( PDF ) Caracterização imunológica e genética da deficiência do componente C5 do sistema complemento humano

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CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA E GENÉTICA DA

DEFICIÊNCIA DO COMPONENTE C5 DO SISTEMA

COMPLEMENTO HUMANO

PRISCILIA AGUILAR RAMIREZ

Dissertação de Teses apresentada ao

Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo para a obtenção

do título de Mestre em Imunologia.

São Paulo

2007

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CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA E GENÉTICA DA

DEFICIÊNCIA DO COMPONENTE C5 DO SISTEMA

COMPLEMENTO HUMANO

PRISCILIA AGUILAR RAMIREZ

Dissertação de Teses apresentada ao

Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo para a obtenção

do título de Mestre em Imunologia.

Área de concentração: Imunologia

Orientadora: Professora Dra. Lourdes Isaac

São Paulo

2007

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A mis padres (Alicia y Alexander) por todo

su amor, cariño y apoyo incondicional em

todas las etapas de mi vida.

A mis hermanitos (Alicia, Peter y Nova) por

estar unidos a pesar de la distancia,

hermanitos yo los quiero mucho y siempre

voy a estar orgullosa de uds.

Al bebito Fabiam por devolver la ternura y

la alegria a mi hogar.

A Ricardo por ser el amor de mi vida

À família deficiente de C5

pela boa vontade e

colaboração

"Para os erros há perdão; para os fracassos, chance; para os amores impossíveis, tempo. De

nada adianta cercar um coração vazio ou economizar alma. O romance cujo fim é instantâneo

ou indolor não é romance. Não deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o

medo impeça de tentar. Desconfie do destino e acredite em você. Gaste mais horas realizando

que sonhando, fazendo que planejando, vivendo que esperando, porque embora quem quase

morre esteja vivo, quem quase vive já morreu."

Luis Fernando Veríssimo

Agradecimentos:

À Dra. Lourdes Isaac pela sua qualidade humana, por ensinar fora e dentro do laboratório,

Lou obrigada por todo o que fez por mim, como orientadora, esteve comigo e com as minhas

folhas escritas e resultados até o último dia e como pessoa ajudando-me sempre que teve um

problema. Obrigada pela a sua paciência.

À Dra. Beatriz Costa de Carvalho do Departamento de Alergia, Imunologia Clínica e

Reumatologia, Escola Paulista de Medicina (UNIFESP), pelo acompanhamento médico da

família C5 deficiênte.

Aos antigos companheiros de laboratório: Rafael, Carol, Thiago e Vitão pelos sorrisos e

alegrias sem fim.

A Benício pela sua amizade e por me abrir as portas de seu lar, fazer com que a sua família

fora como a minha.

Aos companheiros do laboratório: Alda, Daysseane, Lorena, Fabio, José e Edimara pela

convivência agradável e bons momentos.

A Marlene, Mariane e Isabel pelos ensinos de vida que ofereceram para mim.

Aos: Drs. Antonio Condino, Denisse Tambourgi e Maria Moura, por todos os dias que se

tomaram corrigindo a minha qualificação, eu segui todos os seus conselhos, obrigada por isso.

Aos docentes do departamento de Imunologia: Ises de Almeida Abrahamsohn, Vera L. G.

Calich, José Alexandre M. Barbuto, Sonia Jancar Negro pelos equipamentos utilizados e todo

o material prestado sempre que eu precisse.

As secretarias do departamento de Imunologia: Eny, Jotelma e Valeria, pela ajuda brindada e

pela eficiência de seus servicios em todo momento.

A Ricardo por nuestro amor, por aguantar mis malos dias y ajudarme en la parte final del

trabajo, yo te amo.

A Marcos por ser um amigo y estar conmigo siempre que lo necesite.

A Marcos, Julio Cesar y Andres que junto com Ricardo formarom conmigo uma família neste

país.

A mis amigas del Peru: Carolina, Saby y Miriam por la fuerza desde lejos, chicas gracias por

sus pensamientos positivos, por sus consejos y su cariño, las quiero mucho.

A sra. Maria, sr Joaquin e sr. Jair por nos adotar na nossa estância neste pais, vocês foram

como uns pais pra nos.............obrigada.

A Felipe e Zilda pela amizade e os optimos almorços no bandeião.

A todos os meus amigos villarrealinos y anexos: Glenda, Miguel, Miguelito, Paola, César,

Juan, Erica, Cesty, Eric y Dioguito.

A Arturo, Raul y Alexei por brindarme su sincera amistad.

A Marilu e Laércio pelas boas conversas entre experimento, pela amizade e pela ajuda

prestada em todo momento. A Gaby pela disposição desinteressada e pela amistade brindada.

A Renata e Simone pelas optimas traducções empre que eu necesite vocês ajudaron-me com

muita boa bontade.

A Jose Maria e Mario Julio pela sua ajuda desinteresada nos primeiros dias nesta

universidade.

A todos os funcionários de Instituto de Ciências Biomédicas pelo bom tratamento aos alunos.

A Renata, Jose Antonio, Ana Paula e a toda a gente da biblioteca que sempre me ajudarom

com muito carinho.

RESUMO

AGUILAR-RAMIREZ, P. Caracterização imunológica e molecular da deficiência do

componente C5 do sistema complemento humano. Disertação (Mestrado em Immunologia)

– Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2007.

A deficiência da proteína C5 do sistema complemento humano é rara. Há apenas cerca

de 38 casos relatados na literatura internacional. Esta deficiência é freqüentemente associada a

severas infecções recorrentes, provocadas por bactérias do gênero Neisseria. Os soros de

pacientes deficientes desta proteína possuem atividade bactericida reduzida e apresentam

níveis diminuídos de fatores quimiotáticos. Além disso, outras funções dependentes da

adequada ativação do sistema complemento podem estar comprometidas. Observamos a

ausência completa da proteína C5 no soro de três irmãos (II:4, II:5 e II:9), pertencentes a uma

mesma família com história de consangüinidade. Cinco integrantes pertencentes a esta família

já sofreram de episódios recorrentes de meningite e outras infecções. O objetivo principal

neste trabalho é caracterizar imunológica e geneticamente esta deficiência encontrada pela

primeira vez entre brasileiros. Empregando a técnica de imunodifusão dupla e imunodifusão

radial obtivemos níveis expressivos das proteínas C3, C4, C6, C7, C8, C9, Fator B, Fator H e

Fator I em todos os membros desta família avaliada, mas a proteína C5 não foi detectada no

soro dos três irmãos. Encontramos concentrações muito baixas da proteína C5 no soro destes

irmãos (0,9; 1,0; 1,3 µg/ml - concentração normal em indivíduos brasileiros saudáveis: 45-

190 µg/ml), quando avaliados por ELISA. Os soros dos probandos II:9, II:4 e II:5 não

apresentaram qualquer atividade hemolítica mediada pela via clássica ou pela via alternativa.

Enretando, quando a proteína C5 purificada foi adicionada ao soro do indivíduo deficiente

II:9, a atividade hemolítica mediada pela via alternativa atingiu níveis normais. O soro do pai

(I:2) apresentou apenas 25% da atividade hemolítica mediada pela via clássica, enquanto a

atividade hemolítica mediada pela via alternativa esteve presente em níveis normais. Deve-se

ressaltar que o soro de I:2 apresentou concentrações relativamente normais da proteína C1s e

da proteína C4. Usando a técnica de RT-PCR, a partir de RNA total extraído dos fibroblastos

do indivíduo II:9, detectamos a substituição silenciosa de ACC

498

por ACT

498

no cDNA do

gene C5, ambos os códons são responsáveis pela codificação de Thr. Os indivíduos I:1, I:2,

II:4 e II:9 apresentaram uma deleção no cDNA do gene C5 localizada entre os nucleotídeos

3876 - 4029, correspondentes ao éxon 30. Estudos feitos no gene C5 mostraram que a deleção

do éxon 30 deve-se à substituição de GAG

4028

por GAA

4028

no último nucleotídeo do éxon 30

o que leva a um erro no splicing deste mesmo éxon durante o processamento do RNAm de

C5. Este defeito foi responsável pela deficiência de C5 nesta família, provavelmente em

função da produção de uma proteína incompleta, instável e mais rapidamente degradada após

sua síntese.

Palavras Chaves: complemento, proteína C5, imunodeficiência, imunogenético, infecções

por bactérias do gênero Neisseria, sistema imune

ABSTRACT

AGUILAR-RAMIREZ, P. Immunological and genetic characterization of the deficiency

of the component C5 of the human complement system. Master thesis (Immunology)

Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2007.

The deficiency of the C5 component of the complement system is rare. Only 38 described

cases were described in the literature. This deficiency is frequently associated with severe and

recurrent infections, especially caused by Neisseria. The deficient patients sera have less

bactericidal activity and reduced production of chemotactic factors. Moreover, their sera fail

to properly activate the complement system. We found complete absence of C5 in the serum

of 3 members (II:4, II:5 e II:9) of a family with history of consanguinity. Five members of

this family had suffered from recurrent episodes of meningitis, and other less severe

infections. Our general objective is to characterize immunologically and genetically this

deficiency, the first of its type described in the Brazilian population. Using double

immunodifusion and radial immunodifusion we noted that C3, C4, C6, C7, C8, C9, Factor B,

Factor H and Factor I have expressive levels in all the individuals of this family, C5 was

absent in individuals II:4, II:5 and II:9 serum. This siblings contained lowest concentrations

of C5 (0.9; 1.0; 1.3 µg/ml - normal concentration in health Brazilian: 45 – 190 µg/ml) when

evaluated by ELISA. The probands sera II:4, II:5 e II:9 were also unable to mediate the

hemolytic activity by the classical and alternative pathways. When purified C5 was added to

the deficient serum at approximately physiological level, hemolytic activity was restored to

close to normal levels. Furthermore, the father’s serum (I:2) presented only 25% of hemolytic

activity mediated by the classical pathway and followed normal activity mediated by the

alternative pathway. The I:2 sera presented normal levels of C1s and C4. Using RT-PCR of

mRNA C5 obtained from the fibroblasts one of deficient (II:9), we detected a silent mutation

of ACC

498

to ACT

498

, both codons are responsible for the codification of Thr. Individuals I:1,

I:2, II:4 and II:9 have a deletion in the C5 cDNA located between nucleotides 3876 - 4029,

correspondent to exon 30. Studies shown that this deleção is due to the substitution of

GAG

4028

for a GAA

4028

in the last codon of exon 30 that leads to exon 30 skiping during the

processing of the C5 RNAm. This defect was responsible for the deficiency of C5 in this

family, probably in function of the production of an incomplete, unstable protein and more

quickly degraded after its synthesis.

Key words: complement, protein C5, immunodeficiency, immunogenetics, disease for

bacteries of Neisseria sp.immune system

LISTA DE ABREVIATURAS:

aa: aminoácido

Ag: antígeno

Ac: anticorpo

C1 INH: inibidor da proteína C1

C1q: molécula C1q do sistema complemento

C1r: molécula C1r do sistema complemento

C1s: molécula C1s do sistema complemento

C2: proteína C2 do sistema complemento

C3: proteína C3 do sistema complemento

C3(H

0)Bb: primeira C3 convertase da via alternativa

C3bBb: segunda C3 convertase da via alternativa

C3bBb3b: C5 convertase da via alternativa

C4: proteína C4 do sistema complemento

C4b2a: C3 convertase da via clássica

C4b2a3b: C5 convertase da via clássica

C4BP: C4b binding protein

C5: proteína C5 do sistema complemento

C5D: indivíduo C5 deficiênte

C6: proteína C6 do sistema complemento

C7: proteína C7 do sistema complemento

C8: proteína C8 do sistema complemento

C9: proteína C9 do sistema complemento

CCPR: complement control protein repeat

CR1: receptor do complemento do tipo 1

CR2: receptor do complemento do tipo 2

CR3: receptor do complemento do tipo 3

CR4: receptor do complemento do tipo 4

DAF: decay accelerating factor

ESE: exonic splicing enhancers

fB: fator B

fD: fator D

fH: fator H

fI: fator I

FHN: fibroblasto de humano normal

GADS: síndrome de artrite e dermatite por gonococos

GAPDH: gliceraldeído fosfato desidrogenase

IFN: interferon

Ig: imunoglobulina

IL: interleucina

ICAM: molécula de adeão intercelular

LES: lúpus eritematoso sistêmico

LPS: lipopolissacarídeo de Escherichia coli

MAC: Complexo de Ataque à Membrana

MASP: serino protease associada à MBL

MBL: lectina que se liga à manose

MCP: membrane co-factor protein

PBS: salina tamponada com fosfato

VCAM: molécula de adesão das células vasculares.

LISTA DE AMINOACIDOS

Fenilalanina Phe F

Leucina Leu L

Isoleucina Ile I

Metionina Met M

Valina Val V

Serina Ser S

Prolina Pro P

Treonina Thr T

Alanina Ala A

Tirosina Tyr Y

Histidina His H

Glutamina Gln Q

Asparagina Asn N

Lisina Lys K

Ácido aspartico Asp D

Ácido glutâmico Glu E

Cisteina Cys C

Triptofano Trp W

Arginina Arg R

Glicina Gly G

Códon de parada (UAA, UAG,UGA)

INDICE

I. INTRODUCÇÃO...........................................................................................................01

1.1 VIA CLÁSSICA....................................................................................................01

1.2 VIA ALTERNATIVA...........................................................................................03

1.3 VIA DAS LECTINAS...........................................................................................05

1.4 COMPLEXO ATAQUE À MEMBRANA..........................................................07

1.5 COMPONENTE C5..............................................................................................11

1.5.1 Receptor para C5a.............................................................................................13

1.6 PROTEÍNAS REGULADORAS.........................................................................15

1.6.1 Reguladores Plasmáticos...................................................................................15

1.6.2. Reguladores associados à membrana celular....................................................17

1.7 FUNÇÕES BIOLÓGICAS DERIVADAS DA ATIVAÇÃO DO SISTEMA

COMPLEMENTO................................................................................................20

1.7.1 Formação do Complexo Ataque à Membrana...................................................20

1.7.2 Produção de Anafilatoxinas...............................................................................20

1.7.3 Opsonização......................................................................................................21

1.7.4 Função Quimiotática.........................................................................................23

1.7.5 Solubilização e Transporte de Imunocomplexos...............................................25

1.7.6 Remoção dos Imunocomplexos pelo fígado......................................................25

1.7.7 Ativação dos linfócitos B e geração de memória imunológica.........................26

1.7.8 Função Adjuvante..............................................................................................27

1.8 FUNÇÕES BIOLÓGICAS DERIVADAS DA PROTEÍNA

C5............................................................................................................................28

1.8.1 Formação do Complexo Ataque à Membrana...................................................28

1.8.2 Atividade Quimiotática.....................................................................................29

1.8.3 Aumento da Explosão Respiratória...................................................................30

1.8.4 Regeneração Tecidual.......................................................................................31

1.8.5 Ativação da Produção de Citocinas...................................................................31

1.8.6 Regeneração de Órgãos e Tecidos.....................................................................33

1.8.7 Ativação dos linfócitos T...................................................................................33

1.9 IMUNODÊFICIENCIAS PRIMÁRIAS.............................................................34

1.9.1 DEFICIÊNCIAS DAS PROTEÍNAS DE COMPLEMENTO....................39

1.9.1.1 Deficiências Das Proteínas Da Via Clássica.........................................41

1.9.1.2 Deficiências Das Proteínas Da Via Das Lectinas..................................43

1.9.1.3 Deficiências Das Proteínas Da Via Alternativa.....................................44

1.9.1.4 Deficiências Das Proteínas Da Via Terminal Comum..........................47

1.9.2 DEFICIÊNCIA DA PROTEÍNA C5.............................................................51

II. OBJETIVO.....................................................................................................................60

III. MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................................61

3.1 Pacientes..................................................................................................................61

3.2 Cultura de Fibroblastos...........................................................................................64

3.3 Imunodifusão Dupla................................................................................................64

3.4 Imunodifusão Radial...............................................................................................65

3.5 Ensaio Hemolítico mediado pela Via Clássica........................................................66

3.6 Ensaio Hemolítico mediado pela Via Alternativa...................................................66

3.7 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)......................................................67

3.8 Extração do RNA total............................................................................................68

3.9 Extração do DNA genômico...................................................................................69

3.10 Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction RT-PCR “One

Step”.........………………………………...............................................................69

3.11 RT-PCR “Two Step”..........…..…………................................................................70

3.12 Extração de DNA a partir do gel.............................................................................71

3.13 Sequênciamento de nucleotídeos.............................................................................72

3.14 Fluxograma do trabalho..........................................................................................75

3.14.1 Determinação da Atividade Hemolítica Mediada pela Via Clássica e

Alternativa.........................................................................................................75

3.14.2 Determinação da Concentração sérica das proteínas de complemento nos

indivíduos I:1, I:2, II:4, II:5, II:9 e famliares....................................................75

3.14.3 Determinação das possíveis mutações presentes no material genético (DNA

genômico e RNA) dos indivíduos avaliados e confirmação da mutação

apresentada........................................................................................................76

IV. RESULTADOS...............................................................................................................81

4.1 Resultados experimentais........................................................................................81

4.2 Fluxograma dos resultados......................................................................................92

V. DISCUSSÃO...................................................................................................................93

VI. CONCLUSÕES............................................................................................................103

VII. BIBLIOGRAFIA..........................................................................................................104

INDICE DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Via Clássica do Sistema Complemento Humano.....................................................03

Figura 2. Via Alternativa do Sistema Complemento Humano................................................04

Figura 3. Via Das Lectinas do Sistema Complemento Humano.............................................07

Figura 4. Estrutura de dois transcritos truncados no gene C5 humano....................................11

Figura 5. Componente C5........................................................................................................12

Figura 6. Receptor C5a............................................................................................................14

Figura 7. Proteínas Reguladoras do Sistema Complemento Humano.....................................19

Figura 8. Funções dependentes do Sistema Complemento......................................................24

Figura 9. Etapas a serem seguidas avaliação de um indivíduo com suspeita de

imunodeficiência primária........................................................................................................35

Figura 10. Fatores que contribuem à falha da resposta imune contra meningococos em

indivíduos complemento suficiêntes e indivíduos LCCD.........................................................49

Figura 11. Expressão do gene C5 em fibroblastos de indivíduos normais..............................72

Figura 12. Heredograma da família brasileira deficiente de C5..............................................77

Figura 13. Imunodifusão dupla dos soros dos membros da família deficiente de C5.............79

Figura 14. Amplificação do DNA genômico da região que brange o éxon1...........................83

Figura 15. Avaliação comparativa dos produtos amplificados do cDNA C5 de vários

membros desta família..............................................................................................................85

Figura 16. Sequênciamento do éxon 4 do paciente II:9 ..........................................................86

Figura 17. Sequênciamento dos éxons 29, 30 e 31 do cDNA de C5 dos indivíduos I:1, I:2,

II:4 e II:9 e os respectivos cromatogramas...............................................................................87

Figura 18. Amplificação da região comprendida entre o éxon 29 ao éxon 31, incluindo os

introns proximos do DNA genómico dos indivíduos I:1, I:2 e II:9..........................................88

Figura 19. Seqüenciamento do éxon 30 do DNA genômico C5 e seu respeitivo intron nos

indivíduos I:1, I:2 e II:9............................................................................................................90

Figura 20. Seqüênciamento do intron 30 e o éxon 31 do gene C5 dos indivíduos I:1, I:2 e

II:9.............................................................................................................................................91

Figura 21. Freqüência de ocorrência (%) das bases próximas a junção éxon-íntron...............99

Figura 22. Mecanismo geral de splicing nuclear e de grupo II............................................. 100

Figura 23. Reconhecimentos dos sítios do splicing através do éxon ....................................101

LISTA DE TABELAS

Tabela. 1. Proteínas do Sistema complemento...................................................................09-10

Tabela 2. Imunodeficiência combinada de linfócito T e/ou linfócito B..................................36

Tabela 3. Deficiências de imunoglobulinas.............................................................................37

Tabela 4. Outras imunodeficiências........................................................................................38

Tabela 5. Comparação da freqüência da ocorrência de infecções causadas por Neisseria sp.,

S. pneumoniae e H. influenzae em pacientes deficientes de complemento..............................39

Tabela 6. Deficiências de proteínas do sistema complemento.................................................40

Tabela 7. Comparação das doenças ocasionadas por meningococcos em indivíduos normais,

LCCD e indivíduos deficientes de properdina..........................................................................48

Tabela 8. Deficiências de C5..............................................................................................53-59

Tabela 9. Atividade hemolítica mediada pela via clássica e via alternativa dos pacientes

deficientes da proteína C5 (II:4, II:5 e II:9) e familiares..........................................................78

Tabela 10. Dosagens de proteínas do complemento do soro de pacientes deficientes da

proteína C5 (II:4, II:5 e II:9) e familiares.................................................................................81

Tabela 11. Atividade hemolítica do soro do probando II:9, após reposição com proteína C5

humana purificada.....................................................................................................................82

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Concentração das classes de imunoglobulinas no soro do probando II:9..............62

Quadro 2. Contagem diferencial de células sangüíneas no probando II:9..............................63

Quadro 3. Provas hematológicas realizadas com o probando II:9...........................................63

Quadro 4. Anticorpos produzidos pelo indivíduo II:9 de diferentes sorotipos contra

pneumococos.............................................................................................................................63

Quadro 5. Oligonucleotídeos utilizados na PCR, RT-PCR e sequênciamento.......................74

I. INTRODUÇÃO

O sistema complemento é composto por mais de 30 proteínas solúveis e de membrana,

as quais participam de sua ativação e regulação, bem como de propriedades biológicas

importantes que intervêm nos mecanismos de defesa inatos ou adquiridos. Este sistema é

ativado seqüencialmente por pelo menos três vias: clássica, alternativa e das lectinas.

1.1. VIA CLÁSSICA

O complexo C1 é o primeiro a participar da ativação desta via. Este complexo é

formado por uma molécula de C1q associada a duas moléculas de C1r e duas de C1s

dependente de cálcio (LEPOW et al., 1953). C1q, por sua vez, é formado por seis arranjos

moleculares, cada um deles formados por duas cadeias A; duas cadeias B e duas cadeias C

estruturalmente organizadasarranjadas como um “ramalhete de tulipa”.

A ativação desta via é iniciada principalmente pela ligação do C1q ao fragmento Fc

das imunoglobulinas IgM ou IgG principalmente das sub-classes IgG1 e IgG3 (Figura 1). As

outras classes de imunoglobulinas IgA, IgD e IgE e a subclasse IgG4 não ativam a via clássica

do complemento, enquanto a subclasse IgG2 é um ativador fraco de complemento. Para que

esta ativação aconteça, dois dos seis monômeros da molécula de C1q deverão estar ligados à

região CH

da IgM ou CH

da IgG (MÜLLER-EBERHARD & LEPOW, 1965), as

imunoglobulinas que deverão estar ligadas especificamente a antígenos. Essa ligação provoca

modificações conformacionais que ativam C1r e C1s. Uma vez ativado, C1s exibe sítios

catalíticos que clivam C4 e C2.

Em 1954, LEPOW et al. mostraram que agregados solúveis de antígeno-anticorpo

ativavam o complexo C1 na presença de cálcio, além de inativar as moléculas C2 e C4 (hoje

sabemos que na verdade são clivadas). A proteína C1s ativada cliva a proteína C4, gerando

dois fragmentos C4a e C4b. O fragmento C4b tem a propriedade de se ligar covalentemente à

superfície de células do hospedeiro, de microorganismos ou a imunocomplexos próximos ao

lugar de ativação.

C4b ligado a uma molécula aceptora irá se ligar o componente C2, o qual também será

clivado pela proteína C1s, gerando dois fragmentos: C2a e C2b. O fragmento C2a permanece

ligado ao fragmento C4b formando o complexo C4bC2a que constitui a C3 convertase da via

clássica. WILLOUGHBY & MAYER (1965) demonstraram que a C3 convertase formada na

via clássica possui um sítio de ligação para a proteína C3, podendo permanecer depositada na

superfície da célula alvo.

A C3 convertase é responsável pela clivagem da proteína C3. Estruturalmente, a

proteína C3 é formada pela ligação de duas cadeias: a cadeia "α" e a cadeia "β" unidas entre si

por ponte dissulfeto. A clivagem da cadeia α de C3 ocorre graças à existência de um sítio

catalítico no fragmento C2a da C3 convertase da via clássica (C4bC2a), gerando dois

fragmentos: C3a e C3b. O fragmento C3b também se liga ao complexo C4bC2a, gerando a

C4b2a3b chamada C5 convertase da via clássica, a qual por sua vez cliva a proteína C5,

gerando C5a e C5b. SHIN et al. (1971) demonstraram que o complexo formado por

fragmentos de C4, C2 e C3, hoje conhecido como C5-convertase da via clássica “C4b2a3b”,

ao clivar a proteína C5 libera os fragmentos C5a e C5b à fase fluida.

Figura 1. Via Clássica do Sistema Complemento Humano, ativada por complexos

antígeno-anticorpo solúveis ou fixados na superfície da célula. C4b2a: C3 convertase;

C4b2a3b: C5 convertase; S-C5b-9: complexo C5b-9 unido à proteína S e C5b-9: Complexo

de Ataque à Membrana (MAC).

1.2. VIA ALTERNATIVA

A via alternativa tem um importante papel no sistema imune inato por não depender da

presença de anticorpos específicos para ser ativada. É positivamente regulada pela properdina

(PILLEMER et al., 1954). A ativação desta via inicia-se com a clivagem de C3 em C3a e

C3b, via proteases presentes no soro ou pela hidrólise do grupo tiól-ester localizado na cadeia

C3α, gerando C3(H

O) (PANGBURN & MÜLLER-EBERHARD, 1980). Em seguida, o

Fator B, estrutural e funcionalmente semelhante a C2, liga-se a C3(H

O) formando

C3(H

O)B. Este Fator B ligado a C3(H

O) é clivado pelo Fator D, gerando os fragmentos Ba

e Bb. Este último participa da formação da primeira C3 convertase da via alternativa

C3(H

O)Bb (Figura 2), que cliva C3 por meio de um sítio catalítico presente no fragmento

C1q

C1r/C1s

MAC

C8βα

C8γ

C5b

C6C7

C1q

C1r , C1s

C4a

C4bC2

C4b2a

C4b2a3b

C3a

C3b

C6+C7+C8+C9

C5b-9

fase

fluida

S-C5b-9

C5a

C5b +

C2b

C1q

C1r/C1s

MAC

C8βα

C8γ

C5b

C6C7

C1q

C1r , C1s

C4a

C4bC2

C4b2a

C4b2a3b

C3a

C3b

C6+C7+C8+C9

C5b-9

fase

fluida

S-C5b-9

C5a

C5b +

C2b

C1r/C1s

MAC

C8βα

C8γ

C5b

C6C7

MAC

C8βα

C8γ

C5b

C6C7

C1q

C1r , C1s

C4a

C4bC2

C4b2a

C4b2a3b

C3a

C3b

C6+C7+C8+C9

C5b-9

fase

fluida

S-C5b-9

fase

fluida

S-C5b-9

C5a

C5b +

C2b

Bb, gerando os fragmentos C3a e C3b. Este último fragmento liga-se covalentemente a

grupamentos hidroxilas encontrados em superfícies celulares ou aminas presentes em

proteínas. O fragmento C3b também apresenta sítio de ligação para o Fator B, o qual por sua

vez será clivado pelo Fator D, formando-se então o complexo C3bBb (MEDICIUS et al.,

1976) que atua como a segunda convertase da via alternativa clivando mais moléculas C3 em

C3a e C3b. Desta forma, há uma contínua clivagem e geração dos fragmentos C3b, os quais

participam diretamente da formação da C3-convertase, constituindo-se assim uma alça de

amplificação que precisa ser regulada, para evitar o consumo excessivo dos componentes de

complemento e a resposta inflamatória exagerada, por mecanismos que explicaremos mais

adiante. O fragmento C3b ao se ligar à C3bBb forma a C5 convertase (C3bBbC3b) capaz de

clivar a cadeia alfa de C5, liberando os fragmentos C5a e C5b.

Figura 2. Via Alternativa do Sistema Complemento Humano, iniciada pela hidrólise

espontânea de C3 gerando C3(H

0). C3(H

0)Bb: primeira C3 convertase; C3bBb: segunda C3

convertase; C3bBb3b: C5 convertase; S-C5b-9: complexo C5b-9 unido à proteína S, MAC:

Complexo de Ataque à Membrana.

VIA

ALTERNATIVA

MAC

C8βα

C8γ

C5b

C6C7

Ativação

Espontânea

C3(H2O)

fB + fD

C3 (H2O) B

C3(H2O)Bb

C3bB

C3bBb

C3bBb3b

C3a C3b

C6+C7+C8+C9

(1-1 8)

fase

fluida

C5b-9

S-C5b9

C5a C5b +

Alça de

Amplificação

+fB

+fD

VIA

ALTERNATIVA

MAC

C8βα

C8γ

C5b

C6C7

Ativação

Espontânea

C3(H2O)

fB + fD

C3 (H2O) B

C3(H2O)Bb

C3bB

C3bBb

C3bBb3b

C3a C3b

C6+C7+C8+C9

(1-1 8)

fase

fluida

C5b-9

S-C5b9

C5a C5b +

Alça de

Amplificação

+fB

+fD

MAC

C8βα

C8γ

C5b

C6C7

MAC

C8βα

C8γ

C5b

C6C7

Ativação

Espontânea

C3(H2O)

fB + fD

C3 (H2O) B

C3(H2O)Bb

C3bB

C3bBb

C3bBb3b

C3a C3b

C6+C7+C8+C9

(1-1 8)

fase

fluida

C5b-9

S-C5b9

C5a C5b +

Alça de

Amplificação

+fB

+fD

1.3. VIA DAS LECTINAS

A proteína ligante de manose (MBL - mannose-binding lectin) é uma lectina tipo C,

parecida estruturalmente à proteína C1q, capaz de se ligar na presença de íons cálcio a grupos

de manose ou N-acetilglucosamina (IHARA et al., 1982), presentes nas paredes celulares de

leveduras, bactérias gram-negativas e outras células. Diferentemente de C1q, a MBL pode ser

isolada em forma de dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros e hexâmeros.

MATSUSHITA & FUJITA (1992) encontraram uma serino-protease distinta da

proteína C1s que se associava a MBL, à qual denominaram MASP (do inglês MBP -

associated serine protease), que induz a ligação e a clivagem das proteínas C4 e C2 (Figura

3). Esta serino-protease associada à MBL chamada MASP (na época apenas uma MASP

havia sido descrita) em condições não redutoras é formada por uma banda de 83 kDa,

semelhante à proteína C1s. Em condições redutoras, duas cadeias, uma pesada (66 kDa) e

uma leve (31 kDa) podem ser visualizadas após electroforese. Estes autores também

encontraram seqüências homólogas da região amino-terminal da cadeia leve da MASP com as

proteínas C1s e C1r.

THIEL et al. (1997) descreveram uma nova serino-protease associada à membrana à

qual denominaram MASP-2, que sob condições redutoras mostra-se formada por duas

cadeias: uma pesada de 52 kDa e uma leve de 32 kDa, unidas entre si por ponte dissulfeto. Ao

compararem as regiões amino-terminais das proteínas C1s, C1r, MASP-1 e MASP-2, estes

autores observaram que estas quatro proteínas possuem em comum três aminoácidos

essenciais (His

468

, Asp

517

e Ser

618

) para a formação de seu centro ativo. Estes autores também

observaram que a ativação da MASP-2, também se dá pela clivagem entre os resíduos Arg e

Ile, igualmente ao observado nas proteínas C1s, C1r e MASP-1, localizados entre o domínio

CCP e o domínio serino-protease. Por se observar uma alta similaridade entre MASP-2 e C1s

(47%) e entre MASP-1 e C1r (52%) foi inferido e posteriormente constatado que MASP-2

poderia também ativar C4. MATSUSHITA et al. (2000), observaram que a forma ativa de

MASP-2 tem a capacidade de consumir C4, ativar C2 e clivar C3 em suas cadeias α e β. A

forma ativa de MASP-1 cliva a cadeia α de C3 gerando C3a e C3b.

Uma forma truncada da MASP-2, conhecida como uma pequena proteína não

enzimática associada a MBL (sMAP) ou conhecida como um peptídeo de 19 kDa ligado a

MBL (MAP-19) foi descoberta por TAKAHASHI et al. (1999). DAHL et al. (2001)

descreveram um novo tipo de MASP, hoje conhecida como MASP-3, que tem a capacidade

de ligar-se a MBL, mas ao se misturar rMASP-3 com plasma contendo complexos formados

por MBL-manose e C4, eles observaram uma forte inibição do consumo e ativação do C4.

Esta inibição também ocorreu quando MASP-3 competiu contra MASP-2 pela ligação com

MBL o que também inibe a ativação da via das lectinas.

ZUNDEL et al. (2004) constataram que MASP-3 não reage diretamente com o

inibidor de C1 (C1-INH), e nem se liga às proteínas C2, C4 e C3, somente cliva o substrato

N-carboxibenziloxiglicina-L-arginina tiobenzil ester. CORTESIO & JIANG (2006)

demonstraram que MASP-3 e MASP-1 derivam do mesmo gene, contendo as duas a mesma

cadeia “A” e uma cadeia “B” que só difere pela localização do centro catalítico.

Figura 3. Via Das Lectinas do Sistema Complemento Humano, ativada pela Lectina Ligante

de Manose (MBL) que in vivo se liga a manose e a resíduos de N-acetilglicosamina presentes

em abundância nas paredes celulares de bactérias. MASP: serino protease associada à MBL.

S-C5b-9: complexo C5b-9 unido à proteína S. Complexo de Ataque à Membrana (MAC).

MASP-3 liga-se à MBL, mas não ativa complemento.

1.4. COMPLEXO DE ATAQUE À MEMBRANA

Estas três vias convergem para uma via terminal comum que resulta na formação e

deposição do complexo de ataque à membrana (MAC), o qual se deposita sobre as superfícies

de microorganismos patogênicos, membranas de células infectadas por alguns tipos de vírus e

células de certas linhagens de células tumorais.

A formação deste complexo citolítico é iniciada pela clivagem da proteína C5 em C5a

e C5b. Ao fragmento gerado C5b se liga a proteína C6 (120 kDa) do sistema complemento.

Este complexo (C5b6) permite a ligação da proteína C7 (110 kDa). O componente C7 é uma

proteína de cadeia única, estruturalmente semelhante à proteína C6, e com sua ligação a C5b6,

MBL

MASPs

MAC

C8γ

C5b

C6C7

C4bC2

C4b2a

C4b2a3b

C3a C3b

C6+C7+C8+C9

fase

fluida

S-C5b-9

C5a

C5b +

VIA DAS

LECTINAS

C2b

C4a

MASP

1,2,3

MBL

Carboidratos na superfície

da membrana

MBL

MASPs

MAC

C8γ

C5b

C6C7

C4bC2

C4b2a

C4b2a3b

C3a C3b

C6+C7+C8+C9

fase

fluida

S-C5b-9

C5a

C5b +

VIA DAS

LECTINAS

C2b

C4a

MASP

1,2,3

MBL

MASPs

MAC

C8γ

C5b

C6C7

MAC

C8γ

C5b

C6C7

C4bC2

C4b2a

C4b2a3b

C3a C3b

C6+C7+C8+C9

fase

fluida

S-C5b-9

C5a

C5b +

VIA DAS

LECTINAS

C2b

C4a

MASP

1,2,3

MBL

MASP

1,2,3

MBL

Carboidratos na superfície

da membrana

forma-se o complexo C5b67. Este complexo liga-se a uma superfície hidrofóbica, que pode

ser a membrana da célula alvo.

A próxima proteína que fará parte do MAC é C8 estruturalmente formada por três

cadeias α, β e γ. A cadeia α de 64 kDa e a cadeia γ de 22 kDa estão unidas entre si por ponte

dissulfeto e a cadeia β de 64 kDa une-se à subunidade C5b do complexo C5b67. O complexo

resultante C5b678 resulta na formação de pequenos poros, que podem causar lise da célula

alvo mesmo antes da inserção de vários monômeros de C9. A inserção do primeiro monômero

de C9 ao complexo C5b678 é feita na cadeia α da proteína C8 e as ligações seguintes desta

proteína (até 18 monômeros de C9) ocorrem através de pontes dissulfetos entre os

monômeros. A união destes monômeros permite a formação de cilindros ou poros intra-

citoplasmáticos, cujo diâmetro e estabilização dependerão do número de monômeros de C9

ligados ao complexo C5b678 (WARE & KOLB, 1981). A formação deste complexo de

ataque à membrana C5b6789(n) permite a lise osmótica da célula alvo.

SHINKAY et al. (1988) mostraram que a molécula de C9 é homóloga à perforina. O

seqüenciamento dos cDNAs dos genes da perforina e do C9 em células de camundongo,

revelou que a região compreendida entre os resíduos 170-390 da perforina é homóloga à

região compreendida entre o resíduos 328-560 do gene C9, sendo ambas as moléculas

responsáveis pela formação de canais intra-citoplasmáticos.

A ativação do sistema complemento culmina com a formação do MAC C5b-9(n)

inserido na bicamada lipídica da célula alvo ou com a produção de outra forma solúvel que se

apresenta citoliticamente inativa no soro, o complexo SC5b-9. A proteína S, também chamada

vitronectina, é um monômero solúvel de 83 kDa, que se liga ao complexo C5b-7, inibindo a

sua capacidade de associar-se à membrana. Analogamente à proteína S, outro monômero

chamado SP40 (clusterina) também inativa o complexo C5b-9(n).

Tabela 1. Proteínas do Sistema complemento (Morgan, 1990; Morley & Walport, 2000)

Concentração

no plasma

Componente

eso Molecular

(kDa)

Estrutura – subunidades

mg/L (µM)

C1q 460 18 cadeias: 6A (26kDa),

6B (26kDa), 6C (26kDa)

100-

180

0.15

C1r 83 Cadeia simples, ligada a

C1q

50 0.30

C1s 83 Em plasma formando o

complexo C1qC1r

C1s

50 0.30

C2 100 Cadeia simples 20 0.20

Via Clássica

C4 205 1 cadeia α (97 kDa)

1 cadeia β (75 kDa)

1 cadeia γ (33 kDa)

200-

600

3.0

MBL 32 2-6 trimeros 0-5

MASP-1 93 Cadeia pessada (66 kDa)

Cadeia leve (31 kDa)

MASP-2 76 Cadeia A (52 kDa)

Cadeia B (31 kDa)

Via das

Lectinas

MASP-3

Fator B 93 Cadeia simples 210 2.0

Fator D 24 Cadeia simples 2 0.05

Via

Alternativa

Properdina 220 4 subunidades identicas

(55kDa)

20-26 0.10

Comum

C3 185 1 cadeia α (110 kDa)

1 cadeia β (75 kDa)

1000-

1500

7.0

C5 190 1 cadeia α (115 kDa)

1 cadeia β (75 kDa)

70-160 0.4

C6 120 Cadeia simples 65 0.5

C7 110 Cadeia simples 55 0.5

C8 150 1 cadeia α (64 kDa)

1 cadeia β (64 kDa)

1 cadeia γ (22 kDa)

55 0.4

Via

Terminal

Comum

C9 69 Cadeia simples 60 0.8

C1-INH 110 Cadeia simples 200 1.8

C4bp 500 8 subunidades idénticas

(70kDa)

250 0.5

Fator H 150 Cadeia simples 450 3.0

Fator I 80 1 cadeia α (50 kDa)

1 cadeia β (38 kDa)

35 0.4

Proteína S 83 Cadeia simples 500 6.0

Proteínas

Reguladoras

Solúveis

Sp-40, 40 70 2 subunidades (35 kDa) 50

CR1 160-250 Cadeia simples

DAF 70 Cadeia simples

MCP 45-70 Cadeia simples

Proteínas

Reguladoras

HRF/MIP 65 Cadeia simples

Componente Peso Molecular

(kDa)

Estrutura – subunidades Concentração

no plasma

mg/L (µM)

Membrana

CD59 20 Cadeia simples

CR2 146-148 Cadeia simples

CR3 255 2 cadeias α - CD11b (160

kDa)

1 cadeia β – CD 18 (95

kDa)

CR4 245 2 cadeias α - CD11c (150

kDa)

1 cadeia β – CD 18 (95 kDa)

C3Ar 54 Cadeia simples

Receptores

C5aR 43-55 Cadeia simples

I.5 PROTEÍNA C5

A proteína C5 é codificada por um gene de 79 kb, compreende 41 éxons com

tamanhos que variam de 58 (éxon 33) a 531 nucleotídeos (éxon 41) e possui íntrons com

tamanhos que variam de 116 a 5600 nucleotídeos (CARNEY et al., 1991). O gene C5 está

localizado no cromossomo 9 humano na posição q32-34 (WETSEL et al., 1988). A expressão

deste gene é responsável pela geração da forma precursora (Pró-C5) sintetizada como única

cadeia polipeptídica (190 kDa), a qual será processada antes de ser secretada como uma

proteína madura formada pelas cadeias β (75 kDa) e α (115 kDa) (TACK et al., 1979). A

cadeia β é codificada pelos éxons 1 - 16 e a cadeia α pelos éxons 16 – 41. A codificação de

C5a é feita pelos éxons 16 e 17. Dependendo do splicing alternativo do gene C5 em humanos,

formam-se três transcritos do gene C5, dos quais dois transcritos truncados são encontrados.

O transcrito completo (5800 bases) é explicado acima. O transcrito truncado pHC5A (Figura

4) é formado pelo splicing que liga o éxon 20 ao éxon poliadenilado 21a e compreende a

região que vai do éxon 1 ao éxon 21a (2946 aa). O transcrito pHC5B de 2071 aa compreende

a região que vai do éxon 1 ao éxon 16 (CARNEY et al., 1991).

Figura 4. Estrutura de dois transcritos truncados no gene C5 humano (CARNEY et al., 1991).

Os éxons estão indicados por caixas, os íntrons por linhas anguladas entre os exones // refere-

se aos éxons e íntron faltantes.

pHC5B

13 14 15 16

POLY A

13 14 15 16 17 18 19 20 21a

POLY A

pHC5A

pC5HG2

13 14 15 16 17 18 19 20 21b 41

POLY A

pHC5B

13 14 15 16

POLY A

13 14 15 16

POLY A

13 14 15 16 17 18 19 20 21a

POLY A

13 14 15 16 17 18 19 20 21a

POLY A

pHC5A

pC5HG2

13 14 15 16 17 18 19 20 21b 41

POLY A

13 14 15 16 17 18 19 20 21b 41

POLY A

O componente C5 é uma glicoproteína plasmática de 1666 aa. Ele é formado por duas

cadeias polipeptídicas: uma de 115kDa (cadeia α) e outra de 75 kDa (cadeia β). Essas cadeias

estão ligadas entre si por uma ponte dissulfeto (Figura 5). Este componente participa da

ativação iniciada por qualquer uma das três vias de ativação e dele dependem diversas

funções biológicas importantes para a resposta imune inata e adquirida que serão comentadas

mais adiante.

C5 é sintetizado principalmente pelo fígado (COLTEN et al., 1972; GENG et al.,

1986) e está presente no plasma em concentração aproximada de 70 a 160 µg/mL (KOHLER

& MÜLLER-EBERHARD, 1967; PFARR et al., 2005). Sua síntese também foi observada no

pulmão (ROTHMAN et al., 1989; STRUNK et al., 1988), baço, intestino fetal (COLTEN,

1972), em células inflamatórias como monócitos (WHALEY, 1980; COLE et al., 1982) e

macrófagos humanos (COLE et al., 1982; COLE et al., 1983) e em células linfoblastóides T e

B nos humanos (REED et al., 1990).

As funções biológicas de C5 dependem da ação de seus fragmentos C5a e C5b,

gerados após clivagem de C5 por C5 convertases das vias clássica (SHIN et al., 1971), das

lectinas (C4b2a3b) e alternativa (C3bBb3b). Independentemente da origem das C5

convertases, a cadeia α (116 kDa) é clivada entre a Arg

751

e a Leu

752

, gerando o fragmento

C5a (11 kDa) e o fragmento C5b formado pela cadeia α’ (105 kDa) e cadeia β (75 kDa)

TACK et al. (1979).

Figura 5. O componente C5 (190 kDa) é uma glicoproteína composta por duas cadeias

polipeptídicas: α (115 kDa) e β (75 kDa), ligadas entre si por uma ponte dissulfeto.

Cadeia

α (115 kDa)

Cadeia

β (75 kDa)

,

-

Cadeia

α (115 kDa)

Cadeia

β (75 kDa)

,

-

Além das C5 convertases conhecidas há bastante tempo, outras enzimas que não

fazem parte do sistema complemento podem também igualmente gerar C5a e C5b. HUBER-

LANG et al. (2002) mostraram que neutrófilos humanos ativados pela presença de C5

produzem uma serino protease, diferente das C5 convertases conhecidas, sendo, por tanto,

capazes de gerar C5a. Esse mesmo grupo de pesquisa no ano 2006 mostrou que a enzima

trombina do sistema da coagulação pode atuar de maneira similar às C5 convertases

tradicionais. Ao analisar a deposição de imunocomplexos no pulmão de camundongos C3

deficientes (C3

-/-

) e C3 suficientes (C3

+/+

), uma significante produção de C5a foi observada

em camundongos C3

-/-

. A produção de C5a em ambas as linhagens foi diminuída pela

presença de anti-trombina, sugerindo que a trombina seja responsável pela clivagem de C5 em

C5a e C5b HUBER-LANG et al. (2006).

1.5.1 RECEPTOR para C5a:

Muitas das funções específicas de C5 dependem da ligação do fragmento C5a ao seu

receptor (C5aR). C5aR é membro da superfamília dos receptores para rodopsina.

Estruturalmente é formado por sete domínios transmembrânicos (GERARD & GERARD,

1994). Sua região amino-terminal (1 a 20 aa) liga-se a uma primeira região transmembrânica

que por a sua vez liga-se a uma segunda e assim sucessivamente a outras cinco regiões

transmembrânicas através de ponte disulfeto (Figura 6), culminando com uma região carboxi

terminal (62 a 74 aa). A região amino-terminal contém 7 Asp localizadas nas posições 5, 10,

15, 16, 18 e 21. Anticorpos específicos para esta região bloqueiam a ligação de C5a com seu

receptor em diversas células, inibindo as atividades inflamatórias desencadeadas pela ligação

C5a-C5aR (MORGAN et al., 1993). O gene C5aR compreende dois éxons localizados no

cromossomo 19 posição q13.2 (GERARD et al., 1993).

O C5aR está localizado na membrana de neutrófilos, monócitos, eosinófilos e

macrófagos, assim como nas células do parênquima hepático, nas células vasculares que

irrigam os músculos da boca, nas células do epitélio alveolar e bronquial, no pulmão e nas

células do sistema nervoso central (HAVILAND et al., 1995).

Figura 6. O receptor de C5a, estruturalmente é formado por sete domínios transmembrana.

que estão ligadas entre si por seis pontes dissulfeto.

1.6. PROTEÍNAS REGULADORAS

A regulação da ativação do sistema complemento é importante para evitar o consumo

desnecessário dos componentes de complemento no soro durante o processo inflamatório o

que levaria à posterior incapacidade de ativação do sistema complemento no momento de

outra infecção. Além do mais, a regulação da ativação do sistema complemento em nossas

próprias células é necessária, caso contrário ocorreria a destruição destas pelo MAC e excesso

de mediadores inflamatórios.

1.6.1 REGULADORES PLASMÁTICOS

O inibidor de C1 esterase (C1-INH) é uma serinoprotease altamente glicosilada,

presente no soro na concentração de 150 µg/mL. Para a inativação de proteases (por ex: C1s

ou C1r), pelo inibidor de serinoprotease é necessário o reconhecimento e clivagem de um

centro reativo na superfície desse inibidor com a posterior ligação dos aminoácidos que

formam parte desse centro com as proteases. No momento da ligação, C1r e C1s clivam o C1-

INH na região Arg

444

-Thr

445

resultando na formação de um complexo estável formado pelo

C1s e C1r e C1-IHN (Figura 7) (SIM et al., 1979). Este fato limita o consumo de C2 e C4

pelo C1, regulando a ativação da via clássica. C1-INH também regula a ativação da via

alternativa mediante a sua ligação com C3b o que inibe a sua posterior ligação com o Fator B,

evitando a formação da C3 convertase da via alternativa (JIANG et al., 2001).

MATSUSHITA et al. (2000) confirmaram que C1-INH inibia proteoliticamente as formas

ativadas de MASP-1 e MASP-2, observando que a atividade proteolítica de MASP-1 contra

C3 e C2 eram inibidas de maneira dose-dependente na presença de C1-INH. O mesmo efeito

foi observado com MASP-2, onde a clivagem de C4 e C2 é inibida de modo dose dependente

na presença de C1-INH.

C4b binding protein (C4BP) é uma proteína plasmática composta por sete cadeias α

iguais (Tabela 1) unidas a um centro em comum correspondente à cadeia β, formando uma

estrutura aracnóide. As cadeias α possuem quatro sítios de ligação para C4b, motivo pelo qual

esta proteína apresenta alta afinidade para se ligar ao fragmento C4b na fase fluida. GIGLI et

al. (1979) isolaram do soro humano de indivíduos normais uma proteína capaz de ligar-se ao

fragmento C4b do sistema complemento, hoje conhecida como C4BP. C4BP também é capaz

de inibir a ligação de C4b com a proteína C2, suprimindo assim a formação da C3 convertase

da via clássica. C4BP ao atuar como co-fator de Fator I, induz a clivagem de C4b formando

iC4b, C4c e C4d (Figura 7) (FUJITA et al., 1978).

PILLEMER et al. (1954) mostraram pela primeira vez a existência de uma proteína

(hoje conhecida como properdina) que atua conjuntamente com as proteínas do sistema

complemento na presença de Mg

. MARCUS et al. (1971) indicaram que a properdina

ajudaria na clivagem de C3. MEDICIUS et al. (1976) provaram que a properdina é capaz de

se ligar a C3b, formando o complexo solúvel P-C3 convertase (este complexo inclui Fator B,

Fator D, C3 e Mg

) na membrana dos eritrócitos cobertos por C3b. A presença de properdina

aumenta a meia vida da C3- e C5- convertases da via alternativa (Figura 7).

O Fator H é um dos principais reguladores da via alternativa (HARRISON &

LACHMANN, 1980) uma vez que previne a formação e promove a dissociação da C3- e C5-

convertases (C3bBb e C3bBb3b) da via alternativa, mediante a dissociação do Fator B ou do

fragmento Bb da C3 convertase e da C5 convertase da via alternativa. O Fator H também atua

como co-fator do Fator I na clivagem de C3b e iC3b (Figura 7).

O Fator I é um dímero formado por duas cadeias: a cadeia α de 50 kDa e a cadeia β

de 38 kDa unidas por ponte dissulfeto. Funcionalmente é uma serino-protease que cliva a

cadeia α do fragmento C4b, em dois fragmentos: um maior chamado C4c e outro menor C4d.

Além disso, quando o Fator I usa como co-fatores o Fator H, MCP ou complement receptor -1

CR1, cliva a cadeia α' de C3b formando iC3b e C3f. Quando o Fator I utiliza como co-fator a

CR1, cliva a cadeia α' de C3b, formando C3c e C3dg (Figura 7). (MORLEY & WALPORT,

2000).

I.6.2 REGULADORES ASSOCIADOS À MEMBRANA CELULAR

A vitronectina (Proteína S) encontra-se no plasma assim como na superfície de

algumas células, tecido conjuntivo e plaquetas, modulando a regulação na formação do

complexo ataque à membrana, uma vez que ao se ligar aos complexos C5b-7, C5b-8 e C5b-9

interfere com a polimerização de C9 (Figura 7), inibindo assim a ligação destes complexos à

membrana da célula alvo (McLEOD et al., 1974; JENNE et al., 1985). TSCHOPP et al.

(1988) mostraram que a vitronectina inibe a formação do complexo de ataque a membrana

mediante interações através de ligações com a heparina. O domínio heparina da proteína S se

liga a uma região carregada negativamente de C9, inibindo a polimerização de C9.

O CR1 (CD35) localizado nas membranas de neutrófilos, eritrócitos, linfócitos B e

células dendríticas foliculares, liga-se a C3b, iC3b e C4b com baixa afinidade. Este receptor

na presença de Fator I permite a clivagem de C3b e iC3b (FEARON, 1979). Ao se ligar a C4b

gera C4c e C4d, acelerando o decaimento da C3 e da C5 convertase da via clássica (Figura 7)

(IIDA & NUSSENZWEIG, 1983). CR1 atua como receptor para imunocomplexos ou

microorganismos opsonizados por C3b e C4b, facilitando a endocitose por células fagocitárias

(ver em Remoção dos Imunocomplexos pelo Fígado). YAZDANBAKHSH et al. (2003)

avaliaram a habilidade de CR1 solúvel em inibir a lise de eritrócitos humanos e observaram

que diversas formas recombinantes truncadas de CR1 (sCR1) têm a capacidade de se ligar a

fragmentos C3b e C4b, inibindo assim a formação da C3- e C5 convertase. Empregando um

modelo in vitro, estes autores mostraram que as moléculas sCR1 inibiam a formação do MAC

e deposição dos fragmentos C3b e C4b na superfície de eritrócitos. Em um modelo in vivo, ao

utilizarem camundongos reativos a eritrócitos humanos do grupo A, eles observaram que ao

receberem transfusão sangüinea deste tipo de eritrócitos a remoção destas células da corrente

sangüínea era mediada por anticorpos anti-A. Contudo, a administração de pequenas doses

(1,5 mg/kg) de CR1 prolongava a sobrevida desses eritrócito, sugerindo assim que CR1

poderia funcionar como um inibidor de hemólise dependente de complemento.

Decay Accelerating Factor (CD55) é uma proteína que protege o tecido hospedeiro do

dano causado pela ativação do sistema complemento. Localizado nas membranas de

eritrócitos, leucócitos, células epiteliais, mas não em células natural killer (NICHOLSON-

WELLER et al., 1986). Atua de maneira similar à C4BP da via clássica, mas não atua como

co-fator de Fator I. Ao se ligar a C4b, evita a ligação de C2 e com isso a formação da C3

convertase da via clássica e das lectinas. Ao evitar a formação da C3 convertase, também

inibe a formação da C5 convertase (Figura 7) e com isso a ativação da via terminal comum

que gera o MAC.

O CD59 pode ser encontrado no plasma, assim como ancorado na membrana de

algumas células como eritrócitos, leucócitos, células do endotélio vascular, brônquios, células

renais e na epidermes e no sinciciotrofoblasto da placenta. O CD59 liga-se à membrana da

célula via uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI), inibindo a formação do MAC

(Figura 7), impedindo a ligação de C9 ao complexo C5b-8 (MERI et al., 1990).

A Membrane Cofactor Protein (MCP) está expressa em todas as células circulatórias

como granulócitos, linfócitos T, linfócitos B, células NK (natural killer) e monócitos

incluindo plaquetas, mas ausente em eritrócitos. Ao atuar com o Fator I induz a clivagem de

C3b e C4b na formação da C3 e da C5 convertases das vias de complemento (Figura 7). Ao

contrario do DAF, a MCP não acelera o decaimento das convertases.

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Figura 7. Proteínas Reguladoras do sistema complemento, proteínas solúveis e proteínas de membrana celular

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I.7. FUNÇÕES BIOLÓGICAS DERIVADAS DA ATIVAÇÃO DO SISTEMA

COMPLEMENTO.

Várias funções biológicas são geradas após ativação do sistema complemento. Segue

abaixo algumas das mais importantes que participam dos mecanismos inatos e adquiridos da

resposta imune.

1.7.1. Formação do MAC

O MAC C5b-9

(1-18)

, é um dois mais importantes agentes citolíticos do sistema imune

inato e adquirido. Este complexo ao inserir-se na bicamada lipídica de células-alvo permite a

passagem de água e íons para o interior da célula, causando a lise osmótica (ver Ativação da

Via Terminal Comum).

1.7.2. Produção de Anafilatoxinas

Na reação de anafilaxia os mastócitos liberam grânulos de histamina nos tecidos ou

órgãos adjacentes a estes. Sabe-se que os fragmentos C5a, C3a e C4a ao se unirem a seus

respectivos receptores na membrana dos mastócitos e basófilos, provocam a liberação de

histamina e de outros mediadores, causando o aumento da permeabilidade vascular.

GERARD & GERARD (1994) mostraram que esta molécula pode atuar como uma

potente anafilatoxina causando contração muscular, aumento da permeabilidade vascular,

desgranulação de mastócitos e basófilos. DAFFERN et al. (1995) mostraram que C5a induz a

polarização e ativação em eosinófilos e neutrófilos. A migração mediada por C5a é dez vezes

mais potente em eosinófilos do que em neutrófilos, enquanto o fragmento C3a somente ativa

eosinófilos. Na atividade enzimática, observou-se que C3a induz a liberação de eosinófilo-

peroxidase em eosinófilos e C5a induz a liberação de eosinófilo-peroxidase e de β-

glucuronidase em ambas as células. TAKABAYASHI et al. (1996) mostraram que os

fragmentos C3a e C3a

desARG

(C3a clivado pela enzima carboxipeptidase N) podem aumentar a

síntese de tumour necrosis factor-α (TNF-α) e interleukin-1β (IL-1β) por monócitos aderentes

em sítios inflamatórios e inibir a síntese das mesmas em células circulantes. Desta forma,

estes fragmentos poderiam ter um papel modulador na inflamação.

1.7.3. Opsonização

O processo de opsonização envolve o reconhecimento de partículas que cobrem

diversos organismos ou antígenos por receptores específicos presentes na célula fagocítica. A

formação desta ligação envolve mecanismos nesta célula, que culminam na ingestão e

digestão do antígeno que foi coberto. Moléculas que cobrem estes organismos e facilitam a

fagocitose são chamadas de opsoninas. As opsoninas formadas durante a ativação do sistema

complemento: C3b, iC3b e C4b, são reconhecidas pelos receptores CR1 (C3b e C4b) e CR3

(iC3b). EHLENBERGER & NUSSENZWEIG (1977) demonstraram pela primeira vez a

função de um receptor de complemento na fagocitose. Quando trataram eritrócitos com IgG

ou com C3 ou com IgG + C3 para empregarem em experimentos de fagocitose por células

polimorfonucleares (PMN), estes autores observaram que C3, por si só, não induzia a

ingestão. Para induzir uma boa ingestão por parte dos neutrófilos eram necessárias 60 000

unidades de IgG por eritrócito, mas na presença de C3 este número diminuiu para 6000.

Demostraram na ligação do receptor de C3b (CR1) presentes nos monócitos, neutrófilos e

outras células PMN com C3b na membrana dos eritrócitos, a cooperação do FcγR ligado a

IgG na membrana dos eritrócitos é requerida para induzir a ingestão. Estabeleceram assim que

a função de C3 com seu receptor na opsonização é aumentar o contacto entre o fagócito e a

partícula a ser fagocitada. BAJTAI et al. (2004) encontraram que a célula dendrítica imatura

derivada de monócito (imMDC) expressa maior concentração das moléculas que constituem

parte do CR3 (CD11b e CD18), quando comparado com células dendriticas maduras.

Ao opzonizar particulas de HIV-1 com C3 e imunoglobulinas (IgG), observou-se que

a infecção de monócitos e macrófagos com HIV era facilitada pelo reconhecimento via CR3.

PRUENSTER et al. (2005) reafirmou este conceito. Os fragmentos de C3 (C3c e C3d), uma

vez formados, depositam-se sobre as cápsides das partículas de HIV recém-sintetizadas e

liberadas pelas células dendríticas hospedeiras. Em um experimento in vitro, mostrou-se que o

vírus HIV ao ser cultivado com C3c/C3d apresentava uma forte ligação com células

dendríticas imaturas via CR3. Esta ligação e posterior fagocitose provoca a infecção da célula

hospedeira. A infecção provocada nesta célula pelas partículas de HIV opsonizadas é duas

vezes maior se comparada com as partículas não opsonizadas. Se estas partículas de HIV

opsonizadas com C3 forem neutralizadas com anti-CR3, a ligação e posterior fagocitose do

vírus por parte das células dendríticas diminui em 50%, quando comparada com o vírus que

não foi neutralizado com anti-CR3.

Outras proteínas do complemento que também funcionam como opsoninas são C1q e

MBL (NAUTA et al., 2004). Ao se incubar células dendríticas imaturas com células

apoptóticas opsonizadas por C1q, estes autores observaram a presença de células duplo

positivas (células dendríticas que se ligam a células apoptóticas via C1q) de maneira tempo

dependente a 37ºC. Esta propriedade também foi observada em macrófagos que ingerem

células apoptóticas opsonizadas com MBL. A ingestão de células apoptóticas opsonizadas

pelas células dendríticas imaturas ou pelos macrófagos depende da concentração de C1q e de

MBL. As células dendríticas e os macrófagos expressam na sua superfície receptores para

C1q (C1qR). NAUTA et al. (2004) mostraram que a interação da células dendríticas com

C1q-célula apoptótica estimulava a síntese de IL-6, IL-10 e TNF e diminuía a síntese de IL-

12p70 pelas células dendríticas. Concluíram que a opsonização de células apoptóticas com

C1q e MBL favorece a fagocitose por parte das céuluas dendríticas, sendo esta função

importante para evitar o reconhecimento de auto-antígenos e desenvolvimento de resposta

auto-imune.

TAYLOR et al. (2004) determinaram in vivo pela primeira vez a contribuição das

proteínas C1q e C4 na ativação, recrutamento e fagocitose de células apoptóticas por

macrófagos murinos residentes ou inflamatórios. Recentemente, nosso grupo demonstrou que

células dendríticas originadas a partir de monócitos são capazes de expressar várias proteínas

como C3, C5, C9, Fator I, Fator H, Fator B, Fator D e properdina em níveis semelhantes aos

observados com macrófagos. O tratamento de células dendríticas com lipopolissacarídeo

promoveu um aumento na expressão de RNAm de C3 e de Fator I, entretanto diminuiu a

expressão do mensageiro de C5, enquanto os níveis de RNAms das proteínas acima não

foram afetados (REIS et al., 2006a). Nessa mesma linha, foi também observada a expressão

aumentada de C6, C7, C8, CR1 e C4BP (REIS et al., 2006b) por estes dois tipos celulares.

1.7.4. Função Quimiotática

A quimiotaxia é um processo pelo qual as células são induzidas a migrar em direção a

moléculas atrativas. Moléculas com esta qualidade são chamadas de fatores quimiotáticos. No

processo inflamatório, os neutrófilos possuem a habilidade de responder a estas moléculas

iniciando o influxo destas células ao foco inflamatório, o que culmina com a resolução deste

processo. FERNANDEZ et al. (1978) foram os primeiros a demostar in vivo que o

componente C5a estimula a migração de neutrófilos (ver em Funções de Complemento

Mediadas por C5).

grupos de manose

N-acetilglucosamina

Macrófago

Figura 8. Funções dependentes do Sistema Complemento. MAC: formação do complexo ataque à membrana.

(d) Aumento da expressão de

CR1 e de moléculas de adesão

C1q

(b,h)

C1r C1s

MBL

(b)

MASP-1,2

fD fB P

C4b

(b)

C2a

C3a

(f, g)

C5a

(c,d,e,f)

C3b

(b,h)

C5b-C9

(a)

IgM/IgG-Ab

Hidrólise espontânea

de C3

(a) MAC:

lise de

bactérias

(e) Ativação do burst

respiratório em neutrófilos e

macrófagos

(b) Opsonização

(Fagocitose de

bactérias)

(f) Desgranulação de mastócitos

(histamina, leucotrieno e

prostaglandinas)

(h) Solubilização de

imunocomplexos

Remoção de

imunocomplexos

pelo fígado

(i) Função Adjuvante (C3d,

C3dg)

(j) Ativação do linfócito B

(C3d, C3dg/CD19/CR2)

Eosinófilo

Mastócito

Basófilo

Bactéria

Neutrófilo

Bicamada

lipídica

(g) Aumento da permeabilidade

vascular

Contração de músculo liso

Via Alternativa

Via das Lectinas

Via Clássica

C4a

(f)

C3d, C3dg

(i,j)

grupos de manose

N-acetilglucosamina

Macrófago

Figura 8. Funções dependentes do Sistema Complemento. MAC: formação do complexo ataque à membrana.

(d) Aumento da expressão de

CR1 e de moléculas de adesão

C1q

(b,h)

C1r C1s

MBL

(b)

MASP-1,2

fD fB P

C4b

(b)

C2a

C3a

(f, g)

C5a

(c,d,e,f)

C3b

(b,h)

C5b-C9

(a)

IgM/IgG-Ab

Hidrólise espontânea

de C3

(a) MAC:

lise de

bactérias

(e) Ativação do burst

respiratório em neutrófilos e

macrófagos

(b) Opsonização

(Fagocitose de

bactérias)

(f) Desgranulação de mastócitos

(histamina, leucotrieno e

prostaglandinas)

(h) Solubilização de

imunocomplexos

Remoção de

imunocomplexos

pelo fígado

(i) Função Adjuvante (C3d,

C3dg)

(j) Ativação do linfócito B

(C3d, C3dg/CD19/CR2)

Eosinófilo

Mastócito

Basófilo

Bactéria

Neutrófilo

Bicamada

lipídica

(g) Aumento da permeabilidade

vascular

Contração de músculo liso

Via Alternativa

Via das Lectinas

Via Clássica

C4a

(f)

C3d, C3dg

(i,j)

1.7.5. Solubilização e Transporte de Imunocomplexos

MILLER & NUSSENZWEIG (1975) mostraram que proteínas sericas eram capazes

de solubilizar imunocomplexos. Essa solubilização era dependente da concentração do soro,

presença de Ca

e Mg

e de C3, uma vez que ao utilizar anti-C3, formavam-se precipitados

de Ag-Ac. FUJITA et al. (1977) mostraram que as proteínas C1 e C3b interferiam na

formação da rede de antígeno-anticorpo, o que favorecia a sua solubilização e impedia seu

depósito como agregados insolúveis dentro dos tecidos. Isso é particularmente importante,

pois imunocomplexos circulantes são potencialmente danosos, já que ao depositarem nas

paredes vasculares, ativa o complemento e provoca reações inflamatórias que lesionam os

tecidos locais e circunjacentes.

1.7.6. Remoção dos Imunocomplexos pelo Fígado

Cerca de 90% das moléculas de CR1 na circulação estão presentes nos eritrócitos e

complexos imunes cobertos por C3b são rapidamente ligados aos eritrócitos via CR1,

prevenindo a sua precipitação. Eritrócitos transportam estas redes de imunocomplexos até o

fígado e baço, onde fagócitos residentes destes órgãos são encarregados da remoção destas

redes da superfície dos eritrócitos para a sua posterior internalização e fagocitose, antes de

voltarem a circular (MEDOF et al., 1983). Se não ocorrer esta remoção, estes agregados

insolúveis formados por antígenos próprios ligados a auto-anticorpos poderiam se depositar

em diversos tecidos, iniciando um forte processo inflamatório que culminaria com dano

tecidual.

HELMY et al. (2006) estudaram as propiedades de um novo receptor "CRIg"

expressado em monócitos (humanos) e nas células de Küpffer (humanas e murinas). Este

receptor tem a capacidade de ligar-se aos fragmentos iC3b e C3b ligados a superfície de

patógenos como Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus, favorecendo assim a

opsonização e a fagocitose. Em camundongos deficientes (CRIg

-/-

) infectados

intravenosamente com Listeria monocytogenes, observou-se uma falha na fagocitose destes

patógenos quando opsonizados por fragmentos de C3 na circulação, dos pulmões e do fígado,

acompanhados pelo aumento da mortalidade. Os autores mostraram assim que CRIg presente

na membrana das células de Küpffer intervem na fagocitose e contribui para a rápida remoção

de patógenos circulantes.

1.7.7. Ativação dos linfócitos B e geração de memória imunológica

EDEN et al. (1973) mostraram que populações de linfócitos B possuem na sua

membrana receptores para os fragmentos C3b e C3d. PEPYS (1974) demonstrou que a

depleção de C3 em camundongos previamente sensibilizados por eritrócitos de carneiro,

diminui a síntese de IgG específicos tanto na resposta primária quanto secundária timo-

dependente.

KLAUS & HUMPHREY (1977) observaram que camundongos timectomizados

imunizados com dinitrofenil haemocianina e logo depletados da proteína C3 pelo tratamento

com CoF (cobra venom factor) falhavam no desenvolvimento de linfócitos B de memória,

quando comparados com camundongos que não sofreram de depleção da proteína C3. Estes

resultados demonstraram assim que a proteína C3 é necessária para a geração normal de

linfócitos B de memória. ERDEY et al. (1985) investigaram a ativação de linfócitos murinos

esplênicos em cultura com C3, encontrando que C3 assim como LPS induzia a proliferação e

a ativação (avaliado pela secreção de imunoglobulinas) dos linfócitos B. MELCHERS et al.

(1985) notaram que esta ativação era devida ao fragmento C3d que se ligava ao linfócito B.

KLAUS & HUMPHREY (1986) mostraram que ligação de CR2 com o fragmento C3dg,

previamente ligado ao antígeno apresentado pela célula dendrítica folicular, não somente

induzia a ativação e diferenciação dos linfócitos B, como também induzia o desenvolvimento

de centros germinativos. CARTER & FEARON (1992) mostraram que o complexo formado

pelas moléculas CD19/CR2, CD81 e IgM (BCR) presentes na membrana dos linfócitos B

reduzia em dez vezes a concentração de antígenos requeridos para a ativação dessas células.

AHEARN et al. (1996) mostraram que animais geneticamente modificados [cr2/cr1]

-/-

possuem níveis reduzidos de IgG2a, IgG2b e IgG3, que resulta em uma diminuição da

resposta humoral contra antígenos T-dependentes, levando a uma falha na formação de

centros germinativos.

1.7.8. Função Adjuvante

Os antígenos cobertos pelos fragmentos C3d e C3dg são mais imunogênicos. Antígeno

recoberto por C3d liga-se concomitantemente à IgM de superfície e aos receptores

CD21/CD35 expressos na superfície dos linfócitos B, desencadeando uma forte resposta

imune. DEMPSEY et al. (1996) empregaram uma proteína recombinante HEL (lisozima do

ovo da galinha) sozinha ou ligada com uma, duas ou três unidades de C3d, quando

encontraram que quanto maior o número de fragmentos C3d ligados ao antígeno, maior é a

ativação dos linfócitos B e menor é o limiar de antígenos necessários para a produção de

anticorpos específicos. HAAS et al. (2004) encontraram que camundongos CD21/CD35

-/-

imunizados com estreptoavidina (SA) ligada a tetrâmeros de C3dg, mostravam uma forte

resposta humoral primária e secundária avaliadas pela síntese de IgG e IgM respectivamente

em mais de 10000 vezes comparada com camundongos CD21/CD35

-/-

que só foram

imunizados com SA. Em outro experimento, imunizaram camundongos CD21/CD35

-/-

com a

proteína gp120 de HIV ligada a trímeros de C3d, que acabaram por gerar uma forte resposta

humoral primária aumentando 150 vezes a produção de IgG comparada com camundongos

que só receberam a proteína gp120. Estes dados conjuntamente mostraram que C3dg e C3d

funcionam como uma molécula adjuvante já que a resposta primária e secundária foi

incrementada mesmo na ausência de CD21/CD35.

1.8 FUNÇÕES BIOLÓGICAS DERIVADAS DA PROTEÍNA C5

Com a clivagem de C5 em C5a e C5b, várias funções biológicas são geradas e serão

descritas a seguir:

1.8.1. Formação do MAC

O fragmento C5b apresenta característica hidrofóbica que lhe permite aderir a diversas

superfícies celulares e a ele as demais proteínas da via terminal comum C6, C7, C8 e até 18

unidades de C9 se ligam seqüencialmente até formar o MAC, responsável pela lise celular

graças a um desbalanço osmótico responsável pelo aumento do volume celular e ruptura

celular.

SPRONG et al. (2003) avaliaram a atividade bactericida dependente de C5 em

infecção causada por Neisseria meningitidis. em pacientes defiecientes de C5.estes individuos

apresentam falha na lise de bactérias como Neisseria sp., S. pneumoniae e H. influenzae

evidenciando a importância de estúdos que avaliem a participação de C5b na formação do

MAC nestas bactérias. Suspensões de N. meningitidis do tipo H44/76 foram misturadas com

sangue tratado com anticoagulante ou com PBS, pré-incubando-se por 5 min a 37°C

(controle) ou com anticorpos (anti-C5 ou anti-C5a). Das alíquotas colectadas, observou-se que

quando as bactérias eram incubadas com anti-C5a e com PBS a atividade bactericida foi total.

Ao contrário, quando a amostra foi incubada com anti-C5, observou-se uma atividade

bactericida contra N. meningitidis inferior a 30%, o que reafirma a importância do fragmento

C5b na formação do MAC sob a superfície desta bactéria.

1.8.2. Atividade Quimiotática

O fragmento C5a apresenta propriedade quimiotática responsável pela atração ao foco

inflamatório de diferentes células polimorfonucleares. WARD & NEWMAN (1969) foram os

primeiros a demonstrar in vitro que neutrófilos de coelho mostravam uma forte resposta

migratória ao serem estimulados com C5 tratado com tripsina produzindo C5a e C5b, sendo

esta resposta dose e tempo dependentes. TAUBMANN et al. (1970) demonstraram que

enzimas lisossomais ao serem misturadas com C5 purificado também geravam atividade

quimiotática. NILSSON et al. (1975) mostraram que a tripsina, à semelhança da C5

convertase da via clássica, cliva a cadeia α da proteína C5 gerando C5a. SNYDERMAN et al.

(1975) demonstraram ausência de atividade quimiotática sobre macrófagos expostos a soro

C5 deficiente. FERNANDEZ et al. (1978) corroboraram os achados de WARD & NEWMAN

(1969), mas empregando desta vez C5a purificado, mostrando assim que este fragmento seria

capaz de atrair células para o foco inflamatório.

A atividade quimiotática de C5a não é somente observada na migração de monócitos,

eosinófilos e neutrófilos durante a inflamação, mas também induz a migração de linfócitos B

humanos. OTONELLO et al. (1999) mostraram que linfócitos B isolados de tonsilas de

camundongos apresentavam uma forte polarização e migração, quando expostos a diferentes

concentrações de rC5a em câmara de Boyden. Ao dividir esta população de linfócitos B pelo

seu estado de maturidade, encontrou-se que os linfócitos B de memória migravam mais

quando expostos ao rC5a, em comparação com os linfócitos B virgens e os linfócitos B do

centro germinativo. Empregando citometria de fluxo, constatou-se que linfócitos B de

memória expressam 33-47% de C5aR na sua superfície, os linfócitos B virgens expressam de

10-14% e os linfócitos B do centro germinativo não exibem C5aR, o que sugere que a

migração deve-se à ligação de C5a ao seu receptor encontrado na superfície das diferentes

populações de linfócitos B.

GRANT et al. (2002) empregando um modelo inflamatório in vivo, induziram artrite

reumatóide nos joelhos de camundongos (BALB/c) após injeção de um coquetel composto

por quatro tipos de anticorpos específicos para o fragmento CB11 de colágeno tipo II.

Observaram que camundongos C5aR

-/-

não apresentavam danos ocasionados pela artrite,

quando comparados com os camundongos C5aR

+/+

que desenvolvem todos os processos da

artrite. Os joelhos dos camundongos C5aR

+/+

apresentam altíssimos níveis na expressão

(RNAm) de IL-1 beta, de metaloproteinase 3 (MMP-3), do ligante de osteoprotegerina que

estimula a diferenciação dos osteoclastos e dos marcadores CD4 e CD68 (marcadores

específicos de linfócitos T e de macrófagos respectivamente). Os joelhos dos camundongos

C5aR

-/-

não expressam RNAm da IL-1 beta, da proteína ativadora de neutrófilos no epitélio

(ENA-78), da proteína inflamatória do macrófago (MIP-1 alfa) e das proteínas VCAM-1 e E-

selectina. Motivo pelo qual nestes camundongos diminuem o rolamento e posterior influxo de

neutrófilos, a proliferação de fibroblastos e destruição de cartilagens e ossos neste modelo

inflamatório.

1.8.3. Aumento da Explosão Respiratória

O complemento medeia a ativação de diversas células polimorfonucleares, causando

nestas a ativação da explosão respiratória com a conseqüente liberação de espécies reativas de

oxigênio (H

e O

-2

), de citocinas, de enzimas lisosomais, de ácido araquidônico e de

histamina. WYMANN et al. (1987) observaram que neutrófilos estimulados com antagonistas

de C5a produziam grandes quantidades de H

e que esta resposta não está relacionada com

o consumo de Ca

intracelular nos neutrófilos, mas sim com a ligação de C5a com seu

receptor. EHRENGRUBER et al. (1994) ativaram neutrófilos humanos com os fragmentos

C3a e C5a, observando que C3a também ativa neutrófilos, mas esta resposta é passageira.

Comparando os dois fragmentos, encontraram que a resposta dos neutrófilos é 100 vezes mais

potentes, quando estimulados com C5a.

MOLNESS et al. (2002) estudaram o papel do complemento na indução da explosão

respiratória em granulócitos e monócitos durante a resposta inflamatória induzida com E. coli,

encontrando que a indução da explosão respiratória é três vezes maior em granulócitos que

em monócitos. Quando estas células foram incubadas com sangue humano, E. coli e

compstatina (aminoácido cíclico que inibe a clivagem de C3 e portanto a geração de C5a) a

indução da explosão respiratória foi inibida. Mas ao utilizar anti-C5 humano ou anticorpo

monoclonal anti C5a no lugar de compstatina, estes autores observaram uma diminuição de

70% na explosão respiratória nos granulócitos e 50% nos monócitos. Antagonistas de C5aR

causaram o mesmo efeito nestes tipos celulares. Sendo a explosão respiratória e a fagocitose

dois eventos íntimos e contínuos nessas células, estes autores mostraram que a síntese de uma

das cadeias do receptor para C3 (CD11b) diminuía aproximadamente 2000 vezes, a explosão

respiratória em 3 vezes e a fagocitose em cerca de 600 vezes para granulócitos e 250 vezes

para monócitos, quando tratados com este antagonista de C5aR. Estes dados sugerem que C5a

exerça um papel importante na indução da explosão respiratória e fagocitose neste modelo

experimental.

1.8.4. Regeneração Tecidual

A proteína C5a ajuda no influxo e ativação de células polimorfonucleares as quais, por

sua vez, contribuem para uma forte resposta inflamatória que causa inicialmente lesão

tecidual em um primeiro momento e culmina com a recuperação deste mesmo tecido, após

eliminação do agente patogênico.

1.8.5. Ativação da Produção de Citocinas

A união de C5a com C5aR também ativa a síntese de IL-6, o que contribui ao

estabelecimento do processo inflamatório, conforme mostrado por RIEDEMANN et al.

(2003). Estes pesquisadores investigaram o papel de C5a na resposta inflamatória, mediante a

indução de um estado inflamatório por punctura e ligação de 2/3 do ceco (porção inicial do

intestino grosso) no abdome de camundongos da linhagem C57B6 e 1/3 do ceco em ratos

(Long Evans) nestas condições os autores observaram que a secreção in vitro de IL-6 por

neutrófilos isolados dos ratos controle aumentou 5,5 vezes ao serem estimulados por 4h com

LPS e C5a, quando comparada com neutrófilos estimulados somente por 2 h. Entretanto, os

ratos depletados de neutrófilos ou injetados com anti-C5a diminuíram 4 vezes a síntese de IL-

6. Em neutrófilos de ratos estimulados com LPS e C5a em presença de um inibidor para NF-

kβ, para MEK ½, e para p38, observou-se inibição da síntese de IL-6, sugerindo que na

transcrição de IL-6 há participação de uma via de sinalização dependente de NF-kβ, MEK1/2

e p38. A ligação de C5a com seu receptor (C5aR) e de LPS com (TLR-4) Toll like receptor 4

ativa as vias de sinalização dependentes de MEK1/2 e p38 respetivamente, que induzem a

transcrição e posterior síntese de IL-6 nos neutrófilos.

Observou-se anteriormente (RIEDEMANN et al., 2003) que a resposta inflamatória

induzia uma grande síntese de citocinas (IL-1 beta, TNF-alfa e IL-6), as quais, por sua vez,

ativam diversas células como: neutrófilos, eosinófilos e macrófagos a produzir outras

citocinas (TNF-alfa, IL-12), e diversas moléculas (VCAM, E-selectina, MMP-3, ENA-78,

MIP-alfa, EPO e beta-galactosidase) o que permite potencializar a resposta inflamatória.

C5 além de participar da resposta imune inata, pode também estar envolvido na

regulação da resposta imune adquirida, uma vez que HAWLISCH et al. (2005) mostraram que

C5a tem um efeito negativo na resposta imune induzida por TLR-4. Em macrófagos ativados

e estimulados com LPS e C5a observou-se a diminuição da síntese de todas as subunidades da

família de IL-12 (IL-12p70, IL-23 e IL-27), sendo esta diminuição dosedependente. Este

bloqueio da expressão de IL12p70 dá-se pela inibição do fator de transcrição ERK ½. A

citocina IL-12 induz ativação das células NK e síntese de IFN-gama por linfócitos CD8

. Esta

citocina ativa macrófagos e induz a polarização dos linfócitos T helper 0 a T helper 1,

mostrado experimentalmente in vitro e in vivo em animais infectados com Leishmania major,

já que camundongos C5 deficientes têm uma polarização diminuída dos linfócitos T helper 0

a linfócitos T helper 1, quando comparados com os camundongos C5 suficientes

(HAWLISCH et al., 2005).

1.8.6. Regeneração de Órgãos e Tecidos

STREY et al. (2003) mostraram que camundongos C3 suficientes e C5 suficientes que

haviam sido parcialmente hepatomizados (pHx) iniciavam a etapa de regeneração hepática

mediante o consumo de 5-bromo 2- deoxiuridina (“BrdU”, marcador corado que se deposita

no núcleo dos hepatócitos) 36 h depois da operação, contudo, camundongos C3

-/-

e C5

-/-

, após

cirurgia no fígado, apresentavam uma resposta regenerativa anormal, observando-se nos

cortes histológicos do fígado destes camundongos, áreas necrosadas, assim como baixo

consumo de BrdU nos hepatócitos desses camundongos C3- e C5 deficientes (C3

-/-

e C5

-/-

indicando menor proliferação destas células comprovada pela diminuição na pesagem dos

fígados dos camundongos mortos 44 h depois da operação. Entretanto, a adição de C3a e C5a

reverteu o dano ocasionado ao tecido, aumentando significativamente a síntese de DNA por

hepatócitos, evidenciado pelo consumo de BrdU e regeneração do tecido hepático depois da

extração parcial do fígado.

1.8.7. Ativação de Linfócitos T

KIM et al. (2004) mostraram que C5aR também induzia a geração e ativação de

linfócitos T CD8

, potencializando assim a atividade citotóxica em uma infecção viral in vivo.

Para isso, empregaram camundongos selvagens que foram infectados com o vírus da

influenza X31 (vírus recombinante tipo A). Estes camundongos foram divididos em três

grupos: o primeiro foi tratado com um peptídeo antagonista de C5aR; o segundo foi tratado

com compstatina que ao se ligar a C3 falha na inibição e clivagem de C3 e por tanto inibe a

geração de C5a, e por último o terceiro grupo que não recebeu qualquer tratamento. Estes

autores observaram que os camundongos tratados com o antagonista de C5aR apresentavam

uma diminuição na expansão de linfócitos T CD8+ específicos para o peptídeo NP

366

374

vírus da influenza no pulmão, comparados com os outros tratamentos. Após análise por

citometria de fluxo, constatou-se que os linfócitos T CD8+ dos camundongos tratados com o

antagonista de C5aR, apresentavam menor síntese de interferom-gamma (3 vezes menor),

comparada com os camundongos do segundo e terceiro grupos. O IFN-gama é uma citocina

capaz de aumentar o potencial microbicida e expressão de moléculas de classe I e II do

complexo principal de histocompatibilidade em macrófagos. Também se demonstrou que C5a

ativa a capacidade citolítica dos linfócitos T CD8+ sobre células infectadas com o peptídeo da

influenza (KIM et al., 2004).

1.9 IMUNODEFICIÊNCIAS PRIMÁRIAS

As imunodeficiências primárias ou PIDs (do inglês - primary immunodeficiency

diseases) constituem um grupo de doenças causadas por algum defeito no sistema

imunológico responsável por maior susceptibilidade infecções graves e/ou desenvolvimento

de autoimunidade.

No ano de 1970 a Organização Mundial de Saúde convocou em Genebra a primeira

reunião para classificar as PIDs. Desde então a cada dois anos este comitê atualiza as

informações sobre as PIDs. Na última reunião da Organização Mundial da Saúde ocorrida em

Budapeste (Hungria) em 2006 mais de 120 PIDs foram. Nas Tabelas 2, 3 e 4 algumas delas

estão apresentadas (NOTARANGELO et al. 2005).

Figura 9. Etapas a serem seguidas na avaliação de um indivíduo com suspeita de

imunodeficiência primária (COOPER et al., 2003). HIV: vírus da imunodeficiência humana,

CBC: contagem total de células sangüíneas. PID imunodeficiência primária.

Um indivíduo que sofre de:

•Inexplicáveis infecções recorrentes

•Infecções com patógenos oportunistas

•Falha no tratamento com antibióticos

é suspeito de sofrer PIDs

Estes indivíduos têm algum outro

motivo para sofrer destas infecções

como asma alergia, infecção pelo

HIV, fibrose cística ou outras

anormalidades?

A família tem história de PIDs

NÂO

SIM

Tratamento

correspondente

Testes para a detecção de PIDs: CBC, teste de hipersensibilidade,

avaliação da concentração de imunoglobulinas ( IgG, IgM e IgA),

teste de anticorpos específicos depois da vacinação, ensaio

hemolítico

NÂO

Normal Abnormal

Diagnóstico de imunodeficiência primária ( PIDs):

Deficiência Imune Celular

: diminuição na população de linfócitos T e/ou B.

Deficiências de Anticorpos

: diminuição da população de linfócitos B com ou

sem diminuição dos níveis de IgG.

Síndrome de Wiskott-

ldrich

: decréscimo de plaquetas.

Deficiências de Proteínas de Complemento

: falha na atividade hemolítica

Um indivíduo que sofre de:

•Inexplicáveis infecções recorrentes

•Infecções com patógenos oportunistas

•Falha no tratamento com antibióticos

é suspeito de sofrer PIDs

Estes indivíduos têm algum outro

motivo para sofrer destas infecções

como asma alergia, infecção pelo

HIV, fibrose cística ou outras

anormalidades?

A família tem história de PIDs

NÂO

SIM

Tratamento

correspondente

Testes para a detecção de PIDs: CBC, teste de hipersensibilidade,

avaliação da concentração de imunoglobulinas ( IgG, IgM e IgA),

teste de anticorpos específicos depois da vacinação, ensaio

hemolítico

NÂO

Normal Abnormal

Diagnóstico de imunodeficiência primária ( PIDs):

Deficiência Imune Celular

: diminuição na população de linfócitos T e/ou B.

Deficiências de Anticorpos

: diminuição da população de linfócitos B com ou

sem diminuição dos níveis de IgG.

Síndrome de Wiskott-

ldrich

: decréscimo de plaquetas.

Deficiências de Proteínas de Complemento

: falha na atividade hemolítica

Tabela 2. Imunodeficiências combinadas de linfócito T e/ou linfócito B (NOTORANGELO

et al., 2005)

Doença Linfócito T

circulante

Linfócito B

circulante

Ig sérica Características

associadas

Herança

-/-

+/+

SCID

γc

-/-

, JAK3

-/-

IL-7Rα

-/-

CD45

-/-

CD3δ/CD3ε

-/-

Reduzido Normal ou

incrementado

Reduzido Marcada diminuição de

células NK

Todos A. R.,

exceito γc

-/-

(X-L)

-/-

SCID

RAG ½

-/-

Ártemis

-/-

ADA

-/-

disgenesis

reticular.

Marcada

diminuição

Marcada

diminuição

Reduzido Defeito na recombinação

VDJ

A. R.

Síndrome de

Omenn

Presente Normal ou

diminuído

Reduzido,

exceto IgE

Eritroderma, eosinofília,

adenopatia,

hepatoslenomegalia.

A. R.

DNA ligase IV

Reduzido Reduzido Reduzido Microcefalia, distrofia

facial e sensibilidade à

radiação.

A. R.

CD40L

-/-

Normal Ausência de

IgA, IgG e

IgE.

IgM e IgD

presente em

concentrações

normais

Neutropenia,

trombocitopenia, anemia

hemolítica.

A. R.

PNP

-/-

Diminuição

progressiva

Normal Ligeira

diminuição

Anemia hemolítica

autoimune, danos

neurológicos.

A. R.

MHC-/-

Diminuição

só de

linfócitos

CD4

Normal Normal A. R.

CD3γ

-/-

Reduzida

expressão de

TCR

Normal Normal A. R.

CD8

+/+

, ZAP-

-/-

, TAP ½

-/-

Diminuição

de linfócitos

CD8

expressão

normal de

linfócitos

CD4

Normal Normal A. R.

SCID: imunodeficiência combinada grave, A.R.: herança autossômica recessiva, X-L:

deficiência ligada ao cromossomo X, JAK: janus-associated kinase, IL-7R: receptor IL-7,

ZAP-70: zeta associada à proteína de 70kDa, TAP: transporter associated with antigen

processing.

Tabela 3. Deficiências de imunoglobulinas (NOTORANGELO et al., 2005)

Doença Número de

linfocitos B

Ig sérica Característica

associados

Herança

Ausência de linfócitos B,

redução de todas as Ig

séricas: Btk

-/-

, cadeia

pesada µ

-/-

, Igα

-/-

, BLNK

-/-

, thymona

-/-

Forte redução

ou ausência

Redução de todos

os isótipos.

Infecções graves

causadas por bactérias

Todas A. R.,

exceto Btk

(X-L)

Redução de ao menos 2

isótipos de Ig com baixo

número de linfócitos B:

ICOS

-/-

, CD19

-/-

, TACI

-/-

BAFF receptor

-/-

Normal ou

reduzido

Redução de IgG e

IgA e

concentrações

normais de IgM

Pode ter doenças

autoimunes, ou doenças

linfoproliferativas.

Todas A. R.,

exceto TACI

que pode ter

A.R. e A.D.

Redução de IgG e IgA

sérica e incremento de

IgM com quantidades

normais de linfócitos B:

AID

-/-

, UNG

-/-

Normal Redução de IgG e

IgA e incremento

de IgM

Aumento dos linfonodos

e do centro germinativo

A.R.

Deficiência da cadeia

leve com quantidades

normais de linfócitos B:

cadeia pesada

-/-

, cadeia k

subclasses IgG

-/-

seletiva IgA

-/-

Normal Redução de uma

o mais subclasses

de IgG, IgA e IgE

Pode ser assintomático

ou ter infecções

recorrentes com ou sem

resposta de

imunoglobulinas a

carbohidratos

(antígenos), alergias ou

doenças autoimunes

Variável.

Deficiência de anticorpos

específicos com

concentrações normais de

Ig e de linfócitos B

Normal Normal Inabilidade da síntese de

anticorpos específicos

Variável

A.R.: herança autossômica recessiva, A.D.: herança autossômica dominante, X-L: deficiência

ligada ao cromossomo X, BLNK: B-cell linker protein, ICOS: induzível coestimulador,

TACI: ativador de transmembrana modulador de Ca

, BAFF: fator de ativação o linfócito B,

AID: ativação que induz uma citidina deminase, UNG: uracil DNA glicoilase.

Tabela 4. Outras imunodeficiências (NOTORANGELO et al., 2005)

Doença Linfócito T

circulante

Linfócito B

circulante

Ig sérica Características

associadas

erança

Síndrome de Wiskott-

Aldrich

Redução

progressiva

Normal Redução de

IgM,

aumento de

IgA e IgE

Trombocitopenia,

eczemas, linfomas,

infeções

bacterianas.

X-L

Dano no reparo do

DNA: telangiectasia,

síndrome like-ataxia,

síndrome de Nijmegen

breakage, síndrome de

Bloom

Reduzido Normal Redução de

IgA, IgE e

das

subclasses de

IgG,

incremento

de IgM

Ataxia,

sensibilidade aos

raios X e a outras

radiações.

A. R.

Defeitos tímicos,

síndrome de Di George

Reduzido ou

normal

Normal Reduzido ou

normal

Hipoparatiroidismo,

malformação

conotruncal,

defeitos em 90%

dos genes

envolvidos na

maturação do timo.

A. D.

Dislasia Imuno ósea

hipoplasia da

cartilagem, síndrome

Schimke.

Reduzido Normal Normal A. R.

Síndrome de

Hermansky-Pudlak

tipo2

Normal Normal Normal Albinismo

oculocutâneo,

neutropenia, defeito

na toxicidade do

linfócito T e de NK.

A. R.

Síndrome de Hiper IgE Normal Normal Normal ou

elevado IgE

Candidíase nas

fosas nasais,

assimetria facial,

osteoporose,

escoliose.

A. R.

Candidíase

mucocutânea

Normal Normal Normal Candidíase

mucocutânea,

sensibilidade à

Candida albicans.

A. R. e

A. D.

SCID: imunodeficiência combinada grave, A.R.: herança autossômica recessiva, X-L:

deficiência ligada ao cromossomo X, JAK: janus-associated kinase, IL-7R: receptor IL-7,

ZAP-70: zeta associada à proteína de 70kDa, TAP: transporter associated with antigen

processing.

1.9.1 DEFICIÊNCIAS DAS PROTEÍNAS DE COMPLEMENTO

Indivíduos deficientes de proteínas do sistema complemento geralmente apresentam

uma forte tendência para adquirir infecções piogênicas ocasionadas por bactérias

encapsuladas como Neisseria sp., Streptococcus sp. e H. influenzae. Cabe mencionar que

indivíduos deficientes de alguma das proteínas da via terminal comum são bastantes

suscetíveis a infecções ocasionadas por bactérias do gênero Neisseria. A ocorrência de

infecções causadas por este tipo de bactéria em indivíduos deficientes de complemento é

mostrado na Tabela 5. A deficiência de alguma destas proteínas ocasiona falha na

opsonização, fagocitose e formação do MAC (MORGAN & WALPORT, 1991; FIGUEROA

& DENSEN, 1991). A Tabela 6 mostra o tipo de herança, a caraterística e as doenças

associadas às deficiências complemento.

Tabela 5. Comparação da freqüência de ocorrência de infecções causadas por Neisseria sp.,

S. pneumoniae e H. influenzae em pacientes deficientes de complemento (FIGUEROA &

DENSEN, 1991)

N° de Pacientes (%) com Deficientes

(N° de Homozigotos)

Neisseria. sp. S. pneumoniae H. influenzae

otal (%)

C1, C4, C2 (161) 9 (5,6) 20 (12,4) 8 (5) 32 (20)

C3, fI, fH (46) 17 (37) 12 (26) 2 (4,4) 25 (54)

P, fD (57) 25 (44) 2 (3,5) 2 (3,5) 29 (51)

C5, C6, C7, C8, C9

(267)

151 (57) 2 (0,8) 0 (0) 150 (56)

Total (531) 202 (38) 36 (6,8) 12 (2,3) 236 (44)

total de pacientes com infecção causada por algum destes três tipos de organismos

encapsulados. Cada paciente foi contado só uma vez.

Tabela 6. Deficiências de proteínas do sistema complemento (MORGAN & WALPORT,

1991; WEN et al., 2004; NOTARANGELO et al., 2005; REIS et al., 2006)

N°

casos

Herança

Característica Doença associada

C1q, 42

C1r/C1s 15

C2 >100

C4 24

A. R.

Ativação defeituosa da Via Clássica,

falhas na dissolucão de complexos

imunes e na remoção de células

apoptóticas (C1q

-/-

LES, infecções

piogênicas e

glomerulonefrite

C1-INH >100 A. D. Ativação contínua da Via Clássica

e das Lectinas com consumo de

C4/C2. O contato do sistema de

complemento com o sistema de

coagulação resulta na geração de

bradicinina.

Angioedema

hereditário e LES

MBL >30 A. R. e

L-X

Defeito no reconhecimento de

manose com conseqüente defeito

na ativação da Via das Lectinas

Defeito na

opsonização por

fungos

MASP-2 Ausência da atividade hemolítica

mediada pela Via das Lectinas

LES e infecções

piogênicas

Fator D 1 A. R. Ativação defeituosa da Via

Alternativa

Infecções piogênicas

e por Neisseria sp.

C3 27 A. R.

Ativação defeituosa das três vias de

ativação, ausência do MAC, falha

na opsonização e fagocitose.

Infecções piogênicas

e glomerulonefrite

C5 38

C6 >50

C7 26

C8 32

C9 >50

A. R. Formação defeituosa do MAC,

ausência da atividade hemolítica

mediada por qualquer uma das três

vias.

Infecção por

Neisseria sp

Properdina >50 L-X Falha na ativação da Via

Alternativa

Infecções piogênicas

e por Neisseria sp.

Fator I 31 A. R. Ativação descontrolada da Via

Alternativa com consumo de C3,

aumento na formação da C3- e C5-

convertases das Vias Clássica e

Alternativa.

LES, infecções

piogênicas e

glomerulonefrite

Fator H 21 A. R. Espontânea ativação da via

alternativa com consumo de C3.

LES, infecções

piogênicas,

glomerulonefrite e

SHU.

A. R.: autossômica recesiva, A. D.: autossômica dominante, L-X: herança ligada ao

cromossomo X, LES: lúpus eritematoso sistêmico, SHU: síndrome hemolítico-urêmica

1.9.1.1 DEFICIÊNCIAS DE PROTEÍNAS DA VIA CLÁSSICA

As defic iências de proteínas da via clássica de complemento (C1q, C1r, C1s, C2 e C4)

estão associadas a maior suscetibilidade a infecções graves e desenvolvimento de doenças

autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico (LES). A incidência de indivíduos deficientes

das proteínas C1q, C2 ou C4 e que sofrem de LES é de 90%, ~15% e 75%, respectivamente

(PICKERING et al., 2000). Estas proteínas estão envolvidas com eliminação de

imunocomplexos, de produtos liberados por células apoptóticas que podem funcionar como

auto-antígenos (ver em Solubilização e Transporte de Imunocomplexos e Remoção dos

Imunocomplexos pelo Fígado). A eliminação de linfócitos B imaturos durante a vida

embrionária é dependente de C1q e C4, mas não de C3. (PRODEUS et al., 1998).

A deficiência de C1q é causada pela falha na síntese de C1q (60% dos casos) ou pela

síntese de C1q não funcional (40% dos casos). C1q, C1r e C1s são requeridos para formar o

complexo C1. A deficiência de algum destes três componentes inibe a formação do complexo

C1. Em geral, indivíduos que apresentam a deficiência de C1s, também apresentam a

deficiência de C1r. Uma das explicações poderia ser a proximidade dos genes C1s e C1r no

cromossomo 12 localização 12p13. Indivíduos deficientes destas proteínas podem apresentar

pneumonias, tuberculose pulmonar, infecções por Staphylococcus, rash, vasculites,

glomerulonefrite, hematúria ou ainda serem assintomáticos. Na literatura apresentam-se três

estudos moleculares que explicam a deficiência de C1r e C1s. INOUE et al. (1998) estudaram

um caso de um homem japonês de 26 anos com deficiência total de C1s e deficiência parcial

de C1r, com deleção de 4 pb (TTTG) no éxon 10 do gene C1s. ENDO et al. (1999)

encontraram no alelo paterno de um menino japonês uma deleção de 4 pb (TTTG) no éxon 10

do gene C1s e no alelo materno uma substituição de uma G por uma T no éxon 12 do gene

C1s. DRAGON-DUREY et al. (2001) encontraram em uma menina caucasiana uma

substituição de uma C

534

por uma T no éxon 12 do gene C1s. As mutações apresentadas

nestes três casos geram códons de parada prematura, que ocasionam o bloqueio da tradução

da proteína C1s.

Em nosso laboratório, AMANO (2006) em seu trabalho de mestrado, descreveu a

deficiência total de C1s e parcial de C1r em quatro irmãos, pertencentes a uma família

brasileira com história de consangüinidade. Destes quatro irmãos, dois são assintomáticos,

enquanto que os outros dois sofrem de LES. Estes pacientes apresentam uma substituição de

uma C

938

o que gera um códon de parada prematura. O seqüenciamento do cDNA de C1r

não apontou a presença de alguma mutação que pudesse ser a causa da deficiência. Sugerindo

assim que a regulação de C1r pode ser possivelmente dependente da presença de C1s.

Os dois isotipos de C4 (C4A e C4B) são codificados por genes altamente polimórficos

situados na região da classe II do MHC no cromossomo 6. Tanto C4A como C4B, estão

presentes em igual concentração em 75% da população mundial. Uma pequena diferença

entre os aminoácidos de cada isótipo afeta a sua capacidade de ligar-se a outras proteínas

(C4A) ou de se ligar a resíduos de carboidratos em diversas superfícies celulares (C4B)

(WAN et al., 2004). A deficiência completa de C4 requer a herança de alelos defeituosos nos

4 loci. A deficiência heterozigota de C4 é mais freqüente, estima-se que apenas 60% da

população possua os 4 genes funcionais (MORGAN & WALPORT, 1991).

O angioedema hereditário (HAE) é uma doença caracterizada por edema nas mucosas

com duração de aproximadamente dois a três dias, com ausência de febre ou de outras

manifestações clínicas. Clinicamente, encontram-se três formas de HAE: o tipo I é

caracterizado por uma redução de 30% ou menos na concentração de C1-INH sérica. No HAE

tipo II os indivíduos secretam uma proteína C1-INH disfuncional. No tipo III o padrão de

heramça genética é dominante, mas ligado ao cromossomo X (BORK et al., 2000).

1.9.1.2 DEFICIÊNCIAS DAS PROTEÍNAS DA VIA DAS LECTINAS

A deficiência de MBL é uma das mais freqüentes (5,3% da população da Finlândia),

onde uma grande proporção é assintomática (AITTONIEMI et al., 1996). Um estudo feito

com 9 crianças deficientes de MBL demonstrou que esta deficiência não se encontra isolada,

mas sim associada a outros tipos de imunodeficiências humorais. AITTONIEMI et al. (1998)

observaram que crianças com esta deficiência também possuem deficiência parcial ou total de

uns dos alótipos da imunoglobulina IgG (IgG

, IgG

ou IgG

) e a associação destes dois tipos

de deficiência causam falha na opsonização de bactérias. SUPER et. al. (1989) num ensaio in

vitro observaram que o soro deficiente de MBL apresenta falha na opsonização de leveduras

(S. cerevisiae). Esta opsonização é corrigida mediante a adição de MBL purificada (dose

dependente). Estes autores também observaram uma correlação entre a concentração de MBL

plasmática e a formação de C3b em indivíduos saudáveis. O mesmo grupo de pesquisa

encabeçado por SUMIYA et al. (2003) observou a falha na opsonização destes soros

deficiêntes deve-se à substituição de uma GG

230

C por uma GA

230

C no éxon 1 do gene MBL.

Esta troca produz a troca de glicina por ácido aspártico modificando a conformação

tridimensional da MBL e facilitando com isso sua posterior degradação. Em estudo feito com

crianças inglesas, encontrou-se que as crianças que apresentam mutações heterozigotas no

códon 52, códon 54 e códon 57 do gene MBL sofriam com maior freqüência de osteomielites,

otite média, infecções por Streptococcos, infecção no trato urinário, gastroenterites, celulites e

abscessos, febre de origem desconhecida, tonsilites, meningococemia e infecções no trato

respiratório. Entretanto, as crianças que apresentam mutações homozigotas no códon 54 e 57

do gene MBL apresentam maior risco de contrair infecções meningocócicas graves e inclusive

septicemia generalizada (SUMMERFIELD et al., 1997).

1.9.1.3 DEFICIÊNCIAS DAS PROTEÍNAS DA VIA ALTERNATIVA

A properdina estabiliza a C3- e C5-convertase e sua deficiência está associada ao

cromossomo X, portanto é descrita apenas em indivíduos do sexo masculino. Três tipos de

deficiência de properdina têm sido descritos. No primeiro tipo não se detecta a presença de

properdina, no segundo a properdina está ativa em apenas 10% dos níveis normais e no último

tipo há produção de properdina não funcional. Estes pacientes apresentam infecções causadas

por bactérias do gênero Neisseria (MORGAN & WALPORT, 1991).

HIEMSTRA et al. (1989) descreveram o primeiro caso da deficiência completa de

Fator D em homem caucasiano. Este paciente sofreu três episódios infecciosos, onde primeiro

foi de meningite e os outros dois de septicemia generalizada, ocasionadas por Neisseria. Neste

paciente a opsonização e a fagocitose foram restauradas mediante adição de Fator D ao soro.

BIESMA et al. (2001) descreveram a deficiência de Fator D numa família

dinamarquesa com história de consangüinidade, onde uma das netas sofreu de sérias infecções

causadas por Neisseria meningitidis. Ao avaliar a atividade hemolítica mediada pelo

complemento, observou-se que cinco integrantes desta família (pertencentes a três gerações

diferentes) não ativam a via alternativa, por conta de carência do Fator D no soro destes

pacientes. Observou-se também que nos soros deficientes de Fator D a opsonização e

fagocitoses de E. coli e N. meningitides e fagositose por neutrófilos encontrava-se

comprometida, mas foi restaurada ao se adicionar Fator D purificado. Ao estudar as causas

moleculares desta deficiência foi encontrada nestes deficiêntes uma subtituição de TC

125

G a

125

G no éxon 2 que forma um códon de parada prematura.

FEDERMANN et al. (1980) estudaram a atividade hemolítica de diferentes variantes

do Fator B mostrando que a variante BfFO5.5 não ativa a hemólise pela via alternativa. Esta

variante foi encontrada em três gerações (6 indivíduos) em associação com o haplótipo HLA-

A11 mostrando-se inativa em todos os membros desta família. Estes indivíduos possuem além

do alelo FO5.5 o alelo Bfs que determina a síntese do Fator B hemolíticamente ativo. A

concentração de Fator B no soro é normal a moderadamente baixo. Este estudo constitui a

primeira descrição de uma anomalia genética de Fator B em humanos. Entretanto, ainda não

foi descrita em humanos a deficiência completa de Fator B.

A proteína C3 exerce um papel fundamental nas três vias de ativação do sistema

complemento. Os produtos de clivagem desta proteína participam de diversas funções

imunológicas como: formação da C3- e C5-convertase, produção de opsoninas, liberação de

mediadores inflamatórios, a ativação de linfócitos B com a conseqüente produção de

anticorpos, solubilização, remoção de imunocomplexos e, por último, propriedade adjuvante.

Em nosso laboratório ULBRICH et al. (2001) mostraram que soro C3 deficiente ativado com

LPS, assim como soro humano normal inativado a 56

C, induzia uma menor migração de

leucócitos. Em outra avaliação, constatou-se que a ingestão e morte de C. albicans por

fagócitos normais, ao serem opsonizadas por soro do probando, foram semelhantes à ingestão

e morte destes fungos quando tratados por soro inativado. Dessa maneira, a incapacidade de

exercer as funções imunológicas dependentes do complemento causadas pela ausência de C3

resultaria em maior suscetibilidade a infecções.

Em sua tese de mestrado REIS (2003) mostrou que a deficiência de C3 em dois

indivíduos brasileiros, deve-se a algumas mutações no cDNA do gene C3. O cDNA do

paciente 1 apresentou uma substituição de T

1001

por C

1001

no éxon 9 que resulta na troca de

uma L

314

por uma P

314

, uma substituição silenciosa de G

972

por A

972

que no momento a

tradução dá origem a uma R

304

e por último a substituição de uma G

1716

por A

1716

no éxon 13

que troca um resíduo de W

552

pela formação de um códon de parada prematura no gene C3. O

cDNA do paciente 2, estudado anteriormente por ULBRICH et al. (2001) ok apresentou a

substituição de T

1001

por C

1001

no éxon 9 que resulta na substituição polimorfica de uma L

314

por uma P

314

, a substituição silenciosa de T

1791

por C

1791

no éxon 14 que resultam na formação

de uma P

577

, uma segunda substituição silenciosa de C

2454

por T

2454

no éxon 19 que resultam

na formação de uma S

798

e uma terceira substituição silenciosa de uma C

4371

por T

4371

no éxon

35 que resulta na formação de uma A

1437

e por último a formação de um códon de parada

prematura devido a uma substituição C

2602

por T

2602

no éxon 20 do gene C3.

VYSE et al. (1994) relataram o caso de 3 famílias deficientes de Fator I onde dois

integrantes (irmãos) de uma destas famílias apresentaram esta deficiência. Indivíduos

deficientes de Fator I apresentam concentrações reduzidas de C3 no plasma. Estes indivíduos

deficientes apresentam numerosos casos de infecções recidivantes causados por bactérias do

gênero Neisseria sp.

Nosso grupo de pesquisa (NAKED et al., 2000) descreveu o caso de uma chilena

proveniente de uma família com história de consangüinidade que morreu aos 4 anos de idade

despoies de ter desenvolvido múltiplas infecções bacterianas (meningite meningocócica,

pneumonia, epilepsia de origem bacteriana, otite média e piodermite).Ao avaliar a atividade

hemolítica mediada por complemento, encontramos níveis reduzidos da ativação da via

clássica (30 % - valores normais 56 a 192 %) e nulos na via alternativa o que nos sugeriu a

deficiência de alguma proteína da via alternativa compartilhada pela via clássica. A

deficiência total de Fator I e parcial de Fator H (151 µg/ml – valores normais 228,51 a 829,17

µg/ml) foi encontrada no soro desta paciente. Isto leva a forte consumo de C3 (290 µg/ml –

valores normais 610 a 1410 µg/ml) devido à falha na regulação da ativação da alça de

amplificação da via alternativa.

Dois anos mais tarde (AMADEI et al., 2001) descrevemos também o caso duas irmãs

brasileiras com história de consangüinidade. A irmã mais velha desenvolveu lúpus

eritematoso sistêmico na sua infância, além de outras infecções de origem bacteriana. A irmã

mais nova desenvolveu uma infecção gastro-intestinal e um grave síndrome de estresse

respiratório. Ao avaliar a atividade hemolítica mediada por complemento, encontramos que o

soro de ambas as pacientes não tinhan qualquer atividade mediada pela via clássica ou

alternativa. A concentração de Fator I e Fator B encontraram-se abaixo do límite de

normalidade (64 a 13 µg/ml e 183-513 µg/ml, respectivamente), a concentração de Fator H

foi de 93 e 105 µg/ml, respectivamente – límite de normalidade 454 a 124 µg/ml. Semelhante

ao estudo feito por NAKED et al. (2000) a falha nestas proteínas reguladoras causam um

consumo exagerado de C3 (127 e 259 µg/ml, respectivamente) devido à formação

descontrolada da C3-convertase.

Em nosso laboratório BARACHO (2002) ao estudar uma família brasileira com

história de consangüinidade encontrou que duas irmãs apresentavam deficiência do Fator I.

Tanto o seqüenciamento do cDNA do Fator I como o seqüenciamento do gene Fator I

revelaram a presença de uma inserção A

1204

1205

no éxon 11, a qual gera um códon de parada

prematura, que explicaria a deficiência desta proteína nas duas irmãs.

1.9.1.4 DEFICIÊNCIAS DAS PROTEÍNAS DA VIA TERMINAL COMUM

Indivíduos deficientes nas proteínas da via terminal comum (C5, C6, C7, C8 e C9),

sofrem um bloqueio na formação do MAC. O MAC por ter uma função importante na

neutralização de Neisseria, indivíduos deficientes de uma destas proteínas, apresentam

predisposição a infecções ocasionadas por meningococos e gonococos (MORGAN &

WALPORT, 1991).

O risco de uma doença por meningococcos em pessoas deficientes das proteínas da via

terminal comum (LCCD, do inglês - late complement component deficient individuals) é de

7000 a 10000 vezes mais elevados que em indivíduos normais, e 60% de indivíduos LCCD há

tido pelo menos uma experiência de doença por meningococcos, dos quais aproximadamente

50% sofreram de uma experiência adicional da doença (Tabela 3) (FIGUEROA & DENSEN,

1991).

Tabela 7. Comparação das doenças ocasionadas por meningococos em indivíduos normais,

LCCD (complement component deficient individuals) e indivíduos deficientes de properdina

(FIGUEROA & DENSEN, 1991).

Indivíduos

Parâmetros Normal LCCD

roperdina

-/-

N° de homozigotos 267 54-70

N° de indivíduos com infecção por

meningococos

151 25-37

Freqüência da infecção (%) 0,0072 57 46-53

Proporção homem / mulher 1:3:1 2:2:1 21:0-37:1

Idade média do primeiro episódio 3 17 14-11,5

Recorrência (%) 0,34 41 2-1,4

Recaída (%) 0,6 7,6 0

Mortalidade / 100 episódios (%) 19 1,5 12-51,4

N° isolados 3184 67 16

% B 50 19,4 18,7

Sorogrupos infectantes

% Y 4,4 32,8 37,5

A resposta a meningococos em indivíduos LCCD é diferente da resposta encontrada

em indivíduos normais devido ao aumento da carga parasitária nos indivíduos LCCD durante

a infecção, à falha da formação do MAC sobre a bactéria (Figura 8), à prolongada

sobrevivência do meningococos dentro do fagócito, à apresentação de antígenos alterada e à

ligação de fragmentos C3b/iC3b na superfície destes organismos encapsulados que facilita a

fagocitose em neutrófilos (FIGUEROA & DENSEN, 1991) e à falta de quimioataxia por C5a

(Ver em Atividade Quimiotática Dependente de C5) (DENSEN, 1989) o que altera a

resposta imune contra este patógeno.

Figura 10. Fatores que contribuem à falha da resposta imune contra meningococos em

indivíduos complemento suficiêntes (A) e indivíduos LCCD (B), modificado a partir de

FIGUEROA & DENSEN (1991).

A vacinação com polissacarídeos purificados destas bactérias capsuladas confere uma

proteção contra doenças causadas por diversos sorogrupos de meningococos. Anticorpos

específicos formados contra estes antígenos em indivíduos normais ativam a opsonização e a

fagocitose devido à formação e à deposição do fragmento C3b na superfície capsular e sub-

capsular o que promove juntamente com os anticorpos (IgG2) a remoção da bactéria

encapsulada do organismo pelos fagócitos. Em indivíduos LCCD esta resposta é similar com

exceção da formação do MAC. FIJEN et al. (2000) mostraram num ensaio in vitro que o

alótipo de IgG

, C3b e CR3 atuam sinergicamente na opsonização e fagocitose da N.

meningitidis W135, por células polimorfonucleares em indivíduos LCCD. Estudos feitos por

POTTER et al. (1990) mostraram que indivíduos LCCD durante uma infecção causada por

meningococos produzem 10 vezes mais anticorpos específicos tanto para a membrana externa

como para lipopolissacarídeos do que os indivíduos normais.

Morte por fagocitose

Atividade lítica do soro

Componentes da via alternativa

P, D, B, C3b

Componentes da via clássica

C1, C4 e C2

e da via das Lectinas

MBL, MASP 1,2,3

IgG

IgM

IgG

Neutrófilos

Morte por fagocitose

Falta da atividade lítica do

soro

Componentes da via alternativa

P, D, B, C3b

Componentes da via clássica

C1, C4 e C2

e da via das Lectinas

MBL, MASP 1,2,3

IgG

IgM

IgG

Neutrófilos

Componentes da via

terminal comum

C5, C6, C7, C8 e C9

Morte por fagocitose

Atividade lítica do soro

Componentes da via alternativa

P, D, B, C3b

Componentes da via clássica

C1, C4 e C2

e da via das Lectinas

MBL, MASP 1,2,3

IgG

IgM

IgG

Neutrófilos

Morte por fagocitose

Falta da atividade lítica do

soro

Componentes da via alternativa

P, D, B, C3b

Componentes da via clássica

C1, C4 e C2

e da via das Lectinas

MBL, MASP 1,2,3

IgG

IgM

IgG

Neutrófilos

Componentes da via

terminal comum

C5, C6, C7, C8 e C9

Componentes da via alternativa

P, D, B, C3b

Componentes da via clássica

C1, C4 e C2

e da via das Lectinas

MBL, MASP 1,2,3

IgG

IgM

IgG

Neutrófilos

Morte por fagocitose

Falta da atividade lítica do

soro

Componentes da via alternativa

P, D, B, C3b

Componentes da via clássica

C1, C4 e C2

e da via das Lectinas

MBL, MASP 1,2,3

IgG

IgM

IgG

Neutrófilos

C3C3

Componentes da via

terminal comum

C5, C6, C7, C8 e C9

A deficiência de C6 é a terçeira deficiência de complemento mais comum entre

caucasianos, com uma prevalência de 1: 60000 indivíduos, destes 25% dos casos, é formado

por indivíduos assintomáticos (MORGAN & WALPORT, 1991). Nas províncias de Western

Cape e Gauteng na África do Sul, infecções causadas por meningococos, têm uma incidência

de 20-100:100000 indivíduos por ano, onde a maioria de indivíduos afetados é C6 deficiente

(POTTER et al., 1990). Um total de 45 casos de indivíduos C6 deficientes que apresentaram

infecções ocasionadas por N. meningitidis B foi diagnosticado nesta área (ORREN &

POTTER, 2004).

Apesar do gene C6 se encontrar próximo do gene C7, a deficiência de C7 não é

comum entre caucasianos depois da deficiência de C9, a deficiência de C7 é a segunda

deficiência de complemento mais comum entre japoneses, com uma incidência de 1: 25000

(INAI et al., 1989).

Já que a proteína C8, é composta por 3 cadeias (α, β e γ) e cada uma destas é

codificada por genes diferentes, a deficiência de C8 pode ser resultado de falha na síntese de

qualquer uma das três cadeias. Nesta proteína a cadeia α e γ estão covalentemente ligadas,

mas a cadeia β não está ligada covalentemente a αγ. A deficiência da C8β tem sido

encontrada somente em caucasianos, enquanto a deficiência de C8αγ tem sido encontrada em

japoneses e negros (INAI et al., 1989).

A deficiência de C9 é rara em caucasianos, ZOPPI et al. (1990) descreveram pela

primeira vez a deficiência de C9 em dois irmãos pertencentes a uma família suíça com

numerosos casos de infecções ocasionadas por bactérias do gênero Neisseria, e nestes

indivíduos a formação do MAC pode ser reconstituída mediante a adição de C9. Em outro

estudo com 145640 japoneses, observou-se que os soros de 139 japoneses (0,095%) não

ativavam nem a via clássica nem a via alternativa, sendo posteriormente demonstrado que

estes indivíduos eram deficientes de C9 (FUKUMORI et al., 1989).

1.9.2. DEFICIÊNCIA DA PROTEÍNA C5

A deficiência de C5 (C5D) é muito rara e não pode ser atribuída a uma raça, etnia ou

população ou mais prevalente em alguma região em particular. Até o momento, foram

relatados 38 casos de pacientes com deficiência completa deste componente do sistema

complemento (Tabela 5) distribuídos em 21 famílias.

Os avanços em Biologia Molecular vêm contribuindo para uma melhor identificação

da presença de possíveis mutações no gene C5. WANG et al. (1995) investigaram as causas

moleculares da deficiência da proteína C5 em 3 famílias. A primeira família já havia sido

estudada anteriormente por ROSENFELD et al. (1976), quando encontraram uma primeira

mutação C

4521

AG para T

4521

AG no éxon 36. A mutação acima mencionada forma no

momento da tradução um códon de parada prematura na cadeia α, no lugar da arginina

esperada em todos os indivíduos normais. WANG et al. (1995) estudando uma segunda

família C5D, caracterizada previamente por PETER et al. (1981) encontraram uma mutação

nonsense no éxon 1 de uma C

AG para TAG. Esta substituição localizada no códon que

codifica o primeiro aminoácido da cadeia β no momento da tradução troca uma glicina por

um códon de parada prematura. Além disso, este grupo observou que todos os indivíduos

estudados apresentavam uma condição heterozigota (deleção de 710 pb localizada no éxon 1,

com exceção de uma terceira família que apresentou uma deleção do 1010 pb localizada no

éxon 36.

DELGADO-CERVIÑO et al. (2005) encontraram uma deleção e substituição presente

no éxon 40 em três irmãos homozigotos, no outro irmão heterozigoto e no pai, membros de

uma família de origem espanhola (o triplete CCC na posição 4884-4886 foi trocado por GC)

que causa uma modificação no quadro de leitura no momento da transcrição com a

conseqüente produção de um códon de parada prematura neste mesmo éxon.

PFARR et al. (2005) mostraram que o gene C5 de um menino paquistanês apresentava

substituição no éxon 10 de uma A por uma G na posição 1115, o que prediz a substituição de

uma Lis por uma Arg no códon 372 no momento da tradução de RNA em proteína. Esta

alteração foi encontrada em um dos alelos de todos os membros da família responsável pela

diminuição da concentração de C5 no soro destes familiares. No entanto, o indivíduo

deficiente apresentou esta alteração nos dois alelos o que anulava a presença de C5 no soro.

Quando avaliaram uma região de 540 pb compreendida entre o éxon 9 e éxon 12 de todos os

membros da família, observaram que esta região estava ausente no indivíduo C5D. Após

seqüenciamento do cDNA de C5 de toda a família, constatou-se um salto no éxon 10 (116

pb), causando uma mudança no quadro de leitura e a criação de um códon de parada

prematura, anulando a tradução tanto da cadeia α como da cadeia β da proteína C5 no

indivíduo deficiente. O seqüenciamento também provou que a substituição da A pela G,

localizada no final do éxon 10 dentro de uma região conhecida por exonic splicing enhancer

influenciava a exclusão do éxon 10 no momento da tradução.

Tabela 8. Deficiências de C5.

Família Nº de

paciente

ACIONALIDA

SEXO INFECÇÕES e

AGENTE CAUSADOR

OUTRAS

DOENÇAS

TESTES FEITOS CAUSAS

MOLECULARES

REFERÊNCIAS

1 1 M: 7 meses Recorrentes infecções por bactérias

Gram (-)

C5 não funcional,

opsonização e fagocitose

deficiente.

Miller & Nilsson

(1970)

Caucasiano

H: 5 semanas

9 semanas

Diarréia, rash na pele.

Broncopneumonia, colites erosivas,

fibrose da glândula tiróide, involuçã

do timo.

Doença de

Leiner

3 Caucasiano H: 7 semanas

9 semanas

Diarréia, rash na pele.

Diarréia sangüinolenta, dermatite

seborréica subcutânea generalizada,

linfoadenopatia geral.

Doença de

Leiner

Opsonização deficiente de

levedura, atividade

quimiotática de PMN

normal, níveis normais de

C4 e C5 no soro. C5 não

funcional

Jacobs & Miller

(1972)

4 Afro-

americana

M: 11 anos Várias infecções na pele, ouvido, trato

respiratório superior e vagina.

Fadiga, perda de peso, dores d

garganta e boca. Apresentou

fenômeno de Raynaud e dores na

articulações edemaciadas.

Extremidades frias e pálidas, anemi

moderada e leucocitose.

Otites média e externa, alopecia,

monilíase, oral e vaginal, infecção

prolongada por herpes zoster.

Septicemia enterococal com

meningite, intolerância transitória à

glicose, vasculites cutâneas com

ulcerações, nefrite, tromboflebite com

formação de embolo pulmonar.

Episódio

de LES

com

poliartrite.

0% C5

C1, C2, C3 e C4 em níveis

normais, quimiotaxia

ausente e opsonização e

fagocitose normal só para

S. cerevisae,

C. albicans e S. aureus

Mutação no éxon 36

4521

AG para

4521

GA) no momento

da tradução forma um

códon de parada na

cadeia α

Rosenfeld et. al.

(1976), estudo

molecular feito

por Wang et. al.

(1995)

5 Afro-

americana

M: 10 anos

Meia irmã da

paciente 4

Infecções freqüentes do trato

respiratório superior, pneumonias,

vaginites.

CH50 (80 -160) com 1 –2

% da atividade funcional

de C5

Afro-

americana

M: 23 anos

Nove episódios de infecção

generalizada por gonococos.

Na primeira infecção por

gonococos, a paciente desenvolveu

febre, mialgia, tenosinovites do

pulso e do tendão de Aquiles, lesões

na pele. No terceiro e quarto

episódios de infecção por gonococos

apresentou inflamação pélvica e

lesões pustulares na pele, artralgia e

tendinite. No quinto episódio de

infecção por gonococos, a cultura

para N. gonorrhoeia foi positiva.

Nos episódios 5, 7 e 8 de infecção

por gonococcos, apresentou dor de

cabeça e mal-estar, lesões pustulares

na pele, arthralgia, tenosinovites nos

pulsos e no tendão de Aquiles. nono

episódio a cultura para N.

gonorrhoeae foi positiva.

Deficiência de C5 (6/0,5%)

a atividade hemolítica

dependente de

complemento foi de 0,5%,

quimiotaxia para PMN

nula.

A paciente apresentou

códon de parada

prematura no éxon 1.

Afro-

americana

M: 23 anos

gêmea do

paciente 6

Excelente saúde, mas em algumas

ocasiões apresentou infecção por

gonococos, manifestada por febre,

tenosinovites e pústulas.

8 Afro-

americana

M: 33 anos

Irmã do

paciente 6

Excelente saúde. Não apresentou

infecções causadas por gonococos.

Snyderman et. al.

(1979) , estudo

molecular feito

por Wang et. al.

(1995)

5 9 Paquistanês H: 25 anos

Meningites piogênicas, cultura para N.

meningitis do grupo C positiva. No

ano seguinte apresentou febre e

endurecimento do corpo e pescoço.

Síndrome

de Kernig

ou síndrome

das

meninges

: zero.

Haeney et. al.

(1980)

Afro-

americano

H: 15 anos

Febre, endurecimento da nuca, lesões

purpúreas no corpo e nas quatro

extremidades, desenvolveu

meningococemia fulminante, cultura

para N. meningitidis grupo Y positiva.

Artrite no cotovelo esquerdo, necrose

e amputação de dois dedos no pé

esquerdo.

Afro-

americano

H: 18 anos

irmão do

paciente 10

Desenvolveu meningococemia por N.

meningitidis grupo Y. Febre letargia,

dor de cabeça, vômito, endurecimento

da nuca. Aproximadamente dois anos

depois cultura para N. meningitidis

grupo Y positiva. Febre, dor de cabeça

e garganta, vômito, endurecimento na

nuca.

Afro-

americano

H: 14 anos

irmão do

paciente 10

Desenvolveu meningite

meningocócica por N. meningitidis do

grupo X, febre, mialgia, dor de

cabeça, endurecimento moderado da

nuca.

13 Afro-

americana

M: 20 anos

irmão do

paciente 11

Erupções nas mãos e pés, artralgia nas

juntas dos joelhos, pulsos, cotovelos,

dedos e tornozelos. Apresentou febre

e cultura do líquido cervical para N.

gonorrhoeae positiva. Três meses

depois apresentou GADS pela

segunda vez junto com febre, artralgia

nas juntas, lesões purpúreas na pele.

GADS

(síndrome

de artrite e

dermatite

por

gonococos)

Mutação no éxon 1

AG para T

AG) no

momento da tradução

forma um códon de

parada premature

afetando o primeiro

aminoácido da cadeia β

Peter et. al.

(1981) , estudo

molecular feito

por Wang et. al.

(1995)

7 14 Espanhol H

(17 anos)

Entre dois e cinco anos de idade, el

teve três episódios de meningite po

meningococos.

Febre, calafrios, artralgias, cefaléias e

vômitos. Petéquias no tronco e

extremidades.

CH50: não detectável

C5: não detectável

Ayensa, et. al.

(1985)

(18 anos) Febre, cefaléia, vômitos,

endurecimento na nuca, obnubilação

e erupção petequial. Cultura do

líquido cervical para N. meningitidis

positiva.

8 15 Alemã M: 20 anos

Recorrentes episódios de

meningoencefalite por meningococos.

CH50: não detectável

C5: não detectável

atividade quimiotática,

atividade bactericida e

formação do MAC

indetectáveis

Hildenhagen &

Bitter-Suermann

(1985)

H: 23 anos

Aos 23 anos teve febre, cultura de

líquido cefalorraquideano positiva

para N. meningitidis.

Aos 14 e 19 anos apresentou lesões

purpúreas na pele.

CH50: zero

C5: zero

as demais proteínas de

complemento em níveis

normais.

Francesas

caucasianas

H: 18 anos

Irmão do

paciente 17

Aos 18 anos um episódio de síndrome

de meningite febril.

CH50: zero,

C5: zero, C4: 50%,

as demais proteínas de

complemento em níveis

normais.

Cesbron et. al.

(1985)

scandinava M: 19 anos

3/1977

6/1977

Episódios de meningite, sem lesões

purpúreas na pele.

Septicemia aguda, cultura para N.

meningitidis sorogrupo W-135

positiva.

C5: não detectável, sem

atividade hemolítica

19 M: 19 anos

4/1980

Septicemia aguda e lesões purpúreas

na pele. Isolamento de meningococo

sorogrupo B no sangue

C5: não detectável, sem

atividade hemolítica

Nielsen & Koch

(1987)

11 20 H: 12 anos

44 anos

3meses

depois

Meningite bacteriana

Febre moderada, uma semana depois,

dor de cabeça crônica, febre, fraqueza

muscular.

Dor de cabeça, dor nos ombros,

fraqueza muscular. Cultura do fluído

cérebro-espinal para N. meningitidis

sorogrupo W135 positiva

C5: não detectável,

13%

aproximadamente

Rosen et. al.

(1988)

12 21 M: 20 anos Dois episódios de meningite por C5 indetectável Fijen et. al.

No período

de seis meses

meningococos (diferentes sorogrupos) (1989)

22 M: 16 anos

C5 indetectável 13

23 M: 18 anos

N. meningitidis sorogrupo W135, B e

X, em ambos pacientes.

C5 indetectável

Fijen et. al.

(1989)

24 Suíça M: 15 anos

12/1986

Convulsões aos 4,5 anos. Aos 14 anos

sacroileíte com dor de costas.

Febre, vômito, dor de cabeça,

endurecimento da nuca, e lesões

purpúreas na pele. Cultura do sangue

e do fluido cerebroespinal para

Neisseria meningitidis tipo B positiva

C5 indetectável por RIA

Atividade hemolítica

indetectável

25 H: 20 anos Dor de cabeça, diarréia, vômito e

lesões purpúreas na pele das quatro

extremidades por dois dias. Cultura do

fluido cerebroespinal para Neisseria

meningitidis tipo C positiva.

C5 indetectável por RIA

Atividade hemolítica

indetectável

Gianella-

Borradori et. al.

(1990)

26 M: 1976

11/1984

(29 anos)

Artrite por gonococos

Alopecia, couro cabeludo com

diferentes hipopigmentações, com

cascas. Biópsia da pele mostrou

obstrução folicular, atrofia na

epiderme.

DLE C5 indetectável por RIA

Atividade hemolítica para

a via clássica: 18%

Asghar et. al.

(1991)

27 M: 10 anos

2/1989

Febre e sonolência, petéquias na área

ingüinal e nas costas, um episódio de

meningite e infecção por Herpes

simplex

Atividade hemolítica

(CH

) indetectável

C5 indetectável

28 M: 10 anos

gêmea da

paciente 27

Visivelmente saudável com um

passado de recorrentes infecções

respiratórias e otite

Atividade hemolítica

(CH

) indetectável

C5 indetectável.

29 M: 18 anos

6/1989. Irmã

da paciente 27

Febre, vômito, dor de cabeça, lesões

purulentas na orelha e infecções por

meningococos aos 11 anos.

Atividade hemolítica

(CH

) indetectável

C indetectável

Sanal, Ö et al.

(1992)

30 M: 16 anos.

Irmã da

paciente 27.

Visivelmente saudável com um

passado de recorrentes infecções no

trato respiratório e otite (perfuração

no tímpano direito)

Atividade hemolítica

(CH

) indetectável

C5: 0,2% do normal.

31 H: 13 anos.

Irmão da

paciente 27.

Não declarou infecção bacteriana

Atividade hemolítica

(CH

) indetectável

C5: 0,2% do normal.

17 32 H: 18 anos

10/1982

02/1985

03/1987

08/1991

Um primeiro episódio de febre (acima

dos 40°C), irritação nas meninges e

lesões petecas na pele causada por

meningites bacteriana.

Febre, vômitos, dor de cabeça,

fotofobia, endurecimento da nuca.

Cultura do fluido cérebro-espinal

positiva para N. meningitidis grupo B

Episódio de febre (acima dos 40°C),

seguido por náusea e vômitos.

Desenvolvimento de sepsis,

taquicardia. Cultura do fluido cérebro-

espinal positiva para N. meningitidis

grupo Y.

Episódio de febre (acima dos 39,4°C),

dor de cabeça e malaise. Cultura do

sangue positivo para N. meningitidis

Síndrome d

Kernig e

Brudzinski.

C5 indetectável Atividade

hemolítica (CPH)

indetectável e redução da

atividade quimiotatica de

células granulosas

Bols et. al.

(1993)

18 33 F: 28 anos

Aos 15 anos, primeiro episódio de dor

de cabeça, febre, fotofobia e vômito

causados por N. meningitidis. Aos 22

anos segundo episódio de febre, dor

de cabeça, lesões purpúreas na pele do

braço, tronco e cara.

CPH 0% e APH 0%,

C5 indetectável por RIA

nem por ELISA

Chaudhuri et. al.

(1994)

19 34 Marroquina M: 28 anos Apresentou desidratação nos olhos e

na boca e fatiga grave. Ligeira

sinovite nos pulsos e nas juntas das

metacarpofalanges.

Síndrome

Primária de

Sjögren

Deficiência de C5.

CPH menor que 6%

Schoonbrood et.

al. (1995)

35,36 Espanha Dois irmãos

gêmeos (H)

Um dos dois irmãos sofreu episódio

de meningite aos quatro anos e vários

episódios de pneumonia.

CPH menor 8%

APH menor 50%

Atividade hemolítica

(CH

) indetectável

C5 indetectável

Deleção e substituição

do triplete CCC (4884-

4886) pelo par GC

37 M

Dois episódios de meningites

ocasionados por bactérias aos três e

aos sete anos, freqüente amidalite,

pneumonia e infecção por herpes.

CPH menor 8%

APH menor 50%

Atividade hemolítica

(CH

) indetectável

C5 indetectável

Deleção e substituição

do triplete CCC (4884-

4886) pelo par GC

Delgado Cerviño

et. al. (2005)

21 38 Turco M: 5 anos

11 anos

Dores de cabeça, febre, vômitos,

manchas cor púrpura no abdómen,

teste positivo para N. meningitidis.

Dores de cabeça, febre, vômitos,

hipotensão. Seis meses depois o

paciente apresentou dor de cabeça e

endurecimento na nuca

tividade hemolítica mediad

pela via clássica e pela via

alternativa indetectável

Concentração de C5: 0,02%

Substituição de uma

adenina na posição

1115 por uma guanina,

o que prediz uma

substituição de uma

lisina por uma arginina

no códon 372

Pfarr et. al.

(2005)

DLE: lúpus eritematoso discóide,GADS: síndrome de artrite e dermatite por gonococos, CPH: via clássica de sistema complemento humano,

APH: via alternativa do sistema complemento humano, PMN: células polimorfonucleares. Mulher (M), homem (H).

II OBJETIVOS GERAIS

1. Caracterização genética e molecular da deficiência do componente C5 em uma família

brasileira, onde cinco de dezessete membros já sofreram de meningite.

2. Determinar o tipo de mutação apresentada pelos indivíduos deficientes da proteína C5

pertencentes a esta família responsável pela ausência de C5.

III MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Pacientes:

Os indivíduos deficientes (II.9, II:4 e II:5) são provenientes de uma família brasileira

bastante numerosa com história de consangüinidade (casamento entre primos-irmãos) (Figura

12) que têm sido acompanhados pela DRA. BEATRIZ COSTA CARVALHO do Departamento de

Alergia, Imunologia Clínica e Reumatologia, Escola Paulista de Medicina (UNIFESP). Após

consentimento informado e aprovação pela Comissão de Ética do ICB, amostras de sangue e

biópsias de pele foram obtidos por médico especializado.

A mãe (I:1) teve dois casamentos consangüíneos em segundo grau. No primeiro

casamento teve um casal de filhos, sendo que a filha teve duas meninas, a primeira que

faleceu de meningite tuberculosa aos sete anos de idade e a segunda menina (III:1)

desenvolveu um quadro de meningite. No seu segundo casamento ela teve duas filhas, cinco

filhos e três abortos com o indivíduo I:2 (Figura 12).

O indivíduo II:9 apresentou meningite aos três meses de idade, quando foi internado

por quatorze dias. Aos nove meses de idade apresentou um segundo quadro de meningite

iniciado por convulsões e febre, sendo novamente internado por 13 dias. Aos onze anos de

idade, o individuo II:9 apresentou seu terceiro caso de meningite sendo internado por 11 dias,

quando permaneceu um dia na unidade de terapia intensiva. Em todos os internamentos, o

paciente apresentou manchas pelo corpo e os médicos relataram ter sido causado por

meningite bacteriana. Em nenhum dos episódios de meningite, o agente etiológico foi isolado

e identificado. Este paciente apresentou também um episódio de otite e diversos quadros

virais sem complicações.

A concentração das classes de imunoglobulinas séricas aos treze anos de idade com

exceção da IgE encontrava-se em concentrações normais (Quadro 1) Nesta idade, a produção

de anticorpos: anti-tétano, anti-difteria e anti-sarampo foi 1,19; 1,0 e 0,68 mg/dl

respectivamente. A produção dos anticorpos para pneumococos pré- e pós-imunização

encontram-se no Quadro 4, onde o soro do indivíduo II:9 apresentou uma alta concentração

de anticorpos anti-pneumococos pré- e pós-imunização para o sorotipo 14. O soro do

indivíduo II:9 não foi reagente para HIV. O número de células sangüíneas (Quadro 2),

concentração de hemoglobina e a porcentagem de hematócrito (Quadro 3) para este

indivíduo encontravam-se dentro da normalidade.

O indivíduo II:4 (irmã do paciente II:9) teve meningite meningocócica aos 4 meses e

aos 27 anos de idade e também aqui desconhecemos qual foi o agente etiológico causador

destas meningites.

Quadro 1. Concentração das classes de imunoglobulinas no soro do probando II:9,

determinadas por imunodifusão radial.

Indivíduo II:9 Valores Normais*

IgG 1750 mg/dl 680 a 1601 mg/dl

IgA 190 mg/dl 60 a 336 mg/dl

IgM 384 mg/dl 88 a 378 mg/dl

IgE 19,4 UI/dl Traços

* valores normais para crianças brasileiras saudáveis com mais de 10 anos de idade. Dados

obtidos da tese de Maria Danisi Fujimura. Níveis séricos das subclasses da Imunoglobulina G

em crianças normais e nefróticas. 1991. Tese de Doutorado em Medicina (Pediatria)

Universidade de São Paulo. Testes realizados no Departamento de Alergia, Imunologia

Clínica e Reumatologia da Escola Paulista de Medicina, UNIFESP.

Quadro 2. Contagem diferencial de células sangüíneas no probando II:9

Nº Total (mm

de sangue)

Tipo Celular Probando II:9 Valores Normaís*

Leucócitos 5900 6000 a 15000

Segmentados 3445

Eosinófilos 159 100 a 300

Basófilos 47 0 a 50

Linfócitos totais 1840 1500 a 4000

Monócitos 407 200 a 950

* Intervalo de normalidade, referente a adultos (THORN et al, 1977, com exceção dos

números totais de leucócitos que são referentes a crianças brasileiras de 4 a 7 anos

(CARVALHO 1994). Testes realizados no Departamento de Alergia, Imunologia Clínica e

Reumatologia da Escola Paulista de Medicina, UNIFESP.

Quadro 3. Provas hematológicas realizadas com o probando II:9

Nº Total (mm

de sangue)

Probando II:9 Valores Normaís*

Hematócrito (%) 42 41,5 - 50,4

Hemoglobina (g/dL) 13,9 14 - 17,4

* Intervalo de normalidade para homens adultos (WINTROBE, 1988), (dados fornecidos pela

Dra. Beatriz Costa-Carvalho).

Quadro 4. Anticorpos produzidos pelo indivíduo II:9 de diferentes sorotipos contra

pneumococos (mg/ml).

Sorotipo 1 3 5 6 9 14

Pré-Imunização

0,71 0,32 2,4 1,7 0,54 23

Pós-Imunização

1,5 0,65 2,1 2,1 0,95 11,1

(dados fornecidos pela Dra. Beatriz Costa-Carvalho, UNIFESP).

3.2. Cultura de Fibroblastos

Os fibroblastos foram empregados como fonte de DNA e de RNAm e seu cultivo foi

feito a partir de biópsias de pele de aproximadamente 3 mm

retiradas dos probandos,

familiares e indivíduos normais (controles). Os fragmentos da pele biopsiada foram cortados

em pedaços menores e transferidos para placas de seis câmaras contendo uma gota de meio

"DMEM" (Dulbbeco's Modified Eagle's Medium - Sigma) suplementado com L-glutamina a 2

mM, penicilina a 50 U/mL e 10 % de soro bovino fetal (SBF - Invitrogen) inativado a 56

por 30 min. Para facilitar a aderência das células à placa, empregou-se uma lamínula de vidro

sobre o fragmento de pele, pressionando-o suavemente. Sobre a lamínula colocamos 5 mL de

meio DMEM e as culturas foram mantidas a 37

C sob tensão de 5% de CO

, onde após

algumas semanas, os fibroblastos começaram a proliferar. Quando as células começaram a

ocupar todo o fundo da lamínula e placa, elas foram removidas com solução de tripsina 0,1%

e repicadas (as células podem ser utilizadas até o repique 12) ou congeladas. Os fibroblastos

foram congelados em 90% de SBF e 10% de dimetil sulfóxido (Sigma) e mantidos em

nitrogênio líquido até o momento de utilização. As células descongeladas foram cultivadas em

garrafa de cultura contendo 15 mL de meio DMEM suplementado com SBF (10 %) e

glutamina (1 %) a 37ºC, sob tensão de 5 % de CO

até proliferação e posterior extração do

RNA total ou repique.

3.3. Imunodifusão Dupla (OUCHTERLONY, 1978)

Esta técnica foi usada para determinação da presença de proteínas do sistema

complemento nos soros dos pacientes e seus familiares e posterior comparação com soros

controles. Numa primeira etapa, o sangue foi coletado e centrifugado a 350 g por 10 min a 4

ºC. O soro foi aliquotado e congelado a –80 ºC, até o momento de uso. Uma camada de gel de

agarose a 1 % foi previamente colocada sobre uma lâmina de vidro (10 cm x 4 cm) e, após

secagem, recebeu um segundo revestimento com gel de agarose a 1 % em solução salina

tamponada com fosfato (PBS) pH:7,2 (KH

a 5 mM, K

HPO

a 1,2 mM e NaCl 150 mM).

Em orifícios de ~3 mm de diâmetro, foram colocados 7,5 µL de soro puro anti-C5 humano

produzido em coelho (Calbiochem-Novabiochem) contra 7,5 µL de cada um dos soros de

interesse, sem diluir. A reação foi incubada em câmara úmida a 4 ºC por 48 h, para permitir a

difusão de proteínas séricas e precipitação de imunocomplexos. As lâminas foram lavadas

com excesso de PBS por 48 h, secadas e coradas com Coomassie blue.

3.4. Imunodifusão Radial

Este método (MANCINI et al., 1965), foi usado para a quantificação de proteínas do

sistema complemento (C3, C4, Fator H, Fator I e Fator B) nos soros dos pacientes e seus

familiares. Sobre uma superfície plana, uma lâmina de vidro (8 cm x 8 cm) foi revestida

primeiramente com 2 mL de agarose a 1 % em PBS e, após secagem, foi coberta com agarose

a 1% em PBS contendo 1% de anticorpos específicos (anti-C3, anti-C4, anti-Fator I, anti-

Fator H ou anti-Fator B). A seguir, colocamos dentro de poços de 3 mm de diâmetro 5 µL das

amostras de interesse (soros dos probandos e familiares). Para a construção da curva-padrão,

aplicamos 5 µL de uma mistura de 47 soros de pessoas saudáveis, pura (100 %) ou diluída a

50 %, 25 % e 12,5 %. As placas foram incubadas por 24-48 h em câmara úmida mantida a 4

ºC para difusão e formação do halo de precipitação, seguido por lavagem com excesso de

PBS por 48 h, secagem e coloração com Coomassie Blue. Para a construção da curva padrão,

as diluições do soro correspondem aos valores de "x" e o diâmetro dos halos em mm foi

expressado nas ordenadas “y” Com a média destes dados, construímos a equação da reta y = a

x + b, para calcular a concentração das proteínas de complemento no soro dos pacientes e

familiares. Este ensaio foi realizado em triplicata conforme demonstrado na Tabela 10, onde

se mostra a média destes três experimentos.

3.5. Atividade hemolítica mediada pela Via Clássica

O volume de 4 mL de suspensão de hemácias de carneiro foi lavado 3 X com 10 mL

de tampão Complement Fixation Buffer "CFD" 1X (barbitona sódica a 4 mM, NaCl a 0,145

M, MgCl

a 0,83 mM e CaCl

a 0,25mM), centrifugando-se a 600 g. As hemácias foram

ressuspensas a 10% em tampão CFD e sensibilizadas a 4ºC por 30 min com soro de coelho

anti carneiro E (A) em dose sub-aglutinante. Após este período, a suspensão (EA) foi lavada

1X com tampão CFD.

As placas (8 cm X 8 cm) foram preparadas com 10 mL de agarose em tampão CFD a

1,2 %, contendo 500µL de EA. Poços de aproximadamente 3 mm de diâmetro foram

preparados e preenchidos com 7,5 µL de uma mistura não diluída de soros do 24 indivíduos

adultos saudáveis ou diluída em tampão CFD para a formação da curva padrão (100 %, 75 %,

50 % e 25 %), assim como 7,5 µL de cada soro de interesse (100 % e 50 %) mantidos a –70

ºC até o momento de uso. A placa foi então incubada por 18 h a 4ºC para difusão das

proteínas de complemento e por mais 2 h a 37 ºC para propiciar a lise mediada pela via

clássica.

Para a construção da curva padrão, consideramos a % de diluição do soro como "x" e o

diâmetro do halo de lise foi medido em mm (“y”) e com a média destes dados construímos a

equação da reta y = ax + b. As determinações sempre foram feitas com os soros dos pacientes

puros ou diluídos a 50 %, em duplicatas.

3.6. Atividade hemolítica mediada pela Via Alternativa

O volume de 5 mL do tampão GVB-EGTA-Mg

pH 7,4 (2,5 mL a 0,2 M de MgCl

, 5

mL a 0,2 M de EGTA e 92,5 mL de 1X "GVB") foi aquecido e misturado a 4 mL de agarose a

2 % no mesmo tampão a 56 ºC em banho-maria. A preparação foi transferida para outro

banho-maria mantido a 45 ºC, quando foram adicionados 512 µL de hemácia de cobaia a 10

% no mesmo tampão GVB-EGTA-Mg

, tendo sido previamente lavada por três vezes no

tampão acima. A mistura foi despejada sobre placa de vidro (8 cm X 8 cm), aguardando-se a

solidificação do gel. Para a construção da curva padrão, aplicamos 7,5 µL de uma mistura de

soros do 46 indivíduos adultos saudáveis, pura (100 %) e em diluições feitas em tampão

GVB/EGTA/Mg

(75 %, 50 % e 25 %) dentro dos poços de 3 mm de diâmetro feitos sobre a

placa, assim como 7,5 µL dos soros de interesse. A placa foi então mantida em câmara úmida

a 4 ºC para difusão das proteínas de complemento por 14 h e a 37 ºC por 2 h para que pudesse

acontecer a lise das hemácias pelas proteínas de complemento.

Em alguns experimentos a atividade hemolítica mediada pela via clássica foi avaliada

em soros diluídos (1:2) com soro humano normal (SHN), soro deficiente de C1s (C1sD) ou

com soro deficiente de C2 (C2D). Além disso, em outros experimentos C5 humano purificado

(Calbiochem-Novabiochem) foi adicionado ao soro C5D nas concentrações de 266, 133, 66 e

33 µg/mL, e sua atividade hemolítica foi avaliada tanto pela via alternativa quanto pela via

clássica, incubando-se as placas de hemólise por 18 h a 4°C, seguido por 2 h a 37°C.

3.7. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Anticorpos policlonais monoespecíficos anti-C5 humano (feitos em coelho,

Calbiochem- NovaBiochem) diluídos 1:4000 em tampão carbonato pH 9,6 (NaHCO

0,1M e

0,1M) foram incubados em placas de 96 poços por cerca de 14 h a 4°C. A remoção

dos anticorpos excedentes foi feita mediante a lavagem com PBS contendo Tween 20 (Tween

20 0,05%, NaN

0,02%, NaCl 0,15M, Na

10 mM) seguido por bloqueio com leite (em pó

e desnatado) a 5% em PBS contendo Tween 20 a 0,05%, por 2 h à temperatura ambiente com

o intuito de diminuir as reações inespecíficas. As amostras de interesse como dos probandos e

familiares foram diluídas em leite desnatado 5% em PBS contendo Tween 20 (1/252 e 1/4,

respectivamente) e aplicadas à placa previamente sensibilizada com o anti-C5 (feito em

coelho, Calbiochem-Novabiochem), incubando-se por 2 h a 37°C. Após 5 lavagens,

adicionamos o segundo anticorpo, anti-C5 humano (feito em carneiro, The Binding Site)

quando a placa foi novamente incubada por mais 2 h a 37°C. Após novas lavagens, foi

adicionado o terceiro anticorpo (anti-IgG de carneiro conjugado à fosfatase alcalina,

Calbiochem-Novabiochem) diluído a 1:5000 em leite desnatado 5% em PBS contendo Tween

20 pelo mesmo período. Finalmente, a placa depois de lavada, recebeu a solução reveladora

[tampão para fosfatase alcalina pH: 8,0 (dietanolamina 10%, NaN

, MgCl

) e 0,1% de p-

nitrofenil fosfato disódico (PNPP) – Calbiochem-NovaBiochem)] por 30 min ao abrigo da

luz, lendo-se a absorbância a 405 nm. A construção da equação da reta y = a (lnx)+ b foi feita

empregando diversas diluições de C5. A concentração inicial de 300µg/ml de C5 purificado

foi diluída 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048, 1/4096, 1/8192 e 1/16384 vezes em 5% de

leite desnatado em PBS contendo Tween 20 a 0,05%.

3.8. Extração do RNA total

Para a extração do RNA total, as células (aproximadamente 4 x 10

células/ml) foram

lavadas com PBS gelado pH:7,2 (KH

a 5 mM, K

HPO

a 1,2 mM e NaCl 150 mM) e

lisadas com ajuda de um raspador em 500 µL de solução de desnaturação (citrato de sódio

pH:6,8 a 26 mM, N-lauril sarcosina 0,5%; β-mercaptoetanol a 0,125 M e tiocianato de

guanidina a 4 M). As células lisadas foram transferidas para microtubos de 1,5 ml nos quais

foram adicionados 50 µL de acetato de amônio 2M e 500 µl solução de fenol clorofórmio-

álcool isoamílico. Depois de 15 min a 0 °C, as células foram centrifugadas por 20 min a

12.000 g, a 4

C. O sobrenadante contendo RNA foi transferido para outro microtubo, onde o

mesmo volume de isopropanol foi adicionado para precipitação do RNA, incubando-se a -

C por 18 h. Após esse procedimento, o conteúdo foi centrifugado por 40 min a 15000 g a

C. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado lavado com 1 mL de EtOH 75%, sob uma

nova centrifugação a 15000 g e a 4ºC, por 20 min. O EtOH foi desprezado e o precipitado

contendo RNA total foi ressuspenso em 10 µl de água estéril, livre de RNAse (Promega). Até

o momento de uso, as amostras de RNA foram mantidas a -20ºC. O RNA total extraído dos

fibroblastos foi quantificado, após absorbância lida em espectrofotômetro (260 nm),

aceitando-se a relação da D.O 260 nm/D.O 280 nm entre o 1,7 a 2,0.

3.9. Extração do DNA genômico

Para a extração do DNA genômico, os fibroblastos (aproximadamente 4 x 10

células/mL) foram removidos com solução de tripsina 0,1%, centrifugados (350 g por 10 min

a 4 ºC), posteriormente lavados com PBS gelado pH:7,2 (KH

a 5 mM, K

HPO

a 1,2

mM e NaCl 150 mM). Para a lise e posterior precipitação do DNA, adicionou-se 0,5 mL de

DNAzol (INVITROGEN) e, depois de homogenizado, adicionou-se então 0,3 ml de etanol

(100%), centrifugando-se a 1000 g por 10 min a 4ºC. Retirou-se o sobrenadante e o

sobrenadante foi lavado com 1 mL de etanol (95%). Após secagem, o precipitado foi

ressuspenso em 200µL de tampão de eluição "TE" (10mM Tris-HCl- pH 8,0; 0,1mM EDTA).

3.10. Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction RT-PCR "One Step"

Após quantificação do RNA total, a RT-PCR foi iniciada da seguinte maneira, para 50

µL de reação final de RT-PCR foram utilizados reagentes nas seguintes concentrações finais:

25 µL de 2X Reaction Mix (Invitrogen); 10 µL de RNA total a 30 ng/µL, 2 µL de primers

específicos a uma concentração de 20 pmoles/µL (Tabela 1, primers C5 HU 1F, C5 HU 45F,

C5 HU 587R, C5 HU 3210F e C5 HU 4050R); 1 µl de SuperScript

™

II RT/ Platinum®Taq

Mix e 10 µl de água autoclavada livre de RNAse. As reações de amplificação ocorrerão nas

seguintes condições: 30 min a 50

C, para a síntese da fita de cDNA; 2 min a 94

C; 35 ciclos

de 30 s de desnaturação a 94

C, 30 s de anelamento a 55

C (vide Tabela 1) e 1 min para

extensão a 72

C; seguidos por mais 7 min de extensão a 72

C. Como controle positivo,

usamos na reação de amplificação oligonucleotídeos específicos para GAPDH (gliceraldeído

3-fosfato deshidrogenase) expressado constitutivamente pelas células. Para verificar se houve

alguma contaminação na etapa de preparação da reação, incluímos um controle negativo feito

com todos os reagentes citados no RT-PCR e PCR, porém sem a inclusão do cDNA.

3.11. RT-PCR “Two Steps” – Promega

Após quantificação do RNA, procedeu-se com a RT-PCR em dois passos: o primeiro

para a obtenção do cDNA e o segundo para amplificação do fragmento de cDNA desejado.

Na primeira etapa, foram misturados 2,5µL de RNA total a 600 ng/µl e 4µL de oligo d(T) a

500 ng/µl por 5 min a 70ºC, onde acontece a ligação do oligo d(T) à cauda de poli (A). Em

seguida, foram adicionados os reagentes nas concentrações iniciais de 5 µL de tampão 5X

para a enzima M-MLV transcriptase reversa (250mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KCl, 15mM

MgCl

, 50 mM DTT da Promega); 1µL de inibidor de RNAse (GE Healthcare); 0,5 µL de

dNTP a 10mM; 0,7 µL de M-MLV transcriptase reversa 200 U/µl (Promega) e água

autoclavada, livre de DNAse e RNAse, até completar o volume final de 25 µl. Esta primeira

reação foi incubada por 1 h a 42 ºC para obtenção da primeira fita de cDNA. Para amplificar o

fragmento desejado, empregamos 2,5 µl do produto de cDNA; 2,5 µl de tampão 10X para a

enzima Taq DNA polimerase (200 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 500 mM KCl); 0,75µL de MgCl a

50mM; 0,5µL de dNTPs a 10mM; primers específicos a uma concentração de 30 pmols cada

(Quadro 5); 0,5 µL de Taq DNA polimerase recombinante a 5 U/µL (Invitrogen) e água

autoclavada livre de DNAse e RNAse até se completar 25 µl de reação. Estas reações

aconteceram nas condições seguintes: 2 min a 95

C; 1 min a 94

C para a desnaturação inicial

e 36 ciclos de: 1 min de desnaturação a 94

C, 40 s a diversas temperaturas de anelamento

(Quadro 5) e 2 min de extensão a 72

C, seguidos por mais 7 min de extensão final a 72

A Taq (Thermus aquaticus) DNA polimerase recombinante foi adicionada em dois tempos,

uma primeira metade no momento da preparação da reação de amplificação e a segunda

metade no ciclo número 20 na etapa de extensão.

Os resultados foram analisados após eletroforese em gel de agarose a 1% preparado

com TBE 1X pH 8,0 (ácido bórico a 100mM, Tris a 100mM e 0,4 % de EDTA - 2mM),

empregando-se marcadores para a estimativa do tamanho dos produtos de DNA amplificados.

A corrida eletroforética ocorreu a 60 V por 1 h. Em seguida, o gel foi corado com solução de

brometo de etídeo 10 mM, por 15 min, para revelar as bandas de cDNA de C5 (Figura 11).

Como controle positivo, empregamos oligonucleotídeos específicos do gene de

GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato deshidrogenase) que por ser uma enzima expressada

constitutivamente nos humanos, é usado para assegurarmo-nos que não introduzimos artefatos

técnicos no experimento. Para verificar se acontecia alguma contaminação na etapa de

preparação de amostras, uma amostra contendo todos os reagentes citados no RT-PCR e PCR,

mas sem inclusão do cDNA (controle negativo).

3.12. Extração de DNA a partir do gel

O protocolo abaixo foi empregado para purificação e obtenção de regiões de cDNA

para posterior seqüenciamento de nucleotídeos. Os produtos amplificados pela RT-PCR (50

µL) foram separados eletroforeticamente em gel de agarose preparado a 1 % em TBE 1X

Como referência de tamanho, marcadores com tamanhos conhecidos de DNA foram

incluídos. Após corrida eletroforética, o gel foi corado com solução de brometo de etídeo 10

mM, por 15 min, para revelar as bandas de DNA do gene C5. As bandas presentes foram

cortadas do gel e colocadas num tubo ao qual foram adicionados 10 µL de tampão da captura

(fornecido pelo fabricante- Invitrogen) para cada 0,01 g de gel, incubando-se por 15 min a 50

C em banho-maria. O conteúdo foi transferido para uma coluna de filtração, contendo sílica

para a captura de DNA. Descartamos o gel com o tampão, adicionando-se 500 µL de tampão

de lavagem à coluna, a fim de descartar restos do gel na membrana sílica e finalmente a

coluna de filtração foi transferida para outro tubo, onde foram adicionados 50 µL de tampão

de eluição "TE" (10mM Tris-HCl- pH 8,0; 0,1mM EDTA) aquecido a 60 ºC, seguido por 1

min de descanso. A amostra foi centrifugada e o produto de DNA foi guardado a -20ºC para

posterior seqüenciamento de nucleotídeos.

Semelhante procedimento foi adotado para obtenção de bandas de DNA genômico que

foram encaminhadas para o seqüenciamento de nucleotídeos.

Figura 11. Expressão do gene C5 em fibroblastos de indivíduos normais. Foram empregados

os pares de oligonucleotídeos 102F - 1380R (1278 pb), 1321F - 2710R (1389 pb), 2700F -

4050R (1350 pb) e 4021F - 5436R (1415 pb).

3.13. Seqüenciamento de nucleotídeos

Para a reação de seqüenciamento propriamente dita foram utilizados: 11 µL do DNA

purificado (300 ng/µL); para cada reação utilizou-se 1 µL de um dos primers (3 pmoles/µL);

6 µL de tampão de seqüenciamento (Tris-HCl a 200mM a pH=9, MgCl a 5mM) e 2 µL da

enzima Big Dye- Terminator V3.1 (Applied-Biosystem). A reação de seqüenciamento foi feita

nas seguintes condições: 10 s a 96

C, 5 s a 50

C e 4 min a 60

C por 40 ciclos. Em seguida,

o DNA foi precipitado com 80 µL de isopropanol a 75 %, durante 15 min à temperatura

ambiente e centrifugado 15 000 g por 20 min. O sobrenadante foi aspirado e o precipitado foi

102F 1032F 2700F 4021F

1380R 2710R 4050R 5436R

1375 pb

102F 1032F 2700F 4021F

1380R 2710R 4050R 5436R

1375 pb

lavado com 250 µL de isopropanol a 75 % e centrifugado por 5 min. O precipitado de DNA

foi secado e logo solubilizado para aplicação no gel de seqüenciamento. A corrida em gel de

seqüenciamento foi realizada no Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da

USP, com a colaboração do Dr. Shaker Chuck Farah.

As seqüências de nucleotídeos obtidas foram analisadas em nosso laboratório,

utilizando o programa BLAST N (ALTSCHUL, et. al. 1997) com a referência

gi|179982|gb|M57729.1|HUMCCC5[179982] Homo sapiens complement component C5

mRNA através do sítio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, e analisadas através do programa

Chromas 1.62/2.21.

Quadro 5. Oligonucleotídeos utilizados na PCR, RT-PCR e seqüenciamento, mostrando

temperatura de anelamento, sentido da amplificação e tamanho em pares de base (pb) dos

produtos amplificados do gene C5.

Temperatura (ºC) Nome dos

oligonucleotídeos

posição no cDNA

Seqüência de nucleotídeos para a

construção dos oligonucleotídeos

(5'- 3')

nelamento

tilizada

C5 HU 1F

TACCTCCAACCATGGGCC

62 55

C5 HU 45F

TTCCTGGGGAAACCCTGG

62 55

C5 HU 102F

TTCCGTGTTGGAGCATCTG

60 55

C5 HU 1321F

CTGATGCTCCAGATCTTCC

60 55

C5 HU 2281F

TGTTACCAGTAAGCAAGCC

60 55

C5 HU 2700F

ACATTCACTGTGCTTCC TC

60 53

C5 HU 3210F

AGTGTGTGGAAGGGTGG

58 53

C5 HU 3487F

ACTGCCAGCCCAGAGCA

60 55

C5 HU 4021F

CAGTAGAGGTGCTTCTAAA

58 53

C5 HU 291 F

CAGTCATCAAATGGCTATCA

60 55

C5 HU 303 F

CAGATCTGAGGCCACAC

58 53

C5 HU 315 F

AGGGCCTGACGGAATATTC

62 55

FORWARD

(F)

GAPDH F

CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC

C5 HU 587R GCAGGAATCTTCAAGTCAGG 60

C5 HU 1380R TGCTATTGCTCGGTAACCTT 58

C5 HU 2710R CAGTGAATGTCACCAAGTGA 58

C5 HU 3421R CTTGAACAGGCAAGGTACCC 62

C5 HU 4050R GAGGTCATCATTGAGAAGCA 58

C5 HU 4249R CCCTGCTGGGCTTGTAGC 60

C5 HU 5436R ACTCAGGCTTTAATGATCAG 56

C5 HU 292 R GTGGAGAAGGAGCATCAGTA 60

C5 HU 4001 R GCCTCCCAAGGAAATTCTT 56

C5 HU 316 R CCTCCATCTTTCAGCCAGG 60

REVERSE

(R)

GAPDH-R GGTCTCGCTCCTGGAAGATG

3. 14 Fluxograma do trabalho

3.14.1 Determinação da Atividade Hemolítica mediada pela Via Clássica e Alternativa

3.14.2 Determinação da concentração sérica das proteínas do sistema complemento nos

indivíduos I:1, I:2, II:4, II:5, II:9 e famliares

Via Alternativa

Coleta dos soros dos indivíduos

problema e familiares

Determinação da Atividade hemolítica

Via clássica

Lâminas de vidro recobertas por gel

de agarose misturadas com:

eritrócitos de carneiro sensibilizadas

com IgG de coelho anti-carneiro

eritrócitos de cobaia

Avaliação da

Via clássica

Avaliação da

Via Alternativa

Medida dos halos de lise

Via Alternativa

Coleta dos soros dos indivíduos

problema e familiares

Determinação da Atividade hemolítica

Via clássica

Lâminas de vidro recobertas por gel

de agarose misturadas com:

eritrócitos de carneiro sensibilizadas

com IgG de coelho anti-carneiro

eritrócitos de cobaia

Avaliação da

Via clássica

Avaliação da

Via Alternativa

Medida dos halos de lise

Determinação da

concentração de C5

Determinação da

concentração de

C3,C4, fI, fB, fH

Amostra dos soros dos indivíduos

deficientes e familiares

Imunodifusão Radial

ELISA

Determinação da

concentração de C5

Determinação da

concentração de

C3,C4, fI, fB, fH

Amostra dos soros dos indivíduos

deficientes e familiares

Imunodifusão Radial

ELISA

Amostra dos soros dos indivíduos

deficientes e familiares

Imunodifusão Radial

ELISA

3.14.3 Determinação das possíveis mutações presentes no material genético (DNA

genômico e RNA) dos indivíduos avaliados e confirmação da mutação apresentada

Seqüenciamento dos nucleotídeos para

identificação de mutações presentes no cDNA

Isolamento de DNA total extraída dos

fibroblastos

Amplificação e seqüenciamento dos fragmentos

de DNA genômico para a confirmação da

presença de mutações em C5

Biópsia da pele dos indivíduos C5 deficientes e familiares

Cultura de fibroblastos

Isolamento de RNA total extraída

dos fibroblastos

Amplificação dos fragmentos de cDNA

Identificação do padrão de hereditariedade

após análise do DNA dos pais.

Seqüenciamento dos nucleotídeos para

identificação de mutações presentes no cDNA

Isolamento de DNA total extraída dos

fibroblastos

Amplificação e seqüenciamento dos fragmentos

de DNA genômico para a confirmação da

presença de mutações em C5

Biópsia da pele dos indivíduos C5 deficientes e familiares

Cultura de fibroblastos

Isolamento de RNA total extraída

dos fibroblastos

Amplificação dos fragmentos de cDNA

Identificação do padrão de hereditariedade

após análise do DNA dos pais.

IV. RESULTADOS

4.1. Resultados experimentais

Os indivíduos deficientes de C5 (II:4, II:5 e II:9) provêm de uma família brasileira

com história de consangüinidade resultantes de casamento entre primos-irmãos. Vários

episódios de meningite e infecções recidivantes foram relatados nesta família, sugestivos de

deficiência de proteínas da via terminal comum do sistema complemento. Os indivíduos que

sofreram de meningite estão indicados na Figura 12.

Figura 12. Heredograma da família brasileira deficiente de C5. Os indivíduos deficientes e

seus familiares estão representados por números romanos os quais representam a geração à

qual pertencem e os números arábicos representam a sua posição na família. A concentração

de C5 de cada indivíduo da família está expressada em µg/ml (côr azul) e a setas vermelhas

indicam os indivíduos que tiveram episódios de meningite.

I:1 I:2

68 21

II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6 II:7 II:8 II:9

64 1,3 0,9 67 54 1

III:2 III:3 III:4 III:5 III:6

46 33 38 32 64

III:1

I:1 I:2

68 21

0RUWH

,QGLY¯GXRV1RUPDLV

,QGLY¯GXRVSUREOHP D

$ERUWR

,QGL Y¯GXRVKHWHUR]L JRWRV

I:1 I:2

68 21

II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6 II:7 II:8 II:9

64 1,3 0,9 67 54 1

III:2 III:3 III:4 III:5 III:6

46 33 38 32 64

III:1

I:1 I:2

68 21

0RUWH

,QGLY¯GXRV1RUPDLV

,QGLY¯GXRVSUREOHP D

$ERUWR

0RUWH0RUWH

,QGLY¯GXRV1RUPDLV

,QGLY¯GXRVSUREOHP D,QGLY¯GXRVSUREOHP D

$ERUWR$ERUWR

,QGL Y¯GXRVKHWHUR]L JRWRV

Ao avaliar a atividade hemolítica desta família (Tabela 9), notamos que nenhum dos

soros dos probandos (II:4; II:5 e II:9) foi capaz de apresentar qualquer atividade hemolítica,

seja ela mediada pela via clássica ou pela via alternativa.

Tabela 9. Atividade hemolítica mediada pela via clássica e via alternativa dos pacientes

deficientes da proteína C5 (II:4, II:5 e II:9) e familiares

Atividade Hemolítica

Indivíduos APH (%) CPH (%)

I:1 173,3 107,0

I:2 155,8 < 25%

II:3 170,8 94,1

II:4 sem lise sem lise

II:5 sem lise sem lise

II:7 89,9 157,2

II:8 92,5 102,9

II:9 sem lise sem lise

III:1 141,6 108,9

III:2 78,4 106,2

III:3 69,4 102,9

III:4 52,9 93,1

III:5 74,2 101,2

III:6 n.a. 91,3

APH% e CPH% referem- se às porcentagens de hemólise mediadas respectivamente pelas

vias alternativa e clássica, considerando- se uma curva padrão determinada com uma mistura

de 42 soros de indivíduos normais pura (100%) ou nas diluições 75%, 50% e 25%. Indivíduo

não avaliado (n.a.)

Deve-se ressaltar também que o soro do pai (I:2) apresentou menos de 25 % (limite

mínimo do método) da atividade hemolítica mediada pela via clássica e 155,8 % de lise

mediada pela via alternativa (Tabela 9). Isto sugere que o soro do pai apresenta concentração

reduzida de pelo menos um componente da via clássica (C1q, C1r ou C2), uma vez que as

concentrações de C1s (dados no mostrados) e de C4 (Tabela 10) são aparentemente normais.

Para inicialmente detectarmos a presença ou ausência de proteínas do

complemento (C5, C6, C7, C8 e C9) no soro, utilizamos o método de imunodifusão dupla

(OUCHTERLONY, 1978) em gel de agarose empregando anticorpos policlonais anti-C5,

anti-C6, anti-C7, anti-C8 ou anti-C9 humanos contra os soros puros e diluídos (1/2; 1/4; 1/8;

1/16; 1/32) dos probandos e seus familiares. Como controle, foi empregada uma mistura de

130 soros de adultos saudáveis. Com esta técnica, não pudemos observar a formação de

imunocomplexos quando anti-C5 foi incubado na presença dos soros dos indivíduos II:4, II:5

e II:9 (Figura 13), enquanto as demais proteínas (C6, C7, C8 e C9) encontravam-se presentes

em níveis expressivos nos indivíduos avaliados (dados no mostrados).

Figura 13. Imunodifusão dupla dos soros dos membros da família deficiente de C5. Os soros

dos indivíduos II:4, II:5 e II:9 não formaram halo de precipitação para a proteína C5 (seta

verde). SHN: mistura de soros de 130 indivíduos adultos saudáveis. Soros dos indivíduos

avaliados foram usados puros e nas diluições: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 (para todos os casos a

seta marca o início (puro) e o sentido horário). Anticorpo utilizado, anti-C5, humanos feitos

em coelho.

Para determinarmos as concentrações de proteínas do sistema complemento,

empregamos a técnica de imunodifusão radial (MANCINI, 1965), mediante esta técnica

observamos que as proteínas C3, C4, Fator H e Fator I encontravam-se presentes em

concentrações relativamente normais nos soros dos membros avaliados desta família (Tabela

aC5 aC5 aC5 aC5 aC5

aC5

SHNSHNSHN SHN

II:4I:2 II:9II:7

SHN

SHNSHN

I:1

II:3

II:8

II:5

aC5 aC5 aC5 aC5 aC5

aC5

SHNSHNSHN SHN

II:4I:2 II:9II:7

SHN

SHNSHN

I:1

II:3

II:8

II:5

aC5 aC5 aC5 aC5 aC5

aC5

aC5 aC5 aC5 aC5 aC5

aC5

SHNSHNSHN SHN

II:4I:2 II:9II:7

SHN

SHNSHN

I:1

II:3

II:8

II:5

SHN

SHNSHN

I:1

II:3

II:8

II:5

10). Estes resultados foram comparados com dados já existentes na literatura para indivíduos

brasileiros saudáveis (PFARR et al. 2005, FERREIRA DE PAULA et al. 2003 e FERRIANI

et al. 1999) e com uma mistura de soros de 42 pessoas saudáveis. Interessante notar que as

concentrações séricas de Fator B e da proteína C3 dos pais e filhos (II:3, II:4 e II:5) estão

elevadas (Tabela 10) o que explicaria a elevada atividade hemolítica nestes indivíduos

mediada pela via alternativa. Em outros integrantes desta família (II:7, II:8, III:2, III:3, III:4,

III:5 e III:6) as concentrações do Fator B estão em concentrações reduzidas (140, 183, 150,

125, 149, 111 e 134 µg/mL respectivamente), porém dentro ou próximas do intervalo de

normalidade para indivíduos de 10- 14 anos de idade (183-513 µg/mL - FERRIANI et al.,

1999). Estes resultados mostrados na Tabela 10 corroboram os resultados mostrados na

Tabela 9, onde os pacientes acima mencionados apresentam uma redução da atividade

hemolítica mediada pela via alternativa.

A concentração de C5 presente nos soros de todos os indivíduos desta família foi

determinada por ELISA. Os soros dos pacientes II:4, II:5 e II:9 apresentaram concentração de

C5 de 1,3; 0,9 e 1,0 µg/ml respectivamente (intervalo de normalidade para adultos brasileiros:

45 – 190 µg/ml – média de 48 indivíduos saudáveis: 91 µg/ml), o que explica a ausência total

da atividade hemolítica mediada pela via clássica e a via alternativa nestes pacientes. Este

resultado é compatível com a ausência de C5, uma vez que este componente participa da via

terminal comum do sistema complemento. O soro do pai (I:2) apresentou concentrações

bastante reduzidas de C5 (21 µg/ml), enquanto a concentração da proteína C5 no soro da mãe

(68,3 µg/ml) encontra-se dentro do intervalo de normalidade mencionado acima (Tabela 10),

porém abaixo da média de 91 µg/ml. Os soros dos irmãos saudáveis dos deficientes: II:3, II:7,

II:8 e um dos netos III:6 (filho de II:5) apresentaram 64, 67, 54 e 64 µg/ml de proteína C5

respectivamente. Entretanto, os indivíduos da terceira geração desta família: III:2 (filha do

indivíduo deficiente II:4), III:3, III:4 e III:5 (filhos do indivíduo deficiente II:5) apresentaram

46, 33, 38 e 32 µg/ml da proteína C5 no soro respectivamente, indicativo de um padrão

heterozigoto da deficiência de C5.

Tabela 10. Dosagens de proteínas do complemento do soro de pacientes deficientes da

proteína C5 (II:4, II:5 e II:9) e familiares.

Proteínas de Complemento

Sexo Idade

(anos)

eningites C3

(

g/ml)

(

g/ml)

(

g/ml)

ator

(

g/ml)

ator

(

g/ml

)

Fator B

(

g/ml)

I:1 F 60 Não 3235 677 68 615 58 373

I:2 M 62 Sim 2142 782 21 588

0 313

II:3 M Não 1632 850 64 481 53 325

II:4 M 33 Sim 1879 511 1,3 534

0 391

II:5 F 32 Sim 2232 626 0,9 481

2 360

II:7 M 25 Não 680 396 67 480

.a. 140

II:8 M 22 Não 1343 478 54 756

.a. 183

II:9 M 16 Sim 1795 284 1,0 438

8 227

III:1 F 19 Sim 2553 568 59 434 50 259

III:2 F Não 1249 219 46 423

.a. 150

III:3 F 13 Não 1498 520 33 482

.a. 125

III:4 F 11 Não 1511 679 38 482

.a. 149

III:5 F 10 Não 978 706 32 756

.a. 111

III:6 M 8 Não 1406 396 64 756

.a. 134

alores (6-13 anos)

Normais (adulto)

40-1470

000-1500

99 - 338

450 - 600

45-190

225-1636

242 -759

34 - 91

39 - 100

185-513*

200-210

Indivíduo não avaliado (n.a.). Intervalo de normalidade das proteínas de complemento encontra-

se em µg/ml. A concentração de C5 presente nos soros de todos os indivíduos desta família foi

determinada por ELISA (valores normais para adultos brasileiros: 45 – 190 µg/ml – média de

48 indivíduos saudáveis: 91 µg/ml) Indivíduos deficientes de C5 são mostrados em negrita. A

concentração da proteína C3, C4, Fator B, Fator I e Fator H foram determinadas por

imunodifusão radial. Referências citadas para os valores normais de: Fator I e Fator H

(FERREIRA DE PAULA et al. 2003); e C3, C4 e Fator B (FERRIANI et al. 1999). *Estes

valores correspondem ao intervalo de normalidade para soros de indivíduos de 10 a 14 anos de

idade

Para confirmar que a falta de atividade hemolítica é causada unicamente pela falta de

proteína C5 no soro, decidimos avaliar a via alternativa no probando II:9 após adição de

diferentes concentrações de C5 purificado (266, 133, 66 e 33 ng/µl - Tabela 11). Notamos

que à medida que aumentávamos a concentração de C5 também aumentava

proporcionalmente a atividade hemolítica do soro C5D. Este resultado indica que das

proteínas do sistema complemento que participam da via alternativa apenas o componente C5

está ausente no soro do paciente II:9.

Tabela 11. Atividade hemolítica do soro do probando II:9, após reposição com proteína C5

humana purificada.

Concentração final de C5

em ng/

Atividade Hemolítica

APH (%)

Soro II:9 266 105,9

Soro II:9 133 86,8

Soro II:9 66 82,2

Soro II:9 33 sem lise

Soro II:9 0 sem lise

Concentração da proteína C5 no soro normal: 45 - 190 µg/ml (intervalo de normalidade para

adultos brasileiros: 45 – 190 µg/ml – média de 48 indivíduos saudáveis: 91 µg/ml)

Na etapa seguinte, decidimos investigar quais alterações genéticas poderiam explicar a

ausência deste componente do sistema complemento. Para abordar esta questão, cultivamos

fibroblastos a partir de biópsias de pele de indivíduos normais e dos probandos para servirem

como fonte de DNA e RNA. Empregamos PCR e RT-PCR para investigar a presença de

mutações no gene C5 e RNAm de C5 nestes deficientes.

As regiões do gene C5 foram amplificadas a partir do DNA genômico (Figura 14) e

do cDNA (Figura 15) dos indivíduos deficientes de C5 (II:4 e II:9) e seus familiares (I:1 e

I:2) e comparadas com o controle normal (fibroblasto humano normal – FHN). Devido à

dificultade para amplificar a região correspondente ao éxon 1 do cDNA de C5, decidimos

amplificar os íntrons próximos ao éxon 1 do DNA genômico, mas não encontramos qualquer

mutação (Figura 14) na região correspondente ao éxon 1 nos indivíduos avaliados (I:1, I:2 e

II:9).

Figura 14. Amplificação do DNA genômico da região que abrange o éxon 1. (A) Estrutura

do gene C5. (B) Amplificação do éxon 1 incluindo os íntrons próximos. No seqüenciamento

não se observou a presença de qualquer mutação nos indivíduos avaliados.

Conforme mostrado na Figura 15 (A) o gene C5 contem 41 éxons, com tamanhos

variando de 61 pb (éxon 16) a 531 pb (éxon 41). Na Figura 15 (A) encontra-se a distribuição

dos oligonucleotídeos usados na etapa de amplificação 45F-587R (542 pb); 64F- 587R (523

pb); 102F-1380R (1278 pb); 1321F-2710R (1389 pb); 2700F-4050R (1350 pb) e 4021F-

5436R (1415 pb). Na Figura 11 encontra-se a amplificação destas regiões em fibroblastos de

indivíduos normais para complemento.

FHN I:1 I:2 II:9

500pb

1 2 3 4 39 40 41

............................

1.0F 1.2R

FHN I:1 I:2 II:9

500pb

1 2 3 4 39 40 41

............................

1.0F 1.2R

FHN I:1 I:2 II:9

500pb

FHN I:1 I:2 II:9

500pb500pb

1 2 3 4 39 40 41

............................

1.0F 1.2R

1 2 3 4 39 40 41

............................

1.0F 1.2R

Constatamos que os produtos amplificados no cDNA de C5, correspondentes aos

fragmentos localizados entre 45-587 pb; 102-1380 pb; 1321-2710 pb; 2281-3421 pb e 4021-

5436 pb não apresentaram qualquer deleção visível (Figura 15) em todos os indivíduos

avaliados. A região compreendida entre os nucleotídeos 45-587 (542 pb) apresenta dois

transcritos de 800 pb e 700 pb (descritos anteriormente por CARNEY et al., 1991). A região

comprendida entre os nucleotídeos 3210 - 4050 pb (840 pb), apresenta uma deleção de ~150

pb presente em todos os indivíduos deficientes de C5 avaliados (I:1, I:2, II:4 e II:9). A mãe

(I:2) apresentou um padrão heterozigoto, amplificando pelo menos dois produtos: um de 840

pb (produto expressado no indivíduo normal) e um produto de ~650 pb (produto presente nos

indivíduos deficientes de C5). Resaltamos que a banda de maiorr tamanho é de natureza

inespecífica, confirmada após seqüenciamento.

Figura 15. Avaliação comparativa dos produtos amplificados do cDNA de C5 de vários

membros desta família. (A) Esquema que representa o cDNA C5 (CARNEY, et. al., 1991),

incluindo os oligonucleotídeos utilizados. (B) Amplificação destes produtos em vários

membros da família. Observa-se uma deleção de ~150 nucleotídeos nestes indivíduos (em

vermelho). FHN: fibroblastos de humano normal. GAPDH: controle positivo. Os tamanhos

dos produtos indicados à esquerda da figura referem-se aos tamanhos esperados em

indivíduos normais. I:1: mãe; I:2: pai; II:4 e II:9: pacientes deficientes. Mix: controle técnico.

FHN I:1 I:2 II:4 II:9 mix

Oligonucleotídeo Tamanho

(nucleotídeos)

GAPDHF

GAPDHR

45F 542

587R

102F 1278

1380R

1321F 1389

2710R

2281F 1140

3421R

3210F 840

4050R

4021F 1415

5436R

1 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 39

40503210

3487 4279

Cadeia ?

4021 5436

45 587

64 587

102 1380

1321 2710

2281 3421

1 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 39

40503210

3487 4279

Cadeia ?

4021 5436

45 587

64 587

102 1380

1321 2710

2281 3421

FHN I:1 I:2 II:4 II:9 mix

Oligonucleotídeo Tamanho

(nucleotídeos)

GAPDHF

GAPDHR

45F 542

587R

102F 1278

1380R

1321F 1389

2710R

2281F 1140

3421R

3210F 840

4050R

4021F 1415

5436R

FHN I:1 I:2 II:4 II:9 mix

Oligonucleotídeo Tamanho

(nucleotídeos)

GAPDHF

GAPDHR

45F 542

587R

102F 1278

1380R

1321F 1389

2710R

2281F 1140

3421R

3210F 840

4050R

4021F 1415

5436R

1 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 39

40503210

3487 4279

Cadeia ?

4021 5436

45 587

64 587

102 1380

1321 2710

2281 3421

1 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 39

40503210

3487 4279

Cadeia ?

4021 5436

45 587

64 587

102 1380

1321 2710

2281 3421

1 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 39

40503210

3487 4279

Cadeia ?

4021 5436

45 587

64 587

102 1380

1321 2710

2281 3421

1 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 391 2 3 4 5 6 7 20 21a 21b 22 23 24 25 268 9 10 11 12 14 15 16 17 1813 19

27 28

30 34

3510684

38 39

40503210

3487 4279

Cadeia ?

4021 5436

45 587

64 587

102 1380

1321 2710

2281 3421

A análise do seqüenciamento do gene C5 do paciente II:9 revelou uma substituição

498

por uma T

498

(Figura 16), sendo que na etapa de tradução ambos os códons (ACC e

ACT) geram o aminoácido Thr, portanto esta substituição deve ser considerada como uma

mutação silenciosa.

Figura 16. Seqüenciamento do éxon 4 do paciente II:9. (A) DNA genômico C5. (B)

Cromatograma do éxon 4. (C) Seqüenciamento mostrando a substituição de um ACC

498

por

um ACT

498

(fita 5’-3’) no éxon do indivíduo II:9 (C5D).

Os indivíduos I:1, I:2, II:4 e II:9 apresentaram uma deleção de 153 nucleotídeos

(Figura 17) que corresponde ao éxon 30 em sua totalidade, esta deleção inicia-se no

nucleotídeo G

3876

e culmina no nucleotídeo G

4029

. O experimento foi feito em duplicata no

sentido forward e reverso

498

Indivíduo II:9

5´ 3´ (forward)

1 2 3 4 5 38 39 40 41

............................

FHN GTC TTA ACC TTC ATA

II:9 GTC TTA ACT TTC ATA

aa Val Leu Thr Phe Ile

498498

Indivíduo II:9

5´ 3´ (forward)

1 2 3 4 5 38 39 40 41

............................

1 2 3 4 5 38 39 40 41

............................

FHN GTC TTA ACC TTC ATA

II:9 GTC TTA ACT TTC ATA

aa Val Leu Thr Phe Ile

Figura 17. Seqüenciamento dos éxons 29, 30 e 31 do cDNA de C5 dos indivíduos I:1, I:2,

II:4 e II:9 e os respectivos cromatogramas. (A) Amplificação do cDNA (nucleotídeos 3487 –

4249) mostra uma deleção de 153 nucleotídeos. O indivíduo I:1 (mãe) é heterozigoto e

apresenta os dois produtos amplificados: o normal (762 pb) e sem o éxon 30 (609 pb). (B)

cDNA de C5 mostrando do éxon 29 ao éxon 31. (C) O seqüenciamento e seu respectivo

cromatograma da região mostrada em B mostra a deleção do éxon 30 em sua totalidade. FHN:

fibroblasto humano normal; I:1: mãe; I:2: pai; II:4 e II:9: pacientes deficientes

FHN:

TTATTCAACCCAGGACACCATCAAT....GAGGCCAGTAGAGGTGCTTCTCAATG

Indivíduos C5D:

TTATTCAACCCAG

3876 4030

GTGCTTCTCAATG

800 pb

FHN I:1 I:2 II:4 II:9 mix

Éxon 29 Éxon 30 Éxon 31

I:1

3876 4030

II:9

3876 4030 38764030

38764030

I:2

3876 4030 38764030

II:4

3876 4030

38764030

5´ 3´ (forward)

5´ 3´ (reverse)

FHN:

TTATTCAACCCAGGACACCATCAAT....GAGGCCAGTAGAGGTGCTTCTCAATG

Indivíduos C5D:

TTATTCAACCCAG

3876 4030

GTGCTTCTCAATG

800 pb

FHN I:1 I:2 II:4 II:9 mix

Éxon 29 Éxon 30 Éxon 31

I:1

3876 4030

II:9

3876 4030 38764030

38764030

I:2

3876 4030 38764030

II:4

3876 4030

38764030

I:1

3876 40303876 4030

II:9

3876 40303876 40303876 4030 38764030 38764030

38764030 38764030

I:2

3876 40303876 40303876 4030 38764030 38764030

II:4

3876 40303876 4030

38764030 38764030

5´ 3´ (forward)

5´ 3´ (reverse)

Para avaliar se estes indivíduos possuem um defeito de splicing no éxon 30 ou se

carecem deste éxon no gene C5 decidimos avaliar do éxon 29 ao éxon 31 incluindo os íntrons

próximos a eles, quando encontramos após amplificação que todos os indivíduos avaliados

possuem a região intrônica (Figura 18). Portanto, a causa desta deficiência é um erro no

“splicing” do RNAm de C5 nos indivíduos afetados.

Figura 18. Amplificação da região comprendida entre o éxon 29 ao éxon 31, incluindo os

íntrons próximos do DNA genômico dos indivíduos I:1, I:2 e II:9. (A) Estrutura do gene

C5. (B) Todos os indivíduos avaliados pertencentes à família deficiente de C5 apresentam a

região intrônica correspondente ao éxon 29 e 30. FHN: fibroblasto humano normal; I:1: mãe;

I:2: pai e II:9: pacientes deficientes

FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9

1959 pb

854 pb

627 pb

29-1F 30-1R

30-2F 30-3R

31-1F 4050R

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21b

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

(2860 nucleotídeos) 1340 nucleotídeos

FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9

1959 pb

854 pb

627 pb

29-1F 30-1R

30-2F 30-3R

31-1F 4050R

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21b

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9

1959 pb

854 pb

627 pb

29-1F 30-1R

30-2F 30-3R

31-1F 4050R

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21b

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9

1959 pb

854 pb

627 pb

FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9 FHN I:1 I:2 II:9

1959 pb

854 pb

627 pb

29-1F 30-1R

30-2F 30-3R

31-1F 4050R

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21b

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

29-1F 30-1R29-1F 30-1R

30-2F 30-3R30-2F 30-3R

31-1F 4050R31-1F 4050R

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21b

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

(2860 nucleotídeos) 1340 nucleotídeos

A partir do seqüenciamento destas regiões no gene C5 encontramos a substituição de

uma GAG por uma GAA na posição 31058262 (Figura 19), correspondente ao último

nucleotídeo do éxon 30 no cDNA dos indivíduos I:1, I:2 e II:9. O seqüenciamento dos

nucleotídeos do indivíduo I:1 confirma o padrão heterozigoto. Na Figura 20 se mostra outra

substituição na região intrônica entre o éxon 30 e o éxon 31 de C por G na posição 31055723.

O indivíduo I:1 apresenta um padrão heterozigoto.

Figura 19. Seqüenciamento do éxon 30 e seu respectivo íntron nos indivíduos I:1, I:2 e II:9.

(A) Estrutura do gene C5. (B) Amplificação do éxon 30 e seus íntrons próximos. (C)

Cromatograma do éxon 30. Observa-se uma substituição de G por A (posição 31058262) do

último nucleotídeo do éxon 30 no gene C5 (seta preta). O indivíduo I:1 apresenta um padrão

heterozigoto. FHN: fibroblasto humano normal; I:1: mãe; I:2: pai; II:4 e II:9: pacientes

deficientes

854 pb

FHN I:1 I:2 II:9

1 2 3 4 27 28 29 30 31 32 33 40 41

.............

302F 303R

I:1

5´ 3´ (forward)

5´ 3´ (reverse)

FHN

Éxon 30 Éxon 30Íntron Íntron

II:9

I:2

854 pb

FHN I:1 I:2 II:9

854 pb

FHN I:1 I:2 II:9

1 2 3 4 27 28 29 30 31 32 33 40 41

.............

302F 303R

1 2 3 4 27 28 29 30 31 32 33 40 41

.............

302F 303R

I:1I:1

5´ 3´ (forward)

5´ 3´ (reverse)

FHN

Éxon 30 Éxon 30Íntron Íntron

II:9II:9II:9

I:2I:2

Figura 20. Seqüenciamento do íntron 30 e o éxon 31 do gene C5 dos indivíduos I:1, I:2 e

II:9. (A) Estrutura do gene C5. (B) Amplificação do produto correspondente ao íntron 30 e

éxon 31. (C) Seqüenciamento e correspondente cromatograma. Nos indivíduos I:2 e II:9 se

observa na região intrônica entre o éxon 30 e o éxon 31 a substituição de C por G na posição

31055723. O indivíduo I:1 apresenta um padrão heterozigoto. FHN: fibroblasto humano

normal; I:1: mãe; I:2: pai; II:4 e II:9: pacientes deficientes

311F 312R

1 2 3 4 27 28 29 30 31 32 33 40 41

.............

627 pb

FHN I:1 I:2 II:9

II:9

I:1

I:2

5´ 3´ (forward)5´3´(reverse)

FHN

311F 312R

1 2 3 4 27 28 29 30 31 32 33 40 41

.............

627 pb

FHN I:1 I:2 II:9

II:9

I:1

I:2

5´ 3´ (forward)5´3´(reverse)

FHN

311F 312R311F 312R

1 2 3 4 27 28 29 30 31 32 33 40 41

.............

627 pb

FHN I:1 I:2 II:9

627 pb

FHN I:1 I:2 II:9

II:9

I:1

I:2

5´ 3´ (forward)5´3´(reverse)

FHN

II:9II:9

I:1I:1

I:2I:2

5´ 3´ (forward)5´3´(reverse)

FHNFHN

4.2. Fluxograma dos resultados

Atividade hemolítica mediada pelas Via

Clássica e Via Alternativa ausente

Proteínas C1, C2, C3, C4,

C6, C7, C8, C9, fI, fH, fB

presentes no soro

C5 ausente no soro dos

indivíduos I;2, II:4, II:5 e II:9

Investigação da proteína ausente

mediante imunodifusão dupla,

imudifusão radial e ELISA

Isolamento do DNA genômico extraído

dos fibroblastos

Amplificação e seqüenciamento do gene C5:

substituição de GAG

31058262

por GAA

correspondente ao último nucleotídeo do éxon 30

Biópsia da pele dos indivíduos C5 deficientes e familiares

Cultura de fibroblastos e Isolamento de

RNA total extraído de fibroblastos

Amplificação e seqüenciamento do cDNA C5: deleção

de 153 nucleotídeos correspondentes ao éxon 30

Sugestão: defeito no splicing de C5 nos pacientes

Confirmação do padrão de herança autossômica

recessiva

Atividade hemolítica mediada pelas Via

Clássica e Via Alternativa ausente

Proteínas C1, C2, C3, C4,

C6, C7, C8, C9, fI, fH, fB

presentes no soro

C5 ausente no soro dos

indivíduos I;2, II:4, II:5 e II:9

Investigação da proteína ausente

mediante imunodifusão dupla,

imudifusão radial e ELISA

Isolamento do DNA genômico extraído

dos fibroblastos

Amplificação e seqüenciamento do gene C5:

substituição de GAG

31058262

por GAA

correspondente ao último nucleotídeo do éxon 30

Biópsia da pele dos indivíduos C5 deficientes e familiares

Cultura de fibroblastos e Isolamento de

RNA total extraído de fibroblastos

Amplificação e seqüenciamento do cDNA C5: deleção

de 153 nucleotídeos correspondentes ao éxon 30

Sugestão: defeito no splicing de C5 nos pacientes

Confirmação do padrão de herança autossômica

recessiva

V. DISCUSSÃO

A deficiência da proteína C5 (C5D) é rara e até hoje 38 casos distribuídos em

21 famílias foram relatados na literatura, dos quais quinze são homens e vinte três mulheres.

Esta deficiência não é exclusiva a uma raça em particular, caucasianos (espanhóis,

escandinavos, franceses, suíços, alemães, marroquinos e por último paquistaneses e turcos) e

afro-americanos podem ser C5D (Tabela 8).

Neste estudo, três (II:4, II:5 e II:9) de nove irmãos de uma família brasileira com

história de consangüinidade apresentaram vários episódios de meningite e infecções

repetitivas, o que sugere a possibilidade de se tratar de deficiência de alguma das proteínas da

via terminal comum do sistema complemento. ROSENFELD et al. (1976); HAENEY et al.

(1980); AYENSA et al. (1985); CESBRON et al. (1985); GIANELLA-BORRADORI et al.

(1990); ASGHAR et al. (1991); SANAL et al. (1992); BOLS et al. (1993); SCHOONBROOD

et al. (1995); DELGADO-CERVIÑO et al. (2005) e PFARR et al. (2005) já haviam

demonstrado que indivíduos deficientes de alguma proteína da via terminal comum falhavam

na indução da atividade hemolítica mediada pela via clássica e pela via alternativa.

Indivíduos deficientes de alguma proteína pertencente à via terminal comum do

sistema complemento geralmente apresentam uma forte tendência a adquirir infecções

piogênicas ocasionadas por bactéria do gênero Neisseria (Tabela 5). Em nosso estudo, cinco

integrantes (I:2, II:4, II:5, II:9 e III:1) pertencentes a uma família com histórico de

consangüinidade sofreram de muitos episódios meningite. O probando II:9 apresentou

meningite em três ocasiões: aos três meses, aos nove meses de idade (internado por 13 dias) e

a os onze anos de idade (internado por 11 dias). Os outros quatro pacientes também sofreram

de meningites em diversas ocasiões.

Para saber as causas dos ataques de meningites nestes pacientes, decidimos por avaliar

a atividade hemolítica mediado pelo sistema complemento em esta família. Os soros dos

pacientes II:4, II:5 e II:9 não foram capazes de ativar nenhuma das duas vias do sistema

complemento (via clássica e a via alternativa). O indivíduo I:2 só apresentou 25% de hemólise

na ativação mediada pela via clássica em quanto que a ativação mediada pela via alternativa

foi normal. O indivíduo III:1 apresenta uma boa ativação do sistema complemento apesar de

haver tido meningite em uma ocasião (APH: 141,6 e CPH: 108,9%), sugerindo que quadro de

meningites pode haver-se desenvolvido por outras causas não relacionadas ao sistema

complemento.

Para saber que proteína da via terminal comum esta faltando, decidimos pela técnica

de imunodifusão dupla, observando que as proteínas (C5, C6, C7, C8 e C9) encontram-se

presentes em níveis expressivos em todos os membros da família, com exceção dos

indivíduos II:4, II:5 e II:9 que não expressam C5 no soro.

SNYDERMAN et al. (1979); HAENEY et al. (1980); PETER et al. (1981);

CESBRON et al. (1985); HILDENHAGEN & BITTER-SUERMANN (1985); NIELSEN &

KOCH (1987); ROSEN et al. (1988); FIJEN et al. (1989); GIANELLA-BORRADORI et al.

(1990); SANAL et al. 1992; BOLS et al. (1993); CHAUDHURI et al. (1994); PFARR et al.

(2005); DELGADO CERVIÑO et al. (2005) encontraram que os pacientes C5D apresentavam

maior suscetibilidade a infecções respiratórias, infecções na pele, otites, febre e vômito, além

das infecções redicivantes graves causadas por bactérias do gênero Neisseria, incluindo

Neisseria meningitidis e Neisseria gonorreia. Confirmando este achado o paciente II:9

apresentou também um episódio de otite e infecções por pneumococos.

Em alguns casos, esta deficiência está associada a outros sinais clínicos. ASGHAR et

al. (1991) avaliaram uma paciente de 29 anos C5D que apresentava alopecia,

hipopigmentação no couro cabeludo, crostas e eritema. Após análise histopatológica,

observou-se atrofia da epiderme e lâmina basal, acompanhada por desenvolvimento de lúpus

eritematoso discoidal. Em outro trabalho, SCOONBROOD et al. (1995) relataram um

indivíduo homozigoto C5D que apresentava anti-SSA, (anticorpos específicos para a

síndrome primária de Sjögren), mas, como no caso anterior, faltam muitos estudos para

esclarecer se esta associação é casual ou não.

O grupo de pesquisa de GIANELLA-BORRADORI et al. (1990) mostrou pela

primeira vez a deficiência completa de C5 combinada com deficiência parcial de C4 em uma

família suíça. Os soros destes irmãos não apresentaram atividade dependente da via clássica

ou da via alternativa, mas ao adicionarem C5 purificado, a atividade mediada pela via

alternativa foi completamente restaurada.

Na avaliação das outras proteínas do sistema complemento, encontramos que as

proteínas C4, Fator H e Fator I estão presentes em concentrações relativamente normais nos

soros dos indivíduos avaliados desta família, com exceção do probando II:9 e do familiar III:2

que, comparando com o resto da família, apresentam concentrações reduzidas do componente

C4: 284 e 219 µg/mL respectivamente (limite de normalidade 450-600 µg/mL – FERRIANI

et al. 1999). Mesmo quando esta baixa concentração de C4 foi encontrada no indivíduo III:2

(129 µg/mL), ela foi suficiente para induzir uma adequada atividade hemolítica mediada pela

via clássica (porcentagem de lise: 106,2).

As concentrações de Fator B nos indivíduos (II:7, II:8, III:2, III:3, III:4, III:5 e III:6)

estão em concentrações reduzidas: 140, 183, 150, 125, 149, 111 e 134 µg/mL respectivamente

(intervalo de normalidade em adultos 200-210 µg/mL e em crianças- 185-513 µg/mL-

FERRIANI et al., 1999) o que poderia explicar a baixa atividade hemolítica mediada pela via

alternativa nestes pacientes foi de 89,9%; 92,5%; 78,4%; 69,4%; 52,9% e 74,2%

respectivamente, o indivíduo III:6 não foi avaliado (intervalo de normalidade ao rango de

95% para a ativação da via alternativa é de 71-171%). Estudos futuros deverão ser feitos para

melhor definir se estes pacientes apresentam deficiência parcial de Fator B. Uma

possibilidade a ser considerada é que esta diminuição na concentração desta proteína deve-se

a uma condição de heterozigose em um dos alelos do Fator B que precisaria ainda ser

confirmada.

A técnica de imunodifusão radial serve para determinar a concentração de proteínas

que se encontram em grandes quantidades no soro. Não podemos determinar a concentração

da proteína C5 por esta técnica, já que C5 encontra-se em concentrações bastante reduzidas no

soro de indivíduos brasileiros (45-190 µg/mL). Para solucionar este problema utilizamos uma

técnica de alta sensibilidade (ELISA), onde constatamos que o soro da mãe (I:1) e do pai (I:2)

apresentam respectivamente 21 e 68 µg/mL de C5 no soro. Os filhos II:4, II:5 e II:9 (pacientes

deficientes) apresentam uma concentração bastante reduzida do componente C5 no soro: 1,3;

0,9 e 1,0 µg/mL respectivamente.

O soro dos irmãos saudáveis dos probandos II:3, II:7 e II:8 apresentaram

concentrações da proteína C5 (64, 67 e 54 µg/mL) dentro do limite de normalidade para

indivíduos brasileros (45-190 µg/mL), sugestivo de um padrão heterozigoto. Os indivíduos da

terçera geração dessa família: III:2 (filha do probando II:4) e III:3, III:4, III:5 e III:6 (filhos do

probando II:5) apresentam baixa concentração de C5 sérica. Neste caso, estes indivíduos C5D

tiveram filhos com parceiros normais (C5 suficientes). A expressão de apenas ~50% da

proteína C5 no soro destes indivíduos é suficiente para establecer a atividade da via clássica e

alternativa em patamares próximos ao normal.

Como GARRED et al. (1990) mostraram pela primeira vez que fibroblastos humanos

produzem proteínas da via terminal comum do sistema complemento (C5, C6, C7, C8 e C9),

usamos estas células como fonte de RNA do gene C5, para estudar as causas moleculares

dessa deficiência. Mesmo considerando que os hepatócitos são o local principal de síntese de

C5 (COLTEN et al., 1972; GENG et al., 1986), a utilização de fibroblastos como fonte de C5

foi conveniente pela sua acessibilidade, já que seu isolamento (feito a partir de biópsias de

pele retiradas dos probandos, familiares e indivíduos normais usados como controle), cultivo

e manutenção dos repliques dessa célula é relativamente fácil. Nós corroboramos os estudos

feitos por GARRED et al. (1990), confirmando a síntese de C5 por estas células.

Até o momento, só três estudos moleculares da deficiência da proteína C5 foram

publicados. O primeiro caso descrito por WANG et al. (1995) estudou as causas moleculares

da deficiência da proteína C5 em 3 famílias. A primeira família previamente estudada por

ROSENFELD et al. (1976) descreveu uma substituição de C

4521

AG para T

4521

AG no éxon 36

que criava um códon de parada prematura na cadeia α, no lugar da Arg encontrada em

indivíduos normais. Na segunda família C5D, previamente estudada por PETER et al. (1981),

os autores encontraram uma substituição no éxon 1 de C

AG para T

AG. Esta substituição

também cria um códon de parada prematura. Além disso, observou que os todos os indivíduos

estudados apresentavam uma condição heterozigota (deleção de 710 pb no éxon 1 na primeira

e segunda família e uma deleção do 1010 pb no éxon 36 na terceira família).

Num segundo estudo DELGADO-CERVIÑO et al. (2005) encontraram uma deleção e

substituição no éxon 40 de C

4884

-4885

-4886

por G

4884

4885

em uma família de origem

espanhola. Esta mutação também gerou um códon de parada prematura neste mesmo éxon.

PFARR et al. (2005) mostraram que o gene C5 de um menino pakistanês apresentava

substituição no éxon 10 de A

1115

a G

1115

que prediz a substituição de uma K

372

por uma R

372

Esta alteração (presente só em um dos dois alelos) provoca a diminuição da concentração de

C5 no soro dos familiares. Mas no indivíduo deficiente esta alteração encontra-se nos dois

alelos o que anula a presença de C5 no soro deste probando. Além disso, após

seqüenciamento do cDNA de C5 do probando se confirmou a ausência do éxon 10 (116 pb)

que causou uma mudança no quadro de leitura e a criação de um códon de parada prematura.

O seqüenciamento também provou que a substituição de A

1115

por G

1115

no final do éxon 10

encontra-se dentro de uma região ESE (exonic splicing enhancers) que influenciava a

exclusão do éxon 10 no momento da tradução.

Na Figura 15 observamos a presença de três transcritos de cDNA de C5 em todos os

membros da família localizados entre o nucleotídeo 45 ao nucleotídeo 587. CARNEY et al.

(1991) demostraram a presença de três transcritos do gene C5 em humanos que se formam

dependendo do splicing alternativo. O transcrito completo (Figura 5) de 5818 nucleotídeos

que dara origem à proteína C5 formada pelas duas cadeias α(115 kDa) β(75 kDa). O transcrito

truncado pHC5A (Figura 4) que compreende a região que vai do éxon 1 ao éxon 21a (2946

aa). O transcrito pHC5B (Figura 4) que compreende a região que vai do éxon 1 ao éxon 16

(2071 aa).

Numa primeira etapa, comparamos as seqüências do cDNA de C5 de nossos

indivíduos deficientes e familiares com as seqüências do cDNA de C5 depositadas no

genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov) que corresponde à seqüencia de acesso: NM_001735,

versão: NM_001735.2 GI:38016946, definição: Homo sapiens complement component 5

(C5), mRNA. No seqüenciamento completo do cDNA C5 da família C5D, encontramos que o

pai (I:2) e os filhos (II:4, II:5 e II:9) não expressãm o éxon 30 (Figura 17). A mãe (I:1)

apresenta dois produtos, o primeiro que mostra o cDNA C5 completo já mostrado por

HAVILAND et al. (1991) e o segundo que mostra o cDNA de C5 que carece do éxon 30

(Figura 17).

A falta do éxon 30 no cDNA dos indivíduos I:1, I:2 e II:9 gerou a seguinte pergunta: a

deficiência de C5 seria causada por exclusão do éxon 30 no gene C5 ou por mutações que

causariam os defeitos no splicing durante a formação do RNAm de C5?. Quando os éxon 29 –

31 e respectivos íntrons foram amplificados e seqüenciados partir do gene C5 dos indivíduos

deficiêntes, observamos a substituição de uma GAG

por uma GAA na posição 31058262,

correspondente ao último nucleotídeo do éxon 30 no cDNA. O seqüenciamento da mãe (I:1)

apresenta os dois transcritos (padrão heterozigoto) o GAG

encontrado no último códon de

todos os indivíduos C5 suficientes e o GAA encontrado em todos os indivíduos avaliados

desta família C5 deficiente, confirmando que os indivíduos desta família C5D têm um

problema no splicing do RNAm de C5.

Existem seqüências consenso nos límites éxon - íntron nos pré-RNAm de eucariotes

(Figura 21). Os nucleotídeos mais conservados nos introns nucleares são os dois primeiros e

os dois últimos nucleotídeos da extremidade 5’ e 3’ (GU e AG respectivamente). No éxon as

regiões mais conservadas são G 3’ (55%) e A e G 5’ (67 e 77% respectivamente). CARNEY

et al. (1991) confirmaram esta regra no íntrons do gene C5. No caso dos éxons que forman

parte do gene C5 a freqüência de ocorrência é de G na extremidade 3’ (44%) a A e G na

extremidade 5’ ( 58,5 e 78%, respectivamente).

Figura 21. Freqüência de ocorrência (%) das bases próximas a junção éxon-íntron. As

posições mais conservadas (100%) são as extremidades 5’ e 3’ do íntron (regra GU-AG). Há

uma região de aproximadamente 15 nucleotídeos rica em pirimidinas (Py). A adenina (A)

conservada anterior à região rica em Py é o sitio de ramificação da estrutura do laço formada

após a excisão do íntron.

O processo químico do splicing consiste em duas transesterificações (Figura 22). A

primeira transesterificação ocurre quando o grupo hidroxila da A (punto de ramificação)

promove um ataque nucleofílico ao fosfato de ligação fosfodiéster entre o último nucleotídeo

do éxon 1 e o intron próximo, rompendo a ligação éxon – íntron e formando um laço (Figura

23 a), o grupo 3’ OH livre no éxon 1 (b) ataca o fosfato da ligação fosfodiéster entre o último

nucleotídeo do intron a ser excisado e o primeiro nucleotídeo do éxon 2, ligando-se os dois

éxons (segunda transesterificação), o íntron removido é degradado.

G U A A G U A Py ... Py N C A G A G GPy ... Py

67 77 100 100 60 74 84 50 100 63-91 78 100 100 55 %

éxon íntron éxon

3’ 5’ 3’ 5’

G U A A G U A Py ... Py N C A G A G GPy ... Py

67 77 100 100 60 74 84 50 100 63-91 78 100 100 55 %

G U A A G U A Py ... Py N C A G A G GPy ... Py

67 77 100 100 60 74 84 50 100 63-91 78 100 100 55 %

éxon íntron éxon

3’ 5’ 3’ 5’

Figura 22. Mecanismo geral de splicing nuclear e de grupo II. O splicing de éxons no pré-

RNAm ocurre através de duas reações de transesterificação (adaptado da tese de doutorado de

SAKABE, 2006).

Existem três tipos de introns: os íntron de splicing nuclear, os de grupo I e grupo II. Os

introns de grupo I e II são os chamados auto-catalíticos não requerem de nenhuma maquinaria

enzimática para a remoção dos intróns “spliceossomo” e os introns de splicing nucleares que

requerem do “spliceossomo” para a sua remoção. O spliceossomo é encontrado no nucleo das

células eucarióticas, processa os íntrons flanqueados por GT...AG. Este spliceossomo é

composto por cinco pequenas ribonucleoproteínas nucleares – snRNPs (U1, U2, U4, U5 e U6)

que se ligam a seqüências específicas no íntron. Embora o spliceossomo seja montado durante

éxon 1 éxon 2

G T

A GA

íntron

Sítio de

splicing 5’

Sítio de

splicing 3’

Ponto de

ramificação

éxon 1 éxon 2

A GA

éxon 1 éxon 2

A GA

éxon 1 éxon2

A GA

Íntron excisado

éxon ligados

segunda transesterificação

éxon 1 éxon 2

G T

A GA

primeira transesterificação

éxon 1 éxon 2

G T

A GA

íntron

Sítio de

splicing 5’

Sítio de

splicing 3’

Ponto de

ramificação

éxon 1 éxon 2

G T

A GA

íntron

Sítio de

splicing 5’

Sítio de

splicing 3’

Ponto de

ramificação

éxon 1 éxon 2

A GA

éxon 1 éxon 2

A GA

éxon 1 éxon2

A GA

Íntron excisado

éxon ligados

segunda transesterificação

éxon 1 éxon 2

G T

A GA

primeira transesterificação

éxon 1 éxon 2

A GA

éxon 1 éxon 2

A GA

éxon 1 éxon 2

A GA

éxon 1 éxon 2

A GA

éxon 1 éxon2

A GA

Íntron excisado

éxon ligados

éxon 1 éxon2

A GA

Íntron excisado

éxon ligados

segunda transesterificação

éxon 1 éxon 2

G T

A GA

primeira transesterificação

éxon 1 éxon 2

G T

A GA

primeira transesterificação

a síntese de RNA, geralmente o íntron não é removido até que a transcrição tenha acabado. O

spliceossomo impide que o éxon 1 afaste-se do éxon 2 após a primeira clivagem. Numa

primeira etapa U1 liga-se à região 5’ GU. O reconhecimento do sítio 3’ (ponte de ramificação

+ Py + AG) se da pela ligação U2AF e pela ligação U2 no ponto de ramificação. O próximo

passo é a ligação de U4/U6 e U5 ao complexo U1/U2, na seguinte etapa U1 desliga-se da

região 5’ GU, esta região interage com U6, desfazendo o pareamento U4/U6 e formando-se o

pareamento U6/U2. O complexo restante (U2/U5/U6) é responsável pelas transesterificações.

Pelo tamanho deste complexo um RNAm completamente processado deixa o núcleo. Segundo

SAKABE (2006), pg 40, o modelo descrito acima foi baseado em estudos realizados em

levadura ou em mini genes artificiales de metazoários contendo apenas um pequeno intron e

sítios de splicing fortes [...]. Na maioria de eucariotos os íntrons são maiores que os exons

sendo difícil uma comunicação U1/U2 e conseqüente formação do spliceossomo, por isso se

propõe-se que o reconhecimento dos sítios do splicing ocorra através do exon.

Figura 23. Reconhecimentos dos sítios do splicing através do éxon, proposto por

ROBBERSON et al. (1990). As setas curvadas indican interações entre U1 e U2

éxon 1 éxon2 éxon 3

éxon 1 éxon2 éxon 3éxon 1 éxon2 éxon 3

No gene C5 os íntrons são maiores que os éxons, o tamanho do íntron varia de 116 a

5600 nucleotídeos (íntron 35 e íntron 25 respectivamente) e o tamanho do éxon varia de 58 a

531 nucleotídeos (éxon 33 e éxon 41 respectivamente). Então o mecanismo de splicing dos

íntrons C5 cumpre os requisitos mencionados acima CARNEY et al. (1991).

De acordo com os resultados obtidos na imunodifussão dupla e no Western blot (dados

não mostrados) o pae deveria ter um mecanismo de degradação protéica de C5 diferente a do

observado nos filhos deficientes (II:4, II:5 e II:9). Sabe-se que toda a família contém a mesma

deleção (éxon 30), mas algo deve acontecer com o pai para que ele expresse C5 em níveis

séricos baixos, mas claramente superiores aos filhos deficientes.

Até o momento, a literatura reporta só três estudos moleculares da deficiência C5 e

nenhuma deles descreveu o tipo de mutação no gene C5 aqui relatado. A substituição deste

nucleotídeo no éxon 30 (GAA) a nosso entender é o responsável pela falha no splicing do

éxon 30 e conseqüente producção da proteína incompleta nestes pacientes. Nós apresentamos

o quarto estudo molecular da deficiência de C5 encontrada pela primeira vez em uma família

brasileira com histórico de consangüinidade. Os baixos níveis de C5 nos soros dos deficientes

estão associados a maior susceptibilidade a infecções, confirmada pelo elevado número de

episódios de meningite, descritos nesta família. Nossos resultados também reafirmam a

importância do componente C5 e da completa ativação do sistema complemento para a

eliminação de patógenos como Neisseria meningitidis.

VI CONCLUSÕES

1. Indivíduos deficientes da proteína C5 sofrem de infecções bacteriais causadas por

bactérias do gênero Neisseria sp.

2. A falta de atividade hemolítica mediada pela via clássica e pela via alternativa nos

indivíduos II:4, II:5 e II:6 deve-se à ausência da proteína C5 no soro dos pacientes

deficientes.

3. No éxon 4 do cDNA do indivíduo II:9 a substituição silenciosa de uma ACC

498

por

uma ACT

498

foi encontrada.

4. O cDNA de C5 dos indivíduos I:1, I:2, II:4 e II:9 apresenta a deleção do éxon 30.

Causada pela substituição de GAG

4028

por GAA

4028

no último nucleotídeo deste éxon

no gene C5 que leva a um erro no splicing.

5. A mãe (I:2) apresentou um padrão heterozigoto.

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