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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
CAMPUS CURITIBA
GERÊNCIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA
ELÉTRICA E INFORMÁTICA INDUSTRIAL - CPGEI
JAQUELINE KAPPKE
ESTUDO DOS DANOS PROVOCADOS PELA
RADIAÇÃO GAMA EM CÉLULAS DE E. coli
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
CURITIBA
FEVEREIRO - 2007
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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica e Informática Industrial
DISSERTAÇÃO
apresentada à UTFPR
para a obtenção do grau de
MESTRE EM CIÊNCIAS
por
JAQUELINE KAPPKE
ESTUDO DOS DANOS PROVOCADOS PELA RADIAÇÃO
GAMA EM CÉLULAS DE E. coli
Banca examinadora:
Presidente e Orientador:
PROF. DR. HUGO REUTERS SCHELIN UTFPR
Examinadores:
PROF. DR. EDGAR FRANCISCO OLIVEIRA DE JESUS
UFRJ
PROF. DRA. EDILSA ROSA DA SILVA UTFPR
PROF. DR. SERGEI A. PASCHUK UTFPR
Curitiba, março de 2007
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JAQUELINE KAPPKE
ESTUDO DOS DANOS PROVOCADOS PELA RADIAÇÃO GAMA EM
CÉLULAS DE E. coli
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Elétrica e Informática
Industrial da Universidade Tecnológica Federal do
Paraná, como requisito parcial para a obtenção do
grau de “Mestre em Ciências” – Área de
concentração: Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Hugo Reuters Schelin
Co-orientadora: Profa. Dra. Edilsa Rosa da Silva
Curitiba
2007
i
AGRADECIMENTOS
• Prof. Dr. Hugo Reuters Schelin e a Profa. Dra. Edilsa Rosa da Silva pela
orientação na execução desse trabalho.
• Prof. Dr. Sergei A. Paschuk que acompanhou e ajudou na execução dos
experimentos.
• Profa. Msc. Marlene Soares pelo apoio na execução dos trabalhos no
laboratório de microbiologia.
• Prof. Dr. Edgar de Jesus, que proporcionou a utilização dos equipamentos
do COPPE – UFRJ, pelo apoio e confiança.
• À equipe do Instituto de Física da USP – Pelletron que proporcionaram a
incialização de trabalhos na área dentro do Pelletron.
• A todos que estiveram ao meu lado durante a execução do projeto.
• E a Deus que deu forças pra começar, continuar e terminar esse trabalho.
ii
iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................... v
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS......................................................................... ix
RESUMO............................................................................................................................. x
ABSTRACT.......................................................................................................................... xi
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1 MOTIVAÇÕES ......................................................................................................... 1
1.2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 2
1.3 ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO......................................................................... 3
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.................................................................................... 4
2.1 TÓPICOS TEÓRICOS .............................................................................................. 4
2.1.2 Radiação como um agente mutagênico............................................................... 5
2.1.2.1 Irradiação de microrganismos...................................................................... 8
2.1.2.2 Mecanismo do efeito biológico das radiações ........................................... 10
2.1.3 Mutações........................................................................................................... 12
2.1.3.1 Freqüência de Mutação.............................................................................. 14
2.1.4 Taxa de morte microbiana ................................................................................ 14
2.1.5 Avaliação das características dos microrganismos........................................... 15
2.2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 17
3 METODOLOGIA........................................................................................................... 26
3.1 PRIMEIRA IRRADIAÇÃO .................................................................................... 26
3.1.1 Preparo das amostras......................................................................................... 26
3.1.2 Irradiação das amostras de E. coli..................................................................... 26
3.1.3 Parâmetros utilizados na avaliação do efeito da irradiação nas células............ 27
3.1.3.1 Curva de sobrevivência dos microrganismos irradiados ........................... 27
3.1.3.2 Análise morfológica dos microrganismos ................................................. 28
3.1.3.3 Análise fisiológica dos microrganismos .................................................... 28
3.2 SEGUNDA IRRADIÇÃO ....................................................................................... 31
3.2.1 Preparo das amostras......................................................................................... 31
3.2.2 Irradiação das amostras de E. coli..................................................................... 32
3.2.3 Parâmetros utilizados na avaliação dos efeitos da irradiação sobre células ..... 32
3.2.3.1 Curva de sobrevivência dos microrganismos irradiados ........................... 32
3.2.3.2 Análise morfológica dos microrganismos irradiados ................................ 32
3.2.3.3 Análise fisiológica dos microrganismos .................................................... 32
3.2.3.4 Análise da resistência dos microrganismos a antibióticos......................... 35
3.2.3.5 Isolamento de mutantes auxotróficos......................................................... 36
3.3 TERCEIRA IRRADIAÇÃO.................................................................................... 36
3.3.1 Preparo das amostras......................................................................................... 36
3.3.2 Irradiação das amostras de E. coli..................................................................... 37
iv
3.3.3 Parâmetros utilizados na avaliação dos efeitos da irradiação sobre células ..... 37
3.3.3.1 Curva de sobrevivência dos microrganismos irradiados ........................... 37
3.3.3.2 Análise morfológica dos microrganismos irradiados ................................ 37
3.3.3.3 Análise fisiológica dos microrganismos .................................................... 37
3.3.3.4 Análise da resistência dos microrganismos a antibióticos......................... 38
3.3.3.5 Isolamento de mutantes auxotróficos......................................................... 38
4 RESULTADOS............................................................................................................... 39
4.1 RESULTADOS OBTIDOS COM A PRIMEIRA IRRADIAÇÃO......................... 39
4.1.1 Determinação da fração de sobrevivência ........................................................ 39
4.1.2 Características macroscópicas das colônias...................................................... 40
4.1.3 Características microscópicas ........................................................................... 40
4.1.4 Estudo da atividade metabólica da E. coli irradiada com raios gama............... 41
4.2 RESULTADOS OBTIDOS COM A SEGUNDA IRRADIAÇÃO......................... 43
4.2.1 Determinação da fração de sobrevivência ........................................................ 43
4.2.2 Características macroscópicas das colônias...................................................... 44
4.2.3 Características microscópicas ........................................................................... 44
4.2.4 Estudo da atividade metabólica da E. coli irradiada com raios gama.............. 44
4.2.5 Análise da resistência das E. coli a antibióticos ............................................... 47
4.2.6 Isolamento de mutantes auxotróficos................................................................ 48
4.3 RESULTADOS OBTIDOS COM A TERCEIRA IRRADIAÇÃO......................... 51
4.3.1 Determinação da fração de sobrevivência ........................................................ 51
4.3.2 Características macroscópicas das colônias...................................................... 51
4.3.3 Características microscópicas ........................................................................... 51
4.3.4 Estudo da atividade metabólica da E. coli irradiada com raios gama.............. 52
4.3.5 Análise da resistência das E. coli a antibióticos ............................................... 54
4.3.6 Isolamento de mutantes auxotróficos................................................................ 56
5 DISCUSSÃO .................................................................................................................. 59
5.1 PRIMEIRA IRRADIAÇÃO .................................................................................... 59
5.2 SEGUNDA IRRADIAÇÃO .................................................................................... 60
5.3 TERCEIRA IRRADIAÇÃO.................................................................................... 64
5.4 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 65
5.5 TRABALHOS FUTUROS ...................................................................................... 66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................... 67
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Irradiador Gammacell Excel (GC-220E) com as amostras posicionadas para a
irradiação............................................................................................................................ 27
Figura 2: Curva da fração de sobrevivência celular para E. coli (ATCC25922) irradiada
com feixe de raios gama. ................................................................................................... 40
Figura 3: Curva de sobrevivência celular para E. coli irradiada com feixe de raios gama.44
Figura 4: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
não inoculados. .................................................................................................................. 45
Figura 5: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
inoculados com a E. coli não irradiada. ............................................................................. 46
Figura 6: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
inoculados com a E. coli irradiada com 30 Gy de raios gama........................................... 46
Figura 7: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
inoculados com a E. coli irradiada com 60 Gy de raios gama........................................... 46
Figura 8: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
inoculados com a E. coli irradiada com 90 Gy de raios gama........................................... 46
Figura 9: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
inoculados com a E. coli irradiada com 120 Gy de raios gama......................................... 46
Figura 10: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
inoculados com a E. coli irradiada com 150 Gy de raios gama......................................... 47
Figura 11: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
inoculados com a E. coli irradiada com 180 Gy de raios gama......................................... 47
Figura 12: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose
inoculados com a E. coli irradiada com 210 Gy de raios gama......................................... 47
Figura 13: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli não
irradiadas............................................................................................................................ 49
Figura 14: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 30 Gy de radiação gama (cobalto-60). ...................................................... 49
Figura 15: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 60 Gy de radiação gama (cobalto-60). ...................................................... 49
Figura 16: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 90 Gy de radiação gama (cobalto-60). ...................................................... 49
Figura 17: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 120 Gy de radiação gama (cobalto-60). .................................................... 50
Figura 18: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 150 Gy de radiação gama (cobalto-60). .................................................... 50
Figura 19: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 180 Gy de radiação gama (cobalto-60). .................................................... 50
Figura 20: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 210 Gy de radiação gama (cobalto-60). .................................................... 50
vi
Figura 21: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados
com a E. coli não irradiada. ............................................................................................... 52
Figura 22: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados
com a E. coli irradiada com 30 Gy de raios gama. ............................................................ 53
Figura 23: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados
com a E. coli irradiada com 60 Gy de raios gama. ............................................................ 53
Figura 24: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados
com a E. coli irradiada com 90 Gy de raios gama. ............................................................ 53
Figura 25: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados
com a E. coli irradiada com 120 Gy de raios gama. .......................................................... 53
Figura 26: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados
com a E. coli irradiada com 150 Gy de raios gama. .......................................................... 53
Figura 27: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli não
irradiadas............................................................................................................................ 54
Figura 28: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 30 Gy de radiação gama (cobalto-60). ...................................................... 55
Figura 29: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 60 Gy de radiação gama (cobalto-60). ...................................................... 55
Figura 30: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 90 Gy de radiação gama (cobalto-60). ...................................................... 55
Figura 31: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 120 Gy de radiação gama (cobalto-60). .................................................... 55
Figura 32: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli
irradiadas com 150 Gy de radiação gama (cobalto-60). .................................................... 56
Figura 33: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli
irradiadas com 120 Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:1, utilizando a técnica
da réplica de Lederberg e Lederberg. ................................................................................ 56
Figura 34: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli
irradiadas com 120 Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:10, utilizando a
técnica da réplica de Lederberg e Lederberg. .................................................................... 57
Figura 35: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli
irradiadas com 150 Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:1, utilizando a técnica
da réplica de Lederberg e Lederberg. ................................................................................ 57
Figura 36: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli
irradiadas com 150 Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:10, utilizando a
técnica da réplica de Lederberg e Lederberg. .................................................................... 57
Figura 37: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli
irradiadas com 150 Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:001, utilizando a
técnica da réplica de de Lederberg e Lederberg. ............................................................... 58
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Doses aproximadas de radiações ionizantes para reduzir em 10
6
populações de
diferentes microrganismos (LEITÃO, HAGLER, HAGLER, et al, 1998).......................... 8
Tabela 2: Etapas da produção do efeito biológico provocado pela exposição à radiação
(TAUHATA, SALATI e DI-PRINZIO, 1998). ................................................................. 11
Tabela 3: Testes bioquímicos para E. coli (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996). ........... 16
Tabela 4: Meios de cultura utilizados para os testes bioquímicos (adaptado de RIBEIRO e
SOARES, 2002; MERCK, 1994)....................................................................................... 29
Tabela 5: Composição e indicação dos meios de cultura utilizados para os testes
bioquímicos (Modificada de: PILONETTO, 2006; RIBEIRO e SOARES, 2002)............ 33
Tabela 6: Relação dos antibióticos utilizados com suas características principais
(TRABULSI, R. L.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O. F., et al, 1999)....................... 35
Tabela 7: Número de microrganismos sobreviventes (UFC/mL) e fração de sobrevivência
em diferentes doses de radiação aplicadas em E. coli no primeiro estudo. ....................... 39
Tabela 8: Resultado dos testes bioquímicos de descarboxilação da L-lisina, meio SIM,
Fermenração da Lactose, Citrato de Simmons, Vermelho de Metila e Vogues Proskauer
para a E. coli cultivada e irradiada em placas.................................................................... 41
Tabela 9: Resultado do testes bioquímicos de Descarboxilação da L-lisina, meio SIM,
Fermentação da Lactose, Citrato de Simmons, Vermelho de Metila e Vogues Proskauer
para a E. coli cultivada e irradiada em tubos. .................................................................... 42
Tabela 10: Resultado do meio EMB para as bactérias irradiadas em placas..................... 42
Tabela 11: Resultado do meio EMB para as bactérias irradiadas em tubos. ..................... 42
Tabela 12: Número de microrganismos sobreviventes (UFC/mL) e fração de
sobrevivência em diferentes doses de radiação aplicadas em E. coli no segundo estudo. 43
Tabela 13: Resultado do testes bioquímicos do mini kit para identificação de
enterobactérias, para as diferentes doses de radiação gama aplicadas em E. coli assim
como na E. coli não irradiada. ........................................................................................... 45
Tabela 14: Tabela mostrando a relação dos tamanhos de halos com a classificação dos
microrganismos em sensível, intermediário ou resistente aos antibióticos. ...................... 48
Tabela 15: Resultado do antibiograma realizado com as células de E. coli irradiadas e não
irradiadas. O número representa o diâmetro do halo em milímetros................................. 48
Tabela 16: Número de microrganismos sobreviventes (UFC/mL) e fração de
sobrevivência em diferentes doses de radiação aplicadas em E. coli no terceiro estudo... 51
Tabela 17: Resultado do testes bioquímicos do mini kit para identificação de
enterobactérias, para as diferentes doses de radiação gama aplicadas em E. coli assim
como na E. coli não irradiada. ........................................................................................... 52
Tabela 18: Resultado do antibiograma realizado com as bactérias irradiadas e não
irradiadas. O número representa o diâmetro do halo em milímetros................................. 54
viii
Tabela 19: Resultado do isolamento de mutantes auxotróficos realizado com células de E.
coli irradiadas com 120 Gy de radiação gama (cobalto-60). ............................................ 56
Tabela 20: Resultado do isolamento de mutantes auxotróficos realizado com células de E.
coli irradiadas com 150 Gy de radiação gama (cobalto-60). ............................................ 58
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BHI - Caldo de infusão de coração
DNA - Ácido desoxibonucleico
D
10
- dose necessária para reduzir a população a 10% da inicial
Fpg - proteína formamidopirimidina – DNA – glicosilase
FS - Fração de sobrevivência
Gy - Gray, unidade de dose absorvida
ICDH - isocitrato dehidrogenase
LET - tranferência linear de energia
MC - Meio Completo
MIO - Motilidade Indol e Ornitina
MM - Meio Mínimo
mRNA
- RNA (ácido ribonucleico) mensageiro
NADP
- Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
rad - radiation absorbed dose, unidade de dose absorvida
RBE - eficiência radiobilógica relativa
SIM - Motilidade, indol e àcido sulfídrico
TBq - Tesla Bequerel, unidade de atividade radioativa
trp - operon triptofano
UFC - unidades formadoras de colônias
UV - ultravioleta
UVA - ultravioleta A
x
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de alterações em células de
Escherichia coli expostas à radiação gama (cobalto-60). As irradiações foram realizadas
no Laboratório de Instrumentação Nuclear LIN-COPPE da UFRJ e as análises no
Laboratório de Microbiologia do Departamento de Química e Biologia da UTFPR. As
células de E. coli foram irradiadas com doses de 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300,
480, 600 e 750 Gy. Em seguida, as amostras irradiadas e não irradiadas foram analisadas
através de coloração de Gram, testes bioquímicos (EPM, MIO, caldo Lisina, Citrato de
Simmons e caldo Rhamnose), antibiograma e isolamento de mutantes auxotróficos. Foi
observado que para as doses recebidas a E. coli não apresentou alterações morfológicas. O
valor médio de D
10
encontrado foi de 53,9 Gy. Algumas células de E . coli após irradiadas
mostraram-se capazes de desaminar o L-triptofano ou a E. coli alterou
sua sensibilidade aos antibióticos amoxilina e cefalotonina. Também foi verificado o
aparecimento de colônias mutantes auxotróficas após a irradiação.
xi
ABSTRACT
The purpose of the present work was to investigate alterations occurred in
Escherichia coli cells exposed to gamma radiation (
60
Co source). The irradiations were
made at the LIN-COPPE laboratory of the UFRJ and the analysis at the Biology
Department of the UTFPR. The E. coli cells were irradiated with 30, 60, 90, 120, 150,
180, 210, 240, 300, 480, 600 e 750 Gy doses. The samples were analyzed with Gram-
stain, biochemical tests in EPM, MIO and Lysina Broth, Simmons Cytrate Medium and
Rhamnose Broth, antibiogram and isolation of auxotrophic mutants. The D
10
medium
value was 53.9 Gy. It was observed that for the received doses the E. coli didn’t show
morphological alterations in the tests. Some E. coli cells showed to be able to deaminade
the L-tryptophan or they changed their sensibility for amoxilina and cephalotonine after
the irradiation. Also, we verified the existence of auxotrophic mutants after irradiation.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 MOTIVAÇÕES
Com a descoberta dos raios X por Wilhelm Conrad Roentgen, em 1895, esta
radiação ionizante começou a ser amplamente utilizada em medicina diagnóstica. Porém,
apenas três meses depois da primeira publicação de Roentgen sobre sua descoberta,
começaram a ser publicados também estudos referentes aos danos causados pela
exposição aos raios X (EISENBERG, 1992).
Atualmente as radiações ionizantes vêm sendo aplicadas em muitas áreas como a
medicina para diagnóstico e tratamento, a radiologia industrial e também para reduzir a
população de microrganismos em alimentos, materiais hospitalares e cosméticos.
O número de interações e mutações provocadas pelas radiações ionizantes é
proporcional à dose absorvida, mas os efeitos provocados pela interação da radiação
ionizante com os tecidos biológicos depende também do tipo de radiação e do tempo de
exposição, além do estado em que a célula se encontra no seu ciclo celular e da
concentração de oxigênio no meio circulante à radiação (ANDRADE, 2006).
Os microrganismos são bastante utilizados no estudo das mutações, devido ao seu
curto tempo de geração e ao baixo custo de manutenção de grandes populações de
organismos mutantes. A Escherichia coli é uma bactéria relativamente fácil de manipular
e é bastante aplicada em pesquisas em diversas áreas, sendo considerada o “cavalo de
batalha” da biotecnologia atual (BLACK, 2002).
Uma aplicação dos microrganismos bastante estudada atualmente é na
biorremediação de solos contaminados. Ambientes expostos à radiação em testes
nucleares precisam ser recuperados devendo ser encontrado um microrganismo que tenha
a capacidade de sobreviver em condições adversas, como na presença de altas taxas de
dose de radiação (DALY, 2000).
Uma das formas de avaliar o efeito das alterações causadas pela radiação às
células é através de sua taxa de sobrevivência. Neste aspecto os microrganismos
unicelulares constituem um valioso instrumento, pois comparado a outros organismos,
têm estrutura relativamente simples, apresentam um tempo de reprodução reduzido e seu
cultivo e manipulação são relativamente fáceis (BLACK, 2002; BARBOSA E TORRES,
1998).
2
Em um trabalho anterior Kappke (2004) verificou que a E. coli quando irradiada
com diferentes doses de radiação ultravioleta apresentou uma redução na sua
sobrevivência e também modificações na sua morfologia (bastonetes curtos),
apresentando-se como bastonetes alongados.
Quando irradiada com feixe de prótons, não foi possível obter uma curva de
sobrevivência para as células de E. coli por causa de limitações na metodologia utilizada
para o experimento. Apesar disso, foi possível determinar que as células de E. coli
irradiadas com feixe de prótons, mesmo em doses muito pequenas ( 0,2, 0,4, 0,7 e 1,0
Grays) apresentaram alterações na sua morfologia e nas suas características bioquímicas.
Após irradiada com feixe de prótons, a E. coli mostrou-se alongada ao microscópio óptico
e também apresentou perda da capacidade de descarboxilar a L-lisina (KAPPKE, 2004;
KAPPKE, SILVA, SCHELIN, et al, 2005).
1.2 OBJETIVOS
Este trabalho interdisciplinar tem como proposta verificar a ocorrência de
transformações em organismos procariotos representados pela cepa de Escherichia coli
ATCC25922, após a exposição desta à radiação gama gerada por uma fonte de cobalto-
60.
Um dos objetivos específicos do trabalho compreende determinar uma
metodologia de preparação das amostras de E. coli, no Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Química e Biologia (UTFPR) e a irradiação das amostras no irradiador
Gammacell Excel (GC-220E) da Coordenação dos Programas de Pós-graduação de
Engenharia (UFRJ).
Os efeitos da radiação nas amostras biológicas deverão ser avaliados por: 1)
determinação da fração de sobrevivência celular, 2) verificação da presença de alterações
morfológicas microscópicas através de coloração de gram e macroscópicas através das
características das colônias, 3) avaliação dos resultados das provas bioquímicas de EPM,
MIO, caldo Lisina, caldo Rahmnose e citrato de Simmons, 4) comparação da resposta
microbiana aos antibióticos
cefalotonina, ciprofloxacina, amoxilina,
gentamicina, tetraciclina e amicacina, e 5) realização do isolamento de mutantes
auxotróficos.
3
1.3 ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
Esta dissertação está organizada em cinco capítulos. O Capítulo 2 consiste numa
revisão da literatura sobre o microrganismo em estudo, as mutações, os efeitos da
radiação em material biológico e o uso da radiação como agente antimicrobiano. O
Capítulo 3 descreve a metodologia aplicada neste trabalho para irradiação de E. coli com
radiação gama. No Capítulo 4 os resultados obtidos no experimento são relatados e,
finalmente no Capítulo 5 são apresentadas a discussão dos resultados, as conclusões do
trabalho e as propostas de trabalhos futuros.
4
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 TÓPICOS TEÓRICOS
2.1.1 Escherichia coli
Bactérias são definidas como organismos unicelulares, relativamente simples e
muito pequenos, cujo material genético não está envolto por uma membrana nuclear
especial, por esta razão denominadas procariotas (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
A bactéria E. coli é uma habitante normal do intestino grosso de vertebrados,
sendo sua presença benéfica porque ajuda na produção de certas vitaminas e participa na
digestão de alimentos que não seriam digeridos sem sua presença (TORTORA, FUNKE e
CASE, 2000). A E. coli é anaeróbia facultativa, ou seja, na presença de oxigênio
geralmente mantém seu metabolismo aeróbio, mas na falta do mesmo muda para o
metabolismo anaeróbio (BLACK, 2002). Está incluída na família Enterobacteriaceae, faz
parte do grupo dos coliformes por ter a capacidade de fermentar a lactose, geralmente
com a produção de gases, apesar de alguns biotipos fermentarem lentamente este açúcar
(LEITÃO, HAGLER, HAGLER, et al, 1998).
A E. coli é considerada essencial na pesquisa biológica porque fornece indícios de
características metabólicas e genéticas da vida em geral. O fato das bactérias serem
microrganismos procariotos relativamente simples permite certa facilidade na sua
manipulação em laboratório, sendo esse o principal motivo da escolha de se trabalhar com
esse microorganismo (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996).
Black relaciona a importância da E. coli nos seguintes aspectos:
• Está sempre presente entre a microbiota normal do intestino humano;
Encontrá-la na água indica contaminação com material fecal e, possivelmente,
com bactérias entéricas patogênicas;
• Pode ser patogênica por si só; diferentes cepas produzem várias toxinases e
podem causar infecções oportunistas em diferentes partes do corpo;
• É um importante instrumento para a engenharia genética. Importantes produtos
biológicos podem agora ser produzidos através da tecnologia do DNA
recombinante, e a E.coli é freqüentemente a bactéria na qual um novo material
5
genético é introduzido. Conseqüentemente, ela é considerada o “cavalo de
batalha” da biotecnologia atual (BLACK, 2002).
Os microrganismos têm sido muito utilizados no estudo das mutações devido ao
seu curto tempo de geração e ao relativo baixo custo de manutenção de grandes
populações de organismos mutantes. Avanços importantes no entendimento dos
mecanismos genéticos e das vias metabólicas são proporcionados pela comparação entre
microrganismos normais e mutantes (BLACK, 2002).
2.1.2 Radiação como um agente mutagênico
A radiação é um agente mutagênico, bastante letal, sendo um importante método
físico para controle do crescimento microbiano. No espectro de radiações potencialmente
aplicáveis, por exemplo, à preservação dos alimentos, destacam-se aquelas com
comprimento de onda menores que a luz visível e que apresentam um quantum energético
capaz de excitar ou destruir moléculas orgânicas e portanto, com uma ação letal específica
sobre os microrganismos. A radiação UV, não-ionizante, é capaz de excitar as moléculas
nas quais incide, porém existem radiações de maior freqüência, que são capazes de
romper moléculas individuais em partes, com cargas opostas (íons), sendo assim,
denominadas radiações ionizantes como raios gama e raios X (LEITÃO, HAGLER,
HAGLER, et al, 1998).
As radiações ionizantes possuem a capacidade de quebrar as ligações químicas das
moléculas. O produto é, freqüentemente, um radical livre, um átomo, molécula, ou íon
altamente reativo que ataca outras moléculas na célula, inclusive o DNA (BLACK, 2002).
Esta forma de radiação também pode ser letal para microrganismos e vírus. Muitas
bactérias são mortas pela absorbância de 0,3 10
-5
Gy a 0,4 10
-5
Gy de radiação. Os seres
humanos normalmente não adoecem pela radiação, a menos que estejam sujeitos a
exposições maiores que 0,5 Gy (BLACK, 2002).
As radiações ionizantes podem causar ionizações na água produzindo peróxidos,
que são extremamente reativos e podem ser responsáveis por mutações causadas por
radiações ionizantes. Quanto maior a dose de radiação maior é o número de mutantes
induzidos (AZEVEDO, 1998; PIZZIANI-KLEINER, PEREIRA E AZEVEDO, 1998).
A interação das radiações ionizantes com a matéria é um processo que acontece
em nível atômico. Ao atravessarem um material, estas radiações transferem energia para
6
as partículas encontradas em sua trajetória, se a energia dos fótons penetrantes de radiação
ionizante for maior que a energia de ligação entre os elétrons dos átomos pode provocar
quebra de ligações químicas pela formação de íons e elétrons livres. O elétron arrancado
desloca-se no meio impulsionado pela energia cinética adquirida neste processo; estes
elétrons bombardeiam outras moléculas e causam mais lesões, sendo que os íons e
radicais livres resultantes são muito reativos e novos íons podem, assim, serem
produzidos na matéria. O processo é interrompido quando, tendo sua energia dissipada em
interações, os elétrons acabam capturados por moléculas do meio. A introdução de pares
de íons na matéria recebe o nome de ionização (NOAILHETAS; BLACK, 2002;
TAUHATA, SALATI e DI-PRINZIO, 1998).
Ao arrancarem aleatoriamente elétrons das camadas eletrônicas de átomos, as
radiações ionizantes contribuem para romper, mesmo que momentaneamente, o equilíbrio
entre as cargas positivas e negativas do átomo. À introdução de cargas elétricas livres em
um meio irradiado segue-se um rearranjo eletrônico, que pode envolver elétrons de outros
átomos e moléculas, tendo como conseqüência o restabelecimento do equilíbrio perdido.
Quando um átomo perde elétrons toda a estrutura molecular pode ficar comprometida em
função da busca de uma configuração mais estável. Esta busca pode resultar numa perda
de identidade química para a molécula envolvida e na geração de moléculas alteradas
(NOAILHETAS).
Os fótons são radiações muito penetrantes e causam danos biológicos diferentes
conforme a taxa de dose, energia e tipo de irradiação (TAUHATA, SALATI e DI-
PRINZIO, 1998).
As radiações ionizantes caracterizam-se pela sua alta energia e potencial letal em
nível celular. O efeito esterilizante da irradiação está relacionado a sua capacidade de
ionização e, mais especificamente, à energia absorvida pelo material irradiado. Portanto,
radiação pode ser quantificada em termos de “dose de radiação”, que pode ser expressa
em dose absorvida (LEITÃO, HAGLER, HAGLER, et al, 1998).
A dose absorvida é dada nas unidades rad e gray (Gy), a relação entre as duas
unidades é dada na equação 1 (TAUHATA, SALATI e DI-PRINZIO, 1998)
radGy 1001
=
(1)
A teoria-alvo da lesão por radiação presume que partículas ionizantes, ou pacotes
7
de energia passam através ou junto de porções vitais da célula; estes constituem “golpes”.
Um ou alguns golpes podem causar apenas mutações não letais, algumas concebivelmente
úteis. Mais golpes provavelmente causarão mutações o suficiente para matar o
microrganismo (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
Alguns dos íons formados podem se combinar diretamente com bases no DNA,
resultando em erros na replicação e reparo do DNA que produzem mutações. Um
resultado ainda mais sério é a ruptura de ligações covalentes no esqueleto de açúcar-
fosfato do DNA, que causa rupturas físicas nos cromossomos (BLACK, 2002;
TAUHATA, SALATI e DI-PRINZIO, 1998; BERNARDO, DE OLIVEIRA, DA SILVA,
et al, 2002).
A radiação ionizante pode afetar o DNA diretamente, pela deposição de energia na
macromolécula, ou indiretamente, pela deposição de energia na água circundante com a
formação de radicais primários, incluindo íons de hidrogênio (H
-
), radicais hidroxila
(OH
-
), e elétrons livres (Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997).
A energia dos fótons de radiação pode também interagir com a molécula de água
que é abundante em um organismo biológico e participa praticamente de todas as reações
metabólicas em um organismo. As moléculas de água são atingidas pela radiação em
maior número e sofrem radiólise. Após a ionização da água segue-se um rearranjo
eletrônico e existe possibilidade de produção de radicais livres, que são moléculas
altamente reativas. Os radicais livres mais importantes formados no processos de radiólise
da água são o radical hidroxila (OH
-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e o radical
superóxido (O
2
-
). Estes radicais reagem com os componentes orgânicos celulares,
especialmente o DNA (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000; NOUAILHETAS;
BERNARDO, DE OLIVEIRA, DA SILVA, et al, 2002).
O radical OH
-
é o mais importante, eles são formados na hidratação da camada ao
redor da molécula de DNA sendo responsáveis por 90% dos danos. Assim, o efeito
indireto da radiação é bastante importante nas células vivas (Joint FAQ/IAEA/WHO
Study Group, 1997).
A morte dos microrganismos é conseqüência da ação ionizante desta irradiação;
estudos têm indicado que danos letais ao DNA, afetando a capacidade de multiplicação,
são de suma importância, embora danos a outras moléculas sensíveis, especialmente na
membrana, mereçam destaque na explicação do efeito letal (LEITÃO, HAGLER,
HAGLER, et al, 1998).
A irradiação é um processo tecnológico utilizado no tratamento de resíduos e
8
redução de poluentes e está dentro do grupo de tecnologia denominado Processos
Oxidativos Avançados. Este grupo engloba os processos de oxidação em que radicais
hidroxila são gerados para atuar como agentes oxidantes químicos, e devido à alta
reatividade desses radicais, podem reagir com uma grande variedade de compostos
orgânicos (DANIEL, BRANDÃO, GUIMARÃES, et al, 2001).
A radiação ionizante é utilizada para esterilizar equipamentos plásticos de
laboratório, equipamentos médicos e produtos farmacêuticos. Em doses de 1,0 a 2,5 kGy,
conserva-se carne de gado e de aves; e ainda, em doses de 2,0 a 3,0 kGy, preserva as
frutas. Muitos consumidores nos Estados Unidos rejeitam os produtos irradiados por
medo de receberem radiação, mas tais alimentos são completamente seguros – livres tanto
de patógenos quanto de radiação (BLACK, 2002).
2.1.2.1 Irradiação de microrganismos
O comportamento dos microrganismos frente às radiações ionizantes é variável; as
bactérias Gram negativas, incluindo deterioradoras patogênicas, são mais sensíveis que as
Gram positivas. Os esporos bacterianos são ainda mais resistentes à radiação, ao passo
que os bolores demonstram um comportamento similar ao das células vegetativas de
bactérias; mas as leveduras são mais tolerantes à irradiação do que os bolores (LEITÃO,
HAGLER, HAGLER, et al, 1998).
A presença de microrganismos patogênicos representa o maior perigo nos
alimentos (Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997). A Tabela 1 mostra alguns dados
sobre a resistência de vários microrganismos à radiação ionizante (LEITÃO, HAGLER,
HAGLER, et al, 1998).
Tabela 1: Doses aproximadas de radiações ionizantes para reduzir em 10
6
populações de diferentes
microrganismos (LEITÃO, HAGLER, HAGLER, et al, 1998).
Microrganismos Dose (kGy)
Escherichia coli 0,5 – 3,0
Pseudomonas aeruginosa 1,5 – 2,0
Bacilus cereus 20 – 30
Staphylococcus aureus 0,5 – 20
Aspergillus niger 3,0 – 5,0
Saccharomyces cerevisiae 7,5 – 10
9
Os efeitos biológicos da radiação ionizante em microrganismos podem ocorrer por
interações com componentes críticos das células ou através de interações indiretas em
alvos que formam outras moléculas através da radiólise, principalmente radicais formados
da água (Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997).
A resposta das células microbianas à radiação ionizante depende (Joint
FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997):
• da qualidade e da quantidade dos danos diretos produzidos;
• do número, da qualidade e do tempo de vida das espécies químicas geradas da
radiação e da habilidade inerente da célula em tolerar o dano radioinduzido ou
repará-lo acuradamente;
• da influência dos meios intra e extracelulares nos fatores acima.
A radiação ionizante é capaz de causar uma variedade de mudanças químicas nos
microrganismos. Geralmente, assume-se que o DNA é o alvo mais crítico da radiação
ionizante e que a inativação dos microrganismos pela radiação ionizante é resultado do
dano causado ao DNA (Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997).
Os fatores do meio extracelular que mais influenciam na sobrevivência das células
irradiadas são (Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997):
• Temperatura - tratamentos com temperaturas elevadas, geralmente alcançando
45°C, agem simultaneamente com os efeitos bactericidas da radiação ionizante
nas células vegetativas. Isso ocorre por causa dos sistemas de reparo que
normalmente operam bem em temperaturas ambientes e são danificados em
temperaturas muito altas;
• Qualidade do meio gasoso - a presença de oxigênio aumenta os efeitos letais
da radiação ionizante em células microbianas;
• Atividade de água - os microrganismos são muito mais sensíveis em meios
mais úmidos quando o meio de suspensão é parcial ou totalmente hidratado.
Em condições de baixa umidade, os produtos dos radicais livres da radiólise da
água são muito menores e a quantidade de efeitos indiretos no DNA que eles
podem gerar diminuem;
• Composição química do alimento e pH - na parte dos efeitos da radiação
devido à ação indireta mediada por radicais, a qualidade do meio no qual os
microrganismos estão é um importante fator na determinação da dose
requerida para um efeito microbicida.
10
Pode-se afirmar que, assim como no caso de células danificadas pela radiação, os
microrganismos que sobrevivem à radiação provavelmente se tornarão mais sensíveis às
condições do meio (temperatura, pH, nutriente, inibidores) que as células não irradiadas
(Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997).
A resistência à radiação varia de acordo com o microrganismo podendo haver
diferenças na resistência inerente de espécie para espécie, e também para diferentes cepas
da mesma espécie. Diferenças na sensibilidade a radiação dentro de grupos de
microrganismos similares estão relacionados com diferenças em suas estruturas químicas
e físicas, bem como em sua habilidade de recuperação dos danos causados pela radiação
(Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997).
2.1.2.2 Mecanismo do efeito biológico das radiações
Uma série de eventos ocorre quando um sistema biológico é atingido por emissões
radioativas, esses eventos são descritos por Heneine como a passagem e absorção das
radiações, a formação de íons e radicais (radiólise) e a reação desses radicais em
caminhos metabólicos diferentes dos normais. Dois mecanismos são citados pelo autor
como para explicar os efeitos biológicos (HENEINE, 1991):
• A ação direta, que ocorre quando a radiação choca-se e age diretamente sobre
moléculas biológicas como DNA, proteínas e lipídeos. Esse choque provoca a
inativação de enzimas, quebra de ligações, formação de radicais complexos,
entre outros. Isso impede o funcionamento natural dessas moléculas.
Corresponde a 20% do efeito total.
• A ação indireta, que ocorre quando a radiação incidente é absorvida pela água.
Esse processo provoca a formação de radicais muito reativos que agem sobre
as biomoléculas, lesando-as. Corresponde a 80% do efeito total.
De acordo com Tauhata, Salati e Di-Prinzio são quatro as etapas da produção do
efeito biológico provocado pela exposição à radiação, como mostra a Tabela 2
(TAUHATA, SALATI e DI-PRINZIO, 1998).
11
Tabela 2: Etapas da produção do efeito biológico provocado pela exposição à radiação (TAUHATA,
SALATI e DI-PRINZIO, 1998).
Etapas Descrição
Efeitos Físicos Na exposição celular à radiação ionizante, nos locais
atingidos aparecem muitos elétrons, radicais produzidos pela
quebra das ligações químicas, energia cinética adicional
proveniente da transferência de energia da radiação ao
material biológico, por colisão. Esta fase física tem duração
da ordem de 10
-16
segundos. A carga elétrica adicional
produzida pela ionização ou a energia absorvida permitem
definir as grandezas radiológicas denominadas Exposição ou
dose Absorvida, respectivamente, considerando a massa
biológica atingida.
Efeitos Químicos É a busca pela estabilidade química através do metabolismo
celular, ou seja, após a formação dos íons e radicais livres, a
tendência é a neutralização gradual dos mesmos. Esta fase
dura poucos segundos, é nela que os radicais livres, íons, e os
agentes oxidantes podem atacar moléculas importantes das
células, inclusive o DNA. Nessa etapa pode ocorrer a
radiólise, como o que acontece com a molécula de água.
Efeitos biológicos São as formas que as alterações químicas provocadas pela
radiação podem afetar as células. Pode ser: morte prematura,
impedimento ou retardo de divisão celular ou modificação
permanente que é transmitida para as próximas gerações.
Efeitos Orgânicos São as doenças provocadas por uma grande quantidade de
efeitos biológicos que desequilibram o organismo.
Com relação à permanência, as lesões podem ser reversíveis, desaparecem sem
deixar vestígios aparentes, ou podem ser irreversíveis, permanecendo na célula para
sempre. As lesões podem ser transmissíveis geneticamente, estendendo-se por várias
gerações (HENEINE, 1991).
Os fatores estruturais que aumentam a sensibilidade celular são (HENEINE,
1991):
• Maior quantidade de água, pois esta fornece os efeitos indiretos;
• Maior quantidade de DNA uma vez que é a molécula mais sensível;
• Elevada taxa de reprodução, pois isso aumenta a quantidade de DNA e
também o metabolismo e;
• Células jovens devido ao alto metabolismo e grande quantidade de água.
A presença de oxigênio no meio irradiado aumenta os efeitos das radiações
ionizantes, isto porque a maior parte dos radicais que aparecem pela radiólise é oxidante.
12
Grande parte do efeito direto e indireto das radiações ionizantes é incrementado pela
presença de oxigênio (HENEINE, 1991).
2.1.3 Mutações
As mutações são definidas como mudanças hereditárias na seqüência de
nucleotídeos no DNA, sendo responsáveis pelas mudanças evolutivas nos microrganismos
e pelas alterações que produzem diferentes cepas dentro das espécies (BLACK, 2002).
Na mutação o gene responsável pela codificação de uma enzima sofre uma
alteração, tendo sua atividade reduzida ou cessada em função da mudança ocorrida na
seqüência de aminoácidos. Esta alteração no genótipo pode ser desvantajosa, ou mesmo
letal, quando a célula perde uma característica fenotípica de que necessita. Contudo, uma
mutação pode ser benéfica se, por exemplo, a enzima alterada e codificada pelo gene
mutante possui atividade nova ou potencializada (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
As mutações podem ser de dois tipos importantes: as pontuais que afetam uma
única base e as por deslocamento do quadro de leitura que podem afetar mais de uma base
do DNA (BLACK, 2002; TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
O tipo mais comum de mutação envolvendo um único par de bases é a substituição
quando uma base em um ponto da seqüência do DNA é substituída por outra. Na
replicação do DNA o resultado é a substituição de pares. Se a troca ocorrer dentro de um
gene que codifica uma proteína, o mRNA transcrito transportará uma base incorreta
naquela posição. Quando o mRNA for traduzido, a informação incorreta poderá causar a
inserção de um aminoácido incorreto (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
Uma inserção ou deleção é a adição ou remoção de pares de bases que varia
grandes trechos do DNA devido a troca de fase de leitura da tradução. A inserção ou
deleção de qualquer número de pares de base que não seja múltiplo de três faz com que os
ribossomos leiam um conjunto de códons diferentes. Como exemplo tem-se que a deleção
de um par de nucleotídeos no meio de um gene causa alterações em muitos aminoácidos à
jusante do local da mutação original. As mutações de troca de fase de leitura quase
sempre resultam em uma longa seqüência de aminoácidos alterados e na produção de
proteínas inativas do gene mutado (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
Mudanças tautoméricas podem ocorrer com as bases púricas e pirimídicas do
DNA. Nesse tipo de mutação permanece a forma química do composto, porém as
13
estruturas moleculares são um pouco diferentes que alteram as posições na molécula que
são capazes de formar pontes de hidrogênio. Isso leva a diferentes propriedades no
pareamento de bases (BROWN, 2002).
As mutações são aleatórias, sendo impossível prever quando ocorrerão ou quais
genes serão alterados. Embora todas resultem em mudanças permanentes no DNA, elas
podem ser espontâneas ou induzidas. As espontâneas ocorrem aparentemente na ausência
de qualquer agente conhecido, surgindo durante a replicação e parecem ser conseqüência
de erros no pareamento de bases dos nucleotídeos nas fitas antiga e nova do DNA.
Agentes ambientais, como produtos químicos e radiações, que produzem mutações direta
ou indiretamente, são denominados mutagênicos. Quase todos os agentes que podem
reagir química ou fisicamente com o DNA causam mutações, aumentando
significativamente sua taxa acima da espontânea. Muitas formas de radiação
eletromagnética são agentes mutagênicos (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
Qualquer dano ao DNA celular possui uma resposta instantânea por vários tipos de
processos bioquímicos que tem função de reparar as lesões ao DNA e minimizar as
mutações. Após a exposição a radiação, as células normalmente reagem de três maneiras
distintas: interrupção no ciclo celular, reparo das lesões ao DNA ou ativação da resposta
apoptótica (LI, STORY, FEGERSKI, et al, 2001).
As mutações freqüentemente tornam um organismo incapaz de sintetizar uma ou
mais proteínas. A ausência desta proteína freqüentemente leva a mudanças na estrutura do
organismo ou na sua capacidade de metabolizar alguma substância específica. As
variações fenotípicas freqüentemente observadas em bactérias mutantes incluem
alterações morfológicas na cor das colônias ou nos requerimentos nutricionais (BLACK,
2002).
Mutações podem alterar os requerimentos nutricionais de organismos aumentando
suas necessidades metabólicas, prejudicando assim, sua capacidade para sintetizar
enzimas ou nutrientes. Sendo assim, o organismo pode requerer certos aminoácidos ou
vitaminas em seu meio, porque ele já não pode produzí-los. Tais mutantes
nutricionalmente deficientes são chamados de auxotróficos. Em contraposição aos
auxotróficos, as formas normais não mutantes são chamadas prototróficos, ou cepas
selvagens. Comparações entre as características dos auxotróficos e prototróficos mostram
os efeitos de uma mutação no metabolismo (BLACK, 2002).
14
2.1.3.1 Freqüência de Mutação
A taxa de mutação é definida como a probabilidade de um gene sofrer mutação
quando a célula se divide. Os erros espontâneos na replicação do DNA ocorrem em taxas
muito baixas, em torno de uma vez em 10
9
pares de bases replicados resultando em uma
taxa de mutação de 10
-9
. Como o gene médio tem cerca de 10
3
pares de bases, a taxa de
mutação espontânea é cerca de uma vez a cada 10
6
pares de base replicados (TORTORA,
FUNKE e CASE, 2000).
Um mutagênico freqüentemente aumenta a taxa espontânea de mutação por um
fator de 101.000 vezes. Em outras palavras, na presença de um mutagênico, a taxa normal
de mutações por gene replicado é de 10
-5
a 10
-3
. Os mutagênicos são utilizados
experimentalmente para aumentar a produção de células mutantes (TORTORA, FUNKE e
CASE, 2000).
2.1.4 Taxa de morte microbiana
O termo morte para os microrganismos é definido como a perda da capacidade de
se reproduzir (PELCZAR, CHAN E KRIEG, 1996). Populações bacterianas quando são
aquecidas ou tratadas com substâncias químicas antimicrobianas, normalmente morrem
em uma taxa constante. O mesmo acontece no tratamento com radiações ultravioleta e
ionizantes (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
Vários fatores influenciam a efetividade dos tratamentos antimicrobianos
(TORTORA, FUNKE e CASE, 2000):
• Número de microrganismos - quanto maior for a população inicialmente
presente mais longo é o tempo para sua eliminação.
• Características microbianas - os endósporos são difíceis de matar, e mesmo as
células vegetativas exibem variação considerável na sensibilidade aos
controles físico-químicos.
• Influências ambientais - a presença de matéria orgânica, como sangue, saliva
ou fezes, freqüentemente inibe a ação de antimicrobianos químicos. Isto
também é verdadeiro para o tratamento com o calor. Um meio de suspensão
que contém gorduras ou proteínas tende a proteger as bactérias, que terão
15
maior taxa de sobrevivência. Além disso, o pH pode ser um fator importante.
O calor é mais eficiente quando os microrganismos estão sob condições ácidas.
• Tempo de exposição - em tratamentos com o calor uma exposição prolongada
compensa menores temperaturas. Assim como os outros fatores, os efeitos da
radiação são muito dependentes do tempo.
A intensidade ou a concentração do agente microbicida como um fator importante
para avaliar a sua eficiência. Quanto menor a intensidade ou concentração de um agente
microbicida mais tempo leva para ele destruir uma população microbiana (PELCZAR,
CHAN E KRIEG, 1996).
Utilizando radiações de alto e baixo LET, com altas e baixas taxas de dose, pode-
se obter o percentual de sobrevivência de células de um tecido ou órgão. Os pontos
experimentais podem ser ajustados matematicamente e, as diversas expressões obtidas são
denominadas de curvas de sobrevivência (TAUHATA, SALATI e DI-PRINZIO, 1998).
Os microrganismos morrem em uma taxa constante ao serem expostos a
determinados agentes antimicrobianos. Um exemplo que pode ser citado é o seguinte:
uma população microbiana que inicialmente possui 1 milhão de bactérias; após 1 minuto
de ação de um agente antimicrobiano é reduzida a 100.000. Quando passar mais um
minuto de exposição ao mesmo agente a população se reduzirá a 10.000. E assim continua
a redução da população onde 90% morrem e sobram 10% de células sobreviventes
(PELCZAR, CHAN E KRIEG, 1996; TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
Sendo assim, sobrevivência à radiação é representada convenientemente por
logaritmos de base 10 do número de microrganismos sobreviventes plotados versus a dose
de radiação aplicada. A dose de radiação necessária para produzir a redução da população
microbiana a 10% da população inicial é chamada D
10
(Joint FAQ/IAEA/WHO Study
Group, 1997).
2.1.5 Avaliação das características dos microrganismos
A caracterização dos microrganismos é realizada através de técnicas laboratoriais,
entre estas estão (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996):
• Características morfológicas microscópicas – definida como o tamanho, a
forma, e o arranjo das células. Podem ser determinadas através de vários tipos
16
de colorações e técnicas de microscopia;
• Características nutricionais e culturais – definidas como as necessidades
nutricionais e condições físicas necessárias para o crescimento de determinado
microrganismo e;
• Características metabólicas – relacionado com o metabolismo do
microrganismo. Para a verificação das características metabólicas dos
microrganismos são realizadas provas bioquímicas. A Tabela 3 mostra o
comportamento esperado para E. coli em determinados testes bioquímicos.
Tabela 3: Testes bioquímicos para E. coli (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996).
Teste bioquímico Resultado
Indol +
Voges-Proskauer -
Citrato de Simmons -
Gás Sulfídrico -
Lactose +
Positivo (+), Negativo (-)
As alterações metabólicas em bactérias podem ser determinadas através de provas
bioquímicas. Essas provas verificam as transformações químicas que ocorrem em meios
de cultura específicos após a inoculação do microrganismo (BLACK, 2002; BARBOSA e
TORRES, 1998; TORTORA, FUNKE e CASE, 2000; LEITÃO, HAGLER, HAGLER, et
al, 1998; PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996; RIBEIRO e SOARES, 2002).
As bactérias, em geral, são capazes de utilizar várias fontes de carbono além da
glicose, como galactose, lactose, maltose, acetato e outras, mas podem existir mutantes
incapazes de utilizar certas fontes de carbono ou nitrogênio (AZEVEDO, 1998;
PIZZIANI-KLEINER, PEREIRA e AZEVEDO, 1998).
Podem existir também mutantes resistentes a agentes inibidores. Cepas selvagens
são susceptíveis a inibidores variados, como a estreptomicina, os resistentes diferem de
modo que podem formar colônias na presença de um inibidor (GRIFFITHS, GELBART,
MILLER, et al, 2001; AZEVEDO, 1998; PIZZIANI-KLEINER, PEREIRA e AZEVEDO,
1998).
Bactérias do tipo selvagem são prototróficas, ou seja, elas podem produzir
colônias em meios básicos. Mas, alguns clones mutantes destas são identificados como
auxotróficos, ou seja, não crescem a menos que o meio contenha um ou mais nutrientes
específicos. Esse fenótipo é característica da perda da capacidade celular de produzir
17
aquele composto específico (GRIFFITHS, GELBART, MILLER, et al, 2001; NEDER,
1992).
Muitos microrganismos podem se desenvolver em um meio de cultivo sólido
contendo apenas sais minerais e uma fonte de carbono ou com algum aminoácido,
vitamina ou outro componente adicionado a esse meio. Esse meio é definido como meio
mínimo (MM). Mas, eles podem também se desenvolver em meios complexos contendo
componentes como a peptona, extrato de levedura, caseína hidrolisada, extrato de carne e
outros. Este meio é chamado Meio Completo (MC) (AZEVEDO, 1998; PIZZIANI-
KLEINER, PEREIRA e AZEVEDO, 1998).
Uma espécie microbiana originalmente cresce em meio mínimo e em meio
completo, pode sofrer uma mutação e perder a capacidade de crescer em meio mínimo,
assim essa espécie é chamada auxotrófica e a linhagem original é chamada prototrófica.
Assim, uma grande variedade de microrganismos podem ser isoladas, microrganismos
que não podem crescer em meio mínimo se a ele não for adicionado algum aminoácido,
vitamina, purina, pirimidina ou outro componente essencial (AZEVEDO, 1998;
PIZZIANI-KLEINER, PEREIRA e AZEVEDO, 1998).
2.2 REVISÃO DA LITERATURA
Pesquisas envolvendo microrganismos irradiados, resistentes à radiação,
aplicações da radiação como agente antimicrobiano, vêm sendo realizadas por diversos
autores como Hoerter, Arnold, Kuczynska et al (2005), Rutherford, Reidmiller, Marquis,
et al (2000), Grosovski e Little (1985), entre outros.
O antibiótico cloranfenicol é conhecido por inibir a síntese proteica em diferentes
bactérias sem afetar a síntese de ácidos nucléicos. Okagaki realizou um estudo
comparativo do efeito do cloranfenicol na incubação de 7 cepas de E. coli (cepas: 15, 15T
-
(Cohen), 15T
-
(Zamenhof), 15h
-
, 15-OS21, B/r e B) após a irradiação com luz ultravioleta.
O antibiótico aparentemente age como um agente bactericida na maioria das cepas
utilizadas, com exceção da cepa B, na qual o cloranfenicol aumentou a recuperação da
ação letal da luz ultravioleta. A morte por cloranfenicol ocorreu nas seguintes condições:
na irradiação preliminar com luz ultravioleta; na presença de cloranfenicol no meio de
incubação com ou sem nitrogênio; na presença de recursos energéticos no meio de
18
incubação; e na presença de um dado sistema metabólico da célula, constitutivo ou
induzido pela incubação com certos componentes (OKAGAKI, 1960).
Weatherwax e Landman examinaram a exposição à luz ultravioleta de uma cepa
mutante de E. coli que depende da arginina, tornando-a novamente independente para do
aminoácido. A dependência da fixação da mutação em relação à presença do suplemento
de aminoácido foi verificada pela presença de timina e também da síntese de DNA. Uma
diminuição da freqüência de mutação induzida pela ausência de aminoácidos se mostrou
independente da presença ou ausência de timina (WEATHERWAX E LANDMAN,
1960).
O estudo de Eberle e Masker comparou o efeito do ácido nalidíxico no reparo e na
síntese semiconservativa em E. coli. Seus resultados indicaram que tanto, a replicação
semiconservativa do DNA quanto o reparo extensivo, após a irradiação com ultravioleta,
são bloqueados pelo ácido nalidíxico (EBERLE e MASKER, 1971).
Grosovski e Little realizaram seu trabalho expondo culturas de células humanas
aos raios X e não conseguiram determinar uma dose limiar para obter indução de mutação
para baixas doses de 1,0 a 10,0 rad que correspondem a 0,01 a 0,1Gy (GROSOVSKI e
LITTLE,1985).
A presença de microrganismos patogênicos nos alimentos, como Salmonella, E.
coli O157:H7, Lysteria monocytogenes ou Yersinia enterocolitica, é um grande problema
para as autoridades responsáveis pela saúde pública. Com o objetivo de diminuir ou
eliminar os riscos, são determinadas maneiras de evitar a presença destes microrganismos
nos alimentos sendo que uma das formas de reduzir sua presença é através da irradiação
(Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997).
O objetivo primário da irradiação de alimentos é eliminar os agentes patogênicos e
reduzir o número de seus esporos; porém, altas doses de radiação podem provocar
mudanças no sabor e nas propriedades nutricionais dos alimentos. Estão sendo
pesquisados tratamentos combinados que usam a sensibilidade dos microrganismos a
diferentes estresses que podem ser cumulativos. Diferente da inativação térmica, a
radiação ionizante em pequenas doses não altera significativamente o sabor dos alimentos.
(FIELDING, COOK e GRANDISON, 1997; CLAVERO, MONK, BEUCHAT, et al,
1994).
A radiação gama é um processo eficiente para reduzir os níveis microbianos em
diversos materiais como alimentos e produtos de saúde. Entretanto, as propriedades
intrínsecas da radiorresistência dos microrganismos e os fatores do meio devem ser
19
considerados quando se estuda um processo de redução da população microbiana. Bacilos
gram-negativos, usualmente, são mais sensíveis à radiação gama do que as espécies gram-
positivas (NOGUEIRA, BOTELHO e TENREIRO, 1998).
Muitos fatores influenciam a resistência dos microrganismos à inativação pela
radiação, como por exemplo, a composição e o estado físico do meio, a temperatura
durante a exposição, atividade de água e o estado fisiológico das células. O trabalho de
Clavero, Monk, Beuchat, et al (1994) teve como objetivo determinar a independência ou
atuação da gordura contida na carne moída crua e da temperatura na inativação da E. coli
O157:H7, Salmonella e Campylobacter jejuni. Em sua pesquisa as células inoculadas na
carne moída crua foram irradiadas com doses entre 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, e 3,0 kGy em
um irradiador de cobalto-60. Para a análise microbiológica as diluições das carnes moídas
foram inoculadas em placas de Petri com ágar específico para cada microrganismo. Os
estudos de Clavero, Monk, Beuchat, et al indicaram que os valores D
10
, dose necessária
para reduzir a população a 10% da inicial, para os patógenos em a carne moída congelada
são geralmente maiores que os calculados para a carne moída refrigerada. Como exemplo,
a E. coli O157:H7 refrigerada teve uma D
10
de 0,241 kGy e a congelada uma D
10
de 0,307
Gy. Demonstraram também que em determinada temperatura, o nível de gordura não teve
um efeito significativo nos valoras de D
10
para E. coli O157:H7 e foi determinada a ordem
de sensibilidade dos patógenos à radiação gamma como: Campilobacter jejuni >
Escherichia coli O157:H7 > Salmonella.
Na pesquisa de Fieldin, Cook e Grandison o objetivo foi determinar os efeitos do
acido acético em combinação com a irradiação com feixe de elétrons na sobrevivência da
E. coli e do Lactobacilus curvatus. As amostras desses microrganismos foram irradiadas
em doses entre 0 a 1,2 kGy. Através de sua pesquisa, Fieldin, Cook e Grandison
concluíram que as células de E. coli foram mais susceptíveis a altas concentrações de
ácido acético após terem sido irradiadas (FIELDING, COOK e GRANDISON, 1997).
O material mais importante no estudo das reações nucleares é o trítio. Na pesquisa
de Hasegawa, Yoshioka e Yoshioka (1997) foram comparados os danos do DNA
(plasmídeo pBR322) quando imerso na água contendo trítio com casos de irradiação com
raios gama e raios X. Como controle do experimento a estabilidade do DNA foi estudada
em água não radioativa. Através de seu experimento, Hasegawa, Yoshioka e Yoshioka
concluíram que o grau de risco em água contendo trítio é maior que para raios X e raios
gama.
De acordo com Nogueira, Botelho e Tenreiro (1998) o Methylobacterium
20
extorquens é um bacilo gram-negativo bastante radiorresistente, em tão altos níveis
quanto já foi pesquisado para o M. radiotolerans. Foram feitas curvas de sobrevivência
para comparar as cepas isoladas de cada tipo de Methylobacterium spp.. Os resultados da
pesquisa de Nogueira, Botelho e Tenreiro (1998) mostraram que todas as cepas foram
substancialmente mais sensíveis quando irradiadas em meios líquidos. Quando a
irradiação foi realizada em tampão fosfato M. extorquens teve um valor D
10
de 2,7 kGy e
foi significantemente mais resistente que a cepa rad, e a cepa selvagem e o M.
radiotolerans, cujos valores D
10
se mantiveram na faixa de 2,0 kGy. M. extorquens e a
cepa rad (cepa irradiada) não mostraram diferenças significantes quando irradiadas em
agar peptona glicerol sendo que seus valores D
10
ficaram em torno de 4,5Gy. Nas mesmas
condições, a cepa selvagem comportou-se como a menos resistente com um valor D
10
de
3,1kGy.
Várias colites hemorrágicas de E. coli O157:H7 tem sido associadas ao suco de
maçã, por isso o National Advisory Committee in Microbiological Criteria for Foods
recomenda que a produção de suco de frutas deve incluir tratamentos capazes de produzir
uma redução de 5 unidades logarítmicas nos níveis de E. coli O157:H7. O tratamento dos
produtos com radiação gama é uma alternativa para eliminação de E. coli
enterohemorrágica. Não só a radiação gama pode inativar o patógeno como também pode
fazer isso em baixas temperaturas e não alterar as propriedades organolépticas do produto
(BUCHANAN, EDENELSON, SNIPES, et al, 1998).
O estudo de Buchanan, Edenelson, Snipes, et al (1998) teve como objetivo
determinar a dose de radiação necessária para eliminar a E. coli O157:H7 do suco de
maçã fresco. Os valores D
10
encontrados variaram de 120 a 350 Gy, dependendo da cepa
e das condições dos meios em que se encontravam. A cepa de E. coli O157:H7 com uma
maior dose D
10
foi a SEA13B88, que possui um valor D
10
de 350 Gy. Como a
especificação é de que precisa-se de 5 reduções logarítimica, essa dose deve ser
multiplicada por 5 resultando na aplicação de uma dose de 1,8kGy.
Trigo e Fraqueza (1998) estudaram em seu trabalho as capas de salsicha naturais
de porco e gado, mas o alto nível de microrganismos aumenta o risco da contaminação da
carne com microrganismos patogênicos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito letal
da radiação gama na resistência da população microbiana das capas naturais de porco e
gado. Eles relataram que os valores D
10
para a contagem aeróbica total nas pequenas e
grandes capas de porco foram respectivamente 1,54kGy e 1,65kGy respectivamente, e que
nas capas de gado os valores foram bem maiores por causa da flora dominante e da menor
21
atividade de água. A desidratação aumenta a resistência dos microrganismos à radiação.
Trigo e Fraqueza concluíram que flora Enterobacteriaceae foi quase nula em todos os
tipos de capas após a irradiação com 2 kGy e também que a irradiação gama das capas de
porco com 5kGy reduziu drasticamente a flora contaminante.
O objetivo do estudo de Van Calenberg, Van Cleemput, Mondelaers, et al (1999)
foi aumentar o conhecimento sobre os efeitos das doses de radiação para alimentos com
alta umidade. Então, foram testados os efeitos dos raios X e do feixe de elétrons com
diferentes taxas de doses na qualidade microbiológica de peito de frango, cereais, e
morangos. Assim, as amostras foram irradiadas com doses de 0, 0,5, 1,0 e 1,5kGy. Após a
irradiação as amostras foram incubadas a -18°C até o dia das análises. Com seu trabalho
os autores concluíram que irradiação de 2kGy reduz significantemente a micro-flora
natural da carne de peito de frango, cereais e morangos. O efeito da taxa de dose ou a
diferença entre os raios X e feixe de elétrons na qualidade microbiológica dos alimentos
não foi observada para carne de peito de frango e foi pequena para cereais e morangos.
A radiação ionizante pode ser letal para procariotos e eucariotos porque induz
mudanças deletérias nas estruturas das biomoléculas essenciais, sendo que o mecanismo
mais importante é a geração de radicais livres pela radiólise, por causa da abundância da
água na vida dos organismos. Esses radicais livres têm um alto potencial para causar
danos a componentes críticos das células como DNA, proteínas e lipídios (LEE, KOH,
HUH, et al, 1999).
O estudo de Lee, Koh, Huh et al, investigou o papel do isocitrato dehidrogenase
NADP+-dependente na defesa celular contra a radiação ionizante comparando a cepa que
não possui o ICDH. A pesquisa demonstrou que espécies selvagens de E.coli tiveram uma
taxa de sobrevivência de 77% após a exposição à dose de 200 Gy com raios-X enquanto
que as células deficientes de ICDH mostraram uma taxa de sobrevivência de apenas 33%
na mesma dose. Concluindo que as células selvagens de E. coli são mais resistentes à
radiação ionizante que as células mutadas deficientes de ICDH. Isso sugere que essa
enzima seja um importante agente antioxidante na proteção das células contra a radiação
ionizante, sendo que ele protege as células dos danos causados pela irradiação (LEE,
KOH, HUH, et al, 1999).
Existem mecanismos pelos quais a taxa de mutação aumenta, como a replicação, a
radiação ultravioleta, reparo defeituoso e a transcrição. Esses mecanismos são
responsáveis pela evolução. Em microrganismos, os estresses nutricionais prolongados
resultam em mutações que contribuem para a evolução. Após a escassez de algum
22
nutriente essencial, a célula reestrutura seu metabolismo e engrena o crescimento e
divisão celular para as condições nutricionais existentes. A falta de triptofano aumenta a
expressão do trp (WRIGHT, LONGACRE, E REIMERS,1999).
O experimento de Wright, Longacre, e Reimers utilizou a E. coli K12, CP78 e
CP79. Quando a bactéria não tem no meio algum aminoácido, o operon biossintético é
acionado. O experimento de Wright, Longacre, e Reimers indicou que o operon é sempre
ativado pela enzima ppGpp. A reversão de um auxotrófico em um prototrófico representa
uma restauração de uma capacidade previamente existente (WRIGHT, LONGACRE, E
REIMERS,1999).
Deinococcus radiodurans é uma bactéria com extrema resistência aos efeitos letais
e mutagênicos da radiação ionizante assim como de outros agentes danosos físicos ou
químicos. Sendo que a E. coli é 100 vezes mais sensível aos efeitos da radiação que o
microrganismo citado acima, o trabalho de Bauche e Laval estudou a presença de
mecanismos de reparo envolvidos na maior resistência à radiação do D. radiodurans.
Com sua pesquisa foi possível verificar que o mecanismo de reparo do D. radiodurans
possui resíduos de proteínas de excisão 8-oxoG que apresentam homologia significante
com a proteína Fpg da E. coli, que está envolvida em seu processo de reparo e possui uma
grande escala de atividades em comum. Assim, essa proteína confirma a existência de um
sistema de reparo por excisão de base do D. radiodurans (BAUCHE e LAVAL, 1999).
Rutherford, Reidmiller, Marquis, et al, em seu trabalho, verificaram que para uma
ação conjunta efetiva entre o peróxido e hidrogênio e a radiação ultravioleta é necessário
que o primeiro esteja presente no momento da irradiação (RUTHERFORD,
REIDMILLER, MARQUIS, et al, 2000).
Daly (2000) realizou uma pesquisa teórica que afirma a necessidade da descoberta
ou modelação de um microrganismo capaz de sobreviver em condições adversas
combinadas, como a contaminação química e os altos níveis de radiação que existem em
locais utilizados para testes de armas nucleares. A pesquisa evidenciou a tentativa de
adicionar ao D. radiodurans, características genéticas de microrganismos que são capazes
de transformar metais tóxicos em formas menos danosas.
De acordo com Mollins, Motarjemi e Käferstein, a contaminação de alimentos
com vários patógenos bacterianos, parasitas ou virais é natural, mas pode ser reduzida
com boas práticas na agricultura ou aqüicultura, mantendo-se em baixos níveis. A
irradiação pode ser introduzida como um controle adicional de descontaminação em
alimentos sólidos crus de origem animal e algumas frutas, vegetais e alimentos
23
minimamente processados. A irradiação é um processo não térmico de tratamento e pode
ser eficientemente utilizado para eliminar ou reduzir os números de patógenos bacterianos
para níveis aceitáveis em alimentos. É referenciado como pasteurização fria, por sua
capacidade de eliminar patógenos em alimentos sem aumentar substancialmente a
temperatura e sem causar mudanças químicas ou físicas significantes nos alimentos
(MOLINS, MOTARJEMI e KÄFERSTEIN, 2001).
Niebuhr e Dickson tiveram como objetivo em sua pesquisa determinar a dose
necessária para se obter uma redução decimal na população de determinado
microrganismo (D
10
), para esporos do Bacillus anthracis em condições comparáveis com
cartas contaminadas. Utilizando um feixe de elétrons de 10 MeV e doses de 2,5 a 24,1
kGy, foi encontrado o valor D
10
de aproximadamente 4,19 kGy. Determinaram que a dose
necessária para destruir 10
12
esporos do B. anthracis nessas condições é de 40 kGy e a
temperatura interferiu na resposta do bacilos à radiação, sendo que D
10
é maior em
temperaturas mais baixas (NIEBUHR e DICKSON, 2003).
Mutações transientes têm sido caracterizadas como uma melhor estratégia celular
em termos de adaptação ao stress do meio. Zhang e Sundin usaram 39 testes fenotípicos
em 80 linhagens de bactérias. As bactérias auxotróficas eram inicialmente identificadas
pela incapacidade de crescimento em meio mínimo; requerimentos auxotróficos foram
inicialmente identificados pela adição de suplementos de aminoácidos em grupos de 3 e
depois adicionando os aminoácidos individualmente. Entre as linhagens de Pseudomonas
syringae expostas à radiação UV, foi detectado um total de 30 mutações entre 12
linhagens B86-17 e 15 mutações entre 6 linhagens de GWS242. As principais mutações
encontradas foram alterações nas morfologias das colônias e perda da motilidade
(ZHANG e SUNDIN, 2004).
A E. coli O157:H7 é patogênica e causa um grande número de infecções
provocando até mesmo mortes nos Estados Unidos da América. As investigações da
pesquisa de Mayer-Miebach Stahl, Eschrig, et al, se concentraram nos efeitos do meio e
da temperatura para a resistência à radiação de E. coli DSM498 não patogênica. Em sua
pesquisa, os autores realizaram a irradiação de E. coli DSM498 inoculadas em caldo
nutriente e carne de peru com doses entre 0,5 a 3,0 kGy em temperaturas reduzidas
(0-2ºC) e de congelamento (-85ºC). Através dessa pesquisa ficou determinado que as
taxas de inativação de E. coli em carne de peru não podem ser aplicadas nas mesmas
doses para E. coli em Caldo Nutriente. Determinaram também que em temperaturas
reduzidas (0-2ºC) a taxa de inativação da E. coli foi mais eficiente que em temperatura de
24
congelamento (-85ºC) (MAYER-MIEBACH, STAHL e ESCHRIG, et al, 2005).
Samelis, Kakouri, Savvaidis, et al consideram Lysteria monocytogenes e
Escherichia coli O157:H7 como importantes patógenos da carne que podem sobreviver
nas salsichas cruas fermentadas. A irradiação e a alta pressão hidrostática podem ser as
melhores opções para o controle patogênico na carne de salsicha comparada a
descontaminação química. A pesquisa deles utilizou 4 cepas de Lysteria innocua, uma
cepa não virulenta de L. monocytogenes e E. coli OH157:H7 (ATCC 43888); as carnes
contendo os microrganismos foram irradiadas com uma fonte de cobalto-60 com doses de
2 e 4 kGy a uma taxa de dose de 1kGy/h. As carnes inoculadas irradiadas foram colocadas
nas salsichas e depois foram analisadas microbiológica e quimicamente (SAMELIS,
KAKOURI, SAVVAIDIS, et al, 2005).
Os resultados do trabalho de Samelis, Kakouri, Savvaidis, et al evidenciaram que a
irradiação das carnes com 2 e 4kGy ajuda a acelerar a inativação da L. monocytogenes e
L. inoccua, durante a fermentação, mas não foi suficiente para se obter uma redução de 5
escalas logarítmicas da população de Listeria. Comparada com a E. coli OH157:H7, uma
maior resistência à radiação da Listeria ssp. era esperada, visto que esta é Gram-positiva e
a E. coli é Gram negativa. Sendo que conforme citado anteriormente bactérias Gram-
positivas são geralmente mais radioresistentes que as Gram-negativas. Os autores
concluíram que a irradiação de 2 a 4 kGy é um método promissor na descontaminação de
carne congelada usada para salsicha, controlando a E. coli OH157:H7 durante a
fermentação, mas menos promissora no controle da L. monocytogenes e Listeria ssp..
Além disso, concluíram que a irradiação da carne não teve grandes efeitos na acidificação
da salsicha nem nas taxas de desidratação (SAMELIS, KAKOURI, SAVVAIDIS, et al,
2005).
De acordo com Petin e Kim, a eficiência biológica relativa (RBE) das partículas
densamente ionizantes é determinada pelas características físicas da radiação ionizante.O
RBE das radiações ionizantes com alto LET (transferência linear de energia) é dependente
do aumento da probabilidade da produção de danos primários (eventos físicos) e redução
da capacidade de recuperação pós-irradiação da célula. Radiações de alto LET produzem
mais danos considerados irreversíveis comparados com os danos causados por radiações
de baixo LET (PETIN e KIM, 2005).
Os principais objetivos do estudo de Petin e Kim foram determinar se o LET afeta
o processo de recuperação ou se somente produz um nível mais alto de danos severos e
irreversíveis que não podem ser totalmente reparados, esclarecer a regra de danos
25
irreversíveis e a probabilidade de recuperação em alguns mutantes irradiados de
Saccharomyces cerevisae. Nesse estudo, a recuperação das propriedades líquidas serviu
como um indicador da atividade de reparo celular uma vez que alíquotas da mesma
suspensão celular foram irradiadas com um irradiador gama de cobalto-60 e partículas
alfa de plutônio-239 (PETIN e KIM, 2005).
No experimento realizado por Petin e Kim, a sobrevivência das células irradiadas
com partículas alfa teve uma excessiva redução logarítimica, o RBE das partículas alfa,
definidos como a razão das doses letais médias após a irradiação com baixo e alto LET,
foi de 3,7.
Existem várias indicações de experimentos usando radiações de alto LET que
apontampara a possibilidade de que o principal efeito de partículas densamente ionizantes
está na qualidade das lesões induzidas, ou seja, radiações de baixo LET geram um grande
número de lesões reparáveis enquanto radiações de alto LET geram um grande número de
lesões preferencialmente irreparáveis, o que está de acordo com os resultados da pesquisa
destes autores. Diferenças na velocidade de recuperação são demonstradas por todas as
cepas estudadas, com recuperação mais lenta com o aumento do LET. Foi demonstrado
também no estudo de Petin e Kim (2005) que a probabilidade de recuperação foi idêntica
tanto para radiações de baixo LET quanto para de alto LET para todas as cepas estudadas
(PETIN e KIM, 2005).
Hoerter, Arnold, Kuczynska et al em seu trabalho expuseram culturas de E. coli à
radiação UVA e observaram que as células de E. coli, quando expostas, têm um atraso em
seu crescimento devido a inativação da síntese de uma proteína. Concluíram também que
as células de E. coli sobreviventes à radiação tornaram-se mais sensíveis a estresses
adicionais (HOERTER, ARNOLD, KUCYINSKA, et al, 2005)
26
3 METODOLOGIA
3.1 PRIMEIRA IRRADIAÇÃO
3.1.1 Preparo das amostras
Células de E. coli (ATCC 25922) foram cultivadas em Caldo BHI (g/L: Infusão
de coração e cérebro 17,5; Gelatina digerida enzimaticamente 10; Dextrose 2; Cloreto de
Sódio 5; Fosfato Dissódico, pH 7,0) em 37ºC por 24 horas. Em seguida, procedeu-se a
centrifugação (3.500 rpm, 20 minutos) e a ressupensão das células em solução salina
(NaCl 0,85%). A partir desta suspensão foram feitas as diluições, que foram
posteriormente irradiadas (KAPPKE, 2004; KAPPKE, SILVA, SCHELIN, et al, 2005).
Para a irradiação alíquotas de 0,05 mL da diluição 10
-6
foram inoculadas em agar
MacConkey (g/L: Peptona de caseína 17,0; peptona de carne 3,0; cloreto de sódio 5,0;
lactose 10,0; mistura de sais biliares 1,5; vermelho neutro 0,03; cristal violeta 0,001;
Agar-agar 13,5; pH 7,0), seletivo para bactérias Gram negativas, utilizando a técnica de
espalhamento em placas de Petri. (KAPPKE, 2004; KAPPKE, SILVA, SCHELIN, et al,
2005). Em seguida as amostras foram mantidas em gelo até a irradiação.
Para o preparo de amostras líquidas, as células de E. coli (ATCC 25922) também
foram cultivadas em Caldo BHI ( 37ºC por 24 horas). Alíquotas de 0,5 mL da suspensão
ativada foi inoculada em 4,5 mL de caldo BHI. Em seguida os tubos foram mantidos em
gelo.
3.1.2 Irradiação das amostras de E. coli
Após o espalhamento das alíquotas as bactérias foram submetidas à radiação gama
(cobalto-60) às doses de 60, 120, 180, 240, 300, 480, 600 e 780 Gy em triplicata. Placas
não irradiadas foram utilizadas como um padrão de crescimento de E. coli. O irradiador
utilizado foi o Gammacell Excel (GC-220E), com uma taxa de dose de aproximadamente
60 Gy por minuto e uma atividade de 173,20TBq. Esse irradiador é mostrado na Figura 1.
27
Figura 1: Irradiador Gammacell Excel (GC-220E) com as amostras posicionadas para a irradiação.
As amostras líquidas foram irradiadas no mesmo equipamento. As doses utilizadas
foram 60, 120, 180, 240, 300 Gy. Tubos contendo E. coli em meio líquido não irradiados
foram usados como padrão de crescimento para E. coli irradiada.
3.1.3 Parâmetros utilizados na avaliação do efeito da irradiação nas células
3.1.3.1 Curva de sobrevivência dos microrganismos irradiados
Após a irradiação, as placas foram incubadas a 37º C por 24 horas sendo
determinado o número de células sobreviventes e a fração de sobrevivência (FS) foi
calculada através da equação 2.
0
N
N
FS =
(2)
Na qual, N representa o número de unidades formadoras de colônia após cada
irradiação e N
0
corresponde ao número de unidades formadoras de colônia nas placas não
expostas à radiação (SILVA, CALDEIRA-DE-ARAUJO, AMARAL, et al, 2002;
LEITÃO, HAGLER, HAGLER, et al, 1998).
28
3.1.3.2 Análise morfológica dos microrganismos
As características morfológicas macroscópicas dos microrganismos irradiados
foram avaliadas com relação à forma, estrutura, textura e pigmentação da colônia e
comparado com os microrganismos não irradiados (LEITÃO, HAGLER, HAGLER, et
al,1988; PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996; RIBEIRO e SOARES, 2002).
Para análise das características microscópicas foi usada a técnica da coloração de
Gram, realizada com culturas de E. coli irradiadas e não irradiadas cultivadas em Caldo
BHI por 24 horas a 37ºC.
3.1.3.3 Análise fisiológica dos microrganismos
As características fisiológicas dos microrganismos irradiados foram avaliadas
através de provas bioquímicas realizadas a partir de microrganismos crescidos em agar
nutriente (g/L: peptona de gelatina 5; extrato de carne 3) e incubados por 24 horas a 37ºC.
A partir deste cultivo alíquotas foram inoculadas nos meios específicos aos testes
bioquímicos (RIBEIRO e SOARES, 2002; PILONETTO, 2006).
Todas as amostras irradiadas e não irradiadas foram submetidas aos seguintes
testes bioquímicos: SIM (Ácido Sulfídrico, Indol e Motilidade), Lisina, fermentação da
lactose, citrato de Simmons, meio Klieger, Vogues Proskauer e Vermelho de Metila,
todos realizados em triplicata. Alíquotas também foram inoculadas no meio seletivo
EMB. A formulação e a indicação dos meios é mostrada na Tabela 4.
A leitura dos testes foi realizada com 24 horas de incubação em estufa
bacteriológica à 37ºC.
29
Tabela 4: Meios de cultura utilizados para os testes bioquímicos (adaptado de RIBEIRO e SOARES, 2002;
MERCK, 1994).
Formulação Meio de
Cultura
Componente Quantidade
(g/L)
Indicação Análise do
Resultado
Lisina Peptona de carne
Extrato de
levedura
D(+) glicose
Monohidrocloreto
de L-lisina
Tiosulfato de
sódio
Citrato de amônio
ferro III Púrpura
de bromocresol
Agar-agar
5,0
3,0
1,0
10,0
0,04
0,5
0,02
12,5
Verifica a
descarboxilação da
l-lisina
A mudança de cor
do meio para o
violeta indica
descarboxilação da
l-lisina.
Se não houver
descarboxilação da
L-lisina o todo o
meio sofre viragem
de cor para o
amarelo.
EMB Peptona
Fosfato de
hidrogênio
dipostássico
Lactose
Eosina Y
amarelada
Azul de metileno
Agar-agar
10,0
2,0
5,0
0,4
0,07
13,5
Inibe o crescimento
de bactérias gram
positivas. Distingue
bactérias lactose
positvas de lactose
negativas.
A E. coli nesse
meio deve
apresentar-se em
colônias verdes,
metálicas
refletindo a luz e
com centro azul-
escuro para luz
transmitida.
SIM Peptona de
caseína
Peptona de carne
Citrato de amônio
ferro III
Tiosulfato de
sódio
Agar-agar
20,0
6,6
0,2
0,2
3,0
Verifica motilidade,
formação de H
2
S e
produção de indol.
Motilidade:
indicada pela
turvação difusa do
meio.
Produção de H
2
S:
indicada pelo
escurecimento das
áreas onde os
microrganismos
cresceram.
Indol: o meio é
coberto com
Reagente de
KOVACS. A
produção de indol
faz o reagente ficar
com a cor
vermelha.
Continua
30
Formulação Meio de
Cultura
Componente Quantidade
(g/L)
Indicação Análise do
Resultado
Caldo
lactose
Peptona
Extrato de carne
Cloreto de sódio
Vermelho de
fenol Lactose
10,0
1,0
5,0
0,018
50,0
Verificar a
utilização da lactose
como fonte de
carbono.
Se a bactéria
possuir capacidade
de desdobrar a
glicose em D-
glicose e D-
galactose, o meio
se torna amarelo,
se ela não possuir
o meio se torna
rosa.
Citrato de
Simmons
Fosfato de
Amônia
Dihidrogênio
Fosfato di-
potássio
hidrogênio
Cloreto de sódio
Citrato de sódio
Sulfato de
magnésio
Azul bromotimol
Agar-agar
1,0
1,0
5,0
2,0
0,2
0,08
13,0
Verificar a
capacidade de um
microrganismo em
utilizar o citrato
como única fonte de
carbono para seu
crescimento com
conseqüente
alcalinização do
meio.
O meio adquire cor
azul para
microrganismos
citrato positivos.
Para
microrganismos
citrato negativos o
meio mantem-se
verde.
Klieger Peptona de
caseína
Peptona da carne
Extrato de carne
Extrato de
levedura
Cloreto de sódio
Lactose
D(+) glicose
Citrato de amônio
ferro III
Tiosulfato de
sódio
Vermelho fenol
Agar-agar
15,0
5,0
3,0
3,0
5,0
10,0
1,0
0,5
0,5
0,024
12,0
Serve para
identificar bactérias
intestinais gram-
negativas.
A E. coli nesse
meio mostra-se
com um
crescimento bom e
o meio torna-se
amarelo.
Continua
31
Formulação Meio de
Cultura
Componente Quantidade
(g/L)
Indicação Análise do
Resultado
Vermelho
de metila
(Meio
Clark e
Lubs)
Peptona
Fosfato
dipostássico
Glicose
7,0
5,0
5,0
Testa a habilidade
de um
microrganismo em
produzir ácidos
orgânicos a partir da
fermentação da
glicose.
Acrescentar
vermelho de metila
para a leitura. Se
for positivo o meio
torna-se vermelho
e se for negativo
amarelo.
Vogues
Proskauer
Clark e Lubs: igual ao meio para
o teste do vermelho de metila.
Determina a
habilidade de um
microrganismo em
produzir o
acetilmetilcarbinol
(acetoína) a partir da
fermentação da
glicose.
No momento da
leitura em 2,5mL
do meio adicionar
0,6mL de alfa-
naftol (5%) e
0,2mL de KOH
(40%). Agitar o
tubo e esperar 10
minutos. Se houver
presença de
acetoína o meio se
torna vermelho se
não houver o meio
se torna cobre.
3.2 SEGUNDA IRRADIÇÃO
3.2.1 Preparo das amostras
Células de E. coli (ATCC 25922) foram cultivadas em Caldo BHI, 37ºC por 24
horas, em seguida procedeu-se a centrifugação e a resuspensão das células em solução
salina 0,85%, assim como descrito no item 3.1.1 A partir desta suspensão foram feitas
diluições, e posteriormente irradiadas (KAPPKE, 2004; KAPPKE, SILVA, SCHELIN, et
al, 2005).
Para a irradiação, alíquotas de 0,02 mL da diluição 1:10
6
em solução salina foram
inoculadas em Ágar MacConkey, utilizando a técnica de espalhamento. (KAPPKE, 2004;
KAPPKE, SILVA, SCHELIN, et al, 2005).
32
3.2.2 Irradiação das amostras de E. coli
O procedimento para a irradiação das amostras está descrito no item 3.1.2. As placas
contendo E. coli foram submetidas à radiação gama nas doses de 30, 60, 90, 120, 150,
180, 210, 240, 270 e 300 Gy em triplicata. Placas não irradiadas foram utilizadas como
um padrão de crescimento de E. coli.
Não foram realizadas irradiações de amostras líquidas.
3.2.3 Parâmetros utilizados na avaliação dos efeitos da irradiação sobre células
3.2.3.1 Curva de sobrevivência dos microrganismos irradiados
A curva de sobrevivência foi realizada de acordo com o procedimento já descrito
no item 3.1.3.1.
3.2.3.2 Análise morfológica dos microrganismos irradiados
Realizado conforme descrito no item 3.1.3.2.
3.2.3.3 Análise fisiológica dos microrganismos
As características fisiológicas dos microrganismos foram avaliadas através de
provas bioquímicas, a partir de microrganismos cultivados conforme descrito no item
3.1.3.3. Foram realizados os testes contidos no Mini Kit para Enterobactérias da
Newprov. Esse Mini Kit consiste de um conjunto de cinco meios de cultura para
identificação de enterobactérias, que são: Meio EPM, Meio Caldo Lisina, Meio de MIO,
Meio de Citrato de Simmons e Meio Caldo Rhamnose (PILONETTO, 2006).
A inoculação para avaliação das provas bioquímicas foi realizada utilizando a
biomassa dos tubos de agar nutriente irradiada e não irradiada; no tubo de EPM os
33
microrganismos foram inoculados usando uma agulha bacteriológica através de picada e
estria na superfície. No meio de Lisina, a biomasssa foi inoculada por dissolução e o
cultivo selado com óleo mineral estéril. O meio de MIO foi inoculado através de picada
central única. O meio Caldo Rhamnose foi inoculado por dissolução e o meio de Citrato
de Simmons foi inoculado por estria na superfície (LEITÃO, HAGLER, HAGLER, et
al,1988; RIBEIRO e SOARES, 2002, PILONETTO, 2006). A Tabela 5 mostra os meios
de cultura com sua respectiva composição e indicação dos testes.
Estes testes permitem o diagnóstico laboratorial dos bacilos Gram negativos
fermentadores da glicose, baseando-se principalmente na identificação de enterobactérias
(PILONETTO, 2006).
Tabela 5: Composição e indicação dos meios de cultura utilizados para os testes bioquímicos (Modificada
de: PILONETTO, 2006; RIBEIRO e SOARES, 2002).
Formulação Meio de
Cultura
Componente Quantidade
Indicação Análise do
Resultado
EPM Agar
bacteriológico:
Triptona:
Extrato de
carne:
Cloreto de
sódio:
Fosfato
dissódico:
L-triptofano:
Substrato de
Rugai :
Solução
alcoólica a
1,5% de azul
de bromotimol:
11g/L
10g/L
2g/L
5g/L
2g/L
1g/L
17,5mL/L
2mL/L
Verifica a
fermentação da
glicose; a capacidade
de produzir gás
sulfídrico; a
produção de gás; a
produção da enzima
L-tiptofano
desaminase.
A coloração amarela
na base do tubo
indica a
fermentação da
glicose, o
enegrecimento da
base do tubo indica
a produção de gás
sulfídrico, a
formação de bolhas
indica a produção de
gás e a cor verde
musgo no ápice do
tubo indica a
produção de L-
triptofano
desaminase.
Caldo
Lisina
Peptona:
Extrato de
carne:
Púrpura de
bromocresol:
Vermelho de
cresol:
Monocloridrato
de l-lisina:
5g/L
5g/L
0,01g/L
0,005g/L
10g/L
Determina a
habilidade
enzimática em
promover a
descarboxilação do
aminoácido lisina,
alcalinizando o meio
de cultivo.
A cor amarela relata
a reação negativa e
qualquer cor
diferente de amarelo
é considerado
positivo.
Continua
34
Formulação Meio de
Cultura
Componente Quantidade
Indicação Análise do
Resultado
Caldo
Rhamnose
Extrato de
carne:
Triptona:
Cloreto de
sódio:
Rhamnose:
Azul de
bromotimol:
1g/L;
10g/L;
5g/L;
5g/L;
0,03g/L.
Verifica se o
microrganismo é ou
não capaz de
fermentar este
açúcar.
A mudança de cor
para o amarelo
permite concluir que
o microrganismo é
capaz de fermentar a
Rhamnose.
MIO
Extrato de
levedura:
Peptona
Triptona:
Ornitina:
Dextrose:
Púrpura de
bromocresol:
Agar
bacteriológico:
3g/L
10g/L
10g/L
5g/L
1g/L
0,02g/L
2,25g/L
Verifica a
capacidade de
motilidade das
células, capacidade
de descarboxilação
da ornitina e a
produção de indol.
Verifica a
motilidade pela
turvação do meio,
descarboxilação da
ornitina através da
coloração amarela
no meio e a
produção de Indol é
evidenciada com a
adição do reativo de
Kovacs e formação
de um anel
vermelho.
Citrato de
Simmons
Sulfato de
magnésio:
Fosfato de
amônio
dihidrogenado:
Fosfato
dipotássico:
Citrato de
sódio:
Cloreto de
sódio:
Azul de
bromotimol:
Agar
bacteriológico:
0,02g/L
1g/L
1g/L
2g/L
5g/L
0,08g/L
15g/L
Determina a
capacidade do
microrganismo em
utilizar o citrato
como única fonte de
carbono.
A utilização do
citrato como única
fonte de carbono é
verificada pela
viragem de cor do
meio para azul.
35
3.2.3.4 Análise da resistência dos microrganismos a antibióticos
A células de E. coli irradiadas e não irradiadas foram ativadas em agar MacConkey
e incubadas por 24 horas a 37ºC. Foram inoculadas de 4 a 5 colônias de E. coli em caldo
tripticaseína de soja (g/L: peptona de caseína 17; peptona de soja 3; cloreto de sódio 5;
fosfato dipotássico 2,5; dextrose 2,5), que foi incubado por 3 horas à 37ºC. Depois disto,
procedeu-se a inoculação de 0,1 mL deste cultivo em agar Muller Hinton através da
técnica de espalhamento.
Tabela 6: Relação dos antibióticos utilizados com suas características principais (TRABULSI, R. L.;
ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O. F., et al, 1999).
Antibiótico Grupo Modo de Ação
Cefalotonina BETALACTÂMICOS:
Cefalosporinas.
Inibe a síntese da parede celular através do
bloqueio da fase final de síntese da camada
de peptideoglicano.
Amoxilina BETALACTÂMICOS A amoxilina é um antibiótico
betalactâmico que se une a uma variedade
de proteínas responsáveis da síntese de
dita parede e atua destruindo a parede das
células bacterianas,
Ciprofloxaxina QUILONOLÔNICOS Inibe a síntese de DNA, através da inibição
da ação das girases que são enzimas que
promovem os enrolamentos das moléculas
de DNA para que ocupem menos espaço
na célula.
Gentamicina AMINOGLICOSÍDEOS
Induz a síntese anormal de proteínas e a
formação de ribossomos não-funcionais.
Fixa-se a várias proteínas.
Tetraciclina TETRACICLINAS Bloqueia a síntese proteica. Quando fixada
a subunidade 30S, impede a fixação dos
RNA tranportadores ao ribossomo.
Amicacina AMINOGLICOSÍDEOS
Inibe a síntese protéica das bactérias
sensíveis, pelo o bloqueio irreversível de
sub-unidades de ribossomas.
Os discos de antibióticos foram colocados nas placas inoculadas. Foram utilizados
os seguintes antibióticos: Ciprofloxaxin, Cefalexina, Gentamicina, Amoxilina,
Tetraciclina e Amicacina. As características de cada um destes antibióticos é mostrada na
Tabela 6.
36
As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 horas. Os halos
de inibição foram medidos com um paquímetro.
3.2.3.5 Isolamento de mutantes auxotróficos
A células de E. coli irradiadas com 150 Gy (aproximadamente 5% de sobrevivência)
foram ativadas em caldo nutriente e incubadas por 24 horas a 37ºC. A biomassa foi
centrifugada duas vezes em 3.400 rpm por 15 minutos e ressuspendida em solução salina
0,85% (NEDER, 1992).
Após isso, inoculou-se 0,2 mL com a suspensão centrifugada em 3,0 mL de meio
mínimo (g/L: Fosfato dibásico de potássio: 10,5; Fosfato monobásico de potássio: 4,5;
Citrato de sódio: 0,5; Sulfato de magnésio: 0,05; Sulfato de amônio: 1,0; Glicose: 2,0) e
acrescentado penicilina na concentração de 250 µg/mL. A suspensão em MM foi diluída
em 1:10 e 0,2 mL desta diluição também foi inoculado em 3,0 mL de meio mínimo
contendo penicilina. Ambas as concentrações foram incubadas por 24 horas à 37ºC
(NEDER, 1992).
Procedeu-se uma nova centrifugação (3.400 rpm por 15 minutos) para a remoção da
penicilina e as células foram ressuspendidas em 2,0 mL de solução salina 0,85%. Foi
semeado 0,1 mL dos tubos sem diluição e diluídos em 1:10
e 1:100 em placas contendo
agar nutriente. O inócuo foi espalhado através da técnica de espalhamento. As placas
foram incubadas por 24 horas a 37ºC (NEDER, 1992).
Foi realizada a contagem das placas e escolheu-se as placas contendo de 50 a 300
colônias. Essas placas fora replicadas, através da técnica da réplica de Lederberg e
Lederberg, para placas contendo agar meio mínimo e agar nutriente. As placas foram
incubadas por 24 horas à 37ºC (NEDER, 1992).
3.3 TERCEIRA IRRADIAÇÃO
3.3.1 Preparo das amostras
Células de E. coli (ATCC 25922) foram cultivadas em Caldo BHI, 37ºC por 24
horas, em seguida procedeu-se a centrifugação e a ressuspensão das células em solução
37
salina 0,85%, assim como descrito no item 3.1.1. A partir desta suspensão, foram feitas
diluições, posteriormente irradiadas (KAPPKE, 2004; KAPPKE, SILVA, SCHELIN, et
al, 2005).
Para a irradiação, alíquotas de 0,1 mL da diluição 1:10
6
em solução salina foram
inoculadas em Ágar MacConkey, utilizando a técnica de espalhamento (KAPPKE, 2004;
KAPPKE, SILVA, SCHELIN, et al, 2005).
3.3.2 Irradiação das amostras de E. coli
O procedimento para a irradiação das amostras está descrito no item 3.1.2. As placas
contendo E. coli foram submetidas à radiação gama nas doses de 30, 60, 90, 120, 150,
180, 210, 240 e 300 Gy em triplicata. Placas não irradiadas foram utilizadas como um
padrão de crescimento de E. coli.
3.3.3 Parâmetros utilizados na avaliação dos efeitos da irradiação sobre células
3.3.3.1 Curva de sobrevivência dos microrganismos irradiados
A curva de sobrevivência foi realizada de acordo com o procedimento já descrito
no item 3.1.3.1.
3.3.3.2 Análise morfológica dos microrganismos irradiados
Realizado conforme descrito no item 3.1.3.2.
3.3.3.3 Análise fisiológica dos microrganismos
As características fisiológicas dos microrganismos foram avaliadas através de
provas bioquímicas a partir de microrganismos cultivados conforme descrito no item
38
3.2.3.3. Foram realizados os testes contidos no Mini Kit para Enterobactérias da
Newprov®. A inoculação para avaliação das provas bioquímicas foi realizada de acordo
com a técnica explicada no item 3.2.3.3.
3.3.3.4 Análise da resistência dos microrganismos a antibióticos
A células de E. coli irradiadas e não irradiadas foram ativadas em caldo BHI e
incubadas por 24 horas a 36ºC. Inoculou-se 0,1 mL de E. coli ativada em caldo BHI em
3,0 mL de Caldo Tripticaseína de Soja (g/L: peptona de caseína 17; peptona de soja 3;
cloreto de sódio 5; fosfato dipotássico 2,5; dextrose 2,5), que foi incubado por 3 horas à
37ºC. Depois disto, procedeu-se a inoculação de 0,1 mL deste cultivo em agar Müller
Hinton utilizando a técnica de espalhamento. Os discos de antibióticos foram colocados
nas placas inoculadas, de modo que foram utilizados os mesmos antibióticos:
Ciprofloxaxin, Cefalexina, Gentamicina, Amoxilina, Tetraciclina e Amicacina. As placas
foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 horas. Os halos de inibição foram
medidos com um paquímetro e as características de cada um destes antibióticos é
mostrada na tabela 6 no item 3.2.3.4.
3.3.3.5 Isolamento de mutantes auxotróficos
Essa metodologia está descrita no item 3.2.3.5.
39
4 RESULTADOS
Após a E. coli ser submetida a diferentes doses de radiação gama cobalto-60
procedeu-se um estudo para verificar as alterações detectáveis macroscopicamente e
microscopicamente, as alterações metabólicas, além da determinação da curva de
sobrevivência da biomassa irradiada.
4.1 RESULTADOS OBTIDOS COM A PRIMEIRA IRRADIAÇÃO
4.1.1 Determinação da fração de sobrevivência
As médias do número de microrganismos sobreviventes (UFC/mL) em relação às
doses de irradiação e a fração de sobrevivência (FS) calculada através da equação 2 (item
3.1.3.1) estão mostradas na Tabela 7.
Placas irradiadas com doses acima de 300 Gy não apresentaram crescimento.
Tabela 7: Número de microrganismos sobreviventes (UFC/mL) e fração de sobrevivência em diferentes
doses de radiação aplicadas em E. coli no primeiro estudo.
Dose (Gy) Media de U.F.C./mL FS
0 79,5 10
7
1,00
60 2,67 10
7
0,033
120 6,00 10
7
0,075
180 4,00 10
7
0,050
240 1,00 10
7
0,013
300 0,00 0,00
A curva de sobrevivência celular (Figura 2) foi plotada considerando o número de
unidades formadoras de colônia no tempo zero como o crescimento ótimo. Foi realizada
uma aproximação dos pontos obtidos por uma curva exponencial que está apresentada em
vermelho no gráfico. Na aproximação, sua linha de tendência é dada pela equação 3 com
um fator de correlação de 0,994. Nesta equação, y representa a fração de sobrevivência e
x representa a dose absorvida fornecida em Gray (Gy).
18,58691
.0,99988
x
ey
−
= (3)
40
Figura 2: Curva da fração de sobrevivência celular para E. coli (ATCC25922) irradiada com feixe de raios
gama.
A equação 3 foi usada no cálculo da D
10
do presente estudo. A D
10
encontrada foi
de 42,7 Gy.
4.1.2 Características macroscópicas das colônias
Todas as colônias de E. coli irradiadas nas diferentes doses e cultivadas em ágar
MacConkey lactose positivas apresentaram coloração róseo-avermelhada intensa, secas e
opacas com odor de fermento, características da E. coli não irradiada quando cultivadas
neste meio. Ou seja, não foram verificadas diferenças macroscópicas entre as amostras.
4.1.3 Características microscópicas
As células de E. coli irradiadas nas diferentes doses de radiação gama não
apresentaram alterações morfológicas visíveis ao microscópio ótico (coloração de Gram)
quando comparadas com as células de E. coli não irradiadas.
A células de E. coli no microscópio óptico (coloração de Gram) apresentaram-se
como bastonetes curtos de coloração rósea.
41
4.1.4 Estudo da atividade metabólica da E. coli irradiada com raios gama
A E. coli irradiada com diferentes doses de radiação gama (cobalto-60) apresentou
comportamento característico da E. coli não irradiada quando submetido a várias provas
bioquímicas, relacionadas na Tabela 5 da metodologia (item 3.1.5). A Tabela 8 e a
Tabela 9 mostram os resultados dos testes bioquímicos realizados em relação à dose de
radiação gama recebida pela amostra, em placas e em tubos, respectivamente
(PILONETTO, 2006; RIBEIRO e SOARES, 2002).
Tabela 8: Resultado dos testes bioquímicos de descarboxilação da L-lisina, meio SIM, Fermenração da
Lactose, Citrato de Simmons, Vermelho de Metila e Vogues Proskauer para a E. coli cultivada e irradiada
em placas.
Dose de radiação
gama (Gy)
Prova Bioquímica
0
60
120
180
240
Lisina +
- + + +
Motilidade +
+ + + +
H
2
S - - - - -
SIM
Indol +
+ + + +
Fermentação +
+ + + + Lactose
Produção de gás +
+ + + +
Citrato - - - - -
Vermelho de Metila
+
+ + + + Clarck Lubs
Vogues Proskauer - - - - -
(+) Positivo, (-) Negativo
Os testes da lactose apresentaram resultados positivos para a fermentação e
produção de gás através da mudança de cor para o amarelo e a formação de bolhas nos
tubos de Duhan.
Os testes do citrato apresentaram resultado negativo para todas as amostras, com
meio sem crescimento e na coloração verde.
O teste realizado com o meio Klieger apresentou coloração amarela em todas as
amostras, o que já era esperado para E. coli mostrando que ela fermenta a lactose e a
glicose.
42
Tabela 9: Resultado do testes bioquímicos de Descarboxilação da L-lisina, meio SIM, Fermentação da
Lactose, Citrato de Simmons, Vermelho de Metila e Vogues Proskauer para a E. coli cultivada e irradiada
em tubos.
Dose de radiação
gama (Gy)
Prova bioquímica
0
60
120
180
240
300
Lisina - + + + + +
Motilidade +
+ + + + +
H
2
S - - - - - -
SIM
Indol +
+ + + + +
Fermentação +
+ + + + + Lactose
Produção de gás +
+ + + + +
Citrato - - - - - -
Vermelho de Metila
+
+ + + + + Clarck Lubs
Vogues Proskauer - - - - - -
(+) Positivo, (-) Negativo
A Tabela 10 e a Tabela 11 mostram o resultado do crescimento da E. coli em meio
EMB que é seletivo e confirmativo de E. coli.
Tabela 10: Resultado do meio EMB para as bactérias irradiadas em placas.
Dose de radiação gama (Gy) Crescimento Cor da Biomassa Brilho
0 + Violeta +
60 + Violeta +
120 + Violeta +
180 + Violeta +
240 + Violeta +
(+) Positivo, (-) Negativo
Tabela 11: Resultado do meio EMB para as bactérias irradiadas em tubos.
Dose de radiação gama (Gy) Crescimento Cor da Biomassa Brilho
0 + Violeta +
60 + Violeta +
120 + Violeta +
180 + Violeta +
240 + Violeta +
300 + Violeta +
(+) Positivo, (-) Negativo
43
4.2 RESULTADOS OBTIDOS COM A SEGUNDA IRRADIAÇÃO
4.2.1 Determinação da fração de sobrevivência
A média do número de microrganismos sobreviventes (UFC/mL) em relação às
doses de irradiação é mostrada na Tabela 12.
53667,28
.97963,0
x
ey
−
=
(4)
A Figura 3 mostra a curva de sobrevivência para a segunda irradiação,
relacionando a fração de sobrevivência com a dose absorvida.
Foi realizada uma aproximação dos pontos obtidos para uma curva exponencial
que está apresentada em vermelho no gráfico da Figura 3. Na aproximação, sua linha de
tendência é dada pela equação 4 com um fator de correlação de 0,934. Nesta equação, y é
a fração de sobrevivência e x é a dose absorvida fornecida em Gray (Gy).
A equação 4 foi usada no cálculo da D
10
do presente estudo. A D
10
encontrada foi
de 65,1 Gy.
Tabela 12: Número de microrganismos sobreviventes (UFC/mL) e fração de sobrevivência em diferentes
doses de radiação aplicadas em E. coli no segundo estudo.
Dose (Gy) UFC.10
-5
/ml FS
0 5450
1
30 2250 0,423
60 1475 0,271
90 250 0,046
120 350 0,064
150 475 0,087
180 50 0,009
210 25 0,005
240 0 0
270 0 0
300 0 0
44
Figura 3: Curva de sobrevivência celular para E. coli irradiada com feixe de raios gama.
4.2.2 Características macroscópicas das colônias
Todas as colônias de E. coli irradiadas nas diferentes doses e cultivadas em ágar
MacConkey lactose positiva apresentaram coloração róseo-avermelhada intensa, secas e
opacas com odor de fermento, características típicas da E. coli não irradiadas quando
cultivadas neste meio. Ou seja, não foram observadas diferenças macroscópicas entre as
amostras.
4.2.3 Características microscópicas
As células de E. coli irradiadas apresentaram-se normais em tamanho, forma e cor,
como bastonetes curtos de coloração rosa, conforme as células de E. coli, não irradiadas.
Ou seja, não foram observadas diferenças microscópicas entre as amostras.
4.2.4 Estudo da atividade metabólica da E. coli irradiada com raios gama
A E. coli irradiada com diferentes doses de radiação gama (cobalto-60) apresentou
comportamento característico da E. coli não irradiada quando submetida a várias provas
45
bioquímicas, relacionadas na tabela 14. A única exceção foi o teste da desaminação do L-
Triptofano, através da enzima triptofano desaminase. (PILONETTO, 2006; RIBEIRO e
SOARES, 2002).
Tabela 13: Resultado do testes bioquímicos do mini kit para identificação de enterobactérias, para as
diferentes doses de radiação gama aplicadas em E. coli assim como na E. coli não irradiada.
Dose (Gy) Radiação γ
Prova
Bioquímica
0 30 60 90 120 150 180 210
L-triptofano - + + + + + + +
Glicose + + + + + + + +
Gás + + + + + + + +
EPM
H
2
S - - - - - - - -
Lisina + + + + + + + +
Motilidade + + + + + + + +
Indol + + + + + + + + MIO
Ornitina + + + + + + + +
Citrato - - - - - - - -
Rhamnose + + + + + + + +
(+) Positivo, (-) Negativo
Os resultados dos testes bioquímicos são mostrados numa seqüência de Figuras de
4 até 12. A Figura 4 mostra os testes controle, não inoculados. Os resultados para E. coli
não irradiada é mostrado na Figura 4. Na Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8, Figura 9,
Figura 10 e Figura 11 estão os resultados obtidos para a E. coli irradiada com 30, 60, 90,
120, 150, 180 e 210 Gy, respectivamente. O primeiro tubo corresponde ao meio EPM, o
segundo ao caldo Lisina, o terceiro ao meio MIO, o quarto ao Citrato de Simmons e o
último ao caldo Rhamnose.
Figura 4: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose não inoculados.
46
Figura 5: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a
E. coli não irradiada.
Figura 6: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a
E. coli irradiada com 30 Gy de raios gama.
Figura 7: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a
E. coli irradiada com 60 Gy de raios gama.
Figura 8: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a
E. coli irradiada com 90 Gy de raios gama.
Figura 9: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a
E. coli irradiada com 120 Gy de raios gama.
47
Figura 10: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a
E. coli irradiada com 150 Gy de raios gama.
Figura 11: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a
E. coli irradiada com 180 Gy de raios gama.
Figura 12: Meios EPM, caldo Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a
E. coli irradiada com 210 Gy de raios gama.
4.2.5 Análise da resistência das E. coli a antibióticos
Os halos de inibição dos antibióticos foram medidos após 24 horas da incubação.
A Tabela 15 mostra o tamanho dos halos medidos em milímetros para cada antibiótico em
cada dose de radiação. O tamanho dos halos indica a sensibilidade da bactérias ao
antibiótico (RIBEIRO e SOARES, 2002).
A Tabela 14 mostra os limites de tamanhos de halos para a classificação das
bactérias em sensíveis intermediárias e resistentes.
48
Tabela 14: Tabela mostrando a relação dos tamanhos de halos com a classificação dos microrganismos em
sensível, intermediário ou resistente aos antibióticos.
Halos de inibição (mm) Antibiótico
Sensível Intermediário Resistente
Ciprofloxaxina ≤ 15 16 – 20 ≥ 21
Cefalotonina ≤ 14 15 – 17 ≥ 18
Gentamicina ≤ 12 13 – 14 ≥ 15
Amoxilina ≤ 13 14 – 17 ≥ 18
Tetraciclina ≤ 14 15 – 18 ≥ 19
Amicacina ≤ 14 15 – 16 ≥ 17
A Tabela 15 relaciona o tamanho do halo formado com a dose absorvida, dizendo
também se o tamanho do halo é classificado como resistente (R), intermediário (I) ou
sensível (S).
Tabela 15: Resultado do antibiograma realizado com as células de E. coli irradiadas e não irradiadas. O
número representa o diâmetro do halo em milímetros.
Dose de
radiação γ
(Gy)
Antibiótico
0 30 60 90 120 150 180 210
Ciprofloxaxina 30 R 35 R
33 R
30 R
34 R
24 R
28 R
27 R
Cefalotonina 13 S 15 I 14 S 15 I 14 S 13 S 15 I 15 I
Gentamicina 20 R 20 R
20 R
20 R
20 R
20 R
20 R
20 R
Amoxilina 17 I 19 R
19 R
19 R
17 I 20 R
20 R
18 R
Tetraciclina 24 R 23 R
22 R
22 R
23 R
24 R
22 R
20 R
Amicacina 19 R 18 R
19 R
18 R
19 R
19 R
21 R
18 R
(R) Resistente, (I) Intermediário, (S) Sensível.
A Figura 12, a Figura 13, a Figura 14, a Figura 15, a Figura 16, a Figura 17, a
Figura 18, a Figura 19 e a Figura 20 mostram as placas do antibiograma para a E. coli não
irradiada e irradiada nas doses 30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 Gy, respectivamente.
4.2.6 Isolamento de mutantes auxotróficos
A diluição 1:10 das células irradiadas com 150 Gy, com 182 colônias, foi utilizada
para a realização das réplicas .
Nas réplicas, incubadas por 24 horas a 37°C, apareceu o crescimento de duas
colônias em agar nutriente que não cresceram em meio mínimo.
49
Figura 13: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli não irradiadas.
Figura 14: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 30 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
Figura 15: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 60 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
Figura 16: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 90 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
50
Figura 17: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 120 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
Figura 18: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 150 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
Figura 19: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 180 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
Figura 20: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 210 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
51
4.3 RESULTADOS OBTIDOS COM A TERCEIRA IRRADIAÇÃO
4.3.1 Determinação da fração de sobrevivência
A Tabela 16 mostra o número de unidades formadoras de colônias em cada placa
relacionando com a dose absorvida. Não foi possível fazer uma curva de sobrevivência
assim como não foi possível achar uma D
10
significativa.
Tabela 16: Número de microrganismos sobreviventes (UFC/mL) e fração de sobrevivência em diferentes
doses de radiação aplicadas em E. coli no terceiro estudo.
Dose (Gy) Placa 1
UFC.10
-5
/ml
Placa 2
UFC.10
-5
/ml
Placa 3
UFC.10
-5
/ml
0 0 1 39
30 0 69 54
60 21 0 3
90 5 20 0
120 0 0 2
150 0 1 3
180 0 0 0
210 0 0 0
240 0 0 0
300 0 0 0
4.3.2 Características macroscópicas das colônias
Todas as colônias de E. coli irradiadas nas diferentes doses e cultivadas em ágar
MacConkey lactose positiva apresentaram-se com coloração róseo-avermelhada intensa,
secas e opacas com odor de fermento, características típicas da E. coli não irradiadas
quando cultivadas neste meio. Ou seja, não foram observadas diferenças macroscópicas
entre as amostras.
4.3.3 Características microscópicas
As células de E. coli irradiadas apresentaram-se em relação ao tamanho, forma e
cor, foram observados bastonetes curtos de coloração rosa, conforme as células de E. coli
não irradiadas. Ou seja, não foram observadas diferenças microscópicas entre as amostras.
52
4.3.4 Estudo da atividade metabólica da E. coli irradiada com raios gama
A E. coli irradiada com diferentes doses de radiação gama (cobalto-60) apresentou
comportamento característico da E. coli não irradiada quando submetida a várias provas
bioquímicas relacionadas na Tabela 17. (PILONETTO, 2006; RIBEIRO e SOARES,
2002). Os resultados dose testes bioquímicos são mostrados nas figuras 21 a 26.
Tabela 17: Resultado do testes bioquímicos do mini kit para identificação de enterobactérias, para as
diferentes doses de radiação gama aplicadas em E. coli assim como na E. coli não irradiada.
Dose de
Radiação γ
(Gy)
Prova
Bioquímica
0 30 60 90 120 150
L-triptofano - - - - - -
Glicose + + + + + +
Gás + + + + + +
EPM
H
2
S - - - - - -
Lisina + + + + + +
Motilidade + + + + + +
Indol + + + + + + MIO
Ornitina + + + + + +
Citrato - - - - - -
Rhamnose + + + + + +
(+) Positivo, (-) Negativo.
Figura 21: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a E. coli não
irradiada.
53
Figura 22: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a E. coli
irradiada com 30 Gy de raios gama.
Figura 23: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a E. coli
irradiada com 60 Gy de raios gama.
Figura 24: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a E. coli
irradiada com 90 Gy de raios gama.
Figura 25: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a E. coli
irradiada com 120 Gy de raios gama.
Figura 26: Meios EPM, caldo Lisina, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose inoculados com a E. coli
irradiada com 150 Gy de raios gama.
54
4.3.5 Análise da resistência das E. coli a antibióticos
Os halos de inibição dos antibióticos foram medidos após 24 horas da incubação.
A tabela 17 mostra o tamanho dos halos medidos em milímetros para cada antibiótico em
cada dose de radiação(RIBEIRO e SOARES, 2002).
A Tabela 18 relaciona o tamanho do halo formado com a dose absorvida, dizendo
também se o tamanho do halo é classificado como resistente (R), intermediário (I) ou
sensível (S).
Tabela 18: Resultado do antibiograma realizado com as bactérias irradiadas e não irradiadas. O número
representa o diâmetro do halo em milímetros.
Dose de radiação γ
(Gy)
Antibiótico
0 30 60 90 120 150
Ciprofloxaxina 28,3 R 30,9 R 30,7 R 26,9 R 31,3 R 34,7 R
Cefalotina 13,4 S 12,1 S 13,8 S 12,7 S 12,1 S 11,2 S
Gentamicina 20,8 R 17,6 R 17,7 R 17,3 R 20,5 R 20,8 R
Amoxilina 15,7 I 14,2 I 13,5 I 15,1 I 14,8 I 15,0 I
Tetraciclina 19,1 R 19,2 R 19,6 R 19,6 R 19,9 R 19,0 R
Amicacina 20,5 R 21,3 R 20,1 R 21,9 R 20,5 R 21,9 R
(R) Resistente, (I) Intermediário, (S) Sensível.
A Figura 26, a Figura 278, a Figura 28Figura 29, Figura 30, Figura 31 e Figura 32
mostram as placas do antibiograma para a E. coli não irradiada e irradiada nas doses 30,
60, 90, 120 e 150 Gy, respectivamente.
Figura 27: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli não irradiadas.
55
Figura 28: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 30 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
Figura 29: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 60 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
Figura 30: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 90 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
Figura 31: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 120 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
56
Figura 32: Placa de antibiograma (ágar Muller Hinton) para as células de E. coli irradiadas com 150 Gy de
radiação gama (cobalto-60).
4.3.6 Isolamento de mutantes auxotróficos
Para o experimento realizado com 120 Gy, foram feitas réplicas das placas nas
diluições 1:1 e 1:10 em meio mínimo e agar nutriente. As réplicas são mostradas na
Figura 33 e na Figura 34, sendo elas nas diluições 1:1 e 1:10 respectivamente.
Nas placas contendo E. coli irradiadas com 120 Gy de radiação gama (cobalto-60), a
contagem de UFC crescidas em agar nutriente que não cresceram em meio mínimo é
apresentada na Tabela 19.
Tabela 19: Resultado do isolamento de mutantes auxotróficos realizado com células de E. coli irradiadas
com 120 Gy de radiação gama (cobalto-60).
Diluição UFC crescidas em
AN
UFC crescidas em AN que não
cresceram em MM.
1:1 113 56
1:10 104 48
Figura 33: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli irradiadas com 120
Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:1, utilizando a técnica da réplica de Lederberg e Lederberg.
57
Figura 34: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli irradiadas com 120
Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:10, utilizando a técnica da réplica de Lederberg e
Lederberg.
Para o experimento realizado com 150 Gy, foram feitas réplicas das placas nas
diluições 1:1, 1:10 e 1:100 em meio mínimo e agar nutriente. As réplicas são mostradas
na Figura 35, na Figura 36 e na Figura 37, sendo elas nas diluições 1:1, 1:10 e 1:100
respectivamente.
Figura 35: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli irradiadas com 150
Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:1, utilizando a técnica da réplica de Lederberg e Lederberg.
Figura 36: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli irradiadas com 150
Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:10, utilizando a técnica da réplica de Lederberg e
Lederberg.
58
Figura 37: Placas de agar nutriente e meio mínimo, inoculadas com células de E. coli irradiadas com 150
Gy de radiação gama (cobalto-60) na diluição 1:001, utilizando a técnica da réplica de de Lederberg e
Lederberg.
Nas placas contendo E. coli irradiadas com 150 Gy de radiação gama (cobalto-60), a
contagem de UFC crescidas em agar nutriente que não cresceram em meio mínimo é
apresentada na Tabela 20.
Tabela 20: Resultado do isolamento de mutantes auxotróficos realizado com células de E. coli irradiadas
com 150 Gy de radiação gama (cobalto-60).
Diluição UFC crescidas em
AN
UFC crescidas em AN que não
cresceram em MM.
1:1 47 9
1:10 14 4
1:100 61 1
59
5 DISCUSSÃO
A célula de E. coli foi utilizada como instrumento para a determinação da
letalidade da radiação gama e seu poder para alterar características fenotípicas e
genotípicas das células.
Como foram realizados três experimentos de irradiação a discussão será dividida
em três etapas, seguida das conclusões e sugestões para trabalhos futuros.
5.1 PRIMEIRA IRRADIAÇÃO
A primeira irradiação foi realizada para verificar qual a dose absorvida que inibe o
crescimento da E. coli em agar MacConkey. Na primeira irradiação a E. coli em placas foi
submetida a doses de 60, 120, 180, 240, 300 e 780 Gy; com isso pôde-se verificar que as
doses de 60 a 240 Gy reduziram consideravelmente o número de microrganismos
sobreviventes. Estas doses geraram uma fração de sobrevivência de 7,55% e 1,26%,
respectivamente. Com doses de 300 e 780 Gy não foi verificado crescimento nas placas o
que permite a observação de que doses acima de 300 Gy foram letais para E. coli em agar
MacConkey.
A D
10
para E. coli neste estudo verificada através da equação 3 é de
aproximadamente 42,7 Gy, que é bem menor que a D
10
apresentada no estudo de Joint
FAQ/IAEA/WHO Study Group (1997). Essa referência apresenta a D
10
da E. coli no
camarão como 235 Gy. Isso significa que com uma dose de 235 Gy a população de E. coli
no camarão é reduzida a 10% da população inicial (Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group,
1997). Clavero, Monk e Beuchat et al. determinaram que a E. coli O157:H7 refrigerada
teve uma D
10
de 241 Gy e a congelada uma D
10
de 307 Gy. (CLAVERO, MONK,
BEUCHAT, et al, 1994). Apesar disso, como o meio em que a E. coli se desenvolveu foi
diferente, a sua reação aos efeitos da radiação também podem ter sido diferente (Joint
FAQ/IAEA/WHO Study Group, 1997).
Não foi possível analisar a sobrevivência das amostras líquidas devido à grande
quantidade de inócuo que foi colocado no caldo BHI. Houve grande turvação do meio
mesmo antes de serem irradiados. Depois de irradiados, não foi possível diferenciar o
crescimento de acordo com as doses. Mesmo assim, alíquotas da amostra contida nos
60
tubos irradiados foram submetidas aos demais testes de morfologia e testes bioquímicos.
As análises morfológicas e bioquímicas realizadas com as células de E. coli
crescidas após a irradiação não apresentaram um comportamento diferente do esperado
para E. coli e nem diferente do controle. Sendo assim, a E. coli cultivada em placas
apresentou colônias com bordas regulares e pigmentação rosa-avermelhada conforme o
esperado para E. coli em agar MacConkey (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996;
RIBEIRO e SOARES, 2002).
Utilizando a microscopia óptica e a coloração de Gram foi possível verificar que a
E. coli irradiada em tubos ou placas não apresentou alterações morfológicas visíveis nesta
técnica. As células de E. coli apresentaram coloração, forma e tamanho característicos de
sua linhagem, mostrando-se bastonetes muito curtos com coloração rósea, características
de bacterias Gram-negativas (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996; RIBEIRO e SOARES,
2002).
As provas bioquímicas realizadas (Lisina, EMB, SIM, fermentação da lactose,
citrato de Simmons, meio Klieger, Vogues Proskauer e Vermelho de Metila)
apresentaram-se de acordo com o esperado para E. coli. O teste da lisina foi a única
exceção, mas não se pode afirmar que a E. coli sofreu uma alteração, pois como mostram
as Tabelas 8 e 9, as células não irradiadas apresentaram um comportamento inadequado
sugerindo que o meio Lisina preparado no próprio laboratório de microbiologia não estava
adequado à realização do teste. Devido a este problema, para os testes realizados
posteriormente as provas bioquímicas foram adquiridas de uma empresa especializada e
dentro dos padrões de qualidade exigidos em trabalhos científicos (RIBEIRO e SOARES,
2002).
.
5.2 SEGUNDA IRRADIAÇÃO
Considerando que doses acima de 300 Gy são letais para as células de E.coli em
Ágar MacConkey, nesta etapa da pesquisa as células de E. coli foram irradiadas em placas
com 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 e 300 Gy, aumentando assim, o número de
pontos no gráfico da curva de sobrevivência.
A curva de sobrevivência da figura 2 permite afirmar que nas condições de cultivo
utilizadas no presente trabalho, a cepa de E. coli (ATCC25922) se mostrou sensível à
radiação mesmo nas menores doses.
61
De acordo com Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group (1997), as células de E. coli
quando expostas à radiação em alimentos, a D
10
é de aproximadamente 260. Porém,
através da equação 4, foi possível achar uma D
10
de aproximadamente 65,1 Gy para a E.
coli nas condições do presente estudo.
Como a resposta das células à ação da radiação varia de acordo com uma série de
fatores, essa diferença pode ser aceita. Entre esses fatores está a ação do meio externo
como: (1) temperatura no momento da irradiação; (2) quantidade de oxigênio no ar; (3)
atividade de água (meios mais úmidos provocam maior sensibilidade das células à
radiação); e (4) composição química do meio (Joint FAQ/IAEA/WHO Study Group,
1997).
Como as placas utilizadas para a irradiação possuem um diâmetro muito pequeno
(5,0 cm) não foi possível utilizar o número padrão para contagem em placas que é de 30 a
300 unidades formadoras de colônia ((PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996; RIBEIRO e
SOARES, 2002). Na placa não irradiada o número de UFC crescido foi de
aproximadamente 100 para a alíquota de 0,02 mL de E. coli na diluição 10
-6
. A alíquota
também foi diminuída em relação à primeira irradiação devido à pouca absorção da
alíquota pelo agar MacConkey na hora do espalhamento.
Após a irradiação, as células de E. coli foram submetidas a avaliações de sua
morfologia, características bioquímicas, resistência a antibióticos e a um teste de
isolamento de mutantes auxotróficos.
A avaliação macroscópica e microscópica não apresentou alterações perceptíveis
assim como a maior parte dos testes bioquímicos que mostraram-se como esperado para
E. coli.
A única exceção foi o teste do L-triptofano, onde a E. coli não irradiada ganhou
coloração amarelada em todo o tubo como o esperado para a E. coli ATCC 259922,
significando que ela não possui a capacidade de desaminar o L-triptofano. Já a E. coli
irradiada apresentou coloração verde no ápice do tubo, o que representa a capacidade de
desaminar o L-triptofano, adquirida provavelmente como conseqüência das doses de
radiação gama recebidas, caracterizando uma alteração genotípica.
O antibiograma realizado com as células de E. coli irradiadas e não irradiadas
mostrou diferenças entre as amostras. A E. coli não irradiada formou halos de inibição
para todos os antibióticos mostrando-se sensível à cefalotonina, intermediário para
amoxilina e resistente para ciprofloxacina, gentamicina, tetraciclina e amicacina
(PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996; RIBEIRO e SOARES, 2002). A Tabela 6 relaciona
62
o antibiótico utilizado, seu grupo e sua ação.
Para o antibiótico cefalotonina as células de E. coli irradiadas com doses de 30,
90, 180 e 210 Gy apresentaram mudança de comportamento se comparadas às células de
E. coli não irradiadas. Ela passou de sensível para intermediário, isso significa que ela
estava mais resistente a esse antibiótico após a irradiação.
Quando exposta ao antibiótico amoxilina, as células de E. coli irradiadas com
doses de 30, 60, 90, 150, 180 e 210 Gy apresentaram mudança de comportamento de
resistência de intermediário para resistente, quando comparadas às células de E. coli não
irradiadas. Com isso, sugere-se que a E. coli nesses dois casos adquiriu uma maior
resistência aos antibióticos. Em nenhum caso estudado no presente trabalho ela ficou mais
sensível, sugerindo que a radiação pode aumentar a resistência dos microrganismos a
antibióticos.
Muitas bactérias possuem resistência intrínseca a vários grupos de antibióticos,
porém o problema da resistência aos antimicrobianos é colocado quando as bactérias
sofrem mutações, originando formas resistentes (SOUSA, M. A., FERREIRA, E. S.,
CONCEIÇÃO, G. C., 2004).
A aquisição de resistência por uma célula bacteriana sensível é sempre decorrente
de uma alteração genética expressa bioquimicamente. (TRABULSI, R. L.,
ALTERTHUM, F., GOMPERTZ, O. F., et al, 1999; TORTORA, FUNKE e CASE,
2000).
A célula para adquirir resistência a um antibiótico deve alterar seu material
genético isto significa que a mudança pode ser no nível cromossômico ou plasmidial. Em
nível cromossômico, as alterações podem ser por aquisição de genes ou mutações. Os
plasmídeos são pequenos DNAs circulares que são independentes do DNA
cromossômico, carregam genes que não são essenciais para a vida e podem ser
transmitidos de uma bactéria para outra. Eles também podem sofrer mutações (SOUSA,
M. A., FERREIRA, E. S., CONCEIÇÃO, G. C., 2004).
Os mecanismos genéticos que codificam a resistência bacteriana se exteriorizam
por seis principais mecanismos bioquímicos de ação: inativação enzimática da droga,
alteração da permeabilidade bacteriana à droga, alteração de sistemas de transporte na
célula, retirada ativa da droga do meio intracelular, alteração do receptor à droga e
modificação do sistema metabólico ativo para a droga e síntese das vias metabólicas
alternativas (SOUSA, M. A., FERREIRA, E. S., CONCEIÇÃO, G. C., 2004).
Os dois antibióticos a que as células de E. coli em estudo adquiriram resistência
63
são do grupo dos betalactâmicos. As bactérias geralmente se tornam resistentes a estes
antibióticos através da produção das betalactamases que degradariam o antibiótico com o
anel β-lactâmico. As betalactamases das bactérias Gram-negativas são em maior número e
apresentam espectro de ação mais variado (TRABULSI, R. L., ALTERTHUM, F.,
GOMPERTZ, O. F., et al, 1999; TORTORA, FUNKE e CASE, 2000).
As betalactamases constituem um grupo heterogêneo de enzimas capazes de
inativar as penicilinas, cefalosporinas e por vezes os monobactâmicos. Estas enzimas são
freqüentemente produzidas por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, aeróbias e
anaeróbias, e quebram o anel betalactâmico por hidroxilação irreversível da ligação
amida, com inativação do antibiótico. A produção de betalactamases é o principal
mecanismo de resistência das bactérias Gram-negativas. O grau de resistência irá
depender da quantidade de enzima produzida, da habilidade dessa enzima em hidrolisar o
antimicrobiano em questão e da velocidade com que o betalactâmico penetra pela
membrana externa da bactéria (SOUSA, M. A., FERREIRA, E. S., CONCEIÇÃO, G. C.,
2004).
A produção das betalactamases é geralmente mediada por plasmídeos que são
pequenas moléculas de DNA circulares extra-cromossômicos. Esses plasmídeos são os
grandes responsáveis pela transmissão da resistência das bactérias a antibióticos.
(TRABULSI, R. L., ALTERTHUM, F., GOMPERTZ, O. F., et al, 1999; TORTORA,
FUNKE e CASE, 2000).
A resistência adquirida aos antibióticos cefalotonina e amoxilina pode ter ocorrido
por uma alteração plasmidial que resultou numa modificação dessa característica das
células irradiadas. Mas, como as mudanças no tamanho dos halos medidos no presente
estudo foram muito pequenas, é possível que a alteração seja devido a erros de medida.
Por isso, para um próximo teste sugere-se que os diâmetros dos halos sejam medidos em
diferentes posições, e após a medida seja considerada a média dos diâmetros medidos para
cada halo.
No isolamento de mutantes auxotróficos feito para a E. coli irradiada com 150 Gy
foi possível detectar duas colônias que cresceram nas placas de agar nutriente (meio
completo), mas que não cresceram em agar meio mínimo, sendo consideradas assim
mutantes auxotróficos. Essas colônias devem ser submetidas aos testes para
caracterização de mutantes auxotróficos. Essa futura análise poderá fornecer o tipo de
nutriente que a E. coli deixou de produzir.
64
5.3 TERCEIRA IRRADIAÇÃO
A terceira irradiação foi realizada de acordo com as necessidades previstas através
da segunda irradiação.
Apesar de terem sido utilizadas placas maiores, que deveriam facilitar a contagem
e proporcionar um aumento na quantidade de células da amostra, o resultado obtido com
essa contagem não foi satisfatório. As unidades formadoras de colônias não cresceram de
acordo com o esperado e não foi possível plotar uma curva de sobrevivência com esses
dados. Mesmo assim, os demais testes foram realizados.
A avaliação macro e microscópica da E. coli irradiada, comparada com a não
irradiada, não apresentou alterações verificadas através da metodologia deste estudo nas
células e colônias.
Nas provas bioquímicas realizadas, as células de E. coli não apresentaram
alterações. Os resultados obtidos tanto para as células não irradiadas quanto para as
células irradiadas foram os mesmos.
No antibiograma realizado para verificar o padrão de sensibilidade ou resistência
das células aos antibióticos, a E. coli não irradiada e a irradiada formaram halos de
inibição para todos os antibióticos mostrando-se sensíveis à cefalotonina, intermediárias
para amoxilina e resistentes para ciprofloxacina, gentamicina, tetraciclina e amicacina.
Então, a E. coli não apresentou alterações relacionadas com sua resposta aos antibióticos
utilizados (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996; RIBEIRO e SOARES, 2002).
No isolamento de mutantes auxotróficos feito para as células de E. coli irradiadas
com 120 Gy e 150Gy foi possível detectar várias colônias que cresceram nas placas de
agar nutriente (meio completo), mas que não cresceram em agar meio mínimo como
mostram as Tabelas 18 e 19. Essas bactérias perderam a capacidade de sintetizar algum
aminoácido ou vitamina que era necessário para sua sobrevivência. Elas conseguiram
crescer em agar nutriente por que esse meio é rico em nutrientes e fornece todos os
aminoácidos ou vitaminas que são necessários para a sobrevivência das células, mas como
no meio mínimo esses nutrientes não estavam presentes e como elas não conseguiram
produzí-los, não foi possível o seu desenvolvimento. Por isso, essas colônias são
consideradas mutantes auxotróficos (AZEVEDO, 1998; PIZZIANI-KLEINER, PEREIRA
e AZEVEDO, 1998; NEDER, 1992).
Existe na literatura, referências como o a de Zhang e Sudin (2004) que relatam o
mesmo acontecimento para outras bactérias ou tipos de radiação. O estudo de Zhang e
65
Sudin (2004) relata o mesmo resultado para a bactéria Pseudomonas syringae ao ser
exposta à radiação ultravioleta.
Esses mutantes auxotróficos devem ser submetidos a testes para sua
caracterização. Essa futura análise poderá fornecer o tipo de nutriente que a E. coli deixou
de produzir.
5.4 CONCLUSÕES
As células de E. coli inoculadas em agar MacConkey foram irradiadas com doses
de 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 480, 600 e 750 Gy no laboratório LIN-
COPPE da UFRJ. Em seguida, as amostras irradiadas e as não irradiadas foram analisadas
através de coloração de Gram, testes bioquímicos (EPM, MIO, caldo Lisina, Citrato de
Simmons e caldo Rhamnose), antibiograma, isolamento de mutantes auxotróficos, no
Laboratório de Microbiologia do Departamento de Química e Biologia da UTFPR.
O desenvolvimento do presente trabalho possibilitou as seguintes conclusões:
• Foi possível evidenciar que a dose de 300 Gy é letal para a E. coli inoculada
em agar MacConkey.
• O valor médio de D
10
encontrado foi de 53,9 Gy.
• Não se percebeu alterações morfológicas microscópicas nas células de E. coli
irradiadas através do uso de microscópio óptico (coloração de Gram) e
também não foram achadas alterações macroscópicas nas colônias.
• Os testes bioquímicos realizados mostraram que a E. coli irradiada e a não
irradiada apresentaram o mesmo comportamento nos meios de cultura caldo
Lisina, meio MIO, Citrato de Simmons e caldo Rhamnose, mas após irradiada,
a E. coli pode ter seu comportamento bioquímico alterado para o meio EPM,
mostrando-se capaz de desaminar o L-triptofano.
• Para os antibióticos cefalotonina e amoxilina, a E. coli após irradiada mostrou-
se capaz de adquirir maior resistência.
• Durante os experimentos apareceram algumas colônias consideradas mutantes
auxotróficos.
• A radiação ionizante é capaz de modificar algumas características das células
de E. coli.
66
5.5 TRABALHOS FUTUROS
De acordo com o que já foi realizado e com as dificuldades encontradas aqui são
apresentadas sugestões para trabalhos futuros:
• Realização de microscopia eletrônica das células de E. coli ATCC25922 não
irradiada e irradiada.
• Irradiação da E. coli em meio líquido.
• Irradiação de E. coli com feixe de prótons e comparação dos resultados.
• Caracterização dos mutantes auxotróficos.
67
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73
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de alterações em células de
Escherichia coli expostas à radiação gama (cobalto-60). As irradiações foram realizadas
no Laboratório de Instrumentação Nuclear LIN-COPPE da UFRJ e as análises no
Laboratório de Microbiologia do Departamento de Química e Biologia da UTFPR. As
células de E. coli foram irradiadas com doses de 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300,
480, 600 e 750 Gy. Em seguida, as amostras irradiadas e não irradiadas foram analisadas
através de coloração de Gram, testes bioquímicos (EPM, MIO, caldo Lisina, Citrato de
Simmons e caldo Rhamnose), antibiograma e isolamento de mutantes auxotróficos. Foi
observado que para as doses recebidas a E. coli não apresentou alterações morfológicas. O
valor médio de D
10
encontrado foi de 53,9 Gy. Algumas células de E. coli após irradiadas
mostraram-se capazes de desaminar o L-triptofano ou a E. coli alterou
sua sensibilidade aos antibióticos amoxilina e cefalotonina. Também foi verificado o
aparecimento de colônias mutantes auxotróficas após a irradiação.
PALAVRAS-CHAVE
Escherichia coli, gama, mutações, irradiação.
ÁREA E SUB-ÁREA DE CONHECIMENTO
10500006 Física
10504001 Física Nuclear
20000006 Ciencias Biológicas
20901003 Biofísica
2007
n° 439
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