( PDF ) Estudo de Sthaphylococcus aureus resistentes à meticilina (mrsa) por técnicas genotípicas e fenotípicas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CÂMPUS DE ARARAQUARA

ESTUDO DE Staphylococcus aureus RESISTENTES À METICILINA

(MRSA) POR TÉCNICAS GENOTÍPICAS E FENOTÍPICAS

ALEXANDRE BRAOIOS

ORIENTADOR: Prof. Dr. Antonio Carlos Pizzolitto

Araraquara - SP

2005

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CÂMPUS DE ARARAQUARA

ESTUDO DE Staphylococcus aureus RESISTENTES À METICILINA

(MRSA) POR TÉCNICAS GENOTÍPICAS E FENOTÍPICAS

ALEXANDRE BRAOIOS

TESE PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM ANÁLISES CLÍNICAS,

ÁREA DE ANÁLISES CLÍNICAS.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Antonio Carlos Pizzolitto

Araraquara - SP

2005

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CAPES: 40300005

Ficha Catalográfica

Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

UNESP – Campus de Araraquara

Braoios, Alexandre

B821e Estudo de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) por

técnicas genotípicas e fenotípicas / Alexandre Braoios . – Araraquara, 2005.

102 f.

Tese (Doutorado) –

Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita

Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação

em Análises Clínicas.

Orientador: Antonio Carlos Pizzolitto

. 1.Staphylococcus aureus. 2.MRSA. 3. Tipagem molecular. 4.PCR

multiplex. I. Pizzolitto, Antonio Carlos , orient. II. Título.

CDD: 576

D e d i c a t ó r i a

D e d i c a t ó r i aD e d i c a t ó r i a

D e d i c a t ó r i a

Por não acreditar que a vitória seja um mérito individual, dedico

meu trabalho a todos vocês que me deram força quando eu

fraquejei, me confortaram quando estive cansado, me esperaram

quando me demorei, me ampararam quando precisei e me amaram

sempre. A vocês ofereço cada página, cada frase e cada palavra

aqui escrita. Sem vocês tudo teria sido mais difícil:

Minha Mãe

Meu Pai

Meus Irmãos

Meus Sobrinhos

Meus Amigos

Meu Amor :

"Nosso maior de

"Nosso maior de"Nosso maior de

"Nosso maior desejo na vida é encontrar alguém

sejo na vida é encontrar alguémsejo na vida é encontrar alguém

sejo na vida é encontrar alguém

que nos faça fazer o melhor que pudermos"

ue nos faça fazer o melhor que pudermos"ue nos faça fazer o melhor que pudermos"

ue nos faça fazer o melhor que pudermos"

Ralph Waldo Emerson (1803-1882)

AGRADECIMENTOS



Ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Carlos Pizzolitto, que desde o início

confiou em mim e, com humildade e sabedoria, soube me guiar e ensinar.



Ao Prof. Dr. Antonio Fluminhan Júnior e Profa. Ana Cláudia Ambiel, cuja ajuda foi

inestimável.



Aos queridos companheiros de trabalho, Ana Paula Ramos, Sueli Schadeck,

Nádia Miguel, Regina Stilac Rocha, José Giometti, Ana Cristina Messas e

Ageane Monteiro Oliveira pelo companheirismo que demonstraram desde o

início.



Aos diretores das faculdades de Farmácia e Enfermagem da UNOESTE, Dr.

Leandro Lopes Haidamus e Dra. Nilva Galli, por permitirem minhas ausências e

por confiarem em mim.



Aos técnicos Romério Andrade, Hélcio Kuplans, Luciana Guaberto e Vânia

Vicente, por sempre tentarem facilitar o meu trabalho.



Às funcionárias da secretaria da pós-graduação da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Araraquara, Sônia, Laura e Cláudia, por sempre estarem

dispostas a me ajudar.



À Dra. Márcia Giambiagi-Demarval por ter cedido a cepa JJ1 e por ter ajudado à

distância.



À Ana Carolina Malaspina, Lilian e Dra. Clarice Queico Fujimura Leite pela ajuda

com o dendrograma.



À Profa. Dra. Eliana Varanda e Profa. Dra. Taís Maria Bauab que, com enorme

simpatia, ajudaram nas correções deste trabalho.



À Dra. Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva por ter permitido a utilização

do espectrofotômetro.



Ao Prof. Luiz Carlos Wruck e Prof. Dr. Sérgio do Nascimento Kronka, pela ajuda

com a análise estatística.

“Feliz aquele que transfere o que sabe e

aprende o que ensina”.

Cora Coralina (1889-1985)

RESUMO

Staphylococcus aureus é um dos principais agentes de infecção

humana, especialmente em indivíduos hospitalizados. Cepas MRSA (Methicillin

Resistant Staphylococcus aureus) constituem um grave problema em hospitais de

todo o mundo, aumentando a morbidade e mortalidade de indivíduos infectados. A

vancomicina é uma das únicas opções terapêuticas. No entanto, o uso excessivo

desse antibiótico pode selecionar cepas resistentes, agravando ainda mais o

problema. Trabalhadores hospitalares podem carrear S. aureus nas narinas

anteriores e pele e, assim, constituem um importante elo na epidemiologia das

infecções nosocomiais. Nesse trabalho foram coletadas amostras das mãos e

narinas de 100 trabalhadores do Hospital Universitário “Dr. Domingos Leonardo

Cerávolo” da Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE, em Presidente Prudente

(SP). Desse total, 68% não eram portadores de S. aureus, 27% carreavam S. aureus

sensível a meticilina, 4% carreavam MRSA e 1% carreava BORSA (Borderline

Oxacillin Resistant Staphylococcus aureus). No mesmo período (julho a dezembro

de 2002), 54,3% das infecções estafilocócicas em pacientes internados nessa

Instituição tinham como agente MRSA. A técnica da PCR (Polymerase Chain

Reaction) Multiplex para a detecção do gene femA (gene espécie-específico), mecA

(resistência à meticilina) e ileS-2 (resistência à mupirocina) foi comparada com o

método da difusão com discos e provas convencionais de identificação. Os

resultados da PCR Multiplex apresentaram completa concordância com os

resultados obtidos com os testes fenotípicos convencionais. Para verificar a relação

genética entre as 30 cepas MRSA, 5 isoladas de trabalhadores e 25 de pacientes,

foram realizadas a antibiotipagem e tipagem molecular através da técnica RAPD

(Random Amplified Polymorphic DNA). Pela antibiotipagem as cepas MRSA foram

agrupadas em 4 antibiotipos (A a D), sendo que 87% pertenciam ao antibiotipo A.

Após a análise do padrão de bandas gerado pelo RAPD, 8 grupos (I a VIII) foram

definidos por apresentarem 100% de similaridade. Apenas 2 cepas não foram

consideradas geneticamente relacionadas pelo RAPD, e apresentaram maior perfil

de sensibilidade aos antimicrobianos (antibiotipo B). Por outro lado, 90% das cepas

MRSA puderam ser consideradas fortemente relacionadas por apresentarem 90%

ou mais de similaridade entre si. Os dados obtidos nesse estudo mostram que no

hospital pesquisado existem cepas MRSA com grande similaridade genética,

podendo ser isoladas em alguns trabalhadores hospitalares e provocando doença

em pacientes. Nessa instituição, MRSA parece ser endêmico uma vez que, desde

sua inauguração, há uma alta incidência de infecções por essas cepas. De acordo

com a literatura, a medida mais eficaz em diminuir o número de infecções por MRSA

em ambientes endêmicos é o isolamento do paciente. Todos os microrganismos

isolados nesse estudo apresentaram sensibilidade a mupirocina. O uso de

mupirocina pode ser uma medida profilática importante para erradicação nasal de

MRSA em portadores assintomáticos, no entanto, a literatura relata experiências

sem sucesso em instituições onde há alta incidência de infecções por MRSA e, além

disso, pode ocorrer seleção de cepas resistentes a mupirocina. O perfil de

sensibilidade aos antimicrobianos, apresentado pela maioria das cepas isoladas

nesse estudo, é semelhante àquele encontrado no clone multi-resistente brasileiro

presente em diversos hospitais do país. Entretanto, somente a aplicação de técnicas

de tipagem com maior poder discriminatório poderia confirmar essa hipótese.

Palavras-chave: MRSA; tipagem molecular; RAPD; epidemiologia molecular; S.

aureus

ABSTRACT

Staphylococcus aureus is considered as a major infeccious disease

agent in human, especially in hospitalized people. Methicillin-resistant strains

(MRSA) constitute a serious problem in hospitals around the world, increasing the

morbity and mortality rate of infected people. Usually, vancomycin is the only

therapeutic choice for the treatment of MRSA infections. However, excessive use of

this antibiotic can select resistant strains, aggravating the problem. Health workers

can carry S. aureus in the anterior nares and skin, constituting an important link for

the epidemiology of nosocomial infections. In this study, samples of the hands and

nares of one hundred workers from the University Hospital “Dr. Domingos Leonardo

Cerávolo”, at Presidente Prudente, SP, Brazil, were assessed. Among the one

hundred workers, 68% did not carry S. aureus, methicillin-susceptible S. aureus was

found in 27/100 (27%) of those people; MRSA in 4/100 (4%) and BORSA (Borderline

Resistant Staphylococcus aureus) was found in 1 (1%) health worker. In the same

period (July to December of 2002), 54,3% of the staphylococcal infections in

hospitalized patients were caused by MRSA. Multiplex PCR assay for the detection

of femA (species-specific gene), mecA (methicillin resistance gene) and ileS-2

(mupirocin resistance gene) was compared to the disk diffusion susceptibility test and

conventional identification test methods. The Multiplex PCR technic results were in

complete agreement with the results obtained from conventional methods. Genetic

relationship among the 30 MRSA strains, five isolated from workers and twenty five

from patients, was established by antibiotyping and molecular typing by RAPD. On

the basis of the antibiotyping, the 30 strains were grouped into four clusters (A to D),

of a which 87% were grouped into antibiotype A. According to the profile of RAPD,

eight clusters (I to VIII) were defined as exhibiting 100% of similarity. Only two

isolates exhibited low genetic relationship. Those isolates have showed a larger

susceptible pattern to antimicrobials (antibiotype B). On the other hand, 90% of the

MRSA isolates could to be considered strongly related, showing 90% or more of

similarity among themselve. The data obtained in the present study shows that, there

is a MRSA strain presenting great genetic relationship in this hospital, colonizing

some health workers and causing disease in patients. It was found that, In this

hospital, MRSA appear to be endemic, because there is a high incidence of diseases

for this strain. As described previously, the best measure to decreasing the amount of

MRSA diseases is the isolation of infected patients. All S. aureus isolated in this

study were mupirocin-suceptible. The use of mupirocin can be an important

prevention measure for nasal erradication of MRSA in assymptomathics carriers.

However, there are several reports on experiences relating failures in hospitals with

the occurrence of a high incidence of MRSA and, futhermore, it might occur selection

of mupirocin-resistant strains. In this study, the greater number of MRSA isolates

have showed antibiotic susceptibility profile like those found in the Brazilian clone

presented in various hospitals of the country. However, only the application of typing

methods with best discriminatory power may confirm this hypothesis.

Keywords: MRSA; molecular typing; RAPD; molecular epidemiology; S. aureus

SUMÁRIO

1- Introdução --------------------------------------------------------------------------------------------9

2- Revisão Bibliográfica -----------------------------------------------------------------------------12

2.1- Staphylococcus aureus ------------------ -------------------------------------------------12

2.2- Resistência de S. aureus aos antimicrobianos --------------------------------------13

2.3- Bases genéticas da resistência de S. aureus aos β-lactâmicos ----------------16

2.4- Epidemiologia das infecções por MRSA ----------------------------------------------22

2.5- Detecção de Resistência -----------------------------------------------------------------24

2.6- Tipagem de S. aureus ---------------------------------------------------------------------27

3- Objetivos --------------------------------------------------------------------------------------------31

4- Material e Métodos--------------------------------------------------------------------------------33

4.1- Amostra populacional ----------------------------------------------------------------------33

4.2- Coleta e manutenção das amostras ---------------------------------------------------34

4.3- Identificação das cepas isoladas -------------------------------------------------------35

4.4- Teste de sensibilidade aos antimicrobianos ou antibiotipagem ----------------35

4.5- Confirmação de resistência à oxacilina com screen agar -----------------------36

4.6- Determinação da Concentração Inibitória Mínima para oxacilina -------------37

4.7- Teste de produção de beta-lactamase -----------------------------------------------37

4.8- PCR Multiplex -------------------------------------------------------------------------------37

4.9- Tipagem molecular (RAPD) -------------------------------------------------------------41

5- Resultados -------- --------------------------------------------------------------------------------44

5.1- Freqüência de portadores sadios de MSSA, MRSA e BORSA ----------------44

5.2- Freqüência de MSSA, MRSA e BORSA em pacientes --------------------------47

5.3- Determinação da CIM para oxacilina -------------------------------------------------51

5.4- Antibiotipagem ------------------------------------------------------------------------------51

5.5- PCR Multiplex -------------------------------------------------------------------------------55

5.6- Tipagem Molecular (RAPD) -------------------------------------------------------------59

6- Discussão -------------------------------------------------------------------------------------------65

7- Conclusões -----------------------------------------------------------------------------------------81

8- Referências Bibliográficas ----------------------------------------------------------------------83

Anexos -----------------------------------------------------------------------------------------------95

1- Introdução

Certamente, um dos microrganismos mais amplamente estudados

seja Staphylococcus aureus. Isso se deve ao fato de que essa bactéria faz parte da

microbiota e, portanto, sempre esteve envolvida em diversos processos infecciosos,

atingindo homens e animais desde suas origens. Como patógeno humano, sempre

foi responsável por grande morbidade e mortalidade. Outro aspecto que desperta

grande interesse na comunidade científica é a capacidade deste microrganismo de

desenvolver resistência aos antimicrobianos.

A descoberta da penicilina representou uma revolução na Medicina.

Doenças infecciosas passaram a ser passíveis de cura e, a partir desta descoberta,

novas drogas antimicrobianas foram desenvolvidas, evitando muitas seqüelas e

mortes. No entanto, os microrganismos apresentaram uma enorme capacidade de

adaptação e as “balas mágicas”, capazes de salvar milhares de vidas, exerciam

também uma pressão sobre os microrganismos, selecionando aqueles mais

resistentes.

Na atualidade, cepas multi-resistentes são responsáveis por

diversos surtos em todo o mundo. O arsenal terapêutico tem ficado cada vez mais

limitado e novas pesquisas tentam descobrir drogas mais potentes capazes de

vencer a guerra contra os inimigos microscópicos. Ao tratar doenças infecciosas

causadas por Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) ou oxacilina

(ORSA), os médicos dispõem de poucas alternativas terapêuticas. Uma destas

alternativas são os glicopeptídeos, como a vancomicina, um antimicrobiano caro e,

sua utilização já selecionou cepas resistentes a ela.

Como o tratamento dessas doenças infecciosas tem se tornado cada

dia mais difícil, é necessário conhecer profundamente sua epidemiologia a fim de

podermos estabelecer planos de controle e prevenção. Cepas MRSA são mais

comuns em instituições de saúde, onde a pressão antibiótica é maior. Diversos

surtos são relatados a cada ano e a descoberta da fonte propagadora do

microrganismo é de importância fundamental para o controle. Staphylococcus

aureus, tanto os sensíveis como os resistentes à meticilina, podem habitar as

narinas anteriores das pessoas, especialmente aquelas que convivem diariamente

com indivíduos infectados, como enfermeiros e médicos.

Com o surgimento deste problema, novos campos de pesquisa se

abriram na tentativa de comprovar a relação entre microrganismos causadores de

surtos e microrganismos isolados do ambiente ou de portadores sadios. Técnicas de

tipagem foram desenvolvidas com a finalidade de identificar clones de uma espécie

bacteriana e que poderiam confirmar que determinado surto estaria ocorrendo

devido a uma cepa em particular que teria se originado e disseminado a partir de

uma fonte específica. Técnicas fenotípicas, como a fagotipagem, biotipagem,

sorotipagem e antibiotipagem foram usadas com este propósito. No entanto, o baixo

poder discriminatório e a baixa reprodutibilidade eram obstáculos, já que estas

técnicas utilizam produtos da expressão gênica que podem variar de acordo com as

condições de cultivo, fases de crescimento e ocorrência de possíveis mutações.

Como alternativa, foram desenvolvidas técnicas de tipagem genotípicas que

analisam diretamente o material genético do microrganismo e que, portanto, são

menos variáveis ou influenciadas por fatores ambientais.

Em Presidente Prudente (SP), a realidade das infecções

nosocomiais ainda não é bem estudada. Cepas MRSA são isoladas freqüentemente,

constituindo um grave problema para a saúde de pessoas hospitalizadas. No

entanto, nenhum trabalho foi realizado visando o conhecimento do perfil de

sensibilidade e da relação genética das cepas isoladas nos hospitais dessa cidade.

No presente estudo, foi pesquisado Staphylococcus aureus nas

narinas e mãos de trabalhadores do Hospital Universitário “Dr. Domingos Leonardo

Cerávolo”, da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, em Presidente Prudente

(SP), no período de julho a dezembro de 2002. Cepas de S. aureus que foram

isoladas de amostras biológicas de pacientes apresentando sintomas de processo

infeccioso, no mesmo período, também foram selecionadas para o estudo.

Foram avaliados e comparados os perfis de sensibilidade aos

antimicrobianos das cepas isoladas de trabalhadores e pacientes. A técnica RAPD

(Random Amplified Polymorphic DNA) foi utilizada com o objetivo de avaliar a

relação, ou similaridade genética das cepas de S. aureus resistentes à

meticilina/oxacilina (cepas MRSA).

O conhecimento do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e a

avaliação da relação genética existente entre as cepas MRSA isoladas nesse

hospital, podem fornecer valiosos dados para a Comissão de Controle de Infecção

Hospitalar (CCIH) local.

2- Revisão Bibliográfica

2.1- Staphylococcus aureus

O gênero Staphylococcus é composto por microrganismos esféricos,

produtores da enzima catalase, tolerantes a altas concentrações de NaCl e ao

ressecamento, imóveis e não são capazes de produzir esporos. Estes

microrganismos são ubiquitários e podem ser comumente encontrados na pele,

glândulas da pele e membranas mucosas de aves e mamíferos, em geral

relacionando-se simbioticamente com seus hospedeiros. O nome “Staphylococcus”

(staphylé – cacho de uva) foi introduzido por Ogston em 1883, descrevendo um

grupo de micrococos causadores de inflamação e supuração (KLOOS &

BANNERMAN, 1994).

Tradicionalmente os estafilococos são divididos em dois grupos de

acordo com a capacidade de produção da enzima coagulase: os estafilococos

coagulase-positivo e estafilococos coagulase-negativo. Pertencente ao primeiro

grupo, S. aureus é considerado um dos principais patógenos humanos. Essa

bactéria é responsável por processos infecciosos agudos, como furúnculos,

hordéolos e abscessos, e pode ainda produzir toxinas responsáveis por sérias

patologias, tais como: Síndrome do Choque Tóxico, intoxicações alimentares,

Doença de Ritter entre outras (KLOOS & BANNERMAN, 1994).

Staphylococcus aureus é um dos organismos mais bem

documentados como patógeno oportunista humano. A colonização assintomática é

mais comum do que a ocorrência de processos infecciosos. Este organismo pode

ser encontrado na nasofaringe, períneo e pele (CHAMBERS, 2001). O caráter

oportunista faz do S. aureus um dos mais importantes agentes de infecção

nosocomial, aumentando severamente a morbidade e mortalidade de indivíduos

hospitalizados (KLOOS & BANNERMAN, 1994).

2.2- Resistência de S. aureus aos agentes antimicrobianos

Em 1928 Alexander Fleming anunciou a descoberta de uma

substância produzida pelo fungo Penicillium notatum que apresentava efeito

inibitório sobre algumas bactérias. Assim, o tratamento das doenças infecciosas

ganhava novas perspectivas. A partir desse fato a indústria farmacêutica recebeu

grandes investimentos e promoveu a expansão da pesquisa de novos antibióticos.

Até o final da década de 1960 muitos antibióticos foram introduzidos no mercado,

geralmente com pequenas modificações nas moléculas das drogas já conhecidas.

Porém, quase tão rápido quanto as descobertas dos antibióticos, verificou-se o

aparecimento de cepas bacterianas resistentes aos mesmos, principalmente devido

ao seu uso indiscriminado e inadequado (MANRIQUE & GALVÃO, 1997).

Staphylococcus aureus sempre foi um dos maiores agentes de

doença infecciosa especialmente em hospitais. Antes da descoberta dos

antibióticos, a mortalidade entre pessoas com bacteremia estafilocócica chegava a

80% e a introdução da penicilina G mudou drasticamente esta situação (BRAKSTAD

& MAELAND, 1997). Com o uso excessivo de antibióticos, especialmente penicilina

G, algumas cepas resistentes a essa droga começaram a se tornar um grave

problema dentro dos hospitais. No início da década de 1970, médicos de todo

mundo foram forçados a abandonar a crença de que todas as infecções bacterianas

eram tratáveis, tendo em vista a grande quantidade de agentes antimicrobianos

disponíveis. O otimismo foi abalado pela emergência de microrganismos

apresentando múltipla resistência. Aos poucos a multi-resistência deixou de ser

exceção para se tornar uma regra entre determinados microrganismos, tais como

estafilococos, enterococos e pneumococos (LOWY, 2003)

Na década de 1980, a mortalidade por bacteremia estafilocócica

permanecia entre 20 a 40% apesar do grande número de agentes antimicrobianos

disponíveis (MYLOTTE et al., 1987).

A resistência à penicilina G e a outros β-lactâmicos se dá

principalmente pela produção de enzimas denominadas β-lactamases que inativam o

antibiótico pela quebra do anel β-lactâmico. Jack & Richmond propuseram, em 1970,

o primeiro esquema de classificação das β-lactamases, que foi expandida três anos

depois por Richmond & Sykes (LIVERMORE, 1995). Ambler, em 1980, classificou as

β-lactamases em quatro classes (A a D) de acordo com suas estruturas moleculares

(LIVERMORE, 1995). Bush et al. (1995) propuseram uma classificação de acordo

com o substrato preferencial da enzima e sua susceptibilidade à inibição por

clavulanato. Assim as β-lactamases estafilocócicas pertencem ao grupo funcional 2a

de Bush e à classe estrutural A de Ambler. Kirby (1944) (apud CHAMBERS, 2001)

relatou pela primeira vez a existência de cepas de S. aureus produtoras de β-

lactamase apenas dois anos após a introdução da penicilina. No entanto, esta

resistência não era freqüentemente relatada e ocorria quase exclusivamente em

cepas hospitalares. Segundo o autor, as cepas isoladas da comunidade

permaneciam sensíveis à penicilina G. Seis anos depois, 25% das cepas isoladas

em hospitais apresentavam tal resistência, e em mais uma a duas décadas, a

mesma porcentagem de cepas resistentes à penicilina G era isolada da comunidade

(CHAMBERS, 2001).

Em 1959 foi introduzida a primeira penicilina semi-sintética

resistente às β-lactamases, a meticilina, para resolver o problema do aumento da

prevalência de S. aureus produtores dessas enzimas. Algum tempo depois, com o

surgimento das isoxazolilpenicilinas (oxacilina, dicloxacilina, cloxacilina e

flucloxacilina) que são estáveis em pH ácido e apresentam alto índice de ligação às

proteínas plasmáticas (80%), a meticilina deixou de ser comercializada em muitos

locais, inclusive no Brasil (AMATO NETO et al., 2000). No entanto, em 1961, foi

reportado o primeiro caso de resistência à meticilina, e 25 a 30 anos depois, 25%

das cepas hospitalares eram resistentes a esta droga (LIVERMORE, 2000;

ENRIGHT et al., 2002). Baseado na experiência com as cepas resistentes à

penicilina G, Chambers (2001), projetou para 2006 a 2010 a prevalência de 25% de

cepas MRSA isoladas da comunidade. Apesar da oxacilina ser usada no Brasil, e

não a meticilina, continua sendo empregada a expressão “meticilina-resistente” ou a

sigla MRSA (do inglês Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) para designar as

cepas de S. aureus que não respondem ao tratamento com meticilina e, por

extensão, com as demais isoxazolilpenicilinas (AMATO NETO et al., 2000).

Os antimicrobianos β-lactâmicos, tais como: cefalosporinas,

oxacilinas, meticilina e outras penicilinas agem na etapa final da síntese do

peptidoglicano, ligando-se às transpeptidases e impedindo a formação da parede

bacteriana. Estes antimicrobianos apresentam excelente toxicidade seletiva, uma

vez que as células humanas não possuem parede celular, como as bactérias. Por

essa razão são os antibióticos de escolha, especialmente para gestantes (SEFTON,

2002).

O crescente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus

resistentes à meticilina levou ao uso cada vez maior dos glicopeptídeos, como a

vancomicina, para o tratamento. Este fato criou, mais uma vez, forte pressão seletiva

e assim, cepas de Enterococcus e Staphylococcus vancomicina-resistentes têm sido

isoladas (LOWY, 2003). Este fato, mais o risco de transferência de genes de

resistência via plasmídios, tem apontado para a necessidade de uma redução

drástica no uso de vancomicina (VANNUFFEL et al., 1995). Além do risco de

seleção, o uso de vancomicina aumenta significativamente os custos do tratamento

(NICOLA et al., 2000).

Além dos glicopeptídeos, outras drogas, tais como gentamicina,

sulfazotrim e rifampicina, podem ser efetivas no tratamento de infecções por MRSA.

No entanto, é comum estas cepas apresentarem multi-resistência e demonstrarem

sensibilidade apenas à vancomicina (MULLIGAN et al., 1993; WITTE, 1999).

A resistência adquirida pode ser conseqüência de uma mutação ou

aquisição de DNA extrínseco, via transformação, transdução ou mais comumente,

pela conjugação (SEFTON, 2002).

2.3- Bases genéticas da resistência de S. aureus aos β

ββ

β-lactâmicos e

mupirocina

A resistência de S. aureus à penicilina G é mediada pelo gene

plasmidial blaZ que codifica a β-lactamase. Esta enzima é sintetizada quando a

bactéria é exposta ao antibiótico (resistência induzível) e age hidrolizando o anel β-

lactâmico. O gene blaZ é regulado por dois outros genes, o anti-repressor blaR1 e o

repressor blaI. O gene blaR1 codifica uma proteína relacionada com a transdução de

sinais, e blaI codifica uma proteína repressora que se liga ao sítio operador

impedindo a RNA-polimerase de se ligar e transcrever os genes blaZ e blaR1

(HACKBARTH & CHAMBERS, 1993; LOWY, 2003).

A proteína transmembrana de transdução de sinal BlaR1 possui um

sítio extracelular de ligação à penicilina e um sinalizador intracelular. A ligação da

penicilina ao sítio de ligação extracelular estimula, intracelularmente, a ativação

autocatalítica dessa proteína. Cada molécula de BlaR1 ativada cliva, direta ou

indiretamente (uma vez que outra proteína, BlaR2, também pode participar), a

proteína BlaI em fragmentos inativos permitindo assim a transcrição de blaZ e blaR1

com conseqüente síntese da β-lactamase. Portanto, na ausência de penicilina a β-

lactamase é expressa em baixos níveis, uma vez que BlaI não sofre clivagem e

consegue se ligar impedindo a transcrição (LOWY, 2003).

Alto nível de resistência de S. aureus à meticilina/oxacilina é

reconhecido como um exemplo típico de resistência mediada por cromossomo. Este

tipo de resistência é chamado de resistência intrínseca uma vez que não é devido à

destruição do antibiótico por β-lactamases e sim por modificações na estrutura-alvo

do antimicrobiano (MONTANARI et al., 1990).

As PBPs (Penicillin-binding protein) possuem função de

peptidoglicano-transpeptidases e funcionam como ligases na reação pentaglicil

transpeptidação, ou seja, atuam na “montagem” final do peptidoglicano da parede

bacteriana. As PBPs têm alta afinidade por antibióticos β-lactâmicos, aos quais se

ligam covalentemente inibindo a transpeptidação, resultando assim na inibição da

etapa final da síntese do peptidoglicano. Cepas de Staphylococcus spp. sensíveis à

meticilina apresentam cinco PBPs: PBP1, PBP2, PBP3, PBP3’ e PBP4, com pesos

moleculares entre 41 a 87 Kda (BRAKSTAD & MAELAND, 1997). Alguns autores

consideram apenas as quatro principais PBPs, excluindo PBP3’ (BERGER-BÄCHI,

1999).

A base molecular da resistência à meticilina é a síntese de uma PBP

adicional, referida como PBP2a ou PBP2’, e que é caracterizada pela baixa

afinidade à maioria dos antibióticos β-lactâmicos. A síntese de PBP2a pode ser

afetada por condições de cultivo. Assim, não há expressão de PBP2a em pH 5,2 e

em temperatura de 42°C (BRAKSTAD & MAELAND, 1997). A PBP2a é codificada

cromossomicamente pelo gene mecA que está localizado em um elemento de 32 a

60 Kb, o elemento mec, que não tem equivalente alélico em cepas sensíveis à

meticilina. Estudos epidemiológicos e genéticos sugerem que cepas MRSA

adquirem o elemento mec de estafilococos coagulase-negativos. Entretanto, o modo

de transferência não está totalmente esclarecido (BERGER-BÄCHI, 1999; PETINAKI

et al., 2001).

A regulação da expressão de resistência à meticilina/oxacilina ocorre

de maneira semelhante à regulação da resistência à penicilina G. Os antibióticos β-

lactâmicos, exceto meticilina e oxacilina, induzem a expressão de PBP2a. A indução

ocorre pela ligação do antibiótico à proteína MecR1 resultando em sua ativação, que

por sua vez cliva MecI permitindo a transcrição de mecA (LOWY, 2003). Os

segmentos plasmidiais blaI-blaR1 apresentam 61% e 34% de analogia com os

genes cromossômicos mecI e mecR1 respectivamente. Isso sugere que a função

regulatória e/ou a origem do elemento mecR são similares aos elementos bla. Assim

como a β-lactamase, a síntese de PBP2a também é induzida por antibióticos β-

lactâmicos em cepas que possuem plasmídio codificador da enzima (HACKBARTH

& CHAMBERS, 1993; HIRAMATSU et al., 2001).

Thornsberry et al., (1986) (apud VARALDO, 1993) comprovaram que

baixo nível de resistência à meticilina pode ser de caráter extrínseco, ou seja,

mediada por β-lactamase em cepas de S. aureus com sensibilidade intermediária

(ou resistência diminuída). Segundo o mesmo autor, as cepas de S. aureus com esta

característica de resistência são chamadas de “borderline” resistentes, “borderline”

sensíveis ou simplesmente BORSA (Borderline Oxacillin Resistant Staphylococcus

aureus).

O mecanismo de resistência “borderline” ainda não está totalmente

esclarecido. Alguns estudos demonstraram a presença de PBP2a em cepas

BORSA, e outros demonstraram somente a hiperprodução de β-lactamase

(MONTANARI et al.,1990; MULLIGAN et al., 1993; VARALDO, 1993; BRAKSTAD &

MAELAND, 1997). Barg et al., em 1991 (apud BRAKSTAD & MAELAND, 1997)

demonstraram que a hiperprodução de β-lactamase não é a única causa da

resistência “borderline”. Quando o plasmídio codificador da enzima foi transferido

para duas cepas não produtoras, somente uma delas apresentou resistência

“borderline”, consistente com a suposição que tanto a hiperprodução da enzima

como um pequeno aumento na resistência intrínseca é requerido para a emergência

de resistência “borderline”. Cepas BORSA são caracterizadas por Concentração

Inibitória Mínima (CIM) de oxacilina próximas do ponto de corte de sensibilidade, de

2 a 4 µg/mL (NICOLA et al., 2000).

Em resumo, a resistência de S. aureus à meticilina pode ser

mediada pelo gene cromossômico mecA, que codifica a PBP2a com baixa afinidade

aos antibióticos β-lactâmicos e expressa resistência a altos níveis da droga. A

expressão deste gene é constitutiva ou induzível por algum antibiótico β-lactâmico,

mas não por meticilina e oxacilina. Pode ainda ser conseqüência da hiperprodução

de β-lactamase, ou resistência mec-independente, que em grande quantidade seria

capaz de hidrolisar tanto a penicilina G como a meticilina e oxacilina, expressando

baixos níveis de resistência a essas drogas. Isso implica que, infecções por cepas

com resistência mec-independente podem ser tratadas com inibidores de β-

lactamases, uma vez que se tornam amplamente sensíveis na presença de

clavulanato, um inibidor desta enzima (VARALDO, 1993; FLUIT et al., 2001). Por

outro lado, cepas resistentes devido à produção de PBP2a (mecA

) quase sempre

são tratadas com glicopeptídeos, implicando em maior custo e favorecendo a

seleção de cepas resistentes a esse grupo de antimicrobianos. Deste modo, a

diferenciação laboratorial destes dois mecanismos de resistência é extremamente

importante para orientar o tratamento das infecções provocadas por S. aureus.

Além dos genes diretamente envolvidos na expressão de resistência

à meticilina/oxacilina (mec) outros genes que regulam a síntese e degradação do

peptidoglicano participam indiretamente dessa resistência. Qualquer modificação

estrutural do precursor do peptidoglicano ou a redução de sua síntese resulta em

diminuição da resistência (BERGER-BÄCHI, 1999). A expressão de resistência

somente ocorre em cepas que produzem uma cadeia muropeptídica que é

caracterizada pela adição seqüencial de resíduos de glicina, sob o controle de

proteínas designadas fatores essenciais para resistência à meticilina (Fem). Essas

proteínas são codificadas pelos genes femA, femB, femC, femD e femE

(LABISCHINSKI et al., 1998; HADDADIN et al., 2002). Estudos revelaram que a

inativação do gene femA resulta em diminuição da resistência à meticilina

(MAIDHOF et al., 1991). Independente da presença do gene mecA, mutantes femA

apresentam significante redução de glicina no peptidoglicano, e uma das

conseqüências dessa redução é o aumento da sensibilidade aos β-lactâmicos

(MAIDHOF et al., 1991). Apesar do envolvimento na resistência à meticilina, o gene

femA está presente tanto em cepas sensíveis como em cepas resistentes

(VANNUFFEL et al., 1999).

Um gene femA homólogo também foi caracterizado em S.

epidermidis, S. simulans, S. saprophyticus e S. hominis. A organização genômica de

todos esses genes é altamente conservada, com alternância de regiões homólogas

e variáveis. Essas variações inter-espécies foram exploradas para definir estratégias

para identificação espécie-específica (VANNUFFEL et al., 1999).

A mupirocina é um antibiótico produzido por Pseudomonas

fluorescens e foi introduzida no mercado em 1985. Esse antibiótico age ligando-se

competitivamente à enzima isoleucil RNAt-sintetase (IRS), inibindo assim a síntese

protéica (HUGES & MELLOWS, 1980 apud NUNES et al., 1999).

De acordo com Gilbart et al. (1993) (apud NUNES et al., 1999),

cepas resistentes à mupirocina podem ser divididas em dois grupos de acordo com o

nível de resistência. Cepas com baixo nível de resistência (CIM ≥ 8 a 256 g/mL)

produzem uma enzima IRS modificada com baixa afinidade pela mupirocina. Essa

modificação ocorre devido a mutação no gene cromossômico ileS que codifica a

isoleucil RNAt-sintetase. O mecanismo da baixa resistência à mupirocina ainda não

está completamente esclarecido. Cepas com alto nível de resistência (CIM  512

g/mL) apresentam um gene adicional (ileS-2) localizado em um plasmídio

conjugativo. Alguns estudos demonstraram a presença de uma cópia cromossômica

do gene ileS-2 codificando baixo-nível de resistência, assim os autores sugerem que

o baixo-nível de resistência difere da resistência de alto-nível somente pela

localização e/ou número de cópias do gene ileS-2 (NUNES et al., 1999; RAMSEY et

al., 1996). Esse gene codifica uma enzima que não apresenta afinidade com

mupirocina. Essa IRS apresenta somente 30% de similaridade na seqüência de

aminoácidos com a IRS endógena de S. aureus (LESKI et al., 1999; PÉREZ-ROTH

et al., 2001; YUN et al., 2003).

Nas cepas com alto-nível de resistência, a localização plasmidial do

gene ileS-2, pode ter como conseqüência a transferência desse plasmídio a outros

microrganismos, constituindo um grande problema hospitalar. O uso de mupirocina

pode servir para erradicação de cepas com baixo nível de resistência, mas não para

aquelas com alto nível (MEHTAR, 1998; HARBARTH et al., 1999).

2.4- Epidemiologia das Infecções por MRSA

Herold et al. (1998) (apud CHAMBERS, 2001), relataram o

isolamento de cepas MRSA em crianças da comunidade, e isso têm levado à

especulação de que a epidemiologia do MRSA está se modificando gradativamente,

uma vez que as infecções por MRSA têm sido adquiridas quase exclusivamente em

hospitais. Humanos são os reservatórios naturais de S. aureus e a transmissão

ocorre por contato direto com um hospedeiro colonizado. A colonização pode ser

transitória ou persistente e pode durar anos (KLUYTMANS et al., 1997).

De acordo com Boyce (1998) (apud CHAMBERS, 2001), os

principais fatores de risco para colonização ou infecção por MRSA são (i) exposição

a antibióticos; (ii) internação em Unidades de Terapia Intensiva (UTI); (iii) cirurgia e

(iv) exposição a um indivíduo colonizado. Pessoas da comunidade com infecção por

MRSA geralmente têm um histórico de hospitalização recente; contato íntimo com

uma pessoa que foi hospitalizada ou outros fatores de risco, como o uso prévio de

antibióticos (CHAMBERS, 2001). Em outro estudo é relatada a seleção de S. aureus

com altos níveis de resistência a oxacilina após exposição a fluoroquinolonas in vitro,

sugerindo que os mecanismos de resistência a oxacilina e a fluoroquinolonas podem

estar associados (VENEZIA et al., 2001).

A prevalência de cepas de MRSA pode variar em diferentes regiões,

entretanto os números tendem a se elevar cada vez mais. Nos Estados Unidos, as

infecções por MRSA passaram de 5%, na década de 1980, para 29% em 1991

(KLUYTMANS et al., 1997). Voss et al. (1994 apud BRAKSTAD & MAELAND, 1997)

relataram que a prevalência de MRSA na Espanha, França e Itália, em 1994 estava

em torno de 30%. No Japão, mais de 60% dos isolados de Staphylococcus aureus

eram resistentes à meticilina/oxacilina (KIMURA et al., 1992 apud WITTE, 1999). No

Brasil esta prevalência era de 56% (TEIXEIRA et al., 1995). Trabalhos mais recentes

indicam uma prevalência de 29 a 35% de MRSA nos Estados Unidos e Europa

(HADDADIN et al., 2002).

A colonização por S. aureus precede a infecção e os maiores

reservatórios deste organismo são as narinas anteriores. Geralmente estas cepas

são introduzidas em uma instituição por meio de um paciente colonizado ou um

indivíduo da equipe hospitalar e o principal modo de transmissão se dá através das

mãos destes trabalhadores (MULLIGAN et al., 1993). A taxa média de colonização

da equipe hospitalar por S. aureus é de 27%, podendo variar de 16 a 56%

(KLUYTMANS et al., 1997). Por outro lado, a taxa de colonização por MRSA pode

variar de 2 a 56% (MULLIGAN et al., 1993). Além da transmissão por contato direto,

os equipamentos e utensílios manipulados por pessoas colonizadas podem

desempenhar importante papel na epidemiologia das infecções por MRSA (DIAS et

al., 1997). Existem três padrões de carreamento de S. aureus: (i) 20% das pessoas

são carreadores persistentes, ou seja, sempre carream uma mesma cepa; (ii) cerca

de 60% das pessoas abrigam S. aureus intermitentemente e, em geral, as cepas não

são as mesmas e (iii) cerca de 20% não carream a bactéria. Os carreadores

persistentes parecem estar protegidos da aquisição de outras cepas. No entanto,

essa proteção é diminuída quando ocorre o uso de antibióticos (KLUYTMANS et al.,

1997). VandenBergh et al. (1999) pesquisaram S. aureus em 91 funcionários de uma

universidade holandesa e encontraram 47% de não carreadores; 17% de

carreadores intermitentes e 36% de carreadores persistentes.

Usando técnicas de fenotipagem ou genotipagem é possível

determinar a origem da cepa causadora de surtos hospitalares. Alguns estudos

utilizando estas técnicas comprovaram a transmissão de cepas MRSA, carreadas

pela equipe hospitalar para pacientes (BYUN et al., 1997; AHMED et al., 1998;

SOUSA et al., 2000).

A erradicação de S. aureus, incluindo MRSA, com mupirocina (ácido

pseudomônico A) tem sido efetivo em prevenir infecções pós-operatórias em

pacientes submetidos a cirurgias cardíacas, em pacientes submetidos à hemodiálise

e queimados (FUCHS et al., 1990; MEHTAR, 1998; KRISHMAN et al., 2002). Além

disso, alguns autores relataram sucesso na erradicação nasal de S. aureus (FUCHS

et al., 1990; HARBARTH et al., 1999; LESKI et al., 1999). Por outro lado, o uso

indiscriminado de mupirocina pode favorecer a seleção de cepas resistentes e

assim, a utilização ou não desse antibiótico, para esse propósito, é controverso

(HARBARTH et al., 1999; KRISHMAN et al., 2002; PÉREZ-ROTH et al., 2002).

2.5- Detecção de Resistência

A expressão fenotípica de resistência à meticilina é freqüentemente

heterogênea e os métodos fenotípicos podem falhar na detecção desta resistência,

uma vez que, a expressão fenotípica pode ser influenciada pelas condições de

cultivo, como temperatura, pH e concentração de NaCl do meio. Como

conseqüência, cepas com baixos níveis de resistência podem não ser detectadas,

uma vez que duas subpopulações podem co-existir na mesma cultura e nem todas

as células, apesar de possuírem a informação genética, expressam in vitro o

fenótipo de resistência (MURAKAMI et al., 1991). A distinção entre cepas

hiperprodutoras de penicilinase e cepas verdadeiramente resistentes à meticilina

(mecA

) é problemática (BROWN, 2001).

A técnica da difusão em ágar com discos de oxacilina é a mais

usada em laboratórios. Porém, a expressão fenotípica de resistência pode variar e

isso pode afetar a reprodutibilidade e sensibilidade do método (MARTINEAU et al.,

2000b). O NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)

recomenda a utilização do ágar Mueller-Hinton suplementado com 4% de NaCl e

6µg/mL de oxacilina, o screen agar, para confirmação de resistência à meticilina

(NCCLS M2-A7, 2000). Alguns pesquisadores relatam a dificuldade de detecção de

cepas com resistência “borderline” usando o screen agar e sugerem a realização do

teste de difusão em ágar, utilizando duas temperaturas de incubação: 35 e 42°C,

uma vez que PBP2a não é expressa a 42°C (NICOLA et al., 2000). Em suma, a

utilização do screen agar tem grande valor na confirmação de altos níveis de

resistência, ou seja, para detecção de cepas que possuem o gene mecA codificando

a resistência por meio da produção de PBP2a. Entretanto, cepas com baixos níveis

de resistência (BORSA) e cepas hetero-resistentes, onde em uma população

bacteriana co-existem sub-populações expressando diferentes níveis de resistência,

podem não ser detectadas por estas técnicas.

Cepas com baixos níveis de resistência (BORSA), hiperprodutoras

de β-lactamase, podem ser detectadas através do teste que utiliza uma

cafalosporina cromogênica, o teste do Nitrocefin (BIGNARDI et al., 1996). A

positividade do teste Nitrocefin mais a sensibilidade a amoxacilina/ácido clavulânico

(halo ≥ 20 mm) servem como critério para a caracterização de cepas hiperprodutoras

de β-lactamase e que não apresentam o gene mecA (GEHA et al., 1994;

MARTINEAU et al., 2000a; PETINAKI et al., 2001).

Atualmente, a técnica considerada “padrão ouro”, para detecção de

resistência à meticilina é a amplificação do gene mecA através da técnica da PCR.

No entanto, cepas com baixos níveis de resistência não podem ser detectadas

utilizando este marcador molecular, uma vez que esta resistência não é mediada

pelo gene mecA (MARTINEAU et al., 2000a; BROWN, 2001; FLUIT et al., 2001;

GRADELSKI et al., 2001; PÉREZ-ROTH et al., 2001).

Variações na técnica da PCR têm sido propostas com a intenção de

amplificar e detectar mais de um gene em uma mesma reação. Os genes alvos

podem ser genes de resistência a diferentes antimicrobianos, genes de virulência

e/ou genes espécie-específicos para identificação bacteriana. Assim, em uma

mesma reação é possível identificar o microrganismo e avaliar sua resistência e

virulência. Essas técnicas recebem o nome de PCR Multiplex e têm sido

amplamente usadas com diferentes propósitos (MASON et al., 2001;

MARKOULATOS et al., 2002). Vannuffel et al. (1995), realizaram a técnica de PCR

Multiplex para a amplificação simultânea dos genes mecA e femA. Martineau et al.

(2000a) realizaram simultaneamente sete ensaios de PCR Multiplex, sendo que

cada ensaio continha primers espécie-específicos para S. aureus e S. epidermidis e

mais um par de primers para amplificação de um dos seguintes genes de

resistência: aac(6’)-aph(2’’) (gentamicina), ermA, ermB, ermC e msrA (eritromicina),

blaZ (penicilina) e mecA (oxacilina). Pérez-Roth et al., em 2001, realizaram a técnica

utilizando primers para detecção dos genes mecA, ileS-2 e femB.

Vários parâmetros devem ser criteriosamente avaliados para que a

técnica da PCR Multiplex forneça resultados consistentes. Especialmente

importantes são a concentração de primers, concentração de tampão, temperatura

dos ciclos e proporção de cloreto de magnésio e dNTP (MARKOULATOS et al.,

2002). A realização de PCR Multiplex com o objetivo de amplificar vários

fragmentos-alvo com tamanhos muito diferentes, freqüentemente favorece a

amplificação do fragmento-alvo mais curto, resultando em diferentes quantidades do

produto amplificado (BEJ et al., 1990).

2.6- Tipagem de Staphylococcus aureus

Geralmente o agente etiológico causador de um surto é derivado de

uma única célula, e seus descendentes são geneticamente idênticos ou fortemente

relacionados. Em termos epidemiológicos, os organismos envolvidos no surto são

clonalmente relacionados, pois têm uma origem comum. Porém, existe suficiente

diversidade nas espécies, e organismos isolados de diferentes fontes, períodos e

regiões geográficas podem ser diferenciados ou classificados em subtipos ou cepas

(OLIVE & BEAN, 1999).

Maslow et al., em 1993 (apud TENOVER et al., 1994) caracterizaram

os sistemas de tipagem usando cinco critérios: (i) Tipabilidade, que é a habilidade da

técnica em produzir um resultado não ambíguo para cada isolado examinado.

Portanto, isolados não tipáveis são aqueles que produzem resultados nulos ou

ambíguos; (ii) Reprodutibilidade, que é a habilidade da técnica em produzir o mesmo

resultado quando o isolado é testado repetidamente; (iii) Poder discriminatório, que é

a habilidade da técnica em discriminar isolados não relacionados; (iv) Facilidade de

interpretação e (v) Facilidade de execução.

Em princípio, todos os organismos de uma mesma espécie devem

ser tipáveis pela técnica utilizada, ou seja, a característica analisada deve estar

presente em todos os membros da espécie. Por exemplo, a fagotipagem

freqüentemente é aplicada para caracterização de S. aureus, mas existem isolados

dessa espécie que não apresentam receptores para bacteriófagos, assim não

podem ser fagotipados (TAMBIC et al., 1997).

Além da fagotipagem outras técnicas fenotípicas são usadas na

caracterização de microrganismos. A biotipagem utiliza características bioquímicas

do microrganismo para classificá-lo. Entretanto essa técnica apresenta baixa

reprodutibilidade e baixo poder discriminatório, uma vez que a expressão fenotípica

dessa característica pode variar. O padrão de sensibilidade aos antimicrobianos tem

baixo poder discriminatório, pois os microrganismos podem modificar seu padrão de

sensibilidade por meio de mutações e aquisição ou perda de plasmídios de

resistência. Assim, por envolverem produtos de expressão gênica, essas

características tendem a variar de acordo com fatores ambientais, fases de

crescimento e mutações espontâneas (TENOVER et al., 1997).

Técnicas de tipagem genotípicas são baseadas na análise da

estrutura genética de um organismo. Estas técnicas estão menos sujeitas a

variações naturais, porém podem ser afetadas por inserções ou deleções gênicas

(TENOVER et al.,1997). De acordo com Swaminathan & Matar (1993), a habilidade

dos sistemas de tipagem molecular em distinguir epidemiologicamente isolados

bacterianos é um reflexo da variação genética existente no DNA cromossômico das

espécies. Os organismos mais comumente associados com infecções, em geral, são

subgrupos de algumas cepas mais virulentas. Por conseqüência, esse subgrupo

pode exibir pouca diversidade genética e isso pode dificultar a diferenciação entre as

cepas. Cepas MRSA são um exemplo desse fenômeno, pois muitas dessas cepas

isoladas de pacientes são derivadas de relativamente um pequeno número de

clones (TENOVER et al., 1997).

Diversas técnicas moleculares têm sido usadas para a tipagem de

S.aureus. Dentre elas, o Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) e Random

Amplified Polymorphic DNA (RAPD) são as mais utilizadas. PFGE é considerado por

muitos autores a técnica “padrão ouro”. No entanto, esta técnica requer

equipamentos sofisticados, software para interpretação e sua padronização inter-

laboratórios pode falhar (WELLER, 2000). Outros autores defendem a utilização do

RAPD para tipagem molecular de S. aureus, relatando boa correlação entre esta

técnica e o PFGE, além de ser uma técnica mais rápida, não exigir equipamentos

sofisticados e que também produz resultados satisfatórios (VAN BELKUN et al.,

1995; OLMOS et al., 1998; DAUTLE et al., 2002; KONDOH et al., 2002).

O RAPD, também referido como Arbitrarily Primed-Polymerase

Chain Reaction (AP-PCR), é uma variação da técnica da PCR e descrito

primeiramente por Williams et al. (1990) e Welsh & McClelland (1990) (apud OLIVE

& BEAN, 1999). Esta técnica é baseada no uso de primers de seqüências curtas,

geralmente de 10 bases, e escolhidas aleatoriamente (randomicamente), ou seja, a

seqüência alvo não é determinada. Deste modo, a seqüência compreendida entre

dois primers hibridizados é amplificada arbitrariamente. Em outras palavras, os

produtos da PCR terão o tamanho correspondente à distância entre dois primers. O

número e localização destas seqüências variam em diferentes cepas de uma

espécie bacteriana. Após a separação eletroforética dos produtos amplificados, um

padrão de bandas (fingerprint) é gerado e que, teoricamente, é característico de uma

cepa bacteriana em particular. O padrão de bandas gerado pode ser visualizado sob

iluminação ultravioleta após adição de brometo de etídio. Uma única substituição de

bases, inserção ou deleção pode alterar o anelamento do primer, tendo como

conseqüência padrões de bandas diferentes (POWER, 1996; TENOVER et al., 1997;

OLIVE & BEAN, 1999).

Uma das vantagens do RAPD é a pouca quantidade de DNA

necessária para sua realização, uma vez que partes deste DNA serão amplificadas

por PCR, ao contrário do PFGE onde não há amplificação e grande quantidade e

pureza do DNA são exigidas. Este fato é especialmente importante quando se

trabalha com bactérias Gram positivas, uma vez que a composição de suas paredes

dificulta a extração e purificação do DNA (DAUTLE et al., 2002).

O poder discriminatório da técnica RAPD aplicada a MRSA é menor

do que PFGE, entretanto, para avaliações epidemiológicas de pequenos surtos, o

RAPD é considerado uma valiosa ferramenta para caracterização inicial das cepas

envolvidas no surto. Alguns trabalhos relatam completa correlação entre os

resultados do PFGE e RAPD (OLMOS et al., 1998; CETINKAYA et al., 2000;

STRANDEN et al., 2003). Com a intenção de aumentar o poder discriminatório pode-

se combinar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos (antibiotipagem) com a

técnica RAPD (BARTZAVALI-LOUKI et al., 2003).

Diversos primers podem ser utilizados na reação do RAPD. A

combinação de dois ou mais primers, em geral, resulta em um número maior de

bandas o que conseqüentemente pode melhorar o poder discriminatório da técnica.

Pode-se também combinar os resultados obtidos pela utilização de um único primer

com os resultados da utilização de combinações de primers (FUNG et al., 2001).

3- Objetivos

O presente trabalho tem como objetivo geral estudar as cepas

de Staphylococcus aureus isoladas de pacientes e trabalhadores do Hospital

Universitário “Dr. Domingos Leonardo Cerávolo”, em Presidente Prudente (SP), com

a finalidade de conhecer o perfil de resistência desses microrganismos que, desde a

inauguração do referido hospital, são responsáveis por grande parte das doenças

infecciosas que acometem os pacientes. O estudo visa também conhecer a relação

genética existente entre as cepas MRSA isoladas no período de julho a dezembro

de 2002, bem como padronizar a técnica PCR Multiplex para identificação e

avaliação de resistência de S. aureus, com a finalidade de oferecer uma opção mais

rápida para diagnóstico laboratorial dessas infecções. Assim, o presente estudo tem

como objetivos específicos:

 Avaliar a presença de MRSA nas narinas anteriores e mãos da equipe de

trabalhadores do Hospital Universitário “Dr. Domingos Leonardo Cerávolo” da

Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, em Presidente Prudente-SP, no

período de julho a dezembro de 2002.

 Comparar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos destas cepas com

aquelas isoladas de pacientes que apresentavam infecção por MRSA durante o

mesmo período, tentando estabelecer uma correlação inicial entre eles, de

acordo com a semelhança de seus perfis de sensibilidade.

 Comparar os resultados da PCR Multiplex para a amplificação de fragmentos

correspondentes aos genes de resistência à meticilina/oxacilina e à mupirocina,

mecA e ileS-2 respectivamente, ao fenótipo de resistência. Comparar também a

amplificação do fragmento correspondente ao gene espécie-específico femA,

presente na espécie S. aureus independente de sua resistência ou sensibilidade

à meticilina/oxacilina, e a identificação feita com provas fenotípicas.

 Comparar e combinar os resultados da tipagem fenotípica dos isolados, por meio

da antibiotipagem feita com 12 antimicrobianos, com a tipagem molecular por

meio do RAPD, usando os primers OPA05, OPA11 e MecA2.

 Determinar, por meio do RAPD combinado à antibiotipagem, uma possível

relação genética entre as cepas MRSA isoladas das narinas e mãos da equipe

de trabalhadores desse hospital, com os isolados das infecções de pacientes.

4- Material e Métodos

4.1- Amostra populacional

No total, cem (100) trabalhadores hospitalares aceitaram participar

voluntariamente deste estudo. Esse grupo foi constituído de 79 auxiliares de

enfermagem, 14 enfermeiros, 3 médicos, 2 fisioterapeutas e 2 estudantes do curso

de graduação em Enfermagem. Esses indivíduos trabalhavam nos respectivos

setores do Hospital Universitário “Dr. Domingos Leonardo Cerávolo” da Universidade

do Oeste Paulista - UNOESTE: UTI (25); Clínica Médica (18); Clínica Cirúrgica (16);

Pediatria (12): Emergência (11); Ginecologia e Obstetrícia (07); Berçário (06);

Moléstias Infecto-Contagiosas (03), e os dois estudantes do curso de graduação em

Enfermagem estagiavam na Clínica Médica.

Foram coletadas amostras das mãos e narinas destes

trabalhadores. Antes da coleta os voluntários foram comunicados verbalmente e por

escrito sobre a pesquisa e seus objetivos. Ao concordarem em participar como

voluntários assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo I).

No presente estudo, todos os trabalhadores hospitalares que

apresentaram MRSA nas narinas e/ou mãos foram submetidos a uma nova coleta,

realizada três meses após a primeira, com a finalidade de observar a persistência no

carreamento de cepas MRSA.

No período de estudo, 40 pacientes (21 homens e 19 mulheres) que

apresentaram processo infeccioso por S. aureus consentiram a participação no

presente trabalho. Aos pacientes que apresentaram infecção por MRSA, durante o

mesmo período de coleta das amostras na equipe de enfermagem, também foi

solicitada uma autorização por escrito, e só foram incluídos no trabalho após

assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Se o paciente estivesse

impossibilitado de assinar ou fosse menor de idade, um responsável assinou o

termo. Só foram incluídas no trabalho amostras recebidas rotineiramente no

Laboratório de Microbiologia Clínica da Faculdade de Farmácia e Bioquímica da

UNOESTE. O paciente ou responsável foi procurado para assinatura do termo de

consentimento livre e esclarecido apenas nos casos em que houve isolamento de S.

aureus nas amostras clínicas dos mesmos. Deste modo, nenhum procedimento

adicional envolvendo o paciente, além do que constava no pedido de exames do

médico, foi realizado.

O presente estudo foi devidamente autorizado pela Direção Clínica

do referido hospital (Anexo II) e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade do

Oeste Paulista – UNOESTE (Anexos III e IV).

4.2- Coleta e manutenção das amostras

As amostras das narinas anteriores foram coletadas pelos próprios

trabalhadores hospitalares sob supervisão, após terem recebido instrução para tal.

Um swab estéril embebido em solução fisiológica estéril foi introduzido em cada

narina até que não recebesse mais resistência mecânica, e movimentos rotatórios

foram aplicados. Após a retirada, o swab foi imediatamente semeado em uma placa

de ágar manitol-sal (Britania). Em seguida, com o auxílio de alça bacteriológica,

foram feitas estrias a fim de se obter o isolamento das colônias. Tanto a semeadura

inicial feita com o próprio swab, como as estrias para isolamento foram executadas

próximas a uma lâmpada a álcool, para evitar contaminação do meio de cultura. As

placas semeadas foram enviadas imediatamente para o Laboratório de Microbiologia

Clínica da Faculdade de Farmácia e Bioquímica da UNOESTE e incubadas a 35-

C por 18 a 24 horas em aerobiose.

Um outro swab embebido em solução fisiológica estéril foi

friccionado nas palmas das mãos, dorso, ponta dos dedos e região interdigital do

indivíduo. Estas amostras foram semeadas em placas de ágar manitol-sal, estriadas

e incubadas como descrito anteriormente.

As cepas de S. aureus recuperadas de amostras clínicas de

pacientes atendidos no referido hospital e aquelas recuperadas das amostras nasais

e das mãos de trabalhadores hospitalares foram repicadas para TSB (Tryptic Soy

Broth - Difco) e após crescimento em aerobiose (18 horas a 35°C) foram aliquotadas

e mantidas a –20

4.3- Identificação das cepas isoladas

Os isolados constituídos por cocos Gram-positivos foram submetidos

ao teste da catalase em lâmina. Os isolados catalase-positiva foram identificados por

meio dos testes da coagulase em tubo, fermentação do manitol (Oxoid) e DNAse

(Oxoid). A diferenciação de S. aureus de outras espécies coagulase positivas foi

feita pelo teste de produção de ácido a partir de maltose e trealose (KLOOS &

BANNERMAN, 1999; KONEMAN et al., 2001).

4.4- Teste de sensibilidade aos antimicrobianos ou antibiotipagem

Cultivos de 18-24 horas foram ensaiados frente a 12

antimicrobianos: tetraciclina (30 g), gentamicina (10 g), sulfametoxazol-trimetoprim

(23,75/25 g), penicilina G (10 U), vancomicina (30 g), oxacilina (1 g),

cloranfenicol (30 g), eritromicina (15 g), mupirocina (5 g), amoxacilina+ácido

clavulânico (20/10

g), clindamicina (2 g) e ciprofloxacina (5 g) através do método

de difusão em ágar. O ensaio foi realizado em ágar Mueller-Hinton (Oxoid),

preparado de acordo com as especificações do fabricante, com inóculo padronizado

de 10

organismos/mL, equivalente ao padrão 0,5 da escala de MacFarland, como

recomendado pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS

M2-A7, 2000). Como controle da técnica da difusão foram utilizadas as cepas de S.

aureus ATCC 29213 e ATCC 43300.

Os antibiotipos foram definidos de acordo com o resultado da leitura

dos halos de inibição de crescimento observado no ágar Muller-Hinton. Assim, a

diferença de sensibilidade ou resistência para apenas um antimicrobiano testado foi

suficiente para definição de um antibiotipo distinto.

4.5- Confirmação de resistência a oxacilina com screen agar

Seguindo as recomendações do NCCLS (M2-A7, 2000), todos os

isolados (90) de S. aureus foram confirmados quanto a resistência à oxacilina

usando-se o screen agar. O meio de cultura usado foi o ágar Mueller-Hinton (Oxoid)

acrescido de 4% de NaCl e 6µg/mL de oxacilina (Sigma). O inóculo foi preparado da

mesma maneira como referido para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos. A

semeadura foi feita por ponto ou spot, técnica que consiste em tocar a superfície do

ágar com swab estéril previamente mergulhado na suspensão bacteriana (referente

à escala 0,5 de MacFarland) em solução fisiológica. Em seguida, as placas foram

invertidas e incubadas em estufa bacteriológica (35°C) em aerobiose, por

exatamente 24 horas.

Após incubação as placas foram examinadas com lupa, com luz

transmitida, visando a observação de crescimento bacteriano. A presença de uma só

colônia foi suficiente para confirmar a resistência à oxacilina.

4.6- Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para Oxacilina

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) para oxacilina foi

determinada por meio da técnica da macrodiluição em caldo Muller-Hinton (MH)

suplementado com 2% de NaCl. Foram utilizadas diluições seriadas de oxacilina

(Sigma), cujas concentrações finais variavam de 0,12 g/mL a 128 g/mL. Foi

utilizada uma suspensão bacteriana em caldo MH suplementado com NaCl 2%

equivalente ao padrão 0,5 da escala de MacFarland (NCCLS M7-A5, 2000). A CIM

foi determinada como a menor diluição de oxacilina capaz de inibir o crescimento

bacteriano no caldo, evidenciado com a turvação visível do meio líquido após 18-24

horas de incubação a 35°C (ANDREWS, 2001). Foram consideradas cepas MRSA

amostras que apresentaram CIM ≥ 4 g/mL para oxacilina, cepas com CIM < 2

g/mL foram consideradas MSSA (MERLINO et al., 2002).

4.7- Teste de produção de beta-lactamase

A produção de beta-lactamase foi avaliada por meio do teste do

Nitrocefin (Glaxo). A técnica consiste em adicionar uma colônia de S. aureus a uma

lâmina contendo algumas gotas de cefalosporina cromogênica. O resultado positivo

é evidenciado pela coloração avermelhada observada em lâmina. A mudança de

cor, de amarelo para vermelho, ocorre quando o amido ligado ao anel β-lactâmico da

cefalosporina cromogênica é hidrolizado pela β-lactamase (Livermore, 1995).

4.8- PCR Multiplex

A técnica da PCR Multiplex foi realizada com o objetivo de amplificar

fragmentos correspondentes aos genes femA (espécie-específico), mecA

(resistência à meticilina/oxacilina) e ileS-2 (resistência à mupirocina). Os resultados

obtidos pela PCR Multiplex foram comparados aos resultados da identificação

fenotípica convencional e também com os resultados da técnica da difusão em ágar

para avaliação da sensibilidade à oxacilina e mupirocina.

4.8.1- Extração e quantificação do DNA: A extração do DNA bacteriano foi

realizada no Laboratório de Genética Molecular da UNOESTE, utilizando o Kit

GFX Genomic Blood® (Amersham Biosciences), que contem uma solução de

lise, solução de extração, solução de lavagem e colunas GFX de purificação,

além de ter sido feito um pré-tratamento com lisozima. Os componentes e

protocolo de extração encontram-se detalhados no Anexo V e VI. A

quantificação do DNA bacteriano foi realizada no Laboratório de Bioquímica

da UNESP – Campus de Presidente Prudente, através de leitura em

espectrofotômetro (Shimadzu UV1601) nos comprimentos de onda 260nm e

280nm, visando a quantificação e avaliação da pureza respectivamente. Para

a quantificação, o DNA bacteriano foi diluído 1:100 em tampão TE pH 8,0. A

concentração (g/mL) de DNA bacteriano foi determinada aplicando a

seguinte fórmula:

[

260

x 50/OD

260

x fator da diluição]. Após a leitura nos

comprimentos de onda citados, a razão OD

260

/OD

280

foi calculada. Se esta

razão for de aproximadamente 1.8, indica que o DNA apresenta um bom

estado de pureza. Todas as amostras de DNA bacteriano utilizadas nesse

estudo apresentaram essa característica. Após a quantificação foram

preparadas soluções-trabalho de DNA, de maneira que todas as amostras

apresentassem concentrações semelhantes.

4.8.2- Primers: Para amplificar a seqüência de nucleotídeos correspondente

ao gene mecA, foram usados o primer MecA1 (5’-GTA GAA ATG ACT GAA

CGT CCG ATA A-3’) e o primer MecA2 (5’-CCA ATT CCA CAT TGT TTC

GGT CTA A-3’), que resultam em um produto da PCR de 310 pb (PÉREZ-

ROTH et al., 2001). Para amplificar a seqüência de nucleotídeos pertencentes

ao gene femA presente somente na espécie S. aureus, foram usados os

primers F1 (217-[5’]CTT ACT TAC TGG CTG TAC CTG-237) e F2 (902-

[5’]ATG TCG CTT GTT ATG TGC-884) que resultam em um fragmento de 686

pb (VANNUFFEL et al., 1995). Para a amplificação da seqüência de

nucleotídeos correspondente ao gene ileS-2, que codifica resistência a

mupirocina foram usados os primers MupA (5’-TAT ATT ATG CGA TGG AAG

GTT GG-3’) e MupB (5’-AAT AAA ATC AGC TGG AAA GTG TTG-3’) que

resultam em um fragmento de 456 pb (PÉREZ-ROTH et al., 2001).

4.8.3- Reação de amplificação: após a extração e quantificação do DNA, 5

µL da solução-trabalho de DNA (template) foram adicionados a 20 µL do mix

da PCR, de maneira que fosse obtida a concentração final de DNA em torno

de 50ng/25µL. O mix da PCR consistia de tampão

[

(Tris-HCl 20 mM; KCl 50

mM (pH 8.4)]; 0.2 mM de cada um dos quatro deoxiribonucleotídeo trifosfato

(dATP, dCTP, dTTP e dGTP) (Gibco); MgCl

3 mM, 25 pmol dos primers

MecA1, MecA2, MupA e MupB e 50 pmol dos primers F1 e F2 (BEJ et al.,

1990), e 1.25 U de Taq polimerase (Gibco). Para reduzir a formação de

produtos inespecíficos, os tubos somente foram colocados no termociclador

quando a temperatura de denaturação foi alcançada (94

C). Todas as

amplificações por PCR foram realizadas com o termociclador PTC-100 da MJ

Research, no Laboratório de Genética Molecular da UNOESTE. Em adição,

todas as amplificações foram feitas com um controle negativo, contendo todos

os reagentes, mas sem amostra de DNA bacteriano. Cada reação de

amplificação envolveu uma etapa inicial de denaturação a 94

C por 5 minutos,

seguido de 10 ciclos de amplificação (denaturação a 94

C por 30 segundos,

anelamento a 64

C por 30 segundos e extensão a 72

C por 45 segundos), em

seguida 25 ciclos de amplificação (denaturação a 94

C por 45 segundos,

anelamento a 50

C por 45 segundos e extensão a 72

C por 1 minuto) e

finalizando com uma etapa de extensão a 72

C por 10 minutos. Após a

reação de amplificação, 5 µL do produto final foi submetido à eletroforese em

gel de agarose 2% a 100 V por 45 minutos. Para estimar o peso molecular

dos produtos amplificados foi usado comparativamente um marcador

molecular de 100 pb (Gibco). O gel foi corado com brometo de etídio (Gibco),

e os produtos da amplificação foram observados usando radiação UV

(PÉREZ-ROTH et al., 2001). As imagens foram capturadas com uma câmera

CCD acoplada sobre o transiluminador, operada com o programa

ChemiImager 4000 (Alpha Innatech 2000). Após a verificação do peso

molecular dos produtos amplificados, através do referido software, as

imagens foram armazenadas como arquivos em computador pessoal na

estação de trabalho do referido Laboratório.

4.8.4- Cepas padrão: foram utilizadas as cepas ATCC 43300 (MRSA), ATCC

29213 (S.aureus sensível à meticilina e mupirocina) e cepa JJ1 (cepa

transconjugante RN8411 contendo plasmídio pMG1, resistente a mupirocina),

fornecida pelo Departamento de Microbiologia Médica do Instituto de

Microbiologia Dr. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro

(UFRJ), como controles positivos da reação da PCR Multiplex.

4.9- Tipagem Molecular (RAPD)

A padronização da técnica RAPD foi realizada utilizando-se diversas

concentrações dos primers, dNTPs, Taq polimerase, cloreto de magnésio e DNA

bacteriano. Também foram avaliados três diferentes protocolos de amplificação, com

diferentes temperaturas de anelamento e quantidade de ciclos de amplificação.

Todos os S. aureus resistentes à meticilina/oxacilina, confirmados

pela amplificação do fragmento de 310 pb presente no gene mecA, foram

selecionadas para a tipagem através da técnica do RAPD, com o objetivo de avaliar

a relação genética existente entre elas. A técnica foi aplicada individualmente para

os isolados de um mesmo paciente (1-2P, 7-10P, 14-15P e 23-24P).

No experimento piloto, foram selecionadas aleatoriamente duas

cepas pertencentes ao antibiotipo A e as duas cepas pertencentes ao antibiotipo B,

com a finalidade de observar se a utilização dos primers OPA5, OPA11 e MecA2

forneceria padrão de bandas suficiente para diferenciar MRSA com perfis de

sensibilidade tão distintos. Além disso, para avaliação da capacidade discriminatória

da técnica RAPD, foi utilizada uma cepa MRSA resistente apenas aos β-lactâmicos e

que foi isolada de um paciente da comunidade. A foto contendo os fragmentos

amplificados pela técnica RAPD e o dendrograma gerado, com a inclusão dessa

cepa comunitária podem ser observados nos Anexos VII e VIII, respectivamente.

4.9.1- Extração e quantificação do DNA: a extração e quantificação do DNA

bacteriano foram feitas como descritos anteriormente no item 4.8.1.

4.9.2- Amplificação: após a extração e quantificação do DNA, 5 µL desta

suspensão (template) foram adicionados a 20 µL do mix da PCR (2ng/µL),

consistindo de tampão [10 mM Tris-HCl ; KCl 30 mM (pH 8.4)]; 0.4 mM de

cada um dos quatro deoxiribonucleotídeo trifosfato (dATP, dCTP, dTTP e

dGTP) (Gibco); MgCl

3 mM, 50 pmol de cada primer e 1.25 U de Taq

polimerase (Invitrogen). Para cada amostra foi feita uma reação contendo os

primers OPA05, OPA11 e MecA2 (Invitrogen), descritos adiante. As reações

do RAPD também foram realizadas no termociclador PTC-100 da MJ

Research, como descrito nos itens anteriores. Todas as amplificações foram

feitas com um controle negativo, contendo todos os reagentes, mas sem

amostra de DNA bacteriano. Cada reação de amplificação foi composta de

uma etapa inicial de denaturação a 94

C por 5 minutos seguida por 50 ciclos

consistindo de 1 minuto a 94

C; 2 minutos a 35

C e 2 minutos a 72

C e

finalizando com 72°C por 10 minutos. Em seguida foi procedida a eletroforese

em gel de agarose 1,5% a 100 V (45 mA) por 1 hora e 30 minutos e coloração

com 10 µL de brometo de etídio (10mg/mL) em 300 mL de tampão (KONDOH

et al., 2002). Foi utilizado para comparação o marcador de peso molecular de

1kb (Gibco). As imagens foram capturadas, analisadas e armazenadas como

descrito anteriormente, no item 4.8.3. Com a finalidade de avaliar a

reprodutibilidade, a reação de amplificação foi realizada duas vezes, em dias

distintos, para todas as amostras.

4.9.3- Primers: Foram selecionados para a realização da técnica RAPD os

primers OPA11 (5’-CAA TCG TCC GT-3’); MecA2 (5’- CCA ATT CCA CAT

TGT TTC GGT CTA A – 3’) e OPA05 (5’-AGG GGT CTT G-3’) (Invitrogen),

por terem apresentado maior poder discriminatório quando utilizados em

conjunto. Para a escolha dos primers também foram consideradas

experiências bem-sucedidas relatadas por outros pesquisadores (BYUN et al.,

1997; OLMOS et al., 1998; BARTZAVALI-LOUKI et al., 2003). No entanto, o

uso combinado destes primers não foi relatado na literatura consultada.

4.9.4- Análise dos produtos de amplificação gerados por RAPD das

cepas MRSA isoladas: foi realizada no Departamento de Ciências Biológicas

da Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Campus de Araraquara

(Universidade Estadual Paulista – UNESP) por meio da geração de

dendrograma utilizando o programa GelCompar II (Applied Maths), que utiliza

o Coeficiente de Dice de similaridade e UPGMA (Unweighted Pair Group

Method with Arithmetic Mean) de agrupamento. Foi utilizada uma tolerância

de 2% na posição das bandas para comparação dos padrões RAPD. Para a

análise do RAPD, não foram consideradas diferenças na intensidade das

bandas.

5- Resultados

5.1- Freqüência de portadores sadios de MSSA, MRSA e BORSA

No total, cem (100) trabalhadores hospitalares aceitaram participar

voluntariamente deste estudo. Esse grupo foi constituído por diversos profissionais,

como descrito em Material e Métodos (item 4.1). Foram isolados 40 Staphylococcus

aureus das mãos e/ou narinas de 32 (32%) trabalhadores, sendo que 4 albergavam

MRSA, 27 albergavam Staphylococcus aureus meticilina-sensível (MSSA) e 1

indivíduo albergava S. aureus “borderline” resistente (BORSA) (Figura 1). Os

portadores de MRSA pertenciam aos setores UTI (02) e Clínica Médica (02) e as

cepas foram isoladas das mãos de um indivíduo e das narinas de 3 outros deles.

Do total de 32 portadores, 22 (68,8%) apresentaram S. aureus

somente nas narinas; 6 (18,7%) apresentaram somente nas mãos. Em 4 (12,5%)

trabalhadores hospitalares foram isolados S. aureus simultaneamente nas narinas e

mãos. Ao comparar os perfis de sensibilidade destas cepas isoladas das narinas e

mãos do mesmo trabalhador hospitalar, constatou-se que, em três destes indivíduos,

os perfis de sensibilidade dos S. aureus isolados eram diferentes entre si (Tabela 1).

Em um destes trabalhadores hospitalares (CRSM) foi isolado MRSA (19E) e, após

três meses desse isolamento, nova coleta foi realizada. Entretanto, nessa nova

coleta, não foi isolado MRSA. Somente foram isoladas cepas MSSA nas mãos (35E)

e narina (36E) desse indivíduo (Tabela 1).

Todas as cepas de S. aureus isoladas foram testadas quanto à

produção de beta-lactamase por meio do teste do Nitrocefin (Glaxo). Das 40 cepas

isoladas das mãos e narinas anteriores de 32 trabalhadores hospitalares, 22 (55%)

apresentaram resultado positivo para o teste.

As cepas ainda foram semeadas em screen agar para confirmação

fenotípica de resistência à oxacilina. Todas as cepas (5) consideradas resistentes à

oxacilina pelo método da difusão com disco cresceram no meio contendo oxacilina, e

assim, puderam ser consideradas definitivamente como MRSA. Por outro lado,

nenhuma amostra considerada sensível pelo primeiro método cresceu neste meio,

obtendo assim correspondência de 100% nos resultados comparativos entre os dois

métodos.

Entre as 40 cepas isoladas dos 32 trabalhadores hospitalares, 33

(82,5%) apresentaram sensibilidade à oxacilina (MSSA); 5 cepas (12,5%)

apresentaram resistência à meticilina/oxacilina (MRSA), sendo que 4 dessas cepas

foram isoladas na primeira coleta de amostras e 1 cepa foi isolada em coleta

realizada três meses depois. Essa nova coleta de amostras foi realizada em todos os

portadores de cepas MRSA, com o objetivo de avaliar a persistência do estado de

portador nasal de MRSA. Apenas em um trabalhador hospitalar foram isoladas

cepas MRSA (6E e 34E) nas duas coletas realizadas. A similaridade genética entre

essas cepas foi de 93%.

Somente duas cepas (5%) foram consideradas BORSA por terem

apresentado resultado positivo para o teste Nitrocefin, sensibilidade para Amoxicilina

+ Ácido Clavulânico (halo > 20mm) e sensibilidade intermediária à oxacilina (halo

entre 11 – 12 mm), além de apresentar CIM de oxacilina de 2 g/mL.

Com exceção de vancomicina e mupirocina, aos quais, todas as

cepas apresentaram sensibilidade, os antimicrobianos que apresentaram maior

poder inibitório foram oxacilina, amoxicilina + ácido clavulânico e cloranfenicol. O

percentual de cepas resistentes aos diferentes antimicrobianos utilizados no teste de

sensibilidade pode ser observado na Figura 2.

Figura 1:

Distribuição percentual dos 100 trabalhadores hospitalares de

acordo com o isolamento de S. aureus

entre julho e dezembro de 2002.

Presidente Prudente - SP.

68%

1% 4%

27%

Não Portadores

Portadores de MSSA

Portadores de MRSA

Portadores de BORSA

Tabela 1: Perfis de sensibilidade das amostras de S. aureus isoladas de indivíduos com colonização

concomitante das mãos e narinas. Presidente Prudente – SP, julho a dezembro de 2002.

Portador

Nº da

Cepa

Amostra

Coletada

Resistência*

JGC

09E

10E

Narina

Mão

PEN

23E Mão PEN, SUT

EAS

25E Narina PEN

28E Mão PEN, SUT, CIP, CLI, ERI

MPSR

29E Narina PEN, CLI, ERI

CRSM

19E

35E

36E

Narina

Mão

Narina

PEN,CLO,CIP,CLI,AMC,ERI,GEN,OXA,SUT,TET

PEN,CIP,CLI,ERI,GEN,SUT,TET

*AMC (Amoxicilina + Ácido Clavulânico); CLO (Cloranfenicol); CIP (Ciprofloxacina); CLI

(Clindamicina); ERI (Eritromicina); GEN (Gentamicina); OXA (Oxacilina); PEN (Penicilina); SUT

(Sulfametoxazol + Trimetoprim); TET (Tetraciclina).

5.2- Freqüência de MRSA, MSSA e BORSA nos pacientes hospitalizados.

No período estudado, 40 pacientes que apresentaram processos

infecciosos por S. aureus, consentiram a participação no presente estudo. Em 32

destes pacientes foi coletada apenas uma amostra biológica; de 6 pacientes foram

coletadas 2 amostras biológicas diferentes e em 2 pacientes foram realizadas 3

coletas de amostras diferentes. De cada uma dessas amostras biológicas foi isolado

um S. aureus.

Em quatro, dos oito pacientes com mais de uma amostra biológica

coletada, foram isolados dez S. aureus com perfis de sensibilidade diferentes entre

si e, portanto, foram consideradas cepas distintas. Nos outros quatro pacientes,

foram isolados oito S. aureus resistentes à meticilina/oxacilina (dois de cada

paciente) com perfis de sensibilidade idênticos. Assim, por se tratar de um estudo

epidemiológico, os S. aureus isolados de um mesmo paciente e apresentando o

mesmo perfil de sensibilidade foram considerados como uma única cepa. Essas

cepas foram aqui referidas por dois números seguidos da letra “P”. Assim, do

paciente MIO foi isolada a cepa 1-2P; do paciente ERS foi isoladas a cepa 7-10P; do

paciente WBS foi isolada a cepa 14-15P e do paciente ARB foi isolada a cepa 23-

24P. Portanto, o total de cepas isoladas de pacientes, no presente estudo, foi de 46.

O percentual de cepas resistentes a cada antimicrobiano utilizado na

técnica da difusão em ágar pode ser observado na Figura 2. Do total de 46 cepas de

S. aureus, 25 (54,3%) apresentaram resistência à meticilina/oxacilina (MRSA) e 20

(43,5%) foram consideradas MSSA. Apenas uma cepa (2,2%) foi considerada

BORSA, de acordo com os critérios já mencionados anteriormente (Figura 3). As

cepas MRSA foram isoladas de diversas amostras clínicas, com predomínio de

ponta de cateter e sangue (Figura 4).

Todas as 46 cepas foram testadas quanto à produção de beta-

lactamase, 38 (83%) eram produtoras e 8 (17%) não-produtoras da enzima. Entre as

38 cepas que apresentaram resultado positivo para o teste do Nitrocefin, estão

incluídas todas as 25 cepas MRSA e a única cepa BORSA isolada de um paciente.

Assim como observado nas cepas isoladas de trabalhadores

hospitalares, os resultados do crescimento em ágar contendo oxacilina tiveram

100% de correspondência com os resultados do método da difusão, ou seja, as 25

cepas MRSA cresceram no screen agar. Por outro lado, não houve crescimento de

nenhuma das 20 cepas MSSA no screen agar, assim como não foi observado

crescimento quando este ágar foi semeado com a única cepa BORSA isolada de

pacientes.

AMC

CLO

CIP

CLI

ERI

GEN

OXA

PEN

SUT

TET

Antimicrobianos

PACIENTES TRABALHADORES

Figura

: Percentual de cepas de S. aureus isoladas de tr

abalhadores

hospitalares (40) e pacientes (46) que apresentaram resistência

aos

diferentes antimicrobianos utilizados no método da difusão em ágar.

Presidente Prudente

SP, julho a dezembro de 2002.

Cepas de S. aureus (%)

0 20 40 60 80 100

Figura 3:

Distribuição percentual das 46 cepas de S. aureus isoladas de

pacientes segundo sua característica de resistência a oxacilina. Presidente

Prudente - SP, julho a dezembro de 2002.

54,3%

43,5%

2,2%

MRSA

MSSA

BORSA

Figura 4:

Distribuição percentual das amostras biológicas dos quais foram

isoladas cepas MRSA em pacientes atendidos no Hospital Universitário

Domingos Leonardo Cerávolo - UNOESTE, no período de julho a dezembro de

2002.

34%

28%

14%

17%

Ponta de Cateter

Sangue

Incisão Cirúrgica

Secreção Pulmonar

Outros

5.3- Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para oxacilina

A CIM de oxacilina foi determinada para as 86 cepas, 40 isoladas de

trabalhadores hospitalares e 46 cepas isoladas de pacientes que apresentaram

processo infeccioso.

As 40 cepas isoladas dos trabalhadores hospitalares puderam ser

divididas de acordo com a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de oxacilina. Assim,

70% (28) apresentaram CIM de 0,12 g/mL; 7,5% (3) CIM de 0,25 g/mL; 5% (2)

CIM de 0,5 g/mL; 5% (2) CIM de 2 g/mL (cepas BORSA); 2,5% (1) apresentou

CIM 32 g/mL e 10% (4) apresentaram CIM de 64 g/mL. Estes dois últimos grupos

são constituídos pelas cepas MRSA isoladas dos trabalhadores hospitalares.

As Concentrações Inibitórias Mínimas de oxacilina para as 46 cepas

isoladas de pacientes foram assim distribuídas: 11% (5) apresentaram CIM de 0,12

g/mL; 4% (2) CIM de 0,25 g/mL; 17% (8) CIM de 0,5 g/mL; 11% (5) CIM de 1

g/mL; 2% (1) CIM de 2 g/mL (cepa BORSA); 2% (1) CIM de 32 g/mL; 40% (18)

CIM de 64 g/mL e 13% (6) apresentaram CIM de oxacilina de 128 g/mL.

5.4- Antibiotipagem

O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi utilizado como

triagem inicial para posterior tipagem genotípica. Para a antibiotipagem foram

excluídos os resultados dos antimicrobianos amoxicilina+ácido clavulânico,

penicilina, oxacilina, vancomicina e mupirocina uma vez que todas as cepas

apresentaram resultados idênticos (resistência para os 3 primeiros e sensibilidade

para os 2 últimos). Deste modo, as 30 cepas consideradas MRSA (5 isoladas de

trabalhadores e 25 de pacientes), confirmadas pelo crescimento em screen agar,

puderam ser agrupadas em 4 antibiotipos designados pelas letras maiúsculas A, B,

C e D, sendo que o antibiotipo A foi o mais freqüentemente encontrado (Tabela 2).

Foi possível observar a predominância de cada antibiotipo de acordo

com o setor hospitalar ao qual o portador ou paciente de onde foi isolada a cepa

pertencia. Assim, os antibiotipos das amostras isoladas dos trabalhadores

hospitalares apresentaram semelhanças com os antibiotipos encontrados nos

pacientes atendidos nos setores aos quais pertenciam estes trabalhadores, podendo

sugerir um elo epidemiológico entre estas cepas. Os dados referentes à distribuição

de cada antibiotipo nos diferentes setores do hospital podem ser observados na

Tabela 3.

Tabela 2: Freqüência dos antibiotipos encontrados entre as 30 amostras de MRSA. Presidente

Prudente – SP, julho a dezembro de 2002.

Perfil de Sensibilidade*

Antibiotipo

CLO CIP CLI ERI GEN SUT TET

Nº de Cepas (%)

A R R R R R R R 26 (87%)

B S S S S S S S 2 (7%)

C S R R R R S R 1 (3%)

D R R R R R R S 1 (3%)

*CLO (Cloranfenicol); CIP (Ciprofloxacina); CLI (Clindamicina); ERI (Eritromicina); GEN

(Gentamicina); SUT (Sulfametoxazol + Trimetoprim); TET (Tetraciclina).

Tabela 3: Distribuição de cada antibiotipo de MRSA isolados de pacientes e trabalhadores

hospitalares de acordo com o setor hospitalar. Presidente Prudente – SP. Julho a dezembro de 2002.

Trabalhadores

Pacientes

Antibiotipo

UTI CM

UTI CM CC MI HEM

Total

A 02 01 09 06 06 01 01 26

B - 01 01 - - - - 02

C - - 01 - - - - 01

D 01 - - - - - - 01

Total 03 02 11 06 06 01 01 30

*UTI (Unidade de Terapia Intensiva); CM (Clínica Médica); CC (Clínica Cirúrgica); MI (Moléstias

Infecto-contagiosas); HEM (Hemodiálise).

5.5- PCR Multiplex

A padronização da técnica PCR Multiplex foi feita utilizando as

cepas-padrão citadas no item 4.8.4 de Material e Métodos.

Na Figura 5 podem ser observados os fragmentos amplificados

correspondentes aos genes femA, mecA e ileS-2. Na canaleta 1 observa-se um

fragmento de 686 pb correspondente ao gene femA, espécie-específico. Nas

canaletas 2 e 3 pode-se observar, respectivamente, o fragmento de 310 pb

correspondente ao gene mecA e o fragmento amplificado de 456 pb correspondente

ao gene ileS-2, além do fragmento de 686 pb.

Figura 5: Cepas utilizadas para padronização da técnica da

PCR Multiplex. Marcador de peso molecular de 100 pb (M);

ATCC 29213 (1); ATCC 43300 (2) e JJ1 (3)

800 pb

200 pb

100 pb

M 1

2 3 M

686 pb

310 pb

456 pb

A detecção molecular dos marcadores para os genes femA, mecA e

ileS-2 através de PCR Multiplex foi realizada para todos os 86 S. aureus, sendo 40

isolados de trabalhadores hospitalares e 46 isolados de pacientes. Os S. aureus

isolados de amostras biológicas de um mesmo paciente e que foram considerados

como uma única cepa (1-2P; 7-10P; 14-15P e 23-24P), foram avaliadas

individualmente nesta técnica. Assim, as cepas isoladas de pacientes totalizam 50

amostras.

Os resultados da identificação fenotípica por meio dos testes

convencionais descritos anteriormente foram totalmente compatíveis com os

resultados da amplificação do fragmento de 686 pb do gene femA espécie-

específico. Todas as amostras apresentaram sensibilidade à mupirocina pelo teste

da difusão em ágar com discos do antibiótico, o que foi confirmado pela ausência de

amplificação do fragmento de 456 pb do gene ileS-2. As 30 cepas MRSA,

confirmadas fenotipicamente pelo crescimento em screen agar, apresentaram

amplificação do fragmento de 310 pb do gene mecA. Por outro lado, as cepas que

apresentaram sensibilidade no teste da difusão e confirmadas pela ausência de

crescimento em screen agar não apresentaram amplificação desse fragmento,

assim como as cepas BORSA.

Os resultados da PCR Multiplex de todas as cepas de S. aureus

isoladas de trabalhadores hospitalares são mostrados nas Figuras 6 e 7, onde se

pode observar a amplificação do fragmento de 686 pb, correspondente ao gene

femA, em todas as cepas analisadas. A amplificação do fragmento de 310 pb

correspondente ao gene mecA que codifica resistência à meticilina/oxacilina pode

ser observada em apenas 5 cepas isoladas de trabalhadores hospitalares (2E, 6E,

19E, 24E e 34E).

Nas Figuras 8, 9 e 10 podem ser observados os fragmentos de 686

pb em todas as cepas isoladas de pacientes e também a amplificação do fragmento

de 310 pb em grande parte dessas cepas.

De acordo com o estatístico consultado, Prof. Dr. Sérgio do

Nascimento Kronka da Universidade Estadual Paulista – UNESP campus de

Jaboticabal, devido ao fato dos resultados terem sido exatamente iguais para os

métodos utilizados na identificação e avaliação de resistência à meticilina/oxacilina,

um teste χ

mostraria não significância e, portanto, não se comprovaria diferença

estatística entre esses métodos.

M 1E 2E 3E 4E 5E 6E 7E 8E 9E 10E 11E 12E 13E 14E 15E 16E 17E 18E 19E 20E M

800

300

100

310

686

M 21E 22E 23E 24E 25E 26E 27E 28E 29E 30E 31E 32E 33E 34E 35E 36E 37E 38E 39E 40E M

800

300

100

Figuras 6 e 7: PCR Multiplex para os genes femA (686 pb), mecA (310 pb) e ileS-2

(456

pb) de cepas de S. aureus isoladas de trabalhadores hospitalares. M

: Marcador de peso

molecular de 100 p

M 41P 42P 43P 44P 45P 46P 47P 48P 49P 50P

800

300

100

Figuras 8, 9 e 10: PCR Multiplex para os genes femA (686 pb), mecA (310 pb

) e

ileS-2 (456 pb) de cepas de S. aureus isoladas de pacientes. M: Marca

dor de peso

molecular de 100 pb.

800

300

100

M 21P 22P 23P 24P 25P 26P 27P 28P 29P 30P 31P 32P 33P 34P 35P 36P 37P 38P 39P 40P M

800

300

100

M 1P 2P 3P 4P 5P 6P 7P 8P 9P 10P 11P 12P 13P 14P 15P 16P 17P 18P 19P 20P M

686 pb

310 pb

5.6- Tipagem molecular (RAPD)

O método RAPD foi realizado para todas as cepas MRSA (5 isoladas

de trabalhadores hospitalares e 25 de pacientes) utilizando os primers OPA05,

OPA11 e MecA2, descritos em Material e Métodos, incluindo as cepas isoladas de

um mesmo paciente (1-2P; 7-10P; 14-15P e 23-24P), que foram avaliadas

individualmente. A utilização desses 3 primers em uma mesma reação de PCR

produziu de 4 a 16 fragmentos com pesos moleculares que variaram de 760 a mais

de 3054 pb (Figura 11).

O dendrograma foi construído por meio do programa GelCompar II

que utiliza o coeficiente de Dice de similaridade e UPGMA (Unweighted Pair

Group Method with Arithmetic Mean) de agrupamento (Figura 12). Diferenças na

intensidade das bandas não foram consideradas.

Por meio do RAPD, as 30 cepas MRSA puderam ser agrupadas em

8 grupos designados por algarismos romanos (I-VIII). Os grupos genotípicos I e IV

abrangeram o maior número de cepas, 09 (30%) e 13 (43%) respectivamente. Todas

as 09 cepas pertencentes ao grupo I apresentaram o mesmo antibiotipo (A). Entre as

cepas incluídas no grupo IV, 12 apresentaram o antibiotipo A e apenas uma cepa

(21P) apresentou antibiotipo C (sensibilidade ao sulfametoxazol + trimetoprim e

cloranfenicol). A similaridade genética entre esses dois grupos genotípicos foi de

90%, sugerindo uma forte relação genética entre eles.

O grupo genotípico V, composto por três cepas (2E, 6E e 3P),

apresentou 93% de similaridade genética com o grupo IV e, assim, apresentou

também cerca de 90% de similaridade com o grupo I.

Os grupos II, III, VI, VII e VIII incluem apenas uma cepa cada. Os

grupos genotípicos II e III apresentaram cerca de 93% de similaridade genética com

as cepas pertencentes ao grupo genotípico I e, com os grupo genotípicos IV e V a

similaridade genética foi de cerca de 90%. Assim, das 30 cepas analisadas, 27

(90%) que compõem os grupos genotípicos I, II, III. IV e V apresentaram 90% ou

mais de similaridade genética entre si.

A cepa 36P (grupo genotípico VI) apresentou pouco mais de 80% de

similaridade genética com os grupos citados anteriormente, podendo representar

uma moderada similaridade genética.

As cepas 28P (grupo genotípico VII) e 24E (grupo genotípico VIII)

apresentaram o perfil de sensibilidade mais amplo entre as cepas MRSA estudadas,

ou seja, resistência somente aos β-lactâmicos (antibiotipo B). A similaridade genética

entre esses dois grupos e os demais foi de 50% e 40% respectivamente, revelando

maior distância genética entre as cepas analisadas nesse estudo.

As cepas 6E e 34E foram isoladas do mesmo trabalhador hospitalar,

em coletas realizadas com um intervalo de tempo de três meses. Essas cepas fazem

parte dos grupos genotípicos V e IV, respectivamente. Esses dois grupos

apresentam 93% de similaridade entre si e foram considerados grupos

geneticamente relacionados.

A combinação dos resultados obtidos pela genotipagem com os

resultados da antibiotipagem pode ajudar na diferenciação de subgrupos. Dessa

forma, o grupo genotípico IV, contendo 13 cepas, poderia ser dividido em dois

subgrupos: IV-A, para as 12 cepas que apresentaram antibiotipo A e subgrupo IV-C

para uma cepa que apresentou antibiotipo C. Por esse mesmo critério, o grupo V

(composto por três cepas) poderia ser dividido em dois subgrupos: V-A (2 cepas) e

V-D (1 cepa).

Os dados referentes aos grupos genotípicos definidos pelo RAPD,

antibiotipo, CIM de oxacilina, unidade ou setor hospitalar e tipo de amostra biológica

referentes às 30 cepas MRSA podem ser observados na Tabela 4.

Figura

Fragmentos gerados pela técnica RAPD utilizando os primers

OPA05,

OPA11

e MecA2 em DNA cromossômico de amostras MRSA isoladas de portadores

sadios (nº E) e pacientes (n°P); M: Marcador de peso molecular de 1Kb.

M 2E 6E 19E 24E 34E 1P 2P 3P 4P M M 5P 7P 10P 13P 14P 15P 18P 20P 21P M

3054

2036

1636

1018

506

M 22P 23P 24P 25P 28P 29P 35P 36P M M 37P 38P 40P 41P 43P 47P 49P 50P M

3054

2036

1636

1018

506

Figura

Dendrograma construído com base no coeficiente de

similaridade de

Dice ilustrando a relação das cepas MRSA isoladas de trabalhadores hospitalares

(nºE) e pacientes hospitalizados (nºP) no período de julho a dezembro de 2002.

Dice (Opt:1.00%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

RAPD

100

24P

23P

24P

35P

37P

40P

43P

49P

47P

29P

20P

25P

19E

34E

10P

13P

15P

14P

15P

10P

22P

21P

41P

38P

18P

36P

28P

24E

UTI

Cl Med

Cl Cir

UTI

Cl Med

Cl Cir

UTI

Cl Cir

Cl Med

UTI

Cl Med

UTI

Cl Med

UTI

Cl Cir

UTI

Cl Med

Hemo

UTI

Cl Med

50P

Grupo I

Grupo II

Grupo III

Grupo IV

Grupo V

Grupo VI

Grupo VII

Grupo VIII

Tabela 4: Dados referentes às 30 cepas MRSA isoladas de portadores e pacientes utilizadas em

estudo epidemiológico no período de julho a dezembro de 2002. Hospital Universitário “Dr. Domingos

Leonardo Cerávolo”, Presidente Prudente (SP).

Padrão

RAPD

Nº da

Cepa

Antibiotipo

CIM de

oxacilina

(g/mL)

Unidade

Hospitalar

Iniciais Amostra

Biológica**

Data da

Coleta

23-24P* A 64 UTI ARB P-PC 17/09-20/09

35P A 64 CL. MÉD. LGP PC 19/10

37P A 128 CL. MÉD. JRM SG 27/10

40P A 64 CL. CIR. ABM PC 07/11

43P A 64 UTI JRO IC 23/11

49P A 64 UTI RCS LA 10/12

50P A 128 CL. MÉD. JBM PC 22/12

47P A 64 CL. CIR. MEL IC 02/12

29P A 128 UTI WLA PC 01/10

II 20P A 128 UTI JPS IC 13/09

III 25P A 128 C. CIR. EE IC 20/09

19E A 64 CL. MÉD. CRSM FN 11/09

34E’ A 64 UTI EAB FN 04/11

1-2P* A 64 CL. MÉD. MIO PC-SG 04/07-04/07

4P A 64 MI VCP SG 18/07

7-10P* A 64 UTI ERS PD-SG 06/08-09/08

5P A 64 UTI RCS SO 21/07

13P A 64 CL. MÉD. AR SG 09/07

14-15P* A 64 UTI WBS PC-SG 24/08-25/08

22P A 64 UTI VA P 16/09

21P C 64 UTI JFC PC 13/09

41P A 64 CL. CIR. EPSM PC 07/11

38P A 64 CL. CIR. HGP PC 01/11

18P A 64 CL. CIR. JRCJ A 08/09

2E D 64 UTI TWN FN 05/08

6E’ A 64 UTI EAB FN 05/08

3P A 64 CL. MÉD. FMM PC 09/07

VI 36P A 128 HEM. AGM SG 22/10

VII 28P B 32 UTI DOF SG 01/10

VIII 24E B 32 CL. MÉD. JCP M 16/10

‘Mesmo trabalhador hospitalar. *Amostras diferentes do mesmo paciente. **FN (Fossas Nasais); IC

(Incisão Cirúrgica); LA (Líquido Ascítico); M (Mão); PC (Ponta de Cateter); PD (Ponta de Dreno); A

(Amostra Abdominal); SG (Sangue); SO (Secreção Ocular); P (Amostra Pulmonar).

6- Discussão

A meticilina foi introduzida em 1959 para tratar doenças infecciosas

causadas por S. aureus resistentes à penicilina G. O primeiro isolamento de uma

cepa resistente à meticilina foi relatado no Reino Unido em 1961 por Jevons, em

seguida foram relatados isolamentos de MRSA em outros países da Europa, Japão,

Austrália e Estados Unidos (apud ENRIGHT et al., 2002). Hoje, infecções

provocadas por MRSA ocorrem em hospitais de todo o mundo e têm ocorrido

também na comunidade. Cepas MRSA se adaptaram bem à pressão seletiva

exercida pelo uso de antimicrobianos. Assim, cepas MRSA geralmente apresentam

múltipla resistência e podem apresentar sensibilidade somente aos glicopeptídeos

(HIRAMATSU et al., 2001).

O Hospital Universitário “Dr. Domingos Leonardo Cerávolo” da

Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, em Presidente Prudente (SP), está em

funcionamento desde 1997. No entanto, nenhum estudo foi realizado visando

conhecer melhor os principais agentes de processos infecciosos, sua epidemiologia

e perfis de sensibilidade aos antimicrobianos. Os dados referentes às infecções por

MRSA somente agora, com o desenvolvimento do presente trabalho, começam a ser

estudados.

De acordo com Rodrigues (1997), é recomendável que cada

instituição tenha seu mapa de agentes etiológicos, bem como o perfil de

sensibilidade aos antimicrobianos. Segundo o mesmo autor, esse conhecimento tem

fundamental importância para orientação na terapêutica assistencial, tornando

menos empírica possível a utilização de antibióticos de amplo espectro em situações

emergenciais. Contribuindo, desse modo, para a redução da pressão seletiva

exercida sobre os microrganismos.

Desde o primeiro ano de funcionamento, a freqüência de cepas de

S. aureus resistentes à meticilina no Hospital Universitário pesquisado nesse

trabalho, passou de 40,5% para 60,3% em 2002*. No período de julho a dezembro

de 2002, 54,3% das cepas de S. aureus isoladas de pacientes atendidos nessa

Instituição de Saúde apresentaram resistência à meticilina. Tavares (2000), em

artigo de revisão, relata que 30 a 100% dos S. aureus isolados em diferentes regiões

do Brasil são resistentes à meticilina. Teixeira et al. (1995), encontraram uma média

de 56% de cepas resistentes à meticilina em estudo abrangendo hospitais de várias

regiões do Brasil.

A incidência de MRSA pode variar entre diferentes hospitais, no

entanto, é certo que na maioria dessas instituições a prevalência aumentou

gradativamente. Em estudo realizado entre 1990 e 1997 foi observado um aumento

de 260% na incidência de MRSA em diversos hospitais participantes de um

programa de monitoramento (BARLETT et al., 2000 apud GRAFFUNDER &

VENEZIA, 2002). O conhecimento dos fatores que podem contribuir para o

desenvolvimento de processos infecciosos por MRSA é objeto de estudo em

diversos centros de pesquisa. Graffunder & Venezia (2002), destacaram como

principais fatores para o desenvolvimento dessas infecções a hospitalização prévia;

internações prolongadas; cirurgia; nutrição parenteral e o uso de quinolonas, em

especial levofloxacina.

Cepas MRSA, em geral, são introduzidas em um hospital por meio

de um paciente colonizado ou um indivíduo da equipe de trabalhadores hospitalares

(MULLIGAN et al., 1993). As narinas anteriores são o principal reservatório de S.

aureus e a transmissão ocorre principalmente através de contato direto e também

por equipamentos e utensílios contaminados, uma vez que, essa bactéria possui boa

resistência às condições ambientais. Dessa forma, uma vez introduzida e

disseminada em um hospital, dificilmente é erradicada desse ambiente (DIAS et al.,

1997). Wagenvoort et al. (2000) encontraram cepas MRSA em 26% dos teclados de

computadores e 15% das torneiras dentro de uma UTI, demonstrando ampla

contaminação ambiental.

No Hospital Universitário, ora estudado, 68% dos trabalhadores

hospitalares não carreavam S. aureus. Por outro lado, 27% carreavam S. aureus

sensível à meticilina (MSSA); 4% carreavam MRSA e 1% carreava BORSA. Do total

de 32% de trabalhadores hospitalares portadores de S. aureus, em 12,5% dos

portadores foram isolados S. aureus das mãos e narinas, sendo que, em três desses

indivíduos os microrganismos isolados apresentaram sensibilidade à meticilina

(MSSA) e em um trabalhador os isolados foram identificados como BORSA.

Segundo Kluytmans et al. (1997), a taxa de colonização da equipe

hospitalar por S. aureus pode variar de 16 a 56%. Assim, a taxa de portadores

encontrada no Hospital Universitário (32%), encontra-se próxima da média

encontrada por esses autores. Por outro lado, Mulligan et al. (1993) relataram que a

taxa de colonização por MRSA possui um intervalo maior, entre 2 e 56%. No

presente estudo, a taxa de 4% de colonização da equipe hospitalar por MRSA

encontra-se próxima ao limite mínimo citado por esse autor.

As cepas 6E e 34E foram isoladas do mesmo trabalhador hospitalar

com um intervalo de três meses entre as coletas das amostras. O perfil de

sensibilidade aos antimicrobianos das duas cepas é idêntico (antibiotipo A). No

entanto, através da análise do padrão de bandas gerados pela técnica RAPD, as

duas cepas não estão incluídas no mesmo grupo genotípico. A cepa 6E faz parte do

grupo genotípico V, e a cepa 34E pertence ao grupo genotípico predominante (grupo

IV). Entretanto, a similaridade genética entre esses dois grupos genotípicos foi de

93%, demonstrando grande relação genética.

Nesse estudo, apenas os portadores de cepas MRSA foram

submetidos a uma nova coleta de amostra, diferentemente de outros autores que

determinaram a persistência do carreamento em portadores de S. aureus

independentemente de sua sensibilidade à oxacilina. Kluytmans et al. (1997),

demonstraram que 20% dos trabalhadores hospitalares eram carreadores

persistentes de S. aureus, enquanto, VandenBergh et al. (1999) encontraram 36%

de indivíduos carreando de modo persistente esse microrganismo.

O perfil de sensibilidade mais amplo, apresentado pela maioria das

cepas isoladas dos trabalhadores hospitalares (Figura 2) pode indicar que esses

indivíduos foram colonizados por cepas extra-hospitalares. De acordo com

Chambers (2001), ao contrário de cepas hospitalares que apresentam resistência a

múltiplos antimicrobianos, cepas isoladas da comunidade tendem a apresentar

resistência somente aos β-lactâmicos. Isso porque a pressão seletiva exercida pelo

uso de antibióticos é muito menor na comunidade do que em hospitais.

O teste do Nitrocefin não detectou a enzima β-lactamase em todas

as cepas de S. aureus que apresentaram resistência à penicilina, avaliada pelo

método da difusão em ágar. Trinta e seis (90%) S. aureus isolados de trabalhadores

hospitalares apresentaram resistência à penicilina e, dentre esses, apenas 61% (22)

apresentaram resultado positivo no teste do Nitrocefin. Por outro lado, 45 (97,8%) S.

aureus isolados de pacientes eram resistentes à penicilina, mas apenas 84,5% (38)

destes, apresentaram resultado positivo para o teste do Nitrocefin. De acordo com

Livermore (1995), os testes para detecção de β-lactamase, que utilizam

cefalosporinas cromogênicas, podem fornecer resultado falso-negativo para

estafilococos que produzem baixos níveis da enzima. Desse modo, a pouca

quantidade de enzima seria insuficiente para produzir uma mudança de cor (de

amarelo para vermelho) adequadamente visível.

Os resultados da amplificação de seqüências marcadoras dos genes

femA (686 pb), ileS-2 (456 pb) e mecA (310 pb) apresentaram 100% de

concordância com os testes de sensibilidade (método da difusão e screen agar) e

também com os testes de identificação bacteriana convencionais. Outros autores

também relatam boa correlação entre métodos fenotípicos e genotípicos de

identificação e avaliação de resistência. Sakoulas et al. (2001) compararam a

amplificação do gene mecA com o teste de aglutinação MRSA-screen Latex (Denka

Seiken) para detecção de PBP2a e encontrou 99,7% de concordância entre os dois

métodos. Pérez-Roth et al. (2002) obtiveram 100% de concordância entre a PCR

Multiplex para amplificação de fragmentos dos genes femB, mecA e ileS-2 e testes

convencionais de identificação e também com a técnica da difusão para avaliação

da sensibilidade à oxacilina e mupirocina.

Embora S. aureus seja uma bactéria de fácil crescimento e os testes

de identificação sejam de fácil execução, a identificação e detecção de resistência

de forma rápida são muito importantes para o diagnóstico e pronto tratamento de

processos infecciosos e também para o controle de infecções hospitalares, uma vez

que o paciente afetado por cepas multi-resistentes pode ser mais rapidamente

tratado e isolado, se necessário. Nesse sentido, a utilização de técnicas mais

rápidas, como a PCR Multiplex é uma valiosa ferramenta para esse fim.

Nas técnicas convencionais, desde o isolamento primário até a

leitura e interpretação do antibiograma decorrem cerca de 48 a 72 horas, enquanto

que para a técnica da PCR Multiplex, cerca de 6 a 8 horas após o isolamento do

patógeno são suficientes para o diagnóstico. Técnicas de extração de DNA mais

simples e rápidas podem ser adotadas tornando o diagnóstico ainda mais rápido.

Nunes et al. (1999) e Pérez-Roth et al (2001) utilizaram aquecimento a 100°C no

protocolo de extração de DNA, reduzindo custo e tempo para o diagnóstico. Mason

et al. (2001) propuseram uma técnica de extração a ser aplicada no próprio

espécime clínico. Nesse estudo, os autores desenvolveram uma técnica de extração

aplicada diretamente em amostras retiradas do frasco de hemocultura, sem a

necessidade de isolamento do patógeno, conseguindo, desse modo, um diagnóstico

mais rápido.

A utilização de vários primers destinados à amplificação de

fragmentos de diferentes genes de resistência e genes espécie-específicos é uma

alternativa bastante atraente. Assim, em uma única reação de amplificação pode-se

obter a identificação e análise da resistência do agente infeccioso. No entanto, a

amplificação simultânea de fragmentos-alvo, com diferentes tamanhos, pode ser

dificultada, uma vez que a amplificação de fragmentos menores é favorecida e isso

resulta em quantidades diferentes dos produtos amplificados. Bej et al. (1990)

recomendam a utilização de diferentes concentrações de primers, assim, primers

direcionados à amplificação de fragmentos maiores devem estar em maior

concentração para que a quantidade dos produtos da amplificação seja semelhante.

Nenhuma cepa utilizada no presente trabalho possuía

simultaneamente os três genes pesquisados. Nunes et al. (1999) relataram a

dificuldade em amplificar simultaneamente esses mesmos genes. Esses autores

realizaram a amplificação de fragmentos dos genes femA, mecA e ileS-2 em duas

reações de amplificação, uma reação para o gene femA e outra reação para os

outros dois genes. No presente estudo, a amplificação simultânea dos fragmentos

correspondentes aos genes femA e ileS-2, presentes na cepa JJ1 cedida por uma

das pesquisadoras participantes do referido trabalho, foi possível graças à utilização

de quantidades duas vezes maiores (50 pmol) dos primers F1 e F2.

Apesar de fornecer resultados mais rápidos e de ser considerada a

técnica padrão-ouro para detecção de resistência, a técnica da PCR ainda é

inacessível para a maioria dos laboratórios de análises clínicas, uma vez que, são

necessários equipamentos e reagentes caros.

A PCR auxilia ainda a diferenciação entre cepas MRSA e cepas

BORSA. De acordo com Tomasz et al. (1989 apud NICOLA et al., 2000), cepas

BORSA podem ser hiper-produtoras de β-lactamase ou apresentar modificações nas

PBP regulares, tendo como conseqüência baixa afinidade dessas PBP com os β-

lactâmicos. Cepas com essa última característica são raramente isoladas e foram

designadas pelos autores como MODSA (Modified PBP Staphylococcus aureus).

A resistência “borderline”, ou resistência mec-independente, é

chamada de falsa resistência, uma vez que, infecções provocadas por essas cepas

podem ser tratadas com antibióticos β-lactâmicos associados a um inibidor de β-

lactamase (FLUIT et al., 2001). Por outro lado, as infecções provocadas por cepas

MRSA devem ser tratadas com outro grupo antimicrobiano, geralmente um

glicopeptídeo. Assim, a diferenciação entre cepas MRSA e cepas BORSA pode

minimizar o uso de vancomicina e, dessa maneira, evitar a seleção de cepas de S.

aureus e Enterococcus spp. resistentes a esse antimicrobiano, além de diminuir os

custos do tratamento (LOWY, 2003).

De acordo com os critérios mais aceitos atualmente, cepas BORSA

podem ser caracterizadas pela positividade do teste do nitrocefin, sensibilidade à

amoxicilina + ácido clavulânico (halo  20mm), CIM de oxacilina de 2 a 4 g/mL e

ausência do gene mecA (VARALDO, 1993; MARTINEAU et al., 2000b; NICOLA et

al., 2000; FLUIT et al., 2001).

No presente estudo, foram isoladas 3 cepas BORSA, duas (35E e

36E) foram isoladas da mão e narina de um trabalhador hospitalar e uma cepa foi

isolada de secreção de mama de uma paciente (39P). Em nenhuma delas houve

amplificação do fragmento de 310 pb referente ao gene mecA (Figuras 3 e 5).

A mupirocina, empregada na eliminação de MRSA em portadores

sadios, é uma alternativa no tratamento de infecções por S. aureus, incluindo MRSA.

No entanto, a utilização de mupirocina no tratamento de processos infecciosos é

bastante limitada, uma vez que é um antimicrobiano de uso tópico.

Todas as 86 cepas de S. aureus isoladas nesse estudo

apresentaram sensibilidade a mupirocina, tanto no teste de sensibilidade aos

antimicrobianos convencional como na reação da PCR Multiplex (ileS-2

). A

incidência de cepas resistentes à mupirocina é bastante variada (KRISHMAN et al.,

2002; PÉREZ-ROTH et al., 2002; YUN et al., 2003). No Brasil, Nunes et al. (1999)

analisaram 50 cepas e encontraram 34% com alto nível de resistência e 34% com

baixo nível de resistência à mupirocina em um hospital do Rio de Janeiro.

De acordo com Eltringham (1997 apud MEHTAR 1998), baixo nível

de resistência à mupirocina não está relacionado com o uso excessivo de

mupirocina, ao contrário da resistência em alto nível. Esse tipo de resistência à

mupirocina não tem grande significado clínico uma vez que essas cepas podem ser

eliminadas aumentando-se a concentração do antibiótico. No entanto, cepas com

alto nível de resistência não podem ser erradicadas com mupirocina (HARBARTH et

al., 1999).

Existem relatos de sucesso na erradicação nasal de MRSA em

pequenos surtos (MEIER et al., 1996 apud MEHTAR, 1998). Nessa situação, a

primeira meta é identificar todos os portadores, incluindo pacientes e trabalhadores e

depois determinar a relação epidemiológica, por meio de testes de tipagem, desses

isolados. Em seguida, a erradicação pode ser feita nesses indivíduos associando-a a

outras medidas de controle de infecção (KLUYTMANS et al., 1997; HADDADIN et

al., 2002). Kotilainen et al. (2003) tiveram sucesso na eliminação de MRSA

epidêmico em um hospital finlandês. Nos países escandinavos menos de 1% dos S.

aureus isolados em pacientes hospitalizados apresentam resistência à meticilina.

Assim, os autores enfatizam a necessidade de adoção permanente de medidas

rígidas para a prevenção de infecções por cepas MRSA, tais como a educação

contínua dos trabalhadores hospitalares, o isolamento de pacientes infectados por

MRSA, acompanhamento de pacientes e trabalhadores expostos a indivíduos

infectados, eliminação das cepas em portadores entre outras medidas.

Em suma, o uso de mupirocina como tratamento profilático e

também para erradicação nasal de portadores é um assunto controverso. Existem

relatos descrevendo a emergência de cepas com alto nível de resistência

relacionada ao uso indiscriminado de mupirocina (MILLER et al., 1996).

Em uma revisão da literatura, Cooper et al. (2004) analisaram 46

trabalhos publicados relatando medidas de controle para infecções por MRSA e

concluíram que a medida mais efetiva em prevenir a transmissão de MRSA em

ambientes endêmicos é o isolamento do paciente. Landman et al. (2003) relataram

que medidas de controle e prevenção conseguiram diminuir a incidência de

infecções por uma cepa MRSA recentemente introduzida em um hospital americano,

no entanto, as medidas adotadas não produziram os mesmos resultados para

infecções provocadas pela cepa MRSA endêmica presente nessa mesma instituição.

De acordo com os dados obtidos no presente estudo, o uso de

mupirocina não seria indicado para erradicação de MRSA nos portadores, uma vez

que a incidência de infecções por esse microrganismo é alta desde a inauguração

desse hospital (40,5%). Além disso, deve-se considerar o risco de colonização por

outros microrganismos e o risco de seleção de cepas resistentes à mupirocina.

Das cepas MRSA isoladas no presente estudo, 26 (87%)

apresentam resistência ao cloranfenicol, clindamicina, ciprofloxacina, gentamicina,

sulfametoxazol + trimetoprim, tetraciclina e eritromicina (antibiotipo A), sendo que 3

foram isoladas de trabalhadores dos setores Clínica Médica (1) e UTI (2), e 23 cepas

foram isoladas de pacientes internados nos setores: UTI (9), Clínica Médica (6),

Clínica Cirúrgica (6), Hemodiálise (1) e no Setor de Moléstias Infecto-contagiosas

(1). Esse perfil de resistência é semelhante ao encontrado nas cepas mais

freqüentemente isoladas nos hospitais brasileiros. Esse clone, designado clone

multi-resistente brasileiro, é relatado nos hospitais do país desde 1990 e também

tem sido isolado na Argentina, Chile e Uruguai (TEIXEIRA et al., 1995; AIRES DE

SOUSA et al., 2001).

A aplicação da técnica PFGE poderia confirmar se as cepas isoladas

nesse estudo pertencem ao clone endêmico brasileiro predominante. De acordo com

a literatura, essa é a melhor técnica para tipagem de S. aureus pelo seu alto poder

discriminatório.

O RAPD é considerado uma boa alternativa para a caracterização

inicial de cepas de S. aureus isoladas em uma determinada Instituição,

apresentando poder discriminatório razoavelmente bom, rapidez e menor custo.

Tenover et al. (1997), salientam que a técnica PFGE é o método de referência para

tipagem de S. aureus. No entanto, o mesmo autor recomenda a utilização do RAPD

como técnica alternativa, quando a técnica de referência (PFGE) não está disponível

ou quando se tem como objetivo a discriminação de um grupo de isolados.

Uma outra vantagem do RAPD, ao contrário do PFGE, é a pouca

quantidade de DNA exigida para realização da técnica, uma vez que ocorrerá

amplificação de fragmentos do genoma bacteriano. Isso é especialmente importante

quando se trabalha com bactérias Gram-positivas que apresentam maior dificuldade

para a extração do DNA. Além disso, a técnica pode ser usada satisfatoriamente

para tipagem de outros microrganismos, tais como Candida albicans, Proteus

mirabilis, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas sp., Streptococcus mutans entre

outros, o que faz a técnica especialmente atraente para ser implementada no

laboratório de rotina (TAMBIC et al., 1997; DAUTLE et al., 2002).

A técnica RAPD não é indicada para estudos mais amplos, quando

se deseja comparar cepas isoladas em diferentes regiões. Cepas MRSA apresentam

pouca variação genética e, a maioria das cepas são derivadas de poucos clones.

Dessa maneira, é necessário que seja aplicada uma técnica de tipagem com alto

poder discriminatório capaz de revelar pequenas alterações genéticas (TENOVER et

al., 1997). Provavelmente a maior desvantagem da técnica RAPD seja a dificuldade

de padronização inter-laboratórios, pois diversos primers podem ser utilizados e,

além disso, a utilização de diferentes termocicladores, marcas de reagentes,

temperaturas de anelamento, métodos de extração e purificação do DNA podem

afetar o resultado final (POWER, 1996; DASSANAYAKE & SAMARANAYAKE,

2003).

Vários autores obtiveram bons resultados utilizando a técnica RAPD

em estudos epidemiológicos. Alguns estudos apresentaram resultados similares na

tipagem de MRSA utilizando PFGE e RAPD (TAMBIC et al., 1997; OLMOS et al.,

1998; FUNG et al., 2001; KONDOH et al., 2002).

Lee (2003), aplicou a técnica RAPD com dois primers para avaliar a

relação genética existente entre cepas MRSA isoladas de animais e sua potencial

transferência para humanos. Bartzavali-Louki et al. (2003) utilizaram a combinação

da antibiotipagem e RAPD para avaliar a relação clonal entre 57 cepas MRSA

isoladas durante dois anos em um hospital grego. Segundo esses mesmos autores,

apesar da técnica RAPD apresentar menor poder discriminatório, comparando-se

com PFGE, a combinação de diferentes primers pode determinar adequadamente a

clonalidade de cepas MRSA. Al-Thawadi et al. (2003), compararam os resultados de

três técnicas genotípicas, entre elas PFGE e RAPD, e obtiveram resultados

semelhantes na avaliação da relação genética existente entre as cepas analisadas.

No presente trabalho, foram utilizadas para tipagem as técnicas da

antibiotipagem e RAPD. A escolha desses métodos foi feita levando-se em

consideração a disponibilidade de equipamentos no Hospital Universitário da

UNOESTE e a possibilidade de aplicação futura dessas técnicas para tipagem de

outros microrganismos. A antibiotipagem possui fácil execução, é acessível a

qualquer laboratório de rotina e fornece resultados rápidos. A maior desvantagem é

o baixo poder discriminatório e a reprodutibilidade; entretanto, pode ser usado como

triagem inicial para determinar a relação entre os isolados (TENOVER et al., 1994;

WELLER, 2000).

Para a realização da técnica RAPD foram utilizados três primers

(OPA05, OPA11 e MecA2) que geraram de 4 a 16 fragmentos. A utilização desses

primers, em conjunto, não foi relatada na literatura consultada. O uso de um único

primer na reação do RAPD pode não fornecer número de bandas suficiente para

uma boa discriminação das cepas. Melhores resultados da técnica podem ser

conseguidos usando dois ou mais primers na reação. Byun et al. (1997),

compararam os resultados da técnica RAPD utilizando dois e cinco primers, na

primeira reação obtiveram seis grupos e na segunda, dez grupos.

Foi possível observar que, no Hospital Universitário pesquisado, há

predominância de cepas MRSA dos grupos genotípicos I (composto por 9 cepas) e

IV (composto por 13 cepas). Esses dois grupos compreendem 73,3% das cepas

MRSA isoladas.

As 30 cepas MRSA isoladas nesse estudo foram agrupadas em 4

antibiotipos e, pela técnica RAPD, em 8 grupos. Com a combinação dos dois

métodos de tipagem foi possível dividir alguns grupos em subgrupos. Assim, as

cepas pertencentes ao grupo genotípico IV (13 cepas) puderam ser divididas nos

subgrupos IV-A (12) e IV-C (1). As três cepas do grupo genotípico V puderam ser

divididas nos subgrupos V-A (2) e V-D (1). Todas as 26 cepas pertencentes ao

antibiotipo A apresentaram grande similaridade genética entre si (90%), com

exceção da cepa 36P que apresentou 80% de similaridade com as demais.

As cepas 21P (grupo genotípico IV-C) e 2E (grupo genotípico V-D)

apresentaram perfis de sensibilidade distintos: a primeira com sensibilidade ao

cloranfenicol e sulfametoxazol + trimetoprim (antibiotipo C), e a segunda com

sensibilidade apenas à tetraciclina (antibiotipo D). Apesar da diferença observada no

perfil de resistência dessas cepas e as pertencentes ao antibiotipo A, todas elas

apresentaram grande similaridade genética entre si. Os genes que codificam multi-

resistência em MRSA estão localizados em plasmídios e transposons, incluindo os

genes que codificam resistência à tetraciclina e trimetoprim (WITTE, 1999). De

acordo com Weller (2000), o perfil de sensibilidade pode ser influenciado por fatores

ambientais. Assim, é possível que os antibiogramas de dois isolados pertencentes a

um mesmo clone possam diferir devido à aquisição ou perda de plasmídios

carreando genes de resistência.

A cepa 24E apresentou o maior perfil de sensibilidade entre as

cepas MRSA estudadas (antibiotipo B), juntamente com a cepa 28P. Essas duas

cepas apresentaram resistência somente aos β-lactâmicos e foram as únicas que

apresentaram CIM de 32 g/mL para oxacilina. Essas cepas demonstraram maior

distância genética entre todas as cepas MRSA através da análise do padrão de

bandas gerado pela técnica RAPD. Apesar de apresentarem o mesmo perfil de

sensibilidade, as duas cepas apresentam baixa similaridade genética entre si e com

as demais.

De quatro pacientes (MIO, ERS, WBS e ARB) foram coletados 2

amostras biológicas para análise e, em cada uma dessas amostras foi isolado MRSA

com o mesmo perfil de sensibilidade. Em estudos epidemiológicos, isolados

bacterianos provenientes de um mesmo paciente devem ser considerados como

uma única cepa. Isso foi confirmado pela similaridade genética de 100% encontrada

entre estes isolados (1-2P; 7-10P; 14-15P e 23-24P).

No grupo genotípico IV estão incluídas a cepa 34E, isolada de

amostras nasal de um auxiliar de enfermagem da UTI, e as cepas 7-10P, 5P, 14-

15P, 21P e 22P, isoladas de pacientes internados também na UTI. O fato de ter sido

isolada uma cepa MRSA desse auxiliar de enfermagem com o mesmo perfil

genotípico das cepas isoladas de pacientes, atendidos nessa mesma unidade

hospitalar, pode sugerir a participação, direta ou indireta, desse portador na

epidemiologia das infecções por MRSA na UTI do hospital. Fato semelhante foi

observado com as cepas 19E, 1-2P e 13P, a primeira isolada de um trabalhador da

Clínica Médica e as duas últimas de pacientes internados nesse mesmo setor.

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) de oxacilina foi idêntica (64

g/mL) para todas as 16 cepas pertencentes aos grupos IV e V. Por outro lado, no

grupo genotípico I, seis cepas apresentaram esse mesmo valor e três cepas

apresentaram CIM de 128 g/mL (Tabela 4). Todos esse grupos apresentaram

grande similaridade genética e, as CIMs mais elevadas podem indicar maior indução

na expressão da resistência, uma vez que a expressão de resistência de S. aureus à

meticilina/oxacilina pode ser induzida por antibióticos β-lactâmicos, com exceção de

meticilina e oxacilina (FLUIT et al., 2001). Outros fatores também podem estar

envolvidos na expressão de resistência. De acordo com Berger-Bächi (1999), além

da produção de PBP2a, outros fatores codificados cromossomicamente estão

envolvidos na síntese e degradação do peptidoglicano e, portanto, podem influenciar

a expressão de resistência. O mesmo autor afirma que a presença de plasmídios

contendo os genes que regulam a produção de β-lactamase também influenciam a

expressão do gene mecA.

Como não foram realizadas coletas de amostras ambientais, não foi

possível certificar a presença de MRSA no ambiente. No entanto, os dados obtidos

sugerem que no Hospital Universitário “Dr. Domingos Leonardo Cerávolo”, em

Presidente Prudente - SP, existem duas cepas predominantes (I e IV), com alta

similaridade genética entre si, que estão disseminadas por diversos setores do

hospital pesquisado, colonizando alguns trabalhadores hospitalares e provocando

doença infecciosa nos pacientes atendidos.

7- Conclusões

• Entre os 100 trabalhadores do Hospital Universitário “Dr. Domingos Leonardo

Cerávolo” da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, em Presidente

Prudente (SP), que aceitaram participar desse estudo, 68 (68%) não eram

portadores de S. aureus, 27 (27%) eram portadores de S. aureus sensível à

meticilina/oxacilina (MSSA), 4 (4%) eram portadores de S. aureus resistente à

meticilina/oxacilina (MRSA) e apenas 1 (1%) era portador de S. aureus

”borderline” resistente (BORSA).

• No período estudado (julho a dezembro de 2002), 54,3% (25) das cepas de S.

aureus isolados de pacientes internados no referido Hospital e que aceitaram

participar do estudo, apresentaram resistência à oxacilina, dado semelhante

aos encontrados em outros hospitais brasileiros. Por meio da antibiotipagem

foi possível estabelecer uma correlação inicial entre as cepas MRSA isoladas

de trabalhadores hospitalares (5) e de pacientes (25). Assim, 26 (87%) das

cepas MRSA foram agrupadas no antibiotipo A, sendo que 3 foram isoladas

de trabalhadores hospitalares e 23 de pacientes.

• Houve 100% de concordância entre os resultados das técnicas fenotípicas e

genotípica (PCR Multiplex) para identificação de S. aureus e para avaliar sua

resistência ou sensibilidade à oxacilina e mupirocina. A utilização da PCR

Multiplex é uma importante ferramenta no diagnóstico e controle de infecções

hospitalares, possibilitando mais rapidamente o isolamento e a orientação

terapêutica. A utilização de concentrações diferentes de primers possibilitou a

amplificação simultânea de fragmentos presentes nos genes femA e ileS-2.

• Por meio da antibiotipagem foi possível dividir os 30 MRSA isolados em 4

antibiotipos, sendo que o mais freqüente foi o antibiotipo A (87%). Por outro

lado, a genotipagem utilizando a técnica RAPD agrupou esses 30 isolados em

8 grupos (I a VIII). Das 26 cepas MRSA pertencentes ao antibiotipo A, 25

foram distribuídas em cinco grupos genotípicos e esses grupos apresentaram

similaridade genética de 90% ou mais. Apesar do menor poder discriminatório

apresentado pela antibiotipagem, com a combinação dos resultados dos dois

métodos de tipagem aqui empregados, foi possível dividir alguns grupos

genotípicos em subgrupos, aumentando assim a discriminação das cepas

isoladas nesse estudo.

• Apenas dois isolados (28P e 24E) apresentaram baixa similaridade genética

em relação às demais cepas, e possuíam também perfis de sensibilidade

(antibiotipo B) bastante distintos. Assim, pode-se concluir que, no Hospital

“Dr. Domingos Leonardo Cerávolo” – UNOESTE, em Presidente Prudente

(SP), existem duas cepas MRSA predominantes (grupos genotípicos I e IV), e

que apresentam alta similaridade genética entre si. Essas cepas

predominantes foram isoladas tanto de pacientes internados como de

trabalhadores hospitalares. Esses dados podem sugerir a importante

participação de trabalhadores hospitalares na epidemiologia das infecções

provocas por MRSA nesse hospital.

• A padronização da técnica RAPD no Hospital Universitário “Dr. Domingos

Leonardo Cerávolo” é de grande importância, uma vez que a técnica poderá

ser utilizada sistematicamente no estudo de tipagem epidemiológica de

agentes de infecção hospitalar.

8- Referências Bibliográficas

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Anexos

Anexo I- Modelo do Termo de Consentimento

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Eu, _____________________________________________________,

possuidor do RG ___________________________ concordo em participar

voluntariamente do projeto de pesquisa “Detecção molecular de resistência e

caracterização genotípica de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina

(MRSA)”. Estou ciente de que minha identidade será mantida em sigilo e que os

dados obtidos no estudo não poderão ser usados sem minha autorização. Fui

esclarecido verbalmente e por escrito dos objetivos desse trabalho e, por aceitar os

termos autorizo minha participação.

Responsável pelo projeto: Alexandre Braoios

Telefone para contato: (18) 2291083 e 2291084

Presidente Prudente, ______ de ______________ de 2002

Assinatura

Anexo II – Autorização para realização do trabalho no Hospital Universitário da

UNOESTE.

Anexo III – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Oeste

Paulista

Anexo IV – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Oeste

Paulista

Anexo V – Composição do Kit GFX Genomic Blood (Amersham Biosciences)

para extração do DNA bacteriano

COMPOSIÇÃO DO KIT GFX GENOMIC BLOOD (Amersham Biosciences)

• Solução de lise: 10 mM KHCO

; 155 mM HH

Cl; 0,1 mM EDTA

• Solução de extração: tampão contendo agente caotrópico e detergente.

• Solução de lavagem: Tampão Tris-EDTA.

• Colunas GFX: Colunas MicroSpin

contendo uma matriz de fibra de vidro.

• Tubos: microtubos com capacidade para 2 mL

REAGENTES NÃO FORNECIDOS PELO KIT:

• RNAse A (Qiagen): 20 mg/mL

• Tampão TE: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.

• Lisozima (Calbiochem®): 10 mg/mL em 10 mM Tris-HCl, pH 8.0

• Tampão lisozima: 0.1 M NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 5% Triton X-

100)

• Proteinase K (GIBCO®): 20 mg/mL em 10 mM Tris-HCl pH 8.0.

100

Anexo VI – Protocolo de extração do DNA bacteriano

• Centrifugar 1,5mL de cultura em caldo (35°C 18 hs), por 30 segundos a

14.000 rpm

• Desprezar o sobrenadante

• Adicionar 40 uL de tampão lisozima (agitar em vortex imediatamente até o

total desprendimento)

• Adicionar 10 uL de lisozima e agitar em vortex

• Deixar o tubo por 15min em T° ambiente (agitar ocasionalmente)

• Adicionar 10L Proteinase K e agitar. Incubar a 55° por 15 min.

• Adicionar 5 uL RNAse A, agitar e deixar por 15min em temperatura ambiente.

• Adicionar 500 L da solução de extração, agitar, deixar por 10 min em

temperatura ambiente agitando ocasionalmente.

• Transferir toda a mistura para a coluna GFX encaixada em um microtubo

• Centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.

• Descartar o líquido do tubo e colocar 500 L de sol de extração na coluna

(Centrifugar 8000 rpm 1 min).

• Descartar novamente o líquido depositado no tubo.

• Adicionar 500 L de solução de lavagem na coluna GFX.

• Centrifugar a velocidade máxima – 12 a 16000 rpm por 3 minutos.

• Descartar o líquido do tubo e transferir a coluna para um novo tubo de 1,5 mL

• Adicionar 200 l de tampão TE pré-aquecido a 70°C na coluna encaixada no

novo tubo e deixar por 1 minuto em temperatura ambiente.

• Centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.

• Manter o microtubo coletor a -20°C até o momento do uso.

101

Anexo VII – Fragmentos gerados pela técnica RAPD utilizando os primers

OPA5, OPA11 e MecA2 na amostra comunitária utilizada para avaliação da

capacidade discriminatória:

M: Peso molecular de 1 Kb

B: Branco (todos os reagentes sem amostra de DNA)

CC: Cepa comunitária

M B CC M

3054

506

1018

1636

2036

102

Anexo VIII – Dendrograma gerado pelo programa GelCompar II utilizando a

amostra comunitária para avaliação da capacidade discriminatória da técnica

RAPD

100

Dice (Opt:1.00%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

RAPD

Cepa comunitária

28P

24P

23P

35P

37P

40P

43P

49P

50P

47P

29P

20P

25P

19E

34E

13P

15P

14P

10P

22P

21P

41P

38P

18P

36P

24E

UTI

Cl Med

Cl Cir

UTI

Cl Med

Cl Cir

UTI

Cl Cir

Cl Med

UTI

Cl Med

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Cl Med

Hemo

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