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Daniel Rey de Carvalho
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA
BIOCOMPATIBILIDADE IN VITRO DE TITÂNIO GRAU II E IV
COM E SEM ATAQUE ÁCIDO.
Araçatuba
2005
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Daniel Rey de Carvalho
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA BIOCOMPATIBILIDADE IN VITRO DE
TITÂNIO GRAU II E IV COM E SEM ATAQUE ÁCIDO.
Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Magro Filho
Co-orientador: Prof. Dr. Adalberto Luis Rosa
Araçatuba
2005
Tese
apresentada à Faculdade de
Odontologia de Araçatuba -
UNESP, como
parte dos requisitos para obtenção do título
de DOUTOR pelo curso de Pós-
Graduação
em Odontologia, área de concentração em
IMPLANTODONTIA
.
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Dedicatória
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha mulher Heloisa
Que esse trabalho represente o FUTURO
O meu crescimento como ser humano, marido e em breve, como pai de família
Dedico este trabalho ao meu tio Paulinho
Que esse trabalho represente o PRESENTE
O resultado de minha introdução e desenvolvimento na Implantodontia
Dedico este trabalho aos meus pais César e Célia
e aos meus irmãos Gustavo e Flávio
Que esse trabalho represente o PASSADO
A retribuição aos investimentos feitos ao longo de minha vida
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me ajudado todas as vezes que pedi força no cumprimento de
minhas tarefas e por ter iluminado meu caminho.
Agradeço ao
Prof. Dr. Adalberto Luis Rosa
pelo apoio, orientação e disponibilização
de recursos para a execução deste trabalho. Agradeço também, por ter entendido e respeitado
as minhas limitações.
Agradeço ao colega Márcio Mateus Beloti pelo acompanhamento e constante
disponibilidade em me ajudar neste trabalho, além do exemplo de dedicação à pesquisa.
Agradeço ao Prof. Dr. Osvaldo Magro Filho por ter-me aceito como seu orientado,
permitindo que este trabalho fosse realizado em parceria com outras instituições.
Agradeço ao Diretor do Curso de Odontologia da Universidade Católica de Brasília,
Prof. Dr. Sérgio de Freitas Pedrosa, pelo apoio nas atividades do Doutorado e pela
confiança depositada em meu trabalho no Curso de Odontologia. Agradeço também ao colega
Prof. Eric Jacomino Franco pelo apoio nos momentos em que estive ausente.
Agradeço aos colegas de CTBMF da Universidade Católica de Brasília, Alexandre G.
B. Castro, Normeu Lima Jr. e Sérgio Bruzadeli Macedo por todas as vezes que me
substituíram nas atividades de graduação, durante os impedimentos para a realização deste
trabalho.
Agradeço ao
Normeu Lima Jr.
, parceiro das atividades de consultório e hospital, pela
compreensão devido às minhas ausências.
Agradeço às minhas avós Bebé e Joana e ao tio Dirceu pelo carinho e apoio
incondicional durante a permanência em Araçatuba. Graças ao Doutorado pude ficar mais
tempo perto da
vó Bebé,
antes de sua partida.
Agradeço à minha prima Cristine Marinelli Perri pela disponibilidade em me
hospedar enquanto estive em Ribeirão Preto.
Agradeço a empresa
SIN - Sistema de Implantes Nacionais,
através do
Prof. Dr.
Ariel Lenharo, pelo apoio a esta pesquisa.
Agradeço à Profa. Dra. Simoni Gheno pela disponibilidade em realizar a
Microscopia de Força Atômica
Agradeço ao Prof. Dr. Alfredo Júlio Fernandez Neto e sua orientada de mestrado,
Fabiana S. Gouveia, pela disponibilidade e orientação na utilização do Interferômetro à
Laser.
Agradeço ao Prof. Dr. Richard Landers pela disponibilidade em realizar as análises
de XPS.
Agradeço ao técnico Marco Militão pela disponibilidade em realizar a Microscopia
Eletrônica de Varredura.
Agradeço ao Diretor da Faculdade de Odontologia,
Prof. Dr. Paulo Roberto Botacin
;
e ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Prof. Dr. Wilson
Roberto Poi, por permitirem a execução deste trabalho.
Aos professores e alunos dos cursos de Especialização em Implantodontia da
UNESP, APCD e UNIP
.
Aos funcionários e alunos do Laboratório de Cultura de Células da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto/USP.
Aos
funcionários da Seção de Pós-graduação da Faculdade de Odontologia de
Araçatuba/UNESP.
Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de
Araçatuba/UNESP.
A todas as pessoas que contribuíram para que eu chegasse até aqui.
Epígrafe
EPÍGRAFE DO DOUTORADO
"Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina"
Cora Coralina
EPÍGRAFE DO MESTRADO
"Vigie seus pensamentos,
porque eles se tornarão suas palavras;
Vigie suas palavras,
porque elas se tornarão seus atos;
Vigie seus atos,
porque eles se tornarão seus hábitos;
Vigie seus hábitos;
porque eles se tornarão seu caráter;
Vigie seu caráter,
porque ele será o seu destino"
Poeta anônimo americano
Resumo e Unitermos
Abstract and Keywords
RESUMO
REY DE CARVALHO, D. Caracterização e avaliação da biocompatibilidade in
vitro de titânio grau II e IV com e sem ataque ácido. Araçatuba, 2005. 88p. Tese de
Doutorado em Odontologia com Área de Concentração em Implantodontia - Faculdade de
Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista.
Os eventos biológicos da osseointegração podem ser afetados pelas características
químicas e físicas dos materiais. O objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar a
biocompatibilidade de superfícies de cpTi grau II (GII) e IV (GIV) submetidas (CA) ou não
(SA) a duplo ataque ácido. As superfícies foram avaliadas por MEV, XPS e Interferometria a
Laser. Para a biocompatibilidade considerou-se a proliferação, viabilidade e adesão celulares,
atividade de ALP e formação de matriz mineralizada. As superfícies sem ataque ácido
exibiram sulcos e as superfícies com ataque ácido, exibiram cavidades e uma topografia mais
homogênea. A rugosidade das superfícies GIISA, GIICA e GIVCA eram semelhantes entre si
e diferentes da GIVSA. A espessura da camada de óxido esteve entre 5,0 e 5,5nm, com
predominância do TiO
2
, e os elementos químicos presentes em maiores concentrações foram
C, O, Ti e traços de S, Na e Si. As células mantiveram-se viáveis, proliferaram e exibiram
marcador de diferenciação osteoblástica em todas as superfícies avaliadas, como atividade de
ALP. Observou-se formação de nódulos de mineralização em maior grau nas superfícies sem
ataque ácido; em menor grau no GIICA e não foi observada no GIVCA. Concluímos que as
superfícies sem e com duplo ataque ácido exibiram topografias diferentes, entretanto, sem
alteração da composição química. Os tratamentos de superfície dos discos de titânio com
duplo ataque ácido resultaram em alteração da biocompatibilidade in vitro dessas superfícies,
evidenciada pela redução na formação de matriz mineralizada.
UNITERMOS: Osteoblastos - biocompatibilidade - discos de titânio.
ABSTRACT
REY DE CARVALHO, D. Response of human bone cell to commercially pure
titanium grade II and IV submitted to dual acid etched or not. Araçatuba, 2005. 88p. Tese de
Doutorado em Odontologia com Área de Concentração em Implantodontia - Faculdade de
Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista.
There is a general agreement that alterations of surface features can improve both
biological and biomechanical response to cpTi. The aim of this study was to investigate the
biocompatibility of cpTi discs grade II (gII) and IV (gIV) machined and submitted to dual
acid etched (DAE) or only machined (M). Topographic features were evaluated by SEM, XPS
and Laser Interferometry. For biocompatibility tests were considered cell attachment, cell
proliferation and viability, ALP activity and bone-like nodule formation. Machined discs
showed groove surface and DAE surfaces discs showed more regular topography with
cavities. MgII, DAEgII and DAEgIV showed similar average roughness values but different
than MgIV. The oxide film was essentially composed of TiO
2
with 5,0-5,5nm thickness. All
surface discs showed C, O, Ti with S, Na, Si traces. The results showed that all discs allowed
cell attachment, cell proliferation, cell viability and osteoblastic differentiation expressed as
ALP activity. Increased bone-like nodule formation was observed in MgII and MgIV
surfaces. DAEgII showed decreased bone-like nodule formation and DAEgIV showed no one.
We concluded that cpTi discs showed different topographical features but similar chemical
composition. DAE surface discs exhibited decreased in vitro bone-like nodule formation.
KEYWORDS: Osteoblast cells - biocompatibility - titanium discs.
Listas de
Abreviaturas, Figuras e Tabelas
LISTA DE ABREVIATURAS
µg Micrograma.
µm Micrometro.
ALP Alkaline phosphatase.
cpTi Commercially pure titanium.
E
B
Energia de ligação do elétron em relação ao nível de Fermi.
EDS Energy Dispersive Spectrometry.
EDTA Ethylenediamine-tetraacitic acid.
E
kin
Energia cinética de ejeção do elétron da amostra.
eV Elétronvolt.
H
2
SO
4
Ácido sulfúrico.
HCl Ácido clorídrico.
hv Energia do fóton incidente na amostra estudada.
KGy Kilogray.
M Molar.
mBar Milibar.
MEV Microscopia eletrônica de varredura.
mM Milimolar.
mmol Milimol.
nm Nanometro.
PBS Phosphate Buffered-saline.
Ra Média aritmética dos valores de altura à partir de um plano médio da superfície.
Medida linear.
Sa Média aritmética dos valores de altura à partir de um plano médio da superfície.
Medida de uma área.
Sku Kurtosis. Coeficiente de achatamento. Descreve a forma de distribuição da altura
de uma superfície.
Sq Desvio padrão das alturas da superfície a partir de um plano médio.
Ssk Skewness. Coeficiente de assimetria. Descreve a simetria de um pe
rfil a partir de
um plano médio.
Ti-Al
6
-V
4
Liga de titânio-6% de alumínio-4% de vanádio.
TiO
2
Dióxido de titânio.
XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy.
α-MEM α-Minimum Essential Medium.
LISTA DE FIGURAS
1.
MEV das superfícies de cpTi avaliadas em menor aumento à esquerda e maior
aumento à direita.
A: GIISA, B: GIICA, C: GIVSA e D: GIVCA.
2.
Imagens axonométricas da rugosidade das superfícies de cpTi obtidas por
Interferômetro a Laser.
A: GIISA, B: GIICA, C: GIVSA e D: GIVCA.
3. A: Picos fotoelétricos dos elementos químicos em cada amostra avaliada. B:
Ampliação do trecho de 0 à 250eV. C:
Espectro típico da linha 2p do Ti mostrando os
dados com o fundo inelástico, dados sem fundo inelástico e a decomposição da linha
nos componentes correspondentes a Ti metálico, TiO, Ti
2
O
3
, e TiO
2
.
4. Efeito das superfícies de cpTi na adesão celular ao final de 24 horas, expressa como
porcentagem do número inicial de células plaqueadas (2x10
4
células/poço). A adesão
celular não foi afetada pelas superfícies de cpTi (ANOVA: df=3;
F=2,35; p=0,111).
Os resultados são apresentados como média e a barra indica o desvio padrão.
5. Efeito das superfícies de cpTi no número de células aos 1, 7, 14 e 21 dias. O número
de células não foi afetado pelas superfícies ao final de 1 dia (ANOVA: df=3, F=2,35,
p=0,111) e 21 dias (ANOVA: df=3, F=0,75, p=0,536), mas foi afetado
aos 7 dias
(ANOVA: df=3, F=43,66, p=0,00001) e 14 dias (ANOVA: df=3, F=53,81,
p=0,00001) da seguinte maneira: GIVCA < GIICA < GIISA = GIVSA. O número de
células foi afetado pelo período de cultura da seguinte maneira: 1 dia < 21 dias < 7
dias = 14 dias. Os resultados são apresentados como média e a barra indica o desvio
padrão.
6. Efeito das
superfícies de cpTi na proliferação celular, expressa como tempo de
duplicação em horas entre 1 e 7 dias. O tempo de duplicação foi afetado pelas
superfícies (ANOVA: df=3, F=27,64, p=0,00001) da seguinte maneira: GIISA =
GIVSA < GIICA = GIVCA
. Os resultados são apresentados como média e a barra
indica o desvio padrão.
7.
Efeito das superfícies de cpTi na atividade de ALP, expressa como µ
mol
timolftaleína/h/mg proteína, aos 7, 14 e 21 dias. A atividade de ALP não foi afetada
pelas superfícies aos 7 dias (ANOVA: df=3, F=0,81, p=0,511) e 21 dias
(ANOVA:
df=3, F=2,35, p=0,110), mas foi afetada aos 14 dias (ANOVA: df=3, F=4,81,
p=0,015) da se
guinte maneira: GIICA < GIISA = GIVSA = GIVCA e pelo período de
cultura (ANOVA: df=2,
F=247,80, p=0,00001) da seguinte maneira: 21 dias < 14 dias
< 7 dias. Os resultados são apresentados como média e a barra indica o desvio padrão.
8. Matriz mineralizada corada por Alizarin red S. A: GIISA, B: GIICA, C: GIVSA e D:
GIVCA. A formação de matriz mineralizada aos 21 dias foi afetada pelas superfícies
(KRUSKAL-WALLIS: df=3, p=0,0009) da seguinte forma:
GIVCA = GIICA <
GIVSA < GIISA.
9. Nódulos de matriz mineralizad
a formados sobre superfícies de cpTi, observados por
MEV.
10.
A: Nódulo avaliado por MEV/EDS. B,C e D mostram o mapeamento dos elementos
químicos encontrados indicados pela cor cinza. B mostra o cálcio, C o fósforo e D o
titânio. E: gráfico mostrando os elementos químicos presentes na superfície avaliada.
LISTA DE TABELAS
1. Quadro comparativo dos valores de rugosidade.
2.
Quadro comparativo das espessuras da camada de óxido de titânio.
3.
Quadro comparativo das porcentagens dos elementos químicos.
Sumário
SUMÁRIO
Introdução 21
Proposição 24
Materiais e Métodos 26
Resultados 34
Discussão 44
Conclusões 50
Bibliografia 52
Anexo 1: Caracterização da Superfície 58
Anexo 2: Avaliação da Biocompatibilidade 72
Anexo 3: Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa 85
Anexo 4: Normas para Publicação 87
Introdução
INTRODUÇÃO
Na atualidade, um dos objetivos da pesquisa em implantodontia é o desenvolvimento
de mecanismos que induzam a uma formação óssea rápida, guiada e controlada.
1
Estes
objetivos poderiam ser alcançados pela compreensão das características de superfície dos
implantes, como a determinação dos efeitos da energia superficial, composição, topografia e
rugosidade sobre as respostas biológicas, como proliferação e diferenciação celular, produção
de matriz extracelular, sua maturação e mineralização.
2
O material usado para a confecção dos implantes é o titânio, devido a sua melhor
resposta biológica.
3
A composição do titânio comercialmente puro (cpTi) permite sua
classificação em quatro graus distintos dependendo do conteúdo de oxigênio, ferro e
nitrogênio.
4
Segundo Albrektsson (1985)
5
estes elementos melhoram suas propriedades
mecânicas e físico-químicas. Associadas às características do metal, modificações nas
superfícies dos implantes osseointegráveis podem ser conseguidas através de tratamento com
duplo ataque ácido. Estas superfícies, quando comparadas às usinadas, exibiram altas taxas de
sucesso clínico
6,7
, propiciaram maior contato osso-implante
8,9
e maior resistência ao torque de
remoção
10
. Associado a tais fatos, o tratamento de superfície com ácidos propicia ausência de
contaminantes, como por exemplo, partículas advindas de jateamento.
11
Segundo Davies & Hosseini (2000)
12
as características de superfície de um
biomaterial são determinadas pelos aspectos químico e topográfico. Por meio da análise de
Espectroscopia de Fotoelétron Excitados por Raios-X (XPS), observou-se que os elementos
encontrados em maior quantidade nas superfícies dos implantes foram C, O e Ti e em menor
quantidade N, Al, Si, Na, Mg, Ca, Zn, Cl, F e P.
13,14
Espera-se que as superfícies com ataque
ácido tenham valores baixos de contaminantes, devido à remoção dos mesmos pelo próprio
ácido.
14
Cassineli et al (2003)
15
reforçam que a análise química deve ser adotada em todo
experimento que avalia a resposta biológica das superfícies de implantes. Em relação à
topografia, a rugosidade aumenta a área de contato e melhora o potencial de embricamento
mecânico com o osso.
9,10
Wennerberg & Albrektsson (2000)
16
sugerem que preferencialmente
sejam usadas medidas tridimensionais e que o filtro de corte seja especificado e escolhido de
maneira que possa mostrar ondulação separada de rugosidade. Gadelmawla et al (2002)
17
enfatizam que a real geometria de uma superfície é tão complicada que um finito número de
parâmetros não podem fazer uma descrição completa.
Winkelmann et al (2003)
18
consideram importante a relação das propriedades físico-
químicas de um material com a resposta celular e integração tecidual. Em superfícies mais
complexas, como a com duplo ataque ácido, a adesão plaquetária torna-se aumentada.
19,20
Segundo Davies & Hosseini (2000)
12
a rede tridimensional de fibrina e plaqueta, ancorada na
superfície do implante, promove um arcabouço para as atividades do reparo, sendo um pré-
requisito essencial para migração de células osteogênicas in vivo. Muitos eventos biológicos
individuais associados à interface osso-implante, segundo Cooper et al (1998)
21
, podem ser
investigados em osteoblastos isolados. No entanto, o foco das avaliações de
biocompatibilidade in vitro devem ser as células osteogênicas humanas, tentando combinar a
origem das células com um local de real aplicabilidade
22
, pois mesmo que as células sejam de
humanos, podem advir de vários sítios doadores diferentes, como medular do osso ilíaco ou
fêmur
12
, processo alveolar da mandíbula
22
ou serem derivadas de osteossarcoma, como as
células MG63
23
. Diferentes morfologias e fenótipos podem existir de acordo com as
diferentes linhagens e estado de maturação das células, produzindo respostas variadas às
superfícies.
24
Para Cooper et al (1998)
21
a cultura de células oferece oportunidade única de
relacionar aspectos da formação óssea e os efeitos das alterações de superfície dos materiais.
Até o momento não existem relatos na literatura que avaliaram a biocompatibilidade
in vitro do cpTi com composição química e tratamentos de superfícies diferentes utilizando
células de humanos obtidas de fragmentos ósseos de processo alveolar.
Proposição
PROPOSIÇÃO
O objetivo deste estudo foi caracterizar física e quimicamente a superfície e avaliar a
biocompatibilidade in vitro do titânio comercialmente puro grau II e IV, submetidos ou não ao
duplo ataque ácido (ácido sulfúrico - H
2
SO
4
/ ácido clorídrico - HCl).
Materiais e Métodos
MATERIAIS E MÉTODOS
1. OBTENÇÃO DOS DISCOS DE TITÂNIO
Os discos de cpTi grau II e IV foram obtidos a partir de barras comerciais com
12mm de diâmetro e cortados para terem 4mm de espessura. Todos os discos foram usinados
em um torno CNC (Traub TNL 12, Germany) e divididos em grupos conforme o preparo de
sua superfície:
• GIISA – discos de cpTi grau II usinados.
• GIICA – discos de cpTi grau II usinados e submetidos ao duplo ataque ácido com
H
2
SO
4
e HCl a 60
o
C.
• GIVSA – discos de cpTi grau IV usinados.
•
GIVCA
– discos de cpTi grau IV usinados e submetidos ao duplo ataque ácido
com H
2
SO
4
e HCl a 60
o
C.
Os discos foram limpos e esterilizados por 25 KGy de cobalto 60 (raio gama). Para a
caracterização da superfície foi utilizado um disco de cada grupo, sendo realizada análises da
topografia, rugosidade, espessura e presença de contaminantes da camada de óxido de titânio.
Para a avaliação da biocompatibilidade in vitro foram utilizados 45 discos de cada grupo.
2. CARACTERIZAÇÃO DA SUPERFÍCIE DOS DISCOS DE TITÂNIO
2.1. Análise da topografia
A topografia da superfície dos discos de titânio foi avaliada através de Microscopia
Eletrônica de Varredura (XL30 FEG, Philips, Heindover, Holand) no Laboratório de
Caracterização Estrutural do Departamento de Engenharia de Materiais da Universidade
Federal de São Carlos - UFSCAR. Para tanto, os discos foram colocados numa câmara sob
alto vácuo (10
-5
mBar) com 20kV para serem observados no MEV.
2.2. Análise da rugosidade
A rugosidade de superfície dos discos de cpTi foi avaliada em Interferômetro a Laser
(Microfocus Expert IV, UBM Corporation, Sunnyvale, CA, EUA), no Laboratório de
Tribologia e Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica da Universidade Federal de
Uberlândia - UFU. Foi avaliada uma área pré-determinada de 3mm X 5mm por meio de
leitura óptica. Os dados obtidos foram analisados utilizando o software Mountains Map
Universal (Digital Surf Sarl, versão 3.0, Besancon, France) possibilitando a caracterização da
superfície quanto à forma e ondulação. O cálculo da rugosidade foi feito utilizando um filtro
de corte (“cut-off”) de 0,25mm. Os parâmetros empregados para caracterização numérica
foram a média aritmética das alturas da superfície a partir de um plano médio (Sa) e o desvio
padrão dos picos e vales da superfície (Sq). Também foram utilizados parâmetros funcionais
como coeficiente de achatamento (Sku - Kurtosis), que descreve a forma de distribuição da
altura de uma superfície e coeficiente de assimetria (Ssk - Skewness), que descreve a simetria
de um perfil a partir de um plano médio.
17
2.3. Análise da composição química da superfície
Um disco de cada grupo foi submetido à análise da superfície por meio de
Espectroscopia de Fotoelétron Excitado por Raios-X (VSW HA 100-VSW, Scientific
Instrument LTDA, Manchester, England) no Departamento de Física Aplicada do Instituto de
Física Gleb Wataghin da Universidade de Campinas - UNICAMP. Este método permitiu a
avaliação dos elementos químicos presentes na superfície e da espessura da camada de óxido
de titânio em nanometros (nm). As amostras foram avaliadas em ambiente de ultra-alto vácuo
(10
-9
/10
-10
mBar) onde uma fonte de raios X foi usada para ejetar elétrons da amostra. O
átomo absorve um fóton proveniente dos raios X e emite um elétron com determinada energia
de ligação que é ejetado com energia cinética (E
kin
), dada pela reação de Einstein E
kin
=hv-E
B
,
onde hv é a energia do fóton incidente (1486,6eV) e E
B
é a energia de ligação do elétron em
relação ao nível de Fermi. Os fotoelétrons ejetados possuem uma distribuição de energia
cinética que consistem em picos. A posição exata do pico indica o estado químico do átomo
emissor e a intensidade do pico fornece informação quantitativa sobre a composição da
superfície.
25-27
A referência da energia de ligação foi o pico 1s do C num hidrocarboneto (C-
C/C-H) igual a 284.6eV.
3. AVALIAÇÃO DA BIOCOMPATIBILIDADE IN VITRO DOS DISCOS DE
TITÂNIO
3.1. Obtenção e cultura de células do processo alveolar de humano
As células foram obtidas de fragmentos ósseos do processo alveolar (explantes)
durante procedimento cirúrgico em doador saudável, sob aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa com seres humanos da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo - USP. As células foram isoladas e cultivadas de acordo com a combinação de
métodos descritos por Maniatopoulos et al (1988)
28
e Mailhot & Borke (1998)
29
. Os
fragmentos ósseos foram coletados em tubo de centrífuga contendo meio de cultura e após,
transportados para um tubo de centrífuga com 10ml colagenase tipo II (1mg/ml) para serem
agitados por 30 minutos em banho à 37ºC, sendo este procedimento repetido por 6 vezes. Os
sobrenadantes das duas primeiras agitações foram descartados e aqueles das quatro últimas
agitações foram agrupados para obtenção das células. As células foram transferidas para
placas de cultura de 75cm
2
contendo α-MEM (α-Minimum Essential Medium, Gibco, Life
Technologies, Grand Island, NY, USA) suplementado com 15% de soro de feto bovino
(Gibco), 50µg/ml de gentamicina (Gibco), 0,3µg/ml de anfotericina (Gibco), 10
-5
M
dexametasona (Sigma, St. Louis, MO, USA), 5,0µg/l de ácido ascórbico (Sigma) e 7mM de
β-glicerofosfato (Sigma). O desenvolvimento da cultura de células foi avaliado em
microscópio de fase invertido (Axiovert 25, Carl Zeiss, Germany) por um período de 3 à 4
semanas. Ao final deste período as células confluentes foram liberadas das placas pelo
tratamento com tripsina 0,25% (Gibco) e EDTA 1mM (Ethylenediamine-tetraacitic acid,
Gibco) e transferidas para placas contendo 24 poços cada (Falcon, Franklin Lakes, USA)
numa concentração de 2x10
4
células/poço. Foram utilizadas 9 placas com 24 poços para
cultivo celular. Os discos de titânio de cada grupo foram colocados individualmente em 5
poços de cada placa sendo 4 poços sem discos mantidos como grupo controle das condições
de cultura das células. Durante todo o experimento as células foram mantidas em incubadora
sob 95% de ar atmosférico com 5% de CO
2
à 37
o
C e o meio de cultura trocado cada 3 ou 4
dias.
3.2. Adesão celular
As células foram incubadas por 24 horas. O meio de cultura das células foi removido
e os poços lavados três vezes com PBS (Phosphate Buffered-saline, Gibco) à 37
o
C para
eliminar as células não aderidas. As células aderidas foram enzimaticamente (Tripsina 0,25%
+ EDTA 1mM) liberadas dos discos e contadas, através de um microscópio de fase invertido
(Axiovert 25), utilizando-se um hemocitômetro (Fisher Scientific). A adesão celular foi
expressa como porcentagem do número de células iniciais.
3.3. Proliferação e viabilidade celular
Após 24 horas, 7, 14 e 21 dias as células aderidas foram enzimaticamente (Tripsina
0,25%, EDTA 1mM e Colagenase 1,3mg/ml) liberadas dos discos. Amostras dessa suspensão
de células em solução enzimática foram incubadas por 5 minutos com o mesmo volume de
azul de trypan 1% (Sigma) que cora em azul as células não-viáveis, sendo assim, contadas as
células viáveis e não-viáveis utilizando-se microscópio de fase invertido (Axiovert 25) e um
hemocitômetro (Fisher Scientific). Para cada tempo, a proliferação foi expressa como o
número total de células por poço e a viabilidade como porcentagem de células viáveis
contadas. A proliferação também foi expressa como tempo de duplicação das células
calculado entre 1 e 7 dias e que indica o tempo decorrido para que a população celular dobre
de tamanho, conforme descrito por Patterson (1979)
30
.
3.4. Medida da atividade de fosfatase alcalina
A atividade de fosfatase alcalina (ALP) foi medida aos 7, 14 e 21 dias através da liberação
de timolftaleína pela hidrólise do substrato timolftaleína monofosfato, utilizando um kit
comercial (Labtest Diagnóstica SA, Belo Horizonte, MG, Brasil) e seguindo as instruções do
fabricante. Para isso foram utilizados tubos branco, padrão e testes. O meio de cultura das células
foi removido, os poços lavados três vezes com PBS a 37
o
C e preenchidos com 2ml de solução de
lauril sulfato de sódio 0,1% (Sigma), que ficou em contato com as células por 30 minutos. Em
todos os tubos foram adicionados 50µl de substrato e 0,5ml de tampão dietanolamina
0,3mmol/ml, pH 10.1. No tubo padrão foi acrescentado 50µl da solução padrão. Os tubos foram
mantidos à 37
o
C por 2 minutos. Em seguida, foi adicionado em cada tubo teste, 50µl da solução
de lauril sulfato de sódio que estava em contato com as células. Os tubos foram mantidos à 37
o
C
por 10 minutos. Após esse período foram adicionados em todos os tubos, branco, padrão e testes,
2ml do reagente de cor (Na
2
CO
3
0,09mmol/ml e NaOH 0,25mmol/ml) e em seguida a
absorbância foi medida em um espectrofotômetro (CE3021, Cecil, Cambridge, UK) com
comprimento de onda de 590nm. A atividade de ALP, expressa em µmol de timoftaleína/h/ml,
foi calculada a partir da medida do tubo padrão. Para a normalização dos dados, foi medido o
conteúdo de proteína total, utilizando o método de Lowry et al (1951)
31
modificado, onde 1ml de
lauril sulfato de sódio dos mesmos poços utilizados para medida da atividade de ALP foram
transferidos para tubos de ensaio e misturados com 1ml de solução de Lowry (Sigma) e deixados
em repouso à temperatura ambiente por 20 minutos. Após esse período, foi adicionado em cada
tubo 0,5ml da solução de reagente de fenol de Folin e Ciocalteau (Sigma) e novamente deixados
em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, a absorbância de cada tubo foi
medida em um espectrofotômetro (CE3021) utilizando o comprimento de onda de 680nm. O
conteúdo de proteína total em µg/ml foi calculado em cada poço com base em uma curva padrão
feita a partir de albumina bovina (Sigma).
3.5. Formação de Nódulos de Mineralização
O meio de cultura das células foi removido, os poços lavados três vezes com PBS à
37
o
C e fixados com formalina 4%. Em seguida, os discos de cpTi foram desidratados em série
crescente de álcoois e corados com Alizarin red S (Sigma), que colore em vermelho os
nódulos de mineralização ricos em cálcio. As imagens digitais dos discos corados foram
pontuadas por cinco avaliadores, que desconheciam a identificação de cada disco. Foi
elaborado um quadro comparativo visual, onde os discos estavam dispostos aleatoriamente,
para que os avaliadores atribuíssem escores para cada disco variando entre zero (nenhuma
coloração) e três (máxima coloração). A fim de calibrar os avaliadores, foi mostrado a eles o
disco menos corado e o mais corado. As análises morfológica e química dos nódulos de
mineralização foram realizadas por Microscopia Eletrônica de Varredura / Espectroscopia de
Energia Dispersiva (MEV / EDS - Carl Zeiss, DSM 940A, Germany) realizadas no
Laboratório de Caracterização Estrutural do Departamento de Engenharia de Materiais da
Universidade Federal de São Carlos - UFSCAR.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados referentes à adesão, proliferação, viabilidade celulares e atividade de
fosfatase alcalina foram submetidos à análise de variância (ANOVA), seguido do teste de
DUNCAN quando apropriado, utilizando o software SPSS versão 6.0 para Windows.
Resultados com p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Os dados da
formação de matriz mineralizada, considerando a moda dos cinco avaliadores, foi comparada
pelo teste de KRUSKAL-WALLIS seguido pelo teste de FISCHER.
Resultados
RESULTADOS
1. CARACTERIZAÇÃO DA SUPERFÍCIE DOS DISCOS DE TITÂNIO
1.1. Análise da topografia
Observou-se que os discos de cpTi apresentaram superfícies diferentes de acordo
com os tratamentos realizados. Superfícies GIISA e GIVSA apresentaram sulcos produzidos
pelo processo de usinagem (Figura 1A e C) e superfícies GIICA e GIVCA apresentavam
cavidades produzidas pela ação dos ácidos (Figura 1B e D). As superfícies que foram apenas
usinadas apresentaram topografias semelhantes entre si, assim como as superfícies usinadas e
submetidas a duplo ataque ácido (Figura 1A e C, B e D, respectivamente).
1.2. Análise da rugosidade
A leitura óptica das superfícies de cpTi mostrou diferenças na microtopografia dos
grupos avaliados (Figura 2). Observou-se que as rugosidades das superfícies GIISA, GIICA e
GIVCA eram semelhantes entre si e diferentes da superfície GIVSA. O maior desvio padrão
entre a média das alturas foi observado na superfície GIVSA. Valores de Sku, inferiores a 3
indicaram que as superfícies GIISA, GIICA e GIVCA possuem poucos picos altos e vales
baixos. Já a superfície GIVSA possui muitos picos altos e vales baixos, com valor de Sku
superior a 3. A superfície GIVCA foi considerada simétrica, por ter valor Ssk nulo, as
superfícies GIISA e GIVSA apresentaram predominância de picos, com Ssk positivo, e a
superfície GIICA apresentou predominância de vales, com Ssk negativo (Tabela 1).
A
B
C
D
Figura 1.
MEV das superfícies de cpTi avaliadas em menor aumento à esquerda e maior aumento à direita.
A: GIISA, B: GIICA, C: GIVSA e D: GIVCA.
A
B
C
D
Figura 2.
Imagens axonométricas da rugosidade das superfícies de cpTi obtidas por Interferômetro a Laser.
A: GIISA, B: GIICA, C: GIVSA e D: GIVCA.
Tabela 1. Quadro comparativo dos valores de rugosidade.
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Sa (µm) 0.40 0.44 3.58 0.71
Sq (µm)
0.64 0.56 4.32 0.89
Sku 1.07 1.45 10.00 2.39
Ssk 2.10 -0.07 0.04 0.00
1.3. Análise da composição química da superfície
Não foram observadas diferenças nas espessuras das camadas de óxido de titânio
entre as superfícies avaliadas (Tabela 2). O óxido de titânio predominante nas superfícies
avaliadas foi o TiO
2
(dióxido de titânio - Figura 3A). As superfícies GIISA e GIVSA
apresentaram maior concentração de C e menores concentrações de O e Ti quando
comparadas às superfícies GIICA e GIVCA. Traços de S estavam presentes em todas as
superfícies e de Si somente nas superfícies de cpTi grau II (Figura 3B e C). Traços de Na
somente não apareceram no grupo GIVCA (Tabela 3).
Tabela 2.
Quadro comparativo das espessuras da camada de óxido de
titânio.
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
nm 5.5 5.0 5.5 5.1
Tabela 3.
Quadro comparativo das porcentagens dos elementos
químicos.
% GIISA GIICA GIVSA GIVCA
C 1s 52.44 41.04 50.18 36.30
Na 1s 0.96 2.34 1.89 -
O 1s 30.31 37.72 32.07 41.49
S 2p 5.57 3.28 2.29 6.31
Si 2p 1.35 1.47 - -
Ti 2p3/2 9.37 14.15 13.57 15.90
1000 800 600 400 200 0
Intensidade (u.a)
Discos de Titânio
G4 com ácido
G4 sem ácido
G2 com ácido
G2 sem ácido
O
KLL
C1s
Ti2p
O1s
Energia de Ligação (eV)
250 200 150 100 50 0
Discos de Titânio
G4 com ácido
G4 sem ácido
G2 com ácido
G2 sem ácido
Si2p
Si2s
O2s
Ti3p
Ti3s
S2p
S2s
Intensidade (u.a)
Energia de Ligação (eV)
445 45 0 455 460 465 470 47 5 480
Plasm on
2p1/2
2p3/2
Ti
2
O
3
TiO
TiO
2
Ti m etal
Ti 2p
Amostra G 2 sem Ácido
Dad os sem Fundo In elástico
Dados + F und o Inelástic o
Energia d e Ligação (eV)
A B C
Figura 3.
A: Picos fotoelétricos dos elementos químicos em cada amostra avaliada. B: Ampliação do trecho de 0
à 250eV. C: Espectro típico da linha 2p do Ti mostrando os dados com o fundo inelástico, dados sem fundo
inelástico e a decomposição da linha nos componentes correspondentes a Ti metálico, TiO
2
Ti
2
O
3
, e TiO.
2. AVALIAÇÃO DA BIOCOMPATIBILIDADE IN VITRO DOS DISCOS DE
TITÂNIO
2.1. Adesão celular
A adesão celular não foi afetada pelos tratamentos de superfície dos discos de titânio
após 24 horas de cultura celular (ANOVA: df=3, F = 2,35, p=0,111; Figura 4).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
% células aderidas
Figura 4.
Efeito das superfícies de cpTi na adesão celular ao final de 24 horas, expressa como porcentagem do
número inicial de células plaqueadas (2x10
4
células/poço). A adesão celular não foi afetada pelas superfícies de
cpTi (ANOVA: df=3; F=2,35; p=0,111). Os resultados são apresentados como média e a barra indica o desvio
padrão.
2.2. Proliferação e viabilidade celular
O número de células não foi afetado pelas superfícies ao final de 1 dia (ANOVA:
df=3, F=2,35, p=0,111) e 21 dias (ANOVA: df=3, F=0,75, p=0,536), mas foi afetado aos 7
dias (ANOVA: df=3, F=43,66, p=0,00001) e 14 dias (ANOVA: df=3, F=53,81, p=0,00001)
da seguinte maneira: GIVCA < GIICA < GIISA = GIVSA. O número de células foi afetado
pelo período de cultura da seguinte maneira: 1 dia < 21 dias < 7 dias = 14 dias (Figura 5). O
tempo de duplicação, calculado entre 1 e 7 dias, foi afetado pelas superfícies (ANOVA: df=3,
F=27,64, p=0,00001) da seguinte maneira: GIISA = GIVSA < GIICA = GIVCA (Figura 6). A
viabilidade celular foi afetada (ANOVA: df=3, F=4,05, p=0,010) pelas superfícies da seguinte
maneira: GIVCA < GIISA = GIICA = GIVSA, mas não foi afetada (ANOVA: df=3, F=1,83)
pelo período de tempo.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
0 1 7 14 21
Período (dias)
N
0
células x 10
4
/ poço
GIISA
GIICA
GIVSA
GIVCA
Figura 5.
Efeito das superfícies de cpTi no número de células aos 1, 7, 14 e 21 dias. O número de células não
foi afetado pelas superfícies ao final de 1 dia (ANOVA: df=3, F=2,35, p=0,111) e 21 dias (ANOVA: df=3,
F=0,75, p=0,536), mas foi afetado aos 7 dias (ANOVA: df=3, F=43,66, p=0,00001) e 14 dias (ANOVA: df=3,
F=53,81, p=0,00001) da seguinte maneira: GIVCA < GIICA < GIISA = GIVSA. O número de células foi
afetado pelo período de cultura da seguinte maneira: 1 dia < 21 dias < 7 dias = 14 dias. Os resultados são
apresentados como média e a barra indica o desvio padrão.
0
10
20
30
40
50
60
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Tempo de Duplicação (h)
Figura 6.
Efeito das superfícies de cpTi na proliferação celular, expressa como tempo de duplicação em horas
entre 1 e 7 dias. O tempo de duplicação foi afetado pelas superfícies (ANOVA: df=3, F=27,64, p=0,00001) da
seguinte maneira: GIISA = GIVSA < GIICA = GIVCA. Os resultados são apresentados como média e a barra
indica o desvio padrão.
2.3. Medida da atividade de fosfatase alcalina
A atividade de ALP não foi afetada pelas superfícies aos 7 dias (ANOVA: df=3,
F=0,81, p=0,511) e 21 dias (ANOVA: df=3, F=2,35, p=0,110), mas foi afetada aos 14 dias
(ANOVA: df=3, F=4,81, p=0,015) da seguinte maneira: GIICA < GIISA = GIVSA = GIVCA.
A atividade de ALP foi afetada (ANOVA: df=2, F=247,80, p=0,00001) pelo período de
cultura da seguinte maneira: 21 dias < 14 dias < 7 dias (Figura 7).
2.4. Formação de Nódulos de Mineralização
Após 21 dias de cultura observou-se a formação de nódulos de mineralização
recobrindo algumas áreas dos discos, com exceção do grupo GIVCA (Figura 8). Para cada
disco, o escore considerado foi a MODA dos cinco avaliadores, que foi utilizada para análise
estatística. Constatou-se que houve diferença estatística entre a coloração das superfícies dos
discos de titânio (KRUSKAL-WALLIS: df=3, p=0,0009), na seguinte ordem: GIVCA =
GIICA < GIVSA < GIISA. Através de MEV observou-se que os discos estavam recobertos
por células formando multicamadas, sendo impossível individualizar as células e matriz
extracelular. A mineralização ocorreu pela formação de pequenos nódulos que se fundem para
formar nódulos maiores (Figura 9). A observação por MEV utilizando mapeamento da
composição química evidenciou que houve sobreposição das imagens do Ca e P e ambos são
distintos daquele do Ti (Figura 10B, C e D) Pela análise com EDS, constatou-se que o nódulo
de mineralização era composto por 19.59% de fósforo, 39.40% de cálcio e 41.02% de
oxigênio (Figura 10E).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
7 14 21
Período (dias)
µmol timolftaleína / h / mg proteína
GIISA
GIICA
GIVSA
GIVCA
Figura 7.
Efeito das superfícies de cpTi na atividade de ALP, expressa como
µ
mol timolftaleína/h/mg proteína,
aos 7, 14 e 21 dias. A atividade de ALP não foi afetada pelas superfícies aos 7 dias (ANOVA: df=3, F=0,81,
p=0,511) e 21 dias (ANOVA: df=3, F=2,35, p=0,110), mas foi afetada aos 14 dias (ANOVA: df=3, F=4,81,
p=0,015) da seguinte maneira: GIICA < GIISA = GIVSA = GIVCA e pelo período de cultura (ANOVA: df=2,
F=247,80, p=0,00001) da seguinte maneira: 21 dias < 14 dias < 7 dias. Os resultados são apresentados como
média e a barra indica o desvio padrão.
A B C D
Figura 8.
Matriz mineralizada corada por Alizarin red S. A: GIISA, B: GIICA, C: GIVSA e D: GIVCA. A
formação de matriz mineralizada aos 21 dias foi afetada pelas superfícies (KRUSKAL-WALLIS: df=3,
p=0,0009) da seguinte forma: GIVCA = GIICA < GIVSA < GIISA.
Figura 9.
Nódulos de matriz mineralizada formados sobre superfícies de cpTi, observados por MEV.
A B C D
E
Figura 10.
A: Nódulo avaliado por MEV/EDS. B,C e D mostram o mapeamento dos elementos químicos
encontrados indicados pela cor cinza. B mostra o cálcio, C o fósforo e D o titânio. E: gráfico mostrando os
elementos químicos presentes na superfície avaliada.
Discussão
DISCUSSÃO
No presente estudo as superfícies de cpTi usinados, graus II e IV, submetidos ou não
ao duplo ataque ácido foram caracterizadas física e quimicamente. Através de MEV
observou-se que as superfícies sem ataque ácido exibiram sulcos produzidos pelo processo de
usinagem e as superfícies com ataque ácido, exibiram cavidades e uma topografia mais
homogênea. A rugosidade das superfícies GIISA, GIICA e GIVCA eram semelhantes entre si
e diferentes da superfície GIVSA. Wennerberg & Albrektsson (2000)
16
recomendaram a
utilização de um filtro de corte para a distinção de ondulação e rugosidade. Neste estudo, o
filtro de corte utilizado foi de 0,25mm, permitindo assim, a obtenção dos valores de
rugosidade separados da ondulação. Para a avaliação da topografia adotou-se parâmetros
tridimensionais, sendo eles Sa, Sq, Sku e Ssk, assim como Wang et al (1998)
32
. Somente o
GIVSA apresentou valor elevado de Sa, podendo ser considerado "rugoso" de acordo com
Wennerberg et al (1995)
33
. Os demais apresentaram valores reduzidos, sendo considerados
"minimamente rugosos". O alto valor de Sa do GIVSA deveu-se, provavelmente, à presença
de cavacos resultante do processo de usinagem. Constatou-se através dos valores de Sku que
as superfícies mostraram uma topografia mais plana, com exceção do GIVSA, que apresentou
muitos picos altos e vales baixos. As superfícies sem ataque ácido evidenciaram
predominância de picos; já no GIICA observou-se predominância de vales e no GIVCA uma
simetria topográfica.
Independente do tratamento de superfície empregado, o titânio forma uma estável
camada de óxido que, quando exposto ao ar, alcança a espessura de 2 à 10nm.
34,35
Observou-
se em nossas amostras, assim como descrito por Wieland et al (2005)
35
, que a espessura da
camada de óxido esteve entre 5,0 e 5,5nm e o óxido predominante foi o TiO
2
. A análise dos
contaminantes da camada de óxido de titânio realizada através do XPS mostrou que os
elementos químicos presentes em maiores concentrações foram C e O, seguidos de Ti e traços
de S, Na e Si. Da mesma forma que nos resultados de Ameen et al (1993)
13
, os discos de
titânio sem ataque ácido mostraram maior concentração de C, enquanto O e Ti apareceram
discretamente em maior concentração nos discos com ataque ácido. Tal fato deveu-se ao
tratamento de superfície aplicado, que promove uma diminuição da concentração de C, com
aumento de Ti e O. Cassinelli et al (2003)
15
observaram este mesmo efeito nas superfícies
avaliadas e consideradas mais limpas.
No presente estudo avaliou-se o comportamento de células humanas obtidas de
fragmentos ósseos do processo alveolar, cultivadas em condições que permitissem sua
diferenciação em osteoblastos. As células mantiveram-se viáveis, proliferaram e exibiram
marcador inicial de diferenciação osteoblástica em todas as superfícies avaliadas, como
atividade de ALP. No entanto, marcador tardio de diferenciação osteoblástica, como a
formação de nódulos de mineralização, foi observado em maior grau nas superfícies sem
ataque ácido; em menor grau no GIICA e não foi observado no GIVCA.
Com relação à adesão celular, não foram observadas diferenças estatisticamente
significantes entre as superfícies, a despeito de nas amostras de GIVCA ter ocorrido uma
discreta redução no número de células. Outros trabalhos demonstraram que diferenças de
rugosidade de superfície também não afetaram a adesão celular.
22,37,38
Para Mustafa et al
(2001)
22
não é possível obter grande diferença na adesão celular num período tão curto, como
o de 3h. Em nosso estudo, avaliou-se a adesão após 24h em cultura e mesmo assim não
existiram diferenças entre as amostras estudadas, mostrando que todas as superfícies foram
biocompatíveis.
Observou-se que as células cultivadas sobre as superfícies GIISA e GIVSA
apresentaram maior número de células entre o 7
o
e o 14
o
dias. Além disso, o tempo de
duplicação nessas superfícies foi menor, indicando maior proliferação celular. Isto sugere que
a proliferação celular não foi afetada pela topografia da superfície porque essas superfícies
mostraram o menor e o maior valor de Sa, respectivamente. Isto está em desacordo com os
resultados de Martin et al (1995)
23
e Bächle & Kohal (2004)
39
que mostraram um aumento do
número de células na superfície menos rugosa, mas está em acordo com Rosa & Beloti
(2003)
37
que mostraram que o tempo de duplicação não foi afetado pelas características
topográficas das superfícies. As discrepâncias entre esses estudos podem ser explicadas pela
avaliação de superfícies com topografias diferentes, muitas vezes citadas apenas como
rugosas, pela utilização de células de origem diferente e , ainda, pela utilização de métodos
diferentes de avaliação da proliferação celular.
Bächle & Kohal (2004)
39
relatam que culturas celulares em superfícies rugosas
tendem a exibir redução do número de células e aumento da atividade de ALP. Em todas as
superfícies avaliadas, a atividade de ALP foi maior no dia 7 com redução dessa atividade nos
períodos subseqüentes. Isto indica que, pelo menos uma parte das células apresentava
fenótipo osteoblástico. Nas superfícies sem ataque ácido, embora não estatisticamente
significante, foi observada maior atividade de ALP do que nas superfícies com ataque ácido,
sugerindo que também não houve efeito da topografia sobre este parâmetro. Nos estudos de
Mustafa et al (2001)
22
, a atividade de ALP, também normalizada pela atividade de proteína
total, não foi afetada pelas superfícies avaliadas, enquanto Rosa & Beloti (2003)
37
evidenciaram aumento da atividade de ALP com rugosidades entre 0,80µm e 1,90µm e
Martin et al (1995)
23
mostraram que a atividade de ALP diminuiu conforme o aumento da
rugosidade das superfícies.
A formação de matriz mineralizada foi evidenciada pela marcação com Alizarin red
S e confirmada pela análise morfológica e química dos nódulos por meio de MEV e EDS.
Comparando os discos corados com Alizarin red S, ficou evidente uma maior formação de
matriz mineralizada nas superfícies GIISA e GIVSA, apenas uma discreta marcação na
superfície GIICA e ausência de matriz mineralizada na superfície GIVCA. Observados por
MEV, constatou-se que houve a formação de nódulos de mineralização, que se apresentaram
como a fusão de nódulos menores. Submetidos à análise EDS, os nódulos mostraram
composição de Ca e P, numa razão de 1,23, sendo próxima da razão Ca/P na hidroxiapatita.
Segundo Prado da Silva et al (2000)
26
, a razão de Ca/P da hidroxiapatita é 1,67; ou 1,50 para a
hidroxiapatita deficiente em cálcio. Wieland et al (2005)
36
encontraram uma razão entre Ca e
P de 1,7 e mostraram que os osteoblastos produziram mais e maiores nódulos de
mineralização na superfície com Ra de 4,33µm, seguido da superfície com Ra de 0,58µm. Já
Rosa & Beloti (2003)
38
observaram discreto aumento na formação de nódulos de
mineralização com Ra próxima de 0,80µm. Sob o ponto de vista da rugosidade, as superfícies
GIVSA e GIISA, com Sa 3,58µm e 0,40µm, respectivamente, estão de acordo com o estudo
de Wieland et al (2005)
36
. Entretanto, não há explicação aparente para a reduzida formação de
nódulos de mineralização na superfície GIICA e a ausência no GIVCA.
Perizzolo et al (2001)
40
sugeriram existir uma relação direta entre a atividade de ALP
e a formação de nódulos de mineralização, que não foi observada neste estudo. Embora todas
as superfícies tenham sustentado um perfil de atividade de ALP semelhante, a quantidade de
matriz mineralizada foi diferente e, principalmente, não houve formação de matriz
mineralizada na superfície GIVCA. Considerando que a atividade de ALP é necessária apenas
para o início da mineralização da matriz mas não para a progressão do fenômeno,
41
é possível
que tenha ocorrido o início desta formação em todas as superfícies. No entanto, por alguma
razão, na superfície GIVCA o fenômeno não tenha progredido de forma a que o método de
marcação por Alizarin red S pudesse permitir visualizar e quantificar esta formação de matriz
mineralizada.
Por outro lado, a ausência de nódulos de mineralização no GIVCA poderia estar
relacionada a um discreto aumento da concentração de S ou ausência do Na, observados nesta
superfície. Segundo Ameen et al (1993)
13
, os elementos encontrados em pequenas
concentrações não devem ser ignorados, pois podem determinar o sucesso ou fracasso da
osseointegração, entretanto, não há relatos na literatura sobre a influência destes elementos
com a atividade dos osteoblastos.
Observou-se na literatura, resultados contraditórios que acarretaram em dificuldades
de comparações com o presente estudo. As discrepâncias entre esses estudos podem ser
explicadas pela avaliação de superfícies com topografias diferentes, nem sempre
completamente caracterizadas e muitas vezes citadas apenas como rugosas; pela utilização de
células de origem diferente e, ainda, pela utilização de métodos diferentes de avaliação das
respostas celulares. Isto reforça a necessidade de que quaisquer modificações da superfície ou
da composição química do Ti devam ser exaustivamente estudadas utilizando métodos in
vitro e in vivo para que seja possível conhecer seu comportamento biológico.
Conclusões
CONCLUSÕES
Os resultados do presente estudo permitiram concluir que:
1. Os tratamentos de superfície dos discos de titânio GII e GIV com duplo ataque ácido
resultaram em topografias mais homogêneas do que as usinadas, entretanto
apresentando rugosidades semelhantes, com exceção do grupo GIVSA.
2. Os tratamentos de superfície dos discos de titânio com duplo ataque ácido não
resultaram em alteração da composição química dessas superfícies.
3. Os tratamentos de superfície dos discos de titânio com duplo ataque ácido resultaram
em alteração da biocompatibilidade in vitro dessas superfícies, evidenciada pela
redução na formação de matriz mineralizada em comparação com as superfícies não
tratadas.
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Anexo 1
Caracterização da Superfície
1. SCANNING ELECTRON MICROSCOPY (SEM) - MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE VARREDURA (MEV)
GIISA
GIICA
GIVSA
GIVCA
2. SCANNING ELECTRON MICROSCOPY / FIELD EMISSION GUM (SEM/FEG)
GIISA:
GIICA:
GIVSA:
GIVCA:
3. ATOMIC FORCE MICROSCOPY (AFM) - MICROSCOPIA DE FORÇA
ATÔMICA (MFA)
GIISA
GIICA
GIVSA
Não foi possível obter imagens do GIVCA, pois a altura dos picos ultrapassou 5µm, que é o limite de
captação do MFA.
4. LASER INTERFEROMETRY - INTERFEROMETRIA A LASER
Quadro comparativo dos valores de rugosidade. Filtro de
corte (“cut-off”) 0,25mm:
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Sa (µm) 0.40 0.44 3.58 0.71
Sq (µm) 0.64 0.56 4.32 0.89
Sku 1.07 1.45 10.00 2.39
Ssk 2.10 -0.07 0.04 0.00
Definições:
Sa Média aritmética das alturas da superfície a partir de um plano médio.
Sq Desvio padrão das alturas da superfície a partir de um plano médio.
Sku Kurtosis. Coeficiente de achatamento. Descreve a forma de distribuição da altura de
uma superfície.
- Sku>3: muitos picos altos e vales baixos (fina)
- Sku<3: poucos picos altos e vales baixos (plana)
Ssk Skewness. Coeficiente de assimetria. Descreve a simetria de um perfil a partir de um
plano médio.
- Ssk positivo: predominância de picos
- Ssk nulo: supefície simétrica
- Ssk negativo: predominância de vales
GIISA:
Topografia
Ondulação
Rugosidade
Medidas da rugosidade:
Sa (µm) 0.40
Sq (µm) 0.64
Sku 1.07
Ssk 2.10
GIICA:
Topografia
Ondulação
Rugosidade
Medidas da rugosidade:
Sa (µm) 0.44
Sq (µm) 0.56
Sku 1.45
Ssk -0.07
GIVSA:
Topografia
Ondulação
Rugosidade
Medidas da rugosidade:
Sa (µm) 3.58µm
Sq (µm) 4.32µm
Sku 10.00µm
Ssk 0.04
GIVCA:
Topografia
Ondulação
Rugosidade
Medidas da rugosidade:
Sa (µm) 0.71µm
Sq (µm) 0.89µm
Sku 2.39µm
Ssk 0.00
5. X-RAY PHOTOELECTRON SPECTROSCOPY (XPS) - ESPECTROSCOPIA DE
FOTOELÉTRON EXCITADOS POR RAIOS-X ou ELECTRON SPECTROSCOPY
FOR CHEMICAL ANALYSIS (ESCA) - ESPECTROSCOPIA ELETRÔNICA PARA
ANÁLISE QUÍMICA
Quadro comparativo dos elementos químicos:
% GIISA GIICA GIVSA GIVCA
C 1s 52.44 41.04 50.18 36.30
Na 1s 0.96 2.34 1.89 -
O 1s 30.31 37.72 32.07 41.49
S 2p 5.57 3.28 2.29 6.31
Si 2p 1.35 1.47 - -
Ti 2p3/2 9.37 14.15 13.57 15.90
Quadro comparativo das razões atômicas:
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Ti/C 0.18 0.35 0.27 0.44
Na/Ti 0.1 0.16 0.14 -
Ti/O 0.3 0.38 0.42 0.39
S/Ti 0.6 0.23 0.17 0.4
Si/Ti 0.14 0.1 - -
Quadro comparativo das espessuras da camada de óxido de
titânio:
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
nm 5.5 5.0 5.5 5.1
Quadro comparativo das energias de ligação (A), largura a meia altura em eV (B) e área
relativa (C), respectivamente. Referência de energia de ligação: pico C1s de hidrocarboneto
(C-C,C-H) = 284.6 eV.
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
A B C A B C A B C A B C
C1s
284,6
286,0
283,3
1,8
2,1
2,4
75
18
7
284,6
286,3
288,6
1,9
2,2
2,2
69
21
10
284,6
286,4
289,3
1,9
2,2
2,3
78
15
7
284,6
286,4
288,9
2,0
2,0
2,3
78
16
6
Na1s 1071.8
3.3 - 1071.4 3.4 - 1072.1 3.4 - - - -
O1s
530,0
531,8
1,8
2,3
56
29
529,5
532,3
1,8
2,3
71
29
530,0
531,6
1,8
2,2
71
29
529,9
531,5
1,7
2,2
66
34
S2p 169,0 2,6 - 168,9 2,7 - 169,1 2,7 - 169,2 2,4 -
Si2p 102,5 2,6 - 102,1 2,5 - - - - - - -
Ti2p3/2
453,8
456,1
457,5
459,2
1,8
1,8
1,9
1,9
-
453,6
456,1
457,0
458,3
2,0
1,9
2,0
1,9
-
453,6
456,2
457,2
458,5
1,9
1,9
1,9
1,9
-
453,7
456,3
457,5
458,8
1,9
2,0
1,8
1,8
-
1000 8 00 60 0 400 200 0
Intensidade (u.a)
Discos de Titânio
G4 com ácido
G4 sem ácido
G2 com ácido
G2 sem ácido
O
KL L
C1s
Ti2p
O1s
Energia de Ligação (eV)
250 200 150 100 50 0
Discos de Titânio
G4 com ácido
G4 sem ácido
G2 com ácido
G2 sem ácido
Si2p
Si2s
O2s
Ti3p
Ti3s
S2p
S2s
Intensidade (u.a)
Energia de Ligação (eV)
44 5 45 0 455 460 465 470 47 5 480
Plasm on
2p1/2
2p3/2
Ti
2
O
3
TiO
TiO
2
Ti m etal
Ti 2p
Amostra G2 sem Ácido
Dad os sem Fun do In elástico
Dados + Fundo Inelástic o
Energia de Ligaç ão (eV)
A B C
A: Picos fotoelétricos dos elementos químicos em cada amostra avaliada. B: Ampliação do
trecho de 0 à 250eV. C: Espectro típico da linha 2p do Ti mostrando os dados com o fundo
inelástico, dados sem fundo inelástico e a decomposição da linha nos componentes
correspondentes a Ti metálico, TiO Ti
2
O
3
, e TiO
2
.
Anexo 2
Avaliação da Biocompatibilidade
1. FOTOS DA OBTENÇÃO E CULTURA DAS CÉLULAS
Coleta do fragmento ósseo
(explante).
Transporte do explante em meio
de cultura.
Tratamento enzimático para
liberação celular.
Capela de fluxo laminar. Placas com meio de cultura. Visão interna da incubadora.
Células nas placas de cultura após
24hs em incubadora - MO.
Células nas placas de cultura após
12 dias em incubadora - MO.
Células confluentes nas placas de
cultura após 21 dias em
incubadora - MO.
Células obervadas sobre
hemocitômetro - MO.
Apresentação dos discos de
titânio.
Poços com meio de cultura e
discos de titânio.
2. GRÁFICOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS TESTES DE CULTURA CELULAR
ADESÃO CELULAR (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
% células aderidas
Adesão Celular (% células aderidas) - 24 horas
Poço GIISA GIICA GIVSA GIVCA
1 25,00 16,50 41,50 41,50
2 25,00 75,00 41,50 16,50
3 58,00 66,50 66,50 16,50
4 50,00 66,50 50,00 33,00
5 41,50 25,00 66,50 25,00
Médias 39,90 49,90 53,20 26,50
Desvio Padrão 14,80 27,00 12,63 10,83
Análise estatística - ANOVA - Duncan:
df=3 F = 2,35 p=0,111
PROLIFERAÇÃO CELULAR (n
0
cél x 10
4
/ poço)
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
0 1 7 14 21
Período (dias)
N
0
células x 10
4
/ poço
GIISA
GIICA
GIVSA
GIVCA
Proliferação celular
Médias (n
0
cél x 10
4
/ poço)
Proliferação celular
Desvio padrão (n
0
cél x 10
4
/ poço)
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
0 hora 2,00 2,00 2,00 2,00 0 hora 0,00 0,00 0,00 0,00
24 horas 0,80 1,00 1,06 0,53 24 horas 0,30 0,54 0,25 0,22
7 dias 12,46 7,59 12,70 4,06 7 dias 2,45 0,95 0,85 0,53
14 dias 10,73 6,96 10,75 3,33 14 dias 0,88 1,38 0,85 0,99
21 dias 2,96 2,50 3,03 2,66 21 dias 0,32 0,24 0,83 0,92
Análise estatística - ANOVA - Duncan:
24 horas df=3 F=2,35 p=0,111
7 dias df=3 F=43,66 p=0,00001
GIVCA < GIICA < GIISA = GIVSA
14 dias df=3 F=53,81 p=0,00001
GIVCA < GIICA < GIISA = GIVSA
21 dias df=3 F=0,75 p=0,536
Tratamento df=3 F=4,71 p=0,005
GIICA = GIVCA < GIISA = GIVSA
Tempo df=3 F=47,22 p=0,00001
1 dia < 21 dias < 7 dias = 14 dias
TEMPO DE DUPLICAÇÃO (horas)
0
10
20
30
40
50
60
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Tempo de Duplicação (h)
Tempo de duplicação em horas (1-7 dias)
Poço Controle
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
1 38,04 37,20
47,43
39,32 45,89
2 37,09 34,14
45,71
41,73 50,44
3 38,89 34,14
52,50
41,23 54,28
4 35,48 41,17
52,50
40,12 46,64
5 - 36,80
48,90
39,32 49,36
Médias 37,38 36,69
49,41
40,34 49,32
Desvio Padrão 1,46 2,89 3,04 1,10 3,35
Análise estatística - ANOVA - Duncan:
Tempo de
Duplicação
df=3 F=27,64 p=0,00001
GIISA = GIVSA < GIICA = GIVCA
VIABILIDADE CELULAR (%)
0
20
40
60
80
100
120
1 7 14 21
Período (dias)
Viabilidade celular
GIISA
GIICA
GIVSA
GIVCA
Viabilidade celular
Médias (% cél. viável)
Viabilidade celular
Desvio padrão (% cél. viável)
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
24 horas 96,00 81,11 92,50 66,00 24 horas 8,94 22,08 11,18 23,02
7 dias 91,47 90,94 93,01 70,92 7 dias 1,60 1,88 2,48 34,15
14 dias 92,54 91,21 93,33 91,73 14 dias
2,53 4,59 2,76 7,27
21 dias 94,48 91,69 93,20 90,92 21 dias
4,18 10,38
2,17 2,65
Análise estatística - ANOVA - Duncan:
24 horas df=3 F=2,99 p=0,062
7 dias df=3 F=1,87 p=0,176
14 dias df=3 F=0,169 p=0,916
21 dias df=3 F=0,345 p=0,793
Tratamento df=3 F=4,05 p=0,010
GIVCA < GIISA = GIICA = GIVSA
Tempo df=3 F=1,83 p=0,149
MEDIDA DE PROTEÍNA TOTAL (µg de proteína / 10
4
cél)
0
10
20
30
40
50
60
70
7 14 21
Período (dias)
µg proteína / 10
4
células
GIISA
GIICA
GIISA
GIICA
Proteína total
Médias (µg de proteína / 10
4
cél)
Proteína total
Desvio padrão (µg de proteína / 10
4
cél)
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
7 dias 4,05 4,99 3,53 3,99 7 dias 0,36 0,95 0,27 2,26
14 dias 9,38 22,37 8,70 39,02 14 dias 0,89 3,91 0,72 2,84
21 dias 32,36 49,00 38,38 52,64 21 dias 6,25 5,26 4,38 6,33
Análise estatística - ANOVA - Duncan:
7 dias df=3 F=1,25 p=0,330
14 dias df=3 F=164,70 p=0,00001
GIISA = GIVSA < GIICA < GIVCA
21 dias df=3 F-13,94 p=0,0001
GIISA = GIVSA < GIICA = GIVCA
Tratamento df=3 F=3,27 p=0,003
GIISA = GIVSA < GIICA = GIVCA
Tempo df=2 F=80,82 p=0,00001 7 dias < 14 dias < 21 dias
MEDIDA DA ATIVIDADE DE DE FOSFATASE ALCALINA
(µmol timolftaleína / h / mg proteína)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
7 14 21
Período (dias)
µmol timolftaleína / h / mg proteína
GIISA
GIICA
GIVSA
GIVCA
Medida de Fosfatase Alcalina
Médias (µmol timolftaleína / h / mg proteína)
Medida de Fosfatase Alcalina
Desvio padrão (µmol timolftaleína / h / mg proteína)
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
7 dias 70,37 56,05 63,71 58,08 7 dias 9,80 9,75 13,43 23,28
14 dias 15,81 6,87 15,05 12,55 14 dias 7,22 2,30 3,77 1,52
21 dias 7,95 4,81 7,46 6,48 21 dias 2,62 0,93 1,08 2,72
Análise estatística - ANOVA - Duncan:
7 dias df=3 F=0,82 p=0,511
14 dias df=3 F=4,81 p=0,015
GIICA < GIISA = GIVSA = GIVCA
21 dias df=3 F=2,35 p=0,110
Tratamento df=3 F=0,889 p=0,453
Tempo df=2 F=247,80 p=0,00001 21 dias < 14 dias < 7 dias
3. DISCOS DE TITÂNIO CORADOS COM ALIZARINA RED S
GIISA
GIICA
GIVSA
GIVCA
Controle das condições de cultura
ESCALA VISUAL COMPARATIVA
0
Nehuma
3
Máxima
2
Média
1
Mínima
5
Escala de
Coloração
D
C
B
A
4321 5
Escala de
Coloração
D
C
B
A
4321
Escala visual comparativa para pontuação dos discos corados com Alizarin red S.
Mineralização – MODA:
Poço
GIISA GIICA GIVSA GIVCA
1 2,00 1,00 1,00 0,00
2 3,00 1,00 1,00 0,00
3 2,00 1,00 1,00 0,00
4 3,00 1,00 2,00 0,00
5 2,00 0,00 1,00 0,00
Análise estatística - KRUSKAL WALLIS - FISCHER:
df = 3 p = 0,0009
GIVCA = GIICA < GIVSA < GIISA
4. SCANNING ELECTRON MICROSCOPY (SEM) - MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE VARREDURA (MEV)
Nódulos de mineralização sobre disco de titânio.
5. SCANNING ELECTRON MICROSCOPY / ENERGY DISPERSIVE
SPECTROMETRY (SEM/EDS) - MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA /
ESPECTROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA
MICROANÁLISE:
Nódulo de
mineralização
SE BSE Ca P Ti
EDS - Condições: aumento 2000x - distância 25 mm - Voltagem 20kV
Elemento Elemento % Composição %
P 19.59 P
2
O
5
- 44.88
Ca 39.40 CaO - 55.12
O 41.02
-
Total 100.00 100.00
Anexo 3
Aprovação do
Comitê de Ética em Pesquisa
Anexo 4
Normas para Publicação
Revista para publicação: International Journal of Oral and Maxillofacial Imlants
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