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ELIZABETE DE SOUZA CÂNDIDO
CARACTERIZAÇÃO DE XANTHOMONAS GARDNERI E ANÁLISE
PROTEÔMICA DA INTERAÇÃO ENTRE XANTHOMONAS CAMPESTRIS
PV
. CAMPESTRIS E ARABIDOPSIS THALIANA
Orientadora: Dra. Betania Ferraz Quirino
BRASÍLIA
DISTRITO FEDERAL - BRASIL
JULHO - 2007
I
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ELIZABETE DE SOUZA CÂNDIDO
Caracterização de Xanthomonas gardneri e Análise
Proteômica da Interação Entre Xanthomonas campestris pv.
campestris e Arabidopsis thaliana
ORIENTADORA: DRA. BETÂNIA FERRAZ QUIRINO
Dissertação apresentada à
Universidade Católica de
Brasília, para obtenção do
título de Mestre em Ciências
Genômicas e Biotecnologia.
BRASÍLIA
DISTRITO FEDERAL - BRASIL
JULHO – 2007
II
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Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2007.
Orientação: Betânia Ferraz Quirino
1. Bactérias. 2. Tomate – Doenças e pragas. 3 .Xanthomonas
campestris. 4. Podridão negra. I. Quirino, Betânia Ferraz, orient. II. Título
CDU: 632
C217c Cândido, Elizabete de Souza.
Caracterização de xanthomonas gardneri e análise proteômica da
integração entre xanthomonas campestris pv. campestris e arabidopsis
thaliana / Elizabete de Souza Cândido. – 2007.
171 f.: il. ; 30 cm
Ficha elaborada pela Divisão de Processamento do Acervo do SIBI - UCB
III
À minha família pelo
companheirismo e estímulo, em
especial à minha mãe Maria José,
por seu apoio incondicional e amor
constante, dedico.
IV
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus; que com sua mão afável conduziu-me, levando-me
a superar as dificuldades e obstáculos encontrados pelo caminho.
À meu pai e meu irmão; pela paciência, apoio e companheirismo. À
minha mãe; pelo suporte emocional, carinho e incentivo constante, pelas
longas horas de ausência e preocupações suportadas. Sem seu exemplo
de coragem e perseverança nada disso seria possível.
Aos amigos da Banda Saraf e Kleber; por seu carinho, compreensão e
incentivos constantes.
À minha orientadora Dra. Betania Ferraz Quirino; pelo apoio e
intervenção direta na execução dos trabalhos. Por seu exemplo de
profissionalismo e dinamismo constante.
À Dra. Eliane Noronha; por sua disposição constante em colaborar com a
elaboração e execução dos experimentos, além do esclarecimento de
muitas dúvidas.
Ao Dr. Octávio Luiz Franco; por sua colaboração, incentivo e discussões
esclarecedoras.
Ao Dr. Eduardo Leonardecz; pelo auxílio nas análises estatísticas.
À Dra. Alice Maria Quezado – Duval; pelas colaborações e disposição
em ajudar.
Aos colegas de trabalho do grupo Arabidopsis; Pollyanna, Bárbara,
Leonardo e Rachel, por todos os momentos de crescimento que
compartilhamos.
V
À Cenadar; da equipe de limpeza, pelo carinho com “nossas salas de
crescimento”. Sua presença foi essencial para o bom desenvolvimento
dos trabalhos.
Às companheiras Andréa, Jackeline, Simone, Patrícia, Kelly e Michelle;
pelas alegres discussões, abrigo, carinho e conforto em todos os
momentos.
A todos os amigos do laboratório; por todas as alegrias e dificuldades
compartilhadas.
Ao CNPq e à UCB pelo suporte financeiro concedido.
VI
“A falsa ciência cria os ateus; a verdadeira
faz o homem prostrar-se diante da divindade.”
Voltaire
VII
SUMÁRIO
Agradecimentos...........................................................................................................V
Lista de Figuras........................................................................................................XI
Lista de Tabelas.......................................................................................................XV
Lista de Abreviações..............................................................................................XVI
Resumo........................................................................................................................XX
Abstract......................................................................................................................XXI
Introdução .................................................................................................................. 24
Xanthomonas campestris pv. campestris................................................................. 30
Xanthomonas gardneri................................................................................................... 32
Arabidopsis thaliana como modelo de estudo ...................................................... 35
Caracterização da Atividade Enzimática de Xanthomonas gardneri......... 39
Interação Planta-Patógeno.......................................................................................... 48
Análise Proteômica da Interação-Planta Patógeno........................................... 51
Hipóteses..................................................................................................................... 58
Objetivos...................................................................................................................... 60
Metodologia................................................................................................................ 62
Caracterização da Resistência de X. gardneri a diferentes antibióticos.. 64
Caracterização da Resistência de Arabidopsis thaliana à Xanthomonas
gardneri............................................................................................................................... 65
Quantificação de Proteínas secretadas por Xanthomonas gardneri........... 67
Caracterização da Atividade Enzimática de Xanthomonas gardneri......... 68
Análise Proteômica da Interação-Planta Patógeno........................................... 74
Resultados e Discussão .......................................................................................... 85
Detecção de Xantomonadinas..................................................................................... 85
Caracterização da Resistência de X. gardneri a diferentes antibióticos.. 86
Caracterização da Resposta de A. thaliana e diferentes Solanáceas a
Xanthomonas gardneri................................................................................................... 88
Quantificação de Proteínas secretadas por Xanthomonas gardneri........... 94
Ensaios Enzimáticos....................................................................................................... 96
Análise proteômica....................................................................................................... 100
Conclusões................................................................................................................ 133
Perspectivas Futuras............................................................................................. 136
Referências Bibliográficas.................................................................................. 139
VIII
Apêndices.................................................................................................................. 156
Apêndice 1 - Reagentes, Soluções e Meios de Cultura..................................................... 156
Apêndice 2 – Artigo Xanthomonas gardneri exoenzymatic activity towards plant tissue
.............................................................................................................................................. 164
IX
X
L
ISTA DE FIGURAS
Páginas
X. gardneri......................................................................................92
Figura 8: Arabidopsis thaliana, ecótipo CS 6100, com sintomas de
amarelecimento 6 dias após a inoculação...................................................93
Figura 1: Sintomas de podridão - negra causada por Xanthomonas
campestris pv. campestris em Brassica olearaceae (repolho)...............30
Figura 2: Sintomas de mancha bacteriana causada por Xanthomonas sp.
em Solanum lycopersicum (tomate)....................................................34
Figura 3: Estruturas químicas dos principais componentes da parede
celular vegetal (L-arabinose, D-xilose, pectina e celulose) e da
sacarose..........................................................................................46
Figura 4: Estruturas tridimensionais das enzimas empregadas na
degradação da parede celular vegetal. ...............................................46
Figura 5: Ligação dos spots (pontos protéicos) ao gel de referência. ...81
Figura 6: Organização dos diferentes ecótipos de A. thaliana de acordo
com a análise estatística referente à resposta ao isolado CNPH467 de X.
gardneri. ........................................................................................89
Figura 7: Resposta de ecótipos de A. thaliana ao isolado CNPH 467 de
Figura 9: Jiló comprido (Solanum gilo) apresentando sintomas de
Hipersensibilidade (HR)...................................................................93
XI
Figura 10: Quantificação de Proteína secretada por X. gardneri na
presença de diferentes substratos.......................................................94
Figura 11: Atividade de Celulase de X. gardneri crescida na presença de
diferentes substratos........................................................................96
Figura 12: Atividade de α-arabinofuranosidase de X. gardneri crescida
na presença de diferentes substratos..................................................97
Figura 13: Gel de referência para comparações entre as réplicas de géis
bidimensionais de diferentes tratamento de folha de A. thaliana CS 1308,
X. campestris pv. campestris CNPH17 e secretoma...........................101
Figura 14: Réplicas biológicas de extração fenólica de amostras de
folhas de Arabidopsis thaliana CS 1308 + tampão 10mM MgCl
2
........105
Figura 15: Sobreposição das imagens dos géis de réplicas biológicas de
Arabidopsis thaliana CS 1308 + tampão 10mM MgCl
2
.......................106
Figura 16: Curva de regressão, apresentando o nível de similaridade
entre os géis de Arabidopsis thaliana CS 1308 + tampão 10mM
MgCl
2
...........................................................................................106
Figura 17: Pontos protéicos identificados no gel de Arabidopsis thaliana
CS 1308 + tampão 10mM MgCl
2
......................................................107
Figura 18: Réplicas biológicas de extração fenólica de amostras de
folhas de Arabidopsis thaliana CS 1308 + X. campestris pv. campestris
CNPH 17.......................................................................................109
Figura 19: Sobreposição das imagens dos géis de réplicas biológicas de
Arabidopsis thaliana CS 1308 + X. campestris pv. campestris CNPH
17.................................................................................................110
XII
Figura 20: Curva de regressão de Arabidopsis thaliana CS 1308 + X.
campestris pv. campestris CNPH 17.................................................110
Figura 21: Pontos protéicos identificados no gel de Arabidopsis thaliana
CS 1308 + X. campestris pv. campestris CNPH 17............................111
Figura 22: Sobreposição das imagens dos géis de Arabidopsis thaliana
CS 1308 + tampão 10mM MgCl
2
e Arabidopsis thaliana CS 1308 + X.
campestris pv. campestris CNPH 17.................................................115
Figura 23: Curva de regressão de Arabidopsis thaliana CS 1308 +
tampão 10mM MgCl
2
e Arabidopsis thaliana CS 1308 + X. campestris
pv. campestris CNPH 17.................................................................115
Figura 24: Comparação dos spots expressos nos diferentes tratamentos
com folha de A. thaliana CS1308.....................................................117
Figura 25: Réplicas técnicas de extração de amostras de X. campestris
pv. campestris CNPH17 em gel 2DE (SDS-PAGE)............................123
Figura 26: Sobreposição das imagens dos géis de réplicas técnicas de
Xanthomonas campestris pv. campestris CNPH17. ...........................124
Figura 27: Curva de regressão, de X. campestris pv. campestris CNPH
17 ................................................................................................124
Figura 28: Pontos protéicos identificados no gel de X. campestris pv.
campestris CNPH 17 (Xcc1)............................................................125
Figura 29: Análise do secretoma de X. campestris pv. campestris na
presença de folhas de ecótipo suscetível e resistente de A. thaliana em
gel 2DE (SDS-PAGE).....................................................................129
XIII
Figura 30: Sobreposição das imagens dos géis de secretoma de X.
campestris pv. campestris na presença de folhas de ecótipo suscetível e
resistente de A. thaliana.................................................................130
Figura 31: Curva de regressão de secretoma de X. campestris pv.
campestris na presença de ecótipo suscetível (CS 1194) e resistente (CS
1308) de A. thaliana.......................................................................130
Figura 32: Pontos protéicos identificados no gel de secretoma de X.
campestris pv. campestris na presença de ecótipo suscetível (CS 1194)
de A. thaliana................................................................................131
Figura 33: Pontos protéicos identificados no gel de secretoma de X.
campestris pv. campestris CNPH 17 na presença de ecótipo resistente
(CS 1308) de A. thaliana................................................................131
Figura 34: Comparação dos spots expressos nos diferentes tratamentos
e secretoma de X. campestris pv. campestris...................................132
d
XIV
LISTA DE TABELAS
Páginas
Tabela 1: Grau de severidade de sintomas de X. gardneri em plantas de
A. thaliana......................................................................................65
Tabela 2: Cromatografia de camada fina para detecção de
xantomonadinas...............................................................................85
Tabela 3: Teste de resistência do isolado CNPH467 de X. gardneri à
diferentes antibióticos......................................................................86
Tabela 4: Solanáceas de inter sse econômico inoculadas com
Xanthomonas gardneri CNPH 467 em suspensão de 5 x 10
8
UFC/mL..........................................................................................91
Tabela 5: Spots únicos em réplicas de géis de A. thaliana infiltradas com
tampão 10 mM MgCl
2
.....................................................................102
e
XV
LISTA DE ABREVIAÇÕES
infiltradas com tampão 10 mM MgCl
2
lhas de A. thaliana inoculadas com X. campestris pv.
etilamonio]-1-propanosulfonato
uisas em Hortaliças - EMBRAPA
% - Porcentagem
µg – Micrograma
µL- Microlitro
2D- Bidimensional
2DE – Eletroforese bidimensional
3D – Tridimensional
Amp – Ampicilina
ANAVA – Análise de variâncias
APS – Persulfato de Amônio
Ara - Folhas de A. thaliana
Ara + Xcc - Fo
campestris
BCA – Ácido bicinconínico
CHAPS - 3-[(3-Colamidopropil)dim
CHL – Cloramfenicol
cm – centímetro
CNPH – Centro Nacional de Pesq
cv. - Cultivar
DNA- Ácido desoxirribonucléico
DNS: Ácido 3,5 – Dinitrossalicílico
dpi – Dias pós inoculação
DTT – Ditioltreitol
XVI
E – Encharcamento
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
inomicina
treptomicina
pressed sequence tags
a.
a para focalização
o dibásico
micina
de Potássio monobásico
e
ura, Pecuária e Abastecimento
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Espec – Espect
Estrep – Es
ESTs- Ex
EUA - Estados Unidos da América
g – Força centrífuga relativa (gravidade) quando para medidas de rotação
de centrífug
g – Grama
h- Hora
HR – Reação de Hipersensibilidade
IPG buffer – Tampão para gel de poliacrilamid
isoelétrica
K
2
HPO
4
- Fosfato de Potássi
Kan – Kana
kDa - quilodáltons
KEGG - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
KH
2
PO
4
- Fosfato
LC - Cromatografia líquida
M - Molar
mA – Mili Ámper
MAPA – Ministério da Agricult
mg – Miligrama
MgCl
2
- Cloreto de Magnésio
XVII
mL - Mililitros
l
ultura Murashige & Shook Basal Salt mixture
e massa
iente
Data Bank
no Bruto
lfluorido
ratory for Structural Bioinformatics
nucléico
por minuto
to de Sódio
mM - Milimolar
mRNA - RNA mitocondria
MS ¼ – Meio de c
MS - Espectrometria d
N – Necrose
NA - Meio Ágar Nutr
NaCl – Cloreto de Sódio
nm - Nanômetros
NO – Não Observado
OD – Densidade Óptica
m/v – massa/volume
PDB - Protein
pH - Potencial hidrogeniônico
pI - Ponto Isoelétrico
PIB – Produto Inter
PMSF – Fenilmetanosulfoni
pv. – Patovar
RCSB - Research Collabo
Rf - Fator de relação
Rif – Rifampicina
RNA - Ácido ribo
rpm – Rotações
rRNA - RNA ribossomal
SDS – Dodecil Sulfa
XVIII
SDS PAGE – Eletroforese por gel de poliacrilamida em tampão Dodecil
ies de um mesmo gênero
tano
ged Image File Format
e camada delgada
ormadoras de Colônias
ersidade de Brasília
W – Watts
WR – Working reagent
Xcc – Xanthomonas campestris pv. campestris
monas gardneri
Xanthomonas vesicatoria
Sulfato de Sódio
SP - São Paulo
spp. – Várias espéc
SS – Sem Sintomas
TCA – Ácido Tricloracético
T-DNA - DNA de transferência
TEMED - 1,2-Bis(dimetilamino)e
Tet – Tetraciclina
TIFF - Tag
TLC - Cromatografia d
UFC - Unidades F
UNB – Univ
UV – Ultra- violeta
V - Volts
v/v – volume/volume
var. – Variedade
Xg – Xantho
Xv –
XIX
RESUMO
As bactérias do gênero Xanthomonas causam diversas doenças em
plantas cultiváveis em todo o mundo. A mancha-bacteriana é considerada
uma das mais importantes para a cultura do tomateiro (Solanum
lycopersicum L.), ocorrendo em praticamente todos os continentes e na
maioria das áreas produtoras de tomate e também de pimentão no Brasil.
Foi
ealizada uma pesquisa de possíveis hospedeiros (com ênfase na família
aceae) e também foi testada a planta modelo Arabidopsis thaliana.
segundo lugar, objetivou-se analisar as alterações proteômicas no
8 de A. thaliana que é sabidamente resistente a
anthomonas campestris pv. campestris (Xcc) isolado CNPH 17.
Nas brássicas a podridão - negra causada por Xanthomonas campestris
pv. campestris é considerada a mais importante doença. A importância
econômica dessas doenças tornam necessários estudos acerca das
interações envolvidas na colonização das plantas hospedeiras e a
caracterização efetiva dos patógenos.
Esta dissertação possui dois objetivos centrais envolvendo duas
espécies de Xanthomonas: X. gardneri e X. campestris pv. campestris.
Primeiramente visa caracterizar enzimaticamente e detectar componentes
químicos de valor taxonômico de Xanthomonas gardneri (Xg), uma das
espécies que podem causar a mancha-bacteriana em tomateiro.
r
Solan
Em
ecótipo CS130
X
XX
ABSTRACT
Bacteria of the Xanthomonas genus cause disease to different crop
plants. Bacterial spot is considered one of the most important diseases
of tomatoes (Solanum lycopersicum L.) and occurs in almost all the
continents and in the different regions of Brazil where tomatoes and
ether different plants, mostly within the Solanaceae
amily, were able to be a host to X. gardneri. The model plant A.
liana was also tested. The second goal was to identify modifications
in the proteome of the A. thaliana resistant ecotype CS1308 in the
presence of Xanthomonas campestris pv. campestris isolate CNPH 17.
peppers are cultivated. In crucifers black-rot caused by Xanthomonas
campestris pv. campestris is considered the most important disease. The
economic importance of these diseases prompts studies about the
interactions between hosts and pathogens as well as a thorough
characterization of the pathogens.
This work has two main goals involving two Xanthomonas species:
X. gardneri and X. campestris pv. campestris. The first goal was to
characterize the enzymatic activity and detect chemical compounds of
taxonomic value of the plant pathogen Xanthomonas gardneri (Xg) one
of the species that can cause the bacterial spot in tomatoes. Furthermore,
it was tested wh
f
tha
XXI
22
1.
INTRODUÇÃO
23
INTRODUÇÃO
O panorama da agricultura no Brasil vem apresentando profundas
transformações nos últimos anos. A tecnologia biológica hoje aparece
como referência e ponto de convergência para o chamado pacote
tecnológico da agricultura produtivista; neste sentido a Biotecnologia
vem causando transformações nas bases da pesquisa agrícola em todas as
suas dimensões. Desta forma, estamos vivendo uma mudança de
paradigma (Salles-Filho & Bonacelli, 2003).
Realizando-se uma análise das tecnologias aplicadas à
agroindústria, pode-se afirmar que a Biotecnologia aplicada à agricultura
seria capaz de mudar essencialmente a produção agrícola mundial. Isto
acontece porque nos primeiros anos deste século, produziram-se avanços
impensáveis quando se trata de inovação biotecnológica, analisando
como as empresas de bioengenharia marcam as pautas da segunda grande
revolução tecnológica da história.
Através da ciência biológica, tem se conseguido superar as
restrições à produção agrícola que são impostas pela natureza. Assim,
através da biotecnologia, conseguiu-se realizar grandes feitos, tais como
alterar o ciclo natural do crescimento das plantas, hoje existe a
possibilidade de que uma espécie de cultivo gere seus frutos várias vezes
durante o período natural da planta, além do desenvolvimento de uma
espécie arbórea ou hortaliças resistentes a determinadas pragas ou
alterações climáticas (Tabieres et al., 2003).
24
Segundo o MAPA (2004) o agronegócio brasileiro é uma atividade
próspera, que atua com modernidade, eficiência e competitividade no
cenário mundial, conferindo segurança e rentabilidade aos investidores.
O Brasil em sua imensidão de terras possui 388 milhões de hectares
agricultáveis férteis e com alto índice de produtividade, sendo que 90
milhões ainda não foram explorados.
O agronegócio representa hoje o maior impulsionador da economia
do país, sendo que um em cada três reais gerados no país é proveniente
da agricultura. Os negócios agrícolas são responsáveis por 33% do
Produto Interno Bruto (PIB), 42% das exportações totais e 37% dos
empregos brasileiros. Contudo, o excelente desevolvimento das
exportações do setor e o crescente surgimento de empregos nesta cadeia
de produção não podem devem ser atribuídos somente à vocação
agropecuária brasileira. O grande desenvolvimento da área científico-
tecnológica, juntamente com a modernização das atividades rurais,
contribuíram de forma uniforme na transformação do país numa das mais
respeitáveis plataformas mundiais do agronegócio.
Nesse sentido, faz-se pertinente os estudos acerca dos
fitopatógenos que acometem as lavouras brasileiras. Neste estudo,
portanto, será dada ênfase ao grupo das xantomonas.
O gênero Xanthomonas caracteriza-se por englobar bactérias
Gram-negativas. Este gênero pertence ao filo Proteobacteria, classe
Gammaproteobacteria, ordem Xanthomonadales e à família
Xanthomonadaceae (Garrity & Holt, 2000, citado por Quezado-Duval,
2003).
25
Bactérias do gênero Xanthomonas produzem pigmentos amarelos,
ligados à membrana da parede celular, semelhantes aos carotenóides que
são referidos como xantomonadinas (Chun, 2002). Esses pigmentos são
únicos para Xanthomonas e são normalmente utilizados como indicadores
quimio-taxonômicos e marcadores para diagnóstico. Aparentemente não
são importantes para o patógeno após a infecção da planta hospedeira,
não protegem as bactérias de nenhum dos mecanismos de radiação UV e
aparentemente não possuem papel na proteção contra danos UV diretos.
Entretanto, não se exclui a possibilidade de protegerem de danos UV
indiretos, mediados por um agente fotosensitivo desconhecido na
superfície da folha. Estudos preliminares indicaram que xantomonadinas
podem proteger as bactérias de danos da luz no espectro do visível na
presença de fotosensitizadores. As xantomonadinas podem providenciar
proteção a danos da luz visível na presença de um fotosensitizador
exógeno: azul de toluidina (Chun, 2002; Poplaswsky et al., 2000).
Nas condições ambientais brasileiras, as xantomonas em geral
sobrevivem em hospedeiros susceptíveis ou em folhas secas no solo, por
pelo menos 30 a 60 dias. Acredita-se que não sobreviva em restos de
cultura incorporados ao solo por um período maior que três meses,
apresentando baixa competitividade com microorganismos antagonistas
ou que tenham maior habilidade saprofítica no solo; pode desenvolver-se
também na rizosfera e em folhas de plantas não hospedeiras.
Desenvolve-se como epífita em folhas de plantas hospedeiras e
sua multiplicação sob condições de baixa umidade ou em ambientes
desfavoráveis, dá condições de sobrevivência ao patógeno, sem que
26
apresente sintomas aparentes da doença. E quando das condições
apresentarem-se favoráveis ocorrem as epidemias.
A bactéria infecta a planta através de estômatos, por
microferimentos resultantes do atrito entre folhas pela ação dos ventos,
ferimentos ocasionais pela ruptura de pêlos foliares ou pelo ataque de
pragas (Wierzbicki, 2004).
As condições ambientais que favorecem a ocorrência e o
desenvolvimento das doenças causadas pelas xantomonas são alta
umidade relativa e temperatura em torno de 22,5ºC a 27,5ºC (Cox et al.,
1965, citado por Wierzbicki, 2004). Doenças causadas por estes
microorganismos, distribuem-se na maioria das regiões produtoras de
tomate e pimentão nos estados brasileiros. Dentre as doenças causadas
por xantomonas, duas delas serão abordadas no decorrer deste trabalho, a
podridão-negra – causada por Xanthomonas campestris pv. campestris
Dowson, e a mancha bacteriana causada por Xanthomonas gardneri.
Diversas plantas são consideradas hospedeiras de Xanthomonas
spp., especialmente as Solanáceas. Os patógenos podem variar quanto à
especificidade do hospedeiro. Esta variação pode ser a nível inter ou
intra-específico. Pode – se encontrar isolados que atacam somente alguns
cultivares da espécie hospedeira (especialização intra-específica). Estes
são agrupados em raças fisiológicas, ou simplesmente raças. A definição
de uma raça, portanto, dá-se de acordo com as reações fenotípicas dos
isolados quando inoculados em uma série de cultivares, denominada de
série diferencial. Esporadicamente, podem surgir isolados mutantes
dentro de uma raça, que apresentam um espectro de patogenicidade
27
alterado, podendo, por exemplo, atacar cultivarem antes resistentes.
Estes isolados são denominados de variantes e o conjunto dos indivíduos
resultantes da propagação assexuada destes é agrupado em um biotipo.
Finalmente, os biotipos podem ser elevados à categoria de raça quando
do estabelecimento de uma série diferencial que os distingam das demais
raças (Camargo, 1995; Jones et al., 1998; Leach & White, 1996).
Os aspectos taxonômicos e evolutivos dos membros do gênero
Xanthomonas associados ao tomate e ao pimentão têm gerado muitas
discussões e controvérsias desde a sua descrição em 1921.
Originalmente, cada variante do gênero que apresentava um hospedeiro
diferente ou produzia sintomas diferentes era classificado como uma
espécie separada (Lobo, Giordano & Lopes, 2004; Vauterin, Rademaker
& Swings, 2000).
A taxonomia bacteriana em geral vem sofrendo mudanças
contínuas e radicais em conseqüência da incorporação sistemática de
métodos de caracterização molecular dos ácidos nucléicos para a
classificação(Takatsu, 2000).
A aparente contradição entre patótipo (variante de um patógeno) e
a diversidade genômica real no gênero torna-se particularmente
verdadeira quando os grupos genômicos (espécies) são analisados mais
contiguamente. A classificação atual do gênero Xanthomonas é baseada
nas subpopulações patogênicas do mesmo. A diversidade real dos
membros fitopatogênicos é provavelmente menor do que o observado até
a atualidade (Vauterin, Rademaker & Swings, 2000).
28
Atualmente encontram-se com genoma completamente seqüenciado
três espécies do gênero Xanthomonas, Xanthomonas axonopodis pv. citri
e Xanthomonas campestris pv. campestris, com sequenciamento
completado no ano de 2002 (da Silva et al., 2002) e Xanthomonas oryzae
pv. oryzae no ano de 2005 (Lee et al., 2005), além de diversas
seqüências parciais e plasmidiais disponíveis nos bancos de dados.
Contudo, ainda se faz necessário realizar-se testes de identificação a fim
de elucidar a posição taxonômica e os possíveis hospedeiros destes
microorganismos, dado que ainda existe uma ampla gama de espécies
dentro deste grupo a serem devidamente identificadas e seqüenciadas.
29
XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS
Assim como a maioria das espécies do gênero Xanthomonas,
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) apresenta como
características morfológicas produção de muco, aparência convexa e têm
a capacidade de produzir a goma de xantana, um polissacarídeo
extracelular (Schaad et al., 2001).
Xcc apresenta patogenicidade às brássicas, e infecta
preferencialmente através de hidatódios. Depois que infectam o
hospedeiro as bactérias se multiplicam, formando então com o
polissacarídeo extracelular (goma de xantana) um biofilme. A formação
do biofilme oferece às colônias de Xcc estabilidade para uma melhor
proliferação bacteriana (Dow et al., 2003).
A doença causada por Xcc, a podridão - negra se desenvolve em
qualquer estágio de desenvolvimento das plantas hospedeiras, e é
possível que a transmissão ocorra através das sementes. Nos períodos
úmidos têm proporcionado quedas consideráveis às culturas de brócolis
(Brassica oleracea var. italica L.), couve-flor (Brassica oleracea var.
botrytis L.) e repolho (Brassica oleracea var. capitata L.), chegando a
até 50% de perda na produção (Peruch et al., 2006).
A podridão é um sintoma próprio de órgãos suculentos. É o estado
dos tecidos em decomposição. Pode ser de dois tipos: seca e úmida, na
dependência da consistência do substrato e, em especial da capacidade
enzimática do patógeno envolvido no parasitismo. Uma eficiente ação
pectinolítica conduz, em regra, a uma rápida e intensa perda de água por
30
parte das células e, por conseguinte, a uma podridão úmida (Ponte,
1980).
A podridão - negra causa lesões amarelas em forma de “V”, com o
vértice voltado para o centro da folha. Nos estágios avançados da doença
as folhas tornam-se amarelas e podem apresentar necrose (Figura 1).
Pode ainda ser observado em alguns casos, subdesenvolvimento, murcha,
queda prematura de folhas e apodrecimento das plantas afetadas (Peruch
et al., 2006).
Figura 1: Sintomas de podridão - negra causada por
Xanthomonas campestris pv. campestris em Brassica
olearaceae (repolho). Setas indicam as lesões. Fonte:
WARWICK HRI, 2007.
31
XANTHOMONAS GARDNERI
A descrição de Xanthomonas gardneri (Xg) é a mesma do gênero
Xanthomonas e usualmente as cepas são isoladas de plantas de tomates
(Solanum lycopersicum L.). Segundo Quezado-Duval (2003), membros
desta espécie podem apresentar patogenicidade tanto a tomate quanto a
pimentão, ou somente a tomate; entretanto, alguns isolados encontrados
na Costa Rica apresentaram patogenicidade somente à pimentão.
Xanthomonas gardneri foi primeiramente descrita na Iugoslávia em
1975 por Sutic e foi inicialmente classificada como Pseudomonas
gardneri. Posteriormente foi considerada por Dye como sinônimo de
Xanthomonas vesicatoria (Doidge) Dows, pois a bactéria não poderia ser
distinguida de X. vesicatoria por procedimentos laboratoriais, sendo que
ambas bactérias produziam doenças similares em tomate. X. gardneri
pode ser distinguida de Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas
perforans, e Xanthomonas vesicatoria por similaridades do DNA
(principalmente por hibridização DNA:rRNA) e por algumas
características fenotípicas (Jones, Stall & Bouzar, 1998).
As xantomonas que atacam tomate podem ser classificadas em
grupos – A a D – dentre outras classificações, que se baseiam em
variações fenotípicas como atividade amilolítica, perfil protéico,
utilização de fontes de carbono, análise de anticorpos monoclonais,
análise de ácidos graxos; além de variações genotípicas como análises
RFLP, elementos repetitivos E hibridização DNA – DNA. Xg possui
fraca atividade amilolítica e pectolítica, tem um padrão distinto de
reação com anticorpo monoclonal 8, e um perfil protéico distinto de SDS
32
PAGE, com uma banda típica de 27kDa. De acordo com esses
parâmetros, X. gardneri pertence ao grupo D das xantomonas causando a
mancha - bacteriana em tomateiro (Quezado–Duval et al., 2004; Jones,
Stall & Bouzar, 1998).
Diferentemente de outras xantomonas associadas ao tomateiro, Xg
não utiliza determinadas fontes de carbono (dextrina, glicogênio, N-
acetil-D-glucosamina, D-galactose, gentibiose, α-D-lactose lactulose,
ácido acético, cis-ácido aconítico, ácido malônico, ácido propriônico, D-
alanina, glicil-L-ácido aspártico, L-arabinose e L-treonina, entre outros).
As cepas de Xg têm atividade metabólica em Tween 40, celobiose, D-
frutose, L-fucose, α-D-glucose, D-manose, D-melibiose, psicose,
sucrose, D-trealose, ácido pirúvico metil éster, ácido succinil mono-
metil éster, ácido α-cetoglutárico, ácido succinil, ácido bromosuccinil,
ácido succinâmico, L-alanimida, L-alanina, L-alanil-glicina, ácido L-
glutâmico e L-serina (Jones et al., 2004; Quezado-Duval et al., 2004).
As manchas, tais como as causadas por Xg, são caracterizadas
principalmente com base na forma, tamanho e coloração (Figura 2). As
manchas individuais, dependendo da suscetibilidade do hospedeiro e das
condições ambientais, podem coalescer e provocar necrose de grandes
áreas do limbo foliar (Bedendo, 1995).
As manchas foliares são sintomas facilmente perceptíveis, embora
o agente causal nem sempre possa ser identificado de imediato. No caso
de doenças bem conhecidas, no entanto, a presença de determinado tipo
de mancha permite a caracterização das mesmas. De uma maneira geral,
as manchas de origem bacteriana aparecem inicialmente como pequenos
33
pontos translúcidos, normalmente referidos como pontos encharcados.
Estes pontos evoluem para áreas maiores também encharcadas. A região
mais central destas áreas começa a sofrer necrose e, posteriormente,
estabelecem-se as lesões necróticas, que podem coalescer e tomar
grandes porções foliares (Bedendo, 1995).
Em relação à forma, são geralmente esféricas, ovaladas, fusiformes
e alongadas; quanto ao tamanho, variam desde pontuações de poucos
milímetros até alguns centímetros. No tocante à cor, predominantemente
são de coloração marrom ou marrom-avermelhado, existindo também
tonalidades de amarelo, púrpura, cinza, preta entre outras. É comum a
observação de um halo amarelado ao redor da mancha. Como
conseqüência da presença de manchas nas folhas, a planta pode
apresentar desfolhamento precoce, queda acentuada de flores e frutos,
subdesenvolvimento e má formação de frutos ou sementes. Plantas,
quando severamente atacadas nos estágios iniciais do crescimento,
podem ser levadas à morte. Através da ação de toxinas e enzimas
hidrolíticas, ocorre a desorganização, morte e decomposição do tecido
atacado, tornando disponíveis os nutrientes necessários ao metabolismo
microbiano. As enzimas normalmente sintetizadas desestruturam a
lamela média e a parede celular e decompõem os constituintes celulares
complexos em substâncias mais simples, prontamente assimiláveis pelo
patógeno (Bedendo, 1995).
34
Figura 2: Sintomas de mancha bacteriana causada por Xanthomonas
sp. em Solanum lycopersicum (tomate). Setas indicam os sintomas
observados. Fonte: Momol et al., 2005.
ARABIDOPSIS THALIANA COMO MODELO DE ESTUDO
Arabidopsis thaliana, da família Brassicaceae, tem sido
intensamente utilizada como planta modelo durante os últimos 15 anos.
Dentre as plantas modelo, Arabidopsis tem sido utilizada extensivamente
para identificar sistemas envolvendo processos de desenvolvimento
vegetal, como formação das flores, organização das raízes, padrão da
formação epidérmica e desenvolvimento do meristema (Irish & Benfey,
2004).
O desenvolvimento, reprodução e resposta ao estresse e doenças
em Arabidopsis são muito semelhantes ao de plantas cultivadas.
35
Cientistas de todo o mundo vêm trabalhando com este organismo
criando-se um sinergismo entre os mesmos (Clauss & Koch, 2006).
Arabidopsis necessita de espaço mínimo para um bom crescimento,
uma planta pode produzir sementes maduras com aproximadamente seis
semanas de vida. Seu cultivo é simples e barato, proporcionando
experimentos genéticos envolvendo centenas de milhares de plantas.
Possui genoma diplóide (aproximadamente 1x10
8
pares de bases), com
pouca repetição de DNA não - codificante; tornando-se um excelente
modelo para análises genéticas.
Uma vez que um gene foi descoberto em Arabidopsis, o gene
equivalente pode ser facilmente encontrado em outras plantas. É
encontrada livre na natureza em toda a Europa, no Mediterrâneo, no
Leste das ilhas africanas, na Ásia Central e Oriental (onde se sugere que
tenha se originado). Teria sido introduzida também na América e
Austrália. Cresce em pastagens e em paredões, ao longo das estradas e
outros lugares comuns (Meyer et al., 2005; Max-Planck Institut, 2006).
A. thaliana possui seu genoma totalmente seqüenciado (The
Arabidopsis Genome Initiative, 2000; Theologis et al., 2000). Bases de
dados apresentam informações sobre A. thaliana, indo desde a seqüência
do seu DNA até mapas genéticos, densamente povoados de marcadores
moleculares e morfológicos. Livrarias de cromossomos bacterianos
artificiais, já seqüenciados e arranjados em “contigs” também estão
disponíveis, facilitando a clonagem de genes conhecidos apenas
fenotipicamente. Existem muitas coleções de ESTs (expressed sequence
tags) disponíveis, dando margem a estudos de diversas questões
36
biológicas. Entretanto, as seqüências de DNA ou proteínas ainda carecem
de informações relevantes acerca de sua funcionalidade. Assim o
paradigma prévio da genética molecular, de se encontrar os genes a
partir das funções biológicas, agora se converte em um paradigma pós-
genômico, onde se buscam as funções biológicas a partir dos genes
(Bouché & Bouchez, 2001; Buell & Somerville, 1997; Quirino & Bent,
2003).
Progressos significantes nas pesquisas moleculares atentam para
expectativas de que ocorra uma aproximação entre o transcriptoma
(análise dos transcritos – mRNA), proteoma ou metaboloma, afim de que
se realize uma análise com uma maior cobertura de genes de herança
simples (Lijsebettens & Montagu, 2005).
Os pesquisadores que trabalham com Arabidopsis têm uma
maravilhosa arma em seu arsenal: a transformação fácil de genes
integrativos de cópia única de sementes em germinação e plantas intactas
quando utilizam vetores de transferência de T-DNA via Agrobacterium.
O poder desta tecnologia é altamente utilizado para a clonagem de
mutantes, e, além disso, é crescente o número de projetos visando
estudar o processo de mutagênese. Desta forma, os métodos têm sido
melhorados por adição de características que facilitam a apreensão do
gene e da habilidade de se produzir um local secundário para a
integração das construções de T-DNA através de seqüências internas de
transposons (Haag, 2007). Bases de dados disponíveis na internet
permitem uma noção das coleções de knouckout de inserções mutacionais
37
em Arabidopsis, principalmente para os ecótipos Columbia e Landsberg,
como o site SIGnAL (2007).
Segundo Alonso et al. (2003), foram encontrados 88.122 setores de
integração de alta qualidade de T-DNA no genoma de Arabidopsis e
determinados sem ambigüidade. Essas análises permitiram identificar
que em 74% dos genes de Arabidopsis existem mutações relacionadas ao
T-DNA, e que com exceção dos transposons não foram encontradas
inserções com polaridade significativa para nenhuma categoria de gene
funcional. Embora o mecanismo preciso de integração do T-DNA no
hospedeiro ainda não esteja completamente elucidado, uma variedade de
proteínas do hospedeiro aparecem desempenhando importantes papéis
não somente no transporte do T-DNA, mas também no processo de
integração deste.
Ainda no contexto de ferramentas disponíveis para o estudo mais
acurado dos genes e seus respectivos produtos de Arabidopsis, contamos
com os microarranjos, que permitem estudar a expressão de centenas de
genes simultaneamente, possibilitando uma compreensão maior dos
processos que ocorrem em determinado tecido. Bases de dados como o
KEGG dispõem de informações que modelam a utilização desses arranjos
gênicos, como os arranjos Affymetrix, tornando possível a comparação
com genes de várias espécies de forma ontológica (Goffard & Weiller,
2007).
A. thaliana tem contribuído imensamente na caracterização
bioquímica dos processos de defesa em uma ampla diversidade de
espécies vegetais, e tem sido utilizada para identificar as proteínas e os
38
sistemas que mediam a transdução de sinais de defesa. Tem sido também
um modelo para estudos de patologia vegetal, tendo resultado na
identificação e mapeamento de loci que conferem resistência a bactérias,
fungos e patógenos virais, assim como a clonagem de genes de
resistência a partir de estudos de interação planta - patógeno (Bouché &
Bouchez, 2001; Buell & Somerville, 1997; Quirino & Bent, 2003).
A maioria dos recursos disponíveis para os sistemas experimentais
em Arabidopsis podem também ser utilizados para se entender a função
de genes e proteínas em plantas economicamente importantes tal como o
tomate e outras brássicas.
CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE XANTHOMONAS
GARDNERI
As plantas superiores são compostas de diferentes células e tipos
teciduais que cumprem funções especializadas e conduzem o crescimento
coordenado, o desenvolvimento e a reprodução do organismo todo.
Funcionalmente, os órgãos vegetais podem ser divididos em tecidos
importadores e tecidos exportadores. As interações importação –
exportação não são apenas importantes para o desenvolvimento normal
das plantas, mas têm um papel crucial durante as interações planta –
patógeno. Para proporcionar uma colonização com níveis satisfatórios de
sucesso das plantas hospedeiras, vários grupos de fitopatógenos como
vírus, fungos ou bactérias têm diferentes estratégias para otimizar o
39
metabolismo da planta em seu benefício (Biemelt & Sonnewald, 2006;
Sergeeva et al.., 2006).
As plantas são os maiores produtores de carboidratos do planeta, e
a maior parte deste material está contida em sua parede celular ou na
matriz extracelular. A parede celular da célula vegetal é uma malha
poliédrica altamente organizada, consistindo primariamente de celulose,
hemicelulose, substâncias pécticas, substâncias aromáticas e proteínas
(Schell et al.., 1988; Koukiekolo et al.., 2005).
A parede celular é uma estrutura dinâmica que contribui para a
morfologia geral da planta; está envolvida na expansão e divisão celular,
e atua também como fonte de reconhecimento de sinais moleculares
provenientes do mesmo ou de diferentes organismos. A regulação da
morfologia e composição da parede celular é importante para a
determinação do tamanho e forma celulares, interações com o ambiente,
resistência mecânica, e defesa contra o ataque de patógenos; além de
estar intrinsecamente envolvida com o crescimento e desenvolvimento da
planta (Minic et al.., 2004; Feiz et al., 2006).
Bactérias fitopatogênicas Gram negativas como espécies de
Pseudomonas, Xanthomonas, Pectobacterium e Ralstonia possuem
estratégias sofisticadas para explorar as reservas nutrientes provenientes
das plantas, invadindo seus hospedeiros através de feridas ou aberturas
naturais como estômatos, hidatódios e lenticelas; colonizando o espaço
intercelular (Biemelt & Sonnewald, 2006).
Dado o pouco conhecimento que se tem acerca da caracterização
de X. gardneri, é interessante que se façam testes para ampliar o espectro
40
de informações sobre a bactéria; principalmente quando se trata da
análise de como este patógeno age para conseguir infectar seus
hospedeiros. Neste sentido têm-se dado grande atenção às enzimas
produzidas para ultrapassar a barreira imposta pela parede celular das
células vegetais.
ENZIMAS EMPREGADAS NA DEGRADAÇÃO DA PAREDE CELULAR
A celulose e a hemicelulose são componentes integrais da parede
celular, já as substâncias pécticas estão localizadas em outras regiões
como no meio da lamela (Schell et a.l, 1988; Koukiekolo et al.., 2005).
Em plantas lenhosas os três maiores constituintes são a celulose (35 –
50%), a hemicelulose (20 – 30%) e a lignina (20 – 30%) (Subramaniyan
& Prema, 2000). A parede celular representa uma zona de proteção para
os componentes ativos que regulam as interações célula – célula; ela
contém proteínas secretadas que desempenham papéis cruciais numa
variedade de respostas de defesa. As proteínas de parede celular mais
bem estudadas são as de função estrutural, incluindo extensinas,
proteínas ricas em glicina, proteínas ricas em prolina, lectinas e
proteínas arabinogalactânicas. Entretanto, ela contém um amplo número
de proteínas não estruturais, incluindo peroxidases, invertases,
proteases, manosidases, galactosidases, glucanases, celulases entre
outras (Oh et al., 2005).
A celulose é a maior fonte de carbono disponível
(aproximadamente 150 bilhões de toneladas de material orgânico é
41
fotossintetizado anualmente). É freqüentemente encontrada em
associação fechada com outros componentes da parede celular, como as
hemiceluloses, lignina e outros polissacarídeos, que tornam a
bioconversão bem mais complicada. A celulose é um polímero não
ramificado, composto por unidades de D - glicose anidro unidos por
ligações 1,4-β-D-glicosídeos (Figura 3), que podem ser hidrolisados por
enzimas celulolíticas produzidas tanto por bactérias como por fungos,
possuem massa molecular entre 50 e 90 kDa. As celulases (Figura 4) de
bactérias, fungos e animais são encontradas na forma monomérica, mas
também podem formar um complexo enzimático multipolimérico
denominado celulossoma. Bactérias celulolíticas incluem espécies
aeróbicas como as Pseudomonas e Actinomicetes, anaeróbicas
facultativas como Bacillus e Cellulomonas, e anaeróbicos estritos como
Clostridium. A possibilidade de uso comercial de preparações de
celulases para a produção de glicose, álcool e proteínas de celulose está
sob estudos intensivos (Heck et al., 2002; Dillon, 2004).
Dow et al. (1990) relata que estudos de patogenicidade com Xcc (o
agente causal da podridão - negra em brássicas) sugerem um papel para
as enzimas extracelulares no processo de desenvolvimento da doença;
afirmam que mutantes incapazes de exportar celulases (EC 3.2.1.4) são
não-patogênicas em todas as plantas utilizadas em estudo.
Alguns estudos acerca da homologia existente entre os organismos
produtores de celulases demonstraram, através das homologias das
seqüências de aminoácidos, que existem grupos distintos de celulases
microbianas, sugerindo que esses organismos possam ter evoluído a
42
partir de mais de um ancestral comum por evolução polifilética (Dillon,
2004).
A hemicelulose é a segunda fração vegetal mais abundante
disponível na natureza. Considera-se hemicelulose a parte facilmente
hidrolisável da parede celular vegetal. São polissacarídeos de baixa
massa molecular que se ligam às microfibrilas de celulose,
principalmente em tecidos lignificados. O polímero é armazenado em
sementes como componente estrutural da parede celular em plantas
lenhosas. Resíduos desperdiçados contêm cerca de 40% de hemiceluloses
formados por açúcares pentose. Os monômeros das várias hemiceluloses
são normalmente utilizados em diferentes antibióticos, álcoois,
alimentação animal, especialidades químicas e combustíveis (Heck et al.,
2002; Filho, 2004). Classificam-se as hemiceluloses de acordo com os
resíduos de açúcares da cadeia principal, sendo que a maioria delas é
formada por heteropolissacarídeos contendo um ou mais diferentes
monômeros de açúcar (Filho, 2004).
As xilanas são os maiores componentes da biomassa vegetal
renovável, e a mais abundante das hemiceluloses. Na parede celular,
encontram-se entre a molécula de lignina e o conjunto de fibras de
celulose. As xilanas da maior parte dos materiais vegetais são
heteropolissacarídeos com um esqueleto homopolimérico linear de β-1,4
ligados com unidades de β-D-xilopiranose que, dependendo da origem,
podem apresentar ramificações contendo principalmente resíduos de
acetil, arabinosil e glucanosil (Filho et al. 1996; Silveira et al. 1999;
Heck et al. 2002; Koukiekolo et al. 2005; Minic et al. 2004).
43
As xilanas podem ser categorizadas como homoxilana,
arabinoxilana, glucoronoxilana, e glucorono-arabinoxilana. Tem sido
proposto que as arabinoxilanas possuem um papel na ligação das
microfibrilas de celulose e podem também regular a expansão celular e a
rigidez da parede celular. Os grupos descritos acima, na xilana atuam
como fatores limitantes na realização de uma hidrólise eficiente do
substrato. A hidrólise completa da hemicelulose requer a interação de um
número de enzimas hemicelulolíticas que tenham a habilidade de clivar
tanto cadeias principais quanto laterais da estrutura, tais como β-
xilanases, β-xilosidases, α-L-arabinofuranosidases, α-glucoronidases e
acetil-esterases (Koukiekolo et al. 2005; Milagres, Magalhães & Ferraz,
2005). As xilanases (EC 3.2.1.8) (Figura 4) são de grande importância
para a produção de papéis, tendo em vista que a hidrólise da xilana
facilita a separação da lignina da massa de papel e reduz o uso de cloro
como agente de branqueamento (Subramaniyan & Prema, 2000).
A pectina é um heteropolissacarídeo coloidal complexo, localizado
na parede celular primária e na lamela média das plantas superiores. É
composta principalmente de resíduos de ácido D-poligalacturônico,
unidos por ligações do tipo α-1,4 e que, de acordo com sua origem e
método de extração, apresentam ramificações de resíduos de ramnose,
arabinose, galactose e xilose (Filho, 2004). Os complexos pectinolíticos
têm sido isolados de plantas, fungos filamentosos e bactérias. As
substâncias pécticas são especialmente suscetíveis à degradação
enzimática, devido à sua maior exposição que os outros componentes da
parede celular. As enzimas que degradam de pectina, as pectinases (EC
44
3.2.1.15) são conhecidas como importantes na patogênese por um número
de bactérias fitopatogênicas, mais notadamente as erwinias que atacam
raízes. As maiores aplicações industriais de enzimas pécticas (Figura 4)
incluem a extração e clarificação de sucos de frutas, processamento de
uvas, tecnologia de produção de vinho, maceração de vegetais e frutas, e
extração de óleos vegetais (Schell et al. 1988; Koukiekolo et al, 2005;
Oliveira et al. 2006).
As bactérias fitopatogênicas crescem nos espaços intracelulares
dos tecidos vegetais, aproveitando-se dos nutrientes disponíveis ali. Nas
plantas superiores, a sacarose (α-D-glucopiranosil β-D-frutofuranosídeo)
é o maior produto da fotossíntese transportado dos órgãos de
armazenamento para os órgãos de dissipação. O processo envolvido no
fluxo armazenamento-dissipação, envolve o carregamento através do
floema, para que a sacarose saia das células do mesófilo e do apoplasma,
e que entre no floema. A sacarose é a forma predominante dos
carboidratos encontrados nos espaços intercelulares dos tecidos
ativamente fotossintetizantes (Kim et al. 2004).
A invertase (β-fructofuranosídeofrutohidrolase, EC 3.2.1.26),
exemplificada na Figura 4, é uma enzima que hidrolisa a sacarose, dando
origem a glicose e frutose em quantidades iguais. É encontrada em
leveduras, invertebrados, vertebrados, algas verdes, bactérias, vegetais
(relacionando-se com o amadurecimento do fruto) e fungos. A fonte
principal de invertase é a levedura Saccharomyces cerevisiae, onde se
encontram duas formas da enzima, uma externa localizada na parede
celular e associada a manana (um carboidrato polimérico) e uma interna,
45
localizada no citoplasma e não ligada a manana. As moléculas ligadas à
parede celular possuem uma seqüência de aminoácidos que as direciona
para o retículo endoplasmático, onde ocorre a glicosilação (inserção de
dez unidades de manana por unidade da enzima na região N-terminal)
(Reddy et al., 1988; Vitolo, 1989, citado por Vitolo, 2004).
46
47
Figura 3: Estruturas químicas dos principais componentes da parede celular vegetal (L-
arabinose, D-xilose, pectina e celulose) e da sacarose.
Figura 4: Estruturas tridimensionais reveladas por cristalografia das enzimas envolvidas na degradação
da parede celular vegetal (Alfa-arabinofuranosidase(1WD4), Xilanase(1HEH), Pectinase(1HG8) e
Celulase(1G9G)) e da Sacarose (Invertase (2AC1)). Imagens disponíveis no banco de dados RSCB PDB
(
htt
p
://www.rcsb.or
g
/
p
db
),
PDB ID indicados nos
p
arênteses.
INTERAÇÃO PLANTA-PATÓGENO
As plantas oferecem um ambiente amplamente nutritivo, e devido a
esta característica, a maioria delas minimiza os danos causados pelos
ataques inevitáveis de organismos fitopatogênicos (fungos, oomicetos,
bactérias, vírus, nematóides).
Em geral, as plantas são resistentes à maioria dos patógenos; e
desta forma, a proteção à maioria dos patógenos é conseguida por
barreiras, como cutículas e compostos antimicrobiais. As respostas de
defesa das células vegetais podem ser autônomas, de forma que cada
célula pode sentir e responder aos ataques de patógenos (Bonas &
Lahaye, 2002; Dangl & Jones, 2001; Jakob et al., 2002). As reações de
defesa são provocadas localmente e em partes distantes do local de início
da infecção; este último fenômeno, conhecido como resistência sistêmica
adquirida, é uma das respostas de defesa vegetal induzida mais estudada
(Kachroo et al., 2003).
As plantas possuem uma grande variedade de respostas de defesa
quando atacadas por um microorganismo patogênico, incluindo o reforço
das paredes celulares através da lignificação ou a deposição de calose, a
produção de compostos antimicrobianos como as fitoalexinas e enzimas
hidrolíticas, ou mesmo a expressão de proteínas relacionadas à patogênse
de funções ainda desconhecidas. Em alguns casos particulares de
interação planta – patógeno muitas (ou todas) as respostas de defesa do
hospedeiro podem ser ativadas, tornando difícil de determinar a
48
importância relativa de diferentes respostas dos hospedeiros em resposta
ao ataque de um patógeno específico (Reuber et al., 1998).
Normalmente, os microorganismos são de tamanho mínimo, o que
lhes permite passar através dos estômatos e outras portas naturais até o
apoplasto – considerado a ante-sala das riquezas nutritivas das plantas.
Os colonizadores do apoplasto são os patógenos que comumente
produzem sintomas como anéis amarelos, cancros, e virtualmente afligem
todas as plantas cultivadas. Sua relação com o hospedeiro é definida
através de duas características; eles gastam sua vida parasitando através
da parede de células vegetais, nos espaços intracelulares de vários
órgãos das plantas ou no xilema, e eles são necrogênicos – são capazes
de causar a morte das células vegetais. A sua habilidade de se
multiplicar e posteriormente causar a morte celular depende das enzimas
secretadas que degradam a parede celular ou moléculas que conseguem
atravessá-la (Alfano & Collmer, 1996).
Fitopatógenos Gram-negativos, tais como as xantomonas, são todos
capazes de causar necrose, entretanto a agressividade dos sintomas pode
variar significantemente. Cepas de Xanthomonas campestris e
Pseudomonas syringae têm seus patovares definidos pela especificidade
aos hospedeiros e associados às características fenotípicas e, às vezes
associados também às raças dentro de patovares baseados em interações
com cultivares diferenciais do hospedeiro (Alfano & Collmer, 1996).
Tem-se conhecimento de que Xanthomonas campestris pv.
campestris (Xcc) é um dos agentes causais da podridão - negra em
brássicas e da podridão - negra em repolhos. X.campestris pv. campestris
49
infecta um amplo número de espécies da família Brassicaceae, incluindo
Arabidopsis, e é globalmente considerada como uma doença
economicamente importante das brássicas. Estudos da resistência de Xcc
em relação a Brassica spp. indicaram que a resistência à podridão - negra
pode ser uma herança monogênica clássica ou de herança poligênico
(Buell & Somerville, 1997; Meyer et al., 2005). Xcc tem sido estudada
em detalhes para algumas características como organismo modelo para
investigação da fitopatogenicidade genética bacteriana (Crecy-Lagard et
al., 1990).
O progresso feito na elucidação das interações planta-patógeno
utilizando Arabidopsis como modelo tem sido refletido em diversos
trabalhos desenvolvidos na área. Emerge o interesse em utilizar
populações naturais de A. thaliana e seus patógenos para entender a
evolução e dispersão dos genes de resistência na natureza (Abel et al.,
2000). Em vista de se compreender melhor as interações planta-patógeno
e realizar análises pós-genômicas, é desejável que se desenvolvam
trabalhos com espécies modelo e assim se propõem patossistemas
alternativos, como Arabidopsis – Xanthomonas.
Em estudo preliminar da interação entre Arabidopsis e o
fitopatógeno Xanthomonas campestris pv. campestris, o ecótipo CS 1308
de A. thaliana apresentou-se mais resistente ao ataque da bactéria entre
os ecótipos estudados. Este não é um ecótipo dos mais comumente
estudados, e ainda carece de informações acerca das interações
moleculares que ocorrem no momento do ataque bacteriano. Deste modo,
diversas vertentes de estudo podem ser exploradas, além de aspectos
50
moleculares visando maior compreensão desse sistema biológico (do
Carmo et al., 2007).
ANÁLISE PROTEÔMICA DA INTERAÇÃO-PLANTA PATÓGENO
Dada a importância que a agricultura possui na economia nacional,
existe uma preocupação constante dos produtores com a possibilidade de
que algum fitopatógeno se instale e prolifere em suas lavouras, afetando
a qualidade e a quantidade do seu produto. Nesse sentido, a compreensão
molecular da interação planta-patógeno poderá trazer novas perspectivas
no desenvolvimento de plantas resistentes (Quirino & Bent, 2003).
A proteômica é a análise global dos produtos de um gene em vários
tecidos e estados fisiológicos das células e permite a quantificação e
subseqüente identificação de centenas de proteínas de um organismo;
tornou-se muito importante no campo da genômica funcional, agora que
conta-se com diversos genomas seqüenciados completamente e métodos
analíticos para o desenvolvimento da caracterização protéica. O
proteoma de um organismo pode ser definido como o complemento de
proteínas de um órgão em particular, tecido, tipo celular ou organela
num determinado estágio do desenvolvimento deste (Oh et al., 2005;
Hochholdinger et al., 2006; Komatsu & Yano, 2006).
Enquanto o genoma é relativamente estático, o proteoma é
altamente dinâmico e responde a eventos celulares internos e externos.
As respostas podem incluir mudanças não somente relativas à
abundância, mas também a modificações pós – traducionais de cada
51
proteína ou interações proteína – proteína (Komatsu & Yano, 2006;
Ephritikhine et al., 2004). A identificação dos produtos gênicos preditos
em nível protéico realiza uma ligação entre os dados dos genomas
seqüenciados e as funções protéicas (o que chamamos de genômica
funcional). Muitos dos genes estimados em um genoma são associados a
múltiplos produtos protéicos, que podem ser resultado de splicing
alternativo ou de modificações pós – traducionais. Uma vez que uma
proteína foi produzida, ela pode ser submetida a arranjos com mudanças
incríveis que levam a enormes implicações nos processos biológicos
(Pandey et al., 2006; Peck, 2005).
A proteômica tem sido vista como uma importante ferramenta para
a investigação de processos celulares e redes funcionais. Engloba um
conjunto de tecnologias amplamente úteis no estudo dos sistemas
biológicos, permitindo a análise de um grande número de proteínas ao
mesmo tempo.
A proteômica aparece como uma promessa revolucionária em
termos de tecnologia e análise dos sistemas vivos. Se os genomas e os
microarranjos deram um vislumbre do que existe dentro dos organismos
vivos, a proteômica irá buscar a elucidação dos mecanismos envolvidos
no metabolismo celular. Contudo é sabido que não será tarefa fácil de
realizar – o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na síntese e
maturação das proteínas - tendo em vista que as proteínas são
notadamente mais diversas em suas propriedades que os ácidos
nucléicos, por exemplo (Peck, 2005).
52
Uma dificuldade geral associada aos procedimentos experimentais
de extração de proteínas é o seu alto grau de heterogeneidade estrutural e
fisicoquímica. Desta forma, não é possível se extrair e solubilizar o
proteoma por completo de um tecido com um simples protocolo de
extração, devido especialmente as dificuldades associadas com a
solubilização de proteínas hidrofóbicas associadas à membrana; e além
disso não existem tecnologias disponíveis capazes de promover a
amplificação de proteínas que são encontradas somente em pequenas
quantidades, e que – em sua maioria – apresentam grande interesse
biológico (Hochholdinger et al., 2006).
Em termos de proteômica de plantas, Arabidopsis tem sido
utilizada como o melhor sistema atualmente. Com o recente avanço dos
projetos de sequenciamento de genomas, milhares de proteínas
conhecidas ou hipotéticas têm sido identificadas nas sequências
genômicas vegetais, o que vem oferecendo importantes informações
sobre a localização celular das proteínas, de componentes de complexos
protéicos, identificação de componentes envolvidos no metabolismo da
célula vegetal, entre outros (Ephritikhine et al., 2004).
A análise protéica pode ser realizada tipicamente de duas formas.
Podem ser separadas por SDS-PAGE ou eletroforese bidimensional,
seguida de identificação por espectrometria de massa (MS).
Alternativamente, as proteínas podem ser identificadas diretamente por
cromatografia líquida (LC) – MS/MS (Peck, 2005).
Para estudos com poucas proteínas, a identificação baseada em
espectrometria de massa tem sido bem sucedida utilizando-se amostras
53
de uma série de espécies que ainda têm sua sequência genômica limitada.
Para experimentos com amostras mais complexas, como um experimento
em larga escala LC – MS/MS, somente experimentos utilizando-se
Arabidopsis ou arroz (Oryza sativa) podem explorar completamente a
tecnologia proteômica disponível (Peck, 2005).
O progresso na proteômica vegetal foi possibilitado pelas
ferramentas de análise através da eletroforese bidimensional (2D) (Oh et
al., 2005).
Na primeira dimensão, as proteínas são separadas por focalização
isoelétrica, que distingue as proteínas em função da sua carga. Na
segunda dimensão, as proteínas são separadas por massa molecular. O
gel pode ser corado com Azul de Comassie ou com prata para tornar as
proteínas visíveis. Pontos mais escuros (spots) no gel são proteínas que
migraram para locais específicos. Recentemente, a proteômica tem sido
ajudada pela espectrometria de massa. O mapeamento de massa identifica
uma proteína fragmentando-a em peptídeos curtos e deduz depois a
identidade da proteína através da comparação entre as massas observadas
dos peptídeos e uma base de dados de seqüências (Andrade et al., 2005;
Baginsky & Gruissem, 2006).
Um dos avanços mais significantes em proteômica através dos anos
de pesquisa foi o desenvolvimento de opções para se realizar
comparações quantitativas entre amostras. Experimentos com sistemas
estáticos – seqüenciamento de proteínas de uma organela isolada ou com
uma modificação pós – traducional particular – podem prover
informações valiosas, que podem ser refinadas com análises de softwares
54
específicos para bioinformática. Entretanto, o alvo das pesquisas mais
recentes têm sido os experimentos comparativos: qual a composição
protéica de uma organela ou uma população de proteínas com uma
mudança pós - traducional durante uma resposta biológica. No caso de
análises comparativas, pode-se comparar o proteoma de dois genótipos
diferentes de um organismo (selvagem x mutante), diferentes estágios de
desenvolvimento de um mesmo genótipo podem ser analisados de
maneira temporal, ou um genótipo em comum pode ser comparado antes
e depois da aplicação de um estímulo exógeno abiótico ou biótico. As
análises proteômicas das respostas a estímulos bióticos, como o ataque
de patógenos ou simbiose, têm sido recentemente descritos (Peck, 2005;
Hochholdinger et al., 2006).
A análise proteômica tornou-se uma fonte indispensável de
informações acerca da expressão de proteína, variantes de splicing, e a
predição errônea ou incompleta da estrutura de genes nas bases de dados
(Pandey et al. 2006).
Estudos publicados retratam as interações planta – patógeno
focando as mudanças moleculares relacionadas ao ataque do patógeno
e/ou à resposta da planta. Diversas moléculas sinalizadoras podem ser
identificadas na planta, assim como fatores de virulência e avirulência
podem ser identificados nos microorganismos. Apesar de A. thaliana e
Xcc possuírem o genoma totalmente seqüenciado, pouco se sabe acerca
das proteínas codificadas, da expressão de proteínas da planta hospedeira
quando sob invasão do patógeno; deste modo, é economicamente viável e
55
interessante que se realize o estudo proteômico de suas relações (Marra
et al., 2006; Andrade et al., 2005).
Em estudos prévios (do Carmo et al. 2007) foi analisada a resposta
de 33 diferentes ecótipos de A. thaliana a um isolado brasileiro de Xcc,
identificando o ecótipo CS1308 como resistente à infecção por Xcc,
tornando-se pertinente investigar as alterações proteômicas do mesmo
quando inoculado com Xcc. A análise proteômica permitirá o estudo
global das proteínas expressas quando da interação da planta com a
bactéria.
56
2.HIPÓTESES
57
H
IPÓTESES
Em relação a X. gardneri:
• Xanthomonas gardneri representa um membro verdadeiro do
gênero Xanthomonas.
• Xanthomonas gardneri é capaz de infectar diferentes plantas
hospedeiras, incluindo a planta modelo A. thaliana.
• Há a secreção diferencial de proteínas de X. gardneri quando em
interação com a parede celular vegetal, em comparação ao
crescimento do patógeno em meio destituído de fonte de carbono.
3.2. Em relação a X. campestris pv. campestris:
• O ecótipo resistente a Xcc CS1308 de A. thaliana é capaz de
alterar seu padrão de expressão protéica ao interagir com o
patógeno Xcc. A identificação de tais proteínas pode auxiliar no
entendimento de como este ecótipo é capaz de se defender contra o
patógeno.
58
3.OBJETIVOS
59
O
BJETIVOS
1. Avaliar a presença de xantomonadinas em X. gardneri utilizando
cromatografia.
2. Avaliar a resposta de A. thaliana e outras espécies de solanáceas a
X. gardneri.
3. No caso de A. thaliana ser hospedeira de X. gardneri, avaliar a
reação de diferentes ecótipos de A. thaliana à infecção por X.
gardneri.
4. Caracterizar a atividade enzimática de proteínas secretadas por X.
gardneri ao interagir com paredes celulares vegetais de diferentes
composições.
5. Comparar o proteoma do ecótipo resistente de A thaliana CS1308
na ausência e na presença de Xcc e identificar proteínas
diferencialmente expressas.
60
4. METODOLOGIA
61
METODOLOGIA
ORIGEM DOS ISOLADOS DE XANTHOMONAS GARDNERI E CONDIÇÕES
DE CRESCIMENTO
A cepa CNPH467 de X. gardneri (IBSBF 1782 da Coleção de
Culturas Fitopatogênicas do Instituto Biológico, Campinas, Brasil) foi
obtida de uma lavoura de tomate para processamento industrial
apresentando sintomas de mancha-bacteriana em Morrinhos, Estado de
Goiás, Brasil, em 1998, e gentilmente cedida pela Dra. Alice Maria
Quezado-Duval (Embrapa Hortaliças) como descrito previamente
(Quezado-Duval et al.. 2004). Três outros isolados de X. gardneri
também foram obtidos de tomates para processamento no estado de
Goiás. Os isolados 2006-17 e 2006-21 foram obtidos no ano de 2006,
ambos na cidade de Goiânia, e o isolado 334-T foi obtido em 1997 na
cidade de Itapaci. No decorrer dos experimentos os isolados foram
estocados em tampão Fosfato pH 7.0 (1.5 g/L K
2
HPO
4
, 1 g/L KH
2
PO
4
) à
temperatura ambiente.
O isolado de X. campestris pv. campestris CNPH77 foi utilizado
como controle positivo (Willian et al.. 1980; Simpson & Johnson 1990).
O isolado de Xanthomonas vesicatoria 89-T foi utilizado como controle
negativo, ambos para o ensaio de detecção de xantomonadinas.
Antes dos experimentos, as cepas bacterianas foram recuperadas
através de plaqueamento em meio Agar Nutriente (NA). As placas foram
mantidas em incubadora sem agitação à 28ºC, quando retiradas do
estoque em glicerol 20% à -80ºC, por 4 dias de incubação. Quando
62
retiradas do estoque em Tampão Fosfato pH 7,0 e à temperatura ambiente
(aproximadamente 25ºC), foram mantidas sob incubação por 2 – 3 dias.
Quando houve necessidade de se crescer Xg em meio mínimo, como no
caso dos ensaios enzimáticos, utilizou-se o meio mínimo descrito por
Dye, (1966), adicionando-se especificamente a fonte de carbono desejada
para análise.
IDENTIFICAÇÃO DE XANTOMONADINAS
Xantomonadinas foram extraídas como descrito por Schaad et al
(2001). Foram inoculadas em placas de meio NA colônias puras de Xcc
CNPH77, e dos isolados de Xg CNPH467, 2006-17 e 334-T. As placas
contendo Xg foram incubadas por 96 horas a 28ºC. As placas com Xcc
foram incubadas por 48 horas a 28ºC.
Depois de atingido o tempo de crescimento ideal para cada bactéria,
as bactérias foram ressuspendidas em 3 – 5 mL de metanol e
acondicionadas em tubos falcon de 15 mL; sendo em seguida diluídas até
que se obtivesse a O.D. de 0,5 a 600 nm. Os tubos foram colocados em
água fervente até que o pigmento fosse removido das bactérias (ou seja,
quando a solução adquirisse a coloração amarela). As amostras foram
centrifugadas a 11760 g por 15 minutos para remoção das partículas
celulares. O sobrenadante foi então decantado e evaporou-se o metanol
com o auxílio do evaporador Speed Vac a 60ºC, até que a densidade
óptica atingisse aproximadamente 0,4 em 443 nm.
Para realização da cromatografia de camada delgada, foi utilizada a
Cromatofolha – Alumínio CCF, 20 x 20 cm Silicagel 60 Merck KGaA.
63
Um total de 25 μl de cada amostra foi aplicado na cromafolha de TLC.
Na cuba de vidro foram colocados aproximadamente 300 mL de metanol
(J.T. Baker, México) para atuar como solvente. O solvente migrou por
aproximadamente 10 cm e o experimento foi finalizado. O valor de Rf
foi calculado para cada pigmento amarelo observável. A presença de
pigmento amarelo com Rf de 0,45 (0,42 – 0,49) é indicador da presença
de xantomonadinas. O experimento foi repetido três vezes para
conferência dos resultados.
CARACTERIZAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE X. GARDNERI A DIFERENTES
ANTIBIÓTICOS
O isolado CNPH467 de Xg foi crescido previamente em meio NA
durante 48h, a 28ºC, e em seguida a cultura bacteriana foi ressuspendida
em água não destilada, autoclavada e a concentração ajustada para
aproximadamente 5 x 10
3
UFC/mL (Unidades Formadoras de Colônia)(
com A
600nm
=0,3).
As placas de meio NA com antibiótico foram preparadas
previamente (suplementando-se o meio NA com a concentração adequada
de antibiótico; vide Tabela 2. Em cada placa foram espalhados 500 µL de
solução bacteriana, as placas foram incubadas por 48h, à 28ºC,
procedendo-se em seguida com a contagem das colônias formadas. O
teste foi realizado em triplicata.
64
CARACTERIZAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE ARABIDOPSIS THALIANA À
XANTHOMONAS GARDNERI
A) Crescimento de Plantas
Os ecótipos de A. thaliana foram crescidos em substrato Plantmax
Hortaliças HT® (Eucatex Agro, Paulínia, SP) em condições de
iluminação fluorescente para dias curtos (16h escuro/ 8h luz) com
aproximadamente 100 m
-2
s
-1
, temperatura de 24ºC e umidade relativa em
torno de 50%. Sementes plaqueadas em meio MS ¼ (Sigma, St. Louis,
MO, E.U.A.) foram embebidas e colocadas a 4ºC por dois dias para
quebra de dormência, sendo em seguida transferidas para germinarem na
presença de luz. As plantas com cinco semanas pós-germinação foram
utilizadas nos experimentos.
Foram crescidas doze diferentes plantas da família Solanaceae, em
casa – de - vegetação localizada na Embrapa Hortaliças – CNPH,
Brasília, e posteriormente inoculadas com Xg para análise de
suscetibilidade.
B) Inoculação de X. gardneri em plantas de A. thaliana e
espécie de Solanaceae
Para os ensaios de inoculação das folhas de A. thaliana e das
solanáceas, foram testadas as concentrações de 5 x 10
6
, 5 x 10
7
e 5 x 10
8
65
UFC/mL de suspensão bacteriana. Para o experimento folhas de A.
thaliana foram inoculadas com a utilização de seringas de 1 mL com uma
suspensão de X. gardneri de 5 x 10
8
UFC/mL na face abaxial das folhas.
Plantas controle foram inoculadas com tampão 10 mM MgCl
2
. Plantas de
tomate (cv. Bonny Best) foram utilizadas como controle positivo para
virulência bacteriana. Para analisar as plantas inoculadas, foi utilizada
uma escala de sintomas, como ilustrado na Tabela 1.
Tabela 1: Grau de severidade de sintomas de X. gardneri em plantas de
A. thaliana
Grau de Severidade Sintomas Morfológicos
0 Sem sintomas aparentes.
1 Raras lesões isoladas.
2 10% da parte inoculada com
amarelecimento.
3 50% da parte inoculada com
amarelecimento.
4 Necrose mas áreas
fotossintetizantes ainda presentes.
5 Necrose total.
Para o teste de patogenicidade de espécies de Solanáceas (Tabela
4), uma planta foi utilizada como controle e não recebeu a suspensão
bacteriana; duas plantas foram borrifadas com a suspensão bacteriana, na
concentração de 5 x 10
8
UFC/mL nas folhas.
66
Posteriormente, foram cobertas com sacos plásticos umedecidos
internamente com água para proporcionar maior umidade. Uma planta foi
inoculada com a utilização de seringas, infiltrando a suspensão através
da face abaxial das folhas, no mínimo 3 (três) folhas de cada planta
foram inoculadas.
O aparecimento de sintomas nas plantas foi monitorado à partir de
dois dias após a inoculação.
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS SECRETADAS POR XANTHOMONAS
GARDNERI
Para se realizar a quantificação de proteínas produzidas por X.
gardneri crescida em Meio Dye (1966) foi utilizado o método descrito
por Bradford (1976). A quantificação foi realizada em triplicata.
O controle negativo foi feito substituindo-se a amostra por 100 μL
de água destilada. Em cada tubo de ensaio foram colocados 100 μL de
amostra e adicionado 1 mL do reagente de Bradford. Deixou-se reagir
por 5 minutos e procedeu-se a leitura da absorbância a 595 nm. Em
seguida foi calculada a média dos valores obtidos. Os valores obtidos
foram aplicados em equação linear obtida por uma curva padrão de BSA.
O valor da quantidade de μg de proteína/ 100 μL) foi encontrado e em
seguida convertido para μg de proteína/ 1 mL (1000 μL).
Para quantificação de proteínas das amostras de folhas de
Arabidopsis inoculadas com Xcc e com tampão 10 mM MgCl extraídas
2
67
pelo protocolo proposto por Wang et al.. (2003), foi utilizado BCA
Protein Assay Kit (Pierce, EUA), seguindo-se as instruções do
fabricante. Realizou-se a análise com a amostra sem diluição, com
diluição 1:2 (50µL da amostra + 50µL de tampão de ressuspensão) e 1:5
(20µL da amostra + 80µL de tampão de ressuspensão).
Foi colocado 25µL de cada controle (Soroalbumina bovina nas
concentrações: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 e 1,2 µg/mL) ou da amostra em
tubos de polipropileno de 1,5 mL, e em seguida adicionou-se 500 µL de
solução BCA Working Reagent (WR), procedendo-se com a incubação
dos tubos à 37ºC por 30 minutos. Após 30 minutos de reação, foi
realizada a leitura da absorbância a 562 nm na mesma ordem em que se
iniciou as reações. Os valores de absorbância obtidos foram utilizados
para o cálculo de concentração protéica a partir da equação da curva
padrão obtida com os valores de referência.
CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE XANTHOMONAS
GARDNERI
X. gardneri, isolado CNPH 467 foi crescida em placas com meio
Ágar Nutritivo (NA) a 28ºC em incubadora sem agitação por 2 – 3 dias.
Após detectado crescimento bacteriano em placa, parte da cultura
bacteriana foi inoculada em 250 mL de meio Caldo Nutritivo (mesma
composição do ágar nutritivo, mas sem o ágar), e deixada em incubadora
com agitação de 180 rpm à 28
o
C por 2 – 3 dias.
68
Posteriormente, foi retirada uma alíquota (3 – 4 mL) e adicionada
ao meio mínimo com os respectivos substratos (farelo de trigo, papel
filtro, folhas e apenas meio mínimo), até que se obtivesse a densidade
óptica de 0,1 a 600 nm. As folhas foram cortadas em pedaços de
aproximadamente 0,5 cm, lavadas com água destilada e em seguida
adicionadas ao meio. Posteriormente, o meio adicionado das folhas foi
autoclavado. O mesmo procedimento foi adotado para os tratamentos
com farelo de trigo e papel filtro (cortado em pedaços de 0,5 cm x 0,5
cm aproximadamente).
Em seguida, X. gardneri foi crescida novamente com agitação de
180 rpm em 50 mL de meio Dye (1966) ou meio contendo 0,5% (m/v) de
farelo de trigo, 0,5% (m/v) de papel filtro, 1,0% (m/v) de folha de A.
thaliana (ecótipo CS 903)..
Amostras de sobrenadante foram retiradas nos tempos 0 h, 12 h, 24
h, 36 h, 48 h, 60 h e 72 h após a inoculação do meio com X. gardneri e
utilizadas como fonte de enzimas.
Para obtenção do sobrenadante de Saccharomyces cerevisiae, 0,5 g
da levedura foi macerado em 10 mL de tampão 50 mM pH 5,0 acetato de
sódio e posteriormente centrifugado por 25 minutos a 8400 g, coletando-
se então o sobrenadante. As alíquotas foram armazenadas em
refrigerador –20
o
C até a realização dos testes de atividade enzimática.
Para controle positivo para os ensaios de celulase, xilanase,
pectinase e α-arabinofuranosidase foi utilizado o extrato bruto do fungo
Tricoderma harzianum, previamente preparado no laboratório de
69
Enzimologia da Universidade de Brasília (UnB). O controle negativo foi
feito utilizando – se água destilada.
As amostras de sobrenadante de X. gardneri (10 mL) foram
liofilizadas e ressuspendidas em 2 mL de água destilada, obtendo-se uma
concentração 5 vezes maior que a inicial. Para a quantificação protéica
também foram utilizadas as amostras liofilizadas.
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE CELULASE
A atividade de celulase foi determinada como descrito por Lowe et
al. (1987). Papel filtro foi utilizado como substrato. O papel foi cortado
em tiras de 6 x 1 cm (50 mg), adicionou-se 1 mL de tampão pH 7,2
fosfato de sódio, em seguida 1 mL do sobrenadante da cultura bacteriana
nos diferentes substratos (papel filtro, folhas, farelo de trigo e meio
mínimo), em cada um dos tempos de crescimento. Os tubos foram
incubados a 45
o
C por 4 horas. A reação foi interrompida pela adição de 1
mL do reagente de DNS. Após a adição do DNS os tubos foram fervidos
por 10 minutos. A absorbância a 550 nm foi medida. O espectrofotômetro
foi zerado com água destilada. Os valores obtidos foram convertidos em
UI (Unidades enzimáticas - quantidade de enzima que. catalisa a
formação de 1. µ. mol. de produto por minuto).
70
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE α-ARABINOFURANOSIDASE
O ensaio para α-arabinofuranosidase para X. gardneri, foi
realizado de acordo com o protocolo sugerido por Filho et al. (1995).
Brevemente, incubou-se 0,5 mL de tampão 100 mM pH5,0 acetato de
sódio, 100 μL de substrato (p-nitrofenol arabinofuranosídeo) e 400μL de
sobrenadante, a 50
o
C por 15 minutos em banho-maria. A reação foi
interrrompida pela adição de 1 mL de carbonato de sódio e procedeu-se a
leitura da absorbância a 410 nm. Um aumento de 0,1 na absorbância
corresponde a 1U (Unidade enzimática).
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE PECTINASE
O ensaio de pectinase para X. gardneri, foi realizado de acordo
com o protocolo descrito por Soriano et al. (2005). Brevemente, foram
incubados 50 μL de sobrenadante das culturas bacterianas, 75 μL de
tampão 50mM pH 5,0 acetato de sódio, contendo 0,12 M de NaCl e 6 mM
EDTA, e 125 μL de substrato (0,4% (m/v) de ácido poligalacturônico) e
incubado por 1 hora a 45
o
C. A reação foi interrompida com a adição de 1
mL do reagente de DNS. Foi realizada a leitura da absorbância a 520 nm.
Os valores obtidos foram convertidos para UI.
71
DETERMINAÇÃ DA ATIVIDADE DE XILANASE
O ensaio enzimático para detecção de atividade xilanolítica em X.
gardneri foi realizado sob a temperatura de incubação de 50
o
C, durante
30 minutos, utilizando-se xilana from at spelts a 1% (m/v) como
substrato. Para cada amostra foram incubados 50 μL de sobrenadante por
3 minutos no banho-maria a 50
o
C. Em seguida adicionou-se 100 μL de
xilana 1% (m/v) e incubou-se por 30 minutos. Adicionou-se então 300
μL do reagente de DNS a fim de interromper a reação e detectar o
produto da reação. Os tubos foram fervidos por 10 minutos e adicionou-
se 1,5 mL de água destilada a cada tubo. Foi realizada a leitura da
absorbância a 540 nm. O ensaio foi realizado em triplicata e os valores
obtidos convertidos para UI.
Para a realização de controle negativo foi utilizada água
destilada no mesmo volume das amostras analisadas.
Para a preparação da xilana 1% (m/v) utilizou-se 1 g de
xilana, 20 mL de NaOH 1 M e deixou-se sob agitação durante 30
minutos. Adicionou-se 20 mL de HCl e deixou-se sob agitação durante
30 minutos, em seguida o volume foi completado para 100 mL com
tampão 100 mM pH 5,0 acetato de sódio e agitou-se por mais 30 minutos.
Posteriormente centrifugou-se a mistura por 15 minutos a 8400 g. O
sobrenadante foi coletado e mantido no refrigerador a –20
o
C.
72
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE INVERTASE
Para a detecção da atividade de invertase (sacarase) para X.
gardneri, foi realizado ensaio enzimático com amostras crescidas em
farelo de trigo 0,5% (m/v) e folhas de Arabidopsis 1 % (m/v). Foi
utilizado como substrato para o ensaio sacarose 0,4% (m/v) em tampão
acetato de sódio 50 mM pH 5,0, perfazendo um total de 950 μL para cada
amostra, previamente incubado por 2 minutos a 37
o
C e em seguida
acrescentado 50 μL do sobrenadante. Para os controles negativos,
adicionou-se 1 mL do reagente de DNS antes do sobrenadante. Os tubos
foram incubados por 20 minutos a 37
o
C. Para parar a reação foi
adicionado 1 mL de DNS e ferveu-se os tubos por 5 minutos. Após
esfriar, adicionou-se 2 mL de água destilada e realizou-se a leitura da
absorbância a 550 nm. Os valores de absorbância foram convertidos para
UI. Como controle positivo utilizou-se o sobrenadante da levedura
Saccharomyces cerevisiae.
73
ANÁLISE PROTEÔMICA DA INTERAÇÃO-PLANTA PATÓGENO
EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FOLHAS DE ARABIDOPSIS
INOCULADAS COM
XCC E COM TAMPÃO 10 MM MGCL
2
Para extração das proteínas totais das folhas de Arabidopsis do
ecótipo CS1308 inoculadas com Xcc e com tampão 10mM MgCl2
(controle), foi utilizado o protocolo proposto por Wang et al. (2003),
com algumas modificações.
As folhas (inoculadas e controle) foram previamente maceradas em
nitrogênio líquido e o tecido aliquotado em tubos de polipropileno de 2
mL contendo 0,2 g de tecido em cada. Em seguida, as amostras foram
ressuspendidas em 2 mL de acetona gelada, agitadas por 30 segundos e
posteriormente centrifugadas a 11760 g por 5 minutos.
Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o procedimento
anterior foi repetido duas vezes. Após o descarte do sobrenadante,
adicionou-se 1 mL de TCA 10% (m/v) em acetona gelada, centrifugou-se
por 5 minutos a 11760 g e o sobrenadante descartado, sendo esta etapa
repetida até a remoção completa do pigmento (clorofila).
As amostras foram lavadas duas vezes com TCA 10% (m/v) em
água gelada, centrifugadas como na etapa anterior e o sobrenadante
descartado por duas vezes. O precipitado formado foi lavado duas vezes
com 1 mL de acetona 80% (v/v) gelada.
O precipitado formado na etapa anterior foi então ressuspendido
em 0,8 mL de fenol tamponado com Tris pH 10.5 (Sigma – Aldrich,
74
EUA) e 0,8 mL de tampão de solubilização (30% (m/v) sacarose, 2%
(m/v) SDS, 0,1 M Tris – HCl pH 8,0 e 0,5% (v/v) de β-mercaptanol). A
mistura foi então agitada e em seguida centrifugada a 11760 g por 5
minutos.
A fase fenólica foi então coletada e centrifugada novamente para
retirada de eventuais contaminações e aliquotada em tubos de
polipropileno em frações de 200µL cada. Adicionou-se cinco (5) volumes
de 0,1 M de acetato de amônio em metanol gelado, as amostras foram
então acondicionadas em refrigerador -20ºC para precipitação das
proteínas durante 60 minutos.
Após o período de precipitação, centrifugou-se as amostras a
11760 g durante 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. O
precipitado foi lavado com 0,1 M acetato de amônio em metanol gelado
por duas vezes e em acetona 100% gelada também por duas vezes.
Aguardou-se a evaporação da acetona com os tubos abertos à temperatura
ambiente e em seguida estes foram estocados em refrigerador -20ºC.
Para análise em gel bidimensional, todos os precipitados
resultantes da extração foram previamente ressuspendidas em tampão de
ressuspensão (2% (m/v) SDS, 5% (v/v) glicerol e Tris-HCl pH 8,0) e
concentradas em um único tubo. Posteriormente, realizou-se a
quantificação colorimétrica das proteínas utilizando-se o BCA Protein
Assay Kit (Pierce, E.U.A.).
Após a quantificação, 300 µg de cada amostra foi precipitada com
TCA 75% (m/v) durante 45 minutos acondicionadas em gelo, em seguida
as amostras foram centrifugadas à 11760 g por 15 minutos, o
75
sobrenadante foi descartado e adicionou-se 1 mL de acetona 100% (v/v)
gelada centrifugando-se novamente por 15 minutos. A acetona foi
descartada e os resíduos evaporados em temperatura ambiente. O
precipitado resultante foi mantido em refrigerador -20ºC até a
ressuspensão para análise em gel bidimensional. Foram realizadas duas
extrações indentependentes, perfazendo duas repetições biológicas do
procedimento. O material vegetal foi extraído de 40 plantas, com cerca
de oito folhas inoculadas (40 plantas controle e 40 plantas inoculadas).
EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV
CAMPESTRIS
Para análise comparativa do padrão de proteínas expressas por A.
thaliana na presença de Xcc, foi utilizado o isolado CNPH17 para
exclusão de possíveis proteínas bacterianas no padrão encontrado.
Xcc foi crescida por 48 horas em placas de meio NA à 28ºC. Após
o período de incubação, a bactéria foi ressuspendida em tampão Tris 10
mM pH 8,0 e a densidade ótica (OD) ajustada para 0,8 a 600 nm.
Em seguida, 100 mL da amostra foi centrifugada a 2,510 g à 4ºC
por cinco minutos. O precipitado foi lavado duas vezes com Tris 40 mM
adicionado de 1 mM de PMSF. O precipitado foi ressuspendido com
tampão de lise (8 M Uréia, 4% (m/v) CHAPS, 40 mM Tris pH 8,0 para
completar o volume e PMSF para uma concentração final de 1 mM) em
sonicador no gelo por dois minutos.
76
As proteínas insolúveis e restos celulares foram removidos por
centrifugação a 3780 g durante 60 minutos.
As proteínas extraídas foram quantificadas utilizando-se o método
de Bradford (1976) para as análises iniciais, sendo em seguida
precipitadas com TCA 75% (m/v) e acetona, como descrito para folha.
Para as análises subseqüentes, foi utilizado o método colorimétrico
com o BCA Protein Assay Kit. A amostra foi inicialmente precipitada
com TCA 75% (m/v) e em seguida ressuspendida em tampão de
ressuspensão e concentrada. Em seguida procedeu-se com a quantificação
e a amostra foi novamente precipitada com TCA 75% (m/v).
EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE SECREÇÃO DE XANTHOMONAS
CAMPESTRIS PV
. CAMPESTRIS NA PRESENÇA DE ECÓTIPOS RESISTENTE E
SUSCETÍVEL DE
ARABIDOPSIS THALIANA
O isolado CNPH17 de Xcc foi crescido em meio Dye (1966)
suplementado com 1% (m/v) de folhas cortadas de A. thaliana de um
ecótipo resistente (CS 1308) e outro suscetível (CS 1194) durante 48h,
numa rotação de 180 rpm a 28ºC, com OD inicial de 0,1.
Após o período de incubação, as amostras foram centrifugadas a
4200 g durante 25 minutos para decantação dos resíduos de folha e
células bacterianas. O sobrenadante foi então coletado e realizou-se a
quantificação de proteínas através do método de Bradford (1976).
77
Posteriomente as amostras foram precipitadas com TCA 75%
(m/v), como já descrito anteriormente para as amostras de folha e cultura
bacteriana.
Após a precipitação, procedeu-se com a análise bidimensional das
amostras. Para estocagem o material foi mantido congelado em
refrigerador a – 20ºC.
Para este experimento foi realizada apenas uma extração das
amostras.
ANÁLISE DE PROTEÍNAS ATRAVÉS DE ELETROFORESE
BIDIMENSIONAL (GEL 2DE)
As amostras protéicas precipitadas foram então ressuspendidas
com a solução de rehidratação para as tiras de gel (strips) (6M Uréia, 2M
Tiouréia, 2% (m/v) CHAPS, 0,5% ou 2% (v/v) IPG buffer no mesmo pH
da strip, traços de azul de bromofenol e água bidestilada) e em seguida
aplicadas no aparato de hidratação (cama) e colocou-se uma strip de 13
cm, pH 3 – 11 (Immobiline DryStrip, GE Healthcare Bio-Sciences AB,
Uppsala, Sweeden) com a face gelatinosa voltada para baixo em cada
compartimento. Cada strip foi coberta com 2 mL de óleo mineral
puríssimo (PlusOne Drystrip Cover Fluid, Amersham Biosciences,
Suécia) a fim de evitar ressecamento e mantidas em ambiente
climatizado em temperatura de 20ºC para hidratação por cerca de 14
horas.
78
Após o término da hidratação das tiras, procedeu-se com a
focalização isoelétrica das amostras, colocando-as na cuba de
eletroforese horizontal e recobertas com Cover Fluid. As amostras
correram no gel para focalização isoelétrica com a fonte programada
utilizando-se o seguinte programa: Gradiente, 500 Volts por 30 minutos,
1000 Volts por 30 min, 3500 Volts por 1h 30 min e 3500 Volts por 5h 30
min. Em todas as fases manteve-se a programação de 2 mA e 5 W, com
refrigeração fixa em 15ºC.
Depois de finalizada a focalização isoelétrica, as tiras foram
acondicionadas em tubos de ensaio, devidamente vedados com Parafilm
®
(filme para laboratório - Chicago, Illinois, E.U.A) e guardados em
refrigerador -80ºC até a realização da segunda dimensão através de gel
SDS- PAGE segundo protocolo proposto por Laemmli (1970), utilizando-
se somente o gel separador na concentração de 12% (10 mL de
Acrilamida 30% (v/v); 6,25 mL de Tampão de Separação pH 8,8; 8,5 mL
de água destilada; 250 µL de perssulfato de amônio (APS) e 15 µL de
TEMED).
Para realização da segunda dimensão das amostras foram
preparados a cada corrida dois géis SDS PAGE 12% (Laemmli, 1970) e
aguardou-se a polimerização por 40 minutos. As tiras foram equilibradas
em solução de equilíbrio (50 mM Tris – HCl pH 8.8; 6 M Uréia; 30%
(v/v) Glicerol; 2% (m/v) SDS; 1% (m/v) iodoacetamida ou DTT; traços
de azul de bromofenol) com iodoacetamida por 20 minutos e ditiotreitol
1% (m/v) (DTT) também por 20 minutos.
79
Após o equilíbrio, as tiras foram aplicadas sobre o gel SDS-PAGE.
Utilizou-se 15 µL do marcador de massa molecular Benchmark Pre-
Stained Ladder (Invitrogen) para cada gel. Os géis foram vedados com
gel selante (0.25 M Tris base; 1.92 M glicina; SDS 1% (m/v); agarose
0.5% (m/v), traços de azul de bromofenol).
Em seguida os géis foram levados ao aparato de eletroforese
vertical, utilizou-se tampão de corrida 1X nas porções superior e inferior
da cuba. As amostras correram nos géis utilizando a programação da
fonte para gradiente, primeiramente por 30 minutos a 250 Volts, e em
seguida por 5:30h também a 250 Volts, sempre em 50 mA e 10 W;
também com refrigeração fixa em 15ºC.
Após a corrida, os géis foram colocados em solução descorante
overnight, e posteriormente as proteínas detectadas (spots) revelados
através da coloração com nitrato de prata.
COLORAÇÃO DOS GÉIS 2 DE COM NITRATO DE PRATA
Após a realização da segunda dimensão (SDS-PAGE), os géis
foram corados segundo protocolo proposto por Blum et al.. (1987).
Primeiramente, os géis foram deixados em solução descorante (50% (v/v)
metanol, 10% (v/v) ácido acético e água destilada) overnight; em seguida
foram colocados em 50% (v/v) de etanol durante 20 minutos, sendo que
este procedimento foi repetido por 3 vezes. Após a retirada do etanol,
adicionou-se solução de tiosssulfato de sódio (0,04g para 200 mL de
água destilada) por 2 minutos. Em seguida, os géis foram lavados três
80
vezes com água destilada; posteriormente adicionou-se solução de nitrato
de prata (0,4 g de nitrato de prata, 148 µL de formaldeído para 200 mL
de água destilada) incubando-se por 15 minutos. Em seguida, a solução
de nitrato de prata foi retirada e os géis foram novamente lavados três
vezes em água destilada e adicionou-se a solução de carbonato de sódio
(12 g de carbonato de sódio, 4 mL de tiossulfato de sódio, 100 µL de
formaldeído para 200 mL de água destilada), permanecendo nesta última
até o aparecimento dos spots. Para se parar a revelação dos géis, solução
de carbonato de sódio foi retirada e adicionou-se solução descorante aos
géis. Para cada gel foram preparados 200 mL de cada solução. Todo o
procedimento de coramento dos géis foi realizado sob agitação para
uniformização dos resultados.
ANÁLISE DAS IMAGENS DOS GÉIS 2 DE
As imagens dos géis bidimensionais foram digitalizadas
utilizando-se o “scanner” HP Scanjet 8290, modo fotografia. Estas,
posteriormente foram analisadas no software BioNumerics 4.6 adquirido
da Applied Maths BVBA (Bélgica).
Para o processamento das imagens no BioNumerics, elas foram
padronizadas, e determinou-se a coloração em escala de cinza, formato
TIFF com OD de 8 bits, a fim de minimizar distorções na análise dos
géis. A detecção dos pontos protéicos (spots) foi realizada com subtração
do fundo e detecção automáticos seguida de correções manuais.
81
Procedeu-se com a normalização dos géis, criação do gel de
referência a partir de spots determinados nos géis analisados,
determinação da métrica dos géis, a fim de que a análise siga os padrões
determinados pelos marcadores de massa molecular (Y), ponto
isoelétrico (X) e intensidade (Z) de alguns spots.
Após normalizados, os géis foram ligados ao gel de referência
previamente criado através de “landmarks”, representado na Figura 5.
Devido ao passo da corrida eletroforética de SDS-PAGE apresentar
dependência logarítmica, foi utilizado um ajuste logarítmico de 2 graus
para massa molecular. Os demais valores permaneceram segundo o
padrão proposto pelo software.
Figura 5: Ligação dos pontos protéicos (spots) ao gel de referência. Spots iguais em
ambos os géis ligam-se entre si e ao gel de referência pré estabelecido. Imagem
adaptada do The BioNumerics Manual, 2006.
Gel A
Gel de Referência
Gel B
A mesma proteína
82
Foram capturadas imagens tridimensionais (3D) de cada gel,
imagens sobrepostas ao gel de referência e imagens de sobreposições
entre géis comparativos.
Quando se procedeu com as comparações, os géis tiveram seus
spots iguais ligados entre si e identificados numericamente.
Posteriormente estabeleceu-se como parâmetros para identificação dos
spots expressão diferencial e significância (para se verificar spots
extremamente diferenciais entre os géis através de uma regressão entre
eles, foi determinado como valor de p 0,02 (Na hipótese estatística que
testa, o p-valor é a probabilidade de obter um extremo do resultado pelo
menos de um ponto de dados dado, supondo o ponto de dados era a
chance do resultado sozinho) para se calcular a probabilidade do spot
pertencer a distribuição baseando-se na curva de regressão e nos limites
de desvio padrão). Para ambos os parâmetros foi utilizado volume (em
pixels) como medida de análise. As tabelas geradas pelo software foram
utilizadas para seleção de spots de interesse.
83
5. RESULTADOS E
DISCUSSÃO
84
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DETECÇÃO DE XANTOMONADINAS
Foram utilizados para detecção da presença de xantomonadinas em
X. gardneri, os isolados CNPH467, 2006-17, 2006-21 e 334T através de
cromatografia de camada delgada. Xcc CNPH 77 foi utilizado como
controle positivo. A identificação de um ponto amarelo com um valor de
Rf entre 0,42 e 0,49 indica a presença de xantomonadinas. Como
apresentado na Tabela 2, para o controle positivo o valor do Rf foi de
0,43.
Para os pigmentos extraídos de X. gardneri (de todos os isolados
estudados), foi observado um valor de Rf de 0,42, indicando a presença
de pigmentos amarelos consistentes com o esperado para xantomonadinas
(Schaad et al., 2001). A taxonomia de Xg tem sido objeto de
controvérsias e tem mudado através dos anos. Desta forma, a detecção
desses pigmentos amarelos na solução extraída de Xg, pode auxiliar a
ampliar o corpo de dados que indicam que Xg é verdadeiramente um
membro do gênero Xanthomonas (Starr & Stephens, 1964).
85
Tabela 2: Valores de Rf* para pigmentos amarelos extraídos de
diferentes Xanthomonas e detectados por cromatografia de camada
delgada.
Isolado Rf
Xg CNPH467 0,42
Xg 2006-17 0,42
Xg 2006-21 0,42
Xg 334T 0,42
Xcc CNPH77 0,43
*Rf representa a relação entre a distância percorrida pelo pigmento amarelo e a distância
percorrida pelo solvente.
CARACTERIZAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE X. GARDNERI A DIFERENTES
ANTIBIÓTICOS
Foi testada a resistência de Xg CNPH467 a diferentes antibióticos
em diferentes concentrações, a fim de se ampliar o espectro de dados
para caracterização deste patógeno.
Foi realizado um controle plaqueando-se 500 µL de solução de Xg
ressuspendida em água autoclavada em placas de meio NA sem a adição
de nenhum antibiótico.
Todo o experimento foi feito em triplicata, e calculada uma média
do número de colônias formadas em cada placa.
Xg foi capaz de desenvolver colônias na presença de ampicilina
(25 e 50
µg/mL), kanamicina (25 µg/mL), espectinomicina (25 µg/mL) e
estreptomicina (25 e 50 µg/mL). Na presença de cloranfenicol (25 e 50
86
µg/mL), tetraciclina (25 e 50 µg/mL) e rifampicina (25, 50 e 100 µg/mL)
não houve nenhum crescimento (Tabela 3).
Quezado-Duval et al. (2003) em estudo acerca da sensibilidade de
Xanthomonas a diferentes compostos e antibióticos detectou a resistência
de isolados de Xg a estreptomicina 25 µg/mL, o que pode ser confirmado
com os dados obtidos neste experimento. Houve cerca de 30% de
resistência do isolado CNPH467 à estreptomicina 25 µg/mL. Tem-se
conhecimento de que a resistência é verificada em baixas concentrações
do antibiótico, entretanto existem relatos de isolados raros de
xantomonas que são capazes de crescer na presença de 200 mg/mL do
antibiótico.
Para a seleção de mutantes resistentes a antibióticos, com o intuito
de se desenvolver experimentos moleculares, como transformações ou
silenciamento genético, ou mesmo para estudos de curva bacteriana in
planta as melhores escolhas seriam cloranfenicol, rifampicina e
tetraciclina, tendo em vista que não houve resistência observada do
isolado aos mesmos.
Tabela 3: Teste de resistência do isolado CNPH467 de X. gardneri a
diferentes antibióticos em diferentes concentrações..
Antibiótico Concentração / Colônias Formadas
25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
Controle 680 ± 10 700 ± 10 690 ± 10
Ampicilina (Amp) 328 ± 10 317 ± 10 --------
Cloranfenicol (Chl) 0 0 --------
Kanamicina (Kan) 48 ± 2 0 --------
Espectinomicina (Espec) 98 ± 2 0 --------
Estreptomicina (Estrep) 230 ± 4 326 ± 4 --------
Tetraciclina (Tet) 0 0 --------
Rifampicina (Rif) 0 0 0
Xg crescida em meio NA sem adição de antibiótico foi utilizada como controle positivo. Valores de
colônias formadas ± erro padrão. ----: concentração não testada para o antibiótico; 0: nenhuma colônia
presente nas placas
87
CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA DE A. THALIANA E DIFERENTES
SOLANÁCEAS A XANTHOMONAS GARDNERI
Para testar se a planta modelo A. thaliana pode ser hospedeira de
X. gardneri, cinco plantas de 25 ecótipos diferentes foram inoculadas
com uma suspensão bacteriana de 5 x 10
8
UFC/mL. Para cada ecótipo,
três plantas foram inoculadas com tampão 10 mM MgCl
2
para controle de
injúrias mecânicas.
O desenvolvimento dos sintomas foi monitorado e seis dias depois
da inoculação, ambos amarelecimento (Figura 8) e necrose foram
observadas para a maioria dos ecótipos. Algumas folhas apresentando
sintomas da doença foram coletadas, esterilizadas e plaqueadas em meio
NA. Colônias bacterianas apresentando cor e morfologia semelhante a X.
gardneri foram isoladas.
Posteriormente, as colônias foram re-inoculadas em plantas de
tomate (Lycopersicum esculentum L.), da variedade Bonny Best a fim de
se confirmar, através dos Postulados de Koch, a capacidade de Xg
infectar a planta.
Após seis dias da inoculação, foram observados sintomas de
mancha - bacteriana, como amarelecimento e pontos necróticos
desenvolvendo-se nos tomateiros. Isto indica que A. thaliana pode ser
uma hospedeira de X. gardneri, pois o patógeno re-isolado das plantas de
A. thaliana foi capaz de produzir sintomas no hospedeiro do qual foi
isolado primeiramente. Uma escala numérica foi utilizada para comparar
os sintomas entre os ecótipos (Tabela 3).
88
Os resultados obtidos dos experimentos de avaliação do grau de
severidade dos sintomas foram regularizados (padronizados para
utilização do software) para fins de análise estatística através do
software SAS
®
. Foi realizado o teste de variância (ANAVA), utilizando-
se delineamento em blocos (10 blocos, 25 ecótipos com 25 repetições no
máximo) com dados desbalanceados. Detectou-se diferença significativa
(p<0,0001) e o coeficiente de variância foi de 17,53%, confirmando que
existe diferença significativa entre os ecótipos.
Através do teste de Tukey (teste de médias) os ecótipos analisados
foram agrupados conforme sua similaridade ou diferença estatística.
Foram determinados três grupos distintos, sendo o primeiro composto
pelo ecótipo CS1540 classificado como mais suscetível; o segundo
perfazendo um grande grupo de ecótipos com resposta intermediária
(CS903, CS1020, CS1072, CS1084, CS1194, CS1198, CS1308, CS1354,
CS1438, CS1492, CS1566, CS1594, CS3112, CS6100, CS6181, CS6604,
CS6699, CS6930, CS8580, e Col-0), e o terceiro grupo menos suscetível
(CS1640, CS6175 e CS1643), ressaltando-se que o ecótipo mais
resistente entre todos foi o CS1643, como pode ser visto nas Figuras 6 e
7.
89
CS1643 CS1640
CS6175
CS903 CS1020 CS1072
CS1084 CS1194 CS1198
CS1308 CS1354 CS1438
CS1492 CS1566 CS1594
CS3112 CS6100 CS6181
CS6604 CS6699 CS6930
CS8580 Col – 0
CS1540
Figura 6: Organização dos diferentes ecótipos de A. thaliana de acordo com a análise
estatística referente à resposta ao isolado CNPH467 de X. gardneri. Os ecótipos foram
dispostos em três grupos, apresentando resistência crescente da esquerda para a direita.
Em relação às solanáceas inoculadas com Xg, sete dos doze tipos
em estudo apresentaram colapso das folhas 24 horas após a inoculação,
pelo método de infiltração através de seringa, sugerindo que possa estar
ocorrendo uma reação de hipersensibilidade, como pode ser observado na
Tabela 4. Na Figura 9 é mostrada a reação de hipersensibilidade
desencadeada em uma planta de Jiló Comprido (Solanum gilo) 24 h
depois da inoculação pelo método de infiltração.
Plantas que não apresentaram sintomas 24 h após a inoculação
(lobeira, beringela, e tomate), mas que desenvolveram necrose cinco dias
após a inoculação (dpi) podem ser suscetíveis a Xg, pois houve uma
resposta à longo prazo da planta em sinal da presença do patógeno;
entretanto, são necessários testes adicionais para que se consolidem tais
dados.
Estes dados são de fundamental importância, para o bom
desempenho da prática agrícola atual. Determinando-se a gama de
90
hospedeiras de Xg, torna-se possível um plantio direcionado, a fim de se
evitar a proliferação da bactéria em safras posteriores, evitando-se o
cultivo de plantas que possam servir de hospedeiras para Xg (como
tomate e berijela), ou mesmo a proximidade da área de cultivo de plantas
nativas que também podem ser hospedeiras do fitopatógeno em questão
como no caso da lobeira.
Foi realizada a inoculação de Xg através de pulverização, contudo
não foi possível se observar os resultados deste experimento devido a
problemas técnicos na formação da câmara úmida.
Seria interessante repetir esta etapa do estudo, tendo em vista que
Xg infecta seus hospedeiros através de estômatos, hidatódios e
microferimentos, poder-se-ia mimetizar a infecção ocorrendo
naturalmente, e desta forma avaliar mais precisamente a resposta da
planta ao ataque deste patógeno.
91
Tabela 4: Respostas observadas após diferentes tempos em solanáceas
inoculadas através de infiltração por seringa com Xanthomonas gardneri
CNPH 467 em suspensão de 5 x 10
8
UFC/mL.
Sintomas
Planta Espécie Idade
Infiltração
24 h
Infiltração
5 dpi
Maria Pretinha 2 meses HR N
Solanum americanum Mill.
Jiló Comprido 2 meses HR N
Solanum gilo
Juá Bravo
2 meses HR/E N
Ziziphus joazeiro Mart.
Jurubeba
Alaranjada
2 meses HR/N N
Solanum paniculatum L.
Jurubeba doce
2 meses HR NO
Solanum paniculatum L.
Lobeira 3 meses SS N
Solanum lycocarpum Saint
Hilaire
2 meses SS N
Berinjela Cica
Solanum melongena
Pimentão Early
2 meses HR/E N
Capsicum cordiforme
Juá de Capote 2 meses NO NO
Zizyphus joazeiro Martius
Lobeira Tucuruí
2 meses SS E/N
Solanum lycocarpum Saint
Hilaire
2 semanas SS N
Tomate Yuba
Solanum lycopersicum L.
Batata Monalisa 2 semanas HR/E N
Solanum tuberosum L.
HR: Reação de Hipersensibilidade (Colapso); N: Necrose; E: Encharcamento; SS:
Sem Sintomas e NO: Não Observado
92
93
Figura 8: Arabidopsis thaliana, ecótipo
CS 6100, com sintomas de
amarelecimentoamarelecimento 6 dias
após a inoculação. As setas indicam a
Figura 9: Jiló comprido (Solanum gilo)
apresentando sintomas de hipersensibilidade
(HR) 24 h após o inóculo na porção foliar que foi
inoculada com seringa.
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS SECRETADAS POR XANTHOMONAS
GARDNERI
Como apresentado na Figura 10, X. gardneri foi capaz de produzir
proteínas em resposta a todas as condições de crescimento testadas (na
presença de folhas, farelo de trigo, papel filtro e meio mínimo). Em
geral, as proteínas secretadas foram detectadas somente após 24 h de
crescimento. X. gardneri crescida em meio mínimo demonstrou o maior
nível de secreção de proteínas.
É possível que a bactéria estivesse estressada devido a essas
condições de crescimento e respondeu com um aumento considerável de
secreção protéica.
94
95
ENSAIOS ENZIMÁTICOS
O controle utilizado para os ensaios enzimáticos de celulase,
pectinase, xilanase e α-arabinofuranosidase, foi o extrato bruto do fungo
T. harzianium, e apresentou atividade para todos os testes realizados.
Como disposto na Figura 11, Xg apresenta atividade de celulase
constitutiva quando crescida em meio mínimo. Na presença de folhas de
Arabidopsis foi observada a maior atividade de celulase nos tempos de
crescimento finais. É interessante notar que não houve atividade
considerável de celulase para Xg crescida na presença de papel filtro e
farelo de trigo, mesmo ambos contendo celulose. Talvez a dimensão da
superfície de contato possa ter papel significativo nestes experimentos,
interferindo na degradação enzimática do papel filtro e do farelo de
trigo.
Foi detectada atividade de α-arabinofuranosidase no sobrenadante
de Xg crescida em meio mínino e também houve crescimento na presença
de folhas de Arabidopsis, farelo de trigo e papel filtro (Figura 12). Os
maiores níveis de atividade de α-arabinofuranosidase foram detectados
na presença de folhas de Arabidopsis 48h após a inoculação.
Tanto a atividade de celulase quanto α-arabinofuranosidase foram
significantes na presença de folhas de Arabidopsis, o que favorece uma
degradação eficiente da parede celular, dado a importância da
cooperação entre essas duas enzimas. Não foram detectadas atividades
pectinolítica, xilanolítica e de invertase para Xg. Esse resultado
corrobora com estudos anteriores de Bouzar et al. (1999), que também
não detectou atividade pectinolítica para Xg.
96
97 97
99
No entanto, é conhecido que Xg tem a capacidade de degradar
sacarose (Jones et al. 2004), mas não foi possível detectar a presença de
invertase. Blanvillain et al. (2007), reportam que Xcc possui um
transportador TBDR (TonB-dependent receptors) que transporta a
sacarose (o maior açúcar das plantas), e sugerem que este gene seja
necessário para o desencadeamento de virulência completa em
Arabidopsis e está associada a genes que são requeridos para o
metabolismo da mesma, formando assim, um “locus de utilização da
sacarose”. Talvez este açúcar possa estar sendo transportado para o
interior da célula e então hidrolisado pela invertase intracelularmente.
As informações acerca dos estudos realizados com Xg podem também ser
conferidas em versão Artigo “Xanthomonas gardneri exoenzymatic
activity towards plant tissue”, disponível no Apêndice 2 deste trabalho.
ANÁLISE PROTEÔMICA
Dentre as plantas estudadas atualmente, Arabidopsis continua
sendo o foco principal das pesquisas. A disponibilidade da seqüência
genômica dessa espécie ao domínio público simplifica bastante a
identificação das proteínas através de espectrometria de massa (MS).
Além disso, existe uma quantidade significativa de seqüências de ESTs
publicadas, permitindo o avanço na elucidação dos proteomas
identificados (Rossignol et al. 2006).
O material vegetal inclui uma variedade de genótipos, cultivares,
transgênicos e mutantes, órgãos, células e frações subcelulares. Os
100
objetivos dos ensaios científicos vão desde uma descrição global do
proteoma ao estudo dos processos biológicos, fisiológicos ou
bioquímicos, mais comumente explorando a estratégia de expressão
diferencial (Rossignol et al. 2006).
Entretanto, no que tange aos fitopatógenos, poucos têm seu
genoma completamente seqüenciado, e isto tende a dificultar a
identificação das proteínas extraídas ou secretadas por estes. Como Xcc
possui seu genoma seqüenciado e publicado esta dificuldade de
identificação é minimizada, facilitando o trabalho com esta bactéria
(Padliya & Cooper, 2006).
PROTEOMA DE FOLHAS DE ARABIDOPSIS INOCULADAS COM XCC E
COM
TAMPÃO 10 MM MGCL
2
No experimento de análise bidimensional das proteínas extraídas
de folhas de A. thaliana foram feitos um total de oito géis; sendo que
quatro foram de amostras de folhas inoculadas com Xcc e quatro com
folhas infiltradas com tampão MgCl
2.
Foram feitas duas réplicas
biológicas de cada amostra; e de cada réplica biológica duas réplicas
técnicas, a fim de se avaliar a reprodutibilidade do experimento.
Segundo Rossignol et al. (2006), os protocolos de extração mais
comumente utilizados para análise proteômica vegetal são baseados na
precipitação com TCA – acetona e na extração com fenol, como o alvo
do estudo se tratava de folhas, foi utilizada uma combinação dessas duas
técnicas para se realizar o experimento.
101
A otimização desses protocolos é fundamental, e como cada órgão
da planta é composto de diferentes células existe uma limitação da fonte
de tecidos. Isto é particularmente importante quando trabalha - se com
uma planta de pequeno porte como é o caso de Arabidopsis thaliana.
Suas folhas são de pequena dimensão (cerca de 1,5 a 2 cm de
comprimento) e existe a necessidade de grande quantidade de material
para se proceder com as análises protéicas
Para cada gel utilizou-se 300µg de proteína para que se pudesse
obter uma melhor visualização das mesmas após a coloração com nitrato
de prata. A partir das análises através do software BioNumerics foi
possível se comparar as imagens obtidas, e a partir daí calcular o nível
de similaridade e diferença entre os géis; permitindo a seleção de pontos
protéicos (spots) de interesse para posterior seqüenciamento por
espectrometria de massa. Primeiramente foi estabelecido um gel de
referência com 22 spots que se encontravam em praticamente todos os
géis (com exceção das amostras de Xcc) para normalização das imagens
e ligação dos géis entre si (Figura 13).
102
Comparando-se os géis das amostras de folhas de A. thaliana
Figura 13: Gel de referência para comparações entre as réplicas de géis
bidimensionais de diferentes tratamentos de folha de A. thaliana CS 1308 e X.
campestris pv. campestris CNPH17.
infiltradas com tampão 10 mM MgCl
2
(Ara) (réplicas biológicas e
técnicas) através do software, foram encontrados um total de 176 spots
somando-se todos os géis; sendo que alguns spots variaram entre as
réplicas, estando presentes de forma variada nas réplicas.
As maiores variações foram encontradas nos géis de Arabidopsis
controle (infiltradas com tampão MgCl
2
). Ara1 e Ara1.1 representam
réplicas técnicas, assim como Ara2 e Ara2.2. Ara 1 e Ara 2 representam
duas réplicas biológicas distintas.
Aqueles spots únicos em cada gel foram selecionados para
comparação das variações sofridas entre os experimentos, sejam aquelas
que surgiram devido à manipulação da amostra, durante a eletroforese ou
103
devido a algum fator ambiental que estivesse alterando o perfil de
expressão protéica. Na Tabela 5 é possível visualizar os spots
selecionados dos géis de Ara.
Tabela 5: Spots únicos em réplicas de géis de A. thaliana infiltradas com
tampão 10 mM MgCl
2.
Ara 1 e Ara 1.1 - réplicas técnicas; Ara 2 e Ara
2.2 – réplicas técnicas. Cada grupo de réplicas técnicas representa uma
réplica biológica.
Réplica Identificação do Spot pI Massa Molecular
53 3,97 25,39
59 8,97 37,62
64 5,96 32,03
Ara 1
65 5,63 28,98
66 4,85 31,15
92 4,80 55,90
98 5,43 40,93
27 5,65 4,44
Ara 1.1
59 8,97 37,62
Ara 2
59 8,97 37,62
159 4,67 17,99
160 4,74 70,18
163 5,18 29,78
165 4,39 32,50
166 4,31 15,32
168 4,94 14,34
169 5,09 59,03
170 4,86 24,87
Ara 2.2
171 4,79 20,77
172 4,58 21,47
173 4,18 20,51
174 4,36 25,55
175 6,06 15,57
176 7,83 18,63
177 5,11 32,59
178 5,29 31.46
pI: Ponto isoelétrico
104
Duas réplicas biológicas (Ara1.1 e Ara2.2) são mostradas na
Figura 14, seguidas da imagem tridimensional dos géis. O software
permite realizar a sobreposição das imagens para a comparação dos
mesmos e identificação de spots diferenciais através de diferenças na
coloração. O gel Ara1.1 é mostrado em laranja e o gel Ara2.2 em azul na
Figura 15.
Por meio de uma curva de regressão (Figura 16), foi possível
avaliar quão semelhantes são os dois géis. Apesar dos spots diferenciais,
existe um padrão protéico que se mantém em todos os experimentos,
resultando em uma curva que tende a linearidade. É possível ainda
verificar a identidade dos spots na Figura 17, onde eles foram
assinalados e um número dado a cada spot. Quando se procedeu com a
comparação, os géis foram ligados e desta forma um spot que se encontra
em mais de um gel teve a mesma identificação.
105
106
106
107
Figura 17: Pontos protéicos identificados no gel de Arabidopsis thaliana CS
1308 + tampão 10 mM MgCl
2
(Ara2).
As amostras de folhas de A. thaliana inoculadas com X. campestris
pv. campestris (Ara + Xcc) tiveram o mesmo tratamento que as amostras
infiltradas com tampão 10 mM MgCl
.
2
Foi encontrado um total de 105 spots, sendo que não foram
encontrados spots diferenciais únicos entre as réplicas (quando se
comparou todos os géis), sendo duas réplicas biológicas ([Ara + Xcc1;
Ara + Xcc1.1] e [Ara + Xcc2; Ara + Xcc2.2]) e de cada réplica biológica
uma réplica técnica .
108
Duas réplicas biológicas são mostradas na Figura 18, onde é
possível visualizar também a imagem tridimensional dos géis, conferindo
uma noção de volume aos spots. Na Figura 19 observa-se a sobreposição
dos géis, Ara + Xcc1 em laranja e Ara + Xcc1.1 em azul. Pequenos
traços em azul mais intenso são provenientes da normalização das
imagens, quando os spots não estão precisamente no mesmo lugar, a
imagem é distorcida a fim de que possam ser sobrepostos igualmente. Na
curva de regressão (Figura 20) observa-se novamente a tendência linear,
proporcionando maior confiabilidade aos dados, dada a reprodutibilidade
do padrão encontrado nos géis. Na Figura 21 estão identificados os
spots, seguindo a mesma numeração para os géis de A. thaliana infiltrada
com tampão 10 mM MgCl .
2
109
110
110
111
Figura 21: Pontos protéicos identificados no gel de Arabidopsis thaliana
CS 1308 + X. campestris pv. campestris CNPH 17 (Ara+Xcc2).
Foi realizada uma comparação entre os géis de Ara e Ara + Xcc,
com o intuito de se selecionar spots diferencialmente expressos, que
pudessem representar uma resposta da planta à presença do fitopatógeno:
spots que seriam expressos somente na presença do patógeno, spots que
desaparecessem por completo na presença do patógeno e spots que
alterassem seu padrão de expressão após a inoculação, seja aumentando
ou diminuindo a intensidade dos pontos protéicos.
Na Figura 22 observa-se a sobreposição dos géis Ara1.1 (azul) e
Ara + Xcc (laranja). Apesar de apresentarem padrão de migração muito
semelhante, é possível ver pontos em azul que correspondem a pontos
112
protéicos presentes apenas no gel de Ara1.1, principalmente na região
que corresponde a aproximadamente 64 kDa e na porção mais inferior do
gel de cerca 19 kDa.
Quando se comparou os dois géis, foram identificados 74 spots
presentes em ambos e 47 spots diferenciais – sendo que 15 deles
aparecem apenas nos géis de Ara e os 32 restantes nos géis de Ara +
Xcc.
As proteínas que aparecem no gel Ara + Xcc podem representar
proteínas de Xcc (intra ou extracelulares), e não necessariamente
proteínas expressas por A. thaliana devido à presença da bactéria, já que
nas amostras de folhas existiam células bacterianas.
Na Figura 23 é mostrada a análise por regressão linear,
corroborando os dados obtidos em análises anteriores.
Dos spots presentes apenas nas amostras de Ara + Xcc, foram
selecionados 21 (vinte e um) (68, 73, 89, 313, 315, 317, 319, 320, 321,
322, 323, 325, 326, 327, 328, 332, 335, 336, 337, 338 e 340), com base
em sua intensidade e volume para posterior seqüenciamento. Os spots
selecionados encontram-se numa faixa de pI (ponto isoelétrico) de 4,55
até 8,45, e com as massas moleculares entre 50 e 15 kDa (Figura 24).
Em estudos acerca da interação entre Fusarium oxysporum e
tomate, Rep et al. (2002) encontraram uma PR de 15 kDa, presente no
xilema induzida em resposta à infecção pelo fungo, e associaram-na às
peroxidases encontradas nos vasos de plantas de arroz infectadas com
Xanthomonas oryzae. Estas PR podem estar sendo secretadas do
apoplasto para o xilema em resposta à presença do patógeno, ou o xilema
113
pode estar respondendo de forma única apresentando suas próprias PRs.
Similarmente, as proteínas escolhidas para identificação que apresentam
massa em torno de 15 kDa podem representar PRs induzidas em resposta
à presença de Xcc.
A maioria das proteínas solúveis têm um pI numa faixa de variação
de pH de 4 – 8. Para esse grupo de proteínas, existe uma boa correlação
entre o nível de acumulação de mRNA e o nível de produto traduzido.
Alguns estudos têm descrito que as proteínas diferencialmente
encontradas aparecem como estando constitutivamente presentes (defesa
primária) ou são especificamente induzidas nas plantas
tolerantes/resistentes (Rossignol et al.., 2006).
Dos spots presentes em ambos os géis, 9 (nove) foram
selecionados (63, 74, 267, 314, 318, 324, 333, 334 e 339), pois sua
expressão foi aumentada nos géis de Ara + Xcc, podendo, desta forma
representar alguma proteína de defesa basal que tem o aumento de sua
expressão estimulada pela presença do patógeno. Os spots selecionados
encontram-se numa faixa de pI (ponto isoelétrico) de 5,20 até 6,90, e
com as massas moleculares entre 50 e 15 kDa.
A sobrevivência da planta, assim como sua produtividade é
altamente dependente da habilidade de adaptação, resposta, resistência e
tolerância a várias condições impostas pelo ambiente. As plantas têm
desenvolvido mecanismos sofisticados de defesa para se defenderem de
estresses bióticos (patógenos, herbívoros, plantas parasitas) e abióticos
(seca, salinidade, luz UV, solos pobres ou poluídos, etc.). Como o
estímulo ambiental é percebido e entendido pelo complexo defensivo e a
114
rede de sinalização adaptativa, altera a expressão gênica. As trocas
protéicas e metabólicas, o retardamento do crescimento, e como esses
eventos levam à resistência/tolerância tem sido na prática o alvo de
maior interesse dos pesquisadores (Rossignol et al. 2006).
115
116
117
As plantas tipicamente crescem em condições ótimas ou sub-
ótimas de estresse e spots diferenciais, uma vez que são estatisticamente
validados, podem ser extraídos dos géis, purificados, digeridos e
analisados por MS para identificação. Proteínas diferenciais,
selecionadas de tratamentos contrastantes como resistente/tolerante
versus suscetível/não tolerante são fortes candidatas a estarem
envolvidas nas respostas a estresses (Rossignol et al. 2006). Desta
forma, é esperado que os spots selecionados para a espectrometria de
massa, que estão presentes em ambos os géis (Ara e Ara + Xcc)
correspondam a proteínas de defesa basal ou mesmo de resposta gene
específica de A. thaliana, que estejam sendo expressas ou aumentando
sua expressão devido à presença de Xcc.
A maioria das proteínas diferenciais encontradas em genótipos
contrastantes resistentes e suscetíveis (em geral são aumentadas nos
tipos resistentes e diminuídas nos tipos suscetíveis) perfazem duas
grandes categorias: aquelas envolvidas na defesa ou relacionadas ao
estresse; e enzimas associadas com metabolismo de carbono e nitrogênio
e metabolismo secundário. No grupo das proteínas relacionadas à defesa
ou à patogênse (PRs), são normalmente encontradas glucanases,
quitinases, proteases, inibidores de proteases, antioxidantes entre outras.
Para o estudo desse grupo, ferramentas bioquímicas ou transcriptômicas
têm sido utilizadas com maior ênfase do que para o segundo grupo
(Rossignol et al., 2006; Rep et al., 2002).
Alguns estudos de proteômica comparativa têm caracterizado
proteínas de sistemas de sinalização que mediam mudanças na expressão
118
gênica e modificações nas respostas aos estímulos ambientais, isto
representa uma das mais inovadoras contribuições da proteômica. A
pesquisa em plantas tem focado principalmente nas cascatas de
fosforilação envolvidas na adaptação a diferentes condições de estresse,
como o ataque de patógenos. Os processos de reconhecimento do
patógeno pelo hospedeiro são crucialmente importantes para a
sobrevivência da planta, uma vez que a sensitividade é a precursora da
ativação das respostas de defesa.
Para plantas que são hospedeiras, a resistência ao patógeno
governada por interações gene-a-gene, tem sido mostrado que o
reconhecimento inicial envolve interações diretas ou indiretas com o
produto gênico dos genes de avirulência do patógeno, e os genes de
resistência correspondentes da planta hospedeira (Rossignol et al. 2006;
Chivasa et al, 2006).
119
PROTEÍNAS DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS
CNPH17
Em estudos realizados por Chung et al.. (2007), foram
identificadas 281 proteínas de Xcc, o que representa 6,7% do proteoma
predito para esta bactéria. Entre as proteínas identificadas, foram
relatadas proteínas envolvidas na biossíntese de goma de xantana,
chaperonas, endoglucanases (EngXCA, que pode representar uma
celulase associada à virulência).
Os dados disponibilizados por pesquisas com proteoma de Xcc
auxiliam nas comparações com amostras de A. thaliana inoculadas,
viabilizando a exclusão de proteínas únicas de Xcc das análises.
Foram comparados dois géis de Xcc, consistindo em uma amostra
biológica e duas réplicas técnicas que foram denominadas como Xcc1 e
Xcc2. Na Figura 25 estão dispostos os géis de Xcc, seguidos da imagem
tridimensional.
Como nos experimentos anteriores, foi feita uma sobreposição das
imagens para avaliar quão diferentes os dois géis se apresentaram
(Figura 26). A curva de regressão referente à comparação das réplicas
apresentou uma leve curvatura, indicando que há diferença entre as
mesmas, que interfere no padrão protéico (Figura 27).
De todas as análises realizadas, as das amostras de Xcc foram as
que apresentaram as maiores diferenças entre as réplicas técnicas, talvez
devido a alguma falha durante a extração ou na focalização isoelétrica
120
tornando-se necessária a realização de mais testes para confirmação do
padrão de expressão das proteínas.
Podem também apresentar sensibilidade às pequenas alterações
do ambiente, temperatura de incubação, manuseio, inibidor de proteases
utilizado (PMSF), etc.
Os spots encontrados nos géis de Xcc também se apresentam com
volume e intensidade muito pequenos, o que dificulta na preparação
(excisão do spot, purificação e digestão) da amostra para espectrometria
de massa. Na Figura 28 estão identificados os spots do gel Xcc1.
Quando realizou-se a comparação dos géis de Xcc com os géis de
Ara + Xcc, foram encontrados apenas dois spots que puderam ser ligados
(Figura 29, spots 3 e 20), provavelmente devido à inconstância do padrão
protéico encontrado nos géis de Xcc.
Cabe ressaltar que os padrões encontrados para Xcc são
provenientes de bactérias cultivadas em meio de cultura, não
necessariamente refletem a expressão gênica da bactéria em seu habitat
natural.
121
122
123
Figura 28: Pontos protéicos identificados no gel de X. campestris pv. campestris
CNPH 17 (Xcc1).
124
SECRETOMA DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS
CNPH17 NA PRESENÇA DE ECÓTIPO SUSCETÍVEL (CS1194) E RESISTENTE
(CS1308) DE A. THALIANA
Muitas bactérias têm impacto na agricultura devido às proteínas
que secretam. Essas proteínas extracelulares podem ser benéficas em
processos como a utilização da biomassa, ou elas podem ser devastadoras
quando atuam como fatores de virulência em doenças de plantas (He et
al. 1993).
Estudos realizados com bactérias fitopatogênicas como Erwinia
chrysanthemi, Erwinia carotovora (Jones) Holland e Xcc mutantes, que
possuíam deficiências na produção individual de enzimas envolvidas na
degradação da parede celular vegetal, mostraram uma redução parcial em
sua virulência. Por outro lado, mutantes que apresentavam deficiências
nas proteínas secretadas eram geralmente não patogênicas (He et al.
1993).
Foi realizado um estudo para se avaliar a resposta de Xcc quando
na presença de ecótipo suscetível (CS1194) e resistente (CS1308) de A.
thaliana, com o intuito de comparar as proteínas secretadas pela bactéria
nos tratamentos contrastantes.
Neste experimento não foram feitas réplicas, um gel de cada
amostra foi analisado, permanecendo portanto, a necessidade de
repetição do mesmo para consolidação dos resultados.
Nas análises de secretoma através do software BioNumerics; na
presença de CS1308 foram encontrados 82 spots diferenciais da amostra
125
com CS1194. Todos os spots secretados por Xcc na presença de folhas
de CS1194 foram também secretados na presença de folhas de CS1308.
Para esse experimento, observou-se que as proteínas encontradas
na presença de CS1194 representam um subconjunto das proteínas
encontradas na presença de CS1308. Como não foram realizadas
repetições desse experimento, os dados obtidos não permitem uma
análise consistente da resposta bacteriana frente aos dois tratamentos
propostos. Na Figura 29 encontram-se as imagens dos géis do tratamento
com ecótipo suscetível (CS1194) e do ecótipo resistente (CS1308).
Foi feita uma análise de sobreposição também para os tratamentos
de secretoma, que pode ser visto na Figura 30, onde o ecótipo suscetível
(CS1194) é mostrado em laranja e o ecótipo resistente (CS1308) em azul.
A curva de regressão dos géis (Figura 31) é mostrada para se confirmar
que o padrão protéico dos géis é similar.
Nas Figuras 32 e 33 é possível visualizar todos os spots presentes
nos géis de secretoma, identificados com um número dado pelo software
BioNumerics. As figuras mostradas deixam claro o aumento da expressão
protéica de Xcc na presença do ecótipo resistente, devido ao elevado
número de spots presentes no gel de CS1308. Desta forma, propõe-se que
na presença de ecótipo resistente de A. thaliana, Xcc apresente resposta
diferencial de secreção protéica, aumentando o número de proteínas
expressas quando em contato com o mesmo.
Dos spots diferenciais, foram escolhidos 16 (95, 98, 131, 132, 138,
148, 170, 172, 174, 175, 177, 178, 188, 208 e 224) para seqüenciamento,
dado que para a análise por espectrometria de massa, são necessários
126
spots com alta intensidade e volume, pois durante o tratamento de
descoramento podem ocorrer perdas de material. Os spots selecionados
encontram-se numa faixa de pI de 3,5 até 6, e com massas moleculares
entre 70 e 32 kDa. Os spots selecionados podem ser visualizados na
Figura 34.
Xcc tem sido utilizada como um excelente modelo de estudo para
interações planta-patógeno. Seu processo de invasão requer a secreção de
celulases, peptidades e outras enzimas de degradação. Em estudos
recentes do proteoma de um isolado de Xcc (B100), foram identificadas
13 enzimas de degradação. Outros estudos (com o isolado Xcc 8004)
utilizando mutagênese encontraram também vários genes relacionados à
virulência, incluindo codificadores de proteínas de sinalização celular e
enzimas metabólicas (Chung et al. 2007).
Em estudos realizados com sobrenadantes da bactéria
fitopatogênica Erwinia chrysanthemi, foram identificadas proteases,
celulases, pectinases e flagelinas, além de algumas proteínas
intracelulares, provavelmente liberadas devido à lise celular espontânea
(Kazemi-Pour et al.., 2004). Desta forma, é possível que nos spots
escolhidos para identificação encontrem-se algumas dessas proteínas.
Unindo-se as análises de folhas de A. thaliana infectadas,
saudáveis e de secretoma de X. campestris pv. campestris, ter-se-á uma
comparação completa do efeito causado por este patógeno na planta
hospedeira. Por um lado, examina-se a resposta da planta ao ser
infectada e seus meios de defesa, por outro, verifica-se os mecanismos
utilizados pelo fitopatógeno para invadir e colonizar seu hospedeiro.
127
128
129
130
131
131
6.
CONCLUSÕES
132
CONCLUSÕES
AO QUE SE REFERE À CARACTERIZAÇÃO DE XANTHOMONAS GARDNERI
1. Xanthomonas gardneri possui pigmentos amarelos consistentes
com xantomonadinas.
2. O isolado CNPH467 de Xg é suscetível aos antibióticos
cloranfenicol, tetraciclina e rifampicina, nas concentrações de 25,
50 e 100 µg/mL. Ao passo que na presença de ampicilina,
espectinomicina, estreptomicina 25 e 50 µg/mL e kanamicina 25
µg/mL, Xg foi capaz de desenvolver quantidades consideráveis de
colônias bacterianas.
3. A. thaliana é hospedeira de Xg.
4. Não foi identificado nenhum ecótipo de A. thaliana dentre os 25
testados com resposta de resistência completa ao isolado CNPH467
de Xg, na concentração de 5 x 10
8
UFC/mL.
5. Segundo a análise estatística existe diferença significativa entre os
ecótipos testados para avaliar o grau de suscetibilidade à Xg.
Segundo o teste de Tukey os ecótipos analisados podem ser
divididos em três grupos: mais suscetível, intermediário e menos
suscetível, ressaltando-se que o ecótipo mais resistente entre todos
foi o CS1643 e o ecótipo CS1540 foi apontado como o ecótipo
mais suscetível de todos.
6. Xg é capaz de infectar diferentes solanáceas. Sete das doze
espécies testados desenvolveram reação de hirpersensibilidade com
24h após a inoculação. Plantas que não desenvolveram HR 24h
133
após a inoculação podem apresentar suscetibilidade à Xg, tais
como lobeira e berinjela.
7. Existe secreção diferencial de proteínas por Xg na presença de
diferentes fontes de carbono. Os maiores níveis de secreção foram
detectados na presença de 1% (m/v) de folhas de A. thaliana. Xg
foi capaz de secretar celulase e α-arabinofuranosidase na presença
de folhas de A. thaliana, entretanto, não apresentou secreção de
pectinase, xilanase e invertase.
AO QUE SE REFERE AO ESTUDO PROTEÔMICO DA INTERAÇÃO ENTRE X.
CAMPESTRIS PV
. CAMPESTRIS E A. THALIANA
1. Com base nas análises dos géis bidimensionais e através do
software BioNumerics, é possível inferir que existe quantidade
diferencial de proteínas em folhas de A. thaliana do ecótipo
resistente a Xcc, CS1308 quando infectado com a bactéria.
2. Existe expressão diferencial de proteínas secretadas por Xcc na
presença de ecótipo suscetível (CS1194) e resistente (CS1308).
134
7. PERSPECTIVAS
FUTURAS
135
PERSPECTIVAS FUTURAS
Tendo em vista os avanços que podem ser alcançados com a
elucidação dos mecanismos de interação do patossistema Arabidopsis
thaliana x Xanthomonas campestris pv. campestris e Arabidopsis
thaliana e Xanthomonas gardneri e seus produtos de sinalização; torna-
se desejável a continuidade do presente estudo.
A confirmação da suscetibilidade de diferentes solanáceas a X.
gardneri permitirá ampliar os dados acerca da gama de hospedeiros desse
fitopatógeno, assim como a análise da expressão de proteínas secretadas
por X. gardneri na presença de folhas de A. thaliana (CS1308) e em
folhas de tomate (Solanum lycopersicum L.) através 2DE e
espectrometria de massa, contribuirá significativamente para a
caracterização desta bactéria.
A identificação das proteínas expressas diferencialmente por
folhas de A. thaliana na presença de Xcc selecionadas no presente estudo
através de espectrometria de massa, permitirá que se proceda com uma
análise funcional de proteínas de Arabidopsis cuja expressão aponta para
uma possível função na resistência da planta ao patógeno.
O fato de que tanto o genoma de Arabidopsis quanto o de Xcc foram
completamente seqüenciados irá facilitar a análise de bioinformática,
possibilitando a identificação de um maior número de proteínas de
interesse. A continuidade deste estudo contribuirá para a identificação de
mudanças proteômicas específicas da resposta de um ecótipo de
Arabidopsis resistente a um fitopatógeno bacteriano. A análise funcional
136
das proteínas identificadas através de genética reversa torna-se, desta
forma pertinente. O silenciamento de genes de interesse, também
conhecido como RNAi, pode ser utilizado para confirmar os dados
obtidos através das análises proteômicas, uma vez que a planta com gene
silenciado deverá apresentar padrão oposto ao da planta não silenciada.
Além disso, pode-se analisar como a defesa da planta é alterada nestas
plantas silenciadas. Conta-se também com coleções knockout de
Arabidopsis que podem auxiliar nos estudos de análise funcional.
Dando continuidade também aos estudos de secretoma, das proteínas
expressas diferencialmente por Xcc na presença de folhas de ecótipo
suscetível e resistente de A. thaliana, abre-se a possibilidade de se fazer
uma análise funcional através da obtenção de mutantes de Xcc que
tenham estes genes deletados de seu genoma.
Genes presentes em Arabidopsis freqüentemente possuem
homólogos em outras espécies de plantas. Devido à similaridade entre
Arabidopsis e outras brássicas, é provável que os conhecimentos obtidos
através deste estudo usando Arabidopsis sejam diretamente aplicáveis a
plantas de interesse comercial, cultivadas tanto no Distrito Federal como
em outras partes do Brasil, como é o caso da couve e do tomate de onde
foram isoladas Xcc e Xg, respectivamente, utilizadas neste trabalho.
137
8. REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
138
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABEL, S.; BLAZQUÉZ, M.; DANGL, J.; DENG, X. et al.., 2000.
Arabidopsis Research 2000. The Plant Cell, 12, 2302 - 2309.
ALFANO, J.R. & COLLMER, A., 1996. Bacterial Pathogens in Plants:
Life up against the cell Wall. The Plant Cell, 8, 1683 – 1698.
ALONSO, J.M.; STEPANOVA, A.N.; LEISSE, T.J.; KIM, C.J.; CHEN,
H.; SHINN, P.; STEVENSON, D.K.; ZIMMERMAN, J.; BARAJAS,
P.; CHEUK, R.; GADRINAB, C.; HELLER, C.; JESKE, A.;
KOESEMA, E.; MEYERS, C.C.; PARKER, H.; PREDNIS, L.;
ANSARI, Y.; CHOY, N.; DEEN, H.; GERALT, M.; HAZARI, N.;
HOM, E.; KARNES, M.; MULHOLLAND, C,; NDUBAKU, R.;
SCHMIDT, I.; GUZMAN, P.; AGUILAR-HENONIN, L.; SCHMID,
M.; WEIGEL, D.; CARTER, D.E.; MARCHAND, T.; RISSEEUW,
E.; BROGDEN, D.; ZEKO, A.; CROSBY, W.L.; BERRY, C.C. &
ECKER, J.R., 2003. Genome-Wide Insertional Mutagenesis of
Arabidopsis thaliana. Science, 301, 653 – 657.
ANDRADE, A.E., FELIX, G.C., OLIVEIRA, A.C., NORONHA, E.F. et
al.., 2005. Expressão Diferencial de Proteínas de Xanthomonas
campestris pv. campestris na Interação com a Planta
Hospedeira Brasssica olearacea. Boletim de Pesquisa e
Desenvolvimento/Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,
93, 1 – 14.
139
APPLIED MATHS, 2006. The BioNumeriCSManual 4.6: Integral
Databasing and Analysis of Biodata. Applied Maths BVBA, 327
p.
AZEVÊDO, S.S., MICHEREFF, S.J. & MARIANO, R.L.R., 2002.
Epidemiologia Comparativa da Podridão - negra e da
Alternariose do Repolho no Agreste de Pernambuco.
Fitopatologia Brasileira, 27, 17 – 26.
BAGINSKY, S. & GRUISSEM, W., 2006. Arabidopsis thaliana
proteomics: from proteome to genome. Journal of Experimental
Botany, 57, 1485 – 1491.
BEDENDO, I.P. 1995. Manchas Foliares. In: Filho, A.B.; Kimati, H. &
Amorin, L.(eds), 1995. Manual de Fitopatologia: Volume 1 -
Princípios e Conceitos. Editora Agronômica Ceres Ltda. São Paulo
– SP, 848 – 858
BIEMELT, S. & SONNEWALD, U., 2006. Plant-microbe interactions
to probe regulation of plant carbon metabolism. Journal of Plant
Physiology, 163, 307 – 318.
BLANVILLAIN, S.; MEYER, D.; BOULANGER, A.; LAUTIER, M.;
GUYNET, C.; DENANCE, N.; VASSE1, J.; LAUBER, E. &
ARLAT, M. 2007. Plant Carbohydrate Scavenging through
TonBDependent Receptors: A Feature Shared by
Phytopathogenic and Aquatic Bacteria. PLoS ONE, 2, e224, 1 –
20.
140
BOUCHÉ, N. & BOCHEZ, D., 2001. Arabidopsis gene Knockout:
phenotypes wanted. Current Opinion in Plant Biology, 4, 111 –
117.
BRADFORD, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the
quantification of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72,
680 – 685.
BUELL, C.R. & SOMERVILLE, S.C., 1997. Use of Arabidopsis
recombinant inbred lines reveals a monogenic and a novel
digenic resistance mechanism to Xanthomonas campestris pv.
campestris. The Plant Journal, 12, 21-29.
CAMARGO, L.E.A. 1995. Análise Genética da Resistência e da
Patogenicidade. In: Filho, A.B.; Kimati, H. & Amorin, L.(eds),
1995. Manual de Fitopatologia: Volume 1 - Princípios e Conceitos.
Editora Agronômica Ceres Ltda. São Paulo – SP, 470 – 492
CHIVASA, S.; HAMILTON, J.M.; PRINGLE, R.S.; NDIMBA, B.K.;
SIMON, W.J.; LINDSEY, K. & SLABAS, A.R., 2006. Proteomic
analysis of differentially expressed proteins in fungal elicitor-
treated Arabidopsis cell cultures. Journal of Experimental
Botany, 57, 1553–1562.
CHUN, W.W.C., 2002. Xanthomonadins, Unique Yellow Pigments of
the Genus Xanthomonas. The Plant Health Instructor, 10, 1094 –
2000.
CHUNG, W.J., SHU, H.Y., LU, C.Y., WU, C.Y., TSENG, Y.H., TSAI,
S.F. & LIN, C.H., 2007. Qualitative and comparative proteomic
141
analysis of Xanthomonas campestris pv. campestris 17.
Proteomics, 7, 2047–2058.
CLAUSS, M.J. & KOCH, M.A., 2006. Poorly known relatives of
Arabidopsis thaliana. TRENDS in Plant Science, 11, 449 – 459.
CRECY-LAGARD, V. GLABER, P.; LEJEUNE, P.; SISMEIRO, O.;
BARBAER, C.E.; DANIELS, M.J. & DANCHIN, A., 1990. A
Xanthomonas campestris pv. campestris Protein Similar to
Catabolite Activation Factor is Involved in Regulation of
Phytopathogenicity. Journal of Bacteriology, 172(10), 5877 –
5883.
DA SILVA, A.C.; FERRO, J.A.; REINACH, F.C.; FARAH, C.S.;
FURLAN, L.R.; QUAGGIO, R.B.; MONTEIRO-VITORELLO,
C.B.; VAN SLUYS, M.A.; ALMEIDA, N.F.; ALVES, L.M.; DO
AMARAL, A.M.; BERTOLINI, M.C.; CAMARGO, L.E.;
CAMAROTTE, G.; CANNAVAN, F.; CARDOZO, J.;
CHAMBERGO, F.; CIAPINA, L.P.; CICARELLI, R.M.;
COUTINHO, L.L.; CURSINO-SANTOS, J.R.; EL-DORRY, H.;
FARIA, J.B.; FERREIRA, A.J.; FERREIRA, R.C.; FERRO, M.I.;
FORMIGHIERI, E.F.; FRANCO, M.C.; GREGGIO, C.C.;
GRUBER, A.; KATSUYAMA, A.M.; KISHI, L.T.; LEITE, R.P.;
LEMOS, E.G.; LEMOS, M.V.; LOCALI, E.C.; MACHADO, M.A.;
MADEIRA, A.M.; MARTINEZ-ROSSI, N.M.; MARTINS, E.C.;
MEIDANIS, J.; MENCK, C.F.; MIYAKI, C.Y.; MOON, D.H.;
MOREIRA, L.M.; NOVO, M.T.; OKURA, V.K.; OLIVEIRA, M.C.;
OLIVEIRA, V.R.; PEREIRA, H.A.; ROSSI, A.; SENA, J.A.;
142
SILVA, C.; DE SOUZA, R.F.; SPINOLA, L.A.; TAKITA, M.A.;
TAMURA, R.E.; TEIXEIRA, E.C.; TEZZA, R.I.; TRINDADE DOS
SANTOS, M.; TRUFFI, D.; TSAI, S.M.; WHITE, F.F.; SETUBAL,
J.C. & KITAJIMA, J.P., 2002. Comparison of the genomes of two
Xanthomonas pathogens with differing host specificities.
Nature, 417, 459-463.
DILLON, A.J.P., 2004. Celulases. In: Suraia Said; Rosemeire Pietro.
(Org.). Enzimas como agentes Biotecnológicos. 1 ed. : Editora
Legis Summa Ltda, 1, 243 – 306.
DO CARMO, L.S.T., 2006. Caracterização da Variabilidade Natural
da Resposta a um Isolado Brasileiro de Xanthomonas campestris
pv. campestris em Arabidopsis thaliana. Tese (Mestrado) –
Universidade Católica de Brasília, 128 p.
DO CARMO, L.S.T., CANDIDO, E.S., CAMPOS, P.F., QUEZADO-
DUVAL, A.M., LEONARDECZ, E., LOPES, C. & QUIRINO, B.F.,
2007. Natural variability in Arabidopsis thaliana germoplasm
response to Xanthomonas campestris pv. campestris.
Fitopatologia Brasileira, 32, 68 - 74.
DOW,J.M.; CLARKE, B.R.; MILLIGAN, D.E.; TANG, J. & DANIELS,
M., 1990. Extracellular Proteases from Xanthomonas
campestris pv. Campestris, the Black Rot Pathogen. Applied and
Environmental Microbiology, 56, 2994 – 2998.
DOW, J. M.; CROSSMAN, L.; FINDLAY K.; HE, Y. Q.; FENG, J. X. &
TANG, J. L., 2003. Biofilm dispersal in Xanthomonas campestris
143
is controlled by cell– cell signaling and is required for full
virulence to plants. PNAS, 19, 10995–11000.
EPHRITIKHINE, G.; FERRO, M. & ROLLAND, N., 2004. Plant
membrane proteomics. Plant Physiology and Biochemistry, 42,
943 – 962.
FEIZ, L.; IRSHAD, M.; PONT-LEZICA, R.; CANUT, H. & JAMET, E.,
2006. Evaluation of cell wall preparations for proteomics: a
new procedure for purifying cell walls from Arabidopsis
hypocotyls. Plant Methods, 2.
FILHO, E.X.F., 2004. Pectinases. In: Suraia Said; Rosemeire Pietro.
(Org.). Enzimas como agentes Biotecnológicos. 1 ed. : Editora
Legis Summa Ltda, 1, 307 - 321.
FILHO, E.X.F., 2004. Xilanases. In: Suraia Said; Rosemeire Pietro.
(Org.). Enzimas como agentes Biotecnológicos. 1 ed. : Editora
Legis Summa Ltda, 1, 137- 184.
FILHO, E.X.F.; PULS, J. & COUGHLAN, M.P., 1996. Purification and
Characterization of Two Arabinofuranosidases from Solid-
State Cultures of Fungus Penicillium capsulatum. Appl. Environ.
Microbiol., 62(1), 168 – 173.
GOFFARD, N. & WEILLER, G., 2007. GeneBins: a database for
classifying gene expression data, with application to plant
genome arrays. BMC Bioinformatics, 8, 87.
HAAG, E.S., 2007. Dial-a-mutant: web-based knockout collections for
model organisms. Biology of the Cell, 99, 343–347.
144
HE, S.Y.; LINDEBERG, M. & COLLMER, A. 1993. Protein secretion
by planta pathogenic bacteria. In: Chet, I.(Ed). Biotechnology in
Plant Disease Control.1 ed. : Wiley – Liss, 39 – 64.
HECK, J.X.; HERTZ, P.F. & AYUB, M.A.Z., 2002. Cellulase and
Xylanase production by isolated amazon Bacillus strains using
soybean industrial residue based solid-state cultivation.
Brazilian Journal of Microbiology, 33, 213 – 218.
HOCHHOLDINGER, F.; SAUER, M.; DEMBINSKY, D.; HOECKER, N.;
MUTHREICH, N.; SALEEM, M. & LIU, Y., 2006. Proteomic
dissection of plant development. Proteomics, 6, 4076 – 4083.
IRISH, V.F. & BENFEY, P.N., 2004. Beyond Arabidopsis.
Translational Biology Meets Evolutionary Developmental
Biology. Plant Physiology, 135, 611 – 614.
JAKOB, K.; GOSS, E.M.; ARAKI, H.; VAN, T.; KEITMAN, M. &
BERGELSON, J., 2002. Pseudomonas viridiflava and P. syringae
- Natural Pathogens of Arabidopsis thaliana. MPMI, 15, 1195 –
1203.
JONES, J.B.; LACY, G.H.; BOUZAR, H.; STALL, R.E. & SCHAAD,
N.W., 2004. Reclassification of the Xanthomonads Associated
with Bacterial Spot Disease of Tomato and Pepper. System.
Appl. Microbiol., 27, 755-762.
JONES, J.B.; STALL, R.E. & BOUZAR, H., 1998. Diversity Among
Xanthomonads Pathogenic on Pepper and Tomato. Annu. Rev.
Phytopathol., 36, 41 – 58.
145
KAZEMI-POUR, N.; CONDEMINE, G. & HUGOUVIEUX-COTTE-
PATTAT, N., 2004. The secretome of the plant pathogenic
bacterium Erwinia chrysanthemi. Proteomics, 4, 3177 – 3186.
KIM, H.S.; PARK, H.J.; HEU, S. & JUNG, J., 2004. Molecular and
Functional Characterization of a Unique Sucrose Hydrolase
from Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Journal of
Bacteriology, 186, 411 – 418.
KOMATSU, S. & YANO, H., 2006. Uptade and challenges on
proteomiCSin rice. Proteomics, 6, 4057 – 4068.
KOUKIEKOLO, R.; CHO, H.Y.; KOSUGI, A. INUI, M.; YUKAWA, H.
& DOI, R.H., 2005. Degradation of Corn Fiber by Clostridium
cellulovorans Cellulases and Hemicellulases and Contribution
of Scaffolding Protein CbpA. Applied and Environmental
Microbiology, 71, 3504 – 3511.
LAEMMLI, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during
assembly of the head bacteriophage T . Nature, 227, 680 – 685.
4
LEACH, J.E. & WHITE, F.F., 1996. Bacterial Avirulence Genes. Annu.
Rev. of Phytopathol., 34, 153 – 179.
LEE, B.M.; PARK, Y.J.; PARK, D.S.; KANG, H.W.; KIM, J.G.; SONG,
E.S.; PARK, I.C.; YOON, U.H.; HAHN, J.H.; KOO, B.S.; LEE,
G.B.; KIM, H.; PARK, H.S.; YOON, K.O.; KIM, J.H.; JUNG,
C.H.; KOH, N.H.; SEO, J.S. & GO, S.J., 2005. The genome
sequence of Xanthomonas oryzae pathovar oryzae KACC10331,
the bacterial blight pathogen of rice. Nucleic Acids Research,
33, 577-586.
146
LIJSEBETTENS, M.V. & MONTAGU, M.V., 2005. Historical
perspectives on plant developmental biology. International
Journal of Developmental Biology, 49, 453 – 465.
LOWE, S.E.; THEODOROU, M.K. & TRINCI, A.P.J., 1987. Cellulases
and Xylanase of an Anaerobic Rumen Fungus Grown on Wheat
Straw, Wheat Straw Holocellulose, Cellulose, and Xylan.
Applied and Environmental Microbiology, 53, 1216 – 1223.
MARRA, R.; AMBROSINO, P.; CARBONE, V.; VINALE, F.; WOO,
S.H.; RUOCCO, M.; CILIENTO, R.; LANZUISE, S.; FERRAIOLI,
S.; SORIENTE, I.; GIGANTE, S.; TURRÀ, D.; FOGLIANO, V.;
SCALA, F. & LORITO, M., 2006. Study of the three-way
interaction between Trichoderma atroviridae, plant and fungal
pathogens by using a proteomic approach. Current Genetics, 50,
307 – 321.
MEYER, D.; LAUBER, E.; ROBY, D.; ARLAT, M. & KROJ, T., 2005.
Optimization of pathogenicity assays to study the Arabidopsis
thaliana – Xanthomonas campestris pv. campestris pathosystem.
Molecular Plant Pathology, 6, 327 – 333.
MILAGRES, A.M.F.; MAGALHÃES, P.O. & FERRAZ, A., 2005.
Purification and properties of a xylanase from Ceriporiopsis
subvermispora cultivated on Pinus taeda. FEMS Microbiology
Letters, 253, 267 – 272.
MINIC, Z.; RIHOUEY, C.; DO, C.T.; LEROUGE, P. & JOUANIN,L.,
2004. Purification and Characterization of Enzymes Exhibiting
147
β-D-Xylosidase Activities in Stem Tissues of Arabidopsis. Plant
Physiology, 135, 867 – 878.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO,
2004. Agronegócio Brasileiro: Uma Oportunidade de
Investimentos. Disponível na Home Page do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento:
http://www.agricultura.gov.br/portal/page?_pageid=33,968707&_d
ad=portal&_schema=PORTAL, acessado em 03/07/2007.
MOMOL, T.; JONES, J. & OLSON, S., 2005. Recommended
Management Strategies for Bacterial Spot on Tomato Caused
by Xanthomonas species and Current Reclassification of the
Associated Pathogens. NFREC Extension Report No: 2005-7.
Disponível na Home Page: http://nfrec.ifas.ufl.edu/tomato1.htm,
acessado em 13/07/2007.
MYSORE, K.S.; TUORI, R.P. & MARTIN, G.B., 2001. Arabidopsis
genome sequence as a tool for functional genomiCSin tomato.
Genome Biology, 2, 1003.1 – 1003.4.
OH, I.S.; PARK, A.R.; BAE, M.S.; KWON, S.J.; KIM, Y.S.; LEE, J.E.;
KANG, N.Y.; LEE, S.; CHEONG, H. & PARK, O.K., 2005.
Secretome Analysis Reveals an Arabidopsis Lipase Involved in
Defense against Alternaria brassicicola. The Plant Cell, 17, 2832
– 2847.
OLIVEIRA, K.F.; MALAVOLTA, L.; SOUZA, C.S.; VICENTE, E.J. &
LALUCE, C., 2006. Pectinolytic activity secreted by yeasts
148
isolated from fermented citrus molasses. Journal of Applied
Microbiology, 100, 633 – 640.
PADLIYA, N.D. & COOPER, B., 2006. Mass spectrometry-based
proteomics for the detection of plant pathogens. Proteomics, 6,
4069 – 4075.
PANDEY, A.; CHOUDHARY, M.K.; BHUSHAN, D.;
CHATTOPADHYAY, A.; CHAKRABORTY, S.; DATTA, A. &
CHAKRABORTY, N., 2006. The Nuclear Proteome of Chickpea
(Cicer arietinum L.) Reveals Predicted and Unexpected
Proteins. Journal of Proteome Research, 5, 3301 – 3311.
PECK, S.C., 2005. Update on ProteomiCSin Arabidopsis. Where do
We Go From Here?. Plant Physiology, 138, 591 – 599.
PERUCH; L.A.M.; MICHEREFF, S.J. & ARAÚJO, I.B., 2006.
Levantamento da intensidade da alternariose e da podridão -
negra em cultivos orgânicos de brássicas em Pernambuco e
Santa Catarina. Horticultura Brasileira, 24, 464-469.
PONTE, J.J. 1980. Etiologia. In: Fitopatologia: Princípios e
Aplicações.2ª ed. São Paulo: Nobel, 61 – 91
POPLAWSKY, A.R.; URBAN, S.C. & CHUN, W.W.C., 2000. Biological
Role of Xanthomonadin Pigments in Xanthomonas campestris
pv. campestris. Applied and Environmental Microbiology, 66,
5123 – 5127.
QUIRINO, B.F. & BENT, A.F., 2003. Deciphering host resistance and
pathogen virulence: the Arabidopsis/Pseudomonas interaction as
a model. Molecular Plant Pathology, 4(6), 517-530.
149
QUEZADO-DUVAL, A.M., 2003. Diversidade de Xanthomonas spp.
Associadas à mancha-bacteriana em tomateiro para
processamento industrial no Brasil. Tese (Doutorado) – Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiróz”, Universidade de São
Paulo, 111 p.
QUEZADO-DUVAL, A.M., FILHO, A.G., LEITE, R.P.Jr. & CAMARGO,
L.E.A., 2003. Sensibilidade a cobre, estreptomicina,
oxitetraciclina em Xanthomonas spp. Associadas à mancha-
bacteriana do tomate para processamento industrial.
Horticultura Brasileira, 21, 670 – 678.
QUEZADO-DUVAL, A.M.; LEITE, R.P.Jr.; TRUFFI, D. & CAMARGO,
L.E.A., 2004. Outbreaks of bacterial spot caused by
Xanthomonas gardneri on processing tomato in Central-West
Brazil. Plant Disease, 88, 157 – 161.
REP, M.; DEKKER, H.L.; VOSSEN, J.H.; DE BOER, A.D.;
HOUTERMAN, P.M.; SPEIJER, D.; BACK, J.W.; DE KOSTER,
C.G. & CORNELISSEN, B.J.C., 2002. Mass Spectrometric
Identification of Isoforms of PR Proteins in Xylem Sap of
Fungus-Infected Tomato. Plant Physiology, 130, 904–917.
REUBER, T.L.; PLOTNIKOVA, J.M.; DEWDNEY, J.; ROGERS, E.E.;
WOOD, W. & AUSUBEL, F.M., 1998. Correlation of defense
gene induction defects with powdery mildew susceptibility in
Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant
Journal, 16, 473 – 485.
150
ROSSIGNOL, M.; PELTIER, J.B.; MOCK, H.P.; MATROS, A.;
MALDONADO, A.M. & JORRÍN, J.V., 2006. Plant proteome
analysis: A 2004 – 2006 uptade. Proteomics, 6, 5529 – 5548.
SALLES-FILHO, S. & BONACELLI, M. B., 2003. Biotecnologia
transforma bases da pesquisa agrícola. Disponível em: Brasil
Rural: C&T no Campo -
http://www.comciencia.br/reportagens/agronegocio/15.shtml,
acessado em 02/07/2007.
SCHELL, M.A.; ROBERTS, D.P. & DENNY, T.P., 1988. Analysis of the
Pseudomonas solanacearum Polygalacturonase Encoded by pglA
and Its Involvement in Phytopathogenicity. Journal of
Bacteriology, 170, 4501 – 4508.
SERGEEVA, L.I., KEURENTJES, J.J.B., BENTSINK, L., VONK, J.,
VAN DER PLAS, L.H.W., KOORNNEEF, M. & VREUGDENHIL,
D., 2006. Vacuolar invertase regulates elongation of Arabidopsis
thaliana roots as revealed by QTL and mutant analysis. PNAS,
21, 2994 – 2999.
SIGnAL - SALK INSTITUTE GENOMIC ANALYSIS LABORATORY,
2007. SIGnAL “T-DNA Express" Arabidopsis Gene Mapping
Tool”. Disponível na Home Page: http://signal.salk.edu/cgi-
bin/tdnaexpress, acessado em 10/07/2007.
SILVEIRA, F.Q. de P.; SOUSA, M.V.; RICART, C.A.O.; MILAGRES,
A.M.F.; MEDEIROS, C.L. & FILHO, E.X.F., 1999. A new
xylanase from a Trichoderma harzianum strain. Journal of
Industrial Microbiology & Biotecnology, 23, 682 – 685.
151
SORIANO, M.; DIAZ, P. & PASTOR, F.I.J., 2005. Pectinolytic Systems
of Two Aerobic Sporogenous Bacterial Strains with High
Activity on Pectin. Current Microbiology, 50, 114 – 118.
STARR, M.P. & STEPHENS, W.L., 1964. Pigmentation and Taxonomy
of the Genus Xanthomonas. Journal of Bacteriology, 87, 293-302.
SUBRAMANIYAN, S. & PREMA, P., 2000. Cellulase-free xylanases
from Bacillus and other microorganisms. FEMS Microbiology
Letters, 183, 1 – 7.
TABIERES, M.S.; ANDREU, R.C. & LIMA, M.V., 2003. Efeitos da
biotecnologia nas economias agrícolas dos países menos
desenvolvidos. Disponível em Brasil Rural: C&T no Campo -
http://www.comciencia.br/reportagens/agronegocio/16.shtml,
acessado em 02/07/2007.
TAKATSU, A., 2000. Classificação Atual de Bactérias
Fitopatogênicas. RAPP, 8, 93 – 120.
THEOLOGIS, A.; ECKER, J.R.; PALM, C.J.; FEDERSPIEL, N.A.;
KAUL, S.; WHITE, O.; ALONSO, J.; ALTAFI, H.; ARAUJO, R.;
BOWMAN, C.L.; BROOKS, S.Y.; BUEHLER, E.; CHAN, A.;
CHAO, Q.; CHEN, H.; CHEUK, R.F.; CHIN, C.W.; CHUNG,
M.K.; CONN, L.; CONWAY, A.B.; CONWAY, A.R.; CREASY,
T.H.; DEWAR, K.; DUNN, P.; ETGU, P.; FELDBLYUM, T.V.;
FENG, J.; FONG, B.; FUJII, C.Y.; GILL, J.E.; GOLDSMITH,
A.D.; HAAS, B.; HANSEN, N.F.; HUGHES, B.; HUIZAR, L.;
HUNTER, J.L.; JENKINS, J.; JOHNSON-HOPSON, C.; KHAN, S.;
KHAYKIN, E.; KIM, C.J.; KOO, H.L.; KREMENETSKAIA, I.;
152
KURTZ, D.B.; KWAN, A.; LAM, B.; LANGIN-HOOPER, S.; LEE,
A.; LEE, J.M.; LENZ, C.A.; LI, J.H.; LI, Y.; LIN, X.; LIU, S.X.;
LIU, Z.A.; LUROS, J.S.; MAITI, R.; MARZIALI, A.;
MILITSCHER, J.; MIRANDA, M.; NGUYEN, M.; NIERMAN,
W.C.; OSBORNE, B.I.; PAI, G.; PETERSON, J.; PHAM, P.K.;
RIZZO, M.; ROONEY, T.; ROWLEY, D.; SAKANO, H.;
SALZBERG, S.L.; SCHWARTZ, J.R.; SHINN, P.; SOUTHWICK,
A.M.; SUN, H.; TALLON, L.J.; TAMBUNGA, G.; TORIUMI,
M.J.; TOWN, C.D.; UTTERBACK, T.; VAN AKEN, S.;
VAYSBERG, M.; VYSOTSKAIA, V.S.; WALKER, M.; WU, D.;
YU, G.; FRASER, C.M.; VENTER, J.C. & DAVIS, R.W., 2000.
Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis
thaliana. Nature, 408, 816-820.
THE ARABIDOPSIS GENOME INITIATIVE (AGI)., 2000. Analysis of
the genome of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature,
408, 796-815.
VAUTERIN, L.; RADEMARKER, J. & SWINGS, J., 2000. Synopsis on
the Taxonomy of the Genus Xanthomonas. Phytopathology, 90,
677 – 682.
VITOLO, M., 2004. Invertase. In: Suraia Said; Rosemeire Pietro. (Org.).
Enzimas como agentes Biotecnológicos. 1 ed.: Editora Legis
Summa Ltda, 1, 207 - 219.
WANG, W; SCALI, M.; VIGNANI, R.; SPADAFORA, A.; SENSI, E;
MAZZUCA, S. & CRESTI, M., 2003. Protein extraction for two-
dimensional electrophoresis from olive leaf, a plant tissue
153
containing high levels of interfering compounds.
Electrophoresis, 24, 2369 – 2375.
WARWICK HRI, 2007. Black rot of Crucifers. Disponível na Home
Page:
http://www2.warwick.ac.uk/fac/sci/whri/about/staff/jvicente/blackr
ot/, acessado em 13/07/2007.
WIEZBICKI, R., 2004. Identificação de Raças de Xanthomonas spp.
Patogênicas à Pimentão no Estado de São Paulo. Dissertação
(Mestrado) - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo, 62 p.
Max-Planck Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, 2006.
Arabidopsis thaliana. Disponível na Home Page:
http://www.mpimp-golm.mpg.de/Arabidopsis/, acessado em
11/07/2006.
154
9. APÊNDICES
155
APÊNDICES
APÊNDICE 1 - REAGENTES, SOLUÇÕES E MEIOS DE CULTURA
Meios de Cultura
Meio NA:
5 g peptona bacteriológica
3 g de extrato de carne
10 g de agar
Completar com 500 mL de água destilada, ajustar o pH para 6,8,
autoclavar.
Para crescimento em meio líquido, não adicionar o àgar (Caldo
Nutritivo).
Meio MS ¼
0,535 g de meio MS
3 g de Ágar
500 mL de água destilada
Regular o pH do meio para 5,8 com KOH. Autoclavar em seguida.
156
Meio Mínimo para Xanthomonas (Dye)
0,5 g NH H PO
4 2 4
0,5 g K HPO
2 4
0,2g MgSO . 7H O
4 2
5 g de NaCl
1 g de extrato de levedura
12g de ágar
0,5% de fonte de carbono (farelo de trigo, papel filtro)
1% de fonte de carbono quando no tratamento com folhas de Arabidopsis
Ajustar o pH para 6,8, e completar o volume para 1 L.
Tampões
Tampão Cloreto de Magnésio 1M (para inoculação das bactérias)
20,33 g MgCl
2
100 mL de água destilada.
Diluir para 10 mM para preparo da solução de inoculação.
157
Tampão Fosfato pH 7,0
0,3 g K HPO
2 4
0,2 g KH PO
2 4
Completar com 200 mL de água destilada, ajustar o pH,
acondicionar em tubos de polipropileno de 1,5 mL (Eppendorf) e
autoclavar.
Antibióticos – Solução estoque
Ampicilina 50 mg/mL em água destilada
Cloranfenicol 34 mg/mL em etanol 100%
Kanamicina 10 mg/mL em água destilada
Rifampicina 25 mg/mL em metanol 100%
Espectinomicina 100 mg/mL em água destilada
Estreptomicina 10 mg/mL em água destilada
Tetraciclina 5 mg/mL em etanol
158
Reagente de Bradford
100 mg de Comassie brilliant blue
50 mg de etanol 95%
100 mL de ácido fosfórico 85%
Completar o volume com água destilada para 1000 mL, filtrar em
papel filtro e estocar em frasco escuro.
Reagente de Dinitrossalicilato (DNS)
Dissolver 10 g de DNS em 200 mL de NaOH 2 M aquecido
o
aproximadamente a 70 C.
Dissolver separadamente 300 g de tartarato de sódio e potássio
tetrahidratado em 500 m L de água destilada.
Adiciona-se lentamente a primeira solução à segunda e em seguida
completar o volume para 1 L com água destilada.
159
Soluções para eletroforese bidimensional
Solução de Acrilamida/bisacrilamida
Acrilamida 30% 60 g
Bisacrilamida 0,8% 1,6 g
Água bidestilada 200 mL
Filtrar a solução em filtro de 0,45 µm. Estocar a 4ºC em vidro
escuro.
Tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
Tris-Base 1,5M 181,5 g
Água bidestilada 750 mL
HCl Ajustar pH 8,8
Ao ajustar o pH, completar o volume com água bidestilada. Filtrar a
solução e estocar a 4ºC.
160
Perssulfato de Amônio 10%
Perssulfato de Amônio puro 1 g para
Água bidestilada 10 mL
Estocar a 4ºC.
Tampão de Corrida 5X pH 8,3
Tris-Base 25 mM 15,1 g
Glicina 192 mM 72,1 g
SDS 0,1% (m/v) 5 g
Água bidestilada 1 L
Estocar à temperatura ambiente.
Solução de Agarose (selante)
Tris-base 0,25M 5,057 g
Glicina 1,92M 28,82 g
SDS 1% 2 g
Agarose 0,5% 1 g
Azul de bromofenol traços
Água bidestilada 200 mL
161
Aquecer a solução até diluir a agarose.
Solução estoque para reidratação de tiras
Uréia 8M 24,02 g
Tiouréia 2M 7,61 g
CHAPS 2% 1 g
IPG Buffer (pH 3 – 11) 1% 500 µL
DTT 1M 32,5 µL para cada tubo
Azul de bromofenol traços
Água bidestilada 500 mL
Distribuir 500 µL da solução em cada tubo de polipropileno de 1,5
mL. Cada 500 µL é suficiente para hidratar duas tiras de 13 cm. A
solução de DTT deve ser adicionada no momento de hidratar as tiras
(32,5 µL de DTT 1M para cada tubo, para uma concentração final de 65 mM).
162
Solução de Equilíbrio com DTT/Iodocetamida
Tris HCl 1,5M pH 8,8 3,35 mL
Uréia 6M 36,03 g
Glicerol 30% 30 mL
SDS 2% 2 g
DTT ou iodoacetamida 1% 1 g ou 1Ml
Azul de bromofenol traços
Água bidestilada 100 mL
Fazer 100 mL de solução com DTT e 100 mL de solução contendo
iodoacetamida. Para equilibrar, utilizar 2 mL por 15 minutos de cada
solução por strip.
163
APÊNDICE 2 – ARTIGO XANTHOMONAS GARDNERI EXOENZYMATIC ACTIVITY TOWARDS
PLANT TISSUE
Autores: Elizabete S. Cândido, Jackeline L. Pereira, Alice M. Quezado-Duval, Eliane F.
Noronha, Ricardo H. Kruger & Betania F. Quirino. (submetido e aceito para publicação
na revista World Journal of Microbiology and Biotechnology (no prelo))
164
165
ORIGINAL PAPER
Xanthomonas gardneri exoenzymatic activity towards plant tissue
Elizabete S. Ca
ˆ
ndido Æ Jackeline L. Pereira Æ
Alice M. Quezado-Duval Æ Eliane F. Noronha Æ
Ricardo H. Kru
¨
ger Æ Betania F. Quirino
Received: 26 March 2007 / Accepted: 21 May 2007
Ó Springer Science+Business Media B.V. 2007
Abstract Bacterial spot caused by Xanthomonas spp. is
an important tomato and pepper disease worldwide. Recent
outbreaks of bacterial spot disease in Central Brazil and
Canada have been attributed to Xanthomonas gardneri,
which is also recognized as group D of Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria. Carotenoid-like pigments called
xanthomonadins, which are diagnostic for yellow Xantho-
monas spp., were extracted from X. gardneri. It was shown
that the model plant Arabidopsis thaliana, member of the
Brassicaceae family, can develop disease symptoms in
response to different isolates of X. gardneri. Secretion of
enzymes has been shown to play an important role in
pathogenicity for different pathogens, and to begin to
understand the interaction of X. gardneri and A. thaliana,a
biochemical analysis of secreted proteins in the presence of
A. thaliana leaves was performed. Different enzymatic
activities such as for cellulase, a-arabinofuranosidase,
pectinase, invertase and xylanase were assayed. In the
presence of leaves, cellulase activity was highest after 60
and 72 h of growth and a-arabinofuranosidase activity was
detected between 12 and 72 h of growth. Pectinase,
invertase and xylanase activities were not detected. Cel-
lulase and a-arabinofuranosidase activities may be impor-
tant for X. gardneri acquisition of plant nutrients through
degradation of cellulose fibers and hemicellulose of the cell
wall, respectively, to the invasion of the host tissue and/or
may generate signal molecules that are recognized by the
plant. This is the first study to address how X. gardneri
responds to host plant tissue.
Keywords Cell-wall degrading enzymes Á Processing
tomatoes Á Plant–pathogen interaction Á Xanthomonadins Á
Enzyme activity
Introduction
Bacterial spot disease of tomatoes (Solanum lycopersicum
L.) and peppers (Capsicum annum L.) is important
worldwide. The most visible symptoms are fruit and leaf
lesions. Different Xanthomonas species have been impli-
cated with the disease; however, the taxonomy of the genus
and of the bacterial spot group has been controversial
(Jones et al. 2004a; Schaad et al. 2000; Vauterin et al.
2000; Young et al. 2001). Changes in Xanthomonas tax-
onomy have been frequent but are contributing to a better
understanding of the genus (Vauterin et al. 1995, 2000;
Jones et al. 2004a). There are four phenotypic groups: A,
B, C and D able to cause disease in tomatoes and/or pepper,
which received a species status in Jones et al. (2004a).
Group D is the most distinct from the others and strains
from this group are also referred to as X. gardneri (Jones
et al. 2004a).
The first bacterium from the X. gardneri group was
identified from a tomato host in the former Yugoslavia and
at the time was named Pseudomonas gardneri (S
ˇ
utic
1957). Later it was considered synonymous with Xantho-
monas vesicatoria based on the fact that Pseudomonas
gardneri could not be distinguished from the latter both in
plants or the laboratory (Dye 1966). It was Hildebrand
et al. (1990) who verified by DNA hybridization, that this
E. S. Ca
ˆ
ndido Á J. L. Pereira Á E. F. Noronha Á
R. H. Kru
¨
ger Á B. F. Quirino (&)
Genomic Sciences and Biotechnology Program, Universidade
Cato
´
lica de Brası
´
lia, SGAN 916 Av. W5 norte, Brasilia, DF CEP
70790-160, Brazil
A. M. Quezado-Duval
Embrapa-Hortalic¸as, Brasilia, DF CEP 70359-970, Brazil
123
World J Microbiol Biotechnol
DOI 10.1007/s11274-007-9452-1
entity represented a separated group from Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria. Strain ICPB XG 101, the type
strain of ‘Pseudomonas gardneri’ was further mentioned as
a pathogen of both tomato and pepper, and was classified as
race T2P1 based on the reaction of a differential set of
tomato and pepper genotypes (Bouzar et al. 1994).
Referred by the epithet Xanthomonas gardneri, the
organism was reported again occurring in Costa Rica
(Bouzar et al. 1999). The picture emerging is that
X. gardneri is more widespread than previously thought. It
has been the major responsible for a bacterial epidemic in
Canadian tomato fields in 2003 and 2004 (Cuppels et al.
2006). Furthermore, in a study of 215 strains collected up
to the year 2000 in processing tomato fields in central-west
Brazil X. gardneri was the predominant xanthomonad
group recovered (Quezado-Duval et al. 2004). No resistant
tomato or pepper genotypes have been reported so far.
The plant cell wall is a natural physical barrier against
pathogens and is at the forefront of the interaction between
plants and pathogens. To gain access to the contents of
plant cells, many phytopathogenic bacteria produce and
secrete various cell-wall-degrading enzymes such as cel-
lulases, pectinases and xylanases (Rajeshwari et al. 2005).
These enzymes are important because in different patho-
systems they were shown to be involved in promoting
pathogenesis and virulence (Yakoby et al. 2000; Toth et al.
2003; Valette-Collet et al. 2003; Liu et al. 2005). Degra-
dation of cell-wall polysaccharides can also release prod-
ucts that trigger defense responses by the plant (Hahn et al.
1981; Bruce and West 1982; Gonzalez and Allen 2003).
Another enzymatic activity that is not related to cell wall
degradation but that can be important to pathogens is that
of invertases which are able to hydrolyze sucrose. Sucrose
is the major transportable product of photosynthesis con-
necting source to sink organs via the phloem. Sucrose is
present in the intercellular spaces of source organs and
pathogens may use sucrose as a source for carbon as well
as energy (Kim et al. 2004).
Despite the growing importance of X. gardneri as a
pathogen and its distance to other Xanthomonas groups,
there are still very few studies dedicated to understanding
the biology of this pathogen and its interaction with host
plants. Here we report on the presence of xanthomonadins,
carotenoid-like pigments, that are diagnostic for yellow
Xanhthomonas spp. (Starr and Stephens 1964), in
X. gardneri which further corroborates its current standing
as a bona fide Xanthomonas. Also, the model plant Ara-
bidopsis thaliana (family Brassicaceae) can develop dis-
ease symptoms when inoculated with different isolates of
X. gardneri. By performing a biochemical analysis of
secreted protein activities, we have begun to investigate the
interaction between X. gardneri and this model plant.
Materials and methods
Origin of X. gardneri and growth conditions
The strain CNPH467 of X. gardneri (IBSBF 1782 from the
Phytobacteria Culture Collection of Instituto Biolo
´
gico,
Campinas, Brazil) was obtained from a field of processing
tomatoes showing symptoms of bacterial spot disease in
Morrinhos, state of Goia
´
s, Brazil, in 1998 as previously
described (Quezado-Duval et al. 2004). Three other
X. gardneri isolates were also obtained from processing
tomato fields in Goia
´
s. Isolate 2006-17 and 2006-21 were
obtained in the year 2006, both in the city of Goia
ˆ
nia and
isolate 334-T was obtained in 1997 in the city of Itapaci.
During the study, X. gardneri isolates were stored in
phosphate buffer pH 7.0 (1.5 g/l K
2
HPO
4
, 1 g/l KH
2
PO
4
)
at room temperature. Xanthomonas campestris pv. cam-
pestris CNPH77, a well-known crucifer pathogen was used
as a positive control (Williams et al. 1980; Simpson and
Johnson 1990), while X. vesicatoria was used as a negative
control. Before experiments, bacteria were revived by
plating onto nutrient-agar (NA), media containing (per l)
10 g bactopeptone, 3 g beef extract, 20 g agar, and incu-
bated at 28 °C for 3–5 days, and to guarantee purity were
then transferred to another NA plate for 2 days at the same
temperature. For enzymatic assays, X. gardneri CNPH467
was recovered from NA plates and inoculated into 250 ml
of nutrient broth for 3 days at 28 °C and agitation of
200 rev/min. Minimal medium (Dye 1966) containing
small cut pieces of Arabidopsis accession CS903 leaves at
1%(w/v) was inoculated with X. gardneri from nutrient
broth to a final O.D.
600
of 0.1. At regular intervals, 50 ml
aliquots were obtained and the supernatants were separated
from bacterial cells and residual substrate by centrifugation
at 4,200g. After lyophilization, samples were resuspended
in 2 ml distilled water and stored at –20 °C until enzymatic
assays were performed in triplicate.
Xanthomonadins identification
Xanthomonadins were extracted from X. gardneri
CNPH467 as previously described by Schaad et al. (2001),
however, the extracted pigments were concentrated using a
SpeedVac (Eppendorf, Germany) rather than a water bath.
Thin layer chromatography was performed using silica gel
60 sheets of 0.2 mm thickness (Merck, Darmstadt,
Germany). The anhydrous methanol (J.T. Baker, Mexico)
used as a solvent was allowed to move approximately
10 cm. The R
f
value was calculated as the distance traveled
by the yellow pigment divided by the distance traveled by
the solvent.
World J Microbiol Biotechnol
123
Arabidopsis growth conditions and inoculation
Accessions CS903 (Kas-1), CS1194 (Go
¨
-0), CS1308
(Le-0), CS1566 (Tu-0), CS6100 (Kelsterbach-1), and
CS6604 (Na-2) of A. thaliana were obtained from the
Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio, USA).
Seeds were plated on MS ¼ medium (Sigma, MO, USA),
imbibed overnight at room-temperature and cold-treated
for 2 days. Plates were exposed to continuous light for
germination. One week after germination, seedlings were
transplanted to pots, 7 cm in diameter, containing Plant-
max Hortalic¸as HT substrate (Eucatex Agro, SP, Brazil).
Plants were grown for 5 weeks under short-day illumina-
tion (8 h light/16 h dark) from cool-white fluorescent
lamps at approximately 100 lmol m
–2
s
–1
. Temperature
was approximately 24 °C and relative humidity 50%.
Plants were subirrigated with water as needed. For plant
inoculations, bacteria grown on NA plates were resus-
pended in 10 mM MgCl
2
and the bacterial concentration
was adjusted to approximately 5 · 10
8
c.f.u./ml. For syr-
inge inoculation, the abaxial side of 3 leaves per plant from
6 plants of each Arabidopsis accession was inoculated with
the bacterial suspension using a 1 ml syringe without the
needle. For spray inoculation, the same number of plants
were used but the whole plant was sprayed to saturation
with the bacterial suspension. Sprayed plants were kept
under high humidity conditions for 2 days. Tomato plants
(cv. Bonny Best) were used as positive controls for
bacterial virulence.
Protein content
Protein content in lyophilized X. gardneri culture super-
natant samples was determined by the Bradford method
(1976).
Enzymatic assays
Cellulase activity against crystalline cellulose was mea-
sured by the filter paper assay (Lowe et al. 1987). In this
assay Whatman no. 1 filter paper strips (6 · 1 cm; ca.
50 mg) were used as a substrate to which 1 ml of 0.2 M
sodium–phosphate buffer (pH 7.2) and 1 ml X. gardneri
lyophilized culture supernatant were added. This mixture
was incubated at 45 °C for 4 h. The reaction was stopped
by addition of 1 ml of DNS reagent. The reducing sugar
produced in the reaction was quantified with dinitrosali-
cylic acid (DNS) reagent (Miller 1959) and absorbance at
550 nm was determined. One unit of enzymatic activity
was defined as the amount of enzyme that will release
1 lmol of glucose in 1 h of reaction. Trichoderma
longibrachiatum crude extract was used as a positive
control.
a-Arabinofuranosidase activity was determined accord-
ing to the method described by Filho et al. (1996). Assays
were carried out for 15 min. at 50 °C in a mixture con-
taining 1 mM of the substrate p-nitrophenyl-a-
D-arabino-
furanoside, sodium acetate buffer 100 mM pH 5.0 and
400 llofX. gardneri lyophilized culture supernatant. The
reaction was terminated by the addition of 1 ml 1 M
sodium carbonate. The release of p-nitrophenol was
determined by measuring absorbance at 410 nm. One unit
of enzymatic activity was defined as the amount of enzyme
that will increase the absorbance at 410 nm in 0.1 unit of
absorbance per minute of reaction. T. longibrachiatum
crude extract was used as a positive control for a-arabin-
ofuranosidase activity.
Pectinase activity was measured according to the pro-
tocol of Soriano et al. (2005). Briefly, 50 llofX. gardneri
lyophilized culture supernatant was incubated with 75 llof
sodium acetate buffer 50 mM (pH 5.0), 0.12 M NaCl,
6 mM EDTA, and 125 ll of substrate (0.4% of polygal-
acturonic acid) for 1 h at 45 °C. The reaction was termi-
nated by the addition of 1 ml DNS reagent and absorbance
was measured at 550 nm. T. longibrachiatum crude extract
was used as a positive control for pectinase activity.
Xylanolytic activity was determined according to the
method described by Cardoso and Filho (2003), by incu-
bating 50 llofX. gardneri lyophilized culture supernatant
with 100 ll of 1% (w/v) xylan substrate for 30 min. at
50 °C. The reaction was stopped by the addition of 300 ll
of DNS reagent. The reaction was terminated by placing
tubes in boiling water for 10 min. and 1.5 ml of distilled
water was added to each tube before absorbance at 550 nm
was measured. Penicillium corylophilum crude extract was
used as a positive control for xylanase activity.
To test for invertase activity, 50 llofX. gardneri
lyophilized culture supernatant were incubated with 950 ll
of sucrose 0.4% (w/v) in 50 mM (pH 5.0) sodium acetate
buffer previously warmed to 37 °C. The reactions were
incubated for 20 min. at 37 °C. Reactions were terminated
by the addition of 1 ml DNS reagent and boiled for 10 min.
Absorbance at 550 nm was measured after the addition of
2 ml of distilled water. Lysed Saccharomyces cerevisiae
cells were used as a positive control.
Results and discussion
Extraction and analysis of pigments
Thin layer chromatography was used to detect the presence
of xanthomonadins in X. gardneri. Xanthomonas campes-
tris pv. campestris was used as a positive control. Identi-
fication of a yellow spot with an R
f
value between 0.42 and
0.49 indicates the presence of xanthomonadins (Schaad
World J Microbiol Biotechnol
123
et al. 2001). For the positive control, X. campestris pv.
campestris the R
f
value was 0.43. For the pigments ex-
tracted from X. gardneri,anR
f
value of 0.42 was observed,
being indicative of the presence of xanthomonadins. The
taxonomy of X. gardneri has been object of controversy
and has changed over the years. The detection of xantho-
monadins in an X. gardneri pigment extract adds to the
body of data that places X. gardneri unequivocally in the
genus Xanthomonas (Starr and Stephens 1964).
Arabidopsis thaliana can develop disease symptoms
in response to X. gardneri
Accessions CS1194, CS1308, CS1566 and CS6604 of A.
thaliana were sprayed with X. gardneri CNPH467 sus-
pension to determine if this method of inoculation would
produce disease symptoms. Sprayed plants from all the
accessions tested developed chlorotic spots 4 days after
inoculation (Fig. 1a). Three plants per accession were
spray inoculated with 10 mM MgCl
2
as a negative control
and as expected these remained healthy. To test if syringe
inoculation would also produce disease symptoms, plants
from the accessions CS903, CS1194, CS1308, CS1566,
CS6100 and CS6604 were syringe inoculated with a X.
gardneri CNPH467 bacterial suspension. Seven days after
the syringe inoculation, chlorosis symptoms were clearly
observed on all accessions tested (Fig. 1b), with some
leaves also displaying necrosis. Three plants per accession
were syringe inoculated with 10 mM MgCl
2
as a negative
control and as expected these remained healthy. To follow
Koch’s postulates, bacteria were isolated from leaf tissue
showing disease symptoms 6 days after inoculation. These
bacteria showed morphology and color consistent with X.
gardneri and were re-inoculated on tomato plants which
showed disease symptoms of chlorosis and necrosis.
To further investigate if other isolates of X. gardneri
were able to cause disease symptoms in Arabidopsis,
accession CS1308 was sprayed with three other isolates
(Fig. 2a–c). The same chlorotic spots progressing to
necrotic regions obtained with isolate CNPH467 were
again observed. Disease symptoms were observed in the X.
campestris pv. campestris positive control (Fig. 2d) but not
with the X. vesicatoria negative control (not shown) at the
same concentration.
These results indicate that A. thaliana can develop dis-
ease symptoms when inoculated with X. gardneri and that
depending on the mode of inoculation, different disease
symptoms develop. Presently it is not clear whether Ara-
bidopsis can be a host to X. gardneri in nature. However,
the development of the X. gardneri/Arabidopsis pathosys-
tem may present great advantages as a model system
because Arabidopsis is the most well studied plant and that
many genomic, genetic and biotechnology tools have been
developed for this plant. Many contributions to under-
standing the molecular details of how a plant interacts and
defends itself have come from studies using Arabidopsis
(Quirino and Bent 2003). As an example, a bacterial
avirulence gene from the tomato pathogen Pseudomonas
syringae pv. tomato was identified based on its interaction
with Arabidopsis (Whalen et al. 1991) and since then this
system has been explored in many ways to dissect the
molecular pathways to disease resistance (Quirino et al.
2004; Katiyar-Agarwal et al. 2006; Sato et al. 2007). We
have observed that different Arabidopsis accessions present
variation in their degree of resistance to X. gardneri (data
not shown) and this can be explored in future studies.
Another advantage of the X. gardneri/Arabidopsis
pathosystem is that the genome from two other Xantho-
monas species, X. axonopodis pv. citri and X. campestris
pv. campestris, have been completely sequenced by
Brazilian researchers (da Silva et al. 2002
). X. axonopodis
pv. citri causes citrus canker which affects most commer-
cial citrus cultivars and X. campestris pv. campestris causes
black rot in crucifers. Comparison between the genomes of
these pathogens with different host specificity showed that
more than 80% of the genes are shared. Although
X. gardneri has not had its genome sequenced, information
from these other Xanthomonas species should be useful to
Fig. 1 Arabidopsis thaliana
inoculated with Xanthomonas
gardneri CNPH467 showing
disease symptoms.
(a) Arabidopsis thaliana
accession CS6100, 6 days after
sprayed with X. gardneri.
Arrows indicate spot lesions.
(b) Arabidopsis thaliana
accession CS6100, 7 days after
syringe infiltration with X.
gardneri. Arrows indicate the
half side of the leaf that was
inoculated
World J Microbiol Biotechnol
123
guide the formulation of gene sequence-based hypotheses
for future research.
Exoenzymatic activity of X. gardneri
To begin to understand how X. gardneri interacts with
plants, X. gardneri was grown in the presence of A. thali-
ana leaves or in minimal medium only. In minimal med-
ium, X. gardneri secreted detectable levels of protein
between 36 h and 72 h (Fig. 3a). When growing in the
presence of Arabidopsis leaves, X. gardneri secreted a
measurable amount of proteins between 24 h and 72 h after
inoculation (Fig. 3b). The peak in secretion occurred at
36 h after inoculation. Overall, the amount of protein
secreted by X. gardneri in minimal medium or in minimal
medium supplemented with leaves was similar.
The array of cell-wall degrading enzymes (CWDE)
includes cellulases, xylanases, pectinases and a-arabino-
furanosidases which contribute to degrade the typical
eudicot cell wall composed of the carbohydrates cellulose,
hemicellulose and pectin. Figure 4a shows that X. gardneri
displayed a low constitutive cellulase activity when grown
in minimal medium. In the presence of Arabidopsis leaves
(Fig. 4b), the highest cellulase activity was detected at the
latest time points analysed (60 and 72 h after inoculation).
Cellulose fibers are composed of chains of approximately
30–36 chains of b-1,4-glucose that are hydrogen bonded to
form a crystalline material (Vorwerk et al. 2004).
Cellulose fibers are crosslinked by hemicellulose and are
embedded in a matrix of pectin. Xylans, such as arabin-
oxylan and xyloglucan, are the most abundant hemicellu-
loses. When grown in minimal medium, X. gardneri
secreted proteins displayed a-arabinofuranosidase activity
Fig. 2 Arabidopsis thaliana,
accession CS1308, inoculated
with Xanthomonas gardneri
isolates 2006-17 (a), 334-T
(b) and 2006-21 (c)orX.
campestris pv. campestris
(d) showing disease symptoms
Fig. 3 Quantification of proteins secreted by Xanthomonas gardneri
at different time points grown in (a) minimal medium and (b) in the
presence of Arabidopsis leaves. Each time point was tested in
triplicate and the vertical bar corresponds to the standard deviation
Fig. 4 Time course of cellulase activity secreted by Xanthomonas
gardneri grown in (a) minimal medium and (b) in the presence of
Arabidopsis leaves. Each time point was tested in triplicate and the
vertical bar corresponds to the standard deviation
World J Microbiol Biotechnol
123
as early as 12 h after inoculation and this activity remained
for all the time points tested (Fig. 5a). The a-arabinofura-
nosidase activity was further induced in the presence of
Arabidopsis leaves (Fig. 5b). At the peak of activity, which
occurred at 48 h after inoculation, the activity in the
presence of Arabidopsis leaves was more than twice that of
that observed in minimal medium only. a-
L-Arabinofur-
anoside residues can be a group that is present at C-2 or
C-3 or both of the xylose units present in xylans of
hemicellulose. a-Arabinofuranosidases remove arabinosyl
residues from hemicellulosic polysaccharides. Cellulase as
well as a-arabinofuranosidase activities were significantly
greater in the presence of Arabidopsis leaves than those
observed in minimal medium. Efficient degradation of the
intricate cell wall material may require cooperation
between these two enzymatic activities.
No enzymatic activity was detected in the assays for
pectinase or xylanase when X. gardneri was grown in
minimal medium only or in the presence of Arabidopsis
leaves although different Xanthomonas are known to have
genes for such enzymes (da Silva et al. 2002). Pectins are
made of chains of galacturonic acid often branched and
decorated by other sugars and are present not only in
primary cell walls but also the middle lamella. While our
study and that of Bouzar et al. (1999) have identified non-
pectinolytic isolates of X. gardneri, work of Cuppels et al.
(2006) reports a weak pectinolytic activity. Therefore,
there may be some variation with respect to the utilization
of this polysaccharide by X. gardneri isolates. Alterna-
tively, the conditions used in assays for pectinase and
xylanase activities can affect enzyme expression and/or
activity and this may also affect the results obtained.
Invertase activity responsible for sucrose hydrolysis was
investigated despite not being related to cell wall degra-
dation, but no activity was detected. Sucrose is present in
the intercellular spaces of source organs and pathogens
may use sucrose as a source for carbon as well as energy
(Kim et al. 2004). Xanthomonas gardneri is known to be
able to utilize sucrose as a carbon source; however, we
have not detected any secreted invertase activity in this
study (Jones et al. 2004b). We conclude that most likely, as
reported for other bacteria (Kim et al. 2004), sucrose is
transported, with or without concomitant phosphorylation,
to the cell interior and then is hydrolyzed by invertase.
Plant pathogens can be divided in biotrophs, necrotrophs
and hemi-biotrophs (Thaler et al. 2004). While biotrophs
derive nutrients from living tissue, necrotrophs kill the host
and then feed on the dead tissue. Hemi-biotrophs are
pathogens that cannot clearly be placed in the two former
categories or that change their lifestyles according to
conditions or stage of their life cycle (Glazebrook 2005).
Although studies with X. gardneri are not yet available,
X. campestris pv. vesicatoria which colonizes the suscep-
tible host apoplast, is probably best described as a hemi-
biotroph (Thaler et al. 2004). Initially, when it invades the
tissue it has a biotrophic lifestyle; however, in the later
stages of infection it is necrogenic (Alfano and Collmer
1996). CWDE can have roles in pathogens of different
lifestyles as they act to facilitate penetration into host tissue
and/or derive substrates from the cell wall for their nutri-
tion. These enzymes may also play a role in triggering
plant defenses by generating signal molecules that stimu-
late host defense (Liu et al. 2005).
Our investigation of exoenzymatic activities of
X. gardneri responding to the presence of leaf tissue from a
susceptible host plant is important because although the
genomes of Xanthomonads have been sequenced (da Silva
et al. 2002) only a biochemical approach can answer the
question of which enzyme activities are present during the
pathogen interaction with a host plant. This is the first
report at a biochemical level to address the question of how
X. gardneri
interacts with host plant tissue. It is possible
that these enzymes play a role in the acquisition of nutri-
ents by X. gardneri or have a role in virulence. Future
experiments where X. gardneri cell wall degrading
enzymes are knocked out should help address this question
experimentally.
Acknowledgements This work was supported by CNPq, Interna-
tional Foundation of Science (IFS), grant number C/3576-1 and Third
Fig. 5 Time course of a-arabinofuranosidase activity secreted by
Xanthomonas gardneri grown in (a) minimal medium and (b) in the
presence of Arabidopsis leaves. Each time point was tested in
triplicate and the vertical bar corresponds to the standard deviation
World J Microbiol Biotechnol
123
World Academy of Sciences (TWAS), grant number 03-120 RG/BIO/
LA. E.S.C. was supported by a scholarship from the Universidade
Cato
´
lica de Brası
´
lia and CNPq.
References
Alfano JR, Collmer A (1996) Bacterial pathogens in plants: life up
against the wall. Plant Cell 8:1683–1698
Bouzar H, Jones JB, Stall RE, Hodge NC, Minsavage GV, Benedict
AA, Alvarez AM (1994) Physiological, chemical, serological, and
pathogenic analyses of a worldwide collection of Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria strains. Phytopathol 84:663–671
Bouzar H, Jones JB, Stall RE, Louws FJ, Schneider JL, de Bruijn FJ,
Jackson LE (1999) Multiphasic analysis of xanthomonads
causing bacterial spot disease on tomato and pepper in the
Caribbean and Central America: evidence for common lineages
within and between countries. Phytopathol 89:328–335
Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation
of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254
Bruce RJ, West CA (1982) Elicitation of casbene synthetase activity
in castor bean, the role of pectic fragments of the plant cell wall
in elicitation by fungal endo-polygalacturonase. Plant Physiol
69:1181–1188
Cardoso OAV, Filho EXF (2003) Purification and characterization of
a novel cellulase-free xylanase from Acrophialophora nainiana.
FEMS Microbiol Lett 223:309–314
Cuppels DA, Louws FJ, Ainsworth T (2006) Development and
evaluation of PCR-based diagnostic assays for the bacterial speck
and bacterial spot pathogens of tomato. Plant Dis 90:451–458
da Silva AC, Ferro JA, Reinach FC et al (2002) Comparison of the
genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host
specificities. Nature 417:459–463
Dye DW (1966) Cultural and biochemical reaction of additional
Xanthomonas species. NZJ Sci 9:913–919
Filho EX, Puls J, Coughlan MP (1996) Purification and characteriza-
tion of two arabinofuranosidases from solid-state cultures of the
fungus Penicillium capsulatum. Appl Environ Microbiol
62:168–173
Glazebrook J (2005) Contrasting mechanisms of defense against
biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu Rev Phytopathol
43:205–227
Gonzalez ET, Allen C (2003) Characterization of a Ralstonia
solanacearum operon required for polygalacturonate degradation
and uptake of galacturonic acid. Mol Plant Microbe Interact
16:536–544
Hahn MG, Darvill AG, Albersheim P (1981) Host–pathogen inter-
actions: XIX. The endogenous elicitor, a fragment of a plant cell
wall polysaccharide that elicits phytoalexin accumulation in
soybeans. Plant Physiol 68:1161–1169
Hildebrand DC, Palleroni NJ, Schroth MN (1990) Deoxyribonucleic
acid relatedness of 24 xanthomonad strains representing 23
Xanthomonas campestris pathovars and Xanthomonas fragariae.
J App Bacteriol 68:263–269
Jones JB, Lacy GH, Bouzar H, Stall RE, Schaad NW (2004a)
Reclassification of the xanthomonads associated with bacterial
spot disease of tomato and pepper. Syst Appl Microbiol
27:755–762
Jones AM, Thomas V, Truman B, Lilley K, Mansfield J, Grant M
(2004b) Specific changes in the Arabidopsis proteome in
response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene
mediated resistance. Phytochemistry 65:1805–1816
Katiyar-Agarwal S, Morgan R, Dahlbeck D, Borsani O, Villegas A,
Zhu JK, Staskawicz BJ, Jin H (2006) A pathogen-inducible
endogenous siRNA in plant immunity. Proc Natl Acad Sci
103(47):18002–18007
Kim HS, Park HJ, Heu S, Jung J (2004) Molecular and functional
characterization of a unique sucrose hydrolase from Xanthomo-
nas axonopodis pv. glycines. J Bacteriol 186:411–418
Liu H, Zhang S, Schell MA, Denny TP (2005) Pyramiding unmarked
deletions in Ralstonia solanacearum shows that secreted proteins
in addition to plant cell-wall-degrading enzymes contribute to
virulence. Mol Plant Microbe Interact 18:1296–1305
Lowe SE, Theodorou MK, Trinci AP (1987) Cellulases and xylanase
of an anaerobic rumen fungus grown on wheat straw, wheat
straw holocellulose, cellulose, and xylan. Appl Environ Micro-
biol 53:1216–1223
Miller GL (1959) Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determi-
nation of reducing sugar. Anal Chem 31:426–428
Quezado-Duval AM, Leite RP, Truffi D, Camargo LEA (2004)
Outbreaks of bacterial spot caused by Xanthomonas gardneri on
processing tomato in central-west Brazil. Plant Dis 88:157–161
Quirino BF, Bent AF (2003) Deciphering host resistance and
pathogen virulence: the Arabidopsis/Pseudomonas interaction
as a model. Mol Plant Pathol 4:517–530
Quirino BF, Genger R., Ham JH, Zabala G, Bent A (2004)
Identification and functional analysis of Arabidopsis proteins
that interact with resistance gene product RPS2 in yeast. Physiol
Mol Plant Pathol 65:257–267
Rajeshwari R, Jha G, Sonti RV (2005) Role of an in planta-expressed
xylanase of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in promoting
virulence on rice. Mol Plant Microbe Interact 18:830–837
Sato M, Mitra RM, Coller J, Wang D, Spivey NW, Dewdney J,
Denoux C, Glazebrook J, Katagiri F (2007) A high-performance,
small-scale microarray for expression profiling of many samples
in Arabidopsis-pathogen studies. Plant J 49(3):565–577
Schaad NW, Jones JB, Chun W (eds) (2001) Laboratory guide for
identification of plant pathogenic bacteria. APS Press, St. Paul,
Minnesota
Schaad NW, Vidaver AK, Lacy GH, Rudolph K, Jones JB (2000)
Evaluation of proposed amended names of several pseudomo-
nads and xanthomonads and recommendations. Phytopathology
87:807–813
Simpson RB, Johnson LJ (1990) Arabidopsis thaliana as a host for
Xanthomonas campestris pv. campestris. Mol Plant Microbe
Interact 3:233–237
Soriano M, Diaz P, Pastor FIJ (2005) Pectinolytic systems of two
aerobic sporogenous bacterial strains with high activity on
pectin. Curr Microbiol 50:114–118
Starr MP, Stephens WL (1964) Pigmentation and taxonomy of the
genus Xanthomonas. J Bacteriol 87:293–302
S
ˇ
utic D (1957) Tomato bacteriosis. Rev Appl Mycol 36:734–735
Thaler JS, Owen B, Higgins VJ (2004) The role of the jasmonate
response in plant susceptibility to diverse pathogens with a range
of lifestyles. Plant Physiol 135:530–538
Toth IK, Bell KS, Holeva MC, Birch PRJ (2003) Soft rot Erwiniae:
from genes to genomes. Mol Plant Pathol 4:17–30
Valette-Collet O, Cimerman A, Reignault P, Levis C, Boccara M
(2003) Disruption of Botrytis cinerea pectin methylesterase gene
Bcpme1 reduces virulence on several host plants. Mol Plant
Microbe Interact 16:360–367
Vauterin L, Hoste B, Kersters K, Swings J (1995) Reclassification of
Xanthomonas. Int J Syst Bacteriol 45:472–489
Vauterin L, Rademaker J, Swings J (2000) Synopsis on the taxonomy
of the genus Xanthomonas. Phytopathology 90:677–682
Vorwerk S, Somerville S, Somerville C (2004) The role of plant cell
wall polysaccharide composition in disease resistance. Trends
Plant Sci 9:203–209
Whalen MC, Innes RW, Bent AF, Staskawicz BJ (1991) Identification
of Pseudomonas syringae pathogens of Arabidopsis and a
World J Microbiol Biotechnol
123
bacterial locus determining avirulence on both Arabidopsis and
soybean. Plant Cell 3(1):49–59
Williams PH (1980) Black rot: a continuing threat to world crucifers.
Plant Dis 64(8):736–742
Yakoby N, Freeman S, Dinoor A, Keen NT, Prusky D (2000)
Expression of pectate lyase from Colletotrichum gloesosporio-
ides in C. magna promotes pathogenicity. Mol Plant Microbe
Interact 13:887–891
Young JM, Bull CT, de Boer SH, Firrao G, Gardan L, Saddler GE,
Stead DE, Takikawa Y (2001) Classification, nomenclature,
and plant pathogenic bacteria—a clarification. Phytopathol
91:617–620
World J Microbiol Biotechnol
123
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