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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ASSOCIAÇÕES DO ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO E DE APOPTOSE
CELULAR COM CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS,
EPIDEMIOLÓGICAS E HISTOPATOLÓGICAS DO CÂNCER
MAMÁRIO DE CADELAS SEM RAÇA DEFINIDA
CAIO HENRIQUE PAGANINI BURINI
BOTUCATU - SP
Julho 2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ASSOCIAÇÕES DO ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO E DE APOPTOSE
CELULAR COM CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS,
EPIDEMIOLÓGICAS E HISTOPATOLÓGICAS DO CÂNCER
MAMÁRIO DE CADELAS SEM RAÇA DEFINIDA
CAIO HENRIQUE PAGANINI BURINI
Tese apresentada junto ao
Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária para obtenção
do título de Doutor
Orientador: Prof. Dr. Enio Pedone Bandarra
Co-Orientadora: Prof. Ass. Dra. Renée Laufer Amorim
BOTUCATU - SP
Julho 2007
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Banca examinadora:
_______________________________________
Prof
a
. Ass. Dra. Renée Laufer Amorim
_______________________________________
Prof
a
. Dra. Maria Denise Lopes
_______________________________________
Prof. Ass. Dr. Luiz Henrique do Araujo Machado
_______________________________________
Prof. Dr. Paulo César Maiorka
_______________________________________
Prof. Dr. Andrigo Barbosa de Nardi
Botucatu, 10 de julho de 2007
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AGRADECIMENTOS
- Ao meu orientador, Prof. Adjunto Enio Pedone Bandarra, pela orientação e
coragem de ousar trabalhar com novas idéias e conceitos, correndo os riscos inerentes a
esta atitude. A quem dedico admiração pela paixão à pesquisa e ao trabalho, por todos os
ensinamentos, pela confiança e amizade nestes anos de convivência.
- À minha co-orientadora Prof. Ass. Dra. Renée Laufer Amorim pela concessão das
condições necessárias para a realização deste trabalho e principalmente pela amizade.
- À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Unesp – Campus de
Botucatu, e à seção de Pós-Graduação, por toda a ajuda nestes anos, desde a residência
até o doutorado.
- À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos e constante incentivo ao trabalho e
à minha formação.
- Aos Professores Doutores: Carlos Roberto Teixeira, Sheila Rahal, José Joaquim
Titton Ranzani e Cláudia Valéria Seullner Brandão, pelo respeito, amizade e possibilidade
de utilização dos ambulatórios da Clínica e Cirurgia de Pequenos Animais.
- Aos Professores Doutores Nereu Carlos Prestes, Sony Dimas Bicudo, João Carlos
Pinheiro Ferreira e Maria Denise Lopes, por toda colaboração, carinho, incentivo e
amizade no decorrer do experimento.
- Aos Professores Doutores Júlio Lopes Sequeira, Noeme Sousa Rocha, Laura
Figueiredo, Raphael L. Andreatti Filho, Lígia P. Boretti e Márcio Kuchembuck pelos anos
de convivência, respeito, amizade e compreensão.
- Aos amigos César e Hélio, pela valiosa análise estatística de grande parte dos
resultados deste trabalho.
- Às veterinárias Marcela Marcondes Pinto Rodrigues e Giovana Wingeter di Santis
pelo incentivo e apoio irrestrito na busca de soluções para todas as dificuldades
encontradas na condução das análises imunoistoquímica deste experimento.
- Aos Residentes da Clínica Cirúrgica de Pequenos Animais pela intensa amizade,
companheirismo e ajuda imprescindível na coleta de dados para o experimento.
- Aos residentes da Patologia Veterinária, Giuliana, Didier e Arita, como também aos
residentes da Ornitopatologia, Rose, Anita e Ticiana, pela amizade e por tornarem o
doutorado mais divertido!
- Aos amigos Pós-Graduandos Júlio (Jamaica), Paola, Renatinho, Leandrinho,
Pedro (Pânico), Rafael, Guilherme (Ornito), Adriana P. Pessoa, Edna T. de Lima (Galega),
Camila Dias Porto, Luciano Fonseca, Celmira Calderón e Ana Paula, que além da
amizade, ajudaram de alguma forma no bom andamento do projeto.
- Aos amigos veterinários Alfredo F. da Maia Lima, Ana Cristina A. Zablith, Otávio A.
Filho, e tantos outros que foram tão importantes durante estes anos de dedicação à Tese.
- À aluna e amiga Bruna B. Beccheli e a todos os alunos e estagiários que
freqüentaram o laboratório de Patologia, com os quais tive o prazer de desfrutar
momentos agradáveis.
- Aos amigos Maury Raul, Noel de Almeida Mello, Luis A. Matiazzi e Onivaldo
Martins (Vadolino) por sua amizade, alegria e incentivo constante.
- Á amiga Marlene Dias Camargo, por ter tornado estes anos mais divertidos e
agradáveis.
- Ás bibliotecárias Rosemary C. da Silva e Luciana Pizzani, pela correção das
referências bibliográficas e Selma de Jesus pela ficha catalográfica.
- Ás amigas Marluci Betini e Maria Luiza Deléu da Silva, pelo carinho, amizade e
atenção durante estes anos de pesquisa.
- Ào Daniel Cristian Ornelas de Oliveira e Sílvio Geraldo dos Santos Júnior pela
documentação fotográfica e pela atenção demonstrada em todas as situações em que
nos encontramos.
- Ao amigo Antônio Cláudio Morales Júnior (Claudinho) e Edílson de Souza Freire,
pela amizade e pela importante ajuda durante estes anos.
- Enfim, a todos os professores, funcionários e colegas pelo carinho e convivência
agradável, conseguindo transformar o local de trabalho em um ambiente prazeroso.
ÍNDICE
RESUMO...............................................................................................................................2
ABSTRACT...........................................................................................................................3
REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................5
CÂNCER DE MAMA ..........................................................................................................7
OBJETIVOS........................................................................................................................44
MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................45
RESULTADOS ...................................................................................................................55
DISCUSSÃO........................................................................................................................77
CONCLUSÕES...................................................................................................................91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................92
ANEXOS............................................................................................................................118
2
BURINI, C.H.P. Associações do índice de proliferação e de apoptose celular com
características clínicas, epidemiológicas e histopatológicas do câncer mamário de
cadelas sem raça definida.Botucatu, 2007. 126p. Tese (Doutorado em Medicina
Veterinária – Clínica Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
Com o objetivo de caracterizar pelo método histológico e imunoistoquimíco
o câncer de mama de cadelas sem raça definida (SRD) foram estudados 40
animais com distribuição uniforme nos estágios I, II, III e IV da doença. Todos os
animais foram submetidos a anamnese, exame físico e complementares
(Citopatológico, Raio x, Ultra Som) para o estadiamento clínico do câncer (TNMc),
amostra histológica da lesão para caracterização do tipo de tumor e amostra
imunoistoquímica para determinação molecular das células em apoptose (caspase
3) e proliferação (PCNA). A amostra foi caracterizada com predominância de idade
acima de seis anos (92,5%), obesos (57,5%) com ingestão de dieta mista (80%)
caseira-industrial. 80% das cadelas já tiveram cria, apresentando pseudogestação
(40%), tumoração das mamas inguinais (70%), em ambas as cadeias, com
nódulos multicêntricos (82,5%) de incidência bilateral (60%), prevalecendo
nódulos de tamanho inferior a 2cm de diâmetro (37,5%). Prevaleceu o carcinoma
simples (70%) em relação ao carcinoma complexo (30%). Os animais com
carcinoma simples apresentaram características de porte grande (50%),
obesidade (57%), cios regulares (89%) e multíparas (82%) e prevalência idêntica
entre os estadiamentos clínico (70%). O estadio mais grave (IV) esteve associado
aos animais com idade média de 8 anos, ausência de obesidade (60%). A
imunomarcação de PCNA e caspase-3 não apresentou diferença significativa
entre os tipos de tumor, suas características clínicas e grau histológico, no entanto
a caspase-3 teve associação significativa entre o estadiamento clínico (I<III e
II<III) e presença de ulceração tumoral (P<0,049).
Unitermos: cão, câncer mamário, estadiamento clínico, histopatologia,
imunoistoquímica.
3
BURINI, C.H.P. Clinical, epidemiological and histopathological association with
PCNA and apoptose breast câncer cell index of mongrel bitches. Botucatu, 2007.
126p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária – Clínica Veterinária) – Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista.
ABSTRACT
The severity of breast cancer in mongrel animals is not defined yet in its
clinical, histologic and imunoistoquimical associative aspects. With the aim to
establish that characterization we studied 40 bitches, 3-15 years old, mixed breed
attended at the U. Vet. Hospital ambulatories in compliance with current ethical
and pathological rules. The animals were alloted according to their clinical stage in
groups stage I, II, III and IV with 10 animals each. After physical examination and
lifestyle records. The tumor nodules were evaluated macro-and-microscopically,
the later through histopathologicaly and imunoistopathologicaly. From these data
the animals were classified as predominantly up to six years old (92,5%), obese
(57,5%), presenting simple carcinoma (CS) more frequent (70%) than complex
carcinoma type (30%). 80% of the animals wasan´t nuliparus, showing
pseudopregnancies (40%), having multicentric nodules (82,5%) sizing less than
two cm diameter (37,5%), located inguinally (70%) in both side mammary chains.
The immunohistochemistry label for PCNA and caspase-3 were not associated
with tumors type, clinical aspects and histological grade, however only caspase-3
had significant association with clinical stage (I<III and II<III) and tumors ulceration
(P<0,049).
Key words: bitches mammary gland cancer, clinical stages, histopathology,
immunohistochemical.
4
INTRODUÇÃO
Na cadela, as neoplasias mamárias representam as lesões tumorais mais
freqüentes, praticamente em todas as partes do mundo (MOULTON, 1990;
MISDORP et al., 1999). No período de janeiro de 1997 a dezembro de 2005 foram
diagnosticados no Serviço de Patologia Veterinária do Hospital Veterinário FMVZ-
Unesp de Botucatu 1204 casos de neoplasia mamária canina, 1198 (99,5%)
acometeram as fêmeas, sendo 1119 (92,7%) desta considerada maligna, das
quais 585 (48,5%) foram em animais sem raça definida (SRD) (BURINI et al.,
2006).
As características biológicas de um tumor são importantes para estimar o
prognóstico da sua evolução e a conduta terapêutica apropriada. Essas
características podem ser dimensionadas por critérios clínicos,
cito/histopatológicos, imunoistoquímico e bioquímico-moleculares, com
metodologias nem sempre padronizadas e classificações de gravidade nem
sempre consensuais.
Considerando-se a raridade do uso associado desses indicadores em
animais e a inexistência de informações deste tipo em câncer de mama de
cadelas Sem Raça Definida (SRD) de diferentes portes, realizou-se o trabalho
anterior (BURINI, 2002). Dentre os resultados obtidos verificou-se que alterações
bioquímicas pró-oxidantes e obesidade estavam relacionadas às formas clínicas
menos grave da doença enquanto que as alterações bioquímicas de caquexia com
as formas mais graves.
Pretende-se agora associar a gravidade da doença, pelos critérios clínico
(TNMc) e histopatológico, com os indicadores moleculares da apoptose e
proliferação celular (caspase 3 e PCNA) determinados no tecido neoplásico. Para
tanto, foram estudadas 40 cadelas portadoras de câncer de mama, SRD atendidas
no Hospital Veterinário (HV) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia -
Unesp/Botucatu, devidamente triadas e eticamente manipuladas. A classificação
do tipo de câncer e o estadiamento da doença foram associados, estatisticamente,
às alterações imunoistoquímica do câncer mamário de cadelas SRD.
5
REVISÃO DE LITERATURA
Medicina Comparada
Os tumores mamários espontâneos dos canídeos apresentam várias
características epidemiológicas, clínicas, bioquímicas e biológicas semelhantes
aos da espécie humana, motivo pelo qual vêm sendo utilizados como modelos
para o conhecimento dos vários aspectos da carcinogênese mamária humana
(SCHINEIDER, 1970; STRANDBERG, 1974; O`BRIEN, 2000; MARTINS et al.,
2002; CASSALI et al., 2005). Dentre as semelhanças destacam-se a idade do
aparecimento, freqüência, morfologia, órgãos alvo de metástases, evolução
clínica, presença de receptores hormonais, o efeito protetor da ovariectomia e o
tratamento cirúrgico (MOULTON, 1990; ZUCCARI et al., 2001). Os diversos
métodos de diagnóstico também vêem apresentando resultados similares entre
ambas às espécies, reforçando a proposta deste animal como modelo para estudo
da carcinogênese mamária humana (CASSALI, 2000; BURINI, 2002). Em estudos
anteriores foi mostrado boa associação entre os critérios de gravidade clínico e
citopatológico com os estados protéico-energético e de estresse oxidativo das
pacientes com câncer de mama (BURINI, 2002).
Também foi demonstrado que as neoplasias mamárias de cães apresentam
o fenótipo antigênico comparável àquele observado em lesões de mama em
mulheres, como a homologia entre os genes BRCA-1 humano e do cão
(MOTTOLESE et al., 1994; SZABO et al., 1996). Existem, contudo, diferenças
entre os tumores mamários do homem e do cão. Uma das mais importantes diz
respeito à freqüência dos tumores complexos mamários que são raros nos
humanos, mas estão entre os mais freqüentes nos caninos (STRANDBERG &
GOODMAN, 1974; CASSALI, 2000).
Em cadelas, foram observados resultados similares aos descritos na
mulher, tanto pela maior expressão do MIB-1 (marcador imunoistoquímico para
avaliar a proliferação celular) nos tumores malignos da mama, principalmente
6
naqueles menos diferenciados, quanto pela correlação inversa com a
imunomarcação para o receptor de progesterona (CASSALI, 2000). Verificou-se
ainda relação entre o tamanho do tumor e a expressão de receptores para
progesterona, sendo a imunomarcação menor nos tumores maiores que 5cm
(CHIARELLI et al., 2000). Contudo, trabalhos que relacionam os receptores para
esteróides sexuais com o desenvolvimento de tumores mamários na cadela são
escassos.
Em Medicina Veterinária, grande esforço tem sido realizado na tentativa de
acrescentar aos fatores de prognóstico clássicos (tamanho do tumor; presença de
ulceração cutânea; invasão ganglionar linfática) novos parâmetros, de natureza
molecular, que auxiliem a decisão clínica, à semelhança do verificado em
Medicina Humana. Mas com o aumento da freqüência das neoplasias e a
preocupação crescente do proprietário em aumentar e melhorar a sobrevida do
paciente tornam necessária a avaliação da eficácia desses procedimentos, a fim
de incorporá-los na medicina veterinária.
Com isso, o propósito deste trabalho foi estudar uma série de tumores
mamários com o objetivo de determinar a importância prognóstica de algumas
características clínicas, histológicas e imunoistoquimica do câncer de mama em
cadelas SRD.
Histoembriologia da glândula mamária
A mama possui amplo espectro de morfologia normal que varia conforme a
fase do ciclo estral, ou de acordo com a fase da vida do indivíduo; puberdade,
gestação, lactação e involução, ou ainda com o efeito de qualquer droga ou
terapia hormonal (HARVEY, 1996; RAHAL et al., 1995; ZAKHOUR & WELLS,
1999).
Os estágios da mamogênese são definidos pelo desenvolvimento sexual e
reprodutivo da fêmea (IMAGAWA et al., 1994). O principal desenvolvimento pós-
fetal é simultâneo à puberdade, sob a influência dos hormônios ovarianos
7
estrogênios e progesterona (ROSS et al., 1993; BURKITT et al., 1994;
SILVERMAN, 1996; ZUCCARI et al., 2001).
Na formação alveolar, as células mioepiteliais não proliferam na mesma
proporção que o epitélio secretor, permitindo contato direto entre este e a
membrana basal, ou seja, a ação estimuladora desempenhada pelo estroma
torna-se efetiva sobre as próprias células secretoras (GETTY, 1981; EVANS &
CHRISTENSEN, 1993; BURKITT et al., 1994; DYCE et al., 1996; PARK &
JACOBSON, 1996; SILVERMAN, 1996; ZUCCARI et al., 2001).
Os carnívoros domésticos não entram em menopausa, e as mamas
continuam sujeitas às influências hormonais até idade avançada (ZUCCARI et al.,
2001).
CÂNCER DE MAMA
Epidemiologia
De acordo com dados estatísticos obtidos da casuística nacional é possível
caracterizar a elevada incidência de tumores mamários. Estas lesões
representaram aproximadamente 52% de todas as neoplasias na fêmea canina
(SCHNEIDER, 1970; BRODEY et al., 1983; WITHROW & MacEWEN, 1996). Os
estudos desenvolvidos com o objetivo de conhecer a proporção de tumores
mamários benignos e malignos têm conduzido a resultados diferentes, embora
algumas fontes descrevam que aproximadamente 50% dos tumores em cães são
malignos. Entretanto, na literatura pode-se encontrar uma disparidade de dados
no que se refere à prevalência dos tumores malignos, com valores superiores a
70%. Talvez isto possa ser explicado, em parte, pela dificuldade encontrada em
proceder ao diagnóstico diferencial entre neoplasias benignas e malignas da
mama de cadelas, possivelmente devido à falta de uniformidade nos critérios de
distinção entre os dois tipos de lesões, sobretudo no caso de tumores do tipo
complexo (CASSALI, 2000; BURINI, 2002).
8
Os tumores mamários acometem com maior freqüência fêmeas entre 10 e
11 anos de idade, sendo rara em animais com menos de 5 anos de idade
(WITHROW & MACEWEN, 1996).
A princípio não existe predileção racial, mas alguns trabalhos apontam as
raças Poodles, English Spaniel, Brittany Spaniel, English Setter, Pointer, Fox
Terrier, Boston Terrier e Cocker Spaniel como predisponentes. Os animais das
raças Boxer, Grey Hounds, Beagles e Chihuahuas apresentaram menor risco de
desenvolverem neoplasias mamárias (MEUTEN, 2002; RUTTEMAN et al., 2001).
Etiologia
O aparecimento de tumor maligno resulta de uma série de eventos
diferentes, gerando uma célula transformada (GATENBY & FRIEDEN, 2002).
Dentre os estímulos iniciais dessas; amplificações, mutações, translocações,
deleções e desregulação gênica figuram as ações de radiações ionizantes, vírus,
hormônios e radicais livres. Dentre esses agentes, o viral e a radiação são pouco
consensuais (ZUCCARI et al., 2001).
As células dos tumores malignos apresentam genes que se expressam de
modo instável e diversificado com conseqüente desregulação da diferenciação
celular. Há geralmente, o envolvimento de três classes de genes, os proto-
oncogenes, os genes oncossupressores e os genes que regulam a apoptose. A
transformação induzida por substâncias químicas metabolizadas no organismo ou
no interior de determinadas células produz reagentes que causam danos ao DNA
induzindo a mutações somáticas, como é o caso dos genes mutados BRCA-1,
BRCA-2 e p53 do tumor de mama (LESLIE & HOWARD, 1992).
Do ponto de vista genético as neoplasias mamárias em humanos
manifestam-se como esporádicas, familiares ou hereditárias. A forma esporádica
resulta de mutação cromossômica em indivíduos até então sem pré-disposição à
doença. Na forma familiar a doença está presente em dois ou mais indivíduos
parentes em primeiro ou segundo graus. Por fim, a forma hereditária é
caracterizada por padrão autossômico dominante de transmissão, o que determina
9
alto risco e precocidade etária ao diagnóstico. Em cadelas, a forma hereditária de
neoplasia mamária é maior em raças definidas como Pointers, Retriviers, English
Setters e Spaniel, Poodles, Boston Terriers e Daschunds (MOULTON, 1990).
A dieta figura entre os principais responsáveis pela etiologia e prevenção do
câncer, sendo a principal rota de exposição dos animais aos carcinógenos
químicos (GREENWALD, 1999; GREENWALD et al., 2001). Dietas contendo
elevados níveis de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAS) podem favorecer seu
acúmulo nos tecidos, tornando-os mais vulneráveis para a peroxidação lipídica,
especialmente se a peroxidação superar o mecanismo antioxidante (WANDER et
al., 1997; OBERLEY, 2002; BURINI, 2002; BURINI et al., 2004). Adicionalmente,
gorduras saturadas são pró-inflamatórias e imunossupressoras enquanto que as
insaturadas não. Destas últimas, os ácidos graxos ômega-3 são anti-inflamatórios
e imunoestimulantes, diferentemente dos ácidos graxos ômega-6 (DAS, 2001).
No que se refere à dieta PELETEIRO (1994); PEREZ et al. (1998) e
SOREMNO (1998) concluíram que o risco de desenvolvimento de neoplasias
mamárias pode estar ligado a fatores nutricionais os quais interagem já nos
primeiros meses de vida. Os pesquisadores constataram que a obesidade no
primeiro ano de vida, assim como um ano antes do diagnóstico pode predispor as
fêmeas às neoplasias.
A alimentação caseira, principalmente a alta ingestão de carnes bovinas e
suínas apresentou correlação positiva com o desenvolvimento tumoral em cadelas
(FIDLER & BRODEY, 1967; FERGUSON, 1985).
Cada vez mais estudos clínicos, epidemiológicos e experimentais mostram
o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (ERO) nos processos
neoplásicos (BURINI, 2002; HEATON et al., 2002). As ERO são potencialmente
capazes de oxidar proteínas, lipídios, organelas citoplasmáticas e materiais
genéticos. Têm-se postulado que estas alterações poderiam propiciar o
aparecimento de alteração celular neoplásica (GALIZIA & WAITZBERG, 2001;
OBERLEY, 2002).
As hipóteses mais citadas sobre a etiologia dos tumores mamários referem-
se à obesidade e à atividade hormonal (SCHNEIDER et al., 1969;
10
SONNENSCHEIN et al., 1991; MORRISON, 1998; ZUCCARI, et al., 2001). Os
autores acima descritos são unânimes em afirmar que alguns tumores mamários
são hormônio-dependentes. A hipótese do envolvimento hormonal na etiologia
dessas neoplasias tem sido a mais aceita, pois os pesquisadores constataram que
o risco de desenvolvimento de tumores mamários é de 0,5% em fêmeas
esterilizadas antes do 1º estro. Este risco é de 8% e de 26% em fêmeas
submetidas à ovariohisterectomia após o 1º e 2º ciclo estral, respectivamente.
ZUCCARI et al. (2001) citaram que em pesquisas realizadas na Califórnia (EUA)
foi observado que as fêmeas da espécie canina não esterilizadas cirurgicamente,
apresentaram incidência de tumores mamários 4 a 7 vezes maior quando
comparadas as fêmeas submetidas à ovariosalpingohisterectomia. Em
decorrência disso, atualmente preconizasse a esterilização cirúrgica precoce,
antes do primeiro estro, em fêmeas da espécie canina.
Estado endócrino/Carcinogênese hormonal
Os hormônios estão dentre os vários fatores indutores ou promotores da
carcinogênese. Sejam endógenos ou exógenos, eles estimulam a proliferação
celular predispondo às alterações genéticas (HENDERSON et al., 1988;
HENDERSON & ROSS, 1996; HENDERSON & FEIGELSON, 2000). Mas, ainda
há controvérsias sobre a gênese das neoplasias hormônio-dependentes. Postula-
se que na carcinogênese hormonal, diferente daquela induzida por vírus ou
agentes químicos, a proliferação celular não necessita de um agente iniciador
específico.
Os hormônios induzem proliferação celular com conseqüentes mutações
genéticas que darão origem à célula neoplásica (MEUTEN, 2002). No entanto,
para CARREÑO et al. (1999), a participação dos hormônios na carcinogênese se
restringe à proliferação das células já transformadas por outros carcinógenos. Os
genes específicos envolvidos na progressão das neoplasias hormônio-
dependentes permanecem desconhecidos, contudo, acredita-se que os
oncogenes, os genes supressores tumorais e os genes do reparo do DNA estejam
11
envolvidos na carcinogênese hormonal, principalmente naquela induzida pelos
esteróides sexuais (GUYTON, 1991; HENDERSON & FEIGELSON, 2000).
As neoplasias hormônio-dependentes podem originar-se de mutações
genéticas resultantes da proliferação de células normais ou da multiplicação de
células já transformadas por outros carcinógenos. Alguns hormônios e drogas anti-
hormonais estão sendo utilizados com sucesso no tratamento dessas neoplasias
em humanos (SILVA et al., 2004). Apesar da freqüência elevada das neoplasias
hormônio-dependentes nos animais, seu tratamento com antagonistas hormonais
e fármacos anti-hormonais, bem como a identificação imunoistoquímica de
receptores hormonais nas neoplasias não fazem parte da rotina dos hospitais
veterinários (CASSALI, 2000).
O estilo de vida da sociedade moderna contribui para aumentar a exposição
da população a alguns fatores ambientais, nutricionais, químicos e hormonais
potencialmente carcinogênicos. É claro que a interferência do homem nos hábitos
alimentares dos animais e no seu ambiente também o coloca sob o mesmo risco.
Talvez essa seja uma das explicações que eqüivale no homem e nos animais
(MOULTON, 1990). Na oncologia, é necessário ir além do diagnóstico e buscar
informações sobre o prognóstico e a terapêutica mais eficiente para a neoplasia
em questão. No câncer de mama humano, a imunomarcação de receptores para
estrógeno e progesterona auxilia na escolha do tratamento. Mas, as chances de
sucesso também estão relacionadas com o diagnóstico precoce já que as
neoplasias decorrentes dos desequilíbrios hormonais, na sua fase inicial, ainda
são hormônio-dependentes com melhor prognóstico em comparação àquelas que
já adquiriram independência hormonal (NORMAN & LITWACK, 1997).
Em cães e gatos, a progesterona exógena estimula a síntese de hormônio
do crescimento na glândula mamária com proliferação lóbulo-alveolar e
conseqüente hiperplasia de elementos mioepiteliais e secretórios, induzindo a
formação de nódulos benignos em animais jovens (MOL et al., 1997; RUTTEMAN
et al., 2001; MEUTEN, 2002). O estrógeno estimula o crescimento ductal.
Entretanto, o risco de desenvolvimento de neoplasias malignas tem sido
12
observado na administração contínua e em altas doses de estrógeno associado a
progesterona (MORRISON, 1998; RUTTEMAN et al., 2001).
Receptores para estrógeno, progesterona, andrógenos, prolactina e para o
fator de crescimento epidermal já foram demonstrados nos tumores de mama de
cadelas, havendo também a coexistência desses receptores numa mesma
neoplasia (MEUTEN, 2002).
Estudos epidemiológicos demonstraram que a administração de esteróides
ovarianos ou derivados sintéticos aumentou a formação de tumores mamários nas
cadelas (RUTTEMAN, 1990). A incidência de neoplasia mamária benigna
aumentou após o tratamento com progestágenos exógenos nas cadelas
(MISDORP, 1988).
Acredita-se que exista relação entre o número desses receptores e a
capacidade proliferativa das células neoplásicas (COSTA et al., 2002). Na cadela,
é elevada a proporção de tumores benignos da mama positivos para receptores
de estrógeno e progesterona. Ao contrário, apenas uma parte das neoplasias
malignas apresentam esses receptores e em concentrações menores (CASSALI,
2000; GERALDES et al., 2000), pois com a progressão do tumor e aumento da
malignidade ocorre redução da dependência hormonal e maior autonomia das
células neoplásicas (MENDONÇA et al., 1992; GERALDES et al., 2000). Além
disso, há correlação inversa entre o número de receptores para estrógeno com a
atividade da glucose-6-fosfatase e da 6-fosfogluconato-desidrogenase, enzimas
conhecidas por estarem relacionadas com a malignidade das células neoplásicas
(NERURKAR et al., 1990).
Em 1994 evidenciou-se a produção de hormônio do crescimento (GH) nas
glândulas mamárias, estimulado pela progesterona. Essa descoberta iniciou
investigações a respeito dos efeitos biológicos do GH mamário sobre a glândula
mamária dos cães; mais especificamente a relação do GH mamário na biologia da
glândula, durante a fase lútea do ciclo ovariano. Além disso, desde que os
progestágenos foram associados ao aumento da incidência de tumores mamários
nos cães a questão discutida foi se o GH mamário poderia mediar os efeitos
tumorogênicos da (vanGARDEREN & SCHALKEN, 2002).
13
Tanto a progesterona endógena como a exógena pode estimular produção
excessiva de GH nas cadelas. Essa produção de GH pelas mamas não é
exclusiva dos cães; é também observada em amostras de tecido mamário normal,
lesões benignas e malignas na mulher (MOL et al., 1996).
O efeito promotor da progesterona, sobre o tumor mamário nas cadelas,
depende de seu efeito estimulador sobre o hormônio do crescimento - GH. A
progesterona aumenta a produção de GH nos cães; o que permanece incerto é se
a produção elevada de GH é o fator responsável pela indução do tumor mamário
ou se representa apenas um efeito secundário da progesterona, sem relação com
o fator promotor tumoral primário associado a esse hormônio. (RUTTEMAN,
1990).
Receptores para estrógeno (ER), progesterona (PR) e para prolactina (PRL-
R) estão presentes no tecido mamário normal das cadelas. Tumores mamários
benignos mostram positividade para ER, PR e PRL-R; ao contrário neoplasias
primárias malignas apresentaram baixas concentrações desses receptores
(HENDERSON et al., 1988; RUTTEMAN, 1990; MILLER, 1991). O envolvimento
da prolactina no tumor de mama nas cadelas é incerto. O número de receptores
descoberto nos tumores de mama benignos não é mais alto do que no tecido
normal, e somente 30% dos tumores malignos apresentam receptores para
prolactina (RUTTEMAN, 1990; MISDORP, 1988).
A descoberta que os níveis de ER, PR e PRL-R nos tumores mamários
malignos e nas metástases são mais baixos do que na glândula normal e nas
lesões benignas, indicam uma perda do controle da função gênica para esses
receptores (RUTTEMAN, 1990; MISDORP, 1988).
O crescimento do tecido mamário normal e/ou neoplásico é estimulado não
só pelos hormônios esteróides, mas também por fatores de crescimento, como o
fator de crescimento epidermal (EGF) e o fator de crescimento transformador
(TGF-α). Tem sido sugerido que a expressão dos genes que controlam esses
fatores de crescimento, ou seus receptores, nas células "transformadas" poderiam
resultar em um crescimento seletivo e escapar de um mecanismo de controle
normal (MOL et al., 1996).
14
A glândula mamária é um dos órgãos mais dinâmicos do organismo e tanto
a divisão celular como a morte celular programada, apoptose, são altamente
controladas (MOL et al., 1996).
Um dos controladores mais importantes da divisão celular nos mamíferos é
representado pelo eixo hipófise – GH / fígado (fator de crescimento semelhante à
insulina - IGF-I) (HENDERSON & ROSS, 1996).
O risco de desenvolvimento do câncer de mama é essencialmente
determinado pela intensidade e duração da exposição do epitélio mamário à ação
conjunta da prolactina e do estrógeno (KOJIMA et al., 1996). Aparentemente a
prolactina facilita a ação mitótica do estrógeno, aumentando o número de seus
receptores. Mas a possibilidade da prolactina estimular a atividade mitótica das
células do epitélio mamário não pode ser afastada (MULDOON, 1981). O
estrógeno promove o crescimento celular por estimular a liberação do fator de
crescimento tumoral alfa e fator de crescimento semelhante à insulina (NORMAN
& LITWACK, 1997).
Existem evidências entre altos níveis do fator de crescimento semelhante à
insulina ligado a proteína-3 (IGFBP-3) com pior prognóstico em carcinomas
invasivos mamários na mulher, sugerindo seu potencial mitogênico (VESTEY et
al., 2005).
A progesterona induz modificações importantes na glândula mamária,
criando um ambiente altamente proliferativo no interior da mama. Concentrações
elevadas de GH, juntamente com níveis crescentes de IGF-I e II, estimulam o
recrutamento das "stem cells", seguida pela proliferação e diferenciação celular
como observada em outros tecidos. Alteração da fase de proliferação da glândula
mamária pode provocar a formação de tumores malignos e benignos (MOL et al.,
1996; vanGARDEREN & SCHALKEN, 2002).
Progesterona, GH, e IGF-I têm um papel essencial em tornar a glândula
mamária mais susceptível aos fatores carcinogênicos indutores de mutações,
resultando no desenvolvimento do tumor ou estimulando o crescimento de
tumores já estabelecidos (MOL et al., 1996).
15
Durante a fase lútea do ciclo ovariano, a glândula mamária é caracterizada
por proliferação transitória e diferenciação das células epiteliais. A sugestão que o
GH mamário estimulado pela progesterona, possa mediar essa proliferação,
associada a progesterona representa uma hipótese (MOL et al., 1996; van
GARDEREN et al., 1997).
Como representação do ciclo ovariano caracterizando as modificações
morfológicas do tecido mamário, têm-se: a fase inativa do tecido mamário que
coincide com a fase de anestro do ciclo ovariano, nessa fase o tecido mamário
consiste principalmente de ductos; o estágio de proliferação do tecido mamário,
que corresponde á fase lútea do ciclo, a mama é caracterizada por um
crescimento nodular dos ductos, esse crescimento é representado por uma
população de células epiteliais que se proliferam transitoriamente; a fase de
diferenciação onde essa população celular se transforma em tecido glandular
lóbulo/alveolar, com capacidade de síntese protéica e o estágio de regressão,
onde a estrutura alveolar involui por apoptose das células epiteliais, as quais são
ingeridas pelos macrófagos e/ou células vizinhas (van GARDEREN & SCHALKEN,
2002).
Receptores para hormônios tireoidianos também já foram observados na
glândula mamária normal e neoplásica, sugerindo a participação dos hormônios
da tireóide no câncer de mama da mulher (NOGUEIRA & BRENTANI, 1996). No
hipotireoidismo, o aumento da secreção de prolactina tem sido incriminado como
um dos fatores que agravam o prognóstico da neoplasia mamária (SMYTH, 1997).
Tipos de câncer mamário
Os adenocarcinomas mamários são neoplasias epiteliais dos ductos
mamários maiores, dos ductos interlobulares, dos ductos intralobulares e dos
alvéolos. Compreendem três padrões de proliferação: acinar, tubular ou papilar,
dependendo do arranjo que as células neoplásicas apresentem, embora
habitualmente, seja possível observar vários padrões em diferentes locais de uma
mesma neoplasia. Além disso, proliferações mioepiteliais em matriz
16
condromucinosa – que caracterizam as formações complexas – também podem
ser observadas. Os tumores mistos, por sua vez, apresentam proliferação de
células mioepiteliais, à semelhança dos tipos complexos de adenocarcinoma mas,
nesse caso, estas células se diferenciam em ilhas de tecido cartilaginoso e/ou
ósseo podendo, inclusive, apresentar medula hematopoética (MISDORP et al.,
1973; ZEZZA NETO, 1997).
Carcinoma in situ é freqüentemente multicêntrico e não é geralmente
visível. Pode ser parte de lesões fibrocísticas ou encontrado acidentalmente
próximo a carcinomas invasivos e outros tipos de tumores. O carcinoma não
invasivo tipo simples são freqüentemente encontrados em cães. Não há relatos
sobre a versão não invasiva do tipo complexo. As células tumorais não invadem a
membrana basal e podem ter várias apresentações: cribriforme, sólido,
eventualmente com necrose central (comedo). A diferença entre carcinoma in situ
e hiperplasia típica ou atípica pode ser difícil, especialmente para aqueles de
células pequenas (MOULTON, 1990).
O carcinoma complexo é relativamente comum em cães. Geralmente são
tumores lobulados, composto por células epiteliais e mioepiteliais (TAVARES et
al., 2006). O epitélio luminal pode ter apresentação tanto tubulopapilar como
também sólida. Pode ocorrer metaplasia escamosa em alguma porção. O tipo
fusiforme de células mioepiteliais são freqüentemente arranjados de forma
reticulada. A substância mucóide intercelular ocasionalmente encontrada deve ser
diferenciada de cartilagem imatura que é encontrada nos carcinossarcomas, os
quais são caracterizados pela presença de células entremeadas em lacunas de
matriz cartilaginosa e/ou óssea (ABURTO et al., 1997; ZEZZA NETO, 1997). O
crescimento expansivo é comum, e a invasão junto aos vasos linfáticos é rara
(10%). Diferenciar carcinoma complexo bem diferenciado de adenoma complexo
pode ser difícil. Ausência de cápsula, crescimento infiltrativo, alta celularidade,
necrose e elevados índices de mitose são indicativos de malignidade, tempo
médio de sobrevida de 10 meses (MEUTEN, 2002; TAVARES et al., 2006).
Carcinoma simples, ou o também chamado adenocarcinoma, é a neoplasia
maligna mamária mais comum nas cadelas. É composto por células do tipo
17
epitelial, a qual apresenta forte tendência para infiltrar para os tecidos e vasos
adjacentes (acima de 50%) (SCHMITT, 2000). A quantia de estroma pode variar
consideravelmente, e a presença de linfócitos peritumorais são comuns, mesmo
com associação de necrose ou não. Baseado em sua diferenciação e
comportamento biológico, pode ser graduado em termos com aumento de
malignidade em : túbulopapilar, sólido ou anaplásico. A sobrevida média é de 10-
12 meses (BRODEY et al., 1983; FERGUSON, 1985; BREARLEY, 1989;
MOULTON, 1990; WITHROW & MacEWEN, 1996).
Carcinoma tubulopapilar é caracterizado pela formação de túbulos com ou
sem projeções papilares. Nos cães, carcinomas tubulares podem estar
acompanhados por proliferação marcante de fibroblastos estromal no tumor
primário ou na metástase. O componente estromal é usualmente escasso no tipo
papilífero, o qual ocorre com freqüência. Uma variante especial é o tipo papilar
cístico, o qual é usualmente bem demarcado e pode ser de difícil diferenciação de
lesões benignas como a hiperplasia ductal papilomatosa. Metástase de lesões
papilares císticas bem diferenciadas para linfonodos regionais já foram relatadas
(MEUTEN, 2002).
No carcinoma sólido as células tumorais são arranjadas em “folhas”,
“cordas” ou ninhos sólidos. Alguns são compostos por células com citoplasma
vacuolizado, possivelmente de origem mioepitelial. A quantia de estroma varia de
pouco a moderada (BREARLEY, 1989; MOULTON, 1990).
O carcinoma inflamatório é caracterizado por seu rápido crescimento,
associado a eritema intenso, calor, dor e edema. O desenvolvimento do tumor,
que se apresenta como uma massa firme e pouco circunscrita dá-se sob forma de
placas que podem se distribuir indeterminadamente sobre a superfície corpórea do
animal de maneira rápida e difusa. Essa massa mantém-se bem aderida ao foco e
pode inclusive, apresentar-se ulcerada (BRODEY et al., 1983; WITHROW &
MacEWEN, 1996).
Freqüentemente, o carcinoma inflamatório, de crescimento desordenado e
invasivo, ultrapassa os limites toraco-abdominais ventrais e acomete as regiões
laterais adjacentes ao foco no corpo do animal (FERGUSON, 1985; BREARLEY,
18
1989; MOULTON, 1990). Possui alto poder metastático, e a primeira via de
disseminação das células tumorais é a rede linfática. O enfartamento dos
linfonodos regionais é facilmente observável por inspeção e palpação destes e,
não raramente, os animais acometidos apresentam edema em um ou mais
membros, provavelmente em virtude da invasão tumoral sobre os vasos linfáticos
aferentes dos gânglios axilares e/ou inguinais superficiais, o que leva a
hipofuncionalidade desses membros. Do ponto de vista microscópico, caracteriza-
se como um carcinoma pouco diferenciado, com evidência de infiltrados celulares
polimorfonuclear e mononuclear e população celular epitelial anaplásica. Pode
estar associado a vários outros tipos de carcinomas que também acometem as
mamas, muito embora se admita que o adenocarcinoma seja mais comumente
observado nestes casos (SILVERMAN, 1996; STONE, 1998; BAKER &
LUMSDEN, 1999; ZAKHOUR & WELLS, 1999; MEUTEN, 2002).
Comportamento biológico
Mesmo na ausência de causas manifestas de morte, os animais com
câncer ainda perdem peso progressivamente e morrem. Geralmente a massa
neoplásica não pode explicar completamente a morte em termos mecânicos,
deve-se então cogitar sobre mecanismos mais sutis que desempenham papéis
importantes na morte do paciente com câncer (RUBIN & FARBER, 2002).
Aproximadamente 70% de todos os cânceres de mama são palpáveis e
quase 50% dos tumores com 0,6 a 1,0 cm de diâmetro são detectáveis no exame
clínico (DONEGAN, 1988; FERREIRA et al., 2006).
Salienta-se que achados clínicos característicos de outros tumores
malignos (diâmetro maior que 5 cm, crescimento rápido, infiltração, eritema e
edema) nem sempre são válidos para as neoplasias de mama. Havendo, pois,
necessidade dos exames citológico e histológico para identificação de células e
metástases (BRASIL, 1998; ZUCCARI, 1999; CAVALCANTE et al., 2005).
19
A ulceração de lesões decorrentes de neoplasias mamárias é um processo
não obrigatório nos estágios iniciais, mas geralmente ocorre em virtude de
complicações durante a evolução da doença (ZUCCARI, 1999).
Ocasionalmente o cancer de mama pode retornar após o primeiro
tratamento. Existem três tipos de recorrência no câncer de mama. A recorrência
local, a qual as células permaneceram no local original, que após algum tempo
voltaram a proliferar. Para muitos pesquisadores a recorrência local não é
considerada como disseminação do câncer mamário, e sim como um fracasso do
tratamento primário. Mesmo depois da mastectomia, os tecidos mamários
próximos à pele e tecido adiposo permanecem possibilitando a recorrência local. A
recorrência regional é mais séria que a local por indicar que o câncer se
disseminou além dos limites da mama e linfonodos regionais. Pode ocorrer na
musculatura peitoral, abdominal, nos linfonodos mais internos, entre as costelas,
entre outros. A recorrência a distância, ou seja a metástase, é sem dúvida a pior
delas. Uma vez fora do tecido mamário, usualmente o câncer pode se disseminar
para os linfonodos regionais/sentinelas e a partir deste para qualquer outro local
do organismo (FIDLER & BRODEY, 1967; ZUCCARI, 1999). A distribuição dos
focos tumorais é determinada, em grande parte, pelas características anatômicas
das veias e dos vasos linfáticos que drenam os locais onde se situam os tumores
primários. No entanto, nos animais, a maioria dos tumores malignos metastatizam
para os pulmões. Isto ocorre devido ao imenso fluxo de sangue que passa por
este órgão e à grande trama de capilares, onde a circulação se torna mais lenta. O
leito capilar pulmonar serve como filtro para os agregados de células tumorais que
se alojam na árvore vascular, inserindo pseudópodos entre as células endoteliais
e emigrando para o parênquima pulmonar (COTRAN et al., 2000; RUBIN &
FARBER, 2002).
O desencadeamento da metástase representa uma série de interações
entre o hospedeiro e a célula tumoral, os quais incluem angiogênese, invasão,
sobrevivência intravascular, instalação e proliferação em órgãos distantes
(KLAUBER et al., 2001; GATENBY & FRIEDEN, 2002).
20
As células tumorais que expressam o fenótipo de invasibilidade possuem a
habilidade em degradar a matriz extracelular (MEC) e violar os compartimentos
teciduais adjacentes. Isto está freqüentemente associado à expressão de enzimas
como a metaloproteinase (MMP), geralmente presente em altas concentrações
nas células metastáticas (MMP-2 e MMP-9 tipo IV colagenase). Outro aspecto
importante destas células é a motilidade celular, que em resposta a sinais, as
células metastáticas devem aderir e soltar repetidamente o substrato para
conseguir a locomoção determinada. Além do substrato da MEC servir como
“piso” para as células tumorais, também pode modular a quimiotaxia, assim como,
expressar integrinas e MMP pelas células tumorais (CURRAN & MURRAY, 2000).
Geralmente, células metastáticas dispõem maior motilidade que suas
companheiras não metastáticas (MOORE, 2001).
A adesão entre as células tumorais está freqüentemente diminuída nos
tumores invasivos e metastáticos. Apesar disso, os mecanismos que induzem a
aberrações nas adesões das células tumorais são pouco compreendidos, sendo
que as proteínas E-caderinas têm recebido considerável atenção. Estas proteínas
também parecem estar envolvidas na regulação da expressão das conexinas,
importantes na comunicação entre as células. Estudo recente visando a expressão
de conexinas e de E-caderina em glândulas mamárias normais, hiperplásicas e
neoplásicas de cadelas, revelou que nas cadelas os tumores malignos
apresentam alterações na expressão destas proteínas em relação às mamas
normais (TORRES et al., 2003). Outro estudo relacionado com a expressão de
caderina-E em neoplasias benignas e malignas da mama em cadelas mostrou
maior marcação para carcinomas metaplásicos e tumores benignos em relação a
carcinomas ductais, associando desta forma, a menor expressão de E-caderina
com a agressividade tumoral, inclusive maiores chances de formar metástases à
distância, assim como o pior prognóstico (GOMES et al., 2003).
Interações entre células neoplásicas com plaquetas ou com células
imunológicas parecem regular a formação de metástases na fase em que as
células tumorais estão na corrente circulatória (BYRNE et al., 2000). O
reconhecimento entre as células tumorais e endoteliais seguidos de fortes
21
interações e eventualmente retração das células endoteliais, facilitam possíveis
interações entre células neoplásicas e matriz subendotelial. A dissolução desta
matriz resulta na extravasão da célula tumoral do leito capilar, sendo as moléculas
de adesão, como as integrinas e não-integrinas responsáveis por este processo
(KLAUBER et al., 2001; MOORE, 2001).
As células tumorais que extravasaram para o parênquima de outro órgão
irão proliferar para formar micrometástases menores que dois milímetros de
diâmetro. Pela angiogênese tumoral, estas micrometástases tornam-se
clinicamente detectáveis. Fatores de crescimento, elaborados pelo estroma dos
órgãos atingidos, são importantes reguladores parácrinos da proliferação da célula
tumoral. Fibroblastos do hospedeiro podem ser importantes fontes de enzimas
degradadoras de matriz extracelular (KLAUBER et al., 2001; GATENBY &
FRIEDEN, 2002).
As citocinas representam uma diversidade de grupos de moléculas peptídicas
que participam de forma proeminente facilitando não somente o crescimento da
neoplasia como também no aparecimento de metástases (HEIMANN et al., 1997).
Elas são mediadoras diretas das interações entres as células, portanto
reguladoras das funções celulares e teciduais. A produção e liberação de citocinas
são processos celulares estritamente regulados, podendo ser desregulado por
transformações malignas (ALTUCCI & GRONEMEYER, 2001).
O fator de necrose tumoral (TNF), antiga caquexina, é o membro chave de
uma grande família de citocinas e receptores cruciais na organização celular. A
ativação de algum dos membros desses receptores implicará em uma variedade
de respostas celulares dependendo do tipo e contexto celular (ALTUCCI &
GRONEMEYER, 2001). Alguns destes receptores da família do TNF são também
“death receptors” sinalizando o processo de apoptose numa variedade de células.
É um potente fator linfóide, o qual exerce efeitos citotóxicos numa grande
variedade de células tumorais e outras células alvo. Em tumores humanos a
expressão do TNF foi evidenciada, e geralmente associada com pior prognóstico.
Administração de altas doses locais de TNF em um tumor destrói seus vasos
sanguíneos apresentando potente ação anti-cancer, mas quando produzida
22
cronicamente, pode agir como promotor endógeno tumoral, contribuindo com o
desenvolvimento do estroma, necessário para o crescimento e expansão do tumor
e formação de metástases (WAJANT et al., 1999; DUNLOP & CAMPBELL, 2000;
KAUFMANN & HENGARTNER, 2001; BALKWILL, 2002).
A habilidade de metastatizar para locais distantes é caracterizada quando
as células tumorais adquirem a independência dos sinais fisiológicos reguladores,
resultando no acúmulo de mutações, tornando as células tumorais invasiva e
resistente à apoptose (HEIMANN et al., 1997).
As metástases nos cães podem ocorrer por via linfática ou venosa. Nos
carcinomas mamários, a via linfática parece ser a mais importante. A drenagem
linfática faz-se para os gânglios linfáticos axilares e inguinais (BREARLEY, 1989;
ENGSTRÖM et al., 1989).
Câncer de mama com metástase ainda é considerado como uma doença
incurável tanto na Medicina Humana como na Veterinária, sendo um dos fatores
prognósticos mais importantes. Micrometástases não detectáveis clinicamente,
certamente contribuem para a recorrência da doença nas pacientes portadoras de
câncer de mama, no entanto pouco se conhece a respeito do mecanismo celular
responsável por este controle (KLAUBER et al., 2001).
Para Brodey, Golds-Chmidt e Roszel o câncer da glândula mamária é a
causa mais comum de metástases pulmonares em cadelas. A demora pela
procura de assistência Veterinária, certamente contribui pelos avançados estágios
da doença em que os animais são encontrados no momento do diagnóstico
(CASSALI, 2000; BURINI et al., 2001; BURINI, 2002). Das neoplasias malignas
mamárias nos cães, 25 a 50% delas apresentam metástases antes da cirurgia
(MOULTON, 2002).
A existência de metástases torácicas, abdominais ou para tecido linfóide
podem ser verificadas com o auxílio de exames por imagem. Desta forma pode-se
determinar a proximidade de um tumor aos grandes vasos, determinar a natureza
cavitária ou cística das massas e avaliar o volume tumoral inicial e pós-tratamento
(CARTER, 1989; BRASIL, 2001).
23
Apesar da diversidade dos cânceres, existem algumas similaridades nas
manifestações clínicas de pacientes portadores da doença progressiva. Mesmo
pacientes que apresentam a doença limitada a um único local, por exemplo,
mulheres e animais com câncer de mama sem evidências de metástase à
distância, podem desenvolver efeitos sistêmicos, como a anorexia e caquexia, que
freqüentemente acompanham o desenvolvimento da doença (MacDONALD et al.,
1995; DUNLOP & CAMPBELL, 2000; TISDALE, 2001; BURINI, 2002).
Pacientes com caquexia neoplásica refletem a profunda perda de tecido
adiposo e magreza corporais. A anorexia, freqüentemente presente, é insuficiente
para promover esta perda de peso, isto devido a: 1- caquexia envolve perda
massiva da musculatura esquelética o que não ocorre durante a anorexia, 2- a
suplementação nutricional não reverte o quadro de magreza, 3- caquexia pode
ocorrer sem anorexia, e 4- a ingestão de alimento parece ser normal para a
profunda perda de peso das pacientes com câncer. Por outro lado à anorexia pode
aparecer quando: 1- existe diminuição do gosto e cheiro do alimento, 2- saciedade
precoce, 3- produção de citocinas, como TNF
α
e IL-1, as quais agem diretamente
no cérebro produzindo anorexia, entre outras. Produtos tumorais parecem ser
mais importantes no desenvolvimento da caquexia (BERGHE et al., 2000;
TISDALE, 2001; BALKWILL, 2002).
Estudos têm sugerido que as citocinas, em particular TNF
α
, IL-6, são
responsáveis pela perda tecidual na caquexia pelo câncer (BALKWILL, 2002).
Vários estudos in vitro têm demonstrado que citocinas pró-inflamatórias como a
IL-6, apresenta efeito citostático e citotóxico em células de câncer de mama,
algumas vezes de maneira autócrina. Aumento significativo dos níveis séricos de
IL-6 foram observados em pacientes com caquexia neoplásica quando
comparados com pacientes com tipos tumorais semelhantes, mas sem a perda de
peso (CRICHTON et al., 1996; KOVACS, 2001; TISDALE, 2001).
24
Métodos diagnóstico e classificatórios
A classificação elaborada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para
tumores e displasias da glândula mamária canina segue o máximo possível a
proposta pela OMS para tumores mamários humanos (MISDORP et al., 1999;
ZUCCARI et al, 2001). Basicamente, acreditam na importância em alcançar a
concordância no registro da informação precisa da extensão da doença para cada
localização anatômica, porque a descrição clínica acurada e a classificação
histopatológica das neoplasias podem interessar a um número de objetivos
correlatos, como ajudar o médico no planejamento do tratamento, indicação do
prognóstico, ajudar na avaliação dos resultados de tratamento, facilitar a troca de
informação entre os centros de tratamento e contribuir para a pesquisa contínua
sobre o câncer (AJCC, 1989).
Neoplasias mamárias se apresentam usualmente como nódulos e cerca de
90% destas lesões são detectadas pelo exame clínico. Este deve seguir uma
rotina padronizada, com condições ideais e a necessária tranqüilidade, com
levantamento mais completo possível da história pregressa. A inspeção e
palpação constituem as duas etapas do exame físico, observando dados como,
simetria glandular, localização, contorno, apresentação, tamanho e contorno do
tumor, inflamações ou ulcerações, condições corpóreas e, particularmente, o
envolvimento de linfonodos regionais e/ou evidências de metástase a distância
com auxílio do exame citopatológico e raio x, respectivamente (BRASIL, 1998;
MISDORP et al., 1999; ZUCCARI et al., 2001).
O sistema TNM trabalha prioritariamente com a classificação por extensão
anatômica da doença determinada clínica e histopatologicamente. As
classificações para o estadiamento clínico e patológico do câncer de mama
propostas pela American Joint Commitee on Câncer (AJCC) e UICC são as
classificações TNM clínica (TNMc) e a TNM histopatológica (TNMp) (AJCC, 1989;
EISENBERG & KOIFMAN, 2000). Os esquemas de classificação são
freqüentemente revisados devido à aquisição constante de novas informações
prognósticas (BRASIL, 1998; BRASIL, 2001).
25
A classificação é aplicável somente para carcinomas e deve haver
confirmação histológica da doença. A sub-região anatômica de origem deve ser
registrada, mas não é considerada na classificação. No caso de tumores múltiplos
sincrônicos em uma mama, o tumor com a maior categoria T deve ser usado para
a classificação. Os tumores de mama, bilaterais e sincrônicos, devem ser
classificados independentemente, para permitir a divisão dos casos por tipo
histológico. Os procedimentos para avaliação das categorias T, N e M são as
seguintes: Categorias T – a extensão do tumor primário; Categorias N – a
ausência ou presença de metástases em linfonodos regionais; Categorias M –
ausência ou presença de metástase à distância.
Seguido pelo exame clínico completo e caracterização do estagio clínico da
doença, atualmente se recorre, antes mesmo da classificação histopatológica, ao
exame citopatológico. Este exame tem apresentado inúmeras vantagens como
meio de diagnóstico, especialmente entre as alterações mamárias de cadelas.
Durante o estágio inicial, pode diferenciar lesões tumorais inflamatórias de lesões
neoplasicas, se for neoplasia, pode ser feito coleta de linfonodos regionais para
melhor estabelecimento do estágio da doença, prognóstico e a presença de
metástase (BAKER & LUMSDEN, 1999). Nos casos de tumores malignos
aparentemente inoperáveis, o diagnóstico citológico positivo será definitivo,
evitando a confirmação desnecessária por biopsia (ALLEN & PRASSE, 1986) e
nos casos de recorrência pós-cirurgia, o exame citológico pode rapidamente e
precisamente indicar a necessidade de novas intervenções. Na maioria dos casos,
o diagnóstico pode ser estabelecido em poucos minutos, e a coleta do material
não é traumática para as pacientes (BAKER & LUMSDEN, 1999; BURINI, 2002;
CASSALI, 2000; SIMEONOV & STOIKOV, 2006).
Também microscopicamente são utilizados três métodos primários para
classificar os tumores mamários: 1- histogenética; 2- classificação histológica e 3-
prognóstico. Classificação histogenética é aplicada pela incerteza da
especificidade da célula de origem de muitos tumores, de acordo com o arranjo
histológico em papilares, tubulares, sólidos e anaplásicos e quanto à origem, em:
lobulares ou ductais (MOULTON, 1990).
26
A melhor precisão diagnóstica e compreensão prognóstica, podem ser
decorrentes da observação de características como presença ou não de
infiltração, ulceração, inflamação, hemorragia, necrose, fibrose e metaplasia. Nas
neoplasias mamárias, constata-se, com relativa freqüência, a coexistência de
padrões histológicos diferentes; em tais situações, o diagnóstico é comumente
baseado no padrão mais severo (MISDORP et al., 1999; EISENBERG &
KOIFMAN, 2000).
A análise histopatológica de um tumor é essencial para obtenção de
informações consistentes sobre os fatores prognósticos do câncer mamário, e
deve ser considerado como um passo fundamental para a orientação terapêutica
destas lesões (SCHMITT, 2000). Técnicas de imunoistoquímica para detecção de
receptores de estrogênio, progesterona, fator de crescimento epidémico,
oncogenes, entre outros, são de grande valia na seqüência de obtenção de um
prognóstico mais acurado em neoplasias mamárias. Entretanto, essas técnicas
são muito dispendiosas e, conseqüentemente, não utilizadas na rotina veterinária.
A análise histopatológica torna-se uma alternativa viável para se chegar a um
significativo e efetivo prognóstico de tumores malignos em cães (FERREIRA et al.,
2003).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a classificação
dos tumores é feita baseada sobre morfologia descritiva em acordo com o grau de
malignidade. É sabido que, de acordo com o grau de malignidade, uma redução
considerável da taxa de sobrevivência dos animais é observada (MISDORP et al.,
1999).
O grau histológico reflete a semelhança das células do tumor ao tecido
original. Esta avaliação pode ser feita pelo grau celular geral ou pelo grau nuclear.
A classificação geral ou celular leva em conta o grau de neoformação tubular, o
pleomorfismo nuclear e a quantidade de figuras de mitose. A classificação de I a III
é proporcional a indiferenciação do tumor, refletindo assim uma crescente piora no
prognóstico. O grau nuclear é baseado na aparência do núcleo, não levando em
consideração o padrão de crescimento do tumor. Aparentemente quanto mais
indiferenciado o tumor maior será a resposta à quimioterapia e menores o
27
conteúdo de receptores hormonais. A avaliação quando feita por patologista
experiente, se mostra um método auxiliar de grande valor em doença mamária
(YAMAGAMI et al., 1996; FRANCO, 1997).
A ordem crescente de malignidade, segundo a OMS é a seguinte:
carcinoma “in situ” (não infiltrativo), carcinoma complexo (com envolvimento de
células mioepiteliais), cacinoma tubulopapilar, carcinoma sólido e anaplásico
(MISDORP et al., 1999).
A tomografia computadorizada (TC) é, um método de diagnóstico por
imagem que produz cortes seccionais de uma região do corpo por meio de
armazenamento de informações em computadores e de raios X, com a vantagem
sobre a radiografia convencional de apresentar grande sensibilidade em
diferenciar pequenas atenuações dos raios X e ser isenta de sobreposição de
estruturas. A utilização do exame tomográfico no estudo da cavidade torácica
permite avaliação de campos pulmonares, mediastinais, pleuras e espaço pleural
e parede torácica. Sua utilização na clínica médica veterinária é para detecção de
linfoadenopatias hilares ou mediastinais, pesquisa de nódulos pequenos e
múltiplos, no direcionamento da aspiração com agulha fina de um nódulo quando
a fluoroscopia não estiver disponível e para detecção precoce e mensuração de
metástases pulmonares. Todavia, para utilização em animais, ela só está
disponível em grandes centros de pesquisa tendo em vista os custos para
aquisição e manutenção do equipamento. É o exame radiográfico indicado como
meio de eleição para a investigação inicial da cavidade torácica dos animais e
complemento fundamental ao exame físico em cadelas com tumor de glândulas
mamárias (PINTO et al., 2006).
Biologia molecular
Os principais alvos da alteração genética são os proto-oncogenes, os genes
supressores tumorais e os genes que controlam a morte celular programada ou
apoptose (DELFINO et al., 1997). Acredita-se que os genes reparadores do DNA
também possuam papel de destaque na carcinogênese, pois qualquer
28
anormalidade nesses genes predisporia a mutações no genoma com subseqüente
transformação neoplásica (LOURO, 2000; COTRAN et al., 2000).
Os fenômenos moleculares que acompanham a carcinogênese e os
diversos eventos que caracterizam o comportamento maligno de uma neoplasia
têm sido exaustivamente estudados. A interpretação e a adaptação destas
informações têm sido úteis para a conduta clínico-oncológica, em particular, na
doença neoplásica mamária. Isto se deve ao fato que o entendimento destes
fenômenos têm esclarecido alguns aspectos dos mecanismos etiológicos e
biológicos do câncer da mama, além de permitirem avanços consideráveis no
diagnóstico e na terapêutica. Dentre estes fenômenos, estão os genes que
regulam a apoptose (SAIKUMAR et al., 1999; ZORNIG et al., 2001).
Os proto-oncogenes são genes promotores do crescimento e da
diferenciação celular que controlam a divisão mitótica ordenada das células
(McKINNELL, 1998). Eles são transformados em oncogenes pelo descontrole da
expressão dos genes ou pela mutação, translocação ou rearranjo dos genes,
resultando na síntese de um produto anormal, as oncoproteínas (CARREÑO et al.,
1999).
A identificação de marcadores moleculares que possam predizer o
comportamento dos tumores é especialmente importante em câncer de mama
devido, sobretudo, à variabilidade na progressão clínica da doença. Alguns
marcadores tumorais e suas relações com o prognóstico são discutidos, dando-se
ênfase àqueles que utilizam, para sua detecção, o método imunoistoquímico e
onde possa ser empregado material fixado em formol e embebido em parafina
(material de arquivo). Os receptores hormonais (RH) são os menos polêmicos e os
tumores positivos para estes marcadores, geralmente, apresentam menor
tamanho, menor grau histológico e nuclear, uma melhor resposta à terapia
hormonal e um melhor prognóstico. Para os outros marcadores tumorais aqui
apresentados (c-erbB-2, catepsina D e E, MIB-1, PCNA, p53, caspase-3) existem
muitas controvérsias, mas parte da literatura associa sua presença com tumores
de alto grau histológico e com pior prognóstico. As divergências existentes na
literatura são discutidas e chega-se a conclusão que mais estudos são
29
necessários antes que os marcadores tumorais possam ser utilizados como
fatores prognósticos do câncer de mama (GAGO et al., 1998; PEREIRA et al.,
2006).
Marcadores prognósticos
Os estudos têm enfocado vários indicadores prognósticos úteis na
avaliação histopatológica do carcinoma da mama. Dentre eles, deve-se incluir,
além dos aspectos histológicos convencionais, a presença ou não de metástases,
a presença ou não de receptores hormonais, a expressão de genes oncogênicos e
supressores, assim como a expressão dos fatores de crescimento e proliferação
tumorais, inclusive a angiogênese (NARITA et al., 1998; EISENBERG &
KOIFMAN, 2000; FOULKES et al., 2001; QUEIROGA & LOPES, 2002;
CAVALCANTE et al., 2006).
Dado a complexidade dos eventos no câncer, a avaliação de combinação
de fatores prognósticos são de grande valia para os clínicos estimarem mais
objetivamente o prognostico individual de pacientes com câncer de mama (GAGO
et al., 1998).
A expressão exacerbada de bcl-2 e bcl-x (L) associado com a diminuição da
apoptose nas células de câncer de mama podem contribuir para formação de
metástases (RUBIO et al., 2001; ZORNIG et al., 2001; FERNANDEZ et al., 2002).
Estudo avaliando o envolvimento do bcl-2 na progressão de carcinomas mamários
primários para metastáticos e sua influência no prognóstico, revelou a presença de
bcl-2 em 59% de carcinomas primários e 65% nos carcinomas mamários
metastáticos, também houve concordância na expressão do bcl-2 entre os sítios
primários e metastáticos. A expressão do bcl-2 foi associada significativamente
com diversos aspectos prognósticos favoráveis, como menor tamanho tumoral e
positividade para receptores de estrógeno e progesterona. O elevado índice
apoptótico foi associado significativamente com vários fatores prognósticos
desfavoráveis, incluindo carcinomas pouco diferenciados, maior tamanho tumoral,
alta expressão de Ki 67 e elevado índice de mitoses. A média do índice de
30
apoptose foi maior nos linfonodos com metástases que nos carcinomas primários.
A baixa expressão do bcl-2 e o elevado índice de apoptose foram
significativamente associados com menores períodos sem reincidência (VILLAR et
al., 2001; FERREIRA et al., 2003).
De modo geral, a imunodetecção do p53 está relacionada à presença de
necrose histológica; negatividade para receptores de estrógeno e associação com
a variante de células grandes encontradas no componente intraductal (POLLER et
al., 1992; BERTAGNOLLI et al., 2006). Em carcinomas ductais invasivos, a
imunopositividade para a oncoproteína p53 está relacionada a pior prognóstico,
menor tempo de remissão da doença, graus histológicos II, III, negatividade para
receptores de estrógeno e progesterona, alto índice de Ki-67 e superexpressão de
c-erbB-2 (CLIN et al., 1994; MUTO et al., 2000). Dos tipos histológicos de
carcinomas mamários invasivos, Domagala et al. (1993) observaram que a
expressão da oncoproteína p53 é muito mais freqüente em carcinomas medulares,
seguidos de carcinomas ductais invasivos de grau III histológico, e, raramente, em
carcinomas lobulares e carcinomas mucinosos. Em cadelas a expressão de p53
foi mais alta nos tumores malignos e com maior intensidade naqueles menos
diferenciados (CASSALI, 2000; BERTAGNOLLI et al., 2006).
Tanto em medicina humana como na veterinária acredita-se que a molécula
de adesão caderina-E tenha ação anti-invasiva no câncer de mama (OLIVEIRA et
al., 2004), desta forma o envolvimento dos linfonodos se faz importante fator
prognostico, mesmo assim existe grande variedade no resultado entre as
pacientes linfonodo-positivo. A relação entre a expressão da caderina-E no CDI
primário e no linfonodo-positivo correspondente, revelou expressão mais intensa
nas metastases linfonodais, sugerindo que a expressão de moléculas de adesão
no sitio metastático denota comportamento menos agressivo, melhor tempo de
sobrevida (OLIVEIRA et al., 2004; HARIGOPAL et al., 2005).
A cadepsina total foi determinada por ELISA em 62 amostras de CDI da
mama de mulher. Foi mais intensa em pacientes linfonodo-negativo que nas
linfonodo-positiva, no estagio tumoral III que nos estágios I e II e nos tumores sem
31
receptores hormonais, quando comparado com tumores positivo para receptores
hormonais (BUDIHNA et al., 1995).
Outro estudo avaliando a correlação da localização imunoistoquimica entre
a cadepsina-D (CD), PCNA e receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R)
com os fatores prognósticos tradicionais como a graduação clínica e histológica,
envolvimento linfonodal, índice de mitose, pôde-se observar em todas as amostras
positividade de imunomarcação para a cadepsina-D no parênquima e no estroma
dos carcinomas. PCNA e EGF-R mostraram positividade quase que
exclusivamente no componente parenquimal do carcinoma. CD total correlacionou
significativamente com a graduação histológica, PCNA (PI), índice de mitose,
EGF-R e metástase linfonodal (OKAMURA et al., 1997).
Estudo avaliando a importância prognóstica do c-erbB-2 e PCNA no câncer
de mama, incluindo envolvimento de linfonodo, tamanho tumoral, graduação
histológica e invasão linfática, revelou que o PCNA tem valor prognostico
independente em pacientes sem envolvimento de linfonodos, e c-erbB-2 e PCNA
não são indicadores prognóstico independentes considerando todas as pacientes
(KATO et al., 2002).
A vascularização (WEIDNER, 1998) do tumor e a angiogênese (CRAFT &
HARRIS, 1994; FOX et al., 1995; GOED et al., 1998; GRAHAM & MYERS, 1999;
RESTUCCI et al., 2000) têm papel muito importante no processo de metastização
nos tumores mamários caninos, à semelhança do que acontece no câncer de
mama da mulher (WEIDNER et al., 1991; LOCOPO et al., 1998; TOI et al., 1999).
Estudo investigando a possível relação entre a expressão do fator de
crescimento endotelial (VEGF) e fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF)
com fatores prognóstico tradicionais do câncer de mama e sítio metastático,
revelou que a expressão de bFGF foi mais freqüentemente encontrada em
tumores com baixa expressão de VEGF; assim como a elevada expressão de
bFGF foi relacionada com tumores de menor tamanho e ausência de metástase
para linfondos caracterizando seu bom prognóstico e maior sobrevida das
pacientes (LINDERHOLM et al., 2003).
32
Com o objetivo de relatar a presença e o significado clínico da metalotionina
(MT) no CDI primário da mama em mulheres, conclui-se que MT positivo (nuclear
e citoplasmático) tem pior prognóstico que MT negativo, indicando maior
agressividade e pouca diferenciação nas células tumorais (ZHANQ et al., 2000).
Resultados semelhantes têm sido descrito em estudos com cadelas portadoras de
câncer mamário (BREGUNCI et al., 2003).
Nos carcinomas simples e complexo de mama canino a reação com o
anticorpo anti-Tenascina mostrou intensa marcação do estroma em determinadas
áreas das amostras tumorais, assim como no endotélio de vasos e também em
algumas áreas ao redor dos ductos do tecido mamário, havendo áreas com
ausência de marcação. A reação do anticorpo anti-Fibronectina, revelou marcação
difusa por todo estroma, possuindo também marcação positiva no endotélio de
vasos e na membrana basal dos ductos das glândulas (CASSALI et al., 2001).
Estudo envolvendo figuras de mitose de fibroblastos nos CDI da mama
também foi proposto ter importante papel na progressão do tumor. A atividade
proliferativa destas células pode predizer a formação de metástase para linfonodo
ou a distância, e neste estudo indicou que a habilidade de formar metástase tem
íntima dependência com a atividade proliferativa de fibroblastos na área interna
dos carcinomas (HASEBE et al., 2000).
A positividade para vimentina e p53 também foram relacionadas com pior
prognóstico (MARIUZZI & SISTI, 1993).
Positividade para EGFR, super-expressão de PCNA e positividade para
vimentina foram significativamente correlacionados com alto grau histológico e
associado a carcinomas negativo para receptores de estrógeno. Uma tendência
positiva foi observada entre tumores com alta proliferação e expressão de EGFR.
O status do EGFR e índice do PCNA não foram correlacionados com o
envolvimento linfonodal, tamanho tumoral e idade. A vimentina foi
preferencialmente expressada em tumores com metástases em linfonodos,
sugerindo ser importante para a predição de tumores biologicamente mais
agressivos (KOUTSELINE et al., 1995).
33
A relação da quantidade de micro vasos (MVQ) com PCNA, c-erbB-2 e
cadepsina D no CDI de mama foi estudado para determinar seu valor prognostico,
sendo positivamente relacionada com a expressão de cadepsina D (células
estromais), PCNA e metástase a distancia, podendo ser um indicador prognostico
independente (CHENG et al., 1997).
Tamanho tumoral, expressão positiva para receptores de estrógeno e
linfonodo positivo não foram significativamente diferentes entre os tipos
histológicos de carcinoma ductal invasivo (CDI) e carcinoma lobular invasivo (CLI).
Pacientes com CLI apresentaram mais freqüentemente tumores menos agressivos
e menor invasão vascular no tumor primário que nos CDI (MERSIN et al., 2003).
Proliferação
O crescimento celular resulta da ação de vários fatores estimuladores ou
inibidores da divisão celular produzidos no meio intra ou extracelular (MAREEL &
LEROY, 2003). O controle do crescimento celular depende da expressão de vários
genes, principalmente daqueles que codificam os fatores de crescimento e seus
receptores (McKINNELL, 1998; CARREÑO et al., 1999).
A compreensão dos mecanismos moleculares envolvendo o controle do
crescimento das células neoplásicas pode identificar os fatores do processo
regulatório, contribuindo para o entendimento dos mecanismos envolvidos na
progressão do tumor (GOMPEL et al., 2001; KAUFMANN & HENGARTNER, 2001;
OBERLEY, 2002). Desta forma, a utilização de técnicas adequadas, servirá como
recurso auxiliar para um diagnóstico mais preciso, tornando o prognóstico mais
favorável, propiciando o estabelecimento de terapias mais apropriadas,
procedimentos clínicos e cirúrgicos adequados, além de um controle sobre
recidivas das neoplasias mamárias bem como de suas metástases.
Os oncogenes e seus produtos podem aumentar a expressão dos genes
das ciclinas e das quinases ciclina-dependentes (CDK), responsáveis pela
progressão ordenada das células nas diversas fases do ciclo celular (PINES,
1995; McKINNELL, 1998). No ciclo normal, quando a célula recebe sinais
34
promotores para seu crescimento, a síntese de ciclinas D e E é estimulada na fase
G1. A progressão das células da fase S para a fase G2 é facilitada pelo controle
da ciclina A ligada a CDK2 e CDK1. O papel exato da ciclina A não é conhecido,
mas evidências sugerem que ela seja indispensável para a replicação do DNA
(PINES, 1995). No início da fase G2 predomina a ciclina B que, ao formar
complexos com CDK1, auxilia a passagem da célula para a fase M e fosforila
proteínas necessárias para a mitose. As mutações que descontrolam a atividade
das ciclinas e das CDK favorecem a proliferação celular (COTRAN et al., 2000).
Dentre os genes supressores tumorais, estão aqueles que regulam a
transcrição nuclear e o ciclo celular (Rb, p53, BRCA-1, BRCA-2), os genes que
regulam a transdução de sinais (NF-1, APC) e os receptores da superfície celular
(receptor do TGF-b e caderinas) (DENG & BRODIE, 2001). A pRb, produto do
gene Rb, é uma fosfoproteína nuclear expressa em todos os tipos celulares, que
em sua forma ativa, inibe a progressão das células da fase G1 para a fase S do
ciclo celular (LOURO, 2000).
O gene p53, denominado guardião do genoma, produz uma proteína que
controla a replicação do DNA, a proliferação celular e a apoptose. Nas células com
DNA alterado, a proteína p53 acumula-se no núcleo e liga-se ao DNA evitando
sua replicação (MUTO et al., 2000).
Essa parada no crescimento celular na fase G1 permite à célula restaurar
seu genoma (COTRAN et al., 2000). Entretanto, danos irreversíveis requerem a
eliminação das células acometidas (PINES, 1995).
Os genes BRCA-1 e BRCA-2 são supressores tumorais. A função desses
genes não é totalmente conhecida, mas acredita-se que estejam envolvidos no
controle da transcrição (COTRAN et al., 2000). Mutações nesses genes
predispõem ao desenvolvimento do câncer de mama, ovário, próstata, cólon,
pâncreas e de laringe (DENG & BRODIE, 2001; INGVARSSON, 2001).
Os produtos dos genes NF-1 e do gene APC também são supressores
tumorais (COTRAN et al., 2000). A proteína APC localiza-se no citoplasma e
degrada a catenina, proteína que pode penetrar no núcleo e ativar a transcrição
dos genes promotores do crescimento. Assim, mutações no gene APC estimulam
35
a proliferação celular (COOPER, 1995). A neurofibromina, produto do gene NF-1
regula a transdução de sinais pela proteína ras e ativa a GTPase, enzima que
facilita a conversão da proteína ras ativa em ras inativa.
Com a mutação ou perda do gene NF-1, a proteína ras é mantida no seu
estado ativo, estimulando também a proliferação celular (PERATONI, 1998).
Vários tipos de moléculas expressas na superfície celular podem controlar o
crescimento e o comportamento da célula, tais como os receptores do TGF que
regulam a transcrição dos genes inibidores do crescimento e as proteínas que
regulam a adesão celular representadas pelas caderinas (LOURO, 2000).
Existe correlação positiva entre a agressividade do câncer, evidenciada
pela menor sobrevida do paciente, e mutações nos gene CDH1 que codifica as
caderinas (MAREEL & LEROY, 2003).
Os genes que impedem (Bcl 2, Bcl-XL) ou induzem (Bax, Bad) à morte
celular programada também são importantes na carcinogênese. O primeiro gene
inibidor da apoptose descrito foi o bcl-2 (LOURO, 2000). A inibição da apoptose
pelo bcl-2 pode ocorrer em qualquer estádio do ciclo celular, porém os
mecanismos envolvidos ainda não foram totalmente elucidados. Postula-se que o
bcl-2 aumente o tempo de sobrevida das células, favorecendo a atuação de outros
oncogenes sobre elas (DELFINO et al., 1997).
O antígeno nuclear de células em proliferação (PCNA) e o antígeno nuclear
Ki-67, podem ser usados pelo método imunoistoquímico para avaliação da
proliferação celular. O PCNA aparece no núcleo das celulas durante o estagio
tardio da G1 para a fase S do ciclo celular e esta intimamente relacionado com a
proliferação celular, com isto esta molécula vem sendo bastante estudada em
medicina humana e ainda pouco na veterinária (NARITA et al., 1993).
Com o objetivo de correlacionar a expressão imunoistoquimica do p53 e
PCNA com parâmetros prognósticos no carcinoma mamário, evidenciou o máximo
de positividade nos tumores de grau III, caracterizando que a expressão do p53 e
PCNA são marcadores de células pouco diferenciadas no cancer de mama (GOEL
et al., 2000).
36
Nos cães os índices proliferativos foram significativamente menores em
tumores não malignos e displasias que em tumores malignos. Nos canceres a
expressão do PCNA foi positivamente correlacionada com o grau de malignidade
histológico e graduação nuclear. Valores elevados de Ki-67 foram positivamente
correlacionados com metastases e morte pela neoplasia (PENA et al., 1998;
MORENA et al., 2004).
Utilizando a técnica de imunoistoquimica para diferenciar a expressão do
PCNA em lesões benignas e malignas no câncer de mama nas mulheres,
concluiu-se que os carcinomas apresentam maior índice proliferativo que
fibroadenomas e lesões fibrocísticas da mama (KALOGERAKI et al., 1994;
NARITA et al., 1993).
O tipo comedo do carcinoma ductal invasivo e carcinoma intraductal
apresentam maiores índices de PCNA que outros tumores. As metástases para os
linfonodos também apresentaram maiortes índices de PCNA que no tumor
primário. Elevada imunomarcação foi relacionada com a presença de metástase
para linfonodo, ausência de formação tubular, figuras de mitose, anisocariose, alto
grau histológico e ausência de receptores para progesterona. PCNA em tumores
linfonodo-positivo foi correlacionado com o tipo de tumor, especialmente com o
carcinoma ductal, ausência de formação tubular, alto grau histológico e ausência
de receptores para progesterona, enquanto que PCNA em tumores linfonodo
negativo foi relacionado com maior tamanho tumoral, figuras de mitose,
anisocariose e alto grau histológico (CUMMINQS et al., 1993; HAERSLEV &
JACOBSEN, 1994).
A proliferação celular foi avaliada em 167 amostras de câncer de mama
primário de pacientes que se submeteram à cirurgia radical. Não houve diferença
entre o índice de PCNA e tamanho tumoral, envolvimento de linfonodos e
receptores hormonais. 146 carcinomas invasivo mostraram que o grupo com
elevados níveis tiveram menor sobrevida comparado com o grupo de menores
expressões de PCNA (HORIKUCHI et al., 1998).
Amostras de material de arquivo (parafina) foram imunocoradas com
anticorpo monoclonal contra PCNA, evidenciando expressão baixa (<25%),
37
intermediária (25-50%) e elevada proliferação (>50%). O índice de proliferação
nas pacientes com alta expressão de receptores para estrógeno foi
significativamente menor que as pacientes com baixas expressões para
receptores hormonais (estrógeno). Com relação ao tipo histológico, o índice de
proliferação do carcinoma esquirroso foi menor que nos carcinomas tubulo-
papilíferos ou tubular sólido (HORIKUCHI et al., 1994).
Outro método utilizado na mensuração da cinética do ciclo calular no câncer
de mama é o Citômetro de Fluxo. Tem servido para estimar a fração proliferativa
de tumores incluindo análises da composição do DNA com determinação da fase
S. Carcinomas apresentam expressões mais elevadas que o tecido normal
adjacente, e as metástases dos linfonodos tem pouco mais expressão que seus
respectivos tumores primários. Os niveis de PCNA não tiveram correlação com
idade, tamanho tumoral, envolvimento linfonodal, invasão linfática intramamária e
receptores hormonais. PCNA foi associado com menor sobrevida comparado com
tumores com baixa expressão de PCNA (TAHAN et al., 1993).
Avaliou-se o significado prognóstico do PCNA em pacientes com metástase
em linfonodo, evidenciando menor sobrevida das pacientes com superexpressão
do PCNA, garantindo seu potencial como importante marcador prognóstico nos
carcinomas metastáticos para linfonodos (SHEEN-CHEN et al., 1997).
Biópsias de 175 tumores primários foram submetidas a imunorreação para
PCNA e análise histopatológica para carcaterização de fatores prognóstico, tadas
elas de mulheres com cancer de mama sendo acompanhadas durante nove anos.
No epitelio normal mamário, apenas ocasionalmente o núcleo foi positivo para
PCNA. Nos carcinomas, as frações de núcleos positivos para PCNA mostrou
considerável variação intratumoral, frequentemente mais expressiva para as
margens invasivas do tumor. Os resultados mostraram que o microscópico de luz
auxilia na determinação da fração de crescimento pela imunomarcação do PCNA
e tem valor progóstico independente no carcinoma mamário, assim como outros
previamente caracterizados como índices de proliferação (AALTOMAA et al.,
1992).
38
A investigação entre PCNA e várias caracteristicas clinico-patológicas e seu
valor prognóstico no carcinoma mamário mostrou que não existe correlação com
as variáveis clinico-patologicas e sobrevida das pacientes portadoras de cancer de
mama (THOMAS et al., 1993).
De acordo com a graduação histologica, baixa expressão de PCNA esta
realcionado com grau I, 26% de células tumorais mostraram positividade nuclear
para PCNA, seguido pelo grau II (30%) e III (33%), mostrando sua significante
correlação com a diferenciação histológica. Metástase a distancia foi encontrada
em mais de 25% dos casos positivos. Neste estudo PCNA provou ser indicador
prognóstico independente em dizer a sobrevida da paciente (AZIZ et al., 2005).
A expressão total do PCNA aumenta significativamente com o aumento da
graduação tumoral. Existe nítida correlação entre o índice de proliferação do tumor
primário e sua metástase para os linfonodos regionais, mas a atividade
proliferativa nas metástases foi significativamente menor que no tumor primário
(OKAMURA et al., 1997).
Apoptose
A apoptose pode ser iniciada por varios sinais externos e internos e executada
entre varias vias de sinalização inter-relacionadas. Em níveis moleculares, o
processo de morte celular forma uma complexa cascata de eventos ordenados,
controlados pela expressão regulada de genes e proteínas associados a
apoptose. É devido à ação planejanda em conjunto destes componentes que
finalmente resulta no desmantelamento celular e formação de corpos apoptóticos
(SHAO et al., 1996).
A ativação do processo de apoptose é um ponto discutível para muitos
pesquisadores, principalmente de seus mecanismos iniciais de ação (KAUFMANN
& HENGARTNER, 2001).
Apoptose é morfologicamente e bioquimicamente uma forma distinta de morte
celular programada que ocorre sobre uma variedade de condições fisiológicas e
patológicas (ALTUCCI & GRONEMEYER, 2001; KAUFMANN & HENGARTNER,
39
2001; SOUZA et al., 2006). Pôr se tratar de um processo regulado, controlado por
uma diversidade de sinais extras e intracelulares, a apoptose é usada para
coordenar a morte, subseqüente à agressão ou dano às células somáticas. Além
disso, a apoptose inclui mecanismos que organizam e ordenam o processo na
célula apoptótica, prevenindo a inflamação do tecido circundante. Doenças
relacionadas com supressão da apoptose incluem câncer, formação de metástase
tumoral, doenças autoimune e infecções virais (SHAO et al, 1996; LIU et al.,
2001).
No contexto de mecanismo homeostático na regulação da população celular
animal, a apoptose apresenta papel complementar, porém opositor à proliferação
celular. São essenciais para o desenvolvimento do animal na fase inicial,
permanecendo também na fase adulta. Nos animais adultos, a morte celular
contrabalança a proliferação celular, mantendo a constância da massa tecidual. A
remoção de células injuriadas por defeitos genéticos, senilidade, doença, ou
exposição a agentes nocivos é possível pelo processo da apoptose. Mais ainda, a
resposta imunológica normal requer eliminação regulada de populações celulares
específicas por este tipo de morte celular (SAIKUMAR et al., 1999).
Apoptose têm importante papel biológico no desenvolvimento e homeostasia
da população celular, como também na patogênese de processos patológicos. O
excesso e deficiência da apoptose contribui para uma variedade de doenças como
no envolvimento da progressão e regressão de tumores. Os avanços no
conhecimento deste processo são estimados pela identificação de “death genes”
há uma década atrás (SHAO et al., 1996).
Uma célula em apoptose pode ser identificada pelos exames histopatológico,
de acordo com as características morfológicas típicas, e mediante técnicas
imunoistoquímicas, utilizando marcadores específicos (SAIKUMAR et al., 1999;
ALTUCCI & GRONEMEYER, 2001; LIU et al., 2001).
Os componentes chave nesta auto-destruição são os membros da família das
caspases. Além disso, pode-se concluir que o mitocôndria tem grande importância
em determinar quando a célula irá entrar no caminho da apoptose (KAUFMANN &
HENGARTNER, 2001).
40
As caspases estão todas implicadas na regulação e execução da apoptose.
São proteoliticamente processadas para sua forma ativa, compostas de resíduos
catalíticos de cisteína e determinantes que controlam a especificidade de
substratos (SCHMITZ et al., 2000; ALTUCCI & GRONEMEYER, 2001). Estes
substratos são agrupados em diferentes classes de acordo com sua função. Entre
estas, estão as proteínas pró e anti-apoptóticas (KAUFMANN & HENGARTNER,
2001).
Há duas famílias de caspases, de acordo com o comprimento de seu
domínio terminal NH
2
. As caspases 1, 2, 4, 5, 8, 9 e 10 têm longos domínios e tem
função em regular a apoptose. Caspases 3, 6 e 7 têm domínios curtos e são
responsáveis pela execução da apoptose. A caspase 3 é a executora terminal,
essencial para as alterações nucleares associadas a apoptose (ZORNIG et al.,
2001).
As caspases podem ser divididas de acordo com suas funções. O primeiro
grupo, o qual está implicado na maturação das citocinas incluem a caspase 1, 4, 5
e 14 (LOS et al., 2003). O segundo grupo, que envolvem as caspases 2, 3, 6, 7, 8,
9 e 10, que estão literalmente implicadas na apoptose. O mecanismo de apoptose
é executado por uma cascata de ativação seqüencial de caspases iniciadoras e
efetoras. As iniciadoras, que incluem as caspaes 2, 8, 9, 10 e 12, apresentam
longos prodomínios com reconhecimento da interação homotipica proteina-
proteina, como os dominios efetores da morte (DED) ou do recrutamento do
domínio das caspases (CARD) que contribuem com a transdução de varios sinais
para a atividade proteolítica. As duas principais funções das caspases iniciadoras
(8 e 9) é distiguir as vias a qual culmina na ativação do principal efetor a
procaspase 3. Caspase 3, 6 e 7 são sabidamente caspases efetoras, são
responsáveis pela clivagem da maioria dos substratos apoptóticos já conhecidos,
como o fator fragmentador de DNA 45 (DFF 45), poli- (ADP-ribose) polimerase
(PARP), sendo todas estas caracterizadas com a apoptose nuclear (KAUFMANN
& HENGARTNER, 2001).
Após exposição de uma célula aos estímulos apoptóticos, o citocromo c é
liberado da mitocôndria ao citosol, o qual representa um dos vários fatores
41
implicados na ativação proteolítica da caspase-3 pela caspase-9 (Apaf-3)
(SAIKUMAR et al., 1999; ZORNIG et al., 2001). Bioquimicamente, foram
identificadas duas proteínas citoplasmáticas, Apaf-1 e Apaf-3, que junto ao
citocromo c formam um complexo, que ativará a caspase-3 (HUANG & OLIFF,
2001).
Por outro lado, todos esses fatores pró-apoptóticos sofrem a influência dos
fatores bcl-2/bcl-x (L), localizados na membrana mitocondrial externa. O bcl-2
bloqueia a apoptose tanto bloqueando a liberação do citocromo c como se ligando
ao Apaf-1 prevenindo a ativação da caspase 9. Alternativamente, membros pró-
apoptóticos da família bcl-2, como Bax, Bak e Bik, promovem a apoptose
deslocando Apaf-1 do Bcl-2/x (L) (OWUOR & KONG, 2002).
De um modo global a regulação da apoptose pode ser exemplificada pela
ação do p53 que pode diminuir a expressão dos níveis de bcl-2 e aumentar os
níveis do Bax. O Bax é liberado para a membrana mitocondrial, com conseqüente
liberação do citocromo c para o citoplasma, ativando a cascata das caspases,
responsáveis pela quebra de proteínas importantes no núcleo e citoesqueleto.
Estas alterações conduzem para os últimos passos da apoptose e das alterações
morfológicas características desta fase. Assim, a apoptose pode ser caracterizada
pela fragmentação do DNA e por corpos apoptóticos. Outro mecanismo possível
de suprimir a apoptose pelo Bcl-2 surgiu da observação que sua expressão pode
afetar a homeostasia intracelular de Ca
+2
(ZORNIG et al., 2001).
O processo de apoptose pode ser induzido por uma variedade de
estímulos, incluindo a ativação de receptores de membrana como TNF/NGF,
incluindo integrantes de sua superfamília (Fas) que são capazes de ativar as
caspases (SCHMITZ et al., 2000; SUYAMA et al., 2002).
Elevados níveis de apoptose foram significativamente associados com
fatores prognósticos desfavoráveis, incluindo carcinomas pouco diferenciados,
maior tamanho tumoral, elevados níveis de expressão ki 67 e elevados índices de
mitose. A média dos índices apoptóticos foi maior nos linfonodos metastáticos que
no carcinoma primário. Desta forma foi fortemente associado com a progressão do
carcinoma primário para a metástase ganglionar (VILLAR et al., 2001).
42
A presença de altos níveis de apoptose foi associado com aumento da
proliferação celular, negatividade para estrógeno, imuno-positividade para erbB-2
e p53, e menor sobrevida. Apoptose não provou ter valor prognóstico
independente em ambos, linfonodo positivo ou linfonodo negativo (LIU et al.,
2001).
Qualquer descoberta é importante para a criação de novas terapias e
métodos de prevenção, que poderão evitar ou tratar com sucesso inúmeras
doenças hoje incuráveis.
Tratamento
Para as neoplasias mamárias em fêmeas da espécie canina, a mastectomia
constitui a terapia de escolha, com exceção dos carcinomas inflamatórios e as
metástases à distância (WITHROW & MacEWEN, 1996).
Além de conhecer os fatores etiológicos oncogênicos é de fundamental
importância para a prevenção que o médico veterinário oriente o cliente no que
refere-se à profilaxia neoplásica; - as exéreses neoplásicas com amplas margens
de segurança combinadas com quimioterapia antineoplásica, constituem opções
terapêuticas para prolongar a sobrevida de cães acometidos por tumores
mamários (HENDERSON et al., 1991; MORRIS et al., 1998; PERATONI, 1998;
FERREIRA et al., 2006).
O estudo da apoptose e do câncer está começando a esclarecer por que
muitos tumores resistem à radioterapia e à quimioterapia. Pensava-se que tais
terapias destruíam o tumor por necrose, mas agora sabe-se que as células
morrem em geral por apoptose. O que parece ocorrer é que tanto a radiação
quanto as drogas danificam o DNA das células cancerosas, ativando o gene p53 e
levando ao “suicídio” celular. Mas células cancerosas sem a p53 ou com altos
níveis de Bcl-2 não morrem, tornando inúteis essas terapias (MUTO et al., 2000).
43
Indicadores moleculares no câncer mamário em cadelas SRD
Com o avanço dos estudos moleculares, são grandes os progressos
oferecendo novas perspectivas para se conhecer melhor a gênese e evolução do
câncer da mama. A expressão histoquímica e imunoistoquímica são habitualmente
utilizadas para designar aqueles setores da histologia que permitem a
identificação e a localização de compostos químicos específicos nos tecidos e
células respectivamente. A grande maioria deles se baseia na produção de
reações coradas, desenvolvidas em cortes de tecidos entre a substância
pesquisada e o reagente utilizado. Apesar dessa aparente simplicidade, estes
dados são escassos em Medicina Veterinária. Mais ainda, o uso associado desses
indicadores em câncer de mama de cadelas SRD, são até o momento
inexistentes. Assim, essa proposta contribuirá não só no aspecto clínico-
epidemiológico, como também de documentação molecular do câncer mamário de
cadelas, com grande potencial para entendimento deste modelo experimental para
estudos humanos.
Este estudo foi realizado para investigar o papel do índice de apoptose como
parâmetro para prognóstico de cadelas SRD com carcinoma mamário. Foi
determinado pela expressão de caspase-3 e comparadas com parâmetros clínicos
tradicionais do cancer de mama. Adicionalmente foi determinado a expressão de
parâmetros funcionais incluindo PCNA.
44
OBJETIVOS
Gerais
Associar o índice de proliferação celular e de apoptose pela
imunomarcação de células positivas para PCNA e caspase-3 com a
classificação histopatológica e estadiamento clínico das neoplasias
mamárias em cadelas sem raça definida.
Específicos
Associar alterações de marcadores de proliferação e apoptose no tumor
primário e na metástase pulmonar;
Associar as características clínicas do câncer de mama com o
comportamento proliferativo e apoptótico avaliados pela técnica
imunoistoquímica.
45
MATERIAL E MÉTODOS
Pacientes
Dentre os animais atendidos no serviço de Patologia, foram selecionadas
40 cadelas, sem raça definida (SRD), de diferentes faixas etárias, agrupadas em
quatro grupos de 10 animais cada, classificados pelo TNMc em grupos no estágio
I, II, III e IV da doença. O critério de inclusão foi baseado na suspeita de neoplasia
mamária confirmada pelo Serviço de Patologia mediante o exame clínico completo
e diagnóstico histopatológico. Foram obtidas junto aos seus respectivos
proprietários, as histórias detalhadas e, em particular, as características
relacionadas ao ciclo estral e reprodução dos animais.
Para a realização deste estudo foram obedecidas as normas éticas exigidas
pela Câmara de Ética em Experimentação Animal – CEEA protocolo n
o
29/99 e
incluiu a obtenção do consentimento esclarecido de cada proprietário.
Análise microscópica
Para a realização deste estudo desenvolveu-se protocolo para a coleta
sistematizada dos dados do exame histopatológico e resultado. O protocolo foi
adaptado seguindo as referências de FERREIRA et al., 2003a.
A leitura do material foi realizada em microscópio de luz, seguindo os
critérios: 100x para avaliação da celularidade e qualidade da coloração; 200x para
as características dos tipos celulares; e, por fim, o aumento de 400x para análise
morfológica individual das células (características nucleares e citoplasmáticas).
Análise clínica
Após a confirmação do diagnóstico para malignidade, o laudo foi
encaminhado, como procedimento de rotina, para o profissional
(clínico/cirurgião/proprietário) responsável pelo caso. Os animais foram
46
identificados em fichas próprias, elaboradas para realização deste estudo. Nestas
fichas foram registrados os dados de identificação do animal, o histórico e o
exame clínico. O histórico da ênfase ao comportamento reprodutivo (cios,
gestações, aborto e uso de anticoncepcionais), visto que o envolvimento hormonal
é a hipótese que tem conseguido maior confirmação junto aos pesquisadores e
clínicos (Anexo A).
Como meio de classificação da altura do animal, utilizou-se o método
aplicado pela Confederação do Brasil Kennel Clube (CBKC, 1987), obtido pela
mensuração da distância entre o solo e a cernelha, permanecendo o animal em
posição quadrupedal. Desta forma aplicou-se como base às normas existentes
para os cães com raça definida, utilizando-se a altura limite até 35cm para porte
pequeno, 36-46cm para porte médio e acima de 46cm para porte grande.
A análise da condição corporal seguiu a metodologia aplicada em estudo
anterior, para a avaliação da composição corporal e achados físicos, por meio da
visualização e um simples exame físico (BURINI, 2002).
Classificação clínica da neoplasia
Após a confirmação do câncer mamário e caracterização do quadro clínico,
foi realizado o estadiamento clínico da doença utilizando-se o sistema TNM-clínico
(Tumor-Linfonodo-Metástase) para câncer de mama, elaborado pela Organização
Mundial de Saúde (OMS). Tem como base à dimensão do tumor (T), a avaliação
da extensão aos linfonodos (N) e a presença ou não de metástases à distância
(M). Após a avaliação destes fatores, os casos foram classificados em estágios
que variam de I a IV graus crescentes de acordo com a gravidade da doença
(Quadro 1) BRASIL, 1998.
Nos casos de multicentricidade utilizou-se o diâmetro do maior tumor e em
casos de tumores bilaterais apenas o tumor com estágio mais avançado foi
considerado.
A classificação pelo TNM-clínico (MISDORP et al., 1999) tem como base os
seguintes critérios:
47
T= Tamanho ou Extensão Tumoral (maior diâmetro do tumor primário)
Tx – tumor primário não pode ser avaliado
T0 – nenhuma evidência de tumor primário
TIS – carcinoma in situ ou doença de Paget do mamilo sem tumor adjacente
T1 – 2 cm ou menos
T2 - > 2,0 até 5,0 cm
T3 - > 5,0 cm
T4 – qualquer tamanho de tumor com extensão direta para parede torácica ou
abdominal ou pele
T4a – extensão à parede torácica
T4b – edema, ulceração da pele ou nódulos cutâneos satélites confinados à
mesma mama
T4c = T4a + T4b
T4d – carcinoma inflamatório
N = Envolvimento Linfonodal
Nx – linfonodos regionais não podem ser avaliados
N0 – ausência de metástases para linfonodos regionais
N1 – metástases para linfonodos regionais ipsilaterais móveis
N2 - metástases para linfonodos regionais ipsilaterais fixos (linfonodos fixos uns
aos outros ou fixos a outras estruturas)
N3 – metástases para linfonodos da cadeia mamária interna ipsilateral
M = Metástase à Distância
Mx – metástases não podem ser avaliadas
M0 – não existem metástases
M1 – presença de metástases à distância
48
Quadro 1 - Estadiamento clínico pela classificação TNM (MISDORP et al., 1999).
Estadiamento clínico
Estadiamento
Tamanho
Linfonodo
Metástase
Estádio 0 TIS N0 M0
Estádio I T1 N0 M0
Estádio IIA T0 N1 M0
T1 N1 M0
T2 N0 M0
Estádio IIB T2 N1 M0
T3 N0 M0
Estádio IIIA T0 N2 M0
T1 N2 M0
T2 N2 M0
T3 N1, N2 M0
Estádio IIIB T4 *qqN M0
*qqT N3 M0
Estádio IV qqT qqN M1
*qqT- qualquer tamanho
*qqN- qualquer envolvimento linfonodal
Análise histopatológica
Foram selecionadas 40 amostras de carcinoma primário das cadelas divididas
em quatro grupos de acordo com o estágio da doença, adicionalmente foi
processada amostra das respectivas metástases pulmonares dos animais no
estágio IV.
Para análise histopatológica foram realizados procedimentos rotineiros para
o processamento da amostra em blocos de parafina, preparação de lâminas e
posterior coloração por Hematoxilina e Eosina (H&E).
As neoplasias foram classificadas segundo a descrição histológica para
tumores mamários em caninos recomendados atualmente pela Organização
Mundial de Saúde. As características utilizadas para pontuação e soma dos
escores para posterior classificação conforme o grau de malignidade estão
descritos no Quadro 2.
49
Quadro 2 – Características utilizadas para classificação de tumores mamários de
cadelas conforme o grau de malignidade.
Características Escore
1. Formação de túbulo: um ponto para formação de túbulos
bem marcada; três pontos para pouco ou nenhuma túbulo
1 2 3
2. Hipercromatismo e mitoses: um ponto se uma figura mitótica
é vista ocasionalmente; dois pontos se duas ou três figuras são
vistas; três pontos se o número é alto
1 2 3
3. Tamanho e forma irregular do núcleo: um ponto se os
núcleos são proporcionais em tamanho e forma, três pontos
quando o pleomorfismo é marcado.
1 2 3
Total do escore Grau de malignidade
3-5
6-7
8-9
I
II
III
Fonte: Misdorp, 1999
Por outro lado, foi proposto outro sistema classificatório, os quais se
baseiam em classificação histológica descritiva, que também contemplaria o fator
prognóstico da neoplasia avaliada. Isto se deve a resultados conflitantes entre
carcinomas compostos por componentes exclusivamente epiteliais (Tipo simples)
e carcinomas com envolvimento de células mioepiteliais (Tipo complexo), neste
último inclui as neoplasias com elementos heterólogos como formações ósseas e
cartilaginosas.
Análise imunoistoquímica
Efetuou-se a análise imunoistoquímica de 50 amostras de câncer de mama
(40 tumores mamários primários e em 10 casos suas respectivas metástases
pulmonares). As 10 metástases pulmonares são dos animais no estágio IV da
doença.
50
Para realização da técnica de imunoistoquímica, os blocos de parafina
foram novamente cortados em micrótomo com espessura de três µm e distendidos
em lâminas histológicas previamente preparadas com Organsylane (Sigma-Aldrich
A3648) com o intuito de promover maior aderência dos cortes às lâminas, evitando
a perda do material durante o procedimento imunoistoquímico. As lâminas foram
estocadas em estufa com temperatura entre 55 e 58ºC por 24 horas, e
transferidas para cubas de vidro vertical para iniciar a técnica.
A técnica de imunoistoquímica seguiu o protocolo do Laboratório de
Imunoistoquímica do Serviço de Patologia da FMVZ – UNESP – Botucatu.
A desparafinização foi realizada com dois banhos em xilol de 30 minutos
cada em temperatura ambiente.
O processo de desidratação foi realizado com passagens em álcool
absoluto (três vezes de três minutos), álcool 95º e álcool 85º.
Iniciou-se então a recuperação antigênica, com o propósito de liberar os
epítopos antigênicos do tecido, bloqueados pela solução fixadora (formol
tamponado a 10%). Este processo variou conforme o anticorpo primário a ser
empregado. Solução de citrato pH 6,0 foi previamente aquecida a 97ºC em banho
Maria, em seguida as lâminas foram colocadas na solução e permaneceram nesta
mesma temperatura por trinta minutos. Após o término desta fase as lâminas
foram deixadas em temperatura ambiente durante vinte minutos para
arrefecimento, sendo posteriormente lavadas com água destilada.
A fase seguinte consistiu do bloqueio da peroxidase endógena por imersão
das lâminas em uma solução de peróxido de hidrogênio 10 volumes por 20
minutos. Em seguida o material foi lavado em água destilada e banhado duas
vezes, de cinco minutos cada, em solução de TRIS (10mM ph7,4).
O material foi incubado durante uma hora com BSA 1% no intuito de reduzir
a coloração de fundo. Então, os anticorpos primários foram diluídos em solução de
BSA 1%, sendo em seguida aplicados às amostras, e estas incubadas em câmara
úmida por 18 horas (“over-night”) à temperatura de 4ºC (Tabela 1).
51
Tabela 1- Anticorpos primários utilizados, tipo de marcação, marca e diluições
padronizadas.
Anticorpo
primário
Tipo de
marcação
Clone Marca Diluição
padronizada
Caspase-3
Nuclear ASP175 Cell Signing 1:200
PCNA
Nuclear PC10 Dako 1:50
O controle negativo para proteínas inespecíficas foi realizado substituindo-
se o anticorpo primário por BSA 1% (o mesmo utilizado na diluição dos
anticorpos). Como controle negativo específico, substituiu-se o anticorpo primário
monoclonal ou policlonal por imunoglobulinas produzidos em camundongo
1
e em
coelho
2
, respectivamente.
Para diminuição das reações inespecíficas dos anticorpos secundários, na
reação com o anticorpo primário anti-caspase-3 clivada, utilizou-se ainda soro
normal de cabra
3
antes da incubação dos anticorpos primários.
Após este período procedeu-se a lavagem das amostras em solução de
TRIS (dois banhos de cinco minutos cada), a incubação com anticorpo biotinilado
e posteriormente com a solução streptavidina-peroxidase, ambas do kit LSAB
4
,
por 30 minutos cada reação, em câmara úmida, à temperatura ambiente. Entre as
duas reações e ao final da segunda lavaram-se as amostras com TRIS por duas
vezes de cinco minutos cada. Utilizou-se ainda, para o anticorpos primário anti-
1
Negative Control Mouse, Dako Cytomation, cod. N1698, Via Real, Carpinteria, CA, USA
2
Negative Control Immunoglobulin, Dako Cytomation, cod. X0903, Carpinteria, CA, USA
3
Goat Serum (Normal), Dako Cytomation, cód. X0907, Via Real, Carpinteria, CA, USA
4
Dako cód. K0690
52
caspase 3 clivada, o sistema de visualização EnVision Dual Link
5
composto por
um polímero ligado ao anticorpo secundário e à peroxidase, compatível com
anticorpos primários produzidos em camundongos (monoclonais) e em coelhos
(policlonais). O produto foi aplicado sobre os cortes onde permaneceu por 30
minutos, após este período o material seguiu o mesmo protocolo utilizado para o
kit LSAB.
Para visualização da reação, os cortes foram cobertos com cromógeno
(DAB líquido+)
6
, preparado no momento do uso, durante cinco a trinta minutos, a
depender do anticorpo primário, e logo depois banhados em TRIS, para a
interrupção da reação, e então lavados em água destilada por dez minutos.
As lâminas foram contra-coradas com Hematoxilina de Mayer por um
minuto, lavadas em água corrente por dez minutos, passadas uma vez em água
destilada e desidratadas. Esta etapa consistiu-se de uma passagem em álcool
85º, uma em álcool 95º, três em álcool absoluto e três em xilol, cada etapa
durando cinco minutos. Cobriram-se as lâminas com lamínulas, aderindo-as com
resina sintética Permount
7
.
Avaliação da imunorreatividade
A imunorreatividade para PCNA e caspase-3 foi considerada quando a
marcação ocorria no núcleo celular e com intensa reação. Em cada preparação
foram contabilizados os núcleos positivos num total de 300 células, selecionando-
se para contagem as áreas com imunorreactividade mais intensa e homogênea.
As contagens foram efetuadas em analisador de imagem, sempre pelo
mesmo observador e com a objetiva de 40x, estabelecendo-se em seguida a
percentagem de núcleos positivos (índice de proliferação (IP) do PCNA e índice de
apoptose (IAPOP) da caspase-3).
A determinação do índice proliferativo (IP) e índice de apoptose (IAPOP)
consistiram do percentual de células com marcação nuclear positiva para PCNA e
5
Dako cód. K4061
6
Dako cód. K3468-1
7
Fisher Scientific cód. SP15-500
53
caspase-3 em 300 células epiteliais contadas nos focos de carcinoma mamário
para cada anticorpo, por lâmina.
Análise estatística
A associação entre variáveis qualitativas foi avaliada através de testes exatos
para tabela de contingência. Aplicou-se, nos demais casos, o teste t, para a
comparação de duas médias, e análise de variância, com o objetivo de comparar
mais de duas médias. Nas situações em que se detectou diferença entre médias
por meio de análise de variância, procedeu-se com a execução do teste de
comparação de múltiplas médias de Tukey, a fim de detectar quais, dentre as
médias comparadas, de fato diferem. Todas as conclusões baseiam-se em um
nível de 5% de significância (VIEIRA, 2004; BUSSAB & MORETTIN, 2006).
Para comparar os estadiamentos com relação ao percentual de cadelas com
pseudogestação, castrada, multiparidas, que abortaram, que utilizaram
contraceptivo, que apresentaram secreção vaginal e que possuem cio regular foi
utilizado o teste exato de Fisher ao nível de significância = 0,05 (SAS, 1999).
Para comparar os estadiamentos com relação ao PCNA da mama e da
Caspase-3 da mama foi utilizado o teste F da Análise de variância (ANOVA) para
amostras independentes ao nível de significância = 0,05 seguido do teste de
Bonferroni para comparações múltiplas. A verificação da normalidade das
variáveis PCNA da mama e Caspase-3 da mama na amostras dos diferentes
estadiamentos foi testada pelo teste de Shapiro-Wilk e a homocedasticidade entre
os grupos foi testada por meio do teste de Leneve. Em ambos os testes o nível de
significância foi = 0,05 (SAS, 1999).
Para comparar os tipos de carcinomas (simples e complexo) com relação ao
percentual de cadelas com pseudogestação, castradas, multiparidas, que
abortaram, que utilizaram contraceptivo, que apresentaram secreção vaginal e que
possuem cio regular foi utilizado o teste de qui-quadrado ou o teste exato de
Fisher ao nível de significância = 0,05 quando as pressuposições para o uso do
teste de Qui-quadrado não eram atendidas.
54
Para comparar os grupos de carcinoma simples e complexo com relação ao
PCNA da mama e da Caspase-3 da mama foi utilizado o teste t de Student para
amostras independentes ao nível de significância = 0,05. A verificação da
normalidade das variáveis PCNA da mama e Caspase-3 da mama nos dois
grupos foi testada utilizando o teste de Shapiro Wilk ao nível de significância =
0,05 e a verificação da igualdade de variância entre os grupos foi testada por meio
do teste de Levena ao nível de significância = 0,05 (SAS, 1999).
Para comparar o tumor primário com metástase pulmonar em relação ao
PCNA e Caspase-3 no estadiamento IV foi utilizado o teste t de Student para
amostras independentes ao nível de significância = 0,05. A verificação da
normalidade das variáveis PCNA e Caspase-3 foi testada utilizando o teste de
Shapiro Wilk ao nível de significância = 0,05 e a verificação da igualdade de
variância entre os grupos foi testada por meio do teste de Levena ao nível de
significância = 0,05 (SAS, 1999).
Para comparar os graus de malignidade I e II em relação ao IP da mama e da
IAPOP da mama foi utilizado o teste de Mann-Whitney para amostras
independentes ao nível de significância = 0,05. A verificação da normalidade das
variáveis PCNA e Caspase foi testada utilizando o teste de Shapiro Wilk ao nível
de significância = 0,05 (SAS, 1999).
Para estudar o efeito da ulceração sobre o PCNA da mama e da Caspase-3 da
mama foi utilizado o teste de Mann-Whitney para amostras independentes ao nível
de significância = 0,05. A verificação da normalidade das variáveis PCNA e
Caspase-3 foi testada utilizando o teste de Shapiro Wilk ao nível de significância
= 0,05 (SAS, 1999).
Para estudar o efeito da presença de linfonodo positivo (metástase) sobre o
PCNA da mama foi utilizado o teste t de Student para amostras independentes ao
nível de significância = 0,05 e sobre a Caspase-3 da mama foi utilizado o teste
de Mann-Whitney para amostras independentes ao nível de significância = 0,05.
A verificação da normalidade das variáveis PCNA e Caspase-3 foi testada
utilizando o teste de Shapiro Wilk ao nível de significância = 0,05 (SAS, 1999).
55
RESULTADOS
No presente trabalho, pelo número de animais avaliados, optou-se pelo
agrupamento dos animais nos estágios tumorais I (local), II (A e B), III (A e B) e IV
(metastático).
Os resultados individuais dos cães no estágio I da doença estão
apresentados nos anexos A, B, C e D; do estágio II nos anexos E, F, G e H; do
estágio III nos anexos I, J, K e L e do estágio IV nos anexos M, N, O e P.
O estudo foi realizado com 40 cadelas sem raça definida, de diferentes
portes apresentavam câncer de mama. Foram estudados animais de 3 a 15 anos
de idade, 37 (92,5%) deles acima de 6 anos, 19 (47,5%) com idade superior a 10
anos e dois animais (5%) com idade de três anos. O porte dos animais variou de
quatro de porte pequeno (10%) e porte médio (45%) e grande (45%). A obesidade
esteve presente em 22 (55%) cadelas. Em 32 (80%) cadelas a alimentação era
mista, caseira e industrial, sendo que oito cadelas (20%) receberam
exclusivamente comida caseira e nenhuma, exclusivamente ração (Figura 1).
Figura 1- Percentual de animais com as principais características
clínicas e epidemiológicas avaliadas (n=40).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Acima de seis
anos
Porte médio Obesidade Alimentação
mista
56
Pela história da doença atual 30 cadelas (75%) eram multíparas, quatro
animais tiveram pelo menos um abortamento até o momento do diagnóstico,
percentual idêntico ao número de cadelas castradas. 37 cadelas (92,5%)
apresentaram cios regulares, 16 (40%) já tiveram pseudogestação e oito (20%)
foram submetidas à administração de contraceptivos (Figura 2).
As lesões mostraram-se mais freqüentes nas mamas inguinais,
acometendo 28 animais (70%) com distribuição semelhante entre as cadeias
direita 31 (77%) e esquerda 33 (82,5%). A distribuição foi crescente no sentido
antero-posterior em ambas as cadeias. Dentre as 40 cadelas, sete (17,5%)
apresentaram um único nódulo mamário enquanto que o envolvimento
multicêntrico estava presente em 33 (82,5%) animais. O envolvimento bilateral das
mamas acometeu 24 animais (60%) Figura 3.
Figura 2- Prevalência dos animais com as características reprodutivas estudadas.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
C
i
o
s
reg
ul
a
r
e
s
Pseudociese
Cont
ra
ce
p
tivo
Aborto
57
Figura 3- Cadela SRD de porte grande - TNMcII, portadora de câncer de mama
multicêntrico bilateral.
Prevaleceu o tamanho tumoral menor que cinco centímetros de diâmetro
em 15 animais (37,5%) acometidos. Como característica clínica geral da amostra
tumoral, há evidência estatística de associação entre os estágios da doença com o
aspecto clínico do tumor (sólido, cístico e infiltrativo) P=0,00023 (Tabela 2).
Apesar de não existir evidência estatística de associação entre os estágios
da doença e a consistência do tumor (firme, macia e elástica), prevaleceram os
tumores de consistência firme (Figura 4).
Dentre as associações de imunomarcação para os anticorpos primários PCNA
e caspase-3 não houve evidência estatística de que IP e IAPOP sejam diferentes
dentre os tamanhos tumorais.
58
Tabela 2- Diferença estatística de associação entre os estágios da doença e
aspecto clínico do tumor.
Estágio Aspecto
clínico
I II III IV
Total
Sólido 10 6 4 6 26
Cístico 0 4 0 0 4
Infiltrativo 0 0 6 4 10
Total 10 10 10 10 40
P=0,00023
Figura 4- Porcentagem de animais em cada característica clínica estudados
dos tumores de mama.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
B
i
lateral
Ingu
i
nais
Firme
59
A média de idade de acordo com o estágio da doença entre os animais foi
de dez anos para os estágio II e III, nove anos para o estágio I e sete anos para o
estágio IV (Tabela 3).
Não houve associação significativa do estadiamento clínico do tumor com
as variáveis idade e obesidade. Embora sem associação significativa da idade
sobre o estadiamento tumoral, o estágio III foi mais freqüente nos animais mais
velhos (média de 10 anos) e a forma mais grave da doença nos animais com
idade entre seis a nove anos (média de 7,5 anos). Com a mesma limitação
estatística, a maioria dos animais obesos esteve distribuída no estágio II (80%),
seguido dos estágios I e III (50%) e com menor freqüência no estágio IV (40%)
Figura 5 (Tabela 4).
Tabela 3 - Distribuição da freqüência do estadiamento clínico neoplásico de
acordo com a idade dos animais.
Estágio Idade
I II III IV
Total
Até 5
1 0 1 1 3
6 – 9
5 5 1 7 18
> 10
4 5 8 2 19
Total
10 10 10 10 40
*Idade = anos
P=0,22
60
Figura 5- Cadela SRD – TNM-I (A). Cadela SRD – TNM-II (B). Cadela SRD –
TNM-III (C). Cadela SRD –TNM-IV (D). Raio x correspondente ao animal anterior,
onde observa-se metástase pulmonar (E).
C
D
A
B
E
61
Tabela 4- Distribuição da freqüência do estadiamento clínico com a condição
corporal dos animais.
Estágio Condição
corporal
I II III IV
Total
Peso ideal
4 1 2 6 13
Acima do peso
1 1 3 - 5
Obeso
5 8 5 4 22
Total
10 10 10 10 40
P=0,15
Embora sem associação estatística, prevaleceram no estadiamento clínico
I, II e IV os animais de porte grande com metade dos casos, e no estágio III
prevaleceu o porte médio (70%) Tabela 5.
Tabela 5- Distribuição da freqüência do estadiamento clínico com o porte dos
animais.
Estágio Porte
I II III IV
Total
Pequeno
2 1 - 1 4
Médio
3 4 7 4 18
Grande
5 5 3 5 18
Total
10 10 10 10 40
P=0,15
62
Nenhuma das características reprodutivas das cadelas tiveram diferença
significativa entre os estágios da doença (Tabela 6).
Tabela 6- Distribuição da casuística em cada característica entre os
estadiamentos da doença.
Estadiamento
Características
I (n=10)
II (n=10)
III (n=10)
IV (n=10)
P
(*)
Pseudo Gestação (%) 60,0 20,0 40,0 40,0 0,391
Castrada (%) 10,0 20,0 10,0 0,0 0,890
Crias (%) 80,0 70,0 60,0 90,0 0,621
Aborto (%) 0,0 20,0 20,0 0,0 0,299
Uso de contraceptivo (%)
0,0 40,0 20,0 20,0 0,206
Secreção vaginal (%) 10,0 20,0 30,0 10,0 0,804
Cio regular (%) 100,0 90,0 100,0 80,0 0,595
(*) Teste exato de Fisher ao nível de significância = 0,05.
Os valores de IP não apresentaram diferença significativa entre os
diferentes estágios da doença, no entanto houve evidência estatística de que a
média de IAPOP seja diferente entre os quatro estágios. Verifica-se maior
quantidade média de células imunomarcadas para caspase-3 no estágio III em
relação aos estágios I e II. Estima-se que este incremento seja de
aproximadamente 35 núcleos celulares imunomarcados a mais no estágio III que
os dois estágios iniciais (P<0,001) Tabela 7 (Figuras 6 e 7).
63
Tabela 7- Resumo descritivo e valores de PCNA e caspase-3 referentes às
comparações entre os estadiamentos da doença.
Estadiamento Biomarcadores
I (n=10) II (n=10) III (n=10) IV(n=10)
p
(*)
PCNA 25,60 ± 6,85
37,90 ± 15,82
32,40 ± 11,58
35,90 ± 10,62
0,112
CASPASE-3 29,20 ± 9,37
28,90 ± 19,24
64,70 ± 18,64
45,10 ± 24,44
<0,001
(1)
(*) ANOVA ao nível de significância =0,05.
(1) I < III (p = 0,001) ; II < III (p=0,001) – Teste de Bonferroni
Figura 6- Relação entre o estadiamento clínico (TNM) e o IAPOP avaliado
pela caspase-3.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
TNM-I
TN
M
-II
TN
M-II
I
TN
M
-IV
Caspase-3
64
Figura 7- Carcinoma simples - TNM II, histopatológico positivo para caspase-3 40x
(A). Carcinoma simples - TNM III, histopatológico positivo para caspase-3 40x (B).
As associações dos biomarcadores PCNA e caspase-3 não apresentaram
diferenças significativas entre as cadelas linfonodo-positivas com as linfonodo-
negativas (Tabela 8). Por outro lado a caspase-3 mostrou associação significativa
entre os tumores ulcerados e aqueles não ulcerados (P<0,049) Tabela 9.
Desta forma, IAPOP teve associação positiva com as cadelas no estágio III
da doença e portadoras de tumores ulcerados.
Tabela 8 - Resumo descritivo e valores de PCNA e caspase-3 referentes ao
estudo do efeito da presença de linfonodo positivo.
Linfonodo Positivo
Biomarcadores
Não Sim
p
PCNA 33,2 ± 13,1 33,1 ± 9,4 0,809
(1)
CASPASE-3 36,0 (24,0 ; 50,5)
53,0 (28,0 ; 68,0)
0,225
(2)
(1) Teste t de Student ao nível de significância =0,05. Valores expressos em média e desvio-padrão.
(2) Teste de Mann-Whitney ao nível de significância =0,05. Valores expressos em mediana e quartís.
A
B
65
Tabela 9 - Resumo descritivo e valores de PCNA e caspase-3 referentes ao
estudo do efeito da ulceração tumoral.
Ulcerado
Biomarcadores
Não Sim
p
(*)
PCNA 30,0 (24,5 ; 36,5)A
34,0 (26,0 ; 51,0)A
0,187
CASPASE-3 30,0 (24,0 ; 41,5)A
57,0 (38,0 ; 65,0)B
0,049
(*) Teste de Mann-Whitney ao nível de significância =0,05.
Letras maiúsculas diferentes na mesma linha diferem entre si pelo Teste de Mann-Whitney ao nível de
significância =0,05.
No estágio terminal (IV) as associações dos biomarcadores de proliferação
e apoptose celular não apresentaram diferença significativa entre amostras de
tumor primário com suas respectivas metástase pulmonar. No entanto, ao nível de
10% de significância, pode-se afirmar que as médias de IAPOP no pulmão e na
mama são diferentes. Estima-se que a quantidade de células em apoptose no
pulmão seja em média 27,1unidades nucleares imunomarcadas a mais que na
mama (Tabela 10) Figura 7.
Tabela 10 - Resumo descritivo e valores de PCNA e caspase-3 referentes às
comparações entre os tumores primário e metastático no estadiamento IV.
Local/Metástase
Biomarcadores
Mama Pulmão
p
(*)
PCNA 35,90 ± 10,62 36,20 ± 10,92 0,951
CASPASE-3 45,10 ± 24,44 65,90 ± 41,84 0,191
(*) Teste t de Student ao nível de significância =0,05.
66
Figura 7- Média de IP e IAPOP entre o tumor primário e respectiva
metástase pulmonar.
A frequência de carcinoma simples foi idêntica entre os estágios da doença,
comprometendo 7 (70%) animais de cada grupo (Figura 8), restando três animais
de cada estágio com carcinoma complexo (Figura 9) Tabela 11.
O estadiamento tumoral mais avançado (IV) foi mais freqüente nos animais
com idade média de 8 anos, não obesos, portadoras do carcinoma simples.
Apesar dos animais não obesos prevalecerem no estágio IV, nenhum apresentou
como condição corporal a magreza ou até mesmo a caquexia, talvez pela
interferência do curso biológico natural da doença por parte dos proprietários,
optando pela eutanásia.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
P
C
NA
Caspase
-
3
mama
pulmão
67
Figura 8- Cadela SRD portadora de carcinoma simples mamário – TNM IV (A).
Histopatologia correspondente - H&E 5x (B). Pulmão com metástase, fixado em
formalina 10%. Destaque, lobo pulmonar cranial direito (C). Histopatologia
correspondente - H&E 5x (D).
A
B
C
D
68
Figura 9- Carcinoma complexo mamário – TNM IV (A). Histopatologia
correspondente - Masson 5x, (B). Histopatologia, metástase pulmonar - Masson
20x (C).
A
B
C
69
Tabela 11- Distribuição da freqüência do estadiamento clínico conforme o tipo de
tumor.
Estágio Tipo de tumor
I II III IV
Total
Carcinoma
simples
7 7 7 7 28
Carcinoma
complexo
3 3 3 3 12
Total
10 10 10 10 40
p= 1
Dentre as portadoras de neoplasia mamária, 28 (70%) delas apresentaram
exclusivamente o componente epitelial (carcinoma simples) Figura 10, e 12 (30%)
cadelas o carcinoma complexo (Figura 11).
70
Figura 10 – Carcinoma simples mamário – M5E – TNMc III. Macroscopia
(A). Citopatologia – Giemsa 40X (B). Superfície de corte (C). Histopatologia –
Masson 5x (D).
A
B
C
D
71
Figura 11- Carcinoma complexo mamário – M5E – TNMc IV. Macroscopia (A).
Histopatologia correspondente – H&E 20x (B). Citopatologia – Giemsa 40X (C).
Histopatologia - Masson 5x (D).
A
D
C
B
72
Não houve diferença estatística entre os tipos de carcinoma com relação a
idade das cadelas. A mesma restrição estatística foi observada com relação ao
porte, condição corporal e tamanho tumoral.
Com a mesma restrição estatística apresentou-se a obesidade, vista em 16
animais (57%) com carcinoma simples e seis animais (50%) com carcinoma
complexo. Essa seqüência foi observada também para a multiparidade (75% e
75%), cios regulares (96% e 83%) e castradas (11% e 8%) Tabela 12 e Figura 12.
Assim, nas cadelas portadoras de câncer mamário, prevaleceu o carcinoma
simples (70%), associado à obesidade (57%), multiparidade (82%), cios regulares
(89%), castradas (11%) e maiores expressões de caspase-3 no estágio III da
doença.
Tabela 12 - Distribuição da casuística em cada característica reprodutiva entre os
carcinomas.
Carcinoma
Características
Simples (n =28)
Complexo (n =12)
p
Pseudogestação (%) 39,3 41,7 0,888
(*)
Castrada (%) 10,7 8,3 1,000
(**)
Crias (%) 75,0 75,0 1,000
(**)
Aborto (%) 10,7 8,3 1,000
(**)
Uso de contraceptivo (%)
14,3 33,3 0,211
(**)
Secreção vaginal (%) 17,9 16,7 1,000
(**)
Cio regular (%) 96,4 83,3 0,209
(**)
(*) Teste de Qui-quadrado no nível de significância = 0,05.
(**) Teste de exato de Fisher no nível de significância = 0,05.
73
Figura 12- Porcentagem de animais que apresentaram as características
clínicas estudadas de acordo com o tipo de tumor
As variáveis IP IAPOP não apresentaram associação significativa entre os
tipos de tumores (carcinoma simples x carcinoma complexo), no entanto estes
índices foram superiores no carcinoma simples (Tabela 13) Figuras 13 e 14.
Tabela 13 - Resumo descritivo e p-valores referentes às comparações entre os
tipos de carcinoma.
Carcinoma Simples Carcinoma Complexo Biomarcadores
n Mínimo Máximo Média ± DP n Mínimo Máximo Média ± DP
p
(1)
PCNA
28 15,00 64,00 33,14 ± 12,35 12
16,00 54,00 32,50 ± 12,24 0,881
CASPASE
28 9,00 100,00 45,14 ± 25,68 12
12,00 65,00 34,58 ± 15,04 0,114
(1) Teste t de Student ao nível de significância =0,05.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
TNMc I-IV
O
besi
dade
Multiparidas
Carcinoma simples
Carcinoma complexo
74
Figura 13- Porcentagem de positividade para IP e IAPOP de acordo com o tipo
tumoral.
Figura 14 - Carcinoma simples – TNM I, positivo para PCNA 40x (A). Carcinoma
complexo, área condromatosa - TNM I, positivo para caspase-3 40x (B).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
ca
r
ci
n
o
m
a
si
m
p
l
e
s
carcinoma complexo
PCNA
Caspase-3
A
B
75
Verificou-se que dentre os tumores complexos 75% apresentaram grau de
malignidade I, ou seja, o melhor prognóstico possível para um tumor maligno
(Tabela 14). Chama a atenção que nenhum entre os tumores complexos se
enquadraram no grau III, ou seja a pior versão tumoral. Já para o carcinoma
simples, verificou-se que ocorreram 68% de grau I, 29% de grau II e (4%) com
grau III. Grande parte dos tumores simples, foram do tipo túbulo-papilar, que se
trata do menos maligno dos carcinomas simples. justificando o maior número de
tumores grau I (Figura 15).
Figura 15- Distribuição dos tumores (carcinoma simples e carcinoma
complexo) pela graduação histopatológica.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Gra
u
I
Grau
II
Gr
a
u
II
I
Carcinoma simples
Carcinoma complexo
76
Tabela 14 – Distribuição histológica descritiva de carcinomas mamários com
respectivos graus de malignidade, recebidos para diagnóstico.
Grau de malignidade Tipos
I II III
Total
Carcinoma simples
18 9 1 28
Carcinoma complexo
9 3 - 12
Total 27 12 1
40
Com a limitação de apenas um animal ser classificado no grau III, a versão
menos diferenciada entre os carcinomas, foi realizado análise com os dois
primeiros graus de malignidade, os quais não apresentaram diferença estatística
entre as variáveis IP e IAPOP de acordo com o grau histológico (Tabela 15).
Tabela 15 - Resumo descritivo e valores de PCNA e caspase-3 referentes às
comparações entre os graus de malignidade.
Grau de malignidade
Biomarcadores
1 2
p
(*)
PCNA 26,0 (20,0 ; 36,0) 34,0 (30,0 ; 47,5) 0,061
CASPASE-3 30,0 (24,0 ; 61,0) 37,5 (32,0 ; 61,5) 0,456
(*) Teste de Mann-Whitney ao nível de significância =0,05. Valores expressos em mediana e quartís.
77
DISCUSSÃO
Conforme o já estabelecido pela literatura, o tumor de mama canino é
biologicamente similar à neoplasia mamária na mulher, sendo considerada como
modelo experimental para carcinogênese mamária (O’BRIEN, 2000; CASSALI et
al., 2005).
A anamnese, os exames físicos e complementares foram fundamentais na
definição do diagnóstico, estadiamento do tumor, classificação da neoplasia e
instituição da terapia, conforme MORRISON (1998) afirmou.
Para Yamagamy et al. (1996), nos cães, o estadiamento clínico parece ser
tão significante quanto a classificação histológica. No presente trabalho o
estadiamento clínico foi de fundamental importância para que se estabelecesse a
classificação clínica precisa e de comum acordo com as citadas pela literatura.
O material proveniente de mastectomia e necropsia, junto ao
processamento rotineiro de cortes histológicos processados e conservados em
parafina, corados em H&E proporcionaram aos clínicos/cirurgiões diagnóstico
definitivo. Com o exame clínico minucioso e auxílio do raio X, foi possível detectar
a presença de metástases à distância, em especial as ganglionares e pulmonares
(estágio IV).
Muitos dos trabalhos realizados nesta área (BOSTOCK, 1986; HELLMÉN et
al., 1993; YAMAGAMI et al., 1996; PÉREZ ALENZA et al., 1997) basearam-se na
classificação proposta pela O.M.S em 1974 (HAMPE & MISDORP, 1974). Moulton
(1990) simplifica esta classificação ao considerar como tumores complexos todos
os tumores com proliferação conjunta de células epiteliais e mioepiteliais, com ou
sem diferenciação cartílagínea e/ou óssea, o que nos pareceu adaptar-se melhor
à presente série de tumores. Dos tumores complexos deste estudo, 17%
apresentaram diferenciação óssea, 25% diferenciação osteóide e 8%
diferenciação condróide. Este último apresentou aspecto clínico mais agressivo
como ulceração cutânea, envolvimento de linfonodos e metástase a distância,
enquanto nos tumores com diferenciação osteóide 33% apresentou ulceração e
78
envolvimento de linfonodos. Com estes achados, fica evidente seu comportamento
agressivo e potencial metastático, apesar da menor incidência.
Em humanos, inúmeros estudos epidemiológicos têm investigado o papel
das medidas antropométricas, incluindo peso ou índice de massa corporal, ganho
de peso, localização topográfica do tecido adiposo, relacionado com o risco de
câncer de mama (TRENTHAM et al., 1997; BALLARD, 1999; McTIERNAN, 2000;
GREENWALD et al., 2001). Uma vez presente, o câncer evolui inicialmente em
compasso nutricional com o hospedeiro, mas em estágios avançados acaba
desnutrindo-o resultando em emagrecimento e perda de peso (WOLFSHEIMER,
2000). No presente trabalho utilizou-se a classificação da condição corporal como
indicador do estado nutricional e notou-se que nos casos mais avançados da
doença os animais apresentavam menor índice de obesidade.
Já está bem estabelecido que a glândula mamária é o sítio mais comum de
neoplasia nas cadelas (KOHLI et al., 1998), e que sua incidência aumenta
conforme a idade, mais rapidamente aos 6-7 anos de idade; 82% dos tumores de
mama ocorrem entre oito e 13 anos de idade nos caninos (SCHNEIDER et al.,
1969; ELSE & HANNANT, 1979; MOULTON, 1990; YAMAGAMI et al., 1996;
MacEWEN & WITHROW, 1996; STONE, 1998). De forma semelhante aos
trabalhos acima citados, 92% das cadelas apresentaram idade superior a seis
anos (média 9,7 anos) até o momento do exame, o que corresponde a cerca de 50
anos na mulher pela tabela de Lebeau (CASSALI, 2000). Certamente o fator idade
pode predispor às afecções oncológicas conforme afirmam inumeros autores, pois
no decorrer deste estudo não diagnosticou-se nenhuma neoplasia em animais
com poucos meses de idade, sendo, portanto, estes casos extremamente raros.
Estudos realizados no Brasil indicam que os tumores de mama ocorrem
com mais frequência em animais Sem Raça Definida, isso se deve ao fato de
haver o predomínio de cães mestiços em nosso país (ZUCCARI, 1999;
FERREIRA et al., 2003).
A prevalência de câncer em cães está aumentando consideravelmente. A
crescente incidência das afecções neoplásicas nessa espécie tem várias razões,
entre elas está a maior longevidade observada nestes animais. Os fatores como a
79
nutrição com dietas balanceadas, as vacinações prevenindo mais precocemente
as doenças infectocontagiosas, os precisos métodos de diagnóstico e também os
protocolos terapêuticos cada vez mais específicos e eficazes, contribuem para a
maior longevidade dos cães (WITHROW & MacEWEN, 1996; MORRISON, 1998).
A obesidade esteve presente em 55% dos animais, dentre os quais
prevaleceu também a alimentação mista, com comida caseira e industrial (80%).
Sabe-se que a obesidade é mais comum no sexo feminino, e que as fêmeas
castradas apresentam risco duas vezes maior de desenvolvê-la. Em decorrência
da menor concentração de hormônios androgênicos, as fêmeas têm menor taxa
metabólica basal que os machos; uma vez castradas, a ausência de todos os
hormônios sexuais favorece o balanço energético positivo. Além disso, a presença
de estrógenos suprime o apetite em várias espécies e raças de animais, como foi
demonstrado em cadelas Beagle (JERICÓ & SCHEFFER, 2002).
Estudos também apontam maior predisposição à obesidade em alguns
subgrupos, como aqueles constituídos por animais adultos e pertencentes a raças
como Labrador, Cairn terrier, Cocker spaniel, Dachshund, Pastores de Sheetland
e Beagles (BORGES & NUNES, 1998). Curiosamente, também são considerados
mais predispostos à obesidade aqueles animais cujos proprietários são obesos
e/ou idosos, e freqüentemente lhes oferecem petiscos ou guloseimas (JERICÓ &
SCHEFFER, 2002).
O perfil etário dos animais do presente trabalho evidenciou cadelas SRD
obesas entre 3 e 15 anos de idade. Jericó e Scheffer (2002) relatam que a partir
da idade de dois anos a obesidade torna-se mais freqüente atingindo sua
prevalência máxima na faixa etária compreendida entre 5 e 8 anos de idade,
declinando suavemente até os 12 anos; a partir daí, decresce abruptamente.
Em cães foi demonstrado que animais magros possuem menor incidência
de câncer que os obesos, desse modo fatores nutricionais podem estar envolvidos
no desenvolvimento do tumor de mama (MacEWEN & WITHROW, 1996).
Cadelas obesas, no primeiro ano de vida, apresentam risco maior de
desenvolvimento de tumores no decorrer da vida (SORENMO, 1998).
80
Fatores como obesidade, o qual pode influenciar no processo de iniciação
da carcinogênese mamária, também poderia influenciar no prognóstico, mesmo
porque, as mulheres na categoria das não obesas, na maioria dos estudos,
apresentaram maior tempo de sobrevida (BIRKIMER, 1988; SENIE et al., 1992;
WOLFSHEIMER, 2000).
De acordo com Mathé (2000), obesidade afeta a expressão dos receptores
de progesterona e pode agravar o “curso” do câncer de mama. O risco relativo de
câncer mamário está diretamente associado com o aumento do consumo de
gordura. Estudos com animais têm mostrado que o aumento da ingestão de
gordura, durante o estágio de iniciação e promoção tumoral, pode aumentar o
desenvolvimento de neoplasias mamárias (VORHERR, 1987; RAY et al., 2001;
YOO et al., 2001).
Dietas inadequadas têm como conseqüência além do depósito de gordura
no tecido subcutâneo, o aumento na conversão dos andrógenos em estrógenos.
As dietas hipercalóricas e/ou hipergordurosas promoveriam o crescimento de
bactérias capazes de converter colesterol em estrógenos no intestino grosso
(PINOTTI & TEIXEIRA, 2000). Uma dieta rica em gorduras, pobre em fibras e em
vitaminas pode ser considerada como fator de aumento do risco do câncer de
mama (BIRKIMER, 1988). O que pode ter ocorrido no grupo dos animais
estudados, em que 80 % dos animais eram alimentados com dietas caseiras e
talvez desbalanceadas.
Quanto aos hábitos alimentares, alguns autores identificaram diferenças
entre a dieta de animais obesos e a dieta de animais não obesos. Os resultados
do presente trabalho apontam predomínio (55%) de obesidade em cães que
ingeriam ração industrial associada à comida caseira. A adição de outros
alimentos a uma dieta previamente balanceada, como é a ração comercial
(industrial), pode aumentar a densidade calórica do alimento. Por vezes, a
administração de petiscos ou de substitutos alimentares como forma de interação
social e efetiva entre o proprietário e o cão pode levar ao consumo excessivo de
nutrientes, de forma a exceder as necessidades energéticas do animal (JERICÓ &
SCHEFFER, 2002; STREIFF et al., 2002).
81
Nos estágios terminais da doença neoplásica, os animais desenvolvem
anorexia, perda de peso e se tornam letárgicos. No entanto, nem toda perda de
peso nos pacientes com câncer se deve à anorexia, sendo parte da perda
associada a fatores humorais, sendo o principal deles o fator de necrose tumoral
(TNF) secretado pelas células tumorais ou pelos macrófagos (indiretamente
afetados pela neoplasia) (TRACEY & CERAMY, 1993; WOLFSHEIMER, 2000).
Neste estudo, 75% dos animais eram multíparas, com pseudogestação em
40% do total de casos.
Para a espécie canina há controvérsias se o número de filhotes teria efeito
protetor ou não na incidência de neoplasias mamárias (MOULTON et al., 1970).
Vários autores observaram que cadelas nulíparas, ou com ninhadas pequenas
têm maior chance de desenvolverem neoplasias da glândula mamária. Alguns
autores acreditam que tumores mamários são mais comuns em cadelas nulíparas
(STRANDBERG & GOODMAN, 1974). Kohli et al. (1998) também relatam a alta
incidência de neoplasia mamária em cadelas nulíparas e em animais que tiveram
menor número de crias se comparados com cadelas que tiveram muitas crias. No
entanto para Morrison (1998) número de filhotes, pseudogestação, ciclo estral
anormal não são fatores significantes para tumorigênese mamária.
A relação entre neoplasia mamária e pseudogestação também gera
controvérsias. A pseudogestação é um fenômeno normal do ciclo estral canino,
mas em algumas cadelas pode estimular ao aparecimento de sintomas clínicos
como secreção excessiva de leite e alterações comportamentais. Durante o
metaestro normal, progestágenos causam crescimento alveolar e secreção láctea,
junto com a proliferação das células mioepiteliais. No entanto, cadelas com
manifestações extremas de pseudogestação deverão também apresentar
respostas exacerbadas à progesterona, ou menos provável, altos níveis de
progesterona sérica. Vallance e Capel-Edwards (1971) foram capazes de induzir o
crescimento de nódulos mamários administrando altas doses de progesterona.
Assim como vários pesquisadores encontraram associação entre pseudogestação
e de neoplasia mamária, outros tantos não encontraram efeito significante da
pseudogestação na incidência destas. Considera-se também, que o leite retido
82
cronicamente pode conter compostos químicos que têm efeito carcinogênico sobre
o epitélio adjacente. Esses agentes podem atuar como indutores e/ou promotores
de neoplasia mamária (ZUCCARI et al., 2001). Portanto, neste aspecto,
necessitam-se de mais estudos para se estabelecer com precisão o envolvimento
da pseudogestação na carcinogênese mamária (ELSE & HANNANT, 1979; MOL
et al., 1996).
Neste estudo, as lesões foram mais freqüentes nas mamas inguinais (70%).
A maior incidência de lesões (benignas ou malignas) ocorre nos últimos
pares sendo 60% destas nas mamas inguinais, como observado. Essa distribuição
anatômica pode ser atribuída ao maior volume dessas mamas, visto que há uma
relação entre o tamanho glandular e a incidência de tumor (MOULTON, 1990;
ZUCCARI et al., 2001).
Prevaleceu a multicentricidade (83%) neoplásica com distribuição bilateral
(60%), sendo que 38% deles foram menores que 2 cm de diâmetro, e 75%
apresentaram aspecto não ulcerado à avaliação macroscópica.
De forma semelhante aos demais mamíferos, a mama da cadela é um
órgão par e, como o câncer deste órgão é frequentemente um processo multifocal,
não é incomum nestas espécies o desenvolvimento independente de câncer entre
as mamas (DONEGAN, 1988). O múltiplo envolvimento das mamas com tumores
ocorre em 50% dos casos e sua presença não parece alterar o prognóstico nos
cães (MOULTON, 1990; STONE, 1998).
Câncer de mama bilateral pode ser resultado tanto de metástases ou do
desenvolvimento de um segundo carcinoma primário. Nenhum dos critérios
disponíveis é válido para fazer esta distinção. No entanto, de acordo com estes
critérios, duas ou mais neoplasias malignas podem coexistir de forma primária
independente apenas quando: (1) cada uma apresentar característica histológica
própria, (2) os tumores forem separados e localizados em órgãos diferentes, e (3)
cada um produzir suas próprias metástases. Muitos outros critérios foram usados
por outros autores, mas nenhum é completamente/totalmente aplicável para o
problema do câncer mamário bilateral. A decisão deve ser feita na preponderância
das evidências (LEIS & URBAN, 1978).
83
Em nosso estudo, se a neoplasia foi encontrada no interior do parênquima
de uma segunda mama no momento do, ou a qualquer momento subsequente ao
exame clínico, e avaliações laboratoriais não revelarem evidências de
disseminação, a segunda lesão foi considerada como um câncer primário
independente. Devido à variabilidade do crescimento neoplásico e o potencial da
existência pré-clínica prolongada, algumas vezes não é possível ter certeza
quando e por quanto tempo dois tipos de neoplasia coexistem (DONEGAN &
SPRATT, 1988).
Sem dúvida, o sinal clínico mais comum do câncer mamário é uma massa
presente na mama (DONEGAN, 1988; MISDORP et al., 1999). Neste estudo todas
as neoplasias diagnosticadas foram de lesões palpáveis, o que certamente
facilitou a realização do exame clínico.
O tamanho do tumor tem mostrado associação estatisticamente significativa
com a sobrevida total dos animais. Muitos autores obtiveram os mesmos
resultados quer em tumores mamários canino (MISDORP & HART, 1976;
PARODI, 1983; YAMAGAMI et al., 1996; PÉREZ ALENZA et al., 1997) como em
tumores mamários humanos (CHU et al., 1998; JACQUEMIER et al., 1998; KATO
et al., 1999).
Apesar de Moulton (1990) e Kohli et al. (1998) afirmarem que a grande
maioria dos tumores complexos mamários atingem dimensões menores que cinco
centímetros, sendo muitos, menores de 1 cm de diâmetro, Shull e Maddux (1999)
afirmam que estes tumores complexos podem evoluir para grandes dimensões e
vêm à ulcerar, mas apresentam baixa expectativa de invasão ou metástase, o
mesmo afirma Mesa (1988) que estes tendem a ser grandes (4,7 cm). Kohli et al.
(1998) relatam que o potencial de malignidade do tumor complexo é
provavelmente baixo.
Corroborando com estes achados, verificamos que dentre os tumores
complexos 75% apresentaram grau de malignidade I, ou seja, tumores bem
diferenciados. Chama a atenção que nenhum, entre os tumores complexos, se
enquadraram no grau III, ou seja anaplásicos. Já para o carcinoma simples,
notamos que ocorreram 68% de grau I, 29% de grau II e 4% de grau III. Grande
84
parte dos tumores simples, foram do tipo túbulo-papilar, que se trata do menos
maligno dos carcinomas simples. justificando o maior número de tumores grau I.
Vários estudos indicam uma relação clara entre o tamanho do tumor e a
sobrevida do paciente, mesmo sem o comprometimento de linfonodos regionais. A
incidência de recidiva também está relacionada ao tamanho tumoral. Pacientes
com tumores maiores apresentam prognóstico significantemente desfavorável,
estando também associados a uma maior incidência de comprometimento nodal.
Neste estudo os animais que apresentaram envolvimento de linfonodo (n=11)
continham tumores maiores que três centímetros (82%), sendo a maioria nos
tumores com mais de seis centímetros de diâmetro (55%).
O tamanho tumoral, junto a outros fatores, particularmente o status dos
linfonodos regionais, pode definir um amplo espectro prognóstico para a
orientação sobre o uso de terapia adjuvante (COUTO & NELSON, 1994; STYLO &
WOOD, 1996; YAMAGAMI et al., 1996; FRANCO, 1997; MORRISON, 1998).
Dentre os marcadores moleculares de proliferaçao celular (PCNA), os
estudos não apresentaram correlação significativa com o tamanho tumoral
(TAHAN et al., 1993; HORIKUCHI et al., 1998), o mesmo foi observado no
presente trabalho. No entanto, em alguns trabalhos citados na literatura mostram
que maiores índices apoptóticos foram significativamente correlacionadas com o
tamanho do tumor (VILLAR et al., 2001). Não foi encontrado diferença significativa
entre o tamanho tumoral e o índice apoptótico no presente trabalho.
Apenas três casos (8%) foram diagnosticados como carcinoma inflamatório,
sendo um deles do tipo complexo. Vale a pena ressaltar que esta é uma afecção
extremamente agressiva de caráter clínico-patológico com manifestações
cutâneas de hiperemia e edemaciação difusa entre as mamas e que geralmente
não apresentam massa dominante (DODD & LAYFIELD, 1996; SILVERMAN,
1996). Os sinais clínico-patológicos característico podem iniciar o processo
(carcinoma inflamatório primário) ou pode aparecer depois, no decorrer do seu
curso (carcinoma inflamatório secundário), sendo este último menos frequente. Os
dois tipos carregam o prognóstico grave (DONEGAN, 1988).
85
Natural que haja diferença estatística entre a presença de ulceração
(P<0,0001) tumoral e envolvimento de linfonodos (P<0,0001) entre os estágios da
doença, uma vez que são critérios classificatórios para o estadiamento clínico III e
IV.
A ulceração cutânea ocorre com relativa frequência nos tumores mamários
caninos (PEREZ-ALENZA, 1994). Nos nossos dados e de acordo com Zárate
(1996), constatamos que a ulceração cutânea não foi exclusiva do grupo dos
carcinoma simples, estando associada significativamente com a malignidade.
Ulcerações têm efeito negativo significante no tempo de sobrevida das
cadelas com diagnóstico de tumores malignos (HELLMEN et al., 1993). No
presente estudo, 73% dos tumores apresentaram aspecto não ulcerado. No
entanto, quando considerado as lesões ulceradas, estas prevaleceram no estágio
III (80%) e nos carcinomas do tipo complexo (42%). O índice apoptótico, avaliado
pela imunomarcação para caspase-3 mostrou-se mais sensível em diferenciar
lesões com aspecto ulcerado, reforçando sua correlação com as variáveis clínico-
patológicas.
SCHONDORF et al. (2004) relatam que elevados índices de apoptose
indicam melhor prognóstico. Em contrapartida, inúmeros são os trabalhos que
correlacionam os elevados níveis de apoptose com fatores prognóstico
desfavoráveis (LIU et al., 2001; VILLAR et al., 2001; FERREIRA et al., 2003).
Neste trabalho foi possível observar diferença significativa entre os estágios clínico
com o índice apoptótico, apresentando maiores expressões nos estágios mais
avançados da doença. Então, as associações da caspase-3 com as variações de
estadiamento clínico da paciente e aspecto clínico tumoral (ulceração)
apresentaram diferença significativa, de comum acordo com os trabalhos que
correlacionam a apoptose com fatores desfavoráveis (VILLAR et al., 2001).
Neste trabalho, prevaleceu o carcinoma simples mamário (70%), sub-
classificados em cistoadenocarcinoma túbulo-papilífero (36%), carcinoma ductal
invasivo (21%), carcinoma sólido (18%), carcinoma tubulo-papilífero (14%) e 4%
para cada um dos tipos: tubular, anaplásico e adenoescamoso.
86
Apesar da maior freqüência dos carcinomas, 30% foi do tipo complexo.
Entretanto, na literatura pode-se encontrar uma disparidade de dados no que se
refere à prevalência dos tumores complexos. Talvez isto possa ser explicado, em
parte, pela dificuldade encontrada por alguns patologistas em proceder ao
diagnóstico diferencial entre as neoplasias da mama da cadela, possivelmente
devido a falta de uniformidade nos critérios de distinção entre os dois tipos de
lesões, sobretudo no caso de tumores do tipo complexo (PELETEIRO, 1994;
MOULTON, 1990; CASSALI, 2000).
Os tumores complexos são uma entidade tumoral mista bastante
controversa, tanto em patologia veterinária (NERURKAR et al., 1989;
PELETEIRO, 1994), quanto em patologia humana (SCHMITT, 1994; GOBBI et al.,
1993).
Tumor complexo com elementos heterólogos (tecido cartilaginoso ou
ósseo) tem sido descrito por apresentar um curso mais agressivo por alguns
autores (CATROPPO & LARA, 2001), mas não por todos (STRANDBERG &
GOODMAN, 1974; BAKER & LUMSDEN, 1999). Para Monlux et al. (1977) o
aparecimento de cartilagem, tecido osteóide e osso constituem o último estágio
relacionado a estas alterações teciduais, e ainda, enfatiza que a terminologia de
cartilagem e osso heterotópico são melhores empregadas nestas condições, por
serem alterações proliferativas e não neoplásicas. De forma semelhante, embora
apresentem evidências histo/morfológicas de malignidade têm comportamento
benigno (CASSALI, 2000). No entanto, estas evidências morfológicas malignas
nas células que compõem tais lesões muitas vezes são capazes de metastatizar.
Quando os tumores complexos apresentam metástases, estas podem ser
representadas por células epiteliais ou também por células pseudo-sarcomatosas,
podendo, em um lugar, aparecer metástase com células epiteliais e, em outro,
metástase com células pseudo-sarcomatosas (NERURKAR et al., 1989; ZEZZA
NETO, 1997). Por outro lado, também foi constatado que os animais com tumores
do tipo complexo apresentavam taxas de sobrevida superiores às dos animais
portadores de tumores com proliferação exclusiva de células epiteliais (HELLMÉN
et al., 1993; FOWLER et al., 1974; KATO et al., 1999). De fato, as células
87
mioepiteliais parecem ter um papel importante suprimindo a proliferação e a
invasão das células neoplásicas, apesar do mecanismo responsável permanecer
desconhecido (YAMAGAMI et al., 1996). Vários estudos indicam que os tumores
complexos são menos invasivos e que é o componente epitelial maligno destes
tumores, o responsável pela progressão local e sistêmica da doença (KURZMAN
& GILBERTSON, 1986; ALLEN & MAHAFFEY, 1989).
O termo carcinossarcoma (NERURKAR et al., 1989; ABURTO et al., 1997;
KOHLI et al., 1998), tumor misto maligno (STRANDBERG & GOODMAN, 1974;
BAKER & LUMSDEN, 1999; ZUCCARI et al., 2001; TATEYAMA et al., 2001),
tumor metaplásico (OBERMAN, 1987; SILVERMAN, 1996; GUPTA, 1999;
CASSALI, 2000; CATROPPO & LARA, 2001; BARTOW, 2002), carcinoma com
metaplasia pseudossarcomatosa (MESA, 1988), entre outros, são as terminologias
encontradas na literatura. Muitas vezes representam a mesma entidade
neoplásica, mas nem sempre são referidas como as mesmas (CATROPPO &
LARA, 2001), com comportamento biológico e implicações terapêuticas distintas
(SCHMITT, 1994; GOBBI et al., 1993). Essas confusões seriam evitadas com uma
classificação geral e possíveis subclassificações, mesmo porque, há evidências,
na literatura, que subtipos morfológicos de tumores complexos apresentam
prognósticos diferentes. Em veterinária não existem trabalhos que procurem
correlacionar elementos mais específicos destes tumores com o seu
comportamento clínico.
A necrose esteve presente em 33% dos tumores, principalmente nos
tumores do tipo simples (62%).
A presença de necrose, nos tecidos tumorais, denota grande velocidade de
crescimento das células neoplásicas, significando clinicamente tumores mais
anaplásicos e com maior capacidade de embolização e metastatização, desse
modo o prognóstico é pior associada à presença de necrose (SILVERMAN, 1991;
MacEWEN & WITHROW, 1996; FRANCO, 1997). Neste tipo de morte celular, a
ruptura celular libera no tecido vizinho o conteúdo celular, rico em proteases e
outras substâncias tóxicas. Além da toxicidade direta para as células vizinhas, o
88
derrame gera substâncias que atraem células do sistema imune, causando intensa
reação inflamatória, em especial neutrófilos e macrófagos (GOMPEL et al., 2001).
As pacientes com tumores apresentando áreas pseudosarcomatosas têm
prognóstico pior que aqueles com componente epitelial somente, devido ao
comportamento mais agressivo desta neoplasia (MESA, 1988). Dez animais
vieram a óbito ou pela solicitação de eutanásia pelo proprietário ou devido à morte
natural decorrente ao estágio avançado da doença. Destes animais, três eram
portadoras de tumores com componentes heterólogos, sugerindo desta forma seu
potencial maligno. Contribuem para esta alta mortalidade o avançado
estadiamento da doença no momento em que as mulheres e as cadelas são
submetidas ao primeiro tratamento. Em geral, 50% dos casos são diagnosticados
em estágios avançados, III e IV (FIGUEROA et al., 1993; BRASIL, 1998).
Em Medicina Veterinária é cada vez mais importante predizer o prognóstico
de um animal com doença oncológica. Desta forma podem iniciar-se novas
modalidades terapêuticas, se aconselhadas, ou não proceder a qualquer
tratamento, evitando assim custos desnecessários.
O prognóstico deve ser baseado em parâmetros que sejam indicadores
válidos. Os parâmetros mais fidedignos, classicamente aceite, são: o tamanho do
tumor; a invasão dos gânglios linfáticos regionais; o grau nuclear; o estádio clínico
e o índice mitótico (MOULTON,1990; MacEWEN & WITHROW, 1996; PÉREZ
ALENZA et al., 1997).
Estudo com animais evidenciaram que o índice mitótico e o grau histológico
apresentaram associação estatisticamente significativa com a sobrevida total. O
índice de proliferação é classicamente aceito como um bom indicador de
prognóstico (COLLAN & HAAPASALO, 1991), sendo vários os estudos em
Medicina Humana que comprovam estes resultados (KESHGEGIAN & CNAAN,
1995; JACQUEMIER et al., 1998; KATO et al., 1999).
Em relação ao grau histológico, os animais com tumores de elevado
pleomorfismo foram os que tiveram menor sobrevida total, o que está em
concordância com o observado em tumores mamários caninos por outros autores
(KURZMAN & GILBERTSON, 1986; PÉREZ ALENZA et al., 1997).
89
Não houve associação significativa do IP e IAPOP com relação as
pacientes linfonodo-positivo. Contudo, foi possível diagnosticar 11 animais
linfonodo positivo, sendo cinco no estágio III e seis casos no estágio IV. Existe
uma disparidade de resultados no que se refere ao valor de biomarcador
prognóstico do PCNA e caspase-3 para pacientes portadoras de câncer de mama
com envolvimento de linfonodo. Vale ressaltar que grande parte não apresenta
correlação positiva com o envolvimento de linfonodo como descrito por OKAMURA
et al. (1997); HORIKUCHI et al. (1998); VILLAR et al. (2001) e FERREIRA et al.
(2003).
O estádio clínico é um bom indicador prognóstico, por estar relacionado de
forma altamente significativa com a sobrevida total de acordo com estudos
realizados por MISDORP & HART (1976) e YAMAGAMI et al. (1996), em
Veterinária. Para o correto estadiamento clínico é necessário informação acerca
do grau de invasão dos gânglios linfáticos regionais. Os nossos dados reforçam a
tese de que nos animais, à semelhança do que acontece nos humanos, os
gânglios linfáticos regionais devem ser sempre removidos na mastectomia para
análise histológica, o que permite a detecção de metástases ou micrometástases
ganglionares.
O PCNA (clone PC10) é um dos marcadores de proliferação celular mais
usados para obter informação acerca da cinética celular (TAHAN et al., 1993;
SARLI et al., 1994; PREZIOSI et al., 1995; MARINHO et al., 1997). A sua utilidade
tem sido demonstrada em Medicina Humana (ISOLA et al., 1990; YANG et al.,
1996; CHU et al., 1998; KOCOVÁ et al., 1998; NIEWIADOMSKA et al., 1998;
HASEB et al., 1999; TYNNINEN et al., 1999) e em Medicina Veterinária (SARLI et
al., 1994; SARLI et al., 1995; PREZIOSI et al., 1995; PEÑA et al., 1998). O PCNA
tem uma semi-vida relativamente longa (20h), permanecendo nas células que
acabaram de abandonar o ciclo celular (YU & FILIPE, 1993; SARLI et al., 1994). O
PCNA também apresenta expressão em células não cíclicas, nas quais estejam a
decorrer fenômenos de reparação de DNA (COLTRERA & GROWN, 1991;
WILSON et al., 1992). Frente a isso, só foram contadas as células fortemente
positivas.
90
De acordo com algumas observações em Medicina Veterinária (PREZIOSI
et al., 1995; SARLI et al., 1995; LÖHR et al., 1997; PEÑA et al., 1998) e com
inúmeros estudos em Medicina Humana (ISOLA et al., 1990, HASEBE et al., 1999;
TYNNINEN et al., 1999), verificamos a presença de uma marcação intratumoral
fortemente heterogênea. A positividade nas áreas cartilaginosas foi menos
frequente e intensa, portanto atenção maior foi dada nas neoformações epiteliais
nestes casos.
Apesar de não haver diferença significativa do IP e graduação histológica,
foi possível observar maiores expressões nos graus menos diferenciados, o que
está de acordo com a literatura (HORIKUCHI et al., 1998).
De fato, muitas neoplasias afetam com mais freqüência animais de
determinada idade, raça e sexo, sendo que estas informações auxiliam no
diagnóstico. Neste estudo, os dados clínicos-epidemiológicos correspondem aos
atualmente encontrados na literatura, sendo fêmeas, SRD, portadoras de câncer
de mama e em relativa frequência em estágios avançados, os quais provaram ser
os mais agressivos, determinados pela graduação histológica e por marcadores
celulares de proliferação e apoptose, como relatado por GILBERTSON et al.
(1998).
A amostragem da lesão foi eficaz no dignóstico histopatológico e
imunoistoquímico. No entanto, notou-se necessidade de amostragem mais
representativa dos diversos subtipos de carcinomas e graus de malignidade para
melhor análise associativa desse critério com os demais estudados
(histopatológico e imunoistoquímico).
Deste estudo emergem como potenciais fatores de prognóstico não apenas
as características clínico-patológicas clássicas (tamanho do tumor, ulceração
cutânea, invasão ganglionar, estádio clínico) como também fatores de natureza
molecular (índice proliferativo medido pelo PCNA e índice de apoptose pela
caspase-3) que poderão revelar uma ajuda imprescindível na avaliação do
prognóstico de um animal com câncer de mama.
91
CONCLUSÕES
A análise dos resultados obtidos, nas condições em que foi realizado o
experimento, permite as seguintes conclusões:
- São cadelas com idade superior a seis anos e não castradas portadoras de
câncer de mama;
- Foi possível associar os índices de proliferação e apoptose, avaliados pela
técnica de imunoistoquímica, aos tipos histológicos e estágios das
neoplasias mamárias em cadelas SRD;
- A imunomarcação de células em apoptose mostrou correlação com
alterações clínico-patológicas: estágio clínico e ulceração;
- Apesar da não diferença significativa, a associação do índice de
proliferação variou de acordo com o tipo e graduação histológica do tumor
de mama.
92
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Universidade Estadual Paulista.
118
ANEXOS
Anexo 1 - Protocolo
RG: Data: N
o
:
Espécie: Raça: Sexo: Idade:
Avaliação Clínica
Ciclo Estral: 1- Regular 2- Irregular 3- Não apresenta
N
o
de crias: 1- Nenhum 2- Um 3- Dois-Três 4- Mais
Pseudogestação: 1- Sim 2- Não
Aborto: 1- Sim 2- Não
Alterações Uterinas (secreções)/Quando? 1- Sim (Data: ) 2- Não
Já cruzou e não ficou prenha? 1- Sim 2- Não
Hormônios: 1- Contraceptivos 2- Abortivos 3- Não
(Tipo: ) (Data: ) (Quantas vezes: )
Desenvolvimento da lesão: Quando?
Lesão tumoral prévia: 1- Sim 2- Não 3- Localização Cirurgia: 1- Sim 2- Não
Tipo de amostra: 1- Biópsia 2- Tumorectomia 3- Mastectomia 4- Outros
Tamanho:
Localização: M1 M2 M3 M4 M5
Consistência: 1- Firme 2- Macia 3- Elástica
Invasão: 1- Sem aderência 2- Aderido na pele 3- Aderido em
musculatura
Mamilo: 1- Sem alteração 2- Ulceração 3- Retração 4-
Eczema
Secreção: 1- Sim 2- Não
Ulceração: 1- Sim 2- Não
Envolvimento de linfonodos: 1- Axilar 2- Inguinal 3- Sem alteração
Características do material: 1- Lesão sólida 2- Lesão Cística 3- Infiltrativa
Avaliação Histopatológica
Carcinoma “in situ”: 1- Sim 2- Não
Envolvimento mioepitelial: 1- Simples 2- Complexo
Invasivo: 1- Carcinoma papilífero 2- Carcinoma tubular 3- Carcinoma sólido
4- Carcinoma anaplásico 5- Carcinoma fusiforme 6- Outros: ___________
119
Anexo A - Características clínico-antropométricas das cadelas no estágio I
portadora de câncer mamário.
Animal Idade Porte Classificação
corporal
Peso kg
1
3,10
Pequeno
Ideal 3,2
2
10,4
Médio
Obeso 10,2
3
8
Grande
Ideal 22,9
4
8
Grande
Obeso 29,2
5
7
Médio
Obeso 16
6
11
Médio
Obeso 6,4
7
15
Pequeno
Ideal 2,0
8
11
Grande
Acima do peso 23,0
9
7
Grande
Ideal 30
10
8
Grande
Obeso 40,5
Anexo B - Características reprodutivas das cadelas no estágio I portadora de
câncer mamário.
Animal
Crias
Castrada
Cios
regulares
Pseudo
gestação
Contraceptivo
Secreção
vaginal
Aborto
1
+* - + + - - -
2
-* - + + - - -
3
+ - + + - - -
4
+ - + + - - -
5
+ - + + - - -
6
+ - + - - - -
7
+ - + - - + -
8
+ - + - - - -
9
+ + + - - - -
10
- - + + - - -
+*- Positivo
- *- Negativo
120
Anexo C - Classificação das cadelas no estágio I conforme a distribuição e
localização da neoplasia mamária.
Mama direita Mama esquerda
Animal 1
O
2
O
3
O
4
O
5
O
1
O
2
O
3
O
4
O
5
O
1
+*
2
+ +
3
+ + +
4
+ + + +
5
+ +
6
+ + + + +
7
+ + +
8
+ +
9
+ +
10
+
+ +
+*- Positivo
Anexo D - Diagnóstico histopatológico e grau de malignidade das cadelas no
estágio I da doença.
Animal
Carcinoma
Simples
Carcinoma
complexo
Grau de
malignidade
1
-* + I
2
+* - I
3
+ - I
4
+ - I
5
+ - I
6
- + I
7
+ - I
8
- + I
9
+ - I
10
+ - I
+*- Positivo
-*- Negativo
121
Anexo E - Características clínico-antropométricas das cadelas no estágio II
portadora de câncer mamário.
Animal Idade
Porte Classificação
corporal
Peso
kg
11
13,4 Grande Obeso 33,2
12
7,1 Grande Obeso 20,9
13
10,5 Grande Obeso 21
14
6 Médio Obeso 10,5
15
8 Pequeno Obeso 2,8
16
11 Grande Ideal 20,0
17
10 Médio Obeso 10,7
18
7 Médio Acima do peso 13,0
19
8 Médio Obeso 13
20
11 Grande Obeso 22
Anexo F - Características reprodutivas das cadelas no estágio II portadora de
câncer mamário.
Animal
Crias
Castrada
Cios
regulares
Pseudo
gestação
Contraceptivo
Secreção
vaginal
Aborto
11
+* -* + - - - -
12
+ + + + + + -
13
+ - + - + - +
14
+ -
-
- + - -
15
- - + + - - -
16
- - + - + - -
17
+ + + - - - -
18
+ - + - - - -
19
+ - + - - + +
20
- - + - - - -
+*- Positivo
-*- Negativo
122
Anexo G - Classificação das cadelas no estágio II conforme a distribuição e
localização da neoplasia mamária.
Mama direita Mama esquerda
Animal 1
O
2
O
3
O
4
O
5
O
1
O
2
O
3
O
4
O
5
O
11
+*
+ + + +
12
+
13
+
14
+ + + + +
15
+ + +
16
+ +
17
+
18
+
19
+ + +
20
+ +
+*- Positivo
Anexo H - Diagnóstico histopatológico e grau de malignidade das cadelas no
estágio II da doença.
Animal
Carcinoma
Simples
Carcinoma
complexo
Grau de
malignidade
11
+* -*
I
12
+ -
I
13
- +
I
14
- +
I
15
- +
I
16
+ -
I
17
+ -
I
18
+ - II
19
+ -
I
20 + -
I
+*- Positivo
-*- Negativo
123
Anexo I - Características clínico-antropométricas das cadelas no estágio III
portadora de câncer mamário.
Animal Idade
Porte Classificação
corporal
Peso
Kg
21
13 Médio Obeso 12,2
22
11 Grande Acima do peso
18,5
23
11 Grande Ideal 21,7
24
14 Médio Acima do peso
12
25
13 Grande Obeso 31,2
26
10 Médio Ideal 8,0
27
15 Médio Obeso 13,0
28
5 Médio Obeso 10
29
11,6 Médio Obeso 11,7
30 8 Médio Acima do peso
7
Anexo J - Características reprodutivas das cadelas no estágio III portadora de
câncer mamário.
Animal
Crias
Castrada
Cios
Regulares
Pseudo
Gestação
Contraceptivo
Secreção
vaginal
Aborto
21
+* -* + + - + -
22
+ - + - + - +
23
+ - + - - - -
24
+ -
+
- + - -
25
+ - + - - + +
26
+ - + + - - -
27
- - + - - - -
28
- - + + - - -
29
- + + - - + -
30
- - + + - - -
+*- Positivo
-*- Negativo
124
Anexo K - Classificação das cadelas no estágio III conforme a distribuição e
localização da neoplasia mamária.
Mama direita Mama esquerda
Animal 1
O
2
O
3
O
4
O
5
O
1
O
2
O
3
O
4
O
5
O
21
+ +* +
22
+ + +
23
+ + +
24
+ + +
25
+ + + + + +
26
+ +
27
+
28
+ + + + + +
29
+ + + + + +
30
+ +
+ +
+*- Positivo
Anexo L - Diagnóstico histopatológico e grau de malignidade das cadelas no
estágio III da doença.
Animal
Carcinoma
Simples
Carcinoma
complexo
Grau de
malignidade
21
+* -* II
22
+ -
I
23
+ -
I
24
- +
I
25
+ -
I
26
- +
I
27
+ -
I
28
+ -
I
29
- +
I
30 + -
I
+*- Positivo
-*- Negativo
125
Anexo M - Características clínico-antropométricas das cadelas no estágio IV
portadora de câncer mamário.
Animal Idade Porte
Classificação
corporal
Peso
kg
31
8 Médio Obeso 9,2
32
8 Pequeno Ideal 6,2
33
3 Médio Ideal 7,0
34
9,2 Grande Ideal 19,0
35
9,11 Grande Ideal 17,8
36
6 Grande Ideal 19,0
37
12 Grande Obeso 26
38
12 Médio Obeso 9,3
39
7 Médio Ideal 8,3
40
9 Grande Obeso 25
Anexo N - Características reprodutivas das cadelas no estágio IV portadora de
câncer mamário.
Animal
Crias
Castrada
Cios
Regulares
Pseudo
Gestação
Contraceptivo
Secreção
vaginal
Aborto
31
-* - - - +* + -
32
+ - + + - - -
33
+ - + - - - -
34
+ -
+
- - - -
35
+ - + + - - -
36
+ - + - + - -
37
+ - + + - - -
38
+ - - + - - -
39
+ - + - - - -
40
+ - + - - - -
+*- Positivo
-*- Negativo
126
Anexo O - Classificação das cadelas no estágio IV conforme a distribuição e
localização da neoplasia mamária.
Mama direita Mama esquerda
Animal
1
O
2
O
3
O
4
O
5
O
1
O
2
O
3
O
4
O
5
O
31
+ +
32
+ + +
33
+ + + + + + + + + +
34
+ + +
35
+ + + + +
36
+ + + + +
37
+ + + +
38
+ + + + +
39
+
40
+ + +
+ +
+*- Positivo
Anexo P - Diagnóstico histopatológico e grau de malignidade das cadelas no
estágio IV da doença.
Animal
Carcinoma
Simples
Carcinoma
complexo
Grau de
malignidade
31
+* -* II
32
+ - II
33
+ - III
34
+ - II
35
- + II
36
+ - II
37
- + II
38
+ - II
39
+ - II
40
+ - II
+*- Positivo
-*- Negativo
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