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ATIVIDADE E FUNCIONALIDADE DAS COMUNIDADES
NITRIFICADORAS, DESNITRIFICADORAS E FIXADORAS DE
NITROGÊNIO EM SOLOS SOB DIFERENTES COBERTURAS
VEGETAIS NA REGIÃO NORTE DO ESTADO DO RIO DE
JANEIRO.
SIDY MACTAR NDAW
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MARÇO – 2007
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ATIVIDADE E FUNCIONALIDADE DAS COMUNIDADES
NITRIFICADORAS, DESNITRIFICADORAS E FIXADORAS DE
NITROGÊNIO EM SOLOS SOB DIFERENTES COBERTURAS
VEGETAIS NA REGIÃO NORTE DO ESTADO DO RIO DE
JANEIRO.
SIDY MACTAR NDAW
Tese apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Doutor em Produção Vegetal.
Orientadora: Prof
a
Emanuela Forestieri da Gama-Rodrigues.
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MARÇO – 2007
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ATIVIDADE E FUNCIONALIDADE DAS COMUNIDADES
NITRIFICADORAS, DESNITRIFICADORAS E FIXADORAS DE
NITROGÊNIO EM SOLOS SOB DIFERENTES COBERTURAS
VEGETAIS NA REGIÃO NORTE DO ESTADO DO RIO DE
JANEIRO.
SIDY MACTAR NDAW
Tese apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Doutor em Produção Vegetal.
Aprovada em Março de 2007.
Comissão examinadora:
_______________________________________________________________
Prof
a
. Solange Silva Samarão (D. Sc., Biociências e Biotecnologia) – ISTCA.
_______________________________________________________________
Prof
a
. Marta Simone Mendonça freitas (D. Sc., Produção Vegetal) – UENF.
_______________________________________________________________
Prof. Antônio Carlos da Gama-Rodrigues (D. Sc., Ciência do solo) – UENF
_______________________________________________________________
Prof
a
Emanuela Forestieri da Gama-Rodrigues (Ph.D., Ciência do solo) – UENF
Orientadora
Ofereço aos meus pais Ousmane Ndaw (“in memoriam”) e Oumou Kalsom Diouf, aos meus
filhos, à minha família, aos meus amigos e à nossa terra.
.
“Transformar o medo em respeito, o respeito
em confiança. Descobrir como é bom chegar
quando se tem paciência. E para chegar
onde quer que seja, aprendi que não é
preciso dominar a força, mas a razão. É
preciso, antes de mais nada, querer”.
Amir Klink
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus, pela presença divina em todos os momentos de
minha vida e pela força espiritual a mim designada, para que eu pudesse
concluir mais essa etapa rumo ao conhecimento científico.
Agradeço aos meus pais Ousmane Ndaw e Oumou Kalsom Diouf por
todos os ensinamentos, amor, carinho e dedicação de sempre.
Meu reconhecimento:
Ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA) da
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), pela
oportunidade de realização do doutorado.
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) e à
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), que
me concederam bolsas de doutorado pleno e doutorado sanduíche,
respectivamente, sem as quais não teria sido possível a realização deste
trabalho.
À Universidade “ Claude Bernard de Lyon I ” e ao Laboratório de
Ecologia Microbiana, pelo apoio e por ter cedido suas instalações e material de
consumo (reagentes) para execução de parte deste trabalho.
Aos meus filhos, meus maiores incentivos para continuar e concluir
meus propósitos.
À Prof
a
. Dra Emanuela Forestieri da Gama-Rodrigues pela orientação
prestada durante todo o curso.
Ao Dr. Franck Poly, pela orientação amiga e, acima de tudo, pautada na
verdadeira ética profissional.
Aos professores membros da banca examinadora, pelas críticas e
sugestões apresentadas.
À técnica do Laboratório de Solos e Nutrição de Plantas, Kátia Regina
Sales pela colaboração e amizade.
Aos amigos do CCTA, em especial à Maria Kellen, ao Zaia, ao Marius, à
Gleicia e à Vanilda, pela amizade, convívio e apoio.
À Alessandra Pontirolli, ma petite amie, minha namorada, pelo incentivo,
amor e carinho de sempre.
À Ana Paula da Silva, pelo apoio, amor e carinho de sempre.
Aos amigos do laboratório “ Ecologie Microbienne “ em especial ao
Xavier Le Roux, à Claire, à Nadine, ao Dad, à Eleonore, à Joana e à My Dung
pela recepção, convívio, troca constante de informações, amizade e apoio.
Aos familiares e aos amigos no Senegal, pelo apoio e estímulo que me
ofereceram para realizar tamanho esforço, longe da companhia e do carinho
deles.
SUMÁRIO
RESUMO GERAL
GENERAL ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO GERAL_______________________________________ 1
2. Hipótese científica __________________________________________ 4
3. Justificativa ________________________________________________ 5
4. Objetivo Geral _____________________________________________ 6
5. REVISÃO DE LITERATURA __________________________________ 8
5.1 Cordão da mata ou corredores de conservação __________________ 8
5.2 Grupos funcionais em ecossistemas terrestres___________________ 9
5.3 Metabolismo microbiano do ciclo de nitrogênio__________________ 12
5.3.1 Mineralização____________________________________________ 13
5.3.2 Nitrificação______________________________________________ 14
5.3.3 Desnitrificação ___________________________________________ 15
5.3.4 Fixação de nitrogênio______________________________________ 15
5.3.5 Reações de transformações biológicas do nitrogênio _____________ 17
5.4 Metodologias empregadas no estudo da diversidade microbiana ____ 18
5.4.1 Extração de DNA de amostras ambientais _____________________ 18
5.4.2 Reação de polimerização em cadeia (PCR) ____________________ 18
5.4.3 DGGE (Eletroforese em gel contendo gradiente de desnaturantes) __ 20
5.5 Principais índices utilizados na mensuração da diversidade________ 21
5.5.1 ĺndice de Simpson ________________________________________ 21
5.5.2 ĺndice de Shannon________________________________________ 22
5.5.3 ĺndice de Pielou __________________________________________ 23
5.5.4 ĺndice de Margalef (DMg) e Menhinick (DMn) ___________________ 23
5.5.5 Coeficiente de mistura de Jentsch (QM) _______________________ 23
5.6 Indicadores microbiológicos de qualidade do solo________________ 24
6. TRABALHOS _____________________________________________ 27
6.1 ATRIBUTOS QUÍMICOS E ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA EM
SOLOS SOB DIFERENTES COBERTURAS VEGETAIS _________________ 28
RESUMO ______________________________________________________ 28
ABSTRACT ____________________________________________________ 30
6.1.1 INTRODUÇÃO___________________________________________ 32
6.1.2 MATERIAL E MÉTODOS __________________________________ 35
6.1.2.1 Caracterização das áreas em estudo _________________________ 35
6.1.2.2 Amostragens ____________________________________________ 35
6.1.2.3 Análises laboratoriais______________________________________ 36
6.1.2.3.1 Solos: atributos químicos e físicos ___________________________ 36
6.1.2.3.2 Serapilheira: atributos químicos _____________________________ 36
6.1.2.3.3 Respiração induzida pelo substrato (SIR) ______________________ 37
6.1.2.3.4 Potencial de desnitrificação ________________________________ 37
6.1.2.3.5 Potencial de nitrificação ___________________________________ 38
6.1.2.3.6 Potencial de fixação de nitrogênio ___________________________ 38
6.1.2.4 Análises estatísticas ______________________________________ 39
6.1.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO______________________________ 40
6.1.4 CONCLUSÕES __________________________________________ 52
6.1.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS___________________________ 53
6.2. DIVERSIDADE ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE
MICRORGANISMOS EM SOLOS SOB DIFERENTES COBERTURAS
VEGETAIS_____________________________________________________ 63
RESUMO ______________________________________________________ 63
ABSTRACT ____________________________________________________ 65
6.2.1 INTRODUÇÃO___________________________________________ 67
6.2.2 MATERIAL E MÉTODOS __________________________________ 69
6.2.2.1 Extração de DNA a partir das amostras de solo e serapilheira ______ 69
6.2.2.2 Caracterização da comunidade total de bactérias________________ 69
6.2.2.3 Identificação dos grupos de microrganismos responsáveis pela
nitrificação do amônio no solo ______________________________________ 71
6.2.2.4 Identificação dos grupos de microrganismos responsáveis pela
desnitrificação do nitrato no solo ____________________________________ 72
6.2.2.5 Análises estatísticas ______________________________________ 72
6.2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO______________________________ 74
6.2.3.1 Diversidade genética e estrutura da comunidade total de bactérias nos
compartimentos solo e serapilheira __________________________________ 74
6.2.3.1.1 Análise visual dos géis_____________________________________ 74
6.2.3.1.2 Dendrograma obtido a partir da análise dos perfis de bandas 16S-
DGGE da comunidade bacteriana total do solo e da serapilheira ___________ 81
6.2.3.2 Diversidade genética e estrutura das comunidades nitrificadoras nos
compartimentos solo e serapilheira __________________________________ 85
6.2.3.2.1 Análise visual dos géis_____________________________________ 85
6.2.3.2.2 Dendrograma obtido a partir da análise dos perfis de bandas AOB-
DGGE das comunidades nitrificadoras do solo e da serapilheira ___________ 90
6.2.3.3 Diversidade genética e estrutura das comunidades desnitrificadoras
nos compartimentos solo e serapilheira_______________________________ 95
6.2.3.3.1 Análise visual dos géis_____________________________________ 95
6.2.3.3.2 Dendrograma obtido a partir da análise dos perfis de bandas NirK-
DGGE das comunidades nitrificadoras do solo e da serapilheira __________ 101
6.2.4 CONCLUSÕES _________________________________________ 105
6.2.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS__________________________ 106
7. CONCLUSÃO GERAL _____________________________________ 112
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ___________________________ 114
ĹNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Transformações biológicas do nitrogênio ___________________ 18
Tabela 2 - Seqüência dos iniciadores utilizados para a amplificação da
comunidade total de bactérias ____________________________________ 70
Tabela 3 - Seqüência dos iniciadores utilizados para a amplificação do β-
Proteobacteria ________________________________________________ 71
Tabela 4 - Seqüência dos iniciadores utilizados para a amplificação de
Eubacteria ___________________________________________________ 71
Tabela 5 - Seqüência do grampo GC de 33 bases utilizadas nas análises de
DGGE ______________________________________________________ 72
ĹNDICE DE QUADROS
Quadro 1 – Análise química das amostras de solo coletadas nas diferentes
coberturas estudadas___________________________________________ 41
Quadro 2 – Regressões entre as atividades microbiológicas e as
características químicas do solo e da serapilheira em quatro áreas sob
diferentes coberturas vegetais ____________________________________ 42
Quadro 3 – Análise da qualidade química e nutricional das amostras de
serapilheira coletadas nas diferentes coberturas estudadas _____________ 51
Quadro 4 - Concentrações dos produtos de DNA extraídos a partir das
amostras de solo e serapilheira ___________________________________ 70
Quadro 5 - Padrões de bandas do DGGE-16S, comparando amostras de
solo das diferentes coberturas vegetais _____________________________ 76
Quadro 6 - Padrões de bandas do DGGE-16S, comparando amostras de
serapilheira das diferentes coberturas vegetais _______________________ 78
Quadro 7 – ĺndices de diversidade dos perfis DGGE comunidade bacteriana
total do solo e da serapilheira das diferentes coberturas estudadas de acordo
com Shannon e com Simpson ____________________________________ 80
Quadro 8 – Comparação dos perfis de bandas DGGE comunidade
bacteriana total do solo e da serapilheira a partir das amostras coletadas em
diferentes coberturas vegetais. ANOSIM ____________________________ 83
Quadro 9 – Equações de regressão linear simples entre os valores de
estrutura da comunidade microbiana total e as características químicas do
solo e da serapilheira ___________________________________________ 84
Quadro 10 - Padrão de bandas DGGE-AOB, comparando amostras de solo
das diferentes coberturas vegetais_________________________________ 87
Quadro 11 - Padrão de bandas DGGE-AOB, comparando amostras de
serapilheira das diferentes coberturas vegetais _______________________ 88
Quadro 12 – ĺndices de diversidade dos perfis DGGE comunidades
bacterianas nitrificadoras do solo e da serapilheira das diferentes coberturas
estudadas de acordo com Shannon e com Simpson ___________________ 90
Quadro 13 – Comparação dos perfis de bandas DGGE-AOB comunidades
bacterianas nitrificadoras do solo e da serapilheira a partir das amostras
coletadas em diferentes coberturas vegetais. ANOSIM _________________ 93
Quadro 14 – Equações de regressão linear simples entre os valores de
estrutura das comunidades microbianas nitrificadoras e as características
químicas do solo e da serapilheira_________________________________ 94
Quadro 15 - Padrão de bandas DGGE-NirK, comparando amostras de solo
das diferentes coberturas vegetais_________________________________ 97
Quadro 16 - Padrão de bandas DGGE-NirK, comparando amostras de
serapilheira das diferentes coberturas vegetais _______________________ 99
Quadro 17 – ĺndices de diversidade dos perfis DGGE-NirK comunidades
bacterianas desnitrificadoras do solo e da serapilheira das diferentes
coberturas estudadas de acordo com Shannon e com Simpson _________ 100
Quadro 18 – Comparação dos perfis de bandas DGGE-NirK comunidades
bacterianas desnitrificadoras do solo e da serapilheira a partir das amostras
coletadas em diferentes coberturas vegetais. ANOSIM ________________ 102
Quadro 19 – Equações de regressão linear simples entre os valores de
estrutura das comunidades microbianas desnitrificadoras e as características
químicas do solo e da serapilheira________________________________ 104
ĹNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo do nitrogênio_____________________________________ 12
Figura 2 – Evolução do C0
2
da população microbiana de solos sob quatro
diferentes coberturas vegetais ____________________________________ 46
Figura 3 – Potencial de desnitrificação da população microbiana de solos sob
quatro diferentes coberturas vegetais ______________________________ 46
Figura 4 – Potencial de nitrificação da população microbiana de solos sob
quatro diferentes coberturas vegetais ______________________________ 46
Figura 5 – Potencial de fixação de nitrogênio da população microbiana de
solos sob quatro diferentes coberturas vegetais ______________________ 48
Figura 6 – Perfil de bandas obtido pela análise de DGGE dos fragmentos do
DNAr 16S amplificados com primers 338f e 518r, comparando amostras de
solo (A) e serapilheira (B) das quatro diferentes coberturas vegetais ______ 75
Figura 7 – Dendrograma gerado através dos programas Gelcompar e Primer
(Utilizando-se coeficiente de Person e método de análise cluster UPGMA)
para analisar os perfis de bandas em experimento de amplificação dos genes
de 16S ribossomal e PCR-DGGE das amostras de solo ________________ 82
Figura 8 – Dendrograma gerado através dos programas Gelcompar e Primer
(Utilizando-se coeficiente de Person e método de análise cluster UPGMA)
para analisar os perfis de bandas em experimento de amplificação dos genes
de 16S ribossomal e PCR-DGGE das amostras de serapilheira __________ 83
Figura 9 – Perfil de bandas obtido pela análise de DGGE dos fragmentos do
gene AOB amplificado com o par de iniciadores CTO189f-GC e CTO654r e
com os primers 357f-GC e 518r, comparando amostras de solo (A) e
serapilheira (B) das quatro diferentes coberturas vegetais ______________ 86
Figura 10 – Dendrograma gerado através dos programas Gelcompar e
Primer (Utilizando-se coeficiente de Person e método de análise cluster
UPGMA) para analisar os perfis de bandas em experimento de amplificação
do gene AOB e PCR-DGGE das amostras de solo ____________________ 91
Figura 11 – Dendrograma gerado através dos programas Gelcompar e
Primer (Utilizando-se coeficiente de Person e método de análise cluster
UPGMA) para analisar os perfis de bandas em experimento de amplificação
do gene AOB e PCR-DGGE das amostras de serapilheira ______________ 92
Figura 12 – Perfil de bandas obtido pela análise de DGGE dos fragmentos do
gene NirK amplificados com primers 338f e 518r, comparando amostras de
solo (A) e serapilheira (B) das quatro diferentes coberturas vegetais ______ 96
Figura 13 – Dendrograma gerado através dos programas Gelcompar e
Primer (Utilizando-se coeficiente de Person e método de análise cluster
UPGMA) para analisar os perfis de bandas em experimento de amplificação
do gene NirK e PCR-DGGE das amostras de solo ___________________ 102
Figura 14 – Dendrograma gerado através dos programas Gelcompar e
Primer (Utilizando-se coeficiente de Person e método de análise cluster
UPGMA) para analisar os perfis de bandas em experimento de amplificação
do gene NirK e PCR-DGGE das amostras de serapilheira _____________ 104
RESUMO
NDAW, SIDY MACTAR, D.Sc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, março de 2007. Atividade e funcionalidade das comunidades
nitrificadoras, desnitrificadoras e fixadoras de nitrogênio em solos sob
diferentes coberturas vegetais na região norte do Estado do Rio de Janeiro.
Orientadora: Emanuela Forestieri da Gama-Rodrigues. Co-orientador: Franck
Poly.
O solo é um recurso natural fundamental que contém uma vasta
diversidade de microrganismos responsáveis pela decomposição da matéria
orgânica e a ciclagem de nutrientes. Apesar das funções dos microrganismos
no crescimento das plantas e na sustentabilidade dos ecossistemas, existem
poucas informações acerca dos efeitos resultantes do manejo do solo, na
ecologia microbiana. O objetivo deste trabalho foi estudar a influência da
Acacia auriculiformis (acácia), Mimosa caesalpiniaefolia (sabiá), comparadas
as coberturas da capoeira e pastagem sobre a atividade microbiológica, os
atributos químicos do solo e a estrutura da comunidade microbiana total em
áreas sob diferentes tipos de uso localizadas na Fazenda Carrapeta,
Conceição de Macabú-RJ. Para tanto, coletaram-se quatro amostras
compostas de solo provenientes de quinze subamostras na profundidade de 0-
10 cm, e quatro amostras simples de serapilheira, em cada área, em setembro
de 2005. O potencial de mineralização do carbono do solo não diferiu entre as
diferentes coberturas avaliadas. A qualidade orgânica e nutricional da
serapilheira influenciou a atividade microbiológica do solo. As atividades
nitrificadoras e desnitrificadoras foram maiores no solo sob capoeira, sendo
significativamente influenciadas pelas concentrações de carbono orgânico,
enquanto a atividade fixadora de nitrogênio foi maior nos solos sob acácia e
sabiá. A acácia e o sabiá promoveram um aumento significativo da fertilidade
do solo, sugerindo o plantio de leguminosas arbóreas, fixadoras de nitrogênio,
como estratégia para reabilitação de áreas florestais com impacto antrópico. A
capoeira apresentou o menor índice de diversidade bacteriana do solo em
relação ao polimorfismo do 16S do DNAr devido, provavelmente, aos baixos
teores de carbono e os possíveis efeitos sobre as estruturas das comunidades
bacterianas decorrentes das atividades antrópicas nos demais solos. Os
maiores valores de índices de diversidade da comunidade de bactérias
desnitrificadoras da serapilheira foram encontrados na acácia e no sabiá
estatisticamente iguais entre si e o menor valor na pastagem; a capoeira
apresentou os valores intermédiarios, não diferindo com o sabiá. A análise de
agrupamento com base no perfil dos géis de DGGE, mostrou efeitos
diferenciais do tipo de coberturas vegetais sobre as estruturas genéticas das
comunidades bacterianas. As estruturas genéticas da comunidade microbiana
total do solo e da serapilheira foram expressivamente influenciadas pela
qualidade química e nutricional da serapilheira e pela fertilidade do solo. Em
relação às comunidades bacterianas nitrificadoras do solo, a capoeira e acácia
apresentaram a mesma estrutura genética, indicando sucessão microbiana no
solo sob esta leguminosa. Já para as estruturas das comunidades bacterianas
desnitrificadoras do solo, necessita-se de mais estudos para elucidar o
agrupamento da capoeira junto a pastagem. Os iniciadores usados neste
trabalho para amplificar os genes AOB e Nirk, não produziram resultados com
sensibilidade e especificidade suficientes para detectar as alterações das
populações de bactérias nitrificadoras e desnitrificadoras da serapilheira.
Palavras chave: atividade microbiológica, diversidade microbiana, grupos
funcionais, nitrificação, desnitrificação, fixação biológica de N
2
.
ABSTRACT
NDAW, SIDY MACTAR, D.Sc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, march 2007. Activity and microbial funtional groups (nitrifiers,
denitrifiers and N
2
fixers) in areas under different soil management practices,
located in north at Rio de Janeiro state. Advisor: Emanuela Forestieri da Gama-
Rodrigues. Co-advisor: Franck Poly.
Soil is an important natural resource that contains a vast diversity of
microorganisms, which are responsible for decomposition and nutrients cycling.
Although microorganisms play an important role on soil sustainability and plants
growth, few information is available about the effects of soil management on
microbial ecology. The objective of this work was to study the influence of
Acacia auriculiformis (acácia) and Mimosa caesalpiniaefolia (sabiá), in
comparison to regenerating secondary forest (capoeira) and pasture on
microbial activity, chemical attributes and genetic structures of the microbial
communities in areas under different soil management located in Carrapeta
farm, Conceição de Macabú-RJ. The soil (four replicate samples composed of
fifteen sub-samples each, from a depth of 0-10 cm)
and litter (four samples)
were collected in September 2005. No significant differences in potential soil C
mineralization were found between areas. The nutritional and organic litter
quality influenced the microbial activity. Potential nitrification and denitrification
were significantly higher at capoeira than the other areas, being significantly
influenced by the organic carbon concentration, while N
2
fixation values were
the highest in the acácia and sabiá areas. This study indicated significant
improvement of soil fertility in the soils under acácia and sabiá, suggesting that
plantation of nitrogen-fixing legume trees is one method by which degraded
forest sites can be restored. The soil under regenerating secondary forest
showed the lowest bacterial diversity indexes in relation to the 16S DNAr,
probably due to the lowest soil carbon contents and anthropical effects on
bacterial community genetic structure in the other areas. The highest diversity
indexes of denitrifiers were detected in the litter samples collected in legume
trees (acácia and sabiá), while the pasture had the lowest value. The indexes
values of capoeira and sabiá areas did not present significant differences. The
analysis Plymouth Routine in Multivariate Ecological Research (Primer)
revealed plant effects on microbial communities. The soil fertility, nutritional and
organic litter quality influenced the genetic structure of the total bacterial
community. In relation to nitrifiers, similar genetic structures were obtained
among the soil samples collected in capoeira acácia areas, indicating bacterial
succession in the reforested area with this legume tree. Already for the
denitrifiers communities, more targeted studies are needed to elucidate the
similar genetic structures between capoeira and pasture areas. The primers
used in this study, targeting the AOB and NirK genes, showed low sensibility
and specificity to detect the alterations of the nitrifiers and denitrifiers
communities in the litter samples.
Keywords: microbial activity, microbial diversity, functional groups, nitrification,
denitrification, biological nitrogen-fixing.
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
O crescimento explosivo da população mundial, agravado pelo
aumento da capacidade do homem de alterar o meio ambiente, está
acelerando o processo de degradação biótica e, conseqüentemente, a taxa de
extinção de espécies. Este quadro tem sido razão de preocupação de
diferentes segmentos da comunidade científica nacional e internacional que
elegeram prioridades, para a conservação da biodiversidade dos ecossistemas
mais ameaçados, como, por exemplo, as florestas tropicais.
No Brasil, a Mata Atlântica representa o ecossistema que mais sofreu
com a interferência do homem. Em sua formação original, ela compreendia
uma área superior a 1,3 milhões de km
2
. Hoje, restam cerca de 5 a 8% da
floresta original. Destes, a maior parte está fragmentada, sofrendo contínua
perda de biomassa vegetal (Ecossistemas, 2001).
A fragmentação de habitats e a exploração excessiva dos recursos
naturais são ameaças para a biodiversidade (Pimm et al. 1995, Pimm e Askins,
1995). Acredita-se que a perda da diversidade biológica pode levar a uma
potencial ruptura do ciclo energético do ecossistema, uma vez que os
processos ecológicos estão interligados e são interdependentes (Zak et al.,
1994). Os microrganismos representam a maior diversidade biológica e
2
fisiológica do solo e são responsáveis pelos processos ecológicos como a
decomposição da matéria orgânica (acima de 95%) e a ciclagem de nutrientes.
Além disso, a microbiota é conhecida por sua capacidade de recuperar formas
de energia e nutrientes que outros organismos mais evoluídos, como os
animais, não conseguem (Loreau, 2001). O nitrogênio é uma evidência dessa
condição, pois, antes dos avanços industriais do século 20, sua disponibilidade
no solo era basicamente dependente de microrganismos (Zilli et al. ,2003).
Os microrganismos do solo podem ser classificados em grupos
funcionais de acordo com suas atuações nos processos biológicos do
ecossistema. Exemplos desses grupos são os microrganismos envolvidos no
ciclo do carbono (organismos heterotróficos) e os envolvidos no ciclo do
nitrogênio, como os responsáveis pelos processos de nitrificação,
desnitrificação e a fixação biológica de nitrogênio (Torsvik e Øvreås, 2002).
Poucos são os estudos feitos a respeito da importância da diversidade
funcional das comunidades microbianas do solo sobre o funcionamento dos
ecossistemas terrestres (Beare et al., 1995; Moore et al., 1995; Pankhurst et
al., 1996) e, não são bem definidos, os efeitos seletivos do tipo de cobertura
morta na microbiota.
Segundo Cattelan et al. (1997), a diversidade florística é importante
para a manutenção e o aumento da diversidade da biota do solo, fazendo com
que o solo seja biologicamente mais ativo. Para Vargas e Scholles (2000), a
diversidade vegetal altera a composição da comunidade microbiana,
estimulando a biodiversidade. Bardgett e Wardle (2003) relatam que as
espécies de pastagens têm efeitos, tanto estimulador como inibidor, na
transformação de N no solo. Isto porque o padrão de resposta, quanto à
atividade metabólica do solo, é fortemente influenciado pela composição dos
resíduos orgânicos frescos adicionados ao solo. Sabe-se, entretanto, que
espécies vegetais, que apresentam alta qualidade nutricional, proporcionam
aumento na atividade e número de microrganismos, já que fornecem uma fonte
de carbono e energia prontamente assimilável. Desse modo, pode-se medir a
atividade microbiana pela quantidade de CO
2
liberado durante o processo
respiratório.
A quantidade de CO
2
liberado ou de O
2
consumido pode dar uma boa
idéia do comportamento da comunidade microbiana do solo, mas não pode
permitir a avaliação de alterações qualitativas que porventura venham ocorrer.
3
Esta parece ser a maior limitação desta técnica, pois as comunidades de
plantas não afetam de maneira uniforme todas as espécies de
microorganismos do solo, podendo levar a drásticas alterações em algumas
populações, mesmo que a liberação de CO
2
ou o consumo de O
2
não sejam
sensivelmente afetados.
O uso da diversidade microbiana como indicador biológico de
qualidade do solo é visto como a abordagem mais efetiva para a identificação,
antes de se chegar a níveis críticos e irreversíveis, do uso inadequado da terra
(Paoletti, 1999). Devido à grande sensibilidade dos microrganismos às
interferências no ecossistema, a diversidade da comunidade pode revelar o
equilíbrio entre os diversos organismos e os domínios funcionais no solo
(Kennedy, 1999; Lavelle, 2000).
Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estudar a influência da
Acacia auriculiformis (acácia), Mimosa caesalpiniaefolia (sabiá), comparadas
as coberturas da capoeira e pastagem sobre a atividade microbiológica, os
atributos químicos do solo e a estrutura da comunidade microbiana em áreas
sob diferentes tipos de uso localizas Fazenda Carrapeta, Conceição de
Macabú-RJ.
4
2. HIPÓTESE CIENTÍFICA
É possível usar grupos funcionais de importância ecológica para
detectar, com maior antecedência, os níveis de recuperação do solo após o
estabelecimento de coberturas florestais.
5
3. JUSTIFICATIVA
A composição da comunidade de plantas pode influenciar na atividade
e diversidade da comunidade microbiana devido à variabilidade na composição
química dos exudatos liberados pelas espécies vegetais e na qualidade dos
resíduos orgânicos depositados sobre o solo. Os microrganismos do solo são
essenciais para a manutenção e funcionamento do mesmo, tanto em
ambientes naturais quanto agrícolas, uma vez que estão relacionados a
processos chave, como formação da estrutura do solo, decomposição de
matéria orgânica e ciclos biogeoquímicos. Impactos antrópicos e, ou, diferentes
tipos de manejo que resultam em diferentes níveis de estresses para as
plantas, refletem na diversidade microbiana, que se torna então um indicador
sensível capaz de alertar para as alterações que venham a ocorrer nas
propriedades físicas e químicas do solo, que governam a ciclagem de
nutrientes. A comparação de perfis de comunidades microbianas de áreas
desmatadas e, ou, em recuperação, com áreas sem interferências antrópicas
recentes, permite avaliar o comportamento e as alterações qualitativas das
populações de microrganismos, visando subsidiar as ações de conservação,
manejo e restauração destas áreas.
6
4. OBJETIVO GERAL
Estudar a influência da Acacia auriculiformis (acácia), Mimosa
caesalpiniaefolia (sabiá), comparadas as coberturas da capoeira e pastagem
sobre a atividade microbiológica, os atributos químicos do solo e a estrutura da
comunidade microbiana em áreas sob diferentes tipos de uso localizas
Fazenda Carrapeta, Conceição de Macabú-RJ.
Objetivos específicos:
• Estudar em solo Latossolo Vermelho-Amarelo sob quatro diferentes
coberturas vegetais a potencialidade de mineralização (SIR), nitrificação,
desnitrificação e fixação biológica de nitrogênio.
• Utilizar a técnica de Eletroforese em Gel contendo Gradiente de
Desnaturantes (DGGE) para estimar a estrutura genética da comunidade
microbiana total e dos grupos de microrganismos responsáveis pelos
processos de nitrificação e desnitrificação do nitrogênio, a partir de amostras de
solos e serapilheira coletadas em áreas sob diferentes coberturas vegetais.
7
• Avaliar a influência das características químicas do solo e da
serapilheira sobre a atividade microbiológica do solo e a diversidade genética
da comunidade microbiana do solo e da serapilheira.
• Interpretar as correlações existentes entre os atributos do solo e
serapilheira visando a obtenção de indicadores da qualidade do solo.
8
5. REVISÃO DE LITERATURA
5.1. “Cordão da mata” ou corredores de conservação
O crescente aumento no processo de erosão genética observada nos
últimos anos na maioria dos ecossistemas tropicais tem despertado um
interesse cada vez maior no estudo da biodiversidade nesses ecossistemas. A
floresta Atlântica é descrita como a mais antiga do Brasil, estabelecida há cerca
de pelo menos 70.000.000 anos (Leitão Filho, 1987), cobrindo uma área de 100
a 120 milhões de ha. Atualmente, a cobertura desta vegetação está reduzida a
cerca de 5 a 8% da floresta original. Na região Norte Fluminense, os impactos
resultantes da exploração humana são ainda mais graves. O desmatamento, o
uso regular de fogo e a mecanização resultaram numa drástica redução do
maciço florestal e, também, num elevado grau de degradação dos solos.
Este cenário vem sendo modificado nos últimos anos através de
técnicas ecológicas caracterizadas pela preocupação com a conservação de
solos, como é o caso dos projetos corredores de conservação também
chamados de “corredores ecológicos” ou “cordão de mata”. O “corredor
ecológico” compreende uma rede de parques, reservas e outras áreas de uso
menos intensivo, que são gerenciadas de maneira integrada para garantir a
sobrevivência do maior número possível de espécies de uma região. Uma
9
importante característica do corredor de conservação é a de que, ao promover
o contato entre dois fragmentos isolados, causa a dispersão de indivíduos de
diferentes populações de uma área para a outra, permitindo o fluxo gênico e a
colonização por espécies, em cada uma das áreas (Primack, 1993).
O plantio de espécies arbóreas constitui-se numa valiosa técnica, tanto
de recuperação das terras degradadas, quanto pelo aumento do potencial de
regeneração natural dos fragmentos da Mata Atlântica e sua biodiversidade,
por exercer efeitos diretos e indiretos sobre as características do solo,
mediante a reciclagem dos nutrientes e as interações delas com o
microambiente. É de se esperar que a inclusão de componentes arbóreos
também favoreça a adição de matéria orgânica, nutrientes e água que
normalmente aumentam a biomassa e a atividade dos microrganismos do solo.
As leguminosas fixadoras de N, por exemplo, fornecem um material formador
de serapilheira rico em N que, além de melhorar a fertilidade do solo, serve de
substrato para melhorar a estruturação e as propriedades biológicas do solo.
As alterações nas condições químicas e físicas do solo podem exercer
significativas modificações na qualidade e na quantidade da matéria orgânica,
influenciando na sobrevivência de microrganismos celulolíticos, diazotróficos,
amonificadoras, nitrificadoras e desnitrificadoras (Kennedy, 1999).
A microbiota do solo tem sido considerada um dos mais sensíveis e
úteis marcadores biológicos para classificar sistemas agrícolas e, ou, florestais
sob distúrbios antrópicos (Turco e Blume, 1998; Kennedy, 1999; Rogers e Tate
III, 2001).
O estudo da dinâmica das comunidades microbianas é de importância
fundamental para a compreensão dos processos funcionais, tais como a
produção de matéria orgânica e a ciclagem de nutrientes, uma vez que a
maioria das importantes transformações dos ciclos biogeoquímicos são
mediadas pelos microrganismos.
5.2. Grupos funcionais em Ecossistemas Terrestres
Um ecossistema é um sistema funcional de relações complementares
entre os organismos vivos e o seu ambiente, ocorrendo uma regulação interna
de fluxos de energia que mantém um equilíbrio dinâmico e estável. Todos os
ecossistemas terrestres dependem da ação de microrganismos para seu
funcionamento e manutenção. Um ecossistema natural difere,
10
fundamentalmente, de um ecossistema que tem a intervenção do homem para
a produção de alimento e outros elementos de alto valor comercial. Num
ecossistema natural a regulação do funcionamento é basicamente um produto
da biodiversidade que controla o fluxo de energia (Swift e Anderson, 1993).
A diversidade funcional é um conceito de grande importância quando
se tem como meta avaliar a diversidade biológica de microrganismos em
ecossistemas terrestres. Os microrganismos podem ser classificados em
grupos funcionais, que refletem sua atuação em um ou mais processos
biológicos dos ecossistemas. Exemplos destes são os microrganismos
envolvidos no ciclo do nitrogênio, como os responsáveis pela fixação biológica
de nitrogênio e os processos de nitrificação e desnitrificação; e os
microrganismos associados ao ciclo do carbono, como aqueles que produzem
enzimas extracelulares específicas (ligno-celulolíticos) para degradar os
polímeros complexos de lignina e celulose (Torsvik e Ovreas, 2002).
A resistência à decomposição de diferentes componentes da planta irá
depender também da proporção de diferentes grupos de organismos que
habitam o solo e, conseqüentemente, de suas condições ecológicas (Orlov,
1995). Por exemplo, durante a degradação da serapilheira, atuam centenas de
espécies de fungos e bactérias com diferentes especializações.
Entre os fungos, os mais eficientes e mais estudados são Pleurotus
ostreatus, Phanerochaete versicolor e o Phanerochaete chrysosporium, sendo
este último exemplo típico de decompositor da lignina. Estes fungos degradam
tanto a lignina quanto à celulose. Segundo Mendonça e Loures (1996), os
fungos são excelentes decompositores de lignina em solos argilosos. Bactérias
como Bacillus, Streptomyces e Nocardia, degradam complexos ligno-
celulolíticos, atribuindo-se também esta ação a outras linhagens de
Flavobacterium, Pseudomonas e Aeromonas. Algumas bactérias aeróbicas,
como Azotobacter e Pseudomonas, reduzem o peso molecular da lignina.
Considerada fonte de energia de qualidade intermediária, a celulose é
decomposta no solo pela ação de enzimas (celulases) produzidas por uma
vasta e diversa população microbiana. São vários os gêneros de
microrganismos capazes de usar a celulose como fonte de carbono. Entre os
fungos encontram-se Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Myrothecium,
Penicillium, Polyporus, Rhizopus, entre outros. Entre as bactérias temos
Bacillus, Cellulomonas, Clostridium, Corynebacterium, Pseudomonas e Vibrio,
11
e, no grupo dos actinomicetos, encontramos Micromonospora, Nocardia e
Streptomices (Alexander, 1977 apud De-Polli et al., 1988). Segundo Kögel-
Knabner (2002), em condições anaeróbicas, predomina a decomposição da
celulose através de grupos particulares de bactérias.
A hidrólise da celulose, substrato orgânico mais abundante incorporado
ao solo (30 a 60% dos resíduos vegetais), é feita por microrganismos
celulolíticos e a quantificação dos mesmos dá indicação do processo de
mineralização de substratos orgânicos e do ciclo do C no solo (Cerri et al.,
1992).
Os microrganismos são importantes na formação da estrutura do solo,
através da formação de húmus e agregados, principalmente fungos
filamentosos e actinomicetos. Estes agregados são estabilizados pela
produção de gomas por bactérias (Gupta e Germida, 1988). A textura também
exerce uma forte influência sobre a biodiversidade do solo. Segundo Hassink
(1994), o tamanho da biomassa e os teores de C e N mineralizados por
unidade de biomassa são dependentes da textura do solo.
A diversidade biológica dos microrganismos heterotróficos pode ser
classificada de acordo com os seguintes grandes grupos:
Bactérias de vida livre: responsáveis pela imobilização e
mineralização de nutrientes, principalmente, N, P e S. Este grupo promove o
crescimento das plantas, a síntese de substâncias húmicas e a agregação do
solo, assim como a degradação de agroquímicos e xenobióticos.
Rizóbios: grupo especializado de microrganismos responsáveis pela
fixação biológica de nitrogênio atmosférico.
Fungos não-micorrízicos: imobilização e mineralização de nutrientes,
principalmente, N, P e S; promovem a redistribuição de nutrientes e o
condicionamento de detritos; são, também, responsáveis pela agregação do
solo e pela decomposição de agroquímicos e xenobióticos.
Fungos micorrízicos: são várias, as vantagens decorrentes da
simbiose deste grupo de fungos com as plantas. As mais importantes são:
intermediação do transporte de elementos essenciais e água do solo para as
raízes; intermediação do movimento entre plantas de elementos essenciais e
carboidratos; regulação do processo de fotossíntese das plantas.
12
5.3. Metabolismo microbiano do ciclo de nitrogênio
O nitrogênio é encontrado em abundância na litosfera, onde ocorre nas
rochas, no fundo dos oceanos e sedimentos, representando 98% do N
terrestre. No solo, o N encontra-se distribuído em vários compartimentos,
sendo que do total do N orgânico terrestre, 96% estão na matéria orgânica
morta e 4%, nos organismos vivos. O N da matéria viva encontra-se
predominantemente nas plantas (94%), 4% na microbiota e 2% nos animais
(Moreira e Siqueira, 2002). Na atmosfera, o N ocorre na forma do gás N
2
,
constituindo 78,1% do seu volume total.
O nitrogênio é o componente essencial dos aminoácidos dos ácidos
nucléicos, vitais para os seres vivos. A deficiência de nitrogênio utilizável
constitui, muitas vezes, o principal fator limitante do crescimento vegetal. As
plantas, com exceção das leguminosas e de outras espécies vegetais capazes
de aproveitar o nitrogênio diretamente da atmosfera, em associação com
microrganismos, absorvem o nitrogênio mineral, principalmente nas formas
amoniacais (NH
4
+
) e nítricas (NO
3
-
); enquanto no solo predomina a forma
orgânica (RCOOHNH
2
), o que implica necessariamente na ocorrência de
muitas transformações. A maioria das transformações sofridas pelo nitrogênio
na biosfera (figura 1) é de origem microbiana (bactérias de vida livre e fungos
não-micorrizicos).
11
10
9
8 7
5 4
3
2
1
NO
3
-
NO
2
-
NH
4
+
PLANTAS
NH
3
N
2
6
MATöRIA
ORGÂNICA
(N-ORGÂNICO)
BIOMASSA
N-MICROBIANO
ANIMAIS
Figura 1
: Ciclo do nitrogênio
1
.
Mineralização (Amonificação); 2. Imobilização (Assimilação); 3. Equilíbrio
químico (dependente do pH); 4,5. Nitrificação; 6,7. Desnitrificação; 8. Fixação; 9.
Imobilização (Redução Assimilativa
-
Plantas);
10.
Decomposição e complexação;
13
O nitrogênio mineral ( NH
4
+
e NO
3
-
) representa apenas de 1% a 2% do
nitrogênio total no solo. Estas duas formas de N são produzidas a partir da
mineralização do nitrogênio orgânico, sendo essas duas formas de N mineral
extremamente dinâmicas no solo (Vale et al., 1993).
5.3.1 Mineralização
A mineralização do N no solo refere-se ao processo de conversão do
N-orgânico a NH
4
+
. A principal fonte de N do solo é a matéria orgânica do solo,
que apresenta o N na forma de RCOOHNH
2
, formando complexos orgânicos
tais como proteínas, aminoácidos, ácidos nucléicos e nucleotídeos. Estes
compostos nitrogenados são, em geral, rapidamente decompostos em
substâncias mais simples por organismos que vivem nos solos. Nesse caso,
quanto maior o potencial produtivo de biomassa do ecossistema, maior é o
aporte de matéria orgânica do solo, conseqüentemente, maior a quantidade de
N mineralizado.
É conveniente ressaltar que grande parte do nitrogênio encontrado no
solo, provem de tecidos microbianos. As bactérias saprófitas e várias espécies
de fungos, principais responsáveis pela decomposição de materiais orgânicos
mortos, utilizam as proteínas e os aminoácidos como fonte para suas próprias
proteínas e liberam o excesso de nitrogênio sob a forma de amônio (NH4
+
).
A mineralização resulta de interações que envolvem substratos
heterogêneos, funcionalidade e diversidade de organismos, textura e estrutura
do solo, pH e fertilidade do solo. Condições ambientais, tais como baixa
temperatura ou baixo potencial de água no solo, reduzem a atividade
microbiana e, portanto, reduzem as taxas de mineralização. As alterações de
manejo também exercem significativas modificações na qualidade e na
quantidade da matéria orgânica, na quantidade e nas formas de N no solo e no
processo de mineralização de N. Bonito et al. (2002) relatam que a maioria do
N disponível na camada da serapilheira é reciclada rapidamente pelos
microrganismos, enquanto o N mais recalcitrante e o N diretamente assimilado
atuam como moléculas básicas para a síntese da matéria humificada no solo,
da qual o N mineral é liberado. Segundo Stevenson (1986), a dinâmica das
reações e as inter-relações entre os constituintes orgânicos são asseguradas
por seis fatores: resíduos de plantas ou animais; biomassa do solo; compostos
14
solúveis; enzimas ligadas ou livres; componente do húmus fração lábil e
componente húmus fração recalcitrante.
5.3.2 Nitrificação
A nitrificação refere-se à oxidação dos íons amônio (NH
4
+
),
provenientes da amonificação, para nitrato (NO
3
-
). O processo de nitrificação
ocorre amplamente no grupo das bactérias nitrificantes. Essas bactérias são
organismos quimiotróficos e utilizam a energia da oxidação do amônio para
fixar gás carbônico. O processo de nitrificação se realiza em dois passos
seqüenciais: a nitritação através da ação bioquímica de bactérias do gênero
Nitrossomonas e a nitratação mediada por bactérias do gênero Nitrobacter.
Sendo que o nitrito (NO
2
-
), produto intermediário neste processo raramente
acumula-se em concentrações detectáveis. A nitrificação é um bom indicador
da atividade biológica e da fertilidade do solo. É um processo sensível às
alterações do ambiente, e pode ser medido com razoável precisão (López et
al., 1998).
A viabilização do processo de nitrificação
em níveis adequados exige
condições ambientais bem definidas. De acordo com Rustead et al. (2000) e
Ekblad e Hogberg (2001), há uma correlação estreita entre a temperatura do
solo e a atividade respiratória dos microrganismos. A atividade dos
nitrificadores é beneficiada quando a temperatura situa-se na faixa entre 25 a
30ºC. A intensidade da nitrificação é maior quando o pH em H
2
O é próximo da
neutralidade. Embora a nitrificação seja beneficiada por valores de pH
próximos da neutralidade, o processo é acidófilo, particularmente na primeira
fase da nitrificação. A calagem eleva o pH, que estimula as atividades das
bactérias nitrificadoras, responsáveis junto com os fertilizantes nitrogenados
pela reacidificação do solo. A umidade do solo influência grandemente as
atividades microbiológicas. As bactérias nitrificadoras são mais exigentes,
paralisando suas atividades quando a tensão da água no solo aproxima-se do
nível de 15 atm (Serrana, 2000).
Além das condições ambientais abordadas, as comunidades de plantas
formadoras de serapilheira influenciam as atividades heterotróficas do solo e
conseqüentemente a dinâmica do nitrogênio. Na presença de resíduos vegetais
com relação C/N maior que 30, o processo de nitrificação é reduzido
15
drasticamente devido ao estímulo à imobilização do N-mineral (Palm et al.,
2001).
5.3.3 Desnitrificação
A desnitrificação é a transformação do nitrato (NO
3
-
), ou do nitrito (NO
2
-
), em produtos gasosos: monóxido de N (NO), óxido nitroso (N
2
O) e, em
seguida, em nitrogênio molecular (N
2
). O processo de desnitrificação é comum
a algumas bactérias, como os gêneros Pseudomonas, Micrococcus e
Thiobacillus (Zumft, 1999). A desnitrificação permite a transferência do N da
biosfera para a atmosfera. Além de causar perda do N disponível para a planta,
o processo de desnitrificação tem uma função ambiental essencial: ele limita a
lixiviação dos nitratos em direção ao lençol freático e, também, produz N
2
O
envolvido na destruição da camada de ozônio e no aumento do efeito estufa
(Crutzen, 1981; Braker et al., 1998; Scala e Kerkhof, 1998; Priemé et al., 2002).
Neste ponto de vista, a desnitrificação é considerada como um processo de
regulação no ciclo de N.
O requisito do processo de desnitrificação é o baixo nível de oxigênio
dissolvido disponível no meio, de tal forma que as bactérias utilizam o oxigênio
do N-NO
3
e do N-NO
2
para respiração, ao invés do oxigênio do ar (Von
Sperling, 2002). Acima de 1,0 mg/L de oxigênio dissolvido, a desnitrificação é
inibida pela maior facilidade de utilização do O
2
. A presença de oxigênio livre
pode inibir a atividade do sistema enzimático necessário à desnitrificação. A
alcalinidade produzida durante a conversão do nitrato a gás nitrogênio resulta
em um aumento do pH. O pH ótimo situa-se entre 7 e 8, podendo variar para
as diferentes populações bacterianas. A temperatura afeta a taxa de remoção
de nitrato e a taxa de crescimento microbiano. Os organismos são sensíveis às
mudanças na temperatura (Ilies e Mavinic, 2000).
5.3.4 Fixação de nitrogênio
O processo de fixação de nitrogênio é definido como sendo a
conversão do nitrogênio molecular (N
2
) em amônia ( N
2
2NH
3
). Essa reação
é dependente da atividade da nitrogenase, a qual catalisa a conversão do
nitrogênio atmosférico a amônia. Existem, na natureza, três grandes sistemas
fixadores: vida livre (microrganismos organotróficos (dependentes de fonte de
carbono orgânico) ou fotossintéticos aeróbios, facultativos e anaeróbios),
associativo (a superfície dos tecidos de plantas constitui um habitat com fonte
16
de carbono e umidade para alguns tipos de microrganismos diazotróficos que,
além de promover a fixação de nitrogênio, podem secretar hormônios de
crescimento e desenvolvimento da planta) e mutualístico (interdependência
entre plantas e bactérias, com formação de estruturas especializadas como,
por exemplo, a simbiose entre o rizóbio e as leguminosas).
A fixação biológica de nitrogênio é um importante componente do ciclo
deste elemento, pois reabastece a biosfera de nitrogênio e compensa a sua
perda devido à desnitrificação (Postgate, 1987). A maioria dos seres vivos não
é capaz de utilizar o nitrogênio atmosférico (N
2
) para sintetizar proteínas e
outras substâncias orgânicas. A fixação biológica do nitrogênio é a capacidade
de alguns organismos, denominados diazotróficos, de utilizarem diretamente o
dinitrogênio atmosférico como fonte de nitrogênio para o seu crescimento :
Nitrogenase (Nase)
N
2
+ (8H+) + (8e-) + 16 ATP --------------------------------
2NH
3
+ H
2
+ 16ADP +P
A interação simbólica leguminosa-rizóbio é sensível aos extremos de
temperatura, sendo que temperaturas baixas retardam a infecção e a formação
de nódulos (Franco e Dobereiner, 1994). De maneira geral, a temperatura na
faixa de 25 a 35ºC favorece a nodulação. Em solos com pH muito alto, ocorre
um aumento considerável na proporção de actinomicetos no solo, organismos
produtores de antibióticos que podem inibir o estabelecimento do rodízio
(Franco e Dobereiner, 1988). Nas associações leguminosa-rizóbio a deficiência
de unidade diminui a infecção dos pêlos absorventes e o crescimento dos
nódulos.
As bactérias não simbióticas dos gêneros Azotobacter e Clostridium
são capazes de fixar o nitrogênio. Azotobacter é aeróbico, ao passo que
Clostridium é anaeróbico; ambas são bactérias saprófitas comuns, encontradas
no solo. Calcula-se que elas fornecem, provavelmente, cerca de 7 quilogramas
de nitrogênio por hectare de solo por ano. Outro grupo importante inclui muitas
bactérias fotossintéticas. As algas azuis de vida livre desempenham, também,
um papel importante na fixação do nitrogênio. Elas são cruciais para o cultivo
do arroz, que constitui a principal dieta de mais da metade da população
mundial. As algas azuis podem desempenhar, também, um importante papel
ecológico na fixação do nitrogênio nos oceanos (Vidotti e Rollemberg, 2004).
17
5.3.5 Reações de transformações biológicas do nitrogênio
As reações de transformação biológica do nitrogênio envolvem um
sistema enzimático bastante variado, que em algumas vias é bem elucidado,
embora em outras seja, ainda, pouco conhecido.
A atividade enzimática do solo resulta, principalmente, da ação de
enzimas extracelulares produzidas pelos microrganismos, fungos e bactérias,
podendo ser encontradas em plantas, animais, restos celulares, livres ou
associadas com componentes do solo (Moreira e Siqueira, 2002). Enzimas são
proteínas que catalisam reações específicas. Elas têm participação essencial
nos ciclos dos elementos no solo e as mais importantes são aquelas
diretamente ligadas à biodegradação de macromoléculas orgânicas (Joshi et
al., 1993; Sinsabaugh et al., 1994; Dilly e Munch, 1996).
Na assimilação de N pelas plantas, o nitrato (NO
3
-
) é convertido em
amônio (NH
4
+
) por enzimas denominadas genericamente de redutases. E nos
processos de denitrificação ou volatilização, processo no qual os
microrganismos heterotróficos utilizam o nitrato como aceptor final de elétrons,
as enzimas envolvidas são também denominadas redutases. Uma vez
absorvido pela célula, o nitrato é reduzido a nitrito pela redutase do nitrato (RN)
e, em seguida, a amônio, pela redutase do nitrito (RNI). Estas primeiras
transformações nesta sequência de eventos são semelhantes nos dois
processos (assimilação e denitrificação). As óxido nítrico redutase e óxido
nitroso redutase são outras enzimas que participam no processo de
denitrificação de N (Shrestha et al., 2001; Philippot et al., 2002).
A nitrogensase é um complexo enzimático responsável pela fixação
biológica de nitrogênio (redução do N
2
até NH
3
), encontrado apenas nos
diazotróficos (Moreira e Siqueira, 2002).
Os possíveis caminhos para obtenção de energia e as enzimas
envolvidas estão relacionados com a adaptação e sobrevivência destes
microrganismos sob uma variedade de condições ambientais (Ye e Thomas,
2001). Na tabela 1, estão representadas a estequiometria dos processos de
tranformação biológica do nitrogênio (reações e produtos) e a variação de
energia livre envolvida.
18
Tabela 1: Transformações biológicas do nitrogênio
Processos, Reações e Produtos ∆G
0
, (kJ.mol
-1
)
Fixação do Nitrogênio
1) 0,5N
2
+ 1,5H
2
+ H
+
→ NH
4
+
-39,4
Nitrificação convencional
2) NH
4
+
+ 1,5O
2
→ NO
2
-
+ 2H
+
+ H
2
O
3) NO
2
-
+ 0,5O
2
→ NO
3
-
-290,4
-72,1
Desnitrificação convencional
4) NO
3
-
+ 1,25{CH
2
O} + H
+
→ 0,5N
2
+ 1,75H
2
O + 1,25CO
2
-594,6
Desnitrificação Autotrófica
5) 3NO
3
-
+ 5NH
4
+
→ 4N
2
+ 9H
2
O + 2H
+
-297
Anammox
6) NO
2
-
+ NH
4
+
→ N
2
+ H
2
O
-358
Fonte: Jetten et al., 1999; Sliekers et al., 2002; Jetten et al., 2003.
5.4. Metodologias empregadas no estudo da diversidade microbiana
5.4.1 Extração de DNA de amostras ambientais
Para a busca de polimorfismo de DNA, faz-se necessária a extração do
DNA genômico. Vários procedimentos de extração de DNA de
microorganismos têm sido descritos na literatura (Ogram et al., 1987; Smalla et
al., 1993; Akkermans et al., 1995; Van Elsas et al., 1997). O que se observa em
geral é que protocolos padrões são utilizados com algumas modificações,
visando resolver os problemas específicos da espécie em estudo.
A escolha de um protocolo de extração depende do material a ser
processado, bem como a aplicação do ácido nucléico, que vai exigir diferentes
graus de pureza (Melo e Valadares, 1998). O sucesso na extração de ácidos
nucléicos a partir de amostras de solo, por exemplo, vai requerer o emprego de
colunas específicas para a otimização das etapas de extração e purificação das
amostras de DNA total quando o solo contém grande quantidade de matéria
orgânica, que contamina o DNA e inibe a reação da polimerase em cadeia
(Trevors, 1996; O’Donnell e Görres 1999).
5.4.2 Reação de polimerase em cadeia (PCR)
Nenhuma tecnologia, nos últimos anos, provocou um impacto tão
profundo no estudo de ecologia microbiana quanto o PCR (reação da
polimerase em cadeia). A técnica de PCR, inicialmente descrita por Mullis e
19
Faloona (1987), permite obter in vitro várias cópias de um determinado
segmento de DNA. Esta metodologia tem permitido o desenvolvimento de
protocolos altamente sensíveis e específicos para a detecção e/ou
quantificação de microrganismos, plasmídios ou genes (Saiki et al., 1998;
Rosado et al., 1996).
A técnica de PCR é desenvolvida com o intuito de amplificar
seqüências conhecidas. A seqüência alvo mais utilizada para o estudo da
comunidade bacteriana total é o gene rRNA 16S. Essas moléculas do rRNA
são consideradas importantes para estudos de ecologia microbiana, porque
estão presentes e com a mesma função em todos os organismos, derivam de
um ancestral comum e parecem ser geneticamente estáveis. Ao mesmo tempo,
são altamente conservadas em algumas regiões e variáveis em outras, contém
grande número de informações nas seqüências devido ao tamanho da
molécula, apresentam domínios independentes podendo ser discriminadas de
outras moléculas e apresentam grande número de seqüências disponíveis em
base de dados (Rosado et al., 1997). A maioria dos estudos de Ecologia
Microbiana Molecular está concentrada no 16S rRNA, devido a disponibilidade
das seqüências em bancos de dados para efeito comparativo.
A reação de PCR baseia-se no anelamento e extensão enzimática de
um par de oligonucleotídeos sintéticos (pequenas moléculas de DNA de fita
simples), utilizados como iniciadores (“primers”). Estes iniciadores ligam-se em
dois extremos opostos da fita de DNA que serve como molde, havendo, então,
expansão a partir desses, através da ação da DNA polimerase termo-estável,
Taq polimerase, isolada originalmente do microrganismo Thermus aquaticus. A
amplificação envolve repetições cíclicas de altas temperaturas necessárias
para a denaturação (92 a 94º C), seguidas de uma temperatura mais baixa
para possibilitar o anelamento dos iniciadores (37 e 60º C) e uma temperatura
intermediária (usualmente 72º C) que permite a extensão da cópia da fita de
DNA, a partir do ponto de ligação dos iniciadores (Saiki et al., 1998).
Com a PCR, após cerca de 30 ciclos de amplificação e menos de 2
horas, a quantidade de DNA alvo é aumentada milhares de vezes, e, após a
separação dos produtos por eletroforese em gel e coloração adequada, estes
podem ser visualizados a olho nu.
As máquinas utilizadas para performance dessas reações de
amplificação são automatizadas e chamadas reatores térmicos ou
20
termocicladores e podem ser programadas para aquecimentos e resfriamentos
cíclicos, e os modelos mais modernos contam com uma maior eficiência na
mudança de temperaturas (Ferreira e Grattapaglia, 1995).
5.4.3 DGGE (Eletroforese em gel contendo gradiente de desnaturantes)
A técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) é usada
para separar fragmentos de DNA de mesmo tamanho, mas com seqüências de
bases nucleotídicas diferentes. Originalmente, foi desenvolvida para detectar
mutações específicas no genoma humano, mas vem sendo aplicada em
ecologia microbiana para determinar a diversidade genética de comunidades
microbianas (Muyzer et al., 1993), estudo de estrutura genética de grupos
funcionais (Griffiths et al., 1999), distribuição espacial de população de
bactérias e estudo de impacto ambiental na comunidade do solo (Engelen et
al., 1998).
Esta técnica utiliza géis de poliacrilamida contendo um gradiente linear
de desnaturação (uréia e formamida), nos quais moléculas de DNA com o
mesmo tamanho, porém com diferentes seqüências, apresentam perfis
migratórios diferentes. As variações na composição de nucleotídeos dos
diferentes segmentos de DNA determinam seu comportamento de migração
em posições diferentes (Muyzer, 1999). O comportamento de migração do
fragmento de DNA no DGGE é governado não apenas pela composição dos
nucleotídeos (conteúdo de G+C), mas também pelas interações entre estes
dentro da molécula (Breslauer et al., 1986; Sugimoto et al., 1996). As bandas
do DNA nos géis de DGGE podem ser visualizadas após coloração com
brometo de etídio, prata ou Syber Green I.
O DNA presente no gel de DGGE pode ser transferido para
membranas de náilon e hibridizado com sondas específicas para determinados
grupos microbianos, ou as bandas de PCR podem ser eluídas do gel,
reamplificadas e seqüenciadas para permitir o posicionamento filogenético dos
membros da comunidade (Heuer e Smalla, 1997; Muyzer e Smalla, 1998).
Usando-se DGGE, pode-se detectar aproximadamente 50% das
variações de seqüências em fragmentos de DNA com até 500 pares de bases
(Myers et al., 1985). Essa porcentagem pode ser aumentada para quase 100%
quando se acrescenta a um dos lados do fragmento de DNA um segmento rico
em GC (grampo de GC). Esse grampo de GC, quando anexado à extremidade
21
5’ de um dos iniciadores, é amplificado por PCR juntamente com o DNA e
introduzido no fragmento de DNA amplificado (Sheffield et al., 1989), agindo
como um domínio de alta resistência à desnaturação, que impede a
dissociação das duas fitas do DNA em fitas simples. Normalmente, o
comprimento do grampo de GC varia entre 30 e 50 nucleotídeos (Muyzer et al.,
1998)
5.5. Principais índices utilizados na mensuração da diversidade
A diversidade, ou biodiversidade, é um atributo das comunidades
biológicas que deve ser estimado para que possamos compará-las com outras
comunidades. O conceito de diversidade de espécie pode ser avaliado por
meio de dois componentes: (1) riqueza das espécies, baseada no número total
de espécies presentes, e (2) uniformidade, baseada na abundância relativa de
espécies e no grau de dominância (Odum,1988). Ao longo do desenvolvimento
da ciência, vários índices têm sido propostos, tais como Simpson (1949),
Margalef (1958), Shannon e Weaver (1949), para o estudo do comportamento
da diversidade de comunidades diferentes, permitindo uma avaliação da
dinâmica populacional frente a diferentes manejos. Os principais índices
utilizados na mensuração da diversidade são:
5.5.1 Índice de Simpson
O primeiro índice desenvolvido para mensurar a diversidade foi o índice
de Simpson. Este é um índice de dominância que sugere que a diversidade é
inversamente relacionada à probabilidade de que dois indivíduos tomados, ao
acaso, em uma comunidade pertençam à mesma espécie. O seu valor oscila
de 0 a 1 e quanto mais alto for, maior a probabilidade de os indivíduos serem
da mesma espécie, ou seja, maior a dominância e menor a diversidade.
O índice de Simpson dá uma importância relativamente pequena às
espécies raras, e uma maior importância às espécies comuns . É calculado
como:
2
1
2
1
∑∑
==
==
S
i
i
S
i
N
N
piC
(Dominância)
2
1
1
1
∑
=
−=−
S
i
i
N
N
C
(Diversidade)
22
onde
==
N
Ni
pi
proporção de cada uma das espécies i (i variando de 1 a S);
S = riqueza ou n
o
de espécies;
==
∑
=
S
i
i
NN
1
quantidade (n
o
de ocorrência, n
o
de indivíduos, biomassa) total.
5.5.2 Índice de Shannon
O índice mais usado em toda a literatura ecológica é, sem dúvida
nenhuma, o índice de Shannon. Este índice começa a causar polêmica pelo
seu nome: alguns autores o chamam de Shannon-Wiener, outros de Shannon-
Weaver. Isto porque a função foi desenvolvida independentemente por dois
pesquisadores: Shannon e Wiener. Porém, o primeiro autor trabalhava com
outro, chamado Weaver. A forma mais correta, segundo Krebs (1985), é
Shannon-Wiener.
Este índice permeou a literatura ecológica nas décadas de 60 e 70, e é
baseado na teoria da informação, ou seja, na quantidade de informação que
existe em uma determinada amostra heterogênea. Como os outros índices de
diversidade, este leva em consideração não só o número de espécies, mas
também o número de indivíduos de cada espécie. Porém, como este índice
fornece números para a igualdade (equitatividade, equitabilidade, eqüidade)
entre as espécies, ele tornou-se particularmente popular entre os cientistas.
O índice de diversidade de Shannon, compreende tanto a riqueza de
substratos quanto a intensidade com que esses substratos são utilizados pela
microbiota (Zak et al., 1994; Goodfriend, 1998; Dauber e Wolters, 2000;
Lupwayi et al., 2001)
O índice de Shannon é calculado por meio da fórmula :
=−=
∑
=
pipiLogH
S
i 1
2
'
(Diversidade).
Onde H’ = conteúdo de informações da amostra (indivíduo) = índice de
diversidade de espécies
A diversidade tende a ser mais alta quanto maior o valor do índice.
Pode-se calcular também a diversidade máxima da amostra, ou seja, a
diversidade, se a abundância de todas as espécies encontradas fosse a
mesma.
23
=
=
SLogH
2max
'
(Diversidade máxima da amostra).
Tendo estes valores, pode-se calcular agora o quanto são
proporcionais as abundâncias das espécies amostradas (equitatividade),
dividindo-se o índice encontrado pelo índice máximo.
5.5.3 Índice de Pielou
Este é um índice de equitatividade ou uniformidade. A uniformidade se
refere ao padrão de distribuição dos indivíduos entre as espécies. Essa medida
de uniformidade é definida como:
max
'
H
H
E =
em que:
E = índice de uniformidade de Pielou;
H
max
= ln S = diversidade máxima;
S = número de espécies amostradas = riqueza.
O índice de uniformidade oscila de 0 a 1, pertence ao intervalo [0,1],
onde 1 representa a máxima diversidade, ou seja, todas as espécies são
igualmente abundantes.
5.5.4 Índice de Margalef (DMg) e Menhinick (DMn)
Estes índices avaliam a riqueza das espécies.
(
)
,
ln
1
N
S
DMg
−
=
e
(
)
N
S
DMn =
onde S representa o número de espécies e N o número total de indivíduos na
amostra.
5.5.5 Coeficiente de Mistura de Jentsch (QM)
=
N
S
QM
24
em que:
S = número de espécies amostradas;
N = número total de indivíduos amostrados.
Quanto mais próximo de 1 o valor de QM, mais diversa é a população.
Existem outros índices de diversidade na literatura (por exemplo, índice
de Brillouin, também baseado na teoria da informação), mas a filosofia destes
índices é sempre a mesma: dar uma idéia não só do número de espécies, mas
também da abundância relativa destas espécies.
Os índices têm sido utilizados por serem relativamente simples e
permitirem comparações de amostras com diferentes tamanhos de populações
(Odum, 1988). O cálculo de índices de diversidade permite identificar desvios
em relação à modelos de equilíbrio ecológico, baseados no estudo de
comunidades em clímax. A principal vantagem da utilização de índices de
diversidade é a tradução de dados ecológicos complexos em números simples,
que podem ser entendidos pelo público leigo. A sua aplicação é também
justificada pela fato de que a simples contagem das espécies pode incluir
espécies raras e levar a conclusões errôneas. Entretanto, os dados dos índices
podem ser interpretados de formas diferentes ou confundidos, dependendo do
cálculo usado.
É importante lembrar que o índice é um simples valor. É possível
encontrar duas comunidades que possuam índice de diversidade semelhante,
entretanto uma pode ter valor de uniformidade alto e baixo valor de riqueza,
enquanto a outra pode ter uniformidade baixa e riqueza alta. Ambas,
uniformidade e riqueza, precisam ser consideradas na avaliação da diversidade
(Kennedy, 1999). O uso de índices que combinam riqueza de espécie e
abundância relativa é o mais usado.
5.6. Indicadores microbiológicos de qualidade do solo
Indicadores biológicos são definidos por aqueles organismos (ou
populações) dos quais sua ocorrência, vitalidade e mudança dependem das
condições do meio ambiente. As várias espécies respondem em uma escala de
variáveis que podem ser de diferentes graus de sensibilidade. Espécies
resistentes são as menos sensíveis e podem ser consideradas como
indicadores cumulativos. É de requerimento que indicadores biológicos possam
ocorrer em número suficiente, possuindo reações específicas estimuladas pelo
meio ambiente (Kovács, 1992).
25
Rapport (1983) identificou, para o ecossistema dos Grandes Lagos,
nos Estados Unidos, cinco indicadores de perturbação ambiental que podem
também ser aplicados aos ecossistemas edáficos. Esses indicadores também
foram reconhecidos por Andren e Lagerlof (1983) em estudos dos efeitos de
várias práticas culturais na mesofauna do solo. São eles:
a) Desequilíbrio na concentração de nutrientes (perda de alguns e
acúmulo de outros);
b) Redução na diversidade de espécies;
c) Substituição de espécies de vida longa por espécies de vida curta
(adaptação para um novo ambiente transitório);
d) Declínio na biomassa da macrofauna e;
e) Aumento na amplitude de flutuação populacional das espécies
chaves.
Um dos problemas com esses indicadores é que eles dão uma
indicação post-factum das perturbações.
Segundo Halloway e Stork (1991), um bom indicador ecológico deve
ser capaz de detectar as perturbações, refletir o funcionamento do
ecossistema, apresentar facilidade de monitoramento com viabilidade
econômica, ter distribuição universal e ainda mostrar especificidade individual
aos padrões de tempo e espaço no ambiente. Por isso, a microbiota do solo
tem sido considerada um dos mais sensíveis e úteis marcadores biológicos
para classificar sistemas sob distúrbios antrópicos (Turco e Blume, 1998;
Kennedy, 1999; Rogers e Tate III, 2001).
Os microrganismos representam a forma de vida mais abundante e
diversificada do planeta (Whitman et al., 1998). Eles são capazes de explorar
um amplo espectro de fontes de energia e de viver em praticamente todos os
habitats. Eles representam o repertório mais rico em diversidade química e
molecular na natureza. Além disso, constituem a base de processos
ambientais, tais como ciclos biogeoquímicos e cadeias alimentares, e mantêm
relações vitais e refinadas entre si e com os organismos superiores (Staley,
1997).
Pouco se conhece sobre o efeito do estresse ambiental sobre os
microrganismos do solo, que pode ser bem diferente, tanto espacial quanto
temporalmente, ao efeito produzido sobre plantas e animais (Kennedy e
Smith,1995). Essas diferenças devem ser bem definidas para que se possa
26
formular hipóteses e fazer interpretações corretas sobre os fatores que
determinam a diversidade dos microrganismos do solo (Staley, 1997; Coutinho
et al., 1999; Rosado, 2000). Além disso, a composição da comunidade de
plantas pode influenciar na diversidade da comunidade microbiana devido à
variabilidade na composição química dos exudatos liberados (Christensen,
1989).
O estudo da diversidade microbiana e a atividade microbiológica dos
solos pode ajudar na identificação de alterações ambientais associadas a
distúrbios antrópicos, além de ser importante para o entendimento do papel das
comunidades microbianas nos diferentes processos que ocorrem nos
ecossistemas (Hugenholtz e Pace, 1996; Rosado et al., 1997).
O diagnóstico completo da diversidade microbiana dos solos é
impraticável, em virtude da enorme variedade de espécies, das dificuldades
metodológicas e do alto custo que esse levantamento acarretaria. Em razão
disso, torna-se necessário identificar espécies, grupos de organismos e, ou
estrutura populacional que se correlacionam com outras características que
conferem melhorias da estrutura do solo, aumento do teor de matéria
orgânica e disponibilidade de nutrientes no solo. Elementos com estas
características poderiam ser considerados bioindicadores da qualidade do solo
(Vaughan, 1998).
No Brasil, dados sobre atividades microbiológicas de grupos
específicos e diversidade genética de microrganismos em áreas de florestas
convertidas em pastagens e, ou áreas reflorestadas por leguminosa são
inexistentes, mas poderiam ser úteis para avaliar o impacto causado pela ação
antrópica nestes ecossistemas. Tanto análises de atividade, quanto de
estrutura das comunidades microbianas podem contribuir significativamente
para a geração de índices de qualidade biológica do solo.
27
6. TRABALHOS
28
6.1. ATRIBUTOS QUÍMICOS E ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA EM
SOLOS SOB DIFERENTES COBERTURAS VEGETAIS
RESUMO
O plantio de leguminosas arbóreas como estratégia de
recuperação de terras degradadas tem aumentado. Porém o impacto desta
prática sobre a atividade microbiana e, ou a fertilidade do solo ainda não é bem
conhecido. Este trabalho foi desenvolvido na Fazenda Carrapeta, Conceição de
Macabú-RJ, com o objetivo de estudar a influência da Acacia auriculiformis
(acácia), Mimosa caesalpinifolia (sabiá), comparadas as coberturas da capoeira
e pastagem sobre a atividade microbiológica e atributos químicos do solo. Para
tanto, coletaram-se quatro amostras, compostas de quinze subamostras de
solo na profundidade de 0-10cm, e quatro amostras simples de serapilheira, em
cada área, em setembro de 2005. Foram avaliados o potencial de
mineralização do carbono, nitrificação, desnitrificação e fixação do nitrogênio
das comunidades microbianas do solo, além dos atributos químicos do solo e
da serapilheira. Avaliou-se, também, a influência da qualidade nutricional do
material vegetal sobre a atividade microbiana. O potencial de mineralização do
29
carbono do solo não diferiu entre as diferentes coberturas avaliadas. A
qualidade orgânica e nutricional da serapilheira influenciou a atividade
microbiológica do solo. As atividades nitrificadoras e desnitrificadoras foram
maiores no solo sob capoeira, sendo significativamente influenciadas pelas
concentrações de carbono orgânico, enquanto a atividade fixadora de
nitrogênio foi maior nos solos sob acácia e sabiá. A acácia e o sabiá
promoveram um aumento significativo da fertilidade do solo, sugerindo o plantio
de leguminosas arbóreas, fixadoras de nitrogênio, como estratégia para
reabilitação de áreas florestais com impacto antrópico.
Palavras chave: atividade microbiana, leguminosas arbóreas, fertilidade do
solo, nitrificadores, desnitrificadores, fixadores de N
2
.
30
CHEMICAL ATTRIBUTES AND MICROBIAL ACTIVITY IN SOILS UNDER
DIFFERENT PLANT COVER
ABSTRACT
Plantation of legume trees as strategy to restore degraded forest sites
has been increased. However, information on the effects of this practice on the
microbial activity and, or the soil fertility is lacking. This research was developed
in Carrapeta farm, Conceição de Macabú-RJ, to evaluate the legume trees
(Acacia auriculiformis (acacia) and Mimosa caesalpinifolia (sabiá) effects on the
chemical attributes and microbial activity, in comparison to regenerating
secondary forest (capoeira) and pasture. The soil (four replicate samples
composed of fifteen sub-samples each, from a depth of 0-10 cm) and litter (four
samples) were collected in September 2005. Potential carbon mineralization,
nitrification, denitrification, N
2
fixation and chemical characteristics were
evaluated. The influence of the organic and nutritional quality of the litter on the
microbial activity also was evaluated. No significant differences in potential soil
C mineralization (SIR) were found between areas. The nutritional and organic
litter quality influenced the microbial activity. Potential nitrification and
31
denitrification were significantly higher at capoeira than the other areas, being
significantly influenced by the organic carbon concentration, while N
2
fixation
values were the highest in the acácia and sabiá areas. This study indicated
significant improvement of soil fertility in the soils under acácia and sabiá,
suggesting that plantation of nitrogen-fixing legume trees is one method by
which degraded forest sites can be restored.
Keywords: microbial activity, legume trees, soil fertility, nitrifiers, denitrifiers, N
2
fixing communities.
32
6.1.1 INTRODUÇÃO
No Brasil, o plantio de espécies leguminosas como estratégia de
recuperação de terras degradadas tem aumentado. Isto porque as leguminosas
adicionam N ao sistema, facilitam a ciclagem de nutrientes, aumentam a
fertilidade na camada superficial do solo, reduzem a erosão devido a uma
permanente cobertura do solo pela serapilheira acumulada e mantém a
umidade do solo (Wormald, 1992; Franco et al., 1995; Franco e Faria, 1997).
A substituição de áreas de pastagens por plantio de leguminosas
sempre acarreta aumento nos estoques de matéria orgânica, proporcionando
melhorias na composição química, física e biológica de solo, principalmente em
se tratando de solos de baixa fertilidade (Testa et al., 1992; Burle et al., 1997;
Silva e Mielniczuk, 1997; Vargas e Scholles, 2000).
Nos ecossistemas florestais, a fertilidade dos solos é proveniente,
principalmente, da dinâmica de matéria orgânica do solo e ciclagem de
nutrientes, os quais são catalizados pela biota do solo (Alcântara, 1995).
Assim, o declínio da atividade microbiana tem grande impacto na fertilidade
natural do solo, com grandes efeitos nos ecossistemas naturais (Brookes,
1995). As populações de microrganismos e seus processos podem fornecer
evidências de modificações no solo, muitas vezes não detectadas por
indicadores físicos ou químicos (Turco et al., 1994). Melloni et al. (2001), em
estudos envolvendo ecossistemas de campo e mata, no sul de Minas Gerais,
verificaram que com a utilização de atributos microbiológicos (número de
esporos de bactérias, fungos, microrganismos solubilizadores de fosfatos,
celulolíticos e amonificadores totais, C da biomassa microbiana e sua atividade,
e quociente metabólico), foi possível caracterizar os diferentes ecossistemas e
registrar a presença de uma comunidade microbiana mais ativa nos solos de
mata.
A atividade microbiológica é definida como toda reação catalisada
pelos microrganismos do solo, refletindo o estado fisiológico de células ativas
(Moreira e Siqueira, 2002). Pode ser dividida em atividades gerais e
específicas. As atividades gerais são aquelas provenientes de todos os
33
microrganismos do solo como, por exemplo, a respiração. Já as específicas
são mediadas por grupos específicos de microrganismos, como por exemplo,
os nitrificadores, desnitrificadores e fixadores de nitrogênio.
A nitrificação refere-se à oxidação de NH
4
+
para nitrato. É um processo
muito sensível às alterações do ambiente e tem sido considerado como um
bom indicador da atividade biológica e fertilidade do solo (Lopez el al., 1998).
Em florestas tropicais, distúrbios como o desmatamento para o
estabelecimento de pastagens, geralmente, aumentam as taxas de nitrificação
e mineralização de N e os níveis de amônio no solo (Matson et al., 1987;
Steudler et al., 1991). Porém, com o aumento da idade das pastagens,
observa-se um declínio nas concentrações de N inorgânico e nas taxas de
nitrificação e mineralização (Piccolo et al., 1994; Ross et al., 1995; Veldkamp et
al., 1999). Anderson e Spencer (1991) sugerem que a nitrificação aumenta
após o corte da floresta, mas pode decrescer a níveis basais em 6 meses, se o
crescimento da vegetação secundária não for impedido. Stewart et al. (1993)
indicam que o aumento da taxa de nitrificação pode durar até 5 anos após o
episódio de fogo, para então declinar, com uma crescente disponibilidade de
NH
4
+
.
A desnitrificação é a transformação do nitrato (NO
3
-
) ou do nitrito (NO
2
-
)
em produtos gasosos (NO, N
2
O e N
2
). Estima-se que 70% das emissões de
N
2
O, sejam provenientes de atividade antrópica (Kroeze, 1993). Nas regiões
tropicais, os ecossistemas terrestres naturais são considerados responsáveis
pela alta emissão de N
2
O (Baird, 2002).
A fixação biológica de nitrogênio é um importante componente do ciclo
deste elemento, pois reabastece a biosfera de nitrogênio e compensa a sua
perda devido à desnitrificação (Postgate, 1987). As leguminosas arbóreas,
quando inoculadas e micorrizadas, podem adicionar ao sistema até 600 kg ha
-1
ano
-1
de nitrogênio (Siqueira e Franco, 1988).
A avaliação da atividade microbiológica é uma ferramenta valiosa
quando se tem como meta avaliar a dinâmica de carbono e nitrogênio em
amostras de solo (Coûteaux et al., 1995; Thirukkumaran e Parkinson, 2000), ou
prever os efeitos decorrentes da influência do enriquecimento do dióxido de
carbono atmosférico sobre a dinâmica de nutrientes (Ball et al., 2000; Hamilton
et al., 2001). Segundo Grisi (1995), ao se medir a atividade dos
microrganismos, pode-se ter uma idéia sobre a importância do seu papel nos
34
ecossistemas, ou seja, se em determinadas condições ambientais as
populações microbianas estão em atividade, decompondo a matéria orgânica,
promovendo assim a biogeociclagem dos nutrientes. Ainda pela avaliação da
atividade microbiana, inclusive em áreas-referência como capoeira (área sem
interferências antrópicas recentes) e pastagens (área com impacto antrópico),
podem ser identificadas as principais limitações do ecossistema impactado e,
sugeridas estratégias visando manter a sustentabilidade do ecossistema.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da Acacia
auriculiformis (acácia), Mimosa caesalpinifolia (sabiá), comparadas às
coberturas da capoeira e pastagem sobre a atividade microbiológica e os
atributos químicos do solo.
35
6.1.2 MATERIAL E MÉTODOS
6.1.2.1. Caracterização das áreas de estudo
O trabalho foi realizado em áreas pertencentes à Fazenda Carrapeta,
no município de Conceição de Macabú-RJ. Segundo a classificação de
Köppen, o clima da região é do tipo Am, quente e úmido. A precipitação
pluviométrica média anual é de 1400 mm, com presença de duas estações
bem definidas: uma seca, de junho a setembro e, outra chuvosa, de outubro a
março, quando se concentra quase a totalidade das ocorrências de chuvas. A
temperatura média anual situa-se em torno de 26º C. O solo é classificado
como Latossolo Vermelho-Amarelo, de textura argilo-franco-arenoso.
A área experimental constitui-se de quatro coberturas vegetais em
parcelas de 1500 m
2
(75 x 20). As parcelas experimentais de cada cobertura
foram dispostas adjacentes uma da outra, na mesma cota de altitude. As
coberturas vegetais foram constituídas de plantios puros das espécies arbóreas
Acacia auriculiformis (acácia), Mimosa caesalpinifolia (sabiá), inoculadas com
estirpes selecionadas de bactérias fixadoras de N
2
e fungos micorrízicos. As
outras duas coberturas vegetais, utilizadas como referência, ambas com
aproximadamente 40 anos de idade, foram uma pastagem degradada que
representa a vegetação anterior ao plantio das espécies arbóreas com
predomínio de Melinis minutiflora (capim-gordura), capim-colonião, Paspalum
maritimum (grama-pernambuco) e Imperata brasiliensis (sapê) e um fragmento
florestal da Mata Atlântica em sucessão secundária, com espécies em
diferentes estádios sucessionais. A escolha da capoeira como um dos
ecossistemas de referência trata-se de uma das estratégias utilizadas para
avaliar alterações do solo em decorrência do tipo de uso e de técnicas de
manejo, por meio da comparação das características do solo manejado com as
do solo não manejado, sob vegetação natural (Barros e Comerford, 2002).
6.1.2.2. Amostragens
Em cada cobertura vegetal, quatro amostras compostas de solo foram
coletadas, sendo cada uma constituída de quinze amostras simples coletadas
ao acaso nas entrelinhas de plantio, na profundidade de 0-10cm, em setembro
de 2005. Para a coleta da serapilheira, considerada aqui como todo o resíduo
36
vegetal (folhas, galhos, cascas, etc) depositado sobre a superfície do solo, em
diferentes graus de decomposição, utilizou-se um gabarito quadrado de
madeira de 0,25m
2
, com quatro repetições. As amostras de solo e serapilheira
foram acondicionadas em sacos plásticos e levadas ao Laboratório de
"Ecologie Microbienne" da Universidade "Lyon 1- France", para as análises de
atividades microbiológicas e diversidade bacteriana. As demais análises foram
feitas no Laboratório de Solos da Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro (UENF).
As amostras de solo foram destorradas e passadas em peneira de
2mm de malha, homogeneizadas, retirando-se as raízes e resíduos visíveis de
plantas e animais do solo. As amostras de solo foram dividadas em três partes:
a primeira destinada às análises microbiológicas (armazenada em câmara fria
a 4º C até a época das análises, 7 dias), a segunda, para a caracterização da
diversidade microbiana (preservada a -20º C até a data de extração de DNAs,
7 dias) e a terceira, seca ao ar, para análise química e granulométrica.
As amostras de serapilheira foram divididas em duas partes. As
destinadas para a caracterização da diversidade microbiana foram trituradas e
armazenadas, conforme descrito para as amostras de solo. A outra parte foi
seca em estufa com circulação de ar forçada à temperatura de 60
0
C e moída
para análise química e nutricional.
6.1.2.3. Análises laboratoriais
6.1.2.3.1. Solos: Atributos químicos e físico
Os solos foram analisados para a determinação do pH (em água);
teores de P, K (extraíveis, por Mehlich – 1), Ca, Mg e Al (trocáveis, por KCl 1
mol L
-1
) (Defelipo e Ribeiro, 1981). O carbono orgânico (C-org.) do solo foi
determinado por oxidação com dicromato de potássio, 1,25 mol
c
L
-1
em meio
ácido (Anderson e Ingram, 1996) e o nitrogênio total (Ntotal) pelo método de
Kjeldahl, conforme descrito em Embrapa (1997). A análise granulométrica foi
determinada segundo Embrapa (1997).
6.1.2.3.2. Serapilheira: Atributos químicos
Determinou-se, na serapilheira, os teores de K (fotometria de chama),
de P (espectrofotometria e, pelo método da vitamina C, modificado por Braga e
Defelipo, 1974), de Ca e Mg (espectrofotometria de absorção atômica), após
37
digestão nítrico-perclórica (Tedesco et al., 1995), e de N pelo método Kjeldahl,
descrito por Bataglia et al. (1983). O teor de C foi obtido por oxidação com
dicromato de potássio (Anderson e Ingram,1996). As concentrações de lignina
e celulose presentes foram quantificadas pelo método fibra em detergente
ácido (FDA), descrito por Van Soest e Wine (1968), e as concentrações de
polifenóis totais extraídas através do método de Anderson e Ingram (1996).
6.1.2.3.3. Respiração induzida pelo substrato (SIR)
A respiração induzida pelo substrato (SIR) foi determinada por
cromatografia gasosa utilizando coluna de Porapak Q 100-120 mesh, N2, forno
60°C, injetor 120°C e detetor 375°C. Em amostras de 10g de solo foram
adicionados 1ml de glucose e água para elevar a umidade a 70% da
capacidade de campo. As leituras foram realizadas após incubação a 26°C por
2, 3, 4, 5 e 6 horas. Os resultados foram expressos em µg C h
-1
g
-1
de solo
seco (Anderson e Domsch, 1978).
6.1.2.3.4. Potencial de desnitrificação
O estudo da cinética do processo de desnitrificação foi realizado em
laboratório através do método de Smith e Tiedje (1979), Tiedje et al. (1989).
Utilisou-se 10 g de solo (peso seco), em frasco de 150 mL previamente
vedados com tampa de borracha e lacrados com anel de alumínio, com 4
repetições por tratamento. Por 6 ciclos consecutivos de 5 minutos cada,
procedeu-se a uma série de vácuo alternado de injeção de gás hélio, para ter o
sistema livre de O
2
. Posteriormente injetou-se 10% de acetileno na atmosfera
do erlenmeyer, sabendo que o acetileno inibe a redução enzimática do N
2
O
para N
2
(Yoshinari et al., 1977) e que, geralmente, 1 a 10% do volume é
necessário para que isto ocorra. Assim, a desnitrificação pode ser medida pela
quantidade de N
2
O, produto final da atividade da comunidade desnitrificadora.
Acrescentou-se uma solução nutritiva de KNO
3
(200µg N-NO
3
-
g
-1
solo seco),
glicose (1mg C-glic g
-1
equivalente solo seco) e ácido glutâmico (1mg C-glu g
-1
equivalente solo seco) para elevar a umidade a 100% da capacidade de
campo. Os frascos foram incubados a 26°C, no escuro , e amostras da sua
atmosfera foram tomadas nos tempos, 2, 3, 4, 5 e 6 horas. As análises foram
realizadas em cromatografia gasosa utilizando coluna de Porapak Q 100-120
mesh, N2, forno 60°C, injetor 120°C e detetor 375°C . O potencial de
desnitrificação foi expresso em µg N-N
2
O h
-1
g
-1
solo seco.
38
6.1.2.3.5. Potencial de nitrificação
O termo potencial de nitrificação tem sido aplicado para medidas de
taxas de nitrificação obtidas em condições de laboratório, sabendo que o
processamento das amostras para incubação, incluindo peneiramento,
secagem, armazenagem, etc., perturbam as amostras. Essas perturbações,
combinadas com as condições de incubação (temperatura, umidade, etc.) são
diferentes daquelas encontradas no campo, assim sendo, resultando em taxas
de nitrificação também diferentes (Hart et al., 1994). Nesse sentido, o termo
potencial de nitrificação não, necessariamente, quantifica a taxa máxima de
nitrificação encontrada no campo, mas sim, aquela definida pelas condições de
incubação. Sabendo disso, procedeu-se a análise do potencial nitrificador da
comunidade microbiana através da quantificação de N
2
O liberado no processo
de denitrificação do nitrato formado durante a oxidação do amônio, segundo o
método de Lensi et al. (1986).
Trabalhou-se com dois frascos de 150mL por amostra, utilizando-se 10
g de solo (equivalente peso seco), com 4 repetições por tratamento, para
determinar a quantidade de NO
3
-
presente no solo (T
0
) e o potencial de
acumulação de NO
3
-
em 24 horas (T
24h
). Procedeu-se à retirada do O
2
na
atmosfera do frasco T
0
e o bloqueio da redução enzimática de N
2
O para N
2
conforme foi descrito acima. No frasco T
24h
, foi adicionada uma solução
nutritiva de (NH
4
)
2
SO
4
(200µg N-NH
4
+
g
-1
solo seco) para elevar a umidade a
70 % da capacidade de campo. O mesmo foi vedado com papel parafilm e
incubado juntamente com o frasco T
0
a 26° C, no escuro. Após o período de 24
horas de incubação, fez-se a transformação de nitrato através do processo de
desnitrificação. Adicionou-se uma suspensão de bactérias desnitrificadoras
(Pseudomonas fluorescens AK15, DO
580nm
= 2) e uma solução nutritiva glicose
(1mg C-glc g
-1
solo seco) e ácido glutâmico (1mg C-glu / g solo seco), para
elevar a umidade a 100 % da capacidade de campo. O potencial de nitrificação
(µg N-NO
3
-
h
-1
g
-1
solo seco) é obtido pela diferença entre a quantidade de NO
3
-
presente após incubação em aerobiose (T
24h
) e a quantidade de NO
3
-
inicialmente presente no solo (T
0
).
6.1.2.3.6. Potencial de fixação do nitrogênio
A atividade da enzima nitrogenase responsável pela fixação biológica
do nitrogênio foi avaliada segundo o método de Hardy et al. (1968), Turner e
39
Gibson (1980). As vantagens e desvantagens dessa técnica foram discutidas
por Vessey (1994) e Minchin et al. (1994).
O princípio deste método é a quantificação do etileno formado durante
a incubação de 10 g de solo (peso seco), com 4 repetições por tratamento, 15
ml de acetileno, glicose (1mg C-glic g
-1
solo seco) e malato (1mg C-mal g
-1
solo
seco) dentro de um frasco de 150 ml, hermeticamente fechado, durante cinco
dias a 26ºC e capacidade de campo. O etileno produzido foi avaliado
diariamente por cromatografia gasosa. O potencial de fixação de N foi expresso
em µg N h
-1
g
-1
solo seco.
6.1.2.4. Análises estatísticas
A análise de variância dos atributos químicos e microbiológicos das
amostras do solo e da serapilheira foi realizada adotando-se o delineamento
inteiramente casualizado, com 4 repetições. Cada cobertura vegetal foi
considerada um tratamento de efeito fixo a exemplo do procedimento
empregado por Lugo et al. (1990) e Gama-Rodrigues et al. (2005). A
comparação das médias foi feita pelo teste de Duncan, ao nível de 5% de
probabilidade. Foram estabelecidas análises de regressões entre os atributos
avaliados.
40
6.1.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O nível de fertilidade do solo sob as coberturas vegetais, de maneira
geral, foi baixo a médio, acidez elevada, e bom nível de matéria orgânica, com
base na classificação proposta por Tomé Junior (1997) e Alvarez et al. (1999).
Houve diferença significativa entre as coberturas vegetais para o nível de
fertilidade do solo (Quadro1). A acácia e o sabiá foram as coberturas vegetais
que apresentaram maiores valores de cálcio (Ca), soma de base (SB) e
nitrogênio total (Ntotal), sendo que para este último a capoeira não diferiu das
leguminosas. Os valores de magnésio (Mg) também foram maiores na acácia e
no sabiá, a capoeira apresentou valor intermediário que não diferiu do sabiá e
da pastagem. O solo da capoeira apresentou pH inferior ao das leguminosas,
mostrando correspondentemente maior teor de alumínio trocável (Al) e acidez
potencial (H+Al) (Quadro 1). Resultados similares foram observados por
Vezzani et al. (2001) em plantios de Eucalyptus saligue e Acacia mearnsii com
45 meses de idade.
As regressões lineares positivas de Ca, SB e negativas de Al e H+Al
com pH (Quadro 2), confirmam o aumento da fertilidade do solo com base na
elevação do pH. Altos valores de pH do solo são comumente associados com
níveis mais elevados de fertilidade, sobretudo a disponibilidade de bases
trocáveis, em grande parte devido a capacidade desses solos de neutralizar os
produtos ácidos da decomposição, ou seja, os cátions metálicos, como Ca
2+
,
presentes na solução do solo podem se orientar e estabelecer interações de
ordem eletrostáticas com os grupamentos funcionais da matéria orgânica. De
acordo com Pompéia (1994), a acidificação do solo tem efeito direto na
lixiviação de macronutrientes (Ca
2+
, Mg
2+
), o que poderá ocasionar a perda da
fertilidade do solo (no caso dos macronutrientes). O pH ácido afeta ainda, de
maneira indireta e negativa, a microbiota do solo, pois, em solos com baixos
valores de pH, elementos como Fe, Al e Mn atingem níveis tóxicos.
41
Quadro 1: Análise química das amostras de solo coletadas nas diferentes coberturas estudadas
Coberturas
Ca Mg Al H+Al
SB CTC pH P K Na C-org Ntotal
C:N
--------------cmol
c
dm
-3
--------------- --------mg dm
-3
--------- -----g kg
-1
------
Acácia 1,2 a
0,6 a 0,3 c
4,8 d
1,9 a
6,7 c 4,6 a 4,8 a
36,3 b 31,0 c 30,5 b
2,9 a 11,1 a
Sabiá 1,5 a
0,5 ab
0,4 c
6,2 c
2,1 a
8,3 b 4,6 a 4,3 a
51,5 a 39,8 a 30,5 b
2,9 a 10,7 a
Capoeira 0,3 b
0,4 bc
1,8 a
9,6 a
0,8 b
10,4 a
4,0 b 4,8 a
28,0 b 32,0 bc
38,7 a
2,8 a 13,8 a
Pastagem 0,6 b
0,3 c 1,2 b
7,3 b
1,0 b
8,3 b 4,3 ab
3,0 a
40,8 ab
37,0 ab
30,4 b
1,9 b 16,1 a
CV% 59,5 29,6 69,5 26,4 43,3 17,0 7,6 26,4 29,5 13,6 14,8 22,2 26,5
Médias seguidas de pelo menos uma mesma letra em cada coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan
em nível de 5% de probabilidade.
CV: coeficiente de variação; Ca: cálcio; Mg: magnésio; Al:. alumínio trocável; H+Al: acidez potencial; SB: soma de base;
CTC: capacidade de troca catiônica; P:fósforo; K: potássio; Na: sódio; C-org: carbono orgânico; Ntotal: nitrogênio total;
C:N: relação entre carbono orgânico e nitrogênio total.
42
Quadro 2: Regressões entre as atividades microbiológicas e as características
químicos do solo e da serapilheira em quatro áreas sob diferentes coberturas vegetais.
n =16
Regressões R
2
CTC solo = 0,226 C-org solo + 1,048 0,55**
Ca solo = 1,233 pH solo - 4,470 0,56**
SB solo = 1,398 pH solo - 4,658 0,53**
Al solo = - 1,474 pH solo + 7,342 0,56**
H+Al solo = - 4,030 pH solo + 24,525 0,50**
SIR = - 2,596 Mg + 4,682 0, 26*
SIR = - 0,534 SB + 4,328 0, 26*
SIR = + 0,531 Al + 3,075 0, 27**
SIR = 0,100 C:N solo + 2,267 0, 28**
SIR = 0,159 H+Al solo + 2,454 0, 19*
DENIT = 3,207 NIT + 0,256 0,81**
NIT = 7,269 C-org solo - 0,372 0, 50**
DENIT = 2,173 C-org solo - 0,998 0, 43**
NIT = 1,359 SIR - 0,187 0,18*
DENIT = 0,307 SIR - 0,596 0,28**
FIX = + 165,325 pH - 640,012 0, 47**
FIX = - 31,772 (H+Al) solo + 301,675 0, 55**
FIX = - 910,096 Al solo + 174,989 0, 71**
FIX = - 6,570 C-org + 293,793 0, 11*
FIX = 68,458 Ntotal solo - 99,820 0, 22*
FIX = 132,779 Ca solo - 39,328 0, 84**
FIX = 338,860 Mg solo - 65,893 0, 27*
FIX = 117,292 SB solo - 87,687 0, 88**
FIX = - 400,061 Nit
+ 110,343 0, 17*
FIX = 68,458 N total solo
- 99,820 0, 22*
FIX = - 137,348 Denit
+ 148,617 0, 28**
Ca solo = 5,472 Celulose + 0,246 0,22*
Mg solo = 5,699 Celulose + 0,281 0,20*
SB solo = 4,347 Celulose + 0,608 0,27**
N total solo = - 1,742 C:N serapilheira + 4,159 0,15*
NIT = 69,263 C-org serapilheira - 0,317 0, 36**
NIT = 5,435 Ntotal serapilheira - 0,156 0, 27*
DENIT = 4,738 C-org serapilheira - 1,001 0, 43**
DENIT = 1,218 Ntotal serapilheira - 0,532 0, 47**
SIR = - 0,892 polifenóis/N + 4,107 0, 13*
SIR = - 6,145 celulose/N + 4,049 0, 11*
NIT = - 3,275 celulose/N da serapilheira + 0,167 0, 20*
NIT = - 20,140 (lignin+celulose/N) serapilheira + 0,208 0, 14*
DENIT = - 0,112 celulose/N da serapilheira + 0,834 0, 22*
DENIT = - 1,588 (lignina+celulose/N) serapilheira + 0,969
0, 14*
CTC: capacidade de troca catiônica; C-org: carbono orgânico; Ca: cálcio; SB: soma de base;
Al:. alumínio trocável; H+Al: acidez potencial; SIR: respiração induzida pelo substrato ou
potencial de mineralização; Mg: magnésio; C:N: relação entre carbono orgânico e nitrogênio
total; Denit: desnitrificação; Nit: nitrificação; C-org: carbono orgânico; Ntotal: nitrogênio total;
Fix: fixação biológica de nitrogênio; polifenóis/N: relação entre polifenóis totais e
nitrogênio total; celulose/N: relação entre celulose e nitrogênio total;
43
O decréscimo da capacidade de troca catiônica (CTC) do solo sob
pastagem foi concomitante à redução no teor de carbono orgânico (C-org),
quando comparado com a capoeira (Quadros 1 e 2), o que indica que a baixa
disponibilidade de forragem na pastagem, em decorrência do manejo
inadequado do pastejo, está contribuindo para a diminuição dos valores de
carbono orgânico e CTC. Vários autores observaram que a substituição da
vegetação nativa por pastagens provoca diminuição nos teores do carbono do
solo. Moraes (1991), estudando uma cronosseqüência de pastagens em
Rondônia, observou uma diminuição de 25% do C original após 20 anos de
uso; Veldkamp (1994), estudando áreas com pastagens na Costa Rica,
encontrou, na camada de 0-40 cm, uma perda de 20% nos estoques de C após
25 anos de uso. Marchiori Jr e Melo (1999) observaram, em um Nitossolo
Vermelho, uma redução do teor de carbono orgânico de 18% com o cultivo de
pastagem em relação a uma mata nativa. Souza et al. (2005), avaliando o
carbono e nitrogênio da biomassa do solo em solos sob pastagem, mata nativa
e áreas reflorestadas com araucária e pinus no Planalto dos Campos Gerais,
Santa Catarina, observaram que os teores de carbono orgânico nas áreas de
reflorestamento diferiram estatisticamente dos encontrados na mata, sendo
15,7% e 14,5% menores.
O maior valor de carbono na capoeira, refletindo em maior CTC neste
solo, pode ser explicado pelo ambiente estável deste sistema, o que implica em
um balanço entre as taxas médias de entrada de carbono no solo, via resíduo
vegetal e conseqüente decomposição pela microbiota, e as taxas médias de
mineralização do material orgânico do solo. No solo sob leguminosas, foi
observada grande deposição e acumulação de resíduos orgânicos, a qual não
foi suficiente para recompor o teor de carbono orgânico no solo nos níveis da
capoeira. Contudo, é possível que, com o passar do tempo, quando houver
significativo acúmulo de serapilheira, os níveis de carbono orgânico e CTC nos
solos sob plantio de leguminosas venham a alcançar ou a superar os da
capoeira.
A respiração induzida pelo substrato (SIR) não apresentou variação
significativa, indicando uma atividade similar da comunidade microbiana entre
as coberturas estudadas (Figura 2). Os valores de carbono liberado
correspondem à maior velocidade de produção de C-CO
2
e foram obtidos no
intervalo de tempo compreendido entre 4 e 7 horas de incubação. A SIR (C-
44
CO
2
liberado) apresentou regressões lineares negativas com Mg, SB e
positivas com Al (Quadro 2). Para estes resultados, não se tem uma explicação
clara, mas poderia se deduzir um efeito biotóxico do Al (condição de estresse)
contribuindo para aumentar as perdas de carbono na forma de CO
2
(Davies et
al., 1964) no solo sob capoeira e, também, a eficiência no uso do carbono pela
comunidade microbiana (altas taxas de mineralização e baixas perdas de C-
CO
2
) nos solos onde foram encontrados maiores valores de fertilidade (acácia,
sabiá e pastagem). Pinto (2001), avaliando a contribuição de espécies arbóreas
de diferentes fases sucessionais da Floresta Estadual do Palmito, Paranaguá-
PR, mostrou aumentos de K e N, favorecendo a atividade microbiana.
Encontrou-se regressões lineares positivas entre SIR com a acidez
potencial (H+Al) e a relação C:N (Quadro 2), que sugere uma alta eficiência
metabólica da comunidade microbiana no processo de mineralização do
carbono orgânico do solo, nas áreas avaliadas. Solos com alta relação C:N e
acidez potencial (H+Al) apresentam mudanças na composição e atividades
metabólicas, considerando o estresse da população (Siqueira e Franco, 1988).
Segundo Leita et al. (1995), um maior valor da respiração microbiana
deve-se a uma maior reciclagem da população microbiana, necessitando de
um maior consumo de energia para a sua sobrevivência. Nos solos com baixa
relação C:N e, ou carbono orgânico de alta qualidade, é maior a eficiência
metabólica da biomassa microbiana, havendo, assim, menores perdas de C na
forma de CO
2
. Pelo fato do teor de carbono orgânico ser maior no solo sob
capoeira, era esperado ter maior atividade respiratória. Isto não ocorreu,
provavelmente, devido ao elevado valor de (H+Al) encontrado neste solo, visto
que a forte acidez do solo afeta negativamente a respiração microbiana do solo
(Siqueira e Franco, 1988). Em relação aos valores de C-CO
2
encontrados no
solo sob plantio de leguminosas, pode-se especular que a melhoria na
fertilidade, como, por exemplo, aumento de Ca, Mg, SB, pH e redução de Al e
(H+Al) nestes solos, proporcionou um crescimento da população de
microrganismos oportunistas que apresentou uma atividade similar a da
capoeira.
Os valores de potencial de nitrificação e desnitrificação variaram entre
0,02 e 0,22 µg de N-NO
3
-
h
-1
g
-1
solo seco e 0,28 e 1,02 µg de N-N
2
O
h
-1
g
-1
solo
seco, respectivamente, para as diferentes coberturas vegetais (Figuras 3 e 4).
Carmo et al. (2005), determinando as alterações na disponibilidade de N e os
45
fluxos de N
2
O no solo de uma pastagem e área de floresta da Amazônia,
encontraram valores superiores de N-NO
3
-
e N-N
2
O variando entre 0,11 e 1,12
µg de N-NO
3
-
h
-1
g
-1
solo seco e 3,03 e 53,36 µg de N-N
2
O
h
-1
g
-1
solo seco,
respectivamente.
Os fluxos de N
2
O liberado (desnitrificação) foram maiores no solo sob
capoeira e estatisticamente iguais entre as demais coberturas (Figura 3),
provavelmente, porque a capoeira também apresentou maior teor de N-NO
3
-
(nitrificação) (Figura 4), o que estaria contribuindo para a produção de N
2
O. O
envelhecimento de um ecossistema tropical leva a um aumento na abundância
de N, gerando, conseqüentemente, maiores perdas de N do sistema através de
vários mecanismos (Chadwick et al. 1999; Hedin et al. 2003). Estes resultados
são confirmados pela regressão significativa positiva do fluxo de N
2
O
(desnitrificação) em função da quantidade de nitrato produzido (nitrificação)
(Quadro 2). Resultados semelhantes foram encontrados por Patra et al. (2005),
estudando os efeitos de pastagens sobre grupos funcionais de microrganismos
envolvidos no ciclo de N.
Os teores de N-NO
3
-
(nitrificação) e N-N
2
O (desnitrificação) foram,
fortemente, influenciados pelos teores de carbono orgânico e a respiração
microbiana do solo (SIR) (Quadro 2). As regressões positivas entre esses
atributos mostram que a atividade de desnitrificação depende da concentração
de carbono disponível; e, também, da qualidade dos doadores de elétrons
(Paul e Clark, 1989). O carbono facilmente decomponível, ao ser adicionado ao
solo, é rapidamente assimilado pelos microrganismos, aumentando a demanda
de O
2
, o que pode resultar em microssítios de anaerobiose no solo,
favorecendo a desnitrificação (Giacomini et al., 2006). Adicionalmente, quanto
maior a disponibilidade de carbono nos ecossistemas florestais maior será a
atividade dos microrganismos heterotróficos e, consequentmente, maior será o
incremento nos fluxos de NO
3
-
servindo como substrato energético para os
microrganismos desnitrificadores e, pela redução da disponibilidade de O
2
no
meio. A desnitrificação biológica envolve a redução, por via biológica, do nitrato
a nitrito e nitrito a nitrogênio gasoso. O nitrito e o nitrato fornecem oxigênio para
respiração microbiana da própria reação de denitrificação. Para que a
desnitrificação ocorra, conjugada com a nitrificação, os nitratos devem estar
presentes juntamente com uma fonte de carbono (Aulakh et al., 1992; D’Haene
et al., 2003) e em condições anóxicas (aeróbia mas com ausência de oxigênio).
46
Figura 2: Evolução do CO
2
da população microbiana de solos sob quatro diferentes
coberturas vegetais. Média de 4 repetições.
Figura 3: Potencial de desnitrificação da população microbiana de solos sob quatro
diferentes diferentes coberturas vegetais (Média de 4 repetições).
Figura 4: Potencial de nitrificação da população microbiana de solos sob quatro
diferentes diferentes coberturas vegetais (Média de 4 repetições).
47
Os teores de N-N
2
O foram superiores aos de N-NO
3
-
(figuras 3 e 4) em
todas as áreas avaliadas, indicando perdas de nitrogênio através do processo
de desnitrificação. O conhecimento da cinética dos processos de nitrificação e
desnitrificação é muito útil e necessário para avaliar os efeitos da atividade
antrópica na atividade biológica do solo. O efeito resultante dos processos de
desnitrificação e nitrificação determinará as perdas de N na forma de N
2
O, ou a
acumulação de nitrato no solo.
Houve diferença significativa na atividade da nitrogenase entre as
coberturas estudadas. Os teores de nitrogênio obtidos através da fixação
biológica de N
2
da acácia e do sabiá foram superiores aos encontrados na
capoeira e na pastagem, as quais apresentaram déficit acima de 88% em
relação ao plantio de leguminosas (Figura 5). Isto foi indicativo da grande
capacidade dessas leguminosas de fixarem o nitrogênio atmosférico mediante
as associações mutualísticas com bactérias do gênero Rhizobium
(Kannegiesser, 1990), proporcionando a adição deste nutriente no sistema e
contribuindo para a sustentabilidade dos agroecossistemas (Alfaia, 1997).
Balieiro et al. (2004) observaram maior aporte de N em área de plantio de
leguminosa arbórea guachapele em relação ao plantio de eucalipto,
evidenciando o benefício dessa no sistema.
As regressões significativas positivas do pH e negativas da acidez
potencial (H+Al), dos teores de Al e do carbono orgânico do solo com a
atividade da nitrogenase (fixação de N
2
) representam modelos preditivos que
explicam a variação do potencial de fixação do nitrogênio nas diferentes
coberturas avaliadas (Quadro 2). Altos níveis de carbono, H
+
e Al causam
inibição da nitrogenase, afetando negativamente a fixação biológica de
nitrogênio.
Segundo Duguma et al. (1988), o baixo pH e a toxidez do Al prejudicam
o processo de fixação do N
2
. Regressões lineares positivas foram obtidas entre
a atividade da nitrogenase (FIX) com os teores de Ntotal, Ca, Mg e SB do solo
(Quadro 2). Tais resultados mostram que o plantio das leguminosas fixadoras
de N promoveu um aumento significativo da fertilidade do solo. Costa et al.
(1997), observaram num plantio de sabiá com seis anos de idade, que os
principais nutrientes incorporados foram C, P, K, Ca e Mg, com significativo
aumento nas concentrações de N.
48
Figura 5:
Potencial de fixação de nitrogênio da população microbiana de solos sob
quatro diferentes coberturas vegetais (Média de 4 repetições).
A atividade da nitrogenase relacionou-se negativamente com o N-NO
3
-
(Nit) e, positivamente, com o nitrogênio total do solo (Quadro 2), indicando que
o N, dependendo da forma que ele se encontra no solo, pode afetar o processo
de fixação biológica do nitrogênio. O alto teor de nitrato (NO
3
-
) na capoeira
pode ter contribuido para inibir a fixação biológica do nitrogênio nesse solo.
Efeito inibitório do processo de fixação biológica de N
2
, decorrente da adição
de nitrato, foi observado em espécies leguminosas, como Acacia auriculiformis
(Goi et al., 1992) e Mimosa caesalpiniifolia (Goi et al., 1997).
O efeito maléfico do íon NO
3
-
no processo de fixação biológica de
nitrogênio pode ser explicado pela relação do nitrato com o processo de
difusão do O
2
nos nódulos (Vessey e Waterer, 1992) e a toxicidade do nitrito
(Rigaud e Puppo, 1977). Estas hipóteses são comprovadas pelas regressões
lineares negativas entre a atividade da nitrogenase (Fix) e os processos de
nitrificação e desnitrificação (Quadro 2).
Os teores médios de fósforo (P), potássio (K), sódio (Na) e lignina na
serapilheira mostraram-se estatisticamente iguais entre as quatro coberturas
vegetais estudadas. A capoeira apresentou maiores teores de carbono
orgânico e o N total da serapilheira, diferindo das demais coberturas que foram
estatisticamente iguais entre si, exceto a acácia que apresentou menor valor de
carbono orgânico (Quadro 3).
As serapilheiras da acácia e do sabiá apresentaram maiores teores de
Ca e foram estatisticamente iguais aos da capoeira que, por sua vez, não
diferiu da pastagem. Os teores de Mg foram maiores na capoeira e no sabiá
que não diferiram entre si. A acácia apresentou o valor médio intermediário e
49
não diferiu do sabiá e da pastagem estatisticamente iguais entre si e nem da
pastagem (Quadro 3). Estes resultados sugerem o papel importante das
leguminosas na ciclagem biogeoquimíca do Ca e Mg, especialmente em áreas
com impacto antrópico. Barreto e Fernandes (2001), avaliando o aporte de
biomassa e o efeito da Gliricídia sepium sobre as forrageiras herbáceas, em
um Latossolo Amarelo em Lagarto/SE, verificaram que esta leguminosa
arbórea fixadora de nitrogênio promoveu o aumento do teor de Ca mais Mg.
Segundo Oliveira e Lacerda (1993) e Louzada et al. (1995), a magnitude do
aporte de nutrientes por meio da produção de serapilheira em plantios de
leguminosas arbóreas supera a faixa observada para fragmentos da Floresta
Atlântica.
Encontrou-se regressões lineares positivas entre Ca, Mg, SB do solo
com os teores de celulose (Quadro 2). A relação C:N da serapilheira também
permitiu predizer a variação do N total do solo (Quadro 2). Estes resultados
demostram qua a ciclagem desses nutrientes em ecossitemas como os de
florestas (naturais ou plantadas) e de pastagem está intimamente ligada a
qualidade da serapilheira. Segundo Constantinides e Fownes (1994), a
concentração de carbono, nitrogênio, lignina e a relação C:N exercem
influência na decomposição dos resíduos. A pastagem com maior relação C:N,
possivelmente, apresentou uma quantidade maior de compostos de carbono
menos lábeis, o que resultaria em taxas mais baixas de mineralização e
disponibilização de nutrientes no solo.
Os teores de N total e de carbono orgânico da serapilheira permitiram
predizer a variação do potencial de nitrificação e desnitrificação nos solos sob
as diferentes coberturas avaliadas (Quadro 2). Altas concentrações de carbono
e nitrogênio nos resíduos orgânicos determinam taxas mais elevadas de
decomposição, promovendo taxas de mineralização de N mais acentuadas, o
que eleva a disponibilidade de amônio no solo. Nessas condições, a atividade
dos microrganismos nitrificantes é maior (Vitousek et al., 1982), o que resulta
num aumento na produção de nitratos, elevando, por conseguinte, a atividade
dos microrganismos desnitrificantes (Stouthamer et al., 1980; Tiedje, 1988;
Patra et al., 2005).
A acácia e o sabiá não diferiram entre si e apresentaram as maiores
concentrações de celulose. A pastagem, com a menor concentração, não
diferiu da capoeira e do sabiá. Com relação as concentrações de polifenóis
50
totais, maiores valores foram observados no sabiá e na capoeira
estatisticamente iguais entre si e, as menores concentrações, na acácia e na
pastagem, que não diferiram da capoeira (Quadro 3). Segundo Vanlauwe et al.
(1997), ainda não existe um consenso em relação ao melhor indicador de
decomposição. Entretanto, os compostos fenólicos são, frequentemente,
correlacionados negativamente com a velocidade de decomposição (Monteiro,
2001; Ndaw, 2003; Froufe, 2003), considerando que este grupo de substâncias
tende a se complexar com as formas de N, tornando este elemento menos
disponível para a comunidade decompositora (Tian et al., 1992; Constantinides
e Fownes, 1994).
De modo geral, as coberturas vegetais produziram serapilheira de boa
qualidade nutricional, determinada pelos baixos teores de polifenóis totais e
valores das relações C:N, N:P, polifenol:N, polifenol:P e celulose:N (Quadro 3).
As regressões lineares negativas entre o potencial de mineralização (SIR) com
as relações polifenol:N e celulose:N (Quadro 2) mostram que a serapilheira de
baixo nível de recalcitrância propicia aumentos na atividade microbiana do solo,
corroborando a semelhança entre as áreas em termos de teores de CO
2
liberado.
As regressões lineares negativas entre os teores de N-NO
3
-
(nitrificação) e N-N
2
O (desnitrificação) com as relações celulose:N e
lignina+celulose:N, (Quadro 2) mostram os efeitos negativos da baixa
qualidade da serapilheira nos processos de nitrificação e desnitrificação. Altas
relações lignina+celulose:N e baixas concentrações de celulose são
associadas com baixas taxas de decomposição (Aber e Melilo, 1980; Froufe,
2003) e liberação de N (Ndaw, 2003; Monteiro e Gama-Rodrigues, 2004).
Nessas condições, ocorre uma competição por amônio entre os
microrganismos heterotróficos do solo, o que resulta em baixas taxas de
nitrificação e desnitrificação.
51
Quadro 3: Análise da qualidade química e nutricional das amostras de serapilheira coletadas nas diferentes coberturas
estudadas
Coberturas
Ca Mg P K Na C-org N total
Polifenóis
Lignina
Celulose
---------------------------------------------------g kg
-1
-------------------------------------------------------
Acácia 11,3 a 0,9 bc 0,3 a 0,263 a 0,150 a 272,0 c 11,1 b 5,2 b 350,0 a 524,0 a
Sabiá 13,8 a 1,5 ab 0,3 a 0,400 a 0,200 a 318,6 b 12,8 b 10,6 a 305,0 a 387,0 ab
Capoeira 7,4 ab 1,8 a 0,3 a 0,400 a 0,288 a 382,2 a 15,9 a 9,0 ab 441,0 a 286,0 b
Pastagem 2,0 b 0,5 c 0,5 a 0,375 a 0,263 a 332,9 b 10,4 b 5,5 b 348,0 a 234,0 b
CV% 54,5 30,7 44,6 36,8 33,6 14,7 22,2 44,2 38,9 42,7
Coberturas
C:N
Polifenol:N
Celulose:N
Lignina +celulose:N
Lignina +polifenol:N
Acácia 24,5 b 0,5 a 4,8 a 79,3 a 31,8 a
Sabiá 25,6 b 0,9 a 3,1 b 55,6 b 25,4 a
Capoeira 24,5 b 0,6 a 1,8 b 46,6 b 29,1 a
Pastagem 32,1 a 0,5 a 2,2 b 56,0 b 34,0 a
CV% 17,3 44,0 34,2 24,2 37,3
Médias seguidas de pelo menos uma mesma letra em cada coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan
em nível de 5% de probabilidade.
CV: coeficiente de variação; Ca: cálcio; Mg: magnésio; P: fósforo; K: potássio; Na: sódio; C-org: carbono orgânico;
Ntotal: nitrogênio total; C:N: relação entre carbono orgânico e nitrogênio total; polifenol:N: relação entre
polifenóis totais e nitrogênio total; celulose:N: relação entre celulose e nitrogênio total; lignina+celulose:N: relação
entre lignina mais celulose e nitrogênio total; lignina+polifenol:N: relação entre lignina mais polifenol e nitrogênio total.
52
6.1.4. CONCLUSÕES
A acácia e o sabiá revelaram-se promissoras em melhorar a fertilidade
do solo, no que tange ao Ca, Mg, SB, pH e redução dos níveis de Al no solo.
A qualidade nutricional e orgânica da serapilheira influenciou a
atividade nitrificadora e desnitrificadora do solo.
As áreas de plantio de leguminosas aportaram maior quantidade de
nitrogênio.
A disponibilidade do carbono foi um fator importante no controle do
processo de desnitrificação que tem sua expressão relacionada com a
disponibilidade de N na forma de nitrato.
Os atributos químicos e as atividades microbiológicas dos solos
estudados podem ser considerados bons indicadores da recuperação de áreas
degradadas.
53
6.1.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aber, J.D.; Melillo, J. M. (1980) Litter decomposition: measuring relative
contributions of organic matter and nitrogen to forest soils. Canadian Journal
of Botany, 58, p.416-421.
Alcântara, R.M.C.M. de. (1995) Propriedades químicas e bioquímicas e suas
interrelações em solos sob vegetação de mata e campo adjacentes. Lavras:
UFLA, 1995. 84p. (Dissertação tese de Mestrado em Solos e Nutrição de
Plantas).
Alfaia, S.S. (1997) Mineralização do nitrogênio incorporado como material
vegetal em três solos da Amazônia Central. Rev. Bras. Ci. Solo, Viçosa, v.
21, n. 3, p.387-392.
Alvarez V., V.H.; Novais, R. F.; Barros, N. F.; Cantarutti, R. B.; Lopes, A. S.
(1999) Interpretação dos resultados das análises de solos. In: Ribeiro, A. C.;
Guimarães, P. T. G.; Alvarez V., V. H. (Ed.). Recomendações para o uso de
corretivos e fertilizantes em Minas Gerais – 5. Aproximação. Viçosa, MG:
CFSEMG, p. 25-32.
Anderson, J.P.E.; Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the
quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biology and
Biochemestry, 10, p.215-221.
Anderson, J.M. e Spencer, T. (1991) Carbon, nutrient and water balances of
tropical rain forest ecosystems subject to disturbance. MAB Digest 7,
UNESCO, Paris, 95p.
Anderson, T.H.; Domsch, K.H. (1993) The metabolic quotient for CO2 (qCO2)
as a specific activity parameter to assess the effects of environmental
conditions, such as pH, on the microbial biomass of forest soils. Soil Biology
and Biochemistry, 25 (3): 393-395.
Anderson, J. D., Ingram, J. S. I. (1996) Tropical soil biology and fertility. In: A
handbook of methods. 2. ed. Wallingford, UK CAB International, 171p.
Andrade, A.G., Costa, G.S., Faria, S.M. (2000) Deposição e decomposição da
serapilheira em povoamentos de Mimosa caesalpiniifolia, Acacia mangium e
Acacia holosericea com quatro anos de idade em plantossolo. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, v.24, n.6, p.777-785.
Aulakh, M.S.; Doran, J.W.; Mosier, A.R. (1992) Soil denitrification -
sinigficance, measurement, and effects of management. Adv. Soil Sci., 18,
p.1-57.
Baird, C. (2002) Química Ambiental. Porto Alegre, Bookman, 622p.
54
Ball, A.S., Milne, E., Drake, B.G. (2000) Elevated atmospheric-carbon dioxide
concentration increases soil respiration in a mid-successional lowland forest.
Soil Biology & Biochemestry, 32, p.721-723.
Balieiro, F.C.; Franco, A.A.; Pereira, M.G.; Campello, E.F.C.; Dias, L.E; Faria,
S.M.; Alves, B.J.R. (2004) Dinâmica da serrapilheira e transferência de
nitrogênio ao solo, em plantios de pseudosamanae guachapele e
Eucalyptus grandis Revista Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.
39, n.6, p. 597-601.
Barreto, A. C.; Fernandes, M. F. (2001) Cultivo de Gliricidia sepium e Leucaena
leucocephala em alamedas visando a melhoria dos solos dos tabuleiros
costeiros. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 36, n. 10, p.
1287-1293.
Barros, N.F.de; Comerford, N.B. (2002) Sustentabilidade da produção de
florestas plantadas na região tropical. In: Alvarez V.; Schaefer,
C.E.G.R.; Barros, N.F.de; Costa, L.M. da; eds. Tópicos em Ciência
do solo. Viçosa, SBCS, p.487-592.
Bataglia, O.C.; Furlani, A.M.C.; Teixeira, J.P.F.; Furlani, P.R.; Gallo, J.R.
(1983) Métodos de análise química de plantas. Campinas, Instituto
Agronômico, 48p. (Boletim Técnico, 78)
Braga, J.M., Defelipo, B.V. (1974) Determinação espectrofotométrica de fosfóro
em extrato de solo e material vegetal. R.Ceres, 21, p.73-85.
Brookes, P.C. (1995) The use of microbial parameters in soil pollution by heavy
metals. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v.19, n.4, p.269-279.
Burle, M.L.; Mielniczuk, J.; Focchi, S. (1997) Effect of cropping systems on soil
chemical charateristics with emphasis on soil acidification. Plant Soil, v.190,
p.309-316.
Camargo, F. A. O., Gianello, C.; Tedesco, M. J., Vidor, C. (1999) Nitrogênio
orgânico no solo, p 117 - 137. In: Santos, G. A.; Camargo, F. A. O.
Fundamentos da matéria orgânica do solo: ecossistemas tropicais e
subtropicais. Porto Alegre: Gênesis, p.118-133.
Carmo, J. B.; Andrade, C.A.; Cerri, C.C.; Piccolo, M.C. (2005) Disponibilidade
de nitrogênio e fluxos N2O a partir de solo sob pastagem apos aplicação de
herbicidas Rev. Bras. Ci. Solo, v.29, p.735-746.
Chadwick, O.A., Derry, L.A., Vitousek, P.M., Huebert, B.J., Hedin, L.O. (1999)
Changing sources of nutrients during four million years of ecosystem
development. Nature 397, p.491-497.
Constantinides, M., Fownes, J.H. (1994) Nitrogen mineralization from leaves
and litter of tropical plants: relationship to nitrogen, lignin and soluble
polyphenol concentrations. Soil Biochem., 26, p.49-55.
55
Costa, G.S., Andrade, A.G., Faria, S.M. de (1997) Aporte de nutrientes pela
serapilheira de Mimosa Caesalpiniifolia (Sabia) com seis anos de idade.
Anais do III Simposio Nacional de Recuperação de Areas degradadas, Ouro
Preto-MG, p.344-349.
Coûteaux, M.M, Bottner, P., Berg, B. (1995) Litter decomposition, climate and
litter quality. Trends in Ecology & Evolution, 10, p.63-66.
Davies, R.I.; Coulson, C.B.; Lewis, D.A. (1964) Polyphenols in plant humus and
soil: 3. J. Soil Sci.;15:229-309.
Defelipo, B.V., Ribeiro, A.C. (1981) Análise química do solo. Viçosa,
Universidade Federal de Viçosa, 17p. (Boletim de Extensão, 29)
D‘Haene, K.; Moreels, E.; De Neve, S.; Daguilar, B.C.; Boecky, P.; Hofman, G.;
Cleemput, O.V. (2003) Soil properties influencing the denitrification potencial
of Flemish agricultural soils. Biol. Fertil. Soils, 38, p.358-366.
Duguma, B.; Kang, B.T.; Okali, D.U.U. (1988) Effect of liming and phosphorus
application on performance of Leucaena leucocephala in acid soils. Plant
and Soil, Dordrecht, v.110, p.57-61.
Ecossistemas (2001) Caatinga, Lojinha do wwf- [email protected]
Embrapa. (1997) Serviço Nacional de Levantamento e Conservação de Solos.
Manual de Métodos de Análise de Solos. 2. ed. Rev. Atual. Rio de Janeiro,
SNLCS.
Forreter, D.I., Bauhus, J., Khanna, P.K., (2004) Growth dynamics in a mixed-
species plantation of Eucalyptus globulus and Acacia mearnsii. Forest
Ecology and Management, v.193, p.81-95.
Forreter, D.I., Bauhus, J., Cowie, A.L. (2005) On the success and failure of
mixed-species tree plantations: lessons learned from o model system of
Eucalyptus globulus and Acacia mearnsii. Forest Ecology and Management,
v.209, p.147-155.
Franco, A.A.; Dias, L.E.; Faria, S. M.; Campello, E.F.C.; Silva, E.M.R. (1995)
Uso de leguminosas florestais noduladas e micorrizadas como agentes de
recuperação e manutenção da vida do solo: um modelo tecnológico. Oecol.
Bras., 1, p.459-467.
Franco, A.A., Faria, S.M. (1997) The contribution of N2-fixing tree legumes to
land reclamation and sustainability in the tropics. Soil Biochem., 29, p.897-
983.
Froufe, L.C.M (2003) Decomposição de folhas de plantios de eucalipto e
pupunha em un fragmento da Mata Atlântica no Norte Fluminense. 142f.
Tese (Doutorado em produção vegetal). UENF. Campos dos Goytacazes-
RJ.
56
Gama-Rodrigues, E.F; Barros, N.F.; Gama-Rodrigues, A.C.; Santos, G.A.
(2005) Nitrogênio, carbono e atividade da biomassa microbiana do solo em
plantações de eucalipto. R. Bras. Ci. Solo, 29, p.893-901.
Giacomini, S.J., Jantalia, C.P., Aita, C., Urquiaga, S.S., Alves, B.J.R. (2006)
Emissão de óxido nitroso com a aplicação de dejetos líquidos de suínos em
solo sob plantio direto. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.41, n.11, p.1653-
1661.
Goi, S. R.; Sprent, J. I.; Jacob-Neto, J. (1997) Effect of different sources of N on
the structure of Mimosa caesalpiniaefolia root nodules. Soil Biol. Biochem.
29, p.983-987.
Goi, S. R.; Sprent, J. I.; James, E. K.; Jacob-Neto, J. (1992) Influence of
nitrogen form on the nitrogen fixation of Acacia auriculiformis. Symbiosis,
82, p.505-512.
Grisi, B. M. (1995) Biomassa e a atividade de microorganismos do solo: revisão
metodológica. Revista Nordestina de Biologia, 10: p.1-22.
Hamilton, J.G., Thomas, R.B., Delucia, E.H. (2001) Direct and indirect effects of
elevated CO2 on leaf respiration in a forest ecosystem. Plant Cell
environment, 24, p.975-982.
Hardy, R. W. F., Holsten, R.D., Jackson, E.K., Burns, R.C. (1968) The
acetylene–ethylene assay for N
2
fixation: laboratory and field evaluation.
Plant Physiology 43, p.1185-1207.
Hart, S.C.; Stark, J.M.; Davidson, E.A.; Firestone, M.K. (1994) Nitrogen
mineralization, immobilization and nitrification. In: Weaver, R.W. (ed.)
Methods of soil analysis. Part 2: Microbiological and Biochemical Properties.
Soil Science Society of America, Inc. p. 985-1017.
Hedin, L.O., Vitousek, P.M., Matson, P.A. (2003) Pathways and implications of
nutrient losses during four million years of tropical forest ecosystem
development. Ecology 84 (9), p.2231-2255
Jetten, M.S.M.; Strous, M.; Van De Pas-Schoonen, K.T.; Schalk, J.; Van
Dongen, U.G.J.M.; Van De Graaf, A. A.; Logemann, S.; Muyzer, G.; Van
Loosdrecht, M.C.M.; Kuenen, J.G.. (1999) The anaerobic oxidation of
ammonium. FEMS Microbiology Reviews 22, p. 421-43.
Jetten, M.S.M.; Sliekers, A. O.; Third, K. A.; Abma, W.; Kuenen, J.G.. (2003)
Canon and Anammox in a gas-lift reactor. FEMS Microbiology Letters 218,
p. 339-344. 2003.
Kannegiesser, U. (1990) Apuntes sobre algunas acacias australianas. 1.-Acacia
mearnsii De Willd. Ciencia e Investigación Forestal, v.4, n.2, p.198-202.
Keller, M.; Veldkamp, E.; Weitz, A.M.; Reiners, W.A. (1993) Effect of pasture
age on soil trace-gas emissions from a deforested area of Costa Rica.
Nature, 365:244-246.
57
Kroeze, C. (1993) Global warming by halocarbons and nitrous oxide. PhD
Thesis, University of Amsterdam, p.187.
Leita, L.; Nobile, M; de; Muhlbachova, G.; Mondoni, C.; Marchiol, L.; Zerbi, G.
(1995) Bioavailability and effects of heavy metals on soil microbial biomass
survival during laboratory incubation. Biology and Fertility of Soils, Berlin,
v.19, n.2-3, p.103-108.
Lensi, R., Mazurie, S., Gourbiere, F., Josserand, A. (1986) Rapid determination
of the nitrification potential of an acid forest soil and assessment of its
variability. Soil Biology and Biochemistry 18, p.239-240.
López, A., Jesus, H.S. de, Rocha, M. de M, Fries, M., Urquiaga, S., Alves,
B.J.R. (1998) Diagnóstico do Potencial de Nitrificação e Desnitrificação em
Solo sob Pastagens de Bracharia sp. e Solo sob Plantio Direto e
Convencional. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, nov.1998. 24p.
(Embrapa-CNPAB. Documentos, 78)
Louzada, M.A.P.; Quintela, M.F.S.; Penna, L.P.S. (1995) Estudo comparativo
da produção de serapilheira em áreas de Mata Atlântica, floresta secundária
“antiga” e uma floresta secundária (capoeira). Oec. Bras., 1:61-74.
Marchiori Jr. M.; Melo, W.J. (1999) Carbono, carbono da biomassa microbiana
e atividade enzimática em um solo sob mata natural, pastagem e cultura do
algodoeiro. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v. 23, p.257-263.
Matson, P.A.; Vitousek, P.M.; Ewel, J.J.; Robertson, G.P. (1987) Nitrogen
Transformations Following Tropical Forest Felling and Burning of a Volcanic
Soil. Ecology, 68: p.491-502.
Melillo, J.M.; Steudler, P.A.; Feigl, B.J.; Neill, C.; Garcia, D.; Piccolo, M.C.;
Cerri, C.; Tian, H. (2001) Nitrous oxide emissions from forests and pasture
of various ages in the Brazilian Amazon. J. Geophys. Res., 106:179- 188.
Melloni, R.; Pereira, E. G.; Trannin, I. C. B.; Santos, D. R. dos; Moreira, F. M.
S.; Siqueira, J. O. (2001) Características biológicas de solos sob mata ciliar
e campo cerrado no sul de Minas Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras,
v. 25, n. 1, p. 7-13.
Minchin, F. R., Witty, J.F., Mytton, L.R. (1994) Reply to ‘‘Measurement of
nitrogenase activity in legume root nodules: in defence of the acetylene
reduction assay.’’ Plant and Soil 158, p.163-167.
Monteiro, M. T. (2001) Carbono, Nitrogênio e Atividade da Biomassa
Microbiana: indicadores de Qualidade do Solo e da Serapilheira em Sítios
Florestais do Norte Fluminense. Campos dos Goytacazes, Universidade
Estadual do Norte Fluminense, 75p. (Tese de Mestrado)
Monteiro, M. T., Gama-Rodrigues, E.F. (2004) Carbono, nitrogênio e atividade
da biomassa microbiana em diferentes estruturas de serapilheira de uma
floresta natural. R. Bras. Ci. Solo, 28, p.819-826.
58
Moraes, J.F.L. (1991) Conteúdos de carbono e tipologia de horizontes nos
solos da bacia Amazônica. Piracicaba: CENA/USP, 1991. 84p. Dissertação
de Mestrado.
Marscher, H., Römheld, V. (1983) In vivo measurement of root-induced pH
changes at the soil-root interface: effect of plant species and nitrogen
source, Zeitschrift fur Pfanzenernahrung und Bodenkunde. 111, p.241-251.
Moreira, F.M.S., Siqueira, J.O. (2002) Microbiologia e bioquímica do Solo.
Minas Gerais, p.231-232.
Ndaw, S.M. (2003) Diversidade, biomassa e atividade microbiana como
indicadores de qualidade do solo e da serapilheira em sítios sob diferentes
coberturas vegetais na região Norte Fluminense. Campos dos Goytacazes,
Universidade Estadual do Norte Fluminense, 98p. (Tese de Mestrado)
Neill, C.; Garcia-Montiel, D.C.; Piccolo, M.C.; Cerri, C.; Steudler, P.A.; Melillo,
J.M.; Brito, M. (1997) Net nitrogen mineralization rates in soils following
deforestation for pasture across the southwestern Brazilian Amazon Basin
Landscape. Oecologia, 110:243-252.
Neill, C.; Garcia-Montiel, D.C.; Piccolo, M.C.;.; Steudler, P.A.; Melillo, J.M.;
Feigl, B.J.; Cerri, C. (1995) Nitrogen dynamics in soils of forest and active
pasture in the western Brazilian Amazon basin. Soil Biol. Biochem.,
27:1167-1175.
Oliveira, R.R.; Lacerda, L.D. (1993) Produção e composição química da
serapilheira na Floresta da Tijuca (RJ). R. Brasil. Bot., 16:93-99.
Patra, A. K., Abbadie, L., Clays-Josserand, A., Degrange, V., grayston, S. J.,
Loiseau, P., Louault, F., Mahmood, S. Nazaret, S., Philippot, L., Poly, F.,
Prosser, J. I., Richaume, A., Le Roux, X. (2005) Effects of Grazing on
microbial functional groups involved in soil dynamics. Ecological Monografs,
75, p.65-80.
Paul, E.A.; Clark, F.E. (1989) Soil microbiology and biochemistry. San Diego:
Academic Press, 1989. 273p.
Piccolo, M.C.; Neill, C.; Cerri, C. (1994) Net Mineralization and Net Nitrification
Along a Tropical Forest-to-Pasture Chronosequence. Plant and Soil 162: p.
61-70.
Pinto, C. (2001) Contribuição de espécies arbóreas de diferentes fases
sucessionais da Floresta Ombrófila Densa das Terras Baixas para ciclagem
de nutrientes minerais, Floresta Estadual do Palmito, Paranaguá, PR.
Curitiba, 2001. 68p. Dissertação (Mestrado em Engenharia Florestal), Setor
de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Paraná.
Pompéia, S. L. (1994) Procedimentos técnicos para recuperação de áreas
degradadas por poluição. In: I Simpósio Sul-Americano e II Simpósio
59
Nacional de recuperação de Áreas degradadas. Curitiba. Anais...Curitiba.
679p.
Postgate, J. R. The fundamentals of nitrogen fixation. (1987) Cambridge:
Cambridge University Press, 252p.
Raven, J.A., Franco, A.A., Jesus, E.L. de, Jacob-Neto, J. (1990) H+ extrusion
and organic acid synthesis in N2-fixing symbioses involving vascular plants.
New phytologist, 114, p.369-389.
Reiners, W.A.; Bouwman, A.F.; Parsons, W.F.J.; Keller, M. (1994) Tropical rain
forest conversion to pasture: Changes in vegetation and soil properties.
Ecol. Appl., 4:363- 377.
Rigaud, J. ; Puppo. A. (1977) Effect of nitrite upon leghaemoglobin and
interaction with nitrogen fixation. Biochem. Biophys. Acta, 497, p.702-706.
Ross, D.J. Speir, T.W.; Kettles, H.A.; Tate, K.R.; Mackay, A.D. (1995) Soil
Microbial Biomassm, C and N Mineralization. And Enzyme Activities in Hill
Pasture: Influence of Grazing Management. Australian Journal of Soil
Research, 33: p.943-959.
Santos, D.R. dos (2000) Fósforo, fungo micorrízico e Azorhizobium na
produção de fitomassa e nutrição de Sesbania virgata e Sesbania rostrada.
Dissertação (Mestrado em Agronomia/Solo e Nutrição de Planta), Lavras-
MG, Universidade Federal de Lavras, MG, 88p.
Silva, I.F.; Mielniczuk, J. (1997) Avaliação do estado de agregação do solo
afetado pelo uso agrícola. Rev Bras Ci Solo, v.21, p.313-319.
Siqueira, J. O., Franco, A. A (1988) Biotecnologia do solo: Fundamentos e
Perspectivas. 1nd. MEC/ESAL/FAEPE/ABEAS/, D.F., Brasília, 236p.
Sliekers, A. O.; Derwort, N.; Campos Gomes, J.L.; Strous, M.; Kuenen, J.G.;
Jetten, M.S.S.. (2002) Completely Autothrophic Nitrogen Removal over
Nitrite in one Single Reactor. Water Research 36, p. 2475-2482.
Smith, M.S., Tiedje, J.M. (1979) The effects of roots on soil denitrification. Soil.
Sci. Soc. Am. J., 43: p.951-955.
Souza, I.M.Z. (2005) Carbono e nitrogênio da biomassa microbiana do solo em
áreas reflorestadas comparadas ao campo e mata nativa do Planalto dos
Campos Gerais, SC. Lages: UDESC, 2005. 61p. (Dissertação tese de
Mestrado em Ciência do Solo).
Stevenson, F.J. (1994) Organics forms of soil nitrogen. In: Humus chemistry;
genesis, composition, reactions. 2.ed. New York, John Wiley& Sons, p.59-
95.
Steudler, P.A.; Melillo, J.M.; Bowden, R.D.; Castro, M.S. (1991) The Effects of
Natural and Human Disturbances on Soil Nitrogen Dynamics and Trace Gas
Fluxes in a Puerto Rican Wet Forest. Biotropica, 23 (4): p.356-363.
60
Stewart, G.R.; Pates, J.S.; Unkovich, M. (1993) Characteristics of inorganic
nitrogen assimilation of plants in fire-prone Mediterranean type vegetation.
Plant, cell and environment 16, p.351-363.
Stouthamer, A.H.; Van’T riet, J.A., Oltmann, L.F. (1980) Respiration of nitrate as
acceptor. In: Knowles, C.J., ed. Diversity in bacterial respiratory systems.
Boca Raton, CRC Press, v.2, p.19-48.
Tedesco, M.J., Gianello, C., Bissani, C.A., Bohnen, H. & Volkweiss, S.J. (1995)
Análise do Solo, Plantas e Outras Materiais UFRS, Porto Alegre, 174p.
Testa, V.M.; Teixeira, L.A.J.; Mielniczuk, J. (1992) Características químicas de
um Podzólico Vermelho-Escuro afetadas por sistemas de cultura. Rev Bras
Ci Solo, v.16, p.107-114.
Thirukkumaran, C.M., Parkinson, D. (2000) Microbial respiration, biomass,
metabolic quotient and litter decomposition in a lodgepole pine forest floor
amended with nitrogen and phosphorus fertilizers. Soil Biology &
biochemistry, 32, p.59-66.
Tian, G.; Tang, B.C.; Brussaard, L. (1992) Biological effects of plant residues
with contrasting chemical compositions under tropical conditions-
decomposition and nutrient release. Soil Biol. Biochem., 24, p.1051-1060.
Tian, G., Brussaard, L., Kang, B.T. (1995) An index for assessing the quality of
plant residues and evaluating their effects on soil and crop in the (sub-)
humid tropics. Appl. Soil Ecol., 2, p.25-32.
Tiedje, J.M. (1988) Ecology of denitrification and dissimilatory nitrate reduction
to ammonium. In: Alexander, J.B.Z., ed. Biology of anaerobic organisms.
New York, John Wiley, 1988. p.179-244.
Tiedje, J. M., Simkins, S., Groffman, P.M. (1989) Perspectives on measurement
of denitrification in the field includingrecommended protocols for acetylene
based methods. Plant and Soil 115, p.261-284.
Tomé Júnior, B. (1997) Manual para interpretação de análise de solo. Guaíba:
Agropecuária. 247p.
Turco, R. F.; Kennedy, A. C.; Jawson, M. D. (1994) Microbial indicators of soil
quality. In: Doran, J. W.; Coleman, D. C.; Bezdicek, D. F.; Stewart, B. A.
Defining soil quality for a sustainable environment. Madison: SSSA.
Turner, G. L., Gibson, A.H. (1980) Pages 111–138 in F. Bergersen, editor.
Methods for evaluating biological nitrogen fixation. John Wiley and Sons,
Chichester, UK. Vessey, J. K. 1994. Measurement of nitrogenase activity in
legume root nodules: in defense of the acetylene reduction assay. Plant and
Soil 158, p.151-162.
61
Van Soest, P., Wine, R. H. (1968) Development of a comphrehensive system of
feed analysis and its applications to forages. J. Assoc. Official Agr. Chem.,
Madison, 51: p.780-785.
Vanlauwe, B.; Diels, J.; Sanginga, N., Merckx, R. (1997) Residue quality and
decomposition: An unsteady relationship? In: CADISCH, G. & GILLER, K.E.,
eds. Driven by nature: Plant litter quality and decomposition. Wallingford,
CAB International, 1997. p.157-166.
Vargas, L.K.; Scholles, D. (2000) Biomassa microbiana e produção de C-CO
2
e
N mineral de um Podzólico Vermelhoescuro submetido a diferentes
sistemas de manejo. Rev Bras Ci Solo, v.24, p.35-42, 2000.
Veen, J.A.; Van Overbeek, L.S.; Van Elsas, J.D. (1997). Fate and activity of
microrganisms introduced into soil. Microbiology and Molecular Biology
Review v.61 pp. 121-135.
Veldkamp, E. (1994) Organic carbon turnover in tropical soils under pastures
after deforestation. Soil Science Society of America. Journal, v.58, p.175-
180.
Veldkamp, E.; Davidson, E.; Erickson, H.; Keller, M.; Weitz, A. (1999) Soil
Nitrogen Cycling and Nitrogen Oxide Emissions Along a Pasture
Chronosequence in the Humid Tropics of Costa Rica. Soil Biology and
Biochemistry, 31: p.387-394.
Verchot, L.V.; Davidson, E.A.; Cattânio, J.H.; Ackerman, I.L.; Erickson, H.E.;
Keller, M. (1999) Land use change and biogeochemical controls of nitrogen
emissions from soil in eastern Amazon. Global Biogeochem. Cycles, 13:31-
46.
Vessey, J. K.; Waterer, J. (1992) In search of the mechanism of nitrate inhibition
ofnitrogenase activity in legume nodules: recent developments. Physiol.
Plant., 84, p.171-176.
Vessey, J. K. (1994) Measurement of nitrogenase activity in legume root
nodules: in defense of the acetylene reduction assay. Plant and Soil,
158:151–162.
Vitousek, P.; Gosz, J.R; Grier, C.C.; Melillo, J.M.; Reiners, W.A.; Todo, RL.
(1982) A comparative analysis of potential nitrification and nitrate mobility in
forest ecosystems. Ecological Monographs, 52, p.155-177.
Wander, M. M.; Traina, B.R. (1994) Organic and conventional management
effects on biologically active soil organic matter pools. Soil Science Society
of America Journal, 58, p.1130-1139.
Wormald, T.J. Mixed and pure forest plantations in the tropics and
subtropics. FAO Forestry Paper 103. Rome, FAO Technical Papers.
Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1992. 152p.
62
Ye, R.W.; Thomas, S.M.. (2001) “Microbial nitrogen cycles: physiology,
genomics and application”. Current Opinion in Microbiology, 4 p. 307-312.
Yoshinari, T., Hynes, R., Knowles, R. (1977) Acetylene inhibition of nitrous
oxide reduction and measurement of denitrification and nitrogen fixation in
soil. Soil Biol. Biochem., 9:p.177-183.
63
6.2. DIVERSIDADE ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE MICRORGANISMOS
EM SOLOS SOB DIFERENTES COBERTURAS VEGETAIS
Resumo
Métodos tradicionais de isolamento e cultivos limitam as análises da
diversidade microbiana no meio ambiente, pois acredita-se que
aproximadamente 10% dos microrganismos possam ser cultivados. Uma nova
perspectiva surgiu com o advento da biologia molecular, que tem permitido
interpretar mais facilmente e de forma mais sensível a diversidade estrutural e
funcional dos microrganismos no solo. Este trabalho foi desenvolvido na
Fazenda Carrapeta, Conceição de Macabú-RJ, com o objetivo de estimar e
comparar a diversidade de comunidades bacterianas em duas áreas
reflorestadas com leguminosas arbóreas (Acácia auriculiformis (acácia) e
Mimosa caesalpinifolia (sabiá)), comparadas às áreas de capoeira e pastagem.
Para tanto, coletaram-se quatro amostras, compostas de quinze subamostras
de solo na profundidade de 0-10cm, e quatro amostras simples de serapilheira,
em cada área, em setembro de 2005. O perfil molecular da comunidade
microbiana foi determinado por DGGE (Eletroforese em Gel com Gradiente de
64
Desnaturantes), extraindo-se o DNA diretamente e submetendo-o à reação de
PCR (polimerase em cadeia) com os iniciadores das regiões, 16S do DNA
ribossomal para a comunidade bacteriana total, CTO para a comunidade
bacteriana nitrificadora e Nirk para a comunidade bacteriana desnitrificadora. A
capoeira apresentou o menor índice de diversidade bacteriana do solo em
relação ao polimorfismo do 16S do DNAr devido, provavelmente, aos baixos
teores de carbono e os possíveis efeitos sobre as estruturas das comunidades
bacterianas decorrentes das atividades antrópicas nos demais solos. Os
maiores valores de índices de diversidade da comunidade de bactérias
desnitrificadoras da serapilheira foram encontrados na acácia e no sabiá
estatisticamente iguais entre si e o menor valor de índice na pastagem; a
capoeira apresentou os valores intermédiarios, não diferindo com o sabiá. A
análise de agrupamento com base no perfil dos géis de DGGE, mostrou efeitos
diferenciais do tipo de coberturas vegetais sobre as estruturas genéticas das
comunidades bacterianas. As estruturas genéticas da comunidade microbiana
total do solo e da serapilheira foram expressivamente influenciadas pela
qualidade química e nutricional da serapilheira e pela fertilidade do solo. Em
relação às comunidades bacterianas nitrificadoras do solo, a capoeira e a
acácia apresentaram a mesma estrutura genética, indicando sucessão
microbiana no solo sob esta leguminosa. Já para as estruturas das
comunidades bacterianas desnitrificadoras do solo, necessita-se de mais
estudos para elucidar o agrupamento da capoeira junto a pastagem. Os
iniciadores usados neste trabalho para amplificar os genes AOB e Nirk, não
produziram resultados com sensibilidade e especificidade suficientes para
detectar as alterações das populações de bactérias nitrificadoras e
desnitrificadoras da serapilheira.
Palavras chave: diversidade microbiana, leguminosas arbóreas, sucessão
microbiana, estruturas genéticas.
65
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL DIVERSITY OF SOIL
MICROORGANISMS IN SOILS UNDER DIFFERENT PLANT COVER
ABSTRACT
Traditional methods of isolation and culture limits the analyses of the
microbial diversity in the environment, it is believed that approximately 10% of
these microrganisms can be cultivated. Nevertheless, a new perspective is
emerging due to the progresses of molecular biology, allowing the interpretation
of structural and functional diversity of soil microorganisms in an easier and
more sensitive way. This research was developed in Carrapeta farm, Conceição
de Macabú-RJ, to compare and estimate the diversity of bacterial communities,
in the soil of four areas, which are: two reforested areas with legume trees
(Acacia auriculiformis (acácia) and Mimosa caesalpinifolia (sabiá)),
regenerating secondary forest (capoeira) and pasture. The soil (four replicate
samples composed of fifteen sub-samples each, from a depth of 0-10 cm) and
litter (four samples) were collected in September 2005. The genetic structure of
the total bacterial community was assessed by coupling PCR amplification of
specific 16S rDNA targets, from soil DNA extracts, with the use of denaturing
66
gradient gel electrophoresis (DGGE). The genetic structures of the ammonia-
oxidizing (nitrifiers) and nitrate-reducing (denitrifiers) communities were
characterized by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel
electrophoresis (PCR-DGGE) targeting group-specific genes (CTO and Nirk,
respectively). The soil under regenerating secondary forest showed the lowest
bacterial diversity indexes in relation to the 16S DNAr, probably due to the
lowest soil carbon contents and anthropical effects on bacterial community
genetic structure in the other areas. The highest diversity indexes of denitrifiers
were detected in the litter samples collected in legume trees (acácia and sabiá),
while the pasture had the lowest value. The indexes values of capoeira and
sabiá areas did not present significant differences. The analysis Plymouth
Routine in Multivariate Ecological Research (Primer) revealed plant effects on
microbial communities. The soil fertility, nutritional and organic litter quality
influenced the genetic structure of the total bacterial community. In relation to
nitrifiers, similar genetic structures were obtained among the soil samples
collected in capoeira acácia areas, indicating bacterial succession in the
reforested area with this legume tree. Already for the denitrifiers communities,
more targeted studies are needed to elucidate the similar genetic structures
between capoeira and pasture areas. The primers used in this study, targeting
the AOB and NirK genes, showed low sensibility and specificity to detect the
alterations of the nitrifiers and denitrifiers communities in the litter samples.
Keywords: microbial diversity, legume trees, bacterial succession, genetic
structures.
67
6.2.1 INTRODUÇÃO
Até pouco tempo atrás, a maioria dos estudos de qualidade do solo era
relacionada à utilização de indicadores físicos e químicos do solo (Doran et al.,
1994). No entanto, embora muito útil para estimar o potencial produtivo do solo,
o uso desses atributos como indicadores de qualidade do solo é comprometido,
uma vez que as alterações nos atributos físicos e químicos do solo podem
levar anos para ocorrer de forma significativa, o que pode revelar tardiamente
um estado de degradação do solo (Carter, 1986). Waksam (1927), investigando
microrganismos e parâmetros físicos e químicos do solo, conclui que os
parâmetros biológicos (número de microrganismos, nitrificação, liberação de
CO
2
, decomposição da celulose, fixação biológica do nitrogênio, atividade
catabólica e potencial de oxidação-redução) deveriam ser utilizados para
avaliar a fertilidade do solo.
A diversidade microbiana, em virtude dos microrganismos estarem na
base da cadeia trófica e diretamente envolvidos nos ciclos dos nutrientes no
solo, tem sido bastante indicada como um importante indicador da qualidade do
solo (Rosado, 2000; Tiedje et al., 2001). Outro argumento a favor dessa
característica é o fato da diversidade microbiana manter-se naturalmente
inalterada ao longo do ano (Smit et al., 2001; Johnson et al., 2003).
Uma maior estabilidade do sistema tem sido associada a uma alta
diversidade da microbiota do solo. Nos ecossistemas com interferências
humanas, práticas como uso freqüente de fogo para renovação das
pastagens e cultivo do solo influenciam as populações da comunidade
microbiana, principalmente através das alterações do pH e da disponibilidade
de nutrientes no solo. O plantio de árvores leguminosas constitui-se uma
alternativa para corrigir a acidez e a baixa fertilidade do solo, propiciando um
ambiente favorável ao crescimento microbiano. Num ecossistema natural a
regulação interna de funcionamento é basicamente um produto da diversidade
biológica, que controla o fluxo de energia e nutrientes (Swift e Anderson, 1993).
A diversidade tem um papel importante na manutenção da estrutura e função
do ecossistema. Os ecossistemas naturais geralmente seguem o princípio de
que mais diversidade permite maior resistência à perturbação e à interferência.
Os ecossistemas com alta diversidade tendem a se recuperar mais
68
rapidamente da perturbação, e a restaurar o equilíbrio em seus processos de
ciclagem de nutrientes e fluxo de energia; em ecossistemas com baixa
diversidade, a perturbação pode provocar mais facilmente modificações
permanentes no funcionamento, resultando na perda de recursos do
ecossistema e em alterações na constituição de suas espécies.
O conhecimento do equilíbrio dinâmico e dos efeitos da atividade
antrópica sobre as populações na comunidade bacteriana é importante, dadas
as inúmeras funções que esses microrganismos desempenham. As análises de
atividade e estrutura das comunidades microbianas podem trazer grande
contribuição para a geração de índices de qualidade biológica do solo, que
podem ser utilizados para o monitoramento dos solos manejados. Embora as
pesquisas direcionadas para este tipo de informação sejam relativamente
intensas em solos de regiões temperadas, ainda são incipientes em relação
aos solos das regiões tropicais. No Brasil há poucos dados comparáveis entre
grupos funcionais de microrganismos presentes em solos de ecossistemas
naturais e em agroecossistemas.
Esse trabalho tem como objetivo estimar e comparar a diversidade de
comunidades bacterianas em solos sob plantio de Acácia auriculiformis
(acácia) e Mimosa caesalpinifolia (sabiá), comparadas às coberturas de
capoeira e pastagem.
69
6.2.2. MATERIAL E MÉTODOS
As caracterizações químicas das amostras de solo e da serapilheira
foram processadas conforme descritas no trabalho 1.
6.2.2.1 Extração de DNA a partir das amostras de solo e serapilheira
A extração de DNA das amostras coletadas foi realizada através do
método de extração direta com o "kit" de extração de DNA para solo
(PowerSoil
TM
DNA Isolation kit) da MOBIO (Carlsbad, California, USA). O “kit”
de extração é um sistema que consegue extrair e purificar DNA de tecidos
vegetais e animais, cultivos celulares, bactérias e fungos em um intervalo de
tempo relativamente curto. O “Kit” é composto de um “eppendorff” contendo
uma matriz de lise e esferas de cerâmica (que ajudam a quebrar a parede da
bactéria), filtros, seis frascos contendo soluções de lise celular específica para
as amostras ambientais e um frasco contendo uma solução de purificação.
O DNA foi extraído de acordo com as instruções do fabricante,
utilizando-se 0,5 g para as amostras de solo e 0,2 g para as amostras de
serapilheira. A eficiência da extração foi verificada através da quantificação de
DNA das amostras (Quadro 4) em espectrofotômetro Xenius, utilizando-se o kit
Picogreen® (Molecular Probes). Foi medida a absorbância a 280 nm de
comprimento de onda para verificar a presença de proteínas e calcular a
pureza do DNA extraído. A razão entre as leituras DO
260
/DO
280
indicou um
valor de pureza dentro da faixa ideal (1,8 ↔ 2,0). A razão abaixo de 1,6 indica
grande quantidade de proteínas e contaminantes.
6.2.2.2. Caracterização da comunidade total de bactérias
O DNA extraído foi amplificado por PCR com os iniciadores 338f e 518r
(Tabela 2), que abrangem a região V3 do DNA ribossômico 16S (Ovreas et al.,
1997). À extremidade 5’ do primeiro “primer” (338f) foi acrescentado um
grampo de GC (5’CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG
GCA CGG GGG G, Muyzer et al., 1993) para fins de utilização do produto de
PCR, obtido na amplificação nos subseqüentes experimentos de DGGE. Este
grampo de GC tem a função de estabilizar o comportamento de desnaturação
da dupla fita de DNA durante a eletroforese em gel com agentes de
desnaturantes do DGGE (Sheffield et al., 1989).
70
Quadro 4: Concentrações dos produtos de DNA extraídos a partir das
amostras de solo e serapilheira.
Solo Serapilheira
ng DNA µl
-1
ng DNA µl
-1
Amostra 1 acácia 10,92 7,26
Amostra 2 acácia 8,17 7,36
Amostra 3 acácia 8,79 16,37
Amostra 4 acácia 9,42 7,05
Amostra 1 capoeira 24,32 10,03
Amostra 2 capoeira 22,84 8,91
Amostra 3 capoeira 13,53 21,24
Amostra 4 capoeira 11,84 14,25
Amostra 1 pastagem 13,59 7,15
Amostra 2 pastagem 13,11 10,52
Amostra 3 pastagem 17,31 14,82
Amostra 4 pastagem 9,13 7,52
Amostra 1 sabiá 6,25 9,41
Amostra 2 sabiá 11,89 8,19
Amostra 3 sabiá 7,77 13,15
Amostra 4 sabiá 6,86 15,34
Tabela 2: Seqüência dos iniciadores utilizados para a amplificação da
comunidade total de bactérias
Iniciadores Seqüência Referências
338f-GC 5´ - ACTCCTACGGGAGGCAGCAG – 3´ Ovreas et al., 1997
518r 5´ - ATTACCGCGGCTGCTGG – 3´ Ovreas et al., 1997
A amplificação por PCR foi realizada em um aparelho termociclador (T
personal, Biometra, Göttingen, Germany). Cada mistura de reação (volume
final de 25 µl) foi constituída de 30 ng de DNA, 0,5 µM de cada primer, 200 µM
de cada deoxinucleosídeo trifosfato, 1,5 mM de MgCl
2
, 5 µl de tampão (10X)
para a enzima Taq DNA polimerase, 2,5 µl da proteina T4 e 2 U de Taq
polimerase (BIOLINE). A reação consistiu de uma etapa inicial de desnaturação
do DNA a 94
o
C por 5 min e depois foi utilizado um esquema de PCR
“touchdown”, nos cinco primeiros ciclos, para minimizar a ocorrência de
produtos inespecíficos (Muyzer et al., 1993). Nesse esquema, a temperatura
inicial de ligação dos “primers” ao DNA molde era de 10
o
C superior à
temperatura ótima de ligação dos iniciadores (65
o
C) e essa temperatura foi
diminuída de 1
o
C a cada ciclo até que a temperatura ideal (55
o
C) fosse
atingida; então 15 ciclos adicionais foram realizados a 55
o
C. A extensão dos
“primers” foi realizada a 72
o
C por 1 min a cada ciclo e uma extensão final foi
feita a 72
o
C por 10 minutos.
71
O DNA amplificado foi analisado através da técnica de DGGE,
utilizando-se um equipamento “D-Code
TM
Universal Mutation Detection System”
(Bio-Rad Richmond, USA). Os produtos de PCR foram aplicados diretamente
em géis contendo 8% (wt/vol) de poliacrilamida e TAE (1X). O gradiente linear
de desnaturantes (uréia e formamida) foi de 30 a 60%. Os gradientes foram
formados a partir de soluções estoque de poliacrilamida (8%), contendo 0 a
100% de desnaturantes (100% corresponde a 7M de uréia e 40% de
formamida). O tempo de eletroforese foi de 16h a 60
o
C e 75V. Após a
eletroforese, os géis foram corados por 30 min com SYBR Green I (Molecular
Probes), fotografados sob luz UV, utilizando-se um sistema de captura de
imagem “Biocapt
MW
” (Vilber-Lourmat, France) e analisados através do
programa Gel Compar II software (Applied Maths, Kortrijk, Belgium).
6.2.2.3. Caracterização da comunidade de bactérias nitrificadoras
A estrutura da comunidade de microrganismos amonificadores foi
avaliada através das técnicas de tipagem infra-específica (PCR-DGGE). A
primeira etapa da amplificação foi feita com o par de iniciadores CTO189f-GC e
CTO654r (Kowalchuk et al., 1997) (Tabela 3), específico para o grupo ß-
Proteobacteria. A segunda etapa consistiu de um nested-PCR, utilizando-se os
iniciadores 357f-GC e 518r (Muyzer et al., 1993) (Tabela 4) visando
caracterizar a população de Eubactéria. As reações de PCR foram realizadas
de acordo com a metodologia descrita por Freitag e Prosser (2003), onde um
grampo de GC (Tabela 5), necessário aos experimentos de DGGE, foi
adicionado aos iniciadores. O DNA amplificado foi analisado através da técnica
de DGGE, como descrito no 6.2.2.2.
Tabela 3: Seqüência dos iniciadores utilizados para a amplificação do ß-
Proteobacteria
Iniciadores Seqüência Referências
CTO189f-GC 5´ -GGAGRAAAGCAGGGGATCG- 3´ Freitag e Prosser,
2003
CTO654r 5´ -CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC- 3´ Freitag e Prosser,
2003
Tabela 4: Seqüência dos iniciadores utilizados para a amplificação de
Eubacteria
Iniciadores Seqüência Referências
357f-GC 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA
CGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′
Muyzer, 1993
518r 5´ -GTATTACCGCGGCTGCTGG-3´ Muyzer, 1993
72
Tabela 5: Seqüência do grampo de GC de 33 bases utilizadas nas análises de
DGGE.
Seqüência do grampo de GC Referências
5´-CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG-3´ Freitag e Prosser,
2003
6.2.2.4. Caracterização da comunidade de bactérias desnitrificadoras
A estrutura genética da comunidade bacteriana de vida livre,
responsável pela desnitrificação de nitrogênio, foi avaliada através da técnica
PCR-DGGE. Para a amplificação de fragmentos específicos do gene nirK,
utilizou-se o método de Liu et al. (2003). À extremidade 5’ de um dos pares de
iniciadores, “reverse primer”, foi acrescentado um grampo de GC para fins de
utilização do produto de PCR obtido na amplificação nos subseqüentes
experimentos de DGGE. Procedeu-se a 2 series de amplificações por PCR. A
primeira reação consistiu de uma mistura de 30 ng de DNA, 1 µM de cada
primer, 200 µM de cada deoxinucleosídeo trifosfato, 1,5 mM de MgCl
2
, 5 µl de
tampão para a Taq DNA polimerase, 1 µl da proteina T4 e 1,75 U de Taq
polimerase (Qbiogene). Os amplicons resultantes desta amplificação foram
utilizados como moldes para uma nova amplificação.
Os produtos de PCR resultantes foram analisados em géis contendo 6
% (wt/vol) de poliacrilamida e TAE (1X). O gradiente linear de desnaturantes
(uréia e formamida) foi de 35 a 65%. Os gradientes foram formados a partir de
soluções estoque de poliacrilamida (6%) contendo 0 a 100% de desnaturantes
(100% corresponde a 7M de uréia e 40% de formamida). O tempo de
eletroforese foi de 4 horas e 30 minutos, a 60
o
C e 150V.
6.2.2.5. Análises estatísticas
A análise visual dos géis de DGGE foi feita com o auxílio de índices de
diversidade. Os índices escolhidos para a avaliação da diversidade genotípica
das comunidades bacterianas, nas diferentes áreas, foram os de Shannon-
Weaver (1949), baseada na riqueza de espécies presentes, e de Simpson
(1949), baseada no grau de dominância (Odum, 1988). Esses índices são
ferramentas poderosas para o estudo do comportamento da diversidade de
comunidades microbianas permitindo uma avaliação da dinâmica populacional
frente a diferentes manejos. Neste sentido, os índices têm sido citados como
indicadores adequados para aferir os efeitos da atividade antrópica e, ou
estresses ambientais numa comunidade simples, ou selecionar o melhor
73
exemplo fora de um grupo de habitats similares para propostas de conservação
(Magurran, 1988). Além disso, esses índices apresentam cálculos simples e
podem ser úteis, quando empregados em áreas delimitadas, no espaço e no
tempo, e que apresentem espécies identificadas. Esses índices combinam o n°
de espécies (S) e o total do n° de individuos (N). Neste trabalho, a riqueza de
espécies foi determinada pelo número de bandas presentes em cada amostra e
o total do n° de indivíduos pela intensidade das ba ndas. Os resultados dos
índices de diversidade (Shannon e Simpson) foram submetidos à análise de
variância (p≤0,05). As comparações de médias foram feitas através do teste de
Duncan (p≤0,05), utilizando-se o pacote estatístico SAEG 9.0.
A similaridade entre as amostras também foi determinada com base na
posição (altura) e presença (ou ausência) das bandas detectadas para fins de
interpretação dos perfis DGGE.
Na comparação das estruturas das comunidades microbianas entre as
áreas, utilizou-se a análise de escalonamento multidimensional (MDS), para as
amostras. A análise de proximidade MDS é um método de ordenação
multivariado, com base numa matriz de similaridade, gerando uma
representação gráfica da distância entre os perfis gerados pela técnica de
DGGE. O stress é um índice resultante da análise de MDS e representa o
ajuste necessário para representar as relações entre as amostras. De acordo
com Clarke e Warnick (1994), um stress de 0,1 corresponde a uma boa
ordenação. Para averiguar se há diferenças em nível de 5% de significância
entre as comunidades microbianas das diferentes coberturas em estudo, foi
aplicada a análise de similaridade ANOSIM unifatorial. A matriz foi calculada
através da distância euclidiana normalizada, sem transformação prévia e com
padronização dos dados, seguindo as recomendações de Clarke e Warnick
(1994). Estas análises foram geradas pelo pacote estatístico Primer 5.2.9
(Plymouth Routine in Multivariate Ecological Research –Plymouth University).
A análise de agrupamento hierárquico foi feita com o programa Primer
5.2.9. O método “Simple matching” foi escolhido para a determinação da matriz
de similaridade porque considera as semelhanças e diferenças entre bandas
comparadas e serviu de base para a realização do dendrograma.
Calculou-se equações de regressão linear simples através do pacote
estatístico SAEG 9.0 para avaliar o efeito das características químicas do solo
e da serapilheira sobre a estrutura das comunidades microbianas.
74
6.2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A avaliação da diversidade de bactérias tem sido fortemente
influenciada pelo uso de técnicas moleculares. A reação da polimerase em
cadeia combinada com DGGE, utilizando seqüências iniciadoras específicas
para famílias, gêneros e espécies de interesse, tem sido utilizada para a
análise da diversidade e da dinâmica de comunidades microbianas do solo, em
função de variações ambientais e, ou antrópicas. Neste estudo, os géis obtidos
a partir de amostras de solo e serapilhera coletadas nas diferentes coberturas
vegetais permitiram a visualização de diferentes perfis genéticos de bactérias,
evidenciando diferenças nas comunidades microbianas.
6.2.3.1. Diversidade genética e estrutura da comunidade total de
bactérias nos compartimentos solo e serapilheira
6.2.3.1.1 Análise visual dos géis
A estrutura da comunidade microbiana total foi caracterizada através
da análise do perfil de bandas em experimento de amplificação dos genes de
16S ribossomal e PCR-DGGE. Pela comparação dos perfis gerados entre as
diferentes áreas, pode-se observar diferenças relativas à diversidade
populacional (figura 6).
A análise dos padrões eletroforéticos revelou a presença de bandas
comuns entre todas as amostras avaliadas, sendo trinta bandas para as
amostras de solo e quarenta e nove para as amostras de serapilheira (Quadros
5 e 6). Doze bandas foram visualizadas apenas na acácia, pastagem e sabiá
(APS) para as amostras de solo (Quadro 5), e três, para as amostras de
serapilheira (Quadro 6). Considerando a capoeira como referência, foi
observada, para as amostras de solo, a ausência de onze bandas na acácia
(CPS), duas, na pastagem (ACS) e uma, no sabiá (ACP) (Quadro 5). Já para
as amostras de serapilheira, notou-se a ausência de dez bandas na acácia
(CPS), uma, na pastagem (ACS) e uma, no sabiá (ACP) (Quadro 6).
Entretanto, não foi encontrada nenhuma banda específica a uma determinada
área (Quadros 5 e 6), o que ressalta certa homologia entre as espécies,
sugerindo que as populações de bactérias se originaram de um grupo ancestral
comum.
75
A – Estrutura genética da comunidade bacteriana total do solo
B – Estrutura genética da comunidade bacteriana total da
serapilheira
Figura 6:
Perfil de bandas obtido pela análise de DGGE dos fragmentos do DNAr 16S amplificados com primers 338f e 518r , comparando amostras de
solo (A) e serapilheira (B) das quatro diferentes coberturas vegetais.
A1:amostra 1 da acácia; A2: amostra 2 da acácia; A3: amostra 3 da acácia; A4: amostra 4 da acácia; C1: amostra 1 da capoeira; C2: amostra 2 da
capoeira; C3: amostra 3 ca capoeira; C4: amostra 4 da capoeira; P1: amostra 1 da pastagem; P2: amostra 2 da pastagem; P3: amostra 3 da pastagem; P4:
amostra 4 da pastagem; S1: amostra 1 da sabiá; S2: amostra 2 da sabiá; S3: amostra 3 da sabiá e S4: amostra 4 da sabiá.
A1
A2
A3
A4
C1
C2
C3
C4
P1
P2
P3
P4
S1
S2
S3
S4
A1
A2
A3
A4
C1
C2
C3
C4
P1
P2
P3
P4
S1
S2
S3
S4
76
Quadro 5: Padrões de bandas do DGGE 16S, comparando amostras de solo das
diferentes coberturas vegetais.
A1
A2 A3 A4 C1 C2 C3 C4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4
L1
PS PS PS PS PS PS PS PS
L2
APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L3
PS PS PS PS PS PS PS
L4
APS APS APS APS APS APS APS APS
L5
PS PS PS PS PS
L6
APS APS APS APS APS APS APS
L7
AP AP AP AP AP
L8
APS APS APS APS APS APS APS APS
L9
APS APS APS APS APS APS
L10
APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L11
APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L12
APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L13
PS PS PS PS PS PS PS
L14
APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L15
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L16
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
L17
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L18
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L19
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L20
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L21
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L22
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L23
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L24
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L25
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
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L26
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
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ACPS
ACPS
L27
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
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L28
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L29
PS PS PS PS
L30
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L31
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L32
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L33
CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L34
ACPS
ACPS
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ACPS
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ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
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L35
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L36
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L37
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L38
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L39
CPS CPS CPS CPS
L40
APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L41
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L42
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L43
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L44
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
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L45
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L46
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L47
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L48
CP CP CP CP CP CP CP
L49
PS PS PS PS PS
L50
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L51
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
77
A1
A2 A3 A4 C1 C2 C3 C4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4
L51
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L52
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L53
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L54
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L55
AS AS AS AS AS AS
L56
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L57
APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L58
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L59
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L60
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L61
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L62
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L63
AS AS AS AS
L64
CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L65
APS APS APS APS APS APS APS APS
L66
APS APS APS APS APS APS
L67
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L68
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
PS: bandas presentes apenas na pastagem e no sabiá; APS: bandas presentes apenas na acácia,
na pastagem e no sabiá; AP: bandas presentes apenas na acácia e na pastagem; ACPS: bandas
presentes na acácia, na capoeira, na pastagem e no sabiá; AS: bandas presentes apenas na
acácia e no sabiá; CPS: bandas presentes apenas na capoeira, na pastagem e no sabiá; ACS:
bandas presentes apenas na acácia, na capoeira e no sabiá e uma no sabiá; ACP: bandas
presentes apenas na acácia, na capoeira e no sabiá; CP: bandas presentes apenas na capoeira e
na pastagem.
78
Quadro 6: Padrões de bandas do DGGE 16S, comparando amostras de serapilheira
das diferentes coberturas vegetais.
A1 A2 A3 A4 C1 C2 C3 C4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4
L1
1 PS PS PS
L2
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L3
CPS CPS CPS CPS
L4
CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L5
CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L6
APS APS APS APS APS
L7
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L8
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L9
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L10
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L11
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L12
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
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L13
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
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L14
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
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L15
ACPS
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ACPS
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L16
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ACPS
L17
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L18
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L19
APS APS APS APS APS APS APS APS
L20
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
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L21
ACPS
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L22
ACPS
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ACPS
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L23
ACPS
ACPS
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ACPS
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L24
ACPS
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L25
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L26
ACPS
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L27
ACPS
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L28
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L29
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L30
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
1
L31
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L32
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L33
ACPS
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L34
ACPS
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ACPS
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ACPS
L35
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L36
ACPS
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ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L37
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L38
ACPS
ACPS
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L39
ACPS
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L40
ACPS
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L41
ACPS
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L42
ACPS
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L43
ACPS
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L44
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L45
ACPS
ACPS
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ACPS
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L46
CPS CPS CPS CPS CPS
L47
CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L48
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
L49
APS APS APS APS APS APS APS APS
L50
ACPS
ACPS
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L51
ACPS
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L52
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
79
A1 A2 A3 A4 C1 C2 C3 C4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4
L53
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L54
AP AP AP 1 1
L55
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L56
ACPS
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L57
ACPS
ACPS
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ACPS
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L58
ACPS
ACPS
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L59
ACPS
ACPS
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L60
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L61
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L62
CS CS CS CS
L63
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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L64
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
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ACPS
ACPS
L65
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L66
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
L67
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L68
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
1 ACPS
L69
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L70
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
PS: bandas visualizadas apenas na pastagem e no sabiá; CPS: bandas visualizadas apenas na
capoeira, na pastagem e no sabiá; APS: bandas visualizadas apenas na acácia, na pastagem e no
sabiá; ACPS: bandas visualizadas na acácia, na capoeira, na pastagem e no sabiá; AP: bandas
visualizadas apenas na acácia e na pastagem; ACS: bandas visualizadas apenas na acácia, na
capoeira e no sabiá e uma no sabiá; AP: bandas visualizadas apenas na acácia e na pastagem;
CS: bandas visualizadas apenas na capoeira e no sabiá.
80
A diversidade da comunidade microbiana total calculada atráves do
índice de Shannon-Weaver foi maior nos solos sob acácia, pastagem e sabiá, e
menor, na capoeira (Quadro 7), sugerindo um possível efeito do impacto ambiental
sobre a comunidade bacteriana do solo (mutações genéticas, deleções, etc)
causado pelo desmatamento ou tipo de uso da terra. Estes resultados são
diferentes dos encontrados por Borneman e Triplett (1997) que observaram maior
diversidade do 16S DNAr na comunidade microbiana do solo em área de mata
nativa da Amazônia, quando comparada a uma área de pastagem. Entretanto, não
foi encontrada diferença significativa entre as amostras de serapilheira (Quadro 7).
O valor do índice de Simpson foi estatisticamente igual entre as áreas
estudadas (Quadro 7), revelando a ausência de dominância de espécies tanto nas
amostras de solo quanto nas de serapilheira. Assim, este resultado demonstra que
a dominância de espécies de microrganismos não é tão importante para a
manutenção da diversidade, isso porque a abundância de algumas espécies
reflete, de forma mais imediata, a flutuação microbiana de curto prazo; e a
diversidade revela o equilíbrio entre os diversos organismos e os domínios
funcionais no solo (Kennedy, 1999; Lavelle, 2000).
Quadro 7: Índices de diversidade dos perfis DGGE comunidade bacteriana total do
solo e da serapilheira das diferentes coberturas estudadas de acordo com
Shannon e com Simpson.
Solos Serapilheira
Sitios Índice de
Shannon
Índice de
Simpson
Índice de
Shannon
Índice de
Simpson
Acácia 3,2 a 0,96 a 3,0 a 0,93 a
Sabiá 3,1 a 0,94 a 3,1 a 0,91 a
Capoeira 2,9 b 0,94 a 3,0 a 0,91 a
Pastagem 3, 2 a 0,95 a 3,1 a 0,94 a
CV % 3,57 1,16 8,24 4,46
Médias (de quatro repetições) seguidas de pelo menos uma mesma letra em cada coluna,
não diferem entre si pelo teste de Duncan em nível de 5% de probabilidade. CV:
coeficiente de variação.
No presente trabalho, a capoeira considerada como um solo sob uma
vegetação em clímax e que não sofreu alteração recente pelo homem, apresentou
as comunidades bacterianas mais adaptadas ao meio ambiente, ou seja, um
sinergismo maior que as áreas sob pastagem e plantio de leguminosas. Um solo
com teor elevado de matéria orgânica tende a manter a população microbiana mais
estável ao longo do tempo, provavelmente, em decorrência da riqueza de nichos
ecológicos, pela disponibilidade das fontes de carbono (De Fede et al., 2001;
Grayston et al., 2001). Ao contrário, o panorama para um tal equilíbrio é quase
81
insignificante em ambientes “transformados”, como nos solos sob pastagem,
devido à remoção dos resíduos vegetais depositados na superfície do solo. Nestes
sistemas, a variação da diversidade microbiana está diretamente ligada ao regime
hídrico, ao clima da região (temperatura) e à qualidade dos resíduos vegetais
aportados (Rogers e Tate III, 2001; Tiedje et al., 2001). A variação da diversidade
microbiana é resultado da dinâmica de populações de determinados grupos de
bactérias do solo, proporcionada por mecanismos de transferência e, em
consequência, recombinações genéticas. O aumento na diversidade genética de
bactérias na acácia e no sabiá, indica que possa existir uma correlação entre a
diversidade microbiana e as espécies leguminosas. Apesar destas áreas estarem
em seus primeiros estágios de sucessão, os processos biológicos fixadores de
nitrogênio podem estar cooperando para uma maior disponibilidade de nutrientes
para o crescimento bacteriano.
Assim, estes resultados mostram que um solo de ecossistema original
pode ter um equilíbrio que um sistema com interferência antrópica não possui,
existindo o consenso de que a diversidade microbiana está diretamente
relacionada à estabilidade do ecossistema (Kennedy, 1999).
6.2.3.1.2. Dendrograma obtido a partir da análise dos perfis de bandas
16S-DGGE da comunidade bacteriana total do solo e da serapilheira
A partir dos géis obtidos por meio de amplificação dos genes de 16S
ribossomal e PRC-DGGE, foi realizada uma análise de agrupamento com perfis
das amostras das diferentes coberturas, de modo a se determinar o nível de
similaridade das comunidades bacterianas características de cada uma. As
matrizes de similaridade construídas procuram fornecer uma idéia global da
semelhança genética das populações microbianas dentro (amostras da mesma
área) e entre as diferentes coberturas. Para tanto, foi utilizado o programa Primer
5.2.9. que, a partir da intensidade e do número de bandas dos géis, formou grupos.
Na figura 7, encontra-se o dendrograma gerado pelo método UPGMA a
partir das amostras de solo. O perfil eletroforético das bandas no DGGE revela alta
similaridade entre amostras coletadas numa mesma cobertura, com 78, 74, 69 e
68% de similaridade, para acácia, capoeira, pastagem e sabiá, respectivamente.
Os valores de similaridade entre áreas, foram baixos, denotando a existência de
quatro grupos genotípicos: sabiá (G1), acácia (G2), capoeira (G3) e pastagem
(G4), baseado na caracterização do 16S DNAr (Figura 7).
82
Figura 7:
Dendrograma gerado através dos programas GelCompar e Primer (utilizando-se
coeficiente de Person e método de análise cluster UPGMA) para analisar os perfis de bandas
em experimento de amplificação do gene de 16S ribossomal e PCR-DGGE das amostras de solo.
Legenda das caneletas: A
1
– Amostra 1 do plantio de acácia; A
2
– Amostra 2 do plantio de acácia;
A
3
– Amostra 3 do plantio de acácia; A
4
– Amostra 4 do plantio de acácia; C
1
– Amostra 1 da
capoeira; C
2
– Amostra 2 da capoeira; C
3
– Amostra 3 da capoeira; C
4
– Amostra 4 da capoeira; P
1
–
Amostra 1 da pastagem; P
2
– Amostra 2 da pastagem; P
3
– Amostra 3 da pastagem; P
4
– Amostra 4
da pastagem; S
1
– Amostra 1 do plantio de sabiá; S
2
– Amostra 2 do plantio de sabiá; S
3
– Amostra
3 do plantio de sabiá; S
4
– Amostra 4 do plantio de sabiá.
O dendrograma, apresentado na figura 8, foi obtido a partir das amostras
de serapilheira. Observou-se, também, alta similaridade entre amostras de uma
mesma área com aproximadamente 71, 55, 59 e 66% de similaridade para acácia,
capoeira, pastagem e sabiá, respectivamente. Os perfis de bandas do DGGE se
separaram a aproximadamente 33% de similaridade, mostrando a existência de
três grupos. Os grupos G1 e G2 formados pelas áreas, capoeira e pastagem,
respectivamente. O grupo G3, pelas leguminosas (acácia e sabiá) (Figura 8). É
possível que a semelhança entre a acácia e o sabiá seja relacionada à introdução
de espécies de bactérias não nativas do solo do ecossistema original, uma vez que
as mudas de sabiá e acácia foram produzidas em áreas diferentes das da coleta.
G1
G3
G2
G4
83
Figura 8:
Dendrograma gerado através dos programas GelCompar e Primer (utilizando-se
coeficiente de Person e método de análise cluster UPGMA) para analisar os perfis de bandas
em experimento de amplificação do gene de 16S ribossomal e PCR-DGGE das amostras de
serapilheira.
Legenda das caneletas: A
1
– Amostra 1 do plantio de acácia; A
2
– Amostra 2 do plantio de acácia;
A
3
– Amostra 3 do plantio de acácia; A
4
– Amostra 4 do plantio de acácia; C
1
– Amostra 1 da
capoeira; C
2
– Amostra 2 da capoeira; C
3
– Amostra 3 da capoeira; C
4
– Amostra 4 da capoeira; P
1
–
Amostra 1 da pastagem; P
2
– Amostra 2 da pastagem; P
3
– Amostra 3 da pastagem; P
4
– Amostra 4
da pastagem; S
1
– Amostra 1 do plantio de sabiá; S
2
– Amostra 2 do plantio de sabiá; S
3
– Amostra
3 do plantio de sabiá; S
4
– Amostra 4 do plantio de sabiá.
O Quadro 8 mostra a comparação, pelo método ANOSIM, da
dissimilaridade entre as áreas, tendo este parâmetro sido estatisticamente
diferente tanto para amostras de solo como de serapilheira, sugerindo influência da
estrutura da comunidade microbiana total pelo tipo de uso da terra. Muitos estudos
já demonstraram a influência da espécie de planta sobre a comunidade microbiana
associada a ela (Germida et al., 1998; Kaiser et al., 2001; Smalla et al., 2001;
Bertrand et al., 2001; Garbeva et al., 2004; Patra et al., 2005). Além disso, as
comunidades vegetais podem modificar as condições dos micro-ambientes
ocupados pelos microrganismos que, por conseguinte, alteram as estruturas das
diversas populações na comunidade (Drozdowicz, 1991; Siqueira et al., 1994).
Quadro 8: Comparação dos perfis de bandas DGGE comunidade bacteriana total
do solo e da serapilheira a partir das amostras coletadas em diferentes coberturas
vegetais. % de dissimilaridade (ANOSIM).
Solo Serapilheira
capoeira pastagem Sabiá
capoeira pastagem
sabiá
Acácia 96* 81* 97* acácia 83* 64* 47*
Capoeira
59* 98* capoeira
89* 87*
Pastagem
88* pastagem
80*
* significativo p < 0,05 NS não significativo
G1
G2
G3
84
As regressões lineares negativas da estrutura da comunidade microbiana
total do solo com os teores de carbono orgânico e nitrogênio total do solo,
nitrogênio total da serapilheira e positivas com a relação C:N da serapilheira
(Quadro 9) são modelos preditivos que explicam a influência direta da fertilidade do
solo sobre as comunidades microbianas do solo. Assim, em solos com elevados
teores de carbono e nitrogênio, como nas matas naturais, há seleção de
estrategistas do tipo “k”, que é a seleção de espécies para as quais, atingir um
tamanho estável e equilibrado, representa uma estratégia bem sucedida. Nos solos
com baixo teor de nutrientes ou alto teor de substratos recalcitrantes (alta relação
C:N da serapilheira), também ocorre a seleção do tipo “k”, indicativo de bactérias
com baixo potencial de crescimento, mas com alta capacidade de competir por
substratos.
Quadro 9: Equações de regressão linear simples
entre
os valores de estrutura da
comunidade microbiana total e as características químicas do solo e da
serapilheira
. n=16
Regressões R
2
16S solo = 0,760 Na solo + 19,449 0,29*
16S solo = 0,302 K solo + 34,064 0,27*
16S solo = - 5,101 N total solo + 59,287 0,20*
16S solo = - 0,580 C-org solo + 64,743 0,18*
16S solo = - 1,343 N total serapilheira + 62,732 0,32*
16S solo = 0,910 C:N serapilheira + 21,582 0,40**
16S serapilheira = 0,691 Na solo + 22,367 0,30*
** significativo a nível de 1% de probabilidade; * significativo a nível de 5% de probabilidade; 16S:
comunidade microbiana total; Na: sódio; K: potássio; N total: nitrogênio total; C-org.: carbono
orgânico; C:N: relaçao entre carbono orgânico e nitrogênio total
Já para a estrutura da comunidade microbiana total da serapilheira, o sódio
é um dos fatores que explicam a dissimilaridade genética observada entre as
diferentes coberturas vegetais (Quadro 9). Assim, no presente trabalho, acredita-se
que, nos solos com alta disponibilidade de sódio (Na) e Potássio (K), há uma
seleção de microrganismos estrategistas do tipo “r”, isto é, máximo crescimento
populacional, produzindo vasto número de descendentes de uma só vez ou em
curtos intervalos. Esta estratégia permite uma próxima geração para manter a
espécie.
Outras variáveis, não avaliadas neste trabalho e que poderiam contribuir
para esclarecer as diferenças das estruturas genéticas de comunidades
microbianas, são a radiação solar e a umidade. Estes fatores ambientais são
muitas vezes responsáveis pelas alterações genéticas, tais como as mutações e
deleções. Além disso, a elevação de temperatura e a perda de umidade
85
proporcionam uma seleção de microrganismos do tipo “l”, que é a seleção de
organismos adaptados (Panilov, 1999). Baseado nos estudos de Reiners et al.
(1994), o desmatamento das matas nativas altera a vegetação e as propriedades
do solo. Neste contexto, as comunidades microbianas do solo, além de sofrerem
influências por diferenças na cobertura vegetal, também podem ser afetadas por
modificações nas condições do meio (Colozzi Filho et al., 1999; Bertrand et al.,
2001; Garbeva et al., 2004).
6.2.3.2. Diversidade genética e estrutura das comunidades nitrificadoras
nos compartimentos solo e serapilheira
6.2.3.2.1. Análise visual dos géis
A figura 9 mostra as separações dos produtos de PCR gerados com a
amplificação utilizando iniciadores para o gene AOB (“ammonia-oxidizing bacteria”
= bactérias oxidadoras de amoníaco) das comunidades bacterianas nitrificadoras
das amostras de solo e serapilheira avaliadas. Os géis obtidos apresentaram um
perfil mais simples comparado ao do gene 16S DNAr, permitindo identificar
visualmente padrões diferentes da comunidade bacteriana, com a existência de
bandas específicas para determinadas áreas e de fácil identificação no gel, além
da existência de bandas comuns a todos os tratamentos.
Dez bandas (ACPS) foram comuns entre as amostras de solos (Quadro
10) e quarenta e cinco bandas, entre as amostras de serapilheira (Quadro 11).
Considerando a capoeira como referência, foi observada, para as amostras de
solo, a ausência de três bandas na pastagem (ACS) e duas no sabiá (ACP)
(Quadro 10). Enquanto nas amostras de serapilheira, notou-se a ausência de três
bandas para acácia (CPS), quatro no sabiá (ACP) e cinco na pastagem (ACS)
(Quadro 11). Outro ponto relevante é a presença de uma banda apenas na acácia,
pastagem e sabiá (APS) para as amostras de solo (Quadro 10), e duas, para as
amostras de serapilheira (Quadro 11). Verificou-se, para as amostras de solo, a
existência de três bandas específicas para cada uma das áreas capoeira (C), sabiá
(S), pastagem (P), e seis bandas, para à acácia (A) (Quadro 10), diferente do que
foi observado para a comunidade bacteriana total. Estes resultados sugerem uma
certa evolução, ou seja, houve transformação de populações das comunidades
nitrificadoras ao longo do tempo, ou ainda, alterações na freqüência dos genes
dessas populações.
86
A – Estrutura genética das comunidades nitrificadoras do solo
B – Estrutura genética das comunidades nitrificadoras da
serapilheira
Figura 9:
Perfil de bandas obtido pela análise de DGGE dos fragmentos do gene AOB amplificado com o par de iniciadores CTO189f-GC e CTO654r e
com os primers 357f-GC e 518r, comparando amostras de solo (A) e serapilheira (B) das quatro diferentes coberturas vegetais.
A1:amostra 1 da acácia; A2: amostra 2 da acácia; A3: amostra 3 da acácia; A4: amostra 4 da acácia; C1: amostra 1 da capoeira; C2: amostra 2 da
capoeira; C3: amostra 3 ca capoeira; C4: amostra 4 da capoeira; P1: amostra 1 da pastagem; P2: amostra 2 da pastagem; P3: amostra 3 da pastagem; P4:
amostra 4 da pastagem; S1: amostra 1 da sabiá; S2: amostra 2 da sabiá; S3: amostra 3 da sabiá e S4: amostra 4 da sabiá.
A1 A2 A3 A4
C1
C2
C3
C4
P1
P2
P3
P4
S1
S2
S3
S4
A1
A2
A3
A4
C1
C2
C3
C4
P1
P2
P3
P4
S1
S2
S3
S4
87
Quadro 10: Padrão de bandas DGGE-AOB, comparando amostras de solo das
diferentes coberturas vegetais.
A1 A2 A3 A4 C1 C2 C3 C4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4
L1
C
L2
S
L3
S
L4
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L5
A
L6
S
L7
AS AS AS
L8
PS PS PS PS
L9
PS 1
L10
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L11
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L12
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L13
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L14
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L15
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L16
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L17
CP CP CP CP
L18
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L19
PS PS PS PS PS
L20
P
L21
APS APS APS APS
L22
APS APS
L23
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L24
APS APS APS APS APS APS
L25
AP AP AP AP AP
L26
A
L27
AC AC AC AC AC AC AC
L28
ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L29
ACS ACS ACS ACS ACS
L30
AC AC
L31
AP AP AP
L32
ACS ACS ACS ACS ACS
L33
CPS CPS CPS CPS
L34
AC AC AC AC AC
L35
C C
L36
AS AS AS
L37
A
L38
AP AP AP AP AP AP
L39
A A A
L40
A
L41
A A A
L42
C
L43
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L44
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L45
AC AC AC AC AC AC AC
L46
AC AC AC AC AC
L47
CP CP CP CP
L48
ACP ACP ACP ACP ACP ACPS
L49
CP CP CP CP
A: banda visualizada apenas na acácia; C: banda visualizada apenas na capoeira; P: banda visualizada apenas na
pastagem; S: banda visualizada apenas no sabiá; AC: bandas visualizadas apenas na acácia e na capoeira; AP:
bandas visualizadas apenas na acácia e na pastagem; PS: bandas visualizadas apenas na pastagem e no sabiá;
AS: bandas visualizadas apenas na acácia e no sabiá; CP: bandas visualizadas apenas na capoeira e na pastagem;
ACP: bandas visualizadas apenas na acácia, na capoeira e na pastagem; ACS: bandas visualizadas apenas na
acácia, na capoeira e no sabiá; APS: bandas visualizadas apenas na acácia, na pastagem e no sabiá; CPS: bandas
visualizadas apenas na capoeira, na pastagem e no sabiá; ACPS: bandas visualizadas em todas as coberturas.
88
Quadro 11: Padrão de bandas DGGE-AOB, comparando amostras de serapilheira das
diferentes coberturas vegetais.
A1 A2 A3 A4 C1 C2 C3 C4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4
L1
AP AP AP
L2
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L3
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L4
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L5
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L6
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L7
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L8
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L9
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L10
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L11
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L12
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L13
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L14
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L15
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L16
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L17
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L18
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L19
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L20
CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L21
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L22
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L23
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L24
PS PS PS PS
L25
AP AP AP AP AP
L26
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L27
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L28
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L29
APS APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L30
APS APS APS APS APS APS APS APS
L31
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L32
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L33
AP AP AP AP
L34
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L35
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L36
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L37
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L38
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L39
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L40
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L41
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L42
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L43
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L44
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L45
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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L46
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L47
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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L48
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
L49
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L50
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L51
ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L52
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L53
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L54
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L55
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
89
L56
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L57
AP AP AP AP AP
L58
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L59
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L60
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L61
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L62
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L63
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L64
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L65
PS PS PS PS
L66
ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L67
ACP ACP ACP ACP ACP
AP: bandas visualizadas apenas na acácia e na pastagem; PS: bandas visualizadas apenas na
pastagem e no sabiá; PS: bandas visualizadas apenas na pastagem e no sabiá; ACP: bandas
visualizadas apenas na acácia, na capoeira e na pastagem; ACS: bandas visualizadas apenas na
acácia, na capoeira e no sabiá e uma no sabiá; APS: bandas visualizadas apenas na acácia, na
pastagem e no sabiá; CPS: bandas visualizadas apenas na capoeira, na pastagem e no sabiá;
ACPS: bandas visualizadas na acácia, na capoeira, na pastagem e no sabiá.
90
Os índices de diversidade (Shannon e Simpson) dos perfis de polimorfismos
do gene AOB, obtidos a partir das amostras de solo e serapilheira, foram
estatisticamente iguais entre as áreas avaliadas (Quadro 12), indicando padrões de
adaptação a ambientes extremos similares das comunidades bacterianas
nitrificadoras. Estes resultados mostram que as flutuações ambientais têm um
grande papel na estrutura da comunidade bacteriana nitrificadora, enquanto o tipo
de planta apresenta um papel muito menos significativo.
Quadro 12: Índices de diversidade dos perfis DGGE comunidades bacterianas
nitrificadoras do solo e da serapilheira das diferentes coberturas estudadas de
acordo com Shannon e com Simpson.
Solos Serapilheira
Sitios Índice de
Shannon
Índice de
Simpson
Índice de
Shannon
Índice de
Simpson
Acácia 2,3 a 0,85 a 2,8 a 0,88 a
Sabiá 1,7 a 0,75 a 2,4 a 0,82 a
Capoeira 2,0 a 0,84 a 2,3 a 0,78 a
Pastagem 2,0 a 0,80 a 2,7 a 0,87 a
CV % 16,74 9,48 14,70 8,51
Médias (de quatro repetições) seguidas de pelo menos uma mesma letra em cada coluna,
não diferem entre si pelo teste de Duncan em nível de 5% de probabilidade. CV: coeficiente
de variação.
Apesar da baixa diversidade genotípica existente, algumas bandas
apresentaram-se específicas para uma determinada área, considerando a PCR-
DGGE, reforçando a importância do uso de ferramentas moleculares na análise
genotípica de comunidades bacterianas. A técnica de DGGE pode ser amplamente
utilizada no estudo das mudanças ocorridas nas comunidades microbianas no
ambiente natural ou submetido a condições de estresse, ou no monitoramento de
microrganismos específicos em um ambiente natural, sendo esta uma poderosa
ferramenta de estudo (Muyzer e Smalla, 1998; Bothe et al., 2000; Kowalchuk el al.,
2000; Rosado e Duarte, 2002; Rowan et al., 2003; Calvó et al., 2004). Muyzer et al.
(1993) já haviam demonstrado que metodologias de PCR-DGGE são extremamente
simples, rápidas e eficazes para distinguir fragmentos de DNA que diferem em
apenas um par de bases.
6.2.3.2.2. Dendrograma obtido a partir da análise dos perfis de bandas AOB-
DGGE das comunidades nitrificadoras do solo e da serapilheira
O agrupamento das áreas com base no perfil do gel dos produtos PCR-AOB
das amostras de solo coletadas está apresentado na figura 10.
Entre as amostras
91
representantes de uma mesma área, obteve-se uma baixa similaridade da ordem de
51, 31, 54 e 47%, para acácia, capoeira, pastagem e sabiá, respectivamente. Ainda
pela figura 10, observou-se a separação das áreas em dois grupos genotípicos com,
aproximadamente, 21% de similaridade. O grupo G1 é formado pelas amostras
coletadas nos solos sob pastagem e sabiá e o grupo G2, pelas amostras coletadas
nos solos sob acácia e capoeira. Este resultado demonstra que o solo sob acácia
possui a mesma estrutura genética que a capoeira considerada como referência,
sugerindo uma sucessão microbiana, ou seja, pode-se inferir que esta cobertura
vegetal retornou a população microbiana que estava presente antes da conversão
da mata em pastagens.
Figura 10:
Dendrograma gerado através dos programas GelCompar e Primer (utilizando-
se coeficiente de Person e método de análise cluster UPGMA) para analisar os perfis
de bandas em experimento de amplificação do gene AOB e PCR-DGGE das amostras de
solo.
Legenda das caneletas: A
1
– Amostra 1 do plantio de acácia; A
2
– Amostra 2 do plantio de
acácia; A
3
– Amostra 3 do plantio de acácia; A
4
– Amostra 4 do plantio de acácia; C
1
–
Amostra 1 da capoeira; C
2
– Amostra 2 da capoeira; C
3
– Amostra 3 da capoeira; C
4
–
Amostra 4 da capoeira; P
1
– Amostra 1 da pastagem; P
2
– Amostra 2 da pastagem; P
3
–
Amostra 3 da pastagem; P
4
– Amostra 4 da pastagem; S
1
– Amostra 1 do plantio de sabiá;
S
2
– Amostra 2 do plantio de sabiá; S
3
– Amostra 3 do plantio de sabiá; S
4
– Amostra 4 do
plantio de sabiá.
O dendrograma de similaridade, construído com base no perfil do gel dos
produtos PCR AOB das amostras de serapilheira (Figura 11), indicou uma baixa
similaridade entre amostras da mesma área, a exceção das coletadas no solo sob
capoeira. Estimou-se 26, 55, 27 e 28% de similaridade para acácia, capoeira,
G1
G2
92
pastagem e sabiá, respectivamente. Comparando os resultados dos perfis das
diferentes áreas, observou-se um distanciamento genético entre as estruturas das
comunidades microbianas, tornando impossível a formação de grupos. Valores de
similaridade, menores do que 21%, foram observados quando se compara as áreas
(Figura 11).
Figura 11:
Dendrograma gerado através dos programas GelCompar e Primer (utilizando-se
coeficiente de Person e método de análise cluster UPGMA) para analisar os perfis de bandas
em experimento de amplificação do gene AOB e PCR-DGGE das amostras de serapilheira.
Legenda das caneletas: A
1
– Amostra 1 do plantio de acácia; A
2
– Amostra 2 do plantio de acácia; A
3
– Amostra 3 do plantio de acácia; A
4
– Amostra 4 do plantio de acácia; C
1
– Amostra 1 da capoeira; C
2
– Amostra 2 da capoeira; C
3
– Amostra 3 da capoeira; C
4
– Amostra 4 da capoeira; P
1
– Amostra 1 da
pastagem; P
2
– Amostra 2 da pastagem; P
3
– Amostra 3 da pastagem; P
4
– Amostra 4 da pastagem;
S
1
– Amostra 1 do plantio de sabiá; S
2
– Amostra 2 do plantio de sabiá; S
3
– Amostra 3 do plantio de
sabiá; S
4
– Amostra 4 do plantio de sabiá.
Estes resultados sugerem uma limitação dos iniciadores CTO quanto a sua
utilização para o estudo de ecologia de bactérias nitrificadoras em amostras de
serapilheira, ou seja, os iniciadores CTO (CTO 189f-GC e CTO 654r), utilizados
neste presente trabalho, não produziram resultados com sensibilidade e
especificidade suficientes para detectar as alterações das populações de bactérias
nitrificadoras (Cebron et al., 2004). Outra interpretação é que possíveis alterações
tenham sido mascaradas pela forte variação entre as amostras de uma mesma área
(Clegg et al., 2000; McCaig et al., 2001).
Em relação às amostras de solo, foram encontrados valores de
dissimilaridades (ANOSIM) significativos entre a acácia e as áreas pastagem e sabiá
(Quadro 13). Estes resultados demonstram, mais uma vez, a influência da estrutura
93
da comunidade microbiana nitrificadora pelo tipo de uso da terra, corroborando a
evolução enunciada na análise visual dos géis.
Estresses naturais ou causados pelo homem podem causar mudanças na
seqüência de DNA de espécies bacterianas (Allen, 1992). Tais alterações podem, ou
não, equipar o organismo com meios melhores para sobreviver em seu ambiente. Se
uma variante de gene melhora a adaptação para o ambiente, permitindo, por
exemplo, fazer melhor uso de um nutriente disponível, a bactéria que leva aquele
gene é mais provável de sobreviver e reproduzir que aqueles sem ele. Com o passar
do tempo seus descendentes tenderão a aumentar e mudarão as características
comuns da população. Vale ressaltar que a evolução, neste aspecto, é a adaptação
de estruturas de diferentes organismos a uma condição ecológica, sendo que essas
estruturas podem ter, ou não, a mesma função.
Quadro 13: Comparação dos perfis de bandas DGGE-AOB comunidades
bacterianas nitrificadoras do solo e da serapilheira a partir das amostras coletadas
em diferentes coberturas vegetais. % de dissimilaridade (ANOSIM).
Solo Serapilheira
capoeira pastagem
Sabiá
Capoeira
pastagem
Sabiá
Acácia 21 NS 71* 51* acácia 73* 30 NS 48*
Capoeira
38 NS 34 NS capoeira
84* 65*
Pastagem
17 NS pastagem
65*
* significativo p < 0,05 NS não significativo
As alterações na estrutura das comunidades bacterianas nitrificadoras
detectadas não refletiram os resultados de atividade potencial de nitrificação
encontrados no trabalho1, indicando um alto grau de redundância ecológica. A
eliminação ou transformação de espécies de microrganismos sensíveis a um
distúrbio qualquer favorece o aumento da população de outros microrganismos mais
tolerantes ao distúrbio (Díaz-Raviña e Baath, 1996) e que desempenhariam a
mesma “função” no sistema (Kennedy, 1999). É sabido, também, que a perda de
elementos de um grupo funcional pode comprometer os processos por eles
desempenhados (Zak et al., 1994). Diante destes dados, outros estudos deveriam
ser desenvolvidos para melhor elucidar as relações entre diversidade estrutural e
funcional destas comunidades. Assim, será necessário o seqüenciamento das
bandas específicas e compará-las com as seqüências depositadas nos Bancos de
genes existentes na internet.
No Quadro 14, estão apresentadas as equações de regressão linear simples
calculadas a partir dos valores de estrutura das comunidades microbianas
nitrificadoras e as características químicas do solo e da serapilheira. Constatou-se
94
que o pH e a fertilidade do solo (Ca e SB) foram os fatores que mais contribuiram
para o crescimento da comunidade nitrificadora da serapilheira coletada na acácia e
no sabiá. Segundo Pereira (1999), as alterações no pH e na disponibilidade de
nutrientes podem influenciar a comunidade microbiana de maneira direta através da
atuação sobre processos microbianos, fisiológicos e bioquímicos específicos, ou,
indiretamente, através da disponibilidade de nutrientes e da neutralização de
elementos tóxicos. A sucessão microbiana observada no solo sob acácia pode estar
relacionada à baixa acidez potencial e ao alto valor de pH. Já no solo sob capoeira,
as alterações ocorridas nas comunidades nitrificadoras estariam relacionadas ao
baixo valor de pH, à alta acidez potencial, ao elevado teor de alumínio do solo e ao
alto teor de carbono na serapilheira colheitada nesta área. Estudos realizados por
Del Moral e Müller (1970), em solos sob Eucalyptus, mostrou baixa ocorrência de
bactérias associadas a um baixo valor de pH, ao elevado conteúdo de alumínio e à
presença de compostos antimicrobianos, como o cineol, presentes nas folhas de
eucalipto. Na pastagem, a seleção das bactérias nitrificadoras parece estar
relacionada aos baixos teores de magnésio (Mg).
A comunidade de bactérias nitrificadoras mostrou-se afetada pela ação dos
compostos fenólicos (Quadro 14), ao contrário da comunidade bacteriana total que
não sofreu nenhum tipo de alteração decorrente dos teores de popilfenóis totais
encontrados neste trabalho. Estes resultados são bastantes condizentes com a
literatura, onde os compostos fenólicos são muito citados devido à sua ação
inibidora sobre o crescimento das bactérias nitrificadoras (Rice, 1984; Bremner e Mc
Carty, 1993).
Quadro 14: Equações de regressão linear simples
entre
os valores de estrutura das
comunidades microbianas nitrificadoras e as características químicas do solo e da
serapilheira.
n=16
Regressões R
2
AOB solo = - 1,612 (H+Al) + 26,862 0,31*
AOB solo = -0,740 C-org serapilheira + 39,663 0,43*
AOB solo = - 4,494 Mg serapilheira + 20,856 0,31*
AOB solo = - 8,903 polifenóis + 22,371 0,31*
AOB serapilheira = 7,566 Ca solo + 30,441 0,59**
AOB serapilheira = 6,023 SB + 28,630 0,50**
AOB serapilheira = - 5,172 Al + 42,002 0,39**
AOB serapilheira = 10,350 pH solo - 7,838 0,42**
AOB serapilheira = - 1,792 (H+Al) + 49,746 0,39**
AOB serapilheira = - 0,630 C-org serapilheira + 59,973 0,33*
** significativo a nível de 1% de probabilidade; * significativo a nível de 5% de probabilidade; AOB:
comunidade microbiana nitrificadora; H+Al: acidez potencial; C-org.: carbono orgânico; Mg: magnésio;
Ca: cálcio; SB: soma de base; Al:. alumínio trocável.
95
6.2.3.3. Diversidade genética e estrutura das comunidades
desnitrificadoras nos compartimentos solo e da serapilheira
6.2.3.3.1. Análise visual do gel
A estrutura das bactérias desnitrificadoras foi avaliada através da análise do
perfil de bandas em experimento com amplificação do gene NirK e PCR-DGGE. Os
géis obtidos apresentaram um perfil mais simples comparado ao do 16S DNAr
(Figura 12), permitindo visualizar vinte e oito, e quarenta e duas bandas comuns
para as amostras de solo e serapilheira, respectivamente (Quadros 15 e 16).
Também foi observada a presença de três bandas apenas na acácia, pastagem e
sabiá (APS) para as amostras de solo (Quadro 15), e uma banda, para as amostras
de serapilheira (Quadro 16). Considerando a capoeira como referência, foi
observada, para as amostras de solo, a ausência de sete bandas na sabiá (ACP) e
oito bandas na acácia (CPS) e na pastagem (ACS) (Quadro 15). Já com o perfil de
bandas obtidas pela análise das amostras de serapilheira, notou-se a ausência de
três bandas na acácia (CPS), dez na pastagem (ACS) e duas na sabiá (ACP)
(Quadro 16). Estes resultados, mais uma vez, demonstraram uma alta homologia
entre as populações microbianas das diferentes áreas avaliadas.
Os índices de diversidade (Shannon e Simpson) dos perfis DGGE
comunidades bacterianas desnitrificadoras do solo não apresentaram diferenças
significativas entre as áreas pelo teste de Duncan, em nível de 5% de probabilidade,
sugerindo um possível efeito das condições climáticas sobre a estrutura destas
comunidades, mais significativo do que a influência provocada pelo tipo de cobertura
vegetal (Quadro 17). Esses resultados são corroborados pela ausência de
correlação significativa entre a estrutura da comunidade desnitrificadora do solo e as
características químicas do solo e da serapilheira. Como as amostras foram
coletadas em setembro, quando as temperaturas do solo estavam amenas e o
conteúdo de água no solo mais elevado, pode ter ocorrido um estímulo para o
desenvolvimento preferencial das populações de bactérias desnitrificadoras. Isto
justificaria a alta semelhança entre as áreas, uma vez que as bandas analizadas
representam apenas as espécies mais abundantes na amostra (Vetriani et al., 1999).
As amostras de serapilheira revelaram maiores índices de diversidade, na
acácia e no sabiá estatisticamente iguais entre si, e o menor índice, na pastagem; a
capoeira apresentou os valores intermédiarios, não diferindo com a sabiá (Quadro
17). Estes resultados reforçam a hipótese de que o tipo de cobertura vegetal
influencia mais a diversidade bacteriana do que o tipo de solo.
96
A – Estrutura genética da comunidade desnitrificadora do solo
B – Estrutura genética da comunidade desnitrificadora da
serapilheira
Figura 12:
Perfil de bandas obtido pela análise de DGGE dos fragmentos do gene NirK amplificados com primers 338f e 518r , comparando amostras de
solo (A) e serapilheira (B) das quatro diferentes coberturas vegetais.
A1:amostra 1 da acácia; A2: amostra 2 da acácia; A3: amostra 3 da acácia; A4: amostra 4 da acácia; C1: amostra 1 da capoeira; C2: amostra 2 da
capoeira; C3: amostra 3 ca capoeira; C4: amostra 4 da capoeira; P1: amostra 1 da pastagem; P2: amostra 2 da pastagem; P3: amostra 3 da pastagem; P4:
amostra 4 da pastagem; S1: amostra 1 da sabiá; S2: amostra 2 da sabiá; S3: amostra 3 da sabiá e S4: amostra 4 da sabiá.
A1
A2 A3
A4
C1
C2
C3
C4
P1
P2
P3
P4
S1
S2
S3
S4
A1
A2
A3
A4
C1
C2
C3
C4
P1
P2
P3
P4
S1
S2
S3
S4
97
Quadro 15: Padrão de bandas DGGE-NirK, comparando amostras de solo das
diferentes coberturas vegetais.
A1 A2 A3 A4 C1 C2 C3 C4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4
L1
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L2
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L3
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L4
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L5
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L6
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L7
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L8
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L9
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L10
CPS CPS CPS CPS CPS
L11
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L12
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L13
AC AC AC AC AC
L14
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L15
PS PS PS PS
L16
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L17
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L18
PS PS PS
L19
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L20
AS AS AS AS 1 AS AS
L21
CS CS CS CS CS CS
L22
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L23
AP AP AP
L24
APS APS APS APS APS APS APS APS APS
L25
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L26
AP AP
L27
APS APS APS APS APS APS APS APS
L28
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L29
APS APS APS APS APS APS APS APS
L30
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L31
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L32
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L33
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
1 ACPS
L34
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L35
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L36
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L37
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L38
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L39
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L40
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L41
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L42
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L43
1
L44
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L45
AS AS
L46
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
98
L46
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L47
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L48
1
L49
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L50
ACS ACS ACS ACS ACS
L51
ACS ACS ACS ACS
L52
ACS ACS ACS ACS
L53
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L54
ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L55
AC AC
L56
AC AC AC AC AC
L57
CS CS
L58
CPS CPS CPS CPS
L59
ACS ACS ACS ACS
L60
AC AC AC
L61
AS AS AS
L62
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L63
ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L64
ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L65
ACS ACS ACS ACS ACS
L66
CS CS CS CS
L67
ACP ACP ACP ACP
L68
ACP ACP ACP ACP ACP 1
L69
CP CP
L70
CP CP
L71
ACP ACP ACP
L72
AS AS AS AS AS
L73
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L74
ACS ACS ACS ACS ACS
AC: bandas visualizadas apenas na acácia e na capoeira; AP: bandas visualizadas apenas na
acácia e na pastagem; AS: bandas visualizadas apenas na acácia e no sabiá; CS: bandas
visualizadas apenas na capoeira e no sabiá; CP: bandas visualizadas apenas na capoeira e na
pastagem; PS: bandas visualizadas apenas na pastagem e no sabiá; PS: bandas visualizadas
apenas na pastagem e no sabiá; ACS: bandas visualizadas apenas na acácia, na capoeira e no
sabiá e uma no sabiá; APS: bandas visualizadas apenas na acácia, na pastagem e no sabiá; CPS:
bandas visualizadas apenas na capoeira, na pastagem e no sabiá; ACPS: bandas visualizadas na
acácia, na capoeira, na pastagem e no sabiá.
99
Quadro 16: Padrão de bandas NirK, comparando amostras de serapilheira das
diferentes coberturas vegetais.
A1 A2 A3 A4 C1 C2 C3 C4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4
L1
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L2
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L3
ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L4
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L5
AC AC AC AC
L6
CS CS CS
L7
CPS CPS CPS CPS
L8
ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L9
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L10
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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L11
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
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L12
ACPS
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ACPS
ACPS
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L13
ACS ACS ACS ACS ACS
L14
ACPS
ACPS
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L15
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L16
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L17
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS
L18
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L20
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L22
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ACPS
ACPS
L23
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L24
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L25
ACP ÄCP ACP ACP ACP ACP 1
L26
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L27
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L28
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L29
APS APS APS APS APS APS APS
L30
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L31
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L32
AC AC AC AC AC AC
L33
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L34
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L35
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L36
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L37
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L38
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L39
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L40
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L41
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L42
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L43
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L44
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L45
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L46
CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS CPS 1 CPS
L47
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
100
L47
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L48
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L49
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L50
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L51
ACS ACS ACS ACS ACS
L52
ACS ACS ACS ACS
L53
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L54
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L55
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
L56
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L57
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L58
AS AS AS
L59
AS AS AS
L60
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L61
ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L62
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L63
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
ACPS
L64
ACS ACS ACS ACS ACS ACS
L65
CS CS CS
L66
A A A A
L67
A A
L68
A
AC: bandas visualizadas apenas na acácia e na capoeira; AS: bandas visualizadas apenas na
acácia e no sabiá; CS: bandas visualizadas apenas na capoeira e no sabiá; CS: bandas
visualizadas apenas na capoeira eno sabiá; ACP: bandas visualizadas apenas na acácia, na
capoeira e na pastagem; ACS: bandas visualizadas apenas na acácia, na capoeira e no sabiá e
uma no sabiá; APS: bandas visualizadas apenas na acácia, na pastagem e no sabiá; CPS: bandas
visualizadas apenas na capoeira, na pastagem e no sabiá; ACPS: bandas visualizadas na acácia,
na capoeira, na pastagem e no sabiá.
Quadro 17: Índices de diversidade dos perfis DGGE-NirK comunidades
bacterianas desnitrificadoras do solo e da serapilheira das diferentes
coberturas estudadas de acordo com Shannon e com Simpson.
Solos Serapilheira
Sitios Índice de
Shannon
Índice de
Simpson
Índice de
Shannon
Índice de
Simpson
Acaciá 2,7 a 0,90 a 3,3 a 0,96 a
Sabiá 2,8 a 0,91 a 3,0 ab 0,93 ab
Capoeira 2,5 a 0,88 a 2,7 b 0,91 b
Pastagem 2,5 a 0,86 a 2,4 c 0,88 c
CV % 6,77 3,62 7,07 2,52
Médias (de quatro repetições) seguidas de pelo menos uma mesma letra em cada coluna, não
diferem entre si pelo teste de Duncan em nível de 5% de probabilidade.
CV: coeficiente de variação.
101
6.2.3.3.2. Dendrograma obtido a partir da análise dos perfis de bandas
NirK-DGGE das comunidades desnitrificadoras do solo e da serapilheira
O dendrograma, obtido a partir da matriz de similariadde baseada no
perfil do gel dos produtos amplificados com os iniciadores NirK de amostras de
solos (figura 13), mostrou uma alta similaridade entre as amostras coletadas
numa mesma área, com 62, 68, 67 e 69% de similaridade para acácia,
capoeira, pastagem e sabiá, respectivamente. A análise de agrupamento das
diferentes áreas revelou a formação de três grupos principais, com
aproximadamente 46% de similaridade. O primeiro grupo (G1) representa as
amostras coletadas no sabiá, o segundo grupo (G2), as amostras da acácia e o
terceiro grupo (G3), as amostras das demais coberturas (Figura 13), mostrando
a importância da cobertura vegetal na manutenção e sobrevivência das
comunidades desnitrificadoras. Segundo Wallenstein et al. (2006), a estrutura
das comunidades desnitrificadoras do solo é fortemente influenciada pela
umidade e temperatura. Solos descobertos são sujeitos a flutuações térmicas e
hídricas que podem ocasionar alterações nas estruturas genéticas ou morte de
parte da comunidade de microrganismos. Assim, a serapilheira depositada e
acumulada sobre o solo diminui os efeitos de variação de temperatura e
umidade, tornando o ambiente propício para o desenvolvimento das bactérias e
outros organismos (Silva Filho e Vidor, 1984). Catelan e Vidor (1990),
estudando os efeitos dos fatores ambientais sobre a população microbiana em
solo sob diferentes sistemas de culturas, concluíram que o desenvolvimento
dos microrganismos foi influenciado pela variação dos fatores climáticos como
umidade e temperatura. Bossio e Scow (1998) ao estudarem a comunidade
microbiana do solo em vários sistemas de manejo, verificaram que a população
de microrganismos presentes no sistema que incluía pastagens foi menor do
que outros sistemas estudados, indicando a forte influência do tipo de
cobertura vegetal sobre os organismos microbianos. Em outro estudo similar,
foi constatada maior presença de bactérias em solo cultivado com leguminosas
do que em gramíneas (Wollum, 1982).
Adicionalmente, os diferentes tipos de serapilheira pela sua estrutura,
espessura, qualidade, composição química e decomposição, entre outros
aspectos, podem criar diferentes microhábitats; e diferentes espécies de
microrganismos podem apresentar respostas positivas ou negativas em relação
a eles. Curiosamente, a análise de dissimilaridade (ANOSIM) revelou valores
102
de dissimilaridade não significativa entre a capoeira e a pastagem (Quadro 18).
Para este resultado, pode-se especular que as bactérias selecionadas nestas
coberturas estejam relacionadas à qualidade da serapilheira, uma vez que, de
modo geral, as serapilheiras de pior qualidade (alta concentração de polifenóis
totais e relações C:N e lignina/(lignina+celulose) foram encontradas nessas
áreas. Porém, outros estudos deveriam ser desenvolvidos para identificar as
bactérias selecionadas e elucidar essa similaridade entre as áreas.
Figura 13:
Dendrograma gerado através dos programas GelCompar e Primer (utilizando-se
coeficiente de Person e método de análise cluster UPGMA) para analisar os perfis de
bandas em experimento de amplificação do gene NirK e PCR-DGGE das amostras de solo.
Legenda das caneletas: A
1
– Amostra 1 do plantio de acácia; A
2
– Amostra 2 do plantio de
acácia; A
3
– Amostra 3 do plantio de acácia; A
4
– Amostra 4 do plantio de acácia; C
1
– Amostra
1 da capoeira; C
2
– Amostra 2 da capoeira; C
3
– Amostra 3 da capoeira; C
4
– Amostra 4 da
capoeira; P
1
– Amostra 1 da pastagem; P
2
– Amostra 2 da pastagem; P
3
– Amostra 3 da
pastagem; P
4
– Amostra 4 da pastagem; S
1
– Amostra 1 do plantio de sabiá; S
2
– Amostra 2 do
plantio de sabiá; S
3
– Amostra 3 do plantio de sabiá; S
4
– Amostra 4 do plantio de sabiá.
Quadro 18: Comparação dos perfis de bandas DGGE-NirK comunidades
bacterianas desnitrificadoras do solo e da serapilheira a partir das amostras
coletadas em diferentes coberturas vegetais. % de dissimilaridade (ANOSIM). .
Solo Serapilheira
capoeira
pastagem Sabiá
Capoeira
pastagem
sabiá
Acácia 91* 81* 99* Acácia 75* 58* 49*
Capoeira
24 NS 99* Capoeira
21 NS 54*
Pastagem
99* Pastagem
38*
* significativo p < 0,05 NS não significativo
No presente trabalho, não foi encontrada uma correlação entre a
atividade e a estrutura da comunidade bacteriana desnitrificadora. Este
resultado demonstra que pode ocorrer a manutenção das funções bioquímicas
G1
G2
G3
103
no ecossistema, mesmo quando ocorre a transformação gênica ou substituição
de um determinado organismo por outro (Walker, 1992; Zilli et al., 2003). Isso
ocorre porque organismos funcionalmente semelhantes exibem várias formas
de sobrevivência, adaptando-se a diferentes condições de crescimento e
suportando adversidade de diferentes ambientes, hábitats e nichos (Perry,
1989). Boyle et al. (2006), utilizando os inicidores NirK para comparar solos sob
floresta de Oregan, USA, também não encontraram correlação entre a
atividade e a composição de comunidade desnitrificadora.
O resultado obtido a partir das amostras de serapilheira forneceu o
dendrograma apresentado na (figura 14). Observa-se uma baixa similaridade
entre as amostras coletadas numa mesma área (44, 43, 40% para capoeira,
pastagem e sabiá, respectivamente), à exceção da acácia que apresentou
similaridade alta de 61% entre as amostras (Quadro 16). As diferentes áreas
não se agruparam devido, provavelmente, à baixa similaridade entre elas (21%
aproximadamente) e à alta variabilidade das amostras coletadas numa mesma
área (Clegg et al., 2000; McCaig et al., 2001) (Figura 14). Este resultado indica
uma baixa eficiência dos iniciadores Nirk quanto a detecção das alterações na
estrutura de comunidade bacteriana da serapilheira. Entretanto, foi possível
detectar alguns efeitos do tipo de planta sobre as comunidades bacterianas
desnitrificadoras.
A análise de proximidade (ANOSIM) revelou dissimilaridades
estatisticamente significativas entre as diferentes áreas, exceto a capoeira e a
pastagem, estatisticamente similares entre si (Quadro 18). Estes dados são
corroborados pela regressão linear negativa entre a estrutura das comunidades
bacterianas desnitrificadoras da serapilheira com a relação C:N e as
regressões lineares positivas entre a estrutura das comunidades bacterianas
desnitrificadoras da serapilheira com os valores de cálcio (Ca), celulose e
relação celulose/N total da serapilheira (Quadro 19).
Nas serapilheira da acácia e do sabiá, consideradas de qualidade
intermediária, é provável que os grupos de bactérias selecionadas sejam
aquelas capazes de usar a celulose como fonte de carbono. Já nas estruturas
de serapilheiras, coletadas na capoeira e na pastagem, supostamente,
ocorreram os grupos mais adaptados aos compostos recalcitrantes. A
comunidade microbiana é regulada pela qualidade da serapilheira, sendo
extremamente dependente da relação C:N dos compostos orgânicos e da
104
forma como o carbono orgânico se apresenta nos resíduos orgânicos (celulose,
ligninas, polifenóis, carboidratos livres, proteínas, etc.) (Hu et al., 1999; Degans
et al., 2000; Marschner et al., 2003).
Figura 14:
Dendrograma gerado através dos programas GelCompar e Primer (utilizando-se
coeficiente de Person e método de análise cluster UPGMA) para analisar os perfis de
bandas em experimento de amplificação do gene NirK e PCR-DGGE das amostras de
serapilheira.
Legenda das caneletas: A
1
– Amostra 1 do plantio de acácia; A
2
– Amostra 2 do plantio de
acácia; A
3
– Amostra 3 do plantio de acácia; A
4
– Amostra 4 do plantio de acácia; C
1
– Amostra
1 da capoeira; C
2
– Amostra 2 da capoeira; C
3
– Amostra 3 da capoeira; C
4
– Amostra 4 da
capoeira; P
1
– Amostra 1 da pastagem; P
2
– Amostra 2 da pastagem; P
3
– Amostra 3 da
pastagem; P
4
– Amostra 4 da pastagem; S
1
– Amostra 1 do plantio de sabiá; S
2
– Amostra 2 do
plantio de sabiá; S
3
– Amostra 3 do plantio de sabiá; S
4
– Amostra 4 do plantio de sabiá.
Quadro 19: Equações de regressão linear simples
entre
os valores de estrutura
das comunidades microbianas desnitrificadoras e as características químicas
do solo e da serapilheira.
n=16
Regressões R
2
NirK serapilheira = 7,615 Ca serapilheira + 31,467 0,30*
NirK serapilheira = 0,222 Celulose:N +30,496 0,20*
NirK serapilheira = 0,282 Celulose + 27,045 0,34**
NirK serapilheira = - 0,796 C:N serapilheira + 58,351 0,24*
** significativo a nível de 1% de probabilidade; * significativo a nível de 5% de probabilidade;
NirK: comunidade microbiana desnitrificadora; Ca: cálcio; C:N: relação entre carbono orgânico
e nitrogênio total.
105
6.2.4. CONCLUSÕES
A qualidade orgânica e nutricional da serapilheira influenciou a
estrutura das comunidades bacterianas nitrificadoras do solo e
desnitrificadoras da serapilheira.
A diversidade da população microbiana total foi maior na acácia e
no sabiá quando comparados com a capoeira, sugerindo uma alteração da
estrutura genética das bactérias presentes nestes solos pelo tipo de uso da
terra.
A comunidade bacteriana nitrificadora da acácia possui a mesma
estrutura genética que a da capoeira, considerada como referência,
validando o uso desta leguminosa como estratégia de recuperação de áreas
sob impacto antrópico.
Os iniciadores, CTO e Nirk, não produziram resultados com
sensibilidade e especificidade suficientes para detectar as alterações das
populações de bactérias nitrificadoras e desnitrificadoras da serapilheira.
.
106
6.2.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Allen, M.F. (1992) Mycorrizal Functioning: An Integrative Plant-Fungal Process.
New York: Chapman & Hall, 515p.
Bertrand, H., Nalin, R., Balli, R., Cleyet-Marel, J.C. (2001) Isolation and
identification of the most efficient plant growt promoting bacteria associated
with canola (Brassica napus). Biology and fertility soils, 33, p.142-156.
Borneman, J.; Triplett, E.W. (1997) Molecular Microbial Diversity in Soils from
Eastern Amazonia: Evidence for Unusual Microorganisms and Microbial
Population Associated with Deforestation. Applied and Environmental
Microbiology, v.63, p.2647-2653.
Bossio, D.A., Scow, K.M. (1998) Impacts of carbon and flooding on soil
microbial communities: phospholipid fatty acid profiles and substrate
utilization patterns. Microb. Ecol., 35, p.265-278.
Bothe, H., Jost, G., Schloter, M., Ward, B.B., Witzel, K. (2000) Molecular
analysis of ammonia oxidation and denitrification in natural environments.
FEMS Microbiol Rev., 24, p.673-690
Boyle, S. A., Rich, J. J., Bottomley, P. J., Cromack, J. K., Myrold D. D. (2006).
Reciprocal transfer effects on denitrifying community composition and
activity at forest and meadow sites in the Cascade Mountains of Oregon.
Soil Biology and Biochemistry 38, p.870-878.
Bremer, J. M., Mc Carty, G. W. (1993) Inhibition of nitrification in soil by
allelochemicals derived from plants and plant residues. Soil Biochemistry,
8:181-218.
Calvó, L., Vila, X., Abella, C.A., Garcia-Gil, L.J. (2004) Use of the ammonia-
oxidizing bacterial-specific phylogenetic probe Nso1225 as a primer for
fingerprint analysis of ammonia-oxidizer communities. Appl Microbiol
Biotechnol, 63, p.715-721.
Carter, M. R. (1986) Microbial biomass and index for tillage-induced changes in
soil biological properties. Soil & Tillage Research, Amsterdam, v. 7, n. 1, p.
29-40.
Catelan, A. J.; Vidor, C. (1990) Sistemas de culturas e a população microbiana
do solo. Revista Brasileira de Ciência do Solo. Campinas, v. 14, n. 2, p.
125-133.
Cebron, A., Coci, M., Garnier, J., Laanbroek, H. J. (2004) Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis Analysis of Ammonia-Oxidizing Bacteria Community
Structure in the Lower Seine River: Impact of Paris Wasterwater Effluents.
Applied Environmental Microbiology, p. 6726–6737.
107
Clarke, K. R.; Warwick, R. M. (1994) Change in marine communities: an
approach to statistical analysis and interpretation. Natural Environmental
Research Council, UK, 144p.
Clegg, C. D.; Ritz, K.; Griffiths, B.S. (2000) % G1C profiling and cross
hybridization of microbial DNA reveals great variation in below-ground
community structure in UK upland grasslands. Applied Soil Ecology, 14,
p.125–134.
Colozzi Filho, A.; Balota, E. L., Andrade, S. (1999) Microrganismos e processos
biológicos nos sistema plantio direto. In: SIQUEIRA, J. O. et al. ed. Inter-
relação fertilidade, biologia do solo e nutrição de plantas. Lavras :
SBCS/UFLA, p.487-508.
De Fede, K. L., Panaccione, D. G., Sextone, A. J. (2001) Characterization of
dilution enrichment cultures obtained from size-fractionated soil bacteria by
Biolog community-level physiological profiles and restriction analysis of 16S
rDNA genes. Soil Biol. Biochem., 33, p.1555-1562.
Degans, B. P., Schipper, L. A., Sparling, G. P., Vojvodic-Vukovic, M. (2000)
Decreases in organic C reserves in soils can reduce the catabolic diversity
of soil microbial communities, Soil Biology and Biochemestry, 32, p.189-196.
Del Moral, R., Müller, C.H. (1970) The allelopathic effects of Eucalyptys
calmadulensis. American Midland Naturalist, v.83, n.1, p.160-200.
Díaz-Raviña, M., Baath, E. (1996) Development of metal tolerance in soil
bacterial communities exposed to experimentally increased metal levels.
Applied and Environmental Microbiology, v.62, p.2970-2977.
Doran, J. W.; Coleman, D. C.; Bezdicek, D. F.; Stewart, B. A. (Eds.). (1994)
Defining soil quality for a sustainable environment. Wisconsin: American
Society of Agronomy.
Drozdowicz, A.G. (1991) Microbiologia ambiental. In: Roitman, I.; Travassos,
L.R.; Azevedo, J.L. (1991) Tratado de microbiologia. Rio de Janeiro:
Manole, v.2, p.1-102.
Freitag, T. E., Prosser, J. I. (2003) Community structure of ammonia-oxidizing
bacteria within anoxic marine sediments. Applied and Environmental
Microbiology 69, p.1359-1371.
Garbeva, P., van veen, J.A., van Elsas, J.D. (2004) Microbial diversity in soil:
Selection of microbial populations by plant and soil type and implications for
disease supressiveness. Annual Review of Phytopatology, 42, p. 243-270.
Germida, J.J., Siciliano, S.D., Freitas, J.R., Seib, A.M., (1998) Diversity of root-
associated bacteria associated with field-grown canola (Brassica napus) and
wheat (Triticum aestivum L.). FEMS Microbiology Ecology, 26, p.43-50.
108
Grayson, S. J.; Grifftih, G. S.; Mawdesley, J. L.; Campebell, C. D., Bardgett, R.
D. (2001) Accounting of variability in soil microbial communities of temperate
upland grassland ecosystem. Soil Biol. Biochem., 33, p.533-551.
Hu, S. J., Van Bruggen, A. H. C., Grunwald, N. J. (1999) Dynamics of bacterial
populations in relation to C availability in a residue-amended soil. Appl. Soil
Ecol., 13, p.21-30.
Johnson, M. J.; Lee, K. Y.; Scow, K. M. (2003) DNA fingerprint reveals links
among agricultural crops, soil properties, and the composition of soil
microbial communities. Geoderma, Amsterdam, v. 114, n. 3/4, p. 279-303.
Kaiser, O., Puhler, A., Selbitschka, W., (2001) Phylogenetic analysis of
microbial diversity in the rizoplane of oilseed rape (Brassica napus
cv.Westar) employing cultivation-dependent and cultivation-independent
approaches. Microbial Ecology, 42, p.136-149.
Kennedy, A. C. (1999) Bacterial diversity in agroecosystems. Agricult. Ecos.
Environ., 74, p.65-76.
Kowalchuk, G.A.; Stephen, J.R.; De Boer, W.; Prosser, J.I.; Embley, T.M.;
Woldendorp, J.W. (1997). Analysis of ammonia-oxidizing bacteria of the
Subdivision of the class Proteobacteria in coastal sand dunes by Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis and sequencing of PCR-amplified 16S
Ribosomal DNA fragments. Appl. Environ. Microbiol. 63, p.1489-1497.
Kowalchuk, G.A., Stienstra, A.W., Heilig, G.H., Stephen, J.R., Woldendorp, J.W.
(2000) Molecular analysis of ammonia-oxidizing bacteria in soil of
successional grasslands of the Drentsche A (The Netherlands). FEMS
Microbiol Ecol, 31, p.207-215
Lavelle, P. Ecological challenges for soil science. (2000) Soil Science, 165,
p.73-86
Liu, X.; Tiquia, S.M.; Holguin, G.; Wu, L.; Nold, S.C.; Devol, A.H.; Luo, K.;
Palumbo, A.V.; Tiedje, J.M.; Zhou, J. (2003) Molecular Diversity of
Denitrifying Genes in Continental Margin Sediments within the Oxygen-
Deficient Zone off the Pacific Coast of Mexico. Appl. Environ. Microbiol. 69,
p.3549-3560.
Magurran, A.E. (1988) Ecological Diversity and its Measurement. New Jersey:
Princeton University Press. 179p.
Marschner, P., Kandeler, E., Marschner, B. (2003) Structure and fonction of the
soil microbial community in a long-term fertilzer experiment. Soil Biol. Bioch.,
35, p.453-461.
McCaig, A. E., L. A. Glover, and J. I. Prosser. (2001) Numerical analysis of
grassland bacterial community structure under different land management
regimes by using 16S ribosomal DNA sequence data and denaturing
gradient gel electrophoresis banding patterns. Applied and Environmental
Microbiology, 67, p.4554–4559.
109
Muyzer, G., Smalla, K. (1998) Application of denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis
(TGGE) in microbial ecology. Mini review. Antonie van Leeuwenhoek, 73,
p.127-141.
Muyzer, G., De Waal, E.C., Uitterlinden, A.G. (1993) Profiling of complex
microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of
polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied
and Environmental Microbiology 59, p.695-700.
Odum, E. P. (1988) Populações em comunidades. In: Odum, E.P., Eds.,
Ecologia. São Paulo: Guanabara, p. 258-272.
Ovreas, L., Forney, L., Daae, F. L., Torvisk, V. (1997) Distribution of
bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvanet, as determined by
denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments
coding for 16S r RNA. Appl. Environ. Microbiol., 63: p.3367-3373.
Panilov, N. S. (1999) Understanding and prediction of soil microbial community
dynamics under global change. Applied Soil Ecology, Amsterdam, v. 11, n.
1, p. 161-176.
Patra, A. K. ; Abbadie, L. ; Clays-Josserand, A. ; Degrange, V. ; Grayston, S.
J. ; Loiseau, P. ; Louault, F.; Mahmood, S.; Nazaret, S.; Philippot, L.; Poly,
F.; Prosser, J.I.; Richaume, A.; Le Roux, X. (2005) Effects of grazing on
microbial functional groups involved in soil N dynamics. Ecological
Monographs, 75(1), p.65-80.
Pereira, J. C.; Neves, M. C. P.; Drozdowicz, A. (1999) Dinâmica das
populações bacterianas em solos de cerrados. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, v.34, n5, p.801- 811.
Perry, D. A.; Amaranthus, M. P.; Borchers, J. G.; Borchers, S. L.; Brainerd, R.
E. (1989) Bootstrapping in ecosystems. Bioscience. 39, p.230-237.
Reiners, W.A.; Bouwman, A.F.; Parson, W.F.J.; Keller, M. (1994) Tropical
Rainforest Conversion to Pasture: Change in Vegetation and Soil
Properties. Ecology Applied, v.4, p.363-377.
Rice, E. L. (1984) Allelopathy. Academic Press, Inc New York
Rogers, B.F.; Tate III. (2001) Temporal analysis of the soil microbial community
along a toposequence in Pineland soils. Soil Biology and Biochemistry, v.33,
n.10, p.1389-1401.
Rosado, A. S. (2000) Diversidade e ecologia de microrganismos do solo. In:
Reunião Brasileira de Fertilidade e Nutrição de Plantas, 23; Reunião
Brasileira Sobre Micorrizas, 7; Simposio Brasileiro de Microbiologia do Solo,
5; Reunião Brasileira de Biologia do Solo, 2, 2000, Santa Maria. Anais...
Santa Maria: UFSM, 2000. CD-ROM..
110
Rosado, A.S., Duarte, G.F. (2002) Utilização de eletroforese em gel com
gradientes de desnaturantes (DGGE) e gel com gradiente de tempertura
para estudar a diversidade microbiana. In: Genética e melhoramento de
microrganismos. Mello, I.S. (ed). EdUSP, São Paulo, p.97-129.
Rowan, A.K., Snape, J.R., Fearnside, D., Barer, M.R., Curtis, T.P., Head, I.M.
(2003) Composition and diversity of ammonia-oxidizing bacterial
communities in wastewater treatment reactors of different design treating
identical wastewater. FEMS Microbiol Ecol, 43, p.195-206
Shannon, C. E., Weaver, W. (1949) The Mathematical Theory of
Communication. University Ilinois Press, Urbana.
Sheffield, V. C.; Cox, D. R.; Lerman, L. S.; Myers, R. M. (1989) Attachment of a
40-base pair G+C-rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by
the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base
changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, Washington, v. 86, p. 232-236.
Silva Filho, G.N.; Vidor, C. (1984) As práticas de manejo de solo na população
microbiana. Revista Brasileira de Ciência do Solo. v. 8, n. 5, p. 291-296.
Simpson, E.H. (1949) Measurement of diversity. Nature, v.163, n.4148, p.688.
Siqueira, J.O.; Moreira, F.M.S.; Grisi, B.M.; Hungria, M.; Araujo, R.S. (1994)
Microrganismos e processos biológicos do solo: perspectiva ambiental.
Brasília: Embrapa-SPI, 1994. p.142. (Embrapa-CNPAF. Documentos, 45).
Smalla, K., Wieland, G., Buchner, A., Zock, A., Parzy, J., Kaiser, S., Roskot, N.,
Heur, H., Berg, G. (2001) Bulk and rhizosphere soil bacterial communities
studied by denaturing gradient electrophoresis: plantdependent enrichment
and seasonal shifts revelead. Applied and Environmental Microbiology, 67,
p.4742-4751.
Smit, E.; Leeflang, P.; Gommans, S.; Van Den Broek, J.; Van, M. S.; Wernars,
K. (2001) Diversity and seasonal fluctuations of the dominant members of
the bacterial soil community in a wheat field as determined by cultivation
and molecular methods. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, v. 67, n. 5, p. 2284-2291,
Swift, M.J.; Anderson, J.M. (1993) Biodiversity and ecosystem Function. In :
Agricultural Systems: New York, v.99 p.15-41.
Tiedje, J. M.; Cho, J. C.; Murray, A.; Treves, D.; Xia, B.; Ahou, J. (2001) Soil
teeming with life: new frontiers for soil science. In: Rees, R. M.; Ball, B. C.;
Campbell, C. D.; Watson, C. A. (Org.). Sustainable management of soil
organic matter. Wallingford: CAB International, p. 393-412
Vetriani, C., Jannasch, H.W.; MacGregor, B.J., Stahl, D.A.; Reysenbach, A.H.
(1999) Population structure and phylogenetic characterization of marine
benthic Archeae in deep-sea sediments. Applied and Environmental
Microbiology, v.65, p.4375-4384.
111
Waksman, S.A. (1927) Principles of soil microbiology. Baltimore: The Williams
and Wilkins, 897p.
Walker, B. H. (1992) Biodiversity and ecological redundancy. Conserv.Biol. 6,
p.18-23.
Wallenstein, M.D.; Myrold, D.D.; Firestone, M.; Voytek, M. (2006)
Environmental controls on denitrifying communities and denitrification rates:
insights from molecular methods. Ecological Applications, 16(6), p.2143-
2152.
Wollum, A.G. (1982) Cultural methods for soil microorganisms. In: Page, A.L.;
Miller, R.H., Keeney, D.R. ed. Methods of soil analysis. Soil Science Society
of America, Madison, p.781-802.
Zak, J. C.; Willig, M. R.; Moorhead, D. L.; Wildman, H. G. (1994) Functional
diversity of microbial communities: a quantitative approach. Soil Biology and
Biochemistry, Oxford, v. 26, n. 9, p.1101-1108.
Zilli, E.J.R., Rumjanek, N.G., Ribeiro, G.C., Costa, L.H., Neves M.C.P. (2003)
Diversidade microbiana como indicador de qualidade do solo. Cad de
Ciência & Tec 20: 391-411
112
7. CONCLUSÃO GERAL
Este trabalho possibilitou a aquisição de informações importantes
relativas à diversidade funcional e às alterações genéticas das populações
microbianas presentes em áreas do bioma Mata Atlântica, localizadas no norte
do Estado do Rio de Janeiro. Os dois atributos avaliados (a atividade
microbiológica e a estrutura das comunidades microbianas), apresentaram-se
como bons indicadores biológicos, pois detectaram alterações decorrentes do
tipo de uso da terra.
A disponibilidade do carbono orgânico foi um fator importante no
controle dos processos de nitrificação e desnitrificação.
A qualidade nutricional e orgânica da serapilheira influenciou a
atividade microbiológica e as estruturas genéticas das comunidades
microbianas.
A análise de diversidade da comunidade microbiana total do solo
demonstrou uma população de bactérias presentes nos solos sob plantio de
leguminosas, que não estava presente na capoeira, refletindo uma alta
atividade microbiana e, conseqüentemente, uma melhoria na fertilidade desses
solos.
113
A acácia possui a mesma estrutura genética da comunidade bacteriana
nitrificadora que a capoeira, considerada como referência, validando o uso
desta leguminosa como estratégia de recuperação de áreas sob impacto
antrópico. Mas, apesar desta cobertura ter proporcionado o retorno da
população que estava presente antes do desmatamento, os microrganismos ali
presentes não conseguiram alcançar o mesmo desempenho (atividade) que os
encontrados na capoeira.
Os iniciadores, CTO e Nirk, não produziram resultados com
sensibilidade e especificidade suficientes para detectar as alterações das
populações de bactérias nitrificadoras e desnitrificadoras da serapilheira.
O nível atual de compreensão dos processos funcionais do
componente biótico do solo e de sua significância ecológica ainda não permite
a recomendação de biondicadores. Estudos posteriores são necessários para
melhor entender a relação entre a diversidade estrutural e funcional dos
microrganismos. Um deles é o seqüenciamento das bandas características de
cada cobertura vegetal e, ou solo, que permitirá a identificação dos grupos de
bactérias.
114
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aber, J.D.; Melillo, J. M. (1980) Litter decomposition: measuring relative
contributions of organic matter and nitrogen to forest soils. Canadian Journal
of Botany, 58, p.416-421.
Akkermans, A.D.L.; van Elsas, J.D. & De Bruiijn, F.J. (1995) Molecular Microbial
Ecology Manual. Kluwer, Dordrecht, The Netherlands.
Alcântara, R.M.C.M. de. (1995) Propriedades químicas e bioquímicas e suas
interrelações em solos sob vegetação de mata e campo adjacentes. Lavras:
UFLA, 1995. 84p. (Dissertação tese de Mestrado em Solos e Nutrição de
Plantas).
Alexander, M. (1977) Introduction to Soil Microbiology. 2. ed. Chichester: John
Wiley & Sons, 467p.
Alfaia, S.S. (1997) Mineralização do nitrogênio incorporado como material
vegetal em três solos da Amazônia Central. Rev. Bras. Ci. Solo, Viçosa, v.
21, n. 3, p.387-392.
Allen, M.F. (1992) Mycorrizal Functioning: An Integrative Plant-Fungal Process.
New York: Chapman & Hall, 515p.
Alvarez V., V.H.; Novais, R. F.; Barros, N. F.; Cantarutti, R. B.; Lopes, A. S.
(1999) Interpretação dos resultados das análises de solos. In: Ribeiro, A. C.;
Guimarães, P. T. G.; Alvarez V., V. H. (Ed.). Recomendações para o uso de
corretivos e fertilizantes em Minas Gerais – 5. Aproximação. Viçosa, MG:
CFSEMG, p. 25-32.
115
Anderson, J.P.E.; Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the
quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biology and
Biochemestry, 10, p.215-221.
Anderson, J.M. e Spencer, T. (1991) Carbon, nutrient and water balances of
tropical rain forest ecosystems subject to disturbance. MAB Digest 7,
UNESCO, Paris, 95p.
Anderson, T.H.; Domsch, K.H. (1993) The metabolic quotient for CO2 (qCO2)
as a specific activity parameter to assess the effects of environmental
conditions, such as pH, on the microbial biomass of forest soils. Soil Biology
and Biochemistry, 25 (3), p.393-395.
Anderson, J. D., Ingram, J. S. I. (1996) Tropical soil biology and fertility. In: A
handbook of methods. 2. ed. Wallingford, UK CAB International, 171p.
Andrade, A.G., Costa, G.S., Faria, S.M. (2000) Deposição e decomposição da
serapilheira em povoamentos de Mimosa caesalpiniifolia, Acacia mangium e
Acacia holosericea com quatro anos de idade em plantossolo. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, v.24, n.6, p.777-785.
Andren, O. and Lagerlof J. (1983) Soil fauna (microarthropods, enchytraeids,
nematodes) in Swedish agricultural cropping systems. Acta Agr. Scand. 33:
p.33-52.
Aulakh, M.S.; Doran, J.W.; Mosier, A.R. (1992) Soil denitrification -
sinigficance, measurement, and effects of management. Adv. Soil Sci., 18,
p.1-57.
Baird, C. (2002) Química Ambiental. Porto Alegre, Bookman, 622p.
Balieiro, F.C.; Franco, A.A.; Pereira, M.G.; Campello, E.F.C.; Dias, L.E; Faria,
S.M.; Alves, B.J.R. (2004) Dinâmica da serrapilheira e transferência de
nitrogênio ao solo, em plantios de pseudosamanae guachapele e
Eucalyptus grandis Revista Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.
39, n.6, p. 597-601.
Ball, A.S., Milne, E., Drake, B.G. (2000) Elevated atmospheric-carbon dioxide
concentration increases soil respiration in a mid-successional lowland forest.
Soil Biology & Biochemestry, 32, p.721-723.
Bardgett, R. D., Wardle, D. A. (2003) Herbivore-mediated linkages between
aboveground and belowground communities. Ecology 84, p.2258–2268.
Barreto, A. C.; Fernandes, M. F. (2001) Cultivo de Gliricidia sepium e Leucaena
leucocephala em alamedas visando a melhoria dos solos dos tabuleiros
costeiros. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 36, n. 10, p.
1287-1293.
Barros, N.F.de; Comerford, N.B. (2002) Sustentabilidade da produção de
florestas plantadas na região tropical. In: Alvarez V.; Schaefer,
116
C.E.G.R.; Barros, N.F.de; Costa, L.M. da; eds. Tópicos em Ciência
do solo. Viçosa, SBCS, p.487-592.
Bataglia, O.C.; Furlani, A.M.C.; Teixeira, J.P.F.; Furlani, P.R.; Gallo, J.R.
(1983) Métodos de análise química de plantas. Campinas, Instituto
Agronômico, 48p. (Boletim Técnico, 78)
Beare M. H., Coleman D. C., Crossley D. A. Jr., Hendrix P. F. and Odum E. P.
(1995) A hierarchical approach to evaluating the significance of soil
biodiversity to biogeochemical cycling. Plant and Soil 170, 5-22.
Bertrand, H., Nalin, R., Balli, R., Cleyet-Marel, J.C. (2001) Isolation and
identification of the most efficient plant growt promoting bacteria associated
with canola (Brassica napus). Biology and fertility soils, 33, p.142-156.
Bonito, G. M.; Coleman, D. C.; Haines, B. L.; Cabrera, M. L. (2002) Can
nitrogen budgets explain differences in soil nitrogen mineralization rates of
Forest stands along an elevation gradient. Forest Ecology and
Management, Amsterdam, v. 5991, p. 1-12,
Borneman, J.; Triplett, E.W. (1997) Molecular Microbial Diversity in Soils from
Eastern Amazonia: Evidence for Unusual Microorganisms and Microbial
Population Associated with Deforestation. Applied and Environmental
Microbiology, v.63, p.2647-2653.
Bossio, D.A., Scow, K.M. (1998) Impacts of carbon and flooding on soil
microbial communities: phospholipid fatty acid profiles and substrate
utilization patterns. Microb. Ecol., 35, p.265-278.
Bothe, H., Jost, G., Schloter, M., Ward, B.B., Witzel, K. (2000) Molecular
analysis of ammonia oxidation and denitrification in natural environments.
FEMS Microbiol Rev., 24, p.673-690
Boyle, S. A., Rich, J. J., Bottomley, P. J., Cromack, J. K., Myrold D. D. (2006).
Reciprocal transfer effects on denitrifying community composition and
activity at forest and meadow sites in the Cascade Mountains of Oregon.
Soil Biology and Biochemistry 38, p.870-878.
Braga, J.M., Defelipo, B.V. (1974) Determinação espectrofotométrica de fosfóro
em extrato de solo e material vegetal. R.Ceres, 21, p.73-85.
Braker, G., Fesefeldt, A.; Witzel, K. P. (1998) Development of PCR primer
systems for amplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect
denitrifying bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 64,
p.3769-3775.
Bremer, J. M., Mc Carty, G. W. (1993) Inhibition of nitrification in soil by
allelochemicals derived from plants and plant residues. Soil Biochemistry,
8:181-218.
117
Breslauer, K.J., Frank, R., Blocher, H., Marky, L.A. (1986) Predicting DNA
duplex stability from the base sequence. Proceedings of the National
Academy of Science of the U.S.A., v.83, p.3746-3750.
Brinkmann, W.L.F.; Nascimento, J.C. (1973) The effect of slash and burn
agriculture on plant nutrients in the Tertiany Region of Central Amazônia.
Acta AmazÔnica, Manaus, p.355-61.
Brookes, P.C. (1995) The use of microbial parameters in soil pollution by heavy
metals. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v.19, n.4, p.269-279.
Burle, M.L.; Mielniczuk, J.; Focchi, S. (1997) Effect of cropping systems on soil
chemical charateristics with emphasis on soil acidification. Plant Soil, v.190,
p.309-316.
Calvó, L., Vila, X., Abella, C.A., Garcia-Gil, L.J. (2004) Use of the ammonia-
oxidizing bacterial-specific phylogenetic probe Nso1225 as a primer for
fingerprint analysis of ammonia-oxidizer communities. Appl Microbiol
Biotechnol, 63, p.715-721.
Camargo, F. A. O., Gianello, C.; Tedesco, M. J., Vidor, C. (1999) Nitrogênio
orgânico no solo, p 117 - 137. In: Santos, G. A.; Camargo, F. A. O.
Fundamentos da matéria orgânica do solo: ecossistemas tropicais e
subtropicais. Porto Alegre: Gênesis, p.118-133.
Carmo, J. B.; Andrade, C.A.; Cerri, C.C.; Piccolo, M.C. (2005) Disponibilidade
de nitrogênio e fluxos N2O a partir de solo sob pastagem apos aplicação de
herbicidas Rev. Bras. Ci. Solo, v.29, p.735-746.
Carter, M. R. (1986) Microbial biomass and index for tillage-induced changes in
soil biological properties. Soil & Tillage Research, Amsterdam, v. 7, n. 1, p.
29-40.
Cattelan, A. J.; Vidor, C. (1990) Sistemas de culturas e a população microbiana
do solo. Revista Brasileira de Ciência do Solo. Campinas, v. 14, n. 2, p.
125-133.
Cattelan, A.J.; Gaudêncio, C.A.; Silva, T.A. (1997) Sistemas de rotação de
culturas em plantio direto e os microrganismos do solo, na cultura da soja,
em Londrina. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v.21, p.293-
301, 1997.
Cebron, A., Coci, M., Garnier, J., Laanbroek, H. J. (2004) Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis Analysis of Ammonia-Oxidizing Bacteria Community
Structure in the Lower Seine River: Impact of Paris Wasterwater Effluents.
Applied Environmental Microbiology, p. 6726–6737.
Cerri, C.C.; Andreux, F.; Eduardo, B.P. (1992) O ciclo do carbono no solo. In:
Cardoso, E.J.B.N.; Tsai, S.M.; Neves, M.C.P. Microbiologia do solo.
Campinas: SBCS. p.73-90.
118
Chadwick, O.A., Derry, L.A., Vitousek, P.M., Huebert, B.J., Hedin, L.O. (1999)
Changing sources of nutrients during four million years of ecosystem
development. Nature 397, p.491-497.
Christensen, M. (1989) A view of fungal ecology. Mycologia, v.81, p.1-19.
Clarke, K. R.; Warwick, R. M. (1994) Change in marine communities: an
approach to statistical analysis and interpretation. Natural Environmental
Research Council, UK, 144p.
Clegg, C. D.; Ritz, K.; Griffiths, B.S. (2000) % G1C profiling and cross
hybridization of microbial DNA reveals great variation in below-ground
community structure in UK upland grasslands. Applied Soil Ecology, 14,
p.125–134.
Colozzi Filho, A.; Balota, E. L., Andrade, S. (1999) Microrganismos e processos
biológicos nos sistema plantio direto. In: SIQUEIRA, J. O. et al. ed. Inter-
relação fertilidade, biologia do solo e nutrição de plantas. Lavras :
SBCS/UFLA, p.487-508.
Constantinides, M., Fownes, J.H. (1994) Nitrogen mineralization from leaves
and litter of tropical plants: relationship to nitrogen, lignin and soluble
polyphenol concentrations. Soil Biochem., 26, p.49-55.
Costa, G.S., Andrade, A.G., Faria, S.M. de (1997) Aporte de nutrientes pela
serapilheira de Mimosa Caesalpiniifolia (Sabia) com seis anos de idade.
Anais do III Simposio Nacional de Recuperação de Areas degradadas, Ouro
Preto-MG, p.344-349.
Coutinho, H.L.C., Oliveira, V.M., Manfio, G.P. & Rosado, A.S. (1999) Evaluating
the microbial diversity of soil samples: methodological innovations. Anais
Academia Brasileira de Ciências 71, p.491-503, 1999.
Coûteaux, M.M, Bottner, P., Berg, B. (1995) Litter decomposition, climate and
litter quality. Trends in Ecology & Evolution, 10, p.63-66.
Crutzen, P.J. (1981) Atmospheric chemical processes of the oxides of nitrogen,
including nitrous oxide. In: Delwiche, C.C. (ed.). Denitrification, nitrification
and atmospheric nitrous oxide. New York, John Wiley. p.17-44.
Dauber, J., Wolters, V. (2000) Microbial activity and functional diversity in the
mounds of three different and species. Soil Biology and Biochemistry, v.32,
p.93-99.
Davies, R.I.; Coulson, C.B.; Lewis, D.A. (1964) Polyphenols in plant humus and
soil: 3. J. Soil Sci.;15:229-309.
De Fede, K. L., Panaccione, D. G., Sextone, A. J. (2001) Characterization of
dilution enrichment cultures obtained from size-fractionated soil bacteria by
Biolog community-level physiological profiles and restriction analysis of 16S
rDNA genes. Soil Biol. Biochem., 33, p.1555-1562.
119
Defelipo, B.V., Ribeiro, A.C. (1981) Análise química do solo. Viçosa,
Universidade Federal de Viçosa, 17p. (Boletim de Extensão, 29)
Degans, B. P., Schipper, L. A., Sparling, G. P., Vojvodic-Vukovic, M. (2000)
Decreases in organic C reserves in soils can reduce the catabolic diversity
of soil microbial communities, Soil Biology and Biochemestry, 32, p.189-196.
Del Moral, R., Müller, C.H. (1970) The allelopathic effects of Eucalyptys
calmadulensis. American Midland Naturalist, v.83, n.1, p.160-200.
De-Polli, H.; Franco, A. A.; Almeida, D. L.; Duque, F. F.; Monteiro, E. M. S. &
Döbereiner, J. (1988) A biologia do solo na agricultura, Seropédica,
EMBRAPA / UAPNBS, 48p. (Documentos, 5).
D‘Haene, K.; Moreels, E.; De Neve, S.; Daguilar, B.C.; Boecky, P.; Hofman, G.;
Cleemput, O.V. (2003) Soil properties influencing the denitrification potencial
of Flemish agricultural soils. Biol. Fertil. Soils, 38, p.358-366.
Díaz-Raviña, M., Baath, E. (1996) Development of metal tolerance in soil
bacterial communities exposed to experimentally increased metal levels.
Applied and Environmental Microbiology, v.62, p.2970-2977.
Dilly, O.; Munch, J.C. (1996) Microbial biomass content, basal respiration and
enzyme activities during the course of decomposition of leaf litter in a Black
Alder (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) Forest. Soil Biology and Biochemestry,
28 (8), p.1073-1081)
Doran, J. W.; Coleman, D. C.; Bezdicek, D. F.; Stewart, B. A. (Eds.). (1994)
Defining soil quality for a sustainable environment. Wisconsin: American
Society of Agronomy.
Drozdowicz, A.G. (1991) Microbiologia ambiental. In: Roitman, I.; Travassos,
L.R.; Azevedo, J.L. (1991) Tratado de microbiologia. Rio de Janeiro:
Manole, v.2, p.1-102.
Duguma, B.; Kang, B.T.; Okali, D.U.U. (1988) Effect of liming and phosphorus
application on performance of Leucaena leucocephala in acid soils. Plant
and Soil, Dordrecht, v.110, p.57-61.
Ecossistemas (2001) Caatinga, Lojinha do wwf- [email protected]
Ekblad, A.; Hogberg, P. (2001) Natural abundance of 13C in CO2 respired from
forest soils reveals speed of link between photosynthesis and root
respiration. Oecologia. v. 127, n.3, p.305-308.
Embrapa. (1997) Serviço Nacional de Levantamento e Conservação de Solos.
Manual de Métodos de Análise de Solos. 2. ed. Rev. Atual. Rio de Janeiro,
SNLCS.
Engelen, B., Meiken, K., Witzingerode, F., Heuer, H., Malkomes, P.H.,
Backhaus, H. (1998) Monitoring impact of a pesticide treatment on bacterial
120
soil communities by metabolic and genetic fingeprint in addition to
conventional testing procudures. Appl. Environ. Microbiol., 64, p.2814-2821.
Ferreira, M.E.; Grattapaglia, D. (1995) Introdução ao uso de marcadores
moleculares RAPD e RFLP em análise genética. Brasília: EMBRAPA-
CENARGEN. p.220 (Embrapa-Cenargen Documento 20).
Forreter, D.I., Bauhus, J., Khanna, P.K., (2004) Growth dynamics in a mixed-
species plantation of Eucalyptus globulus and Acacia mearnsii. Forest
Ecology and Management, v.193, p.81-95.
Forreter, D.I., Bauhus, J., Cowie, A.L. (2005) On the success and failure of
mixed-species tree plantations: lessons learned from o model system of
Eucalyptus globulus and Acacia mearnsii. Forest Ecology and Management,
v.209, p.147-155.
Franco, A. A.; Dobereiner, J. (1994) A biologia do solo e a sustentabilidade dos
solos tropicais. Summa phytopathologica, JAGUARIÚNA, v. 20, p. 68-74.
Franco, A.A.; Dias, L.E.; Faria, S. M.; Campello, E.F.C.; Silva, E.M.R. (1995)
Uso de leguminosas florestais noduladas e micorrizadas como agentes de
recuperação e manutenção da vida do solo: um modelo tecnológico. Oecol.
Bras., 1, p.459-467.
Franco, A.A., Faria, S.M. (1997) The contribution of N2-fixing tree legumes to
land reclamation and sustainability in the tropics. Soil Biochem., 29, p.897-
983.
Freitag, T. E., Prosser, J. I. (2003) Community structure of ammonia-oxidizing
bacteria within anoxic marine sediments. Applied and Environmental
Microbiology 69, p.1359-1371.
Froufe, L.C.M (2003) Decomposição de folhas de plantios de eucalipto e
pupunha em un fragmento da Mata Atlântica no Norte Fluminense. 142f.
Tese (Doutorado em produção vegetal). UENF. Campos dos Goytacazes-
RJ.
Gama-Rodrigues, E.F; Barros, N.F.; Gama-Rodrigues, A.C.; Santos, G.A.
(2005) Nitrogênio, carbono e atividade da biomassa microbiana do solo em
plantações de eucalipto. R. Bras. Ci. Solo, 29, p.893-901.
Garbeva, P., van veen, J.A., van Elsas, J.D. (2004) Microbial diversity in soil:
Selection of microbial populations by plant and soil type and implications for
disease supressiveness. Annual Review of Phytopatology, 42, p. 243-270.
Germida, J.J., Siciliano, S.D., Freitas, J.R., Seib, A.M., (1998) Diversity of root-
associated bacteria associated with field-grown canola (Brassica napus) and
wheat (Triticum aestivum L.). FEMS Microbiology Ecology, 26, p.43-50.
Giacomini, S.J., Jantalia, C.P., Aita, C., Urquiaga, S.S., Alves, B.J.R. (2006)
Emissão de óxido nitroso com a aplicação de dejetos líquidos de suínos em
121
solo sob plantio direto. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.41, n.11, p.1653-
1661.
Grayson, S. J.; Grifftih, G. S.; Mawdesley, J. L.; Campebell, C. D., Bardgett, R.
D. (2001) Accounting of variability in soil microbial communities of temperate
upland grassland ecosystem. Soil Biol. Biochem., 33, p.533-551.
Goi, S. R.; Sprent, J. I.; James, E. K.; Jacob-Neto, J. (1992) Influence of
nitrogen form on the nitrogen fixation of Acacia auriculiformis. Symbiosis,
82, p.505-512.
Goi, S. R.; Sprent, J. I.; Jacob-Neto, J. (1997) Effect of different sources of N on
the structure of Mimosa caesalpiniaefolia root nodules. Soil Biol. Biochem.
29, p.983-987.
Goodfriend, W.L. (1998) Microbial community patterns of potential substrate
utilization: a comparison of salt marsh, sand dune, and seawater-irrigated
agronomic systems. Soil Biology and Biochemistry, v.30, p.1169-1176.
Griffihts, B.S.; Ritz, K.; Ebblewhite, N.; Dobson, G. (1999) Soil microbial
community structure: effects of substrate loading rates. Soil Biol. Biochem.,
v.31, p.145-133.
Grisi, B. M. (1995) Biomassa e a atividade de microorganismos do solo: revisão
metodológica. Revista Nordestina de Biologia, 10: p.1-22.
Gupta, V. V. S. R. & Germida, J. J. (1988) Distribution of microbial biomass and
itas activity in soil aggregate size classes as affected by cultivation. Soil
Biology and Biochemistry. 20, p.777-786.
Halloway, J.D.; Stork, N.D. (1991) The dimensions of biodiversity: the use of
invertebrates as indicators of human impact, In: Hawksworth, H.D., (Ed.)
The biodiversity of microorganisms and invertebrates: its role in sustainable
agriculture. Wallingforf, Oxon, Ox 10 8DE, p.37-63.
Hamilton, J.G., Thomas, R.B., Delucia, E.H. (2001) Direct and indirect effects of
elevated CO2 on leaf respiration in a forest ecosystem. Plant Cell
environment, 24, p.975-982.
Hardy, R. W. F., Holsten, R.D., Jackson, E.K., Burns, R.C. (1968) The
acetylene–ethylene assay for N
2
fixation: laboratory and field evaluation.
Plant Physiology 43, p.1185-1207.
Hart, S.C.; Stark, J.M.; Davidson, E.A.; Firestone, M.K. (1994) Nitrogen
mineralization, immobilization and nitrification. In: Weaver, R.W. (ed.)
Methods of soil analysis. Part 2: Microbiological and Biochemical Properties.
Soil Science Society of America, Inc. p. 985-1017.
Hedin, L.O., Vitousek, P.M., Matson, P.A. (2003) Pathways and implications of
nutrient losses during four million years of tropical forest ecosystem
development. Ecology 84 (9), p.2231-2255
122
Heuer, H.; Smalla, K. (1997) Application of denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis for
studying soil microbial communities,. In Van Elsas, J.D., Wellington, E.M.H.,
Trevors, J. (ed.), Modern Soil Microbiology. Marcel Dekker, Inc., New York,
N.Y, p. 353-373.
Hu, S. J., Van Bruggen, A. H. C., Grunwald, N. J. (1999) Dynamics of bacterial
populations in relation to C availability in a residue-amended soil. Appl. Soil
Ecol., 13, p.21-30.
Hugenholtz, P.; Pace, N.R. (1996) Identifying microbial diversity in the natural
environment: a molecular phylogenetic approach. Trends in Biotechnol. 14,
p.190-197.
Ilies, P., Mavinic, D.S. (2001) The Efect of Decreased Ambient Temperature on
the Biological Nitrification and Denitrification of a High Ammonia Landfill
Leachate. Water Research. Britain.Vol. 35, N° 8, p. 2065-2072.
Jetten, M.S.M.; Strous, M.; Van De Pas-Schoonen, K.T.; Schalk, J.; Van
Dongen, U.G.J.M.; Van De Graaf, A. A.; Logemann, S.; Muyzer, G.; Van
Loosdrecht, M.C.M.; Kuenen, J.G.. (1999) The anaerobic oxidation of
ammonium. FEMS Microbiology Reviews 22, p. 421-43.
Jetten, M.S.M.; Sliekers, A. O.; Third, K. A.; Abma, W.; Kuenen, J.G.. (2003)
Canon and Anammox in a gas-lift reactor. FEMS Microbiology Letters 218,
p. 339-344.
Johnson, M. J.; Lee, K. Y.; Scow, K. M. (2003) DNA fingerprint reveals links
among agricultural crops, soil properties, and the composition of soil
microbial communities. Geoderma, Amsterdam, v. 114, n. 3/4, p. 279-303.
Joshi S.R., Sharma G.D, Mishra R.R., (1993) Microbial enzyme activities
related to litter decomposition near a highway in a subtropical forest of North
East India, Soil. Biol. Biochem. 25, p.1763-1770.
Kaiser, O., Puhler, A., Selbitschka, W., (2001) Phylogenetic analysis of
microbial diversity in the rizoplane of oilseed rape (Brassica napus
cv.Westar) employing cultivation-dependent and cultivation-independent
approaches. Microbial Ecology, 42, p.136-149.
Kannegiesser, U. (1990) Apuntes sobre algunas acacias australianas. 1.-Acacia
mearnsii De Willd. Ciencia e Investigación Forestal, v.4, n.2, p.198-202.
Keller, M.; Veldkamp, E.; Weitz, A.M.; Reiners, W.A. (1993) Effect of pasture
age on soil trace-gas emissions from a deforested area of Costa Rica.
Nature, 365, p.244-246.
Kennedy, A . C. & Smith,K.L. (1995) Soil microbial diversity and the
sustainability of agricultura soils. Plant and Soil,170, p.75-76.
Kennedy, A.C. (1999) Bacterial diversity in agroecosystem. Agriculture
Ecosystem and Environmental. V.74, n.1, p. 65-76.
123
Kögel-Knabner, I, (2002). The Macromolecular Organic Composition of Plant
and Microbial Residues as Inputs to Soil Organic Matter.Organic Matter. Soil
Biology and Biochemistry 34 p.139-162.
Kovács, M. (1992) Biological Indicators in Environmental Protection. Akadémia
Kiadó é Nyomda Vállat, Budapest, 200p.
Kowalchuk, G.A.; Stephen, J.R.; De Boer, W.; Prosser, J.I.; Embley, T.M.;
Woldendorp, J.W. (1997). Analysis of ammonia-oxidizing bacteria of the
Subdivision of the class Proteobacteria in coastal sand dunes by Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis and sequencing of PCR-amplified 16S
Ribosomal DNA fragments. Appl. Environ. Microbiol. 63, p.1489-1497.
Kowalchuk, G.A., Stienstra, A.W., Heilig, G.H., Stephen, J.R., Woldendorp, J.W.
(2000) Molecular analysis of ammonia-oxidizing bacteria in soil of
successional grasslands of the Drentsche A (The Netherlands). FEMS
Microbiol Ecol, 31, p.207-215
Kroeze, C. (1993) Global warming by halocarbons and nitrous oxide. PhD
Thesis, University of Amsterdam, p.187.
Lavelle, P. (2000) Ecological challenges for soil science. Soil Science,
Washington, v. 165, n. 1, p. 73-86.
Leita, L.; Nobile, M; de; Muhlbachova, G.; Mondoni, C.; Marchiol, L.; Zerbi, G.
(1995) Bioavailability and effects of heavy metals on soil microbial biomass
survival during laboratory incubation. Biology and Fertility of Soils, Berlin,
v.19, n.2-3, p.103-108.
Leitão Filho, H.F. (1987) Considerações sobre a florística de florestas tropicais
e subtropicais do Brasil. IPEF, Piracicaba, 35: p.41-46.
Lensi, R., Mazurie, S., Gourbiere, F., Josserand, A. (1986) Rapid determination
of the nitrification potential of an acid forest soil and assessment of its
variability. Soil Biology and Biochemistry 18, p.239-240.
Liu, X.; Tiquia, S.M.; Holguin, G.; Wu, L.; Nold, S.C.; Devol, A.H.; Luo, K.;
Palumbo, A.V.; Tiedje, J.M.; Zhou, J. (2003) Molecular Diversity of
Denitrifying Genes in Continental Margin Sediments within the Oxygen-
Deficient Zone off the Pacific Coast of Mexico. Appl. Environ. Microbiol. 69,
p.3549-3560.
López, A., Jesus, H.S. de, Rocha, M. de M., Fries, M., Urquiaga, S., Alves,
B.J.R. (1998) Diagnóstico do potencial de nitrificação e desnitrificação em
solo sob pastagens de Bracharia sp. e solo sob plantio direto e
convencional. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, nov. 1998. 24p.
(Embrapa-CNPAB. Documentos, 78).
Loreau, M. (2001) Microbial diversity, producer-decomposer interaction and
ecosystem processes: a theoretical model. Proceedings: Biological
Sciences, London, v. 268, p. 303-3098.
124
Louzada, M.A.P.; Quintela, M.F.S.; Penna, L.P.S. (1995) Estudo comparativo
da produção de serapilheira em áreas de Mata Atlântica, floresta secundária
“antiga” e uma floresta secundária (capoeira). Oec. Bras., 1:61-74.
Lupwayi, N.Z., Arshad, M.A., Rice, W.A., Clayton, G.W. (2001) Bacterial
diversity in water-stable aggregates of soils under conventional and zero
tillage management. Applied Soil and Ecology, v.16, p.251-261.
Magurran, A.E. (1988) Ecological Diversity and its Measurement. New Jersey:
Princeton University Press. 179p.
Marchiori Jr. M.; Melo, W.J. (1999) Carbono, carbono da biomassa microbiana
e atividade enzimática em um solo sob mata natural, pastagem e cultura do
algodoeiro. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v. 23, p.257-263.
Margalef, R. (1958) Temporal succession. In: Pouzza, T., Travers, M.
Perspective in marine biology Berkeley. University of California (eds). p.
323-347.
Marscher, H., Römheld, V. (1983) In vivo measurement of root-induced pH
changes at the soil-root interface: effect of plant species and nitrogen
source, Zeitschrift fur Pfanzenernahrung und Bodenkunde. 111, p.241-251.
Marschner, P., Kandeler, E., Marschner, B. (2003) Structure and fonction of the
soil microbial community in a long-term fertilzer experiment. Soil Biol. Bioch.,
35, p.453-461.
Matson, P.A.; Vitousek, P.M.; Ewel, J.J.; Robertson, G.P. (1987) Nitrogen
Transformations Following Tropical Forest Felling and Burning of a Volcanic
Soil. Ecology, 68: p.491-502.
McCaig, A. E., L. A. Glover, and J. I. Prosser. (2001) Numerical analysis of
grassland bacterial community structure under different land management
regimes by using 16S ribosomal DNA sequence data and denaturing
gradient gel electrophoresis banding patterns. Applied and Environmental
Microbiology, 67, p.4554–4559.
Melillo, J.M.; Steudler, P.A.; Feigl, B.J.; Neill, C.; Garcia, D.; Piccolo, M.C.;
Cerri, C.; Tian, H. (2001) Nitrous oxide emissions from forests and pasture
of various ages in the Brazilian Amazon. J. Geophys. Res., 106:179- 188.
Melloni, R.; Pereira, E. G.; Trannin, I. C. B.; Santos, D. R. dos; Moreira, F. M.
S.; Siqueira, J. O. (2001) Características biológicas de solos sob mata ciliar
e campo cerrado no sul de Minas Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras,
v. 25, n. 1, p. 7-13.
Melo, I. S. & Valadares, M. V. I. (1998). In: Melo, I., S. & Azevedo, J., L. de
(eds),Métodos de extração de DNA e sua aplicação em estudos genéticos e
ecológicos. Ecologia Microbiana p. 187-200.
125
Mendonça, E. S., Loures, E. G. (1996) Matéria orgânica do solo. In: Apostila de
Fertilidade do Solo. Viçosa. Imprensa Universitária. p. 118-147.
Minchin, F. R., Witty, J.F., Mytton, L.R. (1994) Reply to ‘‘Measurement of
nitrogenase activity in legume root nodules: in defence of the acetylene
reduction assay.’’ Plant and Soil 158, p.163-167.
Monteiro, M. T. (2001) Carbono, Nitrogênio e Atividade da Biomassa
Microbiana: indicadores de Qualidade do Solo e da Serapilheira em Sítios
Florestais do Norte Fluminense. Campos dos Goytacazes, Universidade
Estadual do Norte Fluminense, 75p. (Tese de Mestrado)
Monteiro, M. T., Gama-Rodrigues, E.F. (2004) Carbono, nitrogênio e atividade
da biomassa microbiana em diferentes estruturas de serapilheira de uma
floresta natural. R. Bras. Ci. Solo, 28, p.819-826.
Moore R., Anderson A. R., Ray D., Walker C., Pyatt D. G., Evans H. F., Carter
C. I., Straw N. A., Wainhouse D. and Winter T. G. (1995) Soil biodiversity: a
literature review. Scottish Natural Heritage, No 17.
Moraes, J.F.L. (1991) Conteúdos de carbono e tipologia de horizontes nos
solos da bacia Amazônica. Piracicaba: CENA/USP, 1991. 84p. Dissertação
de Mestrado.
Moreira, F.M.S., Siqueira, J.O. (2002) Microbiologia e bioquímica do Solo.
Minas Gerais, p.231-232.
Mullis, K., Faloona, F. (1987) Specific synthesis of DNA in nitro via a
polymerase catalysed chain reaction. Method in Enzymology, v.55, p.335-
350.
Muyzer, G.; De Waal, E.C.; Uitterlinden, A.G. (1993) Profiling of Complex
Microbial Populations by Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis Analysis of
Polymerase Chain Reaction-Amplified Genes Coding for 16S rRNA. Appl.
Environ. Microbial. 59 p.695-700.
Muyzer, G., Brinkhoff, T., Nübel, U., Santegoeds, C., Schäfer, H., Wawer, C.,
(1998) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology.
In: Akkermans, A.D.L., Van Elsas, J.D.; De Bruijn, F.J., (Eds). Molecular
Microbial Ecology Manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The
Netherlands p.1-23.
Muyzer, G., Smalla, K (1998). Application of denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis
(TGGE) in microbial ecology. Mini review. Antonie van Leeuwenhoek
73:127-141.
Muyzer, G. (1999) Genetic fingerprinting of microbial communities – present
status and future perspective. In: International Symposium of Microbial
Ecology, 8, Halifax.
http://www.plato.acadiau.ca/isme/symposyum16/muyzer.pdf (9 Mar. 2002)
126
Myers, R.M., Fischer, S.G., Lerman, L.S., Maniatis, T., (1985) Nearly all single
base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected
by denaturing gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Research, 13, p
.3131-3145.
Ndaw, S.M. (2003) Diversidade, biomassa e atividade microbiana como
indicadores de qualidade do solo e da serapilheira em sítios sob diferentes
coberturas vegetais na região Norte Fluminense. Campos dos Goytacazes,
Universidade Estadual do Norte Fluminense, 98p. (Tese de Mestrado)
Neill, C.; Garcia-Montiel, D.C.; Piccolo, M.C.;.; Steudler, P.A.; Melillo, J.M.;
Feigl, B.J.; Cerri, C. (1995) Nitrogen dynamics in soils of forest and active
pasture in the western Brazilian Amazon basin. Soil Biol. Biochem.,
27:1167-1175.
Neill, C.; Garcia-Montiel, D.C.; Piccolo, M.C.; Cerri, C.; Steudler, P.A.; Melillo,
J.M.; Brito, M. (1997) Net nitrogen mineralization rates in soils following
deforestation for pasture across the southwestern Brazilian Amazon Basin
Landscape. Oecologia, 110:243-252.
O’donnel, A.G.; Gorres, H. (1999) 16S rDNA methods in soil microbiology.
Current Opinion in Biotechnology. v.10, p.225-229.
Odum, E. P. (1988) Populações em comunidades. In: Odum, E.P., Eds.,
Ecologia. São Paulo: Guanabara, p. 258-272.
Ogram, A.; Sayler, G.S. & Barkay, T.J. (1987) The extraction and purification of
microbial DNA from sediments. J. Microbiol. Methods 7, p.57-67.
Oliveira, R.R.; Lacerda, L.D. (1993) Produção e composição química da
serapilheira na Floresta da Tijuca (RJ). R. Brasil. Bot., 16:93-99.
Orlov, D.S. (1995) Humic Substances os Soils and General Theory of
Humification. Balkema, Canada, 323p.
Ovreas, L., Forney, L., Daae, F. L., Torvisk, V. (1997) Distribution of
bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvanet, as determined by
denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments
coding for 16S r RNA. Appl. Environ. Microbiol., 63: p.3367-3373.
Palm, C.A., Gachengo, C.N., Delve R.J., Cadisch, G. & Killer, K.E. (2001.)
Organic Inputs for Soil Fertility Management in Tropical Agro ecosystems:
Application of um Organic Resource Database, Agriculture, Ecosystems &
Environment, 83: p.27-42.
Pankhurst C. E., Ophel-Keller K., Doube B. M. and Gupta V. V. S. R. (1996)
Biodiversity of soil microbial communities in agricultural systems.
Biodiversity and Conservation 5, 197-209.
Panilov, N. S. (1999) Understanding and prediction of soil microbial community
dynamics under global change. Applied Soil Ecology, Amsterdam, v. 11, n.
1, p. 161-176.
127
Paoletti, M., G. (1999) Using bioindicators based on biodiversity to assess
landscape sustainability. Agriculture, Ecossystems and Environment, v. 74
(1-3), p.1-18.
Patra, A. K. ; Abbadie, L. ; Clays-Josserand, A. ; Degrange, V. ; Grayston, S.
J. ; Loiseau, P. ; Louault, F.; Mahmood, S.; Nazaret, S.; Philippot, L.; Poly,
F.; Prosser, J.I.; Richaume, A.; Le Roux, X. (2005) Effects of grazing on
microbial functional groups involved in soil N dynamics. Ecological
Monographs, 75(1), p.65-80.
Paul, E.A.; Clark, F.E. (1989) Soil microbiology and biochemistry. San Diego:
Academic Press, 1989. 273p.
Pereira, J. C.; Neves, M. C. P.; Drozdowicz, A. (1999) Dinâmica das
populações bacterianas em solos de cerrados. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, v.34, n5, p.801- 811.
Perry, D. A.; Amaranthus, M. P.; Borchers, J. G.; Borchers, S. L.; Brainerd, R.
E. (1989) Bootstrapping in ecosystems. Bioscience. 39, p.230-237.
Philippot, L.; Piutti, S.; Martin-Laurent, F.; Hallet, S.; Germon. J. C. (2002)
Molecular analysis of the nitrate-reducing community from unplanted and
maize-planted soils. Applied and Environmental Microbiology, 68, p.6121–
6128.
Piccolo, M.C.; Neill, C.; Cerri, C. (1994) Net Mineralization and Net Nitrification
Along a Tropical Forest-to-Pasture Chronosequence. Plant and Soil 162: p.
61-70.
Pimm, S. L. & R.A.Askins. 1995. Forest losses predict bird extinctions in
eastern North America. Proc. Natl. Acad. Sci, 92: 9343-9347.
Pimm, S.L., G.J. Russel, J.G. Gittleman & T.M. Brooks. 1995. The future of
biodiversity. Science, 347-350.
Pinto, C. (2001) Contribuição de espécies arbóreas de diferentes fases
sucessionais da Floresta Ombrófila Densa das Terras Baixas para ciclagem
de nutrientes minerais, Floresta Estadual do Palmito, Paranaguá, PR.
Curitiba, 2001. 68p. Dissertação (Mestrado em Engenharia Florestal), Setor
de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Paraná.
Pompéia, S. L. (1994) Procedimentos técnicos para recuperação de áreas
degradadas por poluição. In: I Simpósio Sul-Americano e II Simpósio
Nacional de recuperação de Áreas degradadas. Curitiba. Anais...Curitiba.
679p.
Postgate, J. R. The fundamentals of nitrogen fixation. (1987) Cambridge:
Cambridge University Press, 252p.
128
Priemé, A.; Timmis, K. N.; Nedwell D. B.; Osborn, A. M. (2002) Diversity of
nitrite reductase (nirK and nirS) gene fragments in forested upland and
westland soils. Appl. Environ. Microbiol. 68, p.1893-1900.
Primack, R.B. (1993) Essentials of Conservation Biology. Sinauer Associates,
Inc., Sunderalnd, Massachussets, 564 p.
Rapport, R.L. (1983) Indicators of water quality from an ecosystem perspective.
manuscript for "Informal Meeting on Water Use and Quality Statistics" at
Conference of European Statisticians, Geneva, 12-14 Dec. Statistics
Canada, Ottawa, Ont. 12 p.
Raven, J.A., Franco, A.A., Jesus, E.L. de, Jacob-Neto, J. (1990) H+ extrusion
and organic acid synthesis in N2-fixing symbioses involving vascular plants.
New phytologist, 114, p.369-389.
Reiners, W.A.; Bouwman, A.F.; Parsons, W.F.J.; Keller, M. (1994) Tropical rain
forest conversion to pasture: Changes in vegetation and soil properties.
Ecol. Appl., 4:363- 377.
Rice, E. L. (1984) Allelopathy. Academic Press, Inc New York
Rigaud, J. ; Puppo. A. (1977) Effect of nitrite upon leghaemoglobin and
interaction with nitrogen fixation. Biochem. Biophys. Acta, 497, p.702-706.
Rogers, B.F.; Tate III. (2001) Temporal analysis of the soil microbial community
along a toposequence in Pineland soils. Soil Biology and Biochemistry, v.33,
n.10, p.1389-1401.
Rosado, A.S.; Seldin, L.; Wolters A.C. & Van Elsas, J.D. (1996) Quantitative
16S rDNA-targeted polymerase chain reaction and oligonucleotide
hybridization for detection of Paenibacillus azotofixans in soil and the Wheat
rhizosphere. FEMS Microbiol. Ecol. 19, p.153-164.
Rosado, A.S., Duarte, G.F., Seldin, L., Van Elsas, J.D. (1997) Molecular
Microbial Ecology: a minireview. Rev. Microbiol. 28: 135-147.
Rosado, A. S. (2000) Diversidade e ecologia de microrganismos do solo. In:
Reunião Brasileira de Fertilidade e Nutrição de Plantas, 23; Reunião
Brasileira Sobre Micorrizas, 7; Simposio Brasileiro de Microbiologia do Solo,
5; Reunião Brasileira de Biologia do Solo, 2, 2000, Santa Maria. Anais...
Santa Maria: UFSM, 2000. CD-ROM..
Rosado, A.S., Duarte, G.F. (2002) Utilização de eletroforese em gel com
gradientes de desnaturantes (DGGE) e gel com gradiente de tempertura
para estudar a diversidade microbiana. In: Genética e melhoramento de
microrganismos. Mello, I.S. (ed). EdUSP, São Paulo, p.97-129.
Ross, D.J. Speir, T.W.; Kettles, H.A.; Tate, K.R.; Mackay, A.D. (1995) Soil
Microbial Biomassm, C and N Mineralization. And Enzyme Activities in Hill
Pasture: Influence of Grazing Management. Australian Journal of Soil
Research, 33: p.943-959.
129
Rowan, A.K., Snape, J.R., Fearnside, D., Barer, M.R., Curtis, T.P., Head, I.M.
(2003) Composition and diversity of ammonia-oxidizing bacterial
communities in wastewater treatment reactors of different design treating
identical wastewater. FEMS Microbiol Ecol, 43, p.195-206
Rustead, L.E.; Huntington, T.G.; Boone, R.D. (2000) Controls on soil
respiration: implications for climate change. Biogeochemistry, v. 49, n. 1, p.
1-6.
Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.;
Mullins, K.B. & Erlich, H.A. (1998) Primer-directed enzymatic amplification of
DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239, p.487-494.
Santos, D.R. dos (2000) Fósforo, fungo micorrízico e Azorhizobium na
produção de fitomassa e nutrição de Sesbania virgata e Sesbania rostrada.
Dissertação (Mestrado em Agronomia/Solo e Nutrição de Planta), Lavras-
MG, Universidade Federal de Lavras, MG, 88p.
Scala, D. J.; Kerkhof, L. J. (1998) Nitrous oxide reductase (nosZ) genes specific
PCR primers for detection of denitrifiers and three nosZ genes from marine
sediments. FEMS Microbiol. Lett., 162, p.61-68
Serrana, 2000
http://www.serrana.com.br/Boletins/Fertilizantes/4_2000/dinamica_nitro.pdf.
Shannon, C. E., Weaver, W. (1949) The Mathematical Theory of
Communication. University Ilinois Press, Urbana.
Sheffield, V.C., Cox, D.R., Myers, R.M., (1989) Attachment of a 40bp G+C rich
sequence (GC-Clamp) to genomic DNA fragments by polymerase chain
reaction results in improved detection of single-base changes. Proceedings
of the National Academy of Sciences USA, 86, p.232-236.
Shrestha, N. K., Hadano, S., Kamachi, T., Okura, I. (2001). Conversion of
Ammonium to Dinitrogen in Wastewater by Nitrosomonas europaea. Applied
Biochemistry and Biotechonology. V. 90, p. 221–232.
Silva Filho, G.N.; Vidor, C. (1984) As práticas de manejo de solo na população
microbiana. Revista Brasileira de Ciência do Solo. v. 8, n. 5, p. 291-296.
Silva, I.F.; Mielniczuk, J. (1997) Avaliação do estado de agregação do solo
afetado pelo uso agrícola. Rev Bras Ci Solo, v.21, p.313-319.
Simpson, E.H. (1949) Measurement of diversity. Nature, v.163, n.4148, p.688.
Sinsabaugh R.L., Moorhead D.L., Linkins A.E., (1994) The enzymatic basis of
plant litter decomposition: emergence of an ecological process, Appl. Soil
Ecol. 1, p.97-111.
Siqueira, J. O., Franco, A. A (1988) Biotecnologia do solo: Fundamentos e
Perspectivas. 1nd. MEC/ESAL/FAEPE/ABEAS/, D.F., Brasília, 236p.
130
Siqueira, J.O.; Moreira, F.M.S.; Grisi, B.M.; Hungria, M.; Araujo, R.S. (1994)
Microrganismos e processos biológicos do solo: perspectiva ambiental.
Brasília: Embrapa-SPI, 1994. p.142. (Embrapa-CNPAF. Documentos, 45).
Sliekers, A. O.; Derwort, N.; Campos Gomes, J.L.; Strous, M.; Kuenen, J.G.;
Jetten, M.S.S.. (2002) Completely Autothrophic Nitrogen Removal over
Nitrite in one Single Reactor. Water Research 36, p. 2475-2482.
Smalla, K.; Creswell, L.C.; Mendonça-Hagler, L.C.; Wolters, A. & Van Elsas,
J.D. (1993) Rapid DNA extraction protocol from soil for polymerase chain
reaction-mediated amplification. J. Appl. Bacteriol. 74, p.78-85.
Smalla, K., Wieland, G., Buchner, A., Zock, A., Parzy, J., Kaiser, S., Roskot, N.,
Heur, H., Berg, G. (2001) Bulk and rhizosphere soil bacterial communities
studied by denaturing gradient electrophoresis: plantdependent enrichment
and seasonal shifts revelead. Applied and Environmental Microbiology, 67,
p.4742-4751.
Smit, E.; Leeflang, P.; Gommans, S.; Van Den Broek, J.; Van, M. S.; Wernars,
K. (2001) Diversity and seasonal fluctuations of the dominant members of
the bacterial soil community in a wheat field as determined by cultivation
and molecular methods. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, v. 67, n. 5, p. 2284-2291,
Smith, M.S., Tiedje, J.M. (1979) The effects of roots on soil denitrification. Soil.
Sci. Soc. Am. J., 43: p.951-955.
Souza, I.M.Z. (2005) Carbono e nitrogênio da biomassa microbiana do solo em
áreas reflorestadas comparadas ao campo e mata nativa do Planalto dos
Campos Gerais, SC. Lages: UDESC, 2005. 61p. (Dissertação tese de
Mestrado em Ciência do Solo).
Staley, J. T. (1997) Biodiversity: are microbial species threatened? Current
Opinion in Biotechnology, 8, p.340-345.
Steudler, P.A.; Melillo, J.M.; Bowden, R.D.; Castro, M.S. (1991) The Effects of
Natural and Human Disturbances on Soil Nitrogen Dynamics and Trace Gas
Fluxes in a Puerto Rican Wet Forest. Biotropica, 23 (4): p.356-363.
Stevenson, F. J. (1986) Cycles of soil: carbon, nitrogen, phosphorus, sulfur,
micronutrients. New York: J. Wiley & Sons, 380 p.
Stevenson, F.J. (1994) Organics forms of soil nitrogen. In: Humus chemistry;
genesis, composition, reactions. 2.ed. New York, John Wiley& Sons, p.59-
95.
Stewart, G.R.; Pates, J.S.; Unkovich, M. (1993) Characteristics of inorganic
nitrogen assimilation of plants in fire-prone Mediterranean type vegetation.
Plant, cell and environment 16, p.351-363.
131
Stouthamer, A.H.; Van’T riet, J.A., Oltmann, L.F. (1980) Respiration of nitrate as
acceptor. In: Knowles, C.J., ed. Diversity in bacterial respiratory systems.
Boca Raton, CRC Press, v.2, p.19-48.
Sugimoto, N., Nakano, S., Yoneyama, M., Honda, K. (1996) Improved
thermodynamic parameters and helix initiation factor to predict stability of
DNA duplex. Nucleic Acid Research, v.24, p.4501-4505.
Swift, M.J.; Anderson, J.M. (1993) Biodiversity and ecosystem Function. In :
Agricultural Systems: New York, v.99 p.15-41.
Tedesco, M.J., Gianello, C., Bissani, C.A., Bohnen, H. & Volkweiss, S.J. (1995)
Análise do Solo, Plantas e Outras Materiais UFRS, Porto Alegre, 174p.
Testa, V.M.; Teixeira, L.A.J.; Mielniczuk, J. (1992) Características químicas de
um Podzólico Vermelho-Escuro afetadas por sistemas de cultura. Rev Bras
Ci Solo, v.16, p.107-114.
Thirukkumaran, C.M., Parkinson, D. (2000) Microbial respiration, biomass,
metabolic quotient and litter decomposition in a lodgepole pine forest floor
amended with nitrogen and phosphorus fertilizers. Soil Biology &
biochemistry, 32, p.59-66.
Tian, G.; Tang, B.C.; Brussaard, L. (1992) Biological effects of plant residues
with contrasting chemical compositions under tropical conditions-
decomposition and nutrient release. Soil Biol. Biochem., 24, p.1051-1060.
Tian, G., Brussaard, L., Kang, B.T. (1995) An index for assessing the quality of
plant residues and evaluating their effects on soil and crop in the (sub-)
humid tropics. Appl. Soil Ecol., 2, p.25-32.
Tiedje, J.M. (1988) Ecology of denitrification and dissimilatory nitrate reduction
to ammonium. In: Alexander, J.B.Z., ed. Biology of anaerobic organisms.
New York, John Wiley, 1988. p.179-244.
Tiedje, J. M., Simkins, S., Groffman, P.M. (1989) Perspectives on measurement
of denitrification in the field includingrecommended protocols for acetylene
based methods. Plant and Soil 115, p.261-284.
Tiedje, J. M.; Cho, J. C.; Murray, A.; Treves, D.; Xia, B.; Ahou, J. (2001) Soil
teeming with life: new frontiers for soil science. In: Rees, R. M.; Ball, B. C.;
Campbell, C. D.; Watson, C. A. (Org.). Sustainable management of soil
organic matter. Wallingford: CAB International, p. 393-412
Tomé Júnior, B. (1997) Manual para interpretação de análise de solo. Guaíba:
Agropecuária. 247p.
Torsvik, V., Øvreås, L. (2002) Microbial diversity and function in soil: from genes
to ecosystems. Current Opinion in Microbiology, Amsterdam, v. 5, n. 3, p.
240–245.
132
Trevors, J. (1996) Nucleic acids in the environment. Curr. Opin. Biotechnol. 7,
p.331-336.
Turco, R. F.; Kennedy, A. C.; Jawson, M. D. (1994) Microbial indicators of soil
quality. In: Doran, J. W.; Coleman, D. C.; Bezdicek, D. F.; Stewart, B. A.
Defining soil quality for a sustainable environment. Madison: SSSA.
Turco, R.F.; Blume, E. (1998) Indicator of Soil Quality. In: Siqueira, J.O.;
Moreira, F.M.; Lopes, A.S.; Guilherme, L.R.G.; Faquin, A.E.; Furtini Neto,
A.E.; Carvalho, J.M. (Ed.). Inter-Relação Fertilidade, Biologia do solo, e
Nutrição de Plantas. Lavras: Sociedade Brasileira de Ciência do Solo,
p.529-550.
Turner, G. L., Gibson, A.H. (1980) Pages 111–138 in F. Bergersen, editor.
Methods for evaluating biological nitrogen fixation. John Wiley and Sons,
Chichester, UK. Vessey, J. K. 1994. Measurement of nitrogenase activity in
legume root nodules: in defense of the acetylene reduction assay. Plant and
Soil 158, p.151-162.
Van Elsas, J.D.; Wellington, E.M.H. & Trevors, J.T. (1997) Modern Soil
Microbiology. New york, Marcel Dekker.
Van Soest, P., Wine, R. H. (1968) Development of a comphrehensive system of
feed analysis and its applications to forages. J. Assoc. Official Agr. Chem.,
Madison, 51: p.780-785.
Vanlauwe, B.; Diels, J.; Sanginga, N., Merckx, R. (1997) Residue quality and
decomposition: An unsteady relationship? In: CADISCH, G. & GILLER, K.E.,
eds. Driven by nature: Plant litter quality and decomposition. Wallingford,
CAB International, 1997. p.157-166.
Vargas, L. K. & Scholles, D. (2000) Biomassa microbiana e produção de C-CO
2
e N mineral de um podzólico vermelho escuro submetido a diferentes
sistemas de manejo. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Brasília, v. 24,
p. 35-42.
Vaughan, D. (1998) Biodiversity and agricultural practice: why should
agriculturists care? Network Paper. Agricultural Administration. Research
and Extension Network. Overseas Development Institute, Londres v. 82, p.
1-5.
Veen, J.A.; Van Overbeek, L.S.; Van Elsas, J.D. (1997). Fate and activity of
microrganisms introduced into soil. Microbiology and Molecular Biology
Review v.61 pp. 121-135.
Veldkamp, E. (1994) Organic carbon turnover in tropical soils under pastures
after deforestation. Soil Science Society of America. Journal, v.58, p.175-
180.
Veldkamp, E.; Davidson, E.; Erickson, H.; Keller, M.; Weitz, A. (1999) Soil
Nitrogen Cycling and Nitrogen Oxide Emissions Along a Pasture
133
Chronosequence in the Humid Tropics of Costa Rica. Soil Biology and
Biochemistry, 31: p.387-394.
Verchot, L.V.; Davidson, E.A.; Cattânio, J.H.; Ackerman, I.L.; Erickson, H.E.;
Keller, M. (1999) Land use change and biogeochemical controls of nitrogen
emissions from soil in eastern Amazon. Global Biogeochem. Cycles, 13:31-
46.
Vessey, J. K.; Waterer, J. (1992) In search of the mechanism of nitrate inhibition
ofnitrogenase activity in legume nodules: recent developments. Physiol.
Plant., 84, p.171-176.
Vessey, J. K. (1994) Measurement of nitrogenase activity in legume root
nodules: in defense of the acetylene reduction assay. Plant and Soil,
158:151–162.
Vetriani, C., Jannasch, H.W.; MacGregor, B.J., Stahl, D.A.; Reysenbach, A.H.
(1999) Population structure and phylogenetic characterization of marine
benthic Archeae in deep-sea sediments. Applied and Environmental
Microbiology, v.65, p.4375-4384.
Vidotti, E.C.; Rollemberg, M.C.E. (2004) Algas: Da economia nos ambientes
aquáticos à bioremediação e à química analítica. Quim. Nova, v.27, p.139-
145.
Vitousek, P.; Gosz, J.R; Grier, C.C.; Melillo, J.M.; Reiners, W.A.; Todo, RL.
(1982) A comparative analysis of potential nitrification and nitrate mobility in
forest ecosystems. Ecological Monographs, 52, p.155-177.
Von Sperling, M. (2002) Princípio do Tratamento Biológico de Águas
Residuárias – Lodos Ativados. Vol. 4. 2ª edição. Editora FCO. UFMG. Belo
Horizonte. Minas Gerais.
Waksman, S.A. (1927) Principles of soil microbiology. Baltimore: The Williams
and Wilkins, 897p.
Walker, B. H. (1992) Biodiversity and ecological redundancy. Conserv.Biol. 6,
p.18-23.
Wallenstein, M.D.; Myrold, D.D.; Firestone, M.; Voytek, M. (2006)
Environmental controls on denitrifying communities and denitrification rates:
insights from molecular methods. Ecological Applications, 16(6), p.2143-
2152.
Wander, M. M.; Traina, B.R. (1994) Organic and conventional management
effects on biologically active soil organic matter pools. Soil Science Society
of America Journal, 58, p.1130-1139.
Whitman, W.B.; Coleman, D.C.; Wiebe, W.J. (1998) Prokaryotes: the unseen
majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A,
v.95, p.6578-6583.
134
Wollum, A.G. (1982) Cultural methods for soil microorganisms. In: Page, A.L.;
Miller, R.H., Keeney, D.R. ed. Methods of soil analysis. Soil Science Society
of America, Madison, p.781-802.
Wormald, T.J. Mixed and pure forest plantations in the tropics and
subtropics. FAO Forestry Paper 103. Rome, FAO Technical Papers.
Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1992. 152p.
Ye, R.W.; Thomas, S.M.. (2001) “Microbial nitrogen cycles: physiology,
genomics and application”. Current Opinion in Microbiology, 4 p. 307-312.
Yoshinari, T., Hynes, R., Knowles, R. (1977) Acetylene inhibition of nitrous
oxide reduction and measurement of denitrification and nitrogen fixation in
soil. Soil Biol. Biochem., 9:p.177-183.
Zak, J.C., Willig, M.R., Moorhead, D.L., Wildman, H.G. (1994) Functional
diversity of microbial communities: a quantitative approach. Soil Biology and
Biochemistry, v.26, p.1101-1108.
Zilli, E.J.R., Rumjanek, N.G., Ribeiro, G.C., Costa, L.H., Neves M.C.P. (2003)
Diversidade microbiana como indicador de qualidade do solo. Cad de
Ciência & Tec 20: 391-411
Zumft, W. G. (1999) The denitrifying prokaryotes. In Dworkin, M., Falkow, S.,
Rosenberg, E., Schleifer, K.H., Stackebrandt, E. (ed.), The prokaryotes: an
evolving electronic resource for the microbiological community, 3rd ed.,
release 3.0. Springer-Verlag, New York, N.Y. www.prokaryotes.com
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