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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIA
Avaliação da atividade in vivo e in vitro da terbinafina e itraconazol frente ao
Sporothrix schenckii
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias, da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, como requisito
parcial para obtenção do grau de Doutora, pela
Médica Veterinária Ana Raquel Mano
Meinerz.
Orientador: João Roberto Braga de Mello
Porto Alegre – RS - Brasil
2007
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Ana Raquel Mano Meinerz
Avaliação da atividade in vivo e in vitro da terbinafina e itraconazol frente ao
Sporothrix schenckii
Aprovada em 2007.
APROVADO POR:
________________________________
Prof. Dr. João Roberto Braga de Mello
Orientador e Presidente da Comissão
________________________________
Prof. Dr. Fernanda de Mello
Membro da Comissão
________________________________
Prof. Dr. Mário Carlos Araújo Meireles
Membro da Comissão
________________________________
Prof. Dra. Márcia de Oliveira Nobre
Membro da Comissão
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Ao meu marido
e a minha família
AGRADECIMENTOS
Passaram-se quatro anos... Depois de todo esse tempo, devo agradecer...
Ao meu orientador, Prof. João Roberto Braga de Mello, pela confiança e pela
oportunidade fundamentais para a realização deste trabalho;
Ao Prof. Mário Carlos Araújo Meireles, pela a minha iniciação no “mundo
científico”, pelas oportunidades e orientações tantas vezes solicitadas, além de todo apoio e
amizade;
Ao Prof. Luiz Filipe Schuch e Márcia de Oliveira Nobre, pela orientação, paciência
e amizade que me acompanharam ao longo desses anos;
Às colegas, amigas e futuras Doutoras, Anelise Martins, Helen Silveira Coimbra
Melissa Xavier, Isabel Madrid pela ajuda em todos os momentos;
A “velha guarda” Lorena Leonardo Souza (Lóren), Marlete Brum Cleff (Eme),
Patrícia Nascente (Na), Renata Osório Faria (Rê) e Tatiana de Ávila Antunes (Antunes)
pelos melhores momentos que ocorreram nesse período, assim também como pelo apoio
dado aos momentos mais difíceis;
A minha “equipe de trabalho”, Ane, Rosema Santin, Luiza Osório, Mel, Kity, Cris,
Anesinha que não só contribuíram de forma fundamental para a realização do trabalho
como transformaram esse período em momentos memoráveis;
Às Médicas Veterinárias, aos funcionários, professores do Laboratório de Doenças
Infecciosas e da Faculdade de Veterinária da UFPel que de alguma forma, direta ou
indiretamente, colaboraram com este trabalho... Silvia Ladeira, Renata Schramm, João
Zani, Paulinho, Toninho, Girlei, Paulinho.
Aos componentes da banca que atenderam ao convite pela atenção, Prof. Márcia
Nobre, Prof. Mário C.A. Meireles e Prof. Fernanda Mello. Além do Prof. Augusto
Langeloh e Prof. Sydney Harter pelas orientações e sugestões que certamente contribuíram
para o enriquecimento deste estudo;
A CAPES pela Bolsa de Estudo e Taxa de Bancada e ao CNPq pelos recursos
disponibilizados através do financiamento do projeto que fez parte deste trabalho;
RESUMO
Meinerz, Ana Raquel Mano. Avaliação da atividade in vivo e in vitro da terbinafina e
itraconazol frente ao Sporothrix schenckii
Orientador: João Roberto Braga de Mello
Considerando a importância do felino doméstico nos relatos zoonóticos da esporotricose,
assim como os problemas relacionados a terapêutica da micose nessa espécie, o estudo
objetiva avaliar a atividade in vitro da terbinafina e itraconazol frente ao S. schenckii;
estudar a ação desses fármacos no tratamento da esporotricose sistêmica experimental;
analisar as enzimas hepáticas e hemograma dos animais submetidos ao tratamento
antifúngico; estudar as possíveis alterações macroscópicas nos animais inoculados com S.
schenckii assim como realizar o retroisolamento do agente. Para o teste in vitro, foram
utilizados 10 isolados de S. schenckii (seis felinos, três humanos e um de cão), os quais
foram avaliados quanto a suscetibilidade frente aos fármacos através da técnica de
microdiluição em caldo de acordo com o CLSI para as fases leveduriforme e filamentosa do
agente. A leitura da CIM foi visual, correspondendo à menor concentração do antifúngico
em que não houve crescimento visível do S. schenckii quando comparado ao controle
positivo. O teste in vivo, foi realizado através da inoculação pelas vias intraperitonial e veia
lateral da cauda de células fúngicas (2x10
3
cél/mL) de dois isolados de S. schenckii (felino
e canino) em 120 ratos norvergicus, divididos em quatro grupos: tratado terbinafina
(250mg/kg) e itraconazol (100mg/kg); diluente terbinafina (250mg/kg de solução de água
destilada com 5% de DMSO e 1% de Tween 20) e itraconazol (100mg/kg de água destilada
estéril), sendo administrados através de sondagem oral uma vez ao dia, durante 30 dias.
Paralelamente foram realizados hemogramas e avaliação das enzimas hepáticas (ALT e
FA), assim como o acompanhamento da evolução clínica e análise histopatológica de todos
animais experimentais. No final do período experimental os animais foram necropsiados e
realizado análise macroscópica com a coleta dos órgãos para a obtenção do retroisolamento
do S. schenckii. A CIM para a terbinafina obtida entre todos os isolados na fase
leveduriforme de esporotricose felina variaram de 0,055µg/mL a 0,109µg/mL, enquanto
que para os isolados humanos e de cão foi de 0,055µg/ml. Para o itraconazol, a CIM frente
aos isolados de esporotricose felina foi de 0,875µg/mL a 1,75µg/mL, já para os casos
humanos foi de 0,219µg/mL e para o isolado de cão de 1,75µg/mL. Para a fase filamentosa
do agente foi observada uma CIM para a terbinafina entre os isolados de felinos de 0,875
µg/mL, enquanto que os isolados humanos e de cão a CIM foi de 0,219µg/mL. Para o
itraconazol os isolados felinos resultaram numa CIM de 3,5µg/mL, já nos isolados de
esporotricose humana e em cão a CIM foi de 1,75µg/mL. Quanto ao estudo in vivo, os
animais tratados com terbinafina e itraconazol resultaram em menor freqüência de
alterações macroscópicas assim como na obtenção do retroisolamento do agente em relação
aos grupos controle. Não foi detectada alterações nas enzimas hepáticas, hemograma e nas
avaliações macro e histopatológicas dos animais submetidos ao tratamento antifúngico.
Com esses resultados conclui-se que a terbinafina e itraconazol possuem atividade in vitro
frente ao S. schenckii e que as doses estudadas dos fármacos são eficazes no tratamento da
esporotricose experimental sistêmica, assim como não produzem alterações das enzimas
hepáticas avaliadas e do hemograma.
Palavras-chave: S. schenckii, Suscetibilidade, Terbinafina, Itraconazol.
ABSTRACT
Meinerz, Ana Raquel Mano. Evaluation of the activity in vivo and in vitro of the
terbinafine and itraconazole against to the Sporothrix schenckii
Adviser: João Roberto de Braga Mello
Considering the importance of the domestic feline in the zoonotic reports of the
esporotrichosis, as well as the related problems the therapeutics of the mycosis in that
species, the study objective was evaluate the activity in vitro of terbinafine and itraconazole
against to S. schenckii; study the activity of those drugs in the treatment of the experimental
systemic esporotrichosis; analyze the hepatic enzymes and blood count of the animals
submitted to the antifungal treatment; study the possible macroscopic alterations in the
animals inoculated with S. schenckii as well as realized the agent retroisolament. For the
test in vitro, 10 isolated of S. schenckii were used (six felines, three humans and one
canine), which were performed as the susceptibility against to the drugs through the
microdiluição technique in broth in accordance with the CLSI for the phases yeast and
mycelial of the agent. The reading of CIM was visual, corresponding to smallest
concentration of the antifungal in that there was not visible growth of S. schenckii when
compared to the positive control. The test in vivo, was performed through the of the
inoculation intraperitonial and lateral vein of the tail of fungal cells (2x10
3
cél/mL) of two
isolated of S. schenckii (feline and canine) in 120 mice norvergicus, divided in four groups:
treaty terbinafine (250mg/kg) and itraconazole (100mg/kg); diluent terbinafine (250mg/kg
of solution of water distilled with 5% of DMSO and 1% of Tween 20) and itraconazol
(100mg/kg of water distilled sterile), being administered by gavage once a day, for 30 days.
Parallel blood counts and evaluation of the hepatic enzymes were accomplished (ALT and
F.A), as well as the accompaniment of the clinical evolution and analysis histopathologic of
all animal experimental. In the end of the experimental period the animals were autopsied
and performed macroscopic analysis with the collection of the organs for the obtaining of
the detected S. schenckii growth. CIM for the terbinafine obtained among all the isolated
in the phase yeast of feline esporotrichosis oscillated between 0,055µg/mL the 0,109µg/mL,
while for the isolated humans and canine was of 0,055µg/ml. For the itraconazole, the CIM
against of the isolated of feline esporotrichosis was from 0,875µg/mL to 1,75µg/mL, for the
human cases it went of 0,219µg/mL and for the isolated canine of 1,75µg/mL. For the
mycelial phase a CIM was observed for the terbinafine among the isolated of felines of
0,875 µg/mL, while the isolated humans and canine CIM was of 0,219µg/mL. For the
itraconazole the isolated felines resulted in a CIM 3,5µg/mL, in the isolated of human
esporotrichosis and canine CIM was of 1,75µg/mL. As for the study in vivo, the animals
treaties with terbinafine and itraconazole resulted in smaller frequency of macroscopic
alterations as well as in the obtaining of the detected agent growth in relation to the
groups control. It was not detected alterations in the hepatic enzymes, blood count and in
the evaluations macro and histopathologic of the animals submitted to the antifungal
treatment. With those results we are to report that the terbinafine and itraconazol apresent
activity in vitro against to S. schenckii and that the studied doses of the drugs are effective
in the treatment of the systemic experimental esporotrichosis, as well as they don't produce
alterations of the appraised hepatic enzymes and blood count.
Key Words: S. schenckii, Susceptibility, Terbinafine, Itraconazole.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Grupos experimentais utilizados para o estudo in vivo.......................... 37
TABELA 2 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) da terbinafina e itraconazol
frente a isolados leveduriformes de Sporothrix schenckii através da técnica de
microdiluição em caldo ................................................................................................ 41
TABELA 3 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) da terbinafina e itraconazol
frente a isolados filamentosos de Sporothrix schenckii através da técnica de
microdiluição em caldo................................................................................................ 42
TABELA 4 - Valores referentes a Alanina Aminotransferase (ALT) e Fosfatase
Alcalina (FA) dos animais experimentais submetidos a administração dos fármacos
antifúngicos e seus respectivos diluentes...................................................................... 43
TABELA 5 - Alterações clínicas observadas nos animais experimentais com
esporotricose sistêmica durante o período do estudo................................................... 44
TABELA 6 – Alterações anatomopatológicas observadas nos animais
experimentais com esporotricose sistêmica durante o período de estudo.................... 50
TABELA 7 - Obtenção do retroisolamento de Sporothrix schenckii a partir do
cultivo do baço, fígado e testículos dos animais experimentais...................................
52
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – Casos de esporotricose felina, os quais originaram os isolados de
Sporothrix schenckii utilizados para o estudo da suscetibilidade antifúngica.
Laboratório de Micologia-UFPel................................................................................. 32
FIGURA 2 – Caso de esporotricose em cão, o qual originou o isolado de Sporothrix
schenckii utilizado para o estudo da suscetibilidade antifúngica. Laboratório de
Micologia-UFPel.......................................................................................................... 32
FIGURA 3 – (a) esporotricose cutânea-linfática correspondente ao caso 1; (b)
esporotricose cutânea fixa correspondente ao caso 2; (c) esporotricose cutânea
disseminada correspondente ao caso 3. Laboratório de Micologia-UFPel.................. 33
FIGURA 4 – (a) felino com esporotricose cutânea disseminada, o qual foi obtido o
isolado fúngico utilizado para a inoculação experimental; (b) isolado de S.
schenckii correspondente ao felino envolvido no estudo; (c) cão com esporotricose
cutânea, o qual foi obtido o isolado fúngico utilizado para a inoculação
experimental; (d) isolado de S. schenckii correspondente ao cão envolvido no
estudo. Laboratório de Micologia-UFPel.................................................................... 37
FIGURA 5 – (a) retirada das colônias de Sporothrix schenckii do meio de cultura
com auxilio de um bisturi estéril; (b) filtragem das colônias em camada dupla de
gaze estéril; (c) lavagem das colônias com PBS; (d) padronização do inóculo
fúngico. Laboratório de Micologia-UFPel................................................................... 38
FIGURA 6 – (a) inoculação experimental com o inóculo fúngico através da veia
lateral da cauda; (b) inoculação experimental com o inóculo fúngico através da via
intraperitonial. Laboratório de Micologia-UFPel......................................................... 39
FIGURA 7 – Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram aumento da espessura cauda.................................................................. 45
FIGURA 8 – Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram úlceras na cauda..................................................................................... 45
FIGURA 9 – Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram aumento testicular.................................................................................. 46
FIGURA 10 – Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram úlceras nos membros.............................................................................. 47
FIGURA 11 - Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram edema no plano nasal..........................................................................
47
FIGURA 12 - Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram úlceras no plano nasal............................................................................ 48
FIGURA 13 - Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental
apresentando flacidez testicular................................................................................... 48
FIGURA 14 – Alterações anatomopatológicas observadas nos animais com
esporotricose experimental sistêmica: (a) lesões nodulares e esbranquiçadas
disseminadas; (b) lesões nodulares eesbranquiçadas nos testículos; (c) nódulo no
parênquima subcutâneo; (d) lesões nodulares e esbranquiçadas no baço e
fígado............................................................................................................................ 50
FIGURA 15- Alterações anatomopatológicas presentes nos animais pertencentes
aos grupos tratado e diluente terbinafina...................................................................... 51
FIGURA 16- Alterações anatomopatológicas presentes nos animais pertencentes
aos grupos tratado e diluente itraconazol..................................................................... 51
FIGURA 17- Retroisolamento do Sporothrix schenckii obtidos dos animais
pertencentes aos grupos tratado e diluente terbinafina................................................. 53
FIGURA 18- Retroisolamento do Sporothrix schenckii obtidos dos animais
pertencentes aos grupos tratado e diluente itraconazol................................................ 53
FIGURA 19- Retroisolamento do Sporothrix schenckii obtidos dos grupos tratado
terbinafina e itraconazol...............................................................................................
54
SUMÁRIO
RESUMO......................................................................................................................
5
ABSTRACT..................................................................................................................
6
LISTA DE TABELAS.................................................................................................
7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES.......................................................................................
8
SUMÁRIO....................................................................................................................
10
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
12
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................
14
2.1 Sporothrix schenckii..............................................................................................
14
2.2 Esporotricose.........................................................................................................
15
2.3 Tratamento da esporotricose...............................................................................
20
2.3.1 Terbinafina........................................................................................................... 22
2.3.2 Itraconazol............................................................................................................ 24
2.4 Provas de suscetibilidade antifúngica..................................................................
26
2.5 Relação das provas in vitro com os resultados in vivo........................................
29
3 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................
31
3.1 Teste de suscetibilidade antifúngica.....................................................................
31
3.1.2 Manutenção e conversão dos isolados de Sporothrix schenckii utilizados........... 33
3.1.3 Preparo do inóculo fúngico................................................................................... 33
3.1.3.1 Inóculo da fase leveduriforme do Sporothrix schenckii ................................. 33
3.1.3.2 Inóculo da fase filamentosa do Sporothrix schenckii........................................ 34
3.1.4 Preparo das diluições antifúngicas........................................................................ 34
3.1.5 Leitura da Concentração Inibitória Mínima (CIM).............................................. 35
3.2 Avaliação das enzimas hepáticas e hemograma dos animais experimentais
submetidos ao tratamento com os antifúngicos e seus respectivos diluentes......... 35
3.3 Avaliação dos antifúngicos no tratamento da esporotricose experimental
sistêmica .......................................................................................................................
36
3.3.1 Isolados de Sporothrix schenckii envolvidos no estudo..................................... 37
3.3.2 Preparo do inóculo fúngico................................................................................... 38
3.3.3 Inoculação experimental....................................................................................... 38
3.3.4 Tratamento dos animais experimentais com esporotricose sistêmica.................. 39
3.3.5 Acompanhamento clínico dos animais experimentais com esporotricose
sistêmica......................................................................................................................... 39
3.3.6 Necropsia dos animais experimentais................................................................... 40
3.3 Analíse estatística...................................................................................................
40
4 RESULTADOS.........................................................................................................
41
4.1 Suscetibilidade in vitro dos isolados de Sporothrix schenckii frente aos
antifúngicos terbinafina e itraconazol........................................................................
41
4.2 Avaliação das enzimas hepáticas e hemograma dos animais experimentais
submetidos ao tratamento antifúngico e seus respectivos diluentes........................
43
4.3 Avaliação da atividade dos fármacos antifúngicos no tratamento da
esporotricose experimental sistêmica.........................................................................
43
4.3.1 Avaliação clínica dos animais experimentais com esporotricose sistêmica......... 44
4.3.2 Alterações anatomopatológicas nos animais experimentais com esporotricose
experimental sistêmica................................................................................................... 49
4.3.3 Obtenção do retroisolamento do Sporothrix schenckii......................................... 52
5 DISCUSSÃO.............................................................................................................
55
6 CONCLUSÃO...........................................................................................................
62
7 REFERÊNCIAS.......................................................................................................
63
1 INTRODUÇÃO
A esporotricose, doença micótica de ocorrência mundial, causada pelo fungo
dimórfico Sporothrix schenckii afeta o homem e várias espécies de animais domésticos,
especialmente a espécie felina. Os felinos representam importante papel na transmissão
do agente para outros animais e ao homem, sendo crescente os relatos zoonóticos da
micose envolvendo, especialmente, felinos machos, não castrados e de livre acesso à
rua, devido aos hábitos inerentes dessa espécie (LOPES et al., 1999; NOBRE et al.,
2002 (b); LOPES-BEZERRA et al., 2006).
O homem pode se contaminar com S. schenckii através de arranhadura,
mordedura, contaminação por solução de continuidade cutânea preexistente, ou contato
direto da pele levemente irritada com lesões ulceradas e exsudativas de felinos
infectados. Estudos sugerem, que a transmissão da esporotricose pelos felinos aos
humanos é facilitada devido ao grande número de microrganismos encontrados nas
lesões desses animais enfermos (NOBRE et al., 2001; LOPES-BEZERRA et al., 2006).
O crescente uso de fármacos antibacterianos e imunossupressores, os avanços
das técnicas de transplantes de órgãos e tratamento do câncer, assim como a maior
sobrevida das vítimas da SIDA (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) resultaram
no aumento do número de pacientes suscetíveis a esporotricose, consequentemente, de
indivíduos sujeitos a falhas terapêuticas, recidiva assim como o desenvolvimento de
resistência aos antifúngicos de uso corrente. Aliado a esses fatores, a aquisição, cada
vez mais freqüente, do felino como animal de companhia, convivendo no mesmo
“nincho urbano” favorece a transmissão da esporotricose ao homem a partir do animal
portador do S. schenckii (NETO et al., 1999; BONIFAZ et al., 2001).
Devido ao caráter zoonótico, a esporotricose é considerada uma micose de
interesse para a saúde pública, no entanto, os fármacos utilizados atualmente no
tratamento da enfermidade não satisfazem completamente a necessidade médica
humana e veterinária, devido, principalmente aos problemas relacionados a espectro,
potência, segurança e propriedades farmacocinéticas dos antifúngicos disponíveis (DE
PAUW, 2000).
Até 1940 a terapia à base de iodo era a única substância disponível para o
tratamento das formas cutâneas e linfocutâneas da esporotricose, constituindo-se uma
13
terapia de baixo custo e eficaz, tanto para os animais como para o homem. Porém,
devido aos freqüentes efeitos colaterias, o seu uso foi limitado, principalmente na
espécie felina, que é sensível aos preparados contendo iodo (STERLING &
HEUMANN, 2000; NOBRE et al., 2002 (a); ROCHETTE et al., 2003). Já a anfotericina
B, antibiótico poliênico, é preconizada para as formas disseminadas da micose em
humanos, demonstrando boa atividade, no entanto são comuns os relatos de toxicidade
associado ao seu uso, principalmente nefrotoxicidade. O itraconazol, por sua vez,
emergiu nos anos noventa como uma alternativa terapêutica com reduzida toxicidade
em comparação aos fármacos tradicionalmente utilizados no tratamento da
esporotricose além de ter maior espectro de ação. Porém, devido, ao seu uso
indiscriminado, observou-se o crescente número de isolados resistentes, resultando em
falhas no tratamento da esporotricose humana e felina (NEGRONI & ARECHALAVA,
1993; KAUFFMAN et al., 2000; MATSUMOTO et al., 2000; BONIFAZ et al., 2001;
GHOSH et al., 2001; STALKUP et al., 2002; BUSTAMANTE & CAMPOS, 2004;
SCHUBACH et al., 2004).
Os freqüentes relatos da resistência in vitro de S. schenckii à anfotericina B e aos
derivados azólicos, bem como os problemas relacionados a toxicidade desses fármacos,
apontam para a necessidade de mais estudos sobre o emprego de novos fármacos
antifúngicos para o tratamento da esporotricose. Nesse contexto a terbinafina,
antifúngico do grupo das alilaminas, se destaca por sua atividade in vitro primariamente
fungicida, frente a várias espécies de fungos filamentosos e dimórficos, inclusive o S.
schenckii, demonstrando ainda menor toxicidade em relação aos outros antifúngicos
utilizados no tratamento da micose (HAY, 1999; PEREZ, 1999; RYDER, 1999; JAIN &
SEHGAL, 2000; JESSUP et al., 2000; DARKES et al., 2003; KOHLER et al., 2004;
CHAPMAN et al., 2004; COSKUN et al., 2004).
Em vista da importância do felino doméstico na transmissão da esporotricose
para outros animais e para o homem, assim como a problemática envolvendo a terapia
da esporotricose na espécie felina, o estudo tem como objetivo avaliar a suscetibilidade
in vitro do S. schenckii frente a terbinafina e itraconazol, assim como a atividade desses
fármacos no tratamento da esporotricose experimental sistêmica, sendo esses
normalmente utilizados no tratamento das formas cutânea e cutânea-linfática sem o
estabelecimento do protocolo terapêutico para a forma sistêmica da micose; estudar as
possíveis alterações macroscópicas nos animais inoculados com S. schenckii; além de
realizar o retroisolamento do agente.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Sporothrix schenckii
Segundo dados históricos, descritos por Arenas (1993), Benjamin Schenck em
1898, nos Estados Unidos, definiu a esporotricose e seu organismo casual, denominando
Sporotrichia. Em 1900, Hektoen & Perkins descreveram o segundo caso de
esporortricose, atribuindo o fungo isolado de Sporothrix schenckii. De Beurman &
Gougerot, na França, realizaram estudos envolvendo inúmeros casos clínicos da
enfermidade, atribuindo, em 1905 o nome de Sporotrichum beurmanni ao
microrganismo destes relatos, tendo sido o agente considerado diferente ao isolado por
Hektoen & Perkins. Mas, em 1921, foram consideradas idênticas as esporotricoses
americana e francesa, sendo que em 1963, Carmichael determinou o nome do agente
como Sporothrix schenckii.
Atualmente o S. schenckii pertence à divisão Ascomycota, subclasse
Euascomycetes, ordem Ophiostomatales, família Ophiostomataceae, gênero Sporothrix
e espécie schenckii. Várias outras espécies do gênero têm sido descritas, sendo a mais
recente conhecida como Sporothrix cynanescens, no entanto, o S. schenckii é a única
patogênica. A forma sexuada do agente não está totalmente definida, embora a análise
molecular de rRNA ribossômico forneceu indiretamente como provável forma sexual o
Ophiostoma stenoceras, que está relacionado para o Ascomycetes (LACAZ et al., 1991;
KNOW-CHUNG & BENNETT, 1992; LOPES-BEZERRA et al., 2006).
O S. schenckii é considerado saprófita de solo rico em matéria orgânica e
celulose tendo sido isolado a partir de cascas de árvores, musgo (Sphaganum) e
sementes de coníferas. Em temperatura ambiente ou em condições in vitro a 25ºC, o
agente tem rápido crescimento, apresentando-se como uma colônia inicialmente branca
amarelada, sedosa, membranosa, às vezes com micélio aéreo, posteriormente tornando-
se pregueada e escurecida. Microscopicamente são observadas hifas finas, septadas,
ramificadas, medindo 1-2µm de diâmetro com conidióforos alongados, simpodiais,
contendo ápices entumecidos, frutificando conídios hialinos, elípticos ou ovais
dispostos em rosetas. Na sua forma parasitária ou quando cultivado a 37ºC, a colônia
adota forma leveduriforme, com aspecto de colônia bacteriana de coloração cinza ou
15
creme. A micromorfologia do agente evidencia células leveduriformes, pequenas, ovais
ou no formato de “charutos”, com brotamento simples ou múltiplo (LACAZ et al, 1991;
KNOW-CHUNG & BENNETT, 1992).
A característica dimórfica do S. schenckii é comprovadamente um dos fatores
relacionados a sua virulência, sendo que o dimorfismo lhe confere maior capacidade de
proteção frente ao sistema imune do hospedeiro. Outros fatores associados a virulência
do agente têm sido descritos, como a provável correlação entre a termotolerância e as
formas clínicas da micose, considerando que isolados incapazes de crescer a
temperaturas superiores a 35 e 37°C, estariam associados com lesões cutâneas
características com a forma cutânea fixa da micose, enquanto que isolados
termotolerantes estariam aptos a se desenvolver nos órgãos internos. Assim como a
presença da melanina na parede fúngica, a qual confere ao agente proteção celular
contra danos químicos e físicos (TACHIBANA et al., 1999). Em relação ao tempo de
cultivo de conídeos, foi observado que os cultivados por um período de sete dias são
mais virulentos, quando comparados com aqueles cultivados há 10 dias, sendo ainda
detectados diferenças entre a composição da parede celular desses conídeos. Estudos
também observaram, que a forma leveduriforme é mais resistente frente ao peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) e neutrófilos em comparação a fase filamentosa do agente
(ROMERO-MARTINEZ et al., 2000; MORRIS-JONES et al., 2003; KAJIWARA et al.,
2004).
2.2 Esporotricose
A esporotricose é uma micose subcutânea, de evolução subaguda ou crônica, de
ocorrência mundial, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, a
micose é conhecida desde 1907, quando foi relatada a infecção no homem e em animais
no estado de São Paulo por Lutz & Splendore. Posteriormente, Freitas et al. (1956)
descreveram a enfermidade em gatos e Souza (1957) relatou a esporotricose em cães.
No Rio Grande do Sul o primeiro relato de caso foi descrito por Londero et al. (1964),
que diagnosticaram a esporotricose em dois cães, sendo que, atualmente, essa é a
micose subcutânea de maior ocorrência no estado (LOPES et al., 1999; LOPES-
BEZERRA et al., 2006).
16
A esporotricose acomete o homem e várias espécies de animais, sendo os felinos
os mais freqüentemente infectados pelo agente. Normalmente, a infecção com S.
schenckii ocorre devido à inoculação acidental ou traumática do agente na pele, por
espinhos ou material vegetal o que, provavelmente, justifica a maior freqüência da
enfermidade em jardineiros, agricultores, tratadores de animais, floristas e
manipuladores de sementes e mineiros, sendo considerada, portanto, uma micose
ocupacional. A infecção pode também ocorrer através da contaminação de feridas
abertas, ou da pele com solução de continuidade, por exsudatos provenientes de animais
infectados, ou, ainda, mais raramente, pela inalação de conídios resultando em infecção
pulmonar (MORRIS-JONES, 2002; LOPES-BEZERRA et al., 2006).
Os relatos de esporotricose humana descrevem freqüentemente, os felinos
domésticos como transmissores da doença, especialmente machos, não castrados e de
livre acesso à rua, devido aos hábitos característicos desta espécie animal, sendo
crescentes os relatos zoonóticos em diversos países (DUNSTAN et al., 1986; RAFAL &
RASMUSSEN, 1991; KELLY & CLARK, 1991; MORISHITA et al., 2001), assim
como no Brasil (LARSSON et al., 1989; FRANCO et al., 1993; MARQUES et al.,
1993; NOGUEIRA et al., 1995; BRUSTEIN et al., 2000; COSTA et al., 2000 (a);
SOUZA et al., 2000; CASTRO et al., 2001; FLEURY et al., 2001; MEINERZ et al.,
2001; NOBRE et al., 2001; CONCEIÇÃO-SILVA et al., 2004; XAVIER et al., 2004;
SCHUBACH et al., 2005).
Os relatos zoonóticos da esporotricose demonstram que o homem pode se
contaminar através de arranhadura, mordedura, contaminação por solução de
continuidade cutânea preexistente, ou contato direto da pele levemente irritada com
lesões ulceradas e exsudativas dos animais enfermos. Estudos sugerem que a
transmissão da esporotricose pelos felinos aos humanos, seja facilitada devido ao grande
número de microrganismos encontrados nas lesões de gatos infectados, sendo que o
agente foi isolado das unhas e cavidade bucal, destacando o risco de transmissão do S.
schenckii através destas vias (SCHUBACH et al., 2000; LOPES-BEZERRA et al.,
2006; SOUZA et al., 2006).
A esporotricose caracteriza-se por uma diversidade de formas clínicas, tendo
apresentação nas formas cutâneas (fixa, linfocutânea e disseminada com o envolvimento
cutâneo) e extracutânea (pulmonar primária e disseminada). Na forma fixa, a infecção
permanece no sítio de inoculação, o tipo linfocutâneo, por sua vez, se caracteriza por
uma lesão primária acompanhada pelo desenvolvimento de nódulos secundários
17
acompanhando a cadeia linfática regional. Já a forma disseminada é caracterizada pela
extensão das lesões a grandes áreas da pele, sendo, normalmente, associada, a um
quadro concomitante de imunodepressão. A apresentação extracutânea da micose é de
rara ocorrência, porém a forma pulmonar decorrente da inalação de esporos fúngicos, ou
de caráter secundário, devido a disseminação hematógena, são as mais relatas. A
disseminação hematógena do agente, pode também resultar em osteoartrite, e mais
raramente endoftalmite e meningite (MORRIS-JONES, 2002; LOPES-BEZERRA et al.,
2006).
Essa variabilidade de sintomas clínicos, bem como a regressão ocasional
espontânea da esporotricose pode estar associado a capacidade de resposta imune do
animal infectado frente ao agente. A forma linfocutânea está, provavelmente,
relacionada com a menor exposição prévia do indivíduo ao S. schenckii. A exposição
prolongada com pequenas quantidades de antígenos fúngicos, pode conferir,
gradualmente, imunidade do hospedeiro frente ao fungo, o que sugere que a forma
localizada da micose seria uma forma de reinfecção, em pacientes que desenvolveram a
imunidade contra o fungo, enquanto que a forma linfocutânea ocorreria em pacientes
sem o contato prévio com o agente. Já a forma extracutânea ocorre, principalmente, em
indivíduos imunossupremidos, sendo demonstrado que os linfócitos CD4 são
importantes na imunidade contra o agente em humanos. Em felinos, estudos procuram
relacionar a coexistência de enfermidades imunossuepressoras, como as retroviroses
felinas, com a esporotricose. No entanto, essa relação ainda não está comprovada, mas
estudos demonstraram que animais portadores do Vírus da Leucemia Felina (FeLV) ou
da Imunodeficiência Felina (FIV) podem desenvolver as formas mais graves da micose
(MANCIANTI et al., 1992; COURCHAMP et al., 2000; SIERRA et al., 2000;
MEINERZ et al., 2002; KAJIWARA et al., 2004).
Nos animais, especialmente em cães e gatos, a esporotricose ocorre na forma de
três síndromes clínicas, sendo elas: forma cutânea, onde a lesão cutânea permanece
localizada, com a formação de nódulos alopécicos que tendem a ulcerar; a forma
linfocutânea, onde os nódulos se desenvolvem no ponto de inoculação com a progressão
da infecção para os tecidos subcutâneos e linfáticos; e a forma disseminada, relatada
mais freqüentemente nos felinos quando comparado a outras espécies. A forma
sistêmica é causada pela disseminação da infecção, por via hematógena ou pela difusão
tecidual a partir do local de inoculação, para ossos, articulações, pulmões e outras
vísceras, estando associada, normalmente, a animais com a sistema imune
18
comprometido, principalmente a resposta celular. Embora seja rara, a inalação do agente
pode resultar na forma pulmonar da doença, ou na sua disseminação sistêmica
(MORRIS-JONES, 2002; LOPES-BEZERRA et al., 2006).
A esporotricose felina pode mimetizar outras infecções granulomatosas e
neoplasias cutâneas. As lesões se concentram, principalmente na região cefálica,
membros e cauda, podendo ser semelhantes àquelas decorrentes de criptococose, ou,
inicialmente, se assemelham a lesões provocadas por brigas, na forma de abcesso,
podendo evoluir para lesões necróticas, erosivas, ulceradas e crostosas. As áreas
lesadas, normalmente, são indolores e não pruriginosas, dessa forma é imprescindível,
para o estabelecimento de um diagnóstico definitivo, recorrer a exames complementares
(LAPPIN, 1993; SCHUBACH et al., 2003; GADEA & CUENCA-ESTRELLA, 2004).
A cultura micológica de exsudatos, tecidos ou aspirados de lesões, permite à
confirmação do diagnóstico para a esporotricose, sendo rara a visualização direta do
microrganismo em exsudato humano, devido à pequena quantidade do agente fúngico
presente. Ao passo que em felinos o exame citológico frequentemente revela a presença
do agente, normalmente esses são polimorfos, podendo estar intra ou intercelularmente.
Para o diagnóstico de certeza, o exame micológico é indispensável, sendo que o S.
schenckii se desenvolve bem no meio de cultura ágar Sabouraud dextrose com
cloranfenicol acrescido de cicloheximida, podendo, também, ser cultivado nos meios
ágar fubá, infusão cérebro-coração (BHI) e ágar batata. O dimorfismo do agente pode
ser demonstrado quando este é cultivado a 25ºC e a 37ºC (LACAZ et al, 1991; KNOW-
CHUNG & BENNETT, 1992; GADEA & CUENCA-ESTRELLA, 2004).
Outros exames podem auxiliar no diagnóstico da esporotricose, como as provas
bioquímicas, sendo as mais realizadas, a prova de hidrólise da uréia; resistência para
cicloheximida e a tolerância a adição de cloreto de sódio no meio de cultivo. Assim
como o hemograma, sendo que humanos com esporotricose demonstram, normalmente
a presença de leucocitose, eosinofilia e índice de sedimentação eritrocitária aumentada.
A inoculação experimental de S. schenckii pelas vias intraperitonial, intratesticular ou
no coxim plantar de animais laboratoriais, como o camundongo, rato ou hamster pode
ser útil na demonstração da patogenicidade do microorganismo. A inoculação do
microrganismo pela via intraperitonial ou intraescrotalmente em roedores, resulta dentro
de duas a três semanas, na detecção do agente no fígado, baço ou testículos. A
esporotricose experimental também pode ser útil na observação da resposta imune do
hospedeiro, assim como, na obtenção do retroisolamento do agente (POLANIA et al.,
19
1990.; DIXON et al., 1992., MUJICA et al., 1992; TACHIBANA et al., 1999;
TACHIBANA et al., 2001; LIMA et al., 2003; NOBRE et al ., 2003; NOBRE et al.,
2004; NOBRE et al., 2005).
O exame histopatológico pode complementar o diagnóstico da esporotricose,
sendo que os tecidos afetados corados pelas técnicas histoquímicas de hematoxilina-
eosina (H.E.), Ácido Periódico de Schiff (P.A.S.) e metenamina argêntica de Gomori
permitem evidenciar a forma leveduriforme do S. schenckii. Em H.E. as células fúngicas
se apresentam pleomórficas, com corpos celulares pequenos, medindo
entre 3 a 5µm envoltos por um halo. Quando corados em P.A.S. apresentam corpo
celular basofílico, halo claro e rima periférica vermelha. Corados pela prata metenamina
de Gomori, observam-se formas de naveta, arredondadas com brotamento simples,
claviformes e/ou brotamentos arredondados. As leveduras podem ainda estar revestidas
por imunoglobulinas, assumindo aspecto de corpúsculos asteróides (fenômeno de
Splendore- Hoeppli), sendo este achado sugestivo da infecção pelo agente. No entanto,
as formas parasitárias do agente podem não ser visualizadas, mesmo em casos de lesões
ativas, com cultura positiva.. A reação inflamatória observada no exame histopatológico
resultante de todas as formas clínicas de esporotricose é do tipo mista purulenta e
granulomatosa (FLEURY et al., 2001; LOPES-BEZERRA et al., 2006).
A formação de granulomas com microabcedação central pode ser observada na
epiderme, derme, tecido subcutâneo ou outros tecidos, caso esteja na forma
disseminada. O granuloma causado pelo S. schenckii pode apresentar centro supurativo,
necrótico, circundado por inflamação granulomatosa epitelióide, com grande número de
células gigantes, multinucleadas e halo linfoplasmocitário com tecido de granulação e
fibrose. Células epitelióides, células gigantes e linfonodos encapsulados por tecido
conjuntivo fibroso são infiltrados celulares clássicos no interior dos granulomas
(MORRIS-JONES, 2002; LOPES-BEZERRA et al., 2006).
Os achados histopatológicos para as espécies canina e felina, se caracterizam por
uma epiderme acantótica e ulcerada com crostas e excudação variável, sendo freqüente
a presença de abcessos na epiderme hiperplásica. Nos felinos pode ser observada uma
intensa inflamação composta por macrófagos e alguns neutrófilos em um padrão
piogranulomatoso nodular a difusa na derme superficial e profunda. Ocasionalmente
podem estar presentes linfócitos e plasmócitos. O que diferencia a esporotricose felina
das demais espécies é a grande quantidade de elementos fúngicos, os quais são
facilmente visualizados, mesmo em colorações de rotina (MORRIS-JONES, 2002;
20
SCHUBACH et al., 2003).
2.3 Tratamento da esporotricose
Até 1940 os iodetos eram as únicas substâncias disponíveis para a esporotricose
cutânea ou cutânea linfática. Sugere-se que o mecanismo de ação seja devido a atuação
desses compostos sobre a resposta imune do hospedeiro, realçando o sistema halogênio-
peroxidase dos polimorfosnucleares, porém estudos in vitro não confirmaram a
atividade do iodo frente ao S. schenckii (DE PAUW, 2000; NOBRE et al., 2002 (a);
LUMBRERAS et al., 2003; BUSTAMANTE & CAMPOS, 2004).
Atualmente o uso do iodo, na forma de iodeto de sódio e potássio é uma
alternativa terapêutica de baixo custo no tratamento da esporotricose de cães, eqüinos e
para o próprio homem, sendo administrado normalmente, como solução saturada, pela
via oral, na concentração de 20%. Em cães de grande porte, são indicadas soluções nas
doses de 40mg/kg de 8/8 ou 12/12 horas e em gatos o iodeto deve ser administrado em
doses inferiores, aconselhando-se 10mg/kg a cada 12 horas, sendo que o tratamento
deve prosseguir por pelo menos um mês após a obtenção da cura clínica. No entanto, o
esquema terapêutico é freqüentemente interrompido devido ao aparecimento de reações
alérgicas e tóxicas, especialmente em felinos que apresentam maior sensibilidade aos
preparados contendo iodo. Os principais sintomas de intoxicação observados nessa
espécie animal são, a presença de secreções óculos-nasais, seborréia seca e
ressecamento da pelagem, vômito, anorexia e depressão, sendo recomendado a
suspensão do tratamento (LUMBRERAS et al., 2003; CATALÁN & MONTEIRO,
2006).
A anfotericina B, antibiótico poliênico, foi introduzida em 1956, representando o
primeiro antifúngico de administração sistêmica comercialmente disponível e desde
então tem sido o tratamento de escolha para a esporotricose nas formas extracutâneas,
cutâneas recalcitrantes e disseminadas em humanos. O fármaco atua se ligando ao
ergosterol da membrana da célula fúngica, induzindo mudanças na permeabilidade de
membrana com conseqüente extravasamento de componentes e morte celular. Quando
administrada pela via oral possui baixa distribuição, com menos de 5% de
biodisponibilidade, sendo necessária administração endovenosa para alcançar e manter
21
concentrações adequadas no plasma (POLAK, 1999; ODDS, 2003; CATALÁN &
MONTEIRO, 2006).
A anfotericina B além de se ligar ao ergosterol também pode, embora em menor
extensão, se ligar a outros esteróis, como ao colesterol, o que justifica, em grande parte,
a magnitude da toxicidade associada ao seu uso. Assim, mesmo com boa atividade
sobre o S. schenckii, os freqüentes efeitos adversos limitam o seu uso, sendo que os
efeitos colaterais mais descritos são a hipocalemia e hipertermia. Outros efeitos são
observados com relativa freqüência, sendo os principais a anorexia, náuseas, vômito,
cefaléia, mialgia e flebite. Reações anafiláticas podem ocorrer em 1% dos usuários,
aconselhando-se a interrupção do esquema terapêutico. A nefrotoxicidade, um dos
efeitos adversos mais importantes, ocorre, geralmente, no inicio da terapia,
normalmente reversível, sendo decorrente da diminuição na taxa de filtração glomerular
e do fluxo sanguíneo renal, resultando em azotemia e oligúria (BUSTAMANTE &
CAMPOS, 2004).
Buscando minimizar os efeitos adversos da anfotericina B e aumentar a sua
eficácia terapêutica, foram desenvolvidas novas formulações do fármaco, surgindo os
análogos do composto como o éster metílico da anfotericina B, que demonstrou ser
menos tóxico, apresentando, no entanto, efeitos relacionados ao sistema nervoso central.
Os complexos lipossomais de anfotericina B são outra nova opção, indicados para
maximizar a penetração do fármaco, porém, com a desvantagem de elevar muito os
custos do tratamento (LYMAN & WALSH, 1992; ODDS, 2003; BUSTAMANTE &
CAMPOS, 2004;).
A anfotericina B tem uso restrito em animais devido, principalmente, aos seus
efeitos nefrotóxicos. Para cães a forma convencional do fármaco (desoxicolato) deve ser
administrado 0,25 a 0,5mg/kg, endovenoso, dissolvido em 500mL a 1L de solução
dextrose a 5%, durante seis a oito horas, três vezes por semana, por um período de dois
a quatro meseses. Já a forma lipossomal deve ser administrada na dose de 2,25mg/kg,
endovenosa a cada 72 horas. Em felinos a forma convencional da anfotericina B deve
ser utilizada nas doses de 0,25 a 0,5mg/kg, nas mesmas condições descritas para cães
(ROCHETTE et al., 2003).
Os antifúngicos do grupo dos triazóis, especialmente o itraconazol, emergiram
como uma alternativa terapêutica eficaz e com reduzidos efeitos colaterais em relação
aos fármacos tradicionalmente utilizados na terapia da esporotricose, sendo atualmente
o fármaco de eleição para o tratamento das formas cutâneas e linfocutâneas da micose.
22
No entanto devido, principalmente, ao seu uso indiscriminado são cada vez mais
freqüentes os relatos de resistência e falhas terapêuticas no tratamento da micose em
animais e humanos (LUMBRERAS et al., 2003; ODDS, 2003; SCHUBACH et al.,
2004).
A ação de outros antifúngicos mais recentes, como a terbinafina, antifúngico do
grupo das alilaminas, tem sido avaliada como uma alternativa para o tratamento da
esporotricose. Este fármaco vem demonstrando uma boa atividade in vitro frente ao S.
schenckii, assim como, boa tolerabilidade e ação no tratamento da esporotricose cutânea
e cutânea linfática (PETRANYI et al., 1987; HULL & VISMER, 1992; HAY, 1999;
RYDER, 1999; PEREZ, 1999; KAUFFMAN et al., 2000; JAIN & SEHGAL, 2000;
JESSUP et al., 2000; MORISHITA et al., 2001; TANUMA et al., 2001; ODDS, 2003;
BUSTAMANTE & CAMPOS, 2004; CHAPMAN et al., 2004; COSKUN et al., 2004;
KHOLER et al., 2004; TRILLES et al., 2005; KHOLER et al., 2006), necessitando, no
entando, mais estudo a fim de avaliar sua eficácia no tratamento da esporotricose felina.
2.3.1 Terbinafina
As alilaminas pertencem a um grupo de antifúngicos sintéticos descobertos
acidentalmente durante estudos de um produto com a atividade sobre o sistema nervoso
central, que resultou em um derivado ciananil chamado naftifina. Essa classe de
antifúngico é composta por fármacos com grande afinidade pelas enzimas fúngicas,
existindo duas alilaminas disponíveis no mercado, a naftifina e terbinafina. A primeira
está disponível apenas na apresentação tópica e a terbinafina além de várias
apresentações tópicas, ainda está disponível na formulação oral (JESSUP et al., 2000;
DARKES et al., 2003).
A terbinafina age inibindo a enzima esqualeno epoxidase e bloqueia a conversão
da esqualeno para lanosterol, e desse modo, eliminando o ergosterol dentro da
membrana celular fúngica alterando a biossíntese dos esteróis fúngicos, acarretando a
deficiência do ergosterol, ocasionando a morte da célula fúngica. A inibição da enzima
não é mediada através do citocromo P-450, o que a diferencia dos azóis, não afetando os
níveis de cortisol e testosterona mesmo quando administrada em altas doses (ODDS,
2003; BUSTAMANTE & CAMPOS, 2004).
A terbinafina é bem absorvida por via oral, sendo que cerca de 70-80% no
23
sistema gastrintestinal e somente uma fração deste fármaco é absorvida por via tópica.
A sua biodisponibilidade é discretamente alterada pela ingestão de alimentos,
demonstrando uma alta disponibilidade quando administrada junto a refeições com alto
teor de lipídios. A sua lenta redistribuição no sangue assim como o acúmulo no tecido
periférico são fatores que provavelmente influenciem na longa meia-vida de eliminação
do fármaco. O agente sofre metabolização hepática e aproximadamente 80% é
excretado na urina e o restante nas fezes (POLAK, 1999; CATALÁN & MONTEIRO,
2006).
A natureza lipofílica e queratofílica da terbinafina leva ao seu acúmulo no tecido
adiposo e queratinizado, sendo por essas características, o fármaco de primeira escolha
para o tratamento das dermatofitoses e onicomicoses. Estudos demonstraram que seu
espectro de ação in vitro e in vivo pode ser ampliado para uma gama de fungos
patogênicos responsáveis por micoses superficiais e infecções sistêmicas, como a
histoplasmose, pneumocistose e aspergilose (HAY, 1999; JAIN & SEHGAL, 2000;
WALZER & ASHBUGH, 2002).
Com relação ao uso da terbinafina no tratamento da esporotricose, vários autores
confirmam a boa atividade utilizando o fármaco nas formas cutâneas e linfocutâneas da
micose com doses variando de 125mg a 1000mg (HULL & VISMER, 1992;
MORISHITA et al., 2001; TANUMA et al., 2001; CHAPMAN et al., 2004; COSKUN
et al., 2004). Quanto ao uso do antifúngico na Clínica Veterinária, estudos
administrando o fármaco em felinos nas doses de 10 a 40mg/kg não observaram efeitos
colaterais, sendo incluída, além do iodeto de potássio e itraconazol, na terapêutica de
felinos com esporotricose, porém são ainda escassos as análises que confirmem a sua
ação no tratamento da esporotricose felina e em cães (MANCIANTI et al.,1999;
KOTNIK et al., 2001; ROCHETTE et al., 2003).
Assim como os estudos clínicos, as análises referentes a suscetibilidade in vitro
do S. schenckii frente a terbinafina também resultaram na boa atividade do fármaco,
sendo que demonstraram atividade fungicida frente ao agente, com valores de CIM
iguais ou menores aos antifúngicos tradicionalmente utilizados no tratamento da
esporotricose (PETRANYI et al., 1987; HULL & VISMER, 1992; HAY, 1999;
RYDER, 1999; PEREZ, 1999; JESSUP et al., 2000).
Os efeitos colaterais devido ao uso da terbinafina, quando ocorrem, são pouco
intensos e temporários. Os sinais de intoxicação mais comuns incluem: anorexia,
náuseas, vômitos, diarréia, urticária e exantema, quando administrados pela via oral ou
24
tópica. Com o uso tópico pode ocorrer eritema, prurido ou sensação de ardor no local da
aplicação. Raramente, podem ser observadas reações cutâneas graves, alteração do
paladar, perda do apetite e alterações hepatobiliares. A hepatotoxicidade associada a
terbinafina é de rara ocorrência, sendo poucos os relatos desse efeito (BALFOUR &
FAULDS, 1992; LAZAROS et al., 1996; AMICHAI & GRUNWALD, 1998;
FERNADES et al., 1998; SULLIVAN, 1999).
2.3.2 Itraconazol
Os antifúngicos do grupo dos azóis são estruturalmente relacionados, compondo
fármacos de amplo espectro com similar mecanismo de ação, variando a
farmacocinética, a toxicidade e uso clínico. A estrutura química compreende,
basicamente, um ou mais anéis de cinco átomos de carbono (anel azólico), unidos ao
restante da molécula por ligação do tipo C-N. Os imidazóis contêm dois átomos de
nitrogênio no anel azólico enquanto que, para os triazólicos, um terceiro átomo de
nitrogênio foi introduzido na estrutura (POLAK, 1999; JAHAM et al., 2000).
Embora haja diferenças estruturais entre os azóis, sugere-se que os fármacos
pertencentes ao grupo compartilhem semelhantes mecanismos de ação, atuando através
da inibição da biossíntese do ergosterol, que é o produto final da via metabólica de
esteróis fúngicos. Isso ocorre devido à inibição seletiva da enzima 14 alfa-demetilase,
dependente do citocromo P-450, que participa da seqüência de eventos envolvida na
conversão de lanosterol a ergosterol. Consequentemente, ocorre um acúmulo de uma
série de percursores metilados com a concomitante diminuição, ou mesmo a ausência,
do produto final da via biossintética. Com a substituição do ergosterol por precursores
metilados há a formação de membranas plasmáticas defectivas, com permeabilidade
alterada. A atividade antifúngica é primariamente fungiostática, podendo ser fungicida
em doses elevadas frente a determinadas espécies fúngicas (JAHAM et al ., 2000).
Em se tratando especificamente do itraconazol, o fármaco tem recebido maior
destaque, devido ao largo espectro de ação frente a leveduras e fungos filamentosos
responsáveis pelas micoses superficiais e sistêmicas com efeitos tóxicos bastante
reduzidos, por demonstrar maior afinidade pelo sistema enzimático fúngico. O
itraconazol se liga mais especificamente ao citocromo celular fúngico do que àqueles
pertencentes aos mamíferos, demonstrando com isso pouca ou nenhuma interação com
25
o sistema enzimático humano. Esse fator determina a toxicidade seletiva dos azóis,
mesmo que alguns processos metabólicos da célula humana também dependam de
reações mediadas pelo citocroma P-450, os azóis demonstram maior afinidade pelo
sistema enzimático fúngico (WU et al., 2004; CATALÁN & MONTEIRO, 2006).
O itraconazol foi autorizado em 1992 para uso nos quadros de blastomicose,
aspergilose e histoplasmose, inclusive em pacientes imunossupremidos. Em especial
para a esporotricose, o fármaco demonstrou alta atividade tanto em estudos in vitro
como estudos in vivo e estudos clínicos nas formas cutâneas, linfocutâneas e extra-
cutâneas da micose nas doses de 100 a 200mg/dia com bons resultados terapêuticos
(RESTREPO et al., 1986; BAKER et al., 1989; GRANT & CLISSOLD, 1989; CONTI-
DIAZ et al., 1992; LESHER, 1992; BREELING & WEINSTEIN, 1993; WINN et al.,
1993; SCHARKEY-MATHIS, 1993; MERCURIO & ELEWISKI, 1993; BADLEY &
VAN SCOY, 1996; RAMIREZ et al., 1998; NOGUCHI et al., 1999; MATSUMOTO et
al., 2000; BONIFAZ et al., 2001; MCGINNIS et al., 2001; STALKUP et al., 2002;
BUSTAMANTE & CAMPOS, 2004).
Na Clínica Veterinária, o itraconazol é o fármaco antifúngico mais amplamente
utilizado. As suas indicações incluem o tratamento da dermatofitose, blastomicose e
aspergilose nasal em cães nas doses de 5 a 10mg/kg. Em felinos é utilizado no
tratamento das dermatofitoses e criptococose nas mesmas doses prescritas para cães,
sendo que para a esporotricose as doses podem variar de 10 a 40mg/kg (NOBRE et al.,
2002 (a); ROCHETTE et al., 2003).
O itraconazol é bem absorvido pela via oral, aconselhando-se a sua
administração, para melhor biodisponibilidade, juntamente com refeições ricas em
lipídios. A absorção é altamente dependente do pH gástrico, por isso recomenda-se,
para a sua máxima absorção, evitar a administração simultânea de fármacos que
diminuam a acidez estomacal como cimetidina e ranitidina. O fármaco demonstra ampla
distribuição na maioria dos tecidos orgânicos em níveis superiores às concentrações
sangüíneas, explicando, assim, a sua eficácia no tratamento de um grande número de
micoses. No entanto, são consideradas desprezíveis a sua concentração no fluído
cérebro-espinhal, saliva e fluidos oculares. Seu metabolismo é hepático, sendo
eliminado através das fezes e tendo alguns de seus metabólitos encontrados na urina
(BUSTAMANTE & CAMPOS, 2004; CATALÁN & MONTEIRO, 2006).
O itraconazol é comercializado na forma de cápsulas e solução oral. A cápsula
apresenta absorção variável, enquanto que a apresentação líquida é formulada com
26
ciclodextrina que estabiliza o antifúngico e aumenta a sua absorção, resultando em
maiores níveis séricos e teciduais. A formulação líquida melhora em 30% a
disponibilidade do agente e deve ser administrada preferencialmente à cápsula, para
todos os pacientes imunossuprimidos com doença sistêmica. Ainda está disponível uma
formulação intravenosa do itraconazol, também solubilizada em ciclodextrina,
oferecendo maior absorção e maiores índices séricos do que qualquer formulação oral
do fármaco. A formulação endovenossa é o tratamento de primeira escolha para
histoplasmose e blastomicose. No entanto a ciclodextrina é excretada pela urina, o que
limita o uso em pacientes com a função renal reduzida, sendo contra-indicada em
pacientes com patologias renais (DE PAUW, 2000; KAUFFMANN et al., 2000).
Mesmo sendo o itraconazol considerado um fármaco com reduzida toxicidade
em relação aos outros azóis, são descritos como os principais efeitos colaterais náuseas,
vômitos, hipocalemia, hipertensão e cefaléia, sendo contra-indicado na gravidez,
lactação e em pacientes com doença hepática. Em felinos foi descrito efeitos como
anorexia e ocasionalmente sinais gastrointestinais. Ainda podem ser observados, em
algumas espécies, aumento de enzimas hepáticas como a fosfatase alcalina, sendo
aconselhável monitorar o paciente mensalmente (AMICHAI & GRUNWALD, 1998;
KAUFFMANN et al., 2000; ROCHETTE et al., 2003).
2.4 Provas de suscetibilidade antifúngica
As técnicas utilizadas na execução das provas de antifungigrama têm sido
adaptações daquelas tradicionalmente empregadas para bactérias, sendo as mais
utilizadas a diluição em caldo, diluição e difusão em ágar. Porém, devido a variáveis
observadas nos meios de cultura empregados, pH do meio e os tampões utilizados, as
concentrações do inóculo, o tempo e temperatura de incubação e ainda a inibição parcial
nos testes com azólicos tornava-se impraticáveis as comparações desses resultados entre
os laboratórios. Ao passo que com o aumento de pacientes imunodeprimidos,
consequentemente suscetíveis a doenças micóticas onde o tratamento antifúngico está
sujeito a recidiva, falhas terapêuticas e aparecimento de resistência, o teste in vitro
tornaram-se fundamentais no auxilio da escolha terapêutica, ou mesmo para detectar os
casos de resistência, auxiliar nos estudos de interações entre os fármacos e nas pesquisa
27
de novos agentes antifúngicos (CUENCA-ESTRELLA & TUDELA, 2002;
SANGLARD, 2003).
Nessas circunstâncias, o Comitê Nacional para a Padronização Clínica e
Laboratorial (National Committee for Clinical and Laboratory Standards-NCCLS)
desenvolveu estudos sobre as características biológicas dos fungos, as propriedades
físico-químicas dos antifúngicos e, sobretudo, as condições técnicas do ensaio,
resultando em publicações de documentos que padronizavam as técnicas antifúngicas
(CORMICAN & PFALLER, 1996; SANGLARD, 2003).
Em 1997 o NCCLS publicou o documento M27-A, o qual descreve a
metodologia aplicada para o estudo da suscetibilidade antifúngica frente a fungos
leveduriformes. O método se baseia no cálculo da Concentração Inibitória Mínima
(CIM), implantando a técnica de diluição em caldo (NCCLS, 2002b). Em 2002 foi
publicada a segunda edição deste documento (NCCLSM27-A2), incluindo modificações
na técnica de macrodiluição, surgindo a técnica de microdiluição em caldo, a qual
consiste na preparação de diferentes concentrações do antifúngico em um meio líquido,
nos quais adiciona-se o inóculo do fungo. Essa técnica demonstra várias vantagens em
relação a anterior, como a maior facilidade na sua execução e além da possibilidade de
determinar a CIM, estabelece também a concentração fungicida mínima (CFM)
(NCCLS, 2002b).
A CIM para um antifúngico com atividade fungicida representa a menor
concentração do fármaco capaz de produzir inibição total do crescimento fúngico ou a
menor concentração do agente fungiostático que produzir diminuição proeminente em
turvação em tempo e temperaturas variáveis conforme o microrganismo estudado. Para
o itraconazol e os novos triazólicos, posaconazol, ravuconazol e voriconazol, a leitura
da CIM pode ser definida como a menor concentração do fármaco que proporciona
qualquer grau de crescimento discernível (NCCLS, 2002b).
As provas de suscetibilidade antifúngica para fungos leveduriformes foram mais
desenvolvidas em relação aos fungos filamentosos devido à importância das leveduras
na clínica médica e ainda pelas dificuldades na realização das provas antifúngicas para
fungos filamentosos, entre elas a dificuldade de padronização do inóculo, tempo e
temperatura de incubação. Em 2002, o NCCLS publicou documento M38-A para a
realização de provas de suscetibilidade frente aos fungos filamentosos (NCCLS/M38-A,
2002), sendo similar ao proposto para as leveduras. O método M38-A foi adaptado a
espécies de Aspergillus, Fusarium e Rhizopus além da forma filamentosa do Sporothrix
28
schenckii, não sendo, no entanto, utilizados, para avaliar a suscetibilidade da fase
leveduriforme de fungos dimórficos (NCCLS, 2002a).
Em relação ao comportamento do S. schenckii frente às provas de
suscetibilidade, sabe-se que os testes de antifungigrama para os fungos dimórficos ainda
não são confiáveis, devido, principalmente, aos problemas referentes à reprodutibilidade
intra e inter-laboratoriais, especialmente da sua fase filamentosa, onde a principal
dificuldade está na padronização do inóculo. Ao passo que na sua forma leveduriforme
o seu crescimento pode ser mais lento em comparação as bactérias ou as outras
leveduras (MAGDALI et al., 2000).
O S. schenckii apresenta particularidades que devem ser levadas em
consideração para a execução dos testes de suscetibilidade. Dentre elas, se destaca a
diferença entre a suscetibilidade conforme a forma do agente utilizada, onde os estudos
demonstram maior sensibilidade quando utilizado a sua fase leveduriforme. Outro fator
relevante é que os documentos descritos no NCCLS preconizam uma temperatura de
incubação de 35°C, embora a temperatura ideal para o crescimento in vitro do S.
schenckii esteja entre 25°C a 30°C. Aliado ao fato de que a maioria dos estudos que
determinaram a suscetibilidade in vitro de antifúngicos frente ao S. schenckii utiliza
como inóculo a fase filamentosa mesmo sendo a fase leveduriforme a forma patogênica.
Salientando ainda que os métodos de referência descritos no NCCLS propõem apenas
condições para a realização das provas de sensibilidade na sua forma filamentosa
(TRILLES et al., 2005).
O NCCLS serviu de base para a criação do El European Committee on
Antibiotic Susceptibility Testing de la Sociedad Europea de Microbiologia Clínica y
Enfermedades Infecciosas (EUCAST-ESCMID), baseado no método NCCLS-M27-A.
Porém, com algumas modificações, como o período de incubação para a obtenção do
CIM (24-48h) assim como, a substituição da leitura visual para o cálculo da
porcentagem da inibição, incorporando a leitura espectrofotometrica (EUCAST, 2003).
O EUCAST em termos gerais apresenta uma correlação elevada com as técnicas
referentes ao NCCLS, constituindo uma alternativa válida para os estudos de
sensibilidade antifúngica (CUENCA-ESTRELLA & TUDELA, 2002).
29
2.5 Relação das provas in vitro com os resultados in vivo
Paralelamente aos estudos de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos, foram
desenvolvidos análises a fim de determinar a concentração do fármaco (CIM) que
poderia ser utilizada para as provas in vivo, resultando, no entanto, na determinação de
pontos de corte para um número limitado de fármacos antifúngicos (fluconazol,
itraconazol e 5-flucitosina) frente a determinadas espécies de Candida (CORMICAN &
PFALER, 1996; ESPINEL-INGROFF, 1996; TOMÁS et al., 2004).
Os testes de suscetibilidade antifúngica, em sua maioria, são realizados em
condições padronizadas utilizando uma fase constante de crescimento do
microrganismo com condições fixas de pH, temperatura, umidade e concentração de
oxigênio. Porém, em infecções, essa situação normalmente não persiste, existindo vários
fatores que podem influenciar a correlação entre as provas in vitro com as in vivo.
Dentre os fatores, deve-se levar em consideração os intrínsecos ao antimicrobiano, ao
hospedeiro e ao patógeno (ALVES et al., 1999; RIVAS & SERRANO, 2003).
Em relação aos fatores que podem influenciar a correlação entre as provas de
suscetibilidade com os estudos in vivo se destaca o sistema imunológico do organismo
suscetível, sendo a imunidade fundamental para debelar um microrganismo patogênico,
onde qualquer falha dessa resposta pode alterar a evolução da infecção. Assim como
existe a possibilidade de uma interação entre o fármaco e as células do hospedeiro,
podendo resultar na diminuição da resposta imunológica (RIVAS & SERRANO, 2003;
GADEA & CUENCA-ESTRELLA, 2004).
Sob um ponto de vista farmacológico, uma infeção só pode responder a um
tratamento se esse for capaz de alcançar concentrações ativas e adequadas. As
concentrações do fármaco devem ser comprovadas através do cociente entre as
concentrações do antifúngico no soro ou tecido, com a desvantagem da dificuldade de
determinar os parâmetros farmacocinéticos na região da infecção. É importante
considerar que porcentagens dos fármacos, se unem as proteínas plasmáticas,
permanecendo uma pequena parcela ativa. Ainda, sabe-se que alguns antifúngicos
quando metabolizados resultam em metabólitos com ação antimicrobiana variável,
necessitando determinar essa atividade. Deve-se ainda considerar as variações
individuais do paciente saudável com o enfermo, sendo ainda obscura a relação ideal
entre os parâmetros farmacocinéticos e a sensibilidade in vitro dos microrganismos. A
30
localização da infecção é um outro fator que pode interferir no desenvolvimento do
quadro clínico, assim como condições de anaerobiose e pH, que podem influenciar
diretamente sob a atividade de um fármaco (ODDS, 2003; SANGLARD, 2003).
Assim como os fatores relacionados aos fármacos, vários são os aspectos
associados ao microrganismo que podem influenciar na resposta de um determinado
antifúngico. Dentre esses se destacam a concentração do inóculo, fase de crescimento,
fatores de virulência como toxinas, enzimas extracelulares, produtos metabólicos, além
de fatores de aderência e a resistência a ação do soro (CUENCA-ESTRELLA &
TUDELA, 2002).
Os estudos em modelos experimentais podem oferecer a possibilidade de
integrar os efeitos do fármaco e as defesas do organismo hospedeiro, sendo que alguns
autores indicam uma boa correlação entre os resultados in vitro e a evolução da
enfermidade nos animais. A principal limitação desses estudos, se deve a extrapolar os
achados experimentais para a espécie humana. Principalmente devido a farmacocinética
dos animais experimentais ser diferente ou diferir da dos seres humanos (RIVAS &
SERRANO, 2003; GADEA & CUENCA-ESTRELLA, 2004).
Mesmo com as dificuldades de se determinar a melhor forma de conseguir
métodos confiáveis para a correlação dos testes in vitro com os in vivo, essa é
fundamental, principalmente para utilizar o valor observado da CIM como utilidade
terapêutica, sendo que esses valores obtidos nos testes de suscetibilidade in vitro
deveriam limitar um ponto de corte (ALVES et al., 1999; RIVAS & SERRANO, 2003).
31
3 MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi realizado em três etapas, que consistiram: estudo da
atividade in vitro dos fármacos antifúngicos frente ao S. schenckii; análise das enzimas
hepáticas e hemograma e avaliação do tratamento antifúngico (terbinafina e itraconazol)
frente a esporotricose experimental sistêmica.
3.1 Teste de suscetibilidade antifúngica
Para o estudo da suscetibilidade do S. schenckii frente aos fármacos
antifúngicos, foram utilizados 10 isolados provenientes de seis casos de esporotricose
felina (Figura 1), três humanos (Figura 2) e um isolado de cão (Figura 3), sendo esses
oriundos da Micoteca do Laboratório de Micologia da Faculdade de Veterinária da
Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
O antifungigrama foi realizado através da técnica de microdiluição em caldo
conforme o Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) adaptada para um fungo
dimórfico conforme a metodologia descrita por Trilles et al (2005).
32
Figura 1- Casos de esporotricose felina, os quais originaram os isolados de Sporothrix
schenckii utilizados para o estudo da suscetibilidade antifúngica. Laboratório de
Micologia-UFPel.
Figura 2- Caso de esporotricose em cão, o qual originou o isolado de Sporothrix
schenckii utilizado para o estudo da suscetibilidade antifúngica. Laboratório de
Micologia-UFPel.
33
Figura 3- (a) esporotricose cutâneo-linfática correspondente ao caso 1; (b)
esporotricose cutânea fixa correspondente ao caso 2; (c) esporotricose cutânea
disseminada correspondente ao caso 3. Laboratório de Micologia-UFPel.
3.1.2. Manutenção e conversão dos isolados de Sporothrix schenckii
Todas as amostras de S. schenckii foram mantidas na sua fase miceliana a partir
de subculturas em tubos contendo meio Brain Heart Infusion (BHI), mantidos sob
refrigeração em temperatura média de 4ºC, realizando subcultivos em intervalos de seis
meses, como o recomendado por Kohler et al. (2004).
A conversão do S. schenckii para a fase leveduriforme foi obtida através do
cultivo dos isolados em meio líquido BHI incubados durante 10 dias à 37
o
C sob
agitação (100 ciclos/minutos). Posteriormente a cultura foi filtrada em camada dupla de
gaze estéril, centrifugada (1500 rpm/ 15 minutos) e lavadas duas vezes com solução
salina tamponada (PBS).
3.1.3 Preparo do inóculo fúngico
3.1.3.1 Inóculo da fase leveduriforme do Sporothrix schenckii
Os inóculos fúngicos, foram preparados a partir de colônias leveduriformes de
48-72 horas de S. schenckii, cultivadas em meio BHI líquido sob constante agitação a
37ºC. As colônias foram ressuspendidas em tubos contendo solução salina estéril depois
de agitadas por 15 segundos em Vortex e ajustada a turbidez em 0,5 da escala de
MacFarland. A suspensão fúngica foi diluída em solução salina (1:50) homogeneizada e
a
b
c
34
submetida a uma diluição (1:20) em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI
1640) acrescido do tampão de Ácido Morfolino Propanosulfônico (MOPS). Após, o
inóculo fúngico foi distribuído no sentido das linhas das microplacas em volumes de
100µL.
3.1.3.2 Inóculo da fase filamentosa do Sporothrix schenckii
O inóculo correspondente a fase filamentosa do S. schenckii foi obtido a partir
de colônias de 10 dias incubadas a 25ºC em meio Ágar Sabouraud dextrose com
cloranfenicol e cicloheximida. A colônia foi recoberta por 1mL de solução salina estéril,
adicionando-se uma gota (0,01mL) de Tween 20, com o posterior preparo da suspensão
fúngica através da suave raspagem das colônias com auxilio de ponteiras estéreis sobre
as hifas. Essa suspenção (1mL) foi colocada em um tubo estéril, sendo que após 5
minutos, período necessário para a sedimentação, o sobrenadante foi transferido para
outro tubo estéril, homogeneizada por 15 segundos em agitador Vortex. A suspensão
fúngica foi diluída em RPMI (diluição 1:50) com tampão MOPS alcançando a 0,4X10
4
a 5X10
4
UFC/mL. O inóculo foi distribuído no sentido das linhas das microplacas em
volumes de 100µL.
3.1.4 Preparo das diluições dos antifúngicos
A partir da solução mãe dos fármacos terbinafina e itraconazol nas
concentrações de 1600µg/mL foi realizada nove diluições seriadas em DMSO
alcançando uma concentração final dos antifúngicos de 3µg/mL. Essas concentrações
foram diluídas á 1% em meio RPMI 1640 com tampão MOPS estabelecendo
concentrações com intervalos de 16µg/mL a 0,03 µg/mL. Alíquotas de 100µl dessas
concentrações foram dispensadas seqüencialmente nas placas de microtitulação,
preenchendo os poços pertencentes às colunas numeradas de um a dez.
35
3.1.5 Leitura da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Os testes de suscetibilidade antifúngica foram realizados em duplicata, sendo
uma coluna da microplaca para o controle positivo, preenchida com meio RPMI1640
com MOPS e inóculo fúngico e outra coluna referente ao controle negativo, contendo o
meio RPMI1640.
Para a realização da leitura da CIM utilizando a fase leveduriforme do S.
schenckii, as microplacas foram incubadas à 35ºC por cinco dias. Já para o estudo da
fase filamentosa do agente, as microplacas foram incubadas a 30ºC por um período de
seis dias. A leitura da CIM foi de acordo com a metodologia descrita por Trilles et al.
(2005), onde correspondeu a menor concentração do antifúngico capaz de produzir
proeminente inibição do crescimento do S. schenckii quando comparado ao controle-
positivo.
3.2 Avaliação das enzimas hepáticas e hemograma dos animais experimentais
submetidos ao tratamento com os antifúngicos e seus respectivos diluentes
A primeira etapa do estudo consistiu na avaliação das enzimas hepáticas e
hemograma (série branca e vermelha) dos animais experimentais através da análise da
Alanina Aminotransferase (ALT) e Fosfatase Alcalina (FA), hemograma completo e
análise histopatológica dos órgãos pertencentes ao sistema respiratório, digestório,
tecido sub-cutâneo, testículos, baço, fígado e rins.
Para estas análises laboratoriais foram utilizados como modelos biológicos 40
ratos norvergicus, albinos linhagem Wistar, com oito semanas de idade, machos com
massa corporal média de 300g. Os animais foram alojados no Biotério Central da
Universidade Federal de Pelotas (UFPel), sendo mantidos em condições constantes de
umidade, temperatura (25ºC) e 12 horas de ciclo de claro e escuro recebendo dieta e
água “ad libitum” durante o período experimental.
Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais contendo 10
animais em cada grupo, sendo eles: tratado terbinafina (tratados com 250mg/Kg de
terbinafina diluída em uma solução contendo 1% de Tween 20 e 5% de DMSO); tratado
itraconazol (tratados com 100mg/kg de itraconazol diluído em água destilada estéril) e
36
os grupos diluente terbinafina e itraconazol, os quais foram administrados os respectivos
diluentes de cada fármaco.
Os fármacos e diluentes foram administrados diariamente pela via oral com o
auxilio de uma sonda orogástrica por um período de 30 dias, quando foi coletado sangue
(1mL) através de punção intracardiaca para análises laboratoriais, com a posterior
necropsia para estudo histopatológico.
As enzimas hepáticas foram analisadas através do Kit comercial Lab-test
executado de acordo com as normas do fabricante com a posterior leitura em aparelho
espectrofotométrico. O hemograma foi realizado no Laboratório de Patologia Clínica do
Hospital de Clínicas Veterinária (HCV) da Faculdade de Veterinária da Universidade
Federal de Pelotas-UFPel e análise histopatológica no Laboratório de Patologia Animal
da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas-UFPel.
3.3 Avaliação dos antifúngicos no tratamento da esporotricose experimental
sistêmica
Para a realização do estudo in vivo foram utilizados os mesmos modelos
biológicos nas condições descritas anteriormente. Sendo que para essa fase
experimental, foram utilizados 120 ratos norvergicus (Rattus rattus), albinos linhagem
Wistar.
Os animais experimentais foram divididos em quatro grupos experimentais para
cada isolado do S. schenckii estudado, sendo os grupos: tratado terbinafina composto de
40 animais os quais foram administrados 250mg/Kg de terbinafina diluída em uma
solução contendo 1% de Tween 20 e 5% de DMSO; tratado itraconazol com 40 animais,
os quais foram administrados 100mg/kg de itraconazol diluído em água destilada estéril
e os grupos diluente terbinafina e diluente itraconazol contendo 20 animais em cada
grupo em que foi administrado os respectivos diluentes de cada fármaco (Tabela 1).
37
Tabela 1- Grupos experimentais utilizados para o estudo in vivo
Grupos experimentais Isolado 1 (nº de animais) Isolado 2 (nº de animais)
Tratado terbinafina 20 20
Diluente terbinafina 10 10
Tratado itraconazol 20 20
Diluente itraconazol 10 10
3.3.1 Isolados de Sporothrix schenckii envolvidos no estudo
Todos os animais experimentais foram inoculados com a fase filamentosa do S.
schenckii, sendo utilizados dois isolados, os quais corresponderam, respectivamente, ao
caso de esporotricose cutânea disseminada felina e um ao caso de esporotricose cutânea
em um cão (Figura 4).
Figura 4- (a) felino com esporotricose cutânea disseminada, o qual foi obtido o isolado
fúngico utilizado para a inoculação experimental; (b) isolado de S. schenckii
correspondente ao felino envolvido no estudo; (c) cão com esporotricose cutânea, o qual
foi obtido o isolado fúngico utilizado para a inoculação experimental; (d) isolado de S.
schenckii correspondente ao cão envolvido no estudo- Laboratório de Micologia-UFPel.
a b
c d
38
3.3.2 Preparo do inóculo fúngico
O inóculo fúngico foi preparado utilizando colônias de S. schenckii cultivadas a
25ºC por um período de 7 a 10. As colônias foram retiradas do meio de cultura com
auxilio de um bisturi estéril, posteriormente foram filtradas em camada dupla de gaze
estéril, centrifugada (1500 rpm/15 minutos), lavadas duas vezes com solução salina
tamponada (PBS) homogeneizado e padronizado em 2X10
3
células de S. schenckii/mL
(Figura 5).
Figura 5- (a) retirada das colônias de Sporothrix schenckii do meio de cultura com
auxilio de um bisturi estéril; (b) filtragem das colônias em camada dupla de gaze estéril;
(c) lavagem das colônias com PBS; (d) Padronização do inóculo fúngico. Laboratório
de Micologia-UFPel.
3.3.3 Inoculação experimental
A suspensão de células fúngicas na concentração de 2X10
3
células de S.
schenckii/mL foram inoculadas em volume de 0,1mL pela via intraperitonial e a mesma
dosagem pela veia lateral da cauda em todos os animais (Figura 6).
a b c d
39
Figura 6- (a) inoculação experimental com o inóculo fúngico através da veia lateral da
cauda; (b) inoculação experimental com o inóculo fúngico através da via intraperitonial.
Laboratório de Micologia-UFPel.
3.3.4 Tratamento dos animais experimentais com esporotricose sistêmica
Três dias após os animais experimentais serem inoculados com S. schenckii, foi
iniciado o tratamento dos grupos experimentais uma vez ao dia por um período de 30
dias conforme o descrito por Kan & Bennet (1988). A administração dos fármacos
assim como os diluentes nas doses predeterminadas foi realiza em todos os animais pela
via oral com o auxilio de uma sonda orogástrica.
3.3.5 Acompanhamento clínico dos animais experimentais com esporotricose
sistêmica
Durante o período experimental, os animais foram avaliados diariamente, a fim de
observar alterações físicas referentes ao plano nasal (edema e úlceras); cauda (espessura
aumentada e úlceras) e testículos (aumento e alterações na consistência), sendo essas
descritas em relatórios semanais.
a b
40
3.3.6 Necropsia dos animais experimentais
No final do período experimental, os animais foram sacrificados através de
superdosagens de fenobarbital (100mg/kg) e necropsiados para a análise anato-
patológica, sendo coletados o fígado, testículos, baço, rins e sistema digestório para a
obtenção do retroisolamento do agente.
O retroisolamento do S. schenckii foi obtido a partir do cultivo em duplicata a
25ºC por até 15 dias de fragmentos do fígado, baço e testículos em ágar Sabouraud
dextrose com cloranfenicol acrescido de cicloheximida. Após esse período foi realizado
a conversão conversão para a fase leveduriforme (conforme descrito no íten 3.1.2) para
demonstração do dimorfismo do agente.
Os mesmos procedimentos descritos foram realizados com os animais que
morreram durante o período experimental.
3.3 Analise estatística
Para avaliar estatisticamente a evolução dos tratamentos frente a esporotricose
sistêmica experimental foi utilizado o programa Epi Info 6.0, utilizando o teste de qui-
quadrado, segundo Mantel-Henzel, com grau de significância de 95%. Para a análise
microbiológica foi utilizado o teste de qui-quadrado.
41
4 RESULTADOS
4.1 Suscetibilidade in vitro dos isolados de Sporothrix schenckii frente aos
antifúngicos terbinafina e itraconazol
A suscetibilidade da fase leveduriforme do S. schenckii frente a terbinafina para
todos os isolados estudados de esporotricose felina, resultaram em uma CIM de
0,055µg/mL a 0,109µg/mL, enquanto que para os isolados dos casos de esporotricose
humana e canina a CIM foi de 0,055µg/mL. Em relação ao itraconazol, a CIM frente
aos isolados de esporotricose felina foi de 0,875µg/mL a 1,75µg/mL, já para os casos de
esporotricose humana os valores da CIM foram de 0,219µg/mL, enquanto que para o
isolado do caso clínico de esporotricose canina foi observada uma CIM do itraconazol
de 1,75µg/mL (Tabela 2).
Tabela 2- Concentração Inibitória Mínima (CIM) da terbinafina e itraconazol frente a
isolados leveduriformes de Sporothrix schenckii através da técnica de microdiluição em
caldo
Sporothrix
schenckii
CIM (µg/ml)
Itraconazol
CIM (µg /ml)
terbinafina
1* 0,875 0,109
2* 0,875 0,109
3* 0,219 0,055
4* 1,75 0,055
5* 1,75 0,055
6* 1,75 0,055
7** 0,219 0,055
8** 0,219 0,055
9** 0,219 0,055
10*** 1,75 0,055
*Isolado obtido de esporotricose felina; ** Isolado obtido de esporotricose
humana;***Isolado obtido de esporotricose canina
42
Em se tratando da CIM para a terbinafina e itraconazol utilizando a fase
filamentosa do S. schenckii, foi observado valores para a terbinafina entre os isolados de
felinos de 0,875 µg/mL, enquanto que os isolados humanos e de cão a CIM foi de
0,219µg/mL. Para o itraconazol os isolados felinos resultaram numa CIM de 3,5µg/mL,
já nos isolados obtidos a partir de casos de esporotricose humana e em cão a CIM foi de
1,75µg/mL (Tabela 3).
Tabela 3- Concentração Inibitória Mínima (CIM) da terbinafina e itraconazol frente a
isolados filamentosos de Sporothrix schenckii através da técnica de microdiluição em
caldo
Sporothrix
schenckii
CIM (µg/ml)
itraconazol
CIM (µg /ml)
terbinafina
1* 3,5 0,875
2 * 3,5 0,875
3 * 3,5 0,875
4* 3,5 0,875
5 * 3,5 0,875
6* 3,5 0,875
7** 1,75 0,219
8** 1,75 0,219
9** 1,75 0,219
10*** 1,75 0,219
*Isolado obtido de esporotricose felina; ** Isolado obtido de esporotricose
humana;***Isolado obtido de esporotricose canina
43
4.2 Avaliação das enzimas hepáticas e hemograma dos animais experimentais
submetidos ao tratamento antifúngico e seus respectivos diluentes
Os valores para Alanina Aminotransferase (ALT) e Fosfatase Alcalina (FA) foram
compatíveis aos valores normais para a espécie estudada (HARKNESS & WAGNER,
1995) entre todos os grupos experimentais (Tabela 4).
Tabela 4 - Valores referentes a Alanina Aminotransferase (ALT) e Fosfatase Alcalina
(FA) dos animais experimentais submetidos a administração dos fármacos antifúngicos
e seus respectivos diluentes
Valores normais para a espécie estudada: Alanina aminotransferase (U/L) 17 – 50;
fosfatase alcalina (U/L) 39 – 216
Os parâmetros tanto da série vermelha como na série branca e proteínas
plasmáticas totais (PPT) estiveram dentro dos limites fisiológicos normais para a espécie
estudada (HARKNESS & WAGNER, 1995). Assim como nenhuma anormalidade foi
observada no exame histopatológico dos órgãos coletados. No entanto, no decorrer do
período experimental 25% (5/20) dos animais pertencentes ao grupo tratado terbinafina
morreram imediatamente após sondagem oral. A análise histopatológica dos órgãos
coletados durante a necropsia não evidenciou qualquer anormalidade associada aos
antifúngicos ou aos diluentes em todos os grupos experimentais.
4.3 Avaliação da atividade dos fármacos antifúngicos no tratamento da
esporotrticose experimental sistêmica
Enzimas avaliadas Tratado
terbinafina
Diluente
terbinafina
Tratado
itraconazol
Diluente
itraconazol
ALT (UI/L) 30 -36 20 -42 26 -45 29 - 45
FA (UI/L) 39,2 – 50,7 38 – 72,1 40 – 50,7 42,4 – 64,3
44
4.3.1 Avaliação clínica dos animais experimentais com esporotricose sistêmica
As alterações observadas nos animais experimentais iniciaram na primeira
semana após a inoculação com o S. schenckii, sendo observadas no decorrer das quatro
semanas do estudo: aumento da espessura da cauda, úlceras na cauda, aumento
testicular, edema nos membros, úlceras nos membros, edema do plano nasal, úlceras no
nariz, flacidez testicular, caquexia e óbitos. Essas alterações analisadas estatisticamente
resultaram em diferenças significativas (p<0,05) entre grupo tratado terbinafina e
itraconazol em relação aos seus respectivos diluentes, sendo que no grupo diluente
foram observadas maior número de animais afetados em relação ao grupo tratado
(Tabela 5).
Tabela 5- Alterações clínicas observadas nos animais experimentais com esporotricose
sistêmica durante o período do estudo
Alterações
clínicas
Tratado terbinafina
(%)
Diluente terbinafina
(%)
Tratado itraconazol
(%)
Diluente itraconazol
(%)
Semanas
1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º
Aumento da
espessura da
cauda
47,3 43,2 11,4 - 90 90 90 90 37,5 82,5 37,5 25 85 95 95 95
Úlcera na
cauda
5,2 21,6 11,4 - 10 95 95 95 30 40 30 5 40 85 85 85
Aumento
testicular
- - - - 90 90 90 95 - - - 5 60 100 100 85
Edema dos
membros
- 10,8 11,4 - - 10 10 10 - - - - - 15 20 20
Úlceras nos
membros
- 10,8 20 - - 90 90 90 5 5 5 - - 45 45 50
Edema no
plano nasal
- 8,1 - - - 85 85 85 - - - - - 30 35 35
Úlceras no
plano nasal
- - - - - 60 60 60 - - - - - 40 40 40
Flacidez
testicular
- - - - - - - 75 - - - - - - 5 35
Caquexia
- - - - - - - 25 - - - - - - 5 35
Óbitos
5 25 5 25 - - - - - - - - - - - -
Em se tratando especificamente do aumento da espessura da cauda, foi
observado no decorrer do período experimental a alteração em maior freqüência entre os
animais pertencentes ao grupo diluente terbinafina e itraconazol. Entre os grupos
experimentais tratados com os antifúngicos foi observado redução do sinal clínico, onde
no final da quarta semana nenhum animal do grupo tratado terbinafina permaneceu
45
afetado, enquanto que no tratado itraconazol 25% se mantiveram com as lesões (Tabela
5 e Figura 7).
Figura 7- Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram aumento na espessura da cauda.
Em relação a úlcera na cauda, o grupo tratado com terbinafina obteve uma
redução semanal na freqüência de animais afetados, não sendo observado nenhum
animal com a alteração na última semana do estudo. O mesmo foi observado no grupo
tratado itraconazol, permanecendo no final do período experimental com dois (2/40)
animais afetados. Os grupos referentes aos diluentes dos fármacos, por sua vez, foi
detectado o aumento da freqüência de animais afetados (Tabela 5 e Figura 8).
Figura 8- Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram úlceras na cauda.
0
20
40
60
80
100
1234
semanas
% de positividade
Terbinafina Itraconazol Diluente Terbinafina Diluente Itraconazol
0
20
40
60
80
100
1234
semanas
% de positividade
Terbinafina Itraconazol Diluente Terbinafina Diluente Itraconazol
46
O aumento testicular não foi observado em nenhum animal pertencente ao grupo
tratado terbinafina durante o estudo. Já no grupo tratado itraconazol a alteração foi
observada a partir da terceira semana do experimento em 5% (2/40) dos animais. O
grupo diluente terbinafina apresentou no decorrer do experimento, aumento progressivo
de animais com aumento testicular, enquanto que nos animais pertencentes ao grupo
diluente itraconazol, foi observada uma redução de animais afetados na quarta semana
(Tabela 5 e Figura 9).
Figura 9- Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram aumento testicular.
O edema nos membros foi observado entre os animais tratados terbinafina a
partir da segunda semana do estudo, reduzindo o número de animais afetados na última
semana experimental. No grupo tratado itraconazol, não foi detectado nenhum animal
afetado no decorrer do experimento. Os animais do grupo diluente terbinafina e
itraconazol apresentaram a alteração a partir da segunda semana, com aumento de
animais acometidos no decorrer do estudo (Tabela 5).
As úlceras nos membros foram observadas a partir da segunda semana em
ambos os grupos tratados (terbinafina e itraconazol), porém os animais obtiveram a cura
clínica na última semana do experimento. Os diluentes apresentaram lesões a partir da
segunda semana, prosseguindo afetados até a quarta semana do estudo (Tabela 5 e
Figura 10).
0
20
40
60
80
100
1234
semanas
% de positividad
e
Terbinafina Itraconazol Diluente Terbinafina Diluente Itraconazol
47
Figura 10- Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram úlceras nos membros.
O edema do plano nasal foi observado em apenas 8% do grupo tratado
terbinafina na segunda semana do estudo, não sendo observado, a alteração no decorrer
do estudo nos grupos submetidos ao tratamento antifúngico. No entanto, nos grupos
diluentes (terbinafina e itraconazol) foi detectado animais afetados até o final do estudo
(Tabela 5 e Figura 11).
Figura 11- Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram edema no plano nasal.
0
20
40
60
80
100
1234
semanas
% de positividade
Terbinafina Itraconazol Diluente Terbinafina Diluente Itraconazol
0
10
20
30
40
50
1234
semanas
% de positividade
Terbinafina Itraconazol Diluente Terbinafina Diluente Itraconazol
48
Em relação a úlceras no plano nasal, não foi observado nenhum animal afetado
no grupo tratado terbinafina, assim como no grupo tratado itraconazol. Os animais
pertencentes aos grupos diluentes, por sua vez, apresentaram úlceras até o final do
experimento (Tabela 5 e Figura 12).
Figura 12- Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental que
apresentaram úlceras no plano nasal.
Quanto a flacidez testicular, apenas os grupos diluentes apresentaram a
alteração, sendo que o grupo diluente terbinafina 75% dos animais apresentaram-se
afetados na última semana do estudo, enquanto que o diluente itraconazol foi observado
35% dos animais com a alteração na última semana (Figura 13).
Figura 13- Percentual de animais com esporotricose sistêmica experimental
apresentando flacidez testicular.
0
20
40
60
1234
semanas
% de positividade
Terbinafina Itraconazol Diluente Terbinafina Diluente Itraconazol
0
10
20
30
40
50
60
1234
semanas
% de positividade
Terbinafina Itraconazol Diluente Terbinafina Diluente Itraconazol
49
A caquexia não foi observada em nenhum dos animais tratados com os
antifúngicos. Nos diluentes, entretanto, foi observado 25% (5/20) de animais do grupo
diluente terbinafina com caquexia na quarta semana, e no grupo diluente itraconazol 5%
(1/20) na terceira semana aumentando a freqüência para 35% (7/20) na quarta semana
(Tabela 5).
Durante o período experimental, ocorreu o óbito de (6/40) dos animais
pertencentes ao grupo tratado terbinafina. Dois animais morreram na primeira semana
do estudo, um na segunda, dois na terceira e um na última semana, totalizando seis
animais. Todos foram imediatamente necropsiados e coletados órgãos do sistema
digestório, respiratório, tecido sub-cutâneo e cérebro para análise histopatológica, a qual
revelou hiperemia e congestão pulmonar, caracterizando assim um quadro asfixia
aguda.
4.3.2 Alterações anatomopatológicas nos animais experimentais com
esporotricose experimental sistêmica
Em relação as alterações anato-patológicas observadas nos animais com
esporotricose sistêmica experimental, essas quando presentes, se apresentaram na forma
de lesões nodulares e esbranquiçadas no baço, fígado, testículos, tecido subcutâneo e
ainda a presença de icterícia dos órgãos, sendo que as lesões ocorreram de forma
localizada e/ou disseminada (Figura 14).
As análises estatísticas evidenciaram que todos os animais pertencentes ao grupo
tratado com terbinafina e itraconazol diferiram (p<0,05)
em relação ao grupo diluente,
demonstrando que os animais que foram submetidos ao tratamento antifúngico
apresentaram a menor freqüência ou ausência de alterações anatomopatológicas (Tabela
6).
50
Figura 14- Alterações anatomopatológicas observadas nos animais com esporotricose
experimental sistêmica: (a) lesões nodulares e esbranquiçadas disseminadas; (b) lesões
nodulares esbranquiçadas nos testículos; (c) nódulo no parênquima subcutâneo; (d)
lesões nodulares e esbranquiçadas no baço e fígado.
Tabela 6- Alterações anatomopatológicas observadas nos animais experimentais com
esporotricose sistêmica durante o período de estudo
Tratado
terbinafina (%)
Diluente
terbinafina (%)
Tratado
itraconazol (%)
Diluente
itraconazol (%)
Baço - 100 25 95
Fígado 11,7 100 25 85
Testículos 26,4 100 67,5 95
Icterícia - 25 - -
Nódulos
subcutâneo
8,8 100 12,5 85
Lesões
disseminadas
- 100 - 85
Em se tratando dos grupos, tratado e diluente terbinafina, foi evidenciado maior
número de animais afetados no grupo diluente em todos os parâmetros macroscópicos
avaliados, sendo que os animais tratados não apresentaram alterações no baço, icterícia
e lesões disseminadas (Figura 15).
a b
c d
51
Figura 15- Alterações anatomopatológicas presentes nos animais pertencentes aos
grupos tratado e diluente terbinafina.
Em relação aos grupos tratado e diluente itraconazol, também foi observado maior
freqüência de alterações no grupo do diluente, exceto quanto as alterações testiculares
em que no grupo tratado itraconazol foram observados 67,5% (27/40) animais com
alterações no órgão enquanto que o seu grupo diluente apresentou 95% (19/20) animais
com alterações macroscópicas (Tabela 6). Em relação a icterícia e lesões disseminadas
não foi evidenciado nenhum animal pertencente ao grupo tratado itraconazol com as
alterações (Figura 16).
Figura 16- Alterações anatomopatológicas presentes nos animais pertencentes aos
grupos tratado e diluente itraconazol.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
tratado diluente
GRUPOS EXPERIMENTAIS
baço
dissemi
testic
subc
icterícia
fígado
0
5
10
15
20
25
30
tratado diluente
GRUPOS EXPERIMENTAIS
baço
disseminada
testículo
subcutânea
icterícia
figado
52
Em relação aos tratamentos terbinafina e itraconazol, houve diferença estatística
(p=0,0004) quanto a variável aumento testicular, sendo que os animais pertencentes ao
grupo tratado terbinafina apresentaram menor freqüência de animais com a alteração
26,5% (9/34) em relação ao grupo tratado itraconazol 67,5% (27/40).
4.3.3 Obtenção do retroisolamento do Sporothrix schenckii
A obtenção do retroisolamento do S. schenckii a partir do cultivo dos órgãos
(baço, fígado e testículos) em meios específicos a 25ºC resultou no crescimento de
colônias filamentosas enegrecidas e enrugadas, sendo que a análise microscópica dessas
colônias foi observada a presença de hifas finas, hialinas, septadas com conidióforos
simpodiais frutificando conídios dispostos em formatos de “margarida”. A 37ºC, as
colônias adotaram aspecto de colônia bacteriana, de coloração branca a acizentada, onde
a microscopia revelava células leveduriformes, ovais a alongadas semelhantes a
“charutos”. Esses achados são consistentes aos observados em estudos que descrevem a
macro e micromorfologia do S. schenckii.
A análise estatística do retroisoalamento obtido a partir do cultivo dos órgãos
específicos resultou em diferenças entre os grupos tratados com os antifúngicos e seus
respectivos diluentes, demonstrando que os grupos experimentais em que foram
administrados os fármacos, obtiveram menor e/ou nenhum, retroisolamento positivo
para o S. schenckii em relação aos grupos em foram administrados os diluentes (Tabela
7).
Tabela 7- Obtenção do retroisolamento de Sporothrix schenckii a partir do cultivo do
baço, fígado e testículos dos animais experimentais
ÓRGÀOS Tratado
terbinafina (%)
Diluente
terbinafina (%)
Tratado
itraconazol (%)
Diluente
itraconazol (%)
Baço - 80 - 80
Fígado - 100 5 80
Testículos 3 100 22,5 95
53
O retroisolamento do S. schenckii ocorreu em todos os órgãos avaliados no
grupo diluente terbinafina, enquanto que nos animais tratados com terbinafina só foi
observado o isolamento do agente no testículo de um animal (Figura 17).
Figura 17- Retroisolamento do Sporothrix schenckii obtidos dos animais pertencentes
aos grupos tratado e diluente terbinafina.
Em relação ao grupo tratado itraconazol e seu respectivo diluente, foi observada
maior freqüência de retroisolamento positivo para o S. schenckii entre o grupo diluente
em relação aos tratados (Figura 18).
Figura 18- Retroisolamento do Sporothrix schenckii obtidos dos animais pertencentes
aos grupos tratado e diluente itraconazol.
0
5
10
15
20
tratado terbinafina diluente terbinafina
baço
figado
testiculos
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
tratado itraconazol diluente itraconazol
baço
figado
testiculos
54
No entanto foi evidenciado diferenças estatísticas (p=0,0142) entre os grupos
tratados terbinafina e itraconazol, tendo um maior número de animais com o isolamento
positivo para o agente no testículo no grupo tratado itraconazol (Figura 19).
Figura 19- Retroisolamento do Sporothrix schenckii obtidos dos grupos tratado
terbinafina e itraconazol
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
tratado terbinafina tratado itraconazol
GRUPOS EXPERIMENTAIS
baço
figado
testiculos
55
5 DISCUSSÃO
Quanto a avaliação da suscetibilidade in vitro dos isolados de Sporothrix
schenckii frente aos antifúngicos terbinafina e itraconazol, mesmo não existindo um
ponto de corte que estabeleça quais os valores da CIM que determine a sensibilidade ou
resistência do S. schenckii frente a terbinafina, estudos tem considerado que valores de
CIM entre 0,1 a 0,4µg/mL estão associados a sensibilidade do agente frente ao fármaco.
Dessa forma, os resultados observados neste estudo demonstram atividade in vitro da
terbinafina frente a fase leveduriforme e filamentosa, embora com valores de CIM
maiores quando utilizada a fase filamentosa do agente. Resultados semelhantes foram
encontrados por outros autores, com CIMs menores ou iguais a outros antifúngicos
recomendados para o tratamento da esporotricose, como a anfotericina B e itraconazol
(PETRANYI et al., 1987; HULL & VISMER, 1992; HAY, 1999; JESSUP et al., 2000;
REX et al ., 2001; MCGINNIS et al., 2001; KOHLER et al., 2004; TRILLES et al.,
2005; KOHLER et al., 2006; MEINERZ et al., 2005).
Em relação ao itraconazol, também não há padronização de um valor da CIM
que identifique resistência ou sensibilidade ao S. schenckii. No entanto, é preconizado
que a suscetibilidade do agente frente ao fármaco traduz em CIM menor ou igual a
1µg/mL (MCGINNIS et al., 2001; REX et al., 2001). Considerando esses valores de
CIM para o itraconazol frente ao agente, este estudo resultou na sensibilidade quando
utilizado a fase leveduriforme do S. schenckii em três isolados de esporotricose felina e
em todos os isolados humanos avaliados. No entanto, foi detectado através do teste,
resistência frente ao isolado de cão e para os demais isolados provenientes de
esporotricose felina. Com relação ao estudo da suscetibilidade utilizando a fase
filamentosa, todos os isolados avaliados apresentaram-se resistentes frente aos
itraconazol.
Embora estudos anteriores tenham demonstrado a boa atividade in vitro do
itraconazol frente ao S. schenckii (KAUFFMAN et al., 2000; KOÇ et al., 2001;
KOHLER et al., 2004; KOHLER et al., 2006), Catalán & Monteiro (2006) associam o
fracasso terapêutico com a ocorrência de isolados resistentes. Segundo os autores,
devido ao amplo espectro antifúngico do itraconazol, esse foi utilizado, muitas vezes, de
56
forma indiscriminada acarretando, principalmente, o aparecimento de resistência. Como
demonstram os relatos descritos por Schubach et al (2004) em que resultaram na alta
freqüência de felinos tratados com o fármaco com remissão da micose e ainda Kohler et
al (2004) que detectaram valores de CIM altos (4µg/mL) do itraconazol frente a
isolados provenientes de casos de esporticose disseminada felina.
Em se tratando das fases de S. schenckii utilizadas no estudo, foi observado
valores maiores de CIM entre os isolados filamentosos em relação a fase leveduriforme.
O mesmo foi demostrado em estudos realizados por Triller et al (2005), onde as CIMs
obtidas tanto para a terbinafina como o itraconazol, estudando a fase filamentosa do S.
schenckii, foram maiores em relação aos obtidos com a fase leveduriforme. Mais
recentemente Kohler et al. (2006) avaliando a suscetibilidade de isolados clínicos de
casos de esporotricose humana e animal, utilizando as duas fases do agente, resultaram
em valores de CIMs maiores quando aplicado o teste com a fase filamentosa do S.
schenckii. Segundo os autores, essa diferença entre as fases filamentosa e
leveduriforme frente as provas de suscetibilidade, geram a necessidade de novos
estudos, que estabeleçam critérios diferenciados para a realização das provas in vitro
para S. schenckii.
As manifestações clínicas decorrente da esporotricose experimental sistêmica
foram compatíveis com as descritas por outros autores, onde inocularam conídios e/ou
leveduras/mL em concentrações variando de 2x10
3
a 7,5x10
6
reproduzindo com sucesso
a esporotricose nas suas diversas formas clínicas em variados modelos experimentais
(HIRUMA & KAGAWA, 1983; POLANIA et al.,1990; DIXON et al.,1992; MUJICA
et al., 1992; SHIRAISHI et al.,1992; TACHIBANA et al., 1999; LIMA et al., 2003;
NOBRE et al., 2003; NOBRE et al., 2004; NOBRE et al., 2005).
Quanto a evolução da esporotricose experimental frente aos tratamentos
antifúngicos e seus respectivos diluentes, foi observado diferenças estatísticas
significativas entre o grupo diluente e os tratados terbinafina e itraconazol. Os grupos
experimentais, nos quais, foram administrados os antifúngicos resultaram em menor
número de animais afetados e/ou cura clínica.
Entre os grupos nos quais foram administrados os fármacos, a evolução clínica
da micose não diferiu. No entanto foram detectadas diferenças estatísticas significativas
em relação ao aumento da espessura da cauda, onde foi observado uma redução de
animais afetados pertencentes ao grupo tratado com terbinafina em relação ao
itraconazol.
57
Em relação a terbinafina, as doses administradas nos animais experimentais com
a forma sistêmica da micose, resultaram na eficácia do tratamento, coincidindo com
outros estudos clínicos que demonstraram a atividade do fármaco no tratamento de
pacientes com esporotricose nas formas cutâneas e cutânea-linfática, com doses que
variaram de 125-1000mg (HULL & VISMER, 1992; MORISHITA et al. 2001;
TANUMA et al., 2001; CHAPMAN et al., 2004; COSKUN et al., 2004). No entanto na
clínica Veterinária ainda são escassos os estudos que confirmem a ação da terbinafina
no tratamento da esporotricose felina e em cães (MANCIANTI et al.,1999; KOTNIK et
al., 2001; ROCHETTE et al., 2003).
Assim como o observado para a terbinafina, este estudo também resultou na boa
atividade do itraconazol no tratamento da esporotricose experimental sistêmica. Outros
autores demonstraram a eficácia do fármaco em doses variando de 100mg a 400mg/dia,
para as diferentes formas de apresentação da doença (RESTREPO et al.,1986; BAKER
et al., 1989; GRANT & CLISSOLD, 1989; SHAW et al., 1989; CONTI-DIAZ et
al.,1992; LESHER, 1992; BREELING et al., 1993; MENESES et al.,1992;
MERCURIO & ELEWISKI, 1993; WINN et al., 1993; SCHARKEY-MATHIS et
al.,1993; BADLEY & VAN SCOY, 1996; HOWELL & TOOHEY, 1998; RAMIREZ et
al.,1998; NOGUCHI et al., 1999; MATSUMOTO et al., 2000; BONIFAZ et al ., 2001;
KOÇ et al., 2001; MCGINNIS et al., 2001; HAMPTON et al, 2002; PREARO et al.,
2002; STALKUP et al., 2002; COSKUN et al., 2004). Em Medicina Veterinária, é o
antifúngico mais amplamente utilizado na clínica de pequenos animais, sendo
recomendado nas doses de 5-10 mg/kg uma vez ao dia para o tratamento da
esporotricose canina e felina, apresentando, normalmente, boa tolerabilidade para essas
espécies (ROCHETTE et al., 2003).
Em se tratando especificamente da esporotricose sistêmica são escassos os
estudos que demonstrem a atividade, especialmente da terbinafina, no tratamento da
micose. Em relação ao itraconazol, Kauffman et al. (2000) indicam o fármaco como
tratamento de manutenção, após a administração inicial da anfotericina B. No entanto, o
presente estudo demonstrou que altas doses de terbinafina e itraconazol são promissoras
no tratamento da apresentação sistêmica da esporotricose.
No presente estudo foram utilizadas doses superiores da terbinafina e itraconazol
em relação as doses terapêuticas recomendadas normalmente para o tratamento de
micoses. A ação dose-dependente desses fármacos também foi relatada por outros
autores, como o demonstrado por Chapman et al. (2004), em que obtiveram melhor
58
resposta terapêutica utilizando doses maiores (1000mg) de terbinafina no tratamento de
pacientes com esporotricose linfo-cutânea. O mesmo foi evidenciado com o itraconazol,
onde as baixas concentrações do fármaco, estão diretamente associadas as falhas
terapêuticas, sendo que o fármaco em concentrações maiores tem uma ação mais efetiva
e o seu declino a valores plasmáticos inferiores a 6 µg/mL está relacionado com a
redução da sua atividade (CÁTALAN & MONTEIRO, 2006).
Além das doses, estudos apontam outros fatores como o diluente, que podem
influenciar nas concentrações plasmáticas adequadas de um determinado fármaco. Kan
& Bennet (1988) demonstraram que a terbinafina quando diluída em uma solução de
água destilada com 5% de DMSO e 1% de Tween 20, alcança maiores concentrações
plasmáticas. Baseados nessa constatação, este estudo aplicou a mesma metodologia, o
que provavelmente colaborou com a boa ação do fármaco frente a esporotricose
sistêmica.
Quanto as análises das enzimas hepáticas e hemograma, assim como a análise
histopatológica dos animais experimentais submetidos ao tratamento antifúngico e seus
respectivos diluentes, não foi demonstrado nenhuma alteração, mesmo utilizando doses
elevadas de terbinafina (250mg/kg) e de itraconazol (100mg/kg). Outros estudos com
modelos experimentais, utilizando doses entre 100 e 400mg/kg de terbinafina, para
tratamento de enfermidades como meningite coccidioidal, pneumonia por Pneumocystis
carinii e leishmaniose experimental, não demonstraram nenhuma alteração durante o
período estudado (SORENSEN et al., 2000; DANNAOUI et al., 2002; WALZER &
ASHBUGH, 2002; SAMPAIO et al., 2003). O mesmo foi evidenciado com o
itraconazol, onde Dannaoui et al. (2002) administraram terbinafina (150mg/kg) ou
itraconazol (100mg/kg) em ratos com zigomicose experimental duas vezes ao dia, por
via oral por um período de dez dias, sendo que ambos os fármacos foram diluídos em
água estéril.
Os efeitos hepatotóxicos provocados pela terbinafina são de rara ocorrência, sendo
que a elevação da ALT, FA e bilirrubina ocorre em menos de 10% dos pacientes
expostos ao fármaco. Embora, sinais de disfunção hepática não sejam relevantes, tem
sido descritos relatos de pacientes que desenvolveram hepatotoxicidade, com o aumento
transitório das enzimas hepáticas, porém com o restabelecimento do paciente após a
interrupção do tratamento (AMICHAI & GRUNWALD, 1998; TRÉPANNIER et al.,
1998; FERNANDES et al., 1998; BURSTEIN et al., 2004). Em relação ao itraconazol,
o aumento temporário das enzimas hepáticas é o efeito colateral mais freqüentemente
59
descrito, durante o uso do fármaco em humanos, sendo geralmente, reversível e
transitório. Porém a administração de doses elevadas por um período prolongado,
aumenta a liberação do fármaco no soro, o que pode contribuir para a toxicidade
hepática (LAZAROS et al., 1996; AMICHAI & GRUNWALD, 1998; ODDS, 2003).
Quanto aos resultados correspondentes ao hemograma, eritrograma (hematócrito,
hemoglobina e contagem de hemácia), leucograma e Proteínas Plasmáticas Totais (PPT)
resultaram em níveis fisiológicos para a espécie estudada tanto em relação à terbinafina
como para o itraconazol. Mesmo sendo raras as alterações no hemograma com o uso
desses fármacos antifúngicos, Nagaoka et al (2003) relataram um caso de leucocitopenia
em um paciente em que foi administrado itraconazol por um período de 16 semanas,
onde apresentou alterações na contagem de células brancas.
Em relação as alterações anatamopatológicas e histopatológicas nos animais com
esporotricose experimental sistêmica assim como na obtenção do retroisolamento do S.
schenckii, os resultados observados neste estudo foram semelhantes aos encontrados por
outros autores. Como os realizados por Polania et al (1990) onde inocularam a fase
leveduriforme do agente pela via subcutânea resultando na presença de edema, eritema,
alopecia, necrose no local da inoculação, pús e úlcera, com a disseminação do S.
schenckii após uma semana da inoculação, com a demonstração do microrganismo tanto
no cultivo dos órgão afetados, como pelo exame histológico com a coloração de PAS.
Além de Mujica et al. (1992) em que reproduziram a esporotricose por meio da
inoculação intraperitonial e na veia da cauda em ratas, resultando na disseminação do
agente no fígado, baço e glândula suprarenal .
A avaliação da evolução clínica, assim como as alterações macroscópicas e a
obtenção do retroisolamento do S. schenckii resultaram na boa atividade da terbinafina e
itraconazol no tratamento da esporotricose experimental sistêmica. As análises dos
resultados, demonstraram que a terbinafina obteve resultados semelhantes ou superiores
ao itraconazol em determinadas variáveis analisadas. A eficácia do fármaco pode ser
atribuída as suas características farmacocinéticas, sendo descrito que em cada semana
de terapia diária, este permanece nos compartimentos cutâneos em altas concentrações,
por até 2-3 meses após a interrupção da terapia (PETRANYI et al., 1987; BALFOUR &
FAULDS, 1992). Essa característica, associada com a sua ação fungicida, pode explicar
a ausência de falhas terapêuticas, não sendo descritos casos de reicidiva da enfermidade
por mais de seis meses pós-tratamento (JAIN & SEHGAL, 2000; CHAPMAN et al.,
2004).
60
Kovarik et al. (1995) estudando as características farmacocinéticas da terbinafina
em animais experimentais administraram múltiplas doses do fármaco, analisando as
suas concentrações em vários compartimentos corporais durante um período de quatro
semanas. Os autores observaram que a meia-vida do agente é em média de 20 a 28 dias
e essa longa meia-vida pode ser atribuída ao lento retorno do fármaco para o
compartimento de protoplasma central de tecido periférico e gorduroso locais. O estudo
conclui ainda que as altas concentrações de terbinafina em amostras de tecido
combinadas com sua taxa lenta de redistribuição indica que as concentrações fungicidas
são mantidas durante semanas a meses após o curso terapêutico. Hosseini-Yeganeh &
Maclachlan (2002) administraram em ratos 6 mg/kg do fármaco pela via endovenosa,
observando que nesse modelo experimental há uma distribuição a tempos maiores do
que duas horas após a administração e uma rápida redistribuição do fármaco, atingindo
o pico máximo de concentração após uma hora e meia de administração em uma única
dose de 500 e 750 mg. Baseado nesses resultados, os autores acreditam que devido as
características farmacocinéticas, espera-se que a terbinafina induza uma proteção
contínua para as infecções fúngicas, assim pode ser relacionados a tratamentos por
menores períodos.
Em contrapartida, estudos demonstram que terapias que utilizam antifúngicos de
primeiro efeito fungiostático, como o itraconazol, estão associadas ao retorno da
enfermidade assim como falhas terapêuticas e a ocorrência de isolados resistentes, assim
como o visto no uso do itraconazol para o tratamento da esporotricose felina, onde a
remissão da micose pode ser freqüentemente observada (SCHUBACH et al., 2004).
No decorrer do período experimental, foram observados óbitos nos animais
pertencentes ao grupo tratado terbinafina. As mortes de todos os animais envolvidos,
ocorreram logo após a sondagem, sendo esses submetidos imediatamente a necropsia
com a coleta dos órgãos para a avaliação histopatológica resultando em alterações
condizentes a um quadro de asfixia aguda.
Os principais efeitos colaterais descritos com o uso da terbinafina são
dificuldade de esvaziamento gástrico, náuseas e dores abdominais. No decorrer do
estudo foi observado aumento da salivação antes da administração do fármaco e maior
sensibilidade abdominal nos animais pertencentes ao grupo tratado com o antifúngico.
Provavelmente esses fatores contribuíram para o retorno esofágico da terbinafina
durante a sondagem oro-gástrica com o desenvolvimento de um quadro de asfixia e
morte aguda. Kan & Bennet (1988) administrando em ratos 200mg/kg de terbinafina
61
preparada nos mesmos diluentes utilizadas no estudo (DMSO e Tween 20) também
observaram a morte dos animais experimentais. Segundo os autores, a causa morte foi
devido a falsa-via durante a sondagem oro-gástrica.
Considerando os escassos estudos em Medicina Veterinária em relação a
terbinafina no tratamento da esporotricose, assim como o uso preconizado do
itraconazol nas formas cutâneas de casos da micose em felinos e caninos, o estudo da
atividade desses fármacos no tratamento da esporotricose experimental sistêmica
contribuiu de forma relevante nos avanços dos estudos de fármacos antifúngicos frente a
micoses sistêmicas.
62
6 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos, nestas condições experimentais, permitem as seguintes
conclusões:
A terbinafina demonstrou atividade in vitro frente a fase leveduriforme e
filamentosa do S. schenckii;
O itraconazol demonstrou atividade in vitro frente a fase leveduriforme do S.
schenckii em três isolados de esporotricose felina e em todos os isolados humanos
avaliados. Os isolados estudados mostraram-se resistentes frente ao isolado de cão e
para os demais isolados provenientes de esporotricose felina, assim como todos os
isolados referentes a fase filamentosa do S. schenckii;
As enzimas hepáticas avaliadas (ALT e FA), assim como a análise
histopatológica dos animais experimentais submetidos ao tratamento antifúngico e seus
respectivos diluentes, não sofreram alterações durante o período do estudo;
Os grupos de animais pertencentes aos grupos tratado terbinafina e itraconazol
resultaram na menor freqüência e/ou ausência de animais afetados clinicamente em
comparação aos diluentes;
As alterações anatomopatológicas ocorreram em maior freqüência nos animais
dos grupos diluentes em relação aos tratados terbinafina e itraconazol;
O retroisolamento do S. schenckii ocorreu de forma mais freqüente no grupo
diluente terbinafina e itraconazol do que nos grupos tratados com os antifúngicos. Entre
os grupos tratado terbinafina e itraconazol foi observada diferença estatística quanto o
retroisolamento do agente nos testículos, sendo que os animais tratados com o
itraconazol foi observado maior número de isolados positivos.
63
7 REFERÊNCIAS
ALVES, S. H.; LOPES, J. O.; CURY, A. E. Teste de suscetibilidade aos antifúngicos:
por que, quando e como realizar. http://www.newslab.com.br/antifung.htm, 1999.
AMICHAI, B; GRUNWALD, M. H. Adverse drug reactions of the new oral antifungal
agents-terbinafine, fluconazole and itraconazole. International Journal of
Dermatology, v. 37, p. 410-415,1998.
ARENAS, R. Esporotricose. In: Micologia medica ilustrada. 1ºed. México: Nueva
editorial interamericana, 1993, v.1, cap.13, p.145-160.
BADLEY, A. D;
VAN SCOY, R. E. Lon-term follow up of multifocal of osteoaricular
sporotrichosis treate with itraconazole. Clinical Infectious Diseases .v. 23, p. 94-95,
1996.
BAKER, J. H.; et al. Fungemia caused by amphotericin B-resistent isolate Sporothrix
schenckii. Successful treatment with itraconazole. Archives of Pathology &
Laboratory Medicine, v. 113, p. 1279-1281, 1989.
BALFOUR J, A.; FAULDS, D. Terbinafine. A review of its pharmacodynamic and
pharmacokinetic properties, and therapeutic potential in superficial mycoses. Drugs, v.
43, p. 699, 1992.
BONIFAZ, A; et al. Successfull treatment of AIDS related disseminated cutaneous
sporotrichosis with itraconazole. AIDS Patient Care, v. 15, p. 603-606, 2001.
BREELING, J. L; WEINSTEIN, L. Pulmonary sporotrichosis treated with itraconazole.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 103, p. 113-114, 1993.
BRUSTEIN, R.; et al. Esporotricose felina na cidade do Rio de Janeiro e alguns
municípios vizinhos. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v.7, suplemento 1,
p.132, 2000.
BURSTEIN, Z; et al. Hepatits tóxica colestásica por terbinafina: relato de caso. La
Revista de Gastroenterologia del Perú, v. 24, p. 357-362, 2004.
BUSTAMANTE, B; CAMPOS, P. E. Sporotrichosis: a forgotten disease in the drug
rsearch. Expert review of anti-infective therapy, v. 2, p. 85-94, 2004.
CASTRO, A. P.; et al. Recorrência de esporotricose em gatos com envolvimento
zoonótico. Ciência Animal, v. 11, suplemento 1, p .187. 2001.
CATALÁN, M; MONTEIRO, J. C. Antifúngicos sistémicos. Revista Iberoamericana
de Micologia, v. 23, p. 39-49, 2006.
64
CHAPMAN, S. W.; PAPPAS, P.; et al. Comparative evaluation of the efficacy and
safety of two doses of terbinafine (500 and 1000 mg day) in the treatment of cutaneous
lymphocutaneous sporotrichosis. Mycoses, v. 47, p. 62-68, 2004.
CONCEIÇÃO-SILVA, F.; SCHUBACH, T. M. P.; et al. Cat-transmitted sporotrichosis
epidemic in Rio de Janeiro, Brazil: Description of a series of cases. Clinical Infectious
Diseases Society of America, v. 38, p. 529-535, 2004.
CONTI-DIAS, I; CIVITA, E; GEZUELE, E. Treatment of human cutaneous
sporotrichosis with itraconazole. Mycoses, v. 35, p. 153-156, 1992.
CORMICAN, M. G.; PFALLER M, A. Standardization of antifungal susceptibility
testing. Journal Antimicrob Chemother.,v. 38, p. 561-578,1996.
COSKUN, B; et al. Sporotrichosis successfully treated with terbinafine and potassium
iodide: case report and review of the literature. Mycopathologia, v. 158, p. 53-56,
2004.
COSTA, D. M.; et al. Esporotricose felina: relato de quatro casos no Rio de Janeiro.
Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v.7, suplemento1, p.131, 2000 a.
COSTA, U. M.; et al. Detection of Feline Leukemia Virus (FeLV) antigen from 1992 to
june 2000 by indirect immunofluorescence test in Porto Alegre, Rio Grande do Sul,
Brasil. Virus Reviews & Research. v. 5, p. 94, 2000 b.
COURCHAMP, F.; SAY, L.; PONTIER, D. Transmission of Feline Immunodeficiency
Virus in a population of cats. Wildlife research, v. 27, p. 1-9, 2000.
CUENCA-ESTRELLA, M; TUDELA, J. L. R. Pueden basarse las indicaciones de los
antifúngicos en los estudios de sensibilidad? Revista Iberoamericana de Micologia, v.
19, p. 133-138, 2002.
DANNAOUI, E; et al. Efficacy of antifungal therapy in a nonneutropenic murine model
of zygomycosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy , v. 46, p. 1953-1959,
2002.
DARKES M. J, SCOTT, L. J, GOA, K. L. Terbinafine: a review of its use in
onychomycosis in adults. American Journal of Clinical Dermatology, v. 4, p. 39-65,
2003.
DE PAUW, B. E. New antifungal agents and preparation. International Journal of
Antimicrobial Agents, v. 16, p. 147-150, 2000.
DIXON, D. M.; DUNCAN , R.; HURD, N. J. Use of a mouse model to evaluate clinical
and environmental isolates of Sporothrix spp. From the largest U.S. Epidemic of
sporotrichosis. Journal of Clinical Microbiology, v. 30, p. 951-954, 1992.
DUNSTAN, R. W.; et al. Feline sporothrichosis: a report of five cases with transmission
to humans. Journal of the American Academy of Dermatology, v.15, p.37-45, 1986.
ESPINEL-INGROF, A. Standardization of antifungal susceptibility testing: review
update. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 13, p. 64 - 68, 1996.
65
FERNANDES, N. F; GELLER, S. A; FONG, T. L. Terbinafine hepatotoxicity: case
report and review of the literature. The American Journal of Gastroenterology, v. 93,
p. 459-460, 1998.
FLEURY, R. N.; et al. Zoonotic sporotrichosis. Transmission to humans by infected
domestic cat stratching: report of four cases in São Paulo, Brazil. International
Journal Dermatology., v.40, p.318-322, 2001.
FRANCO, S. R. V. S.; et al. Esporotricose em gato doméstico: transmissão humana.
Rev do Instituto de Medicina Tropical São Paulo., v. 35, p. 327-330, 1993.
FREITAS, D.C.; et al. Esporotricose em cães e gatos. Revista da Faculdade de
Medicina Veterinária, v. 7, p. 381-387, 1956.
GADEA, I; CUENCA-ESTRELLA, M. Recomendaciones para el diagnostico
micológico y studios de sensibilidad a los antifúngicos. Enfermedades Infecciosas y
Microbiologia Clinical, v. 22, p. 32-39, 2004.
GHOSH, A.; et al. In vitro susceptibility pattern of Sporothrix schenckii strains isolated
from three centers in India. India Journal of Medical Research, v. 113, p. 214-220,
2001.
GRANT, S. M.; CLISSOLD, S. P. Itraconazole. A review of its pharmacodynamic
and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in superficial and systemic
mycoses. Drugs, v. 37, p. 310-44, 1989.
HAMPTON, D. E; ADESINA, A; GHODOSH, J. Conjuctivial sporotrichosis in the
absence of antecedent trauma. Cornea, v. 21, p. 831-833, 2002.
HARKNESS, J. E; WAGNER, , J. E. The biology and medicine of rabbits and rodents.
Baltimore. Williams & Williams, 1995.
HAY, R. J. Therapeutic potential of terbinafine in subcutaneous and systemic
mycoses. Brazilian Journal Dermatology, v. 141, p. 36-40, 1999.
HIRUMA, M; KAGAWA, S. The effect of heat on Sporothrix schenckii in vitro and
in vivo. Mycopathologia, v. 84, p. 21-30, 1983.
HOSSEINI-YEGANEH, M; MAcLACHLAN, A. J. Physiologically based
pharmacokinetic model for terbinafine in rats and humans. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 46, p. 2219-2228, 2002.
HOWELL, S. J; TOOHEY, J. S. T. Sporotrichal arthritis in South Central Kansas.
Clinic Orthopedics and Related Research, v. 346, p. 208-214, 1998.
HULL, P. R; VISMER, H. E. Treatment of cutaneous sporotrichosis with terbinafine.
Brazilian Journal Dermatology, v. 126, p. 51-56, 1992.
JAHAM, C.; PARADES, M.; PAPICH, M. G. Antifungical dermatologic agents: azoles
and allylamines. Small Animal/ exotics, v.22, p.548-558, 2000.
66
JAIN, S; SEHGAL, V. N. Terbinafine, a unique oral antifungal: current perceptions.
International Journal of Dermatology, v. 39, p. 412-423, 2000.
JESSUP, C. J.; RYDER, N. S.; GHANNOUM, M. A. An evaluation of the in vitro of
terbinafine. Medical Micology, v.38, p. 155-159, 2000.
KAJIWARA, H; et al. Impaired host defense against Sporothrix schenckii in mice with
chronic granulomatous disease. Infection and Immunity, v. 72, p. 5073-5079, 2004.
KAN, V. L.; BENNETT, J. E. Efficacies of four antifungal agents in experimental
murine sporotrichosis. Antimicrob Agents Chemother, v. 32, p. 1619-23, 1988.
KAUFFMAN, C. A.; HAIJJEH, R.; CHAPMAN, S. H. Pratice guidelines for
management of patients with sporotrichosis. For the Mycoses Study Group. Infectious
Disease Society of America. Clinical Infectious Diseases, v. 30, p. 684-687, 2000.
KELLY, S. E.; CLARK, W. T. Feline sporotrichosis: a case report with zoonotic
involvement. Australian Veterinary Practitioner, v. 21, p. 139-140, 1991.
KNOW-CHUNG, K. J.; BENNETT, J. E. Sporotrichosis In: Medical Mycology. Lea &
Fibeger, Philadelphia, p.707-729, 1992.
KOÇ, A. N; UKSAL, U; OYMAC, O. Case report. Successffully treated subcutaneous
infections with Sporothrix schenckii in Turkey. Mycoses, v. 43, p. 75-77, 2001.
KOHLER, L. M; et al. In vitro susceptibilities isolates of Sporothrix schenckii to
itraconazole and terbinafine. Journal of Clinical Microbiology, v. 42, p. 4319-4320,
2004.
KOHLER, L. M; et al. In vitro susceptibilities isolates of Sporothrix schenckii to
amphotericin B, itraconazole, and terbinafine: comparision of yeast and mycelial forms.
Clinical Microbiology Reviews, v. 52, p. 843-847, 2006.
KOTNIK,T.; KOZUH, E. N.; et al. Terbinafine hydrochloride treatment of
Microsporum canis experimentally- induced ringworn cats. Veterinary of
Microbiology, v. 83, p. 161-168, 2001.
KOVARIK, J. M; et al. Multiple-dose, pharmacokinetics, and distribuition in tissue of
terbinafine and metabolites. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 39, p. 2738-
2741, 1995.
LACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS, J. E. C. M. Esporotricose e outras micoses
gomosas. In: Micologia médica. São Paulo, Sarvier, p.233-247, 1991.
LAPPIN, M. R. Feline zoonotic diseases. The Veterinary Clinics of North American,
v. 23, p. 57-78, 1993.
LARSSON C. E.; et al. Feline sporotrichosis: clinical and zoonotic aspects. Revista do
Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v.31, p.351-358, 1989.
LAZAROS, G. A; et al. Terbinafine-induced cholestatic liver disease. Journal
Hepatology, v. 24, p. 753-756, 1996.
67
LESHER, J. L. JR. New antifungal agents. Dermatologic Clinics, v. 10, p. 799-805,
1992.
LIMA, R. F; SCHAFFER, G. V; BORBA, C. M. Variants of Sporothrix schenckii with
attenuated virulence for mice. Microbes and Infection, v. 5, p. 933-938, 2003.
LONDERO, A. T.; CASTRO, R. M.; FISCHMAN, O. Two cases of sporotrichosis in
dogs in Brazil. Sabouraudia, v.3, p.273-274. 1964.
LOPES, J. O; et al. Epidemiologia da esporotricose na região central do Rio Grande do
Sul. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 32, p. 541-545, 1999.
LOPES-BEZERRA, L; et al. Sporothrix schenckii and Sporotrichosis. Anais da
Academia Brasileira de Ciências, v. 78, p. 293-308, 2006.
LUMBRERAS, C; LIZASOAIN, M; AGUADO, J. M. Antifúngicos de uso sistémico.
Enferm Infecc Microbiol Clin, v. 21, p. 366-380, 2003.
LUTZ, A.; SPLENDORE, A. Sobre uma micose observada em homens e ratos
(Contribuição para o conhecimento das assim chamadas esporotricoses). Revista de
Medicina, v.10, p.443-450, 1907.
LYMAN, C. A.; WALSH, T. J. Systemically administred antifungal agents. A review of
their clinical pharmacology and therapeutic applications. Drugs, v. 44, p. 9-35, 1992.
MAGDALI, S; et al. Susceptibilidad de Sporothrix schenckii in vitro em fase
filamentosa y de levedura. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología,
v.20, 2000.
MANCIANTI, F.; et al. Mycological findings in Feline Immunodeficiency virus-
infected cats. Journal of Medical Mycology, v. 30, p. 257-259, 1992.
MANCIANTI, F.; PEDONESE, F.; MILLANTA, F. Eficacy of oral terbinafine in feline
dermatofhytosis due to Microsporum canis. Journal Feline Medicine surg., v.1, p. 37-
41, 1999.
MARQUES, S. A.; et al. Esporotricose do gato doméstico (Felis catus): transmissão
humana. Revista do Instituto de Medicina Tropical São Paulo, v. 35, p. 327-330,
1993.
MATSUMOTO, H.; et al. A case of fixed sporotrichosis with recurred in a child
following itraconazole treatment. Nippon Ishinki Gakkai Zasshi, v. 41, p. 83-87,
2000.
MCGINNIS, M. R; et al. Sporothrix schenckii sensitivity to voriconazole, itraconazole
and amphotericin B. Medical Mycology, v. 39, p. 369-371, 2001.
MENESES, C; BUSTAMANTE, B; HOLGADO, W. Itraconazol en el tratamiento de la
sporotrichosis subcutanea. Boletin de la Sociedad Peruana de Medicina Interna, v. 5,
p. 2-3, 1992.
68
MEINERZ, A.R.M.; et al. Esporotricose com linfangite ascendente envolvendo felino
doméstico. In: XXI Congresso Brasileiro de Microbiologia, Foz do Iguaçu-PR, 21 a 25
de outubro de 2001. Anais, 299p.
MEINERZ, A. R. M.; et al. Virus da leucemia Felina e a Relação com Microsporose e
Esporotricose. I Congresso de Especialidades em Medicina Veterinária- Curitiba- PR,
2002. Anais, 184p.
MEINERZ, A. R. M.; et al. Atividade in vitro da terbinafina e itraconazol sobre o
Sporothrix schenckii V Congresso Latino-Americano de Micologia-Brasília-DF, 2005.
Anais, 244, 2005 p.
MERCURIO, M. G.; ELEWISKI, B. E. Therapy of sporotrichosis. Seminars in
Dermatology, v. 12, n. 4, p. 285-289, 1993.
MIGLIANO, M. F.; FREITAS, D. C.; MORENO, G. Esporotricose em cães. Revista
da Faculdade de Veterinária de São Paulo, v.7, São Paulo, p.225-233, 1963.
MORISHITA, N.; et al. A case of lymphocutaneous sporotrichosis. Nippon Ishinkin
Gakkai Zasshi, v. 42, p.149-54, 2001.
MORRIS-JONES, R. Sporotrichosis. Clinical and Experimental Dermatology, v. 27,
p. 27-31, 2002.
MORRIS-JONES, R.; et al. Synthesis of melanin-like pigments by Sporothrix schenckii
in vitro and during mammalian infection. Infectino and Immunity, v.71, p. 4026-4033,
2003
MUJICA, M.T.; et al. Esporotricosis experimental en ratas. Revista Argentina de
Micologia, v.15, p.7-12, 1992.
NEGRONI, R & ARECHALAVA, A. I. Itraconazole: phamacokinetics and indications.
Archives of Medical Research, v. 24, p. 387-393, 1993.
NAGAOKA, Y; OKOCHI, H; TAMAKI, K. Leukocytopenia after administration of
itraconazole. Mycoses, v. 46, p. 240-241, 2003.
National Comittee for Clinical Laboratory Standards, 2002. Reference method for
broth diluition antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. Approved Standard
M38-A. National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa, (a).
National Comittee for Clinical Laboratory Standards, 2002. Reference method for
broth diluition antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved Standard M27-A2.
National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa, (b).
NETO, R. P. J; et al. Esporotricose cutânea disseminada como manifestação inicial da
síndrome da imunodeficiência adquirida- relato de caso. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, v.32, p.57-61,1999.
NOBRE, M. O.; et al. Recurrence of sporotrichosis in cats with zoonotic involvement.
Revista Iberoamericana de Micologia, v. 18, p. 137-140, 2001.
69
NOBRE, M. O.; et al. Drogas antifúngicas para pequenos e grandes animais.
Ciência Rural, v.32, p. 175-184, 2002 (a).
NOBRE, M. O; et al. Differences in virulence between isolates of feline sporotrihosis.
Mycopathologia, v. 160, p. 43-49, 2005.
NOBRE, M. O; et al. Development of experimental sporotrichosis in a murine
model with yeast and mycelial forms of Sporothrix schenckii. Acta Scientiae.
Veterinariae, v. 31, p. 161-166, 2003.
NOBRE, M.O.; et al. Esporotricose zoonótica na região sul do Rio grande do Sul
(Brasil) e revisão bibliográfica. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v.9, p.36-
41, 2002 (b).
NOBRE, M.O.; et al. Poduction and evaluation of albino mutants of Sporothrix
schenckii. Acta Scientiae Veterinariae, 2004.
NOGUCHI, H; HIRUMA, M; KAWADA, A. Case report. Sporotrichosis successfully
treated with itraconazole. Mycoses, v. 42, p. 571-576, 1999.
NOGUEIRA, R. H. G.; et al. Relato de esporotricose felina (Sporothrix scenckii) com
transmissão para o homem: aspectos clínicos, microbiológicos e anatomopatológicos.
Arquivos Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 27, p. 43-51, 1995.
ODDS, F. Antifungal agents: their diversity and increasing sophistication. Mycologist,
v. 17, p. 51-55, 2003.
PAREDES, S.; et al. Terbinafina en onicomicosis pediatrica: estudio prospectivo.
Revista Chilena de Dermatologia, v. 16, p. 188-190, 2000.
PEREZ, A. Terbinafine: broad new spectrum of indications in several subcutaneous and
systemic and parasitic diseases. Mycoses, v. 42, p. 111-114, 1999.
PETRANYI, G.; MEINGASSNER, J. G.; MIETH, H. Antifungal activity of the
allylamine derivative terbinafine in vitro. Antimicrob Agents Chemother, v. 31, p.
1365-8, 1987.
POLAK, A. The past, present and future of antimycotic combination therapy. Mycoses,
v. 42, p. 335-370, 1999.
POLANIA, L.A.G.; ALZATE, A.; SARAIVA, N. Comportamiento experimental del
Sporothrix schenckii y la Leishmania mexicana em el hamster. Revista do Instituto
Tropical de São Paulo, v. 32, p.319-324, 1990.
PREARO; et al. Case report: bilateral sporotrichosis. Mycoses, v. 45, p. 415-417, 2002.
RAFAL, E. S.; RASMUSSEN, J. E. An unusual presentation of fixed cutaneous
sporotrichosis: a case report and review of the literature. Journal of the American
Academy of Dermatology, v. 25, p. 928-932, 1991.
70
RAMIREZ, J; BYRD, R. P; ROY, P. M. Chronic cavitary pulmonary sporotrichosis:
efficacy of oral itraconazole. The Journal of the Kentucky Medical Association, v.
96, p. 103-105, 1998.
RESTREPO, A.; et al. Itraconazole therapy in liynphangitic and cutaneous
sporotrichosis. Archives of the Dermatology, v. 122, p. 413-417, 1986.
REX, J. H; et al. Antifungal Susceptibility testing: practical aspects and current
challenges. Clinical Microbiology Reviews, v. 14, p. 643-658, 2001.
RIVAS, P; SERRANO, R. Q. Utilidad clínica de las pruebas de suscetibilidad
antimicótica. Revista Clombiana de Cancerologia, p. 34-42, 2003.
ROCHETTE, F; et al. Antifungal agents of use in annimal health-pratical aplications.
Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, v. 26, p. 31-53, 2003.
ROMERO-MARTINEZ, R.; et al. Biosynthesis and functions of melanin in Sporothrix
schenckii. Infection and immunity, v.68, p.3697-3703, 2000.
RYDER, N. S. Activity of terbinafine against serious fungal pathogens. Mycoses, v. 42,
p. 115-119, 1999.
SAMPAIO, R. N. R; et al. Ineficácia in vivo da terbinafina em leishmaniose cutânea
causada por Leishmania amazonensis em camundongos C57BL/6. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 36, p. 531-533, 2003.
SANGLARD, D. Resistance and tolerance mechanisms to antifungal drugs in fungal
pathogens. Mycologist, v. 17, p. 74-78, 2003.
SCHARKEY-MATHIS, P. K; KAUFFMAN, C. A; GRAYBILL, J. R. Treatment of
sporotrichosis with itraconazole. The American Journal of Medicine, v. 95, p. 279-
285, 1993.
SCHIRAISHI, A; NAKAGAKI, K; ARAI, T. Role of cell-mediated immunity in the
resistence to experimental sporotrichosis in mice. Mycopathologia, v. 120, p. 15-21,
1992.
SCHUBACH T. M. P, et al. Evaluation of an epidemic of sporotrichosis in cats: 347
cases (1998–2001). Journal of the American Veterinary Medical Association, v.
224, p. 1623-1629, 2004.
SCHUBACH, A; et al. Cat-transmitted sporotrichosis, Rio de Janeiro, Brazil. Emerging
Infectious Diseases, v. 11, p. 1952-1954, 2005.
SCHUBACH, T. M. P.; et al. Pathology of sporotrichosis in 10 cats in Rio de Janeiro.
The Veterinary Record, v. 152, p. 172-175, 2003.
SCHUBACH, T.M.; et al. Isolation of Sporothrix schenckii from the nails of domestic
cats (Felis catus). Medical Mycology, v.39, p.147-149, 2000.
71
SHAW, J. C; LEVINSON, W; MONTANARO, A. Sporotrichosis in the
Immunodeficiency Syndrome. Journal of the American Academy of Dermatology, v.
21, p. 1145-1147, 1989.
SIERRA, P.; et al. Fungal flora on cutaneous and mucosal surfaces of cats infected with
feline immunodeficiency virus or feline leukemia virus. American Journal of
Veterinary Research, v. 61, p. 158-161, 2000.
SORENSEN, S. N; et al. Comarative efficacies of terbinafine and fluconazole in
treatment of experimental coccidioidal meningites in a rabbit model. Antimicrob.
Agents Chemother. v. 44, p. 3087-3091, 2000.
SOUZA, L. L.; et al. Isolation of Sporothrix schenckii from the nails of healthy cats.
Brazilian Journal Microbiology, v. 37, p. 303-305, 2006.
SOUZA, M. D. M.; et al. Esporotricose felina e a importância zoonótica – relato de caso
no Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v. 7 –
suplemento 1, p.131, 2000.
SOUZA J. J. Esporotricose em cães. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA
VETERINÁRIA, 7, Recife, 1957. Anais. Recife, p.367-371.
STALKUP, J. R.; BELL, K.; ROSEN, T. Disseminated cutaneous sporotrichosis treated
with itraconazole. Cutis, v. 69, p. 371-374, 2002.
STERLING, J. B; HEUMANN, W. R.. Potassium iodide in dermatology: A 19 th
century drug for the 21
st
century-Uses, pharmacology, adverse effects, and
contraindications. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 43, p. 691-
697, 2000.
SULLIVAN, D. P. O. Terbinafine tolerability in general medical pratice. British
Journal of Dermatology, v. 141, p.21-25, 1999.
TACHIBANA, T.; MATSUYAMA, T.; MITSUYAMA. Sopothrix schenckii thermo-
intolerant mutants losing fatal visceral infectivity but retaining hight cutaneous
infectivity. Medical Mycology, v. 39, p. 295-298, 2001.
TACHIBANA, T.; MATSUYAMA, T.; MUTSUYAMA, M. Involvement of CD4
+
+ T
cells and macrophages in acquired protection against infection with Sporothrix
schenckii in mice. Medical Mycology, v.37, p.397-404, 1999.
TANUMA, H.; ASAI, T.; A. B. E. M.; NISHIYAMA, S.; KATSUOKA, K. Lymphatic
vessel-type sporotrichosis: immunohistochemical evaluation and cytokine expression
pattern. Mycoses, v. 44, p. 316-120, 2001.
TOMÁS, J. G; CALVO, C. R; RUESCA, R. B. Criterios de sensibilidad a los azoles.
Rev Esp Quimioterap, v. 17, p. 83-90, 2004.
TRÉPANNIER, E. F; NAFZIGER, A; AMSDEN, G. W. Effect of terbinafine on
theophylline pharmacokinetics in healthy volunteers. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 42, p. 695-697, 1998.
72
TRILLES, L; et al. In vitro antifungal susceptibilities of Sporothrix schenckii in two
growth phases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 9, p. 3952-3954, 2005.
WALZER, P; ASHBAUGH, A. Use of terbinafine in mouse and rats models of
Pneumocystis carinni. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 46, p. 514-516,
2002.
WINN, R. E.; et al. Systemic sporotrichosis treated with itraconazole. Clinical
Infectious Diseases, v. 17, p. 210-217, 1993.
WU, J. J; et al. Therapy of systemic fungal infections. Dermatologic Therapy, v. 17, p.
532-538, 2004.
XAVIER, M. O.; et al. Esporotricose felina com envolvimento humano na cidade de
Pelotas, RS, Brasil. Ciência Rural, v. 34, p. 1961-1963, 2004.
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