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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS DE ARARAQUARA
CONTRIBUIÇÃO AO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA
CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA E LEVANTAMENTO DA
PREVALÊNCIA DE OOCISTOS DE Cryptosporidium spp NAS
FEZES E EM SECREÇÃO BRÔNQUICA DE PACIENTES HIV
POSITIVOS.
ISABEL MARTINEZ
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
ANÁLISES CLÍNICAS, ÁREA DE CONCENTRAÇÃO:
PARASITOLOGIA
ORIENTADOR
:
Prof. Dr. Francisco Miguel Belda Neto
ARARAQUARA
1999
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Ficha Catalográfica
Elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP-Campus de Araraquara
Martinez, Isabel
M385 Contribuição ao diagnóstico laboratorial da criptosporidiose humana
e levantamento da prevalência de oocistos de Cryptosporidium spp nas
fezes e em secreção brônquica de pacientes HIV positivos / Isabel
Martinez. – Araraquara, 1999. .
80 p.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. Faculdade
De Ciências Farmacêuticas. Departamento de Análises Clínicas.
Orientador: Belda Neto, Francisco Miguel.
1. AIDS. 2. Cryptosporidium spp - Diarréia 3. Cryptosporidium spp -
Diagnóstico. I. Martinez, Isabel. II. Belda Neto, Francisco Miguel,
Orientador. III. Título.
CDD: 616.9
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COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Francisco Miguel Belda Neto
Prof. Dr. João Aristeu da Rosa
Prof. Dr. Sergio Albuquerque
Prof. Dr
a
Vera Lucy De Santi Alvarenga
Prof. Dr. Arício Xavier Linhares
Araraquara, 17 de dezembro de 1999.
Ao Yuri,
meu filho.
i
Para meus pais, Pedro e Josephina
Devo a vocês tudo que sou.
Obrigada é muito pouco.
ii
À minha amiga, Zenaide
que sempre me incentivou.
iii
i
Ao Prof. Dr. Francisco Miguel Belda Neto,
meu orientador, pelo incentivo, apoio e
confiança na condução desse trabalho.
iv
i
AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho se deve a todos que direta ou
indiretamente contribuíram para a sua elaboração.
À Profa. Dra. Arlete Scrassolo Martini pela amizade e preciosa ajuda
na confecção final do trabalho.
À Auxiliar Acadêmica Maria Zenaide Tita Fernandes pelo apoio e
colaboração.
À Auxiliar de Laboratório, Joselma Gomes Duque Ferreira, pela
colaboração.
Ao Prof. Dr. João Aristeu da Rosa, pelo incentivo e apoio.
Ao Prof. Dr. João Flávio Giazzi pelo incentivo e colaboração.
Ao Prof. Dr. Arnaldo Buainain pelo apoio, incentivo e colaboração.
Ao Dr. Oswaldo Luiz Luz Lima, responsável pela Vigilância
Epidemiológica e Programa DST/AIDS do SESA, pelo apoio e colaboração
À Dra. Volia de Carvalho Almeida, Infectologista do SESA, pelo
apoio e colaboração.
À Enfermeira, Angela Aparecida Costa, funcionária do SESA, pela
colaboração.
À Enfermeira, Marisa Marques Monteiro, funcionária do SESA, pela
inestimável ajuda no fornecimento de dados para a realização do trabalho.
Às Auxiliares de Enfermagem, Isabel Cristina Figueiredo, Palmira de
Fátima Temponi e Maria Helena Pierre, pela valiosa ajuda na
intermediação com os pacientes do Programa DST/AIDS do SESA.
Às Técnicas de Enfermagem, Neusa Eli Figueiredo, Réa Sylvia Tidei
Amaral, Silvana Lupateli e Sonia Maria dos Santos Somenzari, pelo apoio
e prestimosa ajuda no contato com os pacientes do Programa DST/AIDS do
SESA.
v
i
Às tecnicas de laboratório, Celina Saletti Deróbio e Célia
Martins e à farmacêutica Maisa de Fátima Hortenci Coronado, do SESA,
pelo apoio e colaboração.
Ao Dr. Marcos Abdo Arbex, pela amizade e pela ajuda no contato
com o SESA.
Às funcionárias, Maria Irani Coito, Laura Odette Dorta Jardim,
Queila Simone Baraldo Leme e Ana Lúcia Minale Barbosa da Silva, pelo
auxílio na realização do levantamento bibliográfico, obtenção das separatas
e correção das bibliografias.
Ao Sr. Francisco Carlos Rocatelli, pela ajuda na elaboração das
fotografias.
Às funcionárias da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas – UNESP, Sonia Ornellas Silva, Claudia Lúcia
Molina e Laura Rosim, pela colaboração.
Ao meu irmão, Alexandre Martinez, pela amizade, carinho e
colaboração no ajuste final do trabalho.
A todos,
muito obrigada.
vi
i
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUCÃO ...............................................................................................
1
1.1. Cryptosporidium e Cripidtosporidiose .....................................................
.
1
1.2. Recursos diagnósticos ...............................................................................
7
2. OBJETIVOS .....................................................................................................
10
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................
11
3.1.Grupos de estudo
.......................................................................................
11
3.1.1.Grupo A .................................................................................................
11
3.1.2.Grupo B .................................................................................................
12
3.2.Entrevista ...................................................................................................
12
3.3.Coleta do material .....................................................................................
13
3.4.Procedimento laboratorial .......................................................................
13
3.5.Modificacões técnicas ...............................................................................
15
3.6.Procedimento para preparo das lâminas e técnicas específicas
para identificação de oocistos de Cryptosporidium spp nas fezes ......... 16
3.6.1.Método de coloração pela auramina ......................................................
18
3.6.2.Método de coloração pelo Kinyoun modificado com
alteração no procedimento............................
18
3.7.Procedimento para preparo das lâminas e técnicas específicas
para identificação de oocistos de Cryptosporidium spp
em secreção brônquica .............................................................................
19
3.8.Reagentes e soluções empregadas ........................................................... 20
3.8.1.Solução salina tamponada – PBS .....................................................
20
3.8.2.Solução de formaldeído a 10% tamponada ...........................................
20
3.8.3.Solução corante de auramina ................................................................
20
vii
i
3.8.4.Solução álcool-ácido clorídrico ..............................................................
21
3.8.5.Solução ácool-ácido sulfúrico ................................................................
21
3.8.6.Solução de permanganato de potássio ...................................................
21
3.8.7.Solução de fucsina carbólica de Kinyoun .............................................
22
3.8.8.Solução aquosa de azul de metileno ......................................................
22
3.8.9.Solução de hidróxido de sódio a 3%......................................................
22
3.8.10. Solução de N-acetil-L-cisteína ...........................................................
22
4. RESULTADOS ...............................................................................................
24
4.1.Resultados obtidos nas amostras fecais de pacientes
HIV positivos pertencentes ao grupo A ..................................................
24
4.2.Resultados obtidos nas amostras fecais de pacientes
HIV positivos pertencentes ao grupo B ...................................................
27
4.3.Resultados obtidos nas amostras de secreção brônquica
de pacientes HIV positivos pertencentes ao grupo B .............................
30
4.4.Resultados obtidos com a modificação efetuada na técnica
de coloração de Kinyoun .........................................................................
31
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................
35
5.1. Considerações sobre as modificações técnicas
47
6. CONCLUSÕES ..............................................................................................
49
7. RESUMO .........................................................................................................
8. SUMMARY .....................................................................................................
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................
10. ANEXOS.......................................................................................................
51
52
53
65
viii
i
Boa liderança consiste em motivar
As pessoas a darem o máximo de si próprias,
Oferecendo-lhes oportunidades.
É desta maneira que as coisas
acontecem naturalmente.
“A vida é uma
oportunidade
e não uma obrigação”
THE TAO OF LEADERSHIP – LAO TZU
ix
i
1. INTRODUÇÃO
1.1.
Criptosporidium
e Criptosporidiose
Criptosporidiose é o termo utilizado para indicação da infecção
causada pelo parasita, Cryptosporidium spp, que é encontrado parasitando
células epiteliais do trato gastrointestinal e respiratório de vertebrados e
está relacionado, principalmente, com doenças entéricas em humanos. Foi
descrito pelo parasitologista americano E. E. Tyzzer, em 1907, que
observou o coccídio na mucosa gástrica de ratos parasitados e
assintomáticos (JANOFF e RELLER,1987).
Cryptosporidium spp é um protozoário de pequenas dimensões,
4 - 6 µm, pertencente ao filo Apicomplexa (possui complexo apical), classe
Sporozoa (reprodução assexuada e sexuada com formação de oocistos),
subclasse Coccidia (ciclo de vida apresenta merogonia, gamogonia e
esporogonia), ordem Eucoccidiida (esquizogonia), subordem Eimeriina
(macrogameta e microgameta), família Cryptosporidiidae (esporocisto -
oocisto com 4 esporozoitas) (TZIPORI e GRIFFITHS, 1998), gênero
Cryptosporidium. Apesar de terem sido nomeadas 19 espécies de
Cryptosporidium, 4 espécies são consideradas válidas (LEVINE, 1984) e
somente 2 são encontradas infectando mamíferos: C. muris e C. parvum
(FAYER e UNGAR, 1986).
O gênero Cryptosporidium tem sido identificado em ampla
variedade de hospedeiros incluindo mamíferos, aves, peixes e répteis. A
espécie comumente relacionada ao encontro de parasitismo em mamíferos
é Cryptosporidium parvum.
Entretanto, considerando as dificuldades na identificação
específica por testes imunológicos e de biologia molecular e a efetiva
confirmação das espécies existentes até o presente, o termo
Cryptosporidium spp é o de preferência quando se trata de isolados obtidos
de humanos (LEVINE,1984; MEINHARDT et al. , 1996).
Classificação taxonômica de Cryptosporidium
Classificação
Nome
Características biológicas
Filo Apicomplexa Complexo apical com anéis polares, rotripias,
micronemas, conoides e microtúbulos
subpeliculares
Classe Sporozoa Locomoção por flexão do corpo, deslize ou
ondulação
Subclasse Coccidia Ciclo de vida com merogonia, gametogonia e
esporogonia
Ordem Eucoccidiida Merogonia presente, em vertebrados
Subordem Eimeriina Desenvolvimento independente de gameta
feminino e masculino
Família Cryptosporidiidae Monoxeno com desenvolvimento sob a
superfície da membrana celular do hospedeiro;
oocisto sem esporocisto com 4 esporozoitas;
microgametas sem flagelo
Gênero
Cryptosporidium
Parasitismo intracelular e extracitoplasmático
Espécies C. muris
C. parvum
Fonte: Adaptada de Fayer & Ungar, 1986; Tzipori, S., 1988; Tzipori & Griffiths, 1998 .
Slavin, em 1955, associou-o, pela primeira vez, como causa
principal de morbidade e mortalidade em perus com diarréia aguda
(FAYER e UNGAR, 1986; TZIPORI e GRIFFITHIS, 1998).
Em 1976 foram descritos os primeiros casos humanos associados
à exposição a animais de fazenda e, casos subsequentes, confirmaram a
classificação de criptosporidiose como uma zoonose (JANOFF e
RELLER, 1987).
Pequenos roedores são reservatórios desse parasita e potentes
fontes de infecção para os animais domésticos e para os humanos
(CHALMERS et al., 1997). Dados obtidos em área urbana periférica no
nordeste do Brasil revelaram que 10,2% de fezes de animais domésticos
eram positivas para oocistos de Cryptosporidium (MARTINS et al.,
1995).
As espécies de Cryptosporidium têm vida parasitária intracelular
e extracitoplasmática obrigatória, com um complexo ciclo biológico: os
oocistos ingeridos pelo hospedeiro liberam esporozoitas que penetram nas
células epiteliais das microvilosidades, se diferenciam e por meio de
processos de esquizogonia, gamogonia e esporogonia, dão origem a novos
oocistos contendo esporozoitos. O protozoário é monoxeno, necessitando
apenas um hospedeiro para o seu desenvolvimento e apresenta baixa
especificidade parasitária (eurixeno). Os oocistos não necessitam de
maturação adicional, sendo excretados na forma infectante, que é resistente
aos desinfetantes habituais, resultando em potencial mecanismo de
transmissão direta por via fecal-oral (FAYER e UNGAR, 1986). Vale
ressaltar ainda, que as doses infectantes para humanos são muitos baixas,
sendo necessários cerca de 10 a 100 oocistos, variando com a fonte de
infecção e a cepa do parasita (MEINHARDT et al.,1996).
Inicialmente foi considerado como emergente patógeno
oportunista ou zoonótico restrito a pessoas imunocomprometidas ou
àquelas que mantinham contato direto com animais; a partir de meados da
década de 80, Cryptosporidium passou a ser reconhecido como um
protozoário de patogenicidade emergente e potencial capacidade para a
produção de enterites em seres humanos (MEINHARDT et al., 1996).
Atualmente a criptosporidiose também está relacionada à
transmissão direta entre pessoas e por meio de água e alimentos
contaminados com oocistos de Cryptosporidium spp (MEINHARDT et al.,
1996).
A infecção humana tem sido descrita nos seis continentes, em
países desenvolvidos e não desenvolvidos e em áreas urbanas e rurais. Sua
prevalência é maior em regiões menos desenvolvidas e nos meses quentes e
úmidos. Atinge pessoas com idade variando de 3 dias a 95 anos. As
crianças são mais susceptíveis e a prevalência é maior em menores de 2
anos. Tanto os indivíduos do sexo masculino como do feminino são
igualmente susceptíveis (FAYER e UNGAR, 1986).
Têm maior risco de adquirir a infecção familiares e parceiros
sexuais de pacientes infectados, trabalhadores da área de saúde, usuários de
piscinas coletivas, funcionários de creches e pessoas que viajam para áreas
endêmicas (MEINHARDT et al., 1996).
A criptosporidiose assume especial importância em pessoas com
deficiência imunológica. A infecção por Cryptosporidium tem sido
relatada em pacientes sujeitos a alterações como hipogamaglobulinemia,
imunodeficiência congênita, imunossuprimidos devido a tratamentos de
câncer, transplantados, etc. Pacientes com deficiência imune reversível
geralmente se recuperam quando a causa da imunossupressão é removida.
Os sintomas clínicos característicos de criptosporidiose são
semelhantes para os pacientes imunocompetentes e os imunossuprimidos,
sendo que em imunossuprimidos esses sintomas se agravam podendo levar
à morte. Em pessoas imunocompetentes, a infecção provoca uma
enterocolite aguda e autolimitada, com cura espontânea entre 10 e 14 dias
(REY,1991). Esses pacientes são importantes na transmissão do coccídio.
A criptosporidiose aguda desenvolve um quadro diarreico
profuso, com a emissão de fezes líquidas, mal cheirosas e de aspecto claro
ou de coloração esverdeada. Clinicamente, ela está associada com
sintomas relacionados à dor abdominal, cólica, náusea, vômitos, dor-de-
cabeça, febre discreta, mialgia, indisposição, anorexia e perda de peso
acentuada. Em pacientes imunossuprimidos este quadro se estabelece
abruptamente e é geralmente persistente. O paciente evacua em média 6
vezes ao dia e suas fezes podem conter até cerca de 10
6
oocistos por grama
de fezes. A excreção de oocistos em tal magnitude pode trazer sérias
dificuldades pelo potencial de transmissão, devido ao fato da dose
infectante para humanos ser muito baixa (10 a 100 oocistos), como já foi
mencionado anteriormente (FAYER e UNGAR,1986; MEINHARDT et
al.,1996).
A infecção pode também envolver todo o trato respiratório,
provavelmente pela aspiração de oocistos durante o vômito (MEINHARDT
et al.,1996). A transmissão sexual por meio de práticas envolvendo contato
oral-anal pode ocorrer (ANASTASI & CAPILI, 1997).
O trato gastrointestinal é o maior alvo de alterações em
indivíduos com imunodeficiência determinada por HIV. A infecção por
Cryptosporidium spp causa em pacientes com AIDS mal absorção e injúria
intestinal proporcional à intensidade de infecção (GOODGAME et al.,
1995).
Cerca de 30 a 97% dos indivíduos infectados com o vírus da
imunodeficiência humana (HIV) podem apresentar quadro diarreico no
decorrer dessa infecção (WUHIB et al.,1994). Estudos no sentido de
avaliar a etiologia da diarréia têm sido levados a efeito em distintas partes
do mundo e indicam a importância da infecção pelo coccídio.
A infecção é observada nos Estados Unidos da América (EUA)
com índices variáveis entre 10 e 15% em pacientes com a síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS). Em países em desenvolvimento o
índice chega a atingir 50% dos pacientes (COLFORD et al.,1996).
A taxa média de prevalência de infecção por Cryptosporidium na
população geral na Ásia e África é de 4,9% e 10,4% respectivamente
(MEINHARDT et al., 1996).
Em um estudo na Espanha, CLAVEL et al., 1995, encontraram
15,54% de positividade em pacientes infectados pelo HIV e 2,13% em
imunocompetentes. Em Dakar (Senegal), Cryptosporidium spp foi
observado em 13,9% dos pacientes com HIV (DIENG, et al., 1994). Na
Malásia, a prevalência é alta, 23%, entre os HIV positivos usuários de
droga intravenosa (KAMEL et al., 1994). Na Itália, BRANDONISIO et al.,
1993, determinaram 33,3% de positividade em um grupo de pacientes HIV
positivos com diarréia e COTTE et al., 1993, em estudos realizados na
França, avaliaram em 37,3% o índice de infecção em pacientes de grupo
semelhante.
No Brasil, MOURA et al., 1989, determinaram 18,2% de
positividade em pacientes com AIDS no Rio de Janeiro. RODRIGUES et
al., 1991, observaram prevalência de 14,3% em aidéticos com síndrome
diarreica. GUIZELINI e AMATO NETO, 1992, encontraram em São
Paulo, 10,4% de amostras com Cryptosporidium spp, sendo essas relativas
a fezes diarreicas de pacientes com AIDS e de adultos e crianças
imunocompetentes. SAUDA et al., 1993, demonstraram a presença de
oocistos de Cryptosporidium spp nas fezes de 19,1% dos pacientes com
AIDS atendidos no Centro de Referência de AIDS em Santos, SP. Em
Campinas , GARLIPP et al.,1995 encontraram 19,6% de prevalência da
criptosporidiose entre pacientes soropositivos para HIV atendidos no
Hospital Universitário da UNICAMP.
Criptosporidiose com envolvimento pulmonar tem sido relatada
em pacientes com AIDS desde 1980 (CLAVEL et al., 1996). LOPEZ-
VELEZ et al., 1995, encontraram 16,28% dos pacientes com AIDS e
diarréia crônica apresentando além de criptosporidiose intestinal a
criptosporidiose pulmonar, com isolamento também de Cryptosporidium
do escarro desses pacientes.
1.2. Recursos diagnósticos
Os primeiros casos de criptosporidiose humana foram
diagnosticados mediante biópsias intestinais ou retais (MEISEL et al.,
1976; NIME et al., 1976).
Antes de 1978, o parasita era diagnosticado somente em cortes
histológicos de tecido e visto na superfície epitelial intestinal por
microscopia eletrônica ou pelas colorações com hematoxilina-eosina,
Giemsa, ácido periódico de Schiff ou azul de toluidina (JANOFF &
RELLER, 1987). Desde que POHLENZ e cols., 1978, descreveram o
encontro de formas (oocistos) de Cryptosporidium em material fecal de
bezerros jovens, o diagnóstico da parasitose tornou-se fundamentalmente
coprológico, ainda que apresente limitações.
Recentemente foram descritos métodos diagnósticos de detecção
de oocistos nas fezes por meio da pesquisa de coproantígenos com técnicas
de aglutinação em partículas de látex sensibilizadas com anticorpos anti-
Cryptosporidium (POHJOLA e cols., 1986), de imunofluorescência direta
(STERLING & ARROWOOD, 1986) e indireta e testes imunoenzimáticos
(ROBERT e cols., 1990). Da mesma forma, testes diagnósticos
imunosorológicos, imunofluorescência direta e indireta (IFA) e enzima
imunoensaio (EIA) têm se apresentado sensíveis e específicos (UNGAR e
cols., 1986; VILLACORTA, 1989). Alguns disponíveis comercialmente,
são métodos que requerem habilidade técnica e equipamento sofisticado o
que muitas vezes, impede seu uso na rotina em grande parte dos
laboratórios de análises (GRACZYK et al., 1996).
O laboratório de Parasitologia da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Araraquara – UNESP tem, há muito tempo, atendido a
Secretaria Municipal de Saúde, a Secretaria Municipal de Educação e
outras, realizando avaliação parasitológica das fezes de grupos de
pacientes, crianças de escolas municipais, além de outras comunidades
solicitantes e trabalhos de extensão universitária. Habitualmente, são
utilizadas técnicas de enriquecimento e pesquisas de rotina para o
diagnóstico das principais protozooses e helmintíases intestinais.
A criptosporidiose não é diagnosticada em nosso laboratório por
tratar-se de infecção usualmente pouco diagnosticada e devido ao fato de
requerer metodologia específica para a evidenciação e conseqüente
identificação do protozoário.
Considerando nosso interesse e também da Secretaria Municipal
de Saúde e do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (Programa
DST/AIDS) na implantação de técnica adequada para o diagnóstico da
criptosporidiose, propôs-se a realização deste estudo.
Levando-se em consideração os aspectos referentes a custo,
necessidade de pessoal habilitado e equipamentos, optou-se por descartar
as técnicas imunosorológicas e direcionou-se à pesquisa de metodologias
disponíveis para a demonstração dos oocistos do parasita presentes na
matéria fecal. Este enfoque é amplamente discutido nos trabalhos
disponíveis na literatura especializada, direcionando as observações para o
diagnóstico coprológico (POHLENZ et al., 1978; GARCIA et al., 1983;
LÓPEZ-BREA et al., 1985; GUIZELINI & AMATO NETO, 1992,
CLAVEL et al., 1995; GARLIPP et al., 1995).
Assim, por meio do estudo de trabalhos da literatura atualizada,
efetuou-se a avaliação das principais técnicas descritas e sua adaptabilidade
às nossas condições e disponibilidades laboratoriais. Ainda, considerou-se
oportuno complementar o estudo com a avaliação da prevalência de
infecção do coccídio em grupos de indivíduos HIV positivos
acompanhados no Programa DST/AIDS, da cidade de Araraquara.
2. OBJETIVOS
1. escolha e implantação de técnica diagnóstica rápida, de fácil
execução e de baixo custo;
2. avaliação da prevalência do coccídio em indivíduos HIV
positivos, que têm seguimento regular no Programa DST/AIDS no Serviço
Especial de Saúde de Araraquara, com ou sem sintomatologia e com
presença ou ausência de quadro diarreico;
3. verificação de envolvimento pulmonar por meio da análise do
escarro desses pacientes.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Segundo dados fornecidos pelo Serviço Especial de Saúde de
Araraquara (SESA), de 1987 a 1998 foram diagnosticados 1352 casos de
infecção por HIV, sendo que até março de 1999, 395 pacientes tinham
seguimento regular no Programa DST/AIDS do SESA.
3.1. Grupos de estudo
3.1.1 Grupo A: Constituído por 17 pacientes HIV positivos,
portadores ou não de quadro diarreico, regularmente acompanhados pelo
Programa DST/AIDS do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA).
Consultado o Centro de Processamento de Dados (CPD) do SESA para
coleta de dados, esses pacientes, conforme as diversas situações clínicas
determinadas pela infecção por HIV, foram classificados como
pertencentes ao Grupo II, pacientes assintomáticos e Grupo IV, pacientes
sintomáticos, segundo o Centro de Controle de Doenças dos Estados
Unidos (CDC ) (FARTHING et al, 1989).
Não foram tratados com medicamentos anti-retrovirais e não
foram submetidos aos testes da contagem de linfócitos T CD4 e/ou carga
viral.
3.1.2. Grupo B: Constituido por 37 pacientes HIV positivos,
portadores ou não de quadro diarreico, regularmente acompanhados no
Programa DST/AIDS do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA).
De acordo com o prontuário de cada paciente incluído no estudo e segundo
o Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC), como no
Grupo A, foram classificados como pertencentes ao Grupo II, pacientes
assintomáticos e Grupo IV, pacientes sintomáticos (FARTHING et al,
1989).
Foram tratados com medicamentos anti-retrovirais e realizados
os testes da contagem de linfócitos T CD4 e/ou carga viral.
Pode-se entrevistar esses pacientes e solicitar-lhes amostras de
fezes e escarro.
3.2. Entrevista
Os pacientes do grupo A não foram submetidos à entrevista e
nem responderam questionário, pois foram a nós encaminhados
aleatoriamente pelos médicos do Programa DST/AIDS.
Os pacientes do grupo B, após haverem sido consultados pelo
médico e informados sobre a natureza deste estudo, foram entrevistados e
responderam a um questionário confidencial contendo dados pessoais e
outras informações importantes relacionadas à infecção por
Cryptosporidium spp. Nessa oportunidade foi feita uma rápida explanação
sobre criptosporidiose e como evitar o contágio e a transmissão.
3.3. Coleta do material
Os pacientes do grupo A foram encaminhados pelos médicos do
Programa DST/AIDS, com o pedido para a realização de exame
coproparasitológico para pesquisa de Cryptosporidium spp.
Aos pacientes do Grupo B, após serem entrevistados, foram
entregues, coletores plásticos estéreis para acondicionamento das amostras
fecal e escarro com orientação para coleta. As fezes deveriam ser o mais
recente possível e o escarro coletado pela manhã, em jejum e após enxágüe
bucal somente com água. Duas amostras de cada material foram
solicitadas aos pacientes e essas deveriam ser entregues com intervalo de 3
dias.
3.4. Procedimento laboratorial
Foram analisadas 24 amostras fecais oriundas de 17 pacientes
HIV positivos e pertencentes ao grupo A de estudo.
Foram analisadas 70 amostras fecais e 39 amostras de escarro
provenientes de 37 pacientes infectados pelo HIV e pertencentes ao grupo
B.
No laboratório, as amostras de fezes dos pacientes, pertencentes
aos grupos A e B, foram submetidas a diversas técnicas parasitológicas
para pesquisa, concomitantemente, de outros enteroparasitas além de
Cryptosporidium spp.
Parte da amostra foi submetida a exame direto sem e com lugol,
ao método de sedimentação espontânea, método de Kato modificado e ao
método de Rugai e cols. (AMATO NETO e CÔRREA, 1980), com a
finalidade de se pesquisar a presença de cistos e trofozoítos de
protozoários, além de ovos e larvas de helmintos.
À outra porção de fezes adicionou-se solução salina tamponada
de fosfatos com formol a 10% (formalina) e guardou-se em geladeira por
24 horas após o que realizou-se a concentração pela técnica de formalina-
acetato de etila (YOUNG et al., 1979) e preparou-se os esfregaços em
lâminas de microscopia, para posterior coloração pelas técnicas da
Auramina (LENETTE et al., 1985) e fucsina-carbólica (Método de
Kinyoun modificado) para verificar-se a presença de oocistos de
Cryptosporidium spp.
As técnicas de concentração e coloração empregadas para
visualização de oocistos de Cryptosporidium spp foram selecionadas entre
as descritas na literatura, considerando-se a sua facilidade de utilização em
nosso laboratório, baixo custo e os bons resultados verificados, aliados às
modificações efetuadas.
Como controle positivo foram usadas lâminas preparadas a partir
de fezes de suínos jovens comprovadamente positivas para
Cryptosporidium spp.
As amostras de fezes dos suínos foram homogeneizadas em
formalina, filtradas em gaze dobrada e guardadas em geladeira por 24
horas. Após esse tempo, concentrou-se o material pela técnica do formol-
éter (RITCHIE, 1948) e procedeu-se a preparação de esfregaços e
coloração pela auramina e fucsina carbólica.
3.5. Modificações técnicas
Na tentativa de evidenciar melhorias na metodologia aplicada no
decorrer do experimento, efetuou-se algumas modificações técnicas,
algumas por observações da literatura e outras por colaboração original.
A técnica de concentração utilizada era a do formol-éter
(RITCHIE, 1948). Depois, por meio de estudo da literatura, optou-se pelo
uso do acetato de etila em substituição ao éter (YOUNG et al., 1979).
No método de coloração pelo Kinyoun, a fucsina carbólica era
deixada sobre o esfregaço por 30 minutos (LENETTE et al, 1985), lavado
com água corrente e em seguida descorado com solução álcool-ácido
sulfúrico 5% (HENRIKSEN & POHLENZ, 1981) até que todo o excesso
de corante fosse removido, cerca de 2 minutos e, novamente, lavado com
água corrente, contracorado com solução de azul de metileno a 1%, por 1
minuto, lavado com água e deixado para secar à temperatura ambiente.
A solução de fucsina carbólica passou a ser deixada sobre o
esfregaço por período de tempo de apenas 3 minutos. Passou-se a proceder
a descoloração com a mesma solução álcool-ácido usada no método de
coloração pela auramina, ou seja ácido clorídrico 0,5 % em álcool etílico
70 %, por cerca de 2 minutos.
Na literatura consultada (CLAVEL et al., 1996), as amostras de
escarro eram centrifugadas com água destilada, a 3000 rpm por 15 min., 2 a
3 vezes. O sedimento final era espalhado em lâmina de microscopia e
deixado para secar à temperatura ambiente, fixado com metanol e corado
pela técnica de Kinyoun modificada. Para amostras de escarro essa
metodologia não pareceu ser muito eficiente uma vez que o coccidio, se
presente, poderia ficar retido no muco e não sedimentar com a
centrifugação. Como não se encontrou outras citações na literatura
referentes a metodologia, as amostras de escarro foram inicialmente
submetidas a fluidificação por meio de uso de solução de N-acetil-L-
cisteína (LACAZ, 1991), comercialmente Fluimucil
e não apresentaram
aderência satisfatória à lâmina, mesmo após fixação. Por esse motivo,
passou-se a empregar solução de hidróxido de sódio a 3 % (DE CARLI,
1994) para fazer a digestão do escarro, também utilizada em partes iguais.
Com isso, diminuiu-se o tempo de digestão do material, de 24 horas com
Fluimucil
, para cerca de 1 hora, obtendo-se dessa maneira, um material
totalmente fluidificado, o que não ocorria com o uso de Fluimucil
. Para
obtenção do esfregaço, procedeu-se a centrigugação do material a 3000
rpm por 15 minutos. O sedimento assim obtido era homogêneo e
espalhava-se com facilidade na lâmina além de ficar firmemente aderido
após secar, não se desprendendo no momento da coloração, como ocorria
com algumas amostras em que se usou o outro fluidificante.
3.6. Procedimento para preparo das lâminas e técnicas
específicas para identificação de oocistos de Cryptosporidium spp nas
fezes
Cerca de 2 g de fezes foram homogeneizadas em 10 mL de
formalina a 10% em cálice graduado de vidro com capacidade para 125 mL
com auxílio de bastão de vidro. Filtrou-se em gaze dobrada para outro
cálice e o material assim obtido foi acondicionado em frascos de vidro tipo
penicilina com tampa de borracha e guardado em geladeira por 24 horas.
Esse procedimento faz com que diminua o risco de contágio ao se
manusear o material. Após, procedeu-se a concentração do material pela
técnica de sedimentação formalina-acetato de etila, onde 7 mL do material
foram transferidos para tubo cônico graduado de centrífuga com
capacidade para 10 mL e acrescentou-se 3 mL de acetato de etila com
posterior agitação em vortex por cerca de 30 segundos para
homogeneização. Centrifugou-se o material a 1500 rpm por 8 minutos.
Desprezou-se o sobrenadante e com o sedimento foram feitos esfregaços
em lâminas de vidro (25 x 76 mm) para microscopia. Para cada amostra
tomou-se cerca de 25 µL do sedimento e fez-se 2 esfregaços de 24 x 24 mm
em cada lâmina que foi deixada para secar a temperatura ambiente, fixados
com metanol e corados pelo método da auramina (LENETTE et al, 1985).
Essas lâminas foram observadas em microscópio de fluorescência Olympus
CBA-K empregando-se aumento de 100x e 400x. Os oocistos de
Cryptosporidium, quando presentes, apresentam-se com fluorescência
verde-amarelada intensa.
As mesmas lâminas foram posteriormente, submetidas à
coloração de Kinyoun modificada e examinadas em microscópio óptico
Jenaval, Carl Zeiss, em aumento de 250x e 1000x. Os oocistos, quando
presentes, são visualizados em destaque, com pigmentação rosa-
avermelhada intensa contrastando com a coloração de fundo azulada
(FIGURAS 1 e 2).
3.6.1. Método de coloração pela auramina
(LENETTE et al, 1985)
Procedimento:
-Fixar o esfregaço com o metanol;
-Cobrir o esfregaço com a solução de auramina O por 15 minutos;
-Lavar com água;
-Descorar com solução de álcool-ácido clorídrico, por 2 minutos;
-Lavar com água;
-Contrastar com solução de permanganato de potássio, por 3 minutos;
-Lavar com água;
-Secar em papel absorvente;
-Leitura.
3.6.2. Método de coloração pelo Kinyoun modificado, com
alterações no procedimento
Procedimento:
-Cobrir o esfregaço com a solução de fucsina carbólica, durante 3
minutos à temperatura ambiente; não aquecer;
-Lavar com água;
-Remover todo o excesso de corante com solução álcool-ácido
clorídrico (2 minutos);
-Lavar com água;
-Cobrir toda a lâmina com solução de azul de metileno , por 1
minuto;
-Lavar com água e deixar secar a temperatura ambiente.
3.7. Procedimento para preparo das lâminas para pesquisa de
oocistos de Cryptosporidium spp em secreção brônquica (escarro)
As amostras de escarro foram submetidas a uma digestão prévia
do muco pela adição de solução de N-Acetil-L-cisteína (Fluimucil
)
(LACAZ et al, 1991) ou em solução de hidróxido de sódio a 3 % (DE
CARLI, 1994) em partes iguais, com agitação até obter líquido homogêneo.
Transferiu-se o material para tubos cônicos de centrífuga, vedou-se a
extremidade superior com Parafilm M
,
centrifugou-se por 15 minutos a
3000 rpm e com auxílio de pipeta Pasteur aspirou-se o sedimento e
confeccionou-se os esfregaços em lâminas de microscopia de 25 x 76 mm.
Após secar à temperatura ambiente, as amostras foram fixadas com
metanol e coradas pelo método da auramina (LENETTE, 1985). Essas
lâminas foram observadas em microscópio de fluorescência Olympus
CBA-K empregando-se aumento de 100x e 400x.
As mesmas lâminas foram posteriormente, submetidas à
coloração de Kinyoun modificada e examinadas em microscópio óptico
Jenaval, Carl Zeiss, em aumento de 250x e 1000x.
3.8. Reagentes e soluções empregados
3.8.1. Solução salina tamponada - PBS (phosphate buffered
solution) 0,01M pH 7,2 - 7,4
Na
2
HPO
4
. 2 H
2
O.............................3,56g
NaH
2
PO
4
.2 H
2
O...............................0,94g
NaCl...............................................16,34g
Água destilada..............................2000 mL
3.8.2. Solução de formaldeído a 10% tamponada (formalina)
Formaldeído.............................................10 mL
Tampão fosfato pH 7,2 qsp.....................100 mL
OBS: Conservar em geladeira.
3.8.3. Solução corante de auramina
Solução A.
Auramina O...........................................0,1g
Álcool etílico 95%.................................10 mL
Solução B.
Fenol líquido ..........................................3 mL
Água destilada.......................................87 mL
Misturar as soluções A e B, acondicionar em frasco âmbar e conservar à
temperatura ambiente.
3.8.4. Solução álcool-ácido clorídrico
Ácido Clorídrico Concentrado....................0,5 mL
Álcool Etílico 70%...................................100 mL
3.8.5. Solução álcool-ácido sulfúrico
Ácido Sulfúrico Concentrado.......................5 mL
Álcool Etílico 70%....qsp..........................100 mL
3.8.6. Solução de permanganato de potássio
Permanganato de Potássio..........................0,5 g
Água destilada.....qsp..............................100 mL
3.8.7. Solução de fucsina carbólica de Kinyoun
Fucsina básica...........................................4 g
Cristais de Fenol ......................................8 g
Álcool etílico 95%...................................20 mL
Água destilada......................................100 mL
Dissolver a fucsina no álcool, adicionar o fenol e a água. Acondicionar em
frasco âmbar e conservar à temperatura ambiente.
3.8.8. Solução aquosa de azul de metileno
Cristais de azul de metileno ........................... 1g
Água destilada.............................................100 mL
3.8.9. Solução de hidróxido de sódio a 3%
Hidróxido de sódio .................................... 3 g
Água destilada .........................................100 mL
3.8.10. Solução de N-acetil-L-cisteína (NALC)
A. Solução de citrato de sódio 0,1 M
Citrato de sódio..................................... 29,4 g
Água destilada.......................................1000 mL
Esterilizar por autoclavagem a 120
°
C por 20 minutos. Estocar em
vidro escuro, a 4
°
C.
B. N-acetil-cisteína em pó .....................0,25 g
Preparo: 0,25 g de NALC em 25 mL de citrato de sódio 0,1 M.
4. RESULTADOS
Estudou-se 2 grupos de pacientes HIV positivos, sendo os do
grupo A encaminhados pelos clínicos do Serviço Especial de Saúde de
Araraquara (SESA) e os do grupo B contatados pessoalmente no SESA.
4.1. Resultados obtidos nas amostras fecais de pacientes HIV
positivos pertencentes ao grupo A
Foram analisadas 24 amostras fecais provenientes de 17
pacientes HIV positivos e pertencentes ao grupo A de estudo. A maioria
dos mesmos entregou apenas uma amostra de fezes para ser analisada,
mesmo havendo a requisição para a repetição de exame feita pelo médico
do SESA.
Para o exame dessas amostras foram utilizados os métodos de
coloração pela Auramina e de Kinyoun modificado, além de técnicas
rotineiras para pesquisa de outras formas de enteroparasitas.
As principais características desses pacientes como: sexo, idade,
fator de risco para aquisição do HIV e classificação , de acordo com o
Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC), bem como a
presença ou não de fezes diarreicas, estão expostas na Tabela 1.
Tabela 1. Características clínicas de 17 pacientes HIV
a
positivos
pertencentes ao grupo A
Características
Sexo
Masculino
Feminino
13
4
Idade (anos)
Fator de risco para contrair HIV
22-58 (32,5)
b
Masculino Homossexual ou Bissexual
3
Uso droga intravenosa 1
Contato heterossexual
Não definido
3
10
Grupo CDC
c
II 6
IV
Fezes
Diarreicas
Não diarreicas
Total
11
8
9
17
a
Vírus da imunodeficiência humana
b
média
c
Centro de Controle de Doenças
Os parasitas entéricos encontrados nas fezes dos pacientes HIV
positivos pertencentes ao grupo A, utilizando-se os métodos parasitológicos
direto, sedimentação espontânea, Rugai e cols e Kato modificado,
considerando-se a presença ou não de diarréia, podem ser visualizados na
Tabela 2.
Tabela 2. Parasitas entéricos encontrados nas fezes de 17
pacientes HIV positivos, pertencentes ao grupo A,
pelos diferentes métodos parasitológicos empregados,
segundo a presença ou não de diarréia.
Com
diarréia
(n* = 8)
%
Sem
diarréia
(n* = 9)
%
Protozoários
Cryptosporidium spp 2
11,76 (25,00)ª
- 0,00
Entamoeba coli - 0,00 1 5,88
Isospora belli 1 5,88 - 0,00
Sarcocystis sp
- 0,00 1 5,88
Helmintos
Ancilostomideo 1 5,88 - 0,00
Strongyloides stercoralis
1 5,88 1 5,88
ª % referente aos pacientes com diarréia
* n = número de pacientes
O exame parasitológico das amostras fecais pelas técnicas de
coloração da Auramina e Kinyoun modificada permitiu a verificação da
presença de Cryptosporidium spp em 2 amostras, sendo que estas se
apresentavam diarreicas e não apresentaram outro tipo de enteroparasita.
Os pacientes eram do sexo masculino.
As demais amostras mostraram-se negativas para o
Cryptosporidium spp.
Em uma amostra, também diarreica, observou-se a presença de
Isospora belli.
O exame parasitológico das amostras de fezes pelos métodos
direto, sedimentação espontânea, de Rugai e cols. e Kato modificado
(AMATO NETO e CÔRREA, 1980) permitiu a verificação da presença de
outros enteroparasitas.
4.2. Resultados obtidos nas amostras fecais de pacientes HIV
positivos pertencentes ao grupo B
Foram analisadas 70 amostras fecais oriundas de 37 pacientes
infectados pelo HIV e pertencentes ao grupo B.
As principais características desse grupo de pacientes como:
sexo, idade, fator de risco para aquisição do HIV e classificação, de acordo
com o Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC), estão
expostas na Tabela 3.
Entre os 37 pacientes, 12 apresentaram fezes diarreicas e 25,
fezes consideradas formadas ou não diarréicas.
Todos os pacientes moravam em casas que possuíam água
encanada e tratada e rede de esgoto.
Tabela 3. Características clínicas de 37 pacientes HIV
a
positivos
pertencentes ao grupo B
Características
Sexo
Masculino
Feminino
19
18
Idade (anos) 18 – 49 (33)
b
Fator de risco para contrair HIV
Masculino Homossexual ou Bissexual
6
Uso droga intravenosa 4
Contato heterossexual 27
Grupo CDC
c
II 13
IV
Fezes
Diarreicas
Não diarreicas
24
12
25
Total 37
a
Vírus da imunodeficiência humana
b
média
c
Centro de Controle de Doenças
O exame parasitológico das amostras fecais pelas técnicas de
coloração da Auramina e Kinyoun modificada apresentou-se negativo para
a presença de Cryptosporidium spp para todas as amostras analisadas.
O exame parasitológico das amostras de fezes pelos métodos
direto, sedimentação espontânea, de Rugai e cols. e Kato modificado
(AMATO NETO e CORRÊA, 1980) permitiu a verificação da presença de
outros enteroparasitas. Os resultados obtidos estão expressos na Tabela 4.
Tabela 4. Parasitas entéricos encontrados nas fezes de 37 pacientes
HIV positivos, com e sem diarréia, pertencentes ao grupo
B, pelos diferentes métodos parasitológicos empregados.
Com diarréia
(n* = 12)
%
Sem diarréia
(n* = 25)
%
Protozoários
Entamoeba coli 1 2,70 - 0,00
Endolimax nana - 0,00 2 5,40
Isospora belli 1 2,70 - 0,00
Helmintos
Strongyloides stercoralis
1 2,70 - 0,00
*
n = número de pacientes
Os resultados dos exames parasitológicos de fezes, referentes aos
54 pacientes, 17 do grupo A e 37 do grupo B, pelos diferentes métodos
empregados, são mostrados na tabela 5
Tabela 5. Parasitas entéricos encontrados nas fezes de 54 pacientes
HIV positivos com e sem diarréia pertencentes aos
grupos A e B.
Com
diarréia
(n* = 21)
%
Sem
diarréia
(n* = 33)
%
Total
(n* = 54)
%
Protozoários
Cryptosporidium spp
2 9,52 - 0,00
2 3,70
Entamoeba coli
1 4,76 1 3,03
2 3,70
Endolimax nana
- 0,00 2 6,06
2 3,70
Isospora belli
2 9,52 - 0,00
2 3,70
Sarcocystis sp
- 0,00 1 3,03
1 1,85
Helmintos
Ancilostomideo
1 4,76 - 0,00
1 1,85
Strongyloides stercoralis
2 9,52 1 3,03
3 5,55
* n = número de pacientes
4.3. Resultados obtidos nas amostras de secreção brônquica de
pacientes HIV positivos pertencentes ao grupo B
Foram analisadas 39 amostras de secreção brônquica (escarro)
provenientes de 37 pacientes HIV positivos e pertencentes ao grupo B de
estudo.
Os pacientes se referiam a pouca produção de secreção e a
maioria deles entregou apenas uma amostra para análise.
Os exames das 39 amostras de escarro coradas pelas técnicas da
Auramina e Kinyoun modificada, apresentaram-se negativos para a
presença de Cryptosporidium spp.
4.4. Resultado obtido com a modificação efetuada na técnica de
coloração de Kinyoun
Nas fotomicrografias apresentadas são demonstradas as variações
na coloração do material examinado pelo método de Kinyoun, devido a
modificação efetuada. As fotomicrografias foram feitas em microscópio
Jenaval – Karl Zeiss Jena com equipamento fotográfico acoplado, de
esfregaços obtidos de material fecal humano positivo para oocistos de
Cryptosporidium spp.
Nas Figuras 1 e 2 são visualizados oocistos de Cryptosporidium
spp submetidos a descoloração com solução álcool-ácido clorídrico em
aumento de 250 x e 1000 x, respectivamente.
Nas Figuras 3 e 4 são demonstrados oocistos de Cryptosporidium
spp submetidos a descoloração com solução álcool-ácido sulfúrico em
aumento de 250 x e 1000 x, respectivamente.
As Figuras 5 e 6 exibem formas leveduriformes em aumento de
250 x e 400 x.
FIGURA 1. Oocistos de Cryptosporidium spp observados em fezes. Coloração ácido-
resistente de Kinyoun empregando-se solução descorante álcool-ácido clorídrico
(aumento de 250 x).
FIGURA 2. Oocistos de Cryptosporidium spp observados em fezes. Coloração ácido-
resistente de Kinyoun empregando-se solução descorante álcool-ácido
clorídrico (aumento de 1000 x).
FIGURA 3. . Oocistos de Cryptosporidium spp observados em fezes. Coloração ácido-
resistente de Kinyoun empregando-se solução descorante álcool-ácido
sulfúrico. (aumento de 250 x).
FIGURA 4. . Oocistos de Cryptosporidium spp observados em fezes. Coloração ácido-
resistente de Kinyoun empregando-se solução descorante álcool-ácido
sulfúrico. (aumento de 1000 x).
FIGURA 5. Formas leveduriformes presentes em material fecal. Coloração ácido-
resistente de Kinyoun com modificação proposta. (aumento de 250 x).
FIGURA 6. Formas leveduriformes presentes em material fecal. Coloração ácido-
resistente de Kinyoun com modificação proposta. (aumento de 400 x).
5. DISCUSSÃO
A criptosporidiose é uma infecção intestinal causada por um
protozoário coccídio monoxênico: Cryptosporidium spp. Apesar de
descrito em princípios do século XX, sua importância foi relevada nos anos
70 quando caracterizado como um dos agentes responsáveis por diarréias
neo-natais em animais de granja, repercutindo em aspectos econômicos em
diferentes regiões (NAVIN e JURANEK, 1984; FAYER e UNGAR, 1986;
TZIPORI e GRIFFITHIS, 1998; ARES-MAZAS e VILLACORTA, 1992 ).
Foi a partir de 1976 que o interesse pelo estudo do protozoário se
incrementou, ocasião em que apareceram os primeiros indícios de quadros
clínicos diarreicos graves em pacientes humanos. Na atualidade, pode-se
caracterizar em Saúde Pública três grupos de população, que parasitados
por Cryptosporidium spp , desenvolvem quadro clínico diarreico (ARES-
MAZAS e VILLACORTA, 1992):
−
O primeiro grupo está constituído por enfermos acometidos por
síndrome da imunodeficiência adquirida em que se manifesta como um
parasita oportunista de difícil erradicação, ainda que o quadro clínico se
apresente variável, sendo considerado como agente patógeno
gastrointestinal responsável por grande morbidade e mortalidade nestes
doentes.
− O segundo grupo é integrado por doentes submetidos a terapia
imunossupressora, que são acometidos por determinadas infecções virais,
por enfermos que apresentam deficiências imunoglobulínicas e por
população infantil com deficiência nutricional. Neste grupo, com a
supressão do tratamento, com o restabelecimento de infecções coexistentes
ou com a normalidade dos estados carênciais, geralmente, ocorre a
remissão da sintomatologia.
− Por fim, o terceiro grupo está formado por pessoas
imunologicamente sadias, principalmente crianças, em que a infecção por
Cryptosporidium se assemelha a uma toxinfecção alimentar, de remissão
espontânea.
Ao que tudo indica, a infecção é adquirida por ingestão e
possivelmente inalação dos oocistos do protozoário, que tem demonstrado
a capacidade de transmitir-se entre uma grande diversidade de hospedeiros
vertebrados, sugerindo a possibilidade de que os animais domésticos
representem importantes reservatórios zoonóticos para o homem (FAYER
& UNGAR, 1986; JANOFF & RELLER, 1987; MEINHARDT et al.,
1996).
Considerando as publicações disponíveis, são considerados
importantes meios de transmissão, os seguintes mecanismos: animal a
animal, homem a homem, animal a homem e contaminação fecal humana
e animal do meio ambiente (JANOFF & RELLER, 1987; NAVIN e
JURANEK, 1984).
A princípio, o diagnóstico desta protozoose realizou-se
acidentalmente mediante biópsias intestinais; na atualidade, o diagnóstico é
fundamentalmente coprológico, ainda que nem todas as técnicas de rotina
se apresentem eficazes. Assim, são importantes recursos as técnicas de
coloração diferenciadas baseadas em propriedades álcool-ácido resistentes
dos oocistos do coccídio. Estas, aplicadas sobre o sedimento obtido pela
realização de técnicas de concentração, têm se apresentado de grande valia
na evidenciação dos oocistos, facilitando o trabalho de busca microscópica
e ampliando a potencialidade diagnóstica pelo exame de fezes (JANOFF &
RELLER, 1987).
Em revisão à literatura referente ao assunto, verificou-se entre as
metodologias estudadas um bom número de técnicas coprológicas
utilizando-se do exame direto de esfregaços a fresco (DELUOL e col.,
1984) ou adicionadas de substâncias com propriedades tintoriais como o
lugol ( MA & SOAVE, 1983), a fucsina fenicada (HEINE, 1982), a
metamina de prata (ANGUS e cols, 1981), a nigrosina (POHJOLA, 1984),
a auramina-rodamina (GARCIA e cols., 1983), a laranja de acridina (MA
& SOAVE, 1983); para algumas dessas técnicas se utiliza microscopia
comum e para outras, microscopia de fluorescência.
Quando os episódios diarreicos encontram-se diminuídos, ocorre
uma consequente escassez de formas do parasito dificultando a observação
das mesmas, requerendo-se o emprego de um grande número de
preparações e largo tempo de observação microscópica para a garantia e
eficácia de diagnóstico.
Levando-se em consideração alguns aspectos sobre o
protozoário, características da matéria fecal a ser examinada, interferências
na execução da rotina laboratorial entre outras, verificou-se alguns tópicos
importantes para a seleção de metodologia para o diagnóstico da
criptosporidiose:
• os oocistos apresentam-se como formas arredondadas muito
pequenas - cerca de 5 µm - de difícil observação ao microscópio óptico.
• a maior eliminação de oocistos são coincidentes com a
ocorrência de períodos diarreicos e, por outra parte, ao produzir-se
aceleração do trato intestinal, as fezes se apresentam repletas de restos que
dificultam a busca e visualização dos oocistos.
• a presença de leveduras, cuja forma e tamanho são muito
similares às dos oocistos, induz à necessidade de conhecimento das duas
estruturas para o diagnóstico diferencial.
Ainda, considerando-se as condições particulares do laboratório
de Parasitologia, imputou-se critérios de adaptabilidade da metodologia,
tendo em vista a necessidade de utilização de técnica de concentração e
enriquecimento do material e a necessidade da realização de técnica de
coloração para melhor evidenciação dos oocistos. Foi levado em conta,
também, a facilidade de execução, rapidez e baixo custo.
Como comentado anteriormente, quando se está em presença de
infecção que tem curso com diarréia aquosa abundante, os oocistos, apesar
de seu grande número, se encontram muito diluídos. Assim, é
recomendado o emprego de técnicas de concentração físicas por flutuação:
• flutuação em sulfato de zinco (ISEKI, 1979),
• flutuação em sulfato de magnésio (PAVLASEK, 1982),
• flutuação em sacarose (GARCIA et al., 1983),
ou métodos difásicos, com uma grande variedade de técnicas, sendo as
mais utilizadas:
•
técnica de Ritchie modificada (ALLEN & RIDLEY, 1970),
• técnica de Ritchie com formalina-acetato de etila (YOUNG et al., 1979;
MacNABB et al., 1985).
A inclinação para a avaliação destas técnicas que são empregadas
freqüentemente em muitos laboratórios de análises é patente, pela
facilidade de execução e também por permitirem preparar, imediatamente,
a partir do sedimento, esfregaços sobre os quais se podem realizar técnicas
de coloração diferencial de procedimento (ARES-MAZAS e
VILLACORTA, 1992).
São muitos os trabalhos que se referem a utilização de corantes
para a evidenciação dos oocistos de Cryptosporidium spp: Giemsa
(BLAKEY, 1984), azul de metileno/eosina (CROSS & MOORHEAD,
1984) entre outros. Pela coloração de Giemsa não se diferencia leveduras
de oocistos de Cryptosporidium; safranina-azul de metileno é sensível e
rápida, mas cansativa visualmente quando o número de amostra a ser
examinada for grande. Ácido periódico de Schiff modificada e prata-
metamina não são colorações eficazes (JANOFF & RELLER, 1987).
Ao se conhecer as propriedades ácido-resistentes dos oocistos, as
modificações efetuadas a partir da coloração de Ziehel Neelsen têm se
mostradas as mais eficazes (POHJOLA et al., 1985) (MA & SOAVE,
1983) (HENRIKSEN & POHLENZ, 1981) (LENETTE et al., 1985).
Um método seguro, rápido e disponível é a coloração pela
Auramina O fluorescente (JANOFF & RELLER, 1987). Nesse método não
se visualiza estrutura interna e a morfologia é variável, mas os oocistos
emitem fluorescência amarela-esverdeada intensa e têm a aparência de um
pequeno “botão-de-camisa” sendo fácil e rápido identificá-lo.
As colorações dimetilsulfóxido-carbolfucsina (BRONSDON,
1984) e ácido-resistente de Kinyoun modificada (HENRIKSEN &
POHLENZ, 1981) eliminam a necessidade de aquecimento. Essas técnicas
são sensíveis e não confundem leveduras, devido ao seu tamanho e
morfologia, com oocistos de Cryptosporidium uma vez que aquelas se
coram em verde com o procedimento ácido resistente. Na técnica de
coloração ácido-resistente modificada, os oocistos de Cryptosporidium se
apresentam corados de rosa-avermelhado intenso contra uma coloração de
fundo verde (JANOFF & RELLER, 1987) ou azul quando se usa o azul de
metileno como corante de fundo (GARCIA et al., 1983).
No presente trabalho, utilizou-se as técnicas de formol-éter
(RITCHIE, 1948) e formalina-acetato de etila (YOUNG et al., 1979) para a
concentração do material e as técnicas tintoriais de auramina (LENETTE et
al., 1985) e fucsina carbólica (Kinyoun modificado), que apresentaram
bons resultados. Esses recursos permitiram esfregaços sem muitas
partículas fecais interferentes e uma coloração de contraste possibilitando o
diagnóstico diferencial pela evidenciação das estruturas internas dos
mesmos. Ainda, vale destacar que essas técnicas oferecem vantagem de
rápido processamento do material com agilização do diagnóstico.
Efetuada a opção pela implantação destas técnicas combinadas,
realizou-se grande número de lâminas preparadas a partir de fezes de
suínos jovens comprovadamente positivos para a presença de oocistos de
Cryptosporidium spp, apresentando boa qualidade e que foram utilizados
como controle positivo para as provas laboratoriais.
O material fecal analisado, foi oriundo de 54 pacientes HIV
positivos pertencentes aos grupos A e B, dentre os 395 pacientes
acompanhados no Programa DST/AIDS do SESA, o que é equivalente a
13,67% de pacientes estudados.
As 94 amostras de fezes, pertencentes aos 2 grupos de estudo (A
e B), foram submetidas à metodologia específica para a identificação de
oocistos de Cryptosporidium spp e aos métodos de rotina para diagnóstico
de parasitoses intestinais.
O grupo A era composto por pacientes que não faziam uso de
medicamentos anti-retrovirais, do teste da contagem da carga viral ou
linfócios T CD4. Eram 17 pacientes HIV positivos, sendo 13 (76,5%) do
sexo masculino e 4 (23,5%) do sexo feminino, com idade média de 32,5
anos. Em relação à classificação do Centro de Controle de Doenças
(CDC), 6 (35,3%) pacientes estavam classificados no Grupo II isto é,
pacientes assintomáticos e 11 (64,7%) no Grupo IV, ou seja de pacientes
sintomáticos (TABELA 1).
Esses dados confirmam os achados da época quando a síndrome
da imunodeficiência adquirida incidia com maior freqüência no sexo
masculino e destacamos ainda os casos positivos entre o sexo feminino
ocorreram em mulheres de idade acima de 40 anos e cujos parceiros
sexuais eram soropositivos e alguns já falecidos (CPD, SESA).
O fator de risco para contrair HIV ficou prejudicado neste grupo
uma vez que a maioria foi considerado indefinido por não constarem dados
esclarecedores nos prontuários médicos dos pacientes do centro de
processamento de dados (CPD) do SESA.
Observou-se outras formas parasitárias com o emprego dos
diferentes métodos coproparasitológicos mencionados anteriormente
(TABELA 2).
Neste grupo encontramos 2 (11,76%) pacientes parasitados pelo
Cryptosporidium spp, apresentando fezes diarreicas e ausência do parasita
nas amostras não diarreicas, concordando com os dados da literatura
consultada.
Verificou-se que 1 paciente se encontrava parasitado por
Isospora belli, protozoário freqüente em pacientes com AIDS e que pode
ser diagnósticado pelas mesmas técnicas empregadas para Cryptosporidium
spp (DIENG et al., 1994).
Embora o nosso objetivo tenha sido a pesquisa de casos de
criptosporidiose, pode-se sugerir a adoção da técnica de Kinyoun
modificada para o diagnóstico concomitante de isosporíase.
Destacamos ainda que o paciente com Isospora belli apresentava
diarréia crônica intermitente e que os exames parasitológicos com técnicas
rotineiras, como métodos direto e sedimentação espontânea (AMATO
NETO e CORRÊA, 1980), nem sempre se apresentam positivas para o
protozoário. Ao empregar-se as técnicas de concentração e coloração para
a pesquisa de Cryptosporidium spp, nesse paciente, estas sempre se
apresentaram positivas para o Isospora belli.
Pode-se também verificar que foi encontrado 1 paciente com
fezes formadas e positivas para Sarcocystis sp (TABELA 2). Esse paciente
faleceu e não se obteve outros dados no CPD – SESA (Centro de
Processamento de Dados).
Como relatado na literatura (NEVES et al., 1998) a prevalência
desse parasito é desconhecida não só no Brasil como também em outros
países.
Observou-se ainda a presença de Entamoeba coli em 1 paciente
cujas fezes se apresentavam não diarreicas.
Quanto aos demais parasitos encontrados em pacientes do grupo
A, deve-se relatar a presença de ancilostomideo em 1 paciente e
Strongyloides stercoralis em 2 pacientes, sendo que um deles apresentava
fezes diarreicas e o outro, fezes normais.
Ressalte-se ainda que o mesmo paciente com fezes diarreicas
apresentou-se parasitado pelos dois helmintos acima citados. Isso é
perfeitamente compreensível uma vez que o mecanismo de transmissão é
semelhante para os dois parasitas (REY, 1992; NEVES et al., 1998).
Para esse grupo o total de amostras de fezes analisadas foi de 24,
sendo 12 diarreicas e 12 não diarreicas, pertencentes aos 17 pacientes do
grupo, 8 (47,1%) pacientes apresentando diarréia e 9 (52,9%) sem diarréia.
O grupo B era composto por 37 pacientes HIV positivos,
acompanhados regularmente no Programa DST/AIDS do SESA e que
usavam medicamentos anti-retrovirais e periodicamente realizavam o teste
da contagem da carga viral e /ou linfócito T CD4.
Para a maioria dos pacientes desse grupo foram examinadas 2
amostras de fezes com intervalo de 3 a 5 dias, o que não ocorreu com o
grupo A, onde grande parte dos pacientes entregou apenas 1 amostra para
análise.
Quanto à idade, foi observada menor faixa etária dos pacientes
acometidos pelo vírus quando comparado ao grupo anterior, apesar da
média de idade ter sido praticamente igual (TABELA 3).
Neste grupo B, observou-se que o fator de risco para contrair
HIV foi maior pelo contato heterossexual, isto é 27 pacientes (73%), 6
(16,2%) eram homo ou bissexual e 4 pacientes (10,8%), faziam uso de
droga endovenosa (TABELA 3).
Da mesma forma que no grupo A, os pacientes deste grupo
apresentaram-se sintomáticos pela classificação do CDC (FARTHING,
1985) em sua maioria (64,9%) (TABELA 3).
Quanto à presença ou ausência de diarréia observou-se aumento
de pacientes com fezes formadas, 25 (67,6%) (TABELA 3), se comparados
aos pacientes do grupo A que foram 9 (52,9%) (TABELA 1).
Esses achados refletem a melhora clínica dos pacientes desse
grupo pela administração do tratamento anti-retroviral e pela realização de
exames parasitológicos de rotina, de contagem de linfócitos T CD4, carga
viral e outros, de responsabilidade do SESA.
Dos 37 pacientes do grupo B que enviaram as amostras de fezes
detectou-se a presença de 13,5% de positividade para formas parasitárias
de protozoários e helmintos (TABELA 4).
Concordando com MAGALHÃES et al., 1993, a Entamoeba coli
e a Endolimax nana não têm papel relevante na indução de diarréia em
pacientes HIV positivos. O mesmo não se pode dizer em relação aos
parasitas patogênicos como o Strongyloides stercoralis e Isospora belli,
cujo percentual de positividade foi de 5,4% para esse grupo. O paciente
com Isospora belli apresentava-se com diarréia crônica intermitente e o
paciente com Strongyloides stercoralis, com diarréia.
Levando-se em consideração os casos de diarréia entre os dois
grupos estudados (A e B) verifica-se que 2 pacientes (9,52%) (TABELA 5)
dos mesmos apresentaram infecção pelo Cryptosporidium spp.
No Brasil, o percentual encontrado para Cryptosporidium spp,
entre aidéticos com diarréia, na literatura consultada varia entre 12,1 % a
19,6 % (DIAS et al., 1988; MOURA et al. , 1989; RODRIGUES et al.,
1991; GUIZELINI et al., 1992; MAGALHÃES et al., 1993; SAUDA et al.,
1993; GARLIPP et al., 1995).
Os trabalhos dos autores acima referidos foram realizados, na sua
totalidade, com pacientes em demanda hospitalar, caracterizados por
amostragem que variaram de 48 a 157 pacientes HIV positivos e
apresentando sintomatologia clínica.
Verifica-se que o percentual de positividade encontrado neste
trabalho para o Cryptosporidium spp, encontra-se ligeiramente inferior aos
valores mencionados acima, talvez devido ao fato desses pacientes, apesar
de condição sócio-econômica baixa, receberem acompanhamento de
Assistente Social do Programa DST/AIDS do SESA e possuírem água
encanada e tratada e rede de esgoto em suas residências.
Dos 17 pacientes pertencentes ao grupo A, pacientes não
submetidos a medicação anti-retroviral, 8 se encontravam com fezes
diarreicas e destes, 2 apresentaram diagnóstico positivo para
Cryptosporidium spp, correspondendo a 25 % de positividade quando
estudado isoladamente, o que está de acordo com dados da literatura
(ANAND et al., 1996; MERCADO e GARCIA, 1995; DIENG et al., 1994;
KAMEL et al., 1994; COTTE et al., 1993; BLANSHARD et al., 1992).
Esses autores apresentam estudos com amostragens variando de 13 a 145
pacientes HIV positivos, com diarréia, em regiões de diferentes países –
Manipur, Índia; Santiago, Chile; Dakar, Senegal; Kuala Lumpur, Malásia;
Lyon, França; Londres, Inglaterra – com índice de positividade variando de
13,9 % a 46,6%.
Ao compararmos com o total de amostras analisadas (94)
referentes ao total de pacientes (54), a positividade para Cryptosporidium
spp cai drasticamente para 3,70% dos pacientes estudados (TABELA 5).
Este valor é compatível com os encontrados nos países desenvolvidos
(SORVILLO et al., 1994; PEDERSEN et al., 1996; MEINHARDT et al.,
1996; FAYER & UNGAR, 1986).
Julgamos esses dados mais compatíveis com o nosso estudo,
considerando-se a nossa amostragem ser de pacientes acompanhados em
um Programa de Saúde e residentes em cidade com boa infra-estrutura
sanitária.
As 39 amostras de escarro, examinadas pelas técnicas da
Auramina e Kinyoun modificada, apresentaram-se negativas, em sua
totalidade, para Cryptosporidium spp.
Cumpre-nos salientar que observando-se alguns dos esfregaços
de escarro corados pela auramina foram visualizadas estruturas que
despertaram suspeita de micobactéria. O fato foi comunicado ao SESA que
tomou as providências cabíveis.
Houve dificuldade para a obtenção de 2 amostras de escarro, que
foram solicitadas somente para os pacientes do grupo B. Os pacientes,
diziam que não conseguiam expectorar ou ficavam de entregar em outro
dia e não o faziam.
Embora tenhamos encontrado apenas 2 casos de criptosporidiose
na amostra populacional estudada, deve-se salientar que a utilização de
técnicas combinadas de concentração pela formalina-acetato de etila e
coloração de Kinyoun modificada, que foram adotadas nesta investigação,
mostrou-se eficaz, confiável e exeqüível a qualquer Laboratório de
Análises Clínicas, pela facilidade de execução, baixo custo e que permite
identificar não só o Cryptosporidium spp, objeto deste estudo, como
também o Isospora belli que freqüentemente acomete os pacientes HIV
positivos.
Deve-se destacar a importância do acompanhamento dos
pacientes HIV positivos em nível de Saúde Pública em Araraquara
realizado pelo Programa DST/AIDS do SESA.
5.1. Considerações sobre as modificações técnicas
No decorrer do experimento efetuou-se algumas modificações na
tentativa de proporcionar melhorias nas técnicas diagnósticas. Assim, na
execução da técnica de concentração, optou-se pela substituição do éter
(RITCHIE, 1948) por acetato de etila (YOUNG et al, 1979).
O produto apresentou-se mais eficiente na remoção da gordura e
de detritos fecais e, além do acetato de etila apresentar uma maior
facilidade de aquisição, quando comparado ao éter, apresenta menor
restrição comercial e é menos perigoso para o manuseio.
Na realização da coloração das lâminas, o tempo de utilização da
fucsina carbólica foi reduzido de 30 (HENRIKSEN & POHLENZ, 1981)
para 3 minutos (LENETTE et al., 1985) e procedeu-se a substituição da
solução de álcool-ácido sulfúrico a 5% (HENRIKSEN & POHLENZ,
1981) por solução de ácido clorídrico a 0,5% em álcool etílico 70%
(contribuição original). Essas mudanças promoveram descoloração efetiva
e eficiente, removendo melhor o excesso de fucsina em mesmos tempos de
descoloração. Ao contracorar com a solução de azul de metileno os
oocistos, de coloração rosa-avermelhada, sobressaiam-se contra o fundo
azul, sendo possível visualizá-los em aumento de 250x (FIGURA 1) e
diminuindo sobremaneira o tempo de microscopia, tornando o trabalho de
análise das lâminas mais rápido e menos cansativo. As formas suspeitas
foram examinadas com o aumento de 1000x (FIGURA 2) para
confirmação.
Os esfregaços submetidos a descoloração com álcool-ácido
sulfúrico necessitaram de maior tempo de microscopia e maior acuidade
visual devido a dificuldade de visualização dos oocistos de
Cryptosporidium spp quando se utilizava aumento de 250 x (FIGURA 3).
Torna-se mais fácil visualizar o coccídio em aumento de 1000x, mas isso
faz com que a análise da lâmina corada seja mais demorada e cansativa
(FIGURA 4).
As leveduras coradas pelo método de Kinyoun com a
modificação efetuada, são facilmente distinguíveis de oocistos de
Cryptosporidium spp, pelo fato dessas corarem-se em azul (FIGURA 5 e
6).
Na preparação das amostras de escarro, com a utilização de
Fluimucil
, não se obteve bons resultados na aderência do material às
lâminas. Os resultados foram muito bons quando substituiu-se o
Fluimucil
por solução de hidróxido de sódio a 3% para a digestão do
escarro, conforme descrito por DE CARLI, 1994. Além de redução do
tempo de digestão de 24 horas para 1 hora, agilizando o diagnóstico, o
material sedimentado por centrifugação, apresentou-se mais homogêneo,
espalhando-se com facilidade e aderindo-se mais firmemente à lâmina,
favorecendo a coloração.
6. CONCLUSÕES
1 Sugere-se a implantação da técnica de Kinyoun, por nós
modificada em nosso trabalho, pela facilidade de execução, baixo custo e
bons resultados obtidos podendo ser utilizada em qualquer laboratório de
Análises Clínicas, de caráter institucional ou particular.
2 Na técnica de Kinyoun modificada a utilização de solução
descorante de ácido clorídrico 0,5% em álcool etílico 70% promoveu
melhor visualização dos oocistos de Cryptosporidium spp nos esfregaços
corados, devido a remoção do excesso de fucsina.
3 A substituição da solução de N-acetil-L-cisteína por hidróxido
de sódio a 3% promoveu melhor fluidificação do material, facilitando a
concentração e a confecção do esfregaço, com redução do custo de exame
de escarro, além de diminuir o tempo de preparo e o contato com o material
biológico.
4 Entre os 54 pacientes HIV positivos estudados, obteve-se
3,7% de positividade para o Cryptosporidium spp em amostras fecais.
5
Considerando-se o total de 21 pacientes com fezes diarreicas,
o índice de positividade foi de 9,52% para o coccídio pesquisado.
6 Avaliando-se os pacientes HIV positivos, não medicados com
anti-retrovirais, obteve-se 11,76% de positividade para o Cryptosporidium
spp.
7 Considerando-se o grupo de pacientes HIV positivos não
medicados com anti-retrovirais e com presença de diarrréia, obteve-se 25%
de positividade para o Cryptosporidium spp.
8 Nos pacientes submetidos a medicação com anti-retrovirais
não se encontrou oocistos de Cryptosporidium spp nas amostras de fezes
examinadas.
9 Entre os pacientes estudados e submetidos à análise de escarro
não constatamos a presença de formas de Cryptosporidium spp no material
examinado.
7. RESUMO
A criptosporidiose é uma infecção causada pelo
Cryptosporidium spp, um protozoário coccídio de patogenicidade
emergente e responsável por severa e prostante diarréia aquosa em
humanos. Em pacientes HIV positivos, os sintomas gastrointestinais
podem ser graves e prolongados e incluem náuseas, febre baixa, cólicas
abdominais, anorexia e diarréia aquosa. Envolvimento pulmonar também
pode ocorrer. Foram analisadas 94 amostras de fezes de 54 pacientes HIV
positivos com e sem diarréia e 39 amostras de escarro de 34 desses
pacientes. Demonstrou-se uma prevalência de 9,52% de Cryptosporidium
spp entre os pacientes com diarréia. Não se encontrou amostra de escarro
positiva para o coccídio pesquisado. O diagnóstico foi baseado na
identificação dos oocistos de Cryptosporidium spp empregando-se os
métodos de coloração pela Auramina e ácido-resistente (Kinyoun) onde
efetuou-se modificação que facilitou a visualização das formas do coccídio.
Palavras-chave: Cryptosporidium spp, AIDS, diagnóstico, diarréia
8. SUMMARY
Cryptosporidiosis, a infection caused by Cryptosporidium spp, is
a coccidial protozoan of emergencial pathogenicity causing severe
protacted watery diarrhea in humans. In HIV seropositive patients, the
gastrointestinal symptoms may be serious and prolonged and may include
nausea, low-grade fever, abdominal cramps, anorexia and watery diarrhoea.
Cryptosporidiosis with pulmonary involvement in patients with AIDS can
occur too. It was analysed 94 stool samples from 54 patients with and
without diarrhoea, and 39 sputum samples from 34 of this patients. The
prevalence of Cryptosporidium spp among patients with diarrhea was
9,52%. The sputum samples were negative in all analysis for the coccidia
demonstration. The diagnosis was based on the recognition of
Cryptosporidium spp oocysts using an auramina staining and acid-fast
staining (Kinyoun) where was effected a modification that offered the best
results in the visualization of coccidial forms..
Key words : Cryptosporidium spp, AIDS, diagnosis, diarrhea
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10. ANEXOS
ANEXO 1
QUESTIONÁRIO (CONFIDENCIAL)
1. NOME:............................................................................................................IDADE.........................
2. ENDEREÇO:...................................................................................................CIDADE:.....................
3. PROCEDÊNCIA:..........................................................HÁ QUANTO TEMPO:..................................
4. USUÁRIO DE DROGA ENDOVENOSA: SIM NÃO
5. PREFERÊNCIA SEXUAL: HOMO HETERO BISEXUAL
6. CONTATO COM ANIMAIS: DOMÉSTICO (CÃO, GATO) FAZENDA PÁSSAROS
7.CONTATO COM ÁGUA: PISCINA REPRESAS LAGOS RIOS
8. VIAGEM RECENTE:
SIM
NÃO LOCAL:
9.CONTATO COM PARENTE, AMIGO, CONHECIDO COM QUADRO DIARREICO RECENTE
SIM NÃO
10. USO MEDICAMENTO: SIM NÃO QUE TIPO:
11. SINTOMAS CLÍNICOS:
( ) DIARRÉIA (aquosa, volumosa) - DURAÇÃO (dias):______QUANTAS EVACUAÇÕES/DIA:____
( ) DOR ABDOMINAL ( ) CÓLICAS ( ) PERDA DE PESO ( ) PERDA DE APETITE
( ) FLATULÊNCIA ( ) FEBRE BAIXA ( ) NAÚSEA ( ) VÔMITO
( ) PROBLEMAS RESPIRATÓRIOS: tosse, dor no peito, falta de ar
( ) DOR QUADRANTE SUPERIOR DIREITO
12. RESIDÊNCIA: ( ) água tratada ( ) rede esgoto
13. ÁGUA DE BEBER: ( ) torneira ( ) filtro ( ) fervida e/ou filtrada
ANEXO 2
TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO
Eu, _________________________________________, residente
em _________________________, concordo em participar como voluntário do
projeto de pesquisa entitulado “CONTRIBUIÇÃO AO DIAGNÓSTICO
LABORATORIAL DA CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA E
LEVANTAMENTO DA PREVALÊNCIA DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium
spp NAS FEZES E EM SECREÇÃO BRÔNQUICA DE PACIENTES HIV
POSITIVOS”.
Estou ciente das informações anexas a esse Termo, referente aos
objetivos da pesquisa e orientações que deverei seguir durante a fase de coleta das
amostras biológicas de secreção brônquica (escarro) e fezes.
Araraquara, ____ de ______________ de 19___.
_________________________
assinatura
INFORMAÇÕES
Projeto: “Contribuição ao diagnóstico laboratorial da criptosporidiose
humana e levantamento da prevalência de oocistos de Cryptosporidium spp nas fezes e
em secreção brônquica de pacientes HIV positivos”.
Amostras: Serão analisadas amostras biológicas de:
- secreção brônquica ( coletada em jejum, pela manhã, pelo próprio
paciente).
- amostras de fezes, cuja coleta não é invasiva.
Objetivo: Verificar a ocorrência do parasita Cryptosporidium spp em
pacientes HIV positivos.
Paralelamente, no material disponível para análise, será pesquisada a
presença de outros enteroparasitas.
Considerações sobre risco: Os indivíduos que irão participar da pesquisa
não serão submetidos a nenhum tipo de risco. Todo o material empregado para coleta
das amostras biológicas de escarro e fezes são estéreis e de uso único.
OBSERVAÇÃO: DÚVIDAS -
Fone: (016) 232-0200 R. 294 Isabel
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