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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL - FACULDADE DE MEDICINA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas: Psiquiatria
Dissertação de Mestrado
ASSOCIAÇÃO ENTRE GENES CANDIDATOS E MEDIDAS
NEUROPSICOLÓGICAS EM CRIANÇAS E ADOLESCENTES COM
TRANSTORNO DE DÉFICIT DE ATENÇÃO E HIPERATIVIDADE
Christian Kieling
Orientador
Luis Augusto Rohde
Porto Alegre
2007
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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL - FACULDADE DE MEDICINA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas: Psiquiatria
ASSOCIAÇÃO ENTRE GENES CANDIDATOS E MEDIDAS
NEUROPSICOLÓGICAS EM CRIANÇAS E ADOLESCENTES COM
TRANSTORNO DE DÉFICIT DE ATENÇÃO E HIPERATIVIDADE
Christian Kieling
Orientador
Luis Augusto Rohde
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Médicas: Psiquiatria
como requisito parcial para obtenção do grau
de Mestre em Psiquiatria.
Porto Alegre
2007
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2
K47a Kieling, Christian
Associação entre genes candidatos e medidas
neuropsicológicas em crianças e adolescentes com
transtorno de déficit de atenção e hiperatividade /
Christian Kieling ; orient. Luis Augusto Rohde – 2007.
89 f.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio
Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-
Graduação em Ciências Médicas: Psiquiatria, Porto Alegre,
BR-RS, 2007.
1. Transtorno da falta de atenção com hiperatividade 2.
Fenótipo 3. Criança 4. Adolescente 5. Genótipo 6.
Polimorfismo genético I. Rohde, Luis Augusto Paim II.
Título.
NLM: WS 350.8.A8
Catalogação Biblioteca FAMED/HCPA
3
Ask not what disease the person has,
but rather what person the disease has.
- (atribuído a) William Osler
4
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Luis Augusto Rohde, pelo incentivo, confiança e generosidade na orientação
deste trabalho. Incansável na busca pela excelência, aproximou fronteiras, me
permitindo enxergar mais longe. Sua paixão e dedicação pela pesquisa são altamente
contagiantes.
À Profa. Mara H. Hutz, paradigma de competência, pelo estímulo na reflexão
científica.
Aos colegas do Programa de Déficit de Atenção e Hiperatividade do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre, em especial ao grupo da genética: Tatiana Roman, Júlia
Genro, Ana Paula Guimarães, Cristian Zeni, Guilherme Polanczyk e Marcelo Schmitz.
Às psicólogas Heloísa Kaefer, Natália Soncini e Márcia Knijnik, pela realização dos
testes neuropsicológicos empregados nesta dissertação.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa
de estudos.
Aos colegas e professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas:
Psiquiatria, pelo acolhida e pelo convívio enriquecedor.
Aos professores da Faculdade de Medicina, pela compreensão e pelo suporte.
Aos colegas da ATM07/2 e de outras turmas, pela amizade e pelo apoio.
Aos meus pais, pelo amor e incentivo sempre renovados.
À Renata, pelo inestimável.
5
SUMÁRIO
Resumo 6
Abstract 8
1. Introdução 10
2. Base conceitual e revisão da literatura 14
2.1. Neurobiologia do TDAH 14
2.2. Neuropsicologia do TDAH 19
2.3. Endofenótipos em psiquiatria: fundamentos e aplicações 23
3. Objetivos 29
4. Proteção dos direitos humanos 30
5. Artigo 1 36
5.1. Versão em inglês 36
5.2. Versão em português 48
6. Artigo 2 61
7. Conclusão 86
6
RESUMO
Introdução: As heterogeneidades genotípica e fenotípica do transtorno de déficit de
atenção e hiperatividade (TDAH) impõem barreiras à elucidação de suas bases
biológicas. O uso do conceito de endofenótipo apresenta-se como estratégia através
da qual uma redução na variabilidade fenomenológica pode proporcionar um
aumento na sensibilidade a dimensões específicas do fenótipo, facilitando a
identificação de substratos genéticos do transtorno.
Métodos: Em uma amostra clínica de crianças e adolescentes com TDAH, buscou-se a
identificação de diferenças no desempenho neuropsicológico de acordo com grupo
genotípico. Os testes utilizados foram o Continuous Performance Test (CPT) e o
Wisconsin Card Sorting Test (WCST). Investigaram-se polimorfismos funcionais dos
genes para o receptor D4 de dopamina (DRD4) e para a enzima dopamina-beta-
hidroxilase (DBH). Análises de associação e familiares foram realizadas, avaliando-se
diferentes variáveis como potenciais confundidores.
Resultados: A presença de pelo menos um alelo de 7 repetições do DRD4 esteve
associada a um maior número de erros por comissão no CPT (p=0,036), enquanto que
e homozigose 44 protegeu contra erros tanto por omissão (p=0,017) quanto por
comissão (p=0,025), mesmo após ajuste para idade. Já em relação ao gene DBH, a
homozigose CC no polimorfismo -1021 C/T esteve associada a um menor desempenho
cognitivo medido por um escore fatorial que explicou 83,8% do desempenho nos
testes CPT e WCST (p=0,002). Este achado de associação foi corroborado por uma
análise familiar confirmatória.
7
Discussão: A redução da variabilidade fenomenológica por meio do uso de testes
neuropsicológicos de função executiva permitiu a identificação de subgrupos de
pacientes com TDAH associados a polimorfismos funcionais de genes que codificam
proteínas do sistema catecolaminérgico. Além disso, observou-se que o refinamento
do fenótipo TDAH por meio de medidas compostas de funções executivas pode ajudar
no entendimento das bases moleculares do transtorno. Tais achados fornecem
evidência adicional acerca do papel de polimorfismos dos genes DRD4 e DBH no
desempenho de crianças e adolescentes com o diagnóstico de TDAH em testes
neuropsicológicos de funções executivas.
8
ABSTRACT
Introduction: The genotypic and phenotypic heterogeneities of attention-deficit and
hiperactivity disorder (ADHD) hinder the elucidation of its biological bases. The use
of the concept of endophenotype is a strategy through which a reduction in the
phenomenological variability may enhance the sensitivity to specific dimensions of
the phenotype, therefore contributing to the identification of the genetic
underpinnings of the disorder.
Methods: In a clinical sample of children and adolescents with ADHD, differences in
neuropsychological performance were investigated according to genotypic group. The
following tests were used: the Continuous Performance Test (CPT) and the Wisconsin
Card Sorting Test (WCST). Functional polymorphisms of genes coding for the
dopamine D4 receptor (DRD4) and the dopamine-beta-hydroxylase enzyme (DBH)
were investigated. Association and family-based analyses were performed, assessing
different variables as potential confounders.
Results: For DRD4, the presence of at least one 7 repeat allele was associated with a
higher number of commission errors in the CPT (p=0.036), while the 44 homozigosity
protected against both errors of omission (p=0.017) and commission (p=0.025), even
after adjusting for age. Regarding the DBH gene, the CC homozigosity for the -1021
C/T polymorphism was associated with a worse cognitive performance as measured
by a factorial score that explained 83.8% of the performance in both CPT and WCST
(p=0.002). This association was corroborated by a confirmatory family-based analysis.
Discussion: The use of neuropsychological tests of executive function to reduce the
phenomenological variability of ADHD allowed the identification of subgroups of
9
patients associated with functional polymorphisms of genes that code for proteins
critical to catecholaminergic systems. In addition, the refinement of the ADHD
phenotype by means of composite measures of executive function can contribute to a
better understanding of the molecular bases of the disorder. These findings provide
further evidence on the role of DRD4 and DBH polymorphisms in the performance of
children and adolescents with ADHD in neuropsychological tests of executive
function.
10
1. Introdução
O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é uma síndrome ou
categoria diagnóstica definida pelo aparecimento precoce da tríade desatenção,
hiperatividade e impulsividade. Tais características devem se manifestar em um
padrão persistente de desatenção e/ou hiperatividade, mais freqüente e grave do
que aquele tipicamente observado em indivíduos em nível equivalente de
desenvolvimento (APA, 1994). De acordo com os critérios diagnósticos da quarta
edição do Manual Diagnóstico e Estatístico da Associação Norte-Americana de
Psiquiatria (DSM-IV), alguns dos sintomas que causam prejuízo devem estar presentes
em dois ou mais contextos e ter início antes dos sete anos de idade. Deve, ainda,
haver evidência clara de interferência no funcionamento social, acadêmico ou
ocupacional do indivíduo.
O fenótipo do TDAH está associado a um prejuízo funcional abrangente, com início na
infância e que com freqüência persiste até a idade adulta. Crianças com TDAH podem
apresentar baixo rendimento escolar, histórico de repetências, suspensões ou
expulsões e dificuldades de relacionamento com pares (Lahey et al, 2004). Na
adolescência, observa-se um maior número de acidentes com lesões físicas (Swensen
et al, 2004). Ao longo do tempo, indivíduos com TDAH têm maior chance de
desenvolver outros transtornos psiquiátricos, particularmente transtornos de humor,
abuso/dependência de substâncias e personalidade anti-social (Biederman et al,
1996; Wilens et al, 2004). Em conjunto, tais características traduzem-se em escores
inferiores em medidas de qualidade de vida (Klassen et al, 2004).
O diagnóstico de TDAH é clínico e baseado em critérios operacionais que variam de
acordo com a classificação nosológica empregada. Os critérios propostos pelo DSM-IV
11
exigem a presença de pelo menos seis de nove sintomas de desatenção e/ou de
hiperatividade/impulsividade, conforme apresentado na Tabela 1. A partir da
distribuição de sintomas entre os diferentes domínios, pode-se definir um dos três
subtipos de TDAH: predominantemente desatento (seis ou mais sintomas de
desatenção e menos de seis sintomas de hiperatividade/impulsividade);
predominantemente hiperativo/impulsivo (seis ou mais sintomas de
hiperatividade/impulsividade e menos de seis sintomas de desatenção); ou
combinado (seis ou mais sintomas em ambas as dimensões).
Contudo, a variabilidade na apresentação clínica do TDAH supera em muito a divisão
tripartite do transtorno, cuja heterogeneidade está relacionada a fatores como idade
de início, gênero, perfil de comorbidades, intensidade de sintomas e resposta ao
tratamento. Além disso, embora a abordagem proposta pelo DSM-IV seja de natureza
categórica, o próprio estabelecimento de um ponto de corte (número mínimo de
sintomas) para a caracterização do diagnóstico evidencia o caráter dimensional do
TDAH.
Contrastando com as diretrizes do DSM-IV, a definição de transtorno hipercinético
(TH) da décima revisão da Classificação Estatística Internacional de Doenças e
Problemas Relacionados à Saúde (CID-10) requer a presença de sintomas nas três
dimensões (i.e., desatenção, hiperatividade e impulsividade). Uma outra diferença
importante entre os dois sistemas classificatórios é a possibilidade de diagnóstico
simultâneo de comorbidades. Enquanto o DSM-IV exige apenas que os sintomas de
TDAH não sejam mais bem explicados por outro transtorno mental, a CID-10 não
permite o diagnóstico de TH na vigência de transtornos de ansiedade, bem como
durante episódios maníacos ou depressivos (WHO, 1996).
12
Tabela 1. Critérios diagnósticos para transtorno de déficit de atenção e
hiperatividade
A. Ou (1) ou (2)
(1) seis (ou mais) dos seguintes sintomas
de desatenção persistiram por pelo
menos 6 meses, em grau mal-adaptativo
e inconsistente com o nível de
desenvolvimento:
(2) seis (ou mais) dos seguintes
sintomas de hiperatividade persistiram
por pelo menos 6 meses, em grau mal-
adaptativo e inconsistente com o nível
de desenvolvimento:
(a) freqüentemente deixa de prestar
atenção a detalhes ou comete erros por
descuido em atividades escolares, de
trabalho ou outras
(a) freqüentemente agita as mãos ou
os pés ou se remexe na cadeira
(b) com freqüência tem dificuldades para
manter a atenção em tarefas ou
atividades lúdicas
(b) freqüentemente abandona sua
cadeira em sala de aula ou outras
situações nas quais se espera que
permaneça sentado
(c) com freqüência parece não escutar
quando lhe dirigem a palavra
(c) freqüentemente corre ou escala
em demasia, em situações nas quais
isto é inapropriado (em adolescentes
e adultos, pode estar limitado a
sensações subjetivas de inquietação)
(d) com freqüência não segue instruções
e não termina seus deveres escolares,
tarefas domésticas ou deveres
profissionais (não devido a
comportamento de oposição ou
incapacidade de compreender instruções)
(d) com freqüência tem dificuldade
para brincar ou se envolver
silenciosamente em atividades de
lazer
(e) com freqüência tem dificuldade para
organizar tarefas e atividades
(e) está freqüentemente “a mil” ou
muitas vezes age como se estivesse “a
todo vapor”
(f) com freqüência evita, antipatiza ou
reluta a envolver-se em tarefas que
exijam esforço mental constante (como
tarefas escolares ou deveres de casa)
(f) freqüentemente fala em demasia
(g) com freqüência perde coisas
necessárias para tarefas ou atividades
(por ex., brinquedos, tarefas escolares,
lápis, livros ou outros materiais)
(g) freqüentemente dá respostas
precipitadas antes de as perguntas
terem sido completadas
(h) é facilmente distraído por estímulos
alheios à tarefa
(h) com freqüência tem dificuldade
para aguardar sua vez
(i) com freqüência apresenta
esquecimento em atividades diárias
(i) freqüentemente interrompe ou se
mete em assuntos de outros (por ex.,
intromete-se em conversas ou
brincadeiras)
13
B. Alguns sintomas de hiperatividade-impulsividade ou desatenção que causaram
prejuízo estavam presentes antes dos 7 anos de idade.
C. Algum prejuízo causado pelos sintomas está presente em dois ou mais
contextos (por ex., na escola [ou trabalho] e em casa).
D. Deve haver claras evidências de prejuízo clinicamente significativo no
funcionamento social, acadêmico ou ocupacional.
E. Os sintomas não ocorrem exclusivamente durante o curso de um transtorno
invasivo do desenvolvimento, esquizofrenia ou outro transtorno psicótico e não
são melhor explicados por outro transtorno mental (por ex., transtorno do humor,
transtorno de ansiedade, transtorno dissociativo ou um transtorno de
personalidade).
A prevalência do TDAH é estimada em torno de 5% na população de crianças e
adolescentes em diferentes regiões geográficas. De acordo com um recente estudo
de meta-regressão (Polanczyk et al, 2007), a discrepância entre os valores de
prevalência em diferentes estudos é explicada em grande medida pela utilização de
diferentes instrumentos diagnósticos. Estudos que investigaram o construto TDAH em
diferentes países evidenciaram a validade do diagnóstico em contextos distintos
(Rohde, 2002). Tais achados, em conjunto com um crescente corpo de outras
evidências científicas, sugerem fortemente a presença de componentes
neurobiológicos na fisiopatologia do TDAH.
A elucidação das bases biológicas do transtorno pode se beneficiar de ferramentas
auxiliares à entrevista clínica que permitam uma redução na variabilidade fenotípica
observada entre indivíduos com TDAH. Nesse sentido, dificuldades evidenciadas em
testes neuropsicológicos, que também interferem na adaptação do sujeito às
demandas sociais, sobretudo as escolares, são particularmente úteis na
caracterização de fenótipos mais homogêneos.
14
2. Base conceitual e revisão da literatura
2.1. Neurobiologia do transtorno de déficit de atenção e hiperatividade
Alterações em diferentes sistemas neurotransmissores têm sido implicadas nos
processos fisiopatológicos subjacentes ao TDAH. As vias do sistema catecolaminérgico
– relacionadas à farmacodinâmica dos principais medicamentos utilizados no
tratamento do TDAH – vêm sendo o principal alvo de investigação. Evidências
provenientes de pesquisas em neuroimagem, bioquímica e genética têm associado
sistematicamente estruturas e funções relacionadas aos sistemas dopaminérgico e
noradrenérgico com o TDAH.
Estudos realizados nas últimas duas décadas demonstraram consistentemente que
indivíduos com TDAH possuem um volume cerebral menor do que controles pareados
(Casey et al, 2007). Um estudo longitudinal conduzido por Castellanos et al (2002)
revelou que alterações precoces em crianças diagnosticadas com TDAH, quando
comparadas a um grupo controle, mantêm-se constantes ao longo do
desenvolvimento (com exceção do núcleo caudado, para o qual a diferença entre
casos e controles torna-se mínima na adolescência). Uma metanálise recentemente
publicada identificou diferenças volumétricas significativas entre indivíduos com
TDAH e controles nas seguintes regiões encefálicas: vermis cerebelar, sobretudo
lóbulos ínfero-posteriores; esplênio do corpo caloso; núcleo caudado (somente à
direita); e volume cerebral total (Valera et al, 2007). Em suma, estudos funcionais e
estruturais convergem para o envolvimento de regiões de intensa atividade
catecolaminérgica, enfatizando sobretudo o córtex pré-frontal e suas conexões com o
córtex parietal, os núcleos da base e o cerebelo.
15
Catecolaminas, especificamente dopamina (DA) e noradrenalina (NA), são essenciais
para a ativação de regiões cerebrais como o córtex pré-frontal, e um número
crescente de estudos implica o sistema catecolaminérgico na fisiopatologia do TDAH
(Fischman & Madras, 2005). O mecanismo exato através do qual esses sistemas
neurotransmissores agem ainda é pouco compreendido. Presume-se, contudo, que na
maioria das situações não há uma correlação direta entre níveis catecolaminérgicos e
atividade cerebral. Uma das hipóteses mais aceitas propõe a existência de uma
relação em curva u invertida entre níveis extracelulares de DA ou NA e desempenho
cognitivo (Arnsten, in press). Nesse sentido, estudos de tomografia por emissão de
pósitrons (PET) já evidenciaram o efeito regulador de diferentes polimorfismos do
gene para a enzima catecol-O-metil-transferase (COMT, responsável pela degradação
de DA) na ativação cerebral durante a execução de tarefas de memória de trabalho
(Meyer-Lindenberg et al, 2005). Acredita-se, assim, que haveria níveis ótimos para o
funcionamento neuronal, o qual estaria prejudicado tanto na falta quanto no excesso
de neurotransmissores.
Juntamente com os dados de pesquisas neurobiológicas, a observação de uma alta
recorrência do TDAH em famílias (Biederman et al, 1991) tornou o transtorno um alvo
atrativo para a investigação genética. A pesquisa por genes de susceptibilidade ao
TDAH, isto é, genes não diretamente causais, mas que conferem uma predisposição
genética ao indivíduo, tem enfocado principalmente o papel de genes codificadores
de proteínas essenciais para a neurotransmissão catecolaminérgica.
O TDAH, como os demais transtornos psiquiátricos, é considerado uma entidade
multifatorial, ou seja, trata-se de um fenótipo resultante de uma interação complexa
entre múltiplos genes – com diferentes tamanhos de efeitos – e fatores ambientais.
Estima-se que um grande número de genes esteja envolvido na etiologia do TDAH,
16
cada um deles exercendo um efeito diferente e sujeito a interações com outros
genes e fatores ambientais, incluindo aí fatores intra-uterinos, hábitos de vida,
ambiente familiar, acadêmico e social. Devido à sua complexidade, a investigação de
doenças multifatoriais tipicamente envolve um conjunto de diferentes desenhos
metodológicos, que inclui estudos genéticos clássicos (famílias, adoção e gêmeos) e
moleculares (estudos de associação e ligação). Enquanto os primeiros fornecem
evidências da existência de componentes genéticos, os últimos visam a identificar
quais são esses fatores.
Estudos de associação buscam comparar as freqüências alélicas entre grupos de casos
e controles, sendo positivos quando encontram uma prevalência genotípica
significativamente diferente entre os grupos. São particularmente úteis para a
investigação de doenças complexas, que lidam com vários genes candidatos de
pequeno efeito. Seu grande desafio é o pareamento entre casos e controles, já que
idealmente buscam-se indivíduos que não apresentem diferenças em outras variáveis
que não o seu status de caso ou controle (outras variáveis estas que, caso presentes,
constituiriam as chamadas variáveis confundidoras).
Análises de ligação em heranças complexas incluem, via de regra, grupos familiares,
valendo-se do princípio mendeliano de que determinado alelo tem, de modo
aleatório, 50% de risco de ser transmitido dos genitores para sua prole. Um de seus
exemplos é o modelo do teste de desequilíbrio de transmissão (TDT), no qual busca-
se uma transmissão preferencial de determinado alelo (estatisticamente acima dos
50% previstos) para os filhos que apresentem determinado traço fenotípico. Estudos
familiares são, desse modo, especialmente robustos a um tipo específico de variável
de confusão, sobretudo quando comparados a estudos de associação: a estratificação
populacional, que ocorre quando há uma sobre-representação de determinado grupo
17
étnico na comparação entre casos e controles, fenômeno que enviesaria a
distribuição genotípica entre grupos independentemente da relação entre fator em
estudo e desfecho.
Resultados de estudos de genética tradicional e molecular convergem para sugerir
que tanto fatores genéticos quanto fatores não genéticos contribuem para a gênese
do TDAH (Faraone et al, 2005). É importante lembrar que evidências de agregação
familiar não necessariamente implicam fatores genéticos na etiologia do transtorno,
uma vez que o convívio em um mesmo ambiente (família) também contribui para a
recorrência familiar de um transtorno. Torna-se assim necessário isolar do familiar a
parcela atribuível a fatores genéticos.
Utilizando diferentes desenhos metodológicos, observou-se altas estimativas de
herdabilidade para o TDAH, com valores atingindo 70% a 80% (Faraone & Doyle,
2001). Sendo herdabilidade a parcela da variância da manifestação fenotípica
explicada pela variação genotípica, sugere-se que genes possuam um papel
fundamental na susceptibilidade ao transtorno. Críticas ao conceito de herdabilidade
incluem a ausência de espaço para uma variância conjunta (interação) entre genes e
ambientes, hoje reconhecida como fundamental na gênese de comportamentos
humanos. Além disso, ao partilhar a variância fenotípica total em contribuições
genéticas e ambientais, o componente genético, mesmo que constante, pode
aparentemente variar em função do impacto da variância ambiental na variância
fenotípica (quanto mais homogêneo o ambiente, maior a contribuição genética). O
fato é que a existência de uma herdabilidade considerável, sobretudo quando
replicada em diferentes populações e utilizando diferentes métodos, sugere
fortemente um papel para elementos genéticos na etiologia do TDAH.
18
Entre os genes estudados nas diferentes modalidades de estudos realizadas até o
momento, destacam-se o gene para os receptores tipo quatro e cinco de dopamina
(DRD4, DRD5); o gene para o transportador de dopamina (DAT1); o gene para a
enzima dopamina-beta-hidroxilase (DBH); bem como o gene SNAP-25 (que codifica
uma proteína sináptica responsável pela liberação de neurotransmisores via
exocitose) e os genes serononinérgicos 5HTT (que codifica o transportador de
serotonina) e HTR1B (responsável pela codificação do receptor de serotonina).
Um ponto importante para a plausibilidade de estudos de associação entre
polimorfismos genéticos e doenças ou transtornos é a definição (seja in vivo, in vitro
ou in silico) do papel que a alteração genética representa no organismo. Torna-se,
desse modo, fundamental a investigação acerca da funcionalidade do polimorfismo,
entendida como sendo a repercussão biológica do mesmo nos processos de expressão
gênica, de codificação de proteínas ou de ações bioquímicas de tais produtos
gênicos. Para alguns dos genes candidatos para o TDAH, já existem investigações
avançadas em relação a sua funcionalidade.
O polimorfismo -1021C/T do gene DBH demonstrou ser um regulador extremamente
importante da atividade enzimática da enzima dopamina-β-hidroxilase, respondendo
por até 50% de seus níveis plasmáticos e de sua atividade enzimática (Cubells &
Zabetian, 2004). Tal enzima é fundamental para a conversão de DA em NA nos
terminais sinápticos. Já no caso do gene DRD4, um polimorfismo em número variável
de repetições em tandem (VNTR) no éxon III do também demonstrou in vitro
respostas diferenciadas ao estímulo catecolaminérgico (tanto DA quanto NA são
potentes agonistas do receptor DRD4).
19
Em uma revisão sistemática da literatura, Faraone et al (2005) sumarizaram os
principais achados de estudos de associação e de ligação em TDAH (Tabela 2). Os
reduzidos odds ratios globais encontrados sugerem que a contribuição de
polimorfismos genéticos para a etiologia do TDAH ocorre através de muitos genes de
pequeno efeito cada um. Os autores da revisão sugerem que a aplicação de
estratégias que aumentem o poder estatístico de estudos torna-se imperiosa na
tentativa de melhor caracterizar a relação entre genes e comportamentos. Tais
estratégias incluem a condução de metanálises e estudos colaborativos com grupos
de diferentes países e origens étnicas, a inclusão de fatores ambientais (sobretudo
dados perinatais) como covariáveis, bem como o refinamento do fenótipo complexo
através de técnicas neurocientíficas específicas.
Tabela 2. Odds ratios significativos para variantes genéticas avaliadas em três ou
mais estudos familiares ou de casos e controles (extraído de Faraone et al, 2005)
Polimorfismo Desenho OR 95% IC
Receptor D4 de dopamina (VNTR éxon III) familiar 1,16 1,03–1,31
Receptor D4 de dopamina (VNTR éxon III) casos-controles
1,45 1,27–1,65
Receptor D5 de dopamina (repetição CA) familiar 1,24 1,12–1,38
Transtportador de dopamina (VNTR) familiar 1,13 1,03–1,24
Dopamina-β-hidroxilase (Taq) casos-controles
1,33 1,11–1,59
SNAP-25 (T1065G) familiar 1,19 1,03–1,38
Transportador de serotonina (5-HTTLPR) casos-controles
1,31 1,09–1,59
Receptor de serotonina (HTR1B) familiar 1,44 1,14–1,83
OR, odds ratio; IC, intervalo de confiança; VNTR, número variável de repetições em
tandem.
2.2. Neuropsicologia do transtorno de déficit de atenção e hiperatividade
O modelo causal de desenvolvimento do TDAH é baseado em diversos pressupostos,
dentre os quais as teorias neuropsicológicas ocupam um lugar de destaque. Há mais
20
de um século, a utilização de princípios e técnicas neuropsicológicas tem se revelado
extremamente frutífera na pesquisa acerca da natureza de doenças neurológicas e
psiquiátricas (Lezak, 1995). Em relação ao TDAH, as últimas décadas observaram o
surgimento de distintas teorias que auxiliaram no entendimento dos processos
cognitivos subjacentes ao transtorno.
Especialmente relevante foi a aplicação do conceito de funções executivas (FE),
geralmente concebidas como a capacidade mental de controlar e propositadamente
aplicar as próprias habilidades mentais. Apesar da existência de divergências na
literatura acerca da definição precisa de FE, há um razoável consenso de que FE
incluem processos como manter sustentadamente ou redirecionar a atenção, inibir
respostas inapropriadas, planejar estratégias para comportamento futuro, iniciar e
executar tais estratégias, além da capacidade de intercambiar flexivelmente
estratégias de resolução de problemas. Partindo desse modelo, os sintomas do TDAH
podem ser considerados como sendo causados pela disfunção em sistemas de controle
neurocognitivo, estando as relações entre cérebro e comportamento amplamente
mediadas por déficits em processos inibitórios (Sonuga-Barke, 2005). De acordo com
Barkley (1997), o padrão geral de disfunção executiva associado ao TDAH baseia-se
no aparecimento precoce de déficits na inibição de respostas, que seria a capacidade
de inibir respostas inapropriadas em favor de alternativas mais apropriadas, sendo
considerada um pré-requisito para o auto-controle, a regulação emocional e a
flexibilidade cognitiva.
De maneira simplificada, FE representam processos top-down que facilitam a tomada
de decisões através da manutenção de informações acerca de decisões possíveis na
memória de trabalho e da integração desse conhecimento com informações
provenientes do contexto, com objetivo de identificar a melhor ação para a situação
21
em particular (Willcutt et al, 2005). Uma gama de dados observacionais indica que
lesões a estruturas do córtex pré-frontal acarretam déficits em tarefas de FE. Além
disso, diversos trabalhos têm demonstrado o envolvimento de estruturas neurais
relevantes para FE no TDAH (Nigg et al, 2005). É interessante ressaltar que os
prejuízos observados no grupo com TDAH em relação a funções executivas parecem
ser independentes do perfil de comorbidades (Nigg et al, 1998) – o efeito contrário,
que pode ser o caso na presença de sintomas atencionais subsindrômicos (por
exemplo, cinco sintomas de TDAH) em pacientes com outros transtornos, nunca foi
testado.
Trabalhos recentes têm desafiado o pressuposto de homogeneidade neuropsicológica
do TDAH. Estudos sugerem que outros processos, como aversão à demora, também
contribuem de maneira expressiva para a composição do quadro clínico. Na aversão à
demora há uma reação emocional negativa à imposição de demora, bem como uma
redução no controle exercido por recompensas futuras sobre o comportamento
presente (Sagvolden et al, 1998). Dados experimentais sugerem que a inibição de
respostas e a aversão à demora constituem processos independentes (Solanto et al,
2001), correspondendo aquela mais a processos cognitivos propriamente ditos e
estando esta mais relacionada a processos motivacionais nos quais há atribuição de
valor. Cabe ressaltar que mais do que elementos de teorias competidoras, inibição de
respostas e aversão à demora muito provavelmente constituem processos
complementares na fisiopatologia do TDAH (Sonuga-Barke, 2005).
Até recentemente, a pesquisa em neuropsicologia do TDAH focou-se na busca de um
déficit único central que oferecesse uma explicação causal abrangente dos sintomas
comportamentais encontrados no transtorno (Pennington, 2005). Os resultados
obtidos na maioria dos estudos, contudo, têm sugerido que um modelo de déficit
22
único não será suficiente para a compreensão dos processos neuropsicológicos
subjacentes aos transtornos psiquiátricos. Revisões metanalíticas têm deixado claro
que nenhum teste ou bateria de testes neuropsicológicos possui acurácia suficiente
para o diagnóstico de TDAH (Frazier et al, 2004). Dada a inexistência de padrões-ouro
biológicos em psiquiatria (todo teste é comparado ao diagnóstico clínico baseado em
critérios operacionais), cabe o questionamento acerca de qual o melhor papel para
os estudos em neuropsicologia no entendimento do TDAH.
Toda teoria baseada em déficit único esbarra na limitação de não atingir
sensibilidade e especificidade suficientes para abarcar a categoria diagnóstica TDAH
(fenômeno semelhante ocorre mesmo na partição do fenótipo em subtipos
predominantemente desatento e hiperativo/impulsivo). Entretanto, dada a
existência de critérios diagnósticos padronizados (sejam do DSM-IV ou da CID-10),
medidas neuropsicológicas de fato não são necessárias para o processo diagnóstico.
Como levantado por Nigg (2005), a questão nosológica que realmente passa a se
colocar é a seguinte: quantos indivíduos entre aqueles que preenchem critérios para
o transtorno podem ser vistos como possuindo déficits neuropsicológicos de acordo
com os modelos teorizados?
Qualquer que seja o teste e o ponto de corte adotados, sempre haverá uma parcela
de indivíduos “negativos” com o transtorno e outra de “positivos” sem o transtorno.
Ao adotar limiares mais restritivos, aumenta-se o valor preditivo positivo às custas da
redução do valor preditivo negativo de determinado teste. No caso do TDAH, as
propriedades distributivas do desempenho neuropsicológico de crianças e
adolescentes podem ser extremamente relevantes para o entendimento desta
questão (Nigg, 2005). Grupos de crianças com TDAH invariavelmente apresentam uma
23
maior variância do que grupos controles, sugerindo que os efeitos de grupo
apresentados na literatura são na realidade carreados por um subgrupo de indivíduos.
Uma meta-análise publicada em 2005 por Willcutt et al reuniu 83 estudos,
totalizando 3734 casos e 2969 controles, e avaliou o desempenho de crianças e
adolescentes em testes de função executiva. Os resultados sumarizados, apesar de
evidenciarem uma diferença significativa entre grupos nas diferentes tarefas,
apontaram pequenos a moderados tamanhos de efeito padronizados para a
comparação entre grupos com e sem TDAH. Além disso, ficou clara a sobreposição de
distribuições de resultados, levando à conclusão de que os déficits medidos pelos
testes avaliados não contribuem causalmente para o diagnóstico de TDAH em todos
os casos. Os autores concluem então que déficits em funções executivas não são nem
necessários nem suficientes para causar todos os casos de TDAH.
Reconhecendo a natureza multifatorial da etiologia cognitiva do transtorno, Nigg
(2005) propõe a existência de ao menos dois modelos explanatórios: (1) todos os
casos são resultantes de processos fisiopatológicos similares, todos com pequeno
efeito e agindo de modo aditivo e interativo (o que acarretaria um enorme desafio
para a pesquisa etiológica); e (2) grupos de casos representam duas ou mais
populações de indivíduos que, ao fim e ao cabo, terminam por apresentar um
fenótipo categórico semelhante.
2.3. Endofenótipos em psiquiatria: fundamentos e aplicações
Múltiplos desafios se colocam na investigação das bases biológicas de transtornos
psiquiátricos. Talvez uma das principais questões que vem à tona seja a fragilidade
das categorias diagnósticas, que se traduz, por exemplo, no caso dos estudos em
24
genética, em uma fragilidade na definição do fenótipo. Os manuais classificatórios
hoje disponíveis baseiam-se, sobretudo, em dados fenomenológicos para a definição
de categorias nosológicas. Além disso, apesar da crescente busca por evidências
científicas para definição e caracterização dos diferentes transtornos psiquiátricos,
muitos dos critérios adotados ainda não refletem mais do que opiniões de comitês.
Debates contemporâneos incluem discussões sobre qual modelo diagnóstico deva ser
adotado nos sistemas classificatórios psiquiátricos. Dimensões conceituais definidoras
das propriedades de um transtorno psiquiátrico estabelecem o paradigma de
operacionalização de sistemas diagnósticos. Zachar e Kendler (2007) recentemente
discutiram dimensões relevantes para o entendimento da natureza dos transtornos
psiquiátricos; entre elas estavam os debates causalismo versus descritivismo,
essencialismo versus nominalismo e categorias versus contínuos.
A definição médica tradicional de uma doença, baseada sobretudo no modelo de
doenças infecciosas, prevê a identificação de agentes etiológicos discretos e únicos.
A identificação de tais agentes no campo da psiquiatria, entretanto, não parece ser
viável. Um enfoque alternativo propõe que o melhor entendimento acerca de uma
determinada categoria nosológica pode ser obtido não através da busca de agentes
causais, mas sim através da descrição precisa de seus elementos constitutivos. Essa
abordagem fenomenológica pode ser tanto relativa (até a descoberta dos reais
fatores etiológicos) quanto absoluta (assumindo a impossibilidade da identificação de
agentes causais na psiquiatria).
O debate entre causalismo versus descritivismo está intimamente relacionado à
discussão essencialismo versus nominalismo. Para um essencialista, categorias
psiquiátricas existem independentemente dos sistemas nosológicos, cabendo a estes
25
a descoberta da real natureza dos transtornos para uma classificação acurada da
realidade. Já os nominalistas não têm qualquer pretensão de identificar suas
categorias com elementos da natureza; as mesmas não constituiriam mais do que
instrumentos operacionais úteis na prática clínica. Uma posição intermediária, a dos
chamados nominalistas moderados, reconheceria a importância da descoberta de
fatos naturais acerca de transtornos psiquiátricos, mas também argumentaria que
existem diferentes modos de classificar a realidade. Nesse modo de ver, classificação
seria um exercício tanto de decisão quanto de descoberta (Zachar & Kendler, 2007).
Uma outra questão em aberto na definição nosológica em psiquiatria diz respeito aos
limites dos transtornos. Seriam estes mais bem definidos como categorias discretas
ou como graus de intensidade distintos de uma dada característica dimensional,
presentes em diferentes medidas na população em geral? Um modelo categórico ou
taxonômico não apenas prevê a existência de categorias qualitativamente
independentes entre si, mas também de contrastes claros entre o normal e o
patológico. Já um modelo baseado em contínuos propõe, baseado em doenças como
hipertensão e osteoporose, por exemplo, que transtornos psiquiátricos são resultado
de um conjunto de traços quantitativos, sendo os limites entre categorias não mais
do que um reflexo de pontos de corte arbitrários.
Existe um grande hiato entre genes candidatos e sintomas manifestados por
transtornos psiquiátricos como TDAH (tipicamente medidos por entrevistas clínicas ou
escalas de avaliação), de modo que se torna desejável tanto conceitual quanto
empiricamente a investigação de construtos que auxiliem na união desses pontos
(Waldman 2005). O conceito de endofenótipos surge no campo da psiquiatria em 1967
(Gottesman & Shields). De acordo com sua definição na época, endofenótipos seriam
“fenótipos internos identificáveis por testes bioquímicos ou exames microscópicos”.
26
Ficando adormecido por duas décadas, o uso do conceito foi retomado a partir da
segunda metade da década de 1990 com a explosão dos estudos em genética
molecular. Outros termos utilizados como sinônimos ou equivalentes ao conceito
endofenótipos incluem fenótipos intermediários, marcadores biológicos, traços
subclínicos, marcadores de vulnerabilidade (Gottesman faz uma distinção entre
endofenótipos e marcadores biológicos na medida em que apenas aqueles teriam uma
etiologia genética bem definida, constituindo um tipo especial destes).
A lógica por trás do emprego de endofenótipos na investigação das bases biológicas
de transtornos psiquiátricos (bem como de qualquer doença ou traço complexo) está
na tentativa de mendelização de fenótipos complexos. Desse modo, endofenótipos
seriam idealmente monogênicos, representando fenótipos intermediários na cadeia
causal entre genes e comportamentos e fornecendo alvos mais apropriados para
estudos moleculares, de modo a permitir, em última análise, uma redução das
variabilidades fenotípica e genotípica. Do ponto de vista metodológico, a
característica mais importante de um endofenótipo é ser geneticamente menos
complexo do que o fenótipo como um todo, estando mais próximo do produto gênico
propriamente dito e fazendo parte de uma das vias fisiopatológicas para o transtorno
como um todo.
Dado que genes têm como principal papel a codificação de proteínas, endofenótipos
ideais seriam produtos protéicos. Sem a possibilidade desse tipo de análise na
maioria dos transtornos psiquiátricos no momento, os endofenótipos utilizados até
hoje incluem sintomas, dimensões ou outras características diagnósticas, bem como
marcadores de neuroimagem, neurofisiologia, neuroquímica e neuropsicologia.
Considerado um fator de risco para determinado transtorno, um endofenótipo pode
estar presente em indivíduos que não apresentam o fenótipo pleno. Mais do que isso,
27
presume-se uma prevalência aumentada de endofenótipos entre familiares de
indivíduos com o fenótipo completo se comparados com a população em geral.
Sendo um conceito ainda em construção, a literatura ainda debate sobre quais
critérios devem ser preenchidos por determinado marcador para que o mesmo possa
ser considerado um endofenótipo. Gottesman e Gould (2003) propõem que um
endofenótipo deve (1) estar associado com o transtorno na população; (2) possuir
herdabilidade significativa; (3) ser primariamente estado-independente, no sentido
de manifestar-se independentemente da atividade do transtorno; (4) co-segregar
com o transtorno em famílias; e (5) ser encontrado em familiares não afetados em
uma freqüência superior à da população geral. Já Waldman et al (2006) ampliaram os
requisitos necessários para a definição de um endofenótipo. Além dos itens já
elencados por Gottesman e Gould, endofenótipos também deveriam (6) ter boas
propriedades psicométricas e, preferencialmente, distribuição normal; (7) possuir
substratos genéticos em comum com o transtorno; (8) estar associados e/ou ligados a
genes candidatos para o transtorno; (9) mediar a associação e/ou ligação entre genes
candidatos e o transtorno; e (10) moderar a associação e/ou ligação entre genes
candidatos e o transtorno.
A aplicação do conceito de endofenótipos no processo de identificação das bases
biológicas do TDAH parece extremamente promissora. De acordo com os critérios de
Wakefield (1992) para a definição de um construto válido, além de apresentar
validade psicométrica e de acarretar prejuízo significativo, um transtorno também
deve ser cientificamente identificável, i.e., apresentar disfunção em um processo
psicológico ou biológico. A existência de heterogeneidade tanto no nível genotípico
quanto no fenotípico torna necessária uma homogeneização das características do
TDAH para sua melhor compreensão. A neuropsicologia aparece como uma
28
ferramenta de enorme valia para o refinamento fenotípico do transtorno, processo
que visa, em última análise, à redução da complexidade genética das características
fenomenológicas observadas.
A hipótese do prejuízo em funções executivas no TDAH constitui-se na teoria
neuropsicológica com o maior número de estudos até o momento. Apesar de
certamente não explicar ou englobar o transtorno como um todo, evidências de
agregação familiar (Nigg, 2004; Crosbie & Schachar 2001), além de uma repercussão
prognóstica negativa (Biederman et al, 2004; Biederman et al, 2006) convergem para
a caracterização de um subgrupo TDAH com disfunção executiva (Nigg, 2005).
Esta dissertação tem como objetivo investigar a associação entre polimorfismos de
alguns dos principais genes candidatos para o TDAH e o desempenho de crianças e
adolescentes em medidas neuropsicológicas. A hipótese a ser testada é a da
identificação, em uma amostra de pacientes com TDAH, de subgrupos genotípicos
específicos com desempenho diferenciado em provas de funções executivas. Propõe-
se que o refinamento fenotípico propiciará um aumento na sensibilidade a dimensões
específicas do TDAH, facilitando a identificação de substratos biológicos do
transtorno.
29
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
- investigar o papel de polimorfismos de genes candidatos para o transtorno de
déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) no desempenho de crianças e
adolescentes com o transtorno em testes neuropsicológicos de funções executivas.
3.2. Objetivos específicos
- verificar a associação entre o polimorfismo VNTR do éxon III do gene para o
receptor D4 de dopamina e o desempenho neuropsicológico de crianças e
adolescentes com TDAH em testes de funções executivas;
- verificar a associação entre o polimorfismo -1021 C/T do gene para a enzima
dopamina-beta-hidroxilase e o desempenho neuropsicológico de crianças e
adolescentes com TDAH em testes de funções executivas.
30
4. Proteção dos direitos humanos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
como adendo à linha de pesquisa intitulada “Estudo do transtorno de déficit de
atenção e hiperatividade – sucetibilidade genética e genes candidatos”, protocolo
98201.
31
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36
5. Artigo 1
5.1. Versão em inglês
ASSOCIATION BETWEEN DRD4 GENE AND PERFORMANCE OF CHILDREN WITH ADHD
IN A TEST OF SUSTAINED ATTENTION
Christian Kieling BA
1
, Tatiana Roman PhD
3
, Alysa E. Doyle PhD
4
,
Mara Helena Hutz PhD
2
, and Luis Augusto Rohde MD
1
1
Departmento de Psiquiatria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, Brasil
2
Departmento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
Brasil
3
Departmento de Ciências Morfológicas, Fundação Faculdade Federal de Ciências
Médicas de Porto Alegre, Brasil
4
Departmento de Psiquiatria, Universidade Harvard, Boston, Massachusetts
Key Words: Attention-deficit/hyperactivity disorder; child; continuous performance
test; dopamine D4 receptor; genetics; neuropsychology
This work was partially supported by research grants from Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brazil) (Grants 471761/03-6 and
300226/2002-0), and Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
We thank Heloisa Kaefer, Márcia Knijnik, and Natália Soncini for conducting
neuropsychological testing.
Received 1 October 2005; revised 19 April 2006; accepted 21 April 2006. Available
online 15 June 2006. Published in Biological Psychiatry 2006 Nov 15;60(10):1163-5.
37
Background
The adoption of neuropsychological tests as endophenotypic measures can provide an
increased sensitivity to specific dimensions of attention-deficit/hyperactivity
disorder (ADHD).
Methods
The association between a variable number of tandem repeats polymorphism at the
dopamine D4 receptor gene (DRD4) and the performance of children and adolescents
with ADHD in a continuous performance test (CPT) was evaluated. The sample
comprised 90 clinically referred children and adolescents with ADHD. Errors of
omission and commission in the CPT were computed and the number of 48-base pairs
tandem repeats in the exon III of DRD4 was assessed.
Results
The presence of a 7-repeat allele was associated with more errors of commission and
the homozygosity of the 4-repeat allele was related to fewer errors of commission
and omission even after adjusting for age.
Conclusions
These findings bring further evidence on the role of DRD4 polymorphisms on the
performance in sustained attention tasks among children and adolescents with ADHD
diagnosis.
38
Introduction
The molecular basis of attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) still remains
unknown, despite its high heritability estimates (Biederman and Faraone 2005). This
may be due to its complex nature, both at the genotypic (multiple genes) and the
phenotypic (phenomenological heterogeneity) levels. Supported by neurobiological
findings, the most investigated neurotransmitter system is the dopaminergic (Bobb et
al 2005). Although there is no clear consensus, a meta-analysis conducted by Faraone
et al (2001) evidenced a significant role for the dopamine D4 receptor (DRD4) gene,
specifically the 7-repeat allele of the exon III variable number of tandem repeats
(VNTR), in the etiology of ADHD.
One hypothesis that could explain the lack of consistency in the literature is the
great variability in the phenotypic definition of ADHD based on DSM-IV criteria
(American Psychiatric Association 1994). The augmentation of categorical
descriptions by quantitative measures strengthens the assessment of genetic
underpinnings, affording more straightforward association studies (Gottesman and
Gould 2003 and Sergeant 2005).
The adoption of neuropsychological tests as endophenotypic measurements might
enhance the power of genetic studies since it may provide an increased sensitivity to
specific dimensions of ADHD (Doyle et al 2005). Thus far, only a small number of
studies have assessed the role of DRD4 polymorphisms and performance on
neurocognitive measures in individuals with ADHD. Results have been variable, with
one study showing an association between the DRD4 7-repeat allele and an impulsive,
error-prone response style (Langley et al 2004) and two studies showing greater
39
inattention, impulsivity, and reaction time anomalies in individuals without the 7-
repeat allele (Swanson et al 2000 and Manor et al 2002).
Continuous performance tests (CPTs) assess the maintenance of focused attention
while responding to target stimuli and the inhibition of responses to non-target
stimuli. In a recent meta-analytic review, Frazier et al (2004) showed that CPT scores
achieved the largest effect size for the diagnosis of ADHD. The aim of this study was
to evaluate the association between the most investigated candidate gene for ADHD
(DRD4) and performance on a CPT in a large, well-characterized sample of children
and adolescents from Brazil.
Methods and Materials
Subjects
The sample consisted of 90 children and adolescents referred to the ADHD outpatient
clinic at our University Hospital (HCPA). Inclusion criteria were: 1) age between 7
and 17 years; 2) ADHD diagnosis according to DSM-IV; 3) drug naïve patients; and 4)
IQ ≥ 70. The only exclusion criterion was the presence of clinical conditions that
might interfere with the test, including blindness, deafness, pervasive developmental
disorder, and other major neurological disorders. No child, however, met such
exclusion criteria. ADHD and comorbid diagnoses were achieved through a three-
stage process: 1) evaluation with a semi-structured interview (Schedule for Affective
Disorders and Schizophrenia for School-Age Children, Epidemiological Version – K-
SADS-E; Orvaschel 1985), modified to assess DSM-IV criteria and applied to parents by
trained research assistants, whose inter-rater reliability for the ADHD diagnosis had
been previously evaluated (kappas from .77 to 1.00, p < .001); 2) discussion of each
40
diagnosis derived through the K-SADS-E in a clinical committee chaired by a senior
psychiatrist (LAR); and 3) clinical evaluation of ADHD and comorbid conditions using
DSM-IV criteria by a child psychiatrist who had previously received the K-SADS-E
results. When a diagnostic disagreement occurred in the three-stage process, priority
was given for diagnoses obtained through clinical interviews (Rohde et al 2005).
Severity of ADHD symptoms was assessed with the Swanson, Nolan, and Pelham
(SNAP-IV) rating scale (Swanson et al 2001). Parents provided written informed
consent and children or adolescents gave verbal assent to participate. The Ethical
Committee of HCPA approved this investigation.
Neuropsychological Assessment
Full Scale IQ was estimated from vocabulary and block design subtests of the
Wechsler Intelligence Scale for Children–Third Edition (Wechsler 1991), administered
by trained psychologists. Subjects performed a simplified version of the CPT
(Cornblatt et al 1988). Testing was implemented using standardized procedures,
including same software and raters. A series of numbers, from 1 to 9, appeared
randomly, one at a time, with a fixed interval, on the computer screen. Subjects
were required to press a button whenever the number 6 appeared. Omission (missed
targets) and commission (incorrect targets) errors were computed and adjusted
respectively for the number of times the selected and other digits appeared.
Genotyping
High molecular weight genomic DNA was extracted from whole blood by a salting-out
procedure (Lahiri and Nurnberger 1991). The DRD4 exon III region containing the 48-
41
base pair VNTR polymorphism was amplified by polymerase chain reaction as
described by Roman et al (1999).
Data Analysis
Comparison among categorical variables was performed using chi-square or Fisher’s
exact test. All continuous variables showing a normal distribution were compared
between the groups by Student T test; for those variables (e.g., CPT measures) that
did not show a normal distribution, non-parametric tests were used (Mann-Whitney U
test). The significance level accepted was .05. Potential confounders evaluated were
age, sex, ethnic background, ADHD subtype, severity of symptoms (SNAP-IV scores),
IQ, setting for data collection, and comorbidity (mood, anxiety, and disruptive
behavior disorders). A confounder was defined as a variable associated with both
independent and dependent variables (p ≤ .2). Only age, despite significant overlap
between genotypic groups, met the criteria for a confounder and was included in
adjusted analyses. In order to obtain a normal distribution, CPT scores were ranked
before inclusion in the analysis of variance (Montgomery 1997). All tests were two-
tailed.
Results
Sample Characteristics
Ninety children and adolescents were assessed. Mean age was 10.9 (SD = 2.8) years,
and mean IQ was 94 (SD = 12). Most of the sample was of European ancestry (95.2%)
and males (74.4%). The ADHD combined type was the most prevalent (69.7%), and
oppositional defiant disorder was the most common comorbid condition (41.1%).
42
Subgroup analyses according to genotype showed that mean age was 9.77 years (SD =
2.66) for children in the 7-repeat group and 11.34 (SD = 2.79) for those without the
allele. Children with two 4-repeat alleles had a mean age of 11.35 years (SD = 2.72)
while those without homozygosity had a mean of 10.36 (SD = 2.87).
Neuropsychological Performance
There were differences on CPT scores among different genotypic groups after
adjusting for age (Table 1). The presence of a 7-repeat allele was associated with
more commission errors (F = 4.55, df = 1, p = .036). In the same direction, subjects
with two copies of the 4-repeat allele made fewer errors of both commission (F =
5.94, df = 1, p = .017) and omission (F = 5.23, df = 1, p = .025). Severity of symptoms
(SNAP-IV scores), albeit not fulfilling statistical criteria for a potential confounder,
was included in additional analyses and did not significantly affect any results (data
available upon request).
Discussion
Our data suggest an association between the DRD4 genotype and CPT performance in
children and adolescents with ADHD. Youths with one or more 7-repeat alleles gave
more impulsive responses, while 4-repeat homozygosity was associated with reduced
errors of both inattention and impulsivity. Neurochemical mechanisms may underlie
such contrast, given that the receptors expressed by the non–4-repeat alleles show a
suboptimal response to dopamine (Wang et al 2004).
The present work should be interpreted in the context of some limitations. First, a
small number of neuropsychological outcomes were evaluated. Second, we cannot
43
exclude haplotype heterogeneity among alleles with the same number of repeats.
However, the robustness of our findings is supported by the conservative data
analyses and the fact that ours is a drug-naïve sample. The impact of medication is a
potential confounder not frequently considered in previous studies.
Our results provide a constructive replication of a previous study (Langley et al 2004)
and go a step further to identify a significant difference in CPT performance
according to DRD4 status within the ADHD diagnosis. We not only evaluated the
impact of the 7-repeat allele, but also demonstrated the protective effect of the 4-
repeat allele. These findings add further evidence on the role of DRD4 polymorphisms
on the performance of children and adolescents in sustained attention tasks that
cannot be explained by the severity of the ADHD symptoms.
44
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and Statistical Manual of Mental Disorders (4th ed.), American Psychiatric
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Antonio (1991).
47
Table 1. Scores for omission and commission errors on the Continuous Performance Test according to DRD4 genotype
Score Unadjusted analysis Adjusted analysis*
n Median Range Z p F P
Omission errors
7-repeat present 26 0.200 0.754 -3.12 0.002 0.49 0.485
7-repeat absent 64 0.073 0.911
4-repeat homozygosity 48 0.070 0.911 -2.85 0.004 5.23 0.025
4-repeat homozygosity 42 0.192 0.875
Commission errors
7-repeat present 26 0.019 0.100 -2.15 0.036 4.54 0.036
7-repeat absent 64 0.007 0.165
4-repeat homozygosity 48 0.006 0.165 -2.75 0.006 5.94 0.017
4-repeat homozygosity 42 0.012 0.100
*Adjustment for age; DRD4: dopamine D4 receptor gene.
48
5.2. Versão em português
ASSOCIAÇÃO ENTRE O GENE DRD4 E O DESEMPENHO DE CRIANÇAS E ADOLESCENTES
COM TDAH EM UM TESTE DE ATENÇÃO SUSTENTADA
Christian Kieling BA
1
, Tatiana Roman PhD
3
, Alysa E. Doyle PhD
4
,
Mara Helena Hutz PhD
2
, and Luis Augusto Rohde MD
1
1
Departmento de Psiquiatria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre
2
Departmento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre
3
Departmento de Ciências Morfológicas, Fundação Faculdade Federal de Ciências
Médicas de Porto Alegre
4
Departmento de Psiquiatria, Universidade Harvard, Boston, Massachusetts
Palavras-chave: transtorno de déficit de atenção e hiperatividade; criança; teste de
desempenho continuado; receptor D4 de dopamina; genética; neuropsicologia
Este trabalho foi parcialmente financiado por verbas de pesquisa do Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (processos 471761/03-6 e
300226/2002-0), e Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
Agradecemos Heloisa Kaefer, Márcia Knijnik e Natália Soncini pela condução da testagem
neuropsicológica.
Recebido 1 de outubro de 2005; revisado 19 de abril de 2006; aceito 21 de abril de
2006. Disponível online 15 de junho de 2006. Publicado em 15 de novembro de 2006 no
periódico Biological Psychiatry 60(10):1163-5.
49
Fundamentação
A adoção de testes neuropsicológicos como medidas endofenotípicas pode fornecer uma
sensibilidade aumentada a dimensões específicas do transtorno de déficit de atenção e
hiperatividade (TDAH).
Métodos
Avaliou-se a associação entre um polimorfismo de número variável de repetições em
tandem no gene para o receptor D4 de dopamina (DRD4) e o desempenho de crianças e
adolescentes com TDAH em um teste de desempenho continuado (CPT). A amostra foi
composta por 90 crianças e adolescentes com TDAH referidas para acompanhamento
clínico. Erros de omissão e de comissão no CPT foram computados e o número de
repetições em tandem de 48 pares de base no éxon III do DRD4 foi medido.
Resultados
A presença do alelo de 7 repetições esteve associada a um número maior de erros de
comissão, enquanto que a homozigose do alelo de 4 repetições esteve relacionada a um
número menor de erros de comissão e de omissão mesmo após o ajuste para idade.
Conclusões
Tais achados fornecem evidência adicional para o papel de polimorfismos do DRD4 no
desempenho em tarefas de atenção sustentada entre crianças e adolescentes com o
diagnóstico de TDAH.
50
Introdução
As bases moleculares do transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) ainda
não estão claras, apesar de suas altas estimativas de herdabilidade (Biederman &
Faraone, 2005). Isto pode se dever à sua natureza complexa, tanto em nível genotípico
(múltiplos genes) quanto fenotípico (heterogeneidade fenotípica). Baseando-se em
achados neurobiológicos, o sistema neurotransmissor mais investigado tem sido o
dopaminérgico (Bobb et al, 2005). Apesar de não haver um consenso inequívoco, uma
metanálise conduzida por Faraone et al (2001) evidenciou um papel significativo para o
gene do receptor D4 de dopamina (DRD4), especificamente para o alelo de 7 repetições
do polimorfismo de número variável de repetições em tandem (VNTR) do éxon III, na
etiologia do TDAH.
Uma hipótese que pode explicar a carência de consistência na literatura é a grande
variabilidade na definição fenotípica do TDAH baseada nos critérios do DSM-IV (American
Psychiatric Association, 1994). A potencialização de descrições categóricas por medidas
quantitativas fortalece a avaliação de substratos genéticos, proporcionando estudos de
associação mais diretos (Gottesman & Gould, 2003 e Sergeant, 2005).
A adoção de testes neuropsicológicos como medidas endofenotípicas por aumentar o
poder de estudos em genética ao prover uma sensibilidade aumentada a dimensões
específicas do TDAH (Doyle et al, 2005). Até agora, apenas um pequeno número de
estudos avaliou o papel de polimorfirmos do DRD4 no desempenho em tarefas cognitivas
em indivíduos com TDAH. Os resultados foram diversos, com um estudo mostrando
associação do alelo de 7 repetições do DRD4 com um estilo de respostas impulsivo e
51
errático (Langley et al, 2004) e dois estudos mostrando maior desatenção, impulsividade
e anomalias em tempo de reação entre indivíduos sem o alelo de 7 repetições (Swanson
et al, 2000 e Manor et al, 2002).
Testes de desempenho continuado (CPTs) avaliam a manutenção de atenção focada
durante a resposta a estímulos alvo e a inibição de respostas a estímulos não-alvo. Em
uma recente revisão metanalítica, Frazier et al (2004) demonstraram que escores de
CPT atingem os maiores tamanhos de efeito para o diagnóstico de TDAH. O objetivo
deste estudo foi avaliar a associação entre o gene candidato mais investigado no TDAH
(DRD4) e o desempenho em um CPT em uma amostra de crianças e adolescentes com
TDAH no Brasil.
Materiais e métodos
Sujetos
A amostra foi composta por 90 crianças e adolescentes referidos para o ambulatório de
TDAH do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Os critérios de inclusão foram os
seguintes: 1) idade entre 7 e 17 anos; 2) diagnóstico de TDAH conforme critérios do DSM-
IV; 3) pacientes sem uso prévio de psicofármacos; e 4) QI estimado ≥ 70. O único critério
de exclusão foi a presença de doenças clínicas que pudessem interferir com a realização
da testagem, tais como cegueira, surdez, transtorno global do desenvolvimento e outras
doenças neurológicas relevantes. Nenhuma criança enquadrou-se em tais critérios de
exclusão. TDAH e diagnósticos comórbidos foram investigados através de um processo
em três estágios: 1) avaliação em entrevista semi-estruturada (Schedule for Affective
52
Disorders and Schizophrenia for School-Age Children, Epidemiological Version – K-SADS-E;
Orvaschel, 1985), modificada para avaliar critérios DSM-IV e aplicada a pais de pacientes
por assistentes de pesquisa treinados, cuja confiabilidade para o diagnóstico de TDAH
havia sido avaliada previamente (valores kappa variando de 0,77 a 1,00, p < 0,001); 2)
discussão de cada diagnóstico obtido através do K-SADS-E em comitê clínico comandado
por psiquiatra sênior (LAR); e 3) avaliação clínica de TDAH e condições comórbidas
utilizando critérios operacionais do DSM-IV por psiquiatra da infância e adolescência, o
qual recebia os resultados obtidos no K-SADS-E. Na ocorrência de discordância
diagnóstica durante o processo de três estágios, prioridade era dada aos diagnósticos
obtidos em entrevista clínica (Rohde et al, 2005). A intensidade de sintomas do TDAH foi
avaliada com a escala de Swanson, Nolan, and Pelham (SNAP-IV) (Swanson et al, 2001).
Pais forneceram consentimento informado por escrito, e crianças e adolescentes
concordaram verbalmente em participar deste estudo. O Comitê de Ética do HCPA
aprovou esta investigação.
Avaliação neuropsicológica
O QI foi estimado a partir dos subtestes de vocabulário e de cubos da escala Wechsler
Intelligence Scale for Children – Third Edition (Wechsler, 1991), administrada por
psicólogas treinadas. Os sujeitos realizaram uma versão simplificada do CPT (Cornblatt
et al, 1988). A testagem foi feita utilizando procedimentos padronizados, incluindo o
mesmo software e avaliadoras. Uma série de números, de 1 a 9, aparecia
aleatoriamente, um de cada vez, em intervalos fixos, em uma tela de computador. Os
sujeitos eram requisitados a apertar uma tecla sempre que o número 6 aparecesse. Erros
de omissão (alvos perdidos) e de comissão (alvos incorretos) foram computados e
53
ajustados respectivamente para o número de vezes que o número escolhido e os demais
apareciam.
Genotipagem
DNA genômico de alto peso foi extraído do sangue por um procedimento de salting-out
(Lahiri and Nurnberger, 1991). A região do éxon III do DRD4 contendo o polimorfirmo
VNTR de 48 pares de base foi amplificada por reação em cadeia da polimerase como
descrito por Roman et al (1999).
Análise de dados
Comparações entre variáveis categóricas foram realizadas utilizando qui-quadrado ou
teste exato de Fisher. Todas as variáveis contínuas apresentando distribuição normal
foram comparadas entre grupos pelo teste T de Student; para aquelas variáveis (e.g.,
medidas do CPT) que não apresentaram distribuição normal, testes não-paramétricos
foram usados (teste U de Mann-Whitney). O nível de significância foi estabelecido em
0,05. Potenciais confundidores avaliados foram idade, sexo, etnia, subtipo de TDAH,
intensidade de sintomas (escores SNAP-IV), QI, e comorbidades (humor, ansiedade, e
transtornos externalizantes). Definiu-se como confundidor aquela variável associada
simultaneamente com as variáveis dependente e independente (p ≤ 0,02). Apenas idade,
apesar de apresentar grande sobreposição ente grupos genotípicos, preencheu critérios
para confundidor, sendo assim incluída nas análises ajustadas. Para obtenção de
distribuição normal, escores do CPT foram ranqueados antes da inclusão na análise de
variância (Montgomery, 1997). Todos os testes foram bi-caudais.
54
Resultados
Características da amostra
Noventa crianças e adolescentes foram avaliados. A média de idade foi de 10,9 (DP =
2,8) anos, e o QI médio foi de 94 (DP = 12). A maior parte da amostra era de
ancestralidade européia (95,2%) e masculina (74,4%). O subtipo combinado de TDAH foi o
mais prevalente (69,7%), e o transtorno e oposição e desafio foi a condição comórbida
mais comum (41,1%). Análises de subgrupo de acordo com genótipo mostraram que a
média de idade foi de 9,77 anos (DP = 2,66) para crianças no grupo de 7 repetições e de
11,34 (DP = 2,79) para aqueles sem o alelo. Crianças com duas cópias do alelo de 4
repetições tinham uma média de idade 11,35 anos (DP = 2,72), enquanto que aquelas
sem a homozigose tinham uma média de 10,36 (DP = 2,87).
Desempenho neuropsicológico
Observou-se diferenças nos escores do CPT entre os diferentes grupos genotípicos após o
ajuste para idade (Tabela 1). A presença de um alelo de 7 repetições esteve associada a
um número maior de erros por comissão (F = 4,55, df = 1, p = 0,036). Na mesma direção,
sujeitos com duas cópias do alelo de 4 repetições cometeram menos erros tanto por
comissão (F = 5,94, df = 1, p = 0,017) quanto por omissão (F = 5,23, df = 1, p = 0,025).
Intensidade de sintomas (escores SNAP-IV), apesar de não preencher critérios
estatísticos para potencial confundidor, foi incluída em análises adicionais e não afetou
significativamente os resultados (dados não apresentados).
55
Discussão
Nossos dados sugerem uma associação entre o genótipo DRD4 e o desempenho no CPT
em crianças e adolescentes com TDAH. Jovens com um ou mais alelos de 7 repetições
deram mais respostas impulsivas, enquanto que a homozigose de 4 repetições esteve
associada com um número menor de erros tanto de desatenção quanto de impulsividade.
Mecanismos neuroquímicos podem subjazer tal contraste, dado que receptores
expressados por alelos não-4 apresentam uma resposta subótima ao estímulo
dopaminérgico (Wang et al, 2004).
O presente trabalho deve ser interpretado no contexto de alguma limitações.
Primeiramente, um número reduzido de desfechos neuropsicológicos foi avaliado. Além
disso, nós não podemos excluir heterogeneidade haplotípica entre alelos com o mesmo
número de repetições. Contudo, a robustez de nosso achados é reforçada pela análise
conservadora de dados e pelo fato de que nossa amostra era virgem de psicofármacos. O
impacto da medicação no desempenho neuropsicológico é um potencial confundidor não
considerados em todos os estudos prévios.
Nossos resultados fornecem uma replicação construtiva de um estudo anterior (Langley
et al, 2004) e vão um passo além ao identificar uma diferença significativa no
desempenho no CPT de acordo com o genótipo DRD4 dentro do diagnóstico TDAH. Nós
não apenas avaliamos o impacto do alelo de 7 repetições, mas também demonstramos o
efeito protetor do alelo de 4 repetições. Tais achados trazem evidência adicional para o
papel de polimorfismos do DRD4 no desempenho de crianças e adolescentes em um teste
de atenção sustentada que não pode ser explicado pela intensidade de sintomas do
56
TDAH.
57
Referências
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60
Tabela 1. Escores para erros por omissão e por comissão no CPT de acordo com o genótipo DRD4
Escore Análise bruta Análise ajustada*
n Mediana Intervalo Z P F P
Erros por omissão
7 repetições presente 26 0,200 0,754 -3,12 0,002 0,49 0,485
7 repetições ausente 64 0,073 0,911
Homozigose 4 repetições 48 0,070 0,911 -2,85 0,004 5,23 0,025
Homozigose 4 repetições 42 0,192 0,875
Erros por comissão
7 repetições presente 26 0,019 0,100 -2,15 0,036 4,54 0,036
7 repetições ausente 64 0,007 0,165
Homozigose 4 repetições 48 0,006 0,165 -2,75 0,006 5,94 0,017
Homozigose 4 repetições 42 0,012 0,100
*Ajuste para idade; CPT: teste de desempenho continuado; DRD4: gene para o receptor D4 de dopamina.
61
6. Artigo 2
THE -1021 C/T DBH POLYMORPHISM IS ASSOCIATED WITH NEUROPSYCHOLOGICAL
PERFORMANCE AMONG CHILDREN AND ADOLESCENTS WITH ADHD
Christian Kieling¹, Júlia P. Genro², Mara H. Hutz², and Luis Augusto Rohde¹
¹Department of Psychiatry, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre
²Department of Genetics, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre
Running head:
DBH and neuropsychology in ADHD
Correspondence to:
Dr. Luis Augusto Rohde (lrohde@terra.com.br)
Serviço de Psiquiatria da Infância e Adolescência, Hospital de Clínicas de Porto
Alegre, Rua Ramiro Barcelos, 2350 Porto Alegre, 90035-003, RS, Brazil.
Submitted for publication in the American Journal of Medical Genetics: Part B,
Neuropsychiatric Genetics on May 8, 2007.
62
Abstract:
Catecholaminergic imbalance has increasingly been implicated in the pathophysiology
of attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD). The enzyme dopamine-beta-
hydroxylase (DβH) – critical to catecholaminergic regulation – is under strong genetic
control, with the -1021 C/T polymorphism accounting for up to 50% of the enzymatic
activity. This work aimed to investigate association between this functional
polymorphism and the performance of children and adolescents with ADHD in
neuropsychological measures of executive function (EF). Sixty-four drug-naïve
patients with ADHD undertook a Continuous Performance Test and the Wisconsin Card
Sorting Test. By means of a factorial analysis, a composite measure of EF was
extracted. Performance according to genotypic group was analyzed, including age as
a confounder. In addition, a family-based association test was conducted as a
confirmatory analysis. Principal components analysis of neuropsychological measures
loaded two factors that explained 83.8% of total variance. Cognitive performance, as
measured by the composite score, showed significant difference between genotypic
groups after adjustment for age (p=0.002). The CC homozygosity was associated with
a diminished global EF performance, a result that was corroborated by the intra-
familial analysis. The present study demonstrated an association between the
neuropsychological performance of children with ADHD and a functional
polymorphism in the promoter region of the DBH gene. The refinement of the ADHD
phenotype by means of composite measures of EF can contribute to uncover the
molecular underpinnings of ADHD.
Key words: attention-deficit/hyperactivity disorder; dopamine-beta-hydroxylase;
endophenotype; executive functions
63
Introduction
Mounting evidence implicates catecholaminergic imbalance in the neurobiological
basis of attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) [Pliszka, 2005]. Dopamine-β-
hydroxylase (DβH) catalyzes the conversion of dopamine (DA) into norepinephrine
(NE) and is found in sympathetic terminals, adrenal glands, and in the prefrontal
cortex (PFC). It is stored in catecholamine-containing vesicles and released along
with DA and NE by exocytosis into the extracellular space [Cubells and Zabetian,
2004].
DβH activity and levels are under strong genetic control [Weinshilboum, 1978]. High
concentrations of DβH have been identified in human PFC [Gaspar et al., 1989], and
knockout mouse models have demonstrated that DβH levels and activity in the PFC
are regulated by a gene-dosage effect [Bourdelat-Parks et al., 2005]. Serum and
cerebrospinal fluid levels exhibit important inter-individual variation and stability in
adult life [Jonsson et al., 2004]. In the pediatric population, a marked increase is
observed during childhood, with a decrease and stabilization occurring in
adolescence [Freedman et al., 1972; Paclt and Kouddelova, 2004].
The chromosomal localization for DBH, the gene encoding DβH, is at 9q34 [Craig et
al., 1988]. A restriction site in intron 5 (Taq1) was the first DBH polymorphism
associated with ADHD [Daly et al., 1999]. Although results have been dissonant,
indicating a possible linkage disequilibrium with the true variant [Tang et al., 2006],
a combined odds ratio of 1.33 (95% CI 1.11–1.59) was obtained after pooling together
all published family-based studies [Faraone et al., 2005]. More recently, this same
polymorphism has been associated with performance in sustained and temporal
attention tasks among children and adolescents with ADHD [Bellgrove et al.,
64
2006a,b]. In a longitudinal study, the Taq1 polymorphism was linked to hyperactivity
during childhood, poorer test scores in hyperactive adolescents, and earning less
money on a card playing task in adults [Barkley et al., 2006]. In healthy adults,
another DBH polymorphism (G444A) has also been implicated in cognitive
performance, with results suggesting a selective association with working memory
but not with visuospatial attention [Parasuraman et al., 2005].
The major genetic marker for DβH activity, nonetheless, seems to be located at DBH
promoter region and was identified by Zabetian et al. [2001]. They demonstrated
that the -1021 C/T polymorphism (rs1611115) was responsible for up to 50% of the
variation of plasma DβH activity in three ethnically distinct populations. To date, few
studies have investigated the association between this functional polymorphism and
ADHD. Results have been inconclusive, including one report of lack of association
[Bhaduri and Mukhopadhyay, 2006] and two other studies exhibiting puzzling
associations that conferred risk according to subtype, gender, and presence of
disruptive behavior [Zhang et al., 2004 and 2005]. Taken together, the literature
suggests that the role of DBH polymorphisms on the pathophysiology of ADHD
warrants further investigation [Wigg et al., 2002].
The clinical and biological heterogeneity of ADHD requires investigational strategies
to address its complexity at both levels. Rather than dichotomic symptom-based
categorization (i.e., either present or absent), ADHD should be regarded as a
phenomenological continuum. Additionally, it is likely that different subgroups of
ADHD patients present distinct characteristics, making the search for a single core
deficit unpromising [Nigg et al., 2005; Pennington, 2005]. The use of the
endophenotypic approach in the study of the molecular bases of ADHD may enhance
65
the sensitivity to specific dimensions of the disorder [Sergeant, 2005a; Waldman,
2005].
A meta-analysis by Willcutt et al. [2005] suggested that executive functions (EF) are
suitable as endophenotypic measures for ADHD. The joint analysis of more than six
thousand individuals with and without ADHD revealed that despite the significant
impairment of ADHD subjects in all tasks, executive dysfunctions were not universally
present in the ADHD group. In this sense, the identification of a particular subset of
ADHD patients presenting with selective neuropsychological impairments propels the
search for specific neurobiological substrates [Waldman et al., 2006]. Interestingly,
evidence from familial aggregation and real-world impairments supports this idea.
Nigg et al. [2004] identified the presence of neuropsychological deficits in relatives
of a subgroup of ADHD children with EF deficits. Biederman et al. [2004] showed that
among children with ADHD, those with executive dysfunction were at higher risk for
grade retention and decreased academic achievement in comparison to those with
ADHD alone. In another work, Biederman et al. [2006] demonstrated additional
support for the external validity of an EF subgroup in a sample of persistent ADHD:
those with psychometrically defined deficits had an increased risk for academic and
occupational underachievement.
In order to parse individuals with and without executive dysfunction, studies usually
employ arbitrary cut-off points (e.g., 90
th
percentile or 1.5 standard deviations).
However, like ADHD characteristics, results from EF tasks are not discrete entities,
but instead are a quantitatively distributed continuum [Sonuga-Barke, 2005]. An
alternative in managing multiple neuropsychological measures is to develop
composite scores that capture the cognitive dimensions of ADHD. Combined variables
may be devised according to theoretical assumptions and/or statistical criteria (e.g.,
66
by means of factorial analyses) [Doyle et al. 2005]. This would provide the ability to
aggregate information into a reduced number of constructs that are psychometrically
robust (reduced measure-associated error) and conceptually powerful.
The aim of this work was to appraise the association and linkage between the -1021
DBH polymorphism and EF performance among patients presenting with ADHD.
Despite previous reports of association between the intronic Taq1 polymorphism and
ADHD (including a family-based study conducted by our group [Roman et al., 2002]),
the -1021C/T polymorphism was chosen in this work because of its known functional
role in the regulation of an enzyme critical to catecholaminergic systems. The
hypothesis to be tested was that the refinement of the ADHD phenotype by means of
composite measures of EF would allow the detection of the role of different DBH
genetic backgrounds on the neuropsychological performance of children and
adolescents with ADHD.
Materials and methods
Participants
The sample consisted of children and adolescents referred to the ADHD outpatient
clinic at our University Hospital (HCPA). Inclusion criteria were age between 7 and 17
years; ADHD diagnosis according to DSM-IV [American Psychiatric Association, 2000];
drug naïve patients; and IQ≥70. Exclusion criterion was the presence of clinical
conditions that could potentially interfere with the tests, e.g., blindness, deafness,
pervasive developmental disorder, and other major neurological disorders. Parents
provided written informed consent, and children or adolescents gave verbal assent to
participate. This investigation was approved by the ethics committee of the HCPA.
67
Diagnostic procedures
Diagnostic procedures for ADHD and comorbid diagnoses in our unit have been
previously described [Rohde, 2002] and comprise a three-stage process: (1)
evaluation with a semi-structured interview (Schedule for Affective Disorders and
Schizophrenia for School-Age Children, Epidemiological Version – K-SADS-E)
[Orvaschel, 1985], modified to assess DSM-IV criteria and applied to parents by
trained research assistants – whose inter-rater reliability had been previously
evaluated (kappas ranging from 0.77 to 1, p<0.001); (2) discussion of each diagnosis
derived through the K-SADS-E in a clinical committee chaired by a senior psychiatrist
(LAR); and (3) clinical evaluation of ADHD and comorbid conditions using DSM-IV
criteria by a child psychiatrist who had previously received the K-SADS-E results.
When a diagnostic disagreement occurred in the three-stage process, priority was
given for diagnoses obtained through clinical interviews. Severity of ADHD symptoms
was assessed with the Swanson, Nolan, and Pelham (SNAP-IV) rating scale [Swanson
et al., 2001].
Neuropsychological assessment
EF was measured by performance in the Wisconsin Card Sorting Test (WCST) [Berg,
1948] and in a version of the Continuous Performance Test (CPT) [Cornblatt et al.,
1988]. Testing was administered by three trained psychologists using standardized
procedures, including same software and hardware. Full Scale IQ was estimated from
vocabulary and block design subtests of the Wechsler Intelligence Scale for Children –
Third Edition [Wechsler, 1991]. Subjects performed a simplified version of the CPT
[Conners, 1985], in which a series of numbers, from one to nine, appeared randomly,
68
one at a time, with a two seconds interval, for nine minutes, on the computer
screen. Individuals were required to press a button whenever the number six
appeared. Omission (missed targets) and commission (incorrect targets) errors were
computed and adjusted respectively for the number of times the selected and other
digits appeared. In the 128-cards computerized version of the WCST, each patient
was required to match series of cards according to varying criteria (number, color, or
shape). Subjects were not instructed about how cards should be matched, having to
apprehend the criterion from feedback given after each choice (correct or incorrect).
Generated scores are number of total errors, perseverative and nonperseverative
errors, perseverative responses and achieved categories.
Genotyping
For each subject, high molecular weight genomic DNA was extracted from whole
blood by a standard salting out procedure. Polymerase chain reaction (PCR)
amplification and genotyping of the DßH promoter region were performed as
previously described by Köhnke et al. [2002].
Statistical analyses
Association between genotype and neuropsychological performance was assessed
using analysis of covariance (ANCOVA). In order to obtain a normal distribution, CPT
and WCST scores were ranked before inclusion in factorial and covariance analyses
[Montgomery, 1997].
Potential confounders – covariates – evaluated were age, sex, ethnic background,
ADHD subtype, severity of symptoms (SNAP-IV scores), IQ, and comorbidity (mood,
69
anxiety, and disruptive behavior disorders). A confounder was defined as a variable
associated with both independent and dependent variables (p≤0.2) [Maldonado and
Greenland, 1993]. Comparison among categorical variables was performed using χ² or
Fisher’s exact test; continuous variables were compared by Student T test or Mann-
Whitney U test, according to data distribution.
Principal components analysis was used to identify factors of cognitive performance
and to quantify the amount of variability accounted by each generated factor. This
procedure also provided factorial scores – composite variables representative of
underlying dimensions. Criteria adopted for factor loading included eigenvalues
greater than 1, scree plot analysis, Kaiser-Meyer-Olkin measure of sampling
adequacy, and Bartlett’s test of sphericity [Hair, 1998]. Extracted factors were
rotated with the varimax orthogonal method, a strategy that minimizes the number
of variables with high loadings on each factor. Factorial scores were obtained
according to extracted factorial weighting and original variables values, generating
new standardized scores (with a mean of 0 and a standard deviation equal to the
squared multiple correlation between the estimated factor scores and the true factor
values) that are suitable for subsequent analyses. All derived factorial scores were
merged by simple sum in order to yield a composite measure of impairment.
This primary outcome variable was additionally analyzed in a family-based
association test (FBAT) [Laird and Lange, 2006], a method that is robust against
artifacts of population stratification and admixture. The FBAT is a generalization of
the transmission
disequilibrium test and it is used to assess simultaneously allele
transmission and offspring trait values. The recently developed PBAT software
[Lange, 2004] provides a test for the null hypothesis of both no linkage and no
association via FBAT statistic, allowing also the use of continuously distributed traits
70
and the adjustment of potential confounders.
SPSS version 13.0 was used in all analyses except genotype distribution and FBAT
statistic. The accepted level of significance was 0.05 for all analyses, excluding
confounder assessment (conservative threshold of 0.2). All tests were two-tailed.
Results
Sample
Sixty-four children and adolescents were included in this study. Global mean age was
10.61 (SD±2.80) years, and mean IQ was 95.66 (SD±12.27). Boys constituted 81.25% of
the entire group, for which the majority of subjects was from European ancestry
(96.61%). Combined ADHD was the most frequent subtype (65.62%), and the most
prevalent comorbidities were oppositional defiant disorder (45.31%), anxiety
disorders (26.98%), and conduct disorder (18.75%). Characteristics according to
genotype are shown in Table 1. Results indicated that only age survived our
statistical threshold for a confounder variable, since it was associated with both the
factor in study and the outcome for a p ≤ 0.2. Thus, age was included as a
confounder in all subsequent analyses. No other variable met criteria for a potential
confounder.
Children and adolescents presented allelic frequencies of 73.4% for the C allele and
26.6% for the T allele; genotypic distribution in this sample was 54.7% for CC, 37.5%
for CT and 7.8% for TT. CT and TT genotypes were pooled into a single group due to
the low prevalence of the later. Frequencies were in Hardy-Weinberg equilibrium
(p=0.599). To perform the confirmatory family-based analysis, information on 49
71
trios was available – for the remaining 15 singletons there was no genotypic
information from parents.
Neuropsychological performance
Principal components analysis of neuropsychological measures loaded two factors
that explained 83.8% of total variance. As expected, scores obtained within the same
neuropsychological test (i.e., WCST or CPT) were strongly correlated. With exception
of WCST nonperseverative errors, which was excluded from subsequent analyses, all
factor extractions exceeded the 0.3 loading level (Table 2). A global measure of
cognitive impairment was obtained by the simple arithmetic sum of the two derived
factorial scores. This combined score had normal distribution, with a mean of 0 and a
standard deviation of 1.41.
Cognitive performance, as measured by the composite score, showed significant
difference between genotypic groups after correcting for age (p=0.002). Estimated
adjusted means indicated a worse performance of the CC group (composite score
0.390; 95% CI 0.043 to 0.737) when compared to the CT/TT group (global score
-0.471; 95% CI -0.853 to -0.089). Inclusion of IQ or SNAP scores as covariates, albeit
not required according to the adopted statistical criteria, was performed and did not
significantly affected results (data not shown).
When factorial scores were assessed independently, the CPT score confirmed a
significant association with genotype (p=0.028), whereas the WCST showed only a
trend for association (p=0.071). In order to further investigate which elements were
specifically associated to the DBH genotype, analyses of covariance were repeated
for every single neuropsychological measurement. Individual items in both CPT and
72
WCST correlated with genotypic group after adjustment for age. Patients with the CC
genotype made more errors of both commission and omission and also presented a
perseverative prone response style (Table 3).
Because not all families had heterozygous parents, only 32 out of the 49 available
trios were informative for the confirmatory analysis. Results obtained in the
association test were corroborated by the FBAT analyses, as the DBH -1021 C/T
polymorphism transmission showed association and linkage with neuropsychological
performance even after adjustment for age (p=0.041). Again, in this subsample,
subjects with CC homozygosity had a worse cognitive performance in comparison to
those with CT or TT genotypes.
Discussion
This work investigated the impact of a DBH polymorphism on the neuropsychological
achievement of children and adolescents with ADHD in tests of EF. By means of a
factorial analysis, a composite index of cognitive impairment was devised in order to
capture latent dimensions of CPT and WCST. The CC homozygosity at the -1021
position of the DBH gene was associated with a diminished global EF performance, as
well as with worse individual scores in both the CPT and the WCST.
Published data suggest that DBH genotypic status has a significant impact in cognitive
function among individuals with [Barkley et al., 2006; Bellgrove et al., 2006a,b] and
without [Parasuraman et al., 2005; Togsverd et al., in press] ADHD. Comparison
among studies remains limited since research that investigated the role of DBH
polymorphisms on cognitive performance analyzed different polymorphisms. Tang et
al. [2006] investigated the contribution of both -1021C/T and Taq1 variations to the
73
plasma DβH levels. They found that although Taq1 was significantly associated with
enzymatic levels, this association was largely explained by linkage disequilibrium
with the -1021C/T polymorphism: in a model that included these two and a third
polymorphism, Taq1 accounted for only 4% of the DβH plasma variance. The same
study also showed that the lack of biunivocity between alleles hinders a precise
correspondence between loci.
While cellular and imaging studies have shown that optimal levels of DA and NE are
needed for proper activation of the PFC [Arnsten and Li, 2005], recent
neurocomputational models are disentangling the roles of DA and NE in cognitive
deficits of ADHD. Computational approaches advocate that DA serves as a gating
system, having a critical role in reinforcement learning [Montague et al., 2004] and
in working memory updating performance [Frank et al., in press]. NE dysregulation
seems to be related to an inconsistent response style, including deficits such as
erratic switching behavior and increased response variability due to a decreased
signal-to-noise ratio. Catecholaminergic modulation would follow the principles of a
Yerkes-Dodson curve (inverted-u relationship between arousal and performance),
according to which insufficient or excessive neurotransmitter levels would result in
suboptimal performance [Aston-Jones and Cohen, 2005].
Animal studies may help to identify the nature of the neurochemical imbalances
underlying ADHD phenomenology. Spontaneous hypertensive rats (SHR) are among
the most investigated animal models of ADHD, presenting poor stability of
performance and impaired ability to withhold responses [Sagvolden et al., 2005].
Different studies evidenced decreased DA release and deficient inhibitory control
over NE terminals, revealing a hypodopaminergic and hypernorepinephric profile for
the SHR [Russel, 2002]. Mice knockout for the Dbh gene presented more differences
74
in DA than in NE levels, highlighting the importance of the DA/NE ratio [Oades et al.,
2005]: although absent in the PFC of -/- mice, NE was only slightly decreased in +/-
animals, whereas DA levels were increased five and twofold respectively [Bourdelat-
Parks et al., 2005]. This is in accordance with the model proposed by Cubells and
Zabetian [2004], in which lower levels of DβH protein may lead to elevated ratios of
DA to NE. They postulate that DβH can act as the rate-limiting enzyme for the
conversion of DA to NE and that this effect would be more pronounced in areas
having DA receptors and receiving NE innervation, such as the PFC [Devoto et al.,
2001].
Only patients who had never made use of any neurological or psychiatric medication
took part in this study (this procedure was possible since neuropsychological
evaluation is part of the diagnostic battery in our clinic). The sample included
patients with different patterns of comorbidities and a relatively large age span.
Notwithstanding the goal of phenotype refinement, these features increase external
validity of our findings and were allowed by the adoption of a conservative analysis
of potential confounders. An important limitation of the present study was the small
sample size (n=64). Nevertheless, analyses exhibited sufficient power to detect
significant differences in the main composite outcome. It should be underscored that
further replications in larger samples are necessary to confirm these results.
Another caveat of the present work refers to the reduced set of neuropsychological
outcomes evaluated. Recently developed tests are increasingly sophisticating the
depiction of ADHD endophenotypes, emphasizing domains other than EF [Nigg, 2005;
Sergeant, 2005b]. Nonetheless, the tests here employed have well-established
psychometric properties in the literature and are widely used in the clinical setting.
In addition, these measures have been shown to be correlated with impairments in
75
real-world activities: deficits in set-shifting, e.g. WCST perseverative errors and
responses, were demonstrated to be associated with problems in goal-directed
behavior in route task both in videogames and in the zoo [Lawrence et al., 2004].
Dimensional analyses based on factorial scores are a reliable alternative to the use of
raw scores, despite the disadvantage of being less readily interpretable [Koren et al.,
1998]. The validity of the findings here reported is supported by the convergent
results obtained with the two independent analytical methods employed, reassured
by the conservative analyses of potential confounders. The use of family-based
association tests provides an analysis that is resilient to population stratification, one
of the most critical limitations of contemporary candidate gene studies. Since
developmental fluctuations in DβH levels have been documented, the inclusion of
age as a confounder may also have potentially corrected for enzymatic activity
differences across ages.
Further investigation of the dynamics of gene-gene and gene-environment
interactions is of capital importance for understanding the exact role of DBH
polymorphisms on cognitive function of patients with ADHD. Longitudinal studies and
examination of other putative endophenotypes are among the most promising
strategies. The present study demonstrated an association between
neuropsychological performance and a functional polymorphism in the promoter
region of the DBH gene. One straightforward explanation is that the CC homozigosity
reflects an increased expression of the DβH enzyme due to its effect in gene
transcription control, thus converting more DA into NE. Alterations in enzymatic
activity may cause catecholaminergic imbalance in the PFC, probably as a result from
decreased inhibitory DA activity associated with an increased NE activity. This might
be relevant given the fact that maximal PFC performance relies on moderate
76
stimulation of receptors, and may be limited by extreme levels of neurotransmitters.
Future research will refine the current understanding of how genetic and
environmental factors affect attentional processes by regulating the neurochemical
milieu.
Acknowledgments:
This work was partially supported by research grants from CNPq (Institutos do
Milênio, 471761/03-6 and 300226/2002-0), Pronex-Fapergs, CAPES (scholarship to
CK), and Hospital de Clínicas de Porto Alegre. The authors wish to thank Heloisa
Kaefer, Márcia Knijnik, and Natália Soncini for conducting neuropsychological testing.
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83
Table 1. Sample characteristics according to DBH genotype and analyses of potential
confounders
CC
n=35
CT/TT
n=29
group
difference
(p-value)
Age – mean (sd) 11.1 (3.1)
10.1 (2.3)
.15*
IQ – mean (sd) 93.7 (11.7)
97.0 (12.8)
.17
Males – n (%) 26 (74.3)
26 (89.7)
.20
European ancestry – n (%) 31 (93.9)
29 (100.0)
.49
ADHD combined – n (%) 25 (71.4)
17 (58.6)
.28*
Total SNAP – mean (sd) 1.7 (0.7)
1.6 (0.5)
.48
Mood – n (%) 4 (11.4)
4 (13.8)
1
Anxiety – n (%) 7 (20.0)
10 (34.5)
.25
ODD – n (%) 19 (54.3)
10 (34.5)
.11
CD – n (%) 7 (20.0)
5 (17.2)
.78
*=Associated with neuropsychological performance for a p ≤ 0.2; DBH, dopamine-
beta-hydroxylase; ADHD, Attention-deficit/hyperactivity Disorder; SNAP, Swanson,
Nolan, and Pelham rating scale; ODD, Oppositional defiant disorder; CD, Conduct
disorder.
84
Table 2. Principal components analysis of neuropsychological measures: rotated
matrix loadings and communalities
components
1 2
communalities
WCST total errors 0.901 0.168 0.839
WCST perseverative responses 0.911 0.176 0.860
WCST perseverative errors 0.926 0.180 0.891
WCST achieved categories -0.767 -0.188 0.624
CPT errors of omission 0.166 0.938 0.908
CPT errors of commission 0.216 0.927 0.906
WCST, Wisconsin Card Sorting Test; CPT, Continuous Performance Test.
85
Table 3. Neuropsychological performance according to DBH genotype
CC n=35 CT/TT n=29 analyses*
test
median range median range F p
CPT
omission errors 0.146 0.911 0.129 0.875 4.836 0.032
commission errors 0.012 0.165 0.010 0.065 9.237 0.003
WCST
total errors 55 83 43 65 3.760 0.057
perseverative errors 23 87 19 75 5.270 0.025
nonperseverative errors 22 68 22 68 0.094 0.760
perseverative responses 25 119 20 98 4.744 0.033
achieved categories 4 12 4 13 1.905 0.173
*Adjusted for age; WCST, Wisconsin Card Sorting Test; CPT, Continuous Performance
Test; DBH, dopamine-beta-hydroxylase.
86
7. Conclusão
Em uma amostra clínica de crianças e adolescentes com TDAH, identificou-se
diferenças no desempenho neuropsicológico de acordo com grupo genotípico. A
presença de pelo menos um alelo de 7 repetições do DRD4 esteve associada a um
maior número de erros por comissão no CPT (p=0,036), enquanto que a homozigose
44 protegeu contra erros tanto por omissão (p=0,017) quanto por comissão (p=0,025),
mesmo após ajuste para idade. Já em relação ao gene DBH, a homozigose CC no
polimorfismo -1021 C/T esteve associada a um menor desempenho cognitivo, medido
por um escore fatorial que explicou 83,8% do desempenho nos testes CPT e WCST
(p=0,002).
A investigação de diferentes potenciais confundidores pode ser vista como um dos
pontos fortes deste trabalho. A utilização de métodos como análise de componentes
principais e análise familiar de desfechos contínuos também têm aparecido como
estratégias promissoras para a obtenção de resultados mais robustos em estudos de
herança complexa. Um dos principais desafios na pesquisa em endofenótipos
neuropsicológicos do TDAH é a validação de critérios para a definição de um
endofenótipo clinicamente relevante. Também será necessário o desenvolvimento de
consensos sobre quais os testes neuropsicológicos mais apropriados para a
investigação em TDAH, objetivando, a posteriori, uma padronização dos mesmos, de
modo a permitir a replicação de estudos em diferentes populações. Não menos
importante, o emprego do conceito de exofenótipos (marcadores externos ao
fenótipo propriamente dito, e.g., perfil de comorbidades) também parece ser de
extrema relevância para pesquisas futuras.
87
Os resultados aqui apresentados devem ser interpretados no contexto de algumas
limitações. O desenho naturalístico deste trabalho, com todas as suas limitações
metodológicas inerentes, o coloca no campo da pesquisa exploratória. O reduzido
número de desfechos neuropsicológicos examinados, bem como a não inclusão de
testes de domínios outros que funções executivas, também pode ser mencionada
como uma restrição importante. O desenho aqui empregado também gerou
limitações em termos de número de pacientes e familiares com genotipagem
disponível. Trabalhos futuros serão necessários para a confirmação dos achados aqui
relatados.
A repercussão biológica das alterações genéticas aqui investigadas ainda são incertas,
mas, baseando-se em trabalhos prévios, são possíveis algumas especulações. Estudos
in vitro sugerem que alelos do DRD4 que não o de 4 repetições apresentam uma
resposta diminuída ao estímulo catecolaminérgico na redução dos níveis
intracelulares de AMP cíclico, fenômeno que poderia estar associado a uma
neurotransmissão menos eficaz. Em relação ao gene DBH, sabe-se que a expressão da
enzima DβH é fortemente regulada pelo polimorfismo -1021, estando a presença de
ao menos uma cópia do alelo T associada a níveis enzimáticos reduzidos se
comparados aos encontrados na homozigose CC. Tais diferenças, ao acarretar
prováveis alterações na regulação dos neurotransmissores NA e DA em determinadas
regiões cerebrais, se traduzem em perfis distintos de desempenho em testes
neuropsicológicos entre pacientes com TDAH.
A redução da variabilidade fenomenológica por meio do uso de testes
neuropsicológicos de função executiva permitiu a identificação de subgrupos de
pacientes com TDAH associados a polimorfismos funcionais de genes que codificam
proteínas do sistema catecolaminérgico. Além disso, observou-se que o refinamento
88
do fenótipo TDAH por meio de medidas compostas de funções executivas pode ajudar
no entendimento das bases moleculares do transtorno. Tais achados fornecem
evidência adicional acerca do papel de polimorfismos dos genes DRD4 e DBH no
desempenho de crianças e adolescentes com o diagnóstico de TDAH em testes
neuropsicológicos de funções executivas.
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