Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS ARARAQUARA
“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM
TRYPANOSOMA CRUZI
”
DANIELA LUZ AMBRÓSIO
Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação
em Análises Clínicas para obtenção do título de mestre em
Análises Clínicas, área de concentração Biologia Molecular
ORIENTADORA:
Profa. Dra. Regina Maria Barretto Cicarelli
ARARAQUARA
2005
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Este trabalho foi desenvolvido no laboratório de Imunologia e Biologia
Molecular do Departamento de Ciências Biológicas, pertencente à Faculdade de
Ciências Farmacêuticas – UNESP – Araraquara, com apoio da CAPES
(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), através da
concessão de uma bolsa de mestrado e auxílio à pesquisa FAPESP (proc.
04/01630-9) e FUNDUNESP (proc. 850/03).
ads:
A Deus que sempre está ao meu lado, iluminando meu caminho.
Aos meus pais Cíntia e Hamilton
e às minhas queridas irmãs Rafaela e Marcela
pelo amor, incentivo e compreensão que me ajudaram a chegar até aqui.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Em especial ao Marco Túlio, pelo carinho, companhia, paciência e incentivo, além do auxílio
nos experimentos e nas análises em bioinformática.
A Profa. Regina Cicarelli que possibilitou e incentivou meu crescimento científico,
profissional e pessoal, e pela amizade.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de
bolsa de estudo.
Às funcionárias da pós-graduação, Cláudia, Sônia e Laura pelos serviços prestados e pela
atenção.
Às minhas queridas amigas Aline, Mirela, Tatiane e Maria Helena e aos amigos Júlio e
Nicholas que sempre estiveram ao meu lado em todos os momentos.
Às estagiárias Joyce e Gabriela que sempre estiveram prontas a ajudar, principalmente nas
reações de sequenciamento.
A todos do Laboratório de Imunologia e de Parasitologia pelo apoio técnico e pessoal.
Enfim, a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a execução deste trabalho,
meu muito obrigada!
“Não fiquem maravilhados diante do novo, nem assustados pelo que ontem vos
era desconhecido. Não recuem diante do mistério, mas procurem enfrentá-lo e
desvendá-lo... Não se considerem os únicos donos da verdade e do conhecimento,
pois um diploma não faz o cientista. Somente assim poderão cumprir sua missão,
ser úteis ao próximo... E façam tudo com amor, pois será um dia esplêndido
aquele em que dos progressos da ciência, participará também o coração”
(Pasteur)
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
1
1. INTRODUÇÃO
A tripanosomíase americana, esquizotripanose ou doença de Chagas,
descoberta e descrita por Carlos Chagas em 1909 é uma zoonose causada pelo
hemoflagelado denominado Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi e transmitida pelo
inseto triatomíneo (hemíptero hematófago da família Reduviidae). Esse protozoário
pertence ao subfilo Mastigophora, ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e
gênero Trypanosoma (Chagas 1909; Schmuñis 2000; Lana & Tafuri 2000; Rey
2001).
1.1. EPIDEMIOLOGIA
Segundo a OMS, existem entre 16 e 18 milhões de pessoas infectadas nas
Américas, desde o México, ao norte, até Argentina e Chile, ao sul, com 100 milhões
consideradas sob risco de contrair a doença de Chagas (Schmuñis 2000; Lana &
Tafuri 2000). Hoje, as estimativas da prevalência da infecção estão sendo
progressivamente revisadas para logo acima de 11 milhões. Muito desse sucesso na
diminuição da prevalência dessa doença se deve às iniciativas regionais em larga
escala para conter o nascimento dos vetores, o rastreamento de doadores de
sangue, detecção e tratamento de casos congênitos (Dias et al. 2002).
1.2. MORFOLOGIA
O T. cruzi apresenta principalmente as formas epimastigota, tripomastigota e
amastigota (Figura 1). A forma epimastigota caracteriza-se por ser alongada, com
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
2
cinetoplasto justanuclear e anterior ao núcleo e flagelo livre na porção anterior
(Figura 1A); essa é a forma de replicação no hospedeiro invertebrado (triatomíneo)
que se encontra na porção posterior do intestino e em cultura em meio líquido
(Chagas 1909; Lana & Tafuri 2000; Rey 2001).
A forma tripomastigota é alongada, com cinetoplasto posterior ao núcleo,
próximo da extremidade posterior, com flagelo que se estende por toda célula e
torna-se livre na porção anterior (Figura 1B). Nessa forma, observa-se um nítido
polimorfismo, podendo ser descritos dois tipos morfológicos polares, formas finas e
formas largas, que resultam em diferenças na evolução parasitológica, na patologia
e na resposta do parasitismo a diferentes substâncias. A forma tripomastigota é
encontrada na circulação sanguínea do hospedeiro vertebrado, podendo estar
presente também nos espaços intersticiais, no líquido cefaloraquidiano, leite,
esperma e em cultura de células. Os tripomastigotas metacíclicos são
morfologicamente semelhantes às formas tripomastigotas, sendo as formas
infectantes liberadas nas fezes do vetor (Chagas 1909; Lana & Tafuri 2000; Rey
2001).
A forma amastigota é arredondada ou ovalada, com um flagelo curto que não
se exterioriza (Figura 1C). É a forma de replicação no hospedeiro vertebrado,
presente no interior de vários tipos de células, mas predominantemente nas fibras
musculares estriadas e lisas e no sistema fagocítico mononuclear e em cultura de
células (Chagas 1909; Lana & Tafuri 2000; Rey 2001).
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
3
Figura 1: Morfologia do Trypanosoma cruzi: A) forma epimastigota, B) forma
tripomastigota
e C) forma amastigota.
Fonte: A) http://www.uta.edu/chagas/html/biolTcru.html e http://www.ciens.ula.ve/~biolprot/protozoo/tcformas.htm; B)
http://www.uta.edu/chagas/html/biolTcru.html e http://www2.nau.Edu/~fpm/research/res.html; C) http://www.uta.edu/chagas/
html/biolTcru.html e http://www.ucm.es/info/parasito/aTLAS.htm - acesso em 08/01/05.
A
B
C
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
4
1.3. CICLO BIOLÓGICO E TRANSMISSÃO
A Figura 2 representa o ciclo biológico da Doença de Chagas. Há
multiplicação de formas epimastigotas no intestino posterior do vetor (A). Na ampola
retal, os parasitas diferenciam-se em tripomastigotas metacíclicos (B) que são
eliminados com as fezes (C). Ao penetrar no hospedeiro vertebrado, os flagelados
invadem células do sistema fagocítico mononuclear cutâneo (D) onde, sob a forma
amastigota, voltam a multiplicar-se e aí passam para o sangue, como
tripomastigotas (E). Os parasitas disseminam-se pelo organismo atacando músculos
e outros tecidos (F). O ciclo fecha-se quando o paciente é picado por outro
triatomíneo (G) e as formas sanguíneas chegam ao intestino do vetor (H) (Rey
2001).
Figura 2: Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi.
Fonte: http://www.who.int/tdr/diseases/ chagas/lifecycle.htm – acesso em 08/01/05
A
B
C
D
E
F
G
H
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
5
Existem 3 ciclos de transmissão vetorial, doméstico, silvestre e peridoméstico.
O ciclo de maior importância epidemiológica é o doméstico, já que perpetua a
infecção em seres humanos. Nesse ciclo, o vetor cresce e multiplica-se em fendas
nas paredes, buracos no telhado, debaixo e atrás de móveis, quadros e outros
pontos das residências com paredes de barro ou tijolo crú e telhados de palha ou
junco (Chagas 1909; Dias 2000).
Os principais mecanismos de transmissão são pelo contato de fezes e urina
de triatomíneos contaminados (principais gêneros são Rhodnius, Triatoma e
Panstrongylus), transfusões sanguíneas e transmissão congênita (Chagas 1909;
Lana & Tafuri 2000).
1.4. A DOENÇA DE CHAGAS
A doença de Chagas apresenta duas fases, aguda e crônica, podendo ser
sintomática (aparente) ou assintomática (inaparente), sendo esta a mais freqüente,
90-98% dos pacientes. A fase aguda inicia-se através de manifestações locais,
quando o T. cruzi penetra na conjuntiva (sinal de Romaña) ou na pele (chagoma de
inoculação), aparecendo dentro de 4 a 10 dias após a picada do triatomíneo,
regredindo em 1 ou 2 meses. A fase crônica pode ser assintomática, em 50-69% dos
pacientes, ou sintomática, podendo apresentar uma forma cardíaca (13%), digestiva
(10%) ou formas mistas (8%) (Chagas 1909; Lana & Tafuri 2000; Brener 2000).
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
6
1.5. DIAGNÓSTICO CLÍNICO E LABORATORIAL
O diagnóstico da infecção pelo T. cruzi deve ser apoiado pela epidemiologia e
pela clínica e confirmado, quanto à etiologia, pelo diagnóstico laboratorial.
Elementos importantes para a suspeita da etiologia chagásica são a região de
procedência do paciente ou o fato de ter vivido ou pernoitado em casas onde havia
triatomíneos, além de levar em conta o fato do paciente ter recebido transfusões
sanguíneas, mesmo fora das áreas endêmicas. A presença dos sinais de porta de
entrada (sinal de Romaña e/ou chagoma de inoculação), acompanhados de febre
irregular ou ausente, adenopatia-satélite ou generalizada, hepatoesplenomegalia,
taquicardia, edema generalizado ou dos pés fazem suspeitar da fase aguda da
doença. As alterações cardíacas acompanhadas de sinais de insuficiência cardíaca
confirmada pelo eletrocardiograma e as alterações digestivas e do esôfago e do
cólon (reveladas por raios X) fazem suspeitar da fase crônica (Lana & Tafuri 2000;
Brener 2000; Rey 2001).
Os métodos de diagnóstico laboratorial apresentam diferentes resultados se
aplicados na fase aguda ou crônica da infecção. Na fase aguda, observa-se alta
parasitemia, presença de anticorpos inespecíficos e início de formação de anticorpos
específicos (IgM e IgG) que podem atingir níveis elevados. Nessa fase recomenda-
se a pesquisa direta do parasita (a fresco, micro-hematócrito, gota espessa, etc) e,
se necessário, pesquisa indireta (xenodiagnóstico, hemocultura, PCR, etc) (Lana &
Tafuri 2000; Luquetti & Rassi 2000; Rey 2001).
Na fase crônica observam-se baixíssima parasitemia e presença de
anticorpos específicos (IgG). Assim, recomendam-se métodos sorológicos (IFI,
ELISA, HAI) ou a pesquisa do parasita por métodos indiretos (xenodiagnóstico,
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
7
hemocultura, PCR, etc), que são necessários em caso de sorologia duvidosa ou
quando se deseja verificar a eficácia do tratamento (Lana & Tafuri 2000; Luquetti &
Rassi 2000; Rey 2001).
1.6. TERAPÊUTICA
A terapêutica da Doença de Chagas continua parcialmente ineficaz, apesar
dos esforços que vêm sendo desenvolvidos por vários laboratórios e pesquisadores.
Diversas substâncias vêm sendo testadas em animais e, algumas delas têm sido
usadas no homem, mas nenhuma consegue suprimir a infecção pelo T. cruzi e
promover uma cura definitiva em todos os pacientes tratados (Lana & Tafuri 2000).
No momento, somente dois medicamentos estão disponíveis para o
tratamento da doença, o benznidazol (Rochagan - grupo dos nitroimidazóis) e o
nifurtimox (Lampit
- grupo dos nitrofuranos), que não resultam na cura definitiva.
No Brasil, o nifurtimox foi retirado do mercado devido a seus efeitos colaterais,
sendo o benznidazol a única alternativa para o tratamento. A eficiência desses
fármacos varia com a linhagem do parasita, possuem efeitos colaterais e devem ser
utilizados com cautela e acompanhamento criterioso (Lana & Tafuri 2000; Rey
2001).
1.7. BIOLOGIA MOLECULAR DO T. cruzi
1.7.1. O GENOMA DE T. cruzi
Como ocorre nos eucariotos, o T. cruzi possui dois genomas distintos,
situados em dois compartimentos celulares bem definidos: o núcleo e a mitocôndria.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
8
Nos tripanosomatídeos, a mitocôndria alberga uma complexa rede de moléculas
circulares de DNA denominada de kDNA. O conteúdo total de DNA (DNA nuclear +
kDNA) do T. cruzi varia intensamente entre as diferentes cepas e clones, existindo
inclusive variações entre clones derivados de uma mesma cepa (Franco da Silveira
2000).
O tamanho do genoma do T. cruzi (100-200 X 10
6
pb) é relativamente
superior ao tamanho dos genomas de outros protozoários parasitas, como por
exemplo, Leishmania (33,6 X 10
6
pb – http://www.sanger.ac.uk/Projects/L_major,
2003) ou T. brucei (35 X 10
6
pb - http://www.sanger.ac.uk/Projects/T_brucei, 2004).
Porém, sua complexidade é significativamente inferior à do genoma humano (3.000
X 10
6
pb) (Franco da Silveira 2000).
A organização da cromatina dos tripanosomas difere em vários aspectos
daquela encontrada nos eucariotos complexos e mesmo em outros protistas. Os
cromossomos dos tripanosomas não se condensam durante a divisão celular e a
segregação dos cromossomos para as células-filhas, durante a divisão celular,
ocorre intranuclearmente, sem a dissolução da carioteca ou membrana nuclear
(endomitose). A divisão celular nos tripanosomas ocorre através do mecanismo
mitótico (Solari 1995).
O cariótipo do T. cruzi parece ser estável nas diferentes formas evolutivas do
parasita. Existe o consenso de que o cariótipo das formas epimastigotas seja
representativo das demais formas evolutivas do parasita. Apesar disso, existem
relatos de alterações na localização dos genes que codificam o RNA da sequência
líder durante o cultivo prolongado do parasita (Wagner & So 1990). Tem sido
relatada a existência de intenso polimorfismo cromossômico entre cepas e clones de
T. cruzi (Henriksson et al. 1996).
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
9
O genoma nuclear do T. cruzi, tal como ocorre em outros eucariotos, é
composto por sequências de DNA que podem ser agrupadas em 3 classes
majoritárias: a) sequências que codificam proteínas, b) sequências que codificam
RNAs e c) sequências repetitivas (DNA repetitivo), as quais, de maneira geral, não
são transcritas. Deve-se também levar em conta a presença de sequências
espaçadoras existentes entre genes codificadores de proteína ou RNA que podem
conter elementos reguladores da transcrição (promotores, ativadores etc) (Franco da
Silveira 2000).
As seqüências repetitivas representam cerca de 44% do genoma nuclear e
podem aparecer agrupadas ou dispersas no genoma. Embora a maioria das
sequências repetitivas não sejam codificadoras, alguns genes de proteínas ou RNAs
contribuem para a formação da fração repetitiva do genoma como, por exemplo, o
RNA da sequência líder que possui mais de 200 cópias dispersas no genoma
(Franco da Silveira 2000).
Muitas seqüências repetitivas estão organizadas em tandem (micro e mini-
satélites, os genes de rRNAs, RNA da sequência líder, tubulina etc), isto é, as
repetições aparecem dispostas uma após a outra de maneira regular e periódica.
Esses agrupamentos podem estar distribuídos em diferentes cromossomos, e o
número de cópias da repetição pode variar de um agrupamento para outro. Os
microssatélites são pequenas sequências de DNA (~6 nts), arranjadas em tandem e
dispersas em um grande número de loci no genoma. Apresentam elevado grau de
polimorfismo, principalmente no que diz respeito ao número de repetições em um
dado locus. Por esse motivo, os microssatélites são extremamente úteis em estudos
filogenéticos, taxonômicos e genéticos (Requena 1996).
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
10
No genoma de T. cruzi, os genes codificadores de proteína podem ser
encontrados em cópia única ou duplicados. A maioria dos genes codificadores de
proteínas ou RNA caracterizados em T. cruzi estão presentes em duas ou mais
cópias, as quais podem estar localizadas em uma única região do cromossomo ou
em diferentes cromossomos. É importante notar que as cópias duplicadas de um
determinado gene podem apresentar divergências entre si, consequência do
processo evolutivo. Os dados disponíveis sugerem haver correlação entre o número
de cópias de um dado gene do T. cruzi e a concentração de seu produto (RNA ou
proteína) na célula (Franco da Silveira 2000).
A tendência do tripanosoma em duplicar os seus genes e agrupá-los em
tandem poderia estar relacionada com a compensação de eventuais perdas de
genes essenciais durante as constantes mudanças do genoma (amplificação e
translocação das sequências gênicas) e com a transcrição policistrônica, já que o
arranjo em tandem facilitaria a síntese e manutenção dos níveis de mRNAs na célula
(Silveira 2000). Além disso, há alguma correlação entre o número de cópias de um
gene e a quantidade de seu produto na célula. Proteínas e RNAs altamente
abundantes (Ex: tubulina, Hsp 70, histonas, etc) são codificados por genes múltipla
cópia (Michels et al. 1990).
Nos tripanosomas o cinetoplasto, que está localizado próximo à base do
flagelo, corresponde a uma condensação de DNA localizada no interior de uma
mitocôndria única e ramificada por todo o corpo do protozoário, albergando
moléculas circulares de DNA (kDNA) denominadas de mini e maxicírculos (Simpson
1987).
No T. cruzi, o kDNA representa cerca de 20-25% do DNA total da célula, e é
composto por dois tipos de moléculas circulares, que diferem em tamanho e função,
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
11
denominadas de minicírculo e maxicírculo. Os minicírculos possuem cerca de 1.400
pb e estão presentes em 10.000 a 20.000 cópias por célula. O número e tipos de
classes de minicírculos podem variar entre as diferentes cepas ou isolados do
parasita. As sequências presentes no minicírculo não são traduzidas em peptídeos,
mas seqüências variáveis são transcritas gerando pequenos RNAs denominados de
gRNAs (RNA guia), que estão envolvidos no processo de editoração dos mRNAs
das enzimas mitocondriais (Macina et al. 1985, Falasca et al. 1990).
Os maxicírculos possuem cerca de 40.000 pb de tamanho, e o número de
cópias por células varia de 20 a 50. Os genes das proteínas mitocondriais e dos
rRNAs mitocondriais estão localizados no maxicírculo. Existem no maxicírculo cerca
de 15 genes que codificam as proteínas mitocondriais envolvidas na respiração
celular (Franco da Silveira 2000).
1.7.2. PROCESSAMENTO DOS RNAs
O estudo da expressão gênica dos tripanosomatídeos tem revelado a
existência de mecanismos genéticos peculiares, como, por exemplo, a organização
dos genes de proteínas em unidades transcricionais policistrônicas, o
processamento dos transcritos através de trans-splicing e a editoração (editing) do
RNA (Franco da Silveira 2000).
A maioria dos transcritos dos genes presente no maxicírculo só pode ser
traduzida em proteínas após a adição ou deleção de resíduos de uridina através de
um processo conhecido como editoração. Trata-se de um mecanismo distinto do
trans-splicing, pois, com a adição ou deleção de uridinas tem-se a formação de um
mRNA, cuja seqüência de nucleotídeos não é mais exatamente aquela codificada
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
12
pelo gene. A editoração é uma reação intermolecular que envolve duas entidades
diferentes, que são o mRNA codificado pelo gene do maxicírculo e o gRNA (guide
RNA) codificado por um gene do minicírculo (Franco da Silveira 2000).
Em tripanosomas, leishmanias e espécies relacionadas, todos os RNAs são
processados por um mecanismo não usual denominado trans-splicing. As regiões de
dois transcritos separados (em lugar de um único pré-mRNA) são unidas de modo
que todo o mensageiro maduro inicia com a mesma sequência (aproximadamente
40 nucleotídeos), denominada spliced leader (SL) (Tschudi & Ullu 1990; Nilsen 1995;
Peris et al. 1997; Sturm & Campbell 1999; Sturm & Yu 1999; Liang et al. 2003). O SL
é derivado de um RNA de 110 nts codificado por genes localizados em um ou dois
cromossomos, dependendo da cepa de T. cruzi. O RNA da SL é clivado e uma
porção resultante de 39 nts é transferida para a região 5’ do mRNA nascente. A
região 5’ do pré-mRNA também é clivada em um sítio específico (nucleotídeo
consenso AG) e substituída pelo SL. Como os RNAs mensageiro e SL são
codificados por genes situados em diferentes sítios do genoma, o processo foi
denominado de trans-splicing (Figura 3A). A reação de trans-splicing é catalisada por
um complexo multienzimático constituído por enzimas específicas (endonucleases,
ligases, etc) e ribonucleoproteínas (U2, U4, U5 e U6 snRNP); U1 snRNP parece ser
exclusiva do cis-splicing (Figura 3B) (Liang 2003).
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
13
Figura 3: Mecanismo de trans-splicing (A) e cis-splicing (B).
GU
SL
// A AG GU //
Pré-mRNA
// A AG
G
U
// A AG
G
U
mRNA
maduro
A)
Pré-mRNA
maduro
GU
éxon 1
A AG GU //
Pré-mRNA
éxon 2
íntron
A AG
G
U
A AG
G
U
B)
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
14
O trans-splicing envolvendo SL está caracterizado em tripanosomas (Sutton &
Boothrody 1986), nemátodes (Nilsen 1989), trematodos (Rajkovic et al. 1990),
euglenóides (Frantz et al. 2000) e em cordados (Vandenberghe et al. 2001) e
requerem, em adição ao SL RNP, as pequenas ribonucleoproteínas U2, U4/U6 e U5;
a sequência SL é transferida por uma partícula RNP (ribonucleoproteína) que
contém domínio semelhante a snRNP de mamífero, incluindo sítio de ligação Sm
(Sm-binding site), embora SL RNP não seja reconhecida por autoanticorpos
humanos anti-Sm (Palfi & Bindereif 1992).
SL está teoricamente presente em todos os mRNAs do tripanosoma e sua
função exata ainda não é conhecida. Existem evidências de que SL confere
estabilidade ao mRNA, impedindo a sua degradação, auxiliando também a interação
do mRNA com os ribossomos. Transcritos desprovidos de SL perdem a sua
estabilidade e não são traduzidos (Ullu et al. 1996)
Tal como ocorre nos eucariotos, os mRNAs dos tripanosomas apresentam na
sua extremidade 3’ uma cauda composta por cerca de 30 resíduos de adenina
(cauda poli-A). Porém, ao contrário dos eucariontes superiores, os mRNAs dos
tripanosomatídeos não apresentam uma sequência consenso para adição de
resíduos de adenina. Os genes em tandem estão separados por espaçadores
intergênicos relativamente curtos (100-300 pb), que contêm regiões ricas em
resíduos de pirimidina (citosina, timina) envolvidos no controle da transcrição. A
distância entre a região rica em pirimidinas e o sítio consenso (AG) para trans-
splicing tem influência sobre a adição da cauda poli-A (Franco da Silveira 2000).
Os dados disponíveis indicam que o controle da transcrição no T. cruzi deve
operar principalmente em nível pós-transcricional. A clivagem das regiões
intergênicas do transcrito primário, com adição de SL e da cauda poli-A, deve
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
15
ocorrer à medida que o transcrito primário está sendo sintetizado (Franco da Silveira
2000).
Em tripanosomas, o trans-splicing tem papel importante na resolução de
unidades de transcrição policistrônicas (transcrito contendo diferentes mensagens,
sob controle de um único promotor) em mRNAs individuais; tais mRNAs de
transcritos policistrônicos são gerados pelo processamento de 5’ através de trans-
splicing do SL e processamento 3’ por clivagem e poliadenilação (Pays et al. 1994).
1.7.3. AS RIBONUCLEOPROTEÍNAS
As ribonucleoproteínas (snRNPs – U1, U2, U4/U6 e U5, principalmente),
complexos que consistem de pequenos RNAs ricos em uridina (UsnRNAs) unidos
fortemente à proteínas, são fatores importantes no funcionamento das células
eucariotas. Esses snRNAs apresentam diferentes tamanhos e formas, podendo ser
muito abundantes (cerca de 10
7
cópias por célula de mamífero, tanto quanto os
ribossomos) e altamente conservadas de leveduras ao homem. Além disso, esses
pequenos RNAs possuem um sítio Sm rico em uridina composto por duas regiões
conservadas chamadas de Sm1 e Sm2, separadas por uma região não-conservada
(Hermann et al. 1995; Séraphin 1995). Esse sítio Sm codifica para um domínio
comum (domínio Sm) responsável por mediar as interações com as proteínas Sm.
As proteínas unidas aos snRNAs podem ser classificadas em dois grupos: as
específicas que estão associadas somente a determinadas snRNPs e sete proteínas
Sm (B/B’, D1, D2, D3, E, F e G isoladas do extrato nuclear de células HeLa,
apresentando pesos moleculares de 28,0/29,0; 16,0; 16,5; 18,0; 12,0; 11,0; 9,0 kDa
e pI de 10,6/10,7; 10,5; 8,0; 8,0; 10,3; 3,3; 8,8; respectivamente) que são comuns
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
16
para todas as partículas (Figura 4) (Luhrmann et al. 1990, Burge et al. 1999, Stark et
al. 2001).
Figura 4: Esquema de U1 snRNP. m
3
G: cap trimetilguanosina; B, D1, D2, D3, E, F e
G: proteínas Sm; asterisco: proteínas específicas de U1 snRNP.
Em tripanosomatídeos, os UsnRNAs são transcritos pela RNA polimerase III e
recebem um cap de 7-metilguanosina (m7G) na extremidade 5’ adicionado pela
enzima guaniltransferase que, associada à RNA polimerase, transfere GMP a partir
de GTP para um grupamento difosfato na extremidade 5’ promovendo uma ligação
5’→5’ (Lodish et al. 2000). O cap 5’ protege o mRNA da ação das exorribonucleases
5’ além de ter papel importante na tradução e processamento dos mRNAs, e
portanto, do processo de splicing, sendo extremamente importante para que ocorram
interações eficientes da U6 snRNA ao sítio de splice 5’ (O’Mullane et al. 1998). Os
snRNAs são então exportados do núcleo para o citoplasma da célula, associando-se
a sete proteínas Sm, gerando o snRNP core com estrutura semelhante a um anel
em torno do sítio Sm e que é essencial para a estabilidade metabólica do snRNP,
importação da partícula para o núcleo e ligação às proteínas específicas (Will &
Lührmann 2001). A U6 snRNP interage com U4 snRNP pelo pareamento dos
*
*
*
U1 snRNA
Sítio Sm
Will & Lürhmann 2001
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________
17
snRNAs, formando U4/U6 snRNP; proteínas LSm (Sm-like) facilitam a interação in
vitro (Achsel et al. 1999). Já os pré-mRNAs recebem o cap 5’ durante o trans-
splicing, quando a sequência SL capped de 39 nucleotídeos é transferida, a partir de
um SL RNA, para a extremidade 5’ de cada RNA mensageiro (Marchetti et al. 1998).
Desde a descoberta do trans-splicing em tripanosomas, acreditou-se que
esses organismos perderam a maquinária para realizar o cis-splicing. Isto foi
baseado na ausência aparente de sequências intercalantes (íntrons) e de U1
snRNA, que no cis-splicing promove interações de pares de bases na região 5’
splice site durante a formação do spliceosome inicial. Mais recentemente, um
candidato a U1 snRNA foi identificado em Chritidia fasciculata, Leishmania
tarentolae e Trypanosoma brucei, que possuem alta similaridade entre si, além de
apresentar uma estrutura cap de trimetilguanosina (TMG) e estar complexada a
proteínas core comuns, semelhante às outras U1 já estudadas; além disso,
sequências intervenientes foram descritas no gene PAP de T. brucei e T. cruzi
(Schnare & Gray 1999, Mair et al. 2000, Djikeng et al. 2001, Palfi et al. 2002). A
sequência de U1 snRNA encontrada em T. brucei é extremamente pequena
(aproximadamente 70 nucleotídeos) em relação aos outros U1 snRNAs (139 a 568
nucleotídeos) (Djikeng et al. 2001; Palfi et al. 2002). Uma questão importante a ser
respondida relaciona-se com a participação dessa U1 snRNA em reações de cis-
splicing em tripanosomatídeos.
Embora bem definidos em mamíferos, as ribonucleoproteínas não estão bem
caracterizadas em certos tripanosomatídeos como o Trypanosoma cruzi. No intuito
de aprender mais sobre os fatores de splicing (principalmente as UsnRNPs), que
possam estar envolvidas na reação de trans-splicing em tripanosomatídeos, este
trabalho propôs a caracterização dos snRNAs de T. cruzi (U2, U4, U5 e U6), visando
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
18
contribuir futuramente para o conhecimento de seu papel no processamento dos
mRNAs de T. cruzi e consequentemente na interação hospedeiro-parasita. Além
disso, uma área de interesse básico e com aplicação prática direta é a descoberta
de novos pontos de ataque quimioterápico, levando em consideração os
mecanismos de resistência a drogas, já que se trata de um mecanismo de
processamento dos RNAs diferente do observado no homem. Este trabalho poderá
contribuir para estudos nesse aspecto.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM Trypanosoma cruzi – Objetivos _______
19
2. OBJETIVOS
1) Obtenção de U1, U4, U5 e U6 snRNAs da cepa Y de Trypanosoma cruzi por
PCR e RT-PCR, utilizando DNA genômico e RNA total do parasita,
respectivamente;
2) Clonagem e sequenciamento dos produtos obtidos, seguidos de análises em
bancos de dados, alinhamentos das seqüências com as de outros organismos,
predição de estrutura secundária e filogenia;
3) Alinhamento, predição de estrutura secundária e filogenia da seqüência de U2
snRNA anteriormente obtida no laboratório.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
20
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Parasita
- Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y) cultivados em meio LIT.
3.2. Soluções e reagentes
Para Extração de RNA total de T. cruzi
- Tampão de lavagem: 100 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 3 mM MgCl
2
.
- Reagente Trizol (Invitrogen)
- Clorofórmio
- Isopropanol
- ETOH 100% e 70%
- H
2
O DEPC: Adicionar 0,1% de Dietilpirocarbonato (DEPC – Sigma), deixar
agitando “overnight” e autoclavar a 121
o
C e 1 atm por 20 min.
- Tampão formamida: 0,025% xylene cyanol; 0,025% Azul de Bromofenol;
Formamida deionizada q.s.p.
Para gel de poliacrilamida 10% com uréia
- Acrilamida/ bis-acrilamida 40%: 40% acrilamida; 1,3% bis-acrilamida.
- TBE [10X]: 890 mM Tris base; 890 mM ácido bórico; 20 mM EDTA. Acertar o pH
para 8,3 e autoclavar a 121
o
C e 1 atm por 15 min.
- TEMED
- APS 10%: solução de Perssulfato de amônio 10%.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Materiais e Métodos _______
21
- PAGE 10% com uréia: 7 M uréia; 1% Acrilamida/ bis-acrilamida 40%; TBE [0,5X].
Para a polimerização, adicionar 0,1% TEMED e 1% APS 10%.
Para Eluição de RNA de gel de poliacrilamida com uréia
- Tampão de extração: 2 M acetato de amônio; 1% SDS; 20
µ
g/ml glicogênio.
- 1-butanol
- ETOH 100% e 70%
- H
2
O DEPC
Para adição de cauda poli-A
- Tris-HCl 1M pH 7,5
- NaCl 5M
- MgCl
2
1M
- MnCl
2
50 mM
- ATP 10 mM
- BSA 10 µg/µl
- Poli-A polimerase 5 U/µl
- Fenol/ clorofórmio/ isoamilálcool
- glicogênio 20 mg/ml
- SET [20X]: 3M NaCl; 20 mM EDTA pH 8,0; 0,6 M Tris-HCl pH 8,0
- ETOH 100% e 70%
- H
2
O DEPC
Para Reação de RT
- kit 3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Invitrogen)
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
22
- kit Ominiscript RT (Qiagen)
Para Extração de DNA genômico de T. cruzi
- Reagente DNAzol (Invitrogen)
Para gel de agarose
- gel 1-2%: 1-2% agarose; TAE [1X] q.s.p. Aquecer até a dissolução completa.
Adicionar 0,5 µg/ml de BrEt.
- gel 4%: 1% agarose; 3% agarose Low Melting Point; TAE [1X] q.s.p. Aquecer até a
dissolução completa. Adicionar 0,5
µ
g/ml de BrEt.
- TAE [50X]: 2M Tris base; 5,7% Ácido acético glacial; 50 mM EDTA (pH 8,0).
- Dye Front (tampão de amostra): 0,25% Azul de bromofenol; 0,25% Xylene Cianol
FF.
Para Reação de PCR
- Tampão PCR [10X]
- MgCl
2
50 mM
- dNTP 10 mM
- primers: TcU4 dir 100 ng/
µ
l (5’- AAGCCTTGCGCAGNGAG -3')
TcU4 inv 100 ng/µl (5’- GCGGTAGGTGTCAAATATTC -3')
TcU5 dir 100 ng/µl (5’- GCATCATCATTTCGACTT -3')
TcU5 inv 100 ng/
µ
l (5’- GTTTAAATTGTTTGGGC -3')
TcU6 dir 100 ng/µl (5’- GTCAMAGCGAAGGACATC -3')
TcU6 inv 100 ng/µl (5’- AAAGCCATATCTCTCGAA -3')
forward 10 pmol/µl (5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Materiais e Métodos _______
23
reverse 10 pmol/µl (5’-AACAGCTATGACCATG-3’)
- Taq DNA Polimerase [5 U/µl] (Amersham Biosciences)
Para Extração de produto de PCR de gel de agarose
- kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen)
Para adição de dATP ao inserto
- Tampão PCR [10X]
- dATP 10 mM
- Taq DNA polimerase [5 U/
µ
l]
Para Reação de Clonagem
- kit TOPO TA Cloning for Sequencing (Invitrogen)
- Solução de CaCl
2
: 60 mM CaCl
2
; 10 mM MOPS (pH 7,0); 15% glicerol. A solução é
esterilizada por filtração em membrana de 0,22
µ
m.
- Kanamicina [10 mg/ml]
Para Extração de DNA plasmidial (miniprep)
- ampicilina [25 mg/ml]
- Solução I: 50 mM glicose; 25 mM Tris-HCl (pH 8,0); 10 mM EDTA. Autoclavar por
15 min.
- Solução II: 0,2 M NaOH; 1% SDS
- Solução III: 3M Acetato de potássio; 11,5% Ácido acético glacial
- Fenol/Clorofórmio
- ETOH 100% e 70%
- TE: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0).
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
24
- RNase A 10 mg/ml (Gibco BRL)
Para Reação de Sequenciamento
- primers: forward 1,6 pmol/µl (5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)
reverse 1,6 pmol/
µ
l (5’-AACAGCTATGACCATG-3’)
- Tampão Save Money: 200 mM Tris-HCl (pH 9,0); 5 mM MgCl
2
- Loading buffer: 5,5% Lane Code Even ou Odd (Applied Biosystem); 11,1% Loading
Color Even ou Odd (Applied Biosystem); 83,4% Formamida deionizada.
- Big Dye Terminator (Applied Biosystem)
- isopropanol 75%
3.3. Meios de cultura
- LB: 1% Triptone; 0,5% Yeast Extract; 1% NaCl. Autoclavar a 121
o
C/ 1 atm por 30
min.
- LB agar: 1% Triptona; 0,5% Extrato de levedura; 1% NaCl; 2% ágar. Autoclavar a
121
o
C/ 1 atm por 30 min.
- SOB: 2% Triptona; 0,5% Extrato de levedura; 8,5 mM NaCl; 2,5 mM KCl. Ajustar o
pH para 7,0 e autoclavar por 30 min. (121
o
C/ 1 atm).
- SOC: SOB suplementado com 10 mM Glicose e 20 mM MgCl
2
.
- LIT: 68,4 mM NaCl; 5,4 mM KCl; 56,3 mM Na
2
HPO
4
; 111 mM Dextrose; 0,3% Liver
Infusion Broth; 0,5% Tryptose; 25 mg/L Haemin. Incubar a 68
o
C por 1 hora. Esperar
esfriar e medir o pH que deve ser 7,2. Filtrar em membrana de 0,22 µm. Adicionar
10% de Soro Fetal Bovino estéril.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Materiais e Métodos _______
25
3.4. Cultura de Trypanosoma cruzi
As formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi (Silva & Nussenzweig 1953)
foram cultivadas em meio LIT, incubando em estufa a 28
o
C. Essa cepa é mantida
no laboratório, realizando-se repiques a cada 15 dias.
3.5. Extração de RNA total de
T. cruzi
- Uma cultura de 50 ml de formas epimastigotas de T. cruzi em meio LIT (~10
8
-10
9
parasitas/ml) foi centrifugada por 10 min. a 4
o
C e 1.500 g;
- O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em 1 ml do tampão de
lavagem, centrifugando novamente por 1 min. a 2.500 g. Essa lavagem foi repetida
mais uma vez;
- Após descartar o sobrenadante foi adicionado 1 ml de Trizol, levando ao vórtex por
1 min. para o rompimento dos parasitas;
- O RNA foi extraído com 200 µl de clorofórmio, centrifugando por 10 min. à TA e
10.000 g;
- A fase superior foi retirada e colocada em um novo tubo para precipitação com 500
µ
l de isopropanol, misturando por inversão e centrifugando em seguida a 4
o
C e
10.000 g por 10 min.;
- O sedimento foi lavado com 1 ml de ETOH 70% e ressuspenso em 100 µl de H
2
O
DEPC.
- A amostra foi analisada após eletroforese em PAGE 10% com uréia, corado com
BrEt e visualizado em transiluminador UV.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
26
3.6. Eluição de RNA de gel de poliacrilamida com uréia
- O gel de poliacrilamida com uréia contendo o RNA foi colocado em tubo com 200 µl
de tampão de extração e incubado a 37
o
C por 1 hora e 30 min.;
- Foi dado um pulso em centrífuga e o tampão foi transferido para um novo tubo para
extração com 200 µl de 1-butanol, homogeneizando em vórtex e centrifugando em
seguida por 5 min. à TA e 10.000 g;
- A fase superior foi descartada e o restante precipitado com 1 ml de ETOH 100%,
centrifugando a 4
o
C e 10.000 g por 15 min.;
- O sedimento foi lavado com 100 µl de ETOH 70%, centrifugando por 5 min. à 4
o
C
e 10.000 g;
- o sedimento foi seco e ressuspenso em 20 µl H
2
O DEPC.
3.7. Adição de cauda poli-A
- Foram adicionados em microtubo de 1,5 ml: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 250 mM
NaCl; 10 mM MgCl
2
; 2,5 mM MnCl
2
; 0,25 mM ATP; 0,5 µg/µl BSA; 6,9 U Poli-A
polimerase e 4 ng/
µ
l RNA, incubando a 37
o
C por 30 min;
- 50 µl H
2
O DEPC e 100 µl fenol/clorofórmio/isoamilálcool foram adicionados,
centrifugando por 5 min. a 4
o
C e 12.000 g;
- o RNA foi precipitado com 0,5
µ
l de glicogênio [20 mg/ml], 5
µ
l SET [20X] e 2,5 vol.
ETOH 100%, centrifugando por 15 min. a 4
o
C 12.000 g;
- Lavagem com 100 µl de ETOH 70%, centrifugando por 5 min. a 4
o
C e 12.000 g.
- o sedimento foi seco e ressuspenso em 13 µl H
2
O DEPC.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Materiais e Métodos _______
27
3.8. Reação de RT-PCR
A reação de RT-PCR foi realizada com 200 ng do RNA da cepa Y extraído do
PAGE e com adição de cauda poli-A. O kit 3’ RACE (Invitrogen) foi utilizado com o
primer TcU6 dir e enzima Ominiscript (Qiagen), seguindo o protocolo abaixo:
- Incubar 13 µl RNA (200 ng) a 65
o
C por 5 min. e colocar no gelo.
- Adicionar: 2,0 µl tampão [10X]; 2,0 µl dNTP 5 mM; 1,0 µl AP solution 10 µM; 1,0 µl
RNAsin [10 U/µl]; 1,0 µl Ominiscript RT; H
2
O DEPC q.s.p. 20 µl. Incubar a 37
o
C por
1 hora.
- Inativar a enzima a 93
o
C por 5 min. e colocar no gelo.
- A PCR foi realizada com 3 µl da reação de RT
- os produtos foram analisados em gel de agarose 4%, corado com BrEt e
visualizados em transiluminador UV.
Obs: a enzima Ominiscript foi utilizada ao invés da enzima presente no kit
(SuperScript), por ser uma enzima mais eficiente para desfazer loops internos da
molécula de RNA.
3.9. Extração de DNA genômico de
T. cruzi
O DNA genômico de uma cultura de 50 ml de formas epimastigotas de T.
cruzi em meio LIT (10
8
-10
9
parasitas/ml) foi extraído com o reagente DNAzol
(Invitrogen), seguindo as especificações do fabricante. A amostra foi analisada após
eletroforese em gel de agarose 1%, corado com BrEt e visualizada em
transiluminador UV.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
28
3.10. Reação de PCR
Adicionou-se em tubos de 0,2 ml:
1,0 µl DNA 100 ng/µl
5,0
µ
l tampão de PCR [10X]
1,5 µl MgCl
2
50 mM
1,0 µl dNTP 10 mM
1,0
µ
l primer dir [100 ng/
µ
l]
1,0 µl primer inv [100 ng/µl]
0,5 µl Taq DNA polimerase [5 U/µl]
H
2
O q.s.p. 50
µ
l
A reação foi colocada em termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Perkin
Elmer), seguindo o ciclo abaixo:
94
o
C – 5 min.
94
o
C – 1 min.
53
o
C – 1 min. 30 X
72
o
C – 1 min. 40 seg.
72
o
C – 5 min.
4
o
C - ∞
Os produtos da reação de PCR foram analisados após eletroforese em gel de
agarose 2% corado com BrEt e visualizados em transiluminador UV. As bandas
referentes aos produtos de PCR foram recortadas do gel de agarose e extraídas
utilizando o kit QIAquick gel extraction (Qiagen), seguindo as especificações do
fabricante.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Materiais e Métodos _______
29
3.11. Adição de dATP ao inserto
A adição de adenina na extremidade 3´ foi necessária para garantir a ligação
do inserto ao vetor TOPO TA. Foram adicionados em tubo de 0,2 ml:
7
µ
l do produto de PCR extraído do gel de agarose (~700 ng)
1 µl Tampão de PCR [10X]
1 µl dATP 10 mM
0,5
µ
l Taq DNA polimerase [5 U/
µ
l]
- A reação foi incubada a 72
o
C por 15 min. em termociclador Gene Amp PCR
System 9700.
3.12. Reação de Clonagem
3.12.1. Reação de Ligação
A reação de ligação do inserto com o vetor TOPO TA (Invitrogen) foi realizada
seguindo as especificações do fabricante.
3.12.2. Preparação de Bactérias Competentes
- Um pré-inóculo de 5 ml contendo bactérias DH5α, após crescimento “overnight”, foi
transferido para 50 ml de meio LB incubando-se a 37
o
C em estufa sob agitação até
que atingisse uma densidade óptica a 600 nm de 0,3;
- A cultura foi centrifugada por 10 min. a 4
o
C e 2.500 g e o sedimento ressuspenso
em 10 ml de solução de CaCl
2
;
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
30
- Novamente as bactérias foram centrifugadas por 10 min. a 4
o
C e 2.500 g e o
sedimento ressuspenso em 10 ml da solução de CaCl
2
, sendo mantidas em gelo
durante 1 hora;
- Centrifugou-se por 10 min. a 4
o
C e 2.500 g e o sedimento ressuspenso em 200µl
de solução de CaCl
2
;
- As bactérias foram aliquotadas em frações de 50 µl cada e congeladas a –80
o
C.
3.12.3. Reação de Transformação
- Após misturar 2 µl da reação de ligação com 50 µl de solução de CaCl
2
, foram
adicionados 50 µl das bactérias DH5α competentes e incubadas em gelo por 30 min;
- Foi realizado um choque térmico a 42
o
C por 2 min., retornando em seguida para o
gelo por 2 min. e à TA por mais 2 min.;
- Adicionou-se 500 µl de meio SOC, incubando-se a 37
o
C por 1 hora e 30 min. sob
agitação (150 rpm);
- As bactérias foram então cultivadas em placas de Petri contendo meio LB ágar com
50
µ
g/ml de kanamicina e incubadas a 37
o
C “overnight”.
3.13. PCR de colônia
- Uma pequena quantidade de bactérias presente em cada colônia foi suspensa em
20
µ
l de meio LB, separadamente.
- Em tubo de 0,2 ml foram adicionados: 5 µl da suspensão de bactérias; 5 µl Tampão
de PCR [10X]; 1,5 µl MgCl
2
50 mM; 1 µl primer forward; 1 µl primer reverse; 1 µl
dNTP 10 mM; 0,5
µ
l Taq DNA polimerase [5 U/
µ
l] e H
2
O q.s.p. 50
µ
l.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Materiais e Métodos _______
31
- As reações foram colocadas em termociclador Gene Amp PCR System 9700
seguindo o ciclo abaixo:
94
o
C – 1 min.
94
o
C – 30 seg.
52
o
C – 30 seg. 30 X
72
o
C – 30 seg.
72
o
C – 5 min.
4
o
C - ∞
- Os produtos foram analisados em gel de agarose 1% corado com BrEt e
visualizados em transiluminador UV.
Obs: o restante da suspensão de bactérias (15 µl) foi utilizada para fazer o repique.
3.14. Extração de DNA plasmidial (miniprep)
- As bactérias recombinantes foram repicadas em 5 ml de meio LB contendo 50
µg/ml de ampicilina e incubadas a 37
o
C, “overnight”, sob agitação.
- A cultura de 5 ml foi centrifugada, removeu-se o sobrenadante e o sedimento foi
ressuspenso em 100
µ
l da Solução I;
- 200 µl da Solução II foi adicionada, misturou-se por inversão 5X e incubou-se em
gelo por 5 min;
- 150 µl da Solução III foi adicionada, misturando em vórtex e incubou-se por 5 min.
em gelo;
- os tubos foram centrifugados por 15 min. a 4
o
C e o sobrenadante foi colocado em
um novo tubo;
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
32
- as amostras foram extraídas com 300 µl de fenol/clorofórmio, centrifugando por 5
min. e a fase superior foi retirada e colocada em um novo tubo;
- precipitou-se com 2 vol. ETOH 100%, incubando por 30 min. a –80
o
C e
centrifugando por 20 min. a 4
o
C, 10.000 g ;
- o sedimento foi lavado com 500
µ
l de ETOH 70%, centrifugando a 4
o
C por 5min.;
- o sedimento foi seco e ressuspenso em 50 µl de TE;
- 3 µl de RNAse A 10 mg/mL foi adicionado e incubou-se a 37
o
C por 1 hora;
- Adicionou-se 50
µ
l de H
2
O e 100
µ
l de fenol/clorofórmio, centrifugando 10 min;
- a fase superior foi colocada em um novo tubo e precipitada com 2 vol. ETOH
100%, incubando a –80
o
C por 30 min. e centrifugando por 20 min. a 4
o
C;
- o sedimento foi lavado com 100 µl de ETOH 70%, centrifugando por 5 min. a 4
o
C;
- o sedimento foi ressuspenso em 15
µ
L de H
2
O destilada, analisado após
eletroforese em gel de agarose 1%, corado com BrEt e visualizado em
transiluminador UV.
3.15. Reação de Sequenciamento
Para o sequenciamento dos plasmídios, foram adicionados os reagentes a
seguir:
4 µL DNA (400 ng)
2
µ
L Tampão Save Money
2 µL primer forward ou reverse [1,6 pmol/µl]
2 µl Big Dye Terminator
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Materiais e Métodos _______
33
40 X
Os tubos foram colocados em termociclador Gene Amp PCR System 9700, seguindo
o ciclo abaixo:
96
o
C – 2 min.
96
o
C – 30 seg.
52
o
C – 30 seg.
60
o
C – 4 min.
4
o
C - ∞
- Após a PCR, foi adicionado 80
µ
l de isopropanol 75% para precipitar o DNA,
deixando à TA por 15 min;
- As amostras foram centrifugadas por 15 min. (12.000 g, TA) e o sobrenadante
descartado;
- o sedimento foi lavado com 1 mL de ETOH 70%, centrifugando por 5 min. (12.000
g, TA);
- o sedimento foi então seco e ressuspenso em 2 µl de Loading buffer. As amostras
foram fervidas a 95
o
C antes de aplicar em PAGE 5% e a eletroforese foi realizada
em sequenciador automático ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Perkin Elmer).
3.16. Alinhamento, Filogenia e Estrutura secundária
O alinhamento múltiplo das sequências de UsnRNAs e as porcentagens de
identidade foram realizadas com o programa GeneDoc (Nicholas & Nicholas 1997).
Para os estudos de filogenia, as seqüências foram alinhadas utilizando-se o
programa BioEdit versão 7.0.0 (Hall 1999) e a árvore filogenética foi construída
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
34
utilizando o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versão 2.1
(Kumar et al. 2001), com metodologia de Distância (distância-p) e algorítimo
neighbor-joining. Foram utilizados valores de bootstrap de 1000 replicações.
A estrutura secundária dos UsnRNAs foi predita pelo programa mfold versão
3.1, disponível em http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Fluxograma _____________
35
4. FLUXOGRAMA DE TRABALHO
Cultura de T. cruzi (cepa Y)
Extração de
RNA total
Extração de
DNA genômico
PCR
Eluição das bandas
de interesse do PAGE
RT-PCR
Eluição do produto
do gel de agarose
Adição de dATP
ao inserto
Ligação em vetor
TOPO TA,
transformação e
plaqueamento
PCR de colônia
Sequenciamento
Miniprep
Alinhamento de sequências
(GeneDoc), estrutura secundária
(mfold) e filogenia (MEGA)
U4, U5 eU6 snRNA
U2 snRNA
Sequência banco
de dados (cód.
acesso
AY205287)
- Alinhamento de
sequências (GeneDoc)
- Estrutura secundária
(
mfold
)
- Filogenia (MEGA)
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
36
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. CONSTRUÇÃO DOS
PRIMERS
Para a amplificação de U1, U4, U5 e U6 snRNAs por RT-PCR, foram
desenhados primers específicos (programa GeneRunner versão 3.00) a partir das
sequências já conhecidas em T. brucei, que foram comparadas por BLAST com
banco de dados do Projeto Genoma de T. cruzi (http://www.tigr.org/ tdb/e2k1/tca1/);
conforme pôde ser observado na figura 5, U1, U4, U5 e U6 snRNAs de T. brucei
apresentaram 83%, 84%, 80% e 97% de identidade, respectivamente, com as
sequências existentes no banco de dados de T. cruzi.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
37
Figura 5: Comparação (BLAST) das sequências de snRNAs de T. brucei com o
genoma de T. cruzi.
Todas as sequências, com exceção de U6 snRNA, apresentaram identidade a
partir do nucleotídeo da posição 1. A sequência de U6 apresentou identidade a partir
do nucleotídeo da posição 13, dificultando a confecção de um dos primers. Assim,
optou-se por desenhar um primer com a sequência imediatamente anterior à
alinhada, referente ao clone depositado no banco de dados de T. cruzi, o qual
continha toda a seqüência de U6 snRNA (primer TcU6 dir).
T. cruzi
T. brucei
U1 T. brucei x T. cruzi (73 bases)
U4 T. brucei x T. cruzi (107 bases)
U5 T. brucei x T. cruzi (62 bases)
U6 T. brucei x T. cruzi (98 bases)
T. cruzi
T. brucei
T. cruzi
T. brucei
T. cruzi
T. brucei
T. cruzi
T. brucei
T. cruzi
T. brucei
T. cruzi
T. brucei
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
38
Caso não houvesse sucesso por RT-PCR, também foram construídos os
primers TcU4 inv, TcU5 inv e TcU6 inv para a amplificação direta do DNA genômico.
A composição dos primers sintetizados encontra-se abaixo:
snRNAs
Primers
U1
TcU1: 5’- AACTCACCTGCAGNGNGTCA -3’
U4
TcU4 dir: 5’- AAGCCTTGCGCAGCGAG -3'
TcU4 inv: 5’- GCGGTAGGTGTCAAATATTC -3'
U5
TcU5 dir: 5’- GCATCATCATTTCGACTT -3'
TcU5 inv: 5’- GTTTAAATTGTTTGGGC -3'
U6
TcU6 dir: 5’- GTCAMAGCGAAGGACATC -3'
TcU6 inv: 5’- AAAGCCATATCTCTCGAA -3'
Não foram construídos primers para U2 snRNAs, pois esta seqüência já foi
clonada anteriormente (Bosetto 2002).
5.2. REAÇÃO DE RT-PCR
Após a obtenção do RNA total de formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) e
corrida eletroforética, as bandas referentes aos snRNAs foram extraídas com intuito
de concentrar os RNAs de interesse, diminuindo-se assim a interferência de outros.
A figura 6 apresenta o RNA total das formas epimastigotas de T. cruzi, estando
indicadas as bandas que foram recortadas e extraídas para purificação.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
39
Figura 6: Eletroforese em PAGE 5% com uréia, corado com BrEt, contendo RNA
total da cepa Y de T. cruzi (em duplicata). As bandas extraídas estão indicadas na
figura.
Como os snRNAs não possuem cauda de poli-A, foi necessário adicioná-la
para a utilização do kit 3´RACE (Life Technologies), seguindo-se as instruções do
fabricante, com a enzima Omniscript (Qiagen). Após a reação de RT, foram
realizadas reações de PCR com os primers de U1, U4, U5 e U6 dir, com
temperaturas de anelamento de 55
o
C, 62
o
C, 50
o
C e 53
o
C, respectivamente.
Somente foi possível, com essa metodologia, obter o produto de U6 snRNA
de aproximadamente 100 pb, que após extração e purificação do gel, foi clonado
utilizando o kit TOPO TA (Invitrogen) (Figura 7).
Bandas
extraídas
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
40
Figura 7: Vetor pCR4-TOPO, presente no kit TOPO TA Cloning for Sequencing
(Invitrogen).
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
41
Após a reação de transformação, a confirmação da presença do inserto foi
realizada através de PCR de colônia, onde a presença de uma banda de
aproximadamente 250 pb (150 pb do vetor + 100 pb inserto) indicou colônia positiva,
como demonstrado na figura 8. As três colônias que apresentaram o inserto foram
sequenciadas.
Figura 8: Eletroforese em gel de agarose 1%, corado com BrEt, contendo o produto
da PCR de colônia da clonagem de U6 snRNA por RT-PCR (1). PM: 1 Kb plus (Life
Technologies).
Até o momento, a clonagem de U1 snRNA de T. cruzi revelou apenas uma
seqüência de 23 nts, incluindo os 20 nts do primer (Bosetto 2002), por isso, neste
trabalho foram estudadas as seqüências de U2, U4, U5 e U6 snRNAs.
5.3. REAÇÃO DE PCR DO DNA GENÔMICO
O DNA genômico de formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi foi extraído
(Figura 9) para utilização na reação de PCR.
300
200
100
PM 1
pb
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
42
Figura 9: Eletroforese em gel de agarose 1%, corado com BrEt, contendo DNA
genômico das formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y). PM: 1 Kb plus (Life
Technologies).
Foram realizadas reações com os pares de primers TcU4 dir e inv, TcU5 dir e
inv e TcU6 dir e inv, com temperaturas de anelamento de 55
o
C, 55
o
C e 53
o
C,
respectivamente. Após corrida eletroforética, observa-se na figura 10, o produto das
reações de PCR com bandas de aproximadamente 100, 50 e 100 pb para U4 (A), U5
(B) e U6 (C) snRNAs, respectivamente.
PM Y
12
2
5
1
Kb
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
43
Figura 10: Eletroforese em gel de agarose 2% (A e C) e 4% (B), corado com BrEt,
contendo o produto de PCR de U4 (A), U5 (B) e U6 (C) snRNA. C-: controle
negativo. PM: 50 pb (Life Technologies). As setas indicam as bandas de interesse.
Em seguida, a banda foi extraída do gel, purificada e clonada em vetor TOPO
TA (Invitrogen). Após a transformação, foi realizada PCR de colônia para a
confirmação da presença do inserto, como mostrado na figura 11. Observa-se a
presença de bandas com aproximadamente 250 pb para U4 (A) e U6 (C) snRNAs e
com aproximadamente 200 pb para U5 snRNA (B), que significam colônias positivas
para o inserto. No total foram obtidas e seqüenciadas 4 colônias de U4, 7 colônias
de U5 e 5 colônias de U6 snRNA.
50
150
100
350
800
PM U6 C-
pb
PM U4 C
-
350
150
100
50
800
pb
PM U5 C
-
150
100
50
pb
A
C
B
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
44
Figura 11: Eletroforese em de agarose 1% (A e C) e 2% (B), corado com BrEt,
contendo os produtos da PCR de colônia da clonagem de U4 (A), U5 (B) e U6 (C)
snRNA por PCR do DNA genômico. PM1: 100 pb, PM2: 50 pb e PM3: 1 Kb plus (Life
Technologies). +: colônia contendo o inserto, -: colônia sem o inserto. As setas
indicam as bandas de interesse.
5.4. ANÁLISE E COMPARAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
As seqüências de U4, U5 e U6 snRNAs de T. cruzi foram submetidas ao
banco de dados do NCBI e os códigos de acesso obtidos foram AY894522,
AY894523 e AY894521, respectivamente.
5.4.1. U2 snRNA
Pesquisas anteriores em nosso laboratório permitiram clonar o U2 snRNA de
T. cruzi, cuja sequência foi depositada no banco de dados do NCBI (National Center
of Biotechnology Information - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ - cód. acesso: AY205287)
(Bosetto 2002). De posse dessa sequência de nucleotídeos e utilizando ferramentas
300
200
100
pb
PM3
+ -
100
200
300
PM1
- +
50
150
100
200
PM2
- +
A
C
B
pb pb
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
45
de bioinformática, realizou-se a análise comparativa com outras sequências, estudo
de filogenia e predição de estrutura secundária.
Na figura 12, observa-se o alinhamento múltiplo da sequência de U2 snRNA
(pb) de T. cruzi com outros tripanosomatídeos utilizando o programa GeneDoc
(Nicholas & Nicholas 1997) com sequências obtidas no NCBI, apresentando-se na
tabela 1 as respectivas porcentagens de identidade entre as sequências.
Figura 12: Alinhamento múltiplo da sequência de nucleotídeos de U2 snRNA de
Trypanosoma cruzi (cód. acesso: AY205287) com Trypanosoma brucei (cód. acesso:
X04678), Trypanosoma congolense (cód. acesso: M58666), Leishmania
amazonensis (cód. acesso: M58665), Leishmania tarentolae (cód. acesso
AY007788), Leptomonas seymouri (cód. acesso: U23406), Leptomonas collosoma
(cód. acesso: X56455), Crithidia fasciculata (cód. acesso: AF326335). As setas
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
46
indicam as seqüências consenso, nas quais as letras em maiúsculo indicam
identidade entre todas as seqüências (caixas em preto) e as minúsculas identidade
em algumas seqüências (caixas em cinza).
Tabela 1: Porcentagem de identidade entre as sequências de U2 snRNA de
diferentes tripanosomatídeos.
T. brucei T. congolense
L. amazonensis L. seymouri
L. collosoma C. fasciculata L. tarentolae
T. cruzi
82 82 70 70 69 71 69
T. brucei
84 69 70 70 69 67
T. congolense
70 71 69 71 70
L. amazonensis
89 79 92 95
L. seymouri
81 92 86
L. collosoma
80 77
Podemos observar que a sequência de U2 snRNA de T. cruzi apresentou
identidade de aproximadamente 80% com as sequências dos outros tripanosomas
(T. brucei, T. congolense) e de aproximadamente 70% com os outros
tripanosomatídeos analisados (L. amazonensis, L. seymouri, L. collosoma, C.
fasciculata, L. tarentolae). Essa sequência mostrou-se altamente conservada nos
primeiros 65 nts próximos à região 5’ em todos os tripanosomatídeos analisados.
A árvore filogenética referente a esses achados foi construída, como
mostrado na figura 13. C. fasciculata foi definida como outgroup e os valores de
fidelidade dos ramos estão indicados como valores de bootstrap de 1000
replicações.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
47
Figura 13: Árvore filogenética de U2 snRNA em tripanosomatídeos. Os valores de
bootstrap estão indicados nos nós da figura. Trypanosoma cruzi (cód. acesso:
AY205287), Trypanosoma brucei (cód. acesso: X04678), Trypanosoma congolense
(cód. acesso: M58666), Leishmania amazonensis (cód. acesso: M58665),
Leishmania tarentolae (cód. acesso AY007788), Leptomonas seymouri (cód. acesso:
U23406), Leptomonas collosoma (cód. acesso: X56455), Crithidia fasciculata (cód.
acesso: AF326335).
A análise filogenética da sequência de U2 snRNA mostrou que os
tripanosomas (T. cruzi, T. brucei e T. congolense) encontram-se próximos
evolutivamente, o mesmo acontecendo entre as leishmanias (L. amazonensis e L.
tarentolae), mas havendo uma distância filogenética entre tripanosomas e
leishmanias.
A estrutura secundária de U2 snRNA pôde ser predita, como mostrado na
figura 14, apresentando 4 loops (I, II, III e IV), semelhantes aos de U2 snRNA de T.
brucei (Günzl 1992). O cap 5´ (Gppp) e a região Sm estão representados na figura.
T.congolense
T.brucei
T.cruzi
L.collosoma
L.amazonensis
L.tarentolae
L.seymouri
C.fasciculata
100
99
93
87
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
48
Figura 14: Estrutura secundária proposta para U2 snRNA de T. cruzi (dG = -34,1 a
37
O
C). Os números I, II, III e IV indicam os loops. O sítio Sm e o cap 5’ (Gppp) estão
indicados na figura.
5.4.2. U4 snRNA
Após o sequenciamento dos clones de U4 snRNA obtidos neste trabalho, uma
sequência de 102 pb foi confirmada, pelo BLAST com outros tripanosomatídeos no
banco de dados do NCBI, como sendo U4 snRNA. Assim, foi feito também o
alinhamento dessas sequências (Figura 15) e as porcentagens de identidade entre
cada uma delas estão indicadas na tabela 2.
Gppp
Sm
I
II
III
IV
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
49
Figura 15: Alinhamento múltiplo da sequência de nucleotídeos de U4 snRNA de
Trypanosoma cruzi (cód. acesso: AY894522) com Trypanosoma brucei (cód. acesso:
Mottram 1989), Leishmania tarentolae (cód. acesso: AY007789), Leptomonas
collosoma (cód. acesso: AF204671), Leptomonas seymouri (cód. acesso:
AJ245951), Crithidia fasciculata (cód. acesso: AF326336). As setas indicam as
seqüências consenso, nas quais as letras em maiúsculo indicam identidade entre
todas as seqüências (caixas em preto) e as minúsculas identidade em algumas
seqüências (caixas em cinza).
Tabela 2: Porcentagem de alinhamento entre as sequências de U4 snRNA de T.
cruzi com diferentes tripanosomatídeos.
T. brucei
L. tarentolae L. collosoma L. seymouri C. fasciculata
T. cruzi
81 72 72 72 72
T. brucei
77 78 76 76
L. tarentolae
88 91 88
L. collosoma
90 86
L. seymouri
94
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
50
A sequência de T. cruzi apresentou 81% de identidade com a de T. brucei e
72% com a de outros tripanosomatídeos (L. tarentolae, L. collosoma, L. seymouri e
C. fasciculata) analisados. Entre Leishmania e as duas espécies de Leptomonas, a
identidade foi de aproximadamente 90%, mas quando comparado com os outros
tripanosomatídeos analisados houve maior divergência evolutiva para a sequência
de U4 snRNA, como observado na figura 16; entre T. cruzi e T. brucei, a distância foi
menor. C. fasciculata foi definida como outgroup e os valores de fidelidade dos
ramos estão indicados como valores de bootstrap de 1000 replicações.
Figura 16: Árvore filogenética de U4 snRNA em tripanosomatídeos. Os valores de
bootstrap estão indicados nos nós da figura. Trypanosoma cruzi (cód. acesso:
AY894522), Trypanosoma brucei (cód. acesso: Mottram 1989), Leishmania
tarentolae (cód. acesso: AY007789), Leptomonas collosoma (cód. acesso:
AF204671), Leptomonas seymouri (cód. acesso: AJ245951), Crithidia fasciculata
(cód. acesso: AF326336).
A estrutura secundária de U4 snRNA de T. cruzi (Figura 17) apresentou 4
loops (I, II, III e IV), sendo que esses também foram semelhantes à estrutura
secundária de U4 snRNA de T. brucei (Mottram 1989), com exceção do loop I que
T.cruzi
T.brucei
L.collosoma
L.tarentolae
L.seymouri
C.fasciculata
94
66
84
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
51
não foi observado na estrutura de T. brucei por ser a região de provável pareamento
com U6 snRNA (assinaladas na figura 17 com linhas duplas). O cap 5´ (Gppp) e a
região Sm estão representados na figura.
Figura 17: Estrutura secundária proposta para U4 snRNA de T. cruzi (dG = -28,5 a
37
O
C). Os números I, II, III e IV indicam os loops. O sítio Sm e o cap 5’ (Gppp) estão
indicados. As seqüências assinaladas com linhas duplas referem-se às regiões de
interação com U6 snRNA.
5.4.3. U5 snRNA
Os clones obtidos da PCR de U5 snRNA apresentaram 50 pb, que após o
BLAST no banco de dados do NCBI, mostraram identidade com U5 snRNA de
outros tripanosomatídeos. Essa sequência foi então alinhada (Figura 18) e a
porcentagem de identidade com outras sequências foi determinada (Tabela 3).
I
IV
III
II
Sm
Gppp
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
52
Figura 18: Alinhamento múltiplo da sequência de nucleotídeos de U5 snRNA de
Trypanosoma cruzi (cód. acesso: AY894523) com Trypanosoma brucei (cód. acesso:
AJ243568), Leptomonas seymouri (cód. acesso: AJ243569), Leptomonas collosoma
(cód. acesso: AF006632), Crithidia fasciculata (cód. acesso: AF182356). As setas
indicam as seqüências consenso, nas quais as letras em maiúsculo indicam
identidade entre todas as seqüências (caixas em preto) e as minúsculas identidade
em algumas seqüências (caixas em cinza).
Tabela 3: Porcentagem de alinhamento entre as sequências de U5 snRNA de T.
cruzi com diferentes tripanosomatídeos.
T. brucei
L. seymouri L. collosoma C. fasciculata
T. cruzi
55 47 48 47
T. brucei
52 56 50
L. seymouri
68 76
L. collosoma
66
A porcentagem de identidade entre as seqüências dos tripanosomatídeos
analisados variou de 47 a 76%. Em relação aos outros snRNAs, a sequência de U5
mostrou ser a menos conservada, com exceção da região próxima à posição 20 do
alinhamento (Figura 19), que segundo Bell & Bindereif (1999) é uma região
altamente conservada entre os tripanosomatídeos. Entre T. cruzi e T. brucei, a
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
53
porcentagem de identidade foi de 55%, sendo que a seqüência de T. brucei
apresentou identidade de 56% com L. collosoma, maior do que T. cruzi.
A árvore filogenética (Figura 19) apresentou altos valores de confiança
(bootstrap 97), mostrando que T. cruzi e T. brucei encontram-se próximos
evolutivamente, havendo uma distância maior em relação aos outros
tripanosomatídeos. C. fasciculata foi definida como outgroup e os valores de
fidelidade dos ramos estão indicados como valores de bootstrap de 1000
replicações.
Figura 19: Árvore filogenética de U5 snRNA em tripanosomatídeos. Os valores de
bootstrap estão indicados nos nós da figura. Trypanosoma cruzi (cód. acesso:
AY894523), Trypanosoma brucei (cód. acesso: AJ243568), Leptomonas seymouri
(cód. acesso: AJ243569), Leptomonas collosoma (cód. acesso: AF006632), Crithidia
fasciculata (cód. acesso: AF182356).
A estrutura secundária para U5 snRNA de T. cruzi também foi predita e
apresenta-se na Figura 20. O cap 5´ (Gppp) e a região Sm estão representados na
figura. A estrutura apresentou semelhança com aquelas propostas para T. brucei, L.
seymouri e L. collosoma (Bell & Bindereif 1999), possuindo somente um loop.
T.cruzi
T.brucei
L.collosoma
L.seymouri
C.fasciculata
95
100
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
54
Figura 20: Estrutura secundária proposta para U5 snRNA de T. cruzi (dG = -2,8 a
37
O
C). O sítio Sm e o cap 5’ (Gppp) estão indicados.
5.4.4. U6 snRNA
As sequências obtidas para os produtos de RT-PCR e PCR de U6 snRNA
foram idênticas, apresentando 101 pb. O alinhamento foi realizado (Figura 21) e as
porcentagens de identidade entre as seqüências estão apresentadas na tabela 4.
Gppp
Sm
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
55
Figura 21: Alinhamento múltiplo da sequência de nucleotídeos de U6 snRNA de
Trypanosoma cruzi (cód. acesso: AY894521) com Trypanosoma brucei (cód. acesso:
X13017), Leishmania tarentolae (cód. acesso: AF305715), Leishmania mexicana
(cód. acesso: X82228), Leptomonas seymouri (cód. acesso: X78552), Leptomonas
collosoma (cód. acesso: X79014), Crithidia fasciculata (cód. acesso: X78551),
Phytomonas sp (X82229). As setas indicam as seqüências consenso, nas quais as
letras em maiúsculo indicam identidade entre todas as seqüências (caixas em preto)
e as minúsculas identidade em algumas seqüências (caixas em cinza).
Tabela 4: Porcentagem de alinhamento entre as sequência de U6 snRNA de T. cruzi
com diferentes tripanosomatídeos.
T. brucei L. tarentolae
L. mexicana
L. seymouri
L. collosoma C. fasciculata Phytomonas sp
T. cruzi
89 91 91 92 90 89 87
T. brucei
97 97 96 95 94 92
L. tarentolae
100 99 98 97 95
L. mexicana
99 98 97 95
L. seymouri
98 97 95
L. collosoma
97 97
C. fasciculata
94
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
56
A seqüência de U6 snRNA de T. cruzi apresentou-se bastante conservada em
relação aos tripanosomatídeos analisados, mostrando aproximadamente 87 - 92%
de identidade com outras sequências. O T. cruzi apresentou identidade maior com
Leishmanias e Leptomonas do que com T. brucei, cuja identidade com outros
tripanosomatídeos ficou em torno de 95%.
Apesar dos valores de bootstrap apresentarem-se baixos na árvore
filogenética (Figura 22), ainda são valores aceitáveis. Observa-se novamente que T.
cruzi e T. brucei apresentaram proximidade evolutiva para esse gene e o mesmo
ocorrendo com as Leishmanias. C. fasciculata foi definida como outgroup e os
valores de fidelidade dos ramos estão indicados como valores de bootstrap de 1000
replicações.
Figura 22: Árvore filogenética de U6 snRNA em tripanosomatídeos. Os valores de
bootstrap estão indicados nos nós da figura. Trypanosoma cruzi (cód. acesso:
AY894521), Trypanosoma brucei (cód. acesso: X13017), Leishmania tarentolae
(cód. acesso: AF305715), Leishmania mexicana (cód. acesso: X82228), Leptomonas
seymouri (cód. acesso: X78552), Leptomonas collosoma (cód. acesso: X79014),
Crithidia fasciculata (cód. acesso: X78551), Phytomonas sp (X82229).
T.cruzi
T.brucei
L.tarentolae
L.mexicana
L.seymouri
L.collosoma
Phytomonas sp
C.fasciculata
56
56
85
64
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
57
A estrutura secundária de U6 snRNA de T. cruzi foi predita conforme
mostrado na figura 23. O cap 5´ (Gppp) está representado na figura. Os loops I e IV
apresentaram semelhança com a estrutura proposta para U6 snRNA de T. brucei.
(Mottram 1989). Assim, os loops II e III não se formam por ser uma provável região
de interação com U4 snRNA (assinalada na figura 23 por linhas duplas).
Figura 23: Estrutura secundária proposta para U6 snRNA de T. cruzi (dG = -21,9 a
37
O
C). Os números I, II, III e IV indicam os loops. O sítio Sm e o cap 5’ (Gppp) estão
indicados. A seqüência assinalada com linhas duplas refere-se à região de interação
com U4 snRNA.
5´ Gppp
IV
III
II
I
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
58
5.4.5. UsnRNAs T. cruzi X H. sapiens
As seqüências de U2, U4, U5 e U6 snRNAs foram alinhadas com as suas
respectivas seqüências presentes em humanos como apresentado na figura 24.
A) U2 snRNA
B) U4 snRNA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______
59
C) U5 snRNA
D) U6 snRNA
Figura 24: Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de U2 (A), U4 (B), U5 (C) e U6
(D) snRNAs de Trypanosoma cruzi (cód. acesso: AY205287, AY894522, AY894523
e AY894521 para U2, U4, U5 e U6 snRNA, respectivamente) com Homo sapiens
(cód. acesso: X59360, X59361, X04215 e X59362, para U2, U4, U5 e U6 snRNA,
respectivamente). As setas indicam as seqüências consenso, nas quais as letras em
maiúsculo indicam identidade entre todas as seqüências e da mesma forma, as
caixas em preto. As caixas em cinza indicam ausência de identidade.
As sequências apresentaram 50, 48, 19 e 60% de identidade com U2, U4, U5
e U6 snRNAs de humano, respectivamente. Para U2 snRNA, em humanos observa-
se a presença de 38 nts a mais do que na sequência de T. cruzi (Figura 24, A). Na
extremidade 5’ existe uma região relativamente conservada do nucleotídeo 1 até o
85 e na região seguinte, até a posição 134 do alinhamento, encontra-se uma região
presente somente em snRNA humano.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
60
A seqüência de U4 snRNA humano apresenta 42 nts a mais que na
seqüência de T. cruzi, enquanto a região do nt 91 até 117 mostrou-se exclusiva em
snRNA humano (Figura 24, B).
Entre as seqüências de snRNAs analisadas, a U5 foi a que apresentou menor
identidade em relação à humana (Figura 24, C); U5 snRNA de T. cruzi apresenta 50
pb, enquanto que a humana possui 116 pb. A seqüência do nt 1 até 63 foi exclusiva
em U5 snRNA humano.
A seqüência de U6 snRNA foi a mais conservada entre H. sapiens e T. cruzi,
apresentando também tamanho semelhante, em torno de 100 pb (Figura 24, D).
Embora altamente especulativo, poder-se-ia supor que tais diferenças entre
as seqüências, especialmente U2, U4 e U5 possam dever-se ao seu envolvimento
na formação dos diferentes spliceossomos para o processamento dos mRNAs de
cada espécie (cis-splicing em humanos e trans-splicing em tripanosomas).
Entretanto, mais estudos devem ser realizados para o entendimento do
envolvimento dessas estruturas na reação de trans-splicing em T. cruzi.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Conclusões_______________
61
6. CONCLUSÕES
Os dados apresentados neste trabalho permitiram as seguintes conclusões:
1. A reação de RT-PCR permitiu a amplificação das seqüências de U2 e U6
snRNAs de T. cruzi;
2. A reação de PCR com DNA genômico de T. cruzi possibilitou a amplificação
das seqüências de U4, U5 e U6 snRNAs;
3. Todos os produtos de PCR foram clonados e sequenciados; as seqüências
obtidas corresponderam aos snRNAs esperados;
4. Todas as seqüências obtidas alinharam-se com as respectivas seqüências de
tripanosomatídeos, com porcentagem de identidade acima de 70%, com
exceção de U5 snRNA que se mostrou a seqüência menos conservada;
5. Todas as árvores filogenéticas dos snRNAs estudados mostraram
proximidade evolutiva entre T. cruzi e T. brucei;
6. As estruturas secundárias preditas para T. cruzi apresentaram semelhança
com àquelas preditas para T. brucei;
7. As seqüências de snRNAs de T. cruzi alinharam-se com as seqüências de
Homo sapiens, apresentando regiões que são exclusivas para H. sapiens em
U2, U4 e U5 snRNAs. U6 snRNA apresentou-se conservada entre as duas
espécies;
8. Até o momento não foi possível a obtenção e clonagem de U1 snRNA de T.
cruzi pela metodologia de RT-PCR.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
62
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- ACHSEL, T.; BRAHMS, H.; KASTNER, B.; BACHI, A.; WILM, M.; LÜRHMANN,
R. A doughnut-shaped heteromer of human Sm-like proteins binds to the 3’-end
of U6 snRNA, thereby facilitating U4/U6 duplex formation in vitro.
EMBO J.
, v. 18,
p. 5789-5802, 1999.
- BELL, M. & BINDEREIF A. Cloning and mutational analysis of the Leptomonas
seymouri U5 snRNA gene: function of the Sm site in core RNP formation and
nuclear localization.
Nucl. Acids Res
., v. 27, n. 20, p. 3986-3994, 1999.
- BOSETTO, M. C.
Caracterização de ribonucleoproteínas (UsnRNPs) em
Tripanosomatídeos
. Dissertação (mestrado), Instituto de Química, Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2002.
- BRENER Z., ANDRADE, Z. A., BARRAL-NETTO M.
Trypanosoma cruzi
e
Doença de Chagas
. 2 ed., Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2000.
- BURGE, C. B.; TUSCHL, T.; SHARP, P. A. Splicing of precursors to mRNAs by
the spliceosome. In:
Gestland, R.; Cech, T. R.; Atkins, J. (Eds),
the RNA World
II (eds), p. 525-560, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1999.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Referências Bibliográficas____
63
- CHAGAS, C. Nova tripanomíase humana. Estudos sobre morfologia e o ciclo
evolutivo do Schizotrypanum cruzi, n. gen., n. sp., agente etiológico de nova
entidade mórbida do homem.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz
, v. 1, p. 159-218, 1909.
- DIAS J. C. P.; SILVEIRA A. C.; SCHOFIELD C. J. The impact of Chagas Disease
Control in Latin America – A Review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 97(5): 603-
612, 2002.
- DIAS J. C. P. Em Brener Z., Andrade, Z. A., Barral-Netto M. Trypanosoma cruzi
e Doença de Chagas
. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.
- DJIKENG, A.; FERREIRA, L.; D’ANGELO, M.; DOLEZAL, P.; LAMB, T.; MURTA,
S.; TRIGGS, V.; ULBERT, S.; VILLARINO, A.; RENZI, S.; ULLU, E.; TSCHUDI,
C.
Characterization of a candidate Trypanosoma brucei U1 small nuclear RNA
gene.
Mol. Biochem. Parasitol.
, v. 113, p. 109-115, 2001.
- FALASCA, C. A.; GILI, M.; GRANA, D.; GOMEZ, E.; ZOPPI, J.; MARESO E.
Chronic myocardial damage in experimental T. cruzi infection of a new world
primate Cebus sp. Monkey.
Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo
, v. 32, p. 151-161,
1990.
- FRANCO da SILVEIRA, J. Em Brener Z., Andrade, Z. A., Barral-Netto M.
Trypanosoma cruzi
e Doença de Chagas
. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2000.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
64
- FRANTZ, C.; EBEL, C.; PAULUS, F.; IMBAULT, P. Characterization of trans-
splicing in Euglenoids.
Curr Genet
, v. 37, n. 6, p. 349-355, 2000.
- GÜNZL, A.; CROSS, M.; BINDEREIF, A. Domain structure of U2 and U4/U6 small
nuclear ribonucleoprotein particles from Trypanosoma brucei: identification of
trans-spliceosomal specific RNA-protein interactions. Mol. Cell. Biol., v. 12, n. 2,
p. 468-479, 1992.
- HENRIKSSON, J.; ÄSLUND, L.; PETTERSON, U. Karyotype variability in
Trypanosoma cruzi.
Parasitol. Today
, v. 12, n. 3, p. 108-114, 1996.
- HERMANN, H.; FABRIZIO, P.; RAKER, V. A.; FOULAKI, K., HORNIG, H.;
BRAHMS, H.; LÜRHMANN, R. snRNP Sm proteins share two evolutionarily
conserved sequence motifs which are involved in Sm protein interactions.
EMBO
J.
, v. 14, p. 2076-2088, 1995.
- KUMAR, S.; TAMURA, K.; JAKOBSEN, I. B.; NEI, M. MEGA2: molecular
evolutionary genetics analysis software.
Bioinformatics
, v. 17, p. 1244-1245,
2001.
- LANA, M. & TAFURI, W. L. Em NEVES D. P. Parasitologia Humana. 10a ed.
São Paulo: Ed. Atheneu, p. 73-96, 2000.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Referências Bibliográficas____
65
- LIANG, X.; HARITAN, A.; ULIEL, S.; MICHAELI, S. trans and cis Splicing in
Trypanosomatids: Mechanism, Factors, and Regulation.
Eukaryotic Cell
, v. 2, n.
5, p. 830-840, 2003.
- LODISH, H.; BERK, A.; ZIPURSKY, S. L.; MATSUDAIRA, P.; BALTIMORE, D.;
DARNELL, J. E. Mol. Cell Biol. 4 ed. New York: W. H. Freeman and Company,
2000. p. 115-116.
- LÜHRMANN, R.; KASTNER, B.; BACH, M. Structure of spliceosoma snRNPs and
their role in pre-mRNA splicing.
Biochem. Biophys. Acta
, v. 1087, p. 265-292,
1990.
- LUQUETTI O. & RASSI A. Em Brener Z., Andrade, Z. A., Barral-Netto M.
Trypanosoma cruzi
e Doença de Chagas
. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, , 2000.
- HALL, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT.
Nucl. Acids Symp. Ser.
, v. 41, p. 95-
98, 1999.
- MACINA, R. A.; SANCHEZ, D. O.; AFFRANCHINO, J. C.; ENGEL J.; FRASCH,
A. C. C. Polymorphism within minicircle sequense classes in the kDNA of
Trypanosoma cruzi.
Mol. Biochem. Parasitol.
, v. 16, p. 61-74, 1985.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
66
- MAIR, G.; SHI, H.; LI, H.; DJIKENG, A.; AVILES, H. O.; BISHOP, J. R.;
FALCONE, F. H.; GAVRILESCU, C.; MONTGOMERY, J. L.; SANTORI, M. I.;
STERN, L. S.; WANG, Z.; ULLU, E.; TSCHUDI, C. A new twist in trypanosome
RNA metabolism: cis-splicing of pre-mRNA.
RNA
, v.
6, p. 163-169, 2000.
- MARCHETTI, M. A.; TSCHUDI, C.; SILVA, E.; ULLU, E. Physical and
transcriptional analysis of the Trypanosoma brucei genome reveals a typical
eukaryotic arrangement with close interspersion of RNA polymerase II and III –
transcribed genes.
Nucl. Acids. Res.
, v. 26, n. 15, p. 3591-3598, 1998.
- MICHELS, P. A.; HANNAERT V.; ERNEST I.; ALLERT S. Organization, structure
and evolutionary aspects of genes in trypanosomes.
Biochem. Soc. Trans.
, v.
18, n. 5, p. 727-729, 1990.
- MOTTRAM, J.; PERRY, K. L.; LIZARDI, P. M.; LÜHRMANN, R.; AGABIAN, N.;
NELSON, R. G. Isolation and sequence of four small nuclear U RNA genes of
Trypanosoma brucei subsp. brucei: identification of the U2, U4, and U6 RNA
analogs.
Mol. Cell. Biol.
, v. 9, n. 3, p. 1212-1223, 1989.
- NICHOLAS, K. B.; NICHOLAS H. B. Jr.
GeneDoc
: a tool for editing and
annotating multiple sequence aligments, 1997.
- NILSEN, T. W. Trans-splicing in nematodes.
Exp. Parasitol
., v. 69, p. 413-416,
1989.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Referências Bibliográficas____
67
- NILSEN, T. W. Trans-splicing: an update. Mol. Biochem. Parasitol., v. 73, p. 1-6,
1995.
- O’MULLANE, L.; EPERON, I. C. The pre-mRNA 5’ cap determines whether U6
small nuclear RNA succeeds U1 small nuclear ribonucleoprotein particle at 5’
splice sites. Mol. Cell. Biol., v. 18, p. 7510-7520, 1998.
- PALFI, Z.; BINDEREIF, A. Immunological characterization and intracellular
localization of trans-spliceosomal small nuclear ribonucleoproteins in
Trypanosoma brucei.
J. Biol. Chem.
, v. 267, p. 20159-20163, 1992.
- PALFI, Z; LANE, W. S.; BINDEREIF, A. Biochemical and functional
characterization of the cis-spliceosomal U1 small nuclear RNP from Trypanosoma
brucei.
Mol. Biochem. Parasitol
. V.121, p.233-243, 2002.
- PAYS, E.; VANHAMME, L.; BERBEROF, M. Genetics control for the expression
of surface antigens in African trypanosomes.
Annu. Rev. Microbiol.
, v. 48, p. 25-
52, 1994.
- PERIS, M.; SIMPSON, A. M.; GRUNSTEIN, J.; LILIENTAL, J. E.; FRECH, G. C.;
SIMPSON, L. Native gels analysis of ribonucleoprotein complexes form a
Leishmania tarentolae mitochondrial extract.
Mol. Biochem. Parasitol.
, v.
85, p.
9-24, 1997.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
68
- RAJKOVIC, A.; DAVIS, R. E.; SIMONSEN, J. N.; ROTTMAN, F. M. A Spliced
Leader is Present on a Subset of mRNAs from the Human Parasite Schistosoma
mansoni.
PNAS
, v. 87, p. 8879 – 8883, 1990.
- REQUENA, J. M.; LOPEZ, M. C.; ALONSO, C. Genomic repetitive DNA elements
of Trypanosoma cruzi. Parasitol. Today, v. 12, p. 279-282, 1996.
- REY, L.
Parasitologia:
parasitos e doenças parasitárias do homem nas
Américas e na África. 3 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
- SCHMUÑIS, G. A. Em Brener Z., Andrade, Z. A., Barral-Netto M. Trypanosoma
cruzi
e Doença de Chagas
. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.
- SCHNARE, M. N.; GRAY, M. W. A candidate U1 small nuclear RNA for
Trypanosomatid Protozoa.
J. Biol. Chem.
, v. 274, p. 23691-23694, 1999.
- SÉRAPHIN, B. Sm and Sm-like proteins belong to a large family: identification of
proteins of the U6 as well as the U1, U2, U4 and U5 snRNPs.
EMBO J.
; v. 14, p.
2089-2098, 1995.
- SILVA, L. H. P. & NUSSENZWEIG, V. Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzi
altamente virulenta para o camundongo branco.
Fol. Clín. Biol.
, v.
20, p. 191-
208, 1953.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Referências Bibliográficas____
69
- SIMPSON, L. The mitochondrial genome of kinetoplastid protozoa: genomic
organization, transcription, replication and evolution.
Ann. Rev. Microbiol.
, v. 41,
p. 363-382, 1987.
- SOLARI, A. J. Mitosis and genome partition in Trypanosomes.
Biocell
, v. 19, p.
65-84, 1995.
- STARK, H.; DUBE, P.; LÜRHMANN, R.; KASINER, B. Arrangement of RNA and
proteins in the spliceosomal U1 small nuclear ribonucleoprotein particle.
Nature
,
v. 409, p. 539-542, 2001.
- STURM, N. R.; CAMPBELL, D. K. The role of intron structures in trans-splicing
and cap4 formation for the Leishmania spliced leader RNA.
J. Biol. Chem.
, v.
274, p. 19371-19367, 1999.
- STURM, N. R.; YU, M. C. Transcription termination and 3’ end processing of the
spliced leader RNA in kinetoplastids.
Mol. Cell Biol.
, v. 19, p. 1595-1604, 1999.
- SUTTON, R. E. & BOOTHROYD, J. C. Evidence for trans splicing in
trypanosomes.
Cell
, v. 47, n. 4, p. 527-35, 1986.
- TSCHUDI, C.; ULLU, E. Destruction of U2, U4 or U6 small nuclear RNA blocks
trans-splicing in trypanosome cells.
Cell
, v. 61, p. 459-466, 1990.
AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________
70
- ULLU, E.; TSCHUDI, C.; GÜNZL, A. Trans-splicing in trypanosomatid protozoa.
Em: Smith, D. F.; Parsons, M.
Mol. Biol. Parasitic Protozoa
. IRL Press Oxford,
p. 115-119, 1996.
- VANDENBERGHE, A. E.; MEEDEL T. H.; HASTINGS K. E. M. mRNA 5'-leader
trans-splicing in the chordates. Genes & Dev., v. 15, p. 294 – 303, 2001.
- WAGNER, W. & SO, M. Genomic variation of Trypanosoma cruzi: involvement of
multicopy genes.
Infect. Immun
., v. 58, p. 3217-3224, 1990.
- WILL, C. L.; LÜRHMANN, R. Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and
function.
Curr. Opin. Cell Biol.
, v. 13, p. 290-301, 2001.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo