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ANA PAULA RODRIGUES BRASIL
AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA E NUTRICIONAL DE FARINHA DE SOJA
PROCESSADA ENZIMATICAMENTE PARA REMOÇÃO DOS
OLIGOSSACARÍDEOS DE RAFINOSE
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola, para obtenção
do título de Magister Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
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ANA PAULA RODRIGUES BRASIL
AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA E NUTRICIONAL DE FARINHA DE SOJA
PROCESSADA ENZIMATICAMENTE PARA REMOÇÃO DOS
OLIGOSSACARÍDEOS DE RAFINOSE
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola, para obtenção
do título de Magister Scientiae.
APROVADA: 12 de julho de 2007.
Prof
a
. Maria do Carmo Gouveia
Pelúzio (Co-Orientadora)
Prof
a
. Ana Cláudia Peres Rodrigues
Prof
a
. Flávia Maria Lopes Passos
(Co-Orientadora)
Prof. José Humberto de Queiróz
Profª. Valéria Monteze Guimarães
(Orientadora)
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ii
Ao meu marido Marcelo
Aos meus pais Paulo Rubens e Dirma
Aos meus irmãos Aline e Paulo Rubens
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por me iluminar e me proteger e permitir que com esforço realize
meus sonhos.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular, pela oportunidade de realização do mestrado.
Ao Departamento de Nutrição e Saúde por disponibilizar os laboratórios
onde parte deste trabalho foi realizada.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela concessão da bolsa de estudos.
À Professora Valéria Monteze Guimarães pela orientação na realização
deste trabalho, pela confiança, paciência e carinho.
À Professora Maria do Carmo Gouveia Pelúzio por ter me orientado durante
a realização dos experimentos.
Ao Professor Sebastião Tavares de Rezende pela colaboração e sugestões.
À Professora Neuza Maria Brunoro Costa pelas sugestões apresentadas e
pelo consentimento para utilização das instalações e equipamentos do
Laboratório de Nutrição Experimental onde o ensaio biológico foi realizado.
Aos laboratórios de Enzimologia e Análises Bioquímicas do BIOAGRO, onde
a maior parte dos experimentos foi realizada.
iv
Ao meu amor Marcelo Santos de Oliveira, por me compreender, ajudar,
ouvir, incentivar, trocar idéias e principalmente pelo seu amor. Essa
conquista é sua também!
À amiga Camila Rocha da Silva pelo apoio, amizade e por saber que podia
contar com você para me ajudar na realização deste trabalho.
À amiga Angélica Pataro Reis pelos ensinamentos, pela troca de
experiências e pelo carinho.
À amiga Fabrícia Queiroz Mendes pela ajuda, pelos ensinamentos e apoio
durante a realização dos experimentos.
Agradeço a todos os amigos e colegas dos Laboratórios do BIOAGRO:
Daniel, Maira, Eleonice, Solange, Pollyanna, Joana, Lílian, Liliane, Lílian,
Anderson.
Ao funcionário Eduardo Rezende Pereira (DQI-UFV) pela atenção, pelo
exemplo de trabalho, e por estar sempre pronto a ajudar.
Aos funcionários do BIOAGRO e do departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular, pela amizade e por estarem sempre dispostos a ajudar.
Aos meus pais Paulo Rubens e Dirma, pelo exemplo, pelo amor
incondicional e por acreditarem que a educação é um bem muito valioso.
Aos meus irmãos Aline e Paulo Rubens, pelo carinho e amizade.
Aos meus sogros, Genézio Paulo de Oliveira e Maria Antônia Santos de
Oliveira, pelo carinho e conselhos.
Enfim a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a
realização deste trabalho.
v
BIOGRAFIA
Ana Paula Rodrigues Brasil, filha de Paulo Rubens Vinhosa Brasil e
Dirma Rodrigues Brasil, nasceu em Itaperuna, Rio de Janeiro, em 06 de
julho de 1979.
Em junho de 2002, graduou-se em Farmácia e Bioquímica, pela
Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), Minas Gerais.
No período de março de 2003 a março de 2005, cursou residência em
Análises Clínicas no Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz
de Fora, Minas Gerais.
No período de agosto de 2003 a agosto de 2004, cursou
especialização Latu sensu, em Análises Clínicas pela Faculdade de
Farmácia e Bioquímica da Universidade Federal de Juiz de Fora, Minas
Gerais.
Em agosto de 2005, iniciou o curso de Mestrado em Bioquímica
Agrícola, na Universidade Federal de Viçosa, concluindo os requisitos
necessários para obter o título de Magister Scientiae, no dia 12 de julho de
2007.
vi
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ............................................ x
RESUMO................................................................................................. xi
ABSTRACT ............................................................................................ xiii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................... 1
1.1. Objetivo Geral ......................................................................... 2
1.2. Objetivos Específicos .............................................................. 3
2. REVISÃO DA LITERATURA ............................................. ................. 4
2.1. Qualidade nutricional da soja e sua utilização na alimentação 4
2.2. Processamento industrial da soja ........................................... 6
2.3. Biossíntese e papel fisiológico dos Oligossacarídeos de
rafinose (RO) ...........................................................................
7
2.4. Oligossacarídeos de rafinose e distúrbios intestinais ............. 9
2.5. Processos para redução dos oligossacarídeos de rafinose
em produtos derivados de soja ................................................
10
2.6. α-Galactosidases: definição e importância comercial .............
12
2.7. α-Galactosidases de leveduras ..............................................
14
2.8. Considerações sobre a levedura Debaryomyces hansenii ..... 15
2.9. Avaliação nutricional de produtos de soja com baixos teores
de oligossacarídeos de rafinose ..............................................
16
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 19
3.1. Microrganismo e manutenção da cultura ................................ 20
3.2. Cultivo de Debaryomyces hansenii em meio YPD .................. 20
3.3.Determinação das condições para o tratamento da
suspensão de farinha de soja desengordurada com células
viáveis de Debaryomyces hansenii .........................................
20
vii
3.4.Tratamento da suspensão de farinha de soja
desengordurada com células viáveis de Debayomyces
hansenii ...................................................................................
21
3.5. Produção de farinha de soja desengordurada tratada e não
tratada com células viáveis de Debaryomyces hansenii .........
22
3.6. Preparo da farinha de soja integral variedade UFVTN 105 .... 23
3.7. Avaliação do índice de urease da farinha de soja integral ...... 23
3.8.Produção da preparação enzimática de α-galactosidase
extracelular pelo cultivo de Debaryomyces hansenii em meio
apropriado.................................................................................
24
3.9. Hidrólise dos RO na farinha de soja integral ........................... 24
3.10.Produção de farinha de soja integral tratada e não tratada
com a preparação enzimática de α-galactosidase de D.
hansenii..................................................................................
25
3.11.Determinação da atividade de α-galactosidase .....................
25
3.12. Determinação da atividade de invertase ............................... 26
3.13. Extração de RO ..................................................................... 26
3.14. Determinação do teor de RO por Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE) ...........................................................
27
3.15. Determinação da composição centesimal das farinhas de
soja tratada e não tratada ......................................................
27
3.15.1. Determinação do teor de proteínas ........................... 27
3.15.2. Determinação do teor lipídico .................................... 28
3.15.3. Determinação de umidade ........................................ 28
3.15.4. Determinação do conteúdo de cinzas ....................... 28
3.15.5. Determinação do teor de carboidratos totais ............. 28
3.16. Ensaio biológico .................................................................... 28
3.16.1. Preparo das dietas .................................................... 29
3.16.2. Animais ...................................................................... 30
3.16.3. Coeficiente de Eficácia Protéica (PER) ..................... 31
3.16.4. Razão Protéica Líquida (NPR) .................................. 31
3.16.5. Digestibilidade verdadeira .........................................
31
viii
3.16.6. Extração e determinação da concentração dos
ácidos graxos de cadeia curta ..................................
32
3.17. Análise estatística ................................................................. 33
4. RESULTADOS ................................................................................... 34
4.1. Experimento 1.......................................................................... 34
4.1.1. Preparo e caracterização das farinhas de soja
utilizadas no ensaio biológico .....................................
34
4.1.1.1.Tratamento da farinha de soja desengordurada
com células viáveis de Debaryomyces
hansenii e remoção dos oligossacarídeos de
rafinose ..........................................................
34
4.1.1.2.Composição das farinhas de soja
desengordurada utilizadas no preparo das
dietas.................................................................
37
4.1.2. Efeito do processamento enzimático no valor
nutricional das farinhas de soja desengordurada .....
38
4.1.2.1. Efeito do processamento enzimático nos
valores de digestibilidade verdadeira .............
38
4.1.2.2. Efeito do processamento enzimático nos
valores de ganho de peso, Coeficiente de
Eficácia Protéica (PER) e Razão Protéica
Líquida (NPR) ................................................
38
4.1.2.3. Efeito da remoção dos oligossacarídeos de
rafinose na produção de ácidos graxos de
cadeia curta ......................................................
40
4.2. Experimento 2 ......................................................................... 41
4.2.1. Preparo e caracterização das farinhas de soja
utilizadas no ensaio biológico ...................................
41
4.2.1.1. Efeito dos tratamentos térmicos no índice de
urease da farinha de soja integral ....................
41
ix
4.2.1.2. Hidrólise de oligossacarídeos de rafinose na
farinha de soja integral usando a preparação
enzimática de α-galactosidase de
Debaryomyces hansenii ...................................
41
4.2.1.3. Composição das farinhas de soja integral
utilizadas no preparo das dietas ....................
43
4.2.2. Efeito do processamento enzimático no valor
nutricional das farinhas de soja ................................
45
4.2.2.1. Efeito do processamento enzimático nos
valores de digestibilidade verdadeira..............
45
4.2.2.2. Efeito do processamento enzimático nos
valores de ganho de peso, Coeficiente de
Eficácia Protéica (PER) e Razão Protéica
Líquida (NPR) ................................................
45
4.2.2.3. Efeito do processamento enzimático na
produção de ácidos graxos de cadeia curta ..
46
5. DISCUSSÃO ...................................................................................... 48
6. CONCLUSÕES .................................................................................. 62
7. REFERÊNCIAS .................................................................................. 64
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
A Absorbância
AGCC
Ácido graxo de cadeia curta
AOAC
Association of Official Analytical Chemists
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
DNS Dinitrossalicilato
DP Desvio padrão
EC Enzyme Comission
FAO Food and Agriculture Organization
GS Galactinol sintase
K
M
Constante de Michaelis-Menten
NPR Razão Protéica Líquida
NPRR Razão Protéica Líquida Relativa
OMS Organização Mundial de Saúde
p/v Peso/volume
PER Coeficiente de Eficácia Protéica
PERR Coeficiente de Eficácia Protéica Relativa
RO Oligossacarídeos de Rafinose
rpm Rotações por minuto
U Unidade de atividade enzimática
YPD Yeast Peptone Dextrose
ρ-NP
ρ-nitrofenol
ρ-NP-α
-Gal ρ- nitrofenil-α-D-galactopiranosídeo
xi
RESUMO
BRASIL, Ana Paula Rodrigues, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, julho
de 2007. Avaliação bioquímica e nutricional de farinha de soja
processada enzimaticamente para remoção dos oligossacarídeos
de rafinose. Orientadora: Valéria Monteze Guimarães. Co-
orientadores: Maria do Carmo Gouveia Pelúzio, Flávia Maria Lopes
Passos e Sebastião Tavares de Rezende.
Os oligossacarídeos de rafinose (RO), presentes em altas
concentrações na soja ou em seus produtos derivados, são considerados
um fator antinutricional, uma vez que podem interferir na absorção dos
nutrientes da dieta, além de serem os principais responsáveis pela indução
de flatulência em humanos e outros animais. Vários estudos indicam que a
ingestão de produtos de soja livres ou com teores reduzidos desses
açúcares pode melhorar a digestão dos nutrientes. Nesse sentido, pesquisas
sugerem que a hidrólise enzimática dos RO presentes em produtos
derivados de soja parece ser uma estratégia eficiente para reduzir o
conteúdo desses açúcares e aumentar o valor nutricional desses produtos.
O objetivo deste trabalho foi a elaboração de farinhas de soja livres de RO,
através do tratamento enzimático com α-galactosidase de Debaryomyces
hansenii UFV-1, e a avaliação nutricional do produto obtido por meio de
ensaio biológico com ratos Wistar. Foram realizados dois experimentos. No
primeiro foi realizada a verificação da atividade de α-galactosidase e a
hidrólise dos RO na suspensão de farinha de soja desengordurada (1:10 p/v)
adicionada de células viáveis de D. hansenii. Foi observado que a atividade
enzimática aumentou com o tempo de incubação da levedura na suspensão
de farinha de soja, e que a redução total dos RO foi observada após 36 h.
No segundo experimento foram determinadas as condições para o
tratamento da suspensão de farinha de soja integral (1:10 p/v) com uma
preparação enzimática de D.hansenii UFV-1 para hidrólise dos RO. Foi
xii
verificado que a preparação enzimática na concentração de 1,2 U/g de
farinha apresentou atividade sobre os oligossacarídeos e a hidrólise total
desses açúcares ocorreu após 20 h de tratamento. Após preparo das
farinhas de soja desengordurada e integral, com e sem oligossacarídeos, a
composição química centesimal foi determinada, assim como o conteúdo de
RO presente antes e após os tratamentos. Para avaliação nutricional das
farinhas obtidas após cada tratamento, verificou-se o efeito da eliminação
dos RO nos parâmetros de digestibilidade, ganho de peso, consumo
protéico, coeficiente de eficácia protéica (PER) e razão protéica líquida
(NPR). Houve melhora significativa (p≤0,05) na digestibilidade verdadeira
das dietas contendo farinhas de soja sem RO, em relação as suas
correspondentes não tratadas. Porém, a remoção dos oligossacarídeos de
rafinose das farinhas de soja desengordurada e integral não promoveu
melhora significativa nos valores de ganho de peso, PER e NPR. A produção
de ácidos graxos de cadeia curta também não diferiu estatisticamente
(p>0,05) para os animais alimentados com dieta contendo farinha de soja
desengordurada ou integral com e sem oligossacarídeos de rafinose.
xiii
ABSTRACT
BRASIL, Ana Paula Rodrigues, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, July,
2007. Biochemical and nutritional evaluation of enzymatically
processed soy flour for removal of raffinose oligosaccharides. Adviser:
Valéria Monteze Guimarães. Co-advisers: Maria do Carmo Gouveia Pelúzio,
Flávia Maria Lopes Passos and Sebastião Tavares de Rezende.
The raffinose oligosaccharides (RO), present in high concentrations in
soy and its derivatives are considered an antinutritional factor, since they can
interfere in the absorption of the diet’s nutrients. In addition to that, they are
most responsible for the induction of flatulence in humans and other animals.
Several studies indicate that the ingestion of soy products free or with low
level of these sugars can bring benefits, improving the digestion of these
nutrients. Researches in this way suggest that the enzymatic hydrolysis of
RO in soy derivatives seems to be an efficient strategy in reducing the
content of these sugars and increasing the nutritional value of these
products. The objective of this work was the production of RO-free soybean
flour, using the enzymatic treatment with Debaryomyces hansenii UFV-1 α-
galactosidase, and the nutritional evaluation of this product through biological
assays using Wistar rats. In order to do that, two experiments were realized.
In the first one, it was accomplished the verification of the activity of α-
galactosidase and the hydrolysis of RO in the suspension of defatted flour (1:
10 w/v) added of viable cells of D. hansenii. It was observed that the
enzymatic activity increased with time of incubation of the yeast in the
suspension of soybean flour, and the total reduction of RO was achieved
after 36 h. In the second experiment, the conditions for treatment of
suspension of whole soybean flour (1:10 w/v) were determined using an
enzymatic preparation of D. hansenii UFV-1 for the RO hydrolysis. It was
verified that the enzymatic preparation (1,2 U/g of flour) showed activity on
the oligosaccharides and that the total hydrolysis of these sugars occurred
xiv
after 20h of treatment. After the preparation of the defatted and whole
soybean flours, with and without oligosaccharides, its centesimal chemical
composition was determined, as well as the RO content present after
treatment. For the nutritional evaluation of the obtained flours after each
treatment, it was verified the effect of the RO reduction in parameters of
digestibility, weight gain, protein consumption, protein efficiency ratio (PER)
and net protein ratio (NPR). It was observed a significant enhancement
(p<0,05) in true digestibility of RO-free soybean flours in relation to its non-
treated correspondents. However, the withdrawal of raffinose
oligosaccharides from the defatted and whole flours did not promote
significant enhancement in the values of weight gain, PER and NPR. The
production of short-chain fatty acids also did not statistically differ (p<0,05)
between the animals fed with defatted flour or with whole flour, with or
without the raffinose oligosaccharides.
1
1. INTRODUÇÃO
A soja (Glicine max, L.) é uma planta da família das leguminosas, com
origem na China, sendo um dos produtos mais antigos cultivados pelo
homem. O grão de soja contém cerca de 40% de proteína apresenta
características similares às dos produtos protéicos de alto valor nutritivo,
como o leite de vaca, por conter quantidade suficiente de quase todos os
aminoácidos indispensáveis.
Por possuir uma fração protéica significativa a soja é utilizada na
alimentação animal, principalmente na forma de farelo, e na alimentação
humana na forma de farinha de soja, concentrados protéicos de soja e
isolados protéicos de soja. A fração óleo é utilizada na indústria de alimentos
para a produção de margarina, óleo de cozinha, agentes emulsificantes e
vários outros produtos.
Além das qualidades nutricionais, estudos sugerem que a soja pode
ter outros aspectos benéficos, incluindo propriedades antineoplásicas devido
à presença de fitoquímicos.
Como conseqüência, a demanda pela soja e seus produtos derivados
tem crescido e a área destinada ao seu cultivo no mundo vem aumentando a
cada ano. A produção mundial total de soja, no ano safra 2005/06, foi
estimada em 220 milhões de toneladas (USDA, 2007).
Entretanto, a soja também contém uma variedade de fatores
antinutricionais que limitam o seu consumo, dentre os quais se destacam:
inibidores de proteases, lectinas, taninos, proteínas alergênicas e pouco
digeríveis, as lipoxigenases, os oligossacarídeos de rafinose (RO) e outros.
A presença de açúcares não digeríveis (oligossacarídeos de rafinose) é a
principal responsável pela ocorrência de flatulência, desconforto abdominal e
diarréia, resultante do metabolismo anaeróbico destes açúcares.
2
Várias pesquisas têm sido realizadas com a finalidade de reduzir ou
eliminar os conteúdos de rafinose e estaquiose nas sementes de soja e em
seus produtos derivados. Isto poderá ser conseguido pela manipulação de
genes importantes para síntese de componentes da via de síntese dos RO
ou pela hidrólise enzimática desses açúcares presentes na soja. Esta última
parece ser a estratégia mais viável e eficaz uma vez que os RO exercem
papel fisiológico importante durante o desenvolvimento das sementes.
A hidrólise enzimática desses açúcares pode ser catalisada pela α-
galactosidase ou invertase ou ambas. A enzima α-galactosidase (α-D-
galactosídeo galactohidrolase; E.C. 3.2.1.22) é encontrada em plantas,
microrganismos e animais e as enzimas isoladas de fungos têm se mostrado
bastante adequadas para aplicações biotecnológicas. Em vista disso, há um
grande interesse no uso de α-galactosidases de leveduras para aplicação
em processos industriais.
A levedura Debaryomyces hansenii é freqüentemente encontrada em
produtos fermentados ricos em proteínas e estudos têm mostrado sua
capacidade de secretar várias enzimas de interesse industrial.
Desta forma, o uso de α-galactosidases de leveduras para reduzir ou
eliminar os RO presentes em produtos derivados de soja se mostra como
uma alternativa racional para melhorar a qualidade nutricional destes
produtos, tornando mais viável o uso da soja como fonte protéica para o
consumo humano e animal.
1.1. Objetivo Geral
O objetivo geral deste trabalho foi produzir de farinhas de soja livres
ou com teores reduzidos de oligossacarídeos de rafinose, através do
tratamento enzimático com α-galactosidase de Debaryomyces hansenii
UFV-1, e avaliar bioquímica e nutricionalmente o produto obtido.
3
1.2. Objetivos Específicos
• Verificar a atividade de α-galactosidase de células viáveis de
Debaryomyces hansenii adicionadas à suspensão de farinha de soja
desengordurada (1:10 p/v);
• Obter α-galactosidase extracelular da levedura Debaryomyces hansenii
pelo cultivo em meio contendo lactose como fonte de carbono;
• Determinar as condições para o tratamento enzimático da farinha de soja
integral utilizando uma preparação enzimática de α-galactosidase de
Debaryomyces hansenii;
• Extrair e determinar os teores de rafinose e estaquiose por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) nas farinhas de soja tratada e não tratada
enzimaticamente;
• Avaliar bioquimicamente a composição das farinhas de soja através da
determinação de proteínas, lipídios, carboidratos totais, cinzas, umidade e
oligossacarídeos;
• Preparar as dietas contendo farinha de soja tratada e não tratada como
fonte de proteína, para avaliação por meio de ensaio biológico;
• Avaliar a qualidade protéica das farinhas tratada e não tratada, por meio
de ensaio biológico com ratos, determinando-se o ganho de peso, consumo
protéico, digestibilidade verdadeira, coeficiente de eficácia protéica (PER) e
razão protéica líquida (NPR);
• Determinar o perfil de ácidos graxos de cadeia curta no conteúdo cecal
dos animais submetidos aos tratamentos citados.
4
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Qualidade nutricional da soja e sua utilização na alimentação
A soja constitui excelente fonte de proteína para alimentação humana
e animal, pois além de conter cerca de 40 % de proteína em seus grãos,
estas são de elevado valor nutritivo (SGARBIERI, 1996). A composição de
aminoácidos indispensáveis, quando comparada com o padrão da
Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO/OMS,
1985), conforme Tabela 1, indica que, com exceção dos aminoácidos
sulfurados, a proteína da soja apresenta teores de aminoácidos devidamente
balanceados (DE, 1971).
Tabela 1 – Padrões de aminoácidos de referência, composição em
aminoácidos de proteína de soja (mg/g) e escore químico.
Aminoácidos
FAO/OMS (1985)
2-5 anos
(mg/g proteína)
Soja*
(mg/g)
Escore Químico
Isoleucina 28 46 1,64
Leucina 66 78 1,18
Lisina 58 64 1,10
Metionina + Cisteína 25 26 1,04
Fenilalanina + Tirosina 63 88 1,40
Treonina 34 39 1,15
Triptofano 11 14 1,27
Valina 35 46 1,31
Histidina 19 26 1,37
*Fonte: SOY PROTEIN COUNCIL, 1987.
Os aminoácidos metionina e cisteína são limitantes na proteína da
soja assim como em todas as leguminosas. Mas, a proteína da soja é rica
em lisina, e este aminoácido é limitado nos cereais, os quais geralmente são
ricos em aminoácidos sulfurados, o que a torna uma fonte protéica ideal para
complementar os cereais (LIU, 1997). Para a população do futuro, a soja
5
pode ser considerada um dos principais alimentos, pelas suas qualidades
nutricionais, sua facilidade de cultivo, adaptação a quase todas as regiões
de cultivo e alta produção (BELLAVER e SNIZEK, 1999).
Na economia brasileira a soja ocupa lugar de destaque. Atualmente o
Brasil é o segundo maior produtor mundial, produzindo cerca de 57 milhões
de toneladas, no ano safra 2005/06, ficando atrás somente dos Estados
Unidos que produziram 83 milhões de toneladas (USDA, 2007).
Segundo Antunes e Sgarbieri (1980) o valor da soja se deve,
principalmente, às suas propriedades como alimento protéico e fonte de óleo
de boa qualidade. Esta leguminosa é notável por seu conteúdo relativamente
alto em lipídios. A maioria das leguminosas tem menos de 10 % de lipídios;
em contraste, a soja tem aproximadamente 20 %. O ácido linoléico contribui
com aproximadamente 53 % do conteúdo total dos ácidos graxos no óleo de
soja, enquanto o ácido graxo essencial linolênico contribui com
aproximadamente 7 a 8 % (LIU, 1997).
A fração protéica da soja tem sido utilizada também para alimentação
humana na forma de farinha de soja, concentrados protéicos de soja e
isolados protéicos de soja contendo respectivamente, 50 %, 70 % e 90-97 %
de proteínas (MOREIRA, 1999). O extrato hidrossolúvel de soja é outro
produto protéico que vem sendo utilizado particularmente como substituto ao
leite de vaca e tem apresentado alta aceitabilidade em programas de
nutrição infantil (MOREIRA, 1999). Tal uso é indicado para pessoas
portadoras de intolerâncias ao leite de origem animal, e de algumas
deficiências genéticas, como a ineficiência em metabolizar a lactose (DE
LUMEN, 1992).
De acordo com Hymowitz et al. (1972), cerca de 8 % do total de
açúcares dos grãos de soja correspondem aos açúcares livres, sendo que
destes 60 % correspondem à sacarose, 4 % à rafinose e 36 % à estaquiose.
Algumas substâncias encontradas na soja estão sendo reconhecidas
por sua poderosa capacidade em prevenir câncer e outras doenças em
humanos. Segundo Liu (1997), a soja é uma fonte rica em fitoquímicos,
muitos dos quais têm efeitos benéficos importantes na saúde humana e
animal. Estes incluem compostos que são encontrados na soja em
concentrações muito maiores do que em outros alimentos, como os
6
isoflavonóides, e compostos que são importantes na prevenção de doenças
crônicas, como a vitamina E. A soja é indicada no tratamento de vários
problemas de saúde da mulher no período pré e pós-menopausa, como na
prevenção e tratamento de osteoporose, em algumas doenças renais,
fibrose cística, doenças inflamatórias, doenças imunes, câncer e hipertensão
(BARNES et al., 1999).
2.2. Processamento industrial da soja
Processos industriais convertem grãos integrais de soja em produtos
como tofu, miso, condimento, molho, algumas farinhas crocantes, leite de
soja e outros. Esses grãos são selecionados, limpos, secos e quebrados
para remoção da casca ou tegumento. Após remoção da casca, os
processadores convertem os grãos de soja em flocos contendo óleo. Os
flocos podem ser usados em alimentação animal, ou podem ser
processados em farelo contendo óleo, que são utilizados em vários
alimentos comerciais para uso humano (LIMA, 1999).
Flocos contendo óleo são imersos em solvente para extração de óleo
que é então degomado para separação da lecitina. Lecitina é um agente
emulsificante, que depois de processada é usada em produtos lácteos e
alimentos instantâneos. O óleo extraído da soja é usado para produzir óleo
de cozinha, margarina e outros. Após extração do óleo, o solvente é
removido e reciclado e os flocos são secos, produzindo um produto com alto
teor protéico e essencialmente livre de óleo, conhecido como flocos de soja
desengordurados. Esses flocos são triturados produzindo o farelo de soja
que é usado em ração animal, principalmente para aves domésticas, suínos,
gado e culturas aquáticas (LIMA, 1999).
Os flocos desengordurados também podem ser processados, sendo
moídos e peneirados, produzindo a farinha de soja desengordurada. Farinha
de soja contém proteína, melhora a cor e aumenta o prazo de
armazenamento de produtos de panificação (MOREIRA, 1999). A farinha de
soja pode ser utilizada para produção de concentrados protéicos de soja que
são usados em bebidas protéicas, como base para sopas e molhos, contém
aproximadamente 70 % de proteína, e mantém a maioria das fibras. A
7
farinha de soja pode também ser processada produzindo os isolados
protéicos de soja, que contêm em torno de 90 % de proteína, baixa umidade,
fornece textura para produtos como carne de soja e são usados por suas
qualidades emulsificantes em muitos produtos incluindo queijo e leite,
sobremesas congeladas e outros. Isolados protéicos são também a fonte
protéica primária em uma variedade de bebidas dietéticas (GOLBITZ, 2003).
O teor de RO é bastante elevado, principalmente nos produtos de soja
produzidos a partir dos grãos integrais como leite de soja e tofu. Produtos
mais processados como farelo e farinha de soja também apresentam altas
concentrações. Um subproduto importante da indústria de processamento de
soja é o melaço de soja, que é rico em isoflavonas, mas não é consumido
devido ao elevado teor desses oligossacarídeos (NIELSEN, 1996).
2.3. Biossíntese e papel fisiológico dos oligossacarídeos de rafinose
Os oligossacarídeos são a fonte primária de energia e substratos para
a síntese de outros compostos durante a germinação das plantas (JIMÉNEZ
et al., 1985). Entre estes, os oligossacarídeos de rafinose (RO) são
amplamente encontrados no reino vegetal em uma variedade de sementes,
nas quais são componentes dos carboidratos de reserva, sendo os
segundos carboidratos solúveis mais abundantes nas plantas (MINORSKY,
2003).
Os RO são sintetizados durante a formação das sementes, e
hidrolisados durante o processo de germinação (KANDLER e HOLF, 1980;
SARAVITZ et al., 1987). De acordo com Dey (1985), a via metabólica de
síntese dos RO pode ser representada como se segue:
UDP- galactose + mio-inositol galactinol + UDP
Galactinol + sacarose rafinose + mio-inositol
Galactinol + rafinose estaquiose + mio-inositol
Galactinol + estaquiose verbascose + mio-inositol
Galactinol + verbascose ajucose + mio-inositol
Um esquema da via de síntese dos oligossacarídeos, bem como das
8
enzimas envolvidas, está representado na Figura 1.
Figura 1- Esquema da via metabólica de síntese dos oligossacarídeos de
rafinose. Fonte: SUAREZ et al. (1999).
UDP-Glc: uridina difosfato-glicose; UDP-Gal: uridina difosfato-galactose; UDP: uridina
difosfato; Glc-6P: glicose- 6 –fosfato.
A enzima galactinol sintase (GS) (UDP-α-D-gal:1-L-mio-inositol-1-O-
α-D-galactopiranosiltransferase, E.C. 2.4.1.123), que requer Mn
+2
para sua
atividade, catalisa a primeira reação na via de síntese dos RO, produzindo
galactinol a partir de UDP-galactose e mio-inositol (LIU et al., 1995). A
atividade de GS, em folhas e sementes, correlaciona-se positivamente com
os níveis de RO e esta enzima parece regular os níveis de oligossacarídeos
de reserva em partes específicas das plantas (CASTILLO et al., 1990).
Subseqüente à primeira reação, sintases específicas catalisam a síntese de
cada oligossacarídeo da série por meio da transferência do galactinol para a
sacarose, a rafinose, a estaquiose e a verbascose, com a produção de α-
1,6-galactosídeos, tri, tetra, penta e hexassacarídeos de rafinose (RIBEIRO,
2001).
Durante o desenvolvimento da planta a rafinose acumula-se nos
órgãos de reserva. Ocorre um aumento na concentração de rafinose nas
9
sementes em maturação devido à perda de água durante este processo
(DEY, 1985). Este açúcar por sua vez é degradado em galactose e sacarose
durante a germinação. A estaquiose é um dos mais abundantes
tetrassacarídeos em plantas (DEY, 1985) e é reconhecida como o maior
açúcar de reserva e transporte em leguminosas. Verbascose e ajucose são
os penta e hexassacarídeos, respectivamente. Estes oligossacarídeos
coexistem com rafinose e estaquiose na maioria das leguminosas e estão
presentes em órgãos de reserva (DEY, 1985).
Os RO têm importantes funções nas plantas servindo como
metabólitos de transporte em muitas leguminosas e desempenhando papel
protetor contra o frio. Além disso, conferem tolerância à dessecação durante
a maturação da semente, sendo que estas respostas a estresses são
ocasionadas pelo resultado da ação dos RO como agentes protetores das
proteínas de membrana (JONES et al., 1999).
2.4. Oligossacarídeos de rafinose e distúrbios intestinais
A ingestão de soja e seus produtos derivados pode resultar em
flatulência, náuseas, desconforto abdominal e diarréia, devido ao alto
conteúdo de oligossacarídeos de rafinose (WAGNER et al., 1976). Isto
ocorre, pois a mucosa do intestino delgado de humanos e de outros animais
monogástricos é desprovida das α-1,6-galactosidases, enzimas necessárias
à conversão dos RO em açúcares mais simples. Assim, 100 % dos RO não
sofrem degradação e são conduzidos à parte posterior do intestino, onde
são fermentados por bactérias anaeróbias com a liberação de grande
quantidade de CO
2
, H
2
e CH
4
fenômeno este conhecido como flatulência
intestinal e que está associado com cólicas, diarréia, dispepsia e
constipação (DE LUMEN, 1992; SUAREZ et al.,1999; KARR-LILIENTHAL et
al., 2005).
Vários estudos sugerem que a conversão enzimática dos RO
presentes no leite de soja e outros derivados parece ser a estratégia mais
eficaz para reduzir os RO e aumentar seu valor nutricional (CRUZ e PARK,
1982; GUIMARÃES et al., 2001; VIANA et al., 2005; VIANA et al., 2006).
Experimentos realizados, principalmente com animais monogástricos,
10
demonstraram que o uso de α-galactosidase em dietas a base de soja
melhora o ganho de peso e a digestibilidade das proteínas e reduz a
flatulência (BAUCELLS et al., 2000; SMIRICKY et al., 2002).
2.5. Processos para redução dos oligossacarídeos de rafinose em
produtos derivados de soja
Vários processos têm sido empregados na tentativa de eliminar ou
reduzir os conteúdos de rafinose e estaquiose em produtos de soja como:
embebição das sementes (KAWAMURA E TADA, 1967), embebição e
germinação (KIM et al., 1973; VIANA et al., 2005), processos de
fermentação (MITAL e STEINKRAUS, 1975) e extração dos
oligossacarídeos com água (KU et al., 1976). Técnicas como ultrafiltração do
extrato hidrossolúvel de soja para remoção destes oligossacarídeos de
rafinose (OMOSAIYE et al., 1978), e de extração desses açúcares com
etanol a partir da farinha de soja (LESKE et al., 1991) também foram
testadas. Entretanto os processamentos tradicionais dos produtos derivados
de soja e de outras leguminosas não eliminam esses oligossacarídeos
termoestáveis (NACZK et al., 1997).
A hidrólise dos oligossacarídeos de rafinose pode ser catalisada
pelas α-galactosidase ou invertase, ou ambas. A primeira enzima catalisa a
hidrólise de ligações α-1,6 produzindo D-galactose e sacarose e, as
invertases (β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase, E.C. 3.2.1.26) hidrolisam
ligações β-1,2 produzindo melibiose e D-frutose ou D-glicose e D-frutose
(Figura 2). Existem vários relatos na literatura sobre a utilização de α-
galactosidase de origem vegetal e microbiana na degradação dos
oligossacarídeos presentes no leite de soja e em farinhas obtidas de soja
(MULIMANI et al., 1997; GUIMARÃES et al., 2001).
11
Figura 2- Oligossacarídeos de rafinose e sítios de clivagem das enzimas
hidrolíticas. Fonte: LEBLANC et al. ( 2004b).
Processos para o tratamento enzimático do leite de soja utilizando α-
galactosidases fúngicas foram propostos por Sugimoto e Van Bauren (1970)
que usaram preparações comerciais de α-galactosidases de Aspergillus
saitoi e verificaram a hidrólise desses açúcares após 3 h de incubação com
a enzima. Thananunkul et al. (1976) utilizaram micélios de Mortierella
vinacea imobilizados em gel de poliacrilamida como fonte de α-
galactosidase para remoção dos RO do leite de soja. Posteriormente,
Mulimani et al. (1995) avaliaram a capacidade de hidrólise dos RO do leite
de soja pela α-galactosidase de Gibberella fujikuroi. O efeito de α-
galactosidases extracelulares produzidas por Lactobacillus plantarum na
qualidade nutricional do leite de soja e derivados também foi avaliado por
Sanni et al. (1997). Scalabrini et al. (1998) testaram a fermentação do leite
de soja por cepas de Bifidobacterium e avaliaram a capacidade de redução
dos RO. A produção de α-galactosidase pelo fungo Aspergillus fumigatus foi
estudada por de Rezende (1998). Viana et al. (2006) observaram completa
redução no conteúdo de rafinose e estaquiose no leite de soja após
12
incubação com α-galactosidase extracelular da levedura Debaryomyces
hansenii UFV-1.
Estudos sobre a utilização de α-galactosidases de vegetais na
hidrólise dos RO em produtos derivados de soja, também têm sido
desenvolvidos. Cruz e Silva (1986) testaram a redução dos RO no leite de
soja pela adição de pequenas proporções de grãos de soja germinados na
formulação do produto, mas não observaram decréscimo substancial de
rafinose e estaquiose. Utilizando sementes em germinação de Cassia
sericea Sw., como fonte de α-galactosidases para hidrólise dos RO, Bhaskar
et al. (1990) demonstraram que melibiose e rafinose eram hidrolisadas,
entretanto a hidrólise de estaquiose não pôde ser detectada. A utilização de
α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba para redução dos RO também
foi avaliada por Mulimani et al. (1997) que concluíram que o tratamento de
farinha de soja com extrato bruto contendo α-galactosidase foi eficiente na
redução de rafinose e estaquiose. Guimarães et al. (2001) demonstraram
redução dos RO do leite de soja após tratamento com α-galactosidase
purificada de sementes de soja germinadas. Viana et al. (2005) observaram
que α-galactosidase parcialmente purificada de sementes de soja em
germinação reduziram o conteúdo de estaquiose e rafinose, no leite de soja,
em 72,3 e 89,2 %, respectivamente, após incubação por 6 h a 40 ºC.
Em vista disso, várias pesquisas então sugerem que a hidrólise
enzimática dos RO presentes no leite de soja e outros derivados parece ser
a estratégia mais eficiente para reduzir o conteúdo desses açúcares e
aumentar o valor nutricional desses produtos (GUIMARÃES et al., 2001),
uma vez que os tratamentos enzimáticos são extremamente específicos,
causando menor alteração nas proporções dos demais componentes dos
derivados de soja (VIANA, 2005).
2.6. α-Galactosidases: definição e importância comercial
As α-galactosidases estão amplamente distribuídas em
microrganismos, plantas e animais (KIM et al., 2002). Estas enzimas
pertencem à classe das hidrolases e constituem um grupo de
13
exoglicosidases que catalisam a clivagem hidrolítica de resíduos terminais
de D-galactose em ligação alfa (α). Estas enzimas hidrolisam D-
galactosídeos simples, bem como moléculas complexas como oligo e
polissacarídeos, glicoproteínas e outros derivados (MANZANARES et al.,
1998). Os genes de α-galactosidases estão classificados em 3 famílias
distintas de glicosil hidrolases, baseado na similaridade da estrutura primária
e análise de clusters hidrofóbicos. A família 27 de glicosil hidrolases é muito
conservada, incluindo α-galactosidases eucarióticas de plantas, animais,
leveduras e fungos filamentosos, que são geralmente menores ou até
mesmo monômeros (ADEMARK et al., 2001). A família 36 contém
principalmente α-galactosidases bacterianas, mas também algumas α-
galactosidases eucarióticas que se caracterizam por serem enzimas grandes
com estrutura tetramérica (HENRISSAT e BAIROCH, 1993; MARGOLLES-
CLARK et al., 1996). A família 4 é caracterizada por conter, até o momento,
somente α-galactosidases bacterianas. As diferenças estruturais entre essas
enzimas podem contribuir para diferenças na atividade (LUONTERI et al.,
1998).
As α-galactosidases são enzimas que têm uma grande importância
comercial devido a sua utilização em vários processos biocatalíticos. Na
indústria de alimentos, estas enzimas constituem uma ferramenta muito útil,
uma vez que participam em diferentes processos para a hidrólise de
açúcares contendo resíduos de galactose. α-Galactosidases promovem a
conversão de galactoligossacarídeos não digeríveis, considerados fatores
antinutricionais indutores de flatulência, presentes em várias leguminosas,
em açúcares digeríveis (GUIMARÃES et al., 2001). Produtos de soja
hidrolisados com as α-galactosidases, como farinha e leite de soja,
apresentam melhores propriedades nutricionais e não induzem o fenômeno
de flatulência, o que contribui para ampliação do mercado consumidor de
soja e derivados. Essa enzima também é usada como aditivo em ração
animal à base de leguminosas para reduzir o teor dos
galactoligossacarídeos (DE REZENDE e GUIMARÃES, 2004).
Além da utilização das α-galactosidases pelas indústrias alimentícias,
essas enzimas são de grande interesse para a indústria farmacêutica, onde
14
participam na biocatálise de vários compostos ativos. Estudos indicam que
esta enzima tem uma possível aplicação na biocatálise de oligossacarídeos
complexos, utilizados nas pesquisas médicas e biológicas. Algumas α-
galactosidases de eucariotos são capazes de remover resíduos de galactose
com ligação α-1,3 terminal de glucanas, o que representa um potencial uso
médico em terapia de transfusão, na conversão de sangue do grupo B para
sangue do grupo O (ZHU e GOLDSTEIN, 1994; VARBANETS et al., 2001).
Na indústria de papel e celulose, as α-galactosidases vêm sendo utilizadas
em alguns processos, principalmente para hidrólise enzimática de
hemiceluloses como galactomananas (BULPIN et al., 1990), em substituição
ao uso de agentes químicos, para redução da poluição ambiental. Outra
aplicação industrial de α-galactosidases é na usina açucareira, onde
pequenas quantidades de rafinose são convertidas em sacarose, pois a
presença do açúcar rafinose afeta a cristalização da sacarose (KOBAYASHI
e SUZUKI, 1972).
Diversos estudos vêm sendo realizados para identificação de novas
fontes de α-galactosidases e também sugerem futuras aplicações dessas
enzimas nativas ou recombinantes em vários outros processos
biotecnológicos.
2.7. α-Galactosidases de leveduras
A α-galactosidase é uma enzima largamente distribuída na natureza e
dentre os microrganismos que a produzem incluem-se bactérias, fungos
filamentosos e leveduras. Leveduras são fungos unicelulares, não
filamentosos, caracteristicamente esféricos ou ovais. Dentre as leveduras
que produzem α-galactosidase as dos gêneros Torulaspora, Saccharomyces
e Kluyveromyces são as mais utilizadas (DE REZENDE e GUIMARÃES,
2004). A produção dessa enzima consiste no crescimento do microrganismo
em meio de cultura seletivo, geralmente meio líquido contendo uma fonte de
carbono indutora da atividade enzimática. Açúcares como galactose,
melibiose, rafinose e estaquiose já foram descritos como indutores da
atividade de α-galactosidase. Outras fontes de carbono mais complexas
15
como galactomananas e até farelo de trigo também induziram a atividade
desta enzima (DE REZENDE, 1998).
Leveduras como Debaryomyces castellii IFO 1359, Debaryomyces
nepalensis IFO 1428, Pichia guillermondii IFO 10106, Saccharomyces
cerevisiae IFO 1997 e Schwanniomyces occidentalis var. occidentalis IFO
1839 apresentam α-galactosidases intra e extracelulares, enquanto que
apenas α-galactosidase intracelular foi produzida por Candida guillermondii
IFO 0566 e Lipomyces starkeyi IFO 10383 (YOSHIDA et al., 1997). Segundo
Viana et al. (2006) a levedura Debaryomyces hansenii UFV-1 produz α-
galactosidases intra e extracelulares quando cultivada em meio contendo
galactose.
Uma grande vantagem do uso de leveduras é que muitas delas são
classificadas como GRAS (Generally Regarded as Safe), especialmente
Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces lactis. Organismos com status
GRAS não apresentam riscos de toxicidade e patogenicidade, o que permite
sua utilização para aplicações na indústria de alimentos e farmacêutica
(HENSING et al., 1995).
2.8. Considerações sobre a levedura Debaryomyces hansenii
A levedura Debaryomyces hansenii é a espécie mais freqüentemente
encontrada em produtos fermentados ricos em proteínas como: salsichas e
queijo (COOK, 1995; ENCINAS et al., 2000; PETERSEN et al., 2002) e junto
com S. cerevisiae metabolizam ácidos orgânicos e aminoácidos, regulando a
acidez de produtos fermentados e também possuem atividades lipolíticas e
proteolíticas, contribuindo assim para o desenvolvimento do flavor (COOK,
1995).
Esta levedura é capaz de converter D-xilose em xilitol sendo este
produto de grande interesse para as indústrias alimentícia, odontológica e
farmacêutica (ROSEIRO et al.,1991; PARAJÓ et al., 1995; SAMPAIO et al.,
2005).
16
D. hansenii é capaz de utilizar misturas de pentoses e hexoses
(glicose-manose, xilose-arabinose, glicose-xilose) como fonte única de
carbono (NOBRE et al., 1999).
Em estudos realizados por Viana (2005), para a seleção de fontes
microbianas produtoras de α-galactosidases, foi observado que a levedura
D. hansenii foi capaz de crescer em diferentes meios de cultura contendo
hexoses, di e trissacarídeos. O açúcar lactose foi o que induziu maior
atividade de α-galactosidase extracelular nos diferentes meios. Rafinose,
melibiose e galactose também induziram a atividade da α-galactosidase
extracelular.
Este autor utilizou galactose, como fonte de carbono, para promover o
crescimento de D. hansenii e a indução da atividade das enzimas α-
galactosidases intra e extracelulares, para posterior purificação e
caracterização enzimática. A alta atividade das α-galactosidases foi
detectada utilizando o substrato ρ-nitrofenil-α-D-galactopiranosídeo (ρ-NP-
αGal), tanto no sobrenadante da cultura quanto nas células previamente
permeabilizadas. As atividades máximas das α-galactosidases
extracelulares de D. hansenii foram detectadas em pH 5,0 e a 60 ºC. Os
valores da K
M
da enzima extracelular para ρ-NP-αGal, melibiose, estaquiose
e rafinose foram de 0,30, 2,01, 9,66, 16 mM, respectivamente. A seqüência
N-terminal da α-galactosidase extracelular de D. hansenii foi determinada
como YENGLNLVPQMGWN. Tanto a enzima extracelular quanto as células
permeabilizadas contendo a α-galactosidase intracelular foram capazes de
hidrolisar os RO presentes em produtos de soja.
2.9. Avaliação nutricional de produtos de soja com baixos teores de
oligossacarídeos de rafinose
A performance nutricional de animais alimentados com produtos à
base de soja é influenciada pela presença de fatores antinutricionais, como
os RO (LIENER, 1981; ANDERSON e WOLF, 1995). Fatores antinutricionais
são substâncias complexas que, quando presentes em alimentos, podem
provocar efeitos fisiológicos adversos ou diminuir a biodisponibilidade de
17
nutrientes interferindo negativamente no desempenho produtivo e
reprodutivo do animal (SILVA e SILVA, 2000). Nesse sentido, a ação
antinutricional dos RO está relacionada com o fato desses açúcares serem
responsáveis pelo aumento da viscosidade do bolo alimentar, interferindo na
digestão dos nutrientes por reduzir sua interação com enzimas digestivas no
intestino (SMITS e ANNISON, 1996). Além disso, a presença de altas
concentrações desses açúcares na dieta pode resultar na retenção de
fluidos, acelerando o fluxo digestivo, afetando a utilização e absorção de
nutrientes (WIGGINS, 1984). A ingestão de produtos de soja contendo
oligossacarídeos de rafinose também pode resultar em flatulência, náuseas,
desconforto abdominal e diarréia (WAGNER et al., 1976). Liying et al. (2003)
reportaram um aumento na incidência de diarréia e um decréscimo de 0,08
Kg/dia no ganho de peso corporal em porcos quando 2 % de estaquiose foi
adicionada à dieta. Smiricky-Tjardes et al. (2003) avaliando os efeitos da
presença de RO na dieta de porcos verificaram uma redução de 5 % na
digestibilidade de nitrogênio quando 3,5 % desses açúcares foi adicionado à
dieta.
Vários estudos têm mostrado que a ingestão de produtos de soja
livres ou com teores reduzidos desses açúcares solúveis traz efeitos
benéficos, reduzindo a viscosidade do bolo alimentar e melhorando a
digestão de nutrientes (SMIRICKY et al., 2002; LESKE et al., 1991; COON et
al., 1990).
Suarez et al. (1999) relataram a ocorrência de menor flatulência em
humanos quando estes ingeriam farinha de soja derivada de sementes com
baixos teores de RO. Parsons et al. (2000) observaram que o valor da
energia líquida metabolizável da dieta foi maior quando frangos de corte
foram alimentados com farinha de soja contendo baixas concentrações de
oligossacarídeos (2.931 Kcal/Kg) comparada a farinha de soja convencional
(2.739 Kcal/Kg). Resultados semelhantes foram encontrados por Leske et
al. (1991). Coon et al. (1990) observaram que a redução dos RO da farinha
de soja, usada na dieta de aves, aumentou o valor da energia metabolizável
em 20 %.
Entre os vários processos para redução ou eliminação dos RO
visando aliviar os efeitos antinutricionais desses açúcares estão a
18
suplementação da dieta com α-galactosidases (IGBASAN et al., 1997;
SMIRICKY et al., 2002) ou a fermentação de produtos de soja por
microrganismos produtores dessa enzima (LEBLANC et al., 2004a;
DONKOR et al., 2007).
Veldman et al. (1993) e Gdala et al. (1997) relataram que quando a
dieta de porcos foi suplementada com α-galactosidase a digestibilidade ileal
da rafinose aumentou levando a uma maior absorção de monossacarídeos
no intestino. Baucells et al. (2000) relataram que o uso de α-galactosidase
em dietas a base de soja melhorou o ganho de peso e a digestibilidade das
proteínas e reduziu a flatulência em porcos. Resultados obtidos por LeBlanc
et al. (2004a) mostraram que ratos alimentados com leite de soja fermentado
por Lactobacillus fermentum CRL 722 apresentaram uma redução no peso
do ceco e no metabolismo microbiano confirmando que a fermentação dos
produtos de soja por microrganismos produtores de α-galactosidase reduz a
quantidade de RO e consequentemente a produção de gases.
Entretanto a remoção dos RO dos produtos de soja ainda tem
resultados controversos, pois alguns autores não relatam efeitos benéficos
no valor nutricional da soja decorrente deste processamento. Irish et al.
(1995) não observaram nenhum efeito na digestibilidade ileal das proteínas
quando, à dieta de frangos, foi adicionada a enzima α-galactosidase.
Resultados obtidos por Smiricky et al. (2002) mostraram que a
digestibilidade da maioria dos aminoácidos em suínos alimentados com dieta
à base de farinha de soja não foi melhorada pela adição de α-galactosidase.
Nestes casos os autores sugeriram que essas variações nos resultados
podem ter sido devido a diferenças nas fontes produtoras e na atividade das
enzimas utilizadas.
Alguns autores até mesmo relataram um efeito benéfico dos RO
atuando com prébióticos por aumentar a concentração de bactérias
benéficas (Lactobacillus e Bifidobacterium) e diminuir a população de
enterobactérias no intestino (KARR-LILIENTHAL et al., 2005).
Em vista disso, um melhor entendimento do efeito da presença dos
RO em produtos derivados de soja pode levar a uma melhora no valor
nutricional e até mesmo a um maior aproveitamento dos mesmos.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Enzimologia e de
Análises Bioquímicas do Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária
(BIOAGRO) e no Laboratório de Nutrição Experimental do Departamento de
Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa,
Minas Gerais.
Os reagentes rafinose, estaquiose, ρ-nitrofenil-α-D-galactopiranosídeo
(ρ-NP-αGal) foram adquiridos da Sigma Chemical Company.
Da Merck S.A. Indústrias Químicas foram obtidas os seguintes
reagentes: ρ-nitrofenol (ρ-NP), sacarose, glicose, lactose, ácido meta
fosfórico.
Da RHOSTER – Indústria e Comércio Ltda. foram adquiridos os
seguintes componentes das dietas experimentais: caseína, amido
dextrinizado, celulose, mistura salínica, mistura vitamínica, L-cistina,
bitartarato de colina.
Sacarose, óleo de soja e amido de milho foram adquiridos no
comércio local.
Os demais reagentes utilizados para a execução deste trabalho
apresentavam procedência e grau de pureza analíticos.
A variedade de soja UFVTN 105, sem lipoxigenases, foi fornecida
pelo Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja do Instituto de
Biotecnologia Aplicada à Agropecuária da Universidade Federal de Viçosa
(BIOAGRO).
A farinha de soja desengordurada (PS 60) foi fornecida pela empresa
BUNGE Alimentos S.A., Esteio-RS, Brasil.
20
3.1. Microrganismo e manutenção da cultura
A fonte de α-galactosidase do presente trabalho foi a cepa de
Debaryomyces hansenii, codificada como UFV-1, que pertence à coleção de
leveduras do Laboratório de Fisiologia de Microrganismos-BIOAGRO-UFV e
foi isolada de ambiente de laticínios da região da Zona da Mata, Minas
Gerais. Esta levedura foi identificada pelo Instituto de Identificação de
Leveduras, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Holanda como
D. hansenii (Zopf) Lodder & Kreger-van Rij var. fabryi Nakase & Suzuki.
A levedura mantida a -80 ºC em glicerol e YPD (1 % de extrato de
levedura, 2 % de peptona e 2 % de glicose), foi estriada em placas contendo
meio YPD (1,5 % ágar) e incubada por 36 h a 30 °C. As placas foram
mantidas a 4 ºC e este estoque foi repicado mensalmente e utilizado para
inóculo.
3.2. Cultivo de Debaryomyces hansenii em meio YPD
A levedura Debaryomyces hansenii mantida em placas a 4
o
C foi
ativada em meio YPD líquido, em erlenmeyers de 250 mL, incubada em
Incubator Shaker Series 25D New Brunswick a 30
o
C, 200 rpm, por 12-15 h.
Após esse período, o meio foi centrifugado a 4000 g, por 5 min, 4
o
C. O
sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com água
peptonada 0,1 % (p/v) para serem então inoculadas em suspensão de
farinha de soja desengordurada ou em outro meio apropriado para indução
da síntese de α-galactosidase.
3.3. Determinação das condições para o tratamento da suspensão de
farinha de soja desengordurada com células viáveis de Debaryomyces
hansenii
Para determinação da concentração inicial de células da levedura a
serem inoculadas na suspensão de farinha de soja desengordurada, a
farinha de soja desengordurada foi ressuspendida, em dois erlenmeyers de
250 mL, em água destilada na proporção de 1:10 (p/v), homogeneizada em
21
agitador magnético por 10 min e estas suspensões foram autoclavadas a
121 ºC por 15 min. As células de D. hansenii, obtidas conforme descrito no
item 3.2, foram então inoculadas (concentração inicial equivalente a A
600
de
0,1 e 0,5, em cada erlenmeyer) nessas suspensões. Cada erlenmeyer
contendo aproximadamente 5 g da farinha de soja desengordurada
reconstituída foi incubado em Incubator Shaker Series 25D New Brunswick a
200 rpm, 30 ºC por 72 h. Alíquotas de 2 mL foram retiradas de 12 em 12 h,
para determinação da atividade de α-galactosidase. O experimento foi
realizado em triplicata.
Foi determinada também a condição de aeração no erlenmeyer
contendo a suspensão de farinha de soja desengordurada inoculada com
células viáveis da levedura, para otimizar a hidrólise dos RO. Para isto, a
farinha de soja desengordurada foi ressuspendida, em dois erlenmeyers de
2000 mL, em água destilada na proporção de 1:10 (p/v), homogeneizada em
agitador magnético por 10 min e estas suspensões foram autoclavadas a
121 ºC por 15 min. As células de D. hansenii, obtidas conforme descrito no
item 3.2, foram então inoculadas (concentração inicial equivalente a A
600
de
0,2) nessas suspensões. Um erlenmeyer continha aproximadamente 500 mL
da suspensão de farinha de soja desengordurada inoculada com a levedura
e o segundo continha aproximadamente 1000 mL. Esses erlenmeyers foram
incubados em Incubator Shaker Series 25D New Brunswick a 200 rpm, 30
ºC por 72 h. Alíquotas de 2 mL foram retiradas de 12 em 12 h, para
determinação da porcentagem de hidrólise dos RO. As alíquotas foram
liofilizadas em liofilizador Edwards Super Modulyo e os RO extraídos de 20-
30 mg do pó obtido. A eficiência da hidrólise foi avaliada pela redução dos
níveis dos RO presentes na suspensão de farinha de soja, em função do
tempo de incubação com a levedura. O experimento foi realizado em
triplicata.
3.4. Tratamento da suspensão de farinha de soja desengordurada com
células viáveis de Debaryomyces hansenii
A farinha de soja desengordurada foi ressuspendida, em erlenmeyer
de 250 mL, em água destilada na proporção de 1:10 (p/v), homogeneizada
22
em agitador magnético por 10 min e esta suspensão foi autoclavada a 121
ºC por 15 min. As células de D. hansenii, obtidas conforme descrito no item
3.2, foram então inoculadas (concentração inicial equivalente a A
600
de 0,2)
nessa suspensão. Cada erlenmeyer contendo aproximadamente 5 g da
farinha de soja desengordurada reconstituída foi incubado em Incubator
Shaker Series 25D New Brunswick a 200 rpm, 30 ºC por 72 h. Alíquotas de 2
mL foram retiradas de 12 em 12 h, para determinação da atividade de α-
galactosidase e da porcentagem de hidrólise dos RO. O experimento foi
realizado em triplicata. As alíquotas foram liofilizadas em liofilizador Edwards
Super Modulyo e os RO extraídos de 20-30 mg do pó obtido. A eficiência da
hidrólise foi avaliada pela redução dos níveis dos RO presentes na
suspensão de farinha de soja, em função do tempo de incubação com a
levedura.
3.5. Produção da farinha de soja desengordurada tratada e não tratada
com células viáveis de Debaryomyces hansenii
Cerca de 50 g de farinha de soja desengordurada foram
ressuspendidas, em erlenmeyers de 2000 mL, em água destilada na
proporção de 1:10 (p/v) e homogeneizada em agitador magnético por 10
min. Em seguida esta suspensão foi autoclavada a 121 ºC por 15 min para
esterilização e inativação de outros fatores antinutricionais como os
inibidores de protease (FLEMING e LEE, 1983). A suspensão de farinha de
soja autoclavada foi inoculada com cultura ativa de D. hansenii resultando
numa concentração inicial equivalente a A
600
de 0,2 e foi em seguida
incubada em Incubator Shaker Series 25D New Brunswick a 200 rpm, 30 ºC
por 36 h. Após esse tempo o conteúdo dos erlenmeyers foi congelado a -80
ºC e posteriormente liofilizado em liofilizador Edwards Super Modulyo para
obtenção da farinha de soja desengordurada tratada (farinha de soja
desengordurada sem oligossacarídeos) para ser usada como fonte protéica
da dieta (D1) utilizada no ensaio biológico. A produção foi realizada num
total de 4000 mL.
A farinha de soja desengordurada não tratada (farinha de soja
desengordurada com oligossacarídeos), utilizada como fonte protéica da
23
dieta (D2), foi preparada da mesma forma como descrito anteriormente,
exceto que a suspensão de farinha de soja após autoclavagem não foi
adicionada de células da levedura.
3.6. Preparo da farinha de soja integral variedade UFVTN 105
Os grãos de soja variedade UFVTN 105 previamente selecionados
foram limpos e submetidos a um tratamento térmico a 80 °C por 5 min em
calor seco para facilitar a retirada da casca. Os grãos secos, após
resfriamento,
foram triturados em moinho de café e o pó resultante da
moagem foi passado em peneira Granutest número 40, abertura 0,42 mm,
32 mesh para padronizar o tamanho de suas partículas. Em seguida, a
farinha obtida foi submetida a um tratamento térmico a 140 ºC por 20 min em
calor seco para inativação de outros fatores antinutricionais presentes na
soja como os inibidores de protease. Após o resfriamento, a farinha foi
acondicionada em embalagens de polietileno e mantida sob refrigeração.
Neste trabalho esta farinha de soja integral variedade UFVTN 105 será
denominada farinha de soja integral.
3.7. Avaliação do índice de urease da farinha de soja integral
Essa metodologia consiste em medir a variação de pH provocada pela
ação da urease em uma solução de uréia sob condições controladas.
Foi utilizada metodologia segundo Baker e Mustakas (1973). Para
cada determinação de variação de pH foram utilizados um tubo controle e
um tubo teste, ambos contendo 0,2 g (±0,001) de amostra. Foram
adicionados 10 mL da solução tampão fosfato de potássio 0,05 M, pH 7,0 ao
tubo branco e 10 mL de solução de uréia tamponada ao tubo teste, sendo
estes devidamente tampados e acondicionados em banho-maria a 30 °C. Os
tubos foram agitados a cada 5 min e retirados do banho-maria após 30 min
de incubação. O conteúdo de cada tubo foi transferido para béqueres e o pH
medido em potenciômetro devidamente calibrado. O índice de urease
consiste na diferença de pH entre os tubos branco e teste. Para cada
tratamento o teste foi realizado em duplicata.
24
3.8. Produção da preparação enzimática de α-galactosidase pelo cultivo
de Debaryomyces hansenii em meio apropriado
Inicialmente, a levedura Debaryomyces hansenii foi ativada em meio
YPD líquido conforme descrito no item 3.2.
As células de D. hansenii foram então inoculadas (concentração inicial
equivalente a A
600
de 0,1) em meio mineral contendo 0,62 g/L KH
2
PO
4
; 2,0
g/L K
2
HPO
4
; 1,0 g/L (NH
4
)
2
SO
4
; 0,1 g/L MgSO
4
.7H
2
O; 5,0 g/L extrato de
levedura e lactose como fonte de carbono. Após incubação a 30 ºC, 200 rpm
por 27 h em Incubator Shaker Series 25D New Brunswick as células foram
separadas por centrifugação a 4000 g, 5 min, a 4 ºC e o sobrenadante
contendo α-galactosidase foi congelado a -20 ºC para posterior hidrólise dos
RO na farinha de soja integral.
3.9. Hidrólise dos RO na farinha de soja integral
A farinha de soja integral foi ressuspendida na preparação enzimática
de α-galactosidase de Debaryomyces hansenii, contendo 0,12 U/mL, na
proporção de 1:10 (p/v) e homogeneizada em agitador magnético por 10
min. Porções de aproximadamente 5 g da farinha reconstituída foram
transferidas para erlenmeyers de 250 mL em triplicata. Os erlenmeyers
foram incubados em Incubator Shaker Series 25D New Brunswick a 100
rpm, 50 ºC por 24 h. Alíquotas de 1 mL foram retiradas de 2 em 2 h, para
determinação da porcentagem de hidrólise dos RO presentes na farinha de
soja. As alíquotas foram liofilizadas em liofilizador Edwards Super Modulyo e
os RO extraídos de 20-30 mg do pó obtido. A eficiência da hidrólise foi
avaliada pela redução dos níveis dos RO presentes na farinha de soja, em
função do tempo de incubação com a enzima.
25
3.10. Produção da farinha de soja integral tratada e não tratada com a
preparação enzimática de α-galactosidase de D. hansenii
A farinha de soja integral foi ressuspendida na preparação enzimática
de α-galactosidase de D. hansenii, contendo 0,12 U/mL, na proporção de
1:10 (p/v) e homogeneizada em agitador magnético por 10 min. Porções de
1000 mL foram transferidas para erlenmeyers de 2000 mL, sendo em
seguida incubados em Incubator Shaker Series 25D New Brunswick a 100
rpm, 50 ºC por 20 h. Após esse tempo o conteúdo dos erlenmeyers foi
congelado a -80 ºC e posteriormente liofilizado em liofilizador Edwards Super
Modulyo para obtenção da farinha de soja integral tratada (farinha de soja
integral sem oligossacarídeos) para ser usada como fonte protéica da dieta
(D3) utilizada no ensaio biológico. A produção foi realizada num total de
4000 mL.
A farinha de soja integral não tratada (farinha de soja integral com
oligossacarídeos), utilizada como fonte protéica da dieta (D4), foi preparada
da mesma forma como descrito anteriormente, exceto que a farinha de soja
foi ressuspendida na preparação enzimática de α-galactosidase previamente
aquecida a 80 °C por 30 min para inativação da enzima.
3.11. Determinação da atividade de α-galactosidase
A atividade de α-galactosidase foi avaliada através da medida da taxa
de conversão do substrato sintético ρ-NP-αGal. A mistura de reação
continha 650 μL de tampão acetato de sódio 100 mM, pH 5,0, 250 μL de
solução de ρ-NP-αGal 2mM e 0-100 μL do extrato enzimático. A reação foi
conduzida por 15 min em banho-maria a 40
o
C e interrompida pela adição de
1 mL de solução 0,5 M de Na
2
CO
3
. Os valores de absorbância a 410 nm
foram transformados em μmoles de ρ-nitrofenol (ρ-NP), utilizando uma curva
padrão construída com 0-0,2 μmoles de ρ-NP a partir de uma solução
estoque de concentração 2 μmoles/mL. Uma unidade de enzima (U) foi
definida como sendo a quantidade de proteína necessária para produzir 1
μmol de ρ-NP por minuto, nas condições de ensaio.
26
3.12. Determinação da atividade de invertase
Os ensaios para determinação da atividade de invertase foram
realizados com o uso do reagente dinitrossalicilato (MILLER, 1956). O
sistema de ensaio constituiu-se de 0-100 μL do extrato enzimático, 250 μL
de solução de sacarose a 1% (p/v) e 650 μL de tampão acetato de sódio 100
mM, pH 5,0. O ensaio foi conduzido por 20 min, a 40 ºC. Após esse período,
foi acrescentado 1 mL do reagente DNS e a amostra foi fervida por 5 min. A
quantidade de açúcar redutor formado foi estimada
espectrofotometricamente a 540 nm, utilizando-se uma curva padrão
construída com glicose. Uma unidade de enzima foi definida como a
quantidade de enzima necessária para produzir 1 μmol de açúcar redutor
por minuto, nas condições de ensaio.
3.13. Extração dos RO
A extração dos RO, após liofilização, das suspensões de farinha de
soja tratada e não tratada foi realizada de acordo com a metodologia
proposta por Guimarães et al. (2001). Aproximadamente 20-30 mg das
amostras liofilizadas foram pesadas em tubos tipo eppendorf e usadas para
o processo de extração dos açúcares solúveis. A fração óleo, presente nas
amostras foi retirada em 4 extrações com 1 mL de éter de petróleo em
banho-maria a 42 °C por 5 min. Os açúcares foram então extraídos em 3
etapas de tratamento com etanol 80 %, em banho fervente por 5 min. Após
cada extração feita com éter de petróleo ou álcool 80 %, a mistura foi
submetida à centrifugação em centrífuga modelo Eppendorf 5415C, 14.000
rpm, por 20 min. O extrato alcoólico total obtido foi evaporado em estufa a 50
ºC e após este procedimento os açúcares foram ressuspendidos em 1 mL de
etanol 80 % e congelados a -20 °C. Após 24 h as amostras foram
centrifugadas nas mesmas condições já descritas, filtradas em filtro Millipore
de 0,45 micra de diâmetro e armazenadas a -20 °C, para posterior análise
por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
27
3.14. Determinação do teor de RO por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE)
Os RO extraídos das farinhas de soja tratada e não tratada, foram
analisados por CLAE em cromatógrafo Shimadizu série 10A, equipado com
detector de índice de refração e coluna em aço inox (25 x 0,465 cm)
contendo o grupo aminopropil (-NH
2
) como fase estacionária. A fase móvel
constituiu-se de uma mistura acetonitrila-água (80:20) em condições
isocráticas. As análises foram realizadas a 35 °C sob um fluxo de 1 mL/min e
todo o processo foi controlado por um computador acoplado ao sistema.
O método foi padronizado para determinação quantitativa dos
açúcares solúveis presentes nos produtos derivados da soja. A partir de uma
solução estoque formada pela mistura dos açúcares frutose, sacarose,
rafinose e estaquiose nas concentrações de 4, 4, 8 e 8 % (p/v),
respectivamente, foram feitas diluições para obtenção das soluções padrão.
Cada solução foi injetada no cromatógrafo para obtenção das curvas padrão,
correlacionando a área do pico com a concentração do açúcar na solução.
As retas foram obtidas por regressão linear. Um volume de 20 μL de cada
amostra foi injetado no cromatógrafo e cada açúcar presente foi identificado
e quantificado por comparação com os tempos de retenção e concentrações
dos açúcares nas soluções padrão. Todos os cálculos foram feitos pelo
computador acoplado ao sistema de CLAE equipado como programa LC-10
versão 2.2 para Windows
®
.
3.15. Determinação da composição centesimal das farinhas de soja
tratada e não tratada
3.15.1. Determinação do teor de proteínas
O teor de nitrogênio foi determinado, em triplicata, pelo método de
Kjeldahl descrito pela Association of Official Analytical Chemists - AOAC
(1997). Para o cálculo da conversão do nitrogênio em proteína foi utilizado o
fator 6,25.
28
3.15.2. Determinação do teor lipídico
O teor de lipídios foi determinado, em triplicata, utilizando aparelho
extrator Soxhlet e éter de petróleo como solvente, com refluxo por 24 h, de
acordo com a AOAC (1997).
3.15.3. Determinação de umidade
O teor de umidade foi determinado, em triplicata, de acordo com a
AOAC (1997) em estufa a 105 ºC, até peso constante.
3.15.4. Determinação do conteúdo de cinzas
A determinação do conteúdo de cinzas foi conduzida, em triplicata,
por meio da calcinação das amostras a 550 °C, segundo método descrito
pela AOAC (1997).
3.15.5. Determinação do teor de carboidratos totais
O teor de carboidratos foi determinado por diferença percentual,
considerando os teores de proteínas, lipídios, cinzas e umidade.
3.16. Ensaio biológico
As farinhas de soja tratada e não tratada foram utilizadas como fonte
de proteína em dietas que foram avaliadas por meio de ensaio biológico com
ratos, realizado no Laboratório de Nutrição Experimental do Departamento
de Nutrição e Saúde da Universidade Federal de Viçosa. Os procedimentos
experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética do Departamento de
Veterinária/UFV (processo nº 57/2007).
29
3.16.1. Preparo das dietas
Foram preparadas dieta aprotéica, dieta com caseína (padrão) e as
dietas experimentais com e sem oligossacarídeos, conforme apresentado na
Tabela 2. A dieta D1 continha farinha de soja desengordurada sem
oligossacarídeos de rafinose decorrente da incubação com a levedura, na
dieta D2 por sua vez, a fonte protéica foi farinha de soja desengordurada
contendo oligossacarídeos. A dieta D3 continha farinha de soja integral sem
RO resultante da incubação desta com a preparação enzimática de α-
galactosidase de Debaryomyces hansenii, enquanto a dieta D4 continha
farinha de soja integral com RO.
A composição das dietas experimentais foi baseada na dieta AIN-
93G, segundo Reeves et al. (1993), com o teor de proteínas ajustado para 9
a 10 %. Após o preparo, a concentração protéica de cada dieta foi
determinada, em triplicata, pelo método semimicro Kjeldahl, usando-se o
fator 6,25 para a obtenção do teor de proteína. As dietas foram
acondicionadas em sacos de polietileno devidamente rotulados e
armazenados em refrigerador a 4
o
C.
As quantidades dos componentes óleo de soja, amido de milho, fibra
alimentar, amido dextrinizado e sacarose foram ajustadas, conforme a
composição das fontes protéicas, de modo a obter dietas isocalóricas e
isoprotéicas.
30
Tabela 2-Composição das dietas experimentais utilizadas no ensaio
biológico (g/100g de mistura).
Dietas
Ingredientes
Aprotéica Caseína D1 D2 D3 D4
Caseína
1
- 17,94 - - - -
Farinha de soja - - 21,12 24,92 35,60 36,21
Amido dextrinizado
1
13,20 13,20 13,20 13,20 13,20 13,20
Sacarose
2
10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
Óleo de soja
2
7,00 7,00 7,00 7,00 - -
Fibra
1
(celulose) 5,00 5,00 2,80 2,80 - -
Mistura Mineral
1
* 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50
Mistura Vitamínica
1
* 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Bitartarato de colina
1
0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
L-cistina
1
0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
Amido de milho
2
59,75 71,68 71,75 68,01 72,01 71,41
D1-Dieta contendo farinha de soja desengordurada sem oligossacarídeos de rafinose após
incubação com a levedura
D2-Dieta contendo farinha de soja desengordurada com oligossacarídeos de rafinose
D3-Dieta contendo farinha de soja integral sem oligossacarídeos de rafinose após
incubação com a preparação enzimática de α-galactosidase
D4-Dieta contendo farinha de soja integral com oligossacarídeos de rafinose
1
Obtido da RHOSTER – Indústria e Comércio Ltda.
* Segundo Reeves et al. (1993).
2
Obtido no comércio de Viçosa, MG.
3.16.2. Animais
Foram utilizados ratos machos da raça Wistar, recém-desmamados,
com média de 23 dias de idade, peso variando de 50 a 60 g, provenientes do
Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCB) da
Universidade Federal de Viçosa (UFV).
Os animais foram divididos em grupos de seis animais cada, de modo
que a diferença entre as médias dos pesos entre os grupos não excedesse a
5 g. Os ratos foram alocados em gaiolas individuais, onde receberam água e
suas dietas experimentais ad libitum por 14 dias. Os animais foram mantidos
em condições de temperatura (22 ± 3
o
C) e luminosidade (fotoperíodo de
31
12h) controladas, sendo o monitoramento do consumo alimentar feito
semanalmente.
Ao término do experimento os animais foram eutanasiados por
inalação com gás carbônico, e foram determinados os valores de ganho de
peso, consumo protéico, digestibilidade verdadeira, coeficiente de eficácia
protéica (PER) e razão protéica líquida (NPR). Foi realizada também, a
determinação da concentração dos ácidos graxos de cadeia curta no
conteúdo cecal dos animais alimentados com as dietas contendo farinha de
soja.
3.16.3. Coeficiente de Eficácia Protéica (PER)
O PER relaciona o ganho de peso dos animais do grupo teste com o
consumo de proteína do grupo teste.
O cálculo foi feito pela seguinte equação (Hegsted, 1977):
ganho de peso do grupo-teste (g)
proteína consumida pelo grupo-teste (g)
3.16.4. Razão Protéica Líquida (NPR)
O NPR foi determinado, de acordo com método de Bender e Doell
(1957), no 14
o
dia do experimento, levando-se em consideração o ganho de
peso do grupo teste, mais a perda de peso do grupo com dieta aprotéica, em
relação ao consumo de proteína do grupo teste (HEGSTED, 1977). Foi
calculado de acordo com a seguinte equação:
ganho de peso grupo-teste(g) + perda de peso grupo aprotéico(g)
proteína consumida pelo grupo-teste(g)
3.16.5. Digestibilidade verdadeira
Para a determinação da digestibilidade verdadeira, as dietas foram
marcadas com índigo carmim na proporção de 200 mg/100 g e oferecidas
PER =
NPR =
32
aos animais no 7
o
e 10
o
dias. As fezes foram coletadas do 8
o
ao 11
o
dia e
acondicionadas em recipientes individuais para cada animal, sendo mantidas
sob refrigeração a 4
o
C.
Ao término do experimento, as fezes foram secas em estufa com
circulação de ar a 105
o
C, por 24 h. Após o resfriamento, as fezes foram
pesadas e moídas em moinho de navalha para determinação do teor de
nitrogênio pelo método semimicro Kjeldahl, com amostras em triplicata,
segundo a AOAC (1997).
A determinação da digestibilidade verdadeira foi possível pelo
emprego de um grupo de seis animais com dieta aprotéica. O cálculo foi
realizado de acordo com a seguinte fórmula:
% Digestibilidade =
I
100x)FKF(I
−
−
em que:
I = nitrogênio ingerido pelo grupo com dieta teste;
F = nitrogênio fecal do grupo com dieta teste;
FK = nitrogênio fecal do grupo com dieta aprotéica
3.16.6. Extração e determinação da concentração dos ácidos graxos de
cadeia curta
A extração e determinação da concentração dos ácidos graxos de
cadeia curta (acético, propiônico e butírico) no conteúdo cecal foi realizada
de acordo com técnica descrita por Smiricky-Tjardes
et al. (2003) com
modificações. As amostras de fezes foram misturadas, em tubo tipo
eppendorf, a 500 μL de uma solução de ácido meta-fosfórico a 25 % e
mantidas em repouso, em temperatura ambiente durante 30 min para
precipitação. Após esse período, as amostras foram centrifugadas em
centrífuga do tipo Eppendorf 5415C, 16.100
g, por 30 min. O sobrenadante
foi transferido para outro tubo sendo novamente centrifugado nas mesmas
condições descritas acima, mas por um tempo de 20 min. Em seguida, o
33
sobrenadante obtido foi congelado a -20 ºC para posterior análise por
Cromatografia Gasosa (CG).
Os ácidos graxos foram determinados em cromatógrafo Shimadizu
série 17A, equipado com detector de ionização de chama e coluna Nukol da
Supelco com 30 m de comprimento e diâmetro de 0,25 mm. Os parâmetros
do equipamento foram: temperatura da coluna 100 ºC por 4 min e 185 ºC por
10 min, temperatura do injetor 220
o
C e temperatura do detector de
ionização de chama 250
o
C. O fluxo da coluna foi de 1,90647 mL/min e a
velocidade linear de 43,228 cm/seg. O gás de arraste utilizado foi o hélio.
O método foi padronizado para determinação quantitativa dos ácidos
graxos acético, propiônico e butírico presentes no conteúdo cecal. A partir de
soluções estoque de ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico nas
concentrações de 3,13; 2,54 e 3,45 ng/μL respectivamente, foram feitas
diluições para obtenção das soluções padrão. Cada solução foi injetada no
cromatógrafo para obtenção das curvas, correlacionando a área do pico com
a concentração do ácido graxo na solução. As retas foram obtidas por
regressão linear. O volume de 1 μL de cada amostra foi injetado no
cromatógrafo e cada ácido graxo presente foi identificado e quantificado por
comparação com os tempos de retenção e concentrações dos ácidos graxos
nas soluções padrão. Todos os cálculos foram feitos pelo
computador
acoplado ao sistema de CG equipado como programa GC-10 versão 2.2
para Windows
®
.
3.17. Análise estatística
Procedeu-se à análise estatística (ANOVA), para determinação do
valor de “F”. Para “F” significativo, utilizou-se o teste de Duncan, a 5 % de
probabilidade, para comparação entre as médias. A dispersão da média foi
expressa nas tabelas de resultados como desvio-padrão da média. Os
cálculos foram realizados através do programa SAEG versão 9.1
(Universidade Federal de Viçosa).
34
4. RESULTADOS
4.1. Experimento 1
4.1.1. Preparo e caracterização das farinhas de soja utilizadas no
ensaio biológico
4.1.1.1. Tratamento da suspensão de farinha de soja desengordurada
com células viáveis de Debaryomyces hansenii e remoção dos
oligossacarídeos de rafinose
Para o tratamento da suspensão de farinha de soja desengordurada
com células viáveis da levedura
D. hansenii foi utilizada uma concentração
inicial do inóculo equivalente a A
600
inicial de 0,2, uma vez que não foi
observado diferença na produção da enzima α-galactosidase quando a
concentração inicial foi equivalente a A
600
de 0,1 e 0,5 (dados não
mostrados). A Tabela 3 mostra os valores de atividade de α-galactosidase
em função do tempo de incubação da suspensão de farinha de soja com a
levedura.
Tabela 3 - Atividade de α-galactosidase (U/mL) no sobrenadante da
suspensão de farinha de soja desengordurada inoculada com células viáveis
de
Debaryomyces hansenii.
Tempo de incubação (h) Atividade* (U/mL)
0 0,0
12 0,15±0,01
24 0,21±0,01
36 0,31±0,01
48 0,37±0,01
60 0,42±0,01
72 0,42±0,01
1U: 1μmol de ρ-NP formado por minuto
*Valores expressos como média±desvio padrão
35
Foi observado que a atividade enzimática aumentou com o tempo de
incubação da levedura na farinha de soja, e que a maior atividade observada
ocorreu em 60 h (0,42 U/mL) e se manteve constante até 72 h, que foi o
tempo máximo de incubação.
Durante a incubação da suspensão de farinha de soja
desengordurada com as células da levedura houve redução no conteúdo dos
RO. Os resultados estão apresentados na Figura 3 e os valores da
concentração dos açúcares solúveis em função do tempo de incubação
estão mostrados na Tabela 4.
Figura 3 - Cromatogramas comparativos da hidrólise dos açúcares solúveis
na farinha de soja desengordurada em função do tempo de incubação com a
levedura
Debaryomyces hansenii nos tempos 0h (A), 12h (B) e 36h (C).
A
B
C
Sacarose
Rafinose
Esta
q
uiose
36
Tabela 4 - Concentração de açúcares solúveis na farinha de soja
desengordurada em função do tempo de incubação com a levedura
Debaryomyces hansenii.
Concentração de açúcares (%) ± DP Tempo de
incubação
(h)
Sacarose Rafinose Estaquiose
0 8,01±0,36 1,15±0,08 3,23±0,75
12 7,02±0,25 2,67±0,12 0,10±0,06
24 6,65±0,14 0,34±0,14 0,0
36 3,47±0,04 0,0 0,0
48 0,0 0,0 0,0
60 0,0 0,0 0,0
72 0,0 0,0 0,0
Os resultados foram calculados a partir de cromatogramas obtidos pela análise por CLAE.
De acordo com os dados apresentados na Tabela 4, houve hidrólise
de 96,2 % de estaquiose após 12 h de incubação com a levedura. A
remoção total dos açúcares rafinose e estaquiose foi observada após 36 h,
período em que também se observa hidrólise de 43,3 % do conteúdo de
sacarose. A concentração deste açúcar foi completamente reduzida após 48
h de incubação. Esses resultados são decorrentes da incubação da
suspensão de farinha de soja com células da levedura em um erlenmeyer de
2000 mL contendo 500 mL de suspensão uma vez que foi verificado que
esta condição de aeração foi mais eficaz para hidrólise dos RO (Tabela 5).
Tabela 5
- Influência da aeração no interior do frasco de cultura de
Debaryomyces hansenii no tempo de hidrólise dos oligossacarídeos de
rafinose na suspensão de farinha de soja desengordurada.
Tempo de
incubação
(h)
Concentração de açúcares (%) ± DP
Condição A Condição B
Rafinose Estaquiose Rafinose Estaquiose
0 1,15±0,08 3,23±0,75 1,15±0,08 3,23±0,75
36 0,0 0,0 0,99±0,08 0,0
Condição A- Corresponde à incubação de 500 mL da suspensão de farinha de soja
desengordurada com células de D.hansenii (concentração inicial equivalente a A
600
inicial de
0,2) em um erlenmeyer de 2000 mL.
Condição B- Corresponde à incubação de 1000 mL da suspensão de farinha de soja
desengordurada com células de D.hansenii (concentração inicial equivalente a A
600
inicial de
0,2) em um erlenmeyer de 2000 mL.
37
4.1.1.2. Composição das farinhas de soja desengordurada utilizadas no
preparo das dietas
Os resultados apresentados na Tabela 6 mostram o resumo da
composição química centesimal das farinhas de soja desengordurada
tratada e não tratada utilizadas no ensaio biológico. Pode-se notar que os
valores de umidade variaram de 7,17 a 7,66 %, cinzas de 7,64 a 9,08 %,
lipídios de 0,11 a 0,14 %, carboidratos de 15,81 a 27,89 % e proteínas de
57,19 a 67,31 %.
Tabela 6 - Composição química centesimal das farinhas de soja
desengordurada tratada e não tratada*.
Amostras
FS1 FS2
Umidade(%)
7,66±0,11 7,17±0,04
Cinzas(%)
9,08±0,01 7,64±0,13
Lipídios(%)
0,14±0,07 0,11±0,04
Proteínas(%)
67,31±0,69 57,19±0,21
Carboidratos totais(%) 15,81
27,89
FS1-Farinha de soja desengordurada sem oligossacarídeos após incubação com a levedura
FS2-Farinha de soja desengordurada com oligossacarídeos
*Valores expressos como média ± desvio padrão
Na Tabela 7 está apresentada a composição dos oligossacarídeos,
rafinose e estaquiose, presentes nas farinhas de soja desengordurada
tratada e não tratada. De acordo com os resultados, o conteúdo de rafinose
e estaquiose na farinha de soja desengordurada após incubação com a
levedura (FS1) foi totalmente reduzido enquanto que na farinha de soja
desengordurada não submetida ao tratamento acima (FS2) foi de 1,15 e
3,23 %, respectivamente.
Tabela 7 - Conteúdo de oligossacarídeos de rafinose nas farinhas de soja
desengordurada tratada e não tratada*.
FS1-Farinha de soja desengordurada sem oligossacarídeos após incubação com a levedura
FS2-Farinha de soja desengordurada com oligossacarídeos
*Valores expressos como média ± desvio padrão
Amostra Rafinose Estaquiose
%
FS1
0,0 0,0
FS2 1,15±0,08 3,23±0,75
38
4.1.2. Efeito do processamento enzimático no valor nutricional das
farinhas de soja desengordurada
4.1.2.1. Efeito do processamento enzimático nos valores de
digestibilidade verdadeira
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 8, a dieta
contendo farinha de soja desengordurada sem a presença de
oligossacarídeos (D1) apresentou um valor de digestibilidade superior e
estatisticamente significativo (p≤0,05) em relação à dieta contendo farinha
de soja desengordurada com oligossacarídeos (D2), 91,28 e 87,14 %,
respectivamente.
Tabela 8 - Digestibilidade protéica verdadeira in vivo absoluta e relativa das
dietas contendo caseína e farinha de soja desengordurada.
Tratamento Digestibilidade* (%) Digestibilidade Relativa
(%)
Caseína 95,54
a
± 2,56 100
D1 91,28
b
± 2,07 95,61
D2 87,14
c
± 2,98 91,27
D1-Dieta contendo farinha de soja desengordurada sem oligossacarídeos após incubação
com a levedura
D2-Dieta contendo farinha de soja desengordurada com oligossacarídeos
As médias seguidas por uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan ao
nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média± desvio padrão
4.1.2.2. Efeito do processamento enzimático nos valores de ganho de
peso, Coeficiente de Eficácia Protéica (PER) e Razão Protéica Líquida
(NPR)
Os resultados, apresentados na Tabela 9, mostraram que os valores
de ganho de peso foram estatisticamente semelhantes, em nível de 5 % de
probabilidade, para os ratos alimentados com as dietas contendo farinha de
soja desengordurada com e sem oligossacarídeos (D1 e D2). De acordo
com os dados apresentados nesta tabela, foi observado também que a dieta
de caseína promoveu maior ganho de peso durante os 14 dias de
experimento.
39
Tabela 9 - Ganho de peso e consumo protéico de ratos alimentados com
dietas contendo caseína e farinha de soja desengordurada.
Dietas Ganho de Peso (g)* Consumo Protéico (g)*
Caseína 66,00
a
± 12,05
17,53ª ± 2,17
D1 29,17
b
± 4,26 11,08
b
± 1,47
D2 33,83
b
± 5,49 12,46
b
± 1,49
D1-Dieta contendo farinha de soja desengordurada sem oligossacarídeos após incubação
com a levedura
D2-Dieta contendo farinha de soja desengordurada com oligossacarídeos
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Duncan ao nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média± desvio padrão
Na Tabela 10 estão apresentados os valores de PER, PER relativo
(PERR), NPR e NPR relativo (NPRR) das dietas contendo caseína e farinha
de soja desengordurada.
Tabela 10 - Coeficiente de Eficácia Protéica (PER), PER relativo (PERR),
Razão Protéica Líquida (NPR) e NPR relativo (NPRR) das dietas contendo
caseína e farinha de soja desengordurada.
Dietas PER* PERR (%) NPR* NPRR (%)
Caseína 3,76
a
± 0,39 100 4,34
a
± 0,46 100
D1 2,63
b
± 0,14 72,16 3,56
b
± 0,16 81,39
D2 2,71
b
± 0,22 70,04 3,53
b
± 0,22 81,94
D1-Dieta contendo farinha de soja desengordurada sem oligossacarídeos após incubação
com a levedura
D2-Dieta contendo farinha de soja desengordurada com oligossacarídeos
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Duncan ao nível de 5% de significância
*Valores expressos como média± desvio padrão
De acordo com os resultados apresentados observa-se que a dieta de
caseína apresentou valores de PER, PERR, NPR e NPRR superiores e
estatisticamente significativos (p≤0,05) aos encontrados para as dietas
contendo as farinhas de soja desengordurada. Porém não houve variação
significativa para esses valores entre as dietas (D1 e D2) formuladas com
farinha de soja desengordurada.
40
4.1.2.3. Efeito da remoção dos oligossacarídeos de rafinose na
produção de ácidos graxos de cadeia curta
A determinação da concentração dos ácidos graxos de cadeia curta
no conteúdo cecal dos animais submetidos às dietas experimentais foi
realizada conforme descrito no item 3.16.6, após 14 dias de experimento. A
Tabela 11 mostra a concentração (μmol/g de amostra) dos ácidos acético,
propiônico e butírico.
Tabela 11 - Concentração (μmol/g de amostra) dos ácidos graxos de cadeia
curta no conteúdo cecal de ratos alimentados com dietas contendo farinha
de soja desengordurada com e sem oligossacarídeos de rafinose*.
Dietas Ácido acético Ácido propiônico Ácido butírico
D1 5,85
a
±0,63 1,97
a
±0,20 1,95
a
±0,21
D2 6,59
a
±0,70 1,86
a
±0,36 3,00
a
±1,19
D1-Dieta contendo farinha de soja desengordurada sem oligossacarídeos após incubação
com a levedura
D2-Dieta contendo farinha de soja desengordurada com oligossacarídeos
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste “F” ao nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média± desvio padrão
A produção de ácidos graxos de cadeia curta não diferiu
estatisticamente para os animais alimentados com dietas contendo farinha
de soja desengordurada sem e com oligossacarídeos de rafinose (D1 e D2).
As fezes dos ratos alimentados com dieta contendo farinha de soja
desengordurada com oligossacarídeos apresentaram uma consistência mais
líquida e um odor mais desagradável em comparação com as fezes dos
animais alimentados com dieta contendo farinha de soja desengordurada
sem oligossacarídeos.
41
4.2. Experimento 2
4.2.1. Preparo e caracterização das farinhas de soja utilizadas no
ensaio biológico
4.2.1.1. Efeito dos tratamentos térmicos no índice de urease da farinha
de soja integral
Nos ensaios para avaliação do índice de atividade de urease, a
farinha de soja integral foi submetida a diferentes tratamentos térmicos
(tempo e temperatura) e a medida da variação do pH, após cada tratamento,
foi realizada conforme descrito no item 3.7.
Os resultados estão apresentados na Tabela 12.
Tabela 12 - Índice de urease na farinha de soja integral submetida a
diferentes tratamentos térmicos.
Tratamento térmico ΔpH*
100 ºC/30 min 1,82±0,01
130 ºC/30 min 1,69±0,01
140 ºC/20 min 0,11±0,01
150 ºC/10 min 1,68±0,02
150 ºC/20 min 0,02±0,01
*Valores expressos como média±desvio padrão
Foi observado que o binômio 100 ºC/30 min apresentou o maior valor
de variação de pH e, consequentemente, de índice de urease, seguido dos
tratamentos 130 ºC/30 min e 150 ºC/10 min. Os resultados mostraram ainda
que a combinação tempo e temperatura 140 ºC/20 min e 150 ºC/20 min
apresentaram valores de índice de urease de 0,11 e 0,02, respectivamente.
4.2.1.2. Hidrólise de oligossacarídeos de rafinose na farinha de soja
integral usando a preparação enzimática de α-galactosidase de
Debaryomyces hansenii
A hidrólise dos RO presentes na farinha de soja integral foi realizada
conforme descrito no item 3.9, seguida da extração de RO e análise por
42
CLAE (itens 3.13 e 3.14, respectivamente). A eficiência da hidrólise foi
avaliada pela redução dos níveis dos RO presentes na farinha de soja em
função do tempo de incubação com a enzima. Como controle negativo, a
farinha de soja foi incubada com igual volume de água destilada nas
mesmas condições.
Os valores da concentração dos açúcares solúveis em função do
tempo de hidrólise estão mostrados na Tabela 13 e os cromatogramas
resultantes da CLAE estão apresentados na Figura 4.
Tabela 13 - Concentração de açúcares solúveis na farinha de soja integral
em função do tempo de incubação com a preparação enzimática de α-
galactosidase de
Debaryomyces hansenii.
Concentração de açúcares (%) ± DP
Tempo de
incubação
(h)
Sacarose Rafinose Estaquiose
0 5,01±0,16 0,93±0,08 2,90±0,16
2 5,02±0,21 1,33±0,07 1,51±0,05
8 5,27±0,22 1,37±0,05 0,58±0,03
10 4,71±0,16 1,05±0,06 0,23±0,01
12 2,45±0,07 0,66±0,10 0,0
16 0,0 0,56±0,08 0,0
20 0,0 0,0 0,0
Os resultados foram calculados a partir de cromatogramas obtidos pela análise por CLAE.
De acordo com os dados apresentados na Tabela 13, a redução total
na concentração dos oligossacarídeos de rafinose, na farinha de soja
integral, foi verificada após 20 h de incubação com a preparação enzimática
na concentração de 1,2 U/g de farinha. Nas primeiras horas de incubação
ocorreu um aumento na concentração de rafinose, provavelmente devido à
hidrólise do açúcar estaquiose, que foi totalmente hidrolisado após 12 h de
incubação. Nesse período também foi verificado 48 % de redução na
concentração do açúcar sacarose na amostra.
43
Figura 4 - Cromatogramas comparativos da hidrólise dos açúcares solúveis
na farinha de soja integral em função do tempo de incubação com a
preparação enzimática de α-galactosidase de
Debaryomyces hansenii nos
tempos 0h (A), 10h (B) e 20h (C).
4.2.1.3. Composição das farinhas de soja integral utilizadas no preparo
das dietas
Os resultados apresentados na Tabela 14 mostram o resumo da
composição química centesimal das farinhas de soja integral tratada e não
tratada utilizadas no ensaio biológico. Pode ser observado que os valores de
umidade variaram de 6,75 a 7,65 %, cinzas de 7,26 a 7,31 %, lipídios de
12,79 a 13,64 %, carboidratos de 32,33 a 32,90 % e proteínas de 39,35 a
40,02 %.
A
B
Sacarose
Rafinose
Esta
q
uiose
C
44
Tabela 14 - Composição química centesimal das farinhas de soja integral
tratada e não tratada*.
Amostras
FS3 FS4
Umidade(%)
6,75±0,10 7,65±0,10
Cinzas(%)
7,26±0,23 7,31±0,01
Lipídios(%)
13,64±0,13 12,79±0,27
Proteínas(%)
40,02±0,12 39,35±0,31
Carboidratos totais(%)
32,33 32,90
FS3-Farinha de soja integral sem oligossacarídeos após incubação com a preparação
enzimática de α-galactosidase
FS4-Farinha de soja integral com oligossacarídeos
*Valores expressos como média ± desvio padrão
Na Tabela 15 está apresentada a composição dos oligossacarídeos,
rafinose e estaquiose, presentes nas farinhas de soja integral tratada e não
tratada. De acordo com os resultados, o conteúdo de rafinose e estaquiose
foi de 0,93 e 2,90 %, respectivamente para a farinha de soja integral não
submetida ao tratamento enzimático (FS4), enquanto o conteúdo destes
açúcares foi completamente reduzido na farinha de soja integral (FS3) após
tratamento com a preparação enzimática de α-galactosidase de
D. hansenii.
Tabela 15 - Conteúdo de oligossacarídeos de rafinose nas farinhas de soja
integral tratada e não tratada*.
FS3-Farinha de soja integral sem oligossacarídeos após incubação com a preparação
enzimática de α-galactosidase
FS4-Farinha de soja integral com oligossacarídeos
*Valores expressos como média ± desvio padrão
Amostra Rafinose Estaquiose
%
FS3
0,0 0,0
FS4 0,93±0,08 2,90±0,16
45
4.2.2. Efeito do processamento enzimático no valor nutricional das
farinhas de soja
4.2.2.1. Efeito do processamento enzimático nos valores de
digestibilidade verdadeira
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 16, a dieta
contendo farinha de soja integral sem a presença de oligossacarídeos (D3)
apresentou um valor de digestibilidade superior e estatisticamente
significativo (p≤0,05) em relação à dieta contendo farinha de soja integral
com oligossacarídeos (D4), 81,42 e 75,91 %, respectivamente.
Tabela 16 - Digestibilidade protéica verdadeira in vivo absoluta e relativa das
dietas contendo caseína e farinha de soja integral.
Tratamento Digestibilidade (%)* Digestibilidade Relativa
(%)
Caseína 95,47
a
± 1,04 100
D3 81,42
b
± 1,37 85,28
D4 75,91
c
± 5,38 79,50
D3-Dieta contendo farinha de soja integral sem oligossacarídeos após incubação com a
preparação enzimática de α-galactosidase
D4-Dieta contendo farinha de soja integral com oligossacarídeos
As médias seguidas por uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan ao
nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média± desvio padrão
4.2.2.2. Efeito do processamento enzimático nos valores de ganho de
peso, Coeficiente de Eficácia Protéica (PER) e Razão Protéica Líquida
(NPR)
Os resultados apresentados na Tabela 17 mostraram que os valores
de ganho de peso foram estatisticamente semelhantes, em nível de 5 % de
probabilidade, para os animais alimentados com as dietas contendo farinhas
de soja integral com e sem oligossacarídeos (D3 e D4). De acordo com os
dados apresentados nesta tabela, foi observado também que a dieta de
caseína promoveu maior ganho de peso durante os 14 dias de experimento.
46
Tabela 17 - Ganho de peso e consumo protéico de ratos alimentados com
dietas contendo caseína e farinha de soja integral.
Dietas Ganho de Peso (g)* Consumo Protéico (g)*
Caseína 61,66
a
± 9,83
17,25ª ± 0,70
D3 22,33
b
± 5,71 12,11
b
± 1,47
D4 17,66
b
± 7,00 11,44
b
± 2,03
D3-Dieta contendo farinha de soja integral sem oligossacarídeos após incubação com a
preparação enzimática de α-galactosidase
D4-Dieta contendo farinha de soja integral com oligossacarídeos
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Duncan ao nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média± desvio padrão
Os valores de PER, PER relativo (PERR), NPR e NPR relativo
(NPRR) das dietas contendo caseína e farinha de soja integral estão
apresentados na Tabela 18.
Tabela 18 - Coeficiente de Eficácia Protéica (PER), PER relativo (PERR),
Razão Protéica Líquida (NPR), NPR relativo (NPRR) das dietas contendo
caseína e farinha de soja integral.
Dietas PER* PERR (%) NPR* NPRR (%)
Caseína 3,56
a
± 0,47 100 4,15
a
± 0,46 100
D3 1,82
b
± 0,14 51,28
2,67
b
± 0,25 64,47
D4 1,50
b
± 0,43 42,30
2,41
b
± 0,36 58,21
D3-Dieta contendo farinha de soja integral sem oligossacarídeos após incubação com a
preparação enzimática de α-galactosidase
D4-Dieta contendo farinha de soja integral com oligossacarídeos
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Duncan ao nível de 5% de significância
*Valores expressos como média± desvio padrão
De acordo com os resultados apresentados, foi observado que a dieta
de caseína apresentou valores de PER, PERR, NPR e NPRR superiores e
estatisticamente significativos (p≤0,05) aos encontrados para as farinhas de
soja integral utilizadas. Porém não houve variação significativa para esses
valores entre as dietas formuladas com farinha de soja integral (D3 e D4).
4.2.2.3. Efeito do processamento enzimático na produção de ácidos
graxos de cadeia curta
A determinação da concentração dos ácidos graxos de cadeia curta
no conteúdo cecal dos animais submetidos às dietas experimentais foi
47
realizada conforme descrito no item 3.16.6, após 14 dias de experimento. A
Tabela 19 mostra a concentração (μmol/g de amostra) dos ácidos acético,
propiônico e butírico.
Tabela 19 - Concentração (μmol/g de amostra) dos ácidos graxos de cadeia
curta no conteúdo cecal de ratos alimentados com dietas contendo farinha
de soja integral com e sem oligossacarídeos de rafinose*.
Dietas Ácido acético Ácido propiônico Ácido butírico
D3 9,74
a
±2,06 3,76
a
±0,77 3,02
a
±0,44
D4 11,90
a
±3,33 4,85
a
±1,80 3,60
a
±
0,78
D3-Dieta contendo farinha de soja integral sem oligossacarídeos após incubação com a
preparação enzimática de α-galactosidase
D4-Dieta contendo farinha de soja integral com oligossacarídeos
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste “F” ao nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média± desvio padrão
A produção de ácidos graxos de cadeia curta não diferiu
estatisticamente para os animais alimentados com dieta contendo farinha de
soja integral sem e com oligossacarídeos de rafinose (D3 e D4). Apesar
disso, foi verificada uma diferença na consistência e no odor das fezes dos
animais alimentados com dieta contendo farinha de soja integral com e sem
oligossacarídeos. As fezes dos ratos alimentados com dieta contendo
farinha de soja integral com oligossacarídeos apresentaram uma
consistência mais líquida e um odor mais desagradável em comparação com
as fezes dos animais alimentados com dieta contendo farinha de soja
integral sem oligossacarídeos.
48
5. DISCUSSÃO
Preparo e caracterização das farinhas de soja utilizadas no ensaio
biológico
Várias pesquisas têm sido realizadas com a finalidade de reduzir ou
eliminar os conteúdos de rafinose e estaquiose nas sementes de soja e em
seus produtos derivados, uma vez que esses açúcares são considerados um
fator antinutricional. O tratamento enzimático destes produtos com a enzima
α-galactosidase parece ser a alternativa mais viável para a hidrólise
enzimática desses açúcares, melhorando a qualidade nutricional desta
leguminosa (GUIMARÃES
et al., 2001).
No presente trabalho foram realizados dois experimentos.
No primeiro experimento, inicialmente foi realizada a verificação da
atividade α-galactosidase na suspensão de farinha de soja desengordurada
adicionada de células viáveis da levedura
D. hansenii.
Foi observado (Tabela 3) que a atividade enzimática aumentou com o
tempo de incubação da levedura na farinha de soja, e que o maior valor
ocorreu em 60 h (0,42 U/mL) e se manteve constante até 72 h, que foi o
tempo máximo de incubação. Scalabrini
et al. (1998) relataram que, durante
o crescimento de diversas cepas de
Bifidobacterium, a maior atividade de α-
galactosidase ocorria nas primeiras 12-24 h de cultivo, o que correspondia à
fase exponencial de crescimento baseado em dados da absorbância da
cultura a 600 nm (A
600
), e na maioria dos casos esta atividade diminuía
durante a fase estacionária. Mas, algumas cepas como
B. infantis MB258 e
B. longum MB201 mantinham alta atividade de α-galactosidase durante 48
h, o que levou os autores a sugerirem que a produção da enzima pode não
ser dependente da fase de crescimento microbiano. No caso da incubação
de
D. hansenii em farinha de soja, as leituras da A
600
foram prejudicadas
49
devido à alta turbidez da suspensão de farinha de soja, o que não permitiu a
construção da curva de crescimento microbiano. Dessa forma, o crescimento
da levedura foi estimado pela medida da atividade enzimática e da hidrólise
de RO no meio de cultura.
Durante o cultivo do microrganismo houve redução no conteúdo dos
RO. De acordo com os dados apresentados na Tabela 4, houve hidrólise de
96,2 % de estaquiose após 12 h de incubação com a levedura. A redução
total dos açúcares foi observada após 36 h, o que indica que
D. hansenii foi
capaz de crescer na suspensão de farinha de soja e utilizar os RO como
fonte de carbono. Isto foi possível, provavelmente devido ao fato da farinha
de soja ser rica em fatores estimuladores de crescimento tais como,
oligossacarídeos, aminoácidos e peptídeos (BEZKOROVAINY, 2001).
Donkor
et al. (2007) relataram redução no conteúdo de rafinose e
estaquiose em 77,4 e 63,5 %, respectivamente, após 48 h de cultivo de
B.
lactis B94 no leite de soja. LeBlanc et al. (2004a) observaram que
Lactobacillus fermentum CRL 722 foi capaz de crescer em leite de soja e
reduzir a concentração inicial de estaquiose em aproximadamente 90 %
após 10 h de incubação, tempo no qual também foi verificado maior
atividade de α-galactosidase. O consumo de rafinose e estaquiose por
cepas de
Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium
longum foram estudados por Scalabrini et al. (1998) que observaram
redução total da rafinose e redução de 68 %, 73 % e 35 %, respectivamente,
no conteúdo de estaquiose após 48 h de incubação desses microrganismos
no leite de soja.
O conteúdo médio de sacarose, rafinose e estaquiose na farinha de
soja desengordurada, utilizada neste experimento, foi de 8,01; 1,15 e 3,23 %
respectivamente. Pode-se verificar pelos dados apresentados na Tabela 4,
que o açúcar estaquiose foi mais rapidamente utilizado que a rafinose,
verificando sua redução quase total já nas primeiras 12h de incubação. Esta
diferença pode ter sido causada pelo acúmulo de rafinose no meio, que é
formada durante a hidrólise da estaquiose, por clivagem da ligação α-1,6 e
remoção de um resíduo de galactose.
50
Pelo fato da levedura produzir e secretar α-galactosidases, como já
discutido anteriormente, foi possível a utilização desses oligossacarídeos
presentes no meio. Porém em um estudo recente, Viana
et al. (2007)
relataram a ocorrência de hidrólise de RO por células de
D. hansenii
permeabilizadas contendo α-galactosidase intracelular. Entretanto neste
trabalho não foi realizado o ensaio para verificação da atividade intracelular,
que, se presente, também pode ter contribuído para redução dos níveis de
RO, caso exista algum transportador que carreie esses açúcares para o
interior da célula.
Foi observada também uma redução no conteúdo de sacarose com o
tempo (Figura 3C e Tabela 4). Isto poderia ser explicado pelo fato de, apesar
de não haver atividade de invertase no meio extracelular (dados não
mostrados), esta enzima pode estar presente intracelularmente, e devido a
presença de algum transportador, esse açúcar poderia estar sendo carreado
para o meio intracelular e utilizado pela levedura.
Esses resultados mostram que a levedura
D. hansenii foi capaz de
crescer e utilizar os RO presentes na suspensão de farinha de soja
desengordurada. Além disso, neste trabalho, após a incubação da
suspensão de farinha de soja desengordurada com a levedura houve uma
melhora no aroma da mesma, o que sugere que o tratamento com células da
levedura pode contribuir para desenvolvimento do
flavor. Uma vez que esta
levedura é encontrada em vários produtos alimentícios como queijos, vinhos
e embutidos (SALDANHA-DA-GAMA
et al., 1997), sua utilização no
processamento de derivados de soja, poderia não apresentar problemas de
segurança. Dessa forma,
D hansenii demonstra ter grande potencial para
utilização na redução dos RO em produtos como a farinha de soja, visando o
aumento da qualidade nutricional desse produto
.
No segundo experimento realizado, foram determinadas as condições
para o tratamento enzimático de uma farinha de soja integral usando uma
preparação enzimática de α-galactosidase de
D. hansenii, para hidrólise dos
RO. A farinha utilizada neste experimento foi preparada no próprio
laboratório, utilizando soja da variedade UFVTN 105, sem lipoxigenases,
cedida pelo Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja do
51
BIOAGRO/UFV. Esta variedade foi escolhida por não conter em suas
sementes a enzima lipoxigenase que também se constitui em um fator
antinutricional, sendo responsável pelo
beany flavor.
Como uma das etapas para a produção da farinha de soja integral,
esta foi submetida a vários tratamentos térmicos a fim de se avaliar as
melhores condições para inativação de outros fatores antinutricionais
termolábeis como os inibidores de protease e lectinas. Em indústrias de soja,
o índice de urease é muito utilizado com o objetivo de avaliar o efeito do
tratamento térmico na qualidade nutricional, uma vez que a urease e os
inibidores de tripsina apresentam um padrão similar de inativação (QIN
et al.,
1996). Nesse sentido, trabalhos realizados por Dale (1991) verificam uma
correlação direta entre a atividade ureática e inibidores de tripsina, indicando
que a utilização da atividade ureática, como medida indireta da inativação
destes fatores antinutricionais é bastante eficiente.
Os resultados da avaliação do índice de atividade de urease (Tabela
12) na farinha de soja submetida aos diferentes tratamentos térmicos
mostraram que o binômio 100 ºC/30 min apresentou o maior valor de
variação de pH e consequentemente de índice de urease, seguido dos
tratamentos 130 ºC/30 min e 150 ºC/10 min. Entretanto, estes valores de
índice de urease se encontraram fora da faixa considerada para inativação
da enzima que é de 0,05-0,2 (OLGUIN
et al., 2003). Os resultados indicaram
que a combinação tempo e temperatura mais eficaz para inativação da
urease foi 140 ºC/20 min, que apresentou uma variação de pH de 0,11.
Neste processo de inativação térmica dos fatores antinutricionais, o
calor aplicado não deve ser muito severo, o que pode implicar na redução da
digestibilidade, em razão de reações químicas que ocorrem com alguns
aminoácidos como, por exemplo,
a reação do grupo amino da lisina com
aldeídos
(LJOKJEL et al., 2000; WHITE et al., 2000; CAFÉ et al., 2000).
Parsons (1992) relata que o índice de urease não deve ser inferior a 0,05,
para assegurar que o farelo de soja não seja superaquecido. Em vista disso,
o tratamento térmico a 150 ºC/20 min foi excessivo o que pode prejudicar a
qualidade nutricional da farinha de soja.
Com o objetivo de reduzir ou eliminar os oligossacarídeos de rafinose
presentes nesta farinha de soja integral foi realizada a hidrólise desses
52
açúcares utilizando uma preparação enzimática de α-galactosidase da
levedura
D. hansenii. De acordo com os dados observados na Tabela 13, a
preparação enzimática apresentou atividade sobre os RO, o que tornou
possível seu uso para hidrólise desses açúcares e produção da farinha de
soja integral livre de RO. O conteúdo médio de rafinose e estaquiose na
farinha de soja integral utilizada era de 0,93 e 2,90 %, respectivamente.
Pode-se verificar pelos dados apresentados nesta tabela, que a
concentração de estaquiose decresceu com o tempo de incubação,
enquanto houve um aumento na concentração de rafinose até o tempo de
incubação de 8 h. Este acréscimo de rafinose provavelmente foi decorrente
do acúmulo desse açúcar no meio, o qual é formado a partir da hidrólise da
estaquiose, por clivagem da ligação α-1,6 e remoção de um resíduo de
galactose.
Foi verificada hidrólise total dos oligossacarídeos na suspensão de
farinha de soja integral após 20 h de incubação com a preparação
enzimática na concentração de 1,2 U/g de farinha. Viana
et al. (2006)
testando a capacidade de hidrólise dos RO no leite de soja, com α-
galactosidase extracelular purificada de
D. hansenii, verificou completa
redução no conteúdo desses açúcares após 4 h de incubação com 2,1 U/mL
de leite.
Após incubação por 6 h, a 40 ºC, da farinha de soja com α-
galactosidase parcialmente purificada de sementes de soja germinadas (5
U/g farinha), Viana
et al. (2005) observaram redução de 72,3 e 89,2 % nos
conteúdos de rafinose e estaquiose, respectivamente. Mulimani
et al. (1997),
utilizando extrato bruto de sementes de guar contendo α-galactosidase (12,8
U/g farinha), conseguiram obter uma hidrólise de 90,4 % da rafinose e 91,9
% da estaquiose na farinha de soja, após incubação por 4 h. Callegari
(2003), trabalhando com α-galactosidase semipurificada de soja var.
Monarca, observou redução dos teores de rafinose e estaquiose de 100 e 53
%, respectivamente, após 8 h de incubação da farinha de soja
desengordurada com α-galactosidase (16 U/g farinha), a 40 °C. Guimarães
et al. (2001) conseguiram reduzir os teores de rafinose e estaquiose em 67 e
53 %, respectivamente, após tratamento do leite de soja com α-
53
galactosidase purificada de sementes de soja em germinação por 12 h, a 30
ºC, utilizando 1,2 U/mL de leite de soja.
Comparando com os dados da literatura, neste trabalho foi necessário
um tempo maior para hidrólise total dos RO. Entretanto, a quantidade de
enzima utilizada foi menor em relação aos trabalhos citados. Provavelmente,
o uso de uma quantidade maior de enzima poderia reduzir a concentração
de oligossacarídeos mais rapidamente.
Como mostrado na Tabela 13 e Figura 4C, houve uma completa
redução do conteúdo de sacarose no tempo de 20 h de incubação da
enzima com a farinha de soja. Entretanto, o extrato enzimático utilizado para
hidrólise dos RO não apresentou atividade de invertase (dados não
mostrados). A redução da sacarose no tempo de 20 h de hidrólise poderia
ser explicada devido a possível atividade de transgalactosilação da α-
galactosidase. Muitas glicosidases exibem atividade de transglicosilação em
adição à atividade hidrolítica, dependendo da concentração de substratos e
produtos. Na transglicosilação, a parte glicosil do substrato é transferida para
compostos hidroxilados diferentes da água, que podem ser álcoois simples,
produtos de hidrólise, açúcares ou uma molécula que seja um segundo
substrato (DE REZENDE e GUIMARÃES, 2004). A atividade de
transgalactosilação foi primeiro observada em α-galactosidase de leveduras
que catalisavam a transferência de um resíduo de galactose de uma
molécula do dissacarídeo melibiose para uma segunda molécula de
melibiose como aceptora, formando o trissacarídeo maninotriose (DEY,
1972). Outros trabalhos também relataram atividade de transgalactosilação
de α-galactosidases de diferentes fontes como sementes de café (KOIZUMI
et al., 1995), da levedura Candida guilliermondii (HASHIMOTO et al., 1995),
dos fungos filamentosos
Aspergillus fumigatus (PUCHART e BIELY, 2005) e
Talaromyces flavus CCF 2686 (SIMERSKÁ et al., 2006). No caso da α-
galactosidase de
D. hansenii, com períodos de tempo maiores de hidrólise
dos RO na farinha de soja, provavelmente houve aumento considerável nas
concentrações de galactose e sacarose, o que poderia ter induzido a
atividade de transgalactosilação.
54
Após preparo das farinhas de soja desengordurada e integral com e
sem oligossacarídeos estas tiveram a composição química centesimal
determinada, assim como a concentração de RO presentes após os
tratamentos. Pelos dados das Tabelas 6 e 14 observou-se que os valores de
umidade encontrados foram um pouco menores que os relatados por Lima
(1999) e Monteiro
et al. (2003) (10 a 12 %) e que são encontrados para a
maioria das farinhas de soja. Esses valores, encontrados no presente
trabalho, podem ser devido ao fato de que após o tratamento enzimático, as
suspensões de farinha de soja foram liofilizadas para retirada da água e
preparo das dietas.
Para farinha de soja desengordurada sem oligossacarídeos (FS1) e
farinha de soja desengordurada com oligossacarídeos (FS2) os teores
reduzidos de lipídios caracterizam a farinha de soja desengordurada, que
apresenta também elevado teor de proteína. O aumento de 10 % no valor de
proteína da FS1 em relação a FS2 se deve ao fato de, no processo de
produção da farinha com ausência dos RO, ter sido adicionada à suspensão,
células de
Debaryomyces hansenii que possivelmente contribuíram com
nitrogênio protéico de sua composição.
Analisando as farinhas de soja integral sem e com oligossacarídeos,
FS3 e FS4, respectivamente, os valores mostrados na Tabela 14,
caracterizam uma farinha de soja integral e estão de acordo com os valores
médios encontrados por Lima (1999) para farinha de soja com teor de
proteína menor ou igual a 45 %.
De acordo com os resultados (Tabela 7), o conteúdo de rafinose e
estaquiose na farinha de soja desengordurada após o cultivo da levedura
(FS1) foi totalmente reduzido, enquanto que na farinha de soja
desengordurada não submetida ao tratamento acima (FS2) foi de 1,15 e
3,23 %, respectivamente. Por sua vez o conteúdo de rafinose e estaquiose
(Tabela 15) para a farinha de soja integral não submetida ao tratamento
enzimático (FS4), foi de 0,93 e 2,90 %, respectivamente, enquanto a
concentração destes açúcares foi completamente reduzida na farinha de
soja integral após tratamento com a preparação enzimática de α-
galactosidase de
D. hansenii (FS3).
55
Os oligossacarídeos encontrados em maior quantidade na soja, e em
seus produtos derivados são estaquiose e rafinose, nesta ordem, e
compreendem aproximadamente 4 - 6 % do peso seco da farinha de soja
(KARR-LILIENTHAL
et al., 2005). Parsons et al. (2000) encontraram uma
média de 0,58 % de rafinose e 3,23 % de estaquiose em farinhas de soja
convencionais que foram utilizadas para verificação do efeito desses
açúcares na dieta de frangos de corte. Grieshop
et al. (2003) verificaram
concentrações médias de 4,1 a 5,7 % de estaquiose e 0,98 a 1,4 % de
rafinose em farinhas de soja produzidas de diferentes variedades de soja.
Efeito do processamento enzimático no valor nutricional das farinhas
de soja
A ação antinutricional dos RO está relacionada com o fato desses
açúcares interferirem na digestão dos nutrientes por reduzir sua interação
com enzimas digestivas no intestino (SMITS e ANNISON, 1996), além de
promoverem a retenção de fluidos, acelerando o fluxo digestivo, afetando a
utilização e absorção de nutrientes (WIGGINS, 1984). A ingestão de
produtos de soja, contendo oligossacarídeos de rafinose, também resulta em
flatulência, náuseas, desconforto abdominal e diarréia (WAGNER
et al.,
1976). Assim, vários estudos têm mostrado que a ingestão de produtos de
soja livres ou com teores reduzidos desses açúcares solúveis traz efeitos
benéficos, reduzindo a viscosidade do bolo alimentar e melhorando a
digestão de nutrientes (COON
et al., 1990; LESKE et al., 1991; SMIRICKY et
al., 2002).
Este trabalho teve com objetivo a produção de farinhas de soja livres
ou com teores reduzidos de oligossacarídeos de rafinose, através do
tratamento enzimático com α-galactosidase de
Debaryomyces hansenii para
posterior avaliação nutricional dessas farinhas. Para isto verificou-se o efeito
da eliminação dos RO nos parâmetros de digestibilidade, ganho de peso,
consumo protéico, coeficiente de eficácia protéica (PER) e razão protéica
líquida (NPR).
De acordo com os resultados apresentados nas Tabelas 8 e 16,
verificou-se uma melhora significativa na digestibilidade verdadeira das
56
dietas contendo farinhas de soja tratadas enzimaticamente (D1 e D3) em
relação as suas correspondentes não tratadas (D2 e D4).
A digestibilidade é a medida da porcentagem das proteínas que são
hidrolisadas pelas enzimas digestivas e absorvidas pelo organismo na forma
de aminoácidos ou de qualquer outro composto nitrogenado, desde que não
haja nenhuma interferência na absorção destes pelo organismo animal ou
humano (SGARBIERI, 1987). Constitui o primeiro fator que afeta a eficiência
da utilização protéica da dieta. Quando certas ligações peptídicas não são
hidrolisadas no processo digestivo, parte da proteína é excretada nas fezes
ou metabolizada pelos microrganismos do intestino grosso (STIPANUK,
2000).
Os resultados mostraram que a redução do conteúdo de RO nas
farinhas de soja, após tratamento enzimático, promoveu uma melhora
significativa na digestibilidade das proteínas. Isto pode ser explicado com
base na observação de que, um decréscimo na concentração de
oligossacarídeos de rafinose pode reduzir, potencialmente, a viscosidade do
bolo alimentar, levando a um aumento no tempo de retenção desta e
aumentando dessa forma a ação das enzimas digestivas sobre os substratos
e conseqüentemente a absorção de nutrientes na mucosa intestinal
(GRAHAM
et al., 2002).
Smiricky
et al. (2002) avaliando os efeitos da presença dos RO, em
diferentes dietas de suínos contendo concentrados protéicos de soja, na
digestibilidade verdadeira, verificaram que a presença desses açúcares
promoveu uma redução significativa na digestibilidade das proteínas e de
todos os aminoácidos, exceto triptofano e prolina.
A adição de 3,50 % de oligossacarídeos de rafinose da soja à dieta
purificada de suínos, contendo caseína como fonte de proteína, levou a um
decréscimo de 5 % na digestibilidade de proteínas (SMIRICKY-TJARDES
et
al., 2003).
Zdunczyk
et al. (1998) relataram que a presença de oligossacarídeos
de rafinose encontrados em sementes de feijão promoveram uma redução
na digestibilidade protéica em ratos alimentados com dieta contendo esta
leguminosa. Sakaguchi
et al. (1998) verificaram que a digestibilidade
57
verdadeira das proteínas em ratos foi menor quando RO foram adicionados
à dieta de caseína.
Veldman
et al. (1993) estudaram o efeito da adição de 15 % de
melaço de soja contendo 18 % de oligossacarídeos na dieta de suínos, e
observaram uma redução de 25 % nos valores de digestibilidade das
proteínas na dieta com melaço, comparada à dieta controle. Estes autores
também relataram que a adição da enzima α-galactosidase melhora a
digestibilidade desses açúcares e das proteínas.
Segundo alguns autores a melhora na digestibilidade dos nutrientes
leva a um incremento nos valores de energia metabolizável da dieta e a uma
conseqüente melhora no desempenho dos animais. A adição de rafinose e
estaquiose nas dietas de frangos de corte, a base de soja, reduziu
significativamente os valores de energia metabolizável da dieta comparada
aos controles (GRAHAM
et al., 2002), enquanto que a remoção desses
açúcares da farinha de soja resultou em um aumento desta energia (COON
et al., 1990; LESKE et al., 1991; LESKE e COON, 1999). Parsons et al.
(2000) comparando o efeito de variedades de soja, com reduzidos teores de
RO e convencionais, observaram que os valores médios de energia
metabolizável foram 2.739 Kcal/Kg para farinha de soja convencional,
enquanto que para farinha de soja com baixos teores de RO essa foi 2.931
Kcal/Kg.
Portanto, a redução dos oligossacarídeos rafinose e estaquiose com o
uso α-galactosidase pode melhorar a digestibilidade, tanto pela redução da
viscosidade do bolo alimentar, quanto pela própria hidrólise desses açúcares
em monossacarídeos digeríveis.
Porém, alguns autores relataram que a presença dos RO nas dietas
ou a suplementação destas com a enzima α-galactosidase não promoveu
nenhum efeito nos valores de digestibilidade dos nutrientes. Gabert
et al.
(1995) verificaram que suínos alimentados com dietas a base de farinha de
soja com adição de RO não apresentaram nenhum efeito na digestibilidade
ileal das proteínas e da maioria dos aminoácidos mensurados. Os autores,
porém justificaram que os resultados encontrados podem ter sido devidos à
reduzida concentração dos RO presentes nas dietas experimentais. Irish
et
58
al. (1995) não observaram nenhum efeito na digestibilidade ileal das
proteínas quando, à dieta de frangos, foi adicionada a enzima α-
galactosidase. Neste caso os autores sugeriram que essas variações nos
resultados podem ter sido devido a diferenças nas fontes produtoras e na
atividade das enzimas utilizadas.
O efeito do processamento enzimático nos valores de ganho de peso,
coeficiente de eficácia protéica (PER) e razão protéica líquida (NPR) para as
dietas contendo farinha de soja são mostrados nas Tabelas 9, 10, 17 e 18.
Os resultados (Tabela 9) mostraram que os valores de ganho de peso foram
estatisticamente semelhantes para os animais alimentados com dieta
contendo farinha de soja desengordurada com e sem oligossacarídeos (D1 e
D2). Para as dietas contendo farinhas de soja integral (D3 e D4) a presença
dos RO também não promoveu diferença significativa, em nível de 5 % de
probabilidade (Tabela 17). Com base nesses resultados comprova-se
também a melhor qualidade nutricional da caseína em relação à proteína de
soja, pois a primeira promoveu maior ganho de peso durante os 14 dias de
experimento.
Em estudos realizados por Graham et al. (2002) foi observado
melhora nos valores de digestibilidade em frangos de corte alimentados com
dieta de farinha de soja tratada enzimaticamente com α-galactosidase
porém, a melhora no ganho de peso dos animais alimentados com esta dieta
com reduzidos teores de RO não foi significativa. Resultados semelhantes
foram encontrados nos trabalhos realizados por Igbasan
et al. (1997) e
Marsman
et al. (1997) que verificaram que a suplementação de dietas com a
enzima α-galactosidase não promoveu melhora nos parâmetros de ganho de
peso e crescimento em frangos de corte.
De acordo com os resultados apresentados (Tabela 10 e 18) observa-
se que a dieta de caseína apresentou valores de PER, PERR, NPR e NPRR
superiores e estatisticamente significativos (p≤0,05) aos encontrados para as
farinhas de soja utilizadas. Este fato demonstra que a qualidade protéica das
farinhas de soja é inferior à caseína para promover crescimento e
manutenção do peso de ratos. Porém não houve variação significativa para
esses valores entre as dietas formuladas com farinha de soja
59
desengordurada (D1 e D2) e entre as dietas contendo farinha de soja
integral (D3 e D4) o que indica que a presença ou não dos oligossacarídeos
de rafinose nas dietas, contendo farinha de soja, estudadas não
influenciaram na qualidade da proteína no que se refere a esses parâmetros
citados.
Resultados semelhantes ao presente trabalho foram encontrados por
Zdunczyk
et al. (1998) que, ao avaliarem o efeito da presença dos RO na
dieta, relataram um decréscimo nos valores de digestibilidade desta em
relação à dieta sem esses açúcares, mas os valores de PER para as duas
não diferiram estatisticamente.
O aumento da digestibilidade pode levar a um aumento da quantidade
de nutrientes protéicos disponíveis para serem utilizados, e dessa forma
promover maior crescimento do animal (GRAHAM
et al., 2002). Porém além
da digestibilidade deve-se levar em conta outros fatores que influem no valor
nutricional das proteínas, como a sua composição e a biodisponibilidade de
aminoácidos (SGARBIERI, 1996). A biodisponibilidade de aminoácidos de
uma proteína é a medida dos aminoácidos absorvidos que serão utilizados
na síntese protéica (MONTEIRO
et al., 2003). Desta forma, a melhoria da
capacidade de digestão não implica necessariamente no aumento da
qualidade protéica, pois os aminoácidos podem estar sendo bem absorvidos,
e não estar participando da síntese protéica em virtude da deficiência de
alguns aminoácidos essenciais (PEREIRA e COSTA, 2002).
Neste sentido, a composição das farinhas de soja integral, do
presente trabalho, diferiu apenas na presença ou não dos oligossacarídeos
de rafinose, ou seja, a composição de aminoácidos era a mesma. Isto pode
ter levado a um comportamento semelhante das dietas (D3 e D4) nos
parâmetros de ganho de peso, PER e NPR que pode ter sido devido à
composição aminoacídica da proteína de soja que de uma forma geral é
deficiente em aminoácidos sulfurados. Este fato, aliado a maior necessidade
destes aminoácidos em ratos, pode subestimar a qualidade protéica desta
leguminosa em promover crescimento animal.
As dietas D1 e D2 também não apresentaram diferença
estatisticamente significativa (p>0,05) nos valores de ganho de peso, PER e
NPR, sugerindo que a adição de células de levedura não melhorou a
60
composição aminoacídica da farinha utilizada na dieta D1. Portanto, nesse
caso, a melhora da digestibilidade das proteínas verificada na dieta contendo
farinha de soja desengordurada tratada, não promoveu melhora no
desempenho animal, provavelmente devido a sua composição aminoacídica.
Oligossacarídeos de rafinose são considerados carboidratos
indigeríveis devido a sua resistência a digestão no intestino delgado
(SAKAGUCHI
et al., 1998). Isto se deve à ausência da enzima α-
galactosidase na mucosa intestinal de humanos e animais monogástricos,
que faz com que esses açúcares sejam conduzidos intactos à parte posterior
do intestino, onde são fermentados por bactérias anaeróbias. Um dos
principais produtos dessa fermentação são os ácidos graxos de cadeia curta
que são absorvidos e utilizados como fonte de energia pelas células
epiteliais do intestino grosso (HENNING e HIRD, 1972; ROEDIGER, 1980).
Observando os dados apresentados nas Tabelas 11 e 19, a produção
de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) não diferiu estatisticamente para
os animais alimentados com dieta contendo farinha de soja desengordurada
sem e com oligossacarídeos de rafinose (D1 e D2). Resultados semelhantes
foram encontrados entre os tratamentos contendo farinha de soja integral
(D3 e D4).
Henninsson
et al. (2001) investigaram a produção e a distribuição dos
ácidos graxos de cadeia curta no intestino de ratos submetidos à dieta à
base farinha de feijão. Estes autores verificaram que, dietas contendo
farinha de feijão com reduzida concentração de RO, não promoveram
diferença na produção de ácidos graxos de cadeia curta, em relação às
dietas contendo altos teores desses açúcares.
Outros autores encontraram diferenças na produção de ácidos
graxos de cadeia curta entre animais alimentados com dietas com e sem
RO. Sakaguchi
et al. (1998) verificaram maior produção de ácidos propiônico
e butírico no ceco de ratos, quando foi adicionado RO na dieta de caseína.
Smiricky-Tjardes
et al. (2003) encontraram resultados semelhantes quando
porcos foram alimentados com dieta à base de farinha de soja. Porém esses
mesmos autores relataram que a fermentação dos oligossacarídeos é mais
lenta quando estes estavam na matriz da leguminosa, do que quando foram
adicionadas à dieta na forma purificada. Além disso, verificaram também que
61
a produção de gás e ácidos graxos de cadeia curta foi maior quando
proveniente da fermentação do açúcar rafinose. Segundo os autores, a
presença de uma molécula de galactose a mais, em ligação α-1,6, no açúcar
estaquiose faz com que a quebra e consequentemente a fermentação seja
mais lenta, gerando menor concentração dos produtos dessa fermentação.
Isto pode ser um dos motivos que justificam o fato de no presente
trabalho a produção de AGCC pelos animais ingerindo dieta com
oligossacarídeos não ter sido alta em relação à dieta sem oligossacarídeos.
Uma vez que o teor de estaquiose das farinhas com RO era quase duas
vezes maior que o teor de rafinose, pode ter havido uma fermentação mais
lenta e a uma produção menor de AGCC durante o experimento. Levrat
et al.
(1991) observaram que em ratos alimentados com dieta à base de soja, a
produção máxima de AGCC ocorreu após 16 dias de experimento, o que
também pode ter influenciado os resultados encontrados neste trabalho que
teve a duração de 14 dias. Provavelmente com um tempo maior de
experimento seria possível verificar diferença na produção de ácidos graxos
de cadeia curta pelos animais alimentados com as dietas contendo farinha
de soja com e sem RO.
Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que o uso
de farinhas de soja livres de oligossacarídeos de rafinose, seja pelo
tratamento com uma preparação enzimática contendo α-galactosidase ou
com células de
Debaryomyces hansenii, promoveu uma melhora nos valores
de digestibilidade protéica. Isto indica que a remoção dos RO em produtos
de soja pode melhorar o valor nutricional por aumentar a absorção dos
nutrientes, uma vez que não exista nenhum outro fator que interfira com a
utilização destes nutrientes absorvidos no organismo.
62
6. CONCLUSÕES
• Leveduras
Debaryomyces hansenii viáveis foram capazes de
hidrolizar os oligossacarídeos de rafinose (RO) presentes na
suspensão de farinha de soja desengordurada, demonstrando seu
potencial na eliminação desses açúcares e produção de farinha de
soja desengordurada livre de RO.
• A atividade de α-galactosidase extracelular aumentou com o tempo
de incubação da levedura na farinha de soja desengordurada,
enquanto o conteúdo dos RO foi reduzido, sendo a redução total
desses açúcares observada com 36 h, nas condições do experimento.
• Os RO presentes na suspensão de farinha de soja integral, tratada
por 20 h com a preparação enzimática de α-galactosidase de
D.
hansenii na concentração de 1,2 U/g de farinha, foram totalmente
hidrolisados, demonstrando que esta enzima pode ser usada para
produção de farinha de soja integral livre de RO.
• Em ensaios biológicos com ratos alimentados por 14 dias com dietas
contendo farinhas de soja com e sem RO, foi demonstrado que houve
melhora significativa na digestibilidade verdadeira das dietas
contendo farinhas de soja sem RO em relação as farinhas com RO.
• A maior digestibilidade não promoveu melhora significativa nos
valores de ganho de peso, coeficiente de eficácia protéica (PER) e
razão protéica líquida (NPR), durante o período do experimento.
63
• A presença ou não de RO na dieta, nas concentrações estudadas,
não alterou significativamente a produção de ácidos graxos de cadeia
curta no conteúdo cecal dos ratos, durante o período do experimento.
64
7. REFERÊNCIAS
ADEMARK, P., LARSSON, M., TJERNELD, F., STALBRAND, H. Multiple
α-galactosidases from
Aspergillus niger : purification,
characterization
and substrate specificities.
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