Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR
AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO E DA ATIVIDADE
GENOTÓXICA DO Croton cajucara BENTH EM RATOS
DIABÉTICOS
FABIANA DOS SANTOS ROSA
Orientadora: Profª. Drª. Norma Possa Marroni
Co-orientador: Prof. Dr. Mauricio Lehmann
CANOAS
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR
AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO E DA ATIVIDADE
GENOTÓXICA DO Croton cajucara BENTH EM RATOS
DIABÉTICOS
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Diagnóstico Genético e
Molecular
FABIANA DOS SANTOS ROSA
Orientadora: Profª. Drª. Norma Possa Marroni
Co-orientador: Prof. Dr. Mauricio Lehmann
CANOAS
2007
ads:
Este trabalho foi realizado nas instalações do Centro de Pesquisas do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre, no Laboratório de Estresse Oxidativo e Antioxidantes da
Universidade Luterana do Brasil (ULBRA) e no Laboratório da Toxicidade
Genética (TOXIGEN) da Universidade Luterana do Brasil (ULBRA).
Dedico este trabalho à minha família
Que trabalhou em dobro,
Sacrificou seus sonhos em favor dos meus,
Que não foram somente pais e irmão,
Mas meus melhores amigos...
A vocês toda minha gratidão!
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À DEUS
Obrigado por tudo!
Recebi da vida muito mais do que merecia.
Obrigada por ter me dado mais uma chance.
AOS MEUS PAIS E A MEU IRMÃO
Não há palavras que possam definir com clareza Amor e Gratidão.
Assim é melhor defini-los com gestos, carinho e muita dedicação.
E foi exatamente desta forma que vocês me ensinaram: que honestidade, respeito
e amor não se compram, eles são frutos daquilo que construímos ao longo de
nossa vida.
Obrigada por tudo!
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Profª Drª Norma pelo empenho, generosidade e
sabedoria com que orientou este trabalho. Serei eternamente grata pela ajuda,
orientação e pelos diversos ensinamentos. Obrigado por tudo!
Ao Profº Dr Mauricio pela paciência, empenho e dedicação com que me
orientou. Obrigado por tudo!
Agradeço a todas as pessoas e serviços que possibilitaram a realização
deste trabalho:
A supervisão de enfermagem do HSLPUCRS (Enfª Neida e Enfª Janete)
por terem me proporcionado a troca de horários; as minhas chefias imediatas
(Enfª Stella e Enfª Miriam) por terem sempre acreditado em meu potencial e me
estimulado. A vocês meu muito obrigado, pois sem a participação de vocês eu
não teria conseguido, Obrigado!
Aos funcionários técnicos de enfermagem que formam minha equipe de
trabalho, meu muito obrigado, pela compreensão das noites de cansaço!
Aos queridos colegas: Graziela Rodrigues, Nelson K. Filho e Ronaldo
Campana Filho, pela grandiosa ajuda. Obrigado pelo tempo que vocês
dispensaram a mim. Ao companheirismo e ao auxilio no decorrer deste trabalho.
Sem a ajuda de vocês não teria iniciado e finalizado esta pesquisa. Meus sinceros
agradecimentos.
Aos colegas do Laboratório de Estresse Oxidativo e Antioxidantes da
ULBRA e do Laboratório de Fisiologia Digestiva e Hepatologia Experimental do
HCPA/UFRGS, e ao Laboratório de Toxicidade Genética da ULBRA, meu muito
obrigado, valeu pela ajuda e compreensão!
Aos professores da Pós-Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular,
pelo apoio e ensinamentos recebidos. Obrigado!
A secretaria da Pós-Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular,
pelos serviços prestados sempre com muita agilidade, organização e bom humor.
Obrigado!
Aos colegas do Mestrado em Diagnóstico Genético e Molecular, pelos
momentos de coleguismo, trocas, momentos de diversão e alegria. Em especial a
colega Cristiane, pela amizade e ajuda em todos os momentos. Obrigado!
“ Descobri como é bom chegar
quando se tem paciência,
e para se chegar onde quer que seja,
aprendi que não é preciso dominar a força,
mas a razão.
É preciso, antes de mais nada, querer.
Um dia é preciso parar de sonhar,
Tirar os planos das gavetas e,
De algum modo, partir...”
(Amyr Klink)
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS ………………………………………………………….11
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................13
LISTA DE TABELAS ............................................................................................14
RESUMO.............................................................................................................. 15
ABSTRACT.......................................................................................................... 17
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 18
1.1 Diabetes Mellitus............................................................................................ 19
1.2 Diabetes Mellitus Experimental ...................................................................... 27
1.3 Formação das Espécies Ativas de Oxigênio (EAO) ....................................... 30
1.4 Estresse Oxidativo ......................................................................................... 32
1.5 Lipoperoxidação (LPO)................................................................................... 34
1.6 Teste de Micronúcleos (MN) .......................................................................... 36
1.7 Croton cajucara BENTH................................................................................ 37
2 OBJETIVOS...................................................................................................... 43
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 44
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 44
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 45
3.1 Delineamento da Pesquisa............................................................................. 46
3.2 Animais........................................................................................................... 46
3.3 Considerações Bioéticas.................................................................................46
3.4 Delineamento Experimental ........................................................................... 47
3.5 Marcação e Pesagem .....................................................................................48
3.6 Indução do Diabetes Mellitus ......................................................................... 48
3.7 Preparação do Chá de Croton cajucara BENTH............................................48
3.8 Morte dos Animais.......................................................................................... 49
3.9 Determinação da Glicemia ............................................................................. 49
3.10 Avaliações Bioquímicas................................................................................ 50
3.10.1 Preparo dos Homogeneizados.................................................................. 50
3.10.2 Dosagem de Proteína................................................................................ 50
3.11 Determinação do Estresse Oxidativo ........................................................... 51
3.11.1 Determinação das Substâncias que Reagem ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS)............................................................................................................... 51
3.11.2 Atividade da Enzima Superóxido Dismutase (SOD).................................. 52
3.11.3 Atividade da Enzima Catalase (CAT) ........................................................ 52
3.12 Avaliação do Dano ao DNA em células da Medula Óssea........................... 53
3.12.1 Análise de Micronúcleos............................................................................ 53
3.13 Análise Estatística ........................................................................................ 54
4 RESULTADOS ..................................................................................................55
4.1 Peso Corporal e Glicose Sangüínea ...............................................................57
4.2 Determinação do Estresse Oxidativo ..............................................................60
4.3 Efeitos do DM induzido por estreptozotocina e do Croton cajucara BENTH
sobre a atividade das enzimas antioxidantes....................................................... 61
4.3.1 Atividade da Superóxido Dismutase (SOD)................................................. 62
4.3.2 Atividade da Catalase (CAT)....................................................................... 62
4.4 Determinação da Genotoxicidade do Croton cajucara Benth através do
Teste de Micronúcleos ......................................................................................... 63
5 DISCUSSÃO..................................................................................................... 66
6 CONCLUSÕES ................................................................................................. 76
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...............................................................................78
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 80
LISTA DE ABREVIATURAS
AAA
Ácido acetil aleuritólico
ADP
Adenosina Difosfato
ATP
Adenosina Trifosfato
> Mayor
µg
Microgramo
µL
Microlitro
µm
Micrômetro
µmol
Micromol
ºC
Graus Centígrados
Ca
++
Cálcio
CAT
Catalase
DM
Diabetes Mellitus
DM tipo1
Diabettes Mellitus insulino dependente
DM tipo2
Diabettes Mellitus não insulino
dependente
DCTN
desidrocrotonina
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
c.p.m
Contagens por minuto
DP
Desvio Padrão
EAO
Espécies Ativas de Oxigênio
g
gramas
g/dL
Gramas por decilitro
Glicose-6-
P
Glicose 6 fosfato
GR
Glutationa Redutase
GSH Glutationa Reduzida
GSSH
Glutationa Oxidada
GPx Glutationa Peroxidase
h hora
KCl Cloreto de Potássio
iNOS Óxido Nítrico Sintase Indúzivel
H
2
O Água
H
2
O
2
Peróxido de Hidrogênio
i.p. intraperitoneal
LPO
Lipoperoxidação
M
Molar
mg
Miligramo
Mg/Kg
Miligrama por quilograma
min
Minuto
mM
Milimolar
mm
Milímetro
mL
mililitros
nm
Nanômetro
mRNA
RNA mensageiro
NaCl
Cloreto de Sódio
NAD Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
Reduzido
NADPH Fosfato Nicotinamida Adenina
Dinucleotídeo
NCE Eritrócito normocromático
MN Micronucleo
NFkB Fator de Transcrição Nuclear Kappa B
O
2
Oxigênio
O
2
•-
Radical Ânion Superóxido
1
O
2
Oxigênio Singlet
OH
•
Radical Hidroxila
PCE Eritrócito policromático anucleado
PGs Prostaglandinas
pH Potencial de Hidrogênio
Q Quercetina
RL Radicais Livres
RNA Ácido Ribonucléico
rpm Rotações por minuto
STZ Estreptozotocina
SOD Superóxido Dismutase
t-DCTN
Trans-desidrocrotonina
t-CTN
Trans-crotonina
TBARS Substancias reativas ao ácido
tiobarbitúrico
TNF-α Fator de Necrose Tumoral α
TPM Transição da permeabilidade mitocondrial
UV Ultravioleta
13
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Efeito da hiperglicemia na formação da proteína glicosilada e da auto-
oxidação da glicose, bem como a formação das espécies ativas de oxigênio
(EAO) e o aumento da via do sorbitol. GSH- glutationa
reduzida.................................................................................................................25
FIGURA 2: Atuação da estreptozotocina nas células pancreáticas beta
(produtoras de insulina).........................................................................................30
Figura 3: Representação dos eritrócitos A –-NCE (eritrócito normocromático); B -
PCE (eritrócito policromático anucleado); C – MNPCE (eritrócito policromático
com MN).................................................................................................................37
Figura 4: Vista geral da planta Croton cajucara BENTH em seu ambiente
natural....................................................................................................................41
Figura 5: Cascas do caule do Croton cajucara BENTH . .....................................42
Figura 6: Peso inicial dos animais nos diferentes grupos estudados...................57
Figura 7: Peso final dos animais nos diferentes grupos estudados......................58
Figura 8: Determinação da glicemia inicial dos animais nos diferentes grupos
estudados...............................................................................................................59
Figura 9: Determinação da glicemia final dos animais nos diferentes grupos
estudados...............................................................................................................60
Figura 10: Determinação da medida das substâncias que reagem ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS)………………………………………………………………….61
Figura 11: Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD).............................62
Figura 12: Atividade da enzima catalase (CAT)....................................................63
Figura 13: Freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMNs)
em medula óssea de ratos machos diabéticos e não diabéticos tratados com
extrato aquoso da casca do caule do Croton cajucara
BENTH...................................................................................................................66
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMNs) e
relação PCE/NCE em medula óssea de ratos machos diabéticos e não-diabéticos
tratados com solução aquosa da casca do caule de Croton cajucara
BENTH...................................................................................................................65
15
RESUMO
O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença endócrino-metabólica freqüente,
que afeta mais de 30 milhões de pessoas em todo o mundo, e estudos
experimentais e clínicos sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na
patogênese e na progressão da mesma. A espécie Croton cajucara BENTH
(CcB) é uma planta natural da região Amazônica. As folhas e as cascas do caule
dessa planta são usadas pela população na forma de chá ou cápsulas, para tratar
várias doenças entre elas, o diabetes. Este estudo teve como objetivo avaliar o
extrato aquoso da casca do caule do Croton cajucara BENTH em relação à
indução de estresse oxidativo e danos ao DNA em ratos diabéticos e não
diabéticos. Os parâmetros utilizados para a análise de estresse oxidativo no
fígado envolveram a mensuração da lipoperoxidação, através das técnicas das
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a avaliação da atividade
das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD). Para
avaliar a atividade genotóxica do extrato foi utilizado o teste de micronúcleos (MN)
em medula óssea.
Para tanto, ratos machos da linhagem Wistar, pesando entre 250-350g,
foram divididos em 6 grupos: controle (CO); 5 dias de tratamento com o extrato
(CcB5D); 20 dias de tratamento com o extrato (CcB20D); diabéticos (DM);
diabéticos com 5 dias de tratamento com o extrato (DMCcB5D) e diabéticos com
20 dias de tratamento com o extrato (DMCcB20D). O diabetes foi induzido por
administração intraperitoneal de estreptozotocina (STZ) na dose de 70mg/Kg.
Os resultados obtidos demonstram que a concentração da glicose
sangüínea aumentou nos animais diabéticos (DM) e em relação ao grupo
controle, assim como houve aumento de TBARS e da atividade da SOD no tecido
hepático dos mesmos. Quanto aos animais não-diabéticos tratados com CcB, não
foi observada diferença nos níveis de glicemia, quando comparado ao grupo
controle. Por outro lado, verificou-se aumento de TBARS e da atividade da SOD
no grupo CcB20D. A atividade da CAT não apresentou diferenças significativas
entre os grupos estudados, assim como a administração do CcB aos animais
16
diabéticos não alterou nenhum dos parâmetros avaliados. No que se refere à
atividade genotóxica, o extrato aquoso do CcB mostrou-se destituído de ação
mutagênica (quebra ou perda cromossômica).
17
ABSTRACT
Diabetes Mellitus (DM) is a common endocrine-metabolic disease that
affects 30 million people worldwide. Laboratory and clinical studies have
suggested that oxidative stress is involved in DM pathogenesis and progression.
Croton cajucara BENTH (CcB) is a plant species native to the Amazonian region,
whose leaves and bark are used by the native population as tea infusion or
capsules in the treatment of several diseases, among DM. The present study
aimed to evaluate the aqueous extract of Croton cajucara BENTH bark in inducing
oxidative stress and DNA damage in diabetic and non-diabetic rats. The
parameters used in the liver oxidative stress analysis involved the measurement of
lipoperoxidation. The techniques adopted were the thiobarbituric acid reactive
substances assay (TBARS) and the activity of antioxidant enzymes catalase
(CAT) and superoxide dysmutase (SOD). The bone marrow micronucleus assay
(MN) was used to assess the genotoxic activity of the extract.
Six groups of male Wistar rats weighing 250-350 g were formed: control
animals (CO); healthy rats with 5-day extract treatment (CcB5D); healthy rats with
20-day extract treatment (CcB20D); diabetic rats (DM); diabetic rats with 5-day
extract treatment (DMCcB5D); and diabetic rats with 20-day extract treatment
(DMCcB20D). Diabetes was induced by intraperitoneal administration of
streptozotocin (STZ) at a 70-mg/kg dose.
The results revealed that glucose concentration in blood was higher in
diabetic animals (DM) as compared to the control group. Also, an increase in
TBARS and in SOD activity was observed in the hepatic tissue of the diabetic
animals. Concerning the healthy animals treated with CcB, no difference was
observed between their glycemic levels and those of the control group. On the
other hand, increases in TBARS reaction and SOD activity were observed in the
CcB20D group. CAT activity did not show any significant differences between the
studied groups. Also, the administration of CcB to diabetic animals failed to alter
the evaluated parameters. As for genotoxic activity, the aqueous CcB extract
proved not to have mutagenic action (chromosomal loss or breakage).
INTRODUÇÃO
19
1 INTRODUÇÃO__________________
1.1 Diabetes Mellitus
O Diabetes Mellitus (DM) é uma desordem metabólica de etiologia múltipla,
caracterizada por uma hiperglicemia crônica com distúrbios no metabolismo dos
glicidios, lipídios e proteínas, resultantes de deficiências na secreção ou ação da
insulina, ou ambas. Os efeitos do Diabetes Mellitus a longo prazo, incluem danos,
disfunção e falência de vários órgãos. Pode apresentar sintomas característicos
tais como sede, poliúria, visão turva e perda de peso; e em casos mais graves
pode desenvolver cetoacidose, ou um estado hiperosmolar não-cetônico que
pode conduzir à letargia, coma, e na ausência de tratamento adequado, à morte
(Sociedade Portuguesa de Diabetologia, 2006).
O DM, conhecido por afetar seres humanos desde os tempos antigos, foi
descrito como a doença que culminava em conseqüências calamitosas. Arateus
(81-138 d.C.) escreveu sobre a “maravilhosa” natureza da doença, que consistia
em “desfazer o corpo em urina”, e era acompanhada por uma terrível sede que
não podia ser saciada. A concentração abundante de glicose carregada pela urina
deu à doença seu nome. Diabetes refere-se ao fluxo de fluido através do sifão, e
mellitus vem da palavra mel. Na idade média, o DM era conhecido como “a
doença da má urina” (SILVERTHORN, 2003).
O DM é uma doença endócrino-metabólica freqüente, que afeta mais de 30
milhões de pessoas em todo o mundo (THOMPSON et al.,1995). E continua a ser
um desafio terapêutico na atualidade. Apesar dos dramáticos avanços no
tratamento e prognóstico desta doença no último século, o DM permanece sendo
uma doença de alta morbidade e mortalidade. A prevenção, tratamento e cura do
Diabetes Mellitus são desafios de ordem mundial, visto que esta doença afeta 1 a
2% da população global (BAUER, 2005).
20
As complicações secundárias, decorrentes da exposição crônica do
organismo a níveis elevados de glicose são observadas em 30% a 50% dos
pacientes com DM (KEEN,1994). E resultam no comprometimento da qualidade
de vida, incapacidade para o trabalho e morte prematura, entre outros, além de
onerarem excessivamente o sistema de saúde (NATHAN, 1993; WILD et al.,
2004).
Embora os dados sobre a incidência e prevalência do DM, no Brasil e no
mundo, não sejam os mais acurados, sabe-se que mais de 18 milhões de
americanos vivem com a doença atualmente e aproximadamente 1,3 milhões de
novos casos são diagnosticados a cada ano naquele país (BAUER, 2005).
A prevalência do diabetes vem crescendo de forma notável, e o advento
da industrialização e urbanização populacional ocorrido nos últimos anos
aceleram este processo (KIRSTEN, 2006). As mudanças no estilo de vida
reduziram a atividade física que, juntamente com uma alimentação mais calórica,
favorecem a ocorrência de obesidade, estresse e hipertensão arterial (MILECH &
OLIVEIRA, 2004).
Em 2000, havia aproximadamente 171 milhões de diabéticos no mundo e
estima-se que este número aumente para 366 milhões em 2030 (WILD et al.,
2004). No Brasil, segundo estimativas do Ministério da Saúde, em 1996 havia
aproximadamente 5 milhões de diabéticos, sendo 90% destes do tipo 2 e 10% do
tipo 1 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1996).
O “Diabetes Health Economics Study Groups” da Federação Internacional
de Diabetes, estima que em 2025, cerca de 300 milhões de pessoas apresentarão
esta doença (GRUBER et al.,1998). Embora o DM tipo 2 seja o mais preocupante
devido a sua prevalência crescente nos últimos anos, o DM tipo 1 cresce
paralelamente (KIRSTEN, 2006).
21
Nos Estados Unidos, há uma estimativa que 123.000 crianças e 1,4
milhões de adultos tenham o DM tipo 1. Anualmente, no mínimo 60.000 crianças
são diagnosticadas em todo o mundo, incluindo 12.000 nos Estados Unidos
(REWERS & KLINGESNSMITH,1997) e de 18 a 20/100.000 crianças no Reino
Unido (DEVENDRA et al., 2004).
No Brasil, existem poucos estudos epidemiológicos sobre o DM tipo 1
(KIRSTEN, 2006). Estudos em três cidades do interior paulista, constataram a
incidência de 7.6/100.000 habitantes naquela população (FEREIRA et al., 2000);
em Londrina, no estado do Paraná, a taxa encontrada foi de 12.7/100.000
habitantes (CAMPOS et al.,1998).
Esta doença apresenta uma variedade de alterações bioquímicas, mas a
fundamental é a redução da entrada de glicose nos tecidos periféricos e o
aumento na liberação de glicose circulante pelo fígado (GANONG,1995). Antes de
1921, a principal causa de morte entre os pacientes diabéticos era a cetoacidose
diabética. Entretanto, desde o descobrimento da insulina, em 1921, a principal
causa de morte entre os pacientes diabéticos envolve as alterações dos grandes
e pequenos vasos sanguíneos (DIAS, 2000).
A American Diabetes Association (ADA) recomenda o termo diabetes tipo1
para o diabetes imuno-mediado, com destruição das ilhotas pancreáticas
(DEVENDRA et al., 2004).
A história natural do DM tipo 1 inclui quatro estágios distintos: (l) pré-
clínico: auto-imunidade dirigida às células beta, com uma distinção aguda e
progressiva da resposta insulínica à glicose intravenosa e oral; (ll) início do
diabetes clínico; (lll) reversão transitória; (lV) diabetes associado com
complicações aguda, crônicas e morte (REWERS et al.,1997).
A exposição do organismo a níveis séricos elevados de glicemia durante
anos é o fator de risco principal para o desenvolvimento de complicações
22
crônicas, como doenças cardiovasculares e vasculares periféricas, retinopatia,
nefropatia, dermopatia diabética, neuropatia periférica e vasculopatia, sendo o
controle rigoroso da glicose, em níveis normoglicêmicos de fundamental
importância para retardar ou evitar as complicações secundárias do DM (KEEN,
1994; BOUNDY, 2004).
Em geral, a neuropatia periférica acomete as mãos e os pés e pode causar
parestesia ou dor. A neuropatia autônoma evidencia-se de várias maneiras,
incluindo-se gastroparesia (que retarda o esvaziamento gástrico e acarreta
sensação de náuseas e plenitude pós-prandial), diarréia noturna, disfunção sexual
e hipotensão postural (BOUNDY, 2004).
A hiperglicemia diminui a resistência do hospedeiro a infecções, porque a
concentração de glicose na epiderme e na urina favorece o crescimento
bacteriano. Por isso, o paciente é suscetível a infecções da pele e do trato urinário
(BOUNDY, 2004). Alguns autores acreditam que as complicações que o DM
determina em diversos tecidos podem ser causadas pelo estresse oxidativo, em
que podemos incluir a alteração da condução nervosa, auto-oxidação da glicose
sangüínea, formação de glicosilação avançada e um aumento da enzima aldose
redutase (LOW at al.,1997).
O diabetes tipo 1 e o tipo 2 são as formas mais prevalentes e incidentes e
se destacam pela diferença na forma da apresentação clínica (KIRSTEN, 2006).
Conforme BOUNDY (2004), as causas do diabetes tipos 1 e 2 ainda não são
conhecidas. Fatores genéticos podem influir no desenvolvimento da doença.
Distúrbios auto-imunes e infecções virais podem ser fatores de risco para o
diabetes mellito tipo 1. Outros fatores de risco são:
• Obesidade, que contribui para a resistência à insulina endógena.
• Estresse fisiológico ou emocional, que pode causar elevação prolongada
dos níveis dos hormônios do estresse (cortisol, epinefrina, glucagon e
23
hormônio do crescimento) e em seguida aumentar a glicose sanguínea e
acentuar as demandas impostas ao pâncreas.
• Gravidez, que causa ganho ponderal e aumenta os níveis do estrogênio e
dos hormônios placentários.
• Alguns fármacos, incluindo diuréticos tiazídicos, corticóides supra-renais
e anticoncepcionais orais, que antagonizam os efeitos da insulina.
O controle da glicemia nas pessoas com diabetes é crítico por três razões:
(l) a insulina é necessária para a prevenção de cetoacidose fatal; (ll) a falta do
controle da glicemia e a conseqüente hiperglicemia associam-se a sintomas como
polidipsia, poliúria, fadiga, entre outros; (lll) indivíduos com diabetes de longa
data, possuem risco aumentado para o desenvolvimento de complicações
secundárias (ROSSINI et al., 2001), como retinopatia, nefropatia e vasculopatia,
além de maior suscetibilidade a certas infecções por fungos, bactérias e vírus
(JOSHI et al.,1999).
Diversos fatores podem estar envolvidos nos mecanismos responsáveis
pelas alterações metabólicas decorrentes do DM, e a hiperglicemia se destaca
como a principal alteração clinica, pois contribui para o aumento nas ligações da
glicose circulante com as proteínas sangüíneas (principalmente a albumina), o
qual é denominada glicosilação não enzimática (BAYNES, 2003), bem como com
a auto-oxidação da glicose (WOLFF & DEAN,1987; WOLF et al., 1991), conforme
representado na Figura 1.
A contribuição do estresse oxidativo para o estabelecimento de um quadro
de neuropatia periférica tem sido bem estabelecida por estudos realizados por
CAMERON et al. (1998), que determinam que o estresse oxidativo causado pelo
DM leva a uma diminuição do fluxo de sangue para a região endoneural,
resultando em hipóxia para essa região. Este aumento na formação de espécies
ativas de oxigênio impede um adequado suporte neurotrófico e causa alteração
no balanço intracelular, deficiência no aporte energético, culminando na
diminuição do mecanismo de transporte iônico.
24
O tratamento intensivo com insulina adia, efetivamente, o início da
progressão de doenças crônicas secundárias em pacientes com DM tipo 1. Os
efeitos benéficos deste tratamento, podem não ser garantidos à comunidade em
geral, pelo alto custo envolvido (GOTOH et al., 2000). Além disto, um controle
glicêmico inadequado está associado à ocorrência freqüente de hipoglicemias
(THE DCCT,1993).
A doença crônica, de acordo com ROSSI (2003), pode começar como uma
condição aguda, às vezes insignificante, mas que se prolonga, alternando
períodos de exacerbação e remissão. Mesmo sendo possível controla-la, as
restrições impostas pelo tratamento e o acúmulo de eventos podem levar a uma
alteração drástica no estilo de vida da pessoa. A qual, se vê diante de uma
situação nunca antes vivida e tem que ser otimista para encarar um tratamento
pelo tempo que lhe há de vida, podendo ser acometida por sentimentos de
ansiedade, depressão e raiva. De acordo com o mesmo autor, a doença crônica
tem algumas características que impõem limitações nas capacidades funcionais
do indivíduo, podendo o impacto proporcionado por ela estender-se a todos os
membros da família e amigos.
Novas alternativas de aplicação de insulina, como o uso de bombas de
insulina de ação rápida, por infusão contínua subcutânea, que permitem menor
oscilação da glicemia nas 24 horas do dia, ou insulina de ação ultraprolongada,
cujo efeito persiste por 24 horas, permitindo assim uma única aplicação durante o
dia, vêm sendo desenvolvidas e buscam oferecer maior liberdade e qualidade de
vida ao paciente diabético (DILLS ,2002).
25
FIGURA 1- Efeito da hiperglicemia na formação da proteína glicosilada e da auto-
oxidação da glicose, bem como a formação das espécies ativas de oxigênio
(EAO) e o aumento da via do sorbitol. GSH- glutationa reduzida (adaptado de
VAN DAM, 2002).
Auto-oxidação da glicose
↓
↓↓
↓ Defesa
antioxidante
Proteína
glicosilada
EAO
EAO
Peroxidação lipídica
Disfunção da mitocôndria
GSH do nervo
periférico
Isquemia do nervo
Capilar
Endotélio
Via do Sorbitol
Hiperglicemia
Fluxo sangüíneo
EAO
26
Esta “condição crônica”, que se prolonga no decorrer da vida, provoca forte
impacto nas relações com o ambiente físico e social, expressando-se por um
novo estilo de vida. Os fatores que podem gerar ansiedade são o medo de perder
a posição social, medo e mutilação cirúrgica, perda da dignidade, medo da morte,
da dor incontrolável e incerteza do futuro. Os sentimentos de raiva são expressos
por irritabilidade, ressentimentos da doença e frustração com o fracasso ou
tratamento (ROSSI, 2003). A depressão é vivenciada pelo sentimento de falta de
ajuda, problemas financeiros, perda de habilidades físicas e posição social
desvalorizada. Além disso, há a necessidade de uma mudança no estilo de vida e
a dependência de medicamentos.
O “Diabetes Control and Complications Trial” (DCCT) demonstrou que
utilizando o tratamento intensivo com insulina, juntamente com uma equipe
multidisciplinar treinada, é possível alcançar um controle glicêmico próximo do
normal por vários anos ocasionando, assim, uma melhor expectativa de vida para
esses pacientes (KEEN,1994),.
A importância do DM do ponto de vista social e econômico é inegável,
devido às altas taxas de morbidade, mortalidade e de incapacitação para o
trabalho. Assim, fica evidente que tal doença mereça uma atenção e cuidados
especiais no sentido de uma detecção precoce dos indivíduos susceptíveis para
que haja possibilidade de intervenção profilática nos mesmos (BALDA et
al.,1999).
Desta forma, a utilização de modelos animais experimentais torna-se de
grande valia para que o estudo no campo de doenças auto-imunes se difunda e
possa colaborar principalmente na prevenção do processo autoimunológico
(PARSLOW et al.,2000). A utilização de modelos animais, que expressam a
doença de forma similar ao verificado em humanos, proporciona um melhor
entendimento da fisiopatologia, oferecendo oportunidades de pesquisa na
formulação de novas modalidades terapêuticas.
27
De acordo com o exposto, faz-se necessários estudos adicionais sobre
esta doença, para que novas descobertas tragam uma melhor qualidade de vida a
estes pacientes.
1.2 Diabetes Mellitus Experimental
Grande parte dos conhecimentos científicos que o homem adquiriu na área
da biomedicina visando, primordialmente, à saúde humana e à dos animais
domésticos foi possível, em grande parte, graças ao uso dos animais de
laboratório em suas pesquisas. Esta íntima relação entre pesquisa biomédica e
uso de animais de laboratório se deve, principalmente, ao conhecimento científico
adquirido a respeito destes animais (ANDERSEN et al., 2004).
Animais de laboratório são definidos como aqueles criados e produzidos
sob condições ideais e mantidos em ambiente controlado, com conhecimento e
acompanhamento microbiológico e genético seguros, obtidos por monitoração
regular (ANDRADE, 2002).
Após vários anos de pesquisa, foram criadas numerosas linhagens de
animais cosangüíneos e híbridos capazes de reproduzir as variáveis causadas
por diferenças genéticas e, mais recentemente, os animais foram classificados
quanto ao “status” sanitário ou ecológico, visando a prevenção de erros induzidos
por diferenças ambientais (COUTO SER, 2002). A padronização dos animais
utilizados em pesquisa é indispensável, pois diminui o número de animais
necessários para atingir a exatidão ou reprodutibilidade do experimento. Assim, o
ambiente onde os animais são mantidos e/ou criados deve prevenir erros
induzidos por diferenças ambientais, denominados padrão sanitário, e este deve
ser definido conforme a relação dos animais com o seu ambiente (MEZADRI et
al., 2004).
Diversos modelos animais, utilizados no estudo do DM experimental
contribuíram para um melhor entendimento das causas, conseqüências e
28
tratamentos da doença. No primeiro estudo envolvendo animais e alterações
metabólicas, foi removido o pâncreas de um cão e produzida uma condição
clínica semelhante à apresentada por humanos. O mesmo modelo foi empregado
por Frederick Banting e Charles Best na Universidade de Toronto no ano de 1921,
a partir do qual descobriram a insulina e realizaram os primeiros estudos em
busca de uma terapêutica apropriada para tratar o DM (PICKUP et al.,1997).
Como o DM é transmitido geneticamente e demora muito tempo para
determinar alterações fisiológicas, os modelos experimentais podem ser utilizados
para aumentar a rapidez no desenvolvimento da doença (DIAS,2005). Atualmente
é aceito que o DM tipo 1 se caracteriza pela destruição auto-imune das células
beta pancreáticas, que são as responsáveis pela produção da insulina. A
utilização de animais com DM auto-imune e, mais recentemente, o aparecimento
de modelos experimentais transgênicos, que possuem a expressão imune para o
desenvolvimento da doença, tem ajudado a esclarecer as condições moleculares
que podem ocorrer em humanos (PICKUP et al.,1997).
Um dos principais problemas na geração do diabetes experimental em
roedores foi resolvido há alguns anos com a utilização da estreptozotocina, que
atua diretamente na indução da morte das células beta do pâncreas. Entretanto,
para o desenvolvimento da neuropatia diabética os animais utilizados nos
experimentos devem sobreviver por um longo período de tempo, mas a incidência
de morte destes animais torna-se muito grande, o que determina um atraso nos
estudos e provavelmente o não desenvolvimento da neuropatia periférica
(HOUNSOM et al., 1997).
A droga chamada estreptozotocina (STZ), atualmente chamada de
estreptozocina nos Estados Unidos, é uma nitrosuréia isolada derivada da
bactéria Streptomyces griseus. Quando utilizada em animais determina uma
severa deficiência de insulina e o quadro de hiperglicemia é instalado. As doses
de STZ (podendo variar de 50 a 100mg/kg de peso corporal) causam necrose das
29
células beta, e o diabetes se desenvolve em um ou dois dias, após a aplicação da
droga.
Este achado foi confirmado em estudo experimental realizado por MELO
(2001), que utilizou a STZ na indução do DM e ficou demonstrado que, 18 horas
após a aplicação da droga, houve a indução do DM.
O mecanismo de ação da STZ é semelhante ao de outra droga também
utilizada para desenvolver o DM, o aloxano. Após a administração do aloxano ou
da STZ, ocorre destruição das membranas celulares e indução de quebra no
DNA, levando à ativação da enzima poli (ADP-ribose) sintase e à depleção da
nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) (YAMAMOTO et al.,1981). Esta enzima
está localizada no núcleo das células beta do pâncreas e necessita de NAD para
realizar o reparo do DNA nuclear. Um aumento na sua atividade pode levar à
depleção do NAD intracelular, sendo impossível produzir insulina nas células beta
do pâncreas.
Os fenômenos citados anteriormente podem ser prevenidos através da
administração de nicotinamida e picolinamida, pois são substâncias que inibem a
ação da poli (ADP-ribose) sintase, ocorrendo assim uma homeostase nos níveis
de NAD intracelular e na produção de insulina (UCHIGATA et al.,1983).
A formação de radicais livres parece ter implicação na destruição das
células beta, pois enzimas que conseguem neutralizar a formação destes radicais,
como a enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), ao serem
administradas em animais que receberam a estreptozotocina diminuíam os efeitos
diabetogênicos determinados pela administração da droga (ROBBINS et
al.,1980), conforme ilustrado na FIGURA 2.
30
FIGURA 3. Atuação da estreptozotocina nas células pancreáticas beta
(produtoras de insulina). Adaptado de PICKUP & WILLIAMS, 1997.
LIKE & ROSSINI (1976) desenvolveram o DM em camundongos após a
aplicação de repetidas doses subdiabetogênicas de STZ (5mg/kg de peso
corporal). As alterações decorrentes foram semelhantes às observadas em
humanos, com grande quantidade de células inflamatórias nas ilhotas
pancreáticas, sugerindo uma resposta auto-imune, que influenciaria danos no
DNA dos animais. A partir desses achados, iniciaram-se os estudos com as
linhagens de animais geneticamente modificados para desenvolver o DM (LIKE &
ROSSINI,1976).
1.3 Formação das Espécies Ativas de Oxigênio (EAO)
Espécies ativas de oxigênio (EAO) são constantemente geradas em
condições normais como conseqüência do metabolismo aeróbico. O oxigênio é
uma molécula estável que atua no organismo como um receptor de elétrons, que
31
é reduzido até água durante a respiração celular, nas mitocôndrias. Durante o
processo de redução, o oxigênio pode receber um elétron, ao invés dos dois
possíveis pela sua conformação, gerando radicais livres de oxigênio (BAUER,
2005).
A formação das EAO em sistemas biológicos está bem estabelecida.
Comprovou-se a geração destas espécies em diversos locais das células animais
como mitocôndria, lisossomos, peroxissomas, membrana plasmática, membrana
nuclear e retículo endoplasmático, bem como no citosol (DIAS, 2000).
Os radicais livres podem ser formados pela perda de um elétron de um
não-radical ou pelo ganho de um elétron por um não-radical. Eles também podem
ser formados quando uma ligação covalente é quebrada e cada um dos átomos
fica com um elétron. Esse processo é chamado de fissão heterolítica
(HALLIWELL et al.,1999).
As EAO se formam durante a redução de O
2
à água na cadeia de
transporte de elétrons mitocondrial. O termo radical livre é determinado quando
uma espécie química como um átomo de hidrogênio ou cloro, um metal de
transição ou uma molécula, possui um elétron não pareado no seu último orbital
(BOVERIS,1998). O elétron não pareado neste orbital confere uma alta
reatividade à molécula, que apresenta forte tendência a adquirir um segundo
elétron para este orbital. Essas espécies altamente reativas têm o potencial de
oxidar moléculas biológicas, incluindo proteínas, lipídios, glicídios e ácidos
nucléicos. Quantidade aumentada de metabólitos oxidados destas moléculas tem
sido detectada em pacientes com uma variedade de doenças (MAXWELL,1995),
tais como câncer, cirrose, artrite, catarata, entre outras.
A estabilidade do radical livre é adquirida por remoção de elétrons de
moléculas vizinhas, produzindo um par eletrônico. Uma forma que expressa e
compara a reatividade química é o tempo de meia vida da espécie química, ou
seja, um curto tempo de meia vida indica uma alta reatividade, sendo que o
32
radical hidroxila parece ser o mais reativo (HALLIWELL et al.,1999). Como o
Diabetes Mellitus é considerado uma doença auto-imune, estudos sugerem que
as EAO podem participar na sua patogênese (HOTTA et al., 2000).
1.4 Estresse Oxidativo
O termo estresse oxidativo é definido quando há uma alteração no balanço
pró-oxidante e antioxidante. No organismo poderia ser também definido como
“uma medida nos níveis de espécies ativas de oxigênio (EAO) no sistema
biológico” (PACKER et al., 2000). Essa definição pode ser completada quando
relacionamos a formação e o consumo de espécies ativas de oxigênio. Como os
metabólitos produzidos pelas EAO se estabelecem em diversos locais
subcelulares, tipos de células, estágios de crescimento, desenvolvimento celular e
regiões dentro da mesma célula, fica difícil conceituar o estresse oxidativo.
De acordo com NOUROOZ-ZADEH (1995), há uma forte evidência de que
existe formação de inúmeros marcadores de estresse oxidativo e que estes estão
aumentados no Diabetes Mellitus (DM). Em estudo realizado pelo mesmo autor,
com pacientes diabéticos, foi demonstrado que a concentração de hidroperóxidos
lipídicos, isoprostanos, malondialdeído e lipoproteínas oxidadas plasmáticas
estava elevada quando comparada à observada em pessoas sem DM.
Os níveis intracelulares dos antioxidantes como o α-tocoferol e a glutationa
estão reduzidos no DM, entretanto a atividade enzimática dos antioxidantes
parece estar levemente aumentada (BELLOMO et al.,1997; NOUROOZ-ZADEH
et al.,1995). Similarmente, existem muitos estudos sobre as conseqüências do
balanço pró-oxidantes e antioxidantes que atuam nas células e a importância
deste mecanismo no desenvolvimento das complicações vasculares.
A hipótese de que a modificação das lipoproteínas de baixa densidade
presentes no sangue, por meio de sua oxidação ou glicosilação e a reação
citotóxica que esta determina nas células endoteliais, é sustentada por diversos
33
autores como sendo o mecanismo responsável pelo estresse oxidativo
(STEINBERG et al., 1989).
O estresse oxidativo pode causar dano a todos os tipos de biomoléculas,
incluindo DNA, proteínas e lipídios (lipoperoxidação). O principal alvo celular de
estresse oxidativo pode variar dependendo da célula, do tipo de estresse imposto
e da intensidade do estresse. O estresse oxidativo intenso pode produzir danos
irreversíveis, levando à morte celular (HALLIWEL et al.,1999).
Para combater o estresse oxidativo há os sistemas antioxidantes de defesa
do organismo que são formados pelo sistema enzimático e não enzimático. Os
antioxidantes enzimáticos são enzimas que removem as espécies ativas de
oxigênio e outras espécies reativas, destacando-se as enzimas superóxido
dismutase (SOD) e catalase (CAT), alvos de nosso estudo.
A SOD é uma enzima que catalisa a dismutação do O
-
2
para formar H
2
O
2
e
O
2
, conforme reação a seguir. Essa reação pode ocorrer espontaneamente em
pH fisiológico, porém, sua velocidade é 10
4
vezes maior com a presença da SOD
(LLESUY,2002).
Essa enzima é ubíqua e apresenta uma variedade de isoformas. Uma delas
contém cobre e zinco em seu sitio de ativação e é encontrada no citosol das
células eucarióticas. Sua atividade enzimática foi descoberta por McCord em
1969. Dentro da mitocôndria, a SOD está presente, ligada ao manganês, estando
localizada na matriz mitocondrial.
2 O
-
2
+ 2H
+
H
2
O
2
+ O
2
SOD
34
O H
2
O
2
formado pela dismutação do O
-
2
, pode ser transformado em H
2
O
pela reação da CAT , conforme reação a seguir.
A CAT que está presente em todos os tecidos de mamíferos é uma
hemoproteína com atividade de peroxidase específica para H
2
O
2
. Atuando
simultaneamente como hidroperóxido e como doador de hidrogênio.
O mecanismo catalítico da CAT e a sua velocidade de reação muito alta
dificultam a sua saturação pelo substrato, o H
2
O
2
. A CAT se encontra,
principalmente nos peroxissomas, de onde remove o H
2
O
2
gerado pela -
oxidação dos ácidos graxos ou pela oxidação dos alcanos. Também está
presente nos eritrócitos e em menor quantidade no plasma. A sua alta atividade
catalítica é a responsável pela regulação dos níveis intracelulares de H
2
O
2
(LLESUY,2002).
O sistema de defesa não-enzimático é formado por antioxidantes
hidrossolúveis e lipossolúveis. Os antioxidantes hidrossolúveis são compostos
que têm alta afinidade pela água, como a glutationa, o ácido úrico e o ácido
ascórbico (vitamina C). Os antioxidantes lipossolúveis são compostos que tem
alta afinidade por lipídios, destacam-se os carotenóides, a vitamina E e a
bilirrubina (DIAS, 2005). Sendo o DM uma doença multifatorial, a investigação de
substâncias que bloqueiam ou diminuem os danos hepáticos determinados pela
doença é de extrema validade e relevância.
1.5 Lipoperoxidação (LPO)
2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2
CAT
35
A formação de radicais livres lipídicos é considerada uma importante forma
de injúria celular. Esse tipo de reação, denominada auto-oxidação dos radicais
livres, requer um elemento para dar início à cascata de reações. A
lipoperoxidação geralmente inicia com a extração dos átomos de hidrogênio que
contém um elétron para ser conjugado à ligação dupla da cadeia dos ácidos
graxos da membrana.
Quando um radical livre reage com um composto não-radical, pode ser
formado outro radical livre, ocorrendo neste momento reações em cadeia. Esse
mecanismo é o que ocorre na lipoperoxidação, a qual envolve os ácidos graxos
poliinsaturados (SOUTHORN et al., 1988). HALLIWEL & GUTTERIDGE (1999)
definem a LPO como sendo uma deteriorização oxidativa dos lipídios
poliinsaturados, ou seja, lipídios que contém, no mínimo, dois carbonos unidos
por ligações covalentes duplas.
As membranas das células e das organelas são mais suscetíveis à LPO,
pois contém grande quantidade de ácidos graxos poliinsaturados. Assim, o
processo de lipoperoxidação envolve a formação e propagação de radicais
lipídicos, consumo de oxigênio e determinam rearranjo das duplas ligações nos
lipídios. A eventual destruição dos lipídios da membrana, faz surgir uma variedade
de produtos de degradação, incluindo álcoois, cetonas, aldeídos e ésteres
(BUEGE et al.,1978).
A lipoperoxidação é um processo natural de renovação das membranas
celulares. Entretanto, o estresse oxidativo aumenta a LPO e provoca severo dano
nas membranas celulares, promovendo um aumento na fluidez da membrana,
quebra das funções secretórias e dos gradientes iônicos. Tendo em vista estas
considerações e entendendo ser o Diabetes Mellitus uma síndrome que acomete
vários órgãos, de alto custo de tratamento e sua alta taxa de mortalidade,
acreditamos ser de suma importância avaliar terapias alternativas utilizadas pela
população em geral e avaliar riscos e vantagens dessas terapias.
36
1.6 Teste de Micronúcleos (MN)
O estudo de danos ao DNA induzidos por substâncias de origem natural ou
sintética é uma área essencial da toxicologia genética uma vez que alterações no
material genético são eventos importantes na carcinogênese (FENECH,2005).
Dentre os testes de avaliação de genotoxicidade preconizados pelas agências
internacionais e instituições governamentais, o teste de micronúcleo em medula
óssea de roedores in vivo é amplamente aceito e recomendado para a avaliação
e o registro de novos produtos químicos e farmacêuticos que entram anualmente
no mercado mundial (CHOY, 2001 e RIBEIRO et al., 2003).
O Teste de Micronúcleos fundamenta-se na identificação de fragmentos
cromossômicos ou de cromossomos inteiros que não estão ligados ao conjunto
de cromossomos de uma célula – constituindo, deste modo, um pequeno núcleo
individual, designado micronúcleo (MN). Vem sendo usado como um padrão de
aberrações cromossômicas em organismos eucarióticos, sendo assim, utilizado
na detecção de agentes que interferem no processo de ligação dos cromossomos
às microfibrilas do fuso mitótico ou aqueles capazes de conduzir a quebras
cromossômicas (FENECH, 2005).
Os micronúcleos (MNs) aparecem nas células filhas em decorrência de
danos induzidos nas células parentais. Os fragmentos cromossômicos, que
resultam de quebras, podem não ser incorporados no núcleo principal das células
filhas após a mitose. Uma membrana nuclear se formará em volta do fragmento, o
qual será visível como um pequeno (micro) núcleo separado do núcleo principal.
Desta forma, a avaliação genotóxica dos fármacos em estudo é realizada em
eritrócitos policromáticos (PCEs), procurando identificar aqueles que contêm
micronúcleos (MNPCEs). A citotoxicidade dos compostos testados pode ser
avaliada através da relação entre o número de PCEs e o total de eritrócitos
normocromáticos (NCEs) encontrados (Figura 3) (KRISHNA & HAYASHI,2000).
37
Figura 3- Representação dos eritrócitos A – NCE (eritrócito
normocromático); B - PCE (eritrócito policromático anucleado); C – MNPCE
(eritrócito policromático com MN) (Krishna e Hayashi, 2000)
1.7 Croton cajucara BENTH
O conhecimento sobre plantas medicinais é na maioria das vezes o único
recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. O uso de plantas no
tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo quanto a espécie humana.
Ainda hoje nas regiões mais pobres do país, e até mesmo nas grandes cidades
brasileiras, plantas medicinais são comercializadas em feiras livres, mercados
populares e encontradas em quintais residenciais. Temos como exemplo a região
Amazônica, onde foram catalogadas, em duas comunidades que vivem nas
margens da Baía de Marajó - PA, 260 plantas entre nativas e cultivadas; 1.200
são comercializadas no mercado livre, em Belém-PA; outras 242 espécies são
cultivadas em quintais residenciais (AMOROZO & GELY, 1988).
O Croton cajucara BENTH, da família Euphorbiaceae, de nome popular
Sacaca (feitiço na língua tupi-guarani), é uma planta arbustiva de casca purulenta,
38
folhas alternas, lanceoladas, olentes, bastante comum na Amazônia (Figuras 4 e
5). As Euphorbiaceae tem importância na medicina como fonte de toxinas e
medicamentos. Resinas e diterpenos do Croton são usados em estudos
experimentais de iniciação de tumores e podem ser úteis na terapia do câncer
(GRYNBERG et al., 1999).
Devido à diversidade bioquímica desta família, parece provável que usos
medicinais adicionais possam ser descobertos, uma vez que muitas pessoas na
América, Ásia e África utilizam essas plantas para diversos males. No estado do
Pará as folhas e cascas do caule dessa planta são utilizadas em forma de chá ou
cápsulas no combate a diabetes, diarréia, malária, febre e no controle de níveis
elevados de colesterol (LUNA COSTA et al., 1998). A Sacaca também é
comercializada em farmácias de manipulação e neste caso o pó das cascas do
caule é vendido em cápsulas (concentração aproximada de 250mg). Já as folhas
são comercializadas livremente, para distúrbios do fígado e auxilio na digestão de
alimentos gordurosos.
O extrato de plantas, praticamente todas que contém bioflavonóides,
apresenta uma significativa ação antioxidante, capaz de diminuir os efeitos
nocivos gerados por radicais livres e, conseqüentemente, o surgimento das
doenças associadas a ele (MACIEL et al., 1998). Em estudos fitoquímicos que
investigaram partes distintas da planta Croton cajucara BENTH como raiz, casca
do caule e folhas, revelaram que a casca se apresenta rica em clerodanos do tipo
diterpenos: trans-desidrocrotonina (t-DCTN), trans-crotonina (t-CTN), cis-cajucara
B e sacarina (MACIEL et al., 1998). De acordo com o mesmo autor, a atividade
farmacológica do maior componente do extrato da casca (t-DCTN) tem sido
extensivamente estudada, sendo que foram detectados efeitos antiinflamatórios,
analgésicos, hipoglicêmico e hipolipidêmico.
Experimentos biológicos realizados com o ácido acetil aleuritólico (AAA)
mostraram que este triterpeno possui atividade antiespasmódica (MACIEL et al.,
1998) e ação antiinflamatória
(PERAZZO et al., 1997). Esta substância mostrou-se
39
inativa em testes que avaliam atividades antitumoral e antiulcerogênica. Através
do estudo fitoquímico realizado com as folhas do Croton cajucara foi possível
isolar e caracterizar três esteróides (b-sitosterol, estigmasterol e 3,O-
glicopiranosil-b-sitosterol), dois flavonóides (3,7,4'-tri-O-metilcanferol e 3,7,-di-O-
metilcanferol) e um diterpeno do tipo 19-nor-clerodano (cajucarinolida)
(MACIEL et
al., 1995).
Outros derivados da DCTN estão sendo obtidos para que seja possível o
estudo da relação estrutura/atividade e dos mecanismos de ação deste diterpeno
bioativo, que além de ser o componente majoritário nas cascas do Croton
cajucara, foi o que apresentou a melhor correlação com grande parte das
propriedades terapêuticas da sacaca (MARTINS, 2000).
Os benefícios medicinais do chá são de conhecimento milenar,
especialmente o de efeito estimulante. Hoje a ciência está comprovando muitas
de suas propriedades terapêuticas (RODRIGUES et al., 2005a). A planta Croton
cajucara BENTH é um caso típico desse aproveitamento etnobotânico pela
farmacologia no isolamento de princípios ativos.
A concentração do chá é determinada pelo seu modo de preparação. Por
exemplo: 25g de casca em um litro (1000mL) de água fervente é usada para
preparar um chá a ser tomado em uma xícara de 100mL, duas vezes ao dia
(MACIEL et al.,1998). A preferência popular pelo uso da cápsula em relação ao
chá é devido ao amargor das cascas do tronco da planta. Em ensaios pré-
clínicos, tais chás são usados na forma de extratos aquosos para testar seus
efeitos farmacológicos, baseados no uso empírico popular(CAMPOS et al., 2002).
Em uma pesquisa com camundongos geneticamente modificados, com
hiperlipidemia, o tratamento com infusão aquosa da casca de Croton cajucara
BENTH, reduziu significamente os níveis de triglicerídios e promoveu uma
redistribuição dos níveis do colesterol (BIGHETTI et al., 2004).
40
No laboratório de Extresse Oxidativo da ULBRA, foi realizado um estudo dos
efeitos antioxidantes dos extratos aquosos a 5% da planta Croton cajucara
BENTH. O extrato resultante foi usado em testes “in vitro” e “in vivo” (dose de
1,5mL diluídos em água), para testar seu efeito antioxidante contra o estresse
oxidativo induzido pelo herbicida Paraquat e a inibição da atividade dos radicais
livres. Os resultados confirmaram que o extrato da planta é um potente agente
antioxidante natural no modelo utilizado (TIEPPO et al., 2006).
Em outra pesquisa, foi verificado o efeito do Croton cajucara BENTH no
estômago de ratos submetidos à lesão com o herbicida Paraquat. Observou-se
diminuição dos danos causados pelo herbicida quando avaliada a liperoxidação
por TBARS e enzimas antioxidantes (RODRIGUES et al., 2005b). O mesmo
estudo avaliou o fígado desses animais e notou-se também o potencial
antioxidante do chá, a partir da diminuição do dano oxidativo causado pelo
Paraquat.
No que se refere à toxicidade genética, poucos estudos foram realizados
com o Croton cajucara BENTH ou seus constituintes isolados. Os resultados
obtidos em bioensaios in vivo caracterizam esta planta como destituída de
atividade genotóxica (AGNER et al., 1999; SANTOS et al., 2006). Tendo em vista
estas considerações, o presente trabalho propõe-se a avaliar o Estresse Oxidativo
e a Genotoxicidade do extrato aquoso da casca do Croton cajucara BENTH em
ratos diabéticos e não-diabéticos através do teste de micronúcleo em medula
óssea e em ensaios bioquímicos.
41
Figura 4 – Vista geral da planta Croton cajucara BENTH em seu ambiente natural
(MIOTTO,2001).
42
Figura 5 – Cascas do caule do Croton cajucara BENTH (MIOTTO,2001).
43
OBJETIVOS
44
2 OBJETIVOS__________________
2.1 Objetivo Geral
Este trabalho tem como objetivo geral avaliar o extrato aquoso da casca do
caule do Croton cajucara BENTH em relação à indução de estresse oxidativo e
danos ao DNA em ratos diabéticos e não diabéticos.
2.2 Objetivos Específicos
• Verificar o peso dos ratos antes e após a indução do Diabetes Mellittus, para
o acompanhamento da doença.
• Avaliar a glicemia dos diversos grupos com e sem o uso do Croton cajucara
BENTH em diferentes tempos de tratamento.
• Avaliar a lipoperoxidação através da técnica de TBARS e a atividade das
enzimas antioxidantes, superóxido dismutase e catalase, nos diferentes grupos
com e sem o uso do Croton cajucara BENTH.
• Avaliar os possíveis efeitos genotóxicos do extrato aquoso do Croton
cajucara BENTH em ratos diabéticos e não diabéticos, através do teste de
micronúcleos em medula óssea.
45
MATERIAIS E MÉTODOS
46
3 MATERAIS E MÉTODOS__________________
3.1 Delineamento da Pesquisa
Este estudo tem caráter experimental qualitativo e quantitativo, no qual
ratos normais e com Diabetes Mellitus induzido, foram tratados com extrato
aquoso de Croton cajucara BENTH.
3.2 Animais
Na realização deste trabalho foram utilizados ratos machos da linhagem,
Wistar, com peso médio de 250g no início dos experimentos, provenientes do
Biotério do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul (UFRGS). Os animais foram mantidos durante o experimento
na Unidade de Experimentação Animal do Centro de Pesquisas do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre, em caixas plásticas individuais, de 47x34x18cm,
forradas com maravalha .
Os animais foram tratados diariamente com água e ração Nutripal (Moinhos
Purina, Porto Alegre, RS/Brasil) ad libitum e as caixas foram limpas de acordo
com a rotina do Centro de Pesquisa, sendo mantidos em uma temperatura de 22
± 4 °C, em ciclo de 12 horas claro/escuro (luz das 7 às 19 horas).
3.2 Considerações Bioéticas
Todos os procedimentos realizados estão de acordo com as normas
estabelecidas pela Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde contidas na
Pesquisa em Saúde e Direito dos Animais, de autoria do grupo de pesquisa e
Pós-Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) (GOLDIM, 1997).
O presente estudo foi submetido ao Comitê de Ética do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre sob o protocolo número 04-453.
47
3.4 Delineamento Experimental
O tempo de duração do DM foi de 60 dias, a partir do dia da indução, onde
houve a inclusão de 6 grupos de animais. O número total em cada grupo no final
do estudo foi estabelecido pela sobrevivência dos animais.
1) Grupo controle (CO): estes animais receberam NaCl 0,9% i.p. e água destilada
a 1,5mL intragastricamente, ração ad libitum e água (n=10).
2) Grupo CcB 5 dias (CcB 5D): estes animais além de água e ração ad libitum,
receberam o extrato aquoso da casca de Croton cajucara BENTH (5g/80ml H
2
O
fervida na dose de 1,5 mL, intragástrica), diariamente, durante 5 dias (n=10).
3) Grupo CcB 20 dias (CcB 20D): estes animais além de água e ração ad libitum,
receberam o extrato aquoso da casca de Croton cajucara BENTH (5g/80mL H
2
O
fervida na dose de 1,5 mL, intragástrica), diariamente, durante 20 dias (n=10).
4) Grupo diabético (DM): estes animais receberam água, ração ad libitum,
estreptozocina num dose de 70mg/Kg (n=10) .
5) Grupo diabético tratado por 5 dias (DM + CcB5D): receberam água, ração ad
libitum, estreptozocina num dose de 70mg/Kg, via injeção intraperitoneal (i.p.) e
extrato aquoso da casca de Croton cajucara BENTH (5g/80mL H
2
O fervida na
dose de 1,5 ml, intragástrica) diariamente, durante 05 dias (n=10).
6) Grupo diabético tratado por 20 dias (DM + CcB 20D): receberam água, ração
ad libitum, estreptozocina num dose de 70mg/kg i.p. e extrato aquoso da casca de
Croton cajucara BENTH (5g/80mL H
2
O fervida na dose de 1,5 mL, intragástrica),
diariamente, durante 20 dias (n=10).
48
3.5 Marcação e Pesagem
No início do estudo, os animais foram marcados no lóbulo da orelha e
pesados individualmente. Foi registrado o peso corporal inicial (momento da
indução do DM), bem como no momento da morte dos animais. Foi utilizada uma
balança da marca Sartoris
, com peso em gramas para a pesagem dos animais.
3.6 Indução do Diabetes Mellitus
O Diabetes Mellitus foi induzido por uma única injeção intraperitoneal (i.p.)
de estreptozotocina (STZ) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA) na
dose de 70 mg/Kg de peso corporal (TAKEUCHI et al., 1994).
A estreptozotocina foi dissolvida em tampão citrato de sódio (0,1 M, pH 4,5)
e ácido cítrico (0,1M, pH 4,5) e administrada na região abdominal esquerda do
animal, cerca de 10 minutos após a diluição em solução tampão.
Os animais do grupo controle receberam somente NaCl 0,9% i.p. no
mesmo volume utilizado para dissolver a STZ. O período do estudo foi de
sessenta dias, a contar do dia em que os animais diabéticos apresentaram uma
glicemia sangüínea acima de 250mg/dL.
3.7 Preparação do Chá de Croton cajucara BENTH
A amostra da casca do Croton cajucara BENTH utilizada no estudo é
procedente da cidade de Santarén no Estado do Pará - Brasil.
Para a preparação do extrato aquoso (EA) foi necessário triturar a casca do
Croton cajucara BENTH até virar pó. O chá foi preparado com 5g da casca
triturada do caule do Croton cajucara BENTH em 100mL de água destilada,
fervida durante 10 minutos. Foi dado para cada animal do grupo estudado, 1,5 mL
do chá intragastricamente (gavagem). Os animais controle receberam água
49
destilada no mesmo volume com o objetivo de também serem estressados com o
procedimento de gavagem.
O chá foi administrado, nos 20 dias finais e nos 05 dias finais do estudo,
aos grupos CcB20D e CcB5D, respectivamente. No 60º dia os animais foram
mortos e retirados o fígado e fêmur para posteriores análises.
3.8 Morte dos Animais
Após o período de sessenta dias, os animais foram anestesiados com
cloridrato de Cetamina (Ketalar
) e cloridrato de xilasina2 (2,6-xilidina) – 5,6
dihidro-4h-1,3 tiazina (Rompum
), numa proporção de 180mg/kg de Ketalar para
50mg/kg de Rompum
. Os anestésicos foram administrados intraperitonealmente
na região abdominal esquerda.
A profundidade da anestesia foi controlada pelos reflexos plantares e
oculopalpebrais quando se realizava algum tipo de pressão das patas dos
animais.
Primeiramente o sangue foi retirado do animal através do plexo retro orbital
(BERNARD & PECARD,1951) e colocado num tubo de ensaio com heparina
(Liquemine
), para evitar a coagulação. Os animais foram colocados em decúbito
dorsal e permaneceram sob ventilação espontânea, respirando normalmente.
Posteriormente, realizou-se tricotomia e desinfecção da região abdominal,
seguida da intervenção cirúrgica, que iniciou com uma laparotomia ventral média
onde foi retirado o fígado e após congelado em nitrogênio líquido e retirado o
fêmur para o teste de micronúcleos.
3.9 Determinação da Glicemia
50
O sangue foi retirado do animal através do seio orbital e colocado num tubo
de ensaio com heparina (Liquemine
), para evitar a coagulação. Após se realizou
a centrifugação do material em centrífuga a 4.000 rpm pelo tempo de 10 minutos.
O precipitado foi desprezado, e o plasma retirado com pipeta (Labsystems
4500, 200-100 µl) para ser congelado em freezer à temperatura de –70º C para
posterior determinação dos índices de glicemia.
Para determinação da glicemia foi utilizado o teste enzimático colorimétrico
(Kit Glicose PAP, LAB TEST), no qual o reagente foi misturado a 40 µL de
amostra do plasma e lido em espectofotômetro (CARY 3E – UV- Visible
Spectrophotometer Varian) com comprimento de onda de 500nm. Foram
considerados diabéticos para esse estudo os animais que apresentaram a
concentração de glicose sangüínea acima de 250 mg/dL (PACKER et al., 2000).
3.10 Avaliações Bioquímicas
3.10.1 Preparo dos Homogeneizados
Para homogeneizar o fígado foram colocados 9 mL de tampão fosfato (KCL
140 mM, fosfato 20 mM; pH 7,4) por grama de tecido. A homogeneização foi
realizada em um aparelho Ultra-Turrax (IKA-WERK) durante 40 segundos, à
temperatura de 0 a 4º C. Posteriormente, o homogeneizado foi centrifugado em
uma centrífuga refrigerada (SORVALL RC-5B Refrigerated Superspeed
Centrifuge) por 10 min a 3000 rpm (1110 x g) (BUEGE & AUST, 1978). O
precipitado foi desprezado, e o sobrenadante retirado e congelado em freezer a
uma temperatura de –70 ºC para posteriores dosagens.
3.10.2 Dosagem de Proteína
A concentração de proteínas no homogeneizado de fígado foi determinada
utilizando, como padrão, uma solução de albumina bovina 1mg/mL (utilizam-se
51
volumes de 50, 100 e 150 µL). Foi colocada uma alíquota do homogeneizado
(20µL) em 780 µL de água destilada e 2,0 mL do reativo C que foi preparado com
50 ml de NaHCO
3
, 0,5 mL do reativo B1 (CuSO
4
.H
2
O 1%) e 0,5 mL do reativo B2
(tartarato de sódio e potássio 2%). Após a adição do reativo C, aguardou-se 10
minutos e foi adicionado 0,2 mL de reativo de Folin-Ciocalteau diluído na
proporção 1:3 em água destilada. Após 30 minutos, realizou-se a medida em
espectrofotômetro a 625 nm (LOWRY et al., 1951).
3.11 Determinação do Estresse Oxidativo
3.11.1 Determinação das Substâncias que Reagem ao Ácido
Tiobarbitúrico (TBARS)
Foi determinada a lipoperoxidação através do método de substâncias que
reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A técnica de TBARS consiste no
aquecimento do material homogeneizado na presença de ácido tiobarbitúrico e
conseqüente formação de um produto de coloração rósea, medido em
espectrofotômetro a 535 nm. O aparecimento de coloração ocorre devido à
presença do malondialdeído e outras substâncias proveniente da peroxidação
lipídica no material biológico.
Foram colocados em tubo de ensaio, nesta ordem de adição, 0,5 mL de
ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,67%, 0,25mL de água destilada, 0,75mL de ácido
tricloroacético (TCA) 10% e 0,25mL do homogeneizado. O TBARS reage com
produtos da lipoperoxidação formando uma base de Schiff e o TCA tem função de
desnaturar as proteínas presentes, além de acidificar o meio de reação. A seguir,
agitou-se cada tubo os quais foram aquecidos a uma temperatura de 100ºC
durante 15 minutos. Após, os tubos foram resfriados e foi acrescentado 1,5 mL de
álcool n-butílico, para extrair o pigmento formado. Os tubos foram colocados em
agitador (Biomatic) por 45 segundos e centrifugados por 10 minutos a 3000 rpm
52
(1110 x g). Por último, o produto corado foi retirado e foi realizada a leitura em
espectrofotômetro (CARY 3E – UV – Visible Spectrophotometer Varian), com um
comprimento de onda de 535nm. A concentração de TBARS foi expressa em
nmoles/mg de proteína (BUEGE & AUST,1978).
3.11.2 Atividade da Enzima Superóxido Dismutase (SOD)
A atividade desta enzima foi definida por sua capacidade de inibir um
sistema de detecção que reage com o O
-
2
.
A reação catalisada é a seguinte:
A técnica de medida da SOD está baseada na inibição dessa reação. Para
isto, se utilizou adrenalina que, no meio alcalino, transforma-se em adrenocromo,
produzindo O
-
2
, que é o substrato da enzima (MISRA et al.,1972). Antes de
realizar a determinação com o homogeneizado do fígado, fez-se a medida do
meio de reação (glicina-NaOH 50 mM, pH 9,6) com 50 µL de adrenalina (60
mM, pH 2,0), está corresponde a 100% da reação. Essa mistura foi agitada e lida
a 480 nm. Posteriormente, foram adicionados diferentes volumes do
homogeneizado e mediu-se a inibição da reação. A atividade enzimática foi
expressa em unidades SOD/g de tecido (quantidade de SOD que inibe em 50% a
velocidade de redução da adrenalina formando um produto corado).
3.11.3 Atividade da Enzima Catalase (CAT)
A enzima catalase catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio em
água e oxigênio, segundo a seguinte reação:
2 O
-
2
+ 2H
+
H
2
O
2
+ O
2
SOD
2H
2
O
2
2 H
2
O + O
2
CAT
53
A velocidade de decomposição do peróxido de hidrogênio é diretamente
proporcional à atividade enzimática e obedece a uma cinética de pseudo primeira
ordem com respeito ao peróxido de hidrogênio O ensaio consistiu-se em medir a
diminuição da absorção a 240 nm (longitude de onda pela qual absorve o
peróxido de hidrogênio).
A medida espectrofotométrica consiste em colocar nas cubetas o meio de
reação (solução reguladora de fosfato 50 mM) com distintas alíquotas da amostra.
Depois, fez-se um gráfico com uma linha de base. Em seguida, adicionou-se 20
µL de H
2
O
2
a 300 mM. A concentração foi expressa em pmol/g de tecido
(BOVERIS & CHANCE, 1973).
3.12 Avaliação do Dano ao DNA em Células da Medula Óssea
3.12.1 Análise de Micronúcleos
O Teste de Micronúcleo baseia-se na identificação de fragmentos
cromossômicos ou de cromossomos inteiros que não estão integrados ao
conjunto de cromossomos de uma célula, formando, assim, um pequeno núcleo
individual, chamado micronúcleo (MN). A análise de MN é usada como padrão de
aberrações cromossômicas em organismos eucarióticos, sendo, portanto,
utilizada na detecção de agentes que interferem no processo de ligação do
cromossomo às microfibrilas do fuso ou aqueles capazes de induzir quebras
cromossômicas.
O presente trabalho utilizou o teste de MN em medula óssea de ratos. Após
a preparação das lâminas, foram analisados os eritrócitos policromáticos (PCEs),
procurando identificar aqueles que continham micronúcleos (MNPCEs). Além da
identificação de MNs, é possível obter dados de citotoxicidade, através da relação
entre PCEs e eritrócitos normocromáticos (NCEs) (FENECH, 2000).
54
Sessenta dias após o início do tratamento, os animais foram sacrificados,
sendo realizada a extração dos fêmures para a coleta da medula, conforme
descrito em KRISHNA & HAYASHI (2000). Após a extração dos fêmures para a
coleta da medula óssea em soro fetal bovino, foi realizada a centrifugação (1000
rpm/5 min), retirada do excesso de sobrenadante e ressuspensão das células.
Para cada animal foram feitos os esfregaços em duas lâminas devidamente
codificadas, e após a secagem, realizou-se a coloração com Leishman eosina-
azul em três etapas: (i) 3 minutos em corante puro, (ii) 15 minutos em corante
diluído (1 parte de corante para 6 de água deionizada e destilada) e (iii) lavagem
em água corrente e destilada/deionizada (RIBEIRO et al., 2003). Após a secagem
das lâminas em ar ambiente por 24h, iniciou-se a leitura das mesmas em
microscópio óptico a um aumento de 1000x.
3.13 Análise Estatística
Para os dados de estresse oxidativo a análise estatística utilizada foi
ANOVA seguida do teste Student-Newman-Keuls. Já, para o teste de
micronúcleo, as análises foram realizadas através da ANOVA seguida do teste
Tukey. Nas duas análises, foram considerados significativos valores de p ≤ 0,05.
RESULTADOS
56
4 RESULTADOS__________________
A apresentação dos resultados segue a seguinte ordem:
1) Determinação do peso dos animais diabéticos e dos animais controle,
nos diferentes grupos, antes da indução do DM e no dia da morte dos
animais.
2) Determinação dos níveis de glicemia nos animais diabéticos e dos
animais controle, nos diferentes grupos, antes da indução do DM e no
dia da morte dos animais
3) Medida da lipoperoxidação do fígado pelo uso de técnicas de
determinação das substâncias que reagem ao ácido tiobaritúrico
(TBARS).
4) Quantificação da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e
catalase (CAT) presentes no fígado dos animais-controle e nos
diabéticos tratados e não tratados com Croton cajucara BENTH.
5) Determinação da genotoxicidade do Croton cajucara BENTH, através
do teste de micronúcleos;
57
4.1 Peso Corporal e Glicose Sangüínea
Determinação do peso dos animais diabéticos e dos animais controle, nos
diferentes grupos, antes da indução do Diabetes Mellitus e no dia da morte dos
animais.
Na Figura 6 estão expressos os pesos dos animais, na data inicial do
estudo.
Observamos que não há diferenças significativas no que diz respeito ao
peso entre os animais estudados nos diferentes grupos na data inicial do
experimento.
0
100
200
300
400
Peso/gramas
CO
CcB5D
CcB20D
DM
DM+CcB5D
DM+CcB20D
Grupos Experimentais
Figura 6 - Peso inicial dos animais nos diferentes grupos estudados. Os
resultados foram expressos com a média ± desvio padrão (DP) de dez animais em
cada grupo. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos
estudados.
58
Observamos na Figura 7 que o peso corporal final, dos animais diabéticos,
reduziu significativamente em relação ao grupo controle e em relação ao grupo
que recebeu o Croton cajucara BENTH por 20 dias. Observamos, também, que
em relação ao peso dos animais dos outros grupos não foram encontradas
diferenças significativas durante o experimento.
0
100
200
300
400
Peso/gramas
CO
CcB5D
CcB20D
DM
DM+CcB5D
DM+CcB20D
Grupos Experimentais
Figura 7 - Peso final dos animais nos diferentes grupos estudados. Os
resultados foram expressos com a média ± desvio padrão da média (DP) de
dez animais em cada grupo.
*Diferença significativa entre o grupo DM e o grupo e o CcB20 (p≤0,05).
*
59
Na Figura 8, podemos observar a determinação dos níveis de glicemia nos
animais diabéticos e dos animais controle, nos diferentes grupos, na data inicial do
experimento. Pode-se observar que no tempo zero (T0), ou seja no início do
experimento, não há diferença significativa na glicemia entre os grupos (p≤0,05).
0
50
100
150
200
250
300
Glicemia mg/dL
CO
CcB5D
CcB20D
DM
DM+CcB5D
DM+CcB20D
Grupos Experimentais
Figura 8 - Determinação da glicemia inicial dos animais nos diferentes grupos
estudados. Os resultados foram expressos com a média ± desvio padrão da
média (DP) de dez animais em cada grupo. Não houve diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos estudados.
Observamos na Figura 9, que os animais diabéticos tratados ou não com o
Croton cajucara BENTH (CcB), apresentaram aumento da glicemia em relação ao
grupo controle (CO). Já os animais diabéticos tratados com CcB não apresentam
redução da glicemia em relação ao grupo diabético (DM). Da mesma forma, os
animais não diabéticos tratados com CcB por 5 e 20 dias não apresentaram
diferenças significativas em relação ao grupo controle (p≤0,05).
60
0
100
200
300
400
500
600
Glicemia mg/dL
CO
CcB5D
CcB20D
DM
DM+CcB5D
DM+CcB20D
Grupos Experimentais
Figura 9 – Determinação da glicemia final dos animais nos diferentes grupos
estudados. Os resultados foram expressos com a média ± desvio padrão da
média (DP) de dez animais em cada grupo.
*Diferença significativa com o grupo CO (p≤0,05).
4.2 Determinação do Estresse Oxidativo
O marcador do estresse oxidativo (TBARS) avaliado neste estudo
apresentou alterações significativas entre o grupo diabético e o grupo controle
(p≤0,05), e entre o grupo controle com o grupo que recebeu o Croton cajucara
BENTH por 20 dias (CcB20D), conforme visualizamos na Figura 10 abaixo
(p≤0,05).
*
*
*
61
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
nmoles/mg proteína
CO
CcB5D
CcB20D
DM
DM+CcB5D
DM+CcB20D
Grupos Experimentais
Figura 10- Determinação da medida das substâncias que reagem ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS). Os resultados foram expressos com a média ± desvio
padrão da média (DP) de dez animais em cada grupo.
*Diferença significativa com o grupo controle (CO) (p≤0,05).
4.3 Efeitos do DM induzido por estreptozotocina e do Croton cajucara
BENTH sobre a atividade das enzimas antioxidantes
*
*
62
4.3.1 Atividade da Superóxido Dismutase (SOD)
Na Figura 11, podemos observar a atividade citosólica da enzima
antioxidante SOD no homogeneizado de fígado nos diversos grupos avaliados.
Houve aumento no grupo diabético quando comparado ao grupo controle. Após a
administração do extrato aquoso do CcB nos animais diabéticos, a atividade da
enzima diminuiu, equiparando-se aos níveis dos animais controle (p≤0,05).
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
SOD mg/dL
CO
CcB5D
CcB20D
DM
DM+CcB5D
DM+CcB20D
Grupos Experimentais
Figura 11 –Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD). Os resultados
foram expressos com a média ± desvio padrão (DP) de dez animais em cada
grupo. *Diferença significativa com o grupo controle (CO)(p≤0,05).
4.3.2 Atividade da Catalase (CAT)
Na Figura 12 observamos que a atividade da enzima catalase (CAT) não
demonstrou diferenças significativas entre os grupos neste estudo. Porém
*
*
63
notamos uma tendência no aumento desta enzima no grupo DM e DM tratados e
no grupo que recebeu CcB20D em relação ao grupo controle (p≤0,05).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
CAT mg/dL
CO
CcB5D
CcB20D
DM
DM+CcB5D
DM+CcB20D
Grupos Experimentais
Figura 12 – Atividade da enzima catalase (CAT). Os resultados foram expressos
com a média ± desvio padrão da média (DP) de dez animais em cada grupo. Não
houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos avaliados.
4.4 Determinação da Genotoxicidade do Croton cajucara Benth
Através do Teste de Micronúcleos
64
O presente trabalho avaliou, através do teste de micronúcleos em medula
óssea de ratos, o potencial tóxico-genético da administração do Croton cajucara
BENTH, amplamente utilizado pela população para o tratamento do Diabetes
Mellitus e de outras doenças. Os resultados de genotoxicidade são apresentados
na Tabela 1 e Figura 13.
Tabela 1 – Freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMNs) e
relação PCE/NCE em medula óssea de ratos Wistar machos diabéticos e não-
diabéticos tratados com solução aquosa da casca do caule de Croton cajucara
BENTH.
Tratamento
Número de PCEs
analisados
(número de ratos)
Número de PCEs
micronucleados em
2000 PCEs ±
±±
± DP*
Razão
PCE/NCE*
Controle
20.000
(10)
3,88 ± 2,70
a
1,11 ± 0,42
b
CcB 5D
20.000
(10)
6,11 ± 1,27
a
1,13 ± 0,58
b
CcB 20D
20.000
(10)
3,25 ± 2,25
a
1,14 ± 0,43
b
DM
20.000
(10)
7,25 ± 4,33
a
0,93 ± 0,40
b
DM + CcB5D
20.000
(10)
6,44 ± 3,47
a
1,12 ± 0,46
b
DM + CcB20D
20.000
(10)
4,22 ± 2,33
a
1,02 ± 0,45
b
DP: Desvio padrão; DM: animais diabéticos; CcB: Croton cajucara
BENTH
. *Valores com
a mesma letra não diferem estatisticamente (one-way ANOVA; teste post-hoc de Tukey,
p≤0,05).
65
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
MN/2000 células
CO
CcB5D
CcB20D
DM
DM+CcB5D
DM+CcB20D
Grupos Experimentais
Figura 13 – Freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMNs)
em medula óssea de ratos machos diabéticos e não diabéticos tratados com
extrato aquoso da casca do caule do Croton cajucara BENTH. Os resultados
foram expressos com a média ± desvio padrão da média (DP) de dez animais em
cada grupo. Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos
avaliados.
A comparação das freqüências de indução de MN entre os diferentes
grupos não mostrou diferenças estatisticamente significativas. Desta forma, os
resultados referentes à análise de micronúcleos demonstram que o Croton
cajucara BENTH não induziu aumentos estatisticamente significativos na
freqüência de micronúcleos (MN) nos animais diabéticos e não-diabéticos, assim
como não foi capaz de induzir danos genéticos nos animais diabéticos. Da
mesma forma, os dados de citotoxicidade não evidenciam nenhuma diferença
entre os grupos (Tabela 1).
66
DISCUSSÃO
67
5 DISCUSSÃO__________________
A definição do DM pode estar baseada em critérios descritos por HARRIS
& CAHILL (1978), e pode ser dividida em duas classes: DM tipo 1 e DM tipo 2. As
formas de diabetes mellitus são classificadas de acordo com sua etiologia e não
mais como “insulino dependente” ou “não insulino dependente” (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE DIABETES, 2003).
O DM tipo 1 é caracterizado pela deficiência das células beta das ilhotas de
Langerhans do pâncreas, na produção ou secreção de insulina, mas com
participação intensa de fatores genéticos e ambientais. Ocorre geralmente em
pessoas jovens e é necessária a utilização de insulina para o tratamento desta
doença.
O DM tipo 2 é caracterizado por uma resistência à estimulação ao captar
glicose no músculo esquelético e no tecido adiposo determinado pela insulina.
Isto contribui para um acúmulo de glicose no meio extracelular e
conseqüentemente no sangue, causando um quadro de hiperglicemia, manifesta-
se predominantemente após os 40 anos e na grande maioria dos casos não é
necessária a utilização de insulina exógena (MILECH & OLIVEIRA, 2004).
A imunidade celular esta alterada nos pacientes com DM, pois a doença
diminui a função dos leucócitos polimorfonucleares, a aderência leucocitária, bem
como a quimiotaxia e a fagocitose. O principal fator responsável parece ser a
acidose metabólica presente no DM (DELAMAIRE et al.,1997; GALLACHER et
al.,1995).
Disfunções vasculares também podem estar presentes em pacientes com
DM, tipo 1 e 2, pois as células endoteliais são estimuladas diretamente pela
hiperglicemia ou pela glicosilação avançada final, a expressarem em sua
superfície de membrana moléculas de adesão celular (MAC), que por sua vez são
ativadas pelas citocinas circulantes, pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e
68
pelo aumento nos níveis de interleucina 1 (IL-1) (BAUMGARTNER-PARZER
et.al.,1995; SCHMIDT et al.,1995).
As dificuldades no tratamento do diabetes (como por exemplo, a
necessidade de várias injeções diárias de insulina para o controle glicêmico), a
ocorrência de complicações crônicas da doença e o risco de hipoglicemias
severas em pacientes com DM tipo1, já justificam, por si só, a pesquisa por
estratégias terapêuticas alternativas à aplicação de insulina exógena. Além dos
vários tipos de pesquisas que buscam soluções alternativas para o tratamento
desta doença, atualmente é dada ênfase aos estudos que aprofundam o
entendimento da patogenia desta doença (PARSLOW et al., 2000). Os modelos
animais têm-se mostrado bastante úteis para este fim (HERNANDORENA et al.,
2001).
A utilização de modelos experimentais com processo patogênico
semelhante ao humano, pode auxiliar no aprofundamento da compreensão do
desenvolvimento do DM tipo 1, assim como permitir o teste de novas modalidades
terapêuticas (KIRSTEN, 2006). Neste sentido, o modelo experimental do DM vem
sendo bastante utilizado e tem contribuído para uma melhor compreensão do
quadro fisiopatológico apresentado em humanos. O DM pode ser desenvolvido
por diversos agentes químicos, entre os quais se destacam o aloxano e a
estreptozotocina (PICKUP et al.,1997).
A estreptozotocina (STZ) é provavelmente a substância de escolha para
estudar o Diabetes Mellitus tipo 1 em animais. O modelo experimental de DM se
tornou mais fácil para ser desenvolvido a partir do descobrimento dessa droga.
Seu mecanismo de ação está baseado na destruição das células beta do
pâncreas, e a grande vantagem de sua utilização é que possui alta afinidade com
essas células.
A STZ foi descrita em 1956 como um antibiótico de amplo espectro de
ação (LEWIS & BARBIERS, 1959) e em 1960 sua atividade antitumoral foi
relatada, principalmente para o tratamento de leucemia (WHITE, 1963). Estudos
69
de tumores com modelos animais (ratos) acabaram por descobrir que a STZ
levava a hiperglicemia, e estudos em cachorros e macacos rhesus evidenciaram o
seu potencial diabetogênico (CARTER et al., 1971). Desde então, esta droga tem
sido usada para induzir diabetes em modelos experimentais.
Os mecanismos pelos quais a STZ induz DM ainda não são completamente
entendidos, porém duas hipóteses parecem estar envolvidas na indução de
hiperglicemia por este composto:
1) Ela causa quebra de DNA das ilhotas pancreáticas e estimula a síntese
nuclear e ADP-ribose e depleta os níveis de NAD+ e NADP + intracelular, o
que inibe a síntese de pró-insulina e induz diabetes (WILSON et al., 1988).
2) Ativação de espécies reativas de oxigênio como superóxido, peróxido de
hidrogênio e radical hidroxila, com indução de estresse oxidativo, o que
parece apresentar papel importante na fisiopatologia do DM (NUKATSUKA
et al.,1988).
A indução do DM é feita através de uma injeção intraperitoneal, o qual é
provavelmente o meio mais utilizado nos modelos experimentais. Quando aplicada
em doses de 50 a 60mg/Kg, os níveis de insulina diminuem em 30% do normal,
levando à hiperglicemia, poliúria, polidipsia e perda de peso. Entretanto a severa
cetose que ocorre em humanos parece não acontecer nos animais, determinando
assim uma sobrevivência por um período de várias semanas sem a reposição da
insulina (PICKUP et al.,1997).
Muitos estudos realizados em animais puderam demonstrar os variados
efeitos que a STZ pode ocasionar. Em estudos feitos por DALL’AGO et al. (1997),
foram observadas alterações na freqüência cardíaca e pressão arterial, bem como
na sensibilidade dos baro- e quimioreceptores quando comparados animais
diabéticos com animais do grupo controle. No presente estudo aplicamos 70mg/kg
70
de STZ intraperitonealmente nos animais e a doença desenvolveu-se em três
dias. Não sendo necessário a reaplicação da droga. Os animais desenvolveram
as principais características do DM como poliúria, polidipsia, hiperglicemia;
confirmando assim, os achados de GANONG (1995). Da mesma forma, LEITER
(1997), também afirma que quando os animais apresentam glicosúria e
hiperglicemia progressiva, ocorre polidipsia e poliúria, além da perda de peso.
Outro dado observado foi a variação do peso corporal dos animais (Figura
7). A perda de peso é um fator que pode ser indicativo de saúde precária dos
animais, ou decorrente do procedimento experimental (ANDERSEN et al., 2004).
Em nosso estudo, os animais não diabéticos apresentaram curva de peso normal
para idade e sexo (Figura7).
Porém, observamos que houve perda de peso, quando comparamos os
animais do grupo diabético com o grupo controle. Enquanto que os animais
diabéticos que receberam o Croton cajucara BENTH apresentaram pequena
elevação, mas não chegou a retornar aos valores iniciais (Figura 7). A diminuição
do peso corporal ocorreu mesmo com os animais estarem recebendo alimentação
e água ad libitum.
Esse dado é confirmado pelos estudos de DIAS (2005) que indica a
diminuição do peso corporal de ratos diabéticos quando comparados com ratos
controle. Segundo o mesmo autor, isso pode ocorrer em animais que
permanecem por período muito prolongado em jejum, pois o glicogênio hepático
está diminuído, e o glicerol é convertido à glicose. Como esse mecanismo é muito
limitado, o substrato para a formação da glicose sangüínea são as proteínas,
justificando assim o resultado encontrado em nosso trabalho. O aumento da
glicemia (Figura 9), em animais diabéticos, deu-se pela administração da STZ
conforme relatado em outros trabalhos (DIAS, 2005).
A hiperglicemia é um fator de risco conhecido na patogênese do DM,
podendo levar a diversas complicações, mas o exato mecanismo dos efeitos que
71
o excesso de glicose causa nos tecidos, permanece desconhecido. Diversos
estudos demonstram que a hipótese mais provável é a de que o acúmulo de
glicose sangüínea pode levar ao estresse oxidativo e isso seria o grande
responsável pelas complicações tardias do DM (PACKER et al., 2000).
No presente estudo utilizamos o extrato aquoso da casca do caule do
Croton cajucara BENTH, o qual foi administrado intragastricamente (gavagem)
nos animais estudados. A importância da investigação do CcB se dá pelo fato de
que a população utiliza este chá empiricamente para a cura de diversos males que
acometem à saúde. E entre eles, está o Diabetes Mellitus. Porém o uso desta
planta deve ser feito com cautela, uma vez que há suspeitas que seu uso em altas
doses ou por períodos prolongados pode causar hepatite tóxica.
As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais
contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas dos
vegetais, prescritos com freqüência, pelos efeitos medicinais que produzem,
apesar de não terem seus constituintes químicos conhecidos (MACIEL et al.,
2002). Dessa forma, usuários de plantas medicinais de todo o mundo, mantém a
prática do consumo de fitoterápicos, tornando válidas as informações terapêuticas
acumuladas durante séculos, e passadas de geração para geração
.
De maneira indireta, este tipo de cultura medicinal desperta o interesse de
pesquisadores em estudos envolvendo áreas multidisciplinares, como por
exemplo botânica, farmacologia e fitoquímica, que juntas enriquecem os
conhecimentos sobre a inesgotável fonte medicinal natural: a flora mundial
(MACIEL et al., 2002).
O Croton cajucara BENTH vem sendo muito estudado atualmente para uso
farmacológico, inspirando-se nos costumes do povo no norte do país, onde essa
planta é muito usada na medicina popular, que retira dela o tratamento para
muitas das doenças que atingem a sua população. Deste conhecimento popular a
ciência investiga os efeitos dos princípios ativos presentes na casca, no caule, nas
folhas e na raiz. Tendo em vista estas constatações nos propomos avaliar o
estresse oxidativo e o poder antioxidante desta planta.
72
A alteração oxidativa é um importante fenômeno biológico que pode ocorrer
pela formação de um não-radical, como o peróxido de hidrogênio, o ácido
hipocloroso ou pelo oxigênio singlet, mas também pelas espécies ativas de
oxigênio, como o ânion superóxido e o radical hidroxil. Essas moléculas alteram
as estruturas da membrana celular, mais precisamente os ácidos graxos
polinsaturados da membrana, resultando na formação dos peróxidos lipidicos. As
membranas das células e das organelas são mais suscetíveis à lipoperoxidação
(LPO), pois contêm grande quantidade de ácidos graxos polinsaturados. A reação
de oxidação pode ser iniciada pelo radical hidroxil, pois é o mais reativo dos
radicais (SOUTHORN & POWIS.,1988). Ao iniciar a lipoperoxidação, o radical livre
remove um átomo de hidrogênio de um ácido graxo polinsaturado, e como o
átomo de hidrogênio possui somente um elétron, resta um elétron
desemparelhado no atomo de carbono.
Assim, o processo de lipoperoxidação envolve a formação e a propagação
de radicais lipídicos, e determina um rearranjo das duplas ligações nos lipídios
insaturados. A eventual destruição dos lipídios da membrana faz surgir uma
variedade de produtos de degradação, incluindo álcoois, cetonas, aldeídos e
ésteres (BUEGE & AUST,1978), os quais podem ser medidos pelas substâncias
que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS).
No presente estudo a lipoperoxidação do fígado (Figura 10) mostrou um
aumento das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no grupo DM e
no grupo tratado com o Croton cajucara BENTH por 20 dias. Isso se deve ao fato
de haver uma reação dos radicais livres com as estruturas da membrana celular.
E isto é confirmado em outros estudos realizados pelo Laboratório de Hepatologia
Experimental do HCPA (DIAS, 2000), que avaliaram o tecido hepático de animais
diabéticos induzidos por estreptozocina.
Esse aumento do TBARS é resultado da reação dos radicais livres com as
estruturas da membrana celular. Isto tem sido proposto em trabalhos de outros
autores que avaliaram o tecido hepático de animais diabéticos induzidos por
estreptozotocina (CHO et al., 2002; YLMAZ et al., 2004). As alterações
encontradas no TBARS confirmam estes achados e sugerem que o estresse
73
oxidativo esta presente no DM. Os resultados encontrados em nosso estudo são
semelhantes a outros já realizados no Laboratório de Hepatologia Experimental do
HCPA (DIAS, 2005), pois ao avaliarmos a alteração hepática em animais com DM
induzidos por STZ, encontramos aumento da lipoperoxidação nos animais
diabéticos através do TBARS. Observamos também, que com o uso do extrato
aquoso do CcB nos animais diabéticos (Figura 10) está variável diminui.
No grupo que recebeu o CcB por 20 dias sugerimos que o aumento do
TBARS indica uma ação pró-oxidante, pois os animais deste grupo não estavam
doentes antes da administração do extrato aquoso do CcB.
Como o estresse oxidativo é o resultado do desequilíbrio entre a geração das
espécies ativas de oxigênio e/ou nitrogênio e a capacidade de defesa corporal,
tanto endógena quanto exógena, e sendo o sistema de defesa antioxidante
enzimático um dos componentes deste complexo, serão discutidos a seguir as
alterações das enzimas antioxidantes no DM. A quantidade e a atividade das
enzimas antioxidantes podem estar alteradas na presença de algum processo
fisiopatológico, caso do DM. Estudos demonstram que a atividade das enzimas
superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) está diminuída em animais
diabéticos (WAHAIEB & GODIN,1987; SEKEROGLU et al., 2000; OZKAYA et
al.,2002). Entretanto , outros autores reportam aumento na atividade enzimática
em animais diabéticos induzidos pela administração de estreptozotocina (HUANG
et al.,1999; ALICEGUZEL et al., 2003; YLMAZ et al., 2004). Essas contradições
podem ocorrer devido à especificidade e à atividade do tecido avaliado, bem como
à variação da severidade e o tempo de doença (UGOCHUWKU et al., 2004).
A enzima superóxido dismutase (SOD) dismuta o O
-
2
e forma H
2
O
2
através
de processos de oxidação e redução, e controla a concentração de estado
estacionário de O
2
(FRIDOVICH, 1976). A atividade da enzima superóxido
dismutase (SOD), (Figura 11), mostrou-se aumentada na atividade enzimática em
animais diabéticos induzidos pela estreptozocina, quando comparada ao grupo
controle, corroborando os resultados com os de outros autores ( YILMAZ et
al.,2004; ALICIGUZEL et al.,2003). Este aumento na atividade da SOD pode ser
74
explicado porque em algumas doenças, ao invés de ocorrer diminuição, o
aumento é decorrente da dismutação do O
-
2,
que está elevado quando do estresse
oxidativo (MATKOVICS,1977).
O aumento da SOD encontrado (Figura 11) pode ser uma resposta
adaptativa ao aumento do estresse oxidativo no fígado dos animais diabéticos,
onde, após a administração do CcB, ocorreu uma redução da atividade desta
enzima. Observamos, também, que houve diminuição da atividade da SOD nos
animais que receberam CcB por 5 e 20dias. Sugerindo assim, uma atividade
antioxidante do CcB nos animais diabéticos tratados.
A catalase (CAT) é uma hemoenzima que catalisa a dismutação do
H
2
O
2
para formar
O
2
e
H
2
O
, e está localizada fundamentalmente nos peroxissomos, ela
remove
H
2
O
2
gerado nas reações da oxidação dos ácidos graxos ou na oxidação
dos alcanos, e pode estar alterada em algumas situações. Em nosso estudo a
atividade da CAT (Figura 12) não apresentou diferença estatisticamente
significativa. Esse resultado pode ser explicado por não ter havido uma maior
formação de H
2
O
2
devido a SOD estar aumentada.
Com o objetivo de avaliar a atividade genotóxica do Croton cajucara
BENTH foi utilizado o teste de micronúcleos em medula óssea. Os resultados
obtidos neste estudo mostram que o extrato aquoso da casca desta planta,
administrado durante 5 e 20 dias, não induziu aumento de danos cromossômicos
(quebra e/ou perda cromossômica) nos ratos diabéticos e não-diabéticos quando
comparados aos seus respectivos controles (Tabela 1 e Figura 13).
Apesar de ter sido pouco estudada em relação à sua atividade genotóxica,
o Croton cajucara BENTH vem sendo descrito na literatura como destituído de
toxicidade genética, o que confirma os resultados obtidos neste estudo. De fato,
SANTOS et al. (2006) avaliaram a atividade genotóxica do extrato metanólico da
casca do Croton cajucara BENTH através do teste de micronúcleo em
camundongos albinos Swiss tratados uma vez por semana, via gavagem, com três
75
diferentes concentrações do extrato (312,5, 625 e 1.250 mg kg
-1
), durante 28 dias.
Os resultados obtidos demonstraram a ausência de atividade genotóxica das três
concentrações utilizadas.
Outro estudo realizado com o Croton cajucara BENTH evidenciou a
ausência de atividade genotóxica, desta vez utilizando a trans-desidrocrotonina (t-
DCTN), o principal diterpeno isolado a partir da casca desta planta. O t-DCTN foi
administrado em dose única, via injeção intraperitoneal, a camundongos albinos
Swiss e a análise genotóxica foi realizada através dos testes de micronúcleo e
aberrações cromossômicas em células da medula óssea (AGNER et al., 1999).
Em função dos resultados negativos apresentados acima, AGNER et al.
(1999) avaliaram a atividade antimutagênica do t-DCTN nos mesmos animais
experimentais, utilizando a ciclofosfamida como indutora de danos genéticos e os
testes de micronúcleo e aberrações cromossômicas em medula óssea como
técnicas de estudo. Para tanto, foram utilizados dois tipos de tratamentos com o t-
DCTN: injeção intraperitoneal e gavagem. Em ambos os casos, o modulador foi
administrado 30 minutos antes da aplicação do agente genotóxico (via i.p.), na
forma de pré-tratamento. Os resultados obtidos nos dois bioensaios utilizados
demonstraram a atividade anti-genotóxica do t-DCTN em relação aos danos
genéticos induzidos pela ciclofosfamida, pelas duas vias de administração.
A partir dos resultados obtidos neste estudo, somados aos dados da
literatura, pode-se concluir que os extratos aquoso e metanólico da casca de
Croton cajucara BENTH, assim como o t-DCTN, seu principal constituinte, não
são capazes de induzir danos cromossômicos do tipo perda e/ou quebra
cromossômica em células da medula óssea de roedores. Soma-se a isto o fato de
que o t-DCTN apresentou atividade anti-genotóxica em camundongos, protegendo
contra a indução de eventos clastogênicos e/ou aneugênicos. Ainda que estudos
adicionais tenham que ser realizados com o objetivo de ampliar o espectro de
eventos genotóxicos a serem avaliados, o Croton cajucara BENTH parece não
oferecer risco de indução de danos genético às pessoas que vem utilizando esta
planta.
76
CONCLUSÕES
77
6 CONCLUSÕES_________________
1) O peso corporal dos animais diabéticos foi menor do que o controle após 60
dias de doença;
2) A glicemia não diminuiu nos animais diabéticos após a administração do Croton
cajucara BENTH (CcB).
3) O marcador de estresse oxidativo avaliado neste estudo (TBARS), apresentou
aumento significativo no grupo DM e no grupo tratado com CcB20 dias, em
relação ao grupo controle.
4) Houve diminuição na atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase
(SOD) no fígado de animais diabéticos após o uso do CcB; mas não houve
mudanças na atividade da enzima catalase (CAT).
5) O Croton cajucara BENTH não mostrou atividade genotóxica quando avaliado
através do teste de micronúcleos em medula óssea de ratos diabéticos e não
diabéticos.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
79
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS_________________
Os resultados obtidos sugerem que o Croton cajucara Benth tem
propriedades antioxidantes nos animais diabéticos e propriedades pró-oxidantes
nos animais controles tratados por 20 dias com o extrato aquoso do Croton
cajucara Benth; entretanto o extrato aquoso mostrou-se destituído de atividade
genotóxica no modelo utilizado.
Como perspectivas futuras pretendemos:
Avaliar os princípios ativos do Croton cajucara BENTH;
Avaliar a expressão das enzimas antioxidantes e
Avaliar o envolvimento do óxido nítrico no experimento utilizado.
80
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
81
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS____________
AGNER, A.R.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; PAMPLONA; S.G.R.S.; CÓLUS
I.M.S. Investigation of genotoxic activity of transdehydrocrotonin, a clerodane
diterpene from Croton cajucara. Teratogenesis, carcinogenesis, and
mutagenesis, v. 19, p.377-384, 1999.
ALICEGUZEL, Y.; OZEN,I.; ASLAN, M.; KARAYALCIN, U. Activities of xanthine
oxidoreductase and antioxidant enzymes in different tissues of diabetic rats. The
Journal of laboratory and clinical medicine, v.142, p.172-177, 2003.
AMOROZO, M.C.M.; GELY, A. Uso de Plantas Medicinais por Caboclos do
Baixo Amazonas. Museu Paraense Emílio Goeldi: Barcarena, p. 47, 1988.
ANDERSEN, M.L; D’ALMEIDA; V.;KO, G.M.; KAWAKAMI, R.; MARTINS, P.J.F.;
MAGALHÃES.L.E; TUFIK, S. Princípios Éticos e Práticos do uso de animais
de experimentação. UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo: São Paulo,
179p., 2004.
ANDRADE, A.O. Bioterismo: evolução e importância. In: ANDRADE A.; PINTO
S.C.; OLIVEIRA, R.S. (Org.) Animais de Laboratório: Criação e
Experimentação. Editora Fiocruz: Rio de Janeiro, pp. 79-94 , 2002.
ATKINSON, M.A.; EISENBARTH, G.S. Type1 diabetes: new perspectives on
disease pathogenesis and treatment. Lancet, v.358, p. 221-229, 2001.
BALDA, C.A.; PACHECO-SILVA, A. Aspectos imunológicos do diabetes mellitus
tipo 1. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 45, p.175-80, 1999.
BAUER, A.C. Avaliação do estresse oxidativo e do efeito citoprotetor de
tocoferóis sobre a viabilidade de ilhotas pancreáticas submetidas ao
processo de isolamento. Porto Alegre, 2005, 130p. Tese (Doutorado em Clinica
Médica e Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina) – Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul.
BAUMGARTNER-PARZER, S.M.; WAGNER, L.; PETTERMANN, M.; GESSEL,
A.; WALDHUAST, W. Modulation by high glucose of adhesion molecule
expression in cultured endothelial cells. Diabetologia, v.38, p.1367-1370,1995.
BAYNES, W. Chemical modification of protein by lipids in diabetes. Clinical
Chemistry and Laboratory Medicine, v.41, p.1159-1165, 2003.
BELLOMO, G.; MAGGI, E.; PALLADINE, G.; PERUGINI.; SECCIA, M. Oxidation
of low density lipoproteins and vitamin e status in non insulin dependent diabetes
mellitus (NIDDM). Diabetes, v.6, p. 29-33, 1997.
82
BERNARD, N.; PECARD, A. A Technique de prélivement d’chantilation de sang
chez lês petits animaux de laboratorie por ponction du plexus ophthalmique.
Journal de la Société de Biologie, v. 145, p.1465, 1951.
BIGHETTI, E.J.B.; SOUZA-BRITO, A.R.M.; DE FARIA, E.C.; OLIVEIRA, H.C.F.
Chronic treatment with bark infusion from Croton cajucara lowers plasma
triglyceride levels in genetic hyperlipidemic mice. Canadian Journal of
Physiology and Pharmacology, v. 82, p. 387-392, 2004.
BOUNDY, J. (Org.). Enfermagem médico-cirúrgica. Reichmann & Affonso
Editores: Rio de Janeiro, 2004.
BOVERIS, A. Biochemistry of free radicals: from electrons to tissues. Medicina,
v.58, p. 350-356, 1998.
BOVERIS, A.; CHANCE, B. The mitocondrial generation of hydrogen peroxide.
The Biochemical Journal,134, p.707-716, 1973.
BUEGE , J.A.; AUST, S.D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in
Enzymology, v. 52, p. 302-309, 1978.
CAMERON, N.E.; COTTER, M.A.; HORROBIN, D.H.; TRITSCHLER, H.J. Effects
of alpha-lipoic acid on neuro-vascular function in diabetic rats: interaction with
essencial fatty acids. Diabetologia, v.41, p.390-399, 1998.
CAMPOS, A.R.; ALBUQUERQUE, F.A.A.; RAO, V.S.N.; MACIEL, M.A.M.; PINTO,
A.C. Investigations on the antinociceptive activity of crude extracts from Croton
cajucara leaves in mice. Fitoterapia, p.116-120, 2002.
CAMPOS, J.J.B; ALMEIDA, H.G.; IOCHIDA, L.C.; FRANCO, L.J. Incidência de
Diabetes mellitus insulino-dependente (Tipo1) na cidade de Londrina, PR, Brasil.
Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabolismo, v. 42, p. 36-44,1998.
CARTER, S.K; BRODER, L.; FRIEDMAN.M. Streptozotocin and metastatic
insulinoma. Annals of Internal Medicine, v. 74, p. 445-446, 1971.
CHO, S.Y.; PARK, J.Y.; PARK, E.M.; CHOI, M.S.; LEE, M.K.; JEON, S.M.; JANG,
M.K.; KIM, M.J.; PARK, Y.B. Alternation of hepatic antioxidant enzyme activities
and lipid profile in streptozotocin-induced diabetic rats by supplementation of
dandelion water extract. Clinica Chimica Acta, v.17, p.109-117, 2002.
CHOY, W.N. Regulatory genetic toxicology tests. In: CHOY, W.N. (Ed.), Genetic
Toxicology and Cancer Risk Assessment. Marcel Deker Inc: New York, p. 93-
113, 2001.
COUTO, S.E.R. Classificação dos Animais de Laboratório quanto ao Status
Sanitário. In: ANDRADE, A.; PINTO, S.C.; OLIVEIRA, R.S. Animais de
Laboratório: Criação e Experimentação. Editora Fiocruz: Rio de Janeiro, 2002.
83
DALL’AGO, P.; FERNANDES, T.G.; MACHADO, U.F.; BELLÓ, A.A.; IRIGOYEN,
M.C. Baroreflex and chemoreflex dysfunctionin streptozotocin-diabectic rats.
Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.30, p.119-124,1997.
DELAMAIRE, M.; MAUGENDRE, D.; MORENO, M.; LE GOFF, M.C. ; ALLANNIC,
H. ; GENETET, B. Impaired leucocyte functions in diabetic patientes. Diabetic
Medicine, v.14, p. 29-34,1997.
DEVENDRA, D.; LIU, E.; EISENBARTH, G.S. Type 1 diabetes: recent
developments. British Medical Journal, v. 328, p. 750-754, 2004.
DIAS, A. S. Avaliação da Lipoperoxidação e do fluxo sangüíneo na artéria
mesentérica de ratos diabéticos por indução de estreptozotocina. Porto
Alegre, 2000, 69 p. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas: Fisiologia),
Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
DIAS, A. S. Efeito da quercetina sobre o estresse oxidativo, ativação do NF-
kB, e expressão da iNOS no fígado de animais diabéticos induzido por
estreptozotocina. Porto Alegre, 2005, 79 p. Tese (Doutorado em Ciências
Biológicas: Fisiologia), Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
DILLS, D.C. Novos aspectos da terapêutica com insulina no diabetes tipo 1 e tipo
2. Current Diabetes Reports Latin América, v. 2, p.125-32, 2002.
FENECH, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research, v. 455, p.
81-95, 2000.
FENECH, M. In vitro micronucleus technique to predict chemosensitivity. Methods
in Molecular Medicine,v.111, p.3-32, 2005.
FEREIRA, S.R.G.; FRANCO, L.J.; VIVOLO, M.A.; NEGRATO, C.A.; SIMOES,
A.C.P; VENTURELLI, C.R. Population-based incidence of lDDM in the state of
São Paulo, Brazil. Diabetes Care, v.16, p. 701-704, 2000.
FRIDOVICH, I. Oxygem radicals, hydrogen peroxide, and oxygen toxicity. In:
PRYOR, W.A. (Ed.) Free radicals in biology. Academic Press: New York, p.239-
277,1976.
GALLACHER, S.J.; THOMSON, G.; FRASER, W.D.; FISHER, B.M.; GEMMELL,
C.G.; MacCUISH, A.C. Neutrophil bactericidal function in Diabetes mellitus
evidence for association with blood glucose control. Diabetic Medicine, p. 916-
920, 1995.
GANONG, W.F. Review of Medical Physiology. 17 ed. McGraw-Hill Publishing
Co.: Appleton Lange, 870 p.,1995.
GOLDIM, J.R, RAYMUNDO, M.M. Pesquisa em saúde e direitos dos animais.
2ª ed. HCPA: Porto Alegre, 28 p. 1997.
84
GOTOH, M.; SATO, Y.; ABE, T.; KANAZAWA, Y. New approaches for successful
islet transplantation. Journal Hepatobiliary Pancreatic Surgery, v. 7, p. 358-363,
2000.
GRUBER, W.; LANDER, T.; LEESE, B.; SONGER, T.; WILLIAMS, R. The
economics of diabetes and diabetes care. World Health Organisation/
International Diabetes Federation: Brussels,136 p.,1998.
GRYNBERG, N.F.; ECHEVARRIA, A.; LIMA, J.E.; PAMPLONA, S.G.S.R.; PINTO,
A.C.; MACIEL, M.A.M.; Anti-tumour activity of two 19-nor-clerodane diterpenes,
trans-dehydrocrotonin and trans-crotonin, from Croton cajucara. Planta Medica, v.
65, 687-689, 1999.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.C. Free radicals in biology and medicine.
Oxford University Press Inc.: New York, 3th ed., 936 p.,1999.
HARRIS, M.; CAHILL, G. Members of NIH Diabetes Data Group Workshop: a draft
classification of diabetes mellitus and other categories of glucose tolerance.
Diabetes, v.27, p.1112-1125, 1978.
HERNANDORENA, B.H.; GONZALES, J.C.R.; GARCIA, J.C.R. Animales de
laboratório en la endocrinología: biomodelos de la Diabetes mellitus tipo1. Revista
Cubana de Endocrinología, v.13, p.168-177, 2001.
HOTTA, M.; YAMATO, E.; MIYAZAKI, J. Oxidative stress and pancreatic β-cell
destruction in insulin dependent Diabetes mellitus. In: PACKER, L.; RÖSEN, P.;
TRITSCHLER, H.J.; KING, G.L.; AZZI, A. (Eds.) Antioxidants in diabetes
management. Ed. Marcel Dekker: New York, p. 265-274, 2000.
HOUNSOM, L.; TOMLISON, D.R. Does neuropathy develop in animal models?
Clinical Neuroscience, v.4, p. 380-389, 1997.
HUANG, W.C.; JUANG, S.W.; LIU, I.M.; CHI, I.C.; CHENG, J.J. Changes of
superoxide dismutase gene expression and activity in the brain of streptozotocin
induced diabetic rats. Neuroscience Letters, v. 275, p.25-28, 1999.
JOSHI, N.; CAPUTO, G.M.; WEITEKAMP, M.R.; KARCHMER, A.W. Infectious in
patients with Diabetes mellitus. New England Journal Medicine, v. 342, p.1906-
1912, 1999.
KARAN, J.H. Diabetes mellitus & hypoglycemia. In: TIERNEY JR, L.M.; MCPHEE
S.J.; PAPADAKIS, M.A. (Eds.) Current medical diagnosis and treatment. 38ed.
Appleton & Lange: Stanford, p.1118-60, 1999.
KEEN, H. The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT). Health Trends,
v. 26, p. 41-43, 1994.
85
KIRSTEN, V.R. Caracterização do modelo experimental NOD (nonobese
diabetic) em ambiente convencional. 103 p., Porto Alegre, 2006. Dissertação
(Mestrado em Medicina e Ciências da Saúde: Nefrologia). Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul.
KRISHNA, G., HAYASHI, M. In vivo rodent micronucleus assay: protocol, conduct
and data interpretation. Mutation Research, v. 455, p. 155-166, 2000.
LEITER, E.H. The NOD mouse: a model for insulin-dependent Diabetes mellitus.
Current Protocols in Immunology, v. 24, p.1-23, 1997.
LEWIS, C.; BARBIERS, A.R. Streptozotocin, a new antibiotic. In vitro and in vivo
evaluation. Antibiotics annual, v. 7, p. 247-254, 1959.
LIKE, A.A.; ROSSINI, A.A. Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: a new
model of Diabetes mellitus. Science, v.193, p. 415-417, 1976.
LLESUY,S,F. Introducción y Especies Activas de Oxígeno. Estresse oxidativo e
antioxidantes. Editora ULBRA: Canoas.,p.21-32,2002.
LOW, P.A.; NICKANDER, K.K.; TRITSCHLER, H.J. The roles of oxidative stress
and antioxidant treatment in experimental diabetic neuropathy. Diabetes, v. 46, p.
385-425, 1997.
LOWRY, H.; ROSEBROUGH, M.J.; FARR, A.L. Protein measurement with the
foline reagent. The Journal of biological chemistry., v. 193, p. 265-275, 1951.
LUNA COSTA, A.M.; RAO, V.S.N.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C. XIIIth
International Congress of Pharmacology, München, 1998.
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; NUNES, D.S.; Resumos da 18
a
Reunião Anual
da Sociedade Brasileira de Química, Caxambu, Brasil, 1995.
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; PAMPLONA, S.G.S.R.; VANDERLINDE, F.A.;
LAPA, A.J.; CARVALHO, J.C.T.; ECHEVARRIA, A.; GRYNBERG, N.F.; FARIAS,
R.A.F.; LUNA COSTA, A.M.; RAO, V.S.N. XV Simpósio de Plantas Medicinais
do Brasil, Águas de Lindóia, Brasil, 1998.
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; VEIGA JR., V.F. Medicinal plants: the need for
multidisciplinary scientific studies. Química Nova, v. 25, p. 429-438, 2002.
MARKS, D.B.; MARKS, A.D.; SMITH, C.M. Basic medical biochemistry: a
clinical approach. Ed. Lippincott Williams & Wilkins: Baltimore, 806 p.,1996.
MARTINS, J.R. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Brasil, 2000.
86
MATKOVICS, B. Effect of plant and animal lesions on superoxide dismutase
activities. In: McCORD, G.; MICHELSON, A.M.; FRIDOVICH, I. (Eds) Superoxide
and superoxide dismutase. Academic Press: New York, p. 501-514, 1977.
MAXWELL, S.R.J. Propects for the use of antioxidant therapies. Drugs, v. 49, p.
345-361, 1995.
MELO, D.A.S. Comparação e análise da expressão do fator de ativação
núcleo Kappa B (NFKB) e da eletrogastrografia em ratos normais e
diabéticos. Porto Alegre, 2001, 98 p. Dissertação (Mestrado em Ciências
Biológicas: Fisiologia), Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
MEZADRI, T.J.; TOMÁZ, V.A.; AMARAL, V.L.L. Animais de laboratório:
cuidados na iniciação experimental. Editora UFSC: Florianópolis, 155 p., 2004.
MILECH, A.; OLIVEIRA, J.E.P. Diabetes mellitus – clinica, diagnóstico,
tratamento multidisciplinar. Atheneu: São Paulo, 147 p., 2004.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Diabetes mellitus: guia básico para diagnóstico e
tratamento. Ministério da Saúde: Brasília, 1996.
MIOTTO, A. Perfil e sensibilidade adrenérgica em átrio direito de ratos
normo e hipercolesterolêmicos tratados ou não com infuso das cascas de
Croton cajucara BENTH. Dissertação (mestrado). Universidade Estadual de
Campinas,SP,p.9,2001.
MISRA, H.P.; FRIDOVICH, I. The role of superoxide anion in the autoxidation of
epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. The Journal of
Biological Chemistry, v. 247, p. 3170-3175, 1972.
NATHAN, D.M. Long-term complications of Diabetes mellitus. New England
Journal of Medicine, v. 328, p. 1676-1685, 1993.
NOUROOZ-ZADEH, J.; TAJADDINI-SARMADI, J.; McCARTHY, S.;
BETTERIDGE, D.J.; WOLFF, S.P. Elevated levels of authentic plasma
hydroperoxides in NIDDM. Diabetes, v. 44, p. 1054-1058, 1995.
NUKATSUKA, M.; SAURAI, H.; YOSHIMURA,Y.; NISHIDA, M.; KAWADA, J.
Enhancement by streptozotocin of 02-radical generation by the xanthine oxidase
system of pancreatic beta-cells. FEBS Letters, v. 239, p. 295-298, 1988.
OZKAYA, Y.G.; AGAR, A.; YARGICOGLU, P.; HACIOGLU, G.;
BILMENSSAIKCIOGLU, S.; OZEN, I.; ALICIGUZEL, Y. The effect of exercise on
brain antioxidant status of diabetic rats. Diabetes Metabolism, v.28, p. 377-384,
2002.
PACKER, L.; RÖSEN, P.; TRITSCHLER, H.J.; KING, G.L.; AZZI, A. Antioxidants
in diabetes management. Ed. Marcel Dekker: New York, 349 p., 2000.
87
PARSLOW, T.G.; STITES, D.; TERR, A.I.; IMBODEN, J.B. Imunologia Médica.
Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 702 p., 2000.
PERAZZO, F.F.; RODRIGUES, M.; CARVALHO, J.C.T.; MACIEl, M.A.M.; PINTO,
A.C.; ARRUDA, A.C.; PAMPLONA, S.G.S.R. III Jornada Paulista de Plantas
Medicinais, Campinas, Brasil, 1997.
PICKUP, J.C.; WILLIAMS, C. Textbook of diabetes. 2nd ed. Blackwell Scientific
Publications: London, 1520 p., 1997.
PITKANIEMI, J.; ONKAMO, P.; TUOMILEHTO, ARJAS, E. Increasing incidence of
type 1 diabetes – role for genes? BioMed Central Genetics, v. 5, p. 5, 2004.
REWERS, M.; KLINGESNSMITH, G.L. Prevention of type 1 Diabetes. Diabetes
Spectrum, v. 10, p. 282-292, 1997.
RIBEIRO, L.R.; SALVADORI, D.M.F.; MARQUES, E.K. Mutagênese ambiental.
Ed. ULBRA: Canoas, 355 p., 2003.
ROBBINS, M.J.; SHARP, A.R.; SLONIN, A.E.; BURR, I.M. Protection against
streptozotocin-induced diabetes by superoxide dismutase. Diabetologia, v.18,
p.55-80,1980.
RODRIGUES, G.; BONA, S.; TIEPPO, M.; PORAWSKI, M.; MARRONI, N.A.P.;
Avaliação da atividade antioxidante do Croton cajucara BENTH frente ao uso
de paraquat. Resumo FESBE: São Paulo, 2005a.
RODRIGUES, G.; BONA, S.; TIEPPO, M.; PORAWSKI, M.; MARRONI, N.A.P. O
efeito do Croton cajucara BENTH no estômago de ratos submetidos à lesão
por paraquat. Resumo FESBE: São Paulo, 2005b.
ROSSI, V.E.C.;BARBOSA,L.M.Impacto do Diagnóstica de Doença Cronica em um
grupo de Diabéticos na cidade de Passos-MG. Nursing. V.65, p.39-42, 2003.
ROSSINI, A.A.; MORDES, J.P.; GREINER, D.L.; STOFF, J.F. Islet cell
transplantation tolerance. Transplantation, v. 72, p. s43-s46, 2001.
SANTOS, F.V.; MESQUITA, S.F.P.; FARIA, M.J.S.S, POERSH, A.; MACIEL,
M.A.M.; PINTO, A.C.; MORIMOTO, H.K.; CÓLUS, I.M.S. Absence of mutagenicity
in somatic and germ cells of mice submitted to subchronic treatment with an
extract of Croton cajucara Benth.(Euphorbiaceae). Genetics and Molecular
Biology, v. 29: 159-165, 2006.
88
SCHIMDT, A.M.; HORI, O.; CHEN, J.X.; LI JF, CRANDALL, J.; ZHANG, J.; CAO,
R.; YAN, S.D.; BRETT, J.; STERN, D. Advanced glycosylation end products
interacting with their endothelial receptors induce expression of vascular cell
adhesion molecule-1 (VCAM-1), in cultured human endothelial cells and in mice.
The Journal of Clinical Investigation, v.96, p. 1395-1403, 1995.
SEKEROGLU, M.R.; SAHIN, H.; DULGER, H.; ALGUN, E. The effect of dietary
tratment on erytrocyte lipid peroxidation, superoxide dismutase and glutathione
preoxidase, and serum lipid peroxidation in patients with type 2 diabetes mellitus.
Clinical Biochemistry, v.33, p. 669-674, 2000.
SILVERTHORN, D.V. Fisiologia Humana: uma abordagem integrada. 2
a
Edição. Ed. Manole: São Paulo, 820 p., 2003.
SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES. Consenso Brasileiro sobre diabetes
2002: diagnóstico e classificação do Diabetes mellitus e tratamento do
Diabetes mellitus tipo 2. Sociedade Brasileira de Diabetes: Rio de Janeiro, 51 p.,
2003.
SOCIEDADE PORTUGUESA DE DIABETOLOGIA. Definição, diagnóstico e
classificação da DM, 2006. Pesquisado em 16/03/2006.
http.www.spd.pt/cla_dia_mellitus/cla_dia_mellitus.html
SOUTHORN, P.A.; POWIS, G. Free radicals in medicine I. Chemical nature and
biologic reactions. Mayo Clinic Proceedings, v.63, p.381-389, 1988.
STEINBERG, D.; PARTHASARATHY, S.; CAREW, T.E.; KHOO, J.C.; WITZTUM,
J.L. Beyond cholesterol. Modifications of LDL that increase atherogenicity. New
England Journal of Medicine, v. 320, p. 915-924, 1989.
TAKEUCHI, K.; UESHIMA, K.; OHUCHI, T.; OKABE, S. Induction of gastric
lesions and hypoglycemic response by food deprivation in streptozotocin-diabetic
rats. Digestive Diseases and Sciences, v. 39, p.626-634,1994.
THE DCCT RESEARCH GROUP. Expanded role of the dietitian in the diabetes
control and complications trial: implications for clinical practice. The Journal of the
American Dietetic Association, v. 93, p. 758-767, 1993.
THOMPSON, K.H.; GODIN, D.V. Micronutrients and antioxidants in the
progression of diabetes. Nutrition Research, v. 15, p.1377-1410, 1995.
TIEPPO, M.; PORAWSKI, M.; SALVADOR, M,; MOREIRA, A.J.; COLLADO, P.S.;
GONZALEZ-GALLEGO, J.; MARRONI, N.P. Croton cajucara BENTH leaves
extract scavenges the stable free radical DPPH and protects against oxidative
stress induced by paraquat. Biological & Pharmaceutical Bulletin, v. 29, p. 161-
165, 2006.
89
UCHIGATA, Y.; YAMAMOTO, H.; NAGAI, H.; OKAMOTO, H. Effect of poly (ADP-
ribose) synthetase inhibitor administration to rats before and after injection of
alloxan and streptozotocin on islet proinsulin synthesis. Diabetes, v. 32, p. 316-
318, 1983.
UGOCHUWKU, N.H.; BAGAYOKO, N.D.; ANTWID, M.E. The effects of dietary
caloric restriction on antioxidant status and lipid peroxidation in meld and severe
streptozotocin-induced diabetic rats. Clinica Chimica Acta, v.34, p.121-129,
2004.
VAN DAM, P.S. Oxidative stress and diabetic neuropathy: pathophysiological
mechanisms and treatament perspectives. Diabetes/metabolism Research and
Reviews, v.18, p.176-184, 2002.
WAHAIEB, S.A.; GODIN, D.V. Alterations in free radical tissue – defense
mechanisms in streptozotocin-induced diabetes in rat. Effects of insulin treatment.
Diabetes, v.36, p.1014-1018,1987.
WHITE, F.R. Streptozotocin. Cancer Chemotherapy Reports, v. 30, p. 49-53,
1963.
WILD, S.H; ROGLIC, G.; GREEN. A.; SICREE, R.; KING, H. Global prevalence of
diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030: response to
Rathman and Giani. Diabetes Care, v. 27, p. 2568-2569, 2004.
WILSON, G.L.; HARTIG, P.C.; PATTON, N.J.; LEDOUX, S.P. Mechanisms of
nitrosourea-induced beta-cell damage. Activation of poly (ADP-ribose) synthetase
and cellular distribution. Diabetes, v. 37, p.213-216, 1988.
WOLFF, S.P.; DEAN, R.T. Glucose autoxidation and protein modification. The
potential role of autoxidative glycosylation in diabetes. Biochemistry Journal, v.
245, p. 243-250, 1987.
WOLFF, S.P.; JIANG, Z.Y.; HUNT, J.V. Protein glycation and oxidative stress in
Diabetes mellitus and ageing. Free Radical Biology and Medicine, v. 10, p. 339-
352, 1991.
YAMAMATO, H.; UCHIGATA, Y.; OKAMOTO, H. Streptozotocin and alloxan
induce DNA strand breaks and poly (ADP – ribose) synthetase in pancreatic islets.
Nature, v. 294, p.284-286, 1981.
YLMAZ, H.R.; YUCEL, N.; ALTUNTAS, I.; OZCELIK, N. Protective effect of coffeic
acid phenethyl ester (CAPE) on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in
diabetic rat liver. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, v.18,
p.234-238, 2004.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo