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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR
Estudo de freqüência de polimorfismos nos genes da
Apolipoproteína A-I (apo A-I) e da Enzima Conversora de
Angiotensina (ECA) em pacientes dislipidêmicos
Maristela Fátima Flores
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Diagnóstico Genético e
Molecular
Orientadora: Drª. Cláudia Dornelles da Silva
Co-orientador: Dr. Moacir Wajner
CANOAS
2006
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2
DEDICATÓRIA
Para Rudimar, meu esposo,
amigo e companheiro, pela
dedicação, carinho e
compreensão.
Aos meus pais, Lindomar e Teresinha,
pelo esforço, apoio e incentivo na busca do
conhecimento e na conquista deste título.
Para meu filho, Luís Paulo, sentido maior da
minha vida, dedico esse título como forma de
incentivo na sua caminhada acadêmica,
pós acadêmica e na sua vida profissional.
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3
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Dra. Cláudia Dornelles da Silva, pela compreensão,
carinho, preciosa sabedoria e pela orientação nestes anos de pesquisa.
Ao meu co-orientador, Dr. Moacir Wajner, pela sabedoria, orientação,
incentivo e por viabilizar a realização desse trabalho.
À Dra. Nadine Clausell do Serviço de Cardiologia do Hospital de Clínicas de
Porto Alegre por ter viabilizado a realização dessa pesquisa.
Ao Doutorando Andry Fiterman Costa, coordenador do Ambulatório de
Dislipidemia do Hospital de Clínica de Porto Alegre, por ter disponibilizado o
acesso aos pacientes, aos dados clínicos e bioquímicos e pelo auxílio incansável
nas análises estatísticas.
À Dra. Marilu Fiegenbaum, pela atenção e colaboração com as análises
estatísticas.
Aos meus pais, pelo incentivo e compreensão nos momentos de ausência,
em especial ao meu pai Lindomar, obrigada por tudo.
Ao meu marido Rudimar, por todo o amor sempre presente e pela confiança
depositada em mim.
Ao meu filho Luís Paulo, obrigada pela compreensão nos momentos
ausentes, pelo carinho e paciência.
À querida colega de mestrado Janice Karpinski, por todo o apoio, carinho e
colaboração na pesquisa.
4
Aos colegas bolsistas do laboratório de Genética Molecular da ULBRA,
Millene Coelho, Paulo Perizzolo e Carlos Pitroski pela dedicação, carinho e auxílio
na realização dos testes, bem como o acesso às instalações e materiais do
laboratório.
À Fernanda Chulla, pela colaboração na coleta e extração de DNA das
amostras.
Ao Coordenador do Programa de Pós-graduação em Diagnóstico Genético e
Molecular, Prof. Daniel Simon, e aos professores pelo incentivo à pesquisa.
A todas as pessoas que, mesmo não mencionadas, contribuíram de alguma
forma para a realização deste trabalho.
5
“A conduta humana se parece muito com o desenho. A perspectiva se altera
quando o olho muda de posição. Não depende do objeto e sim de quem está
olhando”.
(Vicent Van Gogh)
6
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................. 7
LISTA DE TABELAS......................................................................................................... 9
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................10
RESUMO.........................................................................................................................11
ABSTRACT........................................................................................................................12
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................13
1.1 Dislipidemia, aterosclerose e doença cardiovascular. ............................................13
1.2 Lipoproteínas .........................................................................................................14
1.3 Genética das Lipoproteínas ...................................................................................20
1.3.1 Apolipoproteína A-I (apo A-I)...........................................................................21
1.4 Hipertensão arterial sistêmica e o gene da Enzima Conversora da Angiotensina ..26
1.5 Tratamento das Dislipidemias e Hipertensão.........................................................30
2. JUSTIFICATIVA...........................................................................................................32
3. OBJETIVOS.................................................................................................................34
4. METODOLOGIA ..........................................................................................................35
4.1 Delineamento do estudo ........................................................................................35
4.2 População do estudo .............................................................................................35
4.2.1 Seleção das Amostras ....................................................................................35
4.2.2 Coleta de dados..............................................................................................35
4.3 Dosagens bioquímicas...........................................................................................36
4.4 Extração de DNA ...................................................................................................38
4.5 Reação de PCR.....................................................................................................38
4.6 Detecção dos fragmentos de DNA amplificados ....................................................38
4.7 Genotipagem por RFLP .........................................................................................38
4.8 Análises genotípicas ..............................................................................................39
4.9 Análises estatísticas...............................................................................................40
4.10 Considerações éticas...........................................................................................41
5. RESULTADOS ............................................................................................................42
5.1. Análise descritiva da amostra ...............................................................................42
5.2. Análises moleculares da amostra estudada ..........................................................45
5.2.1. Análises moleculares do gene apo A-I ...........................................................45
5.2.2. Análises moleculares do gene ECA ...............................................................47
5.3. Freqüências dos polimorfismos analisados...........................................................48
5.3.1. Freqüências genotípicas e alélicas.................................................................48
5.3.2. Freqüências genotípicas e haplotípicas de acordo com os níveis de lipoproteína
de baixa densidade (LDL) e de alta densidade (HDL)..............................................50
5.3.3. Freqüências genotípicas da Apo A-I e ECA de acordo com o IMC.................52
5.3.4. Níveis bioquímicos de acordo com os genótipos da Apo A-I e ECA dos usuários
e não usuários de estatinas. ....................................................................................53
6. DISCUSSÃO................................................................................................................56
7. CONCLUSÕES............................................................................................................62
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................64
9. ANEXOS......................................................................................................................75
7
LISTA DE ABREVIATURAS
apo: Apolipoproteína
apo A-I: Gene da apolipoproteína A-I
AT II: Angiotensina II
CETP: Proteína transferidora de ésteres de colesterol
DAC: Doença Arterial Coronariana
DCV: Doença cardiovascular
DM: Diabete melito
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
ECA: Enzima Conversora de Angiotensina
HA: Hipertensão arterial
HAS: Hipertensão arterial sistêmica
HDL: Lipoproteína de Alta Densidade
HDL-C: HDL-Colesterol
HL: Lípase hepática
IDL: Lipoproteína de densidade intermediária
IM: Infarto do Miocárdio
IMC: Índice de massa corporal
LCAT: Lecitina Colesterol Acil-transferase
LDL: Lipoproteína de baixa densidade
LDL-C: LDL-Colesterol
NO: Óxido nítrico
PAD: Pressão Arterial Diastólica
PAS: Pressão Arterial Sistólica
pb: Pares de bases
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
QM: Quilomícrons
RFLP: Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição
SNP: Polimorfismo de Nucleotídeo Único
SRAA: Sistema Renina Angiotensina Aldosterona
TG: Triglicérides
8
VLDL: Lipoproteína de muito baixa densidade
VLDL-C: VLDL-Colesterol
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais classes de lipoproteínas e suas densidades.........................
16
Tabela 2. Genes de lipoproteínas e enzimas envolvidos com o metabolismo de
lipídios e que contribuem para o risco de DAC ....................................
21
Tabela 3.
Freqüências genotípicas e alélicas dos polimorfismos MspI no sítio -
75G>A do gene apo A-I.........................................................................
25
Tabela 4.
Freqüências genotípicas e alélicas dos polimorfismos MspI no sítio
+83C>T do gene apo A-I.......................................................................
26
Tabela 5. Freqüências genotípicas e alélicas dos polimorfismos I/D no gene
ECA.......................................................................................................
30
Tabela 6.
Descrição dos primers e condições de amplificação por PCR dos
genes apo A-I e ECA.............................................................................
39
Tabela 7. Análise descritiva da amostra................................................................
42
Tabela 8. Perfil bioquímico da amostra.................................................................
43
Tabela 9. Freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos investigados
nos genes apo A-I e ECA......................................................................
47
Tabela 10.
Freqüências haplotípicas dos polimorfismos presentes nos sítios -
75G>A e +83C>T no gene apo A-I........................................................
48
Tabela 11. Freqüências genotípicas e haplotípicas dos polimorfismos estudados
em relação aos níveis lipídicos de LDL e de HDL...............................
49
Tabela 12. Freqüências genotípicas dos polimorfismos estudados em relação ao
IMC........................................................................................................
50
Tabela 13. Comparação de freqüências para os polimorfismos nos sítios -75G>A
e +83C>T do gene Apo A-I e do polimorfismo I/D da ECA com as
variáveis bioquímicas dos pacientes usuários de estatinas..................
52
Tabela 14. Comparação de freqüências para os polimorfismos nos sítios -75G>A
e +83C>T do gene Apo A-I e do polimorfismo I/D da ECA com as
variáveis bioquímicas dos pacientes não usuários de estatinas...........
53
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Artérias do coração e formação de placas ateroscleróticas.....
14
Figura 2. Agrupamento gênico A-I/C-III/A-IV no cromossomo 11 da
espécie humana.......................................................................
22
Figura 3. Esquema dos polimorfismos presentes no gene apo A-I........ 22
Figura 4. Esquema da lipoproteína de alta densidade (HDL)..................
23
Figura 5. Representação esquemática da organização do gene da
ECA...........................................................................................
28
Figura 6. Diferença entre o alelo inserção (I), com a presença de um
fragmento adicional de 287 pb, enquanto que o alelo deleção
(D), não apresenta esse fragmento..........................................
28
Figura 7a. Tamanho dos fragmentos da apo A-I após o processo de
clivagem com a enzima MspI no sítio +83C>T.........................
Figura 7b. Tamanho dos fragmentos da apo A-I após o processo de
clivagem com a enzima MspI no sítio -75G>A ........................
Figura 7c. Combinação haplotípica dos polimorfismos -75G>A e
+83C>T.....................................................................................
Figura 8. Perfil eletroforético do polimorfismo MspI nos sítios -75G>A
e +83C>T no gene apo A-I......................................................
44
Figura 9. Perfil eletroforético do polimorfismo I/D no gene ECA.............
45
11
RESUMO
As dislipidemias contribuem para o desenvolvimento e a expressão clínica
da aterosclerose, que provoca um estreitamento das artérias coronarianas, devido
à formação de lesões ateromatosas. A aterosclerose é uma condição patológica
extremamente complexa associada a fatores ambientais e genéticos. No presente
estudo foram analisadas as freqüências dos polimorfismos MspI nos sítios -75G>A
e +83C>T no gene da apolipoproteína A-I (apo A-I) e do polimorfismo I/D no gene
da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) em 102 paciente dislipidêmicos. As
variáveis genéticas foram comparadas com dados clínicos, bioquímicos,
antropométricos e com o uso de estatinas. Dessa população, 44 eram homens e 58
mulheres, com idade média de 62,5 anos e com freqüência de 74,5% brancos. As
variáveis tabagismo e álcool foram significativamente mais freqüentes nos indivíduos do
sexo masculino. Nossos resultados mostraram que as freqüências dos genótipos
GG, GA e AA (sítio -75G>A) foram 0,50, 0,45 e 0,05 e para os genótipos CC e CT
(sítio +83C>T) foram de 0,26 e 0,74, respectivamente. Para os genótipos II, ID e
DD no gene ECA, as freqüências encontradas foram 0,20, 0,58 e 0,22,
respectivamente. Não foram observadas diferenças significativas nas freqüências
genotípicas entre homens e mulheres. Verificamos também que a distribuição dos
polimorfismos G/A e I/D estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg, ao contrário do
polimorfismo C/T. Os genótipos GG, CT e ID foram os mais freqüentemente
encontrados na amostra estudada. Não foi observado desequilíbro de ligação entre
os sítios -75G>A e +83C>T (χ
2
= 0,15, p = 0,69). Não foram observadas diferenças
significativas entre níveis lipídicos, pressão arterial, genótipos do gene ECA e os
haplótipos do gene apo A-I na população de indivíduos dislipidêmicos. Foi
encontrada associação estatisticamente significativa entre índices menores de IMC
e o genótipo CT (p < 0,035). Nossos resultados mostram diferenças significativas
entre a presença do genótipo CT no sítio +83C>T do gene apo A-I e redução dos
níveis de colesterol total (p = 0,002), triglicerídeos (p = 0,028) e colesterol não HDL
(p = 0,007) nos pacientes que já estavam usando estatinas, sugerindo que
portadores do alelo T podem se beneficiar mais com o uso de estatinas.
12
ABSTRACT
The dyslipidemia contribute for the development and the clinical expression
of atherosclerosis, that provokes a narrow of the coronary arteries, due to formation
of ateromas. The atherosclerosis is a pathological condition extremely complex
associate to ambient and genetic factors. In the present study was analyzed the
frequencies of MspI polymorphisms in the sites -75G>A and +83C>T in the gene
apo A-I and the polymorphism I/D in the gene ACE in 102 dyslipidemic patients.
The genetic variables had been compared with clinical, biochemistry and
anthropometrics datas and with the use of statins. From this population, 44 were
men and 58 women, with average age of 62.5 years old and prevalence of 74.5%
whites. The tobaccoism and alcohol variables were significantly higher in the
masculine sex individuals. Our results had shown that the frequencies of genotypes
GG, GA and AA (site -75G>A) were 0.50, 0.45 and 0.05 and for genotypes CC and
CT (site +83C>T) were of 0.26 and 0.74, respectively. For the genotypes II, ID and
DD in the gene ACE, the frequencies found were 0.20, 0.58 and 0.22, respectively.
Significant differences in the genotypes frequencies between men and women had
not been observed. We also verify that the distribution of the polymorphisms G/A
and I/D are in Hardy-Weinberg equilibrium, in contrast of polymorphisms C/T. The
genotypes GG, CT and ID were the most frequently found in the sample studied.
Linkage disequilibrium between the sites -75G>A and +83C>T and (χ
2
= 0.15, p =
0.69) were not observed. Significant differences between lipids levels, arterial
pressure, genotypes of the gene ACE and the haplotypes of the gene apo A-I had
not been observed. It was found statistically significant associations between lower
indexes of IMC and the genotype CT (p < 0.035). Our results show significant
differences between the presence of genotype CT in the site +83 pb from the gene
apo A-I and reduction of the total cholesterol levels (p = 0.002), triglyceride (p =
0.028) and cholesterol HDL (p = 0.007) in the patients who already were using
statins, suggesting that the presence of allele T can lead to a more benefits results
in the statins treatment.
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 Dislipidemia, aterosclerose e doença cardiovascular.
As dislipidemias são alterações metabólicas nos níveis de lipídios
circulantes do sangue, estando diretamente relacionadas com a aterosclerose. O
depósito de lipídios desencadeia processos bioquímicos que culminam com a
formação de placas ateroscleróticas na íntima dos vasos arteriais que,
conseqüentemente, podem obstruir parcial ou totalmente um ou mais vasos.
Embora qualquer artéria possa ser afetada, a aorta, as coronárias e os vasos
cerebrais são os principais alvos das placas de ateromas, levando ao infarto do
miocárdio (IM) e ao infarto cerebral (LIBBY et al., 2000).
As dislipidemias, em especial a hipercolesterolemia, contribuem
substancialmente para o desenvolvimento e a expressão clínica da aterosclerose.
Evidências consideráveis sugerem que reduções dos níveis séricos de colesterol
são capazes de estabilizar as placas ateroscleróticas e reduzir a ocorrência de
ruptura de placa, promovendo diminuição de eventos cardiovasculares. Estudos
epidemiológicos têm fornecido evidências de que as doenças cardiovasculares
(DCV) podem ser prevenidas, desde que identificadas e controladas (SHEPHERD,
2006).
A ocorrência de DCV varia amplamente no mundo. Geralmente, a maior
freqüência é encontrada em países ocidentais ou com estilo de vida ocidental. No
Brasil, a DCV é a primeira causa de morte por doença não transmissível, estando o
Rio Grande do Sul com o maior índice em relação aos demais estados do país
(Ministério da Saúde, Indicadores e Dados Básicos, 2005).
O estreitamento das artérias coronarianas, devido ao depósito de lipídios,
pode eventualmente resultar na destruição do tecido cardíaco, causado por
suprimento inadequado de oxigênio ou um infarto. Os ateromas tornam-se cada
vez mais numerosos à medida que a doença evolui, chegando, por sua vez, a
14
cobrir toda a circunferência das artérias, comprometendo o fluxo sangüíneo para os
órgãos (LIBBY et al., 2000). A figura 1 mostra o aspecto das artérias do coração
comprometidas com placas de ateromas.
Figura 1. Artérias do coração e formação de placas ateroscleróticas.
A aterosclerose é uma condição patológica extremamente complexa,
afetada por um número muito grande de variáveis. Os fatores de risco da
aterosclerose constituem a base das doenças arteriais coronarianas (DAC) e são
definidos como condições ou hábitos de vida, tais como: dislipidemias, hipertensão
arterial sistêmica, obesidade, sedentarismo, suscetibilidade genética, diabetes,
tabagismo, sexo masculino, idade acima de 60 anos, entre outros (LIBBY et al.,
2000).
1.2 Lipoproteínas
Na espécie humana, o colesterol, os triacilgliceróis (TG) e os fosfolipídeos
cumprem um papel importante no metabolismo. O colesterol atua como
componente estrutural essencial das membranas celulares, além de ser precursor
de hormônios esteróides e outras substâncias orgânicas importantes, como os
ácidos biliares. O colesterol está presente sob duas formas, colesterol livre e
Íntima danificada
Placa
Células com
Colesterol
15
ésteres de colesterol (combinação do colesterol com ácidos graxos) (CAMPBELL,
2000).
Como os lipídeos são insolúveis em meio aquoso, necessitam ser
transportados no organismo por proteínas, formando complexos hidrossolúveis de
alto peso molecular, denominados lipoproteínas. As lipoproteínas são partículas
esféricas, cuja superfície é composta por uma capa hidrofílica que, por sua vez,
envolve um núcleo hidrofóbico que abriga moléculas lipídicas (TG e colesterol
esterificado). A capa hidrofílica das lipoproteínas é constituída por fosfolipídeos,
colesterol livre e proteínas. As proteínas que as constituem são chamadas de
apolipoproteínas ou apoproteínas (apo). Essas apolipoproteínas são classificadas
como: apo A (apo A-I, apo A-II e apo A-IV), apo B (apo B-100 e apo B-48), apo C
(apo C-I, apo C-II, apo C-III) e apo E, e variam em tamanho e em composição
química (RIBALTA et al., 2003).
As apolipoproteínas atuam como componentes estruturais de lipoproteínas,
interagem com receptores de membrana celular e ainda, atuam como cofatores
enzimáticos. Cinco classes de lipoproteínas são reconhecidas: quilomícrons (QM),
lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de densidade
intermediária (IDL), lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e as lipoproteínas de
alta densidade (HDL). Cada uma dessas classes de lipoproteínas desempenha
atividade específica no transporte de lipídios na circulação. Vários estudos têm
demonstrado que os lipídios presentes nas placas ateroscleróticas derivam das
lipoproteínas circulantes (LIBBY et al., 2000). A tabela 1 mostra as principais
classes de lipoproteínas e suas densidades.
16
Tabela 1. Principais classes de lipoproteínas e suas densidades.
Classe de Lipoproteína Densidade (g/ml
-1
)
Quilomícrons <0,95
VLDL 0.95-1.006
IDL 1,006-1,019
LDL 1,019-1,063
HDL 1,063-1,210
Fonte: CAMPBELL, 2000.
Segundo as diretrizes de dislipidemia e prevenção de aterosclerose, as
dislipidemias podem ser classificadas com base em análises laboratoriais em:
• Hipercolesterolemia isolada – Elevação isolada do colesterol total (CT), em
geral representada por aumento do LDL-colesterol (LDL-C).
• Hipertrigliceridemia isolada – Elevação isolada dos TG, em geral
representada por aumento das VLDL, ou dos quilomícrons, ou de ambos.
• Hiperlipidemia mista - Valores aumentados do CT e dos TG.
• HDL-C baixo - Isolado ou em associação com aumento de LDL-C e/ou de
TG.
Com base na classificação etiológica é possível ainda classificar as
dislipidemias em primária ou secundária. As dislipidemias primárias são
conseqüências de causas genéticas e/ou ambientais, sendo que algumas só se
manifestam em função da influência ambiental, devido à dieta inadequada e/ou ao
sedentarismo. As hiperlipidemias englobam a hipercolesterolemia familiar,
dislipidemia familiar combinada, hipercolesterolemia poligênica, hipertrigliceridemia
familiar e síndrome da quilomicronemia (WAGNER e PEREZ, 2000).
As dislipidemias secundárias podem ser causadas por fatores como,
hipotireoidismo, diabetes mellitus, síndrome nefrótica, insuficiência renal crônica,
17
obesidade, alcoolismo, icterícia obstrutiva, uso de doses altas de diuréticos, beta-
bloqueadores, corticosteróides e anabolizantes (III Diretrizes Brasileiras Sobre
Dislipidemias, 2001).
A via biológica do metabolismo das lipoproteínas é extremamente complexa
e inclui várias etapas importantes, como síntese de apolipoproteínas, sua
modificação intracelular e secreção, modificação extracelular de apolipoproteínas,
hidrólise dos TG e fosfolipídeos realizada pelas enzimas lipase lipoprotéica (LPL) e
lipase hepática (HL), transporte reverso de colesterol das células às lipoproteínas,
esterificação do colesterol realizada pela enzima lecitina Colesterol acil-transferase
(LCAT), troca e/ou transferência de ésteres de colesterol, TG e fosfolipídios
enzimaticamente catalisada, troca e/ou transferência de apolipoproteínas e
catabolismo de lipoproteínas, mediado por receptor. Cada uma destas etapas
envolve uma ação coordenada de várias proteínas (YE e KWITEROVICH, 2006).
Muitos estudos epidemiológicos têm associado níveis aumentados de LDL
com maior risco de adquirir doença arterial coronoriana. As LDLs são as principais
partículas responsáveis pelo transporte de colesterol do fígado para o restante do
corpo. Elas são formadas a partir da degradação das VLDL remanescentes por
ação da HL. Seu núcleo consiste em uma quantidade maior de ésteres de
colesterol que os TG. A apo B-100 é a única apoproteína da superfície, sendo uma
das maiores proteínas conhecidas. Os níveis plasmáticos elevados de LDL
representam um dos principais fatores de risco para a aterosclerose. As LDLs são
retidas na superfície do vaso arterial e rapidamente transportadas através do
endotélio, muitas vezes intactas, ao interior da parede da artéria, participando,
assim, da fase inicial do processo aterogênico (AVOGARO et al., 1980; CASTELLI
et al, 1986).
A acumulação do colesterol nos vasos ocorre quando o influxo de colesterol
para a parede arterial, via lipoproteínas contendo apo B, excede o efluxo de
colesterol. Um influxo de colesterol aumentado é acompanhado de um influxo
18
aumentado de monócitos/macrófagos, que incorporam partículas de LDL oxidadas
e agregadas (YOKOYAMA, 2000).
Segundo Yokoyama (2000) acredita-se que a mobilização celular de
colesterol é o evento “chave” no processo de transporte reverso do colesterol. Esse
é captado dos tecidos periféricos pelas lipoproteínas, principalmente HDL, e
transportado ao fígado para ser excretado através da bile. O transporte reverso de
colesterol tem um papel importante na prevenção da aterosclerose in vivo.
As HDLs, além de realizar o efluxo de colesterol, têm ainda propriedades
anti-aterogênicas adicionais, como antiinflamatórias, anti-agregativas e
antioxidantes. Estudos epidemiológicos têm associado concentrações diminuídas
de HDL-colesterol com aumento no risco de doenças cardiovasculares (PHAN et
al., 2006). As HDLs são um grupo heterogêneo de partículas que variam em
tamanho, densidade, forma e composição de lipoproteínas. As partículas de HDL
são sintetizadas no fígado e no intestino e são liberadas na corrente sangüínea por
exocitose. As formas nascentes são discóides. À medida que recebe moléculas de
colesterol e apoproteínas, sua forma se torna esférica (CAMPBELL, 2000).
Cerca de 50% do peso das HDLs é devido à apoproteínas, das quais a apo
A-I e a apo A-II são as maiores contribuintes. As HDLs possuem um núcleo
composto por ésteres de colesterol e TG. A HDL transporta colesterol dos tecidos
periféricos para o fígado, onde esse é degradado a ácidos biliares. Duas enzimas,
a lecitina colesterol acil-transferase (LCAT) e a proteína transferidora de ésteres de
colesterol (CETP) estão presentes. Estudos sugerem que a HDL seja,
provavelmente, a maior protetora contra o desenvolvimento de doença arterial
coronariana (SRIVASTAVA e SRIVASTAVA, 2000; DEFARIA et al., 2007).
Os TG constituem aproximadamente 95% do tecido adiposo e são as
principais formas de armazenamento de lipídios no corpo. Concentrações séricas
elevadas de TG também têm sido relacionadas com uma maior incidência de
19
aterosclerose. Os triglicerídeos são importantes marcadores metabólicos,
sinalizando para outras alterações lipídicas com potencial aterogênico (III Diretrizes
Brasileiras Sobre Dislipidemias, 2001). Os TG podem ser definidos como gordura
neutra, cujo núcleo é constituído por uma molécula de glicerol unida a três
moléculas de ácidos graxos. Essas moléculas, quando chegam ao sangue são
agrupadas, formando as QM. As QM são formadas por 9% de fosfolipídios, 3% de
colesterol, 1% de proteína apo B e, aproximadamente, 87% de TG. No tempo
médio de uma hora, as QM são removidas da circulação ficando armazenadas na
forma de TG (MARZZOCO e TORRES, 1999).
As Diretrizes Brasileiras sobre dislipidemias recomenda a quantificação dos
níveis séricos de colesterol total, HDL, LDL-colesterol e TG para a definição do
perfil lipídico dos pacientes. O diagnóstico adequado é de suma importância, de
modo a identificar as alterações nas concentrações de lipídios, objetivando ações
que reduzam a morbidade e mortalidade induzidas pela aterosclerose. É desejável
ter baixos níveis de colesterol e LDL na circulação sangüínea e, altos níveis de
HDL (III Diretrizes Brasileiras Sobre Dislipidemias, 2001).
No tratamento da doença aterosclerótica preconiza-se uma reeducação
alimentar com uma dieta com baixa ingestão de gorduras, associação de
exercícios físicos e terapia medicamentosa. O estabelecimento de qualquer uma
dessas ações pode favorecer a prevenção de aterosclerose. Os mecanismos pelos
quais esses processos auxiliam na prevenção da doença não são, entretanto,
totalmente compreendidos (FORTI et al., 2003).
Recentemente foi descrito um manual, relacionando prevenção de
doenças cardiovasculares e apolipoproteínas (FAERGEMAN, 2006). Outros
trabalhos compilam as perspectivas da dislipidemia e da doença coronariana,
enfatizando a importância da dosagem das concentrações de apolipoproteínas
B/A-I como marcadores de risco para doença cardiovascular (BITTNER, 2005;
CHARLTON-MENYS e DURRINGTON, 2006; WALLDIUS e JUNGNER, 2006).
20
1.3 Genética das Lipoproteínas
Uma área promissora da genética é a investigação de variações no DNA
entre indivíduos. Estas variações são chamadas polimorfismos, quando estão
presentes em uma freqüência acima de 1% na população. A base genética para as
variações pode ser uma troca de bases, uma duplicação ou deleção de um ou
vários pares de bases. Estimativas sugerem que variações em uma única base
entre indivíduos (Single Nucleotide Polymorphisms ou SNP) ocorrem na freqüência
de um SNP a cada 1.300 pb no genoma humano, indicando que existem mais de
1,4 milhões de polimorfismos de substituição de uma única base em nosso
genoma. A alta freqüência dessas variações pode constituir a base da
predisposição genética a doenças (LANDER e WEINBERG, 2000; CORELLA e
ORDOVAS, 2005).
Alterações em um grande número de genes envolvidos na síntese de
apolipoproteínas têm sido associadas às dislipidemias. Estima-se que o somatório
de polimorfismos genéticos presentes nesses genes podem levar à deterioração do
perfil lipídico de um indivíduo, predispondo à cardiopatia. Como os polimorfismos
genéticos encontrados são bastante freqüentes na população em geral, seu
impacto é muito maior na saúde pública, quando comparados com mutações de
grande efeito, mas raras na população (BRESLOW, 2000; ANDRADE e HUTZ,
2002; COHEN et al., 2004; CORELLA e ORDOVAS, 2005; ZAMBON et al., 2006).
As duas principais regiões (clusters) gênicas das apolipoproteínas situam-se
nos cromossomos humanos 11 e 19. O cluster das apolipoproteínas APOA1/C3/A4
situa-se na região 23 do braço longo do cromossomo 11 (11q23) (KARATHANASIS
et al., 1983). Mutações nesses genes apresentam comprovada influência sobre os
parâmetros lipídicos (YE e KWITEROVICH, 2000; MAR et al., 2004). Na tabela 2
são mostrados os principais genes de lipoproteínas e enzimas envolvidos com o
metabolismo de lipídeos e que contribuem para o risco de doença cardiovascular.
21
Tabela 2. Genes de lipoproteínas e enzimas envolvidos com o metabolismo
de lipídios e que contribuem para o risco de doença coronariana.
JORDE et al, 2000.
1.3.1 Apolipoproteína A-I (apo A-I)
O gene da apo A-I está localizado na região 23 do braço longo do
cromossomo 11 (11q23), juntamente com os genes apo C-III e apo A-IV
(KARATHANASIS, 1985). O gene que regula a expressão da apo A-I codifica uma
proteína composta por 243 aminoácidos. A apo A-I é a principal constituinte da
HDL e é um ativador in vivo da enzima LCAT (FRANCONE et al., 1989). A figura 2
Gene Localização
cromossômica
Função do produto protéico
Apolipoproteína A-1 11q Componente de HDL; co-fator LCAT
Apolipoproteína A-IV 11q Componente de quilomícrons e HDL;
pode influenciar metabolismo de HDL
Apolipoproteína C-III 11q Variação alélica associada à
hipertrigliceridemia
Apolipoproteína B 2p Ligante para o receptor de LDL; envolvida
na formação de VLDL, LDL, IDL e QM
Apolipoproteína D 2p Componente de HDL
Apolipoproteína C-I 19q Ativação de LCAT
Apolipoproteína C-II 19q Ativação de lipoproteína lipase
Apolipoproteína E 19q Ligante para o receptor de LDL
Apolipoproteína A-II 1p Componente de HDL
Receptor de LDL 19p Captação de partículas circulantes de
LDL
Lipoproteína (a) 6q Transporte de colesterol
Lipoproteína Lipase 8p Hidrólise de lipídios de lipoproteína
Lípase hepática 15q Hidrólise de lipídios de lipoproteína
Lecitina colesterol acil-
transferase
16q Esterificação de colesterol
Proteína Transferidora de
Ésteres de Colesterol
16q Facilita transferência de ésteres de
colesterol e lipoproteínas de fosfolipídios
22
mostra um esquema simplificado do agrupamento gênico A-I / C-III e A-IV no
cromossomo 11 da espécie humana.
Na figura 3 é apresentado um esquema dos polimorfismos presentes no
gene apo A-I.
A síntese da apo A-I se dá, predominantemente, no fígado e no intestino. A
apo A-I estimula o efluxo de colesterol das células periféricas para o fígado,
fornecendo substrato para a ação da LCAT. Esta enzima está envolvida na
transformação de HDL nascente em HDL maduro, através da formação de éster de
colesterol. Vários estudos epidemiológicos e clínicos revelaram uma associação
Figura 3. Esquema do gene apo A-1 e indicação de alguns polimorfismos encontrados. Caixas
cinza e pretas indicam região 5’ não traduzida e regiões codificantes, respectivamente (SHIOJI et
al., 2004).
Figura 2. Esquema simplificado do agrupamento gênico A-I/C-III/A-IV no cromossomo 11 da
espécie humana.
23
entre os baixos níveis plasmáticos de HDL e de apo A-I e o aumento do risco de IM
(COHEN et al., 2004; SHIOJI et al., 2004; ZAMBON et al., 2006).
A avaliação dos níveis plasmáticos de apo A-I tem sido apontada como um
bom parâmetro preditivo de risco de doença coronariana. Valores elevados de apo
A-I (HDL) e baixos de apo B (LDL), se correlacionam com baixo risco aterogênico
(RIBALTA et al., 2003; ZOU et al., 2003; ZAMBON et al., 2006). A figura 4 mostra
um esquema da estrutura da lipoproteína de alta densidade.
Figura 4. Esquema da Lipoproteína de Alta Densidade (HDL)
(http://wichita.kumc.edu/edtech/medill.html).
A identificação de mutações no gene da apo A-I leva a deficiência da HDL,
resultando na diminuição das concentrações de HDL-colesterol e apo A-I no
plasma (ASSMANN et al., 1992; TALMUD et al., 1994; COHEN et al, 2004;
ZAMBON et al., 2006). A primeira descrição de alteração estrutural da apo A-I foi
feita em um estudo com uma família de origem italiana. Essa primeira alteração foi
chamada de alelo Milano para Apo A-I, e resulta de uma mutação que causa uma
substituição do aminoácido arginina por cisteína na posição 173 (Arg173Cys) na
Colesterol livre
Triacilgliceróis
Ésteres de
colesterol
Fosfolipídeo
apo A-I
24
seqüência da apo A-I (WEISGRABER et al., 1983). Indivíduos com esta mutação
apresentaram níveis baixos (30 a 40%) de apo A-I, diminuição da atividade da
LCAT, mas não chegaram a apresentar aterosclerose prematura (ASSMANN et al.,
1992).
Dois polimorfismos localizados a poucos nucleotídeos um do outro, um
situado na região promotora -75G>A e o outro +83C>T no íntron 1 do gene Apo A-I
têm sido associados a alterações nos níveis de HDL, a doença arterial coronariana,
a hiperlipidemia familiar e ainda, a pressão sangüínea. Os polimorfismos referidos
levam as substituições de uma guanina por uma adenina (G/A) no sítio -75G>A e a
transição de uma citosina por uma timina (C/T) no sítio +83C>T do gene da apo A-
I. Ambas variantes alélicas podem ser identificadas em um mesmo experimento,
utilizando a enzima de restrição MspI através da técnica de RFLP (Restriction
Fragment Lenght Polymorphism). Níveis altos de HDL-colesterol têm sido
encontrados em indivíduos com os alelos raros -75G>A*A e +83C>T*T dos
polimorfismos -75G>e +83C>T. O alelo +83C>T*T tem sido associado com melhor
perfil lipídico e melhores níveis de pressão sangüínea (AL-YAHYAEE et al., 2004;
KAMBOH et al., 1996; MA et al., 2005; WANG et al., 1996; ZOU et al., 2003).
LARSON et al., 2002, encontraram em seus estudos uma associação entre
a presença dos alelos raros -75G>A*A e +83C>T*T, nos sítios G-75A e C+83T do
gene apo A-I em mulheres com níveis significativamente altos de glicose. O efeito
do genótipo da apo A-I sobre os níveis de glicose não estão, entretanto,
esclarecidos ainda.
Estudos brasileiros que retratam o perfil genético das apolipoproteína A-I
são escassos. O cluster gênico APOA1/C3/A4 foi investigado, quanto à
variabilidade genética e os níveis de lipídeos em 414 crianças do Estado de
Pernambuco, sendo que os polimorfismos escolhidos para análise no gene apo A-I
foram os do sítio MspI. Os resultados mostraram ausência de associação entre os
polimorfismos analisados e os níveis de lipídeos (De FRANÇA et al., 2005). Esse
mesmo cluster e incluindo o gene apo B foram analisados na população brasileira,
25
não sendo encontrada associação entre os RFLP estudados com infarto do
miocárdio, níveis de colesterol e TG (BYDLOWSKI et al., 1996). Em outro estudo
brasileiro, pesquisadores buscaram entender os resultados controversos descrito
na literatura entre polimorfismos nos genes ECA, apo AI, apo B, apo E, dislipidemia
e doenças cardiovasculares. Foram estudados 112 pacientes com DAC estável,
130 com IM e 137 controles e nenhuma associação foi encontrada (MANSUR et
al., 2000).
Na tabela 3 são apresentadas as freqüências alélicas e genotípicas do
polimorfismo presente no sítio -75G>A no gene apo A-I descritas na literatura.
Tabela 3. Freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo MspI no sítio -75G>A
do gene apo A-I.
População N° genótipos (%)
G-75A
Alelos Referências
GG GA AA G A
Caucasiana 261 (63,8) 130 (31,7)
18 (4,4) 0,80 0,20 BARRE et al.,
1994
Caucasiana 351(65,7) 171 (32,0)
12 (2,3) 0,817 0,183 KAMBOH et
al.,1996
Hispânica 245 (61,7) 143 (36,0)
9 (2,3) 0,80 0,20 LAHOZ et al.,
2003
Italiana – Sul /
Masculino
67 (43,2) 75 (48,4) 13 (8,4) 0,674 0,326
Italiana – Sul/
Feminino
62 (55,4) 39 (34,8) 11 (9,8) 0,728 0,272
GARASTRO et
al., 2003
Omanis 92 (61,0) 51 (34,2) 7 (4,8) 0,780 0,220 AL-YAHYAEE
et al., 2004
Chinesa 176 (57,3) 110 (35,9)
21(6,8) 0,752 0,248
JIA et al., 2005
Americana 67,2 28,7 4,1 0,815 0,185 KAJINAMI et
al., 2005
Brasileira 277 (66,9) 124 (30,0)
13 (3,1) 0,819 0,181 ANDRADE e
HUTZ, 2005
Chinesa/Hipertensos
58,3 36,3 6,7 0,736 0,264
Chinesa/ Diabéticos 51,9 40,5 7,7 0,721 0,279
MA et al., 2005
Na tabela 4 são apresentadas as freqüências alélicas e genotípicas do
polimorfismo presente no sítio +83C>T no gene apo A-I descritas na literatura.
26
Tabela 4. Freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo MspI no sítio +83C>T
do gene apo A-I.
População N° genótipos (%)
C+83T
Alelos Referências
CC CT TT C T
Caucasiana 499 (93,4) 35 (6,6) 0 0,967 0,033 KAMBOH et
al.,1996
Omanis 132 (87,8) 16 (10,9) 2 (01,3) 0,933 0,067 AL-YAHYAEE
et al., 2004
Chinesa 268 (87,2) 39 (12,8) 0 0,936 0,064 JIA et al., 2005
Americana 89,9 9,5 0,6 0,947 0,053 KAJINAMI et
al., 2005
Brasileira 329 (79,5) 78(18,8) 7(1,7) 0,889 0,111 ANDRADE e
HUTZ, 2005
Chinesa/hipertensos
252 (98,1) 19(1,9) 0 0,999 0,001
Chinesa/ Diabéticos 92,5 7,5 0 0,963 0,037
MA et al .,
2005
1.4 Hipertensão arterial sistêmica e o gene da Enzima Conversora da Angiotensina
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é reconhecidamente um dos
principais fatores de risco cardiovascular, sendo responsável por cerca de 46% de
óbitos de causa cardiovascular em nosso meio. A HAS é uma síndrome
caracterizada pela elevação da pressão arterial em níveis iguais ou superiores a
140 mmHg de pressão sistólica e/ou 90 mmHg de diastólica em pelo menos duas
aferições subseqüentes, obtidas em dias diferentes, em condições de repouso e
ambiente tranqüilo. A HAS é uma doença silenciosa que está, freqüentemente,
acompanhada de achados de lesões nos vasos sanguíneos, com conseqüentes
alterações de órgãos como cérebro, coração, rins e retina (SILVA e SOUZA, 2004).
A Enzima Conversora da Angiotensina (ECA) é um componente crucial na
regulação da pressão arterial. A ECA está amplamente distribuída na superfície de
células epiteliais e endoteliais, exercendo um papel importante no metabolismo dos
peptídeos vasoativos como a angiotensina II (ATII) e a bradicinina. A ECA converte
a angiotensina I em angiotensina II, produto ativo principal do sistema renina-
angiotensina-aldosterona (SRAA). A ECA promove a degradação de bradicinina,
27
um potente estimulador da liberação de óxido nítrico (NO). Ambos peptídeos
exercem papel central na regulação da pressão sangüínea e são importantes na
patogênese das doenças cardiovasculares (ERDOS e SKIDGEL, 1987; TAVARES,
2000).
O gene ECA humano está localizado no cromossomo 17q23, possui 24
exons e codifica uma proteína com 1306 aminoácidos. Esse gene apresenta um
polimorfismo do tipo deleção/inserção (D/I) no intron 16 que tem se mostrado
fortemente associado aos níveis circulantes e teciduais da ECA. O polimorfismo do
gene da ECA pode ser determinado pela técnica da Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), permitindo verificar a inserção e/ou deleção. Os genótipos
identificados são homozigotos DD ou II e heterozigoto ID. O genótipo DD está
relacionado à presença de níveis mais elevados de ECA, sendo considerado um
provável marcador de doença coronariana como infarto agudo do miocárdio,
hipertrofia ventricular esquerda e carotídea (LEE et al., 2000; ZAK et al., 2003;
AGRAWAL et al., 2004; SAYED-TABATABAEI et al., 2004). A Figura 5 mostra uma
representação esquemática da organização do gene ECA.
Segundo Guarda et al. (1999), a visualização dos produtos amplificados por
PCR permite identificar o alelo I, através da presença de uma banda de 490 pb e o
alelo D de uma banda de 190 pb em gel. A Figura 6 mostra a diferença entre o
alelo de inserção (I) com a presença de um fragmento adicional de 287 pb,
enquanto que o alelo de deleção (D) não apresenta esse fragmento.
28
Figura 5. Representação esquemática da organização do gene da ECA. Os retângulos
representam as regiões exônicas e as linhas representam as regiões intrônicas. No íntron
16 pode ocorrer a ausência de 287 pares de bases, determinando o genótipo D
(TAVARES, 2000).
Figura 6. Diferença entre o alelo inserção (I), com a presença de um fragmento
adicional de 287 pb, enquanto que o alelo deleção (D), não apresenta esse fragmento
(RIGAT et al., 1990).
Indivíduos que apresentam o genótipo DD possuem aproximadamente o
dobro da concentração de ECA circulante, em relação àqueles com genótipo II,
enquanto indivíduos com o genótipo ID apresentam níveis intermediários de ECA.
O polimorfismo I/D encontra-se correlacionado com 47% da variação total do nível
de ECA circulante no plasma (VÖLZKE et al., 2002, SAYED-TABATABAEI et al.,
2006a).
Alguns estudos têm demonstrado uma correlação entre a presença de uma
cópia ou duas cópias do alelo D com risco aumentando de infarto do miocárdio,
especialmente em indivíduos hipertensos. O efeito deletério do genótipo DD pode
resultar de uma super expressão da ECA, levando a um aumento local de
29
angiotensina II em regiões vascularizadas como a circulação coronariana, podendo
ser considerado como um novo e potente fator de risco para infarto do miocárdio
agudo. Dois estudos baseados na análise de grandes populações encontraram
associação significativa entre o polimorfismo I/D com hipertensão, a qual estaria
restrita a indivíduos do sexo masculino (ODONNELL et al., 1998; BARBALIC et al.,
2006). Outros estudos, entretanto, não tem encontrado associação entre os
polimorfismos no gene ECA e doença cardiovascular (GINER et al., 2000;
MANSUR et al., 2000; SCHUT et al., 2004; SAYED-TABATABAEI et al., 2006b;).
No Brasil, estudos dos polimorfismos (D e I) no gene ECA são escassos, os
grupos analisados incluíram indivíduos com Lupus nefropático (SPROVIERI e
SENS, 2005), população afro-brasileira (SAKUMA et al., 2004), indivíduos com
risco de desordem afetiva bipolar (MEIRA-LIMA et al., 2000) e indivíduos com
doença arterial coronariana (MANSUR et al., 2000; INÁCIO et al., 2004).
Na tabela 5 são apresentadas as freqüências alélicas e genotípicas do
polimorfismo I/D presente no gene ECA descritas na literatura.
Tabela 5. Freqüências genotípicas e alélicas dos polimorfismos I/D no gene ECA.
População N° genótipos (%)
Alelos Referências
II ID DD I D
Chilena 7 (14,5) 30 (62,5) 11 (22,9) 0,458 0,541
GUARDA et al.,1999
Caucasiana 124(24,2) 250 (48,8) 138(26,9) 0,490 0,510
GARDEMANN et
al.,1998
USA 89 (18,6) 243 (50,7) 147 (30,7) 0,439 0,560
McNAMARA et al.,2004
Polonesa 10 (17,3) 22 (37,9) 26 (44,8) 0,362 0,638
SLOWIK et al., 2004
Australiana 120(22,0) 262 (49,0) 158 (29,0) 0,464 0,535
FRANK et al.,2000
Hispânica 5 (4,8) 30 (28,8) 69 (66,3) 0,200 0,800
MATA-BALAGUER et
al., 2004
Holandesa 1156
(21,7)
2657 (49,9) 1508 (28,3) 0,467 0,533
SAYED-TABATABAEI
et al., 2004
Germânica/
Hipertensos
150(23,6) 315(49,5) 171 (26,9) 0,483 0,516
Germânica/
Normotensos
170(23,6) 350 (49,5) 103 (26,8) 0,553 0,446
MONDRY et al., 2005
Americana 75 (20,0) 198 (54,0) 91 (25,0) 0,480 0,520
MARIAN et al., 2000
30
Européia (Norte) 50 (21,5) 117 (50,4) 65 (28,0) 0,467 0,532
Européia (Sul) 44 (15,0) 156 (53,4) 92 (31,5) 0,417 0,582
MUTHUMALA et al.,
2006
Européia (Central) 40 (25,2) 78 (49,1) 41 (25,8) 0,497 0,503
SCHÄFER et al., 2006
Brasileira 42 (20,0) 90 (43,0) 78 (37,0) 0,390 0,610
INÁCIO et al., 2004
Indonésia 6 (37,0) 7 (44,0) 3 (19,0) 0,593 0,406
SASONGKO
et al., 2005
Brasileira (Sul) 11(36,6) 12 (40,0) 7 (23,3) 0,570 0,430
DALMÁZ, 2001
UTI/HCPA -RS 14 (16,0) 37(43,0) 35 (41,0) 0,377 0,622
ALBARUS, 2004
Chinesa/
hipertensos
39,0 44,8 16,2 0,614 0,386
Chinesa/
dislipidêmicos
33,3 57,9 8,8 0,623 0,377
THOMAS et al., 2001
Croata/ Hipertensos 32 (26,0) 70 (56,9) 21 (17,1) 0,545 0,455
BARBALIC et al., 2006
Brasileira/ São
Paulo/ Filhos de
hipertensos
8 (20,0)
15 (37,5)
17 (42,5)
0,387
0,612
Brasileira/ São
Paulo/ Filhos de
normotensos
12 (30,0)
13 (32,5)
15 (37,5)
0,462
0,537
FRANKEN et al., 2004
Europeus com CAD 47(19,9) 126 (53,3) 63 (26,6) 0,466 0,533
RICE et al., 1999
Japonesa 22 (33,0) 36(54,0) 9(13,0) 0,597 0,402
TANIGUCHI et al.,
2001
Austríaca 40 (25,2) 78 (49,1) 41 (25,8) 0,497 0,503
SCHÄFER et al., 2006
Holandeses/
Normotensos
962(22,6) 2106 (49,4) 1196 (28,0) 0,472 0,527
Holandeses/
Hipertensos
441(20,3) 1116 (51,3) 617(28,4) 0,459 0,540
SCHUT et al., 2004
1.5 Tratamento das Dislipidemias e Hipertensão
Quando modificações nos hábitos alimentares não são suficientes para
normalizar as taxas de colesterol plasmático, se utiliza terapias medicamentosas,
visando ou reduzir a síntese endógena de colesterol ou aumentar a sua secreção
na forma de sais biliares. No primeiro caso, se utilizada inibidores competitivos da
3-hidroxi-3- metilglutaril coenzima A (HMGCoA-redutase), chamados estatinas. As
estatinas (Atorvastatina, Lovastatina, Sinvastatina, Pravastatina e Fluvastatina) são
os agentes mais bem tolerados e mais efetivos no tratamento das dislipidemias.
Esses fármacos possuem variados graus de atividade sobre a enzima HMG-CoA
redutase, que catalisa uma etapa precoce e limitante da taxa de biossíntese do
colesterol (MAHLEY e BERSOT, 2003).
31
As estatinas diminuem os níveis LDL colesterol em 20-55%, dependendo da
dose e da estatina empregada, sendo aceito que esta ação promove uma maior
expressão dos receptores de LDL. Estudos sobre os mecanismos de ação dessas
drogas demonstraram que elas agem alterando a síntese e a composição das
lipoproteínas, modificando seu potencial aterogênico, bem como, reduzindo a
absorção intestinal do colesterol (BALLANTYNE et al., 1997). Um estudo
demonstrou uma redução entre 20 a 30% de morte e eventos relacionados a
doenças cardiovasculares entre pacientes que receberam estatinas (ROSS et al,
1999). A ação das estatinas sobre os níveis lipídicos foi revisada por SCHAEFER e
ASZTALOS (2006).
As estatinas são drogas hipolipemiantes de primeira escolha na prática
médica. Entretanto, tem-se observado em alguns casos que o uso terapêutico das
estatinas como monoterapia ainda tem deixado muitos pacientes com dislipidemia
aterogênica com alto risco de desenvolver doença cardiovascular, por não
conseguirem atingir os níveis recomendados de lipídios. Por essa razão, novas
abordagens têm sido propostas para o tratamento de hiperlipidemias como a
combinação de estatinas com fibratos ou estatinas com niacina, uma vez que
essas drogas utilizam vias diferentes de metabolização (revisado por TENENBAUM
et al., 2006).
Na área da cardiologia, vários estudos farmacogenéticos estão sendo
conduzidos, objetivando relacionar os efeitos terapêuticos das estatinas em
pacientes com doença arterial coronariana e a variabilidade genética. Observa-se
com freqüência que a diminuição dos níveis de lipídios no plasma em resposta ao
tratamento com estatinas variam consideravelmente entre os indivíduos,
reforçando a hipótese de que traços genéticos podem ter um papel central nessa
variação interindividual (ANKE-HILSE et al., 2002; DORNBROOK-LAVENDER e
PIEPER, 2003).
32
Considerando estudos farmacogenéticos e o gene ECA, recentemente
BLEUMINK et al. (2005) encontraram associação entre resistência ao uso de
inibidor da ECA, usado no tratamento de pacientes hipertensos, e a presença do
genótipo DD. Os resultados indicaram índices de mortalidade significativos em
indivíduos hipertensos não-respondedores ao tratamento e que portavam o
genótipo DD.
2. JUSTIFICATIVA
As dislipidemias apresentam uma função importante no desenvolvimento e
progressão da aterosclerose, base da doença arterial coronariana, incluindo infarto
agudo do miocárdio. A associação entre DAC e alterações no perfil lipídico, em
particular a hipercolesterolemia, tem sido amplamente evidenciada, seja através de
estudos anátomo-patológicos e experimentais, seja através de estudos
epidemiológicos, clínicos e de intervenção terapêutica. Os níveis plasmáticos de
lipídios e lipoproteínas podem ser resultados do comportamento alimentar e/ou
serem devidos às variações genéticas observadas nos indivíduos. Está bem
estabelecido que fatores genéticos contribuem com os níveis basais de lipídios e
lipoproteínas no plasma.
A dislipidemia, a hipertensão arterial e o diabete melito são considerados os
principais responsáveis pelos índices de morbidade e mortalidade cardiovascular.
Esses fatores de risco cardiovasculares, quando presentes isoladamente ou
associados, determinam um processo acelerado de envelhecimento dos vasos,
fazendo com que mais precocemente aconteçam respostas endoteliais alteradas.
Por essas razões, as doenças cardiovasculares representam um sério problema de
saúde pública, além de consumirem grande parte dos recursos públicos. No Brasil
e em muitos países do mundo, as doenças cardiovasculares são responsáveis por
um grande número de mortes prematuras em adultos e, mesmo quando não são
mortais, levam, com freqüência, a invalidez parcial ou total do indivíduo, com
graves repercussões para a pessoa acometida, sua família e a sociedade. Dados
do SUS sobre a mortalidade no Brasil mostram que o Rio Grande do Sul apresenta
33
um índice maior de mortalidade devido a problemas cardiovasculares que a média
nacional (DATASUS, 1998), o que deve refletir tanto no estilo de vida, como na
constituição genética da população do nosso Estado.
A dislipidemia é um dos problemas mais freqüentes na prática médica.
Atualmente, sabe-se que essa condição, se identificada, pode ser tratada, levando
a uma redução comprovada na incidência de DAC. É importante enfatizar que os
avanços tecnológicos obtidos na área da biologia molecular têm contribuído para o
entendimento entre o risco genético de desenvolvimento de doenças
cardiovasculares, especialmente com relação a identificação de polimorfismos em
genes relacionados ao metabolismo lipídico, como os que codificam as
apolipoproteínas. Além disso, um novo ramo da ciência, denominado
farmacogenética, tem buscado compreender a variabilidade genética de indivíduos
com dislipidemia e a respostas aos medicamentos hipolipemiantes.
A identificação de polimorfismos nos genes apo A-I e ECA tem auxiliado na
identificação de indivíduos com suscetibilidade genética ao desenvolvimento de
doenças cardiovasculares. No Brasil, as publicações referentes a aspectos clínico-
epidemiológicos dessa associação são relativamente escassas e restritas a
resultados obtidos em alguns grupos sociais selecionados como crianças e índios.
Diante disso, o presente projeto de pesquisa tem como objetivos investigar
as freqüências de polimorfismos nos genes apo A-I e ECA em pacientes
dislipidêmicos e compará-las a aspectos clínicos, bioquímicos e antropométricos.
34
3. OBJETIVOS
A presente proposta de pesquisa possui os seguintes objetivos:
A. Investigar a freqüência de polimorfismos presentes no gene que codifica a
Apolipoproteína A-I em pacientes dislipidêmicos, visando contribuir para o
conhecimento da freqüência dos polimorfismos na população estudada.
B. Investigar a freqüência de polimorfismos freqüentes no gene que codifica a
enzima conversora de angiotensina ECA em pacientes dislipidêmicos,
visando contribuir para o conhecimento da freqüência dos polimorfismos na
população estudada.
C. Correlacionar os polimorfismos encontrados no presente estudo com dados
clínicos, bioquímicos e antropométricos, visando contribuir para uma melhor
definição da relação entre genótipo e fenótipo dislipidêmico.
35
4. METODOLOGIA
4.1 Delineamento do estudo
Este é um estudo de freqüência de polimorfismos genéticos em pacientes
dislipidêmicos, do tipo transversal, observacional com base em uma população
clínica de pacientes que procuram o Ambulatório de Dislipidemia, Serviço de
Cardiologia, do Hospital de Clínica de Porto Alegre (HCPA).
4.2 População do estudo
A população do estudo foi composta por amostras de conveniência com
seleção consecutiva dos indivíduos que buscam atendimento no Ambulatório de
Dislipidemia, Serviço de Cardiologia (HCPA).
4.2.1 Seleção das Amostras
Critérios de inclusão: Homens e mulheres dislipidêmicos, provenientes do
Serviço de Cardiologia do HCPA. Todos os pacientes preencheram os critérios de
elegibilidade e assinaram o termo de consentimento e participação do estudo
(anexo 1).
Critérios de exclusão: pacientes em uso de anti-retrovirais, gestantes e
pacientes com idade inferior a 18 anos.
4.2.2 Coleta de dados
Dados clínicos, epidemiológicos e antropométricos foram obtidos a partir de
um questionário aplicado durante a consulta pela equipe médica do ambulatório
aos pacientes atendidos (anexo 2). Subseqüentemente a consulta, o paciente era
encaminhado ao setor de coleta do HCPA para a retirada de 10 ml de sangue em
condições estéreis para as análises moleculares e bioquímicas. As análises
bioquímicas foram realizadas como parte da rotina de diagnóstico laboratorial
oferecida aos pacientes que buscam atendimento no Serviço de Cardiologia do
36
HCPA. As amostras para análise molecular foram guardadas em geladeira, por no
máximo uma semana, até o momento em que foram retiradas e levadas ao
laboratório de biologia molecular da ULBRA.
4.3 Dosagens bioquímicas
Os níveis de colesterol total, HDL-colesterol, VLDL e triglicerídios foram
dosados por métodos enzimáticos, após 12 horas em jejum (anexo 2). A fração
LDL colesterol foi calculada segundo a fórmula descrita por FRIEDEWALD (1972),
que é válida somente para casos onde os níveis de TG são < 400mg/ dL.
4.4 Extração de DNA
O DNA de cada amostra foi extraído a partir de sangue total através da
técnica descrita por Miller et al. (1989).
4.5 Reação de PCR
As condições para a realização da técnica molecular, conhecida como
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), estão descritas na Tabela 6.
Tabela 6. Descrição dos primers e condições de amplificação por PCR dos genes
apo A-I e ECA.
Genes
Primers ( 5’ – 3’)
Condições de
amplificação
Referências
apo A-I
5’-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG-3’
5’-TTAGGGGACACCTAGCCCTCAGGAAGAGCA-3’
94°C – 5’
94°C – 1'
60°C – 30" 30X
72°C – 30"
72°C – 5’
ZOU et al.
(2003)
ECA
5'- CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3'
5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCACGAT-3'
94°C -10'
94°C - 1'
58°C - 1' 30X
72°C - 2'
72°C - 5'
AGRAWAL
et al.
(2004)
37
4.6 Detecção dos fragmentos de DNA amplificados
Os fragmentos de DNA amplificados durante a reação de PCR foram
visualizados em luz ultravioleta após eletroforese em gel de agarose e o tamanho
das bandas avaliado com um marcador de peso molecular (100 pb).
4.7 Genotipagem por RFLP
Os produtos amplificados das regiões polimórficas do gene Apo A-I resultam
em uma banda de 433 pb e foram genotipados através da técnica de RFLP
(análise de polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição), utilizando a
enzima de restrição MspI que cliva no sítio C CGG.
Os produtos amplificados do gene ECA foram genotipados diretamente
através da migração diferencial de tamanho dos mesmos, definindo assim os
genótipos DD, II ou ID (AGRAWAL et al. 2004). Os registros dos dados
moleculares iniciais foram feitos conforme anexo 3.
4.8 Análises genotípicas
A enzima MspI cliva simultaneamente dois polimorfismos no gene apo A-I.
A presença do sítio de restrição no polimorfismo -75G>A resulta em dois
fragmentos de 113 pb e 66 pb. A ausência do sítio de restrição gera um fragmento
de 179 pb (figura7a). A presença do sítio de restrição no polimorfismo +83C>T
resulta em dois fragmentos de 209 pb e 43 pb. A ausência do sítio de restrição
gera um fragmento de 254 pb (figura 7b). Os genótipos foram observados através
dos fragmentos gerados, para o polimorfismo -75G>A, os genótipos foram: GG
(113 e 66 pb), GA (179, 113 e 66 pb) e AA (179 pb). Para o polimorfismo +83C>T,
os genótipos observados foram: CC (209 pb e 43 pb), CT (254, 209 e 43 pb) e TT
(254 pb). Os alelos raros dos polimorfismos -75G>A e +83C>T são
respectivamente A e T (-75G>A*A e +83C>T*T). Quatro haplótipos possíveis são
gerados nas clivagens (G/C, G/T, A/C e A/T), ver figura 7c.
38
Figura 7a: Tamanho dos fragmentos da apo A-I após o processo de clivagem com
a enzima MspI no sítio +83C>T.
209 pb
45 pb
Genótipo Genótipo Genótipo
TT CT CC
254 pb
+83C>T
PCR
5` ...... CCGG ......... 3`
3` .......GGCC ..........5`
Restrição Enzimática Msp
I
5`
3`
254 pb
209pb
45 pb
39
Figura 7b: Tamanho dos fragmentos da apo A-I após o processo de clivagem com
a enzima MspI no sítio -75G>A.
113 pb
66 pb
Genótipo Genótipo Genótipo
AA GA GG
179 pb
-75G>A
PCR
5` ...... CCGG ......... 3`
3` .......GGCC ..........5`
Restrição Enzimática Msp
I
5`
3`
113pb
66 pb
179 pb
40
Figura 7c: Combinação haplotípica dos polimorfismos -75G>A e +83C>T.
Os polimorfismos do gene ECA foram detectados através da análise da
presença de fragmentos de 490 pb e/ou 190 pb.
4.9 Análises estatísticas
Os dados coletados foram inseridos em um programa de análise estatística
SPSS 12.0 Windows e analisados com base em um intervalo de confiança de 95%,
p< 0,005. As variáveis controladas foram: idade, sexo, peso, altura, diâmetro do
quadril, diabete, hipertensão, outras doenças, dados bioquímicos, antropométricos
e clínicos.
Teste qui-quadrado ou exato de Fisher, quando necessário, foi utilizado para
comparar as variáveis categóricas com a presença ou não da associação dos
polimorfismos analisados em pacientes dislipidêmicos.
Teste t-Student ou não paramétrico correspondente foi utilizado para
comparar as variáveis contínuas com a presença ou não do desfecho, com
intervalo de confiança de 95% e p < 0,05.
A análise estatística para o desequilíbrio de ligação foi calculada através do
programa Arleguim utilizando o teste qui-quadrado.
Sítio
-
75G>A
Sítio +83C>T
66 113
45
45
113 66
209
209 179
179
254
254
GT
AC
GC
AT
41
4.10 Considerações éticas
O presente estudo foi projetado de acordo com as Diretrizes e Normas
Regulamentadoras de Pesquisa envolvendo Seres Humanos (resolução 196/1996
do Conselho Nacional de Saúde), aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre no dia 09 de dezembro de 2004 com n° do protocolo
04300 e aprovado também pelo Comitê de Ética da ULBRA. Os pacientes foram
informados do presente estudo, e ao concordarem em participar, assinaram um
termo de consentimento livre e esclarecido conforme anexo 1. Os participantes
receberam informações detalhadas sobre o propósito e objetivos do estudo, bem
como dos procedimentos realizados. Os pacientes que não conseguiram ler o
termo foram informados através de leitura em voz alta.
42
5. RESULTADOS
Os resultados da freqüência de polimorfismos presentes nos genes que
codificam a proteína apo A-I foram obtidos a partir de análises moleculares,
utilizando a técnica de PCR-RFLP e o polimorfismo presente na enzima conversora
de angiotensina, foi analisado através da técnica de PCR. Os estudos foram
realizados em pacientes dislipidêmicos, após seleção consecutiva dos indivíduos
que buscaram atendimento no Ambulatório de Dislipidemia, Serviço de Cardiologia
do HCPA.
5.1. Análise descritiva da amostra
A amostra estudada é composta por 102 pacientes da região metropolitana
de Porto Alegre (RS – Brasil), sendo 44 homens (43,1%) e 58 mulheres (56,9%),
todos dislipidêmicos com idade média de 62,5 ± 11,6 anos, sendo 74,5% brancos.
Do total de pacientes analisados, 23,5% apresentaram histórico familiar em 1° grau
para dislipidemia. Os perfis clínico, bioquímico e antropométrico da amostra estão
descritos nas tabelas 7 e 8.
A tabela 7 mostra as características gerais da amostra estudada. Podemos
observar que entre os hábitos de vida, a freqüência de tabagismo e consumo de
álcool é significativamente maior no sexo masculino em relação ao feminino (p =
0,018 e p < 0,0001, respectivamente), enquanto que o sedentarismo é mais
freqüente em mulheres, apesar dessa diferença não ser significativa . A idade
média, o consumo de estatinas no início do tratamento, doenças concomitantes,
níveis de pressão arterial não diferiram entre homens e mulheres (p > 0,05).
Quanto aos dados clínicos da amostra em estudo, podemos observar uma
freqüência elevada de indivíduos com hipertensão arterial (76,5%), mas sem
diferença significativa entre homens e mulheres (p = 0,212).
43
Em relação as variáveis antropométricas, o que deve ser ressaltado nesta
amostra é a freqüência elevada (67,6%) de indivíduos com IMC acima do normal
(28,7± 4,8), sendo que desses, (3,9%) são obesos mórbidos. De acordo com a
OMS ou WHO (1997), as medidas de IMC são classificadas como: IMC < 25 Kg/m²
como normal, IMC 25 Kg/m² como sobrepeso, 30 Kg/m² como obesidade e 40
Kg/m² obesidade mórbida. Em relação aos parâmetros IMC não observamos
diferenças significantivas entre homens e mulheres (p = 0,076), entretanto foi
encontrada associação entre cintura e sexo (p=0,035).
De acordo com a tabela 8, em relação ao perfil bioquímico nenhuma
diferença significativa foi observada entre o sexo masculino e o feminino (p>0,05).
No entanto, podemos ressaltar que o perfil lipídico de uma forma geral na amostra
estudada não está dentro dos valores de referência para pessoas acima de 20
anos, segundo III Diretriz Brasileira de Dislipidemia, discutido na introdução deste
trabalho. A média dos valores de colesterol total 234,5 mg/dI está no limite superior
do qual se considera desejável (<200 mg/dI), os níveis de LDL colesterol 148,6
mg/dI estão muito acima do limite considerado desejável (100 – 129 mg/dI). A
média de triglicerídeos 247,1 mg/dI encontrada nesta amostra pode ser
considerada alta (>200 mg/dI). Quanto aos valores de HDL 47,4 mg/dI,
observamos que a média ficou entre a categoria baixa (< 40 mg/dI) e alta (> 60
mg/dI), apesar das mulheres terem um nível maior de HDL, essa diferença não foi
significativa (p=0,212).
Os níveis de glicose analisados nesta população (125 mg/dI), estão acima
dos valores considerados normais (70 a 99 mg/dI), nenhuma diferença estatística
foi encontrada entre os sexos (p=0,841).
44
Tabela 7. Análise descritiva da amostra.
Características Total Mulheres Homens p*
N, %
102
56,9
43,1
Idade ª 62,5 ± 11,6 63,5 ± 11,9 61,3 ± 11,1 0,430
Sedentarismo % 62,8 72,4 50,0 0,102
Tabagismo %
Tabagista atual 12,0 6,9 19,0 0,018*
Não tabagista 49,0 60,3 33,3
Ex tabagista 39,0 32,8 47,6
Alcoolismo %
Consumo de álcool 18,4 7,1 33,3 <0,0001*
Não consome 62,2 83,9 33,3
Consumo no passado 19,4 8,9 33,3
Medicação %
Usava estatina 45,1 48,3 40,9 0,459
Não usava estatina 54,9 51,7 59,1
Perfil clínico %
Diabete melito 36,3 39,7 31,8 0,415
Cardiopatia isquêmica 37,3 32,8 43,2 0,281
Hipertensão arterial 76,5 81,0 70,5 0,212
PAS (mmHg)ª 143,9 ± 26,0 148,5 ± 25,5 137,8 ± 25,6 0,559
PAD (mmHg)ª 86,2 ± 12,6 87,5 ± 12,6 84,6 ± 12,5 0,781
Medidas antropométricasª
IMC, kg/m
2
28,7 ± 4,8 29,5 ± 5,4 27,7 ± 3,7 0,076
Cintura (cm) 100,6 ± 11,2 97,9 ± 11,4 103,6 ± 10,4 0,035*
ª valores apresentados como média (±), *p estatisticamente significativo.
45
Tabela 8. Perfil bioquímico da amostra.
Total Mulheres Homens p
COL total 234,5 ± 48,9 239,2 ± 49,3 228,3 ± 48,3 0,755
HDL-c 47,4 ± 9,8 49,5 ± 10,1 44,6 ± 8,7 0,212
LDL-c 148,6 ± 46,4 151,8 ± 46,7 144,1 ± 46,4 0,884
Triglicerídeos 247,1± 204,3 242,8 ± 196,8 252,8 ± 216,0 0,400
COL não-HDL 187 ± 47,7 189,7 ± 45,8 183,4 ± 50,3 0,482
Glicose 125 ± 54,9 123,5 ± 58,3 126,8 ± 50,7 0,841
Valores bioquímicos expressos como média (±) em mg/dI.
5.2. Análises moleculares da amostra estudada
As análises dos polimorfismos nos genes apo A-I e ECA foram feitas em
duplicata (duas amplificações e duas clivagens) e sempre pelo pesquisador
responsável, sendo este cego para os resultados das avaliações clínicas,
bioquímicas e antropométricas dos pacientes em estudo.
5.2.1. Análises moleculares do gene apo A-I
A figura 8 mostra o gel de eletroforese com os resultados obtidos das
análises por PCR-RFLP para o gene apo A-I. O processo de eletroforese foi
analisado em gel de agarose a 3%. Os fragmentos de DNA do polimorfismo -
75G>A e +83C>T no gene apo A-I foram corados com brometo de etídeo e
visualizados em transiluminador UV. A primeira coluna apresenta o marcador de
peso molecular (100 pb), a segunda o controle negativo e a terceira coluna
representa o produto de PCR amplificado (433 pb). As colunas 4 e 8 mostram o
perfil de restrição para os genótipos GG/CC com fragmentos de 209 e 113 pb, a
coluna 5 apresenta o genótipo GG/CT (254, 209 e 113 pb) e as colunas 6 e 7 o
genótipo AA/CC (209 e 179 pb). Os fragmentos pequenos 66 e 43 não foram
46
visualizados nesse tipo de gel. Os tamanhos esperados para os fragmentos de
restrição estão identificados à direita do gel.
Figura 8. Perfil eletroforético dos polimorfismos MspI nos sítios -75G>A e +83C>T
no gene apo A-I.
1 2 3 4 5 6 7 8
433 pb
254 pb
209 pb
179 pb
113 pb
47
5.2.2. Análises moleculares do gene ECA
O polimorfismo I/D no gene da ECA, localizado no cromossomo 17q23, foi
identificado através da técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR). A figura
9 mostra resultados típicos para os produtos de PCR e para o perfil de inserção ou
deleção de 287pb no gene ECA.
Figura 9. Perfil eletroforético do polimorfismo I/D no gene ECA.
1 2 3 4 5 6 7
A classificação por PCR dos genótipos está mostrada na eletroforese em
gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo e visualizados em
transiluminador UV. A primeira coluna mostra o marcador de massa molecular (100
bp); as colunas 2, 3, 4, 5, 6 e 7 mostram produtos de PCR da amplificação do gene
da ECA contendo o polimorfismo I/D (inserção ou deleção de 287pb). As canaletas
2 e 7 mostram o genótipo homozigoto II, canaletas 4 e 6, genótipo heterozigoto ID
e canaletas 3 e 5, genótipo homozigoto DD. Os tamanhos esperados dos
fragmentos I/D estão identificados à direita do gel. A genotipagem foi baseada nas
seguintes informações: 1) indivíduos homozigotos II apresentam em ambos os
cromossomos a inserção de uma seqüência Alu dentro do íntron 16, gerando um
único fragmento amplificado de 490 pb; 2) indivíduos homozigotos DD apresentam,
em ambos os cromossomos, a ausência desta seqüência Alu, gerando um único
490 pb
190 pb
48
fragmento amplificado de 190 pb; 3) indivíduos heterozigotos ID, apresentam no
gel de agarose os dois tamanhos de fragmentos de DNA, 490 pb e 190 pb.
5.3. Freqüências dos polimorfismos analisados
5.3.1. Freqüências genotípicas e alélicas
As freqüências genotípicas, alélicas e haplotípicas dos polimorfismos
estudados na amostra de 102 pacientes dislipidêmicos, estão apresentadas nas
tabelas 9 e 10.
A tabela 9 mostra que não houve diferença significativa nas freqüências
genotípicas entre homens e mulheres nos três sítios polimórficos -75G>A (p =
0,425) e +83C>T (p = 0,769) e I/D (p=0,546). Em ambos os sexos, a distribuição
dos polimorfismos -75G>A e I/D estão em equilíbrio de Hardy – Weinberg.
Entretanto, o polimorfismo +83C>T não está em equilíbrio de Hardy - Weinberg.
Podemos observar que os genótipos GG, CT e ID foram os mais freqüentes na
amostra estudada.
A tabela 10 apresenta as freqüências haplotípicas dos polimorfismos
presentes nos sítios -75G>A e +83C>T no gene apo A-I. O haplótipo mais
freqüente foi o CG com 53,4% de freqüência. Não foi observado desequilíbrio de
ligação entre os sítios -75G>A e +83C>T (χ
2
= 0,15, p = 0,69).
Entre as nove possibilidades de combinações genotípicas em ambos os
polimorfismos -75G>A e +83C>T, não foram encontradas combinações entre os
genótipos -75 GA e +83 TT, -75 AA e +83 TT e -75 GG e +83 TT no total amostra
de dislipidêmicos analisados.
49
Tabela 9. Freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos investigados
nos genes apo A-I e ECA.
Polimorfismos
Total
n = 102
Homens
n = 44
Mulheres
n = 58
p
apo A-I
G-75A
Alelos
G 0,73
A 0,27
Genótipos
GG 51 (50,0) 19 (43,2) 32 (55,2)
GA 46 (45,1) 22 (50,0) 24 (41,4)
0,425
AA 5 (4,9) 3 (6,8) 2 (3,4)
apo A-I
C+83T
Alelos
C 0,63
T 0,37
Genótipos
CC 27 (26,5)
11 (25,0) 16 (27,6)
CT 75 (73,5)
33 (75,0) 42 (72,4) 0,769
ECA
(I/D)
Alelos
I 0,49
D 0,51
Genótipos
II
20 (19,6) 9 (20,5) 11 (19,0)
ID
59 (57,8) 23 (52,3) 36 (62,1) 0,546
DD
23 (22,5) 12 (27,3) 11 (19,0)
50
Tabela 10. Freqüências haplotípicas dos polimorfismos presentes nos sítios
-75G>A e +83C>T no gene apo A-I.
Haplótipos
GC AC GT AT Total
N
109 20 39 36 204
%
53,4 9,8 19,1 17,6
Combinações Genotípicas -75G>A e +83C>T
GG-CC GA-CC AA-CC GG-CT GA-CT AA-CT
N
14 12 1 37 34 4
%
13,7 11,8 1,0 36,3 33,3 3,9
5.3.2. Freqüências genotípicas e haplotípicas de acordo com os níveis de
lipoproteína de baixa densidade (LDL) e de alta densidade (HDL).
As freqüências genotípicas e haplotípicas foram comparadas com os níveis
lipídicos categorizados de LDL (<100 mg/dl e 100 mg/dl) e de HDL (< 40 mg/dl,
HDL 40 mg/dl e HDL > 60 mg/dl). A tabela 11 resume os resultados encontrados
das freqüências genotípicas e haplotípicas. Pode-se observar que não houve
diferença estatisticamente significativa em relação aos níveis lipídicos, genótipos
do gene ECA e as combinações genotípicas do gene apo A-I.
Em relação aos genótipos investigados no gene ECA, pode-se observar que
a freqüência do genótipo ID foi maior entre indivíduos com níveis de LDL
aumentados 100 mg/dl e indivíduos com níveis de HDL normais 40 mg/dl.
Em relação aos haplótipos dos sítios -75G>A e +83C>T, observa-se que a
freqüência da combinação dos genótipos GG/CT é maior entre indivíduos com
51
níveis de LDL aumentados 100 mg/dl e HDL normais 40 mg/dl, apesar de não
haverem diferenças estatisticamente significativas.
Tabela 11. Freqüências genotípicas e de combinações genotípicas dos
polimorfismos estudados em relação aos níveis lipídicos de LDL e de HDL.
LDL p HDL p
LDL
<100
LDL
100
HDL
< 40
HDL
40
HDL
> 60
n (%) n (%)
apo A-I
GG/CC 1 (7,1) 9 (12,3) 1 (5,5) 11 (15,9) 2 (15,3)
GC/CC 0 9 (12,3) 2 (11,1) 7 (10,1) 1 (7,6)
AA/CC 0 1 (1,3) 0 1 (1,4) 0
GG/CT 8 (57,1) 28 (38,3)
5 (27,7) 26 (37,6) 6 (46,1)
GA/CT 3 (21,4) 24 (32,8)
10(55,5)
22 (31,8) 2 (15,3)
AA/CT 2 (14,3) 2 (2,7) 0,214
0 2 (2,8) 2 (15,3)
0,327
Total 14 73 18 69 13
ECA
DD 2 (14,8) 15 (20,5)
5 (27,7) 15 (21,7) 2 (15,3)
ID 9 (64,2) 43 (58,9)
0,862
9 (50,0) 39 (56,5) 10(76,9) 0,610
II 3 (21,4) 15 (20,5)
4 (22,2) 15(21,7) 1 (7,6)
Total 14 73 18 69 13
52
5.3.3. Freqüências genotípicas da apo A-I e ECA de acordo com o IMC.
A tabela 12 apresenta os resultados de freqüências genotípicas de acordo
com as categorias de IMC. A comparação do Índice de Massa Corporal (IMC)
dividido em duas categorias, normal (< 25 kg/m
2
) e Sobrepeso ou obesidade (≥ 25
kg/m
2
) entre os polimorfismos MspI nos sítios -75G>A e +83C>T do gene da apo A-
I e o polimorfismo I/D do gene ECA, apresentado na tabela 12 mostra que houve
uma diferença estatisticamente significativa (P<0,028), quando comparado o índice
de massa corporal (IMC) com os genótipos CC e CT do polimorfismo MspI no sítio
+83C>T do gene da apo A-I, mas não foi observada nenhuma diferença
significativa com o polimorfismo no sítio -75G>A no gene apo A-I e com o
polimorfismo I/D no gene ECA. Devido ao pequeno número de pacientes
homozigotos para o alelo A do polimorfismo -75G>A, eles foram combinados com
os heterozigotos para a análise estatística.
Tabela 12. Freqüências genotípicas dos polimorfismos estudados em relação ao
IMC.
IMC
Normal
(< 25 kg/m
2
)
Sobrepeso ou obesidade
(≥ 25 kg/m
2
)
p
n (%)
apo A-I -75
GG 11 (50,0) 35 (50,7) 0,573
GA + AA 11 (50,0) 34 (49,3)
apo A-I +83
CC 2 (9,1) 22 (31,9) 0,028*
CT 20 (90,9) 47 (68,1)
ECA
DD 6 (27,3) 14 (20,3)
ID 9 (40,9) 43 (62,3) 0,185
II 7 (31,8) 12 (17,4)
Dados expressos em percentual, * p para valores estatisticamente
significativos entre IMC normal e sobrepeso. Para as análises estatísticas, os
genótipos GA e AA foram agrupados.
53
5.3.4. Níveis bioquímicos de acordo com os genótipos da apo A-I e ECA dos
usuários e não usuários de estatinas.
As tabelas 13 e 14 mostram a comparação das variáveis bioquímicas dos
pacientes usuários e não usuários de estatinas no início do estudo entre os
diferentes genótipos nos sítios -75G>A e +83C>T do gene apo A-I.
Não foi observada nenhuma significância estatística entre as variáveis
bioquímicas e os genótipos dos polimorfismos I/D no gene ECA e -75G>A e
+83C>T do gene apo A-I com pacientes que não estavam usando estatinas. No
entanto, entre os pacientes medicados com estatinas, observaram-se diferenças
significativas para os níveis de colesterol total (p = 0,002), triglicerídeos (p = 0,028)
e colesterol não HDL (p = 0,007) entre os genótipos CC e CT no sítio +83C>T.
Devido ao pequeno número de pacientes homozigotos para o alelo A do
polimorfismo -75G>A, eles foram combinados com os heterozigotos para a análise
estatística.
54
Tabela 13. Comparação de freqüências para os polimorfismos nos sítios -75G>A e +83C>T do
gene apo A-I e do polimorfismo I/D da ECA com as variáveis bioquímicas dos pacientes
usuários de estatinas.
USUÁRIOS DE ESTATINAS N= 46
N CT HDL LDL TG COL não
HDL
GLIC
APOA1 -75
GG
25
221 ± 49,3 48,6 ± 10,7 126,7 ± 43,2 301,8 ± 284,4 172,3 ± 45,4 126,1 ± 51,1
GA +AA
21
213,1 ± 45,7 45,9 ± 11,3 127,4 ± 47,2 280,6 ± 245,3 167,2 ± 47,1 126,6 ± 40,2
P
0,579 0,394 0,962 0,627 0,712 0,769
APOA1+83
CC
12
251,5 ± 26,6 50,5 ± 8 153,9 ± 30,2 429,5 ± 362,2 201 ± 27,2 142,3 ± 64,6
CT
34
205,4 ± 47,4 46,4 ± 11,7 119,4 ± 45,2 243,6 ± 206 159 ± 46,2 120,7 ± 36,9
P
0,002* 0,273 0,05 0,028* 0,007* 0,239
ECA
DD
10
208,7 ± 50,1 45,7 ± 11,1 120,5 ± 44,8 294,7 ± 238,3 163 ± 47,6 153,5 ± 63,7
DI
27
221,9 ± 44,7 49,6 ± 11,2 129,3 ± 42,7 276,1 ± 233,4 172,3 ± 42,7 117 ± 40
II
9
213,7 ± 55,4 43 ± 9,4 126,2 ± 55,1 337,3 ± 386,9 170,7 ± 56,7 124,1 ± 29,9
P
0,735 0,253 0,905 0,976 0,863 0,109
Os valores bioquímicos estão expressos como média (desvio padrão) em mg/dI,
*p para valores estatisticamente significativos entre genótipos e níveis bioquímicos dos
usuários de estatinas. Para análise estatística os genótipos GA e AA foram agrupados.
55
Tabela 14. Comparação de freqüências para os polimorfismos nos sítios -75G>A e +83C>T do
gene apo A-I e do polimorfismo I/D da ECA com as variáveis bioquímicas dos pacientes não
usuários de estatinas.
NÃO USUÁRIOS DE ESTATINAS N= 54
N CT HDL LDL TG COL não
HDL
GLIC
APOA1 -75
GG
26
250,8 ± 55,2 48,3 ± 8,5 163,1 ± 47,9 197,0 ± 78,3 202,5 ± 54,4 131,0 ± 83,0
GA +AA
28
247,3 ± 36,3 46,7 ± 9,3 164,7 ± 35,7 219,7 ± 155,3 200,5 ± 34,6 117,1 ± 32,4
P
0,904 0,516 0,896 0,762 0,829 0,415
APOA1+83
CC
13
243,3 ± 52,2 46 ± 7,2 161,4 ± 44,8 199,3 ± 96,0 197,2 ± 48,9 113,3 ± 33,5
CT
41
250,8 ± 44,3 47,9 ± 9,4 164,6 ± 41,6 211,8 ± 132,1 202,8 ± 43,9 127,1 ± 68,5
P
0,613 0,519 0,822 0,933 0,696 0,597
ECA
DD
12
241,4 ± 41,2 44,5 ± 8,4 163,3 ± 35,8 239,5 ± 207,9 196,9 ± 38,3 104 ± 30,2
DI
31
255,2 ± 48,8 47,6 ± 8,7 167,5 ± 44,4 209,2 ± 91,3 207,6 ± 47,3 133,7 ± 76,6
II
11
239,5 ± 43,4 50,2 ± 9,6 154,4 ± 42,9 173,9 ± 77,7 189,2 ± 44,3 117,6 ± 30,3
P
0,512 0,301 0,686 0,511 0,474 0,316
Os valores bioquímicos estão expressos como média (desvio padrão) em mg/dL.
Para análise estatística os genótipos GA e AA foram agrupados.
56
6. DISCUSSÃO
A procura de genes relacionados à susceptibilidade a dislipidemia e a DCV
tem sido objeto de intensas pesquisas, face ao grande impacto dessas condições
na sociedade moderna. Na população brasileira, em especial, considerada
miscigenada, estudos de polimorfismos podem auxiliar na busca de
particularidades, através de associações entre fatores de risco ambientais e
variáveis genéticas.
No presente estudo, as freqüências dos polimorfismos -75G>A e +83C>T
(gene apo A-I) e I/D (gene ECA) foram investigadas em uma população de
pacientes dislipidêmicos e comparadas com parâmetros bioquímicos, clínicos e
antropométricos.
A proteína apo A-I tem sido alvo de intensas pesquisas com ênfase na
identificação de patologias de origem genética ou na busca de marcadores de
risco associados às DCV e dislipidemias. Quanto à proteína ECA, apresenta um
papel crítico no funcionamento do sistema cardiovascular, atuando no controle de
dois peptídeos envolvidos na modulação do tônus vascular (TAVARES, 2000;
BITTNER, 2006; CHARLTON-MENYS e DURRINGTON, 2006).
A amostra estudada foi composta por 43,1 % de homens e 56,9 % de
mulheres. Segundo revisão feita por BITTNER (2006), não há associação
preferencial com um dos sexos, sendo a DCV a causa mais comum de mortes,
tanto em homens, como em mulheres. A freqüência pouco mais elevada de
mulheres na amostra estudada pode estar relacionada com um maior cuidado
das mulheres com relação à saúde e a disponibilidade de tempo para consultar.
A distribuição racial da amostra apresenta preponderância de brancos
(74,5%). Esse dado confere com dados obtidos a partir do Censo de 2000 do
IBGE que relata uma freqüência de 83% de indivíduos que se autodeclararam
brancos na população do Rio Grande do Sul (www.ibge.gov.br/censo/).
57
Na população investigada, a identificação das seguintes características:
histórico familiar (23,5 %), idade (média 62 anos), sedentarismo (62,8 %),
tabagismo (ex e atual, 51 %), diabetes (36,3%), hipertensão (76,5 %), IMC (média
28,7 kg/m
2
) e cintura (média 100,6 cm) mostra a presença de fatores de risco para
DCV, dados esses que conferem com os relatos já bem definidos na literatura
(LIBBY et al., 2000; III Diretrizes Brasileiras Sobre Dislipidemias, 2001). O papel
da história familiar como fator de risco independente para doença coronariana já
foi claramente definido. Dados do estudo de Framingham mostram que pessoas
com história familiar apresentam um risco cardiovascular 29% maior que o de
indivíduos sem história familiar (KANELL, 2002).
As freqüências significativas encontradas entre tabagismo (p = 0,018),
consumo de álcool (p < 0,0001) e indivíduos do sexo masculino refletem um
comportamento da sociedade ocidental que faz com que os homens apresentem
perfis de risco diferenciados para o desenvolvimento de DCV em relação aos
indivíduos do sexo feminino. Segundo dados da literatura, os riscos
cardiovasculares relacionados às mulheres estão associados com irregularidades
no ciclo menstrual e perdas na gravidez, sugerindo que funções ovarianas
anormais durante os anos de pré-menopausa podem aumentar o risco para DCV
(de KLEIJN et al., 1999; SOWERS et al., 2006).
De acordo com a tabela 8, não foram observadas associações significativas
entre níveis bioquímicos e sexo (p > 0,05). No entanto, é possível observar que o
perfil lipídico não está dentro dos valores de referência para pessoas acima de 20
anos segundo as diretrizes brasileiras de dislipidemia (III Diretrizes Brasileiras
Sobre Dislipidemias, 2001), condição essa, pré-requisito para a seleção da
população estudada. Ainda na tabela 8, é possível observar que os níveis de
glicose também estão acima do normal, embora sem associação estatisticamente
significativa, esse dado confere aos pacientes, predisposição ao desenvolvimento
de diabetes, outro fator de risco de grande importância no desenvolvimento de
DCV (BLONDE et al., 2006).
58
As freqüências encontradas dos alelos G (0,73) e A (0,27) investigados no
gene apo A-I são similares às encontradas por outros autores, sendo o alelo A o
mais raro (KAMBOH et al., 1996; LAHOZ et al., 2003; JIA et al., 2005; MA et al.,
2005). Já as freqüências dos alelos C (0,63) e T (0,37) diferem das freqüências
observadas por outros autores que encontraram freqüências bem menores para o
alelo T (KAMBOH et al., 1996; LAHOZ et al., 2003; JIA et al., 2005; MA et al.,
2005), não estando em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Uma explicação para a
maior freqüência do alelo T no presente estudo ainda necessita de maiores
investigações. As freqüências dos alelos I (0,49) e D (0,51) no gene ECA são
similares aos achados na literatura (GARDEMANN et al., 1998; SAYED-
TABATABAEI et al., 2004; MONDRY et al., 2005).
Os genótipos GG (51%), CT (74 %) e ID (58 %) foram os mais freqüentes
na amostra estudada. Na literatura, os genótipos GG e ID também são
encontrados em maior freqüência nas diferentes populações estudadas
(KAMBOH et al., 1996; GARDEMANN et al., 1998; GARASTO et al., 2003;
LAHOZ et al. 2003; FRANKEN et al, 2004; SAYED-TABATABAEI et al., 2004;
KAJINAMI et al, 2005; MA et al., 2005; MUTHUMALA et al., 2006). Entretanto, o
genótipo CC, em vez de CT, como observado no presente estudo, é que
prevalece nas outras populações. MA et al. (2005) encontraram uma freqüência
muito baixa para o genótipo CT na população de hipercolesterolêmicos e
hipertensos estudada. Uma explicação para a maior freqüência do genótipo CT no
presente estudo necessita de maiores investigações.
Uma freqüência baixa do genótipo AA (5 %) e nenhum genótipo TT foram
encontrados. Na literatura, os alelos A e T são mais prevalentes em populações
não dislipidêmicas (controles) (ZOU et al., 2003) e mais raros nas populações
dislipidêmicas (KAMBOH et al., 1996; LAHOZ et al., 2003; KAJINAMI et al., 2005).
Essas características sugerem que as presenças freqüentes dos alelos A e T
possam estar associadas com proteção ao desenvolvimento de DCV. Vários
autores encontraram associação entre a presença do alelo A no sítio -75G>A,
com aumento dos níveis de apo A-I e HDL-C (MINNICH et al., 1995; LAHOZ et
59
al., 2003; KAJINAMI et al., 2005). WANG et al. (1996) mostram que o aumento
nos níveis de HDL-C e sua principal carreadora, a apo A-I, estão associados com
redução na ocorrência de DAC. É sugerido que o alelo A aumenta a expressão do
gene apo A-I (MENG et al., 1997).
Não houve diferença significativa entre genótipos e sexo nos sítios
polimórficos -75G>A (p = 0,425), +83C>T (p = 0,769) e I/D (p = 0,546)
investigados, dados que concordam com os encontrados por outros autores
(SAYED-TABATABAEI et al., 2004; SCHUT et al., 2004; JIA et al., 2005; SAYED-
TABATABAEI et al., 2006a).
Não foi observado desequilíbrio de ligação entre os sítios -75G>A e
+83C>T (χ
2
= 0,15; p = 0,69). Esse dado é ainda controverso na literatura, tendo
autores que também não encontraram ligação entre os polimorfismos MspI no
gene apo A-I (PULKKINEN et al., 2000; JIA et al., 2005) e outros que encontraram
(KAMBOH et al., 1996; LARSON et al., 2002; MA et al., 2005).
No gene apo A-I, o haplótipo mais freqüentemente observado foi o GC
(53,4%) (tabela 10). KAMBOH et al. (1996) estudaram a relação entre os dois
polimorfismos MspI, com níveis de apo A-I e HDL-C. Analisando os haplótipos,
concluíram que GT e AC estão associados com aumento dos níveis de apo A-I,
quando comparado com o haplótipo GC. Portanto, a maior freqüência de GC no
presente estudo pode estar relacionada com predisposição à dislipidemia, uma
vez que é sabido que níveis baixos de apo A-I predispõem a DCV (LAHOZ et al.,
2003; KAJINAMI et al. 2005).
Das nove possibilidades de combinações haplotípicas que podem ocorrer
entre os dois polimorfismos investigados simultaneamente no gene apo A-I, não
foram encontrados os haplótipos GG-TT, GA-TT e AA-TT. Esses dados estão em
concordância com os achados descritos por KAJINAMI et al. (2005).
60
A tabela 12 mostra que foi encontrada associação estatisticamente
significativa entre índices menores de IMC e o genótipo CT (p = 0,028) presente
no sítio +83C>T. Esse dado está de acordo com outro trabalho que, estudando
pacientes diabéticos, encontrou também associação entre o genótipo CT e
valores menores de IMC em relação aos homozigotos CC (MA et al., 2005).
Neste estudo não foram observadas associações entre pressão arterial,
dislipidemia e os polimorfismos analisados, assim como em outros trabalhos que
buscaram esse entendimento (SMITH et al., 1992; BARRE et al., 1994). Outros
autores, entretanto, encontraram associação entre a presença dos genótipos AA e
CT com altos níveis de HDL (LAHOZ et al., 2003; JIA et al., 2005; MA et al.,
2005). MA et al. (2005) encontraram que a presença do alelo T no sítio +83C>T
está associada com níveis mais elevados de HDL-C e pressão sanguínea em um
grupo de indivíduos chineses hipertensos. Com relação aos polimorfismos I/D no
gene ECA, existe atualmente grande controvérsia na associação desses, com
hipertensão arterial sistêmica (revisado por TAVARES, 2000; SAYED-
TABATABAEI et al., 2006b).
A partir dos resultados acima, é possível inferir que os portadores do alelo
T podem se beneficiar mais com o uso de estatinas. É sabido que esses
medicamentos podem elevar modestamente os níveis de HDL e sua proteína
principal, apo A-I, embora não tenha sido encontrada associação do uso de
estatinas com os níveis de HDL (SCHAEFER e ASZTALOS, 2006). LAHOZ et al.
(2003) encontraram associação entre o polimorfismo G/A presente no sítio -75
G>A do gene apo A-I e elevação nas concentrações de HDL-C e também
resposta ao tratamento com pravastatina. Portadores do alelo A apresentaram
concentrações 6,5% maiores de HDL-C em relação aos homozigotos GG. Diante
disso, conclui-se que o alelo A poderia estar influenciando as concentrações de
HDL e que, conforme encontrado no presente estudo, o alelo T estaria modulando
as concentrações das outras lipoproteínas quando do uso de estatinas. Esses
achados corroboram o resultado de que os polimorfismos investigados no gene
61
apo A-I não estão em desequilíbrio de ligação, influenciando independentemente
os níveis de lipídios em pacientes dislipidêmicos, juntamente com as estatinas.
Recentemente, um estudo brasileiro relatou a influência da combinação
genotípica GG/CC do gene apo A-I e diminuição dos níveis de TG e VLDL-C em
mulheres, assim como resposta mais favorável ao tratamento com atorvastatina
(SORKIN et al., 2005).
KAJINAMI et al. (2005) não encontraram associações entre os
polimorfismos -75G>A e os níveis lipídicos. Ao contrário, o alelo C do
polimorfismo +83C>T foi associado com altos níveis de LDL-C antes do
tratamento com atorvastatina.
A resposta ao tratamento com estatinas varia consideravelmente de
pessoa para pessoa, reforçando a idéia de que a variabilidade genética pode
exercer um papel central na resposta interindividual ao tratamento (revisado por
MANGRAVITE et al., 2006).
Finalmente, no presente estudo cabe ressaltar que muitos resultados com
ausências de associações podem ter sido devidos ao pequeno número de
pacientes incluídos na amostra, ficando claro esse fato quando comparados com
outros estudos relacionados.
62
7. CONCLUSÕES
As variáveis tabagismo e álcool foram significativamente maiores nos
indivíduos do sexo masculino, indicando que são fatores risco gênero específico
para suscetibilidade a transtornos do metabolismo de lipídios.
As freqüências dos alelos C (0,63) e T (0,37) no sítio +83C>T do gene apo
A-I, bem como do genótipo CT diferiram das freqüências observadas por outros
autores que encontraram freqüências bem menores em grupos dislipidêmicos,
não estando em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Esses achados no presente
estudo necessitam de maiores investigações para compreensão.
Uma freqüência baixa do genótipo AA (5 %) e nenhum genótipo TT foram
encontrados no presente estudo, esse dado está de acordo com o encontrado
para grupos dislipidêmicos investigados, indicando que a presença dos alelos A e
T em homozigose possam ser fatores protetores ao desenvolvimento de
dislipidemia.
A maior freqüência do haplótipo GC encontrada no presente estudo sugere
predisposição a dislipidemia, uma vez que é sabido que os haplótipos GT e AC
predispõem a elevação dos níveis apo A-I e, conseqüentemente, a maior proteção
no desenvolvimento de alterações no metabolismo lipídico.
A associação estatisticamente significativa encontrada entre índices
menores de IMC e o genótipo CT (p = 0,028) conferem com outro trabalho que
também demonstrou essa influência do genótipo CT e valores menores de IMC
em relação aos homozigotos CC.
Neste estudo não foram observadas associações entre pressão arterial,
dislipidemia e os polimorfismos analisados.
Foi possível encontrar associações significativas entre o genótipo CT (sítio
+83C>T) de pacientes usuários de estatinas e uma melhora nos níveis de
63
colesterol total (p = 0,002), TG (p = 0,028) e colesterol não HDL (p = 0,007).
Portanto, é possível inferir que os portadores do alelo T podem se beneficiar mais
com o uso de estatinas.
64
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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75
9. ANEXOS
ANEXO 1
CONSENTIMENTO PARA PARTICIPAÇAO DO PROJETO DE PESQUISA:
“Estudo de freqüência de polimorfismos nos genes da Apolipoproteína A-I (apo A-I) e da Enzima
Conversora de Angiotensina (ECA) em pacientes dislipidêmicos".
Objetivos do Estudo
As doenças do coração representam um problema de saúde pública no mundo. Existem
diversos fatores de risco responsáveis pelo aparecimento dessas doenças, os quais podem ser
divididos em imutáveis e mutáveis. Fatores imutáveis são aqueles que não podemos mudar e, por
isso, não podemos tratá-los, são eles: hereditariedade (herança genética herdada de nossos pais),
idade e sexo (homens têm maiores chances de ter um ataque cardíaco). Os fatores mutáveis são
aqueles sobre os quais podemos influir, mudando, prevenindo ou tratando, são eles: fumo,
colesterol elevado (HDL é o bom colesterol e o LDL é o mau colesterol), pressão arterial elevada,
dieta (ingestão de alimentos gordurosos), vida sedentária (falta de exercícios físicos), obesidade
(excesso de peso) e estresse (tensão emocional). O colesterol elevado é um dos fatores de risco
mais importantes para o surgimento das doenças do coração e sua diminuição está
comprovadamente ligada a uma diminuição desse risco. O presente estudo tem como objetivo
conhecer uma região do seu material genético (DNA) que pode estar influenciando o aparecimento
de colesterol alto e, conseqüentemente, as doenças do coração.
Procedimentos
Durante a visita ao consultório, algumas perguntas como idade, sexo, escolaridade, dieta
serão realizadas. Serão obtidas também medidas como peso, altura e comprimento do quadril.
Após, será realizada uma coleta de sangue para dosar os níveis de colesterol e realizar as
análises genéticas. As consultas deverão ser devidamente marcadas.
Essas coletas serão feitas apenas para este estudo e em nada influenciarão o tratamento.
A coleta não vai causar nenhum problema, exceto o pequeno incômodo de dor no momento da
introdução da agulha para a retirada do sangue.
Riscos e Desconfortos:
Os riscos e desconfortos aos pacientes deste estudo são aqueles associados aos
procedimentos da coleta de sangue. Essa quantidade é pequena (10 mL) e, por isso, dificilmente
causará algum mal-estar geral (1 em cada 1000 pessoas), no entanto, poderá haver dor no local
da coleta e, eventualmente, um pequeno hematoma.
Benefícios:
Os benefícios da participação nesse estudo estão relacionados aos exames oferecidos e
ao acompanhado recebido para verificar as condições do coração paciente. O paciente também
estará contribuindo com informações fundamentais que ampliarão o conhecimento da relação
entre a hereditariedade e o medicamento usado no tratamento da doença arterial coronariana.
Alternativa:
76
Se o paciente escolher não participar, não haverá nenhuma diferença, quanto ao
acompanhamento médico.
Custos:
Não será cobrado algum pagamento pela participação no estudo.
Dúvidas:
Alguma dúvida referente ao estudo poderá ser esclarecida pela Dra. Nadine Clausell,
telefone 21018657 (Serviço de Cardiologia).
Confidencialidade:
Todas as informações e os resultados advindos dos procedimentos realizados serão
considerados confidenciais e serão conhecidos somente da equipe envolvida. Todos os
questionários e materiais coletados serão identificados através de um código criado na entrada do
estudo. Este código será a única identificação no banco de dados, sendo utilizado para análise
dos dados e divulgação dos mesmos no meio científico.
Participação voluntária:
Uma cópia desse documento será fornecida, caso desejar. Se houver desistência em
algum momento do estudo, nenhuma diferença quanto ao acompanhamento e tratamento será
observada.
Significado de sua assinatura:
A sua assinatura abaixo significa que você entendeu a informação que lhe foi fornecida
sobre o estudo e sobre o termo de consentimento. Se você assinar este documento significa que
você concorda em participar do mesmo.
_____________, _____ de ____________ de ______.
Nome completo: _____________________________________________________
Endereço completo: __________________________________________________
Número do telefone: __________________________________________________
Assinatura do Paciente: _______________________________________________
Data: ______________________________________________________________
Nome da Pessoa que obteve o consentimento: _____________________________
Assinatura: _________________________________________________________
77
ANEXO 2
Título do projeto: Estudo de freqüência de polimorfismos nos genes da
Apolipoproteína A-I (apo A-I) e da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) em
pacientes dislipidêmicos.
PROTOCOLO DE COLETA DE DADOS
NOTA: Toda informação foi mantida sob estrita confidencialidade. Este
questionário foi armazenado em arquivos fechados. Seu número de identificação
foi a única conexão à informação coletada.
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82
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84
84
ANEXO 3
Título do projeto: Estudo de freqüência de polimorfismos nos genes da
apolipoproteína A-I e enzima conversora de angiotensina ECA em pacientes
dislipidêmicos com risco de doença arterial coronariana.
Número de controle: _____________________________________________
Número do paciente no HCPA: _____________________________________
FICHA DE BIOLOGIA MOLECULAR
Gene
Genótipo Sim Não
DD
ECA ID
II
GG
Apo A-I -75G>A GA
AA
CC
Apo A-I +83C>T CT
TT
Observação:__________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
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