ads:
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
ESTUDO FITOQUÍMICO DA RAIZ DA ESPÉCIE Melochia chamaedrys St. Hil
por
GILVAN DE OLIVEIRA COSTA DIAS
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Química, área de Química
Orgânica, da Universidade Federal de Santa Maria (RS), como requisito parcial para
obtenção do grau de DOUTOR EM QUÍMICA.
PPGQ
Santa Maria, RS – BRASIL
2005
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
ads:
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
a comissão examinadora, abaixo assinado, aprova a tese
ESTUDO FITOQUÍMICO DA RAIZ DA ESPÉCIE Melochia chamaedrys St. Hil.
elaborada por
GILVAN DE OLIVEIRA COSTA DIAS
como requisito parcial para obtenção do grau de doutor em química
COMISSÃO EXAMINADORA:
___________________________________________
Prof. Dr. Ademir Farias Morel – Orientador – UFSM
___________________________________________
Profª. Drª. Alana Neto Zoch - UPF
___________________________________________
Profª. Drª. Ionara Irion Dalcol – UFSM
___________________________________________
Prof. Dr. Nilo Zanatta – UFSM
___________________________________________
Prof. Dr. Paulo Mitsuo Imamura – UNICAMP
Santa Maria, 04 de novembro de 2005
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
vi
“Se não morre aquele que planta uma árvore
E não morre aquele escreve um livro,
Com mais razão não deve morrer o educador,
Pois ele semeia nas almas e escreve nos
Espíritos”.
Berthold Brecht
À professora Emília Carolina in memorian
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
vii
AGRADECIMENTOS
A Deus por tudo;
A Universidade Federal de Santa Maria, pelo ensino público, gratuito e de
qualidade;
Ao Projeto Prata da Casa da Universidade Federal do Maranhão, coordenado
pelo prof. Dr. Erasmo Campello de Melo;
Aos órgãos fomentadores deste trabalho: CNPq, CAPES e FAPERGS;
Aos Professores da UNICAMP: Dr. Paulo Mitsuo Imamura e Drª. Anita
Massaiolli, pela obtenção de dados de rotação óptica e espectrometria de massas;
À Profª. Drª. Ionara Irion Dalcol, pela amizade e coorientação deste trabalho;
À Profª. Maria Benedita de Assunção, pelo incentivo, amizade e iniciação à
pesquisa em fitoquímica;
Ao Prof. Dr. Robert Burow, pela contribuição nas análises de difração de
raios-X;
aos amigos de São Mateus-MA, em especial, Adelmo Boueres, Francisco Garreto e
Maria de Oliveira Barros “Meire”;
A Jacilda Porto Noleto, pelo carinho e amizade;
Aos colegas Juliano Rios e Veridiana Silva, pela amizade e ajuda na
formatação deste trabalho;
Aos secretários do Curso de Pós-Graduação em Química: Ademir Sartori e
Valéria Velasquez, pela prestatividade;
Aos colegas de laboratório: Adriana Zago, Anderson, Andréia, Caroline
Stüker, Carolina Oliveira, Cláudia, Elaine, Euclésio, Graciane, Graciela, Irene,
Luciana, Marcelo, Sandro Giacomelli, Susiane, Vinicus Ilha e Vinícius Londeiro, pela
agradável convivência e amizade durante essa jornada;
Aos colegas dos laboratórios de sínteses: Carla, Guilherme Bortolotto,
Helena, Leonardo, Liana, Luciana, Martin, Marcelo Gindri;
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a elaboração
deste trabalho, meu muito obrigado.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
viii
RESUMO
TÍTULO: “ESTUDO FITOQUÍMICO DA RAIZ DA ESPÉCIE Melochia chamaedrys St.
Hil.
AUTOR: Gilvan de Olivera Costa Dias
ORIENTADOR: Prof. Dr. Ademir Farias Morel
Melochia chamaedrys St. Hil. é uma planta conhecida localmente como
“douradinha”; é encontrada na América do Sul, mais precisamente, no sul do Brasil,
Argentina e Uruguai. No Estado do Rio Grande do Sul a espécie M. chamaedrys é
usada pela população local no tratamento de várias doenças, inclusive, câncer e
como anti-hipertensiva.
O presente trabalho descreve especialmente a extração, o isolamento e
caracterização de dois novos compostos: chamaedrona (20) e chamaedrina (28)
bem como a identificação de mais 8 (oito) compostos conhecidos: ácido parasórbico
(25), adoutina-X (29), antidesmona (19), (-)-epicatequina (31), propacina (26),
scutianina B (9) e C (30) e waltheriona A (18) da raiz de Melochia chamaedrys. Suas
estruturas foram identificadas principalmente através de métodos espectroscópicos
incluindo a espectroscopia de RMN de 1D e 2D. Além disso, foram realizados os
ensaios microbiológicos por bioautografia com as novas substâncias e com
antisdemona e seus derivados. Chamaedrona e os derivados de antidesmona foram
fortemente ativos frente a bactérias e fungos enquanto que antidesmona e
chamaedrina foram inativas.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Tese de Doutorado em Química
Santa Maria, 4 de novembro de 2005.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
ix
ABSTRACT
TITLE: “PHYTOCHEMICAL STUDY OF THE ROOTS OF THE SPECIES Melochia
chamaedrys St. Hil.
AUTHOR: Gilvan de Oliveira Costa Dias
ACADEMIC ADVISOR: Prof. Dr. Ademir Farias Morel
Melochia chamaedrys St.Hil. is a plant that is locally known as “douradinha”, it
is found in South America, more exactly in the south of Brazil, Argentina, and
Uruguay. In the state of “Rio Grande do Sul”, the species M. chamaedrys is used by
the local people in the treatment of many diseases, including cancer and
hypertension.
The present research describes especially the extraction, isolation and
characterization of two new compounds: chamaedrona (20) and chamaedrine (28) as
well as the identification of 8 (eight) compounds that are already known: parasorbic
acid (25), adoutine-X (29), atidesmone (19), (-)-epicatechin (31), propacine (26),
scutianine B (9) and C (30) and waltherione A (18) of the roots of Melochia
chamaedrys. Its structures were identified by spectroscopy methods including 1D and
2D NMR spectroscopy. Besides that, bioautography microbiological tests were made
with these compounds and with antidesmone and its derivatives. Chamaedrone and
antidesmone derivatives showed a strong activity against bacteria and fungus, while
antidesmone and chamaedrine did not show any activity.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
POSTGRADUATE COURSE IN CHEMISTRY
Doctoral Thesis in Chemistry.
Santa Maria, November 4
th
, 2005.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
x
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS................................................................................................ vii
RESUMO ..................................................................................................................viii
ABSTRACT................................................................................................................ ix
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................xiii
LISTA DE TABELAS.................................................................................................xvi
LISTA DE ESQUEMAS............................................................................................xvii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS..............................................xviii
1 . INTRODUÇÃO E OBJETIVOS...............................................................................1
2. REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................3
2.1. STERCULIACEAE............................................................................................3
2.1.1. MELOCHIA....................................................................................................4
2.1.1.1. Melochia chamaedrys St. Hil...............................................................5
2.2. Estudos químicos realizados com o gênero Melochia e similares....................5
3. PARTE EXPERIMENTAL........................................................................................9
3.1 Instrumentos Utilizados .....................................................................................9
3.1.1. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear.................................9
3.1.2. Ponto de Fusão..........................................................................................9
3.1.3. Cromatografia Gasosa...............................................................................9
3.1.4. Espectrometria de Massas de Alta Resolução...........................................9
3.1.5. Espectrometria de Massas de Baixa Resolução......................................10
3.1.6. Espectroscopia de Infravermelho.............................................................10
3.1.7. Polarímetro...............................................................................................10
3.2. Materiais e Métodos .......................................................................................10
3.2.1. Cromatografia, solventes e reveladores...................................................10
3.2.2 Determinação de toxicidade “in vivo” através do Teste de Letalidade por
Artemia salina (TLAS)........................................................................................11
3.2.3. Método de Bioautografia..........................................................................12
3.2.3.1. Determinação da Atividade Antimicrobiana “in vitro”.........................13
3.2.4. Método de Horeau ...................................................................................13
3.2.4.1. Príncipio do Método...........................................................................13
3.2.4.2. Regra de Horeau...............................................................................14
3.2.5. Melochia chamaedrys ..............................................................................15
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
xi
3.2.5.1. Coleta e identificação Botânica .........................................................15
3.2.5.2. Preparação dos Extratos e Fracionamentos......................................15
3.2.5.3. Bioensaio...........................................................................................17
3.2.5.4. Análise da Fração Hexânica..............................................................17
3.2.5.5. Análise da Fração Clorofórmica ........................................................18
3.2.5.6. Análise da Fração Acetato de Etila....................................................19
3.2.5.7. Dados sobre os Metabólitos Isolados das Frações Hexânica,
Clorofórmica e Acetato de Etila de Melochia chamaedrys. ...........................20
3.2.5.7.1. Antidesmona (19)........................................................................20
3.2.5.7.2. Chamaedrona (20)......................................................................20
3.2.5.7.3. Ácido Parasórbico (25)................................................................20
3.2.5.7.4. Propacina (26) ............................................................................21
3.2.5.7.5. Scutianina B (27) ........................................................................21
3.2.5.7.6. Chamaedrina (27).......................................................................21
3.2.5.7.7. Adoutina X (29)...........................................................................22
3.2.5.7.8. Scutianina C (30)........................................................................22
3.2.5.7.9. Waltheriona A (18)......................................................................22
3.2.5.7.10. (-)- Epicatequina (31)................................................................23
4. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS.......................................................................24
4.1. BIOENSAIO....................................................................................................24
4.2. Estudo Fitoquímico da Raiz de Melochia chamaedrys...................................24
4.2.1 Caracterização dos compostos GO2 e GO3 obtidos na fração hexânica de
M. chamaedrys. .................................................................................................28
4.2.1.1. GO2...................................................................................................28
4.2.1.1.1. Espectro de Massas....................................................................28
4.2.1.1.2. Espectro de RMN
1
H...................................................................29
4.2.1.1.3. Espectro de RMN do Tipo COSY
1
H-
1
H......................................30
4.2.1.1.4. Espectro de RMN
13
C .................................................................32
4.2.1.1.5. Espectro de RMN do tipo HMQC e HMBC..................................36
4.2.1.2. G03....................................................................................................41
4.2.1.2.1. Espectro de Massas....................................................................41
4.2.1.2.2. Espectro de RMN de
1
H...............................................................42
4.2.1.2.3. Espectro de RMN do Tipo COSY
1
H-
1
H......................................44
4.2.1.2.4. Espectro de RMN do Tipo NOESY
1
H-
1
H ...................................45
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
xii
4.2.1.2.5. Espectro de RMN de
13
C de GO3...............................................47
4.2.1.2.6. Espectro de RMN do Tipo HMQC e HMBC ................................51
4.2.1.3. Definição da configuração relativa dos centros quirais (C-5, C-8) de
GOH através do estudo de raios-X.................................................................60
4.2.1.3.1. Determinação da Estereoquímica do Centro Quiral C-8 de GOH
....................................................................................................................61
4.2.1.4. Determinação da Atividade Antimicrobiana pelo Método de
Biautografia de GO3 e Derivados de GO2.....................................................64
4.2.2. Caracterização dos Compostos Obtidos na Fração Clorofórmica de
Melochia chamaedrys........................................................................................66
4.2.2.1. G-9 ....................................................................................................66
4.2.2.2. G-28 ..................................................................................................71
4.2.2.2.1. Espectro de Massas....................................................................71
4.2.2.2.2. Espectro de RMN de
1
H DE G-28...............................................73
4.2.2.2.3. Espectro de RMN 2D COSY de G28 ..........................................75
4.2.2.2.4. Espectro de RMN 2D do Tipo NOESY........................................76
4.2.2.2.5. Espectro de RMN de
13
C de G-28...............................................78
4.2.2.2.6. Espectros de RMN HMQC e HMBC............................................80
4.2.2.3. G-63 ..................................................................................................85
4.2.2.4. G-65 ..................................................................................................92
4.2.2.5. G-70 ................................................................................................106
4.2.2.6. G-77 e G-90.....................................................................................114
4.3. Caracterização do composto GA-1, obtido da fração acetato de etila de M.
chamaedrys .....................................................................................................115
4.3.1. GA-1...................................................................................................115
5. CONCLUSÕES...................................................................................................122
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................123
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
xiii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Espectro de massas de GO2..................................................................29
FIGURA 2. Principais fragmentações de GO2..........................................................29
FIGURA 3. Espectro de RMN de
1
H de GO2 em CDCl
3
, 400 MHz...........................30
FIGURA 4. Espectro de RMN de 2D, COSY
1
H–
1
H de GO2 em CDCl
3
, 400 MHz. ..31
FIGURA 5. Espectro expandido de RMN de 2D, COSY
1
H–
1
H, região δ 0,89 a 3,25
de GO2 em CDCl
3
, 400 MHz. ...................................................................................32
FIGURA 6. Espectro de RMN de
13
C de GO2 em CDCl
3
, 100 MHz..........................33
FIGURA 7. Espectro expandido de RMN de
13
C de GO2 em CDCl
3
, 100 MHz........34
FIGURA 8. Espectro de RMN de DEPT 135° de GO2 em CDCl
3
, a 100 MHz..........35
FIGURA 9. Expansão do espectro de RMN de DEPT 135°de GO2 em CDCl
3
, a 100
MHz...........................................................................................................................35
FIGURA 10. Espectro 2D, heteronuclear
1
J
H-C
, HMQC de GO2 em CDCl
3
, a 400
MHz...........................................................................................................................36
FIGURA 11. Espectro 2D, heteronuclear, HMBC de GO2 em CDCl
3
, a 400 MHz....38
FIGURA 12. – Espectro expandido 2D, heteronuclear, HMBC de GO2 em CDCl
3
, a
400 MHz....................................................................................................................39
FIGURA 13. Espectro de Massas de GO3................................................................42
FIGURA 14. Fragmentação de GO3.........................................................................42
FIGURA 15. Espectro de RMN de
1
H de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz.........................43
FIGURA 15a. Espectro de RMN de
1
H de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz expandido entre
δ0,85 e 4,28. ............................................................................................................44
FIGURA 17. Espectro de RMN de 2D, NOESY de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz..........47
FIGURA 18. Espectro de RMN de
13
C de GO3 em CDCl
3
, 100 MHz........................48
FIGURA 18a. Espectro de RMN de
13
C de GO3 em CDCl
3
, 100 MHz expandido entre
δ14,00 e 32,43. ........................................................................................................49
FIGURA 19. Espectro de RMN de DEPT 135° de GO3 em CDCl
3
, 100 MHz..........50
FIGURA 20. Espectro de RMN de DEPT 135° de GO3 em CDCl
3
a 100 MHz
expandido entre δ14,32 e 75,40...............................................................................51
FIGURA 21. Espectro de RMN de 2D, HMQC de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz. ..........52
FIGURA 22. Espectro de RMN de 2D, HMBC de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz............53
FIGURA 22a. Expansão do espectro de RMN de 2D, HMBC de GO3 em CDCl
3
, 400
MHz...........................................................................................................................54
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
xiv
FIGURA 22b. Expansão do espectro de RMN de 2D, HMBC de GO3 em CDCl
3
, 400
MHz...........................................................................................................................55
FIGURA 23. Estrutura dos álcoois (GOH e GOH’) de estereoquímica indefinida.....57
FIGURA 24. Espectros de RMN
1
H de GOH e GOH’................................................58
FIGURA 25. Espectro de RMN
13
C de GOH.............................................................58
FIGURA 26. Perfil cromatográfico de GO2, GO3, GOMe e GOMe’ em CHCl
3
e MeOH
(96:4) revelado com Dragendorff. .............................................................................59
FIGURA 27. Cromatogramas das substâncias naturais e modificadas: (A =
GO2+GOMe’+GOMe+GO3; B = GO2+GO3; C = GOMe’; D =GOMe)......................60
FIGURA 28. Estrutura obtida através da difração de raios-X de GOH......................61
FIGURA 29. Cromatograma dos ácidos 2-fenilbutíricos metil ésteres obtidos na
reação do álcool com anidrido 2-fenilbutírico racêmico.............................................62
FIGURA 30. Atribuição do volume dos grupos ligados ao carbono 8. ......................63
FIGURA 31. Estrutura de GOH com estereoquímica absoluta definida (8 R)...........63
FIGURA 32. Estruturas configuracionais dos compostos semi-sintéticos e naturais
GO2 e GO3...............................................................................................................64
FIGURA 33. Demonstração do resultado do ensaio de bioautografia realizado com
os compostos GO2 e GO3 frente à bactéria Escherichia coli ATCC 25792..............66
FIGURA 34. Espectro de RMN de
1
H de G-9, em CDCl
3
, a 400 MHz.......................67
FIGURA 35. Espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-9, em CDCl
3
a 400 MHz.
..................................................................................................................................68
FIGURA 36. Espectro de RMN de
13
C de G-9, em CDCl
3
, a 100 MHz.....................69
FIGURA 37. Espectro de RMN de
13
C DEPT 135°de G-9, em CDCl
3
, a 100 MHz. ..70
FIGURA 38. Espectro de massas de G-28 ...............................................................72
FIGURA 39. Fragmentos iônicos de G-28.................................................................72
FIGURA 40. Espectro de RMN de
1
H de G-28 em CDCl
3
a 400 MHz.......................73
FIGURA 41. Espectro de RMN de
1
H expandido na região entre δ 1,20 e 4,66 de G-
28..............................................................................................................................74
FIGURA 42. Espectro de RMN de
1
H expandido na região entre δ 5,70 e 7,61 de G-
28..............................................................................................................................75
FIGURA 43. Espectro de RMN de 2D, COSY de G28, em CDCl
3
a 400 MHz..........76
FIGURA 44. Espectro de RMN de 2D, NOESY de G-28 em CDCl
3
, 500 MHz. ........78
FIGURA 45. Espectro de RMN de
13
C de G-28 a 100 MHz......................................79
FIGURA 46. Espectro de RMN de
13
C DEPT 135°de G-28 a 100 MHz....................80
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
xv
FIGURA 47. Espectro de RMN 2D, HMQC de G-28 em CDCl
3
a 400,13 MHz.........81
FIGURA 48. Espectro de RMN 2D, HMBC de G-28 em CDCl
3
a 400,13 MHz. ........82
FIGURA 49. Espectros expandidos de RMN 2D, HMBC de G-28 em CDCl
3
a 400,13
MHz...........................................................................................................................83
FIGURA 50. Espectro de RMN de 1H de G-63 em CDCl
3
a 400 MHz......................88
FIGURA 51. Espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-63, em CDCl
3
a 400 MHz.
..................................................................................................................................89
FIGURA 52. Espectro de RMN de
13
C de G-63 a 100 MHz......................................90
FIGURA 53. Espectro de RMN de
13
C DEPT 135°de G-63 a 100,32 MHz...............91
FIGURA 54. Espectro de absorção de Infravermelho de G-65.................................92
FIGURA 57. Espectro de RMN de
1
H de G-65 em CDCl
3
a 400 MHz.......................96
FIGURA 58. Espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-65, em CDCl
3
a 400 MHz.
..................................................................................................................................99
FIGURA 60. Sistema de spins de G-65...................................................................101
FIGURA 61. Espectro de RMN de
13
C de G-65 a 100 MHz....................................103
FIGURA 62. Espectros de RMN de
13
C DEPT 135° e 90° de G-65 a 100 MHz......104
FIGURA 63. Espectro de RMN de
1
H de G-70 em CDCl
3
a 400 MHz.....................107
FIGURA 64. Espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-70, em CDCl
3
a 400 MHz.
................................................................................................................................109
FIGURA 64a. Expansão do espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-70, em
CDCl
3
a 400 MHz....................................................................................................110
FIGURA 64b. Expansão do espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-70, em
CDCl
3
a 400 MHz....................................................................................................112
FIGURA 65. Espectro de RMN de
13
C de G-70 a 100 MHz....................................113
FIGURA 65a. Expansão do espectro de RMN de
13
C de G-70 a 100 MHz.............114
FIGURA 66. Espectro de RMN de
1
H, GA-1, em Acetona-d
6
, a 400 MHz. .............117
FIGURA 67. Espectro de RMN de 2D, COSY de GA-1 em Acetona-d
6
a 400 MHz.
................................................................................................................................118
FIGURA 68. Espectro de RMN
13
C de GA-1 em Acetona-d
6
a 100.32 MHz...........119
FIGURA 69. Espectro de RMN DEPT 135° de GA-1 em Acetona-d
6
a 100 MHz. ..120
FIGURA 70. Espectro de RMN HMQC de GA-1 em Acetona-d
6
a 400 MHz. .........121
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
xvi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Principais sistemas de solventes utilizados nas técnicas cromatográficas.
..................................................................................................................................11
TABELA 2. Cepas utilizadas nos ensaios de bioautografia.......................................13
TABELA 3. Rendimento de resíduo obtido de cada fração.......................................16
TABELA 4. Proporções de solventes utilizados e rendimento em cada fração.........19
TABELA 5. Concentração das amostras requerida para atingir 50% de letalidade
frente a Artemia salina. .............................................................................................24
TABELA 6. Estruturas dos metabólitos isolados e modificados de Melochia
chamaedrys...............................................................................................................26
TABELA 7. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H,
13
C e correlações dos
experimentos COSY e HMBC para GO2, em CDCl
3
.................................................40
TABELA 8. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H,
13
C e correlações dos
experimentos COSY e HMBC para GO3, em CDCl
3
.................................................56
TABELA 9. Determinação da quantidade inibitória mínima de GO3 e derivados de
GO2...........................................................................................................................65
TABELA 10. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H,
13
C e correlações dos
experimentos COSY e HMBC para G-28, em CDCl
3
................................................84
TABELA 11. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H,
13
C para G-65, em CDCl
3
. 105
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
xvii
LISTA DE ESQUEMAS
ESQUEMA 1. Estrutural geral de representação de alcalóides ciclopeptídicos..........4
ESQUEMA 2. Esquema geral da reação de um álcool secundário e um derivado do
ácido 2-fenilbutírico...................................................................................................14
ESQUEMA 3. Regra de Horeau................................................................................15
ESQUEMA 4. Fracionamento do Extrato Bruto.........................................................16
ESQUEMA 5. Refracionamento da fração hexânica e isolamento dos metabólitos
GO2 e GO3...............................................................................................................18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
xviii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
δ
Deslocamento químico
J Constante de acoplamento
λ
Comprimento de onda
µg
Micrograma
ATCC American Type Culture Collection
BB Espectro de carbono totalmente desacoplado
Phe Fenilalanina
°C Grau Celcius
CC Cromatografia em coluna
CCD Cromatografia em camada delgada
CG Cromatografia gasosa
COSY Correlated spectroscopy
d Dubleto
dd Duplo dubleto
EI Ionização eletrônica
EM Espectrometria de massas
Ev Elétron-volt
FAB Fast atom bombardment
FDA Food and Drug Administration
IV Infravermelho
HMBC Heteronuclear multiple-bond correlation
HMQC Heteronuclear multiple-quantum correlation
Hz Hertz
Ileu Isoleucina
Leu Leusina
m Multipleto
mg Miligrama
M + H
+
Íon molecular mais um próton
m/z Relação massa/carga
NOESY Nuclear overhauser enhancement spectroscopy
Pro Prolina
P. Página
Ppm Parte por milhão
Rf Fator de retenção
RMN Ressonância magnética nuclear
s Singleto
t Tripleto
TLAS Teste de Letalidade com Artemia salina
TMS Tetrametilsilano
TSA Trypticase Soy Agar
Trp Triptofano
UFSM Universidade Federal de Santa Maria
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
URI Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai
UI Unidade Internacional
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
1
1 . INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
O estudo de Melochia chamaedrys faz parte do projeto sobre o estudo
químico de plantas medicinais do Rio Grande do Sul, desenvolvido no Núcleo de
Pesquisas em Produtos Naturais da Universidade Federal de Santa Maria – UFSM.
Esse estudo visa à obtenção de substâncias com potencial terapêutico que possam
ser futuramente usadas como protótipos para sínteses de moléculas de interesse
medicinal.
Selecionou-se a raiz de M. chamaedrys para um estudo inicial devido ser esta
a parte mais usada na medicina popular e também, devido à inexistência de
investigação fitoquímica, não somente da raiz, mas também de todas partes da
espécie. Um outro fato interessante que despertou o nosso interesse por esse
estudo e que está dentro desse contexto é que em algumas circunstâncias, esta
espécie é usada em substituição à espécie Waltheria douradinha, Sterculiaceae, a
qual já vem sendo estudada pelo nosso grupo há pelo menos uns dez anos, o que
nos leva, ao mesmo tempo, a fazer um estudo comparativo entre as duas espécies.
O presente trabalho descreve a extração, o isolamento, a caracterização de
dois novos compostos (chamaedrona e chamaedrina) e a identificação de mais oito
compostos conhecidos (ácido parasórbico, adoutina X, antidesmona, (-)-
epicatequina, propacina, scutianina B e C, waltheriona A) da raiz de Melochia
chamaedrys. Além disso, serão discutidos os resultados dos ensaios microbiológicos
realizados com algumas dessas substâncias.
Este trabalho teve como objetivo principal o estudo fitoquímico da raiz da
espécie Melochia chamaedrys St. Hil. e como objetivos específicos à realização:
a) Da extração, separação e purificação de constituintes químicos da raiz da
planta selecionada;
b) Da determinação estrutural dos metabólitos isolados, utilizando-se de
técnicas de análises, tais como: espectrometria de massas,
espectroscopia de ressonância magnética nuclear de
1
H e
13
C
unidimensional e bidimensionais (NOESY, COSY
1
H-
1
H, HMQC e HMQC),
além de comparação com dados da literatura;
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
2
c) Da determinação da estereoquímica dos centros quirais da estrutura dos
alcalóides do tipo quinolinonas, através do estudo de difração de raios-X e
reação de Horeau;
d) Da determinação de toxicidade das frações de Melochia chamaedrys
através do teste de letalidade por Artemia salina;
e) Dos ensaios para determinar a atividade antimicrobiana, através da
técnica de bioautografia dos extratos, frações e de algumas substâncias
isoladas em suas formas puras.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. STERCULIACEAE
A família Sterculiaceae está incluída na ordem Malvales, e compreende cerca
de 70 gêneros de distribuição pantropical, especialmente. São plantas herbáceas,
arbustivas ou arbóreas, com folhas dispostas alternadamente, com estípulas. No
Brasil são exemplos freqüentes as espécies do gênero Waltheria, planta baixa dos
campos e dos cerrados; Helicteres, o popular sacarolha dos cerrados com seus
frutos muitos característicos. Theobroma, valioso cacaueiro, cacau, extensamente
cultivado no sul da Bahia; outra espécie, deste gênero produz na região amazônica
o popular cupuaçu, fruto utilizado em sorvetes, bem como o conhecido cupuaí.
Byttneria, com suas folhas sagitadas é comum nos cerrados. Sterculia, chichá do
Nordeste, cultivado por seus frutos característicos vermelhos com carpelos bem
afastados; a este mesmo gênero pertence o conhecido tacacazeiro da Amazônia;
desta mesma região e do Nordeste é a árvore chamada mutamba (Guazuma).
Brachychiton, originário da Austrália, é cultivado entre nós com o nome de perna-de-
moça. Dombeya, pequena árvore, cultivada nos parques e jardins, introduzida entre
nós, tem características inflorescências brancas ou rosadas, de forma globóide,
pêndulas. Cola é um gênero de espécies africanas com propriedades medicinais.
Das representantes brasileiras as mais significativas, do ponto de vista medicinal,
são as espécies Waltheria communis e W. douradinha, que são conhecidas
popularmente como douradinha e douradinha do campo. Estas plantas têm sido
utilizadas no tratamento de infecções e como analgésico.
1
Desse gênero, existem poucas espécies, sendo que o estudo químico é
bastante restrito; podendo-se citar apenas os alcalóides ciclopeptídicos do tipo
quinolinonas isolados de Waltheria americana
2
e W. douradinha.
3,4
Espécies pertencentes às famílias Sterculiaceae e Rhamnaceae têm
despertado o interesse de pesquisadores, em várias partes do mundo, não só pela
utilização de suas espécies na medicina popular, mas também por apresentarem
como constituintes principais, alcalóides ciclopeptídicos.
5
Esses compostos são
bases mono ou di-metiladas, constituídas por unidades de aminoácidos unidos entre
si, através de ligações amídicas. Em geral, contém uma unidade não aminoácida
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
4
formada por um grupo estirilamina ou um derivado como está representado no
esquema 1.
Esquema 1. Estrutural geral de representação de alcalóides ciclopeptídicos
Devido às diferentes ações farmacológicas associadas a muitos desses
alcalóides, incluindo atividades hipotensivas, antidiarréicas e antidesintérias
5
,
antifúngicas e antibióticas,
6
tais resultados têm incentivado o crescente número de
investigações acerca desses compostos, como isolamentos, determinação estrutural
e síntese.
5,7
Alguns exemplos desta classe de compostos encontram-se presentes
no gênero Melochia e espécies de gênero similares apresentado em seguida.
Uma outra classe de alcalóides de grande importância medicinal encontrada
na família Sterculiaceae é a das quinolinonas. As quinolinonas, hoje
comercializadas, são todas de origem sintéticas.
8
São agentes antibacterianos de
grande interesse na indústria farmacêutica devido à indicação no trato urinário.
8
As
quinolinonas naturais foram obtidas, pela primeira vez, a partir de microrganismo,
mas durante as últimas décadas, quinolinonas contendo uma cadeia alquila na
posição 2 com C
7
-C
15
foram isoladas de numerosas espécies de Rutaceas.
9
2.1.1. MELOCHIA
Melochia é um gênero pantropical com 65 espécies, predominante nas
Américas, desde o sul dos Estados Unidos até o centro da Argentina.
10
As plantas
deste gênero são usadas para tratar inflamações na bexiga,
11
são tumorogênicas
12
e
usadas para curar inchaço abdominal, disenteria
8
e mordidas de cobra.
9
Do ponto de vista químico, as espécies Melochia corcorifolia
15,16
e Melochia
tomentosa
17-21
são as mais estudadas, sendo estas consideradas ricas em
R3
R4 R5
R1
R2
,
,
=
=
=
Leu; Phe; Pro
Leu;
Ile;
Pro;
Phe;
Trp
H;
Me
N
H
N
H
O
NH
O
O
O
N
R1
R2
R4
R5
R3
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
5
alcalóides, particularmente, ciclopeptídicos, quinolinonas e isatinas.
10-16
Neste
trabalho daremos mais ênfase às classes de alcalóides ciclopeptídicos e
quinolinonas, por estas se apresentarem com maior freqüência na espécie estudada.
2.1.1.1. Melochia chamaedrys St. Hil.
Melochia chamaedrys St. Hil. é uma planta conhecida localmente como
“douradinha”, é encontrada na América do sul, mais precisamente, no sul do Brasil,
Argentina e Uruguai. No Estado do Rio Grande do Sul esta espécie é usada pela
população local no tratamento de várias doenças, inclusive, nos casos de infecção
urinária, câncer e hipertensão. Do ponto de vista botânico, esta espécie apresenta
subarbusto; caules de raízes numerosas, prostrados, cilíndricos, tênues, pubérelos,
meio hirsutos, vilosos superiormente; com folhas pecioladas, orbiculadas ou largo
ovadas, obtusas, com base subcordada, com margens crenado-serradas, em cima
hirsutas, em baixo pilosas, ciliadas; inflorescência axilar, umbela, penduculada;
cálice campanulado amplo, com lacínios lanceolados, hirsutos, ciliados; pétalas
obovadas, levemente abrupto ungüiculado; tubo estamenalde forma longistila,
indivisa, duas vezes mais curta que as pétalas; pistilo um terço mais curto que as
pétalas.
1
2.2. Estudos químicos realizados com o gênero Melochia e similares
Em 1975, Kapadia e colaboradores descreveram o isolamento do alcalóide
melochinona (1) a partir do extrato benzênico da raiz de Melochia tomentosa, planta
esta, usada pelos povos nativos de Curaçao, Venezuela no tratamento de câncer de
esôfago.
15
Também da raiz desta mesma espécie, Shukla e colaboradores em 1978
isolaram o composto 6-metoxi-7,8-metilenodioxicumarina (2). Segundo eles, esta
N
H
O
O
1
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
6
publicação constitui a comunicação do primeiro relato de ocorrência de cumarina na
família Sterculiaceae.
14
O
O
O
O
O
2
Neste mesmo ano, Kapadia, Shukla e Basak isolaram de M. tomentosa o
alcalóide melovinona (3), um composto de cadeia aberta análogo a melochinona
(1).
16
Em 1980, esse mesmo grupo de pesquisadores juntamente com o grupo de
Sokoloski e Fales detalha o isolamento e caracterização das isatinas, melosatinas A,
B e C (4, 5 e 6 respectivamente). Neste mesmo artigo são citados os alcalóides
ciclopeptídicos melonovinas A (7) e B (8) e scutianina B (9) isolados em trabalhos
anteriores da mesma planta.
13
N
H
O
O
O
O
3
N
H
O
O
R2
R3
R1
R3
R2
R1
OMe
OMe
OMe
H
H
H
H
H
H
4
5
6
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
7
Posteriormente a melosatina D (10) foi isolada por Kapadia e Shukla da raiz
de M. tomentosa.
17
Bhakuni e colaboradores, em 1987, isolaram das partes aéreas de Melochia
chorcorifolia quatro alcalóides ciclopeptídicos: franganina (11), frangufolina (12),
adoutinaY’ (13) e melofolina (14). Sendo os três primeiros isolados em trabalhos
anteriores.
12
N
H
N
H
O
NH
O
O
O
N
R1
R2
CH(CH
3
)
2
CH
2
CH(CH
3
)
2
CH
2
C
6
H
4
OH
CH
2
C
6
H
5
R1
R2
CH(CH
3
)
2
CH
2
C
6
H
5
7
9
8
N
H
OH
O
O
O
O
10
N
H
N
H
O
NH
O
O
O
N
H
H
R1
R2
CH
2
CH(CH
3
)
2
CH
2
C
6
H
5
R1
R2
CH
2
C
6
H
5
CH
2
CH(CH
3
)
2
CH
2
CH(CH
3
)
2
CH(Me)CH
2
CH
3
11
12
13
N
H
N
H
O
NH
O
O
O
N
OH
H
H
14
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
8
Em contínuo estudo com a espécie M. chorcorifolia, Bhakuni e colaboradores,
em 1991, isolam o Alcalóide pseudooxindólico, melochicorina (15). O tratamento
deste metabólito com anidrido acético e piridina não resultou na formação do
acetato, confirmando, desta forma, a presença natural do grupo hidroxila terciário
nesta molécula.
11
Há dez anos, o grupo de pesquisas do Laboratório de Produtos Naturais da
UFSM conduzido por Morel e colaboradores vem estudando a espécie Waltheria
douradinha (Sterculiaceae), da qual foi possível realizar o isolamento dos seguintes
alcalóides ciclopeptídicos: adoutina Y’ (13), scutianina B (9), waltherina A (16) e B
(17).
3
Recentemente, um novo alcalóide do tipo quinolinona, waltheriona A (18) foi
isolado desta espécie.
4
O nosso interesse em colocar esta espécie nesta revisão
deve-se ao fato de que a espécie Melochia chamaedrys, em certas localidades do
Rio Grande do Sul, é usada em sua substituição; pois segundo as pessoas que a
utilizam, particularmente aquelas do setor rural, afirmam que ambas têm os mesmos
efeitos, do ponto de vista medicinal.
N
H
O
O
OH
15
N
H
N
H
O
NH
O
O
O
N
H
H
16
N
H
N
H
O
NH
O
O
O
N
N
H
H
H
17
N
O
MeO
OMe
Me
OH
O
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
9
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Instrumentos Utilizados
3.1.1. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de RMN uni -[1D:
1
H,
13
C] e os experimentos de efeito nuclear
Overhauser (NOESY), (
1
H x
1
H-COSY), DEPT 135°, heteronuclear de carbono e
hidrogênio (HMQC) e (HMBC) foram obtidos em aparelho Bruker DPX 400, do
Departamento de Química, da Universidade Federal de Santa Maria, operando a
400,13 MHz para
1
H e a 100 MHz para
13
C, usando clorofórmio deuterado (CDCl
3
),
Dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d
6
) e acetona-d
6
, como solventes e TMS como
padrão interno.
Os deslocamentos químicos (δ) foram registrados em partes por milhão
(ppm), em relação ao TMS como padrão interno (δ= 0,00).
3.1.2. Ponto de Fusão
O ponto de fusão de cada substância isolada, foi determinado em aparelho
MQAPF-301 digital da Microquímica, com termômetro não aferido.
3.1.3. Cromatografia Gasosa
Os cromatogramas foram obtidos em cromatógrafos a gás Variam 3800 e CP
3800 equipados com detector de ionização de chama (FID), injetor “SPLIT-
SPLITLESS’, operando com as temperaturas do injetor e do detector a 220 °C e 280
°C respectivamente. O gás de arraste utilizado foi H
2
a 50 Kpa de pressão
(1mL/min.). Foram empregadas colunas capilares de sílica fundida (CCSF) com· 5 m
de comprimento e 0,32 mm de diâmetro, com fases estacionárias quirais ·2,6-Me-3-
Pe-·-CD 50% e Lipodex-E 50%”.
3.1.4. Espectrometria de Massas de Alta Resolução
Para obtenção dos espectros de massa de alta resolução, foi utilizado o
aparelho Bruker BioApex 70 eV Spectromether, do Institut of Biochemistry, Halle-
Saale, Alemanha.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
10
3.1.5. Espectrometria de Massas de Baixa Resolução
As análises foram realizadas em um cromatógrafo a gás marca HP, modelo
6890, do Instituto de Química da UNICAMP.
3.1.6. Espectroscopia de Infravermelho
O espectro de I.V foi registrado em partilhas de KBr num espectrômetro
Perkin-Elmer, modelo LR649122 do Departamento de Química da URI.
3.1.7. Polarímetro
A rotação óptica realizada com as amostras obtidas neste trabalho foi
analisada em Polarímetro Perkin Elmer 341, número em série 9016, dos Institutos de
Química da UNICAMP e UFRGS.
3.2. Materiais e Métodos
3.2.1. Cromatografia, solventes e reveladores
Nas separações cromatográficas em colunas (CC) usou-se sílica gel 60 da
Merck, com granulação equivalente a 70 – 230 mesh. Cromatografias em placas
preparativas foram realizadas usando-se sílica gel 60 GF
254
(Merck).
As pré-análises cromatográficas foram efetuadas em placas de cromatofolhas
A1 de sílica gel 60 GF
254
.
As placas cromatográficas foram reveladas com luz UV (λ
max
254 e 366 nm)
(Spectroline), reativo de Dragendorff, solução de ácido sulfúrico e álcool etílico
(10:90) seguido de aquecimento e por reagente de Erlich específico por grupos
indólicos.
Os solventes e reagentes utilizados foram produtos analiticamente puros
Merck, Vetec e Reagem. Em certos casos, aplicou-se técnica específica de
purificação de solventes, obtendo-se, dessa forma, produtos com maior grau de
pureza.
22
A relação a seguir, apresenta os principais sistemas de solventes utilizados
nas técnicas cromatográficas.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
11
Tabela 1. Principais sistemas de solventes utilizados nas técnicas cromatográficas.
1.Clorofórmio (100%)
9. CHCl
3
, MeOH (93 :
7,0)
17. CHCl
3
, MeOH (50 :
50)
2. CHCl
3
, MeOH (99,5 :
0,5)
10. CHCl
3
, MeOH (92 :
8,0)
18. Tolueno, AcOEt (95
:5,0)
3. CHCl
3
, MeOH (99 :
1,0)
11. CHCl
3
, MeOH (91 :
9,0)
19. Tolueno, AcOEt (90
:10)
4. CHCl
3
, MeOH (98 :
2,0)
12. CHCl
3
, MeOH (90 :
10)
20. Tolueno, AcOEt (85
:15)
5. CHCl
3
, MeOH (97 :
3,0)
13. CHCl
3
, MeOH (85 :
15)
23. Tolueno, AcOEt (80
:20)
6. CHCl
3
, MeOH (96 :
4,0)
14. CHCl
3
, MeOH (80 :
20)
24. Tolueno, AcOEt (70
:30)
7. CHCl
3
, MeOH (95 :
5,0)
15. CHCl
3
, MeOH (70 :
30)
25. Tolueno, AcOEt (50
:50)
8. CHCl
3
, MeOH (94 :
6,0)
16. CHCl
3
, MeOH (60 :
40)
26. Hexano, AcOEt (
20:80)
3.2.2 Determinação de toxicidade “in vivo” através do Teste de
Letalidade por Artemia salina (TLAS)
O ensaio de toxicidade sobre Artemia salina (TLAS) foi inicialmente proposto
por Michael
23
e desenvolvido por Vanhaecke
24
e Meyer
25
. Tem como base, a
habilidade de uma substância em matar larvas de Artemia salina criada em
laboratório. Este método é considerado uma ferramenta bastante eficiente, rápida,
simples e de baixo custo de avaliação preliminar de atividade farmacológica
26
.
Também é muito usado na avaliação da toxicidade de substâncias puras
27
e de
extratos de plantas, na detecção de toxinas fúngicas, metais pesados e pesticidas
28
,
além de “screening” teratológicos e ecotoxicológicos
29
. Uma boa correlação tem sido
feita com TLAS na detecção de compostos antitumorais
25
, anti-Tripanossoma
28
e
antimalárico.
30
O teste é realizado pela eclosão dos ovos da Artemia salina em solução
salina. Após a eclosão, as larvas são submetidas a uma série de diluições da
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
12
amostra por um período de 24 h. Determina-se a CL
50
, concentração letal capaz de
matar 50% da população total de animais, pelo método de Probitos
31
ou por métodos
de regressão linear. As amostras são consideradas ativas quando o teste de
letalidade com Artemia salina, TLAS <1000 µg/mL.
Na tabela 5, encontra-se uma média dos resultados da CL
50
, correspondentes
ao ensaio de TLAS realizado em triplicatas com as frações hexânica, clorofórmica e
acetato de etila de Melochia chamaedrys. O padrão de toxidez utilizado neste ensaio
foi o dicromato de potássio (K
2
Cr
2
O
7
) que é um agente citotóxico, sal de metal
pesado usado para monitorar o desempenho do teste.
3.2.3. Método de Bioautografia
A bioautografia é um método quantitativo aplicado à detecção de compostos
antimicrobianos em misturas de composição variada e mesmo desconhecida. A
amostra a ser testada é aplicada em placa de sílica gel, alumina, papel ou qualquer
outro suporte adequado à cromatografia em camada delgada (CCD). A separação
dos componentes da amostra aplicada com uma fase móvel de escolha pode ser
realizada se o interesse for à verificação dos princípios ativos dentro de uma mistura
complexa. O suporte contendo a amostra é então depositado em uma placa de petri
e sobre esta é aplicado uma fina camada de meio de cultura, proporcionando o
cultivo de um microrganismo sobre os componentes da amostra. A presença de um
composto antimicrobiano é visualizada pela formação de zonas de inibição no
crescimento do microrganismo cultivado. Esta visualização só é possível com a
presença de reveladores químicos. Esses reveladores são corantes indicadores de
microrganismos vivos. Os sais de tetrazólio como TTC (cloreto de 2, 3, 5-trifenil-1H-
tetrazólio) e MTT (brometo de 4,5-dimetil-2H-tetrazólio) são amplamente utilizados
para este fim, pois formam espécies altamente coloridas, conhecidas como
formazanas, ao serem reduzidos por componentes da cadeia transportadora de
elétrons da mitocôndria,
32
tornando fácil à leitura dos resultados.
Os ensaios de determinação de atividade antimicrobiana pelo método de
Bioautografia foram realizados de acordo com Hamburguer e Hostettmann
33,34
.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
13
3.2.3.1. Determinação da Atividade Antimicrobiana “in vitro”
Os ensaios antimicrobianos do extrato metanólico, das frações e substâncias
isoladas de Melochia chamaedrys foram realizados, utilizando cepas padrão (tabela
3) de ATCC (American Type Culture Colletion) e uma cepa isolada de pacientes
(SM-26), cedida pelo Laboratório de Micologia do Departamento de Farmácia da
UFSM. Como referência, foram utilizados os antibióticos cloranfenicol para bactérias
e nistatina para fungos nas concentrações de 0,5 a 0,7 µg para cloranfenicol e 2,3 a
4,0 µg para nistatina, como mostra a tabela 2, página 13.
Tabela 2. Cepas utilizadas nos ensaios de bioautografia
MICRORGANISMOS ANTIBIÓTICOS
Bactérias Gram Positivas
Cloranfenicol (µg)
Staphylococcus aureus ATCC 6538p 0,7
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 0,7
Bacillus subtillis ATCC 6633 0,7
Bactérias Gram negativas
Cloranfenicol (µg)
Salmonella setubal ATCC 19796 0,7
Escherichia coli ATCC 25792 0,5
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 0,5
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 0,6
Fungos (Leveduras)
Nistatina (µg)
Candida albicans ATCC 10231 2,3
Sacharomyces cerevisae ATCC 2601 3,3
Candida dubliniensis SM-26 4,0
Cryptococcus neoformans ATCC 28952 2,4
3.2.4. Método de Horeau
3.2.4.1. Príncipio do Método
Em 1961, Horeau
35
enunciou um método indireto de determinação de
estereoquímica de álcoois secundários. Este método se baseia na reação de um
álcool secundário opticamente ativo com um excesso de anidrido ou cloreto de ácido
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
14
2-fenilbutírico racêmico, em piridina. Esta reação se procede através de resolução
cinética parcial formando ésteres diastereoisoméricos em diferentes proporções. De
acordo com Horeau, a configuração do álcool pode ser determinada através da
medida da rotação óptica do ácido 2-fenilbutírico em excesso na mistura reacional.
Para isso, faz-se necessária à remoção completa das impurezas.
No esquema 2, pode-se observar a reação de um álcool secundário genérico
puro e de estereoquímica desconhecida (a), cujos substituintes são L (substituinte
com maior volume) e M (substituinte de volume médio) que foi submetido a uma
reação com um anidrido ou cloreto de ácido 2-fenilbutírico racêmico formando dois
ésteres diastereoisoméricos (b e c) e os dois ácidos enantioméricos (d e e), dos
ácidos carboxílicos residuais.
Esquema 2. Esquema geral da reação de um álcool secundário e um
derivado do ácido 2-fenilbutírico.
3.2.4.2. Regra de Horeau
Tanto os ésteres diastereoisomérico quanto os enantioméricos do ácido
residual se formam em proporções distintas devido ao efeito estérico dos grupos
volumosos do álcool e do cloreto ou anidrido (+)-2-fenilbutírico, proporcionando
diferentes estados de transições para a reação. Por este motivo, pode-se usar esta
reação para se determinar a estereoquímica do álcool, sendo que para isso,
compara-se o valor da rotação óptica de um enantiômero puro com o da mistura de
enantiômeros (e.e).
Com estes dados, Horeau determinou a estereoquímica de álcoois
secundários, aplicando a seguinte regra: se o excesso enantiomérico for de ácido
C
HOH
M
L
+
X
O
C
2
H
5
H
X
O
H C
2
H
5
O
O
H
H
5
C
2
M
L
H
C
O
O
C
2
H
5
H
M
L
H
C
+
+
OH
O
C
2
H
5
H
OH
O
H
C
2
H
5
(+) - (R)
(-) - (S)
O
O
ou
Cl
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
15
(+)-(S)-2-fenilbutírico, o álcool terá a estrutura (f), e se o excesso for de ácido (-)-(R)-
2-fenilbutírico apresentará a estrutura (g), conforme mostra o esquema 3.
Esquema 3. Regra de Horeau
A medida do excesso enantiomérico pode ser feita através de rotação óptica,
cromatografia líquida ou gasosa
36
. Podendo ser ainda utilizada a espectrometria de
ressonância magnética nuclear de prótons
37
com os ésteres diastereoisoméricos
resultantes da reação do álcool ou amina secundária com os derivados dos ácidos 2-
fenilbutíricos puros. A comparação entre os espectros destes ésteres permite a
determinação da estereoquímica.
3.2.5. Melochia chamaedrys
3.2.5.1. Coleta e identificação Botânica
A espécie Melochia chamaedrys foi coletada no município de Santana do
Livramento – RS em fevereiro e março de 2001. Sua identificação foi realizada pela
professora Thaís S. C. Dorow , do Departamento de biologia da UFSM. Uma
exsicata correspondente à espécie encontra-se depositada no Herbário Botânico da
Universidade Federal de Santa Maria (SMDB) sob o número 9262.
O material vegetal foi selecionado e as raízes, foram secas em estufa de ar
circulante com temperatura controlada a 40 °C durante cinco dias. Após a secagem
as raízes foram trituradas a fino grão em moinho Wiley.
3.2.5.2. Preparação dos Extratos e Fracionamentos
O pó das raízes de Melochia chamaedrys (780 g) foi extraído exaustivamente
com metanol a quente em aparelho de Soxhlet. O solvente foi evaporado à pressão
reduzida em evaporador rotativo, obtendo assim, um líquido viscoso de cor
OH
H M
L
OH
H
M
L
ácido (+)-S-2-fenilbutanóico ácido (-)-R-2-fenilbutanóico
(f) (g)
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
16
avermelhado, denominado extrato bruto (200g), atingindo 25,6% de rendimento em
relação ao material seco. Este foi solubilizado em água e extraído sucessivamente
com hexano, clorofórmio, acetato de etila e butanol. Após a evaporação dos
solventes cada extrato originou respectivamente 10; 4,5; 11 e 35 g de resíduo,
conforme mostra a tabela 3. O esquema 4 página 16, mostra o fracionamento ao
qual o extrato bruto foi submetido.
Tabela 3. Rendimento de resíduo obtido de cada fração.
FRAÇÃO PESO (g) % Relativo ao material seco
HEXÂNICA 10,0 1,28
CLOROFÓRMICA 4,5 0,58
ACETATO DE ETILA 11,0 1,41
BUTANÓLICA 35,0 4,48
Esquema 4. Fracionamento do Extrato Bruto
Antes de se efetuar o estudo químico do extrato bruto metanólico e suas
frações: hexânica, clorofórmica e acetato de etila, fez-se os ensaios preliminares de
toxicidade sobre Artemia salina e microbiológico por bioautografia com o extrato
bruto e as frações hexânica, clorofórmica e acetato de etila, com a finalidade de
detectar em qual das frações pudesse existir compostos com atividade citotóxico e
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
17
antimicrobiana. Vale ressaltar que, a fração butanólica não foi trabalhada neste
aspecto e nem tampouco quanto ao aspecto químico.
3.2.5.3. Bioensaio
O ensaio de TLAS foi realizado com as frações hexânica, clorofórmica e
acetato de etila de Melochia chamaedrys, nas concentrações de 10, 100 e 1000
µg/mL. Este foi executado de acordo com a metodologia proposta por Meyer
3
, cujos
valores correspondentes a CL
50
encontram-se na tabela 5 página 20.
3.2.5.4. Análise da Fração Hexânica
O resíduo hexânico (10 g) foi fracionado a pressão reduzida em coluna de
sílica gel. Neste fracionamento foram obtidos quatro subfrações a partir dos
seguintes solventes adicionados em ordem crescente de polaridade: hexano; éter
etílico; AcOEt e CH
3
OH.
A subfração acetato de etila (1,2 g) foi previamente analisada por
cromatografia de camada delgada (CCD), lâmpadas de U
254nm
e U
365nm,
reagente de
Dragendorff e solução de etanol e ácido sulfúrico (95:05). Detectou-se nesta pré-
análise várias manchas, dentre elas, apenas duas mostraram-se positivas perante o
reagente de Dragendorff, reagente específico para alcalóides. Esta subfração foi
lavada sucessivas vezes com uma mistura de hexano vezes com uma mistura de
hexano e clorofórmio (8:2) até a obtenção de um resíduo viscoso. Este resíduo foi
cromatografado em placas preparativas utilizando-se como eluente clorofórmio e
metanol (95:5). Deste modo foi possível realizar o isolamento dos metabólitos
codificados como GO2 (30 mg) e GO3 (12 mg). O esquema 5 página 18, mostra o
refracionamento desta fração e obtenção dos dois metabólitos mencionados.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
18
Esquema 5. Refracionamento da fração hexânica e isolamento dos
metabólitos GO2 e GO3.
3.2.5.5. Análise da Fração Clorofórmica
O resíduo clorofórmico (4,5 g) foi fracionado em coluna cromatográfica
(c = 80 cm, d = 4 cm), utilizando-se sílica gel 60 (70-230 mesh) como suporte sólido
e um gradiente de clorofórmio e metanol como sistema eluente.
As frações, de 50 mL, foram coletadas em frascos de vidro e analisadas
individualmente em CCD, sendo reunidas conforme suas semelhanças em Rfs,
resultando em 10 frações (Tabela 4).
Todas as frações obtidas apresentaram impurezas, sendo estas submetidas a
novos processos de purificação, por meio de placas preparativas e recristalizações.
Os sistemas de solventes mais utilizados em CCD e placas preparativas foram os
mesmos utilizados na cromatografia em coluna. Desta forma foi possível realizar o
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
19
isolamento de sete substâncias, que foram codificadas pelas seguintes siglas: G-9,
G-28, G-63, G-65, G-70, G-77 e G-90.
Tabela 4. Proporções de solventes utilizados e rendimento em cada fração.
FRAÇÕES SISTEMA ELUENTE COMPOSTO ISOLADO PESO (mg)
1 CHCl
3
Mistura de compostos 220
2 CHCl
3
: MeOH (99,5:0,5) G-9 210
3 CHCl
3
:MeOH (99,5:0,5) G-28 35
4 CHCl
3
:MeOH (99:1) G-63, G-65 60
5 CHCl
3
: MeOH (98:2) G-70, G-77, G-90 160
6 CHCl
3
: MeOH (95:5) Mistura de compostos 130
7 CHCl
3
:MeOH (94:6) Mistura de compostos 180
8 CHCl
3
:MeOH (80:20) Mistura de compostos 350
9 CHCl
3
:MeOH (70:30) Mistura de compostos 300
10 CHCl
3
:MeOH (50:50) Mistura de compostos 800
3.2.5.6. Análise da Fração Acetato de Etila
Da fração acetato de etila de Melochia chamaedrys foi isolado um composto
codificado como GA1. Uma parte desta fração (3 g) foi cromatografada em coluna de
sílica gel, com sistema eluente acetato de etila e tolueno em diferentes proporções.
As frações obtidas de 20 mL cada, na proporção 75:25 entre as frações 8 e 14
possuíam, predominantemente, a substância GA1. Estas foram reunidas conforme
seus Rfs e em seguida concentradas. O resíduo obtido contendo GA1 foi lavado
sucessivas vezes com uma mistura de acetato de etila e hexano (90:10). Desta
forma esse composto foi obtido na sua forma pura, na quantidade de 78 mg.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
20
3.2.5.7. Dados sobre os Metabólitos Isolados das Frações Hexânica,
Clorofórmica e Acetato de Etila de Melochia chamaedrys.
3.2.5.7.1. Antidesmona (19)
Este alcalóide (30 mg) foi obtido do refracionamento em coluna
cromatográfica da fração hexânica e apresentou-se como um óleo viscoso amarelo.
Sua estrutura foi caracterizada por análises de RMN
1
H e
13
C, raios-X e
espectrometria de massas.
Rf: 0,46 (CHCl
3
– MeOH, 96 : 4)
]α[
25
D
+27° (c 1,5, CHCl
3
); +24° (c 1,5, CHCl
3,
Lit.
39,40
)
HRESIME [M+H]
+
a m/z 320.22268 EIMS:m/z = 319 [M]
+
, 207 {[ M]
+
- C
8
H
16
}.
Dados de RMN de
1
H e
13
C (Tabela 7, p. 37)
3.2.5.7.2. Chamaedrona (20)
Este novo alcalóide (12 mg) foi obtido do refracionamento em coluna
cromatográfica da fração hexânica e apresentou-se como um óleo viscoso amarelo,
foi caracterizado por análises de RMN
1
H e
13
C, raios-X e espectrometria de massas.
Rf: 0,28 (CHCl
3
– MeOH 96 : 4);
]α[
25
D
- 3.8 (c 1,2, CHCl
3
).
HRESIME ([M+H]
+
a 336. 25474 EIMS: m/z =335 [M]
+
, 223 {[ M]
+
- C
8
H
16
}.
Dados de RMN de
1
H e
13
C (Tabela 8, p. 54)
3.2.5.7.3. Ácido Parasórbico (25)
Esta substância (210 mg) de aspecto oleoso foi isolada da fração
clorofórmica, sua estrutura foi confirmada através de análises de RMN de
1
H e
13
C e
de dados da literatura.
42
Rf.: 0,55 (CHCl
3
– MeOH 99,5 : 0,5);
]α[
25
D
+170° c 5 em CHCl
3
; +197° (c 6,3
em CHCl
3,
Lit.
42
)
RMN
1
H : δ6,67 (1H, ddd, J = 10, 5, 3 Hz), 5,69 (1H,dt, J =10 e 1,5 Hz), 4,29
(1H, dq, J =9 e 6 Hz), (2 superposição 1H, ddd, J = 9, 3, - 14 e J = 6, 5, -14
Hz), 1,15 (3H, d, J = 6 Hz), RMN
13
C : δ20,20 (6), 30,44 (4), 74,09 (5), 120
(2), 145,07 (3), 164 (1).
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
21
3.2.5.7.4. Propacina (26)
Esta substância (35 mg) foi isolada da fração clorofórmica e apresentou-se
como um sólido branco amorfo, sua estrutura foi confirmada através de análises de
RMN de
1
H e
13
C e de dados da literatura.
46,47
Rf: 0,44 (CHCl
3
– MeOH 98 : 2)
P.f.: 246 – 248°C (Lit.
46,47
226 – 228, 238-241°C)
EIMS: m/z =369,1 [M]
+
, 205,9 (100%); 164 {[M]
+
- C
10
H
6
O
5
}.
Dados de RMN de
1
H e
13
C (Tabela 10, p. 86)
3.2.5.7.5. Scutianina B (27)
Este alcalóide (35 mg) foi obtido da fração clorofórmica e apresentou-se como
um sólido branco cristalino. Teve sua estrutura confirmada por análise de RMN de
1
H e
13
C, comparação em CCD com amostra autêntica e de dados da literatura.
53
Rf: 0,5 (CHCl
3
– MeOH 98 : 1)
P.f.: 248 – 250°C (Lit.
50
247 – 249 °C; [α]
D
= -296° em CHCl
3
).
RMN
1
H : δ 0,94 (3H, d, CH
3
-18); 1,23 (3H, d, CH
3
-19); 2,15 (6H, s, N(CH
3
)
2
);
2,73-3,31 (2H, m, H-30); (1H, m, H-7); 4,4 (1H, dd, H-4); 4,9 (1H, dd, H-3);
6,9-7,3 (14 H, aromático).
RMN
13
C: δ 155,9; 81,5; 54,8; 172,6; 53,9; 166,6; 125,5; 116,3; 132,2; 131,6;
123,1; 122,6;130,1; 29,1; 20,3; 15,1; 171,5; 69,1; 30,8; 140,1; 126,2; 129,0;
127,9, 126,7; 41,7; 29,6; 131,7; 128,5; 126,7; 128,3.
3.2.5.7.6. Chamaedrina (27)
Este novo alcalóide (30 mg) foi isolado da fração clorofórmica após várias
separações em CCD preparativa. Apresentou-se como um sólido branco amorfo e
teve as seguintes características físicas:
P.f.: 222-223 °C; Rf: 0,45 (CHCl
3
– MeOH 98 : 1); [α]
D
= -122,5° c, 1,2;
CHCl
3
), HRESIME ([M+H]
+
a: m/z = 608,3231313 (calc. para C
36
H
41
N
5
O
4
}
EIMS m/z 148 (100%), 130 (C
9
H
8
N), 159 (C
10
H
11
N
2
), 347 (C
20
H
17
N
3
O
3
); IR
v
max
cm
-1
3437 – 3272 (NH), 1640 – 1545 (C=O). Dados de RMN de
1
H e
13
C
(Tabela 10, p. 86)
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
22
3.2.5.7.7. Adoutina X (29)
Este composto (120 mg) apresentou-se como um sólido branco amorfo de
Pf.: 283 - 284 °C ( Lit.
56-58
Pf.: 277- 279, 279 – 280,5 °C; [α]
D
= -316° e –370° em
CHCl
3
) e Rf.: 0,5 (CHCl
3
– MeOH, 98 : 2).
RMN de
13
C δ 156,18 (1); 81,79 (3); 59,36 (4); 172,11 (5); 55,37 (7); 167,07 (8);
125,80 (10); 116,63 (11); 131,98 (12); 130,12 (13); 122,66 (14); 123,09 (15); 131,79
(16); 19,04 (17); 15,14 (18); 11,70 (19); 173,87 (21); 29,70 (22); 34,88 (23); 26,25
(24); 21,83 (25/33); 23,05 (26); 41,94 (28/29); 35,29 (30); 15,94 (31); 20,36 (32).
3.2.5.7.8. Scutianina C (30)
Este metabólito (12 mg) de Pf.: 272 – 273 °C foi isolado da fração
clorofórmica em forma de um sólido branco após cromatografia em placa
preparativa.. Sua identificação foi possibilitada por meio de comparação em CCD
com amostras autênticas e dados da literatura
60
(Pf.: 267 °C).
3.2.5.7.9. Waltheriona A (18)
Esta substância (10 mg) foi obtida da fração clorofórmica na forma de um
sólido branco após várias separações em CCD preparativa. Forneceu Pf.: 207 – 208
e Rf.: 0,4 (CHCl3 e MeOH, 98:2). Sua estrutura foi confirmada por comparação em
CCD com amostra autêntica e dados da literatura
4
descritos abaixo.
P.f.: 206,0 – 207,5°C
[α]
D
= -25,5° c, 0,04 em CHCl
3
; IR v
max
cm
-1
3400 – 3200 (NH), 1685 – 1635
(C=O); HRESIME: m/z = 393,15777 (calc. para C
23
H
23
NO
3
393,15762).
RMN
1
H δ11,27 (1), 7,48 d J = 8,2 (7), 7,41 d, J = 8,2 Hz (8), 4,61 dd, J = 8,0
e 1,7 Hz (10), 1,90/2,13 m (11), 1,82/1,92 m (12), 6,87 dd J = 8,0 e 15 Hz
(13), 6,94 d J = 8,0 e 1,2 Hz (3’), 7,20 ddd J = 8,0; 7,3 e 15 Hz (4’), 6,70 ddd J
= 7,6; 7,3 e 1,5 Hz (5’), 6,29 dd J = 7,6 e 1,5 (6’), 2,41 s (2C-CH
3
), 3,97 s (3C-
OMe), 3,77 s (2’C-OMe).
RMN
13
C δ 141,6 (2); 139,3 (3); 174,4 (4); 119,8 (4a); 141,7 (5); 130,5 (6);
131,8 (7); 117,4 (8); 141,8 (8a); 77,2 (9); 80,16 (10); 21,6 (11); 33,7 (12); 75,6
(13); 134,7 (1’); 156,4 (2’); 110,8 (3’); 128,5 (4’); 120,6 (5’); 131,1 (6’); 14,3
(2C-CH
3
); 55,4 (3C-OMe); 59,2 (2’C-OMe).
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
23
3.2.5.7.10. (-)- Epicatequina (31)
Sólido obtido da fração acetato de etila de; P.f = 235 –236 °C; forma-se em
cristais branco-avermelhado em acetona, quando esta é evaporada; na presença de
solução de cloreto férrico, apresenta mancha de coloração azul escuro. Os dados
obtidos para esta substância neste trabalho, descritos abaixo; foram confirmados
com os dados da literatura.
61
]α[
25
D
- 66° (c, 0,075; CH
3
COCH
3
); Rf = 0,55 (tolueno e AcOET, 70 : 30).
RMN
1
H δ 2,73 (1H, J = 3,2 e J = 16 Hz); 2,86 (1H, J = 4,4 e J = 16 Hz); 4,20
(1H, s); 6,77 (1H, d, J
5’,6’
= 8,4 Hz); 6,83 (1H, d, J
6’,5’
= 8,4 Hz e J
6’,2’
= 1,2 Hz);
7,00 (1H, J
2’,6’,
= 1,2 Hz).
RMN
13
C δ 79,32 (2); 60,53 (3); 20,89 (4); 99,76 (4a); 157,06 (5); 95,68 (6);
157,44 (7); 157,49 (8), 171,00 (8a); 132,17 (1’); 115,19 (2’); 145,17 (3’);
145,19 (4’); 115,46 (5’); 119,32 (6’).
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
24
4. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
Neste item serão discutidos os mecanismos de caracterização dos
metabólitos isolados de Melochia chamaedrys, e serão apresentados os resultados
referentes as suas respectivas atividades biológicas.
4.1. BIOENSAIO
Observa-se na tabela 5 que todas as frações testadas apresentam uma média
toxicidade, visto que, amostras ativas de alta toxicidade são aquelas que
apresentam CL
50
< 50 µg mL
-1
, média toxicidade de CL
50
< 500 µg mL
-1
e de baixa
toxicidade
CL
50
< 1000 µg mL
-1
.
Tabela 5. Concentração das amostras requerida para atingir 50% de letalidade
frente a Artemia salina.
AMOSTRAS CL
50
(µg mL
-1
)
Fração Hexânica 260
Fração Clorofórmica 164,3
Fração Acetato de Etila 162,3
K
2
Cr
2
O
7
19,4
4.2. Estudo Fitoquímico da Raiz de Melochia chamaedrys
O estudo fitoquímico, realizado com o extrato metanólico da raiz de Melochia
chamaedrys, permitiu o isolamento e a determinação estrutural de dois alcalóides
inéditos: um do tipo quinolona e um ciclopeptídico, os quais foram denominados de
chamaedrona (20) e chamaedrina (28). Além dessas substâncias, foram isolados o
ácido parasórbico (25), adoutina X (29), antidesmona (19), (-)-epicatequina (31),
scutianina B (9) e C (30) e waltheriona A (18) ; substâncias isoladas anteriormente
em outras espécies vegetais com registros na literatura
4,39,40,37-41,44,45,46,50,52,53,57,58
.
Na tabela 6 a seguir, encontram-se listadas todas essas substâncias na
ordem de obtenção e apresentação.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
25
A elucidação estrutural dessas substâncias foi efetuada através de métodos
físicos usuais como, EM, RMN de
1
H e
13
C e experimentos uni- e bidimensionais
como COSY, NOESY, DEPT 135°, HMQC e HMBC, além de métodos químicos
como, modificação estrutural. Este último, com a finalidade de confirmar ou tirar
algumas dúvidas em relação à conectividade de alguns substituintes na estrutura.
Também, com algumas dessas substâncias, realizou-se ensaios de frente a
bactérias Gram positivas e Gram negativas e fungos por meio da técnica de
bioautografia.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
26
Tabela 6. Estruturas dos metabólitos isolados e modificados de Melochia
chamaedrys.
Compostos Código
Fórmula
Molecular
[α]
D
Ponto de Fusão Literatura
GO2 C
19
H
29
NO
3
*+27,17°
+24
óleo 35
GO3 C
20
H
33
NO
3
*-3,75° óleo
GOH C
19
H
31
NO
3
*+41° 61º
GOH’ C
19
H
31
NO
3
óleo
GOMe C
20
H
33
NO
3
óleo
GOMe’ C
20
H
33
NO
3
óleo
G-9 C
6
H
8
O
2
+181°
*+170°
óleo 42
G-28 C
20
H
18
O
7
226-228 °C
238-241 °C
*246-248 °C
46
47
*Valores encontrados neste trabalho.
N
H
O
O
O
Antidesmona
19
N
H
O
O
OH
21
N
H
O
O
OH
22
N
H
O
O
O
23
N
H
O
O
O
24
O
O
Ácido Parasórbico
25
O
O
O
O
OH
O
O
Propacina
26
N
O
O
H
O
Chamaedrona
20
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
27
Continuação da Tabela 6.
Compostos Código
Fórmula
Molecular
[α]
D
Ponto de
Fusão
Literatura
G-28Ac C
22
H
20
O
8
202-205 °C
203-204 °C
*199-201 °C
46
47
G-63 C
34
H
40
N
4
O
4
-296°
248-250 °C
*247-249 °C
4
13
53
G-65 C
36
H
41
N
5
O
4
-122,5° 222-223 °C
G-70 C
28
H
44
N
4
O
4
-316°
-370°
277-279 °C
279-280,5 °C
*283-284 °C
56
57
58
G-77 C
31
H
42
N
4
O
4
-231°
267 °C
*272-273 °C 60
G-90 C
24
H
25
NO
6
-25,5°
206-207 °C
*207-208 °C
4
GA-1 C
15
H
14
O
6
-12°
-54°
*- 66°
240 °C
*235-236 °C
61
62
*Valores encontrados neste trabalho.
O
O
O
O
O
O
O
O
Acetato da Propacina
27
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
Scutianina C
30
O
OH
OH
OH
OH
OH
(-) - Epicatequina
31
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
Scutianina B
9
O
N
O
N
N
O
O
N
H
H
H
H
H
1
Adoutina X
29
N
O
MeO
OMe
OH
O
Me
18
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
N
H
Chamaedrina
28
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
28
4.2.1 Caracterização dos compostos GO2 e GO3 obtidos na fração
hexânica de M. chamaedrys.
4.2.1.1. GO2
Este composto foi isolado da fração hexânica (Esquema 5, p. 18),
apresentando-se, depois de purificado, como um óleo de coloração amarela, que
reagiu positivamente frente ao reagente de Dragendorff, sugerindo a presença de
nitrogênio básico na sua estrutura molecular.
A análise de rotação ótica deste metabólito apresentou um [α]
D
= +27,17°
(c = 1,5, CHCl
3
), mostrando tratar-se de uma molécula quiral.
A aplicação de métodos físicos de análises como espectrometria de massas,
ressonância magnética nuclear de
1
H e
13
C e experimentos uni-e bidimensionais,
homo e heteronucleares, assim como a comparação de dados espectrais de outros
alcalóides do tipo quinolonas 6,7 contribuiu nas atribuições dos sinais e na sugestão
da possível estrutura 19 para este metabólito.
19
4.2.1.1.1. Espectro de Massas
O espectro de massas de baixa resolução (EIMS) de GO2 apresentou um
pico à m/z 319 (M
+
), referente ao íon molecular, ao passo que o espectro de massas
de alta resolução (HRESIME) apresentou um íon ”quase molecular” [M+H]
+
=
320,22270. A partir desses dados, juntamente com a análise dos espectros de RMN
de
1
H e
13
C, foi sugerida a fórmula molecular C
19
H
29
NO
3
para GO2.
No espectro de massas de baixa resolução, mostrado na Figura 1, é possível
ver as principais fragmentações que evidenciam a estrutura proposta. O pico base,
por exemplo, a m/z 207 corresponde a uma quebra da cadeia lateral (M-C
8
H
15
) da
N
O
O
O H
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
29
estrutura, e ainda pode ser observada na figura 2 a sucessiva fragmentação desta
cadeia pelos respectivos íons, a m/z 220 (M-C
7
H
15
); 234 (M-C
6
H
13
); 248 (M-C
5
H
11
);
263 (M-C
4
H9); 276 (M-C
3
H
7
); 291 (M-C
2
H
5
) e 304 (M-CH
2
). Estas fragmentações são
decorrentes do mecanismo de clivagem denominado clivagem α. Este tipo de
clivagem leva a formação de um carbocátion e um radical livre. A abundância
relativa desses fragmentos no espectro de massa está associada à capacidade dos
fragmentos formados estabilizarem o radical livre ou a carga positiva formada.
38
Figura 1. Espectro de massas de GO2.
Figura 2. Principais fragmentações de GO2.
4.2.1.1.2. Espectro de RMN
1
H
O espectro de RMN
1
H de GO2 (Figura 3) revela a presença de 18
hidrogênios metilênicos entre δ 1,25 e 2,75, sendo a maioria sobrepostos, de difícil
N
O
O
O
H
m/z 207
m/z 220
m/z 234
m/z 248
m/z 304
m/z 263
m/z 276
m/z 291
m/z 99
m/z 112
m/z 85
m/z 71
m/z 56
m/z 43
m/z 28
m/z 15
+
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
30
atribuição. Entre estes sinais observa-se um singleto intenso em δ 2,35 (3H),
atribuído aos hidrogênios de um grupamento metila, unido a um sistema aromático.
Outro sinal que aparece em δ 3,93 (3H, s) foi atribuído aos hidrogênios de uma
metoxila, também ligada a esse sistema aromático. Observa-se, também, um sinal
ligeiramente deslocado para campo baixo, em δ 8,75, sugerindo que o hidrogênio
esteja ligado a um heteroátomo. Além desses sinais, é de se notar em campo alto
um tripleto em δ 0,89, referente a metila terminal e em δ 3,25 um sinal alargado
correspondente ao único hidrogênio metínico da estrutura.
Figura 3. Espectro de RMN de
1
H de GO2 em CDCl
3
, 400 MHz.
4.2.1.1.3. Espectro de RMN do Tipo COSY
1
H-
1
H
O espectro de RMN de 2D, COSY
1
H-
1
H (Figuras 4 e 5) revela a presença de
um único sistema de spin na molécula. Nesse sistema, é possível observar as
correlações entre o hidrogênio metínico H-5 (δ 3,25) com os pares de hidrogênios
dos grupos metilênicos endocíclicos não equivalentes (H
a
-6; H
b
-6) e (H
a
-9; H
b
-9)
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
31
entre δ 1,37 e 2,07 e a correlação entre os pares hidrogênios (H
a
-6; H
b
-6) e (H
a
-7;
H
b
-7) entre δ 2,07 e 2,58, além de estabelecer uma seqüência de correlações entre
H-5 até 16-Me (δ0,89) da cadeia lateral.
Figura 4. Espectro de RMN de 2D, COSY
1
H–
1
H de GO2 em CDCl
3
, 400 MHz.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
32
Figura 5. Espectro expandido de RMN de 2D, COSY
1
H–
1
H, região δ0,89 a 3,25 de
GO2 em CDCl
3
, 400 MHz.
4.2.1.1.4. Espectro de RMN
13
C
A combinação do espectro de carbono
13
C (Figuras 6 e 7) e experimentos
DEPT 135° permitiram a identificação de 19 sinais distribuídos numa região
N
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
17
18
a
a
b
b
a
b
10
11
12
13
14
15
16
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
33
espectral entre δ 14,06 e 194,91, revelando a existência de um carbono metínico,
nove metilênicos, três metílicos e seis carbonos não-hidrogenados.
Figura 6. Espectro de RMN de
13
C de GO2 em CDCl
3
, 100 MHz.
N
O
O
O H
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
34
Figura 7. Espectro expandido de RMN de
13
C de GO2 em CDCl
3
, 100 MHz.
No espectro de RMN DEPT 135° (Figuras 8 e 9) verificou-se a presença de
nove sinais com amplitude negativa referentes aos carbonos metilênicos (C-6,
C-7, C-9 a C-15) e quatro sinais com amplitude positiva correspondentes aos
carbonos metílicos, (C-16, C-17, C18) e metínico (C-5).
Considerando que no espectro DEPT 135° desaparecem os sinais
correspondentes aos carbonos não hidrogenados, seis carbonos (C-2, C-3, C-4, C-
4’, C-8, C-8’) foram distinguidos dos demais através da comparação com o espectro
de carbono desacoplado. Na tabela 7 encontram-se os valores dos deslocamentos
correspondentes a cada átomo de carbono.
N
O
O
O
H
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
36
4.2.1.1.5. Espectro de RMN do tipo HMQC e HMBC
O espectro bidimensional heteronuclear HMQC (Figura 10) permitiu confirmar
os deslocamentos químicos dos carbonos hidrogenados presentes em GO2, através
da correlação de cada um dos hidrogênios com seus respectivos carbonos.
Figura 10. Espectro 2D, heteronuclear
1
J
H-C
, HMQC de GO2 em CDCl
3
, a 400 MHz.
N
O
O
O
H
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
37
A análise do experimento HMBC (Figuras 11 e 12) permitiu esclarecer
algumas dúvidas com relação à localização de certos grupos e substituintes na
molécula, por exemplo, as localizações do grupo carbonílico (δ 194,91) e do
substituinte n-alquila.
A afirmativa de que o grupo carbonílico se encontrava na posição C-8 foi
definida neste experimento pelo sinal de cruzamento entre os hidrogênios
metilênicos não equivalentes H
a,b
-6, H
a,b
-7 e o carbono C-8 (δ 194,91). Outra
informação importante observada que reforça essa afirmativa e que, ao mesmo
tempo, define a localização do substituinte n-alquila, é a correlação do carbono
metínico C-5 (δ 30,31) com os hidrogênios (H
a
,
b
-6 e H
a,b
-7) e com um dos
hidrogênios metilênicos diastereotópicos da cadeia lateral (H
a ou
H
b
-9) em δ 1,38.
Desta maneira, conclui-se que o substituinte n-alquil se encontra conectado ao
carbono C-5. Pode-se observar ainda no anel aromático que os hidrogênios da
metila (3H-17), que absorvem em δ 2,35, se-correlacionam com o carbono não-
hidrogenado C-2 (δ 138,14), enquanto que os hidrogênios da metoxila (3H-18), que
absorvem em δ 3,93, se correlacionam com o carbono não-hidrogenado C-3 (δ
147,61), sendo que os hidrogênios da metila (C-2) também se correlacionam com
este carbono, sugerindo que os dois substituintes se encontram em carbonos
vicinais. Essas atribuições assim como a localização do grupo carbonílico (δ173,35)
na posição C-4 foram confirmadas pela comparação de dados obtidos de outros
alcalóides do tipo quinolinonas.
15,16
Essas e outras importantes correlações observadas no espectro HMBC estão
presentes na Tabela 7 e visualizadas na estrutura abaixo:
N
O
O
CH
3
CH
3
O
H
H
H
H
H
H
H
H
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
17
18
a
a
b
b
a
10
11
12
13
14
15
16
b
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
40
Tabela 7. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H,
13
C e correlações dos
experimentos COSY e HMBC para GO2, em CDCl
3
.
POSIÇÃO
δ
13
C δ
1
H
COSY
1
H-
1
H HMBC
1
H-
13
C
1 - 8,75
2 138,14 3; 17-Me
3 147,61 2; 18-OMe
4 173,35
4’ 139,10 6
5 30,31 3,25 (1H; *) 6; 9 6; 7; 9
6 24,44 2,07(2H,; m) 5; 7 5; 8; 4’
7 32,25 2,59 (2H; m) 6 6; 8
8 194,91 6; 7
8’ 132,00
9 30,58 1,38 (2H; m) 5; 10 5; 10
10 - 15 22 - 31
16 14,06 0,85 (3H; t) 15
17-Me 14,61 2,35 (3H; s) 2; 3
18-OMe 59,39 3,93 (3H; s) 3
Após a caracterização da estrutura de GO2, constatamos que a mesma havia
sido isolada, em 1999, da espécie Antidesma membranaceum (Euphorbiaceae) por
Buske
39
e colaboladores, os quais a denominaram de antidesmona, correspondente
a um alcalóide isoquinolínico 19a.
Um ano depois (2000), esse mesmo grupo de pesquisadores publicou um
artigo retificando a estrutura desse alcalóide (antidesmona) de estereoquímica
absoluta S.
40
Configuração esta, também obtida por nós e discutida posteriormente.
O
O
N
OH
19a
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
41
Este alcalóide encontra-se patenteado por esse mesmo grupo, pelo fato de o
mesmo exibir uma potente atividade anti-tripanossômica contra o Tripanossoma
cruzi, agente patogênico causador da doença de Chagas
41
. Vale ainda ressaltar que
nos ensaios por bioautografia, realizados por nós, este alcalóide até uma quantidade
inibitória mínima (QIM) de 100 µg não apresentou atividade para os microrganismos
listados na tabela 3.
4.2.1.2. G03
O composto GO3 também foi obtido da fração hexânica (Esquema 3) na
forma de óleo viscoso de cor amarela. Este composto reagiu positivamente frente ao
reagente de Dragendorff, sugerindo a presença de nitrogênio básico na sua
estrutura molecular. Sua estrutura (20) foi cuidadosamente estabelecida pela
comparação dos sinais espectrais de RMN
1
H e
13
C de GO2 e pelas análises
espectroscópicas detalhadas de RMN 2D, incluindo a aplicação dos experimentos
COSY, NOESY, HMQC e HMBC. As análises de espectrometria de massas também
foram fundamentais na elucidação desta estrutura.
20
4.2.1.2.1. Espectro de Massas
Os dados obtidos dos espectros de RMN
1
H e
13
C de GO3 (Tabela 8), além
do íon molecular registrado em m/z 335 no espectro EIMS (Figura 13) e íon “quase
molecular” [M+H]
+
a 336,25474 HRESIMS, conferem ao composto GO3 a fórmula
molecular C
20
H
33
NO
3
. É importante notar que a fórmula molecular C
19
H
29
NO
3
de
GO2, deduzida anteriormente, revelou uma diferença de quatro átomos de
hidrogênios e mais um átomo de carbono quando comparada com a de GO3
(C
20
H
33
NO
3
). O pico base em m/z 193 exibido no espectro EIMS corresponde à
N
O
O
H
O
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
10
11
12
13
14
15
17
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
42
clivagem da cadeia lateral (n-alquila), juntamente com um grupo metoxila (-OMe)
fornecendo, assim, o fragmento principal (100%) (figura 14).
Figura 13. Espectro de Massas de GO3
Figura 14. Fragmentação de GO3
4.2.1.2.2. Espectro de RMN de
1
H
O espectro de RMN
1
H (Figura 15) de GO3 é aproximadamente semelhante
ao composto GO2. A exceção está relacionada à adição de um singleto em δ 3,46,
referente a um grupo metoxila, um multipleto em δ4,20, J = 6 e J = 10 Hz referente a
um hidrogênio metínico na mesma posição do grupo metoxila e as diferenças
significativas, correspondentes aos deslocamentos químicos dos hidrogênios
metilênicos endocíclicos diastereotópicos, (H
a,b
-6 e H
a,b
-8) que absorvem entre δ
1,61 e 2,14.
N
H
O
O
O
- OMe
m/z
m/z 193 (100%)
223
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
44
Figura 15a. Espectro de RMN de
1
H de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz expandido entre δ
0,85 e 4,28.
4.2.1.2.3. Espectro de RMN do Tipo COSY
1
H-
1
H
A conectividade do grupo metoxila ao carbono C-7 observada neste espectro
(Figura16) é muito sugestiva, já que a correlação do hidrogênio metínico H-7
(δ 4,28) ocorre apenas com o par de hidrogênios metilênicos endocíclicos não
equivalentes (H
a
-8, H
b
-8). Por outro lado, percebe-se que esses hidrogênios
metilênicos se correlacionam muito pouco com o outro par de hidrogênios
metilênicos não equivalente (H
a
-6, H
b
-6). É importante notar neste espectro a
correlação entre o hidrogênio metínico H-5 (δ2,91) com um dos hidrogênios de cada
par metilênico do anel (H
b
-6) e da cadeia lateral, (H
a ou
H
b
-9), permitindo, desta
forma, tornar evidente a conectividade da cadeia alifática ao carbono C-5 da
N
O
O
H
O
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
10
11
12
13
14
15
17
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
45
estrutura. Essas e outras correlações encontram-se na tabela 8 (p. 54) e poderão ser
visualizadas na figura abaixo.
Figura 16. Espectro de RMN de 2D, COSY
1
H–
1
H de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz.
4.2.1.2.4. Espectro de RMN do Tipo NOESY
1
H-
1
H
No espectro NOESY (Figura 17) de GO3 observou-se algumas correlações
espaciais importantes que forneceram informações quanto à geometria da molécula.
N
O
O
H
H
H
H
H
H
H
OCH
3
H H
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
17
18
a
a
b
b
a
b
9
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
46
Por exemplo, neste espectro observou-se à interação do hidrogênio metínico H-7,
com um hidrogênio de cada par metilênico do anel (H
b
-6 e H
a
-8) e com os
hidrogênios do grupo metoxila H
3
-19. Estes, por sua vez, interagem com os
hidrogênios H
a
-8 e H
b
-8. Observa-se, também, neste espectro, que o hidrogênio H
b
-6
mostra uma forte interação com os hidrogênios H-5 e H
a
-6 e uma fraca interação
com o hidrogênio H-7. Já o hidrogênio H
a
-6 não interage com H-7 e tem
pouquíssima interação com H-5, logo, sugere-se que, os hidrogênios H-5, H
b
-6 e H-7
estejam do mesmo lado, e que o hidrogênio H-5 esteja em posição cis em relação ao
hidrogênio H-7.
Essas informações, juntamente com os dados presentes na tabela 8,
levou-nos a sugerir a estrutura configuracional I, pelo fato de a mesma apresentar
uma conformação termodinamicamente mais estável (I-a).
I I-a
N
H
O
CH
3
CH
3
O
H
H
H
H
H
H
O
CH
3
H H
a
b
a
b
a
b
2
3
45
6
7
8
4'
8'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
47
Figura 17. Espectro de RMN de 2D, NOESY de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz.
4.2.1.2.5. Espectro de RMN de
13
C de GO3
As atribuições de sinais dos átomos de carbono, pertencentes ao composto
GO3, foram realizadas através de RMN
13
C, utilizando-se os espectros de carbono
totalmente desacoplado (BB) e DEPT 135°, comparando-os com os dados de
deslocamentos de RMN
13
C relatados para antidesmona.
O espectro de carbono (BB), (Figuras 18 e 18a), permitiu a identificação de
vinte sinais distribuídos numa região espectral, entre δ 14,09 e 171,75, indicando a
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
48
presença de carbonos metínicos, metilênicos, metílicos e os não hidrogenados. A
Tabela 8 apresenta os deslocamentos de RMN
13
C obtidos para GO3.
Figura 18. Espectro de RMN de
13
C de GO3 em CDCl
3
, 100 MHz.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
49
Figura 18a. Espectro de RMN de
13
C de GO3 em CDCl
3
, 100 MHz expandido entre
δ14,00 e 32,43.
No espectro DEPT 135° (Figuras 19 e 20) verificou-se a presença de seis
sinais com amplitude positiva, quatro referentes aos carbonos metílicos C-16 (δ
14,09), C-17 (δ 14,40), 18-OMe (δ 59,78), 19-OMe (δ 56,15) e dois referentes aos
carbonos metínicos C-5 (δ 30,91) e C-7 (δ 75,03) e nove sinais com amplitude
negativa correspondentes aos carbonos metilênicos C-6, C-8, C-9 a C-15 (δ 22,20 a
32,51).
Considerando que no espectro DEPT 135°, desaparecem os sinais
correspondentes aos carbonos não hidrogenados, seis carbonos foram distinguidos
dos demais através da comparação com o espectro de carbono desacoplado. Desta
forma, uma grande parte dos sinais foi atribuído aos carbonos da molécula proposta.
Na tabela 8, encontram-se listados os valores correspondentes aos deslocamentos
químicos desses carbonos.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
51
Figura 20. Espectro de RMN de DEPT 135° de GO3 em CDCl
3
a 100 MHz
expandido entre δ14,32 e 75,40.
4.2.1.2.6. Espectro de RMN do Tipo HMQC e HMBC
O espectro bidimensional heteronuclear HMQC, (Figura 21), permitiu
confirmar os deslocamentos químicos dos carbonos hidrogenados, presentes em
GO3, através da correlação de cada um dos hidrogênios com seus respectivos
carbonos já assinalados anteriormente através da análise do espectro
unidimensional de RMN
1
H e dos experimentos bidimensionais COSY
1
H-
1
H e
NOESY.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
52
Figura 21. Espectro de RMN de 2D, HMQC de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz.
As correlações a longa distância via
2
J e
3
J, observadas no espectro HMBC
(Figuras 22, 22a, 23b) foram fundamentais, principalmente, na possível localização
da conectividade do grupo metoxila e cadeia lateral (n-alquila) presente na molécula
proposta para GO3. Neste espectro é possível ver com clareza as correlações do
hidrogênio metínico H-7 (δ 4,28) com o carbono do grupo metoxila (19-OMe) em δ
56,15 e com os dois carbonos não hidrogenados C-4’ (δ 128,87) e C-8’ (δ 140,94)
ppm, sugerindo desta forma a conectividade do grupo metoxila ao carbono C-7. Com
relação à conectividade do substituinte n-alquila ao carbono C-5, apenas uma
correlação foi observada, a correlação de um dos hidrogênios metilênicos
endocíclicos H
a
-6 (δ 1,96) com o carbono metínico C-5 (δ 31,18). As demais
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
53
correlações que permitiram a atribuição dos sinais aos carbonos da estrutura de
GO3, são encontrados na tabela 8 e representados na figura abaixo.
Figura 22. Espectro de RMN de 2D, HMBC de GO3 em CDCl
3
, 400 MHz.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
56
Tabela 8. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H,
13
C e correlações dos
experimentos COSY e HMBC para GO3, em CDCl
3
.
POSIÇÃO δ
13
C δ
1
H COSY HMBC NOESY
1 -
2 137,95 3; 17
3 144,57 2; 18
4 171,75
4’ 128,87 6
5 31,87 2,91 (1H) 6a; 7; 8; 10 6a; 7; 9 6a; 6b; 9a
6 22,65
Ha=1,96
Hb=1,62
5 5; 7; 8; 4’
5
5; 6a; 9a
7 75,03 4,27(1H) 4’; 8’; 19
7; 8b; 19; 8a;
19
8 22,15
Ha=2,14
Hb=1,69
6; 7 6b; 8a; 19
8’ 140,98
9 30,58 5; 10 5; 10 5
10 - 15 22,20 – 32,51
16 14,09 0,86 (3H; t) 15
17 14,40 2,34 (3H; s) 2; 3
18-OMe 59,78 3,93 (3H; s) 3
19-OMe 56,15 3.49 (3H; s) 7; 8a; 8b
Apesar do crescente avanço em técnicas espectroscópicas e
espectrométricas, nem sempre é possível determinar a configuração absoluta de um
produto natural inédito. Neste contexto GO3 é um exemplo. A princípio achou-se que
esse composto poderia ser um derivado de GO2, neste caso a localização do
substituinte estaria na posição C-8, isto é, a metilação ocorreria a partir da redução
da carbonila nesta posição, contrariando, desta forma, a elucidação estrutural
proposta através das análises espectrais.
Com a finalidade de esclarecer tais dúvidas persistentes, desenvolveu-se a
seguinte estratégia:
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
57
A partir do composto GO2 realizou-se a seguinte semi-síntese: GO2 (15 mg)
foi dissolvido em MeOH (2 mL) e NaBH
4
(2 mg) a uma temperatura de 10°C. Após
completar a adição, a mistura foi agitada durante um período de 1 hora. No final da
reação adicionou-se H
2
O para destruição do NaBH
4
restante; em seguida a mistura
reacional foi extraída com CHCl
3
. Finalizada a extração, o solvente foi removido e
obteve-se uma mistura de dois álcoois que foram codificados de GOH e GOH’
(Figura 23).
Figura 23. Estrutura dos álcoois (GOH e GOH’) de estereoquímica indefinida
Esses dois álcoois foram separados em placas de cromatografia de camada
delgada preparativa (CCDP), cujos rendimentos foram respectivamente 66,6% e
13,3% para GOH e GOH’. Após a confirmação da redução do composto GO2,
através de CCD e análises espectrais de RMN
1
H e
13
C (Figuras 24 e 25), fez-se a
metilação dos dois álcoois com diazometano em meio etéreo, obtendo-se, assim, os
compostos GOMe e GOMe’.
N
O
O
HOH
1
2
3
4
4'
5
6
7
8
8'
9
10
11
12
13
14
15
17
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
59
GOMe e GOMe’ foram comparados com GO3 através de análises em CCD
(Figura 26). Verificou-se nesta análise que os Rfs dos dois compostos modificados
apresentaram valores diferentes em relação ao composto natural (GO3), quando
testados em diferentes sistemas de solventes.
A = GO2, Rf = 0.46
B = GO3, Rf = 0,28
C = GOMe, Rf = 0,50
D = GOMe’, Rf = 0.68
Figura 26. Perfil cromatográfico de GO2, GO3, GOMe e GOMe’ em CHCl
3
e MeOH
(96 : 4) revelado com Dragendorff.
A diferença entre GO3 e os compostos modificados (GOMe, GOMe’) também
foi detectada pela injeção em cromatógrafo gasoso (CG), ambos apresentaram
tempos de retenção diferentes com relação ao GO3 (GO3 = 24,0 min., GOMe =
23,19 min. e
GOMe’ = 21,71 min.) (Figura 27). Essas análises comparativas permitiram distinguir
GO3 dos dois compostos semi-sintéticos, podendo, desta forma, concluir que GO3
não é um derivado de GO2. Uma análise de raios-X de GO3 seria necessário para
comprovar a conectividade.
Esta nova substância (GO3) de nomenclatura 3,7-dimetoxi-2-metil-5-octil-
1,4,5,6,7,8-hexaidro-4-quinolinona, foi denominada de chamaedrona. Esta
denominação surgiu da derivação do radical da palavra chamaedrys (chamaedr)
com o sufixo da palavra quinolinona (ona): classe de alcalóides a qual pertence esse
composto.
A B C D
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
60
Figura 27. Cromatogramas das substâncias naturais e modificadas:
(A = GO2+GOMe’+GOMe+GO3; B = GO2+GO3; C = GOMe’; D =GOMe)
4.2.1.3. Definição da configuração relativa dos centros quirais (C-5, C-8)
de GOH através do estudo de raios-X.
Para determinação da difração de raios-X, foi necessário tornar o composto
GOH, de aspecto viscoso, em cristais. Para isso, GOH foi diluído em acetona e
deixado em repouso até a evaporação do solvente, o qual originou cristais possíveis
de serem analisados por este método. A análise do estudo de raios-X deste cristal
pôde confirmar a configuração relativa dos carbonos 5 e 8. A Figura 28 mostra, com
clareza, a geometria cis entre os substituintes n-alquila e hidroxila conectados,
respectivamente a esses carbonos. Embora nesta figura do cristal, os substituintes
apareçam em posição α em relação ao plano, fica claro que não é possível definir a
configuração absoluta nas posições C-5 e C-8 neste experimento com relação ao
plano. Podendo esta também ser demonstrada na posição β, já que se trata de um
A B
C D
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
61
método relativo. Para a confirmação definitiva desta posição, seria necessário
determinar a estereoquímica absoluta de um dos dois centros quirais presentes na
molécula. Para este fim, utilizou-se a técnica de Horeau descrita a seguir:
Figura 28. Estrutura obtida através da difração de raios-X de GOH.
4.2.1.3.1. Determinação da Estereoquímica do Centro Quiral C-8 de GOH
O método de Horeau foi empregado a fim de se determinar a estereoquímica
do carbono 8, dos compostos semi-sintéticos. Para isto, GOH foi submetido a uma
reação com o anidrido 2-fenilbutírico racêmico, obtendo-se, desta forma, dois
ésteres diastereoisoméricos, que foram descartados, e uma mistura de ácidos (+) e
(-)-2-fenilbutíricos em proporções diferentes, conforme mostra o esquema 2 página
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
62
14. A medida do excesso enantiomérico destes ácidos, após a metilação, foi
utilizada para determinação da estereoquímica.
A mistura destes ácidos foi derivatizada utilizando-se diazometano e
analisada por cromatografia gasosa enantiosseletiva (Figura 29).
Figura 29. Cromatograma dos ácidos 2-fenilbutíricos metil ésteres obtidos na reação
do álcool com anidrido 2-fenilbutírico racêmico.
Obteve-se um excesso enantiomérico (7,22%) do ácido (-)-(R)-2-fenilbutírico.
A regra de Horeau determina que, quando o excesso corresponder ao enantiômero
(-)-(R), como neste caso, a estereoquímica do álcool será aquela em que o
substituinte maior (L) ficará próximo ao observador, enquanto que o médio (M) ficará
mais distante, sendo o contrário quando o excesso for do enantiômero (+)-(S). Os
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
63
ligantes OH e H nos dois casos ficarão no plano, conforme podem ser observados
no esquema 3 página 14.
Identificados os grupos L (maior volume) e M (volume médio) para GOH
(Figura 30) e aplicando-se a regra Cahn, Ingold e Prelog (CIP), foi possível
determinar a estereoquímica absoluta para este centro quiral como (R) (Figura 31),
já que se obteve um excesso do ácido residual (R), e o grupo M é o de maior
prioridade que L.
Figura 30. Atribuição do volume dos grupos ligados ao carbono 8.
Figura 31. Estrutura de GOH com estereoquímica absoluta definida (8 R).
Com a determinação da estereoquímica absoluta do carbono 8 pelo método
de Horeau, foi possível ratificar a estrutura do cristal (α em relação ao plano)
presente na Figura 28 e conseqüentemente definir a estereoquímica do carbono 5
(Figura 32, p. 62) como (S). Essas duas técnicas foram essenciais na determinação
da estereoquímica de GO2 e de outros três derivados (GOH’, GOMe, GOMe’), como
também, pôde tirar a dúvida a respeito da conectividade da metoxila no anel não
aromático do composto natural GO3 (chamaedrona).
N
H
O
O
OH
L
M
N
H
O
O
OH
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
64
Figura 32. Estruturas configuracionais dos compostos semi-sintéticos e naturais
GO2 e GO3.
4.2.1.4. Determinação da Atividade Antimicrobiana pelo Método de
Biautografia de GO3 e Derivados de GO2.
Os resultados dos ensaios biológicos, para avaliação da atividade
antimicrobiana do composto GO3, assim como de compostos derivados de GO2,
(GOH, GOH’, GOMe, GOMe’) foram bastante expressivos, quando comparados com
seus padrões; Cloranfenicol para bactérias (0,5 a 0,7µg) e Nistatina para fungos (2,5
a 4,0 µg). Na tabela 9, encontram-se os valores correspondentes à quantidade
inibitória mínima (QIM) das cinco substâncias mencionadas. A substância GO3, por
exemplo, mostrou-se fortemente ativa frente aos microrganismos E. coli, S.
cerevisiae, C. albicans
(QIM = 1,56 µg) e S. epidermidis (QIM = 3,12µg) e uma atividade significativa frente
aos demais microrganismos testados (QIM = 6,25 a 50 µg). A menor quantidade
inibitória para os dois álcoois obtidos (GOH e GOH’) ocorreu frente aos
microrganismos E. coli
(QIM = 1,56µg) para GOH e B.subtilis (QIM = 3,12µg) para GOH’, para os demais
microrganismos testados apresentou uma atividade moderada (QIM = 6,25 a 50µg).
A metilação de GOH, isto é, a transformação para GOMe promoveu uma
notável ampliação do espectro bacteriano. Esta substância foi fortemente ativa para
N
H
O
O
OH
N
H
O
O
OMe
N
H
O
O
OH
N
H
O
O
OMe
N
H
O
O
O
N
H
O
O
O
(20) GOH
(21) GOH'
(22) GOMe
(23) GOMe'
(19) GO2
(20) GO3
S
S
S
S
R
S
R
S
S
S
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
65
todas as bactérias gram positiva e gram negativa testadas (QIM = 1,56µg). Por
outro lado, é de se notar que a atividade frente aos dois tipos de fungos testados (S.
cerevisae, C.albicans) ocorreu o contrário. Para o microrganismo S. cerevisae a
atividade foi reduzida 50 vezes, enquanto para C. Abicans foi totalmente perdida. A
atividade do composto metilado (GOMe’) foi ampliada apenas 50% frente aos
microrganismos
S. aureus, K. pneumoniae e B. subtilis e permanecendo constante para os demais
microrganismos testados. A figura 33 expõe um exemplo do resultado de um desses
ensaios de bioautografia realizado com os compostos naturais GO2 e GO3.
Tabela 9. Determinação da quantidade inibitória mínima de GO3 e derivados de
GO2.
Microrganismos GO2
(µg)
GO3
(µg)
GOH
(µg)
GOH’
(µg)
GOMe
(µg)
GOMe’
(µg)
Padrões
1
(µg)
Staphylococcus aureus ATCC
6538p
NA 25,0 6,25 6,25 1,56 3,12 0,7
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228
NA 3,12 6,25 12,5 1,56 12,5 0,7
Bacillus subtillus ATCC 6633 NA 50,0 NA 3,12 1,56 1,56 0,7
Salmonella setubal ATCC
19796
NA 6,25 12,5 6,25 1,56 6,25 0,7
Escherichia coli ATCC 25792 NA 1,56 1,56 12,5 1,56 12,5 0,5
Klebsiella pneumoniae ATCC
10031
NA 6,25 50,0 25,0 1,56 12,5 0,5
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
NA 25,0 25,0 12,5 1,56 12,5 0,6
Candida albicans ATCC 10231 NA 1,56 1,56 NA NA NA 2,3
Sacharomyces cerevisae ATCC
2601
NA 1,56 1,56 25,0 50,0 25,0 3,3
Candida dubliniensis SM-26 NA NT NT NT 12,5 12,5 4,0
Cryptococcus neoformans
ATCC 28952
NA NT NT NT NA NA 2,4
1
Cloranfenicol para bactérias e nistatina para fungos; NA: não Ativo; NT: não
testado.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
66
É provável que a presença de mais um carbono de hibridização sp
2
no anel
não aromático do composto 19, seja o responsável pela sua não atividade
microbiológica. Isso é percebível pela forte atividade dos compostos modificados (21
a 24) e chamaedrona (20), que apresentam apenas dois carbonos de hibridização
sp
2
e quatro sp
3
no anel não aromático.
Figura 33. Demonstração do resultado do ensaio de bioautografia realizado com os
compostos GO2 e GO3 frente à bactéria Escherichia coli ATCC 25792.
4.2.2. Caracterização dos Compostos Obtidos na Fração Clorofórmica de
Melochia chamaedrys.
4.2.2.1. G-9
O composto G-9 (25) (125 mg) foi isolado da fração clorofórmica e
apresentou-se como óleo de cor castanho-claro. A análise de rotação ótica deste
metabólito apresentou um [α]
D
= +170 (c = 5; CHCl
3
), mostrando tratar-se de uma
molécula quiral. Sua identificação foi possível graças às técnicas espectroscópicas
de RMN de
1
H,
13
C, e experimento bidimensional de COSY, além de dados obtidos
na literatura.
39-41
GO2
GO3
µg 12,5 6,25 3,12 1,56
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
67
25
O espectro de RMN
1
H aliado ao espectro de RMN
13
C sugeriu a presença de
um grupo metila, de um metileno alílico, de um carbono metínico vizinho a um
heteroátomo e de dois hidrogênios olefínicos.
Na região espectral entre δ 1,52 e 6,66 do espectro de RMN
1
H mostrado na
figura 34, é possível observar cinco sinais referentes a oito hidrogênios, sendo 3
hidrogênios pertencentes ao grupo metila (6-Me) em δ 1,52, um hidrogênio metínico
(H-5) em δ 4,30, dois hidrogênios alílicos (H
2
-4) em δ 2,10 e de dois hidrogênios
olefínicos (H-2 e H-3) em δ5,69 e δ6,66, respectivamente.
Figura 34. Espectro de RMN de
1
H de G-9, em CDCl
3
, a 400 MHz.
Na base do espectro
1
H –
1
H COSY (Figura 35) os sinais do intervalo
6,66 – 1,52 foram atribuídos a um sistema de spin. Os sinais em δ 6,66 e 5,69
O
O
1
2
3
4
5
6
O
O
1
2
3
4
5
6
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
68
referentes aos hidrogênios olefínicos H-2 e H-3 estão correlacionados aos
multipletos a δ 2,10 e δ 4,32 atribuídos aos hidrogênios alílicos H
2-4
e hidrogênio
metínico H-5, por sua vez correlacionado ao dubleto da metila em δ1,52.
Figura 35. Espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-9, em CDCl
3
a 400 MHz.
O
O
H
H
H
CH
3
H
1
2
3
4
5
6
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
69
O espectro de RMN
13
C (Figura 36) é bastante informativo para uma lactona,
porque confirma a presença da metila C-6, em δ 20,20, do carbono metileno alílico
C-4 em δ 30,44, do carbono metínico em δ 74,04, dos respectivos carbonos
olefínicos em δ 120,45 e δ 145,07 e mais a presença de um sinal em δ 164,04,
referente a carbonila de lactona.
Figura 36. Espectro de RMN de
13
C de G-9, em CDCl
3
, a 100 MHz.
Os sinais no espectro de DEPT 135° (Figura 37) para o composto G-9 foram
ainda mais precisos, pois foi possível notar o desaparecimento do sinal da carbonila
(C-1), a presença de quatro sinais com amplitude positiva referentes aos carbonos
metínicos (C-2, C-3 e C-5) e metílico (C-6) e um único sinal com amplitude negativa
referente ao carbono metilênico (C-4).
O
O
1
2
3
4
5
6
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
70
Figura 37. Espectro de RMN de
13
C DEPT 135°de G-9, em CDCl
3
, a 100 MHz.
A estrutura 25 determinada através das análises espectroscópicas neste
trabalho e confirmada com dados bibliográficos, corresponde a lactona 5,6-diidro-
6(S)-metil-2H-piran-2-ona, conhecida como ácido parasórbico, substância já descrita
na literatura, porém a sua ocorrência no gênero Melochia está sendo originalmente
descrita neste trabalho.
Esta substância foi isolada, pela primeira vez, do fruto de Sorbus aucuparia
(Rosaceae) por Hofmann há mais de cem anos
42
. Cardellina II e Meinvald também
isolaram esta lactona de Vaccinium macrocarpan. Esses autores relatam ainda em
seu trabalho, a eficiência desta substância em inibir o crescimento de fungo e a
germinação de sementes
40
.
Horton et al
42
e Lichtenthaler et al
43
sintetizaram esta substância. Segundo
eles, esta lactona apresenta uma grande vantagem, pois se trata de uma molécula
simples, fácil de ser sintetizada e de caráter pró-sintético, devido às funções alqueno
e éster presentes na sua estrutura.
O
O
1
2
3
4
5
6
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
71
4.2.2.2. G-28
Esse composto foi isolado da fração clorofórmica de Melochia chamaedrys.
Apresentou-se em forma de um sólido branco amorfo, tornando-se finos cristais
incolores em presença da mistura de acetato de etila e éter de petróleo de ponto de
fusão 246 - 248 °C. A eluição desta substância em CHCl
3
e MeOH (98:2) originou
um
Rf = 0,44.
Através da aplicação de métodos físicos, como espectrometria de massas,
ressonância magnética nuclear de
1
H e
13
C e experimentos uni-e bidimensionais,
como DEPT 135°, COSY, HMQC, HMBC e NOESY, foi possível propor a estrutura
26 a este composto.
26
4.2.2.2.1. Espectro de Massas
O espectro de massas (EIMS) (Figura 38) foi uma das ferramentas de grande
importância na elucidação de 26. A partir dele foi possível deduzir parcialmente os
principais fragmentos e permitir a construção do esqueleto molecular, típico de uma
cumarinalignóide, que posteriormente foi confirmado pelo estudo exaustivo de
espectroscopia de RMN de
1
H e
13
C.
O
O
O
O
OH
O
O
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
72
Figura 38. Espectro de massas de G-28
No espectro de massas (EIMS) foi observado um íon molecular de
m/z = 369,1. Este valor associado aos dados de RMN de
1
H e
13
C, levou-nos a
sugerir a fórmula molecular C
20
H
18
O
7
para a substância em estudo. O pico base à
m/z 205,9 (100%) sugeriu a presença da unidade cumarínica (a), por outro lado, a
eliminação deste íon m/z M–205,9, deixa claro a existência do sistema
(OCH
3
)(OH)C
6
H
3
-CH-CH-CH
3
(b), característico de lignanas.
Essas informações adquiridas nesta análise reforçam a idéia de que os
fragmentos iônicos a e b (Figura 39) constituam a estrutura mencionada para este
composto.
Figura 39. Fragmentos iônicos de G-28.
O
O
OMe
O
O
+
a, m/z =205,9 (100%)
OH
O
b, m/z = 164
.
.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
73
4.2.2.2.2. Espectro de RMN de
1
H DE G-28
O espectro de RMN
1
H de G-28 (Figuras 40 a 42) permitiu identificar a
presença de sinais correspondente a 17 hidrogênios, distribuídos numa região
espectral que compreende deslocamentos entre δ 1,28 a 7,61. Esses sinais
correspondem a hidrogênios metílicos, metínicos, olefínicos e aromáticos,
caracterizando assim a estrutura proposta.
Figura 40. Espectro de RMN de
1
H de G-28 em CDCl
3
a 400 MHz.
Os hidrogênios metílicos são confirmados pela presença de um dubleto a δ
1,28 referente ao grupo metila 4’ sinal resultante do acoplamento com o hidrogênio
H-3’ e a dois singletos a δ 3,88 e δ 3,92, correspondentes aos hidrogênios dos
grupos metoxilas nas posições 6 e 3’’ respectivamente.
O hidrogênio metínico H-2’, apresenta-se como um dubleto a δ 4,66, acopla-
se com o hidrogênio H–3’ (δ 4,21) e este por sua vez, acopla-se com o grupo metila
4’ (δ1,28), apresentando-se como um multipleto.
O
O
O
O
OH
O
O
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
74
Figura 41. Espectro de RMN de
1
H expandido na região entre δ1,20 e 4,66 de G-28.
Na região espectral compreendida entre δ5,70 a 7,61 (Figura 43), encontram-
se os sinais que correspondem aos hidrogênios olefínicos H–3 e H-4 e os
hidrogênios aromáticos H–5, H–2’, H-5’ e H-6’. Também inclui nessa região o sinal
relativo à hidroxila HO-4’.
Os hidrogênios olefínicos H–3 e H–4 com constante de acoplamento J = 9,5
Hz, apresentam-se como dubletos e possuem deslocamentos químicos à δ 6,31 e δ
7,61 respectivamente. Os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento
mencionados para esses hidrogênios são típicos de sistemas cumarínicos
45
, o que
torna mais evidente a estrutura sugerida.
O
O
O
O
OH
O
O
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
75
Figura 42. Espectro de RMN de
1
H expandido na região entre δ5,70 e 7,61 de G-28.
Nesta região, observou-se ainda um singleto em δ 5,70 atribuído à hidroxila
HO-4’’ e outro em δ 6,51 atribuído ao hidrogênio aromático H-5. Observou-se
também a presença de dois dubletos em δ 6,86 e δ 6,95 ppm, atribuídos,
respectivamente aos hidrogênios H-2’’ e H-5’’ (J = 1,9 e J = 8,1 Hz), ambos
acoplados com o hidrogênio H-6’’. Para o hidrogênio H-6’’pode ser observado um
duplo dubleto com deslocamento químico δ 6,90 e constantes de acoplamento J =
1,9 e J = 8,7 Hz.
4.2.2.2.3. Espectro de RMN 2D COSY de G28
Este experimento revelou a interação spin-spin entre os núcleos de
hidrogênios, tornando-se eficiente na atribuição definitiva dos sinais de hidrogênios
na molécula proposta. É possível notar neste espectro (Figura 43) a presença de
dois sistemas de spins. O sistema de spin que aparece em campo mais baixo (δ6,31
e δ 7,61) neste espectro, refere-se à correlação entre os hidrogênios H-3 e H-4, que
aparecem na forma de dubletos (J = 9,5 Hz). Esta correlação torna mais evidente a
O
O
O
O
OH
O
O
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
76
presença do sistema cumarínico na molécula proposta. O outro sistema de spins que
aparece em campo alto, refere-se, as correlações dos hidrogênios do grupo metila
H
3
-4’ e H-2’ com o hidrogênio H-3’.
Principais correlações observadas no espectro COSY de G-28
Figura 43. Espectro de RMN de 2D, COSY de G28, em CDCl
3
a 400 MHz.
4.2.2.2.4. Espectro de RMN 2D do Tipo NOESY
Para análise deste espectro (Figura 44) foi utilizado como ponto de partida o
sinal que absorve em δ 4,66; relativo ao hidrogênio metínico H-2’. Este apresentou
interação espacial com o hidrogênio da metila (H
3
-4’) em δ 1,28 e com H-3’, o que
O
O
O
O
OH
CH
3
O
O
H
H
H
H
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
77
não ajudou a garantir que se tratava de uma geometria cis ou anti entre H-2’ e H-3’.
Por outro lado, sabe-se que H-2’ apresenta constante de acoplamento, J = 7,9 Hz
que conduz a uma interação axial – equatorial, permitido, desta forma, uma
geometria trans entre esses hidrogênios (H-2’ e H-3’). Também a interação espacial
de H-2’ com o hidrogênio aromático, H-2’’ (δ 6,86) do substituinte ligado ao carbono
C-2’ foi bem visível.
Outras interações espaciais observadas no espectro NOESY de G-28 estão
listadas na tabela 10 (p. 76) e podem ser visualizadas na estrutura abaixo.
Principais correlações observadas no espectro NOESY de G-28
O
O
O
O
O
CH
3
H
H
H
H
H
O
CH
3
H
H
CH
3
H
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
78
Figura 44. Espectro de RMN de 2D, NOESY de G-28 em CDCl
3
, 500 MHz.
4.2.2.2.5. Espectro de RMN de
13
C de G-28
A combinação do espectro de RMN
13
C e DEPT 135° facilitou a atribuição dos
sinais de carbonos da estrutura de 26. No espectro de RMN
13
C (Figura 45), foi
observado a presença de vinte sinais de carbonos, numa região espectral
compreendida entre δ17,07 e 160,81. Dos oito carbonos metínicos, cinco aparecem
na região espectral de aromáticos, entre δ 99,94 a 121,23. A unidade cumarínica
α,β-insaturada foi evidenciada pelos sinais δ160,81 (C-2), 74,29 (C-3) e 81,35 (C-4),
O
O
O
O
O
CH
3
H
H
H
H
H
O
CH
3
H
H
CH
3
H
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
79
nestes espectros. A posição relacionada a cada carbono na estrutura, encontra-se
listados na tabela 10.
Figura 45. Espectro de RMN de
13
C de G-28 a 100 MHz.
O espectro de DEPT 135° em concordância com o espectro de
13
C, confirma
que a estrutura química de G-28, é composta por 20 carbonos, 9 não hidrogenados,
8 metínicos e 3 metílicos.
No espectro mostrado na figura 46, é possível notar com clareza a presença
de 11 sinais com intensidade positiva, sendo que, oito deles correspondem aos
carbonos metínicos (C-3, C-4, C-5, C-2’, C-3’, C-2’’, C-5’’, C-6’’) e três aos carbonos
metílicos (C-4’, 6-OMe, 3’’-OMe). A ausência dos demais sinais neste espectro
caracteriza este tipo de experimento, o qual exclui carbonos não hidrogenados.
Deste modo, nove carbonos não hidrogenados são confirmados na estrutura de G-
28, (C-2, C-6, C-7, C-8, C-9, C- 0, C-1’’, C-3’’, C-4’’).
O
O
O
O
OH
O
O
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
80
Figura 46. Espectro de RMN de
13
C DEPT 135°de G-28 a 100 MHz
4.2.2.2.6. Espectros de RMN HMQC e HMBC
O espectro de RMN do tipo HMQC via
1
J
H-C
(Figura 47) permitiu correlacionar
o sinal de cada carbono hidrogenado com o sinal do seu respectivo hidrogênio.
No espectro de RMN do tipo HMBC (Figura 48) apresentando correlações
hidrogênio-carbono via acoplamento à longa distância
3-4
J
H-C
, foi possível observar
as seguintes correlações: O hidrogênio H-2’ correlacionando-se com os carbonos
não hidrogenados (aromáticos), C-1’’, C-2’’ e C-6’’ que aparecem em δ 127,68;
109,74 e 121,24 respectivamente e com os carbonos metínicos C-3’ em δ 74,29 e
metílico C-4’ em δ 17,07. Por outro lado H-3’ correlacionando apenas com os
carbonos C-2’ e C-4’, permitindo desta forma, a confirmação da sua posição e a do
carbono C-2’ com seu respectivo substituinte fenílico. Foi observado também as
correlações dos hidrogênios H-4 e H-3. O hidrogênio H-4 correlaciona-se com os
carbonos C-5, C-9 (δ 138,79) e carbonila C-2 em δ 160,81, já o hidrogênio H-3 em
relação a H-4 é diferenciado pela sua correlação com o carbono C-10 (δ111,53) e a
não correlação com o carbono C-9. Outro dado importante observado foi à
correlação do hidrogênio H-5 com os carbonos C-4, C-6 (δ145,83), C-7 (δ137,68) e
O
O
O
O
OH
O
O
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
81
C-9. Essas informações podem ser mais bem visualizadas nos espectros
expandidos (Figura 49) e na tabela 9.
Figura 47. Espectro de RMN 2D, HMQC de G-28 em CDCl
3
a 400,13 MHz.
O
O
O
O
OH
O
O
2
3
4
5
6
7
8
9
1''
2''
3''
4''
5''
6''
10
2'
3'
4'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
84
Tabela 10. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H,
13
C e correlações dos
experimentos COSY e HMBC para G-28, em CDCl
3
.
POSIÇÃO δ
13
C δ
1
H J COSY
1
H-
1
H HMBC
1
H-
13
C
2 160,81 3; 4
3 114,02 6,31 d (1H, 9,5 Hz) 4 2; 5; 10
4 143,75 7,61 d (1H; 9,5 Hz) 3; 5 2; 5; 9
5 99,97 6,51 s (1H) 6-OMe; 4 3; 4; 6; 7; 9
6 145,83 5; 6-OMe
7 137,68 5; 6-OMe
8 132,28 5; 6-OMe;3’-Me
9 138,79 4; 5
10 111,53 3
2’ 81,35 4,66 d (1H; 7,9 Hz) 3’; 4’-Me 1’’; 2’’; 6’’
3’ 74,29 4,21dq (1H; 7,9 e 6,4 Hz) 2’; 4’-Me 2’; 4’-Me
4’-Me 17,01 1,28 d(3H; 6,4 Hz) 3’; 2’ 8; 2’; 3’
1’’ 127,68 2’; 2’’; 5’’
2’’ 109,74 6,86 d (1H; 1,9 Hz) 2’; 1’’; ;3’’; 4’
3’’ 146,89 5’’; 2’’; 3’’-OMe
4’ 146,36 5’’;6’’, 4’’-OH
5’’ 114,63 6,95 d (1H; 8,1 Hz) 6’’ 4’’-OH
6’’ 121,24 6,90 dd (1H; 8,1 e 1,9 Hz) 5’’; 2’’ 2’; 2’’;4’’-OH
6-OMe 56,27 3,88 s (3H) 6
3’’-OMe 56,04 3,92 s (3H) 3’’
4’’-OH - 5,7 (s) 3’’; 4’’; 5’’
Após a definição estrutural do composto G-28, com base na interpretação de
dados espectrais, principalmente os fornecidos pelos os espectros de ressonância
magnética nuclear de hidrogênio (RMN
1
H) e carbono – 13 (RMN
13
C) uni – (1D) e
bidimensional (2D), verificou-se a existência de informações de RMN
1
H e
13
C e
estereoquímica registradas na literatura para uma substância de estrutura análoga a
de G-28. Essas informações permitiram identificar G-28 como sendo a substância
conhecida como propacina. A certeza de que G-28 tratava-se da propacina também
foi evidenciada quando esta substância foi tratada com anidrido acético e piridina
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
85
pelo processo convencional, para fornecer o derivado monoacetilado G-28Ac (27).
Este derivado apresentou Pf = 199-201 °C, equivalente ao encontrado na literatura
46, 47
, Pf.: 202-203 , 206-204 °C.
27
A propacina foi previamente isolada em Protium opacum (Burseraceae)
46
e
identificada em várias espécies do gênero Jatropha (Euphorbiaceae)
45,48-50
.
Recentemente na raiz da espécie Mondia whitei (Asclepidiaceae) esta substância
também foi encontrada.
51
Devido a interessante atividade biológica desta classe de
compostos, particularmente citotóxica Tanaka et. al.,
47
Lin e Cordell
52
sintetizaram a
propacina e seus regioisômeros a partir da fraxetina (a) e isoeugenol (b). Vale
ressaltar que na família Sterculiaceae o isolamento desta substância ocorre pela
primeira vez.
4.2.2.3. G-63
Este composto foi isolado da fração clorofórmica na forma de um sólido
branco amorfo, o qual mostrou-se homogêneo em CCD em vários sistemas de
solventes. Com o reagente de Dragendorff apresentou reação positiva, produzindo
mancha de coloração alaranjada, sugerindo a presença de nitrogênio básico na
estrutura molecular, característico de alcalóides.
O
O
OH
OH
OH
OMe
a
b
O
O
O
O
O
O
O
O
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
86
A comparação das análises dos dados de RMN de
1
H e
13
C de G-63 com
dados da literatura, como também, a comparação em CCD com amostras autênticas
levou a concluir que o composto G-63, tratava-se de um alcalóide ciclopeptídico,
conhecido como Scutianina-B (9).
9
O espectro de RMN de
1
H (Figura 50) deste composto, permitiu identificar na
região alifática a presença de dois sinais característicos de hidrogênios metílicos que
absorvem à δ 0,88 e 1,18, os quais apresenta-se na forma de dubletos,
correspondentes aos hidrogênios das duas metilas do grupo isopropil, da unidade β-
hidroxileucina. Esses dubletos resultam do acoplamento com um hidrogênio
metínico, neste caso, atribuído ao H-17 de uma unidade hidroxileucina participante
da estrutura de um alcalóide ciclopeptídico. Os hidrogênios atribuídos a H-3 (β-
carbonílico) e H-4 (α-carbonílico), apresentam deslocamentos químicos à δ 4,86 e
4,33, respectivamente. O hidrogênio H-4 apresenta-se como um duplo dubleto,
resultante do acoplamento com H-3 (J = 7,2 Hz) e com o hidrogênio amídico NH-20
(J = 10 Hz). Observa-se também um sinal à δ 2,15 (6H), que corresponde as duas
metilas atribuídas a H
3
-28 e H
3
-29, de um resíduo básico terminal N-N-dimetilado.
Os sinais com deslocamentos químicos entre δ 2,65 e 3,07, que se
apresentam como multipletos, correspondem a hidrogênios metilênicos
diastereotópicos β-carbonílico atribuídos a H-30a e H-30b, de uma unidade
fenilalanina. Esta multiplicidade é resultante do acoplamento destes hidrogênios com
um hidrogênio metínico atribuído ao H-7, o qual foi identificado por apresentar uma
correlação com um hidrogênio amídico, o NH-6 (δ 5,97, d). Também os hidrogênios
O
N
O
N
N
O
O
N
H
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1314
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
32' 33'
26'
25'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
87
diastereotópicos H-23a e H-23b da unidade fenilalanina ligada ao macrociclo,
encontra-se nesta região.
O sinal do hidrogênio metínico H-10 (δ 6,33) da unidade estirilamina foi
identificado por apresentar uma correlação com um sinal pertencente ao hidrogênio
amídico NH-9 (δ 6,54, d) e com o hidrogênio metínico H –11(δ 6,31). Desta forma a
enamina da unidade estirilamina foi identificada.
O espectro de
1
H mostra ainda vários sinais de difícil atribuição,
principalmente, devido à sobreposição dos hidrogênios aromáticos, com
deslocamentos químicos que aparecem numa região entre δ 6,87 e 7,21. Estes
hidrogênios são correspondentes as unidades fenilalaninas, que se trata do
aminoácido terminal e do aminoácido participante do macrociclo. Estas correlações
foram confirmadas através do espectro COSY (Figura 51) juntamente com os
espectros de RMN de
13
C e DEPT 135° (Figuras 52 e 53).
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
91
Figura 53. Espectro de RMN de
13
C DEPT 135°de G-63 a 100,32 MHz
Esta substância foi isolada pela primeira vez da espécie Scutia buxifolia
(Rhamnaceae)
53
, porém nas espécies Melochia tomentosa
13
e Waltheria douradinha
(Sterculiaceae)
4
este alcalóide também foi isolado.
O
N
O
N
N
O
O
N
H
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1314
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
32' 33'
26'
25'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
92
4.2.2.4. G-65
O composto G-65 foi também isolado da fração clorofórmica como um sólido
branco amorfo, com ponto de fusão de 222-223ºC. Na presença de reagente de
Dragendorff reagiu positivamente, produzindo mancha de coloração alaranjada,
sugerindo a presença de nitrogênio básico na estrutura molecular, característico de
alcalóides. Seu espectro de infravermelho (Figura 54) sugere tratar-se de uma
estrutura peptídica, pois o mesmo apresenta bandas em 3437 e 1640 cm
-1
típicos de
grupos NH e CO.
Figura 54. Espectro de absorção de Infravermelho de G-65.
A estrutura 28 proposta para esse alcalóide foi parcialmente deduzida
através das fragmentações obtidas da análise do espectro de massas, que foi
posteriormente confirmada pelo estudo exaustivo de RMN de
1
H e
13
C.
O espectro de massas de baixa resolução (EIMS) (Figura 55 p. 94), de G-65
apresentou um pico à m/z 608 (M
+
), referente ao íon molecular, enquanto que o
espectro de massas de alta resolução (HRESIME) apresentou um íon ”quase
molecular” [M+H]
+
= 608,3231313, correspondente a fórmula molecular C
36
H
41
N
5
O
4
para o composto.
Através da análise do espectro de massas EIMS foi possível identificar vários
fragmentos (Figura 56, p. 96), que auxiliaram na determinação deste alcalóide, como
por exemplo, o pico base, à m/z 148 (100%) sugerindo a presença da unidade N,N-
dimetil fenilalanina em forma de resíduo básico terminal e os sinais de fragmentos de
baixa intensidade a m/z 130 (C
9
H
8
N) e 159 (C
10
H
11
N
2
), típico para peptídios
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
95
Figura 56. Interpretação dos principais fragmentos observados no espectro
de massas de G-65.
Os dados espectrais de RMN do alcalóide discarina B
54
(estrutura 28-A)
serviram de suporte para dedução dos espectros de RMN
1
H,
13
C, DEPT e COSY de
G-65. No espectro de RMN
1
H de G-65 (Figura 57) foi possível identificar os sinais
dos grupos metilas diastereotópicos do β-hidroxiaminoácido como dois dubletos à
δ0,87 (Me-19, J = 6,6 Hz) e δ1,15 (Me-18, J = 6,6 Hz).
N
+
CH
3
CH
3
N
H
H
2
N
N
H
H
2
C
+
+
m/z = 148 (100%)
m/z = 159
m/z = 130
OH
N
H
O
N
H
OCN
m/z = 347
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
96
Figura 57. Espectro de RMN de
1
H de G-65 em CDCl
3
a 400 MHz.
Na região expandida entre δ 2,60 e 2,90 (figura abaixo) é notável a presença
de sinais múltiplos, correspondentes ao hidrogênio metínico H-22 e aos hidrogênios
diastereotópicos (H-23, H-23’) e (H-30 e H30’).
O hidrogênio H-3 (β-carbonílico) da unidade β-hidroxileucina apresentou um
deslocamento químico à δ 4,84, constituindo-se um duplo dubleto, devido ao
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
97
acoplamento com H-17 (J = 2,0 Hz) e com H-4 (J = 7,2 Hz). O hidrogênio metínico
H-4 (α-carbonílico) da mesma unidade apresenta um deslocamento químico à δ 4,33
ppm, na forma de um duplo dubleto, devido ao acoplamento com o hidrogênio
metínico H-3 (J = 7,2 Hz) e com o hidrogênio amídico NH-20 (J = 10,5 Hz). Estes
deslocamentos foram confirmados pela análise do espectro COSY, discutidos a
seguir.
Os hidrogênios aromáticos das unidades p-hidroxi-estirilamina e β-fenilserina,
encontram-se na região entre δ 6,86 e 7,46 em forma de sinais complexos, difíceis
de serem atribuídos, devido à sobreposição de sinais. O sinal referente ao
hidrogênio amídico NH-20 também se encontra localizado nesta região a δ 7,38 (d)
J
20,4
= 10.
Na região entre δ 6,46 e 11,56 do espectro de hidrogênio de G-65, realizado
em piridina (figura abaixo), encontra-se o sinal em δ 11,56, correspondente ao
hidrogênio indólico NH-30, da unidade triptofano. Na expansão do espectro COSY
figura 59 é possível observar a correlação deste hidrogênio com o hidrogênio
metínico do resíduo triptofano.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
98
Através da análise do espectro de RMN de 2D, COSY correlação
1
H-
1
H de G-
65 (Figura 58), foi possível identificar acoplamentos através de correlações que
definiram os seguintes sistemas de spins (Figura 60): (I) o sistema de spins
envolvendo os hidrogênios da unidade β-hidroxileucina; (II) o resíduo terminal
fenilalanina; (III) o grupo N, N-dimetil do resíduo básico terminal; (IV) o aminoácido
triptofano participante do macrociclo; (V) o grupo enamina da unidade estirilamina.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
99
Figura 58. Espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-65, em CDCl
3
a 400 MHz.
Para atribuição dos sinais da unidade β-hidroxileucina foi utilizado como ponto
de partida o hidrogênio NH-20. O sinal deste hidrogênio apresenta correlação com o
sinal do hidrogênio H-4 (α-carbonílico) que por sua vez, correlaciona-se com o
hidrogênio metínico H-3. Não foi observados a correlação do hidrogênio H-3 com o
hidrogênio
H-17. O H-17 apresentou correlação com os hidrogênios heterotópicos das duas
metilas (Me-18 e Me-19), completando assim o sistema de spins da unidade β-
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
100
hidroxileucina. Observa-se também uma correlação do hidrogênio H-4 com H-20 e
H-3.
Constata-se também neste espectro a unidade estirilamina em que o
hidrogênio amídico NH-9 apresenta uma correlação com o hidrogênio metínico H-10.
Este por sua vez, correlaciona-se com o sinal do hidrogênio metínico H-11, definindo
assim a enamina da unidade estirilamina.
Não foi possível atribuir os sinais dos hidrogênios aromáticos das duas
unidades fenilalanina (II) e triptofano (IV), devido à sobreposição dos sinais. Porém,
os hidrogênios não aromáticos pertencentes a esses sistemas de spins (II, IV) foram
atribuídos utilizando como ponto de partida o hidrogênio metínico H-22 para (II) e o
hidrogênio amídico NH-6 (IV). Em (II) observa-se, a correlação do hidrogênio
metínico H-22 com os hidrogênios metilênicos diastereotópicos H-23 e H-23’, estes
por sua vez, correlacionam entre-si. No sistema (IV) fica claro a correlação do
hidrogênio amídico NH-6 com o hidrogênio metínico H-7, o qual apresenta
correlação com os hidrogênios diastereotópicos H-30 e H-30’.
O grupo N,N-dimetil constitui um sistema de spins isolado (III) não
apresentando nenhuma correlação com os outros hidrogênios, portanto, as duas
metilas, 28 e 29 desse grupo, são atribuídos ao típico singleto à δ2,12.
A figura 60 mostra os principais sistemas de spins para o composto G-65.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
101
Figura 59. Espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-65, em piridina a 400 MHz.
Figura 60. Sistema de spins de G-65.
A análise comparativa dos espectros de RMN de
13
C de G-65 (Figura 61) com
o alcalóide discarina B (28-A) juntamente com os espectros DEPT 90° e 135°
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
N
H
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15 16
17
18
19
20
21
22
23
25
26
27
28
29
30
32
33
34
35
36
26'
25'
(I)
(II)
(III)
(IV)
(V)
37
38
39
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
102
(Figura 62) permitiu reconhecer a presença de 36 sinais no espectro de RMN
13
C.
Sendo observado a presença de 27 sinais ligados a hidrogênios nos espectros de
RMN
13
C DEPT 135°: vinte e dois metínicos, dois metilênicos e quatro metílicos. A
diferença entre os números de sinais dos espectros obtidos através das duas
técnicas (BB e DEPT) indicou a existência de nove sinais (36 - 27 = 9)
correspondentes a átomo de carbonos não hidrogenados, sendo três carbonílicos (δ
167,24; 171,54; 172,38) e seis inseridos em anéis aromáticos (δ 116,36 – 156,09).
Também no espectro DEPT 90° foi possível confirmar a existência dos 21 sinais
correspondentes aos carbonos metínicos presente na estrutura. Os demais dados
espectrométricos deste composto encontram-se presente na tabela 11.
Após estas análises, concluímos que o composto codificado como G-65
tratava de um alcalóide ciclopeptídico inédito e denominado neste trabalho de
chamaedrina.
28-A
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
N
H
14,4
28,5
20,1
151,6
82,4
55,5
167,7
64,1
109,2
110,0
122,1
171,2
118,5
119,6
136,4
172,1
12,2
14,8
34,6
27,3
131,3
124,0
125,4
73,9
42,7
127,0
27,7
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
105
Tabela 11. Deslocamentos químicos de RMN de
1
H,
13
C para G-65, em CDCl
3
.
POSIÇÃO
δ
13
C δ
1
H J (Hz)
1 160,81
3 81,89 4,84 (dd) J
3,4
= 7,2; J
3,17
= 2
4 54,96 4,33 (dd) J
4,3
= 7,2; J
4,20
= 10,5
5 171,54
6 - 5,72 (d) J
6,7
= 7,1
7 53,99 4,32 (m)
8 167,24
9 - 6,40 (d) J
9,10
= 7,5
10-16 119,54-131,66
17 29,16 1,85 (m)
18 14,08 1,15 (d) J
18,17
= 6,6
19 20,33 0,87 (d) J
19-17
= 6,6
20 - 7,38 (d) J
20,4
= 10
21 172,2
22 69,36 2,59 (dd) J
22,23
= 7,8; J
22,23’
= 4,2
23,23’ 29,34
2,70 (dd) J
23,22
= 7,8; J
23,23’
= 15
2,81 (dd) J
23’,22
= 7,8; J
22,23’
= 15
24 141,03
25
25’
26 119,27-130,09
26’
27
28-29 41,57 2,12 (s)
30,30’ 31,91 2,83 (dd) J
30,7
= 7,8; J
30,30’’
= 15,6
31 -
32-39 109,64-136,04
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
106
4.2.2.5. G-70
Este composto foi isolado da fração clorofórmica e apresentou-se como um
sólido branco amorfo. Na presença de reagente de Dragendorff, reagiu
positivamente, sugerindo ter na sua estrutura nitrogênio básico, característico de
alcalóides.
Os dados espectroscópicos de RMN de
1
H e
13
C do alcalóide ciclopeptídico
franganina
55
contribuíram para a dedução dos espectros de RMN de
1
H e
13
C
(Figura 63) deste composto, sugerindo tratar-se de um outro alcalóide ciclopeptídico.
Essas informações obtidas nesta análise e análise do espectro COSY de G-70,
foram condizentes com os da literatura para o alcalóide ciclopeptídico adoutina X
(29).
29
Este alcalóide foi isolado previamente da espécie Waltheria americana
(Sterculiaceae)
56,57
. Estudos relatam ainda, o isolamento deste alcalóide na espécie
Ceanothus americanus (Rhamnaceae)
58
. Na espécie em estudo este metabólito se
apresenta em proporções superiores aos demais alcalóides.
Na análise do espectro de RMN de
1
H (Figura 61) deste composto,
observou-se vários sinais na região espectral entre δ0,70 e 1,01 correspondentes a
seis grupos metilas, sendo dois pertencentes à unidade β-hidroxileucina (Me-18 e
19), dois de uma unidade N,N-dimetil-leucina (Me-25 e 26) e dois de uma unidade
isoleucina (Me-31 e Me-32). Os multipletos, com deslocamentos químicos entre δ
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1314
15
16
17
19
20
21
22
23
24
25
26
28
29
30
31
32
27
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
107
1,15 e 1,94 são correspondentes aos hidrogênios metilênicos H-23 e H-30, e aos
hidrogênios metínicos H-17 e H-24.
Figura 63. Espectro de RMN de
1
H de G-70 em CDCl
3
a 400 MHz.
Observou-se, também, um sinal intenso à δ 2,22(6H), correspondente aos
hidrogênios metílicos de uma unidade N,N dimetil do aminoácido básico terminal.
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1314
15
16
17
19
20
21
22
23
24
25
26
28
29
30
31
32
27
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
108
O hidrogênio H-3 (β-carbonílico) da unidade β-hidroxileucina apresentou
deslocamento químico à δ 4,99 que aparece como um duplo dubleto, devido ao
acoplamento com H-17 (J = 2,1 Hz) e com o hidrogênio metínico H-4
(α-carbonílico), que apresenta deslocamento químico à δ 4,47 e desdobra na forma
de um duplo dubleto, devido ao acoplamento com o hidrogênio metínico H-3 (J = 7,0
Hz) e com o hidrogênio amídico NH-20, que acoplam com os hidrogênios α-
carbonílicos H-7 e H-4, respectivamente. O hidrogênio amídico NH-9, da enamina,
apresenta-se também em forma de dubleto com deslocamento químico à δ6,41.
A região espectral que corresponde aos hidrogênios aromáticos deste
composto foi facilmente atribuída, com deslocamentos químicos em δ 7,02 e 7,24.
Os sinais de acoplamento de 7,8 Hz, relação orto, e J = 2,8 Hz, relação meta, em
relação à função éter. Essas constantes de acoplamento são características para
sistemas benzênicos 1,4 disubstituídos
59
.
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1314
15
16
17
19
20
21
22
23
24
25
26
28
29
30
31
32
27
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
109
A análise do espectro de RMN de 2D, COSY
1
H-
1
H (Figura 64) possibilitou
identificar os sinais de hidrogênio que constituem as três unidades aminoácidas
(leucina, isoleucina e β-hidroxileucina) presentes na molécula.
Figura 64. Espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-70, em CDCl
3
a 400 MHz.
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1314
15
16
17
19
20
21
22
23
24
25
26
28
29
30
31
32
27
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
110
Para atribuição dos sinais da unidade β-hidroxileucina, foi utilizado como
ponto de partida o hidrogênio amídico NH-20 que absorve em δ 7,63, o qual
correlaciona-se com o hidrogênio metínico H-4 em δ 4,77, este por sua vez,
correlaciona-se com o hidrogênio metínico H-3 à δ 4,99. Neste espectro não foi
observados a correlação do hidrogênio H-3 com H-17. O H-17 apresenta correlação
com os hidrogênios heterotópicos das duas metilas (Me-18 e Me-19). Completando
assim o sistema de spins da unidade β-hidroxileucina. Observa-se também uma
correlação do hidrogênio H-4 com H-20 e H-3.
Figura 64a. Expansão do espectro de RMN de 2D, 1H-1H COSY, de G-70, em
CDCl
3
a 400 MHz.
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1314
15
16
17
19
20
21
22
23
24
25
26
28
29
30
31
32
27
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
111
Constata-se também no espectro COSY
1
H-
1
H (Figura 64b) da unidade
esterilamina em que o hidrogênio amídico NH-9 apresenta uma correlação com o
hidrogênio metínico H-11, definindo assim a enamina da unidade esterilamina.
A atribuição para a unidade leucina do resíduo básico terminal iniciou pelo sinal
correspondente ao hidrogênio H-22, o qual correlaciona-se com os hidrogênios
metilênicos diasteriotópicos H-23 e H-23’. O hidrogênio H-23 também apresenta
correlação com H-23’ e com H-24, por sua vez, correlaciona-se com as duas metilas
heterotópicas Me-25 e Me-26 completando o sistema de spins.
Para atribuição dos sinais da unidade isoleucina, foi utilizado como ponto de partida
o hidrogênio amíidico NH-6 que absorve em δ 5,86, o qual se correlaciona com o
hidrogênio metínico H-7 em δ3,98, este por sua vez, correlaciona-se com o
hidrogênio H-29 a δ 2,09, que apresenta correlação com CH
3
-32 que absorve a δ
0,71. O hidrogênio metílico CH
3
-31 que absorve a δ 0,80 correlaciona-se com os
hidrogênios diastereotópicos H-30, H-30’ a δ 1,21 e 1,30 definido desta forma o
sistema de spins para unidade isoleucina.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
114
Figura 65a. Expansão do espectro de RMN de
13
C de G-70 a 100 MHz.
4.2.2.6. G-77 e G-90
Os metabólitos G-77 (30) e G-90 (18) foram isolados da fração clorofórmica
(tabela 3), apresentando-se em forma de sólido branco, após purificação em CCDP.
Esses metabólitos foram identificados, respectivamente como scutianina C
60
e
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1314
15
16
17
19
20
21
22
23
24
25
26
28
29
30
31
32
27
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
115
waltheriona A,
4
ambos pertencentes às classes de alcalóides ciclopeptídicos e
alcalóides do tipo quinolonas. Essa confirmação foi gerada a partir da comparação
em CCD destes alcalóides com amostras autênticas e seus respectivos ponto de
fusão (ver tabela 6, p. 23).
4.3. Caracterização do composto GA-1, obtido da fração acetato de etila
de M. chamaedrys
4.3.1. GA-1
O extrato de acetato de etila após ser submetido ao fracionamento em coluna
cromatográfica, forneceu um sólido que foi codificado como GA-1 de
p.f. = 235 – 236 °C. Este na presença de solução de cloreto férrico apresentou
mancha de coloração azul-escuro, característico de compostos fenólicos. Houve
também a formação de cristais de coloração branco-avermelhado em acetona para
este composto, cujo [α]
20
= -66° (c = 0,075; CH
3
COCH
3
).
Os dados espectroscópicos de RMN de
1
H,
13
C, COSY, DEPT e HMQC do
metabólito GA-1 foram compatíveis com os dados espectroscópicos de RMN
encontrado na literatura para o flavonóide (-)-epicatequina (31).
61
Esta substância
apresenta propriedade antiinflamatória e antioxidante.
62
O
N
H
O
N
H
NH
O
O
N
H
H
30
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
2
3
4
5
6
7
8
4a
8a
1'
2'
3'
4'
5'
6'
A
B
C
N
O
MeO
OMe
OH
O
Me
18
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
116
31
O espectro de RMN de
1
H (Figura 66) em acetona-d
6
forneceu dados que
possibilitaram atribuir os sinais correspondentes aos hidrogênios dos anéis A, B e C
de 31.
O anel C foi caracterizado pelos sinais em δ 4,20 (1H, s) para H-3 e δ 4,87
(1H, d, J = 3) para H-2. Os duplos dubletos a 2,86 (1H, J = 4,4 e J = 16 Hz) e 2,73
(1H,
J = 3,2 e J = 16 Hz) referem-se aos hidrogênios diastereotópicos H
4b
e H
4a
,
respectivamente. Estas correlações podem ser mais bem visualizadas no espectro
de COSY (Figura 67). O anel A, com dois substituintes OH nas posições 5 e 7 é
caracterizado pelos dois dubletos em δ 5,92 e 6,01 (J
6,8
= 2,4 Hz) referentes aos
hidrogênios H-6 e H-8. Entretanto, os sinais observados na região entre δ 6,70 e
7,00 apresentam uma multiplicidade indicativa de duas substituições OH – 3’, 4’
conforme esperado para o anel B. Os hidrogênios H-6’ e H-5’, aparecem à δ 6,83
(1H, d, J
5’,6’
= 8,0 Hz (J
6’,2’
= 1,2 Hz) e δ 6,77 (1H, d, J
5’,6’
= 8,4 Hz). O dubleto em δ
7,00, corresponde ao hidrogênio H-2’, com J
2’,6’
= 1,2 Hz, característico de
acoplamento de hidrogênio meta e o sinal alargado que aparece em δ 8,00
corresponde as quatro hidroxilas ligadas aos anéis A e B.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
118
Figura 67. Espectro de RMN de 2D, COSY de GA-1 em Acetona-d
6
a 400 MHz.
O espectro de RMN de
13
C juntamente com os espectros de DEPT 135° e
HMQC (Figuras 68, 69 e 70), de GA1 permitiram confirmar a estrutura 31 proposta,
através da identificação dos três sistemas de anéis na molécula. Na região espectral
relativa a carbono sp
3
, caracterizou-se o anel C, através dos sinais a δ 28,89,
referente ao carbono metilênico C-4, à δ 66,89 e 79,32 relativos aos carbonos
metínicos C-2 e C-3, respectivamente. O anel A, que apresenta substituição 5,7 –
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
2
3
4
5
6
7
8
4a
8a
1'
2'
3'
4'
5'
6'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
119
diidróxi, foi identificado através das ressonâncias em δ 157,06 para C-5 e δ 157,44,
para C-7, com desblindagem típica para carbonos sp
2
contendo substituintes com
efeito mesomérico (+M).
Em conseqüência, C-6 e C-8, corresponderam aos sinais em δ95,08 e 94,37,
demonstrando aumento de densidades eletrônicas para os carbonos em posição
orto aos grupos fenólicos. Essa característica foi também observada para o anel B,
que apresenta substituição 3’,4’-diidróxi (Figura 65).
Figura 68. Espectro de RMN
13
C de GA-1 em Acetona-d
6
a 100.32 MHz.
No espectro de DEPT 135° (Figura 66) nota-se a presença de sete sinais com
intensidade positiva correspondentes aos carbonos metínicos (C-2, C-3, C-6, C-8, C-
2’, C-5’, C-6’) e um único sinal com intensidade negativa referente ao carbono
metilênico C-4. Os demais sinais vistos no espectro de
13
C e ausente neste
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
2
3
4
5
6
7
8
4a
8a
1'
2'
3'
4'
5'
6'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
121
A atribuição dos respectivos carbonos hidrogenados, presentes na estrutura
proposta, foi também facilitada com a ajuda do espectro HMQC, presente na figura
67.
Figura 70. Espectro de RMN HMQC de GA-1 em Acetona-d
6
a 400 MHz.
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
2
3
4
5
6
7
8
4a
8a
1'
2'
3'
4'
5'
6'
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
122
5. CONCLUSÕES
Da raiz de Melochia chamaedrys foram isoladas quatro classes de compostos
naturais; alcalóides, cumarinalignóides, flavonóides e lactonas, tendo a classe dos
alcalóides subdividida em dois grupos de compostos denominada de alcalóides
ciclopeptídicos e alcalóides do tipo quinolinonas.
Através de métodos espetroscópicos e espectrométricos usuais, IV, EM,
raios-X e RMN (1 e 2D) e, em alguns casos pela comparação direta com uma
amostra autêntica, foi possível identificar os seguintes compostos: ácido parasórbico
(25), adoutina X (29), (-)–epicatequina (31), propacina (26), walteriona A (18),
scutianina B(9) e C (30), todos conhecidos, e dois alcalóides inéditos a chamaedrona
(20) e chamaedrina (28). Outros quatro novos compostos semi-sintéticos foram
também sintetizados a partir do alcalóide antidesmona, codificados pelas siglas GOH
(21), GOH’ (22), GOMe (23) e GOMe’ (24).
Os alcalóides inéditos, como também o alcalóide 19 e seus derivados foram
submetidos a ensaios para avaliação da atividade antimicrobiana. Todos se
mostraram ativos, com exceção dos alcalóides 19 e 28.
Os testes de letalidade contra Artermia salina revelaram que as frações
(hexânica, clorofórmica e acetato de etila) de Melochia chamaedrys, apresentaram
uma toxicidade moderada. A fração hexânica da qual foram isolados os compostos
19 e 20, apresentou uma CL
50
maior que as demais frações, indicando esta possuir
uma toxicidade inferior, em relação a essas frações.
Com relação à comparação da espécie Melochia chamaedrys com a espécie
Waltheria douradinha, planta também estudada pelo nosso grupo de pesquisa,
pode-se comprovar a existência de três compostos em comum, 9, 18 e 19, sendo o
último recentemente isolado pelo grupo.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
123
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. JOLY, A. B., Botânica. Introdução à taxonomia vegetal. 2.ed., p. 450-463, 1977.
2. PAÏS, M., MAINIL, J., GOUTAREL, R. Ann. Pharm. Franc., 21 (2), p.139, 1963.
3. MOREL, A. F., Gehrke, I. L. T. S., et. al. Phytochemistry, 51, p. 473-477, 1999.
4. HOELZEL, S. C. S. M., et. al. Phytochemistry, 66, p. 1663-1167, 2005.
5.TSCHESCHE, R., KAUSSAMAN, E. V., “The Alkaloids”, v. 15, Manske (ed).
Academic Press, New York, N. Y., p. 165, 1975.
6. MACHADO, E. C. S., ZANATTA, N., MOREL, A. F. Química Nova. 16, p. 397-402,
1993.
7. SCHIMIDT, U., et. al. J. Org.Chem., 48, p. 2680, 1983.
8. MITSCHER, L. A., Chem. Rev. 305, p. 559-592, 2005.
9. GRUNDON, M. F., The Alkaloid. V. XVII, New York, Ac. Press, p. 105-198, 1975.
10. GOLDBERG, A., Contr. U. S. Natl. Herb., v.34, p.134-363, 1967.
11. BHAKUNI, R. S., SHUKLA, Y. N, THAKUR, R.S., Phytochemistry, 9, p. 3159-
3160, 1991.
12. BHAKUNI, R. S., SHUKLA, Y. N, THAKUR, R.S., Phytochemistry, 26, p. 334-335,
1987.
13. KAPADIA, G. J., et. al., Tetrahedron, 36, p. 2441-2447, 1980.
14. SHUKLA, Y. N., et. al., Phytochemistry, 15, p. 1788. 1976.
15. KAPADIA, G. J., et. al., J. Am. Chem. Soc., V. 97 (23), p. 6814-6819, 1975.
16. KAPADIA, G. J., SHUKLA, Y. N., BASAK, S. P., Phytochemistry, 17, p.1444-
1445, 1978.
17. KAPADIA, G. J., SHUKLA, Y. N., Planta Medica, 59, p. 568-569, 1993.
18. MORTON, J. F., Morris Arbor Bull, 25, p. 24. 1974.
19. O’GARA, R.W., et. al., J. Nat. Cancer inst., 52, p. 445, 1974.
20. C.S.I.R., New Delhi, V. 1, p. 334, 1962.
21. CHOPRA, N. R., NAYAR, S. L., CHOPA, I. C., Glossary of Indian Medicinal
Plants. C.S.I.R. New Delhi, p. 164, 1956.
22. PERRIN, D. D., ARMAREGO, W. L. F. AND PERRIN, D. R. Pergamon Press, 2ª
ed. 1980.
23. MICHAEL, A. S., THOMPSON C. G., ABRAMOVITZ, M., Science, v. 123, p. 464,
1956.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
124
24. VAN HAECKE, P., PERSUUNE, G., Ecotoxicology. Environmental Safety, v. 5
p. 352-387, 1981.
25. MEYER, B. N, et al. , Planta Medica, v. 45, p. 31-34, 1982.
26. COLEGATE, S. M., MOLYNEUX, R. J., CRC Press, EUA, p. 507, 1993
27. CADWELL, G. S., MATTHEW, G. B., PETER, J. W. , Toxicon, v. 12, p. 120-127,
2003.
28. CARBALLO, J. L. et al., BMC Biotecnology, v. 2, p. 17-20, 2002.
29. ALVES, T. M., et al. Biological “screening” of Brazilian medicinal plants. Memorial
Instituto Oswaldo Cruz, v. 95, n. 3, p. 367-373, 2000.
30. CHENG, S. S., et al., Bioresource Technology, v. 89, p. 99-102, 2003.
31. FINNEY, D. J., University Press, Cambridge, p. 55-80, 1974.
32. ATMAN, F. P., Stuttgart, Gustav Fischer Verlag, p. 56, 1976
33. HAMBURGUER, M. HOSTETTMANN, K., Phytochemistry, v. 30, p.3864, 1991.
34. HAMBURGUER, A. L., FUCHS, A., J. Chromatography, v. 51, p. 327-329, 1970.
35. HOREAU, A., Tetrahedron Letters, v. 15, p. 1527-1530, 1961.
36. CHRISTENSEN, S. B., Journal of Organic Chemistry, v. 48, p. 396-399, 1993.
37. HELMCHEN, G., Tetrahedron Letters, v. 16, p. 1527-1530, 1974.
38. FERREIRA, J. T. B., et. al., Série de Textos da Escola de Verão em Química V,
Editora da UFScar, São Carlos-SP, p. 77, 2001.
39. BUSKE, A., et. al., Tetrahedron, 55, p. 1079-1086, 1999.
40. BRUGMANN, G., et. al. Tetrahedron, 56, p. 3691-3695, 2000.
41. BRUGMANN, G., et. al. Pharmaceutical and Pharmacological letters 11 (2), p.
47-48, 2001.
42. CARDELLINA II, J. H., MEINWALD, J., Phytochemistry, v. 19, p. 2199-2200,
1980.
43. HORTON, A. M., LEY, S. V., J. Organometallic Chem., v. 285, p. 17-20, 1985.
44. LICHTENTHALER, F. W., KLINGER, F. D., JARGLIS, P., Carbohydrate
Research, v. 132, p. 1-4, 1984.
45. PARTHASARATHY, M. R., SARADHI, K. P., Phytochemistry. V.23, n.4, p. 867-
869, 1984.
46. ZOGHBI, M. G. B., ROQUET, N. F., GOTTLIEB, O. R., Phytochemistry, v.20, p.
180, 1981.
47. TANAKA, H., et. al., Chem. Pharm. Bull. 36 (5) p. 1738-1743, 1988.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
125
48. DAS, B., VENKATAIAH, B., Biochemical Systematics and Ecology, 29, p.213-
214, 2001.
49. GOULART, M. O. F., et. al., Química Nova, 16 (2), p. 95-100, 1993.
50. MARQUES, M. O. M., YOSHIDA, M., Química Nova, 13 (4), p. 245-246, 1990.
51. PATNAM, R. et. al., Phytochemistry, in press 2005.
52. LIN, L.-J., CORDELL, G. A., J. Chem. Soc., Chem. Commun., p. 160-161. 1984.
53. MERKUSA, V. M., et al. Phytochemistry, 13, p. 1239, 1974.
54. MOREL, A. F., Fakultät fürChemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-
Universitätzu Tübingen Dissertation,Tübingen – Deutschland, p.70 –91, 1985
55. MOREL, A. F., et. al., Phytochemistry, 47 (1), p. 125, 1998.
56. PAÏS, M., et. al., Ann. Pharm. Franc, 21(2), p. 139, 1963.
57. PAÏS, M., et. al., Bull. Soc. Chim. Fr., v. 3, p. 1145, 1968.
58. SERVIS, R. E., et. al. J. Am. Chem. Soc., 91:20, 24(9), 1969.
59. RHAMAN, A., Sping Verlag, New York, 1986.
60. TSCHESCHE, R., AMMERMANN, R., Ber, 107, p. 274, 1974.
61. EL-SEEDI, H. R., et. al., Phytochemistry, 52, p. 1739-1744, 1999.
62. SHOJI, T., et. al., Phytochemistry, v. 59, p. 183-189, 2002.
AcroPDF - A Quality PDF Writer and PDF Converter to create PDF files. To remove the line, buy a license.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
