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Fábio Yoshio
Tanaka
ESTUDO DA VIABILIDADE CELULAR
COMPARANDO OS MEIOS DE CONSERVAÇÃO
PARA ENXERTO ÓSSEO DE CALOTA CRANIANA.
ANÁLISE MICROSCÓPICA E IMUNOISTOQUÍMICA
EM RATOS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia do
“Campus de Araçatuba – UNESP”, para obtenção do
grau de Doutor em Odontologia - Área de Cirurgia e
Traumatologia Buco-Maxilo-Facial.
Orientador: Prof. Dr. Tetuo Okamoto
Co-orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Roberta Okamoto
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Milhares de livros grátis para download.
Dedicatória
ARAÇATUBA
2005
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Dados Curriculares
Fábio Yoshio Tanaka
Nascimento .....:
23/02/1972 – BAURU/SP
Filiação ...........:
Jorge Heiji Tanaka
Alice Yoshiko Tanaka
1991-1994 .........:
Curso de Graduação em Odontologia pela Faculdade de
Odontologia de Araraquara-UNESP.
1996-1999 .........:
Prof. Assistente da Disciplina de Cirurgia e Traumatologia Buco-
Maxilo-Facial da Universidade de Marília- UNIMAR-SP.
1997-1999 .........:
Curso de Pós-Graduação em Cirurgia e Traumatologia Buco-
Maxilo-Facial na Faculdade de Odontologia de Araçatuba –
UNESP.
1999..................:
Prof. Adjunto da Disciplina de Anestesiologia e Cirurgia e
Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da Universidade Paranaense
UNIPAR- Campus Cascavel- PR.
2003-
2005..........:
Curso de Pós-Graduação em Odontologia, nível de Doutorado, área
de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da Faculdade de
Odontologia de Araçatuba-UNESP.
Dedicatória
A Deus,
Pelo seu infinito amor,
Pela razão e motivo da nossa
existência,
Pela Sua Proteção,
Pela Sua Sabedoria.
Venho, neste momento,
agradecê-lo pela oportunidade
recebida de cursar, aprimorar,
aprender a aprender e concluir mais
uma fase da minha vida, pois foi Ele
quem sempre me guio e iluminou meus
passos para esta vitória.
Muito Obrigado!
À minha esposa Rosana Aramaki Tanaka,
pelo incentivo constante,
companheirismo e espírito de
resignação pelo qual você soube:
compreender-me, ajudar-me nas fases
mais árduas da conquista deste ideal
e também pelas horas de convívio e
afeto, que a elaboração deste
Dedicatória
trabalho lhes roubou. Te amo! Meu
sincero muito obrigado!
Á minha filha Larissa Aramaki Tanaka,
Por ser parte integrante neste
contexto e desta etapa da minha
vida, pois neste período de pós-
graduação que participou da minha
alegria desde o momento em que fui
aprovado, mesmo que na vida intra-
uterina. Participou na luta e
concretização deste ideal logo que
você arriscou seus primeiros passos.
Alegrou minha vida com seu sorriso,
carinho e suas primeiras palavras,
deixando sempre a certeza que nunca
estive e nem estarei só.
Aos meus pais Jorge e Alice, por
ter me ensinado os princípios de
educação, amor ao próximo, espírito de
luta, sinceridade e honestidade.
Aos meus Irmãos Maurício e Érika
pelo amor fraterno e participação das
minhas conquistas.
Aos meus sogro e sogra Girou
Aramaki e Tezerinha, pelo sentimento
Dedicatória
que demonstraram, pelo estímulo e
aquele mais sincero e verdadeiro
carinho que só se reserva a um filho.
Agradecimentos Especiais
Ao Prof. Dr. Tetuo Okamoto,
pelo seu exemplo a ser seguido como
pessoa, professor e orientador.
Considero-o como meu pai em minha
formação, pois o senhor me ensinou a
pesquisar, ensinou-me com sua amizade
sincera, confiança e humildade que a
pesquisa se faz por meio de muita
dedicação e amor.
Prof. Tetuo, muito
obrigado pela oportunidade oferecida,
pela orientação segura e confiança
depositada em mim, durante, no
transcorrer do curso e no desenvolver
desta pesquisa.
Dedicatória
A Prof
a
.Dra. Roberta Okamoto,
pelo exemplo de pessoa e
características incomensuráveis como
seu pai. Pela orientação segura,
dedicação e tempo desprendido na
execução e ensinamentos no campo da
imunoistoquímica os quais sem eles a
execução deste trabalho não seria
possível.
Agradecimentos
Agradecimentos
Epígrafe
A inteligência sem amor, te
faz perverso.
A justiça sem amor, te faz
implacável.
A diplomacia sem amor, te faz
hipócrita.
O êxito sem amor, te faz
arrogante.
A riqueza sem amor, te faz
avaro.
A docilidade sem amor, te faz
servil.
A pobreza sem amor, te faz
orgulhoso.
A beleza sem amor, te faz
ridículo.
A autoridade sem amor, te faz
Agradecimentos
tirano.
O trabalho sem amor, te faz
escravo.
A simplicidade sem amor, te
deprecia.
A oração sem amor, te faz
introvertido.
A lei sem amor, te escraviza.
A política sem amor, te deixa
fanático.
A cruz sem amor se converte em
tortura.
A vida sem amor...não tem
sentido.
(Autor desconhecido)
Resumo
Resumo
Tanaka FY. Estudo da viabilidade celular comparando os meios de conservação
para enxerto ósseo de calota craniana. Análise microscópica e imunoistoquímica
em ratos [Tese]. Araçatuba: UNESP - Universidade Estadual Paulista; 2005.
O objetivo deste trabalho foi analisar a viabilidade celular
comparando os meios de conservação para enxerto ósseo. A preservação de
células viáveis em procedimentos de enxerto ósseo é de fundamental importância
para que se tenha a osteogênese. Foram utilizados 43 ratos machos. Após a
antissepsia do campo operatório foi realizada incisão linear na região mediana da
calota craniana para obtenção do enxerto da região parietal direita e esquerda as
quais foram removidas com auxílio de trefina de 5mm de diâmetro acoplada em
micro-motor de baixa rotação, sob constante irrigação com solução de soro
fisiológico 0,9% estéril. As peças do enxerto foram acondicionadas em tubos de
ensaio estéreis os quais foram devidamente identificadas de acordo com o grupo
e mantidas dentro deste tubo conforme cada condição do grupo. Como meio de
conservação da viabilidade celular do enxerto foi utilizado o soro fisiológico a
0,9% (Grupo I) e a solução de Euro Collins
®
(Grupo II) e ainda para verificar se
a temperatura tem influência direta na manutenção da viabilidade celular foi
analisado o enxerto ósseo conservado em temperatura ambiente (Grupo III) e o
enxerto ósseo sem nenhuma solução, porém mantido em gelo (GrupoIV). Para
avaliar a viabilidade celular foi utilizada análise histológica e imunoistoquímica
imediata e ainda em cada grupo analisou-se a viabilidade celular no período de 6
horas, 12 horas, 24 horas e 30 horas. Como resultado observou-se que a solução
de Euro Collins
®
apresentou-se superior ao soro fisiológico no que se diz respeito
à manutenção da viabilidade celular do enxerto ósseo onde se pode notar
viabilidade celular até o período de 30 horas.
Palavras- chave: Osso e Ossos. Transplante ósseo. Sobrevivência celular.
Sobrevivência do enxerto.
Abstract
Tanaka FY. Study of cellular viability comparing storage media for skull vault
bone graft. A microscopic and immunohistochemical analysis in rats. [Tese].
Araçatuba: UNESP - Universidade Estadual Paulista; 2005.
The aim of this study was to analyze cellular viability comparing
storage media for skull vault bone graft. Preservation of viable cells in bone graft
procedures is of paramount importance to obtain osteogenesis. Forty-three male
used in this study. After antisepsis of the operative field, a linear incision was
made on the middle region of the skull vault to obtain a bone graft from the right
and left parietal areas. The grafts were removed with a 5-mm diameter trephine
bur coupled to low-speed handpiece under continuous irrigation with sterile
0.9% saline. The graft pieces were placed in sterile 5-mL test tubes with caps,
and were properly identified according to the group and maintained inside the
test tubes as per each group conditions. The storage media evaluated for
preservation of graft cellular viability were 0.9% saline (Group I) and Euro
Collins
®
solution (Group II). In order to assess whether the temperature has a
direct influence on the maintenance of cellular viability, the analysis was
extended to bone grafts stored at room temperature (Group III) and bone grafts
with no solution, but maintained in ice (Group IV). Cellular viability was
evaluated by immediate histological and immunohistochemical analyses. For
each group, cellular viability was analyzed at 6, 12, 24 and 30 hours after
procedure. The results of this study showed that Euro Collins
®
solution yielded
better performance than 0.9% saline as regards the maintenance of bone graft
cellular viability (up to 30 hours).
Key-words: Bone and bones. Bone transplantation. Cell survival. Graft survival.
Lista de
Abreviaturas
PVPI.........: Polivinilpirrolidona iodada
PBS..........: Solução Tampão Fosfato
HE...........: Hematoxicilina e eosina
OPG........: Osteoprotegerina (Rabbit anti-opg- Santa Cruz Biotechnology)
RANK......: Rabbit anti-rank- Santa Cruz Biotechnology)
RANKL ...: Goat anti-rankl- Santa Cruz Biotechnology)
DAB……: Diaminobenzidina
Lista de Figuras
Lista de Figuras
FIGURA 1
Grupo Euro Collins 24 horas – OPG, borda da calota (original, 160x,
Diaminobenzidina.
31
FIGURA 2
Grupo seco ambiente 30 horas (original, 160x, HE).
32
FIGURA 3
Grupo seco gelo 30 horas (original,) 160x, HE).
32
FIGURA 4
Grupo imediato – OPG (original, 169x, Diaminobenzidina).
33
FIGURA 5
Grupo seco gelo 6 horas – RANKL, periferia da calota (original, 63x,
Diaminobenzidina).
33
FIGURA 6
Grupo seco ambiente 6 horas – RANKL (original, 63x, Diaminobenzidina)
34
FIGURA 7
Grupo soro fisiológico 6 horas – RANK (original, 160x, Diaminobenzidina).
34
FIGURA 8
Grupo Euro Collins 30 horas – OPG (original, 63x, Diaminobenzidina).
35
FIGURA 9
Grupo Euro Collins 30 horas – OPG (original, 160x, Diaminobenzidina).
35
FIGURA 10
Grupo controle da imunoistoquímica (original, 63x, Diaminobenzidina).
36
FIGURA 11
Ratos (Rattus norvegicus albinus.Wistar) acondicionados em gaiolas
(Biotério e Centro Cirúrgico Experimental “Ilídio Teodoro”-UNESP.
66
FIGURA 12
Ratos machos com peso corporal variando entre 250 a 300 gramas.
66
FIGURA 13
Anestesia por via intramuscular.
66
FIGURA 14
Cloridrato de Ketamina e Cloridrato de Xilazina.
66
FIGURA 15
Tricotomia.
66
FIGURA 16
Antissepsia com PVPI.
66
FIGURA 17
Incisão com lâmina 15.
67
FIGURA 18
Descolamento do retalho mucoperiostal com descolador de Molt e
Hollem
ba
c
k 3S
.
67
Lista de Figuras
Hollemback 3S.
FIGURA 19
Osteotomia com broca trefina e irrigação com foro fisiológico 0,9% .
67
FIGURA 20
Área osteotomizada.
67
FIGURA 21
Remoção do osso da calota com auxílio do Hollemback 3 S.
67
FIGURA 22
Peça removida. Preservação das meníngeas.
67
FIGURA 23
Acondicionamento em frascos identificados.
68
FIGURA 24
Acondicionamento em soro fisiológico 0,9%.
68
FIGURA 25
Solução de Euro Collins.
68
FIGURA 26
Ativador da Solução de Euro Collins.
68
FIGURA 27
Conservação em isopor com gelo.
68
FIGURA 28
Conservação em temperatura aproximada de 3 graus Centígrados.
68
FIGURA 29
Peças acondicionadas para tramitação laboratorial.
69
FIGURA 30
Peças lavadas em agitador orbitário.
69
FIGURA 31
Peças em EDTA com trocas semanais.
69
FIGURA 32
Peças conservadas em solução de sacarose.
69
FIGURA 33
Micrótomo de congelação.
69
FIGURA 34
Inclusão da peça em sacarose.
69
FIGURA 35
Corte com espessura de 16 micrometros.
70
FIGURA 36
Colocação dos cortes em lâminas gelatinizadas.
70
FIGURA 37
Lâminas gelatinizadas.
70
FIGURA 38
Secagem das lâminas.
70
Lista de Figuras
FIGURA 39
Protocolo imunoistoquímica.
70
FIGURA 40
Lavagem com PBS.
70
FIGURA 41
Inativação da peroxidase endógena.
71
FIGURA 42
Ciclos de lavagem.
71
FIGURA 43
Anticorpo primário.
71
FIGURA 44
Reação do anticorpo primário.
71
FIGURA 45
Anticorpo secundário.
71
FIGURA 46
Reação do anticorpo secundário.
71
FIGURA 47
Incubação do complexo ABC.
72
FIGURA 48
Revelação.
72
FIGURA 49
Histológico em HE.
72
Lista de Tabelas
Lista de Tabelas
TABELA 1
Grupos e Períodos Experimentais. 25
Sumário
1. Introdução 19
2. Material e Método 23
3. Resultados 28
4. Discussão 37
5. Conclusão 45
6. Referências 47
7. Anexos: 55
Anexo A – Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) 54
Anexo B- Revisão da Literatura 56
Anexo C- Figuras referentes à metodologia científica e experimental 65
Anexo D- Fotos das Lâminas do Histológico e Imunoistoquímico 73
Anexo E- Normas da Journal of Applied Oral Science 83
Anexo F- Instruções de uso – Solução Euro Collins 86
22
Introdução
“O segredo de progredir é começar. O segredo de
começar é dividir as tarefas árduas e complicadas em
tarefas pequenas e fáceis de executar e depois começar
pela primeira”.
(Mark Twain)
19
1) Introdução
∗
O tratamento de deformidades crânio-maxilo-faciais, como
também de defeitos congênitos, nessa área, tem um longo histórico de experiência
com vários tipos de biomateriais. Os grandes defeitos ósseos resultantes de trauma,
neoplasias ou infecções que não cicatrizam espontaneamente e muitas vezes
deixam seqüelas que comprometem a forma e função dos maxilares. Similarmente,
lacunas provenientes de ostectomias no esqueleto facial também, requerem
enxertos para estabilizar os segmentos ósseos e devolver o contorno natural da
região. (Klinge et al.
13
, 1992).
Do ponto de vista da aceitação biológica, em função da superior
compatibilidade tecidual, o melhor material de enxerto é o autógeno. No entanto
quando é utilizado, existe a necessidade de ato cirúrgico adicional para remoção
do material que freqüentemente cria ferida cirúrgica cujo pós-operatório é
clinicamente mais desconfortável ao paciente do que a cirurgia para a correção da
deformidade (Okamoto et al.
17
, 1991, Klinge et al.
13
, 1992). O sintoma pós-
operatório mais freqüente nesse caso é a dor. Porém outras ocorrências podem
surgir: pneumotórax, na remoção de costela (Hauser
8
, 1992); hematoma
retroperitonial (Ziccardi et al.
28
, 1992), na remoção de ilíaco; e perfuração da dura-
máter, na remoção da calota craniana (Jackson et al.
9
, 1987). Estas complicações
são de ocorrência rara e freqüentemente relacionada com técnica incorreta. Assim
esses fatos não devem impedir a utilização de enxertos autógenos, quando sua
aplicação for indicada.
Na implantodontia a necessidade de correção de pequenos ou de
grandes defeitos ósseos para a colocação de implantes e posterior reabilitação
tornou-se prática rotineira e necessária (Kuabara M.R. et al.
14
, 2000). Há
∗
Texto escrito segundo as normas da revista Journal of Applied Oral Science, anexo E.
Introdução 20
controvérsias e discussões a respeito da utilização de materiais para enxerto e
reconstrução óssea, podendo ser utilizados tanto o osso autógeno quanto materiais
alógenos e aloplásticos (Tanaka F.Y. et al.
26
, 2001). No entanto, os melhores
resultados têm sido relatados com o osso autógeno.
O enxerto ósseo autógeno pode ser obtido de área extra-bucal
como a crista ilíaca; osso da calvária; osso da costela; clavícula e tíbia, porém
todas elas exigem a presença de um médico especialista para sua remoção e um
centro cirúrgico hospitalar com a presença do anestesiologista, aumentando
invariavelmente o custo do procedimento para o paciente. Quando se elege como
área doadora região intra-bucal, pode-se utilizar o mento e a região de linha
oblíqua para reconstrução parcial da maxila. Quando se necessita de quantidade
maior de tecido ósseo pode-se acessar o mento e a região de linha oblíqua
bilateralmente, cuja manobra, no entanto ocasionaria o aumento do tempo
cirúrgico. Além disso, pode provocar o estresse do paciente e necessidade de
maior quantidade de tubetes anestésicos o qual pode até ultrapassar o limite
máximo recomendável. Porém, quando se deseja realizar todo esse procedimento
num só tempo operatório que incluiriam a incisão de quatro áreas intra-bucais
distintas o prudente seria a realização deste procedimento sob anestesia geral,
devido aos fatores acima citados. Sugerir ao paciente realizar este procedimento
sob anestesia geral aumenta o custo do procedimento e ou acaba provocando
insegurança para o paciente, visto que muitos apresentam medo da anestesia geral
e do âmbito hospitalar. Desta forma, uma das opções seria a realização da
intervenção cirúrgica em duas etapas. Na primeira etapa reconstruiria um dos
lados da maxila e após recuperação da morbidade local da região doadora e
receptora faria a reconstrução do outro lado. Tal procedimento, no entanto
aumentaria o tempo de reabilitação protética devido o período de convalescença e
o risco de provocar prejuízo na consolidação óssea do enxerto por se tratar de
áreas contíguas. Uma outra possibilidade seria realização deste procedimento
cirúrgico sob anestesia local em dois tempos operatórios. No primeiro ato
operatório, seria realizada a remoção do enxerto das regiões de mento e retro-
Introdução 21
molar bilateral. Decorrido um período de 12 a 30 horas seria realizado o segundo
ato operatório que incluiria o preparo e adaptação do enxerto na região receptora.
Para manutenção e conservação da vitalidade das células contidas no enxerto
ósseo autógeno, seria utilizada a solução de Euro Collins
®
que constitui o meio
utilizado para conservação de órgãos para transplante.
Baseando-se nas propriedades e comprovações científicas da
utilização do Euro Collins
®
como meio de perfusão e estocagem órgãos como:
coração, rins, pâncreas, córneas e outros em condições de serem transplantados,
tornam-se oportuno avaliar este meio como forma de manter a vitalidade celular
do tecido ósseo autógeno para situações clínicas que permita a execução em dois
tempos operatórios, criação de banco de osso autógeno ou até mesmo como meio
de armazenamento para manter as melhores propriedades de viabilidade celular
do enxerto ósseo, quando se requer período extra-corpóreo longo para adaptação
ao leito receptor. Tratando-se de reconstrução de maxila utilizando-se de enxerto
ósseo autógeno de calota craniana o tempo de remoção do enxerto até sua
adaptação na maxila pode-se levar horas e aí também a melhor forma de se manter
este enxerto com viabilidade celular ainda é uma incógnita e não existe ainda um
consenso do que utilizar. Segundo (Piermattei and Flo
20
,1997) após a obtenção, o
enxerto de osso esponjoso autógeno deve ser aplicado o mais rapidamente
possível. No entanto, se for necessária à estocagem até o momento da
transferência para a área receptora, o enxerto deve ser mantido envolto em
compressa de umedecida com sangue ou colocada em cuba e coberta com gaze
umedecida em solução salina fisiológica a 9% ou Ringer (Shena
22
, 1983;
Piermattei and Flo
20
, 1997). A exposição ao meio ambiente por 30 minutos ou
mais diminui a viabilidade celular. Por outro lado a elevação da temperatura
acima de 42 graus centígrados, devido à luminosidade da sala cirúrgica, induz à
morte celular (Fox
5
, 1984). A falta de consenso e a carência de dados na literatura
referentes a algumas situações específicas como foram citadas no transcorrer desta
introdução, estimula a realização deste trabalho de pesquisa cujos resultados
Introdução 22
nortearão e darão subsídios para atividade clínica utilizando-se de enxerto ósseo
autógeno. Assim sendo o presente trabalho tem por objetivos:
1) Avaliar se a solução de Euro Collins
®
apresenta a propriedade
de manter as células do enxerto ósseo autógeno com vitalidade.
2) Analisar a viabilidade celular do enxerto ósseo por análise
microscópica e imunoistoquímica.
23
Material e Método
“Só é útil o conhecimento que nos torna melhores”.
(Sócrates)
2) Material e
Material e Método
24
Método
*
Material e Método
O presente estudo apresentou as seguintes etapas:
a) Parecer da Comissão de ética na Experimentação Animal
(CEEA),
b) Cirurgias experimentais,
c) Obtenção e preparo das peças para avaliação microscópica e
imunoistoquímica,
d) Avaliação microscópica e imunoistoquímica.
Foram utilizados 43 ratos machos de mesma linhagem (Rattus
norvergicus, albinus, Wistar), com peso variando entre 290 a 350g todos
procedentes do Biotério Central UNESP-Araçatuba. Os animais após obtenção dos
enxertos retirados da calvária foram sacrificados. Na fase cirúrgica, os animais
receberam medicação pré-anestésica injetável de cloridrato de tiazina (10 mg/Kg
de peso corpóreo), intramuscular; e após verificação dos sinais de sedação, os
mesmos foram anestesiados com solução anestésica injetável de cloridrato de
Ketamina ( 100 mg/Kg de peso corpóreo) também por via intramuscular. Na
região da calota craniana todos os animais foram submetidos depilação manual.
Após a antissepsia do campo operatório com polivinilpirrolidona iodada (PVPI)
foi realizada incisão linear na região mediana da calota craniana expondo o osso
parietal direito e esquerdo. A seguir com o auxílio de descoladores foi realizado o
descolamento do retalho possibilitando a exposição dos dois ossos parietais. Na
seqüência as peças do enxerto foram removidas com auxílio de trefina de 5 mm de
diâmetro acoplada em micro-motor de baixa rotação, utilizando-se peça de mão
angulada sob constante irrigação com solução de soro fisiológico 0,9% estéril.
*
Figuras referentes à metodologia científica e experimental estão ilustrados no anexo C.
Material e Método
25
As peças foram removidas com auxílio de um Hollemback 3S,
preservando as meníngeas do encéfalo e a sutura sagital mediana, local por onde
percorre a veia sagital mediana.
Todas as peças do enxerto foram acondicionadas
individualmente em tubos de ensaio estéreis de 5 ml com tampa (Vacuum II
®
) as
quais foram devidamente identificadas de acordo com o grupo e mantidas dentro
do tubo de ensaio conforme cada condição do grupo. As peças que deveriam ficar
resfriadas foram mantidas no gelo acondicionadas em isopores de 17 litros com
2/3 de gelo picado, onde a temperatura manter-se-ia por volta de 3°C.
Períodos do experimento:
Imediato (Controle).
Tempo de 6 horas.
Tempo de 12 horas.
Tempo de 24 horas.
Tempo de 30 horas.
Grupos Experimentais:
(Grupo I)-Grupo Soro.
(Grupo II)-Grupo Solução Euro Collins
®
.
(Grupo III)-Grupo Seco em Temperatura Ambiente.
(Grupo IV)-Grupo Gelo (Seco).
Grupos
Experimentais
Grupo Soro
Fisiológico
Grupo Solução de
Euro Collins®
Grupo seco
Temp. ambiente
Grupo Gelo em
meio seco
Períodos
6 peças
Tempo 6 horas
5 peças 5 peças 5 peças 5 peças
Tempo 12 horas
5 peças 5 peças 5 peças 5 peças
Tempo 24 horas
5 peças 5 peças 5 peças 5 peças
Imediato
Tempo 30 horas
5 peças 5 peças 5 peças 5 peças
Total de peças por grupo
20 peças 20 peças 20 peças 20 peças
Total de peças: 86 peças
De cada modelo experimental foram obtidas 2 peças totalizando 43 ratos.
Material e Método
26
Após o período experimental determinado para cada grupo, as
peças foram fixadas em solução de paraformaldeído 4% durante 6 horas. No
transcorrer deste período as peças foram mantidas resfriadas em isopores com
gelo. Decorridas às 6 horas de fixação as peças foram lavadas em solução salina de
tampão fosfato (PBS), utilizando-se agitador orbital ajustado para ciclo de 10
minutos por 3 vezes. Após a lavagem, as peças foram submetidas à descalcificação
em EDTA 5% por 60 dias aproximadamente, com trocas semanais. Após a
descalcificação, as peças foram novamente lavadas em PBS e passadas para a
etapa de crioproteção em sacarose 30% por 48 horas à temperatura de 4° C. Os
cortes foram realizados em micrótomo de congelação obtendo-se cortes
transversais com 16 micrometros de espessura e montadas em lâminas
previamente gelatinizadas.
Após a obtenção dos cortes congelados, uma lâmina de cada
grupo foi submetida à coloração por hematoxilina e eosina (HE), para análise
histológica em microscopia óptica e o restante foram submetidas ao
processamento imunoistoquímico. Os anticorpos primários utilizados durante o
processamento imunoistoquímico foram específicos para a marcação de
Osteoprotegerina -OPG (Rabbit anti-opg - Santa Cruz Biotechnology), proteína
produzida pelos osteoblastos e envolvida nos processos de formação óssea
(Simonet, et al.
23
,1997); RANK (Rabbit anti-rank - Santa Cruz Biotechnology) e
RANKL (Goat anti-rankl - Santa Cruz Biotechnology). A expressão dessas
proteínas em osteoblastos e osteócitos serviram como índice para se avaliar a
viabilidade do tecido ósseo.
Os anticorpos secundários são anti-coelho biotinilado
produzido em burro (Biotin-SP-AffiniPure donkey anti-rabbit IgG - Jackson
Immunoresearch Laboratories) e anti-cabra biotinilado produzido em burro
(Biotin-SP-AffiniPure mouse anti-goat IgG - Jackson Immunoresearch
Laboratories).
Material e Método
27
Ao término da revelação, as lâminas permaneceram em
estufa onde após secagem completa os cortes foram desidratados em série
crescente de álcool, imersão em xilol e montagem das lamínulas com permount.
A análise tanto dos cortes corados em HE como dos cortes
submetidos às reações imunoistoquímicas foram realizada em microscopia óptica.
28
Resultados
“Os dias prósperos não vêm por acaso, nascem de muita
persistência”.
(Henry Ford)
Material e Método
29
Resultados
*
Foram realizadas reações imunoistoquímicas para a identificação das
proteínas Osteoprotegerina (OPG), RANK e RANKL nos cortes congelados,
obtidos da calota craniana dos ratos.
Os grupos experimentais foram determinados com o objetivo de analisar a
interferência do meio de conservação, bem como do tempo, sobre a capacidade
de preservação celular.
A imunoistoquímica é uma ferramenta metodológica que permite a
identificação de proteínas, ou seja, de antígenos, presentes no interior das células.
Portanto, as proteínas são identificadas de acordo com os anticorpos utilizados
nas reações e as marcações sempre aparecerão nas células que contêm as
proteínas presentes no citoplasma ou dispostas como receptores de membrana.
No experimento do presente trabalho, as reações imunoistoquímicas foram
realizadas para identificar a presença de OPG, RANK e RANKL. A expressão
destas proteínas evidenciou-se nos osteócitos marcados pela Diaminobenzidina,
quando a reação imunoistoquímica foi revelada. Em algumas situações, pôde-se
observar também que as lacunas dos osteócitos apareciam com as marcações
imunoistoquímicas pela DAB.
Os osteócitos mostraram-se imunomarcados sempre na periferia do corte
(Figura 1). À medida que se afastava das bordas do corte, as marcações
decresciam e o centro do corte mostrava-se sempre com ausência de células
imunomarcadas.
*
Figuras ilustrativas dos cortes histológicos no final desta sessão e no anexo D.
Resultados
30
Na análise imunoistoquímica a viabilidade celular foi evidenciada pela
coloração marrom-acastalhada dos osteócitos, quando esses expressavam as
proteínas OPG, RANK e RANKL.
Foi realizada a coloração por hematoxilina e eosina como orientação para
a análise da citoarquitetura. Observou-se que nos grupos em que a conservação
foi realizada a seco, por 30 horas (Figura 2), não foi possível identificar a
presença dos núcleos dos osteócitos, corados com hematoxilina, diferente dos
demais grupos e períodos. Portanto, vale destacar que, mesmo que a coloração
com hematoxilina e eosina mostrasse a presença de núcleos celulares corados,
inclusive no centro do corte (Figura 3), foram consideradas viáveis apenas as
células que estavam marcadas por expressarem as proteínas analisadas neste
estudo.
Observou-se que no grupo imediato-controle (Figura 4), no qual o
fragmento da calota craniana foi fixado imediatamente após a sua remoção e
depois foi realizado o processamento imunoistoquímico de rotina, foram
observadas marcações para a OPG.
Na conservação da calota em gelo (Figura 5), sem imersão em líquidos,
notou-se que as células expressavam a RANKL no período de 6 horas de
conservação. À medida que aumentou o tempo de conservação no meio estudado,
houve uma diminuição na quantidade de células imunomarcadas. No período de
30 horas, neste mesmo grupo, não foi possível observar imunomarcações das
proteínas estudadas.
Nos fragmentos de calota craniana mantidos à temperatura ambiente e sem
imersão em líquidos, observou-se que após o período de 30 horas, não havia
expressão significativa de RANKL nas células da calota craniana (Figura 6).
No grupo em que a conservação dos fragmentos foi realizada em soro
fisiológico, foi notado que no período de 6 horas, havia pequena expressão de
OPG nas células (Figura 7).
A conservação das calotas cranianas na solução de Euro Collins mostrou
que em todos os períodos analisados, foi possível observar a expressão de todas
Resultados
31
as proteínas estudadas. A expressão destas proteínas manteve-se em todos os
períodos analisados até 30 horas de conservação. Dentre elas, notou-se uma
maior imunomarcação para a OPG no período de 30 horas de conservação
(Figura 8 e 9).
Experimentos controle foram realizados, nos quais a omissão do anticorpo
primário durante o processamento da reação imunoistoquímica mostraram que as
marcações observadas foram específicas (Figura 10).
FIGURA 1-Grupo Euro Collins 24 horas – OPG, borda da calota (original, 63x,
Diaminobenzidina).
Resultados
32
FIGURA 2-Grupo seco ambiente 30 horas (original, 160x, HE).
Resultados
33
FIGURA 3-Grupo seco gelo 30 horas (original, 160x, HE).
FIGURA 4 - Grupo imediato – OPG (original, 63x, Diaminobenzidina).
Resultados
34
FIGURA 5 – Grupo seco gelo 6 horas – RANKL, periferia da calota (original, 63x,
Diaminobenzidina).
FIGURA 6-Grupo seco ambiente 6 horas – RANKL (original, 63x, Diaminobenzidina) .
Resultados
35
FIGURA 7 - Grupo soro fisiológico 6 horas – OPG (original, 63x, Diaminobenzidina).
FIGURA 8 - Grupo Euro Collins 30 horas – OPG (original, 63x, Diaminobenzidina).
Resultados
36
FIGURA 9 - Grupo Euro Collins 30 horas – OPG (original, 160x, Diaminobenzidina).
Resultados
37
FIGURA 10-Grupo controle da imuno (original, 63x, Diaminobenzidina).
38
Discussão
“Semeia um pensamento e colherás um desejo;
semeia um desejo e colherás a ação; semeia a
ação e colherás um hábito; semeia o hábito e
colherás o caráter”.
(Tihamer Toth)
Discussão 39
4) Discussão
Para a compreensão do mecanismo de incorporação, manutenção e
remodelação óssea é imprescindível o conhecimento da fisiologia óssea, que por
sua vez, esta fundamentada na composição bioquímica e molecular do tecido
ósseo, bem como suas propriedades físico-químicas. Partindo desta prerrogativa,
sabe-se que o tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo formado
por células e um material intercelular calcificado, denominado de matriz óssea
(Junqueira and Carneiro
12
, 1995) e dentre as duas funções mais importantes do
tecido ósseo, está a de manter a integridade do esqueleto, ou seja, suporte
estrutural e a homeostasia de cálcio, visto que 99% deste mineral encontra-se em
todo o organismo, está presente no tecido ósseo, o qual atua como um verdadeiro
reservatório de cálcio. O tecido ósseo é constituído de matriz extracelular que
contém componentes orgânicos (35%) e inorgânicos (65%). As células
correspondem a uma pequena parte da massa óssea, mas são responsáveis tanto
pela função de regulação da distribuição do conteúdo do componente inorgânico
e, portanto, pela manutenção dos níveis circulantes de cálcio (homeostase
mineral), quanto pela contínua reabsorção e formação da matriz óssea, fazendo
com que o sistema esquelético responda a forças mecânicas geradas pela
sustentação de pesos e atividade física (homeostase esquelética).
A matriz orgânica extracelular do tecido ósseo é quase que
exclusivamente (90%) composta por proteína, colágeno, proteoglicans,
glicoproteínas, enzimas, fatores de crescimento e proteolípides (Bianco AC,
Lazaretti-Castro M
3
, 1999).
Sabe-se que a neoformação óssea pode ocorrer a partir de três estádios, a
osteogênese, osteoindução e osteocondução (Garg
6
,1999) ; e que no caso do osso
Discussão 40
autógeno é o único com propriedade osteogênica, ou seja, tem a capacidade de
formar tecido ósseo mesmo na ausência de células mesenquimais indiferenciadas
o que caracteriza esta qualidade, pois compõe-se de células ósseas viáveis, as
quais produzem matriz orgânica e também fatores de crescimento para a
formação do tecido ósseo (Vasconcelos , et al
27
. 1999).
Os enxertos ósseos são utilizados como coadjuvantes no tratamento de
fraturas, perdas e defeitos ósseos na área médica. A literatura sobre enxerto ósseo
começa em 1682, com Van Meeken o qual transferiu o osso do crânio do cão
para o defeito craniano no homem, com sucesso (Rogers
21
, 1930). O cirurgião foi
forçado a retirar o transplante para evitar a excomunhão pela igreja.
Nas últimas décadas, foram idealizadas novas técnicas reconstrutivas,
como a fixação rígida de fraturas, enxerto de tecidos e cirurgias microscópicas.
Em geral, estes procedimentos foram direcionados à traumatologia e a
reabilitação oncológica e mais recentemente, aplicados a outras áreas da cirurgia
bucal. (Joos and Kleinheinz
11
, 2000).
A partir da extração dentária, inicia-se um processo de perda óssea
alveolar contínuo e progressivo, podendo estar, ainda, acompanhado de outros
agravantes, como a pneumatização do seio maxilar, acarretando deficiência
ósseas em altura e espessura, as quais restringem ou mesmo impossibilitam, a
colocação de implantes osseointegrados. A demanda para este tipo de tratamento
vem aumentando, forçando o desenvolvimento de técnicas para reconstrução e
adequação de rebordos alveolares atróficos (Jensen et al.
10
, 1990)
Breine and Branemark
4
, em 1980, foram os primeiros a avaliarem o uso
do enxerto ósseo autógeno e implantes para reconstrução de rebordos atróficos. O
osso autógeno é ainda, o melhor material para reconstrução de rebordos, é
considerado por muitos como “padrão ouro” entre as opções terapêuticas
(Groeneveld et al.
7
, 1999).
Oklund, et al
19
. em 1986 demonstrou que é da sobrevivência das células
na superfície do enxerto, que resulta a superioridade dos enxertos autógenos
recém obtidos sobre os enxertos autógenos congelados ou implantes ósseos.
Discussão 41
Albrektsson,
2
em 1980, não satisfeito com as análises microscópicas
estáticas existentes até então, utilizadas para avaliar o processo de reparo dos
enxertos ósseos corticais e medulares, utilizou o que denominou de método
microscópico vital, instalando câmaras de titânio ocas, separadas por duas esferas
de vidro numa distância de 100 mícras, nas metáfises de tíbias de coelhos, a fim
de estudar de maneira dinâmica “in vivo” e “in situ” os diferentes estádios do
processo de reparo dos enxertos ósseos. Para que isto fosse possível, a câmara e o
osso circunjacentes foram removidos com o auxílio de uma broca trefina e
enxertados em outra extremidade, ou reinseridos no mesmo local. Os enxertos
medulares apresentaram início de revascularização aos 15 dias pós-cirúrgicos e
término após 20 dias, quando então, evidenciou-se o processo de osteogênese e o
aumento de massa óssea trabecular. Os enxertos corticais apresentaram
revascularização mais lenta, completada no 30º dia. Neste período, as fases de
reabsorção e osteogênese ocorriam concomitantemente no mesmo enxerto. As
cavidades menores foram preenchidas por osso primário, ao mesmo tempo em
que outras foram criadas. Aos 35 e 40 dias, a fase osteogênica já havia sido
superada pela reabsorção, até que a massa óssea reduzisse significativamente,
para que outra fase osteogênica predominasse. Calculou-se o índice máximo de
penetração vascular nos enxertos medulares e corticais, obtendo-se os valores de
0,2mm/dia a 0,4mm/dia e 0,15 mm/dia a 0,3mm/dia, respectivamente.
Aproximadamente, a mesma densidade vascular existente anteriormente à
colocação do enxerto foi necessária para que a remodelação óssea acontecesse.
Para que os eventos de incorporação dos enxertos autógenos sigam o
curso normal, alguns cuidados são necessários a fim de se manter a integridade
do fragmento ósseo a ser utilizado. Sabe-se que um fator importante que interfere
no processo de reparo ósseo é o trauma nele causado durante sua manipulação,
principalmente durante as técnicas de osteotomia (Albrektsson
1
, 1980; Okamoto,
et al.
18
1994). O mesmo sucede nos procedimentos de enxertia óssea.
Confirmando esta teoria, Albrektsson
1
, em 1980, realizou um trabalho em
coelhos para verificar a resposta dos tecidos a receberem enxertos ósseos frente a
Discussão 42
vários níveis de trauma, além de observar a velocidade de revascularização e
remodelação óssea na área receptora. A sobrevivência dos enxertos foi testada
por meio de análise histoquímica uma vez que a simples presença de osteócito
nas lacunas não confirmava a viabilidade óssea. Verificou-se que o tempo de
revascularização foi proporcional à intensidade do trauma; ou seja, quanto maior
o trauma, maior o tempo para o início da revascularização e, consequentemente,
da remodelação óssea. A análise histoquímica demonstrou que apenas os
enxertos minimamente traumatizados apresentaram atividade da enzima
diaforase, sendo esta produzida apenas por células metabolicamente ativas.
Os métodos de armazenamento dos enxertos podem determinar as
condições de viabilidade de seu contingente celular. Steiner and Ramp
25
, 1988,
testaram vários meios de armazenamento para enxertos ósseos autógenos e seus
efeitos sobre o metabolismo de glicose e síntese de colágeno. Usaram soro
fisiológico a 0,9%, água destilada e dextrose 5% em solução Ringer lactato. O
estudo sugeriu que os enxertos deveriam ser armazenados em soro fisilógico ou
dextrose 5% em solução Ringer lactado por até cinco horas. A água destilada não
foi recomendada. Além disto, a temperatura do meio de armazenamento exerce
influência sobre as células. Marx, et al.
15
em 1979, documentaram que 94% da
viabilidade celular é mantida até quatro horas de armazenamento em temperatura
ambiente. Soluções com temperaturas elevadas aumentam o índice de morte das
células devido à demanda elevada de oxigênio. Apesar das temperaturas menores
que a ambiente não serem comumente aceitas, acredita-se que sejam associadas a
um discreto aumento no índice de sobrevivência celular.
Um fator importante é que o enxerto não deve ser imerso em solução
isotônica ou tratadas com antibióticos por serem tóxicos para as células
(Piermattei and Flo
20
, 1997).
Partindo-se da premissa que a solução de Euro Collins é utilizada para
estocagem hipotérmica de órgãos por períodos de até 30 a 40 horas (Soc. Bras.
de Nefrologia e Soc. Bras. Urologia
24
, 2002), é oportuno e com significado
clínico muito importante pesquisar a possibilidade de conservação do osso, visto
Discussão 43
que se trata de um tecido cuja complexidade morfofuncional é menor que a de
um órgão, o que pode-se tornar um excelente meio de armazenamento do enxerto
ósseo até a sua completa adaptação ao leito receptor. Isto viabiliza e dá
versatilidade nos processo reconstrutivos dentro da implantodontia, pois se pode
tornar um meio de conservação de tecido ósseo em casos de eventuais bancos de
ossos autógenos.
A utilização da imunoistoquímica como ferramenta metodológica se faz
de maneira muito precisa, pois se trata de uma das poucas opções disponíveis
para se avaliar a viabilidade celular dos enxertos, após os diferentes protocolos e
períodos adotados neste experimento. Porém durante a realização deste
experimento foram encontradas algumas situações em que houve a necessidade
de padronizar a técnica de imunoistoquímica, pois as peças não foram
perfundidas inicialmente, apenas fixadas em paraformoldeído o que diferencia da
tramitação rotineira nos trabalhos de imunoistoquímica. No entanto a utilização
da calota craniana de ratos se mostrou um modelo de fácil execução e
padronização das amostras. Não obstante deve-se considerar a dificuldade de se
obter cortes congelados do osso da calota, porém é ainda a melhor maneira de se
obter as reações de imunoistoquímica visto que neste processo se conserva o
epitopo, isto é o sítio de ligação dos anticorpos utilizados nas reações.
Na análise da imunoistoquímica pode-se evidenciar a viabilidade celular
pela capacidade das células expressarem cada proteína na dinâmica do tecido
ósseo, ou seja: OPG é uma proteína expressada por osteoblastos e osteócitos em
atividade osteogênica (Simonet, et al.
23
1997); a RANKL é uma proteína
relacionada a osteoblastos em situação de estímulo para reabsorção óssea (pela
ligação da RANKL a RANK, presente na membrana dos pré-osteoclastos); a
RANK é uma proteína presente em pré osteoclastos e neste trabalho pode-se
notar a expressão da RANK em osteócitos e osteoblastos o que sugere o
metabolismo ósseo e consequentemente a viabilidade celular.
De acordo com os resultados obtidos: a expressão da OPG indica
atividade dos osteoblastos. Assim sendo, pode-se dizer que a solução de Euro
Discussão 44
Collins demonstrou ser o meio de armazenamento superior ao soro fisiológico
0,9% em todos os períodos, visto que até 30 horas havia expressão celular
semelhante ao grupo imediato. Estes achados vão de encontro com o trabalho de
McAnulty
16
em 1999, o qual obteve o melhor resultado com relação à
manutenção da viabilidade óssea de fragmentos esponjosos obtidos de coelhos
quando se utilizou também da solução de Euro Collins como meio de
armazenamento do enxerto.
O grupo soro fisiológico a 0,9% mostrou que existem células viáveis até o
período de 6 horas devido à expressão da OPG e RANKL, porém com menor
expressão que o Euro Collins. A temperatura baixa parece ter influência na
manutenção da viabilidade celular conforme Marx, et al.
15
em 1979. Nesse
experimento a temperatura não teve influência positiva no que se refere à
manutenção da viabilidade celular e estes achados também vão de encontro com
o trabalho de McAnult
16
de 1999, o qual também observou que o soro resfriado
não teve resultado tão significante quando comparado à solução resfriada de Euro
Collins.
Na análise microscópica dos cortes obtidos e corados em hematoxilina e
eosina pode-se notar que os núcleos celulares foram marcados pela eosina nos
mesmos períodos em que se nota atividade celular pela análise de
imunoistoquímica. A ausência de coloração e marcação do núcleo celular nos
períodos em que também não foram observados atividade celular pelas reações
com o anticorpo, são achados sugestivos de que a ausência de coloração e
evidenciação do núcleo celular no enxerto ósseo significa apoptose celular e/ou
necrose celular. Trabalhos de co-localização para OPG e RANKL deverão ser
realizados para analisar quais dessas proteínas predominam nas células do
enxerto nos diferentes períodos e meios de conservação. Considerando-se que
este estudo é inicial, a co-localização e estudos onde se faz a quantificação das
células viáveis consistirão numa próxima etapa a ser realizada.
De acordo com a metodologia empregada foi possível analisar a
superioridade da solução de Euro Collins
®
sobre as formas mais rotineiras
Discussão 45
aplicadas na prática das cirurgias reconstrutivas, na qual se utiliza o soro
fisiológico como padrão no armazenamento do enxerto ósseo até a sua adaptação
ao leito receptor. Esses resultados vêm nortear e dar suporte científico na forma
e maneira que se tem de armazenar o enxerto ósseo visando otimizar ao máximo
de atividade osteogênica nos processos de reconstrução óssea. Notadamente os
resultados deste trabalho também abrem o prisma para novas pesquisas, visto que
a literatura aponta que o meio de armazenamento em solução de Belzer apresenta
melhores resultados que o Euro Collins
®
no que se refere à conservação de
pâncreas transplantados.
46
“A maior recompensa do nosso trabalho não é o que
nos pagam por ele, mas aquilo em que ele nos
transforma”.
(John Ruskin)
Discussão
Conclusão
47
5) Conclusão
Conclusão
Dentro das condições do presente trabalho, pode-se concluir que:
1) A solução de Euro Collins® se mostrou superior ao grupo soro fisiológico
como forma de manter o enxerto ósseo com células viáveis;
2) A solução de Euro Collins® manteve as células do enxerto ósseo viáveis até
30 horas;
3) A imunoistoquímica mostrou ser a ferramenta metodológica de grande valor
para análise da viabilidade celular;
48
“Não existe vento favorável para aquele que não s
abe para
onde vai”.
(Arthur Schopenhauer)
Referências
49
6) Referências
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55
Anexos
Anexo B
56
ANEXO A
Anexo A
57
58
ANEXO B
59
Revisão da
Literatura
Anexo B
60
1) Revisão da
Literatura
Resultados
1.1) Enxerto Ósseo autógenos.
O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo formado
por células e um material intercelular calcificado, denominado de matriz óssea
(Junqueira and Carneiro
10
, 1995) e dentre as suas funções mais importantes está
a de manter a integridade do esqueleto. Assim, o suporte estrutural e homeostasia
de cálcio, visto que 99% deste mineral encontrado em todo organismo, está
presente no tecido ósseo, o qual atua como um verdadeiro reservatório de cálcio.
Do ponto de vista macroscópico, a estrutura óssea pode ser classificada
em relação a sua densidade em osso cortical (compacto) e medular (trabecular),
uma vez que as características histológicas são as mesmas (Junqueira and
Carneiro
10
, 1995). Basicamente encontram-se dois tipos de ossificação, a
intramembranosa que se forma a partir de membranas conjuntivas e a
endocondral que se forma ao longo das bordas de uma cartilagem (Junqueira and
Carneiro
10
, 1995). Apesar da embriogênese, não existem evidências de diferenças
bioquímicas, morfológicas ou funcionais entre os ossos de diferentes origens
(Hollinger, et al.
8
, 1999).
Sabe-se que a neoformação óssea pode ocorrer a partir de três estádios,
osteogênese, osteoindução e osteocondução; e que no caso do osso autógeno
estes estádios ocorrem como uma sobreposição de eventos, permitindo auma
formação óssea mais rápida (Garg
4
,1999).
O estadio da osteogênese ocorre quando o enxerto é suprido de células
capazes de formação óssea (osteoblastos viáveis). A osteoindução representa a
capacidade do enxerto de estimular a atividade osteoblástica do tecido ósseo
adjacente (área receptora) com subseqüente neoformação óssea a partir da
Anexo B
61
transformação de células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos pela
ação de um ou mais agentes indutores. No caso da osteocondução, o material de
enxerto ósseo conduz o crescimento e permite a aposição óssea a partir do
remanescente ósseo da área receptora (Garg
4
, 1999).
Os autoenxertos, ou enxertos autógenos, apresentam vantagens sobre
os demais pela ausência de imunogenicidade e pela presença de células viáveis
com capacidade osteogênica, mesmo na ausência de células mesenquimais
indiferenciadas (Schenk
15
, 1994).
As primeiras bases científicas para estudo dos enxertos ósseos, foram
demonstradas por Ollier
12
em 1867, quando relatou a transferência de osso e
periósteo e acreditava que ambos permaneciam vivos, baseado na ostegênese que
o próprio autor observou no enxerto.
Quase 30 anos mais tarde, em 1893, Barth
1
foi o primeiro a discordar
de Ollier
12
, pois o mesmo observou nos seus estudos que vários dias após a
transferência do enxerto ósseo, este se apresenta sem vitalidade e que somente
com a invasão gradual de células oriundas do leito receptor, ocorreria o
repovoamento com células vivas, denominando muito mais tarde e mantido até
os dias atuais de osteocondução.
Phemister
13
(1914) concluiu definitivamente que algumas células
osteogênicas da superfície do enxerto ósseo sobrevivivam por difusão de
nutrientes advindos do leito receptor, demonstrando em seu artigo entitulado de
“O transplante de osso e o poder regenerativo de seus constituintes”.
Braine and Branemark
2
, em 1980, foram os primeiros a avaliarem o
uso do enxerto ósseo autógeno e implantes para reconstrução de rebordos
atróficos. A partir deste trabalho, diferentes técnicas de reconstrução têm sido
utilizadas na reabilitação de pacientes parcial ou totalmente desdentados que
apresentam deficiência ou ausência de osso alveolar. De um modo geral, podem-
se agrupar estas técnicas nos seguintes procedimentos: técnica de reconstrução
com enxerto tipo onlay, baseada na fixação de grandes blocos ósseos sobre a
crista do rebordo alveolar; técnica de reconstrução tipo veneer, onde o enxerto é
Anexo B
62
posicionado sobre a face vestibular ou lingual, envolvendo ou não a crista para
obtenção de aumentos em altura e espessura; técnica inlay, onde o enxerto é
posicionado no interior de defeitos ósseos, normalmente associada a ostectomias
completas maxilares (Triplett
18
, 1996), procedimentos de levantamento de seio
maxilar ou fossa nasal (Neyt et al
11
. 1997).
1.2) Solução de Euro Collins®
Este produto tem aplicação com comprovação científica, como solução
utilizada para perfusão gravitacional e/ou estocagem hipotérmica de órgãos. Os
protocolos de preservação de órgãos variam entre as diversas equipes de
transplantes, seja por disponibilidade da solução, custos, experiência própria,
crença científica ou protocolos de pesquisas. Como solução utilizada para
preservação de órgão pode-se destacar: solução de Belzer da University of
Wisconsin (UW) conhecida como Viaspan cujo país de origem EUA. Forma de
Apresentação. Bolsa/Infusão. Concentração. Fabricante. Dupont Pharma; Euro
Collins (EC); solução de Celsior (CS) e Custodiol (HTK). De acordo com o
Projeto Diretrizes intitulado como Transplante Renal-Manuseio do Doador e
Receptor, elaborado pela (Sociedade Brasileira de Nefrologia e Sociedade
Brasileira de Urologia em 30 de setembro de 2002
16
) em conjunto com a
Associação Médica Brasileira e Conselho Federal de Medicina as soluções
preconizadas para perfusão e estocagem de rins a 4 graus centígrados são a
solução de Euro Collins ou solução de Belzer. A solução de Euro Collins é um
produto internacional, cuja representação, produção e comercialização é realizada
pela filial FRESENIUS KABI BRASIL LTDA e em função da sua
disponibilidade, custos e carência de dados na literatura referentes a algumas
situações específicas de nossa realidade estimula-se a realização deste trabalho de
pesquisa.
Anexo B
63
1.3) Anticorpos utilizados nas reações de imunoistoquímica: a expressão das
proteínas OPG, RANK e RANKL
Sabe-se hoje que várias proteínas têm participação na diferenciação de
células osteoprogenitoras em osteoblastos, bem como na diferenciação de
macrófagos em osteoclastos. Estudos direcionados à identificação de fatores de
crescimento e de proteínas efetivamente envolvidas no processo de reparação
óssea e na regulação da atividade osteoblástica/osteoclástica estão sendo
possibilitados com o surgimento de técnicas como a imunoistoquímica,
hibridização in situ, PCR, etc.
Dentre as proteínas ósseas identificadas e envolvidas nos processos de
remodelação/reabsorção óssea podemos destacar a Osteoprotegerina (OPG), a
RANKL e RANK como marcadores das atividades celulares dentro da dinâmica
da remodelação óssea.
A expressão destas proteínas vêm sendo analisada em biópsias de
tecido ósseo de pacientes portadores de enfermidades como mieloma múltiplo
(Roux, et al.
14
, 2002), artrite reumatóide (Hofbauer and Heufelder
9
, 2001)
desordens osteoclásticas (Helfrich
6
, 2003) e principalmente no diagnóstico de
osteoporose (Hofbauer and Schoppet
7
, 2001).
Na membrana dos osteoclastos e em células dendríticas esta presente a
RANK, uma proteína receptora que controla a osteoclastogênese e o
metabolismo do cálcio. O ligante da RANK (RANKL) é uma proteína produzida
pelos osteoblastos, células do estroma ósseo e pelos linfócitos T ativados,
podendo promover a reabsorção óssea ao ligar-se a RANK. Sua expressão é
limitada às áreas de reabsorção óssea e linfonodos.
A osteoprotegerina é uma proteína também produzida por osteoblastos
e células do estroma ósseo e que se liga a RANKL, impedindo sua ligação a
RANK (Stejskal, et al.
17
, 2001). A OPG inibe a osteoclastogênese impedindo a
maturação dos osteoclastos. Além do tecido ósseo, a osteoprotegerina pode ser
detectada em outros tecidos do trato digestivo, coração, pulmão, fígado, rim,
cérebro e até cartilagem (Stejskal, et al.
17
2001). O grau e a atividade da
Anexo B
64
reabsorção óssea dependem principalmente do balanço entre a OPG e a RANKL;
fatores que aumentam a expressão da RANKL na maioria reduzem OPG e vice-
versa (Stejskal, et al.
17
2001). Embora supostamente a osteoprotegerina e a
RANKL possuam muitas outras funções no organismo (influência na resposta
imune, origem de calcificações vasculares e no metabolismo do cálcio em geral,
metabolismo das glândulas mamárias durante a gravidez, etc.), estas proteínas
têm sido estudadas principalmente com a finalidade de se analisar a dinâmica da
remodelação/reabsorção que ocorre dentro da homeostasia óssea. Estudos
mostram que camundongos com deficiência na expressão da OPG apresentam
osteoporose (Bucay, et al.
3
, 1998). Isto parece ocorrer devido à expressão destas
proteínas, que também têm sido detectadas em células do ligamento periodontal,
sugerindo sua participação como moduladores dos processos de reabsorção que
ocorrem no periodonto de inserção (Hasegawa, et al.
5
, 2002).
Referências
1. Barth A. Uber histologische befunde narch kknochen-implantation. Arch.
Klin. Chir., v.43 (suppl.32),p.409-13,1893.
2. Breine U, Branemark PI. Reconstruction of alveolar jaw bone. Scand J
Plast Reconstr Surg, 1980; 14(1): 23-48.
3. Bucay N, Sarosi I, Dunstan CR, Morony S, Tarpley J, Capparelli C,
Scully S, Tan HL, Xu W, Lacey DL, Boyle WJ, Simonet WS.)
Osteoprotegerin deficient mice develop early onset osteoporosis and
arterial calcification. Genes Dev, 1998; 12:1260-1268.
Anexo B
65
4. Garg A.K..Graffiting materials in repair and restoration. In: Lynch SE,
Genco RJ, Marx RE.Tissue engineering: applications in maxillofacial
surgery and periodontics. Chicago: Quintessence Books; 1999. p.83-101.
5. Hasegawa T, Yoshimura Y, Kikuiri T, Yawaka Y, Takeyama S,
Matsumoto A., Oguchi H, Shirakawa T. Expression of receptor activator
of N. F. [kappa] B ligand and osteoprotegerin in culture of human
periodontal ligament cells. Journal of Periodontal Research, 2002; 37 (6):
405-411.
6. Helfrich MH. Osteoclast diseases. Microsc Res tech, 2003; 61(6):514-32.
7. Hofbauer LC, Shhoppet M. Osteoprotegerin: a link between osteoporosis
and arterial calcification? Lancet, 2001; 358(9278):257-9.
8. Hollinger JO., Buck DC, Bruder SP. Biology of bone healing: its inpact on
therapy In: Lynch SE, Genco RJ, Marx RE.Tissue engineering:
applications in maxillofacial surgery and periodontics. Chicago:
Quintessence Books; 1999. p.17-53.
9. Houfbauer L C, Heufelder A.E. The role of osteoprotegerin and receptor
activator of nuclear factor [kappa] B ligand in the pathogenesis and
treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism, 2001; 44
(2):253-259.
10. Junqueira LC, CarneiroJ. Tecido ósseo. In: Junqueira LC, CarneiroJ.
Histologia básica. 8ª. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 1995.p. 108-
26.
Anexo B
66
11. Neyt LF. et al. Reconstruction of the severely resorbed maxilla with a
combination of sinus augmentation, onlay bone grafting, and implants. J
Oral Maxillofac Surg. 1997;55(12):1397-401.
12. Ollier L. Traite experimental et clinique de la regeneration des os et de la
production artificielle du tissue osseux. Paris: P. Masson et Fils; 1867.
p.128.
13. Phemister D. There fale of transplanted bone and regenerative power of its
variousconstituents. Surg. Gynecol.Obstet., v.19, p.303-9, 1914.
14. Roux S, Meignin V, Quillard J, Meduri G, Guichon-Mantel A, Fermand,
JP, Milgron E, Xavier M. Rank (receptor activator of nuclear factor –
[kappa]B) and Rankl expression in multiple myeloma. British Journal of
Haematology, 2002;117(1): 86-92.
15. Schenk RK. Bone regeneration: biologic basis. In: Buser D, Dahlin C,
Schenk RK. Guided bone regeneration in implant dentistry. Chicago,
Quintessence books,;1994. p.49-100.
16. Sociedade Brasileira de Nefrologia e Sociedade Brasileira de
Urologia.Transplante renal- manuseio do doador e receptor. São Paulo:
Associação Médica Brasileira; 2002.
17. Stejskal D, Bartek J, Pastorková R, Růžčka V, Oral I, Horalík D.
Osteoprotegerin, RANK, RANKL. Biomed. Papers, 2001; 145(2), 61-64.
18. Triplett RG, SchowSR. Autologous bone grafts and endosseous implants:
complementary techniques. J Oral Maxillofac Surg. 1996; 55 (12) :486-
Anexo B
67
94.
ANEXO C
68
FIGURA11-Ratos (
Rattus norvegicus
albinus.Wistar)
acondicionados em
gaiolas (Biotério e Centro Cirúrgico
Experi-mental “Ilídio Teodoro”-
UNESP.
FIGURA 12-
Ratos machos com peso corporal
variando entre 250 a 300 gramas.
Anexo C
69
FIGURA 13 - Anestesia por via intramuscular. FIGURA 14-
Cloridrato de Ketamina e Cloridrato
de Xilazina.
FIGURA 15-Tricotomia. FIGURA 16-Antissepsia com PVPI.
FIGURA 17-Incisão com lâmina 15. FIGURA 18–Descolamento do retalho
mucoperiostal com descolador de
Molt e Hollemback 3S.
Anexo C
70
FIGURA 19-Osteotomia com broca trefina
e
irrigação com foro fisiológico
0,9% .
FIGURA 20-Área osteotomizada.
FIGURA 21-Remoção do osso da calota com
auxílio do Hollemback 3 S.
FIGURA 22-Peça removida. Preservação
das meníngeas.
FIGURA 23-
Acondicionamento em frascos
identificados.
FIGURA 24-
Acondicionamento em soro
fisiológico 0,9%.
Anexo C
71
FIGURA 25-Solução de Euro Collins. FIGURA 26-Ativador da Solução de Euro Collins.
FIGURA 27-Conservação em isopor com gelo. FIGURA 28- Conservaçã
o em temperatura
aproximada de 3 graus Centígrados.
FIGURA 29- Peças acondicionadas para
tramitação laboratorial .
FIGURA 30- Peças l
avadas em agitador
orbitário.
FIGURA 31-Peças em EDTA com trocas
semanais.
FIGURA 32-
Peças conservadas em solução de
sacarose.
Anexo C
72
FIGURA 33-Micrótomo de congelação. FIGURA 34-Inclusão da peça em sacarose.
FIGURA 35-Corte com espessura de
16
micrometros.
FIGURA 36-
Colocação dos cortes em lâminas
gelatinizadas.
FIGURA 37-Lâminas gelatinizadas. FIGURA 38- Secagem das lâminas.
Anexo C
73
FIGURA 39-Protocolo Imunoistoquímica. FIGURA 40- Lavagem com PBS.
FIGURA 41-Inativação da Peroxidase endógena.
FIGURA 42-Ciclos de lavagem.
FIGURA 43-Anticorpo primário. FIGURA 44- Reação do anticorpo primário.
Anexo C
74
FIGURA 45-Anticorpo secundário. FIGURA 46- Reação do anticorpo secundário.
FIGURA 47-Incubação do complexo ABC. FIGURA 48-Revelação.
FIGURA 49-Histológico em HE.
Anexo B
75
ANEXO D
Anexo D
76
FIGURA 1-Grupo Euro Collins 6 horas – OPG (original, 160x, Diaminobenzidina).
Anexo D
77
FIGURA 2- Grupo Euro Collins 24 horas – OPG, borda da calota (original, 63x,
Diaminobenzidina).
FIGURA 3
-
Grupo soro fisiológico 6 horas –
OPG, meio da calota (original, 63x,
Diaminobenzidina
).
Anexo D
78
FIGURA 7 - Grupo Euro Collins 30 horas (original,) 160x, HE)
FIGURA 5 - Grupo imediato – OPG (original, 160x, Diaminobenzidina).
Anexo D
79
FIGURA 6 - Grupo imediato – OPG (original, 63x, Diaminobenzidina).
FIGURA 7 – Grupo seco gelo 6 horas – RANKL, periferia da calota (original, 63x,
Diaminobenzidina).
Anexo D
80
FIGURA 8- Grupo seco ambiente 6 horas – OPG (original, 63x, Diaminobenzidina)
FIGURA 9-Grupo seco ambiente 6 horas – RANK (original, 63x, Diaminobenzidina)
Anexo D
81
FIGURA 10-Grupo seco ambiente 6 horas – RANKL (original, 63x, Diaminobenzidina)
FIGURA 11 - Grupo soro fisiológico 6 horas – RANK (original, 160x, Diaminobenzidina).
Anexo D
82
FIGURA 12 - Grupo Euro Collins 30 horas – OPG (original, 63x, Diaminobenzidina).
FIGURA 13 - Grupo Euro Collins 30 horas – OPG (original, 160x, Diaminobenzidina).
Anexo D
83
FIGURA 14-Grupo controle da imuno (original, 63x, Diaminobenzidina).
Anexo D
84
FIGURA 15-Grupo imediato (original, 63x, HE).
FIGURA 16-Grupo imediato (original, 160x, HE).
Anexo D
85
FIGURA 17- Grupo soro fisiológico 12 horas (original, 63x, HE).
FIGURA 18-Grupo Euro Collins 30 horas (original, 63x, HE)
ANEXO E
86
Anexo E
87
Anexo E
88
89
ANEXO F
Anexo F
90
Anexo F
91
Anexo F
92
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
