( PDF ) Agentes infecciosos associados à diarréia aguda em crianças até três anos de idade: estudo em um hospital de referência no município de Vitória

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Universidade Federal do Espírito Santo – UFES

Núcleo de Doenças Infecciosas

Mestrado em Doenças Infecciosas

Ana Daniela Izoton de Sadovsky

“AGENTES INFECCIOSOS ASSOCIADOS À DIARRÉIA AGUDA EM

CRIANÇAS ATÉ TRÊS ANOS DE IDADE: ESTUDO EM UM

HOSPITAL DE REFERÊNCIA NO MUNICÍPIO DE VITÓRIA – ES”

Vitória - Espírito Santo

2005

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Ana Daniela Izoton de Sadovsky

“AGENTES INFECCIOSOS ASSOCIADOS À DIARRÉIA AGUDA EM

CRIANÇAS ATÉ TRÊS ANOS DE IDADE: ESTUDO EM UM

HOSPITAL DE REFERÊNCIA NO MUNICÍPIO DE VITÓRIA – ES”

Dissertação apresentada ao programa de

Pós- Graduação em Doenças Infecciosas do

Núcleo de Doenças Infecciosas da

Universidade Federal do Espírito Santo,

como requisito parcial para obtenção do

Grau de Mestre em Doenças Infecciosas.

Orientadora : Prof. Dra. Liliana Cruz Spano

Co-Orientador: Prof. Dr. Fausto Edmundo

Lima Pereira

Vitória – Espírito Santo

2005

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Sadovsky, Ana Daniela Izoton de

Agentes infecciosos associados à diarréia aguda em crianças até três anos de

idade: estudo em um hospital de referência no município de Vitória – ES.

Ana Daniela Izoton de Sadovsky. Vitória: Universidade Federal do Espírito Santo,

Núcleo de Doenças Infecciosas – Centro Biomédico, 2005.

137 f.

Dissertação de Mestrado apresentada à Coordenação do Curso de Pós-

Graduação em Doenças Infecciosas do Núcleo de Doenças Infecciosas - NDI.

1.Gastroenterite infantil 2.Diarréia Aguda Infecciosa 3. Enterobactérias 4.Rotavírus

I. Universidade Federal do Estado do Espírito Santo. II. Centro Biomédico. Núcleo

de Doenças Infecciosas. III. Título

Ao meu querido Esteban, minhas

filhas Isabella e Carolina e meu filho

Gabriel, razões de minha felicidade

diária.

Aos meus pais Olívio e Lena, razões

de minha existência e dedicação aos

estudos.

Aos meus sogros Oscar e Martha,

razões para meu intenso

questionamento e curiosidade.

A todas as mulheres que amam sua

profissão e que são mães....

AGRADECIMENTOS

• A minha orientadora, Liliana Cruz Spano, incansável pesquisadora, pela

paciência e confiança, além do principal incentivo de meu desenvolvimento nesta

área apaixonante da Virologia;

• Ao meu co-orientador e coordenador do Mestrado em Doenças Infecciosas, Dr.

Fausto Edmundo Lima Pereira, admirável exemplo desde minha graduação, pelo

seu carinho de mestre e oportunidade de aprender a realizar pesquisa;

• Ao Dr. José Paulo Gagliardi Leite, pela viabilização da pesquisa de Rotavirus

pelo treinamento em seu laboratório da metodologia EIERA, por todo apoio científico

e disponibilização de recursos para finalização do estudo viral;

• À Dra. Sônia Maria de Souza Kitagawa, pela disponibilização de seu material que

possibilitou a realização do estudo, além do enriquecimento da discussão sobre os

enteropatógenos bacterianos;

• Ao Dr. Reynaldo Dietze, coordenador do Núcleo de Doenças Infecciosas.

• Ao Dr Mauro Batista de Morais, pelos conhecimentos e apoio desde minha

residência médico e, sobretudo, incentivo acerca do tema da minha tese.

• À Dra. Isabel C A. Scaletsky, Universidade Federal do Estado de São Paulo

(UNIFESP), pela realização dos testes de hibridização nas amostras enviadas.

• À Dra. Dália dos Prazeres Rodrigues, Laboratório de Enterobactérias da

Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ – RJ, pela determinação dos sorotipos de

Salmonella;

• Ao Sr. Alexandre Madi Fialho, pelos ensinamentos na realização da eletroforese

em gel de poliacrilamida na pesquisa do ácido nucléico viral;

• Dra Maria da Penha Herkenhorf, laboratório de Microbiologia do LACEN, por

reencaminhar kit de Biomanguinhos para detecção de ags de RV e de Ad.

• À Dra. Elizabeth Gobbi, diretora clínica HINSG pelo consentimento da pesquisa;

• Ao Laboratório de Análises Clínicas Quintão Ltda., na pessoa da Dra. Wânia

Quintão Coimbra, Unidade do HINSG, que gentilmente auxiliou na obtenção de

amostras fecais de pacientes assintomáticos;

• As minhas amigas de trabalho (e de coração) farmacêuticas Ketene W. Saick e

Paula N. Segui, sem as quais eu não teria um trabalho tão completo e enriquecedor;

• As minhas queridas técnicas de laboratório Heloisa, Erica e Lia, pela dedicação à

minha pesquisa;

• A todos os plantonistas do Pronto socorro do HINSG, que apesar de todo

cansaço imposto por um dia exaustivo de trabalho, recebiam-me com sorrisos e boa

vontade para que eu continuasse minha pesquisa;

• A todos os funcionários (enfermeiras, técnicas e auxiliares de enfermagem, e

outros), sempre dispostos a me auxiliar no Pronto Socorro do HINSG;

• Aos meus pequenos pacientes e seus pais, que possibilitaram a pesquisa;

• Aos meus colegas de mestrado, professores e funcionários do NDI pela torcida;

• À Sra. Fátima Aparecida Pereira, amiga e fiel secretária do Curso de Pós-

Graduação em Doenças infecciosas, pelos inúmeros auxílios;

• Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

COLAB/MS e FIOCRUZ pelo suporte financeiro deste trabalho;

• Aos meus amigos que, mesmo não tendo sido mencionados, foram importantes

pela amizade e incansável apoio;

• A minha irmã, meus cunhados e cunhadas, aos meus sobrinhos e sobrinha e

familiares pelo cuidado com meus filhos quando minha presença não era possível;

• Aos meus pais e sogros, por todos os inúmeros auxílios e sobretudo, pelo amor

fraternal e incentivo, tornando possível finalizar mais esta etapa de minha vida;

• Ao meu marido, pela paciência, amor e companheirismo que tornaram minha

tarefa um pouco menos cansativa;

• Aos meus filhos, pelo amor, pelo aprendizado diário que me concedem sob todos

os aspectos e pela aceitação de minhas incontáveis ausências ao seu lado;

• Ao Senhor, infinitamente bondoso e sábio, que sempre me conduziu durante

todos os dias de minha Vida e à Maria, mãe do Céu, que me fez encontrar forças

iguais às minhas tarefas.

RESUMO

A diarréia aguda é uma causa importante de mortalidade infantil, nos países em

desenvolvimento (OMS). A prevalência de rotavírus (RV), adenovírus (Ad),

categorias diarreiogênicas de E. coli (DEC), Salmonella, Shigella,

Cryptosporidium spp., Entamoeba histolytica e Giardia lamblia, foi pesquisada em

crianças até 3 anos de idade. De fevereiro de 2003 a junho de 2004, foram

obtidas 253 amostras fecais de crianças com diarréia aguda e 78 sem diarréia,

atendidas no Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória (HINSG), Vitória – ES. O

estudo das bactérias foi feito em 241 amostras fecais (12 excluídas por uso de

antimicrobiano) com isolamento de colônias caracterizadas bioquimicamente

como E.coli em 219 e 68 casos com diarréia e sem diarréia, respectivamente.

Estes casos foram submetidos à sorologia com anti-soros polivalentes (EPEC e

EIEC) e testes de hibridização (Hibr) para pesquisa de genes de virulência para

detecção de EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, EAEC e DAEC. RV foram pesquisados

em 147 casos por ensaio imunoenzimático (EIERA) e em 230, através da

eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), e Ad em 147 casos, por ensaio

imunoenzimático (EIERA). Os protozoários foram pesquisados 88 amostras por

ensaio Imunoenzimático (EIE). As crianças com diarréia foram divididas em:

Grupo I (88 casos = todos os agentes pesquisados), Grupo II (147 casos =

bactérias, RV e Ad - EIERA) e Grupo III (230 casos = bactérias e RV - EGPA) e

as crianças sem diarréia compuseram o Grupo IV (78 casos = bactérias e RV -

EGPA). Mais de 60% das amostras colhidas de crianças com diarréia aguda

foram positivas para enteropatógenos, sendo as bactérias, os mais prevalentes,

seguidos pelos vírus. DEC foram detectadas em 41,1% dos casos de diarréia

aguda: EPEC em 3,6% (sorologia) e 9,1% (Hibr); EPEC típica (0,9 %); EPEC

atípica (8,2%); EAEC (9,1%); DAEC (20,6%); EIEC (0,9%); ETEC (4,2%). Nas

crianças sem diarréia, detectou-se EPEC (10,3%); EAEC (20,6%); DAEC

(16,2%); ETEC (1,5%). EHEC não foi detectada. Nas crianças com diarréia

aguda foram detectados Shigella (4,6%), Salmonella (2,9%), RV em 35,2%

(EGPA) e 50% (EIERA); Ad (8,2%) e E. histolytica (8%), Cryptosporidium spp.

(11,4%) e G. lamblia (14,8%). Concluindo, EPEC típica, EIEC e ETEC foram

detectadas apenas ou predominantemente nas crianças com diarréia. EPEC

atípica, EAEC e DAEC não estiveram relacionadas com diarréia aguda, exceto

EAEC nas crianças acima dos dois anos de idade (p = 0,026). RV foi agente

infeccioso mais prevalente considerando somente DEC classicamente patógenas

(EPEC típica, ETEC, EIEC, Shigella e Salmonella), nos menores de 18 meses de

vida e nos meses de março a setembro de 2003. As associações entre

enteropatógenos foram freqüentes, sendo os protozoários, o grupo de

enterópatógenos com o maior número de associações. Dos protozoários

avaliados, apenas G. lamblia parece ser agente etiológico isolado de diarréia

aguda.

ABSTRACT

Acute diarrhea is one of the main causes of infantile mortality worldwide (WHO),

mainly in developing countries. In the present work, the prevalence of Rotavirus

(RV), adenovirus (Ad), diarrheogenic E. coli (EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, EAEC,

DAEC), Salmonella, Shigella, Cryptosporidium spp., Entamoeba histolytica and

Giardia lamblia was studied among children up to 3 years old with acute diarrhea.

From February 2003 to June 2004, stools samples were obtained prospectly from

253 children with acute diarrhea and 78 without diarrhea attending to the

emergency room in a pediatric hospital - Hospital Infantil Nossa Senhora da

Glória (HINSG), in Vitória – Espírito Santo state, Brazil. Bacterial detection was

done in 241 stools samples (12 were excluded because were in use of

antimicrobian drugs) and E. coli were isolated in 219 and 68 cases with and

without diarrhea, respectively. These cases were submited to serology with

policlonal anti-seros (EPEC e EIEC) and hybridization tests (Hybr) to detect

virulence genes of EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, EAEC e DAEC. RV were studied

in 147 cases for immune enzymatic assay (EIARA) and in 230 cases by

poliacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and Ad, only in 147 cases for immune

enzymatic assay (EIARA). Protozoan infection was studied in 88 cases for

immune enzymatic assay (EIA). Children with diarrhea were divided in Group I

(88 cases = all enteropathogens studied), Group II (147 cases = bacterias, RV e

Ad - EIARA) and Group III (230 cases = bacterias and RV - PAGE) and children

without diarrhea were Group IV (78 cases = bactérias and RV - PAGE).

Enteropathogens were detected in more than 60% in children with acute diarrhea

and bacterial infection was the most prevalent: DEC were detected in 41,1%;

EPEC in 3,6% (serology) e 9,1% (Hybr); Typical EPEC (0,9%); Atypical EPEC

(8,2%); EAEC (9,1%); DAEC (20,6%); EIEC (0,9%); ETEC (4,2%). In stools

samples from children without diarrhea, we found Atypical EPEC (10,3%); EAEC

(20,6%); DAEC (16,2%); ETEC (1,5%). EHEC was not detected in the studied

population. Shigella and Salmonella were detected in 4,6% e 2,9%, respectively,

only in children with acute diarrhea. RV were detected in 35,2% (GEPA) and 50%

(EIARA); Ad, in 8,2% and E. histolytica, Cryptosporidium spp. and G. lamblia in

8%, 11,4% and 14,8% of cases with diarrhea, respectively. In conclusion, Typical

EPEC, EIEC and ETEC were detected only or predominantly in children with

acute diarrhea. Atypical EPEC, EAEC and DAEC were not causes of acute

diarrhea, except for EAEC in children more than two years old (p = 0,026). RV

was the most prevalent agent when the classic enteropathogen DEC (Tipical

EPEC, ETEC, EIEC and Shigella e Salmonella) was considered in this study. RV

was more frequent in children below 18 months of life and in a period of March,

2003 up September, 2003. Associations among enteropathogens were frequent

in the studied population and protozoa were the most of them. Comparing all of

protozoa detected, only G. lamblia suggesting being a cause of acute diarrhea,

isolately.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Listas de Abreviaturas

Ac – Anticorpos

Ad – Adenovirus

Ag - Antígenos

BFP - bundle-forming pilus

BM - banho Maria

DAEC - E. coli de adesão difusa

DEC –E. coli diarreiogênica

DO - densidade ótica

EAEC - E. coli enteroagregativa

EAF - EPEC Adherence Factor

EGPA - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

EHEC - E. coli enterohemorrágica

EIEC - E. coli enteroinvasora

EIERA - Ensaio Imunoenzimático para RV e Ad

EPEC - Escherichia coli enteropatogênica clássica

ETEC - E. coli enterotoxigênica

HINSG - Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória

IV – Intravenosa

LEE – locus enterocyte effacement

LT - enterotoxina termolábil

min. - minutos

OMS - Organização Mundial da Saúde/WHO – World Health Organization

OPAS – Organização Pan-Americana de Saúde

PS - Pronto Socorro

RNA df – RNA de dupla fita

RV – Rotavírus

s. - segundos

SHU – Síndrome Hemolítica Urêmica

ST - enterotoxina termoestável

TA - temperatura ambiente

TMB - cromógeno tetrametilbenzidina

UFES – Universidade Federal do Espírito Santo

UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

XII

LISTA DE DIAGRAMAS, FIGURAS, GRÁFICOS, TABELAS E QUADROS

Diagramas:

Página

Diagrama 1: Associação inter e intracategorias de patógenos detectados em

88 amostras fecais de diarréia aguda (Grupo I)

Diagrama 2: Associação entre bactérias, RV e Ad detectados em 147

amostras fecais de diarréia aguda (Grupo II)

Diagrama 3: Associação entre bactérias e RV detectados em 230 amostras

fecais de diarréia aguda (Grupo III)

Figuras:

Figura 1: Distribuição das 331 amostras fecais colhidas de acordo com seu

fracionamento para detecção dos enteropatógenos

Figura 2: Sumário dos procedimentos realizados para detecção bacteriana nas

331 amostras colhidas

Figura 3: Distribuição dos casos de diarréia aguda e sem diarréia de acordo

com a pesquisa simultânea de enteropatógenos

Figura 4: Mapa da região metropolitana da Grande Vitória demonstrando a

localização dos municípios que a compõem: Vitória, Vila Velha, Serra,

Cariacica e Viana com o respectivo número de amostras colhidas

Figura 5: A) Agar McConkey com col. Lac (+) e Lac (-) de E. coli; B)

Transferência das colônias Lac (+) e Lac (-) para membrana de nitrocelulose;

C) Membrana de nitrocelulose com amostras positivas e negativas para

fermentação de lactose. Sequência superior e inferior correspondem,

respectivamente, a filtros não tratados e tratados com solução de lise

bacteriana; D) Hibridização em membrana após revelação. Resultado positivo

com sonda genética para o plasmídio EAF (EPEC típica) pode ser observado

em duas amostras no disco central inferior. Controle positivo e negativo para a

referida sonda se encontra no quadrado central. Fotos obtidas no Laboratório

de Microbiologia da Dra. Isabel C. Scaletsky (UNIFESP)

Figura 6: Eletroferotipos de RNAdf do RV após EGPA corado pela

impregnação pela prata. Colunas 1-3 e 6: padrão 4-2-3-2; Coluna 4: amostra

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

XIII

negativa; Coluna 5: genoma com rearranjo 5-1-3-2

Gráficos:

Gráfico 1: Número total de consultas por gastrenterite aguda e de amostras

fecais obtidas de crianças menores de três anos atendidas no Pronto Socorro

do HINSG no período de 2003 a 2004

Gráfico 2: Distribuição da idade das crianças com diarréia aguda estudadas.

Estão representados os percentis 25 (6 meses) e 75 (18 meses) e a mediana

de 11 meses

Gráfico 3: Tempo de aleitamento materno exclusivo nas crianças com diarréia

aguda

Gráfico 4: Época de introdução de outros alimentos (leites e alimentos sólidos)

nos primeiros seis meses de vida das crianças com diarréia aguda

Gráfico 5: Amostras positivas e negativas para diversas categorias de DEC

pesquisadas em crianças com e sem diarréia aguda

Gráfico 6: Correlação das amostras positivas para RV, Salmonella, Shigella,

ETEC, EIEC e EPEC típica com as estações dos anos de 2003 e de 2004

Gráfico 7 – Distribuição dos casos positivos para RV (EIERA e EGPA) e de

diarréia aguda nos menores de três anos conforme meses do período

estudado

Gráfico 8: Distribuição do número total de amostras colhidas e de amostras

positivas para RV de acordo com os municípios

Gráfico 9: Distribuição mensal dos casos de diarréia aguda positivos para RV

e variações da temperatura média, número de dias de chuva, no período de

fevereiro de 2003 a junho de 2004

Gráfico 10: Número total de amostras positivas para Cryptosporidium, E.

histolytica e G.lamblia e suas associações com bactérias e vírus (RV e Ad)

identificados nas amostras fecais de crianças com diarréia aguda

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

XIV

Tabelas:

Tabela 1a: Prevalência de enteropatógenos por grupos, identificados

isoladamente ou associados, em crianças com diarréia aguda, de acordo

com algumas variáveis relacionadas com a idade, hábitos e condições de

vida, alguns sinais e sintomas e terapia de hidratação IV. Grupo I – os três

agentes pesquisados

Tabela 1b: Prevalência de enteropatógenos por grupos, identificados

isoladamente ou associados, em crianças com diarréia aguda, de acordo

com algumas variáveis relacionadas com a idade, hábitos e condições de

vida, alguns sinais e sintomas e terapia de hidratação IV. Grupo II –

bactérias, RV e Ad (EIERA) pesquisados

Tabela 1c: Prevalência de enteropatógenos por grupos, identificados

isoladamente ou associados, em crianças com diarréia aguda, de acordo

com algumas variáveis relacionadas com a idade, hábitos e condições de

vida, alguns sinais e sintomas e terapia de hidratação IV. a - Grupo I – os

três agentes pesquisados; b - Grupo II – bactérias, RV e Ad (EIERA)

pesquisados; c -

Tabela 2: Agentes patógenos e possivelmente patógenos bacterianos em

amostras fecais de crianças com e sem diarréia aguda

Tabela 3: Distribuição de categorias de Escherichia coli (EPEC atípica e

típica, ETEC, EAEC e DAEC) de acordo com a estratificação de idade em

crianças com e sem diarréia aguda

Tabela 4: Identificação de amostras positivas para Salmonella e Shigella

correlacionadas com a faixa etária de 241 crianças com diarréia aguda

Tabela 5: Agentes enteropatogênicos virais detectados em amostras fecais

de crianças com diarréia aguda

Tabela 6: Distribuição das amostras positivas para RV e Ad por EIERA

(Grupo II) e para RV por EGPA (Grupo III) de acordo com faixa etária das

crianças com diarréia aguda

Tabela 7: Antígenos de protozoários detectados em 88 amostras fecais de

crianças com diarréia aguda (Grupo I) através do EIE para G. lamblia,

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

E.histolytica e Cryptosporidium spp.

Tabela 8: Amostras positivas para protozoários de acordo com a faixa

etária das 88 crianças com diarréia aguda (Grupo I)

Tabela 9: Sinais e sintomas clínicos das crianças com diarréia aguda 74

Tabela 10: Sinais e sintomas clínicos das crianças com diarréia aguda em

amostras positivas para Shigella, Salmonella e DEC

Tabela 11: Sinais e sintomas clínicos das crianças com diarréia aguda nas

amostras positivas com RV (EGPA e EIERA), Ad (EIERA) e associação de

ambos (EIERA)

Tabela 12: Sinais e sintomas clínicos das crianças com diarréia aguda em

amostras positivas para Cryptosporidium ou E. histolytica ou G. lamblia

Quadros

Quadro 1. Anti-soros utilizados na confirmação e/ou triagem de bactérias

patógenas intestinais

Quadro 2. Sondas genéticas específicas para as categorias de DEC

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

XVI

SUMÁRIO

Página

1. INTRODUÇÃO 18

2. REVISÃO DA LITERATURA 22

2.1. CONCEITOS BÁSICOS SOBRE DIARRÉIA E PRINCIPAIS FATORES

DE RISCO

2.2. ETIOLOGIA INFECCIOSA DAS DIARRÉIAS

3. OBJETIVOS 37

3.1. OBJETIVOS GERAIS

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

4. MATERIAL E MÉTODOS 39

4.1. TIPO DE ESTUDO E LOCAL

4.2. AMOSTRAGEM

4.3. COLETA DOS DADOS CLÍNICOS E EPIDEMIOLÓGICOS

4.4. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA

4.5. COLETA, ARMAZENAMENTO E PROCESSAMENTO DAS FEZES

4.5.1. Detecção de bactérias

4.5.1.1. Caracterização bioquímica e identificação de enterobactérias

4.5.1.1.1. Escherichia coli

4.5.1.1.2. Shigella e Salmonella

4.5.2. Detecção de vírus

4.5.2.1. Preparo de suspensões fecais

4.5.2.2. Ensaio Imunoenzimático para Rotavírus e Adenovírus (EIERA) 47

4.5.2.3. Extração de RNA 47

4.5.2.4. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (EGPA) 48

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

XVII

4.5.3. Detecção de protozoários 48

4.5.3.1. Ensaio Imunoenzimático para Cryptosporidium spp.,

Entamoeba histolytica e Giardia lamblia (EIE)

4.5.4 Detecção de mais de um enteropatógeno nas amostras fecais

4.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA

5. RESULTADOS 51

5.1. DADOS DEMOGRÁFICOS

5.2. AGENTES INFECCIOSOS NA AMOSTRA ESTUDADA

5.2.1. Bactérias

5.2.1.1. E. coli diarreiogênica (DEC) 59

5.2.1.1.1. Sorologia para DEC 59

5.2.1.1.2. Testes de Hibridização para pesquisa de genes de

virulência de DEC

5.2.1.2. Shigella e Salmonella

5.2.2. Vírus

5.2.2.1 EIERA

5.2.2.2 EGPA 66

5.2.3. Protozoários 70

5.2.4. Associações entre bactérias, vírus e protozoários

5.2.5. Quadro clínico das crianças com diarréia e associação com

dados sócio-demográficos

6. DISCUSSÃO 79

6.1. CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA ESTUDADA 80

6.2. ENTEROPATÓGENOS DETECTADOS 81

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

XVIII

6.3. BACTÉRIAS 82

6.4. VÍRUS 89

6.5. PROTOZOÁRIOS 94

7. CONCLUSÕES 98

8. PERSPECTIVAS 101

9. TRABALHOS APRESENTADOS 103

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 105

11. ANEXOS 126

Anexo 1: Carta de aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa do Centro

Biomédico - UFES

127

Anexo 2: Ficha de dados clínico-epidemiológicos 128

Anexo 3: Termo de consentimento livre e esclarecido 129

Anexo 4: Procedimentos realizados nas amostras fecais colhidas em Vitória

– ES

130

Anexo 5: Meios de Cultura e Soluções usadas: 131

1. Meios de cultura para isolamento e caracterização bioquímica das

bactérias

131

2. Soluções e reagentes utilizados para detecção dos RV 133

Anexo 6: Organograma resumindo o destino das amostras fecais após coleta

136

1. INTRODUÇÃO

O trato gastrintestinal, com sua grande superfície, representa um importante alvo

para agentes infecciosos que, uma vez conseguindo suplantar as condições

adversas à sua colonização, desenvolverão um processo infeccioso que pode se

traduzir em uma diarréia (Tomar, 2001).

As doenças diarréicas são comuns na infância e se encontram associadas à

importante morbidade e mortalidade, sobretudo nos menores de três anos de idade.

As diarréias apresentam diversas causas, mas as de natureza infecciosa são as

mais freqüentes, principalmente nos países em desenvolvimento (Snyder & Merson,

1982; Guandalini, 2000; Carré et al., 2001; Casburn-Jones et al., 2004). Estima-se

que ocorram 1,5 bilhões de episódios de diarréia por ano em crianças menores de

cinco anos e que destes, resultem de 1,7 a 3 milhões de mortes a cada ano, no

mundo (Parashar et al., 2003 a, b).

O Brasil ocupa o sexto lugar em números de mortes infantis em menores de cinco

anos com índices de 42 mortes/1000 nascidos vivos (OMS, 2002), sendo as doenças

diarréicas responsáveis pelo segundo lugar quando relacionadas a causas

específicas de mortalidade infantil (OPAS, 2002). Em 1997, Szwarcwald et al.

demonstraram diferença significativa de coeficientes de mortalidade infantil e de

mortalidade proporcional por diarréia em diferentes regiões brasileiras com variações

de 5,1% no Rio Grande do Sul até 27,6% no Ceará relacionados ao coeficiente de

mortalidade proporcional por diarréia de acordo com indicadores de saúde por

unidade de federação (1991). Esta diferença poderia ainda ser maior, decorrente de

índices subestimados nas áreas com grandes percentuais de mortes por causas não

definidas. Estados considerados com maior nível de desenvolvimento, como Santa

Catarina e Paraná, ainda apresentaram altas proporções de óbitos por diarréia, de

9,2% e 13,7, respectivamente. No Espírito Santo, o coeficiente de mortalidade

proporcional por diarréia nos menores de cinco anos apresentou queda importante

de 8,67% (1990) para 2,36% (2000), chegando atualmente a 2,71 % (2002)

(DATASUS, 2004).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Nos diversos estados brasileiros, a diarréia é uma queixa freqüente em consultas

nos pronto-socorros e ambulatórios da rede de saúde pública municipal e estadual. A

desidratação é responsável por um grande número de internações hospitalares e de

alto custo para o município ou para o estado (Ribeiro, 2000). Sabe-se que a

população que usufrui da rede do Sistema Único de Saúde, de baixo nível sócio-

econômico, tem um maior risco de adoecimento por diarréia com conseqüentes

agravos nutricionais e morte, sobretudo, crianças oriundas de famílias que vivem em

situação de pobreza e miséria (Toporovski et al., 1999; Souza et al., 2002).

Com relação à etiologia infecciosa da diarréia, é descrita uma importante associação

de pobreza e de higiene precária com presença de agentes infecciosos, agravada

pela introdução precoce de alimentos administrados através de mamadeiras em

detrimento ao leite materno (Elegbe et al., 1982; Feachem, 1984; Esrey et al., 1985;

Tomasi et al., 1994). No Brasil, vários relatos descrevem a Escherichia coli

enteropatogênica clássica (EPEC) como o mais importante agente bacteriano

causador de diarréia aguda, em especial nos menores de um ano de idade,

causando transtornos nutricionais e morte nos menores de seis meses (Guerrant et

al., 1983; Scaletsky et al., 1984,1999; Trabulsi et al., 1988, 2002; Kitagawa et al.,

1989; Andrade et al., 1999; Fagundes-Neto & Andrade, 1999; Fagundes-Neto &

Scaletsky, 2000; Souza et al., 2002). O agente infeccioso viral mais importante é o

rotavírus (RV) (Linhares et al., 1977, 1994; Toporovski et al., 1999; Fernandes et al.,

2000; Linhares, 2000; da Rosa e Silva et al., 2001; Souza et al., 2002, Cardoso et al.,

2003) sabidamente associado com diarréia grave e com altas taxas de internação

hospitalar (Kapikian et al., 2001; Parashar et al., 2003 a, b). Os protozoários mais

envolvidos com diarréias em crianças são: i) Cryptosporidium spp., ii) Giardia lamblia

e iii) Entamoeba histolytica, sendo os dois últimos mais implicados com diarréia

persistente (Cordell & Addiss, 1994; Gennari-Cardoso et al., 1996; Marshall et al.,

1997; Newman et al., 1999, 2001; Toporovski et al., 1999; Orlandi et al., 2001;

Scaletsky et al., 2001; Souza et al., 2002).

Estudos regionais sobre a etiologia das diarréias são importantes para o

planejamento de ações preventivas e terapêuticas. No Espírito Santo não há

publicações sobre a etiologia das diarréias infantis, especialmente as de causa

infecciosa. Então, o objetivo desta pesquisa foi investigar, durante 17 meses, os

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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diversos agentes infecciosos de natureza bacteriana, viral e parasitária, nas

amostras fecais de crianças de até três anos de idade, atendidos com queixa de

diarréia aguda em um hospital de referência, que atende à população de baixa

renda, na região metropolitana da Grande Vitória, Espírito Santo.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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2. REVISÃO DA LITERATURA

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Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. CONCEITOS BÁSICOS SOBRE DIARRÉIA E PRINCIPAIS FATORES DE

RISCO

A Organização Mundial da Saúde (OMS) conceitua “diarréia" como uma alteração de

hábito intestinal caracterizada por aumento do número de evacuações e/ou

diminuição da consistência das fezes devido à presença de água e eletrólitos. Sob o

ponto de vista clínico, ela pode ser classificada em: i) “diarréia aguda”, de início

abrupto e duração máxima de 14 dias, potencialmente autolimitada; ii) “diarréia

persistente”, que ultrapassa 15 dias de duração, freqüente em lactentes com

desnutrição e; iii) “diarréia crônica”, com duração superior a 30 dias; iv) “disenteria”,

com presença de sangue associado a muco e/ou pus.

Os principais fatores de risco para ocorrência das diarréias são:

a) Ausência de Amamentação: o risco de óbito por diarréia para crianças

desmamadas é 14,2 vezes maior do que o de crianças em aleitamento materno sem

outros suplementos lácteos. A simples introdução de água e chás está associada a

um aumento significativo na morbidade e mortalidade de lactentes (Victora et al.,

1987). Escuder et al. (2003) demonstraram que a amamentação foi um dos

principais fatores de redução significativa das principais causas de óbito em São

Paulo, como a pneumonia e a diarréia. Também foi observado em crianças menores

de três meses, com aleitamento misto ou em uso exclusivo de leite de vaca, risco de

adoecimento por diarréia 4,1 e 15,1 vezes maior, respectivamente, do que nas com

aleitamento materno exclusivo. Além da proteção contra a infecção, crianças em

aleitamento materno exclusivo, que apresentam diarréia aguda, têm uma

probabilidade de 16,7 vezes menor de evoluir para diarréia persistente, evitando os

agravos nutricionais conseqüentes deste processo (Victora et al., 1987; Sazawal et

al., 1992; Long et al., 1999; Betrán et al., 2001; Fuchs & Victora, 2002; Escuder et

al., 2003; Vieira et al., 2003; Newburg et al., 2005)

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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b) Ausência de água tratada, de saneamento ou higiene: os hábitos de higiene

doméstica e pessoal estão intimamente ligados à disponibilidade de água potável,

correspondendo a uma redução de 20% a 30% na morbidade e mortalidade por

diarréia (Feachem, 1984; Esrey et al., 1985). A lavagem das mãos é o componente

de higiene pessoal que mantém maior relação com a redução da incidência de

diarréia (Feachem, 1984; Esrey et al., 1985; Barros et al., 1999 a, b; Vazquez et al.,

1999; Lins & Silva, 2000; Curtis, 2001; Leclerc et al., 2002);

c) Prematuridade e ausência de realização de pré-natal: as crianças nascidas

antes de 37 semanas de gestação (prematuras) têm risco duas vezes maior de

apresentarem episódios de diarréia do que aquelas nascidas a termo. Além disso,

em São Paulo, Waldman et al. (1997) encontraram um risco três vezes maior e a

incidência mais alta de gastrenterites no grupo de filhos de mães que não fizeram o

pré-natal, apesar do nascimento a termo. Neste grupo, a mortalidade infantil por

diarréia também foi duas vezes maior, mesmo após levar em conta as diferenças

sócio-econômicas da população estudada (Waldman et al., 1997; Fuchs & Victora,

2002);

d) Desnutrição proteico-energética: a relação entre estado nutricional e diarréia é

complexa, mas a incidência de diarréia é maior, os episódios são mais graves nas

crianças desnutridas, com maior letalidade e repercussão importante no seu

desenvolvimento (Black et al., 1987; Fagundes-Neto & Andrade, 1999; Lins & Silva,

2000; Moore et al., 2001).

2.2 ETIOLOGIA INFECCIOSA DAS DIARRÉIAS

Nos últimos anos, avanços foram alcançados no reconhecimento de novos agentes

etiológicos causadores de diarréia aguda, assim como na elucidação dos

mecanismos pelos quais as infecções entéricas produzem efeitos disabsortivos. O

emprego de técnicas laboratoriais biomoleculares de detecção rápida, como a

soroaglutinação em látex e o ensaio imunoenzimático, resultaram na identificação de

patógenos intestinais em até 84% dos casos de crianças e adultos com doença

diarréica aguda (Guerrant et al., 1985; Gomes et al., 1989, 1991; Prado & O’Ryan,

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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1994; Scaletsky et al. 1999, 2002 a, b; Trabulsi et al., 2002). O conhecimento da

etiologia da diarréia infecciosa pode levar a intervenção terapêutica precoce,

prevenindo a desidratação (Larrosa-Haro et al., 2001).

2.2.1 Bactérias

Uma ampla variedade de patógenos é descrita como causa de diarréia, sendo eles

de natureza bacteriana, viral ou parasitária. Dentre os patógenos intestinais

bacterianos mais importantes temos: i) Categorias diarreiogênicas de Escherichia

coli (DEC); ii) Shigella; iii) Salmonella; iv) Campylobacter; v) Yersinia enterocolitica;

vi) Vibrio; vii) Aeromonas.

As E. coli são os microrganismos anaeróbios facultativos predominantes na

microbiota colônica humana. Esta bactéria coloniza o trato gastrintestinal do lactente

em poucas horas após o nascimento e mantém uma relação de benefício mútuo com

o seu hospedeiro. Algumas cepas estão envolvidas com infecções extra-intestinais, e

outras, comumente não associadas à microbiota normal, no próprio trato

gastrintestinal. As três principais síndromes clínicas resultantes de infecções

produzidas por E. coli são: i) infecção do trato urinário, ii) sepse ou meningite e iii)

doença diarréica.

As E. coli que acometem o trato gastrintestinal são de particular importância em

saúde pública e são denominadas E. coli diarreiogênicas (DEC). São descritas seis

categorias de DEC: i) E. coli enteropatogênica (EPEC), ii) E. coli enterotoxigênica

(ETEC), iii) E. coli enterohemorrágica (EHEC), iv) E. coli enteroinvasora (EIEC), v) E.

coli enteroagregativa (EAEC) e vi) E. coli de adesão difusa (DAEC) (Nataro & Kaper,

1998).

A EPEC é uma categoria diarreiogênica importante nos países em desenvolvimento,

com maior prevalência em crianças de até dois anos, sobretudo nos menores de 12

meses (Guerrant et al., 1983, 1986; Gomes et al., 1991; Prado & O’Ryan, 1994;

Kaper, 1996; Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000; Torres et al., 2001).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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No Brasil, a EPEC é o mais importante agente bacteriano causador de diarréia

aguda nas crianças menores de cinco anos e detectadas em 20 a 40% dos casos,

com tendência à redução de sua prevalência nos últimos anos. É um enteropatógeno

implicado como um fator de risco importante para diarréia de maior duração (diarréia

persistente), com maiores índices de hospitalização e de mortes Fagundes-Neto &

Scaletsky (2000) relataram 42% de EPEC numa população constituída na sua

maioria por pacientes menores de 12 meses e hospitalizados. (Guerrant et al., 1983;

Queiroz et al., 1987; Trabulsi et al., 1988, 2002; Gomes et al., 1989, 1991; Kitagawa

et al., 1989; Stewien et al., 1993; Scaletsky et al., 1999, 2002

b; Oliva et al., 1997;

Andrade et al., 1999; Fagundes–Neto & Andrade, 1999 Toporovski et al.,1999;

Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000; Medeiros et al., 2001; Souza et al., 2002; Orlandi

et al., 2003).

Com relação ao mecanismo de patogenicidade da EPEC, Donnenberg & Kaper

(1992) propuseram um modelo que consiste em três etapas: i) aderência localizada,

(ii) transdução de sinal e (iii) aderência íntima. Elas promovem uma lesão conhecida

como A/E (attaching and effacing), com achatamento das microvilosidades

intestinais, aderência íntima das bactérias ao epitélio intestinal e agregação

polarizada de actina, com conseqüente comprometimento da capacidade absortiva e

digestiva (Nataro & Kaper, 1998).

A EPEC pode ser classificada em “típica” e “atípica”, de acordo com a presença ou

ausência do plasmídio EAF (EPEC Adherence Factor), respectivamente. A EPEC

típica apresenta um padrão de colonização, em cultura de células HEp-2,

denominado de “aderência localizada”, determinada pela presença de uma fímbria

denominada BFP (bundle-forming pilus), codificada pelo referido plasmídio. Esta

EPEC é classicamente descrita associada à doença diarréica em crianças menores

de um ano, sobretudo nos países em desenvolvimento (Cravioto et al., 1990; Nataro

& Kaper, 1998; Scaletsky et al. 1999; Trabulsi et al., 2002; Dulguer et al., 2003).

EPEC atípica, reconhecida como categoria em 1995 no Segundo Simpósio

Internacional sobre EPEC (Kaper, 1996; Nataro & Kaper, 1998), é caracterizada pela

ausência do plasmídeo que codifica a fímbria BFP e por apresentar um padrão de

aderência semelhante à localizada. Tanto a EPEC típica quanto a atípica,

apresentam a ilha de patogenicidade cromossômica LEE (Locus enterocyte

effacement), responsável pela transdução de sinais e achatamento de vilosidades

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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intestinais. Após a década de 90, a EPEC atípica tem sido demonstrada com maior

freqüência nas fezes diarréicas de crianças em países desenvolvidos, em relação à

EPEC típica (Scotland et al., 1996; Afset et al., 2003; Beutin et al., 2003; Robins-

Browne et al., 2004). No Brasil, o papel desta categoria de EPEC na diarréia aguda

ainda não está bem estabelecido (Scaletsky et al. 1999; Trabulsi et al., 2002;

Campos et al., 2004; Gomes et al., 2004).

As ETEC caracterizam-se pela expressão de fatores de colonização, coletivamente

denominados de CFs, que permitem sua aderência em epitélio do intestino delgado,

e pela produção de enterotoxinas termoestável (ST) e/ou termolábil (LT) que

estimulam intensa secreção intestinal. São agentes etiológicos de diarréia aguda em

crianças e adultos, sendo os principais responsáveis pela diarréia dos viajantes

(Nataro & Kaper, 1998). No Brasil, sua prevalência variou de zero a 27,4% de

amostras diarréicas em crianças (Guerrant et al., 1983; Queiroz et al., 1987; Leal et

al., 1988; Kitagawa et al., 1989; Gomes et al., 1991; Mangia et al., 1993; Stewien et

al., 1993; Guth et al., 1994; Almeida et al., 1998; Toporovski et al., 1999; Fagundes

Neto & Scaletsky, 2000; Orlandi et al., 2001; Scaletsky et al., 2002 b, c; Souza et al.,

2002). Apesar de serem importantes agentes infecciosos intestinais em países em

desenvolvimento, como o Brasil, não são pesquisadas em laboratório de rotina

diagnóstica.

As EHEC foram descritas em 1983, após um surto de colite hemorrágica nos EUA

com isolamento da E. coli sorotipo O157:H7 (Riley et al., 1983; Wells et al., 1983) e,

concomitantemente, como agente etiológico da Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU)

em crianças (Karmali et al., 1983). A citotoxicidade provocada nos enterócitos

humanos por este patógeno, também foi demonstrada em culturas de células Vero

justificada pela presença da citotoxina denominada Stx1 e Stx2 (Shiga-like toxin),

homóloga à produzida pela espécie Shigella dysenteriae. A lesão A/E também é

observada nas EHEC, que assim como a EPEC, também apresenta a região

cromossômica LEE (Nataro & Kaper, 1998).

As EIEC são caracterizadas, dentre outros critérios, pela invasão de células epiteliais

colônicas. Produzem enterotoxina denominada EIET, que é responsável pela diarréia

aquosa inicial precedendo a evolução clássica para disenteria (Nataro & Kaper,

1998).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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A EHEC e EIEC são pouco freqüentes no Brasil, sendo encontradas em menos de

2% dos casos de diarréia aguda em crianças (Gomes et al., 1991; Stewien et al.,

1993; Almeida et al., 1998; Toporovski et al., 1999; Fagundes-neto & Scaletsky,

2000; Medeiros et al., 2001; Orlandi et al., 2001; Souza et al., 2002; Régua - Mangia

et al., 2004).

A observação de diferentes padrões de aderência em culturas de células HEp-2 ou

HeLa das EPEC serviu como base para o reconhecimento de duas outras categorias

de E. coli diarreogênicas: EAEC e DAEC (Cravioto et al., 1979). As EAEC

apresentam um padrão denominado de aderência agregativa, caracterizado pela

disposição de células bacterianas como “tijolos empilhados”, enquanto que as

DAEC, pelo padrão de aderência difuso, caracterizado pela dispersão das bactérias

sobre toda a superfície epitelial (Cravioto et al., 1979; Scaletsky et al., 1984; Nataro

et al., 1985; Nataro & Kaper, 1998).

O estudo da EAEC em modelos animais demonstra uma aderência aos enterócitos

associada a um aumento na produção de muco seguida de dano celular pela

produção de uma citotoxina (EAST). Classicamente, EAEC é associada a quadros

de diarréia persistente, mas também tem sido identificada em crianças com diarréia

aguda (Lima et al., 1992; Fang et al., 1995; Bardhan et al., 1998; Nataro & Kaper,

1998; Scaletsky et al., 1999; Andrade et al., 2000; Fagundes-Neto et al., 2000;

Scaletsky et al., 2001, 2002c). A DAEC, por outro lado, foi identificada tanto em

fezes de crianças assintomáticas quanto naquelas com diarréia aguda (Albert et al.,

1999; Scaletsky et al., 2001). Mas, uma susceptibilidade idade-dependente tem sido

observada, sendo a DAEC mais prevalente em crianças acima de 2 anos do que em

lactentes com diarréia aguda (Gomes et al., 1989; Gunzburg et al., 1993; Levine et

al., 1993; Nataro & Kaper, 1998; Scaletsky et al., 1999, 2002 b). Ainda que

identificada nestes casos, a DAEC necessita de maiores estudos para a definição de

sua importância como agente etiológico de diarréia infantil, assim como para

elucidação de sua patogênese. Tanto EAEC como DAEC, não são detectadas pelos

procedimentos de rotina em laboratórios de análises clínicas.

O gênero Shigella é constituído por quatro espécies, todas patógenas intestinais: S.

flexneri, S. boydii, S. sonnei e S. dysenteriae. Causam a disenteria bacilar,

caracterizada por diarréia muco-piossanguinolenta com intensa resposta

inflamatória, proveniente da invasão e destruição da camada epitelial da mucosa do

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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intestino grosso. São importantes patógenos pela gravidade do quadro intestinal e

por apresentarem dose infecciosa muito baixa (Goosney et al., 1999; Campos,

2004). No Brasil, a espécie predominante é a S. flexneri seguida pela S. sonnei

(Kitagawa et al., 1989; Gomes et al., 1991; Stewien et al., 1993; Santos et al., 1997;

Orlandi et al., 2001; Souza et al., 2002).

O gênero Salmonella é constituído por duas espécies: S. enterica, dividida em seis

subespécies, e S. bongori. Existem atualmente mais de 2500 sorotipos de

Samonella; 1478 pertencentes à S. enterica subespécie I que corresponde a 99,5%

dos sorotipos mais comumente isolados. Alguns sorotipos são mais restritos a seus

hospedeiros, enquanto outros são capazes de infectar diversos animais (Campos,

2004). A S. Typhi é adaptada e restrita ao ser humano, enquanto a S. Typhimurium

causa gastrenterite ou septicemia no homem, diarréia letal em bovinos, ou ainda,

uma doença sistêmica em camundongos geneticamente susceptíveis (Campos,

2004). A patogenicidade varia de acordo com o tipo sorológico, idade e condições de

saúde do hospedeiro podendo causar gastrenterite aguda, bacteremia e/ou febres

entéricas, quadros graves com disseminação e abscessos, osteomielite, meningite e

ainda, estado de portador (Pickering & Cleary, 1992). A sua identificação está

normalmente restrita às provas bioquímicas e sorológicas e a diferenciação dos

sorotipos é limitada a laboratórios especializados.

No Brasil, a Shigella e a Salmonella têm sido detectadas de 0,5 a 21% e de 0 a

10,6%, respectivamente, em crianças menores de 5 anos com diarréia aguda

(Guerrant et al., 1983; Kitagawa et al., 1989; Leal et al., 1987, 1988 a, b; Gomes et

al., 1991; Mangia et al., 1993; Almeida et al., 1998; Toporovski et al., 1999;

Fagundes Neto & Scaletsky, 2000; Medeiros et al., 2001; Orlandi et al., 2001;

Scaletsky et al., 2002 b; Souza et al., 2002).

O gênero Campylobacter compreende as espécies C. jejuni, C. coli, C. laridis, C.

hyointestinalis e C. upsaliensis, sendo as duas primeiras, as principais causadoras

de doença em humanos. Sabe-se que um dos seus maiores reservatórios naturais é

o frango. O quadro clínico é muito semelhante ao da shigelose (Pickering & Cleary,

1992). Na América do Sul, o Campylobacter foi identificado de 10 a 35% de

amostras de crianças com diarréia ou assintomáticas (Fernandez, 2004). Estudos

brasileiros recentes têm demonstrado uma prevalência em crianças entre 0 e 11 %

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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dos casos de diarréia aguda (Almeida et al., 1998; Fagundes Neto & Scaletsky,

2000; Medeiros et al., 2001; Orlandi et al., 2001; Souza et al., 2002).

O gênero Yersinia tem 10 espécies, sendo três patogênicas: Y. pestis, Y

enterocolitica e Y. pseudotuberculosis. A Y. enterocolitica tem sido relatada como

causa freqüente de diarréia, de maior ocorrência em crianças e em países de clima

frio (Pickering & Cleary, 1992; Trabulsi & Martinez, 2004). No Brasil, foi relatada pela

primeira vez no fim da década de 70 com uma incidência de 5,6% (Stumpf et al.,

1978). Outras pesquisas demonstraram-na em menos de 1% nos casos de diarréia

aguda em crianças em diferentes localidades brasileiras, como Rondônia (Orlandi et

al., 2001), Ribeirão Preto (Medeiros et al., 2001), São José do Rio Preto (Almeida et

al., 1998), São Paulo (Souza et al., 2002), Belo Horizonte (Queiroz et al., 1987) e

Pernambuco (Leal et al., 1988).

Os vibriões são microorganismos abundantes no meio aquático, detectados em uma

variedade enorme de animais, tais como no zooplâncton e moluscos, e também nas

algas (Thompson et al., 2004). As espécies de maior importância para os humanos

são Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus (Powell et al., 1999). Estes

agentes são causadores de gastroenterites devido ao consumo de água, mariscos

ou alimentos contaminados. V. cholerae é o agente bacteriano responsável por

importantes surtos e epidemias de diarréia profusa em adultos e crianças,

principalmente nos países em desenvolvimento (Glass & Kilgore, 1997; Faruque et

al., 1998, 2002; Sharma et al., 2003; Sack et al., 2004). É endêmico em partes da

Ásia e África e causa grandes perdas hidreletrolíticas, sobretudo em crianças (Niyogi

et al., 1994; Faruque et al., 1998, 2002) através da produção de uma enterotoxina –

toxina colérica (Ctx) - que é considerada 10 vezes mais potente do que a toxina

termolábil (LT) da ETEC (Glass & Kilgore, 1997).

As espécies do gênero Aeromonas têm sido estudadas nas últimas décadas como

agentes etiológicos de diarréia infecciosa em crianças e adultos, sendo A. sobria, A.

hydrophyla e A. caviae, as mais freqüentes (Watson et al., 1985; Gluskin et al., 1992;

Niyogi et al., 1994; Gracey, 1996; Glass & Kilgore, 1997; Lee et al., 2001). As mais

prováveis fontes de infecção são a água, crustáceos e peixes contaminados. Estas

bactérias, ao invadirem o epitélio colônico, liberam toxinas responsáveis pelos

sintomas (Burke et al., 1984; Watson et al., 1985; Glass & Kilgore, 1997). No mundo

tem sido demonstrada de 0,5 até 12,2% e no Brasil, em 1,4 a 2% de amostras fecais

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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de crianças com diarréia aguda (Black et al., 1987; Almeida et al., 1998; Albert et al.,

1999; Essers et al., 2000). Em pessoas saudáveis, foi identificada em taxas iguais ou

menores que 1% (Almeida et al., 1998; Lee et al., 2001).

2.2.2 Vírus

Os agentes infecciosos virais associados às diarréias agudas em crianças são

rotavírus (RV), adenovírus (Ad), calicivírus e astrovírus (Glass & Kilgore, 1997;

Waters et al., 2000). Os RV são os mais freqüentes em todas as partes do mundo

(Prado & O’Ryan, 1994; Horwitz, 2001; Kapikian et al., 2001; Parashar et al., 2003 a,

b).

Os RV pertencem à família Reoviridae e tem o genoma segmentado, constituído de

11 moléculas de RNA de dupla fita (RNAdf) e foi descrito em 1973 por Bishop et al..

O padrão de migração em eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) permite

diferenciar os RV em sete grupos distintos nomeados de A-G (Kapikian et al., 2001).

O RV do grupo A apresenta um perfil eletroforético denominado 4-2-3-2: quatro

segmentos de maior peso molecular, seguidos de dois grupos de peso molecular

intermediário e finalizando com dois segmentos de menor peso molecular. Estes dois

últimos segmentos também são utilizados para classificar os RV do grupo A de perfil

super curto, curto e longo.

Os RV dos grupos A, B e C são descritos em humanos e em animais e os demais,

apenas em animais (Glass & Kilgore, 1997). O RV do grupo A causa diarréia na

infância, os dos grupos B e C causam surtos de diarréias em adultos e em crianças

(Prado & O’Ryan, 1994; Glass & Kilgore, 1997; Kapikian et al., 2001; Parashar et al.,

2003 a, b). Os RV são ainda divididos em subgrupos e sorotipos ou genotipos,

determinados por proteínas e/ou por genes que codificam as proteínas estruturais

VP4 e VP7. O virion apresenta seis proteínas estruturais VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 e

VP7 e outras seis proteínas não estruturais NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 e

NSP6. A proteína VP6, a mais prevalente do virion, é altamente antigênica e permite

a identificação dos RV em grupos (A – G). VP4 e VP7 contêm epítopos

neutralizantes que definem os sorotipos/genotipos P (protease) e G (glicoproteína),

respectivamente. No grupo A, foram identificados 14 sorotipos/genotipos G, dez

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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acometendo a espécie humana (G1-G6, G8-G10 e G12) enquanto que foram

descritos 25 genotipos P, quatro deles acometendo a espécie humana (P[4],P[6],P[8]

e P[9]) (Rahman et al., 2005). Logo, a tipagem dos RV obedece a um sistema binário

de classificação conforme os tipos P e G (Estes, 1996; Parashar et al.,1998;

Kapikian et al., 2001).

Cerca de 90% das crianças tanto nos países desenvolvidos, quanto em

desenvolvimento, adquirem a infecção por RV durante os três primeiros anos de

vida, sendo considerado um dos principais agentes etiológicos de gastrenterite viral

aguda na população infantil e responsável por um alto número de internações (Cook

et al., 1990; Glass et al., 2001; Kapikian et al., 2001; Parashar et al., 2003 a, b;

Widdowson et al., 2005). Estima-se que ocorram 1.560.000 mortes no mundo pela

doença diarréica e que os RV sejam responsáveis por até 39% dos casos (Parashar

et al., 2003).

Com relação ao quadro clínico, os pacientes infectados com RV desenvolvem

vômitos e diarréia de caráter súbito, após um período de incubação de 48 h a 96 h,

podendo apresentar febre em 30 a 50% dos casos. A diarréia é de caráter explosivo,

com inúmeras evacuações aquosas, amareladas e com muco em 25% dos casos. A

duração média da doença é de 5 a 8 dias, com perdas fecais mais graves e

prognóstico pior do que as diarréias não associadas ao RV, podendo evoluir para

desidratação e internação hospitalar (Prado & O’Ryan, 1994; Linhares, 2000;

Kapikian et al., 2001; Mota-Hernandez et al.; 2001; Clark & Mc Kendrick, 2004). Em

lactentes e desnutridos graves podem prolongar a duração da diarréia (Oliveira &

Linhares, 1999; Kapikian et al., 2001).

Desde o primeiro relato de RV no Brasil (Linhares et al., 1977), diversos estudos têm

demonstrado a importância destes vírus, com uma prevalência estimada em crianças

com diarréia aguda variando de 1,1 até 40% (Cardoso et al., 1989, 1992, 2003;

Linhares et al., 1989, 1993; Gomes et al., 1991; Mangia et al., 1993; Pereira et al.,

1993; Stewien et al., 1993; Timenetsky et al., 1994; Leite et al., 1996; Mascarenhas

et al., 1998; Teixeira et al., 1998; Toporovski et al., 1999; Fagundes Neto &

Scaletsky, 2000; Fernandes et al., 2000; Orlandi et al., 2001; da Rosa e Silva et al.,

2001; Scaletsky et al., 2001; Soares et al., 2002; Souza et al., 2002; Schnack et al.,

2003; Carmona et al., 2004; Costa et al., 2004 a). No Espírito Santo, dois estudos de

corte transversal relataram prevalência de 7 (2004) e 17,9% (2003) de RV em

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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crianças com diarréia atendidas em Unidade Básica de Saúde Municipal (Vicentini et

al., 2003 e 2004 a).

A infecção pelos RV predomina nos meses secos e frios do ano (Linhares, 2000;

Kapikian et al., 2001; Coluchi et al., 2002). No Brasil, foi relatado com freqüência

maior entre maio e setembro em Goiânia e no Rio de Janeiro (Gomes et al., 1991;

Cardoso et al., 1992; Pereira et al., 1993), entre março e setembro, com pico em

junho, em Minas Gerais (da Rosa e Silva et al., 2001), entre julho e setembro em

Natal (Fernandes et al., 2000) e de maio a julho no Espírito Santo (Vicentini, 2004 b).

O RV é um vírus estável nas condições ambientais e pequena quantidade pode

contaminar o ambiente. Como a quantidade de vírus eliminado pelo paciente é

grande e a dose infecciosa estimada é baixa (Graham et al., 1987), mínima

contaminação ambiental é suficiente para transmitir a infecção, que se dá por

contato oro-fecal direto e por fômites (Butz et al., 1993; Glass & Kilgore, 1997).

Os Ad, embora fossem freqüentemente encontrados em espécimes fecais, eles não

eram associados à doença do trato gastrointestinal. Em meados de 1980, dois Ad

fecais, previamente não cultivados, foram adaptados em cultura e foram

denominados de sorotipos 40 e 41, formando a espécie F de Ad entéricos humanos

(Wadell et al., 1989). Outro sorotipo implicado em diarréia em crianças é o 31 (Glass

& Kilgore, 1997). Os Ad estão tipicamente associados com doença mais branda do

que a causada por RV, mas com curso mais prolongado (em média de 10,8 dias

contra 5,9 dias para RV), febre e vômito de menor intensidade e ausência de

sazonalidade. O período de incubação pode variar de três a dez dias. A doença

incide mais em crianças menores de dois anos e pode estabelecer o estado de

portador prolongado, tornando as fezes da criança uma fonte comum durante a

infecção aguda e após remissão dos sintomas, sendo de grave repercussão em

pacientes imunossuprimidos (Horwitz, 2001; Clark & Mc Kendrick, 2004).

Diversos estudos demonstram que os Ad correspondem à segunda causa de diarréia

viral em crianças no Brasil e no mundo, com prevalência variando de 1 a 10% dos

casos (Cardoso et al., 1992; Mangia et al., 1993; Pereira et al., 1993; Stewien et al.,

1993; Timenetsky et al., 1993; Glass & Kilgore, 1997, Soares et al., 2002; Subekti et

al., 2002; Pereira Filho, 2004).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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Dentre os protozoários causadores de diarréia, em regiões tropicais, os mais

importantes são a Entamoeba histolytica, a Giardia lamblia e o Cryptosporidium spp.

(Brunser et al., 1997; Procop, 2001). A maioria dos trabalhos descreve a giárdia e a

ameba envolvidas com diarréia persistente e a ameba, geralmente associada à

disenteria (Newman et al., 2001; Abd-Alla & Ravdin, 2002).

A E. histolytica tem sido descrita em fezes de indivíduos assintomáticos e naqueles

com diarréia aguda. No entanto, não se sabe ainda se as estirpes encontradas em

indivíduos assintomáticos são as mesmas dos casos que apresentam diarréia

aguda, já que foram demonstradas características morfologicamente distintas em

ambas (Haque et al., 2003). Alguns autores consideram o encontro de trofozoítas

com hemáceas fagocitadas como um critério de doença invasiva (Garcia &

Brunckner, 1996; Brunser et al., 1997). Sua prevalência, em adultos e crianças,

dependendo da região geográfica estudada, variou de 0,6 a 45,1% (Braga et al.,

1998, 2001; Albert et al., 1999; Abd-Alla & Ravdin, 2002; Haque et al., 2003). No

Brasil, a E. histolytica foi encontrada numa freqüência de zero a 16% dos casos de

diarréia aguda em crianças em diferentes regiões (Guerrant et al., 1983; Gennari-

Cardoso et al., 1996; Toporovski et al., 1999; Fagundes Neto & Scaletsky, 2000;

Braga et al., 1998, 2001; Orlandi et al., 2001; Scaletsky et al., 2001; Souza et al.,

2002).

Há discussão sobre o real impacto da giardíase em diarréias agudas, sobretudo nos

países em desenvolvimento, visto que este parasita foi freqüentemente associado a

quadros de diarréia persistente, mas também detectado em crianças assintomáticas

(Albert et al., 1999; Black et al., 1999; Saldiva et al., 1999; Rivera et al., 2002). Os

estudos brasileiros demonstram detecção do protozoário de 0,7 a 14,6% das fezes

de crianças com diarréia aguda (Guerrant et al., 1983; Stewien et al., 1993; Gennari-

Cardoso et al., 1996; Toporovski et al., 1999; Fagundes Neto & Scaletsky, 2000;

Orlandi et al., 2001; Scaletsky et al., 2002; Souza et al., 2002). Num estudo

prospectivo em Fortaleza, Newman et al. (2001) demonstraram a presença de G.

lamblia em fezes de crianças sem diarréia numa proporção semelhante àquelas com

diarréia aguda (8,8%), mas com uma diferença estatisticamente significativa quando

analisada em crianças com diarréia persistente (20,6%). Saldiva et al. (1999)

evidenciaram uma alta prevalência de giárdia (44%) em crianças de 1 a 12 anos, na

zona rural do estado de São Paulo, sem relato de associação com diarréia.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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A infecção pelo Cryptosporidium spp. está classicamente associada à diarréia aguda

em pacientes imunocomprometidos (Pickering & Cleary, 1992; Brunser et al., 1997;

Juranek, 2000; Ferreira & Borges, 2002). Nos pacientes sem comprometimento do

sistema imunológico, acomete determinadas faixas etárias, especialmente nos

primeiros anos de vida. Este protozoário causa diarréia de caráter aquoso profuso,

com febre, náuseas e vômitos, mas assim como a giárdia e a ameba, este agente

está mais associado à diarréia persistente (Pickering & Cleary, 1992; Juranek, 2000;

Hlavsa et al., 2005). A forma mais comum de infecção é através da ingestão de

alimentos ou água contaminados por oocistos contendo o parasita, sobretudo em

áreas de recreação, tais como piscinas, lagos e riachos. A prevalência mundial

relatada em indivíduos com diarréia variou de 2,1% em países desenvolvidos a 8,5

até 27,8% em países em desenvolvimento (Crawford & Vermund, 1988; Haque et al.,

2003; Nuñez et al., 2003; Adjei et al., 2004; Simango et al., 2004; Abdel-Messih et

al., 2005; Hlavsa et al., 2005). No Brasil, a prevalência variou entre três e 17,4%

(Mangini et al., 1992; Stewien et al., 1993; Gennari-Cardoso et al., 1996; Franco &

Cordeiro, 1996; Newman et al., 1999; Oshiro et al., 2000; Medeiros et al., 2001; Silva

et al., 2003). A freqüência de positividade para o Cryptosporidium foi diretamente

proporcional à faixa etária estudada (Mangini et al., 1992; Stewien et al., 1993;

Gennari-Cardoso et al., 1996; Franco & Cordeiro, 1996; Oshiro et al., 2000; Medeiros

et al., 2001). Porém, Newman et al. (1999) e Silva et al. (2003) observaram uma

correlação inversa em relação à idade.

Schnack et al. (2003) relataram E. histolytica e Cryptosporidium em 56,4 e 85,1%,

respectivamente, em crianças menores de cinco anos, com diarréia aguda, na

cidade de Criciúma, mas não há descrição se o período de estudo coincidiu com um

surto de infecção por estes protozoários neste local.

Os patógenos entéricos bacterianos, virais ou parasitários são muitas vezes

detectados simultaneamente nos pacientes com doença diarréica aguda, dificultando

a interpretação da participação de cada agente infeccioso na doença. Além do

possível somatório de lesões pela coinfecção é provável que a superposição com um

estado de nutrição inadequado contribua para a gravidade da diarréia nos países em

desenvolvimento, onde as infecções múltiplas têm um maior risco de acontecer.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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A freqüência de identificação concomitante de múltiplos enteropatógenos intestinais

em alguns estudos brasileiros variou de 4 a 78% (Stewien et al., 1993; Mangia et al.,

1993; Almeida et al., 1998; Toporovski et al., 1999; Medeiros et al., 2001; Orlandi et

al., 2001; Souza et al., 2002), mas uma notável parte dos estudos busca a

identificação de um agente infeccioso isolamente nas crianças menores de cinco

anos com diarréia aguda.

No estudo dos doentes, uma informação relevante constitui a determinação do

enteropatógeno que está mais freqüentemente associado à necessidade de terapia

de hidratação intravenosa e/ou internação, pela gravidade do episódio clínico ou por

falha ou resposta inadequada à terapia de reidratação oral. Este dado é fundamental

visto que, por exemplo, o RV é um agente associado à transmissão nosocomial,

prolongando o tempo de internação dos contatos (Bishop, 1994; Gusmão et al.,

1995; Kapikian et al., 2001). Portanto, o conhecimento da etiologia da diarréia aguda,

no paciente que necessita de internação, possibilitará medidas preventivas seguras

a serem tomadas nas enfermarias, para minimizar o risco da transmissão e os

custos das internações.

Na medida em que a doença diarréica se torna menos freqüente em comunidades

com melhores condições de higiene e de saneamento básico, a prevalência dos

agentes infecciosos bacterianos e dos protozoários reduz, passando a predominar

as diarréias associadas aos vírus (Feachem, 1984; Esrey et al., 1985, O’Ryan, Prado

& Pickering). Então, a determinação da freqüência dos patógenos intestinais

encontrados num primeiro momento poderá servir como indicador de qualidade

sanitária da região de onde provém o caso, para planejamento e medidas de

intervenção mais eficazes no combate à doença diarréica.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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3. OBJETIVOS

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Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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3. OBJETIVOS

3.1. GERAL

Detectar agentes infecciosos (bactérias, vírus e protozoários) associados à diarréia

aguda em crianças de até três anos de idade, atendidas no PS do Hospital Infantil

Nossa Senhora da Glória (HINSG), em Vitória – ES, e investigar aspectos clínico-

epidemiológicos associados.

3.2. ESPECÍFICOS

3.2.1. Detectar a presença dos agentes bacterianos patógenos ou possivelmente

patógenos associados à diarréia aguda: Escherichia coli enteropatogênica típica e

atípica (EPEC), enterotoxigênica (ETEC), enteroinvasora (EIEC), enteroagregativa

(EAEC), de adesão difusa (DAEC) e enterohemorrágica (EHEC); Shigella (S.

flexneri, S. boydii, S. sonnei e S. dysenteriae) e Salmonella spp;

3.2.2. Detectar antígenos de RV em suspensão fecal por ensaio imunoenzimático e

seu ácido nucleico por eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) e antígenos de

Ad em suspensão fecal por ensaio imunoenzimático;

3.2.3. Detectar antígenos de Giardia lamblia, de Entamoeba histolytica e de

Cryptosporidium spp. em suspensão fecal por ensaio imunoenzimático;

3.2.4. Investigar os principais sinais e sintomas e fatores sócio-demográficos

associados aos diferentes grupos dos patógenos intestinais encontrados.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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4. MATERIAL E MÉTODOS

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Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. TIPO DE ESTUDO E LOCAL

Foi feito um estudo descritivo dos casos de diarréia aguda em crianças até três anos

de idade atendidos durante 17 meses consecutivos no Pronto Socorro (PS) do

hospital pediátrico, Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória (HINSG), situado em

Vitória – ES. O HINSG é um hospital de referência da rede estadual do Serviço

Único de Saúde (SUS), que alberga uma residência médica em Pediatria, atendendo

aos municípios da Grande Vitória, assim como a outros municípios do Estado do

Espírito Santo, do Sul da Bahia e do Sudeste de Minas Gerais. Todas as crianças

são atendidas no Setor de Triagem do PS do referido hospital e, quando necessário,

encaminhadas aos diferentes serviços para observação ou esclarecimento

diagnóstico. No período do estudo, foi realizada uma média de 7200 atendimentos

mensais e o diagnóstico de diarréia aguda, associada ou não a vômitos, variou de

118 a 670 casos mensais, nos menores de três anos (Gráfico 1).

Gráfico 1: Número total de consultas por gastrenterite aguda e de amostras fecais obtidas de

crianças menores de três anos atendidas no Pronto Socorro do HINSG no período de 2003 a

2004

100

200

300

400

500

600

700

800

jan/03

fev/03

mar/03

br/03

i/03

jun/03

jul/

ago/03

set/03

nov/03

/03

jan/04

fev/04

abr

/04

mai/04

jun/04

n de crianças < 3 anos

n de amostras colhidas

Diarréia Aguda amostras colhidas

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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4.2. AMOSTRAGEM

Durante quatro dias da semana, em períodos alternados de quatro horas (matutinos

e vespertinos), as crianças triadas que apresentavam como queixa principal a

diarréia, eram direcionadas para entrevista e coleta das fezes, após consentimento

livre e esclarecido. A obtenção de todas as informações sócio-demográficas e o

procedimento da coleta foram realizados pela investigadora.

O estudo foi feito no período entre fevereiro de 2003 e junho de 2004. Foram usados

os seguintes critérios de inclusão: crianças de ambos os sexos, com idade

compreendida entre zero e três anos, acometidas de diarréia e/ou disenteria por um

período inferior a 15 dias. Foram excluídas aquelas com diarréia persistente ou

crônica. Não foram colhidas amostras de pacientes internados. Nos casos em que a

criança fazia uso de antimicrobiano, a pesquisa de patógenos bacterianos foi

excluída. Foram selecionados 253 casos sendo 11 destes, crianças entre 36 a 48

meses.

Foram obtidas 78 amostras de crianças sem diarréia, selecionadas como controles,

colhidas neste mesmo hospital sendo colhidas um total de 331 amostras. Esse grupo

controle foi utilizado especialmente para avaliar a ocorrência de algumas categorias

de E. coli supostamente diarreiogênicas (EPEC atípica, EAEC e DAEC) (Figura 1).

4.3. COLETA DOS DADOS CLÍNICOS E EPIDEMIOLÓGICOS

Após explicação dos objetivos da pesquisa ao responsável pela criança e a obtenção

da autorização assinada para a coleta do material e dos dados clínico-

epidemiológicos, foi feito o preenchimento de uma ficha com informações sócio-

demográficas e uma anamnese direcionada para fatores de risco para diarréia, sinais

e sintomas associados à diarréia e a terapêutica inicial após seu atendimento (Anexo

2).

Das 253 crianças estudadas, em 20 casos não foi possível ter esta ficha preenchida.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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4.4. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa, do Centro Biomédico,

Universidade Federal do Espírito Santo, em 23 de maio de 2003 (Anexo 1).

Este estudo possibilitou um trabalho de orientação aos familiares das crianças

participantes sobre higiene na alimentação e de utensílios oferecidos à criança, bem

como o reconhecimento precoce de sinais de desidratação, uso de soro de

reidratação oral e tipo de alimentação a ser oferecida durante o quadro de diarréia

aguda, segundo recomendações da OMS (OMS, 2002).

4.5. COLETA, ARMAZENAMENTO E PROCESSAMENTO DAS FEZES

As amostras fecais foram colhidas após eliminação espontânea imediata ou por

estímulo com sonda retal de polivinil de números seis a dez, fracionando o material

conforme se segue: i) fezes “in natura” em recipiente plástico apropriado com tampa

de rosca, para a pesquisa de vírus e de protozoários; ii) em meio de transporte Cary-

Blair para isolamento de enteropatógenos bacterianos (E. coli, Shigella, Salmonella);

iii) em caldo de enriquecimento selenito para enteropatógenos Shigella e Salmonella.

Estes dois últimos foram mantidos à temperatura ambiente (TA), enquanto a primeira

fração permanecia em recipiente térmico mantido a 4ºC, até seu congelamento a -

20º C (Figura 1). As amostras fracionadas foram levadas ao laboratório ao final do

período de coleta e preparadas para as análises microbiológicas e parasitológicas

(Figura 2, Anexo 6). Os meios de cultura e soluções usadas estão descritas no

Anexo 5.

Figura 1: Distribuição das 331 amostras fecais colhidas de acordo com seu fracionamento

para detecção dos enteropatógenos

(

)

(

)

(

)

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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4.5.1. Detecção de Bactérias

A amostra fecal foi processada no laboratório em um período sempre inferior a oito

horas após a coleta em 253 casos de crianças com diarréia aguda e 78 casos sem

diarréia. Foram excluídas 12 amostras das crianças com diarréia aguda para

pesquisa de bactérias por estarem em uso de antimicrobiano (Figura 2).

A amostra preservada em meio de transporte Cary-Blair foi semeada em meios de

cultura diferenciais de baixa seletividade (Ágar MacConkey) para isolamento de E.

coli, e de média seletividade (Ágar SS) para isolamento de Shigella e de Salmonella.

O caldo de enriquecimento selenito foi incubado por 12 a 18 h à 37ºC para favorecer

o isolamento de Salmonella spp e Shigella spp e, posteriormente, semeado em Ágar

SS ou em XLD (Xilose-Lisina-Desoxicolato), seletivos e diferenciais. As placas foram

incubadas por 24 a 48 h a 37ºC. Todos os procedimentos de incubação foram

realizados em incubadora bacteriológica.

Figura 2: Sumário dos procedimentos realizados para detecção bacteriana nas 331 amostras

colhidas

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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4.5.1.1. Caracterização bioquímica e identificação de enterobactérias

4.5.1.1.1. E. coli

Colônias lactose positivas (Lac +), sugestivas de E. coli, e lactose negativas (Lac -)

com ou sem H

S, sugestivas de EIEC, de Shigella ou de Salmonella, foram

selecionadas de cada amostra para identificação bioquímica presuntiva dos gêneros

bacterianos, através dos testes de motilidade, produção de indol, descarboxilação de

lisina, metabolização de citrato, desaminação de fenilalanina, fermentação de

dextrose, lactose e/ou sacarose, produção de gás a partir de glicose e produção de

Quando necessário, testes bioquímicos complementares como a descarboxilação

dos aminoácidos arginina e ornitina foram utilizados na elucidação do gênero

bacteriano.

E. coli Lac + e Lac – foram caracterizadas bioquimicamente como do grupo

enteropatogênica clássica (EPEC) ou enteroinvasora (EIEC), respectivamente,

através de anti-soros polivalentes (PROBAC do Brasil) de acordo com instruções do

fabricante, descritas a seguir: suspensão bacteriana foi realizada em solução salina

(turvação compatível com a escala nº. 2 de Mac Farland, aproximadamente 6 x 10

UFC/mL) e fervida por uma hora. Vinte e cinco microlitros da suspensão fervida

foram homogeneizados em lâmina, separadamente, com 25 µl de anti-soros

polivalentes A, B e C para EPEC (colônias Lac +) ou polivalentes A e B para EIEC

(colônias Lac -) (Quadro 1). Reação de aglutinação foi observada com 30 s. a um

min. Controle negativo da reação foi realizado omitindo-se o anti-soro e adicionando-

se igual volume de salina. Reação era considerada positiva quando a aglutinação na

lâmina era positiva com algum dos anti-soros e não com a salina.

Cinco colônias Lac + e duas Lac - de E. coli foram preservadas em ágar nutriente

para posterior caracterização de todos os tipos diarreiogênicos através dos testes de

hibridização com sondas genéticas radioativas para detecção de genes de virulência

de EPEC, ETEC, EHEC, EAEC, EIEC e DAEC no Laboratório de Microbiologia –

Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) pela Dra. Isabel Cristina Scaletsky

(Quadro 2 e Anexo 6).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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Quadro 1. Anti-soros utilizados na confirmação e/ou triagem de bactérias patógenas

intestinais

GÊNERO E / OU

ESPÉCIE

SOROGRUPOS / SOROTIPOS ANTI-SOROS

O26, O55, O111, O119 Polivalente A

O114, O125, O142, O158 Polivalente B

E. coli (EPEC)

Polivalente C

E. coli (EIEC)

O86, O126, O127, O128

O28ac, O29, O136, O144, O152

O112ac, O124, O143, O164, O167

Polivalente A

Polivalente B

Shigella

S. flexneri

1, 2, 3, 4, 5, 6 e variantes X e Y

Polivalente

S. boydii 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 14

8, 9, 10, e 11

7, 12, 13 e 15

Polivalente 1

Polivalente 2

Polivalente 3

S.sonnei I e II Polivalente

S. dysenteriae

1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7

8ab, 8ac, 9 e 10

Polivalente 1

Polivalente 2

Salmonella A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3, E4, Vi Polivalente O

Quadro 2. Sondas genéticas específicas para as categorias de DEC

Patotipo de E. coli Especificidade da sonda

EPEC Plasmídio EAF*; Gene eaeA*

DAEC Gene daaC

EAEC EAEC (pAA)

EHEC

EHEC (Adesão)

♣

; Stx1

†

; Stx2

†

ETEC LT***; STp

; STh

EIEC Inv

*EAF = Fator de adesão da EPEC; eaeA = gene responsável pela codificação da intimina,

proteína de membrana relacionada à lesão attaching and effacing (A/E) promovida pela EPEC.

daaC = gene associado à biogênese da F1845, adesina fimbrial da adesão difusa;

pAA = plasmídio relacionado à adesão agregativa;

♣

Adesão = plasmídio pO157, onde está

localizado o gene responsável pela síntese da enterohemolisina de EHEC;

†

Stx = citotoxina

“Shiga-like toxin”; ***LT toxina termolábil;

STp e STh toxinas termoestável de porco e

humana, respectivamente;

Inv fragmento isolado do plasmídio de invasão da EIEC (pInv).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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4.5.1.1.2. Shigella e Salmonella

Nos casos de suspeita do isolamento de Shigella ou de Salmonella através das

provas bioquímicas descritas anteriormente, a confirmação do gênero foi obtida

através do uso de anti-soros polivalentes (PROBAC do Brasil) (Quadro 1). No caso

da Shigella, além de confirmação do gênero, foi também possível a determinação da

espécie isolada: S. sonnei, S. flexneri, S. boydii e S. dysenteriae. Nos casos de

suspeita de Salmonella, era utilizado o anti-soro polivalente para antígeno somático

O (PROBAC do Brasil) (Quadro 1). A reação sorológica foi realizada como a

anteriormente descrita, porém, nestes casos, a suspensão bacteriana não foi fervida.

As amostras identificadas como Salmonella foram enviadas para o Laboratório do

Centro de Referência de Enterobactérias da Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ –

RJ, sob a chefia de Dra. Dália dos Prazeres Rodrigues, para determinação do

sorotipo.

4.5.2. Detecção de vírus

As fezes in natura foram preservadas à temperatura de – 20

C para detecção dos

agentes infecciosos virais RV e Ad.

4.5.2.1. Preparo de suspensões fecais

Foram preparadas suspensões fecais a 10% em tampão Tris/Cálcio (0.01M/0,015M),

centrifugadas a 2000 xg a 4ºC por 20 min. O sobrenadante foi coletado e

armazenado à temperatura de – 20ºC até realização dos procedimentos de detecção

antígenos virais pelo Ensaio Imunoenzimático para RV e Ad (EIERA,

Biomanguinhos, FIOCRUZ) e de extração de RNA para EGPA para identificação de

RV. Todas as soluções utilizadas estão descritas no Anexo 5.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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4.5.2.2. Ensaio Imunoenzimático para RV e Ad (EIERA)

Foram submetidas 147 amostras fecais à detecção de antígenos de RV e de Ad.

Os antígenos virais (RV e Ad) na suspensão fecal preparada conforme descrito

anteriormente, foram detectados através do kit EIERA, desenvolvido por

Biomanguinhos, FIOCRUZ-RJ, conforme instruções do fabricante. Este ensaio

imunoenzimático consiste no método de sanduíche duplo de Anticorpos (Ac), em que

os antígenos são capturados em fase sólida por Ac contra Rv ou Ad de soros

hiperimunes de cabras. A detecção da reação se faz através da adição de conjugado

anti-imunoglobulina contra RV ou Ad (de cobaia) marcado com peroxidase, que é

evidenciada com o cromógeno tetrametilbenzidina (TMB). O composto de coloração

azul turquesa se torna amarelo após a adição do ácido sulfúrico, quando os

antígenos virais estão presentes. Portanto, amostras negativas para RV e Ad não

apresentam coloração amarela e as amostras positivas, coloração amarela

nitidamente intensa, na diluição ¼ ou ainda densidade ótica (DO) significativamente

2X mais elevada do que a dos controles. As amostras identificadas como negativas

através da DO apresentam menos que 0,05 do valor zerado (após subtração do

valor da DO do controle negativo) e, as positivas com DO maior ou igual a 0,05 do

valor zerado (após subtração do valor da DO do controle negativo).

4.5.2.3. Extração de RNA

As suspensões fecais foram submetidas ao método de extração de ácido nucleico

descrito por Boom et al. (1990), com algumas modificações, conforme descrito a

seguir: em 200 µL da suspensão fecal foram adicionados 800 µL de tampão L6,

homogeneizados e incubados à temperatura ambiente (TA) para lise celular e

dissociação da nucleoproteína viral. A seguir, foram acrescentados 10 µL de sílica,

homogeneizados e centrifugados a 12000xg/30 s. e os sobrenadantes descartados

em NaOH 10 M (para neutralizar o isotiocianato de guanidina presente no tampão

L6). Adicionou-se então (1) 500 µL de tampão L2 seguido de homogeneização e

centrifugação (12000xg/30 s.); (2) 500 µL de etanol 70% (gelado) seguido de

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

homogeneização e centrifugação (12000xg/30 s.); (3) 500 µL de acetona P.A.

(gelada) e seguido de homogeneização e centrifugação (12000 xg/30 s.). O

sobrenadante foi descartado após cada centrifugação. A seguir, incubou-se em

banho Maria (BM) a 56ºC por 5 min. para evaporação completa da acetona. Foram

adicionados 50 µL de H

O Milli Q, homogeneizados e incubados em banho-maria

56ºC por 15 min. para eluição do RNA de dupla fita. As suspensões foram

homogeneizadas e centrifugadas (12000xg/3 min.). Aproximadamente 40 µL do

sobrenadante foi coletado e estocado a – 20ºC até ser utilizado no procedimento

seguinte.

4.5.2.4. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (EGPA)

A detecção de RV e a determinação de seus eletroferotipos foram realizadas

conforme descrito na literatura (Pereira et al., 1983) em 230 amostras fecais (Grupo

III). O RNAdf extraído foi submetido a uma eletroforese vertical em gel de

poliacrilamida composto por um gel concentrador (4%) e um separador (7,5%). Após

a eletroforese, o gel foi corado pelo método de impregnação pela prata e o perfil

eletroforético visualizado em negatoscópio, de acordo com Herring et al. (1982).

4.5.3. Detecção de protozoários

As fezes in natura foram preservadas a – 20

C para detecção de antígenos dos

protozoários Cryptosporidium, E. histolytica e G. lamblia, que foi realizado em 88

amostras fecais (Grupo I).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

4.5.3.1. Ensaio Imunoenzimático para Cryptosporidium, E. histolytica e G. lamblia

(EIE)

O método imunoenzimático para detecção de antígenos destes protozoários foi

aplicado em 88 amostras fecais de crianças com diarréia aguda, escolhidas

aleatoriamente dentre as 147 que foram submetidas à pesquisa de RV e Ad (Grupo

II), com o kit comercial ProSpecT Ensaio Imunoenzimático para E. histolytica,

Cryptosporidium e G. lamblia em Microplaca (Alexon Inc.- Biobrás diagnósticos)

segundo as instruções do fabricante. Este ensaio consiste no método de sanduíche

duplo de Ac, com detecção qualitativa de antígenos específicos da E. histolytica; do

Cryptosporidium (CSA) e da Giardia (GSA 65), respectivamente. As suspensões

fecais, adequadamente diluídas, foram colocadas em unidades da microplacas

contendo os anticorpos de captura do antígeno (soro hiperimune de cabra) dos

respectivos protozoários. A reação completa-se através da adição de conjugado anti-

imunoglobulinas de cobaia marcado com peroxidase, evidenciada com o TMB. O

composto formado, de coloração azul turquesa, se torna amarelo após a adição do

ácido sulfúrico se os antígenos virais estiverem presentes. As amostras identificadas

como negativas apresentam DO menor que 0,05 do valor zerado (após subtração do

valor da DO do controle negativo) e positivas com DO maior ou igual a 0,05 do valor

zerado (após subtração do valor da DO do controle negativo).

4.5.4 Detecção de mais de um enteropatógeno nas amostras fecais

Para análise das diferentes categorias de enteropatógenos e suas associações, as

amostras foram distribuídas em quatro grupos conforme agente etiológico

pesquisado e metodologia (Figura 3):

i) Grupo I = 88 amostras fecais nas quais foi realizada pesquisa de bactérias,

de antígenos virais (RV e Ad) e de protozoários;

ii) Grupo II = 147 amostras fecais nas quais foi realizada pesquisa de

bactérias e de antígenos virais de RV e Ad;

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

iii) Grupo III = 230 amostras nas quais foi realizada a detecção de bactérias e

detecção do ácido nucléico do RV;

iv) Grupo IV = 78 amostras controles, crianças sem diarréia nas quais foram

detectadas bactérias e ácido nucléico do RV.

Os Grupos I e II correspondem a subgrupos do Grupo III e são constituídos de

material clínico obtido no período de fevereiro a setembro de 2003.

Figura 3: Distribuição dos casos de diarréia aguda e sem diarréia de acordo com a pesquisa

simultânea de enteropatógenos

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todos os dados foram inseridos no programa estatístico SPSS 10.0. A estatística

descritiva foi realizada das variáveis quantitativas representadas por média, desvio

padrão, mediana, valores mínimo e máximo. As variáveis qualitativas foram

estudadas pela freqüência absoluta e frequência relativa (%) e, quando necessário,

realizadas comparações de freqüências pelos testes de Qui - quadrado (x

) ou exato

de Fisher. Todas as estatísticas foram expressas com os respectivos intervalos de

confiança a 95%.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

5. RESULTADOS

__________________________________________________________

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

5. RESULTADOS:

5.1. DADOS DEMOGRÁFICOS DA AMOSTRA ESTUDADA

As crianças atendidas no PS do HINSG, que fizeram parte deste estudo, procediam

predominantemente de três municípios que formam a região Metropolitana de

Vitória: Serra (37%), Vitória (26,9%) e Cariacica (21,4%). Os demais casos (14,6%)

foram provenientes de outros municípios deste estado ou de estados adjacentes

(Figura 4).

* Outros municípios ou estados

Figura 4: Mapa da região metropolitana da Grande Vitória demonstrando a localização dos

municípios que a compõem: Vitória, Vila Velha, Serra, Cariacica e Viana com o respectivo

número de amostras colhidas

= 88

= 11

= 51

= 64

Outros*= 18

= 6

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Das 253 crianças estudadas, 153 eram do sexo masculino (60,5%) e 100, do sexo

feminino (39,5%). A média de idade foi de 13,6 meses (DP: 10,7 m), mediana de 11

meses. A estratificação das idades mostrou que 76,7% tinham menos que 18 meses

de idade (Gráfico 2).

Gráfico 2: Distribuição da idade das crianças com diarréia aguda estudadas. Estão

representados os percentis 25 (6 meses) e 75 (18 meses) e a mediana de 11 meses

253N =

crianças com diarréia aguda

SIM

idade em meses

-10

16624025318234

156

164

182128

140

179

94225

180

A média de idade paterna foi de 30,1 anos (DP= 12,3) e a materna, 24,8 anos (DP=

5,9). Quanto à instrução, 69% (126/183) dos pais e 60,2% (132/219) das mães têm

ensino fundamental completo ou parcialmente completo. Com relação à moradia,

86,5% dos entrevistados residiam em casas de alvenaria e quase todos tinham

acesso à água potável (97,8%). Havia relato de rede de esgoto nas casas de 69%

(158/229) dos entrevistados e 40,7% não tinham filtro. Cento e dois entrevistados

possuíam pelo menos um animal doméstico (44,7%) cuja maior freqüência foi de

cão, isoladamente (17,8%) ou associado a outros animais (26,5%).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

A grande maioria das mães (222/230) realizou pré-natal durante a gestação das

crianças estudadas, com relato de 13% (30/230) de prematuridade. Vinte e oito

casos (12,3%) tiveram peso de nascimento menor que 2500 g. Não houve diferença

estatisticamente significante comparando às crianças prematuras com as nascidas a

termo e aquelas com peso menor ou igual a 2500g, comparando-as com peso

superior a 2500 g quando relacionamos a presença ou ausência de diarréia (p = 0,17

e p = 0,06, respectivamente).

Em 50,6% (118/233) das crianças foi o primeiro relato de diarréia enquanto que

49,4% tinham apresentado dois ou mais episódios anteriores. Outras doenças, que

não a diarréia, ocorreram em 26,1% dos casos, sendo pneumonia e refluxo

gastresofágico, as mais freqüentes. Apenas 18,8% das crianças com diarréia

freqüentavam creches.

Com relação à história alimentar, 37,1% (62/167) das crianças com idade superior a

seis meses realizaram aleitamento materno exclusivo até o sexto mês de vida. Do

total de crianças estudadas, 56% (128/229) receberam outros leites (exclusivamente

ou associados ao leite materno) ou alimentos complementares após três meses de

idade. O leite materno não foi oferecido em 14,8% (34/229) (Gráficos 3 e 4).

Com relação a hábitos específicos, 67,8% (156/230) utilizavam a mamadeira para

oferecimento de outros alimentos (suco, chás, água ou leite). O uso de chupetas foi

referido em 42,8% das crianças. O preparo dos alimentos foi imediato em 89,9% dos

casos.

Gráfico 3: Tempo de aleitamento materno exclusivo nas crianças com diarréia aguda

15%

41%

Não houve 0 a 3 m 4 a 6 m > 6 m

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Gráfico 4: Época de introdução de outros alimentos (leites e alimentos sólidos) nos primeiros

seis meses de vida das crianças com diarréia aguda

0,8

40,9

15,2

30,6

26,6

36,7

6,1

0 10 20 30 40 50

< 3 m

3 - 6 m

> 6 m

Não houve

Época da Introdução de outros alimentos

(meses)

% do total

Sólidos

Outros leites

A procura de atendimento médico ocorreu em média de 3,6 dias (DP: 3,1 dias) após

o início da diarréia. Cerca de 90% dos pacientes compareceram ao PS nos primeiros

sete dias da doença.

Evacuações líquidas ocorreram em 83,8% (201/240) dos casos, relato da presença

de sangue em 14,6% (35/239) e de muco em 55,2% (132/239) (Tabela 1). Apenas

12,6% referiram contactantes com sintomas semelhantes. Diagnóstico de

desidratação ocorreu em 42,4% (101/238) dos casos, embora terapia de reposição

hidreletrolítica intravenosa (IV) tivesse sido realizada em 55,5% (106/238), em

decorrência da associação com vômitos incoercíveis.

A Tabela 1 mostra bactérias, vírus e protozoários identificados conforme o grupo

pesquisado, sua frequência isolada ou em associação, de acordo com a faixa etária,

alguns fatores de risco para doença diarréica, os principais sintomas e número de

crianças que evoluiram para terapia de hidratação IV.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Tabela 1a: Prevalência de enteropatógenos por grupos, identificados isoladamente ou

associados, em crianças com diarréia aguda, de acordo com algumas variáveis relacionadas

com a idade, hábitos e condições de vida, alguns sinais e sintomas e terapia de hidratação

intravenosa (IV). Grupo I – os três agentes pesquisados

Grupos de enteropatógenos identificados

Variáveis

Grupo I (n = 88)

n (%)

B RV e Ad P B+V+P

< de 1 ano 21 (60) 28 (55) 9 (34,6) 16 (50)

Prematuridade 6 (17,1) 8 (15,7) 5 (20) 6 (18,8)

Não recebeu LM * 4 (11,4) 8 (15,7) 3 (11,5) 6 (18,8)

Saneamento básico 35 (100) 50 (98) 17 (68) 32 (100)

Presença de filtro 27 (77,1) 28 (55) 10 (45,5) 21 (65,6)

Febre 28 (80) 41 (80) 20 (76,9) 25 (78,1)

Vômitos 30 (85) 50 (98) 23 (88,5) 31 (97)

Sintomas respiratórios 20 (57,1) 31 (60,8) 13 (50) 20 (62,5)

Sangue nas fezes 6 (17,1) 7 (13,7) 4 (15,4) 5 (15,6)

Desidratação 16 (45,7) 23 (45,1) 13 (50) 16 (50)

Terapia IV 17 (48,6) 27 (52,9) 12 (46,2) 16 (50)

N total de casos 35 (39,8) 51 (58) 26 (10,3) 32 (36,4)

* LM = leite materno ; B = bactérias V = vírus P = protozoários;

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Tabela 1b: Prevalência de enteropatógenos por grupos, identificados isoladamente ou

associados, em crianças com diarréia aguda, de acordo com algumas variáveis relacionadas

com a idade, hábitos e condições de vida, alguns sinais e sintomas e terapia de hidratação

intravenosa (IV). Grupo II – bactérias, RV e Ad (EIERA) pesquisados

Grupos de enteropatógenos identificados

Variáveis

Grupo II (n = 147)

n (%)

B RV Ad B + V

< de 1 ano 33 (54,1) 44 (59,5) 5 (41,7) 18 (54,5)

Prematuridade 12 (19,7) 12 (16,2) 2 (16,7) 9 (27,3)

Não recebeu LM * 9 (14,8) 10 (13,5) 0 (0) 6 (18,2)

Saneamento básico 59 (96,7) 71 (96) 12 (100) 32 (97)

Presença de filtro 39 (63,9) 42 (56,8) 7 (58,3) 26 (78,8)

Febre 45 (73,8) 54 (73) 7 (58,3) 24 (72,7)

Vômitos 54 (88,5) 73 (98,6) 12 (100) 32 (97)

Sintomas respiratórios 31 (50,8) 38 (51,4) 4 (33,3) 16 (48,5)

Sangue nas fezes 9 (14,8) 9 (12,2) 1 (8,3) 4 (12,1)

Desidratação 24 (72,7) 34 (46) 4 (33,3) 13 (39,4)

Terapia IV 25 (40,9) 36 (48,6) 4 (33,3) 14 (42,4)

N total de casos 61 (41,4) 74 (50,3) 12 (8,2) 33 (22,5)

* LM = leite materno ; B = bactérias V = vírus P = protozoários;

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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Tabela 1c: Prevalência de enteropatógenos por grupos, identificados isoladamente ou

associados, em crianças com diarréia aguda, de acordo com algumas variáveis relacionadas

com a idade, hábitos e condições de vida, alguns sinais e sintomas e terapia de hidratação

intravenosa (IV). Grupo III – Bactérias e RV (GEPA) pesquisados

Grupos de enteropatógenos identificados

Grupo III (n= 230)

n (%)

Variáveis

B RV B + RV

< de 1 ano 44 (50) 46 (56,8) 16 (51,6)

Prematuridade 17 (19,3) 10 (12,4) 8 (25,8)

Não recebeu LM * 17 (19,3) 15 (18,5) 6 (19,4)

Saneamento básico 82 (93,2) 77 (95,1) 29 (93,5)

Presença de filtro 65 (73,9) 46 (56,8) 25 (80,6)

Febre 62 (70,5) 61 (75,3) 22 (71)

Vômitos 76 (86,4) 78 (96,3) 30 (96,8)

Sintomas respiratórios 46 (52,3) 45 (55,6) 17 (54,8)

Sangue nas fezes 12 (13,6) 8 (9,9) 3 (9,7)

Desidratação 35 (40) 40 (49,4) 13 (42)

Terapia IV 36 (41) 41 (50,6) 14 (45,2)

N total de casos 88 (38,2) 81 (35,2) 31 (13,5)

* LM = leite materno ; B = bactérias V = vírus P = protozoários;

5.2. AGENTES INFECCIOSOS PESQUISADOS NA AMOSTRA ESTUDADA

Bactérias patógenas (EPEC típica, ETEC, EHEC, EIEC, Shigella ou Salmonella) ou

possivelmente patógenas (EPEC atípica, EAEC e DAEC), vírus ou protozoários

foram encontrados em 83% dos casos pesquisados (73/88) com diarréia aguda que

fazem parte do Grupo I; enquanto que, foram encontrados em 72,1% dos casos do

Grupo II (106/147) e em 60% do Grupo III (138/230).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

5.2.1. Bactérias

Dos 253 casos de diarréia aguda, foram excluídos 12 para pesquisa de bactérias

porque as crianças estavam em uso de antibiótico e/ou quimioterápico (Figura 2,

Anexo 4). As bactérias patógenas ou possivelmente patógenas, foram detectadas

em 41,5% (100/241). Excluindo as categorias de DEC ainda controversas como

agentes etiológicos de diarréia aguda (EPEC atípica, EAEC e DAEC), as bactérias

foram detectadas em 10% (24/241) dos casos (Tabela 1).

5.2.1.1. E. coli diarreiogênica (DEC)

E. coli foi isolada em 219 dos 241 casos de diarréia aguda estudados para bactérias.

Uma a cinco colônias com testes bioquímicos compatíveis com E. coli foram

submetidas à reação sorológica para determinação dos sorogrupos e a testes de

hibridização para pesquisa de genes de virulência.

5.2.1.1.1. Sorologia para DEC

A reação sorológica utilizando anti-soro policlonal para EPEC detectou nove casos

positivos dos 219 em que a E. coli foi isolada (4,1%), representando 3,7% do total de

casos estudados (Tabela 2). Um caso aglutinou com o anti-soro polivalente A (O26,

O55, O111 e O119), oito com o anti-soro polivalente B (sorogrupos O114, O125,

O142 e O158), e nenhum com anti-soro polivalente C (O86, O126, O127, O128).

A pesquisa de EIEC, realizada nas colônias Lac (-) que foram negativas para

Shigella, foram também negativas para esta categoria de E. coli (Tabela 2).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Os sorogrupos de DEC, pesquisados com uso de anti-soros monoclonais para

determinação do antígeno somático O, revelaram dez casos positivos para seis

sorogrupos de E. coli assim distribuidos: O26 e O142 (um caso de cada) e O55,

O119, O125, O128 (dois casos de cada). Dentre estes sorogrupos encontrados,

apenas uma amostra O55 e uma O142 apresentaram positividade na pesquisa com

anti-soros policlonais.

5.2.1.1.2. Testes de Hibridização para pesquisa de genes de virulência de DEC

Os testes de hibridização para pesquisa de genes de virulência de DEC de colônias

Lac (+) e/ou Lac (–) (Figura 5

A-D) foram realizados em 219 casos de crianças com

diarréia aguda, sendo detectadas em 90 destes (41,1%) (Anexo 4, Tabela 2). Houve

amostras fecais em que mais de uma DEC foi detectada.

Figura 5: A) Agar McConkey com col. Lac(+) e Lac (-) de E. coli; B) Transferência das

colônias Lac (+) e Lac (-) para membrana de nitrocelulose; C) Membrana de nitrocelulose

com amostras positivas e negativas para fermentação de lactose. Sequência superior e

inferior correspondem, respectivamente, a filtros não tratados e tratados com solução de lise

bacteriana; D) Hibridização em membrana após revelação. Resultado positivo com sonda

genética para o plasmídio EAF (EPEC típica) pode ser observado em duas amostras no

disco central inferior. Controle positivo e negativo para a referida sonda se encontra no

quadrado central. Fotos obtidas no Laboratório de Microbiologia da Dra. Isabel C. Scaletsky

(UNIFESP).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Foram detectados 20 casos positivos para EPEC (9,1%) através de testes de

hibridização para genes de virulência. A presença dos genes eae (intimina) e bfp

(plamídio EAF), identificados em dois casos de EPEC, caracterizou a EPEC típica

(0,9%) (Figura 5C); enquanto que os demais casos foram caracterizados como

EPEC atípicas (8,2%) pela ausência do plasmídio EAF (Tabela 2).

Dos dez casos em que os sorogrupos de DEC foram determinados com anti-soros

monoclonais (descritos anteriormente), genes de virulência foram detectados em

sete casos. Dos dois casos de O55, um foi caracterizado como EPEC típica e outro

como EPEC atípica. Dois casos de O119, assim como um de O26 e um de O142,

foram identificados como EPEC atípica; enquanto um caso, dos dois do sorogrupo

O128, foi caracterizado como DAEC. Nos demais sorogrupos (um caso de O128 e

dois de O125) não foram detectados genes de virulência.

Não foram encontradas cepas de EHEC, que são caracterizadas pela presença do

gene eae e de genes para STx1 e/ou Stx2 (Tabela 2).

A EIEC foi identificada em dois casos (0,9%) através da detecção do gene inv

(Tabela 2).

A ETEC foi caracterizada em 4,1% dos pacientes (9/219) com diarréia aguda, todas

as cepas contendo genes para a produção da toxina LT e uma, também o gene para

a toxina ST (Tabela 2). Houve associação da ETEC com outros grupos de agentes

infecciosos em seis casos: três com o RV (um destes também com Salmonella), dois

com G. lamblia e um com S. sonnei.

As DEC caracterizadas como DAEC e EAEC de crianças com diarréia aguda

estiveram presentes em 20,6% e 9,1%, respectivamente, e estavam em associação

com dois ou mais enteropatógenos em 48,9% (22/45) e 50% (10/20)

respectivamente.

De 78 crianças sem diarréia (Grupo IV), a E. coli foi caracterizada bioquimicamente

em 68 amostras fecais, que foram submetidas à pesquisa de genes de virulência

através de hibridização. Trinta e uma (45,6%) DEC foram encontradas, assim

distribuídas: EPEC atípica em 10,3%, ETEC em 1,5%, EAEC em 20,6% e DAEC em

16,2%. Não foram detectadas EPEC típica, EHEC ou EIEC em nenhum destes

casos (Tabela 2 e Gráfico 5). Houve uma associação de EPEC atípica com DAEC.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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Tabela 2: Agentes patógenos e possivelmente patógenos bacterianos em amostras fecais de

crianças com e sem diarréia aguda e significância estatística

Agente etiológico

Diarréia aguda

% (n encontrado/total)

Sem diarréia

% (n encontrado/total)

Escherichia coli:

EPEC*

EPEC Típica**

EPEC Atípica**

ETEC**

EHEC**

EIEC**

EAEC**

DAEC**

3,7% (9/241)

0,9% (2/219)

8,2% (18/219)

4,1% (9/219)

0,9% (2/219)

9,1% (20/219)

20,6% (45/219)

10,3% (7/68)

1,5% (1/68)

20,6% (14/68)

16,2% (11/68)

0,08

0,27

0,019

0,53

Shigella sp

S. flexneri

S.sonnei

4,6% (11/241)

Salmonella sp. 2,9% (7/241) 0

*Aglutinação em lâmina com soro polivalente

**Ensaio de hibridização para genes de virulência

Não foi observada diferença estatisticamente significante entre bactérias

possivelmente patógenas como EPEC atípica (p = 0,08), e DAEC (p = 0,53) nas

crianças com e sem diarréia. A EAEC foi observada em número estatisticamente

significante nas crianças sem diarréia (p = 0,019).

EPEC típica e EIEC só foram encontradas nas crianças com diarréia.

Analisando a distribuição de DEC nas diferentes faixas etárias, observou-se na

detecção de EAEC uma diferença estatisticamente significante em crianças maiores

de 24 meses, com diarréia aguda (p = 0,026) em relação às sem diarréia. Nas

crianças com DAEC, nenhuma diferença estatisticamente significante (p = 0,41) foi

observada na estratificação das idades das crianças com e sem diarréia, assim

como nas outras categorias de DEC (Tabela 3 e Gráfico 5).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Gráfico 5: Amostras positivas e negativas para diversas categorias de DEC pesquisadas em

crianças com e sem diarréia aguda

Tabela 3: Distribuição de categorias de Escherichia coli (EPEC atípica e típica, ETEC, EAEC

e DAEC) de acordo com a estratificação de idade em crianças com e sem diarréia aguda

Faixa etária (meses)

Categoria de E. coli

0 – 12 13 - 24 > 25 Total

Diarréia Aguda

EPEC típica

EPEC atípica

ETEC

EAEC

DAEC

Sem Diarréia

EPEC típica

EPEC atípica

ETEC

EAEC

DAEC

* p = 0,009

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

5.2.1.2. Shigella e Salmonella

Através de reações sorológicas, Shigella e Salmonella foram detectadas em 4,6%

(11/241) e em 2,9% (7/241) dos casos, respectivamente. Nestes casos, quando

colônias Lac+ compatíveis bioquimicamente com E. coli estavam presentes (dez das

onze amostras positivas para Shigella e cinco das sete para Salmonella), as

amostras também foram submetidas à pesquisa de DEC por testes de hibridização e

todas, à pesquisa de vírus.

A Shigella foi detectada como agente etiológico único em seis casos; em dois,

associada com EPEC atípica (um destes também com DAEC), em dois, com RV (um

com EAEC) e em um, com ETEC. As espécies identificadas foram S. flexneri (7) e S.

sonnei (4) (Tabela 2 e 9).

Dos sete casos onde Salmonella foi detectada, cinco tinham coinfecção: três com RV

(cada um associada à E. histolytica ou à ETEC ou à EAEC e Ad), um com DAEC e

um com EAEC. Três dessas amostras foram sorotipadas no laboratório de

Enterobactérias da FIOCRUZ, como pertencentes à espécie S. enterica, sorotipos S.

Typhimurium, S. Derby e S. enterica subspécie enterica.

Na distribuição por idade dos casos de Shigella e de Salmonella verificou-se que

82% (9/11) dos casos de shigelose ocorreram nas crianças acima de 12 meses (p=

0,006), enquanto que em 42,9% (3/7) dos casos de Salmonella, em menores de seis

meses (Tabela 4). As amostras positivas para Shigella ocorreram no verão e outono,

enquanto aquelas com Salmonella, somente no outono (Gráfico 6).

Tabela 4: Identificação de amostras positivas para Salmonella e Shigella correlacionadas

com a faixa etária de 241 crianças com diarréia aguda

Faixa Etária Shigella Salmonella

0 – 6 m 1 3

6 – 1 ano 1 1

13 a 18 m 1 0

19 a 24 m 4 1

> 25 m 4 2

Total 11 7

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Gráfico 6: Correlação das amostras positivas para RV, Salmonella, Shigella, ETEC, EIEC e

EPEC típica com as estações dos anos de 2003 e de 2004

6 7

VERÃO OUTONO INVERNO PRIMAVERA

RV Salmonella + Shigella + ETEC+ EIEC e EPEC típica

5.2.2. Vírus

Antígenos de RV e de Ad foram pesquisados nas fezes de 148 e de 147 crianças

com diarréia aguda (Grupo II), respectivamente, e o ácido nucléico de RV em 230

amostras (Grupo III) (Anexo 4).

5.2.2.1. EIERA

EIERA para detecção de antígenos de RV e de Ad resultou em 50% e em 8,2% de

positividade, respectivamente. Das 12 amostras que foram positivas para Ad, nove

também foram positivas para RV (Tabela 5).

Tabela 5: Agentes enteropatogênicos virais detectados em amostras fecais de crianças com

diarréia aguda

Agente etiológico % (n /total)

Rotavírus

EIERA*

EGPA

†

Adenovírus*

50 (74/148)

35,2 (81/230)

8,2 (12/147)

* Ensaio imunoenzimático para RV e Ad (EIERA)

†

Eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA)

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

As amostras submetidas ao EIERA foram coletadas de fevereiro a setembro de

2003, onde o número de diarréia aguda foi muito alto no HINSG (Gráfico 7).

Gráfico 7 – Distribuição dos casos positivos para RV (EIERA e EGPA) e de diarréia aguda

nos menores de três anos conforme meses do período estudado

100

200

300

400

500

600

700

v/03

mar/03

br/

mai/03

un/

ago/03

set

nov/

ez/

an/04

/04

mar/

abr/04

mai/04

/04

n de crianças < 3 anos

n de amostras

diagnóstico de diarréia aguda

RV EIERA

RV EGPA

5.2.2.2. EGPA

Duzentas e trinta amostras de crianças com diarréia aguda foram submetidas à

extração de RNA viral, conforme descrito anteriormente, para detecção de RV por

EGPA. O genoma viral foi encontrado em 35,2% (81/230) dos casos (Tabela 5). O

RV foi caracterizado como sendo do grupo A em 81 casos, através do padrão de

migração dos 11 segmentos de RNAdf em EGPA (4-2-3-2). Uma amostra que

apresentou um perfil de bandeamento atípico: a banda cinco desapareceu e migrou

entre as bandas dois e três, apresentando o perfil 5-1-3-2 (Figura 6). Esta cepa foi

caracterizada como do sorogrupo A no Laboratório de Referência em pesquisa de

Rotavírus, da FIOCRUZ-RJ. Os 81 casos detectados apresentaram perfil de

migração longo.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Figura 6: Eletroferotipos de RNAdf do RV após EGPA corado pela impregnação pela prata.

Colunas 1-3, 6: padrão 4-2-3-2; Col.4: amostra negativa; Col. 5: genoma com reestruturação

(5-1-3-2)

Das 78 amostras obtidas de crianças sem diarréia, 72 foram submetidas a EGPA e

uma foi positiva para RV.

O maior número de casos positivos para RV ocorreu nos municípios da Serra e de

Vitória, com 38,3% e 34,6% dos casos, respectivamente, seguidos por Cariacica,

com 16,1% (Gráfico 8).

Dos casos positivos para RV, 91,4% (74/81) foram detectados em pacientes

menores de dois anos, dos quais 56,8% (46/81) tinham menos de 12 meses de vida.

Dos 18 casos positivos em crianças menores de seis meses, um terço estava abaixo

dos três meses. Os Ad não foram encontrados acima dos 24 meses, sem correlação

estatisticamente significante (p = 0,23) (Tabela 6).

1 2 3 4 5 6

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Gráfico 8: Distribuição do número total de amostras colhidas com diarréia aguda e de

amostras positivas para RV de acordo com os municípios.

n de amostras e

% de RV positivo

rra

Vitória

ila

Cariacica

Vian

municípios

Total % de amostras positivas para RV

Tabela 6: Distribuição das amostras positivas para RV e Ad por EIERA (Grupo II) e para RV

por EGPA (Grupo III) de acordo com faixa etária das crianças com diarréia aguda

Vírus

EIERA EGPA

Faixa Etária

n (%)

0 – 6 m 2 (16,7) 17 (23) 18 (22,2)

7 – 12 m 3 (25) 27 (36,4) 28 (34,6)

21 (26) 13 a 18 m

19 a 24 m

6 (50)

1 (8,3)

16 (21,6)

7 (9,5) 7 (8,6)

>25 m 0 7 (9,5) 7 (8,6)

Positivos/Total 12/147 (8,2) 74/148 (50) 81/230 (35,2)

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

O número de casos positivos para RV foi maior durante os meses de março a

setembro de 2003 (64/81) e foi proporcional ao daqueles que apresentaram

diagnóstico de gastrenterite aguda (vômitos associado à diarréia aguda) nos

mesmos meses (Gráfico 7).

Correlação entre alterações climáticas (temperatura e umidade) e a detecção de RV

não foi observada. Após uma redução significativa dos índices pluviométricos,

verificada nos meses de fevereiro de 2003 e 2004, ocorreu um aumento na

positividade destes vírus nas amostras fecais (Gráfico 9).

Gráfico 9: Distribuição mensal dos casos de diarréia aguda positivos para RV e variações da

temperatura média, número de dias de chuva, no período de fevereiro de 2003 a junho de

2004

jan-03

fev-03

-03

r-03

mai

-0

n-0

ul-03

ago-03

et-

nov-03

dez-03

an-

fev-04

mar-

r-04

mai-

un-

meses do ano

temperatura (o.C)

número de dias de chuva e de

amostras positivas

Dias de chuva Temperatura média RV

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

5.2.3. Protozoários

Das 88 amostras fecais submetidas ao ensaio imunoenzimático para detecção de

antígenos de Cryptosporidium spp., E. histolytica e G. lamblia (Grupo I), 26 (29,6%)

foram positivas. Em três amostras, dois ou três protozoários foram detectados

(Tabela 7). Protozoário foi identificado como único agente infeccioso em 9,1% dos

casos (8/88) e a G. lamblia, estava presente em seis destes. Os demais casos foram

encontrados em associação com outros grupos de patógenos (vírus e/ou bactérias)

(Gráfico 10).

Tabela 7: Antígenos de protozoários detectados em 88 amostras fecais de crianças com

diarréia aguda (Grupo I) através do EIE para G. lamblia, E.histolytica e Cryptosporidium spp.

Agente etiológico % (n /total)

Cryptosporidium spp.

Entamoeba histolytica

Giardia lamblia

11,4% (10/88)

8% (7/88)

14,8% (13/88)

A freqüência de Cryptosporidium e E. histolytica foi semelhante nas diferentes faixas

etárias, enquanto que a G. lamblia apresentou uma freqüência estatisticamente

significante (p = 0,021) em crianças maiores de 12 meses (11/13) (Tabela 8).

As associações dos protozoários encontradas com outras categorias de patógenos

intestinais estão descritas a seguir (Gráfico 10).

Tabela 8: Amostras positivas para protozoários de acordo com a faixa etária das 88 crianças

com diarréia aguda (Grupo I)

Faixa Etária

G. lamblia

n = 13

E. histolytica

n = 7

Cryptosporidium

n = 10

0 – 12 m 2 4 4

13 a 24 m 7 2 4

25 a 36 m 3 1 2

> 36 m 1 0 0

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Gráfico 10: Número total de amostras positivas para Cryptosporidium, E. histolytica e

G.lamblia e suas associações com bactérias e vírus (RV e Ad) detectadas nas amostras

fecais de crianças com diarréia aguda

2 2

n de amostras positivas

G. lamblia E. histolytica Cryptosporidium

Associado à Vírus Associado à Bactérias

Associado aos dois Total de Casos positivos

5.2.4. Associações entre bactérias, vírus e protozoários

No Grupo I (n = 88), em que foram pesquisados vírus, bactérias patógenas ou

possivelmente patógenas e protozoários, foram encontradas 32 associações entre

as diferentes categorias de enteropatógenos: 43,8% de bactérias com vírus (14/32),

28,1% de protozoários com vírus (9/32), 21,9% com as três categorias (7/32) e 6,3%

de bactérias com protozoários (2/32) Das 35 bactérias identificadas, nove eram

agentes clássicos de diarréia (EPEC típica, ETEC, Shigella, Salmonella) (Diagrama

1).

Diagrama 1: Associação inter e intracategorias de patógenos detectados em 88 amostras

fecais de diarréia aguda (Grupo I)

Bactéria

Vírus

9 2

Protozoário

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Das 32 associações entre as diferentes categorias, os vírus estiveram presentes em

30 casos (93,8%), seguidos pelas bactérias em 23 (71,9%) e pelos protozoários em

18 (25%). Correlacionando o número de associações e o número total de amostras

positivas por categoria encontradas nas 88 amostras, o maior número de

associações observadas ocorreu nas amostras positivas para protozoários (18/26),

seguidos pelas bactérias (23/35) e pelos vírus (30/52) (Diagrama 1).

Foram observadas 18 associações de protozoários com vírus ou bactérias: sete de

13 casos positivos para G. lamblia, cinco destes associados a agentes virais (quatro

com RV e um com Ad); seis de sete casos de E. histolytica (cinco com RV e um com

Salmonella); oito de dez casos Cryptosporidium, todos com RV. O protozoário que

apresentou maior prevalência isoladamente foi G. lamblia (Gráfico 10).

Associações entre bactérias e vírus (RV e Ad)

No Grupo II, onde RV, Ad e bactérias foram pesquisados, foram encontradas 32

(21,8%) associações entre vírus e bactérias. A maior frequência das associações

encontrada entre bactérias e RV (74,3 %), seguido de bactérias e RV e Ad (14,3%) e

entre RV e Ad (8,6%) (Diagrama 2).

Diagrama 2: Associação entre bactérias, RV e Ad detectados em 147 amostras fecais de

diarréia aguda (Grupo II)

Bactéria

4 1

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

As associações encontradas representam 24,5% (36/147) do total de amostras

fecais positivas com enteropatógeno classicamente descritos como agentes

etiológicos de diarréia aguda em crianças (RV, Ad, EPEC típica, ETEC, Salmonella e

Shigella) ou não (EPEC atípica, EAEC e DAEC).

No grupo III, 230 amostras fecais foram submetidas a EGPA para detecção do RNA

viral, assim como a detecção de bactérias por métodos sorológicos ou

biomoleculares. Dos 138 casos positivos para qualquer dos patógenos pesquisados,

houve associação em 26,1% (36/138) de bactérias patógenas ou possivelmente

patógenas com RV (EGPA) ou entre si. Considerando categorias patógenas e

possivelmente patógenas de DEC, 5,8% (8/138) e 18,1% (25/138), respectivamente,

estiveram associadas ao RV (Diagrama 3).

Diagrama 3: Associação entre bactérias e RV detectados em 230 amostras fecais de diarréia

aguda (Grupo III)

EPEC

típica

ETEC

EIEC

Salmonella

Shigella

EPEC

atípica

DAEC

EAEC

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

5.2.5. Quadro clínico das crianças com diarréia e associação com dados sócio-

demográficos

Dentre os sinais e sintomas observados nas crianças com diarréia aguda, vômitos,

evacuações com aspecto líquido e febre foram os mais encontrados (Tabela 9).

Tabela 9: Sinais e sintomas clínicos das crianças com diarréia aguda

Sinais e Sintomas % (n / total)

Febre 70,6 (168/238)

Vômitos 87 (208/239)

Anorexia 67,8 (162/239)

Dor abdominal (> 6 m) 10,7 (20/187)

Coriza ou tosse 54,6 (130/238)

Evacuações líquidas 83,8 (201/240)

Sangue nas fezes 14,6 (35/239)

Muco nas fezes 55,2 (132/239)

Desidratação 42,4 (101/238)

Nos casos onde as DEC foram detectadas, as principais queixas foram as

evacuações líquidas e os vômitos, seguidos de febre e dor abdominal, que

ocorreram em mais de um terço dos casos. A desidratação foi identificada em 38

casos (43,7%). Considerando somente as categorias detectadas e classicamente

aceitas como patógenas (EPEC típica, ETEC e EIEC), os sinais e sintomas mais

freqüentes foram vômitos, anorexia, dor abdominal e presença de muco nas fezes,

além de uma menor taxa de desidratação (11%) em relação a outros grupos de

enteropatógenos (Tabela 10, Diagrama 3).

Sangue nas evacuações não foi encontrado nos casos de EIEC (Tabela 10).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Nos casos em que Shigella foi isolada, os sintomas mais comuns foram anorexia

(90%) seguida de dor abdominal, febre e vômitos. A procura de atendimento médico

nestes casos ocorreu de um a sete dias do estabelecimento de sintomas. O relato ou

observação de sangue nas fezes ocorreu em três casos (27,3%) nos quais as

crianças estavam no quarto dia do início da diarréia. A desidratação ocorreu em dois

pacientes e evolução para reposição hidreletrolítica intravenosa, em três casos. A

média de idade foi de 27 meses (variou de 6 m até 48 m). Apenas um destes relatou

contato com indivíduo com sintomas semelhantes, apesar de 36,4% destes (4/11)

freqüentarem creches. Todos dispunham de água potável e saneamento básico e

em 54,5% (6/11) destas casas havia filtro. Não houve associação da presença da

bactéria com ausência de aleitamento materno e utilização de mamadeiras e

chupetas.

Os sinais e sintomas mais freqüentes referidos nas crianças onde Salmonella foi

detectada foram vômitos e febre; sangue esteve presente em 42,9% das amostras

fecais. Evolução para desidratação ou hidratação intravenosa ocorreu em três

pacientes (42,9%) sendo um deles em associação com o RV. Estas crianças tinham

de cinco a 36 meses de vida (média 16,6 meses), não havia relato de contato com

indivíduo com sintomas semelhantes e, apenas uma destas, freqüentava creche.

Acesso à água potável e ao saneamento básico ocorreu em 71,4% (5/7) das casas

destes indivíduos e a presença de filtro, em 42,9% (3/7). Dos três casos onde a

Salmonella foi isolada nas crianças com menos de seis meses de vida, todas já

haviam interrompido o aleitamento materno, com introdução precoce de outros leites

e/ou alimentos.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Tabela 10: Sinais e sintomas clínicos das crianças com diarréia aguda em amostras

positivas para Shigella, Salmonella e DEC

Sinais e Sintomas

Shigella

n (%)

Salmonella

n (%)

ETEC, EIEC e

EPEC

típica

n (%)

Febre 8 (72,7) 5 (71,4) 6 (46,1)

Vômitos 8 (72,7) 6 (85,7) 10 (76,9)

Anorexia 10 (90,8) 3 (42,9) 9 (69,2)

Dor abdominal (* > 6 m) 9 (81,8) 1 (25) 8 (61,5)

Coriza ou tosse 7 (70) 2 (28,6) 4 (30,8)

Evacuações líquidas 8 (72,7) 6 (85,7) 7 (53,8)

Sangue nas fezes 3 (27,3) 3 (42,9) 1 (7,7)

Muco nas fezes 6 (54,6) 4 (57,1) 9 (69,2)

Desidratação 2 (18,2) 3 (42,9) 3 (11)

Total de casos 11 7 13

*n positivo pesquisado > 6 m = Shigella 11, Salmonella 4, DEC 71, ETEC e EPEC

típica

13.

Dos 95 pacientes com RV, detectados em amostras submetidas à EGPA e/ou

EIERA, vômito esteve presente em 96,8%, febre em 74,7% e sintomas respiratórios

em 54,7% dos casos. Fezes aquosas ocorreram em 90% dos casos, associadas

com muco em 52,6% e com sangue em 9,5% (9/95). Dos casos onde houve relato

ou visualização de sangue nas fezes, sete (87,5%) apresentavam associação com

outros enteropatógenos: um com EPEC típica e G. lamblia, dois com DAEC, um com

DAEC e Cryptosporidium, um com Ad, um com E. histolytica e um com

Cryptosporidium. Foram encaminhadas 48 crianças (50,5%) para hidratação

intravenosa por desidratação (46) e dois, por vômitos incoercíveis (Tabela 11). O

relato de contactantes com os mesmos sintomas ocorreu em 13 pacientes (13,7%).

De todas as crianças com amostras positivas para o RV, 20,7% não haviam recebido

leite materno e 56,5% tiveram o aleitamento materno exclusivo interrompido no

terceiro mês de vida; enquanto que naquelas com menos de seis meses, este fato

ocorreu em 30,4% e 87%, respectivamente. A ausência de aleitamento materno

exclusivo teve uma correlação estatisticamente significante com a positividade para

o RV (p = 0,0007).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Ausência de água potável e/ou de rede de saneamento básico só ocorreu em 1,1%

dos casos. Sessenta e dois por cento tinham filtro em casa.

Tabela 11: Sinais e sintomas clínicos das crianças com diarréia aguda nas amostras

positivas com RV (EGPA e EIERA), Ad (EIERA) e associação de ambos (EIERA)

Sinais e Sintomas

n (%)

RV e Ad

n (%)

Febre 71 (74,7) 7 (58,3) 5 (55,6)

Vômitos 92 (96,8) 12 (100) 9 (100)

Anorexia 64 (67,4) 9 (75) 6 (66,7)

Dor abdominal (* > 6 m) 49 (63,6) 8 (66,7) 5 (55,6)

Coriza ou tosse 52 (54,7) 4 (33,3) 2 (22,2)

Evacuações líquidas 85 (89,5) 11 (91,7) 8 (88,9)

Sangue nas evacuações 9 (9,5) 1 (8,3) 1 (11,1)

Presença de muco nas evacuações 50 (52,6) 2 (16,7) 2 (22,2)

Desidratação 46 (48,4) 8 (66,7) 5 (55,6)

Total de casos identificados 95 12 9

*N TOTAL = RV = 77, Ad = 10 e Associação = 7

Nos pacientes onde o Ad foi detectado, todos tinham vômito e 91,7%, evacuações

líquidas. Sintomas respiratórios foram observados em quatro pacientes (33,3%) e

sangue nas fezes, em apenas um; este último em associação com RV, E. histolytica

e Cryptosporidium.

Os principais sinais e sintomas observados nas crianças nas quais antígenos de

protozoários foram detectados nas amostras fecais estão resumidos na Tabela 12.

A média de idade de acometimento foi 21,7 e 16,7 meses para G. lamblia e

Cryptosporidium, respectivamente, e a E. histolytica teve uma média etária menor

(14 meses).

As associações de Cryptosporidium e E. histolytica com outros enteropatógenos

foram maiores do que cada um isoladamente (duas e uma respectivamente),

portanto estes sinais e sintomas descritos são de dois ou mais enteropatógenos

pesquisados presentes na mesma amostra fecal.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

Dos dois casos positivos para G. lamblia com relato de sangue nas fezes, um

apresentou EPEC típica e RV associado e referiu 14 dias de tempo de diarréia. Os

sintomas respiratórios aconteceram em cinco crianças, com três destas associadas

ao RV e uma ao Ad. Febre, assim como vômitos, também ocorreu em cinco casos

de G. lamblia, todos associados aos agentes virais.

Tabela 12: Sinais e sintomas clínicos das crianças com diarréia aguda em amostras

positivas para Cryptosporidium ou E. histolytica ou G. lamblia :

Sinais e Sintomas

Cryptosporidium

n (%)

E. histolytica

n (%)

Giardia lamblia

n (%)

Febre 8 (80) 6 (85,7) 9 (69,2)

Vômitos 8 (80) 7 (100) 12 (92,3)

Anorexia 9 (90) 6 (85,7) 13 (100)

Dor abdominal (* > 6 m) 8 (80) 5 (71,4) 10 (76,9)

Coriza ou tosse 7 (70) 4 (57,1) 5 (38,5)

Evacuações líquidas 10 (100) 7 (100) 11 (84,2)

Sangue nas evacuações 2 (20) 1 (14,3) 2 (15,4)

Muco nas evacuações 6 (60) 5 (71,4) 8 (61,5)

Desidratação 5 (50) 4 (57,1) 7 (53,8)

Total 10 7 13

*n total = 75 pacientes

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

6. DISCUSSÃO

___________________________________________________________________

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

6. DISCUSSÃO

6.1. CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA ESTUDADA

Este estudo evidenciou causas infecciosas de diarréia aguda em crianças até três

anos de idade, de baixo nível sócio-econômico, aspectos clínicos da doença e dados

sócio-demográficos desta população.

Foram estudadas crianças com gastrenterite atendidas no HINSG, hospital terciário

da rede pública estadual, referência no atendimento pediátrico dos municípios da

Grande Vitória, do interior do Estado do ES ou de outros estados, pertencentes a

famílias de renda baixa e, em sua maioria, suprida com acesso à água tratada e

saneamento básico. Não houve diferença significativa com relação ao número de

crianças do sexo masculino e feminino. Estes pacientes, provindos de seu domicílio

ou encaminhadas de unidades básicas de saúde apresentavam um espectro de

doença variando da forma leve à grave.

As amostras fecais colhidas de crianças sem diarréia foram obtidas em número

adequado para verificar associação de determinadas categorias de DEC (EPEC

atípica, EAEC e DAEC) com a etiologia da doença diarréica. Cuidados foram

observados na coleta das amostras e metodologia, de acordo com o agente a ser

pesquisado, como a utilização de meios seletivos e com separação de mais de uma

colônia de E.coli para pesquisa de seus genes de virulência. As crianças foram

atendidas no PS, em sua maioria, nas primeiras 72 horas de doença, o que poderia

favorecer uma maior probabilidade de identificação dos enteropatógenos

pesquisados.

Neste estudo, a grande maioria das crianças selecionadas tinha menos de dois anos

de idade (85,8%, média - 13,6 e mediana - 11 meses). Características desta faixa

etária, como uma proporção maior de líquidos (70 a 75% do peso corporal) em

comparação aos adultos (60%), faz com que suas necessidades hídricas sejam

maiores. Perdas através do trato gastrointestinal, superiores a percentuais de 3 a

10% da água ingerida, favorecem a evolução rápida para a desidratação associada à

necessidade de reposição intravenosa de líquidos (Nelson et al., 2002). Uma perda

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

estimada de 5 a 10 % do peso destas crianças pode contribuir para uma alta taxa de

internação e progressão para complicações como o choque hipovolêmico, sobretudo

quando a reposição é inadequada ou não supera as perdas. Além disso, a

disseminação sistêmica de agentes infecciosos com agravo no estado

hemodinâmico dos pacientes, associada à desnutrição, culmina com altas taxas de

mortalidade infantil por diarréia nos países em desenvolvimento (OMS; OPAS,

2002).

A taxa de mortalidade infantil de 16,07 (2002) no Estado do Espírito Santo é

considerada uma das mais baixas do Brasil, mas a taxa de mortalidade proporcional

por doença diarréica de 2,7% (2002) e de hospitalização por desidratação de 9,1%,

ainda são altas se comparadas a outras cidades da região Sul e Sudeste, apesar de

inferior às relatadas de outras regiões brasileiras (DATASUS, 2004). Logo, este

estudo apresenta sua relevância não só para elucidação da etiologia infecciosa, mas

também para a avaliação de dados clínicos e epidemiológicos da diarréia infantil no

Espírito Santo.

6.2. ENTEROPATÓGENOS DETECTADOS

No presente estudo, foram pesquisadas bactérias (DEC, Salmonella e Shigella), RV,

Ad e protozoários (Cryptosporidium spp., E. histolytica e G. lamblia) em 88 casos

(Grupo I), enquanto bactérias, RV e Ad foram pesquisados em 147 (Grupo II) e

bactérias e RV em 230 (Grupo III). A detecção de enteropatógenos classicamente

descritos ou possíveis agentes etiológicos de diarréia na população estudada foi de

83, 72,1 e 60% nos grupos I, II e III, respectivamente. Este achado é compatível com

diversos estudos prévios que relataram detecção em 64 até 78% dos casos (Stewien

et al., 1993; Toporovski et al., 1999; Scaletsky et al., 2001; Souza et al., 2002).

Deve ser levado em consideração que os agentes pesquisados, relatados nas

diferentes publicações, não foram exatamenete os mesmos. Além disso, esta

pesquisa não incluiu agentes bacterianos dos gêneros Campylobacter, Yersinia,

Vibrio e Aeromonas, assim como outros agentes virais como os calicivírus e

astrovírus, que poderiam ser responsáveis pelo quadro clínico destas crianças nas

quais o resultado foi negativo. Logo, outros estudos devem ser conduzidos

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

ampliando o número de agentes causais, na elucidação da etiologia de diarréia

aguda infecciosa na população da Grande Vitória.

O perfil etiológico da doença diarréica tem se alterado mediante três principais

fatores: i) nível de desenvolvimento com uso de medidas higiênico-sanitárias; ii)

conhecimento dos mecanismos de patogenicidade; iii) novas metodologias de

diagnóstico molecular possibilitando discriminação das categorias distintas de E. coli.

A prevalência de enteropatógenos bacterianos clássicos (EPEC típica, ETEC, EIEC,

Shigella e Salmonella) isoladamente, corresponde a menos de 11%, enquanto que

os enteropatógenos virais foram detectados em percentuais maiores do que 21%,

sem associação, nas amostras avaliadas. Isto evidencia que o RV se caracterizou

como a causa mais importante de diarréia aguda na população estudada, fato que

ocorre em países desenvolvidos com condições sanitárias adequadas (Kapikian,

2001; Parashar et al., 2003 a, b).

6.3. BACTÉRIAS

Na caracterização da E. coli nas fezes de uma criança com diarréia aguda, a

aglutinação com anti-soros polivalentes é o teste empregado na rotina de diagnóstico

em laboratório de análise clínicas, após os testes bioquímicos da cultura, para a

pesquisa de sorogrupos de EPEC, EIEC e do sorogrupo protótipo de EHEC. Desta

forma, as outras categorias de DEC como ETEC, EAEC, DAEC e outros sorogrupos

de EHEC não são identificados usualmente. A EPEC típica, classicamente envolvida

na etiologia de diarréia aguda nos países em desenvolvimento (Scaletsky et al.,

1999, 2001, 2002 a, b; Trabulsi, 2002; Piva et al., 2003; Régua-Mangia et al., 2004),

também não pode ser diferenciada, através da sorologia, das EPEC atípicas que tem

seu papel inferido nas diarréias agudas dos países desenvolvidos (Kaper, 1996;

Scotland et al., 1996; Afset et al., 2003; Beutin et al., 2003; Robins-Browne et al.,

2004).

Neste estudo, também foram usados métodos diagnósticos que detectam os genes

de virulência característicos de cada categoria de DEC, permitindo a detecção

destes enteropatógenos.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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Dentre os enteropatógenos bacterianos pesquisados, as DEC foram os agentes

detectados em maior número nas amostras fecais de diarréia aguda. As categorias

mais prevalentes foram a DAEC seguida pela EAEC e EPEC atípica.

A EPEC é uma categoria diarreiogênica importante nos países em desenvolvimento

em menores de dois anos (Guerrant et al., 1983, 1986; Black et al., 1989; Gomes et

al., 1991; Prado & O’Ryan, 1994; Kaper, 1996; Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000;

Torres et al., 2001). Em pesquisas conduzidas na região sudeste do Brasil, foram

evidenciadas EPEC em 8 a 16,2% de crianças com diarréia aguda, não internadas

(Gomes et al., 1991; Stewien et al., 1993; Mangia et al., 1993; Almeida et al., 1998;

Toporovski et al., 1999; Scaletsky et al.,1999, 2002; Fagundes-Neto & Scaletsky,

2000; Medeiros et al., 2001; Souza et al., 2002; Régua-Mangia et al., 2004). A

pesquisa dos genes de virulência bfp e eae de todos os casos isolados de E.coli

evidenciou EPEC típica em 0,9% dos casos de diarréia aguda. Estes casos

ocorreram em duas crianças aos 12 e 15 meses de vida, ambos em associação com

RV e um também com giárdia. Este achado foi significantemente inferior aos

referidos anteriormente, porém, muitos destes não discriminam se a EPEC isolada

foi caracterizada como típica ou atípica. Por outro lado, redução na prevalência da

EPEC típica vem sendo descrita em outras partes do mundo. No Brasil, alguns

relatos também têm evidenciado esta redução (Kaper, 1996; Scotland et al., 1996;

Scaletsky et al., 1999; Trabulsi et al., 2002; Afset et al., 2003; Beutin et al., 2003;

Campos et al., 2004; Robins-Browne et al., 2004). A baixa prevalência neste estudo

pode ser resultado de fácil acesso à água tratada e saneamento básico nos

municípios da Grande Vitória.

No presente estudo, a sorologia com anti-soros polivalentes detectou menor número

de EPEC do que a pesquisa de genes de virulência. Das nove amostras positivas

pela sorologia para EPEC, a pesquisa dos genes de virulência permitiu discriminá-

las em quatro casos: EPEC atípica em dois (um associado à DAEC), EAEC em um e

DAEC em outro, possíveis patógenos da diarréia. Isto demonstra que o uso de anti-

soros polivalentes para EPEC não discriminam diferentes categorias de DEC.

Recentemente, Campos et al. (2004) correlacionaram diferentes sorogrupos de E.

coli que são compartilhados com distintas categorias, inclusive com cepas

reconhecidamente patógenas (EPEC típica, EHEC, e ETEC), cepas nas quais o

potencial de virulência é controverso (EPEC atípica, DAEC e EAEC) e ainda, cepas

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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não consideradas patógenas. Portanto, a determinação da EPEC baseada somente

em sorologia para detecção do antígeno O, pode erroneamente induzir à etiologia da

diarréia pela EPEC.

A EPEC atípica, definida como categoria diarreiogênica no II Simpósio Internacional

sobre EPEC em 1995 (Kaper, 1996; Nataro & Kaper, 1998), teve sua participação

descrita em casos de diarréia em adultos e crianças, nos países desenvolvidos como

na Inglaterra, Austrália, Alemanha e Noruega (Kaper, 1996; Scotland et al., 1996;

Afset et al., 2003; Beutin et al., 2003; Robins-Browne et al., 2004).

A investigação dos pacientes sem diarréia evidenciou uma freqüência maior da

EPEC atípica (10,3%) em relação aos pacientes com diarréia aguda (8,2%),

estatisticamente não significante, demonstrando que não se constituem agentes de

diarréia aguda na população estudada na Grande Vitória. Da mesma forma, em

outros estudos realizados do Brasil, esta categoria não tem sido associada à diarréia

aguda em crianças, por ter sido identificada em número igual ou maior em pacientes

sem diarréia (Gomes et al., 1991; Almeida et al., 1998; Scaletsky et al., 2001; Nunes

et al., 2003, Régua -Mangia et al., 2004). Entretanto, Campos et al. (2004)

demonstraram a participação da EPEC atípica na diarréia aguda em crianças

paulistanas, onde anteriormente havia predomínio das EPEC típicas. Portanto,

estudos continuados em diferentes áreas geográficas são necessários para avaliar a

participação da EPEC atípica na etiologia da diarréia aguda.

EAEC está descrita classicamente como agente etiológico de diarréia persistente em

crianças (Lima et al., 1992; Fang et al., 1995; Bardhan et al., 1998; Andrade et al.,

2000) e alguns autores sugerem sua relação com etiologia de diarréia aguda (Nataro

& Kaper, 1998; Scaletsky et al., 1999; Fagundes-Neto et al., 2000, Piva et al., 2003;

Huang & DuPont, 2004; Regua-Mangia et al., 2004). Neste estudo, a EAEC foi

identificada em menor número nos casos de diarréia aguda do que nas crianças sem

diarréia, estatisticamente significante, o que demonstra que não se encontra

associada à diarréia aguda na população estudada. Entretanto, a distribuição da

EAEC com relação à idade das crianças evidenciou uma diferença estatisticamente

significante nas crianças com diarréia aguda após o segundo ano de vida quando

comparada às crianças sem diarréia (p = 0,026). Esta distribuição evidencia EAEC

como agente etiológico de diarréia aguda nas crianças acima dos dois anos. Por

outro lado, Scaletsky et al. (2002) relatou que a EAEC foi quase duas vezes mais

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

frequente em crianças menores de cinco meses de vida com diarréia, apesar de

prevalências iguais de EAEC nas crianças com ou sem diarréia, observada em todas

as faixas etárias.

Metade dos casos onde EAEC foi detectada em crianças com diarréia (10/20),

estava associada com um ou mais agentes infecciosos, em sua maioria em menores

de dois anos de idade. Rodrigues et al. (2002) descreveram a EAEC em 20,4% de

54 crianças com diarréia aguda como agente único e em 41% quando outros

enteropatógenos estavam associados, questionando a possibilidade desta categoria

estar colonizando o trato gastrintestinal em determinada idade, sem provocar

doença. No entanto, outros relatos brasileiros mostraram uma prevalência de EAEC

em crianças com diarréia aguda, sem discriminação de faixas etárias, que variou de

3,1 a 19,4% e com prevalências menores nos pacientes sem diarréia sugerindo seu

envolvimento como agente causal de diarréia (Almeida et al., 1998; Scaletsky et al.,

1999, 2001; Souza et al., 2001; Piva et al., 2003; Régua-Mangia et al., 2004).

A DAEC, descrita inicialmente através de testes de adesão em cultura de célula por

Cravioto et al. (1979), vêm sendo investigada como possível agente etiológico de

diarréia aguda em crianças. Esta categoria de DEC foi detectada no Brasil em

crianças com diarréia aguda, com prevalência variando de 14,3 a 20,7% (Scaletsky

et al., 1999, 2001, 2002 b, c; Fagundes-Neto & Scaletsky, 2001; Souza et al., 2002;

Piva et al., 2003). O presente estudo detectou DAEC em 20,6% dos casos de

diarréia aguda e, em mais da metade destes, associada a outros enteropatógenos.

Nas crianças sem diarréia, foi encontrada em 16,2% dos casos, diferença

estaticamente não significante (p = 0,53). Logo, estes resultados demonstram que a

DAEC, assim como a EPEC atípica e EAEC não estiveram associadas à diarréia

aguda, na população estudada.

Neste estudo, não houve correlação estatística de DAEC entre as diferentes faixas

etárias das crianças com diarréia aguda (p = 0,53), embora tenha sido relatado ser

mais prevalente em crianças acima de dois anos com diarréia aguda (Gomes et al.,

1989; Gunzburg et al., 1993; Levine et al., 1993; Nataro & Kaper, 1998; Scaletsky et

al., 1999, 2002 b). Portanto, estudos mais amplos, do tipo caso – controle, são

necessários para avaliação do possível envolvimento da DAEC com diarréia aguda

em diferentes faixas etárias.

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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A EIEC e a EHEC são responsáveis por disenteria e colite hemorrárica,

respectivamente, sendo esta última também implicada como agente etiológico da

SHU. Na amostra estudada, EIEC foi detectada em duas crianças com diarréia

aguda, constituindo 0,9% dos casos. Embora tenha sido realizada a pesquisa por

sorologia convencional, a EIEC só foi evidenciada através da pesquisa do gene Inv.

Esta frequência condiz com outros trabalhos brasileiros que evidenciaram esta

categoria em menos de 2% dos casos (Gomes et al., 1991; Stewien et al., 1993;

Almeida et al., 1998; Toporovski et al., 1999; Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000;

Medeiros et al., 2001; Orlandi et al., 2001; Souza et al., 2002; Régua-Mangia et al.,

2004).

O patotipo EHEC não foi encontrado nas amostras examinadas. Este achado está de

acordo com os achados da literatura, que revelam ser baixa a prevalência desta

categoria no Brasil (Almeida et al., 1998; Toporovski et al., 1999; Medeiros et al.,

2001; Orlandi et al., 2001; Guth et al., 2002 a, b; Souza et al., 2002; Régua-Mangia

et al., 2004). De acordo com trabalhos realizados no estado de São Paulo, a EHEC

só foi encontrada em um caso de 100 amostras (Toporovski et al., 1999) e em três,

de 505 casos de diarréia aguda (Guth et al., 2002 a). Nenhuma destas EHEC

pertencia ao sorotipo 0157:H7, contemplado pelo anti-soro disponível no mercado.

Portanto, sua identificação foi feita através de pesquisas de genes de virulência.

Importante ressaltar que apesar da baixa prevalência de EHEC no Brasil, em outros

países, como a Argentina e o Chile ela se constitui na causa mais importante de

insuficiência renal aguda em crianças (Prado et al., 1997; Spizzirri et al., 1997).

A ETEC, importante agente de diarréia aguda em crianças nos países em

desenvolvimento, foi detectada em 4,1% (9/219) dos casos de diarréia aguda. Este

índice está de acordo com relatos publicados de alguns estados brasileiros, que

encontraram ETEC em 2,6 a 6% dos casos (Almeida et al., 1998; Toporovski et al.,

1999; Fagundes-Neto et al., 2000; Orlandi et al., 2001; Scaletsky et al., 2002

Regua-Mangia et al., 2004). Por outro lado, um estudo realizado no estado de São

Paulo por Souza et al., (2002) revelou a presença de ETEC em 12,3%, compatível

com estudos brasileiros anteriores que apresentavam taxas mais altas de detecção,

que variaram de 10,2 a 23,5% (Guerrant et al., 1983; Queiroz et al., 1987; Kitagawa

et al., 1989; Mangia et al., 1993; Sarinho et al., 1993).

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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A ETEC também foi detectada em uma criança assintomática (1,5%), de seis meses

de idade, provinda de Rondônia, que não tinha filtro, acesso à água potável e rede

de esgoto na sua moradia. Esta criança não teve seguimento para avaliar possível

evolução para o quadro diarréico. Sabe-se que, em regiões endêmicas como países

em desenvolvimento, a maioria das infecções ocorre até os três anos de vida, com

desenvolvimento de anticorpos para fatores de colonização (CFs) e para a toxina LT

da bactéria, afetando sua colonização na mucosa intestinal e neutralizando atividade

da toxina (Nataro & Kaper, 1998; Guth, 2000). Portanto este caso também poderia

corresponder a infecção subclínica pela ETEC, levando em consideração a origem

da criança e suas condições de vida, o que sugere exposição prévia à ETEC. Esta

criança já havia apresentado outros episódios de diarréia.

De todas as cepas isoladas mundialmente, cerca de 35% expressam genes para

toxinas LT e ST, enquanto 35%, apenas para ST e o restante, para LT (Gaastra et

al., 1996). Neste estudo, genes para a produção da toxina LT foram detectados em

todas as amostras positivas para ETEC e em uma, também o gene para a toxina ST.

Este achado sugere que se trata de primoinfecção com cepa produtora de LT, pois

esta toxina induz a formação de Ac neutralizante. Outros relatos brasileiros já

demonstraram uma freqüência maior de cepas produtoras de LT nas crianças com

diarréia aguda (Sarinho et al., 1993; Toporovski et al., 1999).

Das nove amostras positivas, sete eram de crianças maiores do que um ano,

indicando a aquisição desta categoria de DEC após o primeiro ano de vida, através

de melhoria dos cuidados materno - infantis, sobretudo na higene ambiental e

alimentar nesta faixa etária, fato que contribui para redução na sua freqüência,

associado aos anticorpos protetores veiculados através da ingestão de leite materno,

sobretudo naqueles agentes de veiculação por água e alimentos contaminados

(Curtis, 2001; Leclerck et al., 2002).

É descrita uma redução da freqüência das DEC, sobretudo da EPEC, relacionada à

melhoria do padrão higiênico-sanitário das populações com conseqüente

repercussão na morbi-mortalidade infantil (Guerrant et al., 1983; Feachem, 1984;

Scaletsky et al., 1984, 1999; Esrey et al., 1985; Trabulsi et al., 1988, 2002; Tomasi et

al., 1994; Waldman et al., 1997; Nataro & Kaper, 1998). Uma baixa freqüência para

patógenos clássicos como a EPEC, EIEC e ETEC, em relação à pesquisas prévias

pode refletir melhoria das condições de sanitárias de uma população (Guerrant et al.,

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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1983; Trabulsi et al., 1988, 2002; Gomes et al., 1989, 1991; Kitagawa et al., 1989;

Mangia et al., 1993; Stewien et al., 1993; Almeida et al., 1998; Scaletsky et al.,

1999). Isto se reflete pelos dados de acesso à água potável (97,8%) associado ao

saneamento básico (69%) nas famílias das crianças estudadas.

Os resultados obtidos neste estudo revelam a importância da implantação de

estudos biomoleculares a fim de evidenciar adequadamente as DEC e alterações

nos seus padrões epidemiológicos em cada região.

As bactérias do gênero Shigella, agentes infecciosos mais comuns de disenteria,

foram isoladas em 4,6% dos casos, resultado semelhante a outros estudos

brasileiros (Gomes et al., 1991; Stewien et al., 1993) embora percentuais maiores de

6,2 até 21%, já tenham sido relatados (Almeida et al., 1998; Toporovski et al., 1999;

Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000; Medeiros et al., 2001; Scaletsky et al., 2001;

Souza et al., 2002; Orlandi et al., 2003). A espécie identificada em maior número de

amostras foi a S. flexneri (7/11), que corresponde à que tem sido descrita na

literatura em países em desenvolvimento e na população de baixo nível sócio-

econômico, enquanto que nos países desenvolvidos, a S. sonnei é a espécie mais

isolada (Niyogi, 2005).

Neste estudo, houve maior incidência de casos de Shigella acima de um ano de vida

(8/11 casos) (p = 0,006), descrição clássica de literatura que relata predomínio em

crianças de um a cinco anos (Sears & Kaper, 1996; Nataro & Kaper, 1998; Niyogi,

2005).

A apresentação clínica de disenteria ocorre em 30 a 50% dos casos de Shigelose

(Sears & Kaper, 1996), Durante a infeccção, a Shigella coloniza o intestino grosso,

invade as células M ou enterócitos através do plasmídeo de invasividade IpaD,

rompe a vesícula de endocitose e se dissemina movida por um rearranjo de actina

no pólo das células (Sears & Kaper, 1996). A lise das células invadidas, onde a

Shigella prolifera, com quimiotaxia de polimorfonucleares e ulcerações da mucosa,

caracterizam o quadro disentérico. Porém, no início da infecção, as fezes

apresentam-se com a consistência diminuída pela produção da toxina e sem sangue.

Três dos onze casos (27%) positivos para Shigella apresentaram sangue nas fezes

nas amostras deste estudo. Estes casos correspondem àqueles que buscaram

atendimento médico no quarto dia de diarréia enquanto que dos casos restantes,

quatro foram conduzidos ao PS no primeiro dia e os demais quatro, de 3 a 7 dias do

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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estabelecimento do quadro clínico. O tempo médio de diarréia à consulta, justificaria

o encontro de sangue em pequeno número dos casos positivos para Shigella

estudados (Sears & Kaper, 1996; Niyogi, 2005).

A Salmonella pode ser responsável por quadros de diarréia leve até quadros graves

dependendo do sorotipo, da idade e das condições de saúde do hospedeiro

(Pickering & Cleary, 1997). No presente estudo, foi detectada uma prevalência de

2,9% de Salmonella nas crianças com diarréia, de acordo com outros relatos

brasileiros que a detectaram de um até 6,9% dos casos (Mangia et al., 1993;

Stewien et al., 1993; Almeida et al., 1998; Toporovski et al., 1999; Fagundes-Neto &

Scaletsky, 2000; Medeiros et al., 2001; Orlandi et al., 2001; Scaletsky et al., 2001,

2002 b, c; Souza et al., 2002).

Dos sete casos positivos, a Salmonella foi detectada em cinco nas crianças abaixo

dos dois anos, sendo três casos abaixo dos seis meses de vida, fato também

observado em outros trabalhos (Almeida et al., 1998; Medeiros et al., 2001).

Houve identificação da Shigella e Salmonella somente nos meses de outono e verão

condizente com a literatura que demonstra a disseminação destes enteropatógenos

nas estações mais quentes do ano (Pickering & Cleary, 1997; Niyogi, 2005).

O quadro clínico das crianças com amostras positivas para categorias de DEC

classicamente descritas como agentes etiológicos de diarréia (EPEC típica, ETEC e

EIEC), cursou com vômitos, febre e sintomas respiratórios em menor prevalência

comparados aos de outros enteropatógenos. Nestes casos, a evolução do quadro

diarréico para desidratação ocorreu em apenas 11% dos casos, significativamente

menor do que 50% dos casos de RV. Uma menor taxa de desidratação também foi

observada nos casos positivos para Shigella ou Salmonella, o que corrobora com

dados de literatura (Pickering & Cleary, 1992; Brunser et al., 1997; Campos, 2004).

6.4. VÍRUS

Os RV representam uma causa importante de diarréia no mundo (Parashar et al.,

2003 a e b). No Brasil, sua freqüência foi relatada variando de 4,1 a 41% (Gomes et

al., 1991; Mangia et al., 1993; Stewien et al., 1993; Timenetsky et al., 1993; Gusmão

et al., 1999; Toporovski et al., 1999; Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000; Fernandes et

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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al., 2000; Da Rosa e Silva et al., 2001; Meneghetti et al., 2001; Scaletsky et al., 2001;

Orlandi et al., 2001; Rodrigues et al., 2002; Soares et al., 2002; Souza et al., 2002;

Da Silva et al., 2003; Carmona et al., 2004; Costa et al., 2004).

Na amostra estudada, os RV foram os enteropatógenos detectados em maior

número como agentes únicos ou em associação, encontrados em 35,2% do total de

casos pesquisados, semelhante a outros relatos brasileiros (Cardoso et al., 1992,

2003; Teixeira et al., 1998; Rodrigues et al., 2002; Souza et al., 2002; Carmona et

al., 2004; Costa et al., 2004).

O RV apresenta características de sazonalidade, com sua freqüência aumentando

nos meses mais frios e secos do ano (Kapikian, 2001). O período de março a

setembro de 2003 foi o de maior positividade para RV nas amostras colhidas nos 17

meses deste estudo, coincidindo com o relato em outras localidades brasileiras tais

como Minas Gerais, no mesmo período (Da Rosa e Silva et al., 2001) e em São

Paulo, Goiânia e Rio de Janeiro, de maio a setembro (Gomes et al., 1991; Cardoso

et al., 1992; Pereira et al., 1993). Foi descrita uma estabilidade maior nas partículas

do RV em ambientes com baixa umidade (Kapikian, 2001). A região metropolitana de

Vitória não apresenta estações do ano tão bem definidas como em outras regiões do

país e possui uma alta porcentagem de umidade relativa do ar por ser uma cidade

litorânea. Neste estudo, a correlação de maior positividade das amostras para RV

com menores índices de pluviosidade ou com temperaturas mais baixas não foi

evidenciada. Entretanto, houve uma diminuição de pluviosidade em fevereiro de

2003 que coincidiu com o aumento expressivo de casos de diarréia em crianças e

amostras positivas para RV nos meses consecutivos, o que poderia ser explicado

pela maior disseminação de partículas virais a partir daquele momento.

Nas mesmas amostras de fezes em que o RV foi pesquisado através da detecção de

antígenos (EIERA) e de ácido nucleico viral (EGPA), uma positividade de 50%

(74/147) e de 41,2% (61/148) foi encontrada, respectivamente. Sessenta casos

foram positivos para ambos métodos gerando uma concordância de 90% entre os

dois métodos diagnósticos, considerados de boa sensibilidade e especificidade

(Wilhelmi et al., 2001; Altindis et al., 2004).

Portanto, o método de EIERA, aparentemente detectou um número maior de casos

positivos para RV do que EGPA. Entretanto, deve ser considerado que no início da

infecção viral, um grande número de antígenos do RV pode ser detectado, período

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

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em que a quantidade de ácido nucléico pode não ser suficiente para ser evidenciado

por método de detecção direta sem amplificação do genoma viral, gerando

resultados divergentes de acordo com a metodologia utilizada. A técnica de RT-PCR

para a detecção de ácido nucléico do RV foi realizada nestas amostras positivas por

EIERA e negativas por EGPA, com resultado negativo em todas. A não detecção do

ácido nucléico do RV pode se dever à degradação do mesmo ou ainda, ao fato da

infecção não ter sido causada pelo RV. Neste caso, a reação obtida pelo EIERA

seria falso-positiva. Resultados falso – positivos podem ocorrer pela presença de

fatores como proteína A de Staphylococcus, fator reumatóide ou peroxidase nas

amostras fecais, conforme o fabricante deste teste. Para avaliar estes casos que

foram positivos para ambos, testes confirmatórios deveriam ser realizados, mas não

tivemos mais Kits para sua realização.

Os RV dos grupos A, B e C estão associados a infecções humanas no mundo,

sendo o RV do grupo A (RVA) o mais prevalente, sobretudo em crianças (Kapikian et

al., 2001; Parashar et al., 2003 a, b). O perfil eletroforético pela EGPA revelou 81

amostras fecais positivas para o RV pertenciam ao grupo A. Nenhum RV do grupo B

ou C foi encontrado nestas amostras, apesar de alguns relatos de infecções em

crianças e adultos com diarréia aguda no Brasil (Souza et al., 1998; Gabbay et al.,

1999; Araújo et al., 2004).

Os RVA apresentam, caracteristicamente, o perfil eletroforético 4-2-3-2. Uma

amostra apresentou o perfil eletroforético 5-1-3-2, sugerindo um possível rearranjo

viral, que tem sido descrito para o RV, evento que pode ser observado em vírus cujo

genoma é de natureza segmentada. Os rearranjos mais comumente encontrados

ocorrem nos segmentos 5 e 11, sendo que no 11 confere vantagens para o RV na

sua replicação e na estabilidade das partículas virais, sendo mais freqüente em

pacientes imunossuprimidos (Kapikian, 2001).

Houve uma amostra positiva para o RV (EGPA) em paciente de 11 meses de vida

que fazia parte do grupo controle. Existem relatos de infecção sub-clínica por RV na

dependência de fatores, como a virulência da cepa, determinados alelos de VP4

(Ramig, 2004). Há possibilidade de que este paciente estivesse no período de

incubação da doença diarréica, visto que a sintomatologia à consulta médica foi de

anorexia e febre, sem quadro clínico de diarréia, mas com modificação da

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consistência das fezes verificada durante a coleta. Entretanto, a evolução clínica

desta criança não foi avaliada.

Kapikian et al. (2001) e Clark & Mc Kendrick (2004) relataram que 90% das crianças

até os três anos de idade apresentam pelo menos uma infecção por RV. Neste

estudo, a maior prevalência de amostras positivas para o RV foi verificada em

crianças menores de 18 meses de idade (82,7%), sendo pouco mais da metade

abaixo de um ano de idade.

Para que haja infecção produtiva de enterócitos pelo RV, a proteína VP4 necessita

ser previamente clivada por proteases intestinais. A imaturidade do trato

gastrintestinal com menor expressão de proteases intestinais, nos neonatos,

contribuiria para restrição nesta infecção ou ainda, manifestações clínicas ausentes

ou brandas (Ramig, 2004). No entanto, das 28 crianças estudadas com menos de

três meses de vida, cinco foram positivas para RV. Todas estas cinco crianças

estavam sem aleitamento materno. É relatada a importância dos fatores

antiinfecciosos do leite materno para redução de doenças diarréicas, sobretudo em

países em desenvolvimento, assim como sua proteção na diarréia por RV (Parashar,

et al., 1998; Kapikian, 2001). Além da manutenção de uma nutrição protéico-calórica

adequada que fornece condições adequadas a um bom funcionamento do sistema

imunológico do lactente, a presença de fatores pré-bióticos, imunoglobulinas,

lisozima, lactaderina, interferon e leucócitos no leite materno favorecem a proteção

contra diarréia aguda infecciosa (Betrán et al., 2001, 2004; Fuchs & Victora, 2002;

Escuder et al., 2003; Vieira et al., 2003; Carratala Munuera et al., 2005; Newburg et

al., 2004, 2005).

O Aleitamento materno exclusivo até os primeiros 30 dias ocorre em 55,3% das

crianças capixabas e este percentual cai para 10,8% dos casos, quando observado

até o 6º mês de vida (DATASUS, 2004). Obtivemos uma correlação estatisticamente

significante da infecção por RV nas crianças sem aleitamento materno ou com

introduçao precoce de alimentos em detrimento do leite materno, o que demonstra a

importância do incentivo do aleitamento materno exclusivo até o sexto mês de vida

para proteção dos lactentes.

O quadro clínico decorrente da infecção por RV cursa com vômitos em 50 a 60% dos

casos e de muco em 25% das evacuações diarréicas, sem referência de

sangramento (Kapikian, 2001). Neste estudo, nas crianças em que houve detecção

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do RV foi observada uma proporção significativa de vômitos (96,3%) e de muco nas

evacuações (53,1%). A presença de sangue ocorreu em quase 10% dos casos,

embora não seja característica da patogênese do RV. Sete de oito casos de

sangramento estavam em associação com outros patógenos, mas apenas um deles

com característica clássica de possível invasão de mucosa intestinal (E. histolytica).

Toporovsky et al. (1999) e Souza et al. (2002) também verificaram sangue em uma

de 21 e duas de 33 amostras fecais positivas para RV, respectivamente. É

importante ressaltar que outros patógenos que podem apresentar fezes com sangue,

tais como Campylobacter sp ou Yersinia enterocolitica, não foram pesquisados.

Mais da metade dos casos positivos para RV evoluiu para a hidratação intravenosa,

enquanto que outros autores relataram esta evolução em 23 a 27% dos casos

(Timenetsky et al., 1993; Souza et al., 2002). Vômitos, ocorridos em quase totalidade

dos casos, poderia justificar uma maior perda hidreletrolítica com desidratação e

dificuldades da reidratação por via oral. Fatores intrínsecos ao RV, tais como cepas

mais virulentas, ou ao seu hospedeiro, como a desnutrição protéico-calórica,

poderiam ser responsáveis pela exacerbação dos sintomas (Ramig, 2004). Deve ser

levado em consideração que os pacientes atendidos no PS hospitalar podem ser

selecionados dentre aqueles que não obtiveram melhora com a administração do

soro de reidratação industrializado ou de manipulação caseira por orientação

ambulatorial ou mesmo cultural, conseqüentemente com pior quadro clínico,

requerendo hidratação intravenosa. Carmona et al. (2004), verificaram uma maior

prevalência de RV em pacientes com diarréia aguda grave que necessitavam de

internação contra os que não necessitavam. A evolução completa dos casos

encaminhados para a terapia de reidratação IV não pôde ser inferida devido a falta

de seguimento destes. Outros estudos se fazem necessários para que seja realizada

uma correlação com o tipo de cepa circulante no período, a idade com maior

susceptibilidade para reidratação IV e a evolução clínica.

Alguns sorotipos de Ad, denominados adenovírus entéricos, estão relacionados à

diarréia aguda infantil (Glass & Kilgore, 1997; Horwitz, 2001). Antígenos do Ad foram

encontrados em 8,2% das amostras fecais diarréicas estudadas, todas com idade

inferior aos dois anos de vida. Esta prevalência foi maior comparada a outros relatos

brasileiros cuja identificação variou de 1,5 a 3,1% em amostras fecais de crianças

atendidas ambulatorialmente (Timenetsky et al., 1987; Cardoso et al., 1992; Mangia

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et al., 1993; Pereira et al., 1993; Soares et al., 2002). Deve ser levado em

consideração que os anticorpos de captura do teste utilizado para detecção deste

patógeno não discrimina entre cepas entéricas e não-entéricas. Soares et al. (2002)

detectaram Ag deste vírus em 4,9% de 1420 amostras diarréicas de diversas

cidades brasileiras, através de ensaio imunoenzimático. Porém, o isolamento viral e

a pesquisa com Ac monoclonais detectaram 1,55% de Ad entéricos. Pereira et al.

(2004), através da pesquisa por reação em cadeia pela polimerase (PCR) para o

gene da fibra de Ad, em amostras fecais positivas para Ag de Ad (EIERA), revelou

que 65% destas correspondiam ao gênero F (entérica). Logo, estudos

complementares seriam úteis na discriminação das espécies entéricas de Ad.

O Ad foi encontrado associado ao RV em nove de 12 casos estudados (75%). O RV

e Ad foram encontrados infectando um mesmo indivíduo em diversos relatos (Waters

et al., 2000; Giordano et al., 2001; Román et al., 2003). O teste positivo pode conter

antígenos de RV e Ad, mas resultado falso – positivo pode ocorrer pela presença

dos mesmos fatores citados anteriormente para o RV. Da mesma forma, teste

confirmatório segundo seus fabricantes, seria necessário.

No quadro clínico apresentado pelas crianças com Ad, vômito, anorexia e dor

abdominal foram os sintomas mais prevalentes. Sangue nas fezes foi encontrado em

uma amostra com coinfecção com RV e E. hystolitica. A interpretação adequada do

quadro clínico destas amostras positivas para Ad, fica prejudicada devido ao grande

número de associações com outros agentes, principalmente RV e a ausência de

metodologia, neste estudo, que diferencie cepas de Ad entéricos dos não entéricos.

6.5. PROTOZOÁRIOS

Os protozoários foram detectados através da pesquisa de seus antígenos

específicos no ensaio imunoenzimático (Prospect em microplaca – Alexon – Biobrás)

considerado de alta sensibilidade e especificidade (Garcia & Shimizu, 1997; Aldeen

et al., 1998; Boone et al., 1999)

A amebíase é uma das doenças responsáveis por uma alta morbimortalidade

mundial com estimativas de 40 mil mortes/ano (OMS) e cursa com apresentação

clínica de disenteria. A detecção de 8% (7/88) de E. histolytica nas fezes desta

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amostragem está de acordo com a maioria de trabalhos brasileiros publicados

(Guerrant et al., 1983; Gennari-Cardoso et al., 1996; Toporovski et al., 1999;

Fagundes Neto & Scaletsky, 2000; Orlandi et al., 2001; Scaletsky et al., 2002 b;

Souza et al., 2002). Apenas Schnack et al. (2003), utilizando mesmo método

imunoenzimático, encontraram a E. histolytica em 56,4% dos casos de diarréia

aguda em menores de cinco anos, com maior prevalência nos maiores de 12 meses

e importante associação (53%) com outros enteropatógenos, inclusive com a

detecção de Cryptosporidium em 85% dos casos. Nas amostras estudadas, o grande

número de associações observadas com o RV (6/7), compromete a interpretação de

sua correlação etiológica na diarréia aguda. Estudos pareados com controles

também seriam úteis na determinação das estirpes de E. histolytica que teriam forma

clínica de doença invasiva, com apresentação sob forma de complicações extra-

intestinais, de alta morbi-mortalidade daquelas que não o são.

Cryptosporidium spp., agente etiológico de diarréia em pacientes imunossuprimidos

e também em crianças, foi detectado em 11,4% (10/88) em crianças estudadas. Esta

freqüência foi maior do que a encontrada por outros autores brasileiros que variou de

0,5 A 8,4% dos casos (Stewien et al., 1993; Gennari-Cardoso et al., 1996; Saredi &

Bava, 1998; Newman et al., 1999; Toporovski et al., 1999; Medeiros et al., 2001;

Silva et al., 2003). Entretanto, outros estudos em países em desenvolvimento

apresentaram números iguais ou superiores aos encontrados em crianças menores

de cinco anos (Mangini et al., 1992; Nuñez et al., 2003; Schnack et al., 2003; Adjei et

al., 2004; Simango et al., 2004; Abdel-Messih et al., 2005). A associação deste

agente com outros protozoários e com o RV em oito das dez amostras não permite

inferir seu real papel na diarréia aguda.

G. lamblia esteve presente em 14,8% (13/88), em seis casos isoladamente e em

sete em associação com RV, Ad, Cryptosporidium, EPEC típica ou ETEC. As

crianças maiores de um ano com amostras positivas para G. lamblia apresentaram

correlação estatisticamente significante quando comparadas às maiores de um ano.

É sabido que a G. lamblia acomete todas as faixas etárias, mas alguns relatos

também encontraram-na em crianças maiores com diarréia aguda, sobretudo em

desnutridos (Pickering & Cleary, 1997; Toporovski et al., 1999; Newman et al., 2001)

Apesar de ter sido identificada em amostras fecais de pacientes assintomáticos e

com diarréia persistente (Saldiva et al., 1999, Newman et al., 2001; Tashima &

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Simões, 2004), prevalência semelhante ou até maior à encontrada no presente

estudo já foi descrita (Gennari-Cardoso et al., 1996; Orlandi et al., 2001). No entanto,

se considerarmos apenas as seis amostras positivas que não estiveram em

associação com outros enteropatógenos, a prevalência da G. lamblia em diarréia

aguda seria de 6,8%, compatível com estudos anteriores brasileiros que

encontraram em porcentagem inferior a 8% nas fezes de crianças com diarréia

aguda (Guerrant et al., 1983; Stewien et al., 1993; Toporovski et al., 1999; Fagundes

Neto & Scaletsky, 2000; Scaletsky et al., 2002 b; Souza et al., 2002; Schnack et al.,

2003). Portando, dos protozoários estudados, apenas G. lamblia apresentou

correlação com a diarréia aguda.

No quadro clínico da giardíase, os sintomas principais foram anorexia, vômitos e dor

abdominal, esta última descrita com freqüência em escolares, de causa recorrente,

associada ou não à síndrome de mal-absorção por sua patogênese de

“atapetamento” da mucosa intestinal (Pickering & Cleary, 1997; Nelson et al., 2004).

Todas as crianças com amostra fecal positiva para um protozoário, associado ou não

a outros enteropatógenos apresentaram uma alta freqüência de relato de vômitos,

anorexia, dor abdominal e febre. O sangramento nas fezes foi evidenciado em quatro

amostras; em três em associação de bactéria, vírus e protozoário (uma destas com

E. histolytica).

Diversas co-infecções foram observadas nos grupos pesquisados, onde dois ou mais

agentes infecciosos foram detectados numa mesma amostra: 36,4, 24,5 e 15,7% nos

grupos I, II e III, respectivamente. O somatório de fatores patogênicos poderia

contribuir para agravar o quadro de sintomas e um pior prognóstico clínico. Porém, a

correlação com a evolução clínica e a associação entre patógenos e/ou patógenos

únicos não foi realizada na presente investigação por não ser o foco desta pesquisa.

No quadro clínico dos diferentes grupos de patógenos foi difícil a correlação dos

sinais e sintomas com uma etiologia específica da diarréia aguda, visto que nenhum

destes estava predominantemente associado com um determinado patógeno. A

febre, sinal caracteristicamente associado às doenças bacterianas, ocorreu em

menos da metade dos casos das crianças com amostras positivas para bactérias

classicamente patógenas de diarréia aguda, enquanto naquelas com positividade

para RV e protozoários, foi demonstrado em mais de 70% dos casos.

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O vômito foi o sintoma predominante associado às evacuações líquidas, ocorrendo

em 87% de todas as amostras com positividade para qualquer agente infeccioso, o

que justifica a utilização do termo gastrenterite aguda como sinônimo do quadro

clínico desenvolvido por uma criança com diarréia aguda. O vômito associado à

diarréia se constitui em um agravante durante o tratamento destas crianças, pois

pode dificultar a hidratação oral e aumentar os índices de internação (Ribeiro, 2000).

Isto pode cursar com aumento dos custos do Estado e sobrecarregar o sistema de

saúde (Ribeiro, 2000). Por outro lado, crianças que apresentam resolução

espontânea através de administração de soro de reidratação oral, não recorrendo ao

atendimento médico não são computadas epidemiologicamente e muito menos

investigadas do ponto de vista etiológico. Estes dois motivos reforçam a necessidade

de estudos ambulatoriais e hospitalares objetivando a prevalência dos agentes

infecciosos da doença diarréica, evolução clínica e custos para nossa população

usuária do sistema único de saúde (SUS). Comparações das crianças com diarréia

aguda com grupos controle promoveriam a identificação dos fatores de risco e, seu

seguimento, avaliação da repercussão clínica e laboratorial de acordo com a faixa

etária para cada enteropatógeno. A partir destes dados, a proposição de soluções

e/ou estratégias específicas seria fundamental para o planejamento do destino de

verbas na saúde, beneficiando as populações de baixo nível sócio-econômico que

buscam o sistema de saúde municipal ou estadual. Investimentos na prevenção, tais

como vacinação para o RV, educação populacional para conhecimento da doença e

divulgação das principais etiologias para os profissionais que trabalham nos locais

de atendimento destas crianças, seriam importantes fatores para redução da

morbidade e mortalidade infantil.

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7. CONCLUSÕES

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7. CONCLUSÕES

 Enteropatógenos foram detectados em mais de 60% de cada grupo

pesquisado de crianças com diarréia; sendo o grupo das bactérias (todas as

categorias de DEC, Salmonella e Shigella) foram mais prevalentes (41,5%) do

que os outros grupos de enteropatógenos (vírus e protozoários);

 Excluindo-se as bactérias possivelmente patógenas (EPEC atípica, EAEC e

DAEC), os RV foram mais prevalentes nas crianças com diarréia aguda do

que as bactérias classicamente patógenas (EPEC típica, ETEC, EIEC,

Salmonella e Shigella);

 Das bactérias, o grupo de maior prevalência foi o das DEC, seguida por

Shigella e finalmente pela Salmonella;

 EPEC típica e EIEC foram detectadas somente nas crianças com diarréia

aguda e em baixa prevalência na população estudada;

 ETEC foi detectada, predominantemente, nas crianças com diarréia aguda;

 EPEC atípica, DAEC e EAEC não estão associadas nas crianças com diarréia

aguda na população estudada, devido à alta prevalência em crianças com e

sem diarréia aguda;

 A EAEC esteve relacionada com a diarréia aguda somente nas crianças

acima dos dois anos de idade;

 Anti-soros comercialmente usados na rotina diagnóstica das E. coli, não são

adequados para discriminação de cepas patógenas de DEC;

 O uso de técnicas moleculares, como a hibridização para determinação dos

genes de virulência, é importante para evidenciar todas as categorias de E.

coli;

 O RV apresenta alta prevalência na população estudada (35,2%),

predominantemente nos menores de 18 meses de vida, com o maior número

de casos ocorrendo de março a setembro de 2003;

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 A detecção do Ad em alta percentagem com o RV e a não discriminação das

espécies entéricas não permite inferir sua participação na diarréia aguda;

 As associações entre enteropatógenos foram freqüentes nas amostras

estudadas, sendo os protozoários, o grupo de enterópatógenos com o maior

número de associações;

 Dos protozoários avaliados, apenas G. lamblia parece ser agente etiológico

isolados de diarréia aguda;

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8. PERSPECTIVAS

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8. PERSPECTIVAS

Este estudo foi o primeiro realizado no Espírito Santo para esclarecimento da

etiologia infecciosa da diarréia aguda infantil, unindo achados laboratoriais com o

quadro clínico destas crianças. Mas a prevalência de outros enteropatógenos como

Campylobacter, Yersinia, Aeromonas, Astrovirus, Calicivirus e Strongyloides não foi

pesquisada, o que poderia aumentar ainda mais o percentual de positividade destas

amostras. Portanto, neste mesmo material obtido, é importante que sejam

evidenciados ácidos nucléicos de astrovírus e de calicivírus, assim como a

discriminação das espécies entéricas de Ad através de PCR, como seqüência

determinação da etiologia infecciosa.

Este pode ser o primeiro passo para conscientização dos profissionais que lidam

com estas crianças e através destes resultados, despertar o interesse pelo estudo

aprofundado das diarréias infantis, possibilitando a capacitação de recursos

humanos no atendimento e de laboratórios no diagnóstico da diarréia.

Estudos posteriores com o conhecimento de genótipos circulantes de RV,

determinação das espécies de Ad completariam o raciocínio epidemiológico para

investimentos em medidas profiláticas para o controle das diarréias infantis, causa

importante de mortalidade infantil.

A conduta adotada no tratamento imediato da criança com doença diarréica aguda

provavelmente não sofrerá mudanças pela determinação do agente etiológico, mas

posturas deverão ser tomadas na Saúde pública, com intuito de minimizar custos,

taxas de morbi-mortalidade infantil e monitorização indireta das condições de

saneamento básico da população. A implantação de programas educacionais ou

continuação daqueles com enfoque nos fatores de risco para doença diarréica, tais

como a manutenção do aleitamento materno exclusivo por seis meses e sua

manutenção até o segundo ano de vida, além de programas de vigilância dos

agentes etiológicos, permitiria a precisa indicação de medidas preventivas como a

vacina, no caso dos RV.

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9. TRABALHOS APRESENTADOS

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9. TRABALHOS APRESENTADOS

9.1. Tema livre do XVIII Congresso Espiritossantense de Pediatria e V Encontro

Minas, Goiás e Espírito Santo de Nutrição:

Diarréias agudas em crianças residentes na Região Metropolitana de Vitória:

pesquisa de Rotavirus e Adenovirus no período de nove meses.

9.2. Poster apresentado no 6

International Rotavirus Symposium – Cidade do

México – 2004:

Rearrangements of rotavirus gene segments detected in children with acute

gastroenteritis in Rio de Janeiro and Vitória, Southeast Region, Brazil

9.3. Tema livre na XIV Jornada de Iniciação Científica da UFES - 2004:

Rotavírus e Adenovírus : detecção imunoenzimática e molecular em casos de

Diarréia Aguda

9.4. Poster no XV National Meeting of Virology, 2004:

Rotavirus IN ACUTE DIARRHEA IN Vitória, ESPÍRITO SANTO STATE.

9.5. Poster do XLI Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical e do I

Encontro de Medicina Tropical do Cone Sul, 2005.

OCORRÊNCIA DE ANTÍGENOS FECAIS DE Entamoeba histolytica,

Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia EM AMOSTRAS FECAIS DE CRIANÇAS

MENORES DE TRÊS ANOS DE IDADE PORTADORAS DE DIARRÉIA EM

VITÓRIA – ES

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10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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acesso em 06/10/2004

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tm.

http://www.datasus.gov.br/ último acesso -01/09/2005

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

127

11. ANEXOS

___________________________________________________________________

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

128

Anexo 1: Carta de aprovação pelo Comitê de Ética da UFES - Vitória - ES

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

129

2: Ficha de dados clínico – epidemiológicos:

NOME COMPLETO:

IDADE: (em meses) = DATA: hora coleta:

Dn: / / SEXO: COR:

Nome do Pai:

Idade:

Instrução :

Nome da Mãe:

Idade:

Instrução :

Endereço: Bairro:

Cidade: Estado: Renda familiar:

Telefone de contato:

Antecedentes pessoais :

Nºde gestações = Nascidos vivos= Filhos vivos = Pré–natal gestacional

Sim  Não 

Intercorrências

 Ameaça aborto  Infecção congênita  Anemia  outros

Tipo de Parto

Normal  Cesárea 

Tempo no hospital (Em dias) =

Peso nascimento = g

Altura nasc. = cm

Intercorrências neonatais

 Prematuridade  Sepse ou infecção congênita  outros ____________________________

Doenças Anteriores:

Diarréia:(quantos episódios?): Internações por diarréias:

Não  SIM Quantas vezes?

Outras doenças;

 Baixo peso  RGE  Cardiopatia  pneumonia  outras

Alimentação :

Leite Materno até (em meses) = ______ Exclusivo _________ Introdução de suco ou chá : _____

Início do Aleitamento Misto (LM + LV):  nasc. ____m

Só Outros Leites: LV  soja  cabra  Quando?  desde nasc. 

______meses

Introdução de alimentos: Frutas  aos _________m Comida de sal  aos __________m

Forma de Administrar: mamadeira  colher 

Preparo: imediato . Até 2 h  > de 2 h antes 

Uso de chupeta  Chupa dedo 

Ambiente:

Casa de Alvenaria  madeira  Água encanada e tratada  água de poço  Outra fonte 

Rede de esgoto  Fossa Sanitária  Filtro 

Número de cômodos: até 2  de 2 a 4  4 a 6  > 6 

Número de habitantes ________adultos _______crianças

Animal em casa: Sim  Não  Qual?_____________________________

Frequenta creche: Sim  Não 

Contato em creche ou casa com pessoas com mesmos sintomas?  não  sim .Quem? ____________________

Clínica :

Medicações em uso =  sim  não  ANTIBIÓTICO? Qual? _____________________ Anti-helmíntico?____________________-

Diarréia duração: ________ em dias .

Número de evacuações/dia : <5  de 5 a 10 X  de 10 a 15 X  > de 15 X 

Vômitos: Sim  Não  Febre: Sim  Não 

Sintomas respiratórios (tosse ou coriza) : Sim  Não 

Anorexia: Sim  Não 

Dor abdominal: Sim  Não 

Presença de: Sangue Sim  Não  Muco Sim  Não  Pus Sim  Não 

Aspecto :  líquidas  semi-líquida  semi-pastosa  pastosas  endurecidas

Exame Físico: Hidratado  desidratado 

Encaminhado: TRO  SNG  ou EV 

Peso: _____________ Estatura: _________

Se desidrat., após hidratação Peso: _______Foi internado?  sim  não . Onde _________________________________________

Laboratório de Micro :

1) material Bact  sim  não Resultados ____________________________________________________________( / / )

2) material vírus  sim  não Resultados____________________________________________________________( / / )

3) material Parasito  sim  não Resultados ________________________________________________________( / / )

4) suspeita clínica ?________________________________________________________

5) Outros dados relevantes (hemograma, evolução, etc..)

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

130

Anexo 3: Termo de consentimento livre e esclarecido

Termo de Consentimento

Eu, ________________________________________(nome completo

do pai, da mãe ou responsável pela criança) responsável por

_______________________________________ (nome da criança)

autorizo a coleta das fezes para o estudo sobre diarréia aguda em

crianças.

Vitória ,_______/__________/2004

______________________________________________

Nome e Assinatura do responsável

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

131

Anexo 4: Procedimentos realizados nas amostras fecais colhidas em Vitória – ES

Origem das amostras fecais

Diarréia aguda (n = 253) Sem diarréia (n = 78)

Método diagnóstico

amostras

processadas

positivas

amostras

processadas

positivas

Cultura* 241 219 78 68

Sorologia (Aglutinação)*

a) Anti-soro policlonal

EPEC 219 9 78 0

EIEC 28 0 78 0

Shigella 49 11 78 0

Salmonella 14 7 78 0

b) Anti-soro monoclonal

†

219 90 68 31

EIERA*

a) RV

b) Ad

148

147

EGPA* 230 81 72 1

EIE para protozoários* 88 30 4 2

Local de realização* NDI

†

UNIFESP

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

132

Anexo 5: Meios de Cultura e Soluções usadas:

1. Meios para isolamento e identificação das bactérias

I) Meios comerciais (preparados segundo instruções do fabricante e adquiridos do

comércio ou preparados em nosso laboratório)

a) Cary-Blair (Bencton Dickinson)

b) Caldo Selenito (Merck)

c) Ágar MacConkey (Merck e Difco)

d) Ágar SS (Merck e Vetec)

e) Ágar XLD (Diagnostics Pasteur)

f) Fenilalanina (Bencton Dickinson)

g) TSI (Merck)

h) Citrato (Merck)

i) SIM (Biobrás)

j) Ágar nutriente (Vetec)

II) Outros Meios

a) MiLi

Extrato de levedura 0,6 g

Peptona 2,0 g

Triptona 2,0 g

L-lisina 2,0 g

Glicose 0,2 g

Ágar-ágar 0,4 g

Púrpura de bromocresol 0,004 g

Água destilada 200 ml

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

133

b) Caldo peptonado

NaCl 1 g

Peptona 4 g

Água destilada 200 ml

c) Caldo VMVP:

Peptona 5 g

HPO

5 g

Glicose 5 g

Água destilada 1000 ml

III) Soluções:

a) Reativo de Kovacs :

Álcool isoamílico 30 ml

p-dimetilaminobenzaldeído 2 g

HCl concentrado 10 ml

b) FeCl

10% :

FeCl

10 g

Água destilada 100 ml

c) Vermelho de Metila :

Vermelho de metila 0,1 g

Álcool 95% 300 ml

Água destilada 500ml

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

134

2 Soluções e reagentes utilizados para identificação dos RV

a) Sílica:

Dióxido de Sílica (SigmaChemical Company)

60 g

Água destilada q.s.p.

500 mL

b) Tampão L2:

Isotiocianato de guanidina (Gibco BRL.)

120 g

Tris-HCl 0,1 M, pH 6,4 (Gibco BRL)

100 mL

c) Tampão L6:

Triton X-100

2,6 g

Isotiocianato de guanidina (Gibco BRL)

120 g

EDTA 0,2M pH8,0 (Sigma Chemical Company)

22 mL

Tris-HCl 0,1 M, pH 6,4 (Gibco BRL.)

100 mL

d) TampãoTris-Ca

pH 7,2:

Tris base 0,01M (Gibco BRL)

1,21 g

Cloreto de cálcio 0,0015M (Vetec Química Fina Ltda.)

0,22 g

Água Milli-Q q.s.p.

1000 mL

e) Tampão Lower-tris 4X pH 8,8:

Tris base (Gibco BRL)

36,34 g

Água Milli-Q q.s.p.

200 mL

f) Tampão Upper-tris 4X pH 6,8:

Tris base (Gibco BRL)

12,12 g

Água Milli-Q q.s.p.

200 mL

g) Persulfato de amônia a 10%:

Persulfato de amônia*

1 g

Água Milli-Q q.s.p.

10 mL

*Sigma Chemical Company

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

135

h) Acrilamida/Bisacrilamida 50/1,3%:

N’ N’ Metileno-Bisacrilamida*

1,3 g

Acrilamida (Sigma Chemical Company)

50 g

Água Milli-Q q.s.p.

100 mL

i) Gel separador 7,5%:

Água destilada 11,4 mL

Tampão Lower-tris pH 8,8 5,0 mL

Acrilamida / bisacrilamida 50/1,5% 3,0 mL

Solução persulfato de amônio 2%* 0,6 mL

TEMED (Sigma Chemical Company)

10 µL

j) Gel concentrador 4%:

Água destilada

3,05 mL

Tampão Upper-tris pH 6,8

1,25 mL

Acrilamida/bisacrilamida 50/1,5%*

0,4 mL

Solução persulfato de amônio 2%*

0,3 mL

TEMED (Sigma Chemical Company)

7,5 µL

k) Solução fixadora:

Etanol (Merck)

20 mL

Ácido Acético (Grupo Química)

1 mL

Água destilada q.s.p.

200 mL

l) Solução de nitrato de prata 0,001M:

Nitrato de prata (Sigma Chemical Company) 0,185 g

Água destilada q.s.p. 100 mL

m. Solução reveladora:

NaOH (Merk) 6 g

Formaldeído (Química Moderna) 1,5 mL

Borohidreto de sódio (Sigma Chemical Company) * 40 mg

Água destilada q.s.p. 200 mL

Diarréia Aguda Infecciosa em Crianças

___________________________________________________________________________

136

n. Solução de ácido acético 5%:

Ácido acético (Grupo Química) 10 mL

Água destilada q.s.p. 200 mL

o. Solução de etanol 10%:

Etanol (Merck) 20 mL

Água destilada q.s.p. 200 mL

p. Solução para conservar o gel (desidratante):

Metanol (Merk) 130 mL

Glicerina (Isofar) 1 mL

Água destilada q.s.p. 200 mL

q. Tampão Tris-Glicina 4X pH 8,2:

Tris base (Gibco BRL) 12 g

Glicina (Sigma Chemical Company) 57,68 g

Água destilada q.s.p. 1000 mL

Obs. :A solução foi diluída 1X para uso.

Anexo 6: Organograma resumindo o destino das amostras fecais após coleta

–

(

)

(

)

–

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

Exclusão 12 casos*

* Fo

ram colhidas 331 amostras:

253 de

crianças

com diarréia aguda e 78 sem diarréia para

detecção dos 3 grupos de agent

es, mas 12

amostras foram excluídas

na pesquisa bacteriana

(crianças em uso de anti-microbiano)

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