim como no diâmetro das vias aéreas, podem

ser resultantes do processo de remodelamento das vias aéreas, mas por mecanismos

distintos. O processo de remodelamento inclui espessamento das mucosas (James et

al., 1989) e do músculo liso (Carrol et al., 1993), implicando uma diminuição do calibre

das vias aéreas e, conseqüentemente, aumento na resistência pulmonar (ou diminuição

da condutância). Além disso, aumento da produção de muco estimulado pela secreção

de IL-13, tem também papel relevante na obstrução das vias aéreas. Por outro lado,

alterações na expressão de colágeno e elastina podem ter efeito na elasticidade do

tecido pulmonar, levando a uma redução na complacência pulmonar (Roche et al.,

1989; Stone et al.,1995).

Nossos resultados demonstraram que PAS-1 age em parâmetros que afetam as

vias aéreas distais (fluxo de ar), mas não nas vias aéreas proximais (relacionado à

elasticidade do tecido pulmonar). Neste sentido, é provável que PAS-1 não interfira com

a deposição de colágeno, o aumento da massa de músculo liso e/ou o acúmulo de

120

fibroblastos nas vias aéreas. Fouty et al. (2006) demonstraram que a estimulação de

cultura de fibroblastos de pacientes asmáticos com dexametasona, um tipo de

corticosteróide com atividade anti-inflamatória bem documentada, por 72 horas

aumenta a divisão celular e prolonga a fase S do ciclo celular, indicando que

dexametasona mesmo com um efeito anti-inflamatório estimula o acúmulo de

fibroblastos nas vias aéreas, que está associado com o processo de remodelamento

por expressar MMPs. Além disso, um estudo de biópsias de brônquios humanos

demonstrou que a deposição de colágeno III, o aumento da massa muscular lisa, o

acúmulo de fibroblastos e o aumento de glândulas de muco podem ser seletivamente

associados com a asma severa, e dissociados com a eosinofilia e o aumento da

membrana basal, que não se correlacionam com a asma severa (Benayoun et al.,

2003).

Em conjunto, nossos resultados demonstram que PAS-1 é um potente agente

imunomodulador, capaz de inibir os principais parâmetros da inflamação alérgica

pulmonar (migração leucocitária, influxo eosinofílico, atividade de EPO, produção de

anticorpos anfiláticos, produção de citocinas, secreção de quimiocinas e

hiperreatividade pulmonar), por estimular células T citotóxicas e regulatórias, que

secretam respectivamente IFN- e IL-10/TGF-, fatores estes responsáveis pelo efeito

supressor.

121

6 CONCLUSÕES

Em conjunto, os resultados apresentados nos permitem concluir que a atividade

imunossupressora da proteína PAS-1 sobre a inflamação alérgica pulmonar se

caracteriza por:

1) inibição da produção de anticorpos anafiláticos (IgG1 e IgE), de citocinas (IL-4,

IL-5, IL-13), de quimiocinas (eotaxina), do influxo eosinofílico (tanto nas vias

aéreas como no tecido pulmonar) e da hiperreatividade das vias aéreas distais

(condutância);

2) estimulação da produção de IL-12, IFN-, IL-10 e TGF-;

3) IL-10 e IFN-, mas não IL-12, têm papel relevante na atividade

imunossupressora de PAS-1 sobre os parâmetros de inflamação alérgica

pulmonar (produção de anticorpos anafiláticos, de citocinas, de quimiocinas,

infiltrado inflamatório eosinofílico e hiperreatividade das vias aéreas);

4) a atividade imunossupressora de PAS-1 está relacionada com a estimulação

de clones de células TCD8+ e TCD4+CD25+, produtoras de IFN- e de

citocinas reguladoras ( IL-10 e TGF-β), respectivamente.

122

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