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UFSM
Dissertação de Mestrado
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DA
QUERCITRINA SOBRE A PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
_____ _______ ______ _____ ______ _
Caroline Wagner
Santa Maria. RS, Brasil
2007
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II
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DA
QUERCITRINA SOBRE A PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
______________________________
por
Caroline Wagner
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Bioquímica Toxicológica, Área de Concentração em
Bioquímica Toxicológica, da Universidade Federal de Santa
Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do
grau de
Mestre em Bioquímica Toxicológica.
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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III
IV
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por não nos mostrar o sentido da vida.
Agradeço a toda minha família por todo apoio que sempre tive. A minha
mãe Denise, ao meu pai Lui e meu irmão Diego os meus mais sinceros
agradecimentos por tudo que me ensinaram, por todo amor, respeito e
companheirismo. Por sempre acreditarem em mim e me incentivarem na busca
de meus objetivos.
Agradeço ao Thiago por todo seu amor e paciência. Por sempre estar do
meu lado de forma incondicional, por me mostrar que a vida é simples e
maravilhosa.
Ao professor João meus agradecimentos e admiração por nos mostrar o
caminho para o conhecimento e sempre nos estimular a melhorar. A minha
orientadora professora Cristina agradeço por dividir conosco seu conhecimento,
sua amizade e sua eterna preocupação com seus “filhos”.
Ao professor Gilson, e ao professor Félix por toda ajuda, pela paciência e
incentivo.
A professora Marilise por ter me iniciado pesquisa, por sua atenção e
amizade.
Aos demais professores do Programa de Pós-graduação em Bioquímica
Toxicológica que contribuíram de alguma forma para minha formação.
A todos os colegas e amigos do laboratório: Daniel, Robson, Rafael,
Alessandro, Mateus, Thiago, Pabulo, Jardel, a Alessandra, Romaiana, Jéssie,
Danúbia, Viviane, Cássia, Verônica, Sally, Tielle agradeço pelo companheirismo
V
e por compartilharem seus conhecimentos. Aos que já seguiram outros rumos
além de agradecimentos, saudades.
Agradeço em especial a Rose, por tudo que me ensinou, por seu
exemplo de ética, respeito e amor por seu trabalho, além disso, por sua
paciência e amizade.
Aos colegas de laboratório do Prof. Félix que também fizeram parte da
minha formação, agradeço por sua amizade e companheirismo, em especial a
Cris, a Daia e o Gustavo.
Aos colegas do laboratório da professora Cristina e do professor Gilson.
Aos funcionários, Angélica, pelo atendimento e auxílio sempre prestados
com boa vontade e simpatia e ao Rinaldo por cuidar dos nossos animais;
A CAPES e CNPq pelo auxílio financeiro durante a realização deste
trabalho.
Enfim, agradeço à Universidade Federal de Santa Maria e ao Programa
de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica pela possibilidade de realização
deste curso.
VI
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil.
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DA QUERCITRINA SOBRE A
PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
AUTOR: Caroline Wagner
ORIENTADORA: Cristina Wayne Nogueira
CO-ORIENTADOR: João Batista Teixeira da Rocha
As espécies reativas de oxigênio têm sido associadas com a
patofisiologia de desordens neurodegenerativas tais como a doença de
Parkinson e de Alzheimer. Os flavonóides apresentam ação protetora contra
mecanismos oxidativos em modelos in vivo e in vitro, os quais estão
relacionados à suas propriedades antioxidantes. Neste estudo foram
examinados os efeitos antioxidantes da quercitrina, uma forma glicosídica da
quercetina, na peroxidação lipídica induzida por diferentes agentes pró-
oxidantes. A produção de substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico
(TBARS) foi estimulada através da incubação de homogeneizado de cérebros
de ratos com ferro, ferro + EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), ácido
quinolínico, nitruprussiato de sódio fresco e foto decomposto e ferricianato de
potássio. A quercitrina foi capaz de prevenir a produção de TBARS induzidas
por todos os agentes pró-oxidantes. No entanto, a quercitrina foi mais eficiente
quando o agente indutor foi o ferricianato de potássio do que quando os agentes
indutores foram o acido quinolínico e nitruprussiato de sódio, e contra estes a
quercitrina mostrou-se mais eficaz do que para o ferro e ferro + EDTA (ácido
etilenodiamino tetra-acético). Os efeitos da quercitrina na reação de Fenton
(através da degradação da desixiribose) também foram investigados. A
quercitrina causou um significante decréscimo na degradação da desoxiribose.
VII
Desta forma os resultados obtidos indicam que a quercitrina exibe efeitos
antioxidantes e este efeito provavelmente é mediado via diferentes
mecanismos, os quais podem envolver a modulação da reação de Fenton e
receptores N-metil-D-aspartato (NMDA).
Palavras-chaves: Quercitrina, estresse oxidativo, ácido quinolínico, substâncias
que reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), degradação da desoxiribose,
flavonóides, nitroprussiato de sódio, reação de Fenton.
VIII
ABSTRACT
Dissertation of Master’s Degree
Post-Graduate Course in Toxicological Biochemistry
Federal University of Santa Maria, RS, Brazil
Evaluatin of antioxidant properties of quercitrin against lipid peroxidation
AUTHOR: Caroline Wagner
ADVISOR: Cristina Wayne Nogueira
CO-ADVISOR: João Batista Teixeira da Rocha
Reactive oxygen species have been associated with a pathophysiology of
neurodegenerative disorders
such
as Parkinson’s and Alzheimer`s disease.
Flavonoid compounds show protective action against oxidative mechanisms in
different in vivo and in vitro models, which seems to be linked to their antioxidant
properties. In the present study, we examine the protective effects of quercitrin,
a glycoside form of quercetin, against lipid perixidation induced by different pro-
oxidant agents. For that TBARS production was stimulated by the incubation of
rat brain homogenate with Fe2+, Fe2+ plus EDTA, quinolinic acid (QA), sodium
nitroprusside (SNP) and potassium ferricyanide ([Fe (CN)
6
]
3−
). Quercitrin was
able to prevent the formation of TBARS induced by pro-oxidant agents tested;
however, it was more effective against potassium ferricyanide ([Fe (CN)
6
]
3−
)than
quinolinic acid and sodium nitroprusside than Fe
2+
and, Fe
2+
plus EDTA. The
effect of quercitrin on the Fenton reaction was also investigated (deoxyribose
degradation). Quercitrin caused a significant decrease in deoxyribose
degradation. Taken together, the data presented here indicate that quercitrin
exhibits a scavenger and antioxidant role, and these effects probably are
mediated via different mechanisms, which may involve the negative modulation
of the Fenton reaction and N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor.
Keywords
: Quercitrin, Oxidative stress, Quinolinic acid, TBARS, Deoxyribose
degradation, Flavonoids, Sodium nitroprusside, Fenton reaction.
IX
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 1
. Estrutura da quercitrina.
10
ARTIGO
Figura 1. Quercitrin structure. 15
Figure 2. Effect of quercitrin on TBARS production induced by
Fe
2+
and Fe
2+
/EDTA.
16
Figure 3
Effect of quercitrin on TBARS production induced by
quinolinic acid.
16
Figure 4 Effect of quercitrin on TBARS production induced by
sodium nitroprrussite. 17
Figure 5
Effect of quercitrin on TBARS production induced by
(A) Fresh SNP (5 µM), (B) photodecomposed SNP (5 µM) or
(C) [Fe (CN)
6
]
3−
(5 µM).
17
Figure 6 Effect of different concentrations of quercitrin on
Deoxyribose degradation. 18
X
LISTA DE ABREVIATURAS
AQ-ácido quinolínico
DNA - ácido desoxirribonucléico
EDTA-ácido etilenodiamino tetra-acético
EROs- espécies reativas de oxigênio
H
2
O
2
- peróxido de hidrogênio
MDA - malondialdeído
NMDA-N-metil-D-aspartato
NPS-nitroprussiato de sódio
NO-óxido nítrico
RL-Radical Livre
TBARS – substâncias que reagem com o ácido Tiobarbitúrico
XI
SUMÁRIO
RESUMO
VI
ABSTRACT
VIII
LISTA DE FIGURAS
IX
LISTA DE ABREVIAÇÕES X
APRESENTAÇÃO XIII
INTRODUÇÃO
1
1.1 Peroxidação lipídica, espécies reativas de oxigênio e estresse
oxidativo
1
1.1.1 Espécies reativas de oxigênio 1
1.1.2 Peroxidação lipídica 2
1.2 Agentes pró-oxidantes usados
2
1.2.1 Ferro
3
1.2.2 Ácido Quinolínico
4
1.2.3 Nitroprussiato de sódio 5
1.3 Processos neurodegenerativos 6
1.4 Compostos antioxidantes
7
1.4.1 OS flavonóides
7
1.4.2 A Quercitrina
9
2 OBJETIVOS 11
2.1 Objetivo geral
11
2.2 Objetivos específicos
11
3 ARTIGO CIENTÍFICO
12
3.1 Quercitrina, a forma glicosídica da quercetina, previne a peroxidação
lipídica in vitro. 13
XII
3.1.1 Quercitrin, a glycoside form of quercetin, prevents lipid peroxidation in
vitro. Brain Research 1107 (2006) 192-198.
14
4.DISCUSSÃO
21
5.CONCLUSÃO
25
6.PERSPECTIVAS
26
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 27
XIII
APRESENTAÇÃO
No item
INTRODUÇÃO
, está descrita uma sucinta revisão bibliográfica
sobre os temas trabalhados nesta dissertação.
Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob
a forma de artigo, que se encontram no item ARTIGO CIENTÍFICO. As seções
Materiais e Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências
Bibliográficas, encontram-se no próprio artigo.
Os itens,
DISCUSSÃO
e
CONCLUSÕES
, encontradas no final desta
dissertação, apresentam interpretações e comentários gerais sobre o artigo
científico contido neste trabalho.
No item
PERSPECTIVAS
estão expostos os possíveis estudos para
continuação do estudo do autor, referente a esse assunto.
As
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
referem-se somente às citações
que aparecem nos itens
INTRODUÇÃO
e
DISCUSSÃO
desta dissertação.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Peroxidação Lipídica, Espécies Reativas de Oxigênio e estresse
oxidativo
1.1.1 Espécies reativas de oxigênio e Estresse Oxidativo
As células estão continuamente produzindo radicais livres e espécies
reativas de oxigênio (EROs) como parte do processo metabólico.As principais
EROs relacionadas ao estresse oxidativo são o ânion superóxido (O
-
2
), o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), o óxido nítrico (NO) e o radical hidroxila (
.
OH).
As espécies reativas são moléculas que apresentam um elétron
desemparelhado na sua órbita externa. Estas moléculas se caracterizam por ser
altamente instáveis e por ter um tempo de vida muito curto.
Estas espécies reativas são normalmente neutralizadas pelos sistemas
antioxidantes presentes nos organismos. Assim o estado de estresse oxidativo
pode resultar tanto de um aumento na produção de EROs quanto da redução da
capacidade antioxidante celular total. Ou seja, a ocorrência de um dano
oxidativo depende de um desequilíbrio entre a produção de EROs e a atividade
das defesas antioxidantes (Halliwel, 1992; Dawson e Dawson, 1996).
O estresse oxidativo é uma condição celular ou fisiológica de elevada
concentrações de ERO que causa danos moleculares às estruturas celulares,
com conseqüente alteração funcional e prejuízo das funções vitais em diversos
tecidos ou órgãos (Halliwell e Cross, 1994). No entanto, o efeito deletério do
2
estresse oxidativo varia consideravelmente de um ser vivo para o outro, de
acordo com a idade, o estado fisiológico e a dieta (Niess e cols, 1999).
1.1.2 Peroxidação lipídica
As membranas celulares são constituídas principalmente de fosfolipídios,
que apresentam uma cabeça polar e duas caudas hidrofóbicas. Geralmente
estas caudas hidrofóbicas são compostas por ácidos graxos, que podem
apresentar uma ou mais dupla ligação (insaturação) (Halliwell e Gutteridge,
1989).
Os radicais livres são espécies eletrofílicas extremamente reativas que podem
reagir com componentes celulares (Josephy, 1997; Timbrell, 2000). Os radicais
livres são gerados por uma variedade de processos, e podem atacar uma
diversidade de biomoléculas alvos, tais como o DNA, os lipídios e as proteínas.
Os ácidos graxos insaturados das membranas biológicas podem ser
alvos de espécies reativas. Esta interação pode levar a modificação nos lipídios
de membrana que consequentemente vai levar à perda nas características das
membranas biológicas, tornando-as menos firmes e flexíveis, criando fendas
iônicas que alteram sua permeabilidade, o que favorece o trânsito
indiscriminado de metabólitos e detritos celulares, provocando sua ruptura e lise
(Josephy, 1997; Timbrell, 2000).
3
1.2 Agentes pró-oxidantes usados nesse estudo
1.2.1 Ferro
O ferro desempenha um papel importante nos processos metabólicos dos
animais, sendo um constituinte vital nas células de todos os mamíferos, e
também está presente em algumas enzimas que catalisam mecanismos de
oxidação celular. O ferro é de grande importância nos sistemas biológicos, uma
vez que participa de uma grande variedade de reações de transporte de
elétrons. Porém, estes íons podem estimular a produção de radicais livres por
diferentes mecanismos (Braughler e cols, 1986; Minotti e Aust, 1987, 1992).
Inúmeras evidências sugerem o acontecimento de uma cascata de
reações durante o processo neurodegerativo, incluindo estresse oxidativo,
peroxidação lipídica e alterações no metabolismo do ferro, levando a uma
produção excessiva de radicais livres, disfunção mitocondrial e distúrbios na
homeostase do cálcio, os quais vão culminar no dano do citoesqueleto celular e
morte celular (Youdim e cols,1990; Owen e cols,1997; Connor, 1997).Um fator
capaz de gerar estresse oxidativo e disfunção mitocondrial é o excesso de ferro
intracelular, o qual pode acelerar o estresse oxidativo e a peroxidação lipídica
(Olanow e Arendash,1994; Youdim e Riederer, 1997) .
A produção excessiva de H
2
O
2
e O
-
2
podem resultar em dano celular
através de uma cadeia de reações de peroxidação lipídica nas membranas
celulares e alterações na fluidez da membrana. No entanto o H
2
O
2
é
relativamente inerte, e o dano celular ocorre quando EROs e radicais hidroxil
altamente reativos são produzidos pela reação de Fenton, na qual um metal de
4
transição reduzido, como o ferro , doa um elétron para o H
2
O
2
. Assim a reação
de Fenton converte H
2
O
2
para o mais excitotóxico das EROs , o
.
OH. Desta
forma a participação do ferro é essencial na produção do
.
OH, o qual pode
subsequentemente iniciar a peroxidação lipídica ou oxidar grande parte das
moléculas presentes nos sistemas biológicos e propagar reações de radicais
livres. Além disso, um aumento na geração de superóxido pode favorecer a
liberação de ferro das proteínas, e o peróxido de hidrogênio pode degradar o
grupo heme das hemes - proteínas levando a liberação de mais ferro. (Halliwell
e Gutteridge, 1998).
Estudos mostram que determinados agentes quelantes, como o EDTA,
quando associados ao ferro podem estimular a reação de Fenton e por
conseqüência a produção de radical hidroxil (Graft e cols, 1983).
1.2.2 Acido quinolínico
A rota da quinurenina é a principal rota nos mamíferos do metabolismo do
triptofano. Um dos metabólitos dessa rota é o acido quinolínico (AQ) (Moroni,
1999).
O acido quinolínico esta presente no cérebro e pode estar envolvido no
desenvolvimento de algumas doenças neurodegenerativas em humanos, como
a doença de Huntington e a epilepsia (Moroni e cols., 1986; Schwarz e cols.,
1988). O mecanismo através do qual o AQ induz neurotoxicidade parece
envolver a superativação dos receptores NMDA, tanto por estimular pré-
sinapticamente a liberação de aminoácidos neurotransmissores excitatórios , ou
por ação pós-sináptica (Santamaría e Ríos, 1993). A ativação de receptores de
5
glutamato induz o influxo de íons cálcio para o neurônio, o que leva a uma
seqüência de eventos que possivelmente resulta na geração de espécies
reativas de oxigênio (Choi, 1987; Hartley e cols., 1993; Atlante e cols., 1997).
Trabalhos mostram que o AQ pode induzir peroxidação lipídica em
homogeneizado de cérebro de rato (Behan e cols, 1999). A capacidade do AQ
de induzir peroxidação lipídica ocorre especialmente em presença de ferro,
sugerindo a participação do radical hidroxil em seus efeitos tóxicos (Santamaria
e Rios, 1993; Rodríguez-Martinez e cols, 2000; Rossato e cols., 2002).
1.2.3 Nitroprussiato de sódio
O nitroprussiato de sódio (NPS) pode causar inúmeros efeitos
neurotóxicos. Tem sido sugerido que a sua toxicidade esta envolvida com a
liberação de cianato e/ou óxido nítrico (Bates e cols., 1991; Chen e cols., 1991;
Rauhala e cols., 1998). O composto nitruprussiato pode se decompor em
solução aquosa e pH fisiológico, produzindo oxido nítrico. O NO é uma molécula
mensageira neuronal, mas em condições patológicas a sua superprodução
pode iniciar inúmeros eventos neurotóxicos (Dawson e Dawson, 1996). A
produção de NO está claramente ligada a processos de neurodegeneração em
modelos animais de isquemia (Huang e cols.,1994; Kuppusamy e cols., 1995;
Maiese e cols., 1997) e em culturas de células in vitro (Maiese e cols., 1993a,
1997). A rota final que leva à geração de NO e a morte neuronal inclui a
formação de um potente oxidante o peroxinitrito, a liberação intracelular de
cálcio (Maiese e cols.1994), e a ativação da proteína quinase C (Maiese e cols,
1993b). Além disso, NO medeia os efeitos neurotóxicos do glutamato (Dawson
6
e cols., 1991) que estão envolvidos em injúrias neuronais e possivelmente com
a doença de Alzheimer (Meldrum e Garthwaite, 1990).
Sabe-se também que a exposição à luz promove a liberação do óxido
nítrico ou [NO–Fe–(CN)
5
]
2-
é convertido para a forma [(CN)
5
–Fe]
3-
e espécies de
[(CN)
4
–Fe]
2-
(Loiacono e Beart, 1992). Após a liberação de óxido nítrico, o ferro
pode reagir com o NPS, o que pode levar à formação de espécies de oxigênio
altamente reativas como os radicais hidroxil via reação de Fenton (Graf e cols.,
1983).
1.3 Processos neurodegenerativos
O cérebro é particularmente susceptível ao dano oxidativo devido ao seu
alto consumo de oxigênio, por ser relativamente deficiente em mecanismos
antioxidantes e por apresentar altos níveis de metais de transição como o ferro
e ácidos graxos poliinsaturados, um substrato para a peroxidação lipídica
(Reiter, 1995). Desta forma espécies reativas de oxigênio e a peroxidação
lipídica vêm sendo associadas a patogêneses de inúmeros insultos
neurológicos, que incluem: trauma cerebral, isquemia e desordens
neurodegenerativas como Parkinson e Alzheimer (Halliwell, 1992).
Uma das formas de dano neurotóxico causados por estresse oxidativo
envolve o aumento do cálcio intracelular. Este aumento do cálcio pode levar à
perda das funções mitocôndriais, pode ativar fosfolipases, proteases e
endonucleases, levando a danos irreversíveis nas membranas, organelas e na
cromatina e eventualmente morte celular (Orrenius e cols, 1992; Trump e
7
Berezesky, 1995). Outro agente causador de dano neurotóxico é o
neurotransmissor glutamato. Alguns trabalhos mostram que a acumulação de
glutamato no cérebro de ratos pode levar a processos neurodegenerativos, e
em células PC12 altas concentrações de glutamato inibem a captação de
cisteína e depleta a glutationa intracelular, o que pode levar aumento de
espécies reativas de oxigênio e morte celular (Froissard e Durval, 1994).
Desta forma, agentes farmacológicos capazes de seqüestrarem radicais
livres e\ou inibir a peroxidação lipídica, e desta forma, proteger os neurônios das
injúrias oxidativas, podem ser sugeridas como terapias potentes na prevenção
ou tratamento de desordens neurodegenerativas causadas por estresse
oxidativo.
1.4 Composto antioxidante
1.4.1 Flavonóides
Os flavonóides ocorrem naturalmente e são amplamente distribuídos no
reino vegetal, sendo classificados como flavonol, flavanol, flavonona, flavona,
anticianidina e cianidina. A quercetina (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone), um dos
mais abundantes flavonóides encontrados nas frutas e vegetais (Hertog e
cols.1992; Richter e cols, 1999), é um flavonol. Estima-se que em torno de 25-
50 mg de quercetina são consumidos diariamente numa dieta equilibrada
(Formica e Regelson ,1995).
Inúmeros estudos in vitro têm revelado diversos efeitos biológicos da
quercetina, incluindo efeitos antimutagênicos, inibição da proteína quinase C
8
(Lindahl. e Tagesson,1997), inibição de lipoxigenases, atividade mimética da
superoxido dismutase (SOD), tratamento de inflamações, arteriosclerose,
hemorragias, processos alérgicos e inchaço (Formica e Regelson,1995
;Havsten. 1983). A quecertina pode seqüestrar radicais livres (Morel e
cols,1993), prevenir o desenvolvimento de tumores e inibir a ativação
carcinogênica (Richter e cols, 1999).
Uma forma de a quercetina exercer seus efeitos na célula está associada
com as mudanças nas propriedades da membrana celular (Pawlikowska-
Pawlega e cols,2003) que parecem estar relacionadas com o influxo de cálcio
e/ou com seu metabolismo (Morales e Lozoya,1994; Pawlikowska-Pawlega e
cols 2000).
Desta forma a quercetina está relacionada a inúmeros benefícios à saúde
humana e sua atividade antioxidante está em grande parte associada aos seus
inúmeros efeitos biológicos (Terao e cols,1998).Os grupos hidroxilas dos anéis
fenólicos dos flavonóides agem como doadores de elétrons, sendo
responsáveis pela capacidade de seqüestrar radicais livres como
.
OH (radical
hidroxil) e
.
O
2
(radical superóxido) apresentada por estes compostos (Bors e
cols. 1990). A estrutura catecol (estrutura ο-dihydroxyl), a qual possui dois
grupos hidroxil em posições vizinhas, é marcadamente mais eficiente que as
demais configurações em doar elétrons, assim a quercetina e os demais
flavonóides que apresentam a estrutura catecol podem exercer uma poderosa
atividade em seqüestrar radicais livres. Além disso, quercetina assim como sua
forma aglicona, a quercitrina (FIG 1) apresenta uma conformação coplanar que
confere um auto grau de estabilidade, um fator determinante na eficiência
antioxidante (Bors e cols.,1990; Rice-Evans e cols ,1996).A atividade
9
antioxidante dos flavonóides pode também ser associada ás suas propriedades
quelantes, uma vez que os metais de transição como o ferro, podem exercer um
papel crucial na geração de espécies reativas de oxigênio através de reações
como a de Fenton. Somando-se a isso, os flavonoides podem levar também a
um aumento nas defesas antioxidantes do organismo (Halliwel e
Gutteridge,1998).
Estudos recentes também mostraram que diversos flavonóides podem
proteger células neuronais imaturas e células corticais do dano oxidativo
induzido por glutamato (Ishige e cols, 2001; Kim e cols, 2002).
1.4.2 A quercitrina
A quercetina é encontrada na dieta humana principalmente em sua forma
glicosídica, na qual um ou mais grupos açúcar estão ligados ao grupo fenólico
através de uma ligação glicosídica (Herrmann 1976; Hermann e Lebensm,
1998). Estudos têm mostrado que a absorção intestinal da forma glicosídica da
quercetina é superior a da forma aglicona (Hollman e cols, 1995). Por isso é de
fundamental importância os estudos relacionados à forma glicosídica deste
potente antioxidante. Além disso, a porção açúcar ligada à porção aglicona
aumenta a solubilidade em solventes polares e conseqüentemente aumenta a
absorção, através da utilização de transportadores de glicose que estão
presentes na mucosa intestinal (Gee e cols., 1998). No entanto, a maioria dos
estudos tem sido feitos com a forma aglicona (quercetina), e pouco se sabe
sobre as propriedades antioxidantes da forma glicosídica, como por exemplo, a
10
quercitrina, em parte devido ao fato desta não ser disponível comercialmente
(Scalbert e cols, 2002).
FIGURA 1
Estrutura química da Quercitrina
Fonte: Wagner e cols, 2006. Brain Research 1107(2006) 192-198.
Porção açúcar
11
2. OBJETIVOS
2.1OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antioxidante da quercitrina, a forma glicosídica da quercetina,
em sistemas oxidantes in vitro por diferentes agentes pró-oxidantes.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar os efeitos da quercitrina sobre a peroxidação lipídica
(produção de TBARS) induzida por ferro, ferro/EDTA, acido quinolínico,
nitroprussiato de sódio e ferricianato de potássio.
Investigar os efeitos da quercitrina na reação de Fenton, através da
degradação da desoxiribose.
Investigar os mecanismos pelos quais a quercitrina exerce seu efeito
antioxidantes.
12
3. ARTIGO CIENTÍFICO
Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob
a forma de um artigo científico. Os itens Materiais e Métodos, Resultados,
Discussão dos Resultados e Referências Bibliográficas encontram-se no próprio
artigo. O artigo
está disposto na forma que foi publicado na edição da revista
científica.
13
ARTIGO
Quercitrina, a forma glicosódica da quercetina, previne a peroxidação lipídica in
vitro
Quercitrin, a glycoside form of quercetin, prevents lipid
peroxidation in vitro
Caroline Wagner, Roselei Fachinetto, Cristiane Lenz Dalla Corte, Verônica
Bidinotto Brito, Diego Severo, Gilvan de Oliveira Costa Dias, Ademir F. Morel,
Cristina W. Nogueira, João B.T. Rocha,
BRAIN RESEARCH 1107 (2006) 192–198
14
15
16
17
18
19
20
21
4.DISCUSSÃO
Os resultados apresentados no artigo sugerem que a quercitrina
apresenta propriedades antioxidantes e estes efeitos provavelmente são
mediados via diferentes mecanismos, os quais devem envolver a modulação
negativa da reação de Fenton e os receptores NMDA.
. Em concordância com isso os resultados apresentados na figura 2
mostram que a quercitrina foi capaz de reverter a peroxidação lipídica induzida
por Fe e Fe/EDTA. Este efeito antioxidante parece estar relacionado com a
capacidade dos flavonóides de quelar ferro de forma eficiente, inibindo a reação
de Fenton, propriedade esta que está relacionada ao seu anel catecol (Rice-
Evans e cols, 1996).
Os efeitos pró-oxidantes apresentados pelo ácido quinolínico são
atribuídos a sua capacidade de estimular os receptores NMDA, os quais
induzem a produção de radicais livres e posteriormente a peroxidação lipídica
(Pérez-Severiano e cols, 2004; Santamaría e cols, 2003). Já a quercitrina foi
capaz de prevenir os efeitos pró-oxidantes apresentados pelo AQ, de acordo
com dados da literatura que mostram que os flavonóides podem agir como
agentes neuroprotetores em modelos in vivo, o que pode estar relacionado com
os flavonóides apresentarem efeitos antagonistas de receptores NMDA (Naidu e
cols, 2003; Xu e cols, 2005). No entanto diversos trabalhos mostram que os
efeitos neurotóxicos apresentados pelo AQ não são somente devido a sua
capacidade de estimular os receptores NMDA, mas em parte devido a sua
natureza pró-oxidante, a qual é independente dos receptores NMDA (Behan e
cols, 1999; Santamaría e cols, 2001). Em condições in vitro o AQ é capaz de
22
formar complexos com ferro (Goda e cols, 1996) o qual pode estimular a reação
de Fenton (Iwahashi e cols, 1999), sugerindo que a indução de peroxidação
lipídica pelo acido quinolínico é dependente de ferro. E assim os efeitos
antioxidantes apresentados pela quercitrina podem ser devido suas
propriedades de inibir a reação de Fenton, quelando espécies de ferro.
Além de serem eficientes agentes quelantes apresentando um anel
catecol, muitos flavonóides também apresentam dois grupos hidroxil no anel B.
Essa estrutura química permite um maior efeito antioxidante exercido pelo
flavonóides, uma vez que estes dois grupos hidroxil são capazes de agir como
doadores de H e assim estabilizando espécies reativas (Bors e cols,1999; Bors
e cols, 2001; Rice-Evans e cols 1996).Outra estrutura importante dos
flavonóides com potencial antioxidante é a presença de duas insaturações,
juntamente com uma função 4-oxo no anel C e a presença de grupos funcionais
capazes de se ligar a metais de transição como o ferro (Rice-Evans e cols,
1996). Assim, a quercitrina parece apresentar importantes características para
um potente antioxidante, de acordo com os resultados deste trabalho.
A quercitrina apresentou também potentes efeitos atioxidantes quando o
agente indutor foi o nitruprussiato de sódio. Acredita-se que o efeito pró-
oxidante apresentado pelo nitruprussiato de sódio possa ser o resultado da
liberação de NO, cianato ou ambos. Assim, com a intenção de esclarecer essa
questão, foram testados os efeitos pró-oxidantes do NPS foto decomposto e do
ferricianato em comparação ao NPS fresco. Os resultados apresentados nas
figuras 5 a, b, c indicam que o NPS fresco foi mais potente em induzir a
formação de TBARS, seguido pelo NPS foto decomposto. O ferricianato
apresentou um modesto efeito pró-oxidante. Estes resultados confirmam a idéia
23
de que o NPS causa citotoxicidade via liberação de cianato ou NO (Bates e
cols., 1991; Rauhala e cols.,1998), uma vez que produção de TBARS foi mais
pronunciada após a exposição do homogeneizado ao NPS fresco do que ao
NPS foto decomposto e ao ferricianato. Dados da literatura mostram que após a
liberação do NO o NPS ou [NO–Fe–(CN)
5
]
2−
é convertido para espécies
contendo ferro [(CN)
5
–Fe]
3−
e[(CN)
4
–Fe]
2−
(Loiacono e Beart, 1992) e estas
espécies de ferro podem levar a formação de espécies altamente reativas como
o radical hidroxil , via reação de Fenton. Mostrando que os efeitos antioxidantes
da quercitrina podem ser tanto devido a sua capacidade de doar elétrons, como
de modular a reação de Fenton. Confirmando esta capacidade de modular a
reação de Fenton, a figura 6, mostrou que a quercitrina reduziu
significativamente a degradação da desoxiribose.
Assim a quercitrina comprovou ser um potente antioxidante em
cérebro de ratos. Ela foi capaz de proteger este tecido do dano oxidativo
induzido pelos mais diferentes insultos neurotóxicos. Mostrou-se capaz de
proteger de insultos causados pela estimulação de receptores NMDA,
provavelmente por ser antagonista desses receptores. A quercitrina também
protegeu dos efeitos liberação de NO e/ou cianeto devido sua capacidade
antioxidante, o que torna a quercitrina especialmente importante no estudo de
prevenção e reparo de danos no sistema nervoso central. Além disso, ela se
mostrou bastante eficiente como agente quelante de ferro, e capaz de modular
diretamente a reação de Fenton como mostra o experimento com a
desoxiribose, um meio sem interferentes biológicos, onde a quecitrina se
mostrou bastante eficiente, o que pode contribuir ainda mais para suas
24
propriedades neuroprotetoras. E desta forma ser um promissor agente a ser
usado no tratamento de inúmeras desordens neurodegeneratia.
25
5.CONCLUSÃO
De acordo com os resultados apresentados podemos concluir:
A quercitrina foi um potente agente antioxidante e preveniu a peroxidação
lipídica induzida por todos agentes pró-oxidantes usados.
A quercitrina foi capaz de prevenir os efeitos pró-oxidantes exercidos
tanto pelo ferro como ferro e EDTA.
O acido quinolínico induziu peroxidação lipídica provavelmente via
estimulação dos receptores de NMDA e também através da estimulação da
reação de Fenton. A quercitrina apresentou e satisfatórios efeitos antioxidantes.
Estes resultados confirmam a teoria de que o NPS causa citotoxicidade
via liberação de cianato ou óxido nítrico, o que pode levar a estimulação da
reação de Fenton. Assim a quercitrina pode exercer seus efeitos antioxidantes
por prevenir de injúrias causadas por NO.
A quercitrina foi capaz de diminuir os níveis de degradação da
desoxiribose e desta forma modular a reação de Fenton.
Os efeitos apresentados pela quercitrina nesse trabalho parecem estar
envolvidos com a modulação da reação de Fenton e sua interação com os
receptores NMDA.
26
6.PERSPECTIVAS
Com base nos resultados apresentados é de grande interesse verificar:
A interação da quercitrina com receptores de NMDA.
O comportamento deste antioxidante frente a outras medidas de estresse
oxidativo, além do TBARS.
Avaliar um possível papel antioxidante deste flavonóide in vivo, e como
este interage com o sistema biológico in vivo.
27
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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