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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias
AVALIAÇÃO DO HAMSTER (Mesocricetus auratus) COMO MODELO
EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO DA TRANSMISSÃO CONGÊNITA
DO Toxoplasma gondii DURANTE AS FASES CRÔNICA E AGUDA
DA INFECÇÃO E DA TRANSMISSÃO LACTOGÊNICA.
LORENA EVA BIGATTI
Porto Alegre
2007
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
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2
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS –GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
AVALIAÇÃO DO HAMSTER (Mesocricetus auratus) COMO MODELO
EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO DA TRANSMISSÃO CONGÊNITA
DO Toxoplasma gondii DURANTE AS FASES CRÔNICA E AGUDA
DA INFECÇÃO E DA TRANSMISSÃO LACTOGÊNICA .
LORENA EVA BIGATTI
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós Graduação da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul como um dos pré-
requisitos para a obtenção do título de
Mestre em Ciências Veterinárias.
Orientador:
Prof. Dr. Flávio Antônio Pacheco de Araújo.
Projeto aprovado pelo Comitê de Ética da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul.
Porto Alegre
2007
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3
4
5
Para
Eduardo, Gabriel e Honey
6
AGRADECIMENTOS
Ao meu Orientador Prof. Dr. Flávio Antonio Pacheco de Araújo, pela sábia
orientação, pelo apoio, confiança, amizade e pelo estímulo que me ofereceu.
Ao meu Orientador colaborador Prof. Dr. Álvaro Freyre, (Professor Agregado
de Parasitologia de La Universidad de la Republica Facultad de Veterinaria
Montevideo- Uruguay), pela orientação sempre presente, pela precisão de envio dos
materiais, de suma importância e da realização da técnicas de AD (aglutinação
direta ) em Montevidéo.
A Dra. Sandra Tietz Marques, pelo apoio, confiança, amizade, conhecimento
e estímulo sempre presentes.
As colegas de Laboratório Thanara Louzada, Luciane Dubina, Cristina Fialho,
Jairo de Jesus, os quais foram muito importantes para mim durante o Mestrado.
A toda equipe do Pós Graduação que sempre foram gentis e prestativas para
comigo,
À Faculdade de Veterinária por ter me proporcionado este aprimoramento
como profissional e reforçou em mim a convicção que devemos sempre tentar nos
aprimorar através do estudo para que nosso saber se amplie cada vez mais, para
nossa capacitação como profissional e ser humano.
Aos Hamster, animais dóceis e tão prestativos que aprendi muito sobre eles.
Aos professores da Faculdade de Veterinária que sempre me receberam com
muito carinho e de portas abertas.
Ao meu Pai Salvatore Roberto Bigatti, pelo exemplo de homem bom e
humano, amante da natureza e dos animais
A minha Mãe Ines Bonomi Bigatti, pelos ensinamentos e exemplos
importantes aos quais pude buscar sempre o meu melhor.
Ao meu irmão Alberto Pietro Bigatti, que sempre esteve presente e é muito
importante para mim.
À Equipe da Clínica Veterinária Moinhos de Vento pela compreensão e
carinho sempre presentes, em especial a Viviane Bargmann que esteve ao meu lado
em todos os momentos.
Ao Eduardo pelo estímulo, pelo amor e carinho sempre presentes, ao Gabriel
um milagre em minha vida, a Honey um exemplo de amor.
7
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................09
LISTA DE TABELAS................................................................................... 10
LISTA DE FIGURAS................................................................................... 11
RESUMO.................................................................................................... 12
ABSTRACT................................................................................................ 13
1.INTRODUÇÃO......................................................................................... 14
2.OBJETIVOS............................................................................................ 17
2.1 OBJETIVOS GERAIS........................................................................... 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................. 17
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................... 18
3.1 Definição.............................................................................................. 18
3.2 Histórico ............................................................................................... 18
3.3 Taxonomia............................................................................................ 19
3.4 Morfologia............................................................................................. 19
3.5 Ciclo Biológico....................................................................................... 19
3.6 Transmissão.......................................................................................... 20
3.7 Sinais Clínicos....................................................................................... 21
3.7.1 Humanos........................................................................................... 21
3.7.2 Animais............................................................................................. 23
3.8 Imunidade e Patogenicidade................................................................ 25
3.9 Diagnóstico........................................................................................... 27
3.10 Profilaxia............................................................................................. 27
3.11 Modelos experimentais para o estudo de Toxoplasmose................... 28
4.MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................... 32
4.1 Obtenção de oocistos de Toxoplasma gondi....................................... 32
4.2 Medidas para a proteção biológica das pessoas envolvidas no
projeto de trabalho..................................................................................... 32
4.3 Cepas de toxoplasma......................................................................... 32
4.4 Método para detectar gestação.......................................................... 33
4.5 Bioensaio............................................................................................ 33
8
5 EXPERIMENTOS.................................................................................... 34
5.1 EXPERIMENTO 1................................................................................. 34
5.2 EXPERIMENTO 2................................................................................. 35
6. RESULTADO.......................................................................................... 46
6.1 RESULTADO DO EXPERIMENTO 1 .................................................. 46
6.2 RESULTADO DO EXPERIMENTO 2................................................... 47
7. DISCUSSÃO........................................................................................... 48
8. CONCLUSÕES....................................................................................... 53
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 54
9
LISTA DE ABREVIATURAS
AD Aglutinação Direta
HAI Hemaglutinação Indireta
IFN-γ interferon Gama
IgM imunoglobulina M
IgG imunoglobulina G
IgA imunoglobulina A
NaCl 0,5% Cloreto de Sódio a cinco por cento
OMS Organização Mundial da Saúde
PBS Tampão Fosfato Salino
T. gondii Toxoplasma gondii
UI Unidades Internacionais
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Aglutinação direta dos soros de fêmeas Inoculadas via
oral com 40 oocistos da cepa ME49 de T. gondii, 60 dias antes de serem
alojadas com os machos.............................................................................
4
6
Tabela 2 Aglutinação direta dos soros de fêmeas Inoculadas
com 10
2
oocistos de T.gondii (cepa Prugniaud via oral). E aglutinação
direta de soros de seus filhotes e do soro de alguns filhotes
adotados.....................................................................................................
4
7
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Placa de HAI ............................................................... 36
Figura 2 Local dos experimentos.............................................. 37
Figura 3 Cânula especial........................................................... 37
Figura 4 Diferenças morfológicas.............................................. 38
Figura 5 Casal de Hamsters...................................................... 38
Figura 6 Casal copulando.......................................................... 38
Figura 7 Fêmea e seus filhotes................................................. 39
Figura 8 Recém-nascidos.......................................................... 39
Figura 9 Recém- nascido.......................................................... 40
Figura 10 Preparação para retirada de órgãos........................... 40
Figura 11 Retirando pulmões..................................................... 41
Figura 11.1 Sequência da retirada de órgãos................................ 41
Figura 11.2 Separando órgãos....................................................... 41
Figura 12 Preparando inóculo para bioensaio............................. 42
Figura 12.1 Preparando inóculo para bioensaio............................. 42
Figura 13 Inoculação em camundongo....................................... 43
Figura 14 Retirando sangue camundongo.................................. 43
Figura 15 Armazenando sangue................................................. 43
Figura 16 e 16.1 Pesagem em balança de precisão.............................. 44
Figura 17 Administrando inóculo VO hamster............................. 44
Figura 18 Retirando sangue hamster .......................................... 45
12
RESUMO
A Toxoplasmose é uma zoonose cosmopolita que ocorre principalmente em
indivíduos imunodeprimidos, gestantes e em pacientes em terapia anti-câncer. Na
Medicina Veterinária, animais como ovelhas, cabras e porcos são seriamente
afetados podendo ocorrer abortos e com isto perdas significativas em termos
econômicos. Atualmente não se dispõem de vacinas contra a toxoplasmose, mas
tem-se desenvolvido modelos animais em ratas e camundongos para o ensaio
imunológico contra a enfermidade. Os modelos atualmente utilizados, possuem
limitações, por exemplo, não é possível ensaiar no modelo rata um imunógeno de
Toxoplasma gondii, uma vez que todas as linhagens de ratas disponíveis são
resistentes. Portanto não se pode ensaiar desafios vacinais altamente exigentes
neste modelo. Por isso é aconselhável contar com experimentos efetuados em
diversas espécies animais. Está sendo proposto testar o Hamster (Mesocricetus
auratus), com o intuito de estabelecer se é ou não um modelo que se aproxima das
respostas esperadas nos humanos. Antes de se comprometer a custos muito
elevados com ensaios finais de vacinações, o aconselhável é contar com ensaios
em diversas espécies, pois os animais respondem de formas dIferentes aos mesmos
imunógenos. Na transmissão congênita crônica dez Hamsters foram inoculados com
40 oocistos por via oral da cepa Me-49 do T.gondii e após sessenta dias foram
postas para cruzarem com os machos. Obteve-se resultados promissores uma vez
que a transmissão congênita aos seus filhotes nesta fase crônica da infecção foi
nula. Na transmissão congênita aguda da infecção, obteve-se 42,9% de taxa de
transmissão de T.gondii. Não foi observada a transmissão lactogênica, do
toxoplasma, na fase aguda da infecção.
13
ABSTRACT
Taxoplasmosis is a cosmopolitan disease that causes a lot of damage to
immunocompromised people, pregnant women, patients who have had transplants
and people undergoing anticancer therapy. Animals like sheep, goats and pigs are
seriously affected causing abortions and consequently significant economic losses.
This is why, the importance of studing the transmission, the mechanisms of
transmission and the forms of infection. Currently, vaccines against toxoplasmosis
are not available, but animals’ models, in rats and mice, have been developed to an
immune assay against this disease. These models considered to the study have
some limitations, however it is not possible to apply a toxoplasma immune assay on
a rat model, because it is a susceptible race and it has already been proven that rats
are resistant to toxoplasma. We proposed to test the hamster (Mesocrisetua auratus)
with the intention of establishing if it is or not one model that approaches the same
results expected on human beings, therefore before compromising high costs with
final assays of vaccinations, the advisable thing to do is to turn to assays on diverse
species, because animals have different answers to the same immune. We intended
to test hamster (Mesocrisetus auratus), with the intention of establishing if it is or no a
model that approaches the expected ansewer from diferential ways to the same
strains. In the chronic congenital transmit, in Hamsters was obtained promising
results because yours creates didn’t present title when their organs (liver and lung),
they were bioassayed in mice and twenty five days after they were bled and their
serum tested with direct agglutination of Desmonts and Remington (1980), confirming
that the passage wasn’t made during the gestation of females infected before the
conception. In the sharp congenital transmission of the infection, it was obtained
42,9% that passed to their descendants antibodies of T. gondii. In the lactogenic
transmission, wasn’t have title for T.gondii
14
1 INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular responsável por
altas morbidades e mortalidades em infecções congênitas e imunocomprometidos
(Dunn et al., 1999; Remington e Desmonts,. 1990; Petersen et al., 2001)
Em relação à Sistemática do T. gondii, o agente é classificado segundo o
Comitê de Sistemática e Evolução da Sociedade de Protozoologia (Levine et al.
1980).
Esses protozoários pertencem ao Filo Apicomplexa, pois, possuem o
complexo apical (Freyre, 1989).
O T. gondii causa abortos em ovelhas, cabras, porcos e coelhos quando
entram pela primeira vez em contato com o agente durante a gestação (Remington
e Desmonts, 1990; Dubey e Beattie,1988 ). A infecção pode ser assintomática em
recém nascidos, podendo desenvolver sintomas no decorrer da vida, dependendo
das seqüelas e da proporção em que o paciente foi afetado (Remington e Desmonts,
1990). A reativação de cistos latentes de T. gondii no cérebro é fatal em pacientes
imunodeprimidos, como no caso de portadores da AIDS (Síndrome de
Imunodeficiência Adquirida), durante terapias para câncer, ou pacientes que
sofreram transplantes (Luft e Hafner, 1990).
A prevenção da toxoplasmose humana congênita se efetua geralmente de
forma eventual, com base na detecção da infecção durante a gestação, e no
tratamento das mães infectadas. Em mulheres que adquiriram a primo infecção
durante a gestação, 90% dos rescém nascidos são assintomáticos (Spalding et al,
2003), muitos desenvolvem lesões em algum momento de sua vida (Araújo,1999).
Em algumas regiões de agricultores no sul do Brasil a soropositividade fica
em torno de 100%, e em 18 % da população se evidenciam cicatrizes no globo
ocular ( Silveira et al., 2001). Foi detectada alta prevalência (74,5%) da infecção por
T. gondii, em uma população de mulheres grávidas no Rio Grande do Sul, e esta foi
superior ao da América Latina, 50 a 60% (Frenkel, 1974), e próxima à observada em
gestantes do Rio de Janeiro 78.7% (Coutinho. et al 1981).
15
Várias espécies animais podem ser utilizadas para experimentação do
parasito, mas a infecção resultante pode variar em função da espécie utilizada, e
principalmente da cepa de T.gondii e de sua forma de inoculação. (Freyre 2006,
comunicação pessoal).
Os critérios de classificação quanto à virulência da cepa ainda são
imprecisos, sendo classificadas como virulentas, pouco virulentas ou não virulentas.
A infecção resultante pode ser aguda com 100% de mortalidade, em 5 a 7 dias com
cepas de alta virulência (cepa RH), ou formas capazes de causar uma infecção mais
crônica, variando de semanas ou meses com sintomatologia sistêmica, e
predominância de sintomas cerebrais. Em alguns casos a infecção permanece
completamente latente no organismo e se manifesta apenas pela presença de
cistos. Algumas espécies de animais possuem uma resistência natural importante ao
parasito, como o rato, que pode tolerar inoculações elevadas de cepas RH,
produzindo uma infecção crônica com formação de cistos cerebrais. Portanto é
limitado o trabalho com ratos apesar da obtenção de bons estudos sobre primo-
infecção, e particularmente importante para o estudo e compreensão dos
mecanismos de resistência e de indução da imunidade.
Assim é importante a utilização de outros modelos como o Hamster
(Mesocricetus auratus), como modelo experimental na imunidade contra
toxoplasma, (Freyre et al., 2001,Freyre et al 2003 b).
O modelo proposto deve ser estudado exaustivamente para conhecer sua
resposta frente a desafios com o agente. Verificar a transmissão congênita durante a
etapa crônica da infecção pelo T. gondii. Demonstrar que a transmissão congênita
durante a etapa aguda da infecção, seria muito freqüente e demonstrar se o modelo
Hamster poderia infectar seus filhotes durante a fase lactogênica., para detectar se
esta via de transmissão não seria mais freqüente que a transmissão congênita, que
levaria a erros de interpretação de resultados. Só assim poderemos saber se o
Hamster é um bom modelo experimental para o estudo da Toxoplasmose.
O presente trabalho foi desenvolvido em parceria com o laboratório de
Toxoplasmosis de la Universidade de La República, Faculdad de Veterinaria -
Departamento de Parasitologia Veterinária-Montevideo, Uruguay, com o objetivo de
estabelecer um novo modelo experimental para a toxoplasmose em Hamster
(Mesocrisetus auratus), através da análse da resposta imune desta espécie quando
desafiado com o T. gondii.
16
2 OBJETIVOS
2.1. Gerais
Verificar a aplicabilidade do modelo hamster, no estudo da imunidade frente
à toxoplasmose congênita.
2.2. Específicos
2.2.1. Ensaiar a transmissão congênita da toxoplasmose durante o estágio
crônico da infecção.
2.2.2 Ensaiar a transmissão congênita de toxoplasmose durante o estágio
agudo da infecção.
2.2.3.. Verificar a transmissão lactogênica.
17
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Definição
O Toxoplasma gondii é, como a maior parte dos Apicomplexa, um parasita
coccídio intracelular obrigatório (Dubremetz, 1999). Os hospedeiros definitivos são
os felídeos, que podem ser chamados de hospedeiros completos, pois também
podem ser hospedeiros intermediários, quando apresentam o ciclo extra-intestinal ou
tecidual o qual ocorre em muitas outras espécies de vertebrados, incluindo o homem
(Taboada & Merchant, 1997; Frenkel, 1997; Dubey, 1998b).
3.2 Histórico
A toxoplasmose é uma zoonose com distribuição cosmopolita, no entanto sua
prevalência pode variar dentro de um mesmo país ou estado (Jamra 1964, Baruzzi
1970, Ferraroni e Marzochi 1980, Coutinho et al 1981, Guimarães et al 1992).
No ano de 1908, Nicolle e Manceaux, descreveram um parasito intracelular no
baço e no fígado de um roedor do norte da África, o Ctenodactylus gundi.
Acreditando pertencer ao gênero Leishmania, os cientistas o denominaram de
Leishmania gondii.
No mesmo ano, no Brasil, Splendore, observou o mesmo parasito no coelho e
também comparou-o ao agente da leishmaniose visceral. No ano seguinte, Nicolle e
Manceaux retificaram sua posição anterior, sendo informado à Academia de
Ciências de Paris que renomearam o parasito como T. gondii (Freyre, 1989; Pizzi,
1997).
Posteriormente, vários pesquisadores encontraram em diversos animais,
parasitos morfologicamente semelhantes ao Toxoplasma gondii, que foram
denominados de acordo com a espécie animal, (T.canis, T.columbae, T.gallinarum,
18
T.cuniculi). Porém, em 1939 Sabin chegou a conclusão que era uma única espécie
de protozoário (Freyre, 1989; Pizzi, 1997).
3.3 Taxonomia
Segundo Levine et al. (1980) e Levine (1985), este parasita é classificado
como:
Reino Protista, Haeckel, 1866
Sub-Reino Protozoa, Goldfuss, 1817
Filo Apicomplexa, Levine, 1970;
Classe Sporozoea, Leukart, 1879;
Subclasse Coccidia, Leukart, 1879;
Ordem Eucoccidiida, Léger and Duboseq, 1910;
Subordem Eimeriina, Léger, 1911.
Família Sarcocystidae, Poche 1911;
Sub família Toxoplasmatinae, Biocca, 1959
Gênero Toxoplasma, Nicolle e Manceaux, 1909
3.4 Morfologia
Esses parasitos são encontrados sob 3 formas evolutivas: taquizoítos, forma
de multiplicação que ocorrem numa infecção aguda; bradizoítos, contidos no interior
dos cistos ou forma de multiplicação lenta, nas infecções crônicas ou assintomáticas
e oocistos nas fezes de felídeos, pois resultam do ciclo enteroepitelial do parasito,
que só ocorre no intestino de membros da família Felidae (Acha e Szyfres, 1987;
Kawazoe, 2000).
3.5 Ciclo Biológico
O ciclo biológico, deste protozoário, ocorre de duas maneiras: sexuado ou
ciclo enteroepitelial e assexuado ou ciclo extra-intestinal. Estes dois diferentes
padrões de multiplicação ocorrem em felídeos, após a infecção. O ciclo
enteroepitelial ou intestinal de infecção ocorre apenas nestes hospedeiros definitivos
(gatos e em outros felídeos), enquanto o ciclo extra-intestinal de infecção é o padrão
19
que ocorre em todas as espécies que servem de hospedeiros intermediários
(Swango, Bankemper e Kong, 1992; Gagne, 2001).
3.6 Transmissão
A ingestão de carne ovina mal passada pode disseminar o T. gondii para os
carnívoros, inclusive o homem (Coteeler e Famere, 1984). A contaminação dos
ovinos ocorre através dos alimentos, pasto e ração contaminados com oocistos
eliminados por felinos ( Blewet e Watson, 1983).
São citadas ainda outras vias de transmissão, porém de menor importância
na epidemiologia da toxoplasmose, como a transmissão através de sangue ou de
componentes sanguíneos (Amato Neto et al., 1963; Frenkel, 1974b,; Beouvais et al.,
1976; Wendel, 1994), do transplante de órgãos (Reynolds et al, 1966; Ryning et al.,
1979; Rose et al., 1983) e ainda as decorrentes de acidentes de laboratório
(manuseio de animais infectados, vidrarias e seringas contaminadas), ou de
necropsias de animais contaminados (Brown e Jacobs, 1956; Fisher e Reid, 1973;
Herwaldt e Juranek; 1993).
Vetores como responsáveis por transmitir a doença foram temas de muitos
estudos (Giovannoni et al, 1952, Nussenzweig e Deane, 1958). Nenhum deles, no
entanto, conseguiu demonstrar que a transmissão do parasito se dê através de
picadas. Mas os artrópodes podem servir como possíveis carreadores mecânicos de
oocistos, podendo, contaminar alimentos que serão consumidos pelo homem.
As chuvas e os ventos também seriam responsáveis como carreadores para
outros locais (Paim e Queiroz, 1963).
A ingestão de alimentos, como vegetais e água contaminados com oocistos
de Toxoplasma gondii , também é um importante mecanismo de transmissão
(Kasper e Ware, 1985). Esse modo de infecção, possivelmente, é o responsável pela
prevalência da infecção por T. gondii em indivíduos vegetarianos e em animais
herbívoros (Rawal, 1959).
A ingestão de leite de vaca ou de cabra, de ovos de galinha, de patos e de
outras espécies contaminadas com taquizoítos, pode ser considerada uma outra
forma potencial de transmissão de T. gondii , embora o parasito seja raramente
isolado destes produtos (Jacobs e Melton, 1966; Walls e Schultz, 1968; Saari e
Raisanen, 1977; Pinto et al., 1993). A transmissão durante a amamentação não foi
20
ainda comprovada em humanos (Sacks et al., 1982, Goldfa 1993), embora haja
referências na literatura da infecção humana através de leite materno (Bonametti et
al., 1997), e de leite de cabra não processado (Sacks, Roberto, Brooks, 1982), já
tendo sido detectado o parasito no leite de alguns mamíferos (Eichennwald, 1948;
Chamberlain et al., 1953). Está descrito que o leite não pasteurizado pode ser
veículo de transmissão do protozoário, uma vez que a pasteurização destrói os
taquizoítos. (Riemann et al, 1977).
3.7 Sinais Clínicos
3.7.1 Humanos
Na medicina humana, Castellani em 1913 descreveu um caso de
toxoplasmose em um menino, apresentando febre e esplenomegalia (Pizzi, 1997).
Em Praga, na Tchecoslováquia, em 1923, um médico oftalmologista
chamado Janku descreveu pela primeira vez um protozoário com morfologia idêntica
ao T.gondii , em cortes histológicos de olho de uma criança com o quadro clínico de
hidrocefalia, microftalmia e coloma. Após cinco anos, Levaditis relacionou a
hidrocefalia com a toxoplasmose congênita (Pizzi, 1997). Torres em 1927, no Rio de
Janeiro, observou microorganismos compatíveis com o Toxoplasma gondii , em
cortes histológicos de cérebro e músculo esquelético de uma criança, sugerindo ter
ocorrido infecção congênita.
A comprovação quanto ao fato do T. gondii ser capaz de infectar o feto no
útero foi constatado em 1937 por Wolf e Cowen pelo relato da ocorrência de
toxoplasmose fetal cursando com encefalite, meningite e mielite, em recém-
nascidos (Neto e Marchi, 1999).
A infecção congênita ocorre somente quando a mulher, não imune, é
infectada durante a gravidez e a severidade da doença, depende do período
gestacional que ela se encontra e da capacidade dos anticorpos maternos em
proteger o feto (Chemello, Eckert e Teixeira, 1998; Dubey, 1998b). Normalmente
uma mãe não gera mais do que uma criança com toxoplasmose congênita.
O risco de infecção dos fetos, nestes casos, é de 1-2 a cada 1000 no Chile
(Muñoz, 1995), entre 2 e 4 a cada 1000 em Montevideo, Uruguai (Freyre et al.,
21
1993), de 0,33 a cada 1000 no Rio Grande do Sul- Brasil (Neto et al., 2000), e de 1 a
cada 1.000 crianças nascidas vivas na Argentina (Hirt, 2001),
Um estudo sorológico com mais de 800 mães que tiveram filhos com esse
tipo de infecção mostrou que não houve nenhum irmão com toxoplasmose
congênita, com exceção de 14 pares de gêmeos (Renold et al., 1992 apud
Guimarães et al. 1992). A ocorrência de transmissão transplacentária na mulher,
ocorre quando ela contrai a primo-infecção durante a gestação, (Glaser et al. 1994).
No primeiro trimestre, a incidência da infecção é baixa, mas as lesões fetais são
graves. Estima-se que 17% dos fetos serão infectados e 80% destes irão sofrer
doença severa. As infecções no segundo trimestre resultam em 25% de fetos
infectados e destes, 30% terão doença severa. Quando a primo-infecção materna
ocorre no último trimestre a incidência de infecção fetal é de cerca de 70% ou mais e
as lesões são menos severas (Camargo, 1996; Acha e Szyfres, 1987). No primeiro
trimestre de gestação, se a infecção ocorre no processo de nidação, podem ocorrer
endometrites e aborto entre 6 a 8 semanas. Se a infecção ocorre na etapa de
formação da placenta, pode ocorrer placentite e aborto entre o terceiro e quarto mês,
e se a gestação tiver continuidade, nascem com tantos danos que são incompatíveis
com a vida. A infecção, ocorrendo no segundo trimestre da gestação, as crianças
nascem com a Tétrade de Sabin: macro ou microcefalia, retinocoroidite bilateral,
calcificações cerebrais e retardo mental. A gestação estando no terceiro trimestre, a
infecção por T. gondii, causa leve déficit intelectual, retinocoroidite bilateral com ou
sem estrabismo ou nascimento de crianças aparentemente normais, que
apresentam cistos em estado de latência (Pizzi, 1997).
A toxoplasmose pós-natal, não é tão grave, a não ser se ocorrer uma baixa de
imunidade, em geral só 10 a 20% de indivíduos imunocompetentes infectados após
o nascimento apresentam sintomas semelhantes a uma gripe, (Morris, 1996;
Chemello, Eckert e Teixeira, 1998). A toxoplasmose vem apresentando um quadro
grave em indivíduos com o sistema imune severamente comprometido, causando
principalmente encefalite e retinite. Com o surgimento da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS) iniciaram-se associações desta patologia com o
oportunista T. gondii. Também, fazem parte do grupo de risco receptores de órgãos
e pessoas em tratamento quimioterápico (Pizzi, 1997; Kawazoe, 2000).
Estima-se, que 30 a 40% dos adultos, nos EUA possuem anticorpos para T.
gondii. (Dubey, 1994). Inquéritos sorológicos realizados em diversos países indicam
22
uma infecção de 40 a 50% em humanos adultos sadios entre 30 a 40 anos de idade.
A variabilidade de freqüência da infecção está ligada a diversos fatores, tais como
padrões culturais da população, seus hábitos alimentares, a idade, e a procedência
(rural ou urbana), (Apt et al., 1973; Amendoeira, 1980; Melamed 1991). A idade têm
sido associada, com alta freqüência de infecção pelo T.gondii (Jamra, 1964;
Remington, 1974; Ricciardi, 1976; Melamed et al., 1981) pois com o aumento da
faixa etária aumentam também as chances do indivíduo entrar em contato com
algum dos diversos mecanismos de transmissão (Apt et al.,1973; Osório et al.,
1977). Dados, esses, que variam de acordo com fatores geográficos e climáticos,
hábitos alimentares, tipo de trabalho, higiene do meio ambiente e presença de gatos
infectados (Ulon, 1996).
3.7.2 Animais
Animais domésticos têm sido apontados como fonte de infecção para o
homem (Jacobs e Melton 1966; Lindsay et al., 1997). No entanto outros autores
(Kimball et al. 1960; Magaldi et al 1969; Jamra et al 1969; APT et al 1973; Fisher e
Reid 1973; Camargo, 1995) estudando diversos animais naturalmente infectados,
observaram que o contato só tem importância epidemiológica quando é associado
ao hábito de ingerir carne mal cozida. A presença de gatos, no entanto, parece ser
relevante, uma vez que este animal tem comprovada importância na manutenção do
ciclo (Hutchison, 1965; Apt et al., 1973; Dubey, Miller e Frenkel, 1970). Hutchison
(1967), foi o primeiro a demonstrar que os felinos domésticos podiam eliminar
T.gondii pelas fezes; postulou também que os parasitos estariam contidos em ovos
de ascarídeos do gênero Toxocara, porém sua infectividade só foi relacionada com
um pequeno oocisto coccidiano por Frenkel, Dubey; Miller, ( 1970).
O ciclo selvático do parasito foi descrito em 1975 e 1976 (Pizzi, 1997). Incluí-
se entre os felídeos selvagens, o leão da montanha (Felis concolar), jaguar (Felis
yagouaroundi), tigre de bengala ( Felis bengalensis), e o ocelote (Felis pardalis),
(Dubey, 1987).
Melo (1910), citou a toxoplasmose em cães em Turin na Itália (Dubey et al.,
1988) e em 1942, Ollafson e Manlux. em ovinos, nos Estados Unidos (Ulon, 1996).
O diagnóstico de toxoplasmose suína naturalmente adquirida nos Estados Unidos já
23
descrita por Farrel et al., (1952); e, em 1956, Feldman e Miller observaram as
primeiras evidências de infecção em caprinos num rebanho no estado de Nova York.
Weinman e Chandler (1956), revelaram em suas pesquisas uma forte
evidência de que os suínos albergariam na carne protozoários até o momento do
cozimento, posteriormente confirmado por Jacobs, Remington, Melton, (1960), que
elucidaram o significado epidemiológico da forma cística do T. gondii, comprovando
a importância das carnes de animais serem bem cozidas, pois podem agir como
fonte de infecção se ingeridas mal cozidas pelos seres humanos. Segundo (Dubey et
al, 1988) o consumo de carne de suíno é uma das maiores causas de contaminação
para os seres humanos, tendo em vista que os cistos nos suínos persistem por dois
anos, e que existe um cisto por cada 50 gramas em uma carne de porco mal cozida,
e que seria a forma mais frequente de infectar o homem, (Dubey, 1986).
A toxoplasmose atinge também várias espécies animais. Nos cães provoca
principalmente alterações musculares, respiratórias e gastrintestinais. Em outras
espécies, que são importantes na transmissão via carne para humanos, que são
suínos, seguidos de caprinos e ovinos, ocorrem alterações importantes (Dubey,
1999).
Nos suínos a infecção pós-natal é mais freqüente que a
transplacentária,ocorrendo doença clínica em neonatos e leitões jovens, mas
também ocorrem abortos e natimortos em rebanho suínos (Dubey e Beattie, 1988;
Blood e Radostitis, 1991; Freyre et al., 1991).
Em ovinos a toxoplasmose pode causar abortos, natimortos e mortalidade
neonatal. Também pode ocorrer reabsorção embrionária e assim proprietários
acabam considerando essas fêmeas, como sendo estéreis (Dubey e Towle, 1986;
Freyre e Fálcon, 1989). A patologia é semelhante ao que ocorre nas mulheres e
também ocorre a proteção na prenhes subseqüente (Innes, 1997).
Os bovinos são uma das mais resistentes espécies ao T. gondii, sendo
inclusive descrito que não necessariamente ocorre persistência dos cistos pela vida
toda do hospedeiro, como ocorre em ovinos e humanos (Innes, 1997).
Ocorre alta prevalência da infecção por T.gondii tanto em animais silvestres,
naturalmente infectados, quanto nos domésticos (Sogorb et al., 1972, Ferraroni e
Marzochi, 1980).
24
3.8 Imunologia e Patogenicidade
A resposta imunológica dos hospedeiros ao T, gondii é complexa e faz com
que o hospedeiro imunocompetente desenvolva imunidade por toda sua vida,
ficando resistente a novas infeções. (Denkers, Caspar e Sher , 1994).
O mecanismo responsável pela Imunidade protetora ocorre pelos
mecanismos humorais e celulares (Chemello, Eckert e Teixeira, 1998). No sistema
imune, o parasito é barrado pelos monócitos e macrófagos auxiliados pelos
anticorpos específicos da classe IgM e IgA. Quando o IgM é detectado em virtude da
sensibilidade da técnica de Elisa é necessária a dosagem sorológica de IgA, que
quando reagente representaria uma infecção num período inferior a oito semanas. O
diagnóstico poderia ser complementado pela determinação dos índices de avidez de
IgG que, em níveis baixos (inferior a 30%), significaria infecção aguda, num período
inferior a quatro meses, níveis altos, (superior a 60%) representariam infecção
antiga. Na fase aguda da infeção é produzido IgM e IgA, seguida da produção de
IgG. Nas formas crônicas na maioria das infeções o agente não causa
conseqüências clínicas aparentes (Grunspan, 1996, Dubey, 1998b), pois os
taquizoítos poderiam persistir por muito tempo no cordão espinhal e cerebral e
também podendo persistir na placenta meses após o início da infeção na fêmea
segundo esses autores. O aumento nos títulos de IgM é geralmente de curta
duração, positivando a partir da primeira semana pós-infecção e alcançando a
concentração máxima em um mês. As IgG podem persistir com títulos elevados por
um longo tempo, sendo detectado em 12-14 dias e alcançando um pico máximo em
2-3 meses (Camargo, 1995; Pizzi, 1997; Chemello, Eckert e Teixeira, 1998;
Kawazoe, 2000).
O parasito é capaz de colonizar todos os órgãos, tendo predileção pelo
sistema nervoso, principalmente na fase crônica da infeção, onde ocorre neste
sistema e coriorretina. Após a resposta imunomediada por células e liberação do
IFN-γ, ocorre a presença prolongada o parasito nos tecidos do hospedeiro, o que
pode induzir uma estimulação da hipersensibilidade retardada (Pizzi, 1997;
Kawazoe, 2000).
Algumas situações como, cepas de maior virulência, uma dose infectante
abundante, uma via de penetração favorável, e um hospedeiro não
imunocompetente, pode levar a conseqüências de uma toxoplasmose severa e até
25
fatal (Freyre, 1989), assim como em pacientes com câncer, transplantados, e com
Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS) (Alexandre e Hunter, 1998).
Dubey et al. (1997), estudaram a distribuição dos cistos inoculando 10 fêmeas
adultas Sprague-Dawley com: 1 oocisto (3 ratas: grupo A), 10
5
oocistos (3 ratas:
grupo B) da cepa VEG ou 10
4
oocistos da cepa GT-1 (4 ratas: grupo C). Todos os
grupos de ratas foram sacrificados com 76, 240 e 443 dias pós-inoculação,
respectivamente. Foram encontrados cistos no cérebro das 10 ratas, por
microscopia direta. Nos outros órgãos foi realizada digestão péptica e bioensaiados
em camundongos, sendo encontrados cistos em 3 tecidos extra-neurais das ratas do
grupo A, 6 do grupo B e 10 do grupo C. Freyre et al. (2003b) inocularam ratas
Winstar com 10
1
e 10
4
oocistos e procuraram cistos cerebrais por microscopia. Com
os cérebros negativos foi realizado bioensaio em camundongos. Foram encontraram
83% de positivos para cistos cerebrais, seja por visualização microscópica ou por
uso de aglutinação direta do soro dos camundongos. Um experimento semelhante
havia sido realizado por Freyre et al. (2001b) também em ratas Winstar, onde foram
encontrados 78,6% de soros de camundongos positivos pela aglutinação direta,
após o bioensaio de cérebros.
De acordo com Dubey (1987), a idade, sexo e a espécie do hospedeiro
influenciam na suscetibilidade ao T. gondii.
Existem três linhagens principais do T. gondii relacionadas com virulência: a
Tipo 1 está associada com virulência aguda em camundongos; a 2 induz patologia
crônica em linhagens suscetíveis de camundongos e a 3 é a menos virulenta. Nos
humanos a linhagem Tipo 1 está freqüentemente associada com infecção congênita
enquanto o Tipo 2 é mais comum em pacientes em que a doença foi reativada.
Outro fator é que os oocistos produzem infecção mais virulenta que os cistos
(Alexander e Hunter, 1998).
A vacina deveria ser uma boa prevenção e com um custo menor que o
observado hoje, com exames e tratamento de doentes. Ela possui, o objetivo de
reduzir o risco fatal, reduzir o número de cistos deste parasito nos animais e prevenir
a formação de oocistos em felídeos. (Dubey, 1994). A vacinação de animais tem um
outro objetivo importante, que é o de minimizar as perdas econômicas por abortos
(Dubey, Lindsay e Speer 1998). Segundo Galisteo (2004), a vacina ideal para
toxoplasmose deve prevenir a infecção humana, e os alvos vacinais deverão ser os
felinos, que são os responsáveis pela disseminação ambiental de oocistos.
26
3.9 Diagnóstico
A pesquisa direta de taquizoítos do T. gondii pode ser feita na fase aguda, a
partir de vários componentes orgânicos, como, sangue, exsudato, leite, líquido
cefalorraquidiano, saliva, escarro, medula óssea, cortes de placenta, além de
conteúdos de infiltrados cutâneos, ou biópsia de baço, fígado, músculos e gânglios
linfáticos (Neto e Marchi, 1999; Kawazoe, 2000). Na grande maioria das vezes o
diagnóstico laboratorial da toxoplasmose é feito pela identificação e quantificação de
anticorpos específicos através de sorologia (Camargo, 1996).
O diagnóstico sorológico da toxoplasmose em gestantes, recém-nascidos, e
demais indivíduos deve ser corretamente interpretado para diferenciar infecção de
doença. Se a intenção é avaliar a imunidade do paciente, os testes sorológicos que
detectam anticorpos da classe IgG são suficientes (Camargo, 1996). A duplicação do
título de IgG aglutinantes num período de 2 a 4 semanas ou um título elevado de
IgM específica, indica uma infecção aguda. Uma infecção aguda por T. gondii
unicamente significa que o microorganismo está multiplicando-se rapidamente,
fenômeno que pode estar ou não acompanhado de sinais clínicos (Camargo, 1996).
No recém-nascido, anticorpos da classe IgG específicos, podem ser
anticorpos maternos de transferência passiva, que na criança não infectada,
desaparecem progressivamente até a negativação ao longo do primeiro ano de vida
(Camargo, 1996). A pesquisa de IgM e IgA em recém-nascidos é utilizada para o
diagnóstico de toxoplasmose congênita, pois não atravessam a placenta e quando
presente no soro indicam a produção pelo próprio feto, em resposta a uma infecção
pelo T. gondii (Kawazoe, 2000).
3.10 Profilaxia
Como prevenção as mulheres grávidas, não devem manter contato direto com
gatos, solo ou ingerir carne mal passada (Dubey, 1998b). O acompanhamento
sorológico da toxoplasmose em mulheres grávidas, e seu tratamento quando
detectada a infecção aguda, é feito em poucos países devido ao custo. Esse
procedimento é muito importante, mas na verdade é mais paliativo que preventivo, já
que o feto pode ser infectado antes de instalado o tratamento, vindo a nascer, já com
27
graves danos, ou até sem seqüelas, mas portadores de cistos (Freyre, 2006
Comunicação Pessoal).
Se a mulher possui anticorpos antes de ficar grávida ela é imune e o feto está
protegido da infecção, não sendo, necessários métodos preventivos tão rigorosos
(Frenkel, 1982; Camargo, 1996).
A vacinação, deverá ser uma boa prevenção, por um custo menor que o
observado hoje, com exames e tratamento de doentes. Ela possui, o objetivo de
reduzir o risco fatal, reduzir o número de cistos deste parasito nos animais e prevenir
a formação de oocistos em felídeos, (Dubey, 1994), além de minimizar as perdas
econômicas por abortos (Dubey, Lindsay & Speer 1998). Segundo Galisteo (2004), a
vacina ideal para toxoplasmose deve prevenir a infecção humana, e os alvos vacinas
deverão ser os felinos, que são os responsáveis pela disseminação ambiental de
oocistos.
Não existem atualmente vacinas aplicáveis às pessoas (Nielsen et al., 2000).
Uma vacina foi testada, com alto nível de proteção contra a emissão de oocistos
toxoplásmicos pelos gatos. O uso dessa vacina ajudaria a diminuir a prevalência da
infecção toxoplásmica humana e talvez também a dos animais de consumo
(Choromanski et al., 1994; Frenkel et al., 1991; Freyre et al., 1993). Tratando-se de
uma vacina para Toxoplasma vivo, não foi possível ser elaborada e distribuída em
condições rentáveis. Existe também uma vacina que ajuda a diminuir as perdas por
aborto ovino toxoplásmico, porém sua eficácia é de 70%, e não impede a
colonização fetal por Toxoplasma, de modo que o consumo de carne aqui produzida
continua sendo fonte de infecção para as pessoas (Freyre, 1998).
3.11 Modelos experimentais para o estudo de Toxoplasmose
Vários modelos experimentais já foram testados para se estudar o
comportamento do agente, suas formas de contaminação e formas de transmissão,
O modelo rato tem sido extensivamente usado para o estudo da transmissão
congênita e da imunidade contra a toxoplasmose (Dubey e Shen, 1991; Zenner et
al., 1993; Paulino e Vitor, 1999; Freyre et al., 1999a; Freyre et al., 2003a; Freyre et
al., 2003b; Freyre et al., 2006a; Freyre et al., 2006c). As linhagens de ratas
empregadas aos modelos referidos: Wistar, Long Evans, Fischer e Sprague-Dowley
têm mostrado muitas variações individuais em sua resistência natural a
28
toxoplasmose. Foi observado que não é possível ensaiar no modelo rato, um
imunógeno em uma linhagem suscetível à toxoplasmose, pois as linhagens
disponíveis mostram considerável resistência natural a esta infecção e podem tolerar
inoculações elevadas de várias cepas. O trabalho com ratas, apesar da obtenção de
bons estudos sobre primo-infecção e particularmente importante para o estudo e
compreensão dos mecanismos de resistência e de indução da imunidade variam
muito, são animais maiores e por isso requerem, maiores quantidades de
imunógenos (Freyre et al., 2001).
Estudos comparando técnicas de bioensaios, histopatológicas e PCR,
demonstraram que o bioensaio é mais eficiente como forma de testar a virulência do
agente (Garcia, 2006). O objetivo de estudar a infecção por T. gondii usando
modelos experimentais é obter um melhor entendimento da doença em humanos
(Innes, 1997).
Entre os animais de experimentação os ratos são considerados importantes
na epidemiologia da toxoplasmose porque eles seriam fontes importantes de
infecção para porcos e possivelmente para gatos (Dubey , 1997).
Dubey em 1991 não obteve transmissão congênita durante o período crônico
da infecção em ratas inoculadas algumas semanas antes da gestação.(Dubey e
Shen, 1991). Pesquisando a fase aguda da doença, Zenner et al. (1993),
observaram uma incidência de 58,2%, 35,2% e 62,8% em ratas infectadas durante a
prenhes, pelas cepas RH, 76K e Prugniaud, respectivamente.
Em 1997, Dubey constatou que a infecção de ratas não imunes ao T. gondii,
durante a gestação foi transmitida a pelo menos um terço da ninhada. Em 1999,
Paulino e Vitor observaram que filhotes de ratas imunizadas antes da gestação
ficaram totalmente protegidos contra desafios efetuados durante a gestação os
mesmos autores em outro trabalho usaram diferentes linhagens de ratas Wistar e
Holtzn e duas cepas de T. gondii, variando as formas de inoculação, (subcutânea e
oral), e concentrações do inóculo, o resultado foi que 2,9% dos recém nacidos nos
quais as mães foram cronicamente infectadas estavam infectados com o T. gondii.
Freyre em 1999 obteve 10% de transmissão transplacental em ratas onde
foram desafiadas com diferentes cepas do agente antes da concepção.
Freyre (2001), pode concluir que o grau de transmissão durante a gestação
de ratas pode variar de 0-90%, e isto ele atribui a suscetibilidade genética das ratas
pois elas receberam quantidades similares do inóculo de cepas variadas de
29
Toxoplasma gondii. O mesmo autor no ano de 2003b usando o modelo rata obteve
51% de transmissão transplacentária com uma variação de (10 a 80%), não havendo
diferenças quando o inóculo ser cisto ou oocisto. O modelo rato foi testado para se
detectar a imunidade com cepas cruzadas, e o resultado não foi promissor quando
não usadas as mesmas cepas para imunizar e desafiar. (Freyre et al 2006c). Isto
sem contar que altas doses devem ser usadas, e talvez a via de inoculação intra -
peritoneal não tenha sido favorável para a formação da imunidade (Freyre et al,
2006c).
Entre os modelos testados, o camundongo (Balb/C e CF1),
é o mais utilizado, devido a seu pequeno tamanho, fácil manuseio, doses para
inoculação menores e são animais com facilidade para se reproduzirem. Como
modelo experimental vacinal de T. gondii, ele é um forte candidato, pois os
camundongos Balb/c têm comportamento similares aos humanos quando
infectados no início da gestação, e quando infectados crônicamente através de
inoculações subcutâneas de cepas com PBS e 12 dias após desafiadas com as
cepas via peritoneal, (Roberts et al, 1994).
Em 1992 foi demonstrado que a infecção congênita em fêmeas de
camundongos Balb/c foi capaz de proteger suas ninhadas durante a gestação, os
resultados, neste caso, demonstraram que o camundongo fêmea Balb/C pode ser
usado como modelo experimental para testes vacinais importantes aos humanos e
ovinos. A infecção no começo da gestação causa morte fetal, reabsorção ou aborto.
A mortalidade diminui quando as mães são infectadas mais para o final da gestação.
Todavia, os Balb/C quando infectados semanas após colocadas em cria,
desenvolvem uma imunidade capaz de proteger totalmente seus embriões, mesmo
se a re-infecção ocorrer durante prenhez, (Roberts e Alexander, 1992).
Freyre (2006b), comparando métodos diagnósticos para prenhez e infecção
congênita em camundongos Balb/C demonstrou resultados promissores pois ao
serem imunizados 45 dias antes de cruzarem com a cepa Prugniaud de T.gondii na
dose de 10
4
por via oral e outro grupo foi desafiado doze dias após a concepção
com doses via oral das cepas Prugniaud (Bradizoítos) na dose de 10
3
, ou 10
2
e 10
3
de bradizoítos das cepas M3 e M7741 também via oral. No primeiro grupo os
resultados foram promissores pois após o nascimento os filhotes eram bioensaiados
e realizada aglutinação direta demonstrando que a transmissão congênita ocorreu
em 2 de 10 camundongos inoculadas. No segundo experimento em que foram
30
desafiadas enquanto grávidas para demonstrar que houve infecção aguda com a
cepa Prugniaud, 4 ninhadas foram positivas na prova de AD, com a cepa M3 na
dose de 10
2
, 4 de 10 ninhadas foram positivas na prova de AD do bioenssaio , e
com a mesma cepa na dose 10
3
, 6 de 10 foram positivas. Quando desafiadas com
a cepa M7741 na dose de 10
2
, o resultado a prova de AD foi de 4 positivos em 10
ninhadas, e quando a dose se elevou para 10
3
, somente 3 de 8 foram positivos.
Existem poucos antecedentes de toxoplasmose congênita experimental em
hamsters, No modelo de toxoplasmose congênita experimental em hamsters,
realizado por De Roever-Bonnet, em 1960, (Freyre, 2006 comunicação pessoal) foi
comprovada transmissão congênita de toxoplasmose durante a fase crônica da
infecção, mas não se sabe a proporção desta transmissão, porque os resultados se
expressaram em conjunto com a transmissão constatada em camundongos. Freyre
e colaboradores, verificaram que a transmissão da cepa Prugniaud se produziu em
20% de 10 hamsters portadores de infecção crônica, durante a primeira gestação
posterior a inoculação, e em 0% durante a gestação subseqüente (Freyre, 2006
comunicação pessoal). No Modelo Hamster realizado por Frenkel, Freyre e Smith
(1986), consistiu em proteção limitada do mutante ts4 de T.gondii contra desafios
provocados durante a gestação de hamsters. Neste caso o autor declara que a dose
de desafio utilizada foi desproporcional em relação ao peso corporal.
31
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Obtenção de oocistos de Toxoplasma
Para a obtenção de oocistos do parasito, foram utilizados gatinhos
recentemente desmamados, negativos na AD para toxoplasmose na diluição 1:64.
Foi administrado à eles o cérebro de rato com infecção toxoplásmica crônica. Foi
realizada a coleta das fezes dos dias 4 a 7 pós-infecção, as quais foram
concentradas pelo método de Sheather Modificado, e foram incubadas com agitação
em 2% de ácido sulfúrico durante 96 horas até completarem a esporulação. Essa
etapa de obtenção dos oocistos foi feita na Faculdade de Veterinária de Montevideo.
4.2 Medidas para a proteção biológica das pessoas envolvidas no
projeto de trabalho.
Foram aplicadas rigorosamente as diretrizes da Organização Mundial da
Saúde para salvaguardar as pessoas envolvidas no presente projeto de trabalho,
contra o risco de infecção toxoplásmica (Organización Mundial de la Salud, informe
de um comitê de expertos de la OMS. Serie de Informes Técnicos 1994).
4.3 Cepas de Toxoplasma
Foi empregada para imunizar, a cepa ME-49 por via oral, que é uma cepa
completa (formadora de cistos e oocistos). Esta característica se considera
importante para que intervenham na imunização mais antígenos. Muitas outras
cepas poderiam cumprir este papel, além da cepa mencionada, simplesmente se
elegeu uma delas.
32
Foi utilizada para desafiar, a cepa Prugniaud . A via de inoculação foi oral,
pois deve imitar a rota de infecção natural. Esta cepa foi utilizada, porque têm sido
ensaiada para a transmissão congênita em ratas (Zenner et al., 1993; Freyre et al.,
2001; Freyre et al., 2003;).
4.4 Método para detectar gestação:
Para detectar a gestação em fêmeas de hamsters, foram alojadas 4 fêmeas
para cada macho (figura 5 ), Iniciamos a pesá-las sete dias mais tarde (figuras 16 e
16.1). As fêmeas que apresentaram um aumento de peso corporal de 5 gramas ou
mais foram consideradas prenhes.
4.5 Bioensaio
O bioensaio em camundongos das linhagens CF1 foi descrito por (Freyre
et.al., 2001). Os Camundongos foram adquiridos do Laboratório Central do Estado
(Lacen). Todos eram fêmeas e com 3-4 semanas de idade. Foi feito feito um pool
dos órgãos dos Hamsters recém nascidos (pulmão e fígado) após a eutanásia
(figuras 12 e 12.1). Após eram homogeinizados em NaCl 0,5% com 1000 UI de
penicilina e 0,1 mg de streptomicina por ml de homogeinizado, e inoculado
imediatamente intraperitonealmente em 4 camundongos. Nas ninhadas de oito ou
mais filhotes, se utilizou a metade dos filhotes. Nas ninhadas com menos de 8 recém
nascidos, todos os filhotes foram utilizados. Após vinte e cinco dias estes
camundongos foi retirado sangue (figura 14) e seus soros examinados para detectar
anticorpos específicos através da reação de (AD) Aglutinação Direta, Se considerou
que os filhotes estavam protegidos, quando as sub-inoculações em tecidos de recém
nascidos resultaram negativas para T.gondii.
33
5 EXPERIMENTOS
5.1 Experimento No. 1: Transmissão congênita durante a etapa crônica
da toxoplasmose.
Este experimento foi realizado para verificar a hipótese de que a transmissão
congênita da toxoplasmose durante sua etapa crônica, é nula ou mínima em animais
(hamsters) resistentes. Para a validade deste modelo esta transmissão não deveria
ocorrer. Seria tolerável que ocorresse com baixa freqüência. Esta condição permitiria
imunizar com T.gondii viável nas fêmeas antes da gestação, e confirmar que a
própria imunização não resultará em fonte de infecção durante a gestação posterior.
O presente experimento objetiva ensaiar a transmissão congênita da toxoplasmose
durante sua etapa crônica em hamsters gestantes.
Utilizou-se dez hamsters fêmeas, todas vindas de um criatório de Santo
Antônio da Patrulha, com idades de 2 meses, aptas à reprodução, em média
pesando 100 gramas de peso vivo. Todas as fêmeas foram testadas por HAI (figura
1), antes de iniciado os experimentos. O experimento foi realizado no biotério do
laboratório de Protozoologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(UFRGS) (figura 2).
As dez hamsters receberam 40 oocistos esporulados da cepa ME-49 de
T.gondii por via oral, através da cânula feita especialmente para a espécie tendo em
vista que estes animais possui bolsas que poderiam armazenar o inóculo e este não
ser ingerido.(figura 3) Após 60 dias foram colocadas com machos (figuras 4 e 5). As
crias que nasceram, foram eutanasiadas e homogenizadas com solução NaCl 9%
(figuras 7,8,9 e 10), e sub-inoculadas intra-peritonealmente em 4 camundongos
(figura 13). Vinte e cinco dias mais tarde estes camundongos foram anestesiados e
foi feita coleta de sangue (figura 14), para realização da reação de aglutinação direta
(AD) para T.gondii. segundo Desmonts e Remington (1980),
34
O sangue foi retirado da cavidade orbital do olho com um tubo de
microematócrito e coletado em tubos de ensaio, posteriormente centrifugado e seu
soro analisado. (figura 15).
Logo depois deste primeiro parto, as fêmeas seriam postas a copular
novamente, repetindo-se o resto do desenho, se apresentassem algum título. Como
todas foram negativas não foram postas para cruzarem novamente.
Índice de avaliação: O sucesso deste experimento será dado por uma taxa
de transmissão congênita de Toxoplasma menor de 20% durante a primeira
gestação, e ausência de transmissão na gestação subseqüente.
5.2 Experimento No. 2: Transmissão congênita e lactogênica durante a
etapa aguda da toxoplasmose.
Este experimento foi realizado para verificar a hipótese de que, a transmissão
congênita da toxoplasmose durante sua etapa aguda, é muito freqüente. Para a
validade deste modelo, esta transmissão deveria ocorrer em pelo menos 80% das
oportunidades. Esta condição permitiria efetuar desafios válidos em fêmeas
gestantes imunizadas, assim como constituir grupos controles de fêmeas gestantes
não imunizadas, na qual a transmissão congênita deverá se verificar. Ao mesmo
tempo é necessário determinar se existe transmissão lactogênica de T.gondii e se
eventualmente esta via de transmissão não é mais freqüente que a transmissão
congênita, o que poderia causar erros de interpretação dos resultados.
Foram ensaiadas as transmissões congênita e lactogênica da toxoplasmose
durante sua etapa aguda, em hamsters.
Vinte hamsters fêmeas foram alojadas com machos em proporção 4:1. (figura
5) A partir do sétimo dia elas foram pesadas. (figuras 16 e 16.1), quando se
verificava o aumento de peso superior a 5 gramas, a fêmea era considerada prenhe
(Método de incremento do peso, descrito por Tarabla, 2000).
Os filhotes recém nascidos (figuras 7 e 8) da fêmea foram eutanasiados,
bioensaiados em camundongos e 25 dias depois foi retirado sangue e seus soros
foram testados pela técnica de (AD) aglutinação direta.
Os filhotes adotados, vindos de mães livres mamaram três dias nas hamsters
inoculadas e após foram eutanasiados, e seus órgãos (pulmões e fígados)
homogeinizados e bioensaiados em camundongos CF 1(figuras 11,11.1 e 11.2).
35
Vinte cinco dias após os camundongos foram eutanasiados e foi coletado sangue e
realizada a técnica de AD (aglutinação direta) para toxoplasmose.
Todas fêmeas foram eutanasiadas, 25 dias após terem sido inoculadas com
T.gondii e também foi realizado a Técnica de AD nos seus soros.
Índice de avaliação: O sucesso deste experimento será dado pela
transmissão congênita da cepa Prugniaud em pelo menos 80% das fêmeas
estudadas, e pela ausência de transmissão lactogênica naquelas hamsters que não
tenham realizado transmissão congênita.
Foram inoculadas 7 fêmeas de hamsters, com 10
2
das quais três adotaram
filhotes de mães livres.
Figura 1. Placa de HAI, para
T.gondii
36
Figura 2. Local do experimento. (Local climatizado).
Figura 3. Cânula para inoculação via oral.
37
Figura 4.Diferenças morfológicas entre macho e fêmea .
Figura 5. Casal de hamsters
Figura 6. Casal copulando.
38
Figura 7. Fêmea de hamster com
ninhada
Figura 8. Filhotes de hamsters recém
nascidos.
39
Figura 9. Filhote de recém
nascido.
Figura 10. Preparação para retirada
de órgãos
40
Figura 11. Retirando pulmões
Figura 11.1. Sequência da
retirada pulmões
Figura 11.2. Separando órgão.
41
Figura 12 e 12.1. Preparando o inóculo para ser bioensaiado em
camundongos CF1
42
Figura 13. inoculando IP (Bioensaio)
Figura 14. Retirando sangue. Figura 15. Armazenando sangue
43
Figuras 16 e 16.1. Pesagem de Hamster em balança de precisão
Figura 17. Administrando inóculo via oral
para as Hamsters
44
Figura 18. Retirando sangue
Hamster
45
6 RESULTADOS
6.1 Resultados do Experimento 1
Todos os filhotes, das fêmeas de hamsters inoculadas com 40 oocistos via
oral da cepa ME-49 e que 60 dias após foram postas para procriarem,
apresentaram-se negativos na sorologia de Aglutinação Direta. Isto demonstra que a
infecção é crônica as fêmeas não infectariam seus filhotes durante a gestação.
Tabela 1: Aglutinação direta dos soros de fêmeas Inoculadas via oral
com 40 oocistos da cepa ME49 de T. gondii, 60 dias antes de serem alojadas
com os machos.
FEMEA HAMSTER AGLUTINAÇÃO DIRETA
HAMSTER 01 NEGATIVO
HAMSTER 02 NEGATIVO
HAMSTER 03 NEGATIVO
HAMSTER 04 NEGATIVO
HAMSTER 05 NEGATIVO
HAMSTER 06 NEGATIVO
HAMSTER 07 NEGATIVO
HAMSTER 08 NEGATIVO
HAMSTER 09 NEGATIVO
HAMSTER 10 NEGATIVO
46
6.2 RESULTADOS DO EXPERIMENTO 2
Neste experimento, todas a s fêmeas hamsters que foram inoculadas com 10
2
oocistos de T.gondii (cepa Prugniaud via oral) durante a gestação, apresentaram
titulos positivos na prova de Aglutinação Direta. Os seus filhotes apresentaram
42,9% de positividade na prova de Aglutinação Direta quando bioensaiados em
camundongos. Quando três fêmeas adotaram filhotes vindo de mães livres de
infecção, que mamaram por três dias e depois, foram bioensaiados, estes
apresentaram-se negativos a prova de Aglutinação Direta.
Tabela 2: Aglutinação direta dos soros de fêmeas Inoculadas com 10
2
oocistos de T.gondi (cepa Prugniaud via oral). E aglutinação direta de soros de
seus filhotes e do soro de alguns filhotes adotados.
AD HAMSTER AD FILHOTES AD FILHOTES ADOTADOS
POSITIVO POSITIVO
POSITIVO NEGATIVO
POSITIVO POSITIVO
POSITIVO NEGATIVO
POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO
POSITIVO POSITIVO NEGATIVO
POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO
47
7 DISCUSSÃO
Na transmissão congênita durante a etapa crônica da infecção, obtivemos
resultados interessantes pois todas as fêmeas de hamsters inoculadas e suas crias
apresentaram titulações negativas. Todos os soros tiveram títulos menores que 1:64
na sorologia, dos camundongos bioensaiados, demonstrando que todos os filhotes
foram negativos e que não houve a transmissão do T.gondii nesta etapa crônica da
infecção. Os resultados encontrados evidenciam que o hamster é um modelo
experimental que tem apresentado um comportamento semelhante ao que ocorre
nos humanos. Esse fato torna-o um modelo que após ser exaustivamente testado
poderá ser referência para futuras pesquisas.
Existem outros modelos experimentais como o camundongo CF1,
demonstrado anteriormente (Fux et al., 2000). Essas linhagens de camundongos são
heterogêneas e com isso mais resistentes a inoculações quando comparadas com
as linhagens Balb/C que são linhagens homogêneas. O estudo em camundongos é
bastante usado, seu comportamento imunológico em relação ao T.gondii, tem várias
diferenças em relação ao comportamento em humanos e com isso o torna um
modelo limitado.
Em muitos trabalhos testando camundongos Balb/C, verificou-se que a
transmissão à ninhada, só ocorria se a infecção acontecesse durante a prenhez.
(Roberts e Alexander, 1992; Roberts, Brewer e Alexander, 1994; Thouvenin et al.,
1997; Elsaid et al., 2001; Freyre et al., 2006b).
Fux et al. (2000), testaram a infecção congênita na fase crônica da infecção
em 49 camundongos Balb/C e foi observado problemas reprodutivos durante essa
fase da infecção, como hipertrofia do endométrio e miométrio. No nosso experimento
nenhuma Hamster apresentou problemas de abortos ou infecções no trato
reprodutivo, só tivemos problemas gastrointestinais em seis fêmeas inoculadas,
estas vindo a óbito
Freyre et al. (2006b), testaram a transmissão congênita durante a etapa
crônica da infecção em camundongos. As fêmeas de camundongos, foram
48
inoculadas com bradizoítos, da cepa Prugniaud e 45 dias mais tarde foram
colocadas com machos. Após o nascimento os filhotes eram bioensaiados e
realizada aglutinação direta. A transmissão congênita ocorreu em 2 de 10
camundongos inoculadas.
Com camundongos Balb/C, Roberts e Alexander (1992), concluíram ser
possível seu uso como modelo para toxoplasmose em humanos e ovinos.
Em camundongos Balb/C quando infectados semanas após colocadas em
cria, desenvolvem uma imunidade capaz de proteger totalmente seus embriões,
mesmo se a re-infecção ocorrer durante prenhez.
Fux et al. (2000), comparou resultados de transmissão congênita quando
essas fêmeas eram inoculadas no início da gestação e tratadas, quando no meio da
gestação e tratadas e quando inoculadas no final da gestação e não sendo tratadas.
Obtiveram alto índice de titulação dos filhotes quando no início e no final da
gestação independente de serem ou não tratadas com antibióticos. Isto nos mostra
que os camundongos tem respostas imunológicas diferente dependendo do
momento da inoculação.
O modelo rata tem sido extensivamente usado para o estudo da transmissão
congênita e da imunidade contra a toxoplasmose As linhagens de ratas empregadas:
Wistar, Long Evans, Fischer e Sprague-Dowley têm mostrado muitas variações
individuais em sua resistência natural a toxoplasmose. Quando usadas cepas em
linhagens de ratas resistentes não se obtiveram resultados promissores. Isto
demonstra que este modelo tem limitações importantes, para o estudo (Dubey e
Shen, 1991; Zenner et al., 1993; Dubey e Frenkel, 1998; Paulino e Vitor, 1999;
Freyre et al., 1999a; Freyre et al., 2003a; Freyre et al., 2003b; Freyre et al., 2006a;
Freyre et al., 2006c).
Dubey et al. (1999) inocularam ratas (Sprague-Dawley e Wistar) com
1.000.000 taquizoítos RH, que permaneceram clinicamente normais, enquanto
camundongos (Swiss Webster), inoculados com apenas 1 taquizoíto morreram com
toxoplasmose aguda.
A transmissão crônica da toxoplasmose foi estudada por Freyre et al. (1999),
inoculando 89 ratas, com 7 cepas de T. gondii, 2 meses antes de serem postas com
machos. Após o bioensaio das ninhadas foram detectados 10% de transmissão
transplacentária.
49
Experimentos anteriores inoculando fêmeas com cepas diferentes das
usadas para desafiá-las durante a gestação, mostra a urgência de usarmos estas
técnicas em hamsters para estudar seu comportamento de uma forma mais
complexa, assim como já usados em outros modelos experimentais.
Em nosso segundo experimento, objetivamos verificar a transmissão
congênita aguda e lactogênica em Hamsters. Das 7 fêmeas prenhas inoculadas via
oral com a cepa Prugniaud na dosagem de 10
2
,
todas as fêmeas apresentaram-se
positivas e seus filhotes apresentaram uma taxa de 42.9% de positividade durante a
fase aguda da infecção por T.gondii. Os soros de filhotes adotados de mães livres,
todos foram negativos, comprovando que o leite destas fêmeas inoculadas, não teria
potencial de infectar esses filhotes e que essa via de infecção não é mais comum do
que a transplacentária.
O comportamento fisiológico dos animais depende de manejos adequados,
como temperaturas ajustadas, um fotoperíodo de 12 horas por dia. Sua reprodução
se dá mais à tardinha.
As fêmeas entram no cio de três em três dias aproximadamente se
caracterizando por uma secreção amarelada na vulva, isto garante que ao colocar a
fêmea junto ao macho eles não brigariam, o que na prática nem sempre ocorre desta
forma.(figuras 4 e 6).
O trabalho propõem que se alojem sempre 4 fêmeas para um macho, na
prática não obtivemos bons resultados, pois ocorreram muitas brigas entre eles,
principalmente das fêmeas entre si. Quando se colocam as fêmeas no cio em
horários inadequados como de dia as fêmeas muitas vezes ficam agressivas com
os machos, o melhor é sempre escolher o final do dia. Caso os animais se aceitem
bem não é recomendado deixar os casais muitos dias juntos, pois isto faz com que
eles não cruzem mais.
Algumas fêmeas apresentam canibalismo com suas ninhadas, durante o
experimento pudemos observar uma fêmea com este comportamento. É possível
que tenha havido mais casos em horários em que estavam sozinhas, pois várias
fêmeas diagnosticadas como prenhes, não pariram.
Durante o experimento tivemos problemas de reprodução, muitas fêmeas
não conceberam, isto é um dos motivos da complexidade deste modelo, e nossos
resultados estão diretamente ligados ao nascimento dos filhotes. Algumas fêmeas
50
(seis) ao todo apresentaram sintomatologia clinica como diarréia e óbitos alguns dias
após terem sido inoculadas.
Houveram problemas com a cepa prugniaud, em determinado momento
deste experimento foi observado ao microscópio que os oocistos estariam inviáveis,
entramos em contato com o Professor Freyre, no qual confirmou isto, e relatou que
estava com dificuldades em produzir mais oocistos naquele momento, mas que nos
meses subsequentes as cepas estariam disponíveis.
Freyre et al. (2001b), infectaram ratas com 15 dias de prenhes, utilizando 12
diferentes cepas e obtiveram 44% de transmissão transplacentária.
Freyre et al. (2003b) realizaram infecção com 6 cepas de oocistos, em 53
ratas com 15 dias de gestação, os filhotes nascidos foram bioensaiados em
camundongos e posteriormente realizada a aglutinação direta, obtiveram 51% de
transmissão transplacentária.
A proteção conferida à ratas quando inoculadas dois meses antes da
gestação com duas cepas diferentes e desafiadas com uma terceira cepa durante a
gestação, mostrou que dependendo da cepa o comportamento imunológico tem
diferenças significativas. Isto é importante saber no momento de confeccionar uma
vacina( Freyre et al., 2006a).
Em outra pesquisa Freyre et al. (2006c), inocularam ratas Sprague-Dawley
dois meses antes da concepção com a cepa RH (taquizoítos), Prugniaud (oocistos)
e ME (cistos). Doze dias após a cópula as fêmeas foram desafiadas com 10
3
cistos
das cepas Prugniaud, Elg, M3, M-7741 ou Hopa-hopa, ou 10
4
oocistos das mesmas
cepas. Os filhotes foram bioensaiados em camundongos e pesquisaram anticorpos.
Nos animais imunizados com RH e desafiados com cistos ocorreram 38,3% de
transmissão, e nos animais desafiados com oocistos houve 33,3%. Nos animais
imunizados com cistos e desafiados com cistos detectou-se 17% de transmissão, e
nos animais desafiados com oocistos obtiveram 48,2%. Mostrando que não só a
diferença de cepas é importante como também se ela é em forma de cisto ou
taquizoíto.
A importância de serem testados outros modelos consiste que particularmente
os camundongos apresentam muitas vantagens, porém, em condições naturais,
além de haver transmissão vertical durante a infecção crônica, ocorre também nas
sucessivas gerações de filhotes, o que indica que o uso deste animal, não é o
51
melhor modelo para a toxoplasmose humana (Remington, Jacobs e Melton, 1961.
Berveley, 1959 apud Innes, 1997).
Também, sabe-se que os camundongos são muito sensíveis à infecção por T.
gondii, sendo que seu uso para o estudo da toxoplasmose congênita, pode, não ser
o ideal.
Em um experimento em que foram desafiadas fêmeas camundongos Balb/c
durante a prenhez, para demonstrar infecção aguda com a cepa Prugniaud, houve
diferenças de positividade quando a dose foi maior. Freyre neste mesmo trabalho
inoculou fêmeas com cepas Prugniaud não obteve resultados positivos no bioensaio
dos filhotes, destes alguns sofreram canibalismo por parte da mãe adotiva.
No nosso experimento não houve canibalismo as fêmeas não tiveram
problemas quanto a adoção mesmo que os filhotes não fossem colocados
exatamente com os mesmos dias que os filhotes legítimos.
Existem poucos relatos sobre trabalhos em Hamsters. (Freyre 2006,
Comunicação Pessoal), verificou que a transmissão da cepa Prugniaud se produziu
em 20% de hamsters portadores de infecção crônica, durante a primeira gestação
posterior a inoculação, e em 0% durante a gestação subseqüente.
O Modelo Hamster realizado por Frenkel, Freyre e Smith (1986), consistiu em
proteção limitada do mutante ts4 de T.gondii contra desafios provocados durante a
gestação de hamsters. Neste caso o autor declara que a dose de desafio utilizada foi
desproporcional em relação ao peso corporal.
Esta linha de pesquisa visa contribuir para o estudo da Toxoplasmose e no
futuro viabilizar testes vacinais para humanos e animais.
52
8 CONCLUSÕES
Não ocorreu transmissão congênita do T.gondii, durante a fase crônica da
infecção no modelo Hamster.
Ocorreu transmissão congênita durante a fase aguda
Não ocorreu transmissão lactogênica .
53
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