( PDF ) Estresse osmótico e do retículo endoplasmático induzem morte celular programada de maneira dependente das proteínas NRPs

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MAXIMILLER DAL-BIANCO LAMAS COSTA

ESTRESSE OSMÓTICO E DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

INDUZEM MORTE CELULAR PROGRAMADA DE MANEIRA

DEPENDENTE DAS PROTEÍNAS NRPs

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa, como

parte das exigências do Programa de

Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola,

para obtenção do título de Magister

Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS - BRASIL

2007

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MAXIMILLER DAL-BIANCO LAMAS COSTA

ESTRESSE OSMÓTICO E DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

INDUZEM MORTE CELULAR PROGRAMADA DE MANEIRA

DEPENDENTE DAS PROTEÍNAS NRPs

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa, como

parte das exigências do Programa de

Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola,

para obtenção do título de Magister

Scientiae.

APROVADA: 31 de julho de 2007.

_______________________________ ______________________________

Prof. Luciano Gomes Fietto Prof. Marcelo Ehlers Loureiro

(Co-Orientador) (Co-Orientador)

_______________________________ _______________________________

Prof.ª Juliana Lopes Rangel Fietto Claudine Márcia Carvalho

_________________________________

Prof.ª Elizabeth Pacheco Batista Fontes

(Orientadora)

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Aos meus avós José da Costa e Maria da Conceição Costa

DEDICO

iii

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, gostaria de agradecer a Deus, pois se não fosse

ele me guiando por toda a minha vida, talvez não estivesse hoje onde

estou. Agradeço também aos meus pais e familiares pelo grande apoio

durante toda a minha jornada, e principalmente pelo amor e excelente

convivência familiar.

À Universidade Federal de Viçosa, pela oportunidade de realização

de uma Pós-Graduação gratuita e de excelente qualidade e a

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pelo apoio financeiro.

À Professora Elizabeth Pacheco Batista Fontes pela confiança e

principalmente pela orientação durante todo o período de

desenvolvimento da dissertação.

Ao Departamento de Bioquímica, professores e funcionários pela

boa convivência e ensinamentos. Aos meus co-orientadores Marcelo

Ehlers Loureiro (DBV) e Luciano Gomes Fietto (DBB) pela discussão e

ajuda nos experimentos. Este último tenho um agradecimento especial

por ter sido mais que um co-orientador, mas um grande amigo.

Não poderia esquecer de citar minha namorada Giselle pelo apoio

e compreensão durante todo este tempo.

Os colegas do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas e

Laboratório de Proteômica pela excelente convivência e ajuda durante os

trabalhos, em especial aos amigos mais próximos nestes últimos meses:

Rejane, Carol, João Paulo, Gustavo e Pedro Augusto. Este último, aliás,

foi mais que um amigo, mas um parceiro de trabalho e exemplo de força

de vontade na ajuda e condução dos experimentos.

Aos amigos da minha cidade, Marcelo Henrique e Júnior, que

mesmo distante sempre estiveram por perto.

Aos amigos de república, com quem convivi por estes seis anos e

meio em Viçosa.

Aos amigos da Bioquímica Agrícola, da Bioquímica 2001, e os

amigos de Viçosa.

Aos funcionários da estufa de soja e ao Newton, pela ajuda.

A todos os funcionários do BIOAGRO que indiretamente

contribuem para o bom funcionamento do setor.

E a todos que não tenha citado, mas que de alguma forma

contribuíram com este trabalho.

SUMÁRIO

RESUMO............................................................................................... viii

ABSTRACT........................................................................................... xi

INTRODUÇÃO...................................................................................... 1

REVISÃO DE LITERATURA................................................................. 6

O Retículo Endoplasmático e a proteína BiP........................................ 6

A via de resposta a proteínas mal dobradas no retículo

endoplasmático (UPR)..........................................................................

Sinalização da UPR em mamíferos e leveduras................................... 8

A via UPR em plantas........................................................................... 10

Morte Celular Programada em plantas (PCD)....................................... 12

Estresse no RE e Morte Celular Programada em plantas (PCD).......... 14

Estresse Osmótico................................................................................ 14

Proteínas ricas em asparagina contendo domínio DCD (N-Rich

Protein)..................................................................................................

Proteínas contendo domínio NAC......................................................... 18

CAPÍTULO 1

UM NOVO RAMO DE SINALIZAÇÃO DO ESTRESSE NO

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO INTEGRA COM O SINAL

OSMÓTICO ATRAVÉS DE UMA RESPOSTA APOPTÓTICA

DEPENDENTE DA PROTEÍNA NRP....................................................

INTRODUÇÃO...................................................................................... 21

MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................... 26

Células de soja em suspensão e Tratamentos..................................... 26

Extração de RNA e síntese de cDNA.................................................... 26

PCR em tempo real............................................................................... 27

Clonagem molecular do cDNA completo do gene N-rich...................... 27

Expressão transiente em protoplastos de soja...................................... 31

Ensaio de Caspase-3............................................................................ 32

Agroinoculação em folhas de tabaco.................................................... 33

Localização celular de NRP-B (N-rich).................................................. 33

Técnicas de Biologia Molecular............................................................. 34

Análises de Bioinformática.................................................................... 34

RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................. 35

Clonagem do cDNA completo de N-rich1, designado NRP-B, e

análises de bioinformática.....................................................................

Regulação dos genes NRP-A e NRP-B por indutores da UPR ocorre

via um novo ramo de sinalização de estresses no retículo

endoplasmático.....................................................................................

NAM, NRP-B e NRP-A são genes precocemente induzidos por

indutores de morte celular e reprimidos por inibidores de

senescência...........................................................................................

Expressão transiente de NRich induz morte celular em protoplastos

de soja...................................................................................................

O gene NRP-A também é co-regulado pelos estresses osmótico e do

retículo e assim como NRP-B induz morte celular em protoplastos de

soja........................................................................................................

Expressão transiente dos genes NRP-A e NRP-B em folhas de

tabaco induzem senescência................................................................

A proteína NRich está localizada na membrana plasmática................. 60

CONCLUSÕES..................................................................................... 62

CAPÍTULO 2.

vii

SUPEREXPRESSÃO DO CHAPERONE MOLECULAR BiP ATENUA

PROCESSOS DE MORTE CELULAR..................................................

INTRODUÇÃO...................................................................................... 65

MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................... 68

Material Vegetal e Tratamentos............................................................ 68

Extração de RNA e síntese de cDNA.................................................... 68

Fragmentação de DNA genômico......................................................... 69

Monitoração de morte celular por Azul de Evans.................................. 69

Detecção in-vivo de H

2.........................................................................................................

Malondialdeído (MDA)........................................................................... 70

Agroinoculação em folhas de tabaco.................................................... 70

RESULTADO E DISCUSSÃO............................................................... 72

Expressão ectópica de BiP em plantas transgênicas atenua o

processo de morte celular induzida por estresses no RE e

osmótico...............................................................................................

Plantas transgênicas submetidas ao tratamento com tunicamicina

produzem maior quantidade de espécies reativas de oxigênio

(ROS)....................................................................................................

BiP não afeta o nível de peroxidação de lipídeos resultante de

acúmulo excessivo de ROS..................................................................

Superexpressão de BiP atenua os processos de morte celular

induzidos pelas proteínas NRP-A e NRP-B em plantas de tabaco.....

CONCLUSÕES..................................................................................... 83

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 84

viii

RESUMO

COSTA, Maximiller Dal-Bianco Lamas, M.Sc., Universidade Federal de

Viçosa, julho de 2007. Estresse osmótico e do retículo

endoplasmático induzem morte celular programada de maneira

dependente das proteínas NRPs. Orientadora: Elizabeth Pacheco

Batista Fontes. Co-orientadores: Luciano Gomes Fietto, Marcelo

Ehlers Loureiro e Luis Orlando de Oliveira

A identificação de vias de sinalização de resposta em células afetadas

por diferentes estresses, bem como das interações entres estas vias,

constitui um dos interesses majoritários de pesquisas na área de

interações das células vegetais com o meio ambiente. Recentemente,

uma nova via de integração entre os estresses do retículo e osmótico foi

descrita pelo nosso grupo, sendo que dois dos genes que exibiram as

mais fortes induções sinergísticas pela combinação dos estresses, N-rich1

e N-rich2, codificam proteínas similares à proteína NRP, aqui designada

NRP-A, que está especificamente associada ao evento de morte celular

programada. Nesta investigação, foi demonstrado que as ESTs de N-rich1

e N-rich2 correspondiam a um mesmo gene homólogo a NRP-A, sendo

denominados NRP-B. Utilizando plantas transgênicas defeituosas na

ativação da via de resposta a proteínas mal dobrados no RE (via UPR), foi

demonstrado que a ativação dos genes alvos NAM, NRP-A e NRP-B é

sinalizada por estresses no RE por meio de uma via distinta da UPR.

Assim também, a expressão dos três genes não é alterada pelo hormônio

ABA, indicando que a indução destes pelo estresse osmótico é

independente de ABA. Consistente com o envolvimento em morte celular,

os três genes são induzidos por indutores de morte celular e reprimidos

por inibidores de senescência. Além disso, a expressão transiente de

NRP-A e NRP-B promoveu ativação de caspase-3-like em protoplastos de

soja e acelerou o processo de senescência em folhas de tabaco,

evidenciando a participação dessas proteínas em processos de morte

celular. Foi demonstrado que a proteína NRP-B localiza-se possivelmente

na membrana plasmática e sua expressão é capaz de promover ativação

transcricional de NAM e NRP-A, estando possivelmente ancorada a

complexos sistemas de sinalização. Coletivamente estes resultados

descrevem um novo ramo de sinalização do estresse no retículo

endoplasmático que integra com o sinal osmótico através de uma

resposta apoptótica dependente das proteínas NRPs. Como estratégia

para tolerância engenheirada a estresses em plantas, foi demonstrado

que a superexpressão do chaperone molecular BiP confere resistência a

estresses abióticos em plântulas de soja, além de prevenir morte celular.

Expressão ectópica de BiP em plantas transgênicas de soja diminuiu as

lesões foliares necróticas induzidas por tunicamicina, e manteve o turgor

foliar em condições de desidratação induzida por PEG, apresentando,

nestas condições, um teor relativo de células mortas inferior às plantas

não transformadas. O envolvimento de BiP na prevenção de morte celular

foi adicionalmente demonstrado por agroinoculação de NRP-A e NRP-B

em folhas de tabaco transformadas com o gene soyBiPD nas orientações

senso e anti-senso, onde foi observado uma atenuação na senescência

na planta senso e o efeito inverso na planta anti-senso. Experimentos

adicionais deverão ser conduzidos para evidenciar os mecanismos pelos

quais BIP atua em processos de morte celular

ABSTRACT

COSTA, Maximiller Dal-Bianco Lamas, M.Sc., Universidade Federal de

Viçosa, July of 2007. Osmotic- and ER-stress induce NRPs-

dependent programed cell death. Adviser: Elizabeth Pacheco

Batista Fontes. Co-Advisers: Luciano Gomes Fietto, Marcelo Ehlers

Loureiro and Luis Orlando de Oliveira

The identification of cell signaling pathways in response to different

stresses and the interactions among these pathways have become major

focus for understanding the molecular bases of plant cell-environment

interactions. Recently, a novel integrative pathway between ER- and

osmotic-stress has been described by our group. Among the target genes

of the integrative pathway, N-rich1 and N-rich2 genes, which exhibit the

strongest synergistic induction by the combination of both stresses, are

homolog of NRP, here designated NRP-A, that has been shown to be

specifically associated with programmed cell death. In this investigation,

we demonstrated that the N-rich1 and N-rich2 ESTs correspond to the

same NRP-A homolog gene, and hence designated NRP-B. Using

transgenic plants defective for the unfolded protein response (UPR)

activation, we demonstrated that activation of the integrative target genes,

NAM, NRP-A and NRP-B, occurs via an ER-stress signaling pathway

distinct from the UPR. Likewise, the expression of the three genes is not

altered by ABA treatment, indicating that their osmotic induction is ABA-

independent. Consistent with an involvement in cell death programs, all

xii

three genes are up-regulated by cell death inducers and repressed by

senescence inhibitors. Furthermore, the transient expression of NRP-A

and NRP-B promoted caspase-3-like activation in soybean protoplasts and

accelerated senescence in tobacco leaves. These results revealed the

involvement of these proteins in cell death programs. We also

demonstrated that NRP-B is located to the plasma membrane, most likely

associated to signaling systems, and is capable to promote NAM and

NRP-A up-regulation when expressed in soybean protoplasts. Collectively,

these results describe a novel branch of the ER stress signaling that

integrates with the osmotic signal through a NRP-dependent apoptotic

response. As a strategy for engineering stress tolerance in plants, we

demonstrated that enhanced accumulation of the molecular chaperone

BiP confers abiotic stress tolerance in soybean seedlings in addition to

preventing cell death. Ectopic expression of BiP in transgenic soybean

plants decreased tunicamycin-induced leaf necrosis and kept leaf turgor

under PEG-induced dehydration conditions, resulting in dead cell content

lower than that in untransformed plants. The BiP involvement in preventing

cell death was further demonstrated by transient expression of NRP-A and

NRP-B in sense and antisense BiP- overexpressing tobacco leaves. While

in sense leaves senescence was clearly delayed, in antisense leaves the

NRP-induced senescence was accelerated as compared to wilt-type

leaves. Further experiments are necessary to elucidate the mechanisms

by which BiP prevents cell death in plants.

INTRODUÇÃO

A soja é uma cultura agronômica muito relevante para o cenário

agrícola nacional, sendo um dos principais produtos agrícolas produzidos

pelo Brasil pesando de modo relevante em sua balança comercial. O

crescente interesse por essa cultura é devido ao alto teor de proteínas e

óleos de suas sementes, sendo uma das melhores fontes protéicas de

origem vegetal, deficiente somente em aminoácidos sulfurados como

metionina e cisteína

A importância econômica e nutricional da soja a coloca em local

privilegiado entre as espécies passíveis de melhoramento, esperando-se

produzir novos cultivares com qualidade superior. As estratégias

moleculares modernas de melhoramento incluem a alteração racional da

expressão de conjuntos de genes que conferem maior produtividade e

qualidade, assim como maior tolerância a estresses bióticos e abióticos.

Para alcançar esse objetivo, os melhoristas utilizam complexos

sistemas de cruzamentos e retro-cruzamentos quando os genes de

interesse localizam-se na mesma espécie. Porém, quando os genes de

interesse encontram-se fora do pool gênico primário da espécie, ou

deseja-se manipular a expressão de algum gene endógeno da planta, a

engenharia genética oferece as ferramentas básicas para identificar,

selecionar, isolar e transferir genes específicos escolhidos dentro de um

vasto pool gênico, para um amplo espectro de seres vivos (Binsfeld,

2000). Consequentemente, a dificuldade concentra-se, no caso do

melhoramento clássico, na identificação e transferência de genes de

espécies com o fenótipo desejado para variedades cultivadas, e no caso

da engenharia genética, em identificar e caracterizar genes alvos para a

transformação de plantas.

Seca e salinidade são considerados um dos principais fatores de

restrição à agricultura brasileira, limitando o crescimento da planta,

produtividade e distribuição geográfica. Diferentes métodos para

aumentar a tolerância a estresses em plantas têm sido desenvolvidos,

como a manipulação e a reprogramação da expressão de genes

endógenos relacionados com estresse (Mahajan and Tuteja, 2005). Em

geral, são utilizados fatores de transcrição e outros genes regulatórios

como alvo, uma vez que dessa forma pode-se controlar a expressão de

vários genes envolvidos na resposta a um determinado estresse (Jaglo-

Ottosen et al., 1998; Kasuga et al., 1999; Hsieh et al., 2002; Hu et al.,

2006). Entretanto, também tem sido descrito a mudança da expressão de

apenas um gene (Bartels, 2001; Zhu, 2001). Neste caso, alvos efetivos

para serem engenheirados incluem genes envolvidos diretamente em

proteção celular (Zhu, 2001; Kumar et al., 2004). Esta classe inclui os

genes cujos produtos atuam funcionalmente em vias de desintoxicação de

produtos gerados em condições de estresses, tais como os genes

relacionados com o sistema antioxidativo, ou em vias de reparo de

proteínas e estruturas celulares, como genes que codificam chaperones

moleculares (Gupta et al., 1993; Badawi et al., 2004, Rodrigues et al.,

2006). Os chaperones moleculares são induzidos por uma variedade de

estresses fisiológicos, e são definidos como proteínas que facilitam o

correto dobramento das proteínas in vivo, sendo requeridos para uma

ampla gama de processos, incluindo dobramento, oligomerização, e

remoção proteolítica (Pelham, 1989; Hammond & Helenius, 1995).

Qualquer condição de estresse, que quebra a homeostasia do RE

e promove o acúmulo de proteínas mal dobradas na organela, ativa uma

cascata de sinalização que tem sido bem estudada em leveduras e

mamíferos, denominada via de resposta a proteínas mal-dobradas

(Unfolded Protein Response – UPR). Entretanto muito pouco se sabe a

respeito dos componentes da sinalização do estresse no RE em plantas.

Por outro lado, estudos do padrão de expressão gênica em resposta a

diversos outros estresses abióticos em diferentes plantas revelaram uma

possível comunicação entre a via de resposta a estes estresses devido à

expressão em comum de alguns genes (Kreps et al., 2002; Seki et al.,

2002; Denekamp & Smeekens, 2003; Houde et al., 2006).

No intuito de investigar a comunicação entre a via UPR e vias

responsivas a estresse osmótico, e elucidar o potencial do chaperone

molecular BiP em manter o turgor da folha sob déficit hídrico (Bertolotti et

al., 2000; Alvim et al., 2001; Valente, 2006) e em regular a UPR em

plantas, recentemente foi identificado pelo nosso grupo, genes co-

regulados por estes estresses (Irsigler et al. 2007). Os resultados

sugerem a ativação de uma via inédita de sinalização que parece integrar

as duas respostas de defesa da planta, potencializando os mecanismos

de defesa a diversas condições de estresses (Figura 1). Dentro desse

contexto, torna-se importante determinar se a ativação da via de

integração leva à ativação de proteínas de defesa envolvida em respostas

a outros estresses abióticos e bióticos. Estes conhecimentos serão

fundamentais para a definição de estratégias moleculares que possam

efetivamente conferir às plantas cultivadas vantagens fisiológicas que as

permitem superar condições adversas.

O presente trabalho teve como objetivo primordial caracterizar

molecular e funcionalmente os genes co-regulados pelo estresse no RE e

estresse osmótico, em especial aqueles que codificam proteínas ricas em

Asparagina (N-Rich), como alvos moleculares para aquisição de

resistência engenheirada em plantas de soja. Além disso, foi proposto

avaliar o efeito de BiP, inibidor da ativação da via de sinalização em

resposta a proteínas mal dobradas, no controle de morte celular gerada

por estresses abióticos.

Figura 1 - Integração entre as vias de sinalização induzidas em resposta ao

estresse osmótico e ao estresse do retículo endoplasmático (RE). Estresse

originado no RE por acúmulo de proteínas mal dobradas ativa uma via de sinalização

que integra ao sinal osmótico de uma maneira convergente no nível de ativação dos

genes ATAF2, NAM, GST, NRich1 e NRich2. No modelo, é destacado a via UPR, ativada

por um receptor transmembrana do RE que é regulado por concentrações de BiP no RE

e resulta na ativação dos genes que codificam chaperones moleculares tais como:

calreticulina, BiP e calnexina. Em destaque, também, as vias de resposta à seca

dependente do hormônio ABA ou mediada por DREB.

REVISÃO DE LITERATURA

O Retículo Endoplasmático e a proteína BiP

O retículo endoplasmático é o primeiro compartimento da via

secretora de eucariotos, sendo responsável pela síntese e modificação de

proteínas. Imediatamente após a entrada nessa organela, os

polipeptídeos nascentes podem sofrer uma série de processamentos pós-

traducionais. Estes incluem adição covalente de carboidratos e clivagem

por enzimas proteolíticas, enovelamento nas estruturas secundárias e

terciárias apropriadas, as quais podem ser estabilizadas por ligações

dissulfídicas e, em alguns casos, aquisições de estruturas quaternárias

em complexos multiméricos (Yanjun et al., 2003). O retículo

endoplasmático também possui um mecanismo de controle de qualidade

que discrimina proteínas corretamente das incorretamente enoveladas.

Este mecanismo assegura que somente proteínas corretamente

enoveladas e montadas prossigam para seu destino final (Oda et al.,

2003; Sitia & Braakman, 2003). Esses processos são auxiliados e

monitorados por chaperones do retículo endoplasmático, dentre os quais

BiP exerce uma função de destaque.

BiP é uma proteína de 78 kDa, pertencente à família dos

chaperones Hsp70, (Haas & Meo, 1988) sendo um dos chaperones mais

bem caracterizados do retículo endoplasmático (Denecke, 1996). A

proteína BiP possui dois domínios importantes: um amino-terminal que

contém um sítio catalítico e um carboxi-terminal de ligação ao substrato

(McKAY, 1993) que interage com seus substratos de maneira dependente

de ATP (Knarr et al., 2002). BiP é uma proteína multifuncional, envolvida

na regulação de diversos processos celulares associados ao retículo

endoplasmático (Pilon & Schekman 1999), tais como: (1) enovelamento

de cadeias polipeptídicas nascentes, (2) translocação dessas cadeias

polipeptídicas para o lúmen do retículo endoplasmático, (3) sistema ERAD

(degradação de proteína associada ao retículo endoplasmático), além de

(4) funcionar como um vedante do translocon durante os estágios iniciais

de translocação protéica e (5) como sensor da via UPR, que controla a

transcrição de genes de respostas ao estresse na organela para garantir

a sobrevivência celular (Liu & Kaufman, 2003).

A via de resposta a proteínas mal dobradas no retículo

endoplasmático (UPR)

O acúmulo de proteínas mal dobradas é a principal causa de

estresse no RE, e pode ser resultado do rápido influxo de polipeptídios

mal-dobrados nascentes, excedendo a capacidade de dobramento, ou

quando se tem um impedimento para o correto dobramento das proteínas,

como a prevenção de modificações pós-traducionais, o desequilíbrio de

cálcio ou o erro na estrutura primária da proteína (Ron & Walter, 2007).

Estas perturbações podem afetar e acionar a UPR, que é uma via de

transdução de sinal que ativa a transcrição coordenada de um conjunto

de genes envolvidos no restabelecimento da homeostasia no RE, tanto

pelo aumento da capacidade de dobramento das proteínas como pelo

decréscimo da demanda destes dobramentos.

Para aumentar a capacidade de dobramento, a síntese de

chaperones residentes no RE é aumentada (Kozutsumi et al., 1988). Por

outro lado, a demanda de dobramento diminui pela (1) diminuição global

da síntese de proteínas, (2) diminuição da transcrição de genes

codificando proteínas secretórias, (3) degradação de mRNAs específicos

(Hollien & Weissman, 2006) e (4) grande liberação de proteínas mal- e

não-dobradas através da degradação associada ao RE (ERAD) (Travers

et al., 2000).

Sinalização da UPR em mamíferos e leveduras

Três principais proteínas transmembranas, IRE1, ATF6 e PERK

são sinalizadores conhecidos da resposta ao estresse no RE e regulam

uma larga faixa de genes. IRE1 tem domínios quinase e de endo-

ribonuclease (Cox et al., 1993; Mori et al., 1993), e quando ativado

promove processamento e maturação do mRNA que codifica o fator de

transcrição b-ZIP Hac1p de leveduras (Cox & Walter, 1996), homólogo a

XBP-1 de mamíferos (Calfon et al., 2002). Este fator de transcrição regula

expressão de chaperones moleculares, genes relacionados ao ERAD e

uma gama de proteínas secretórias. Em células de mamíferos, o fator de

transcrição ATF6, uma proteína transmembrana do RE, sob condição de

estresse migra para o aparato de Golgi onde seu domínio de

transativação é liberado da membrana por clivagem proteolítica, migrando

então para o núcleo para regular a trancrição de vários genes (Haze et al.,

1999; Chen et al., 2002). PERK, outra proteína transmembrana, é uma

quinase que quando ativada, atenua a tradução de proteínas pela

fosforilação do fator de iniciação da tradução 2 (eIF2α) (Harding et al.,

2000; Holci & Sonenberg, 2005).

Acredita-se que o nível e estado dos chaperones moleculares são

os principais fatores que possibilitam a sensibilidade do estresse no RE. A

capacidade de BiP em Interagir com IRE1 ou PERK (Liu et al., 2002), e a

sua propriedade de ligar a proteínas mal dobradas, sugerem um possível

mecanismo para BiP desempenhar o papel de sensor do estresse no RE.

Segundo este modelo, BiP estaria ligado em condições normais nos

domínios luminais de IRE1, PERK e ATF6, mantendo-os desativados.

Após acúmulo de proteínas mal-dobradas, BiP seria liberado, permitindo a

oligomerização/dimerização e trans-autofosforilação de IRE1 e PERK e

assim sua ativação. A liberação de ATF6 permitiria seu transporte para o

Golgi onde seria clivado gerando um domínio citossólico de ATF6 que

migraria para o núcleo ativando a transcrição de vários genes (Zhang &

Kaufman, 2004). Este modelo é suportado pelo fato de que a

superexpressão de BiP atenua a ativação de PERK e IRE1, reprimindo

assim a UPR, ocorrendo o oposto quando se tem uma repressão de BiP

(Bertolotti et al., 2000; Okamura et al., 2000)

Um modelo alternativo para percepção do estresse no RE propõe

que a ligação de proteínas mal dobradas a IRE1 e PERK ativaria a UPR

de maneira independente de BiP. Esta hipótese tem sido considerada

baseada na observação de que IRE1 de leveduras é capaz de se ligar a

uma cadeia polipeptídica, e também, devido ao fato de que a ativação de

IRE1 nem sempre depende de BiP. Um terceiro modelo, que é

intermediário, postula que a ativação seria devido à liberação de BiP dos

receptores transmembranas, bem como à ligação de proteínas mal

dobradas aos receptores (Ron & Walter, 2007).

A via UPR em plantas

O Retículo Endoplasmático de plantas é diferente do RE de

animais, sendo contínuo ao longo da planta inteira por via das cadeias de

plasmodesmas que permitem comunicação célula-a-célula (Ghoshroy,

1997). Certos sinais de tensão, como um ataque por um patógeno, são

transmitidos ao longo da planta, ocasionando uma indução sistemática de

genes específicos por esta continuidade do RE. Porém, a UPR é

restringida às células onde a tensão foi iniciada não induzindo uma

resposta sistêmica na planta (Jelitto-Van Dooren 1999).

Análises recentes do transcriptoma de A. thaliana induzido por

estresse no RE evidenciaram a indução de genes envolvidos em

diferentes processos como o dobramento de proteínas,

glicosilação/modificação, translocação, degradação de proteínas,

tradução, tráfego de vesículas, morte celular programada, quinases,

fatores de transcrição, proteínas de estresse e proteínas não

classificadas, sendo que muitas são ortólogas a proteínas da UPR de

mamíferos e leveduras (Urade, 2007). Além disto, já foi descrito um cis-

elemento de 24 pb em soja similar a ERSE e ERSE-II de mamíferos que

flanqueiam a região 5’ dos genes induzidos pela UPR (Buzeli et al, 2002),

e dentre os genes identificados pelo transcriptoma de A. thaliana, mais de

65% deles possuem este cis-elemento (Urade, 2007).

Recentemente o fator de transcrição contendo o motivo zíper de

leucina induzido pelo estresse no retículo (bZIP) de Arabidopsis, chamado

AtbZIP60, foi identificado pela sua capacidade de ativar o promotor de BiP

e Calnexina através de elementos responsivos a estresse no RE (Iwata &

Koizumi, 2005). AtbZIP60 está ancorado na membrana sob condições

normais, mas é liberado sobre estresse no RE em um mecanismo

desconhecido. Acredita-se que o mecanismo de ativação seja similar ao

ATF6 de mamíferos e que sua autorregulação seja similar a XBP1 em

células de mamíferos. Entretanto, uma vez que o domínio luminal de

AtbZIP60 é muito menor que o de ATF6, não se sabe se a função de

sensor do estresse no RE é similar ao ATF6 (Urade, 2007).

Em Arabidopsis dois ortólogos de Ire1 foram identificados. AtIre1-1

que é expresso apenas em alguns tecidos e estágios de desenvolvimento,

enquanto o AtIre1-2 é constitutivo em toda a planta. O domínio C-terminal

de AtIre1 é conservado em uma variedade de organismos, enquanto o

domínio N-terminal, que em leveduras tem a função de sensor do

estresse, apresentam seqüência muito diferente. Entretanto, ainda não foi

elucidado como as proteínas Ire1 de plantas funcionam como reguladores

da transcrição no estresse do retículo (Urade, 2007), mas é possível que

BiP tenha papel importante, já que sua superexpressão em plantas de

tabaco resulta em diminuição da ativação da UPR por tunicamicina

(Leborgne-Castel et al., 1999).

Morte Celular Programada em plantas (PCD)

PCD é geneticamente definida como um processo associado a

características morfológicas e bioquímicas distintas que envolvem vias de

sinalização controlando a destruição das células com o mínimo dano às

células vizinhas (Steller, 1995; Pallavan-Unsal et al. 2005). Este processo

é parte integral do ciclo celular de organismos multicelulares (Greenberg,

1996) e pode ser induzido por vários estímulos ambientais ou de

desenvolvimento do organismo (Wertz and Hanley, 1996; Vaux and

Korsmeyer, 1999), ocorrendo em plantas durante os processos de

desenvolvimento, tais como senescência, embriogênese,

desenvolvimento do tecido vascular e durante o processo de interação da

planta com um patógeno (Pennell & Lamb, 1997; Danon et al., 2000).

Processos de PCD em estágios iniciais podem ser revertidos em plantas

(O’Brien et al., 1998).

O processo é similar ao de mamíferos, embora não haja um padrão

comum bem estabelecido, apesar de resultar nos mesmos fenômenos

morfológicos e bioquímicos como quebra do citoplasma, condensação

nuclear, aumento da permeabilidade de membrana, influxo de cálcio,

exposição das fosfatidilserina, liberação do citocromo C, ativação de

proteases especificas e fragmentação do DNA em fragmentos de 50kb e

depois em escadas de nucleossomos (Solomon et al., 1999; Jones, 2000;

Zuppini et al., 2004). Esses sintomas são expressos diferencialmente,

dependendo do propósito de controle da morte celular que ocorre nas

células das plantas (Lam, 2004).

A morte programada é comumente distinguida da morte necrótica,

embora essas formas de morte sejam consideradas como dois extremos

do mesmo fenômeno, chamado ”necroapoptose” (Lemasters, 1999;

Pallavan-Unsal et al. 2005). Pelo menos em células animais, o balanço

vida ou morte é controlado por um delicado equilíbrio entre fatores anti e

pro-apoptóticos. Assim, o principal papel é designado por proteínas da

família Bcl-2 (Tsujimoto and Shimuzu, 2000), que ainda não foram

descritas ou encontradas em plantas até o momento (Chichkova et al.,

2004; Urade, 2007).

A morte celular pode ser dividida em três fases: iniciação, decisão

e degradação (Kroemer & Reed, 2000; Xu et al 2005). Durante a primeira

fase células acumulam moléculas efetoras, as quais diretamente e

seletivamente alteram a permeabilidade da membrana das mitocôndrias.

Isto determina a liberação de fatores apoptóticos que disparam a fase de

degradação. A última fase implica na ativação de proteases específicas e

depois endonucleases as quais são responsáveis pelo típico produto de

degradação na PCD. A decisão da célula em morrer por apoptose ou

necrose depende das condições em que ela se encontra, sendo que a

concentração de ATP e a integridade da mitocôndria são essenciais para

isto (Orrenius et al., 2003).

Estresse no RE e Morte Celular Programada em plantas (PCD)

O RE é o principal sítio para a síntese e enovelamento de

proteínas, e também serve como local para estocagem de cálcio.

Qualquer perturbação em sua homeostasia pode promover o acúmulo de

proteínas mal dobradas, induzindo a UPR. O prolongamento da ativação

da via UPR pode desencadear processos de morte celular (Rao et al.,

2002; Zhang & Kaufman, 2004; Zuppini et al., 2004). Entretanto os

eventos da sinalização celular que conectam estresse no RE e morte

celular não são bem compreendidos (Xu et al. 2005; Urade, 2007).

Recentemente foi identificada em plantas, uma proteína G heterotrimérica

que está envolvida em eventos de sinalização que induz morte celular

associada com a via UPR em Arabidopsis (Wang et al., 2007).

Estresse Osmótico em plantas

Em plantas, assim como em outros organismos, a transpiração de

O é usada para prevenir aumentos significativos de temperatura, sendo

que mais de 90% da água adquirida do solo é consumida por transpiração

durante dias muito quentes (Ueda et al., 2004), acarretando na inibição do

crescimento da planta sob condições de estresse hídrico (Yeo et al., 1991;

Pérez-Alfocea et al., 1993). Esta perda de água excessiva é combatida

pela síntese de vários tipos de osmoprotetores, como glicina-betaína e

prolina (Gorhan et al., 1985; Delauney and Verma, 1993). Por outro lado,

também tem sido demonstrado que a regulação da permeabilidade de

água através de aquaporinas modificam a sensitividade do estresse

hídrico (Aharon et al., 2003).

Vias de trandução de sinal genéricas começam com a percepção

do sinal, seguida pela produção de mensageiros secundários que podem

modular a concentração intracelular de cálcio, freqüentemente iniciando

cascatas de fosforilação que terminam com a ativação de proteínas alvos,

diretamente envolvidos no processo, ou fatores de transcrição que

controlam genes específicos. Os produtos destes genes participam da

produção de moléculas regulatórias, como o hormônio Ácido Abscísico

(ABA), Etileno e Ácido Salicílico (AS), que podem iniciar um segundo ciclo

de sinalização (Xiong et al., 2002; Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki,

2000).

No caso específico do estresse hídrico e osmótico, ocorre uma

resposta complexa iniciada com a percepção do estresse, que ativa vias

de transdução de sinal que manifestam mudanças celulares, fisiológicas e

dos níveis de desenvolvimento. Assim, a resposta depende da severidade

e duração do estresse, genótipo da planta, estágio de desenvolvimento e

fatores ambientais que acarretam o estresse (Bray, 1993).

DRE/CRT (Dehydratation Responsive Element/C-repeat) e ABRE

(ABA Responsive Element) são os principais cis-elementos encontrados

nos genes induzidos por estresse osmótico. O primeiro funciona em

processos iniciais de resposta enquanto o segundo funciona após o

acúmulo de ABA durante a desidratação. Existem vários fatores de

transcrição respondentes a ABA, que se posicionam posterior à resposta

deste hormônio, estando envolvidos em processos tardios de adaptação

ao estresse. (Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki, 2006).

A transdução de sinal em estresse osmótico e salino é similar,

sendo importantes três parâmetros para o retorno a condição de

homeostasia ou a adaptabilidade da planta ao estresse: (1) retorno ao

equilíbrio iônico e osmótico para tentar manter certa homeostasia sob

condição de estresse, (2) controle dos danos e detoxificação acarretada

pelo estresse e (3) coordenação da divisão celular (Mahajan & Tuteja,

2005)

Proteínas ricas em asparagina contendo domínio DCD (N-Rich

Protein)

Uma das primeiras proteínas com alto conteúdo de Asparagina

descrita, a proteína NRP, é induzida durante a reposta hipersensível, e

serve como marcador para morte celular programada estando presente na

parede celular de células de soja (Ludwig & Tenhaken, 2001). Este gene

não responde diretamente ao ácido salicílico, que acelera processos de

morte celular em culturas de células de soja (Shirasu et al., 1997; Ludwig

& Tenhaken 2000), mas sua transcrição pode ser amplificada na presença

dos sinais dessa molécula, que é essencial para a morte celular

programada.

O gene codifica uma proteína que consiste de dois domínios: O

domínio N-terminal é extremamente rico no aminoácido asparagina (25%)

e por isto a proteína foi chamada de N-rich protein (NRP) (Ludwig &

Tenhaken 2001). Na região C-terminal, a proteína codificada pelo gene

NRP, apresenta um domínio relacionado com o desenvolvimento e morte

celular específico de plantas, denominado DCD (Development and Cell

Death). (Tenhaken et al; 2005). O exato papel biológico do gene NRP

ainda não está definido, mas acredita-se que ele esteja envolvido em

processo de PCD atuando na modificação da parede celular de plantas

(Ludwig & Tenhaken 2001). Esta hipótese tem sido sustentada

principalmente (1) devido ao fato de estar presente na parede celular, o

primeiro local de passagem do patógeno, (2) por apresentar

possibilidades de modificações pós-traducionais e (3) devido ao seu

conteúdo não usual de aminoácidos (média de Asn nas proteínas

depositadas no Expasy é 4,44%).

Os genomas de arroz e Arabidopsis, que foram primeiramente

seqüenciados contêm 11 e 7 membros com o domínio DCD,

respectivamente. Pelo menos quatro subgrupos de proteínas podem ser

identificados por comparação filogenética do domínio DCD de arroz e

Arabidopsis. Os quatro subgrupos diferem na arquitetura onde o domínio

DCD é localizado na estrutura da proteína. Enquanto no subgrupo I, o

domínio DCD é encontrado no C-terminal da proteína, no subgrupo II, ele

se localiza na região interna da proteína. O terceiro subgrupo é mais

variável, sendo que as proteínas representativas apresentam o domínio

DCD na região N-terminal, seguido por um domínio ParB. O quarto

subgrupo possui o domínio DCD na região N-terminal, mas contém várias

repetições de KELCH na parte C-terminal da proteína (Tenhaken et al;

2005).

Proteínas contendo domínio NAC

NAC (NAM, ATAF e CUC) é uma família de genes específica de

plantas, sendo que a maioria das proteínas NAC contém um domínio N-

terminal altamente conservado, o qual pode formar uma estrutura hélice-

volta-hélice que se liga especificamente a uma seqüência de DNA (Aida et

al., 1997), uma seqüência sinal de localização nuclear e um domínio C-

terminal variável. As proteínas NAC constituem uma grande família de

fatores de transcrição específicos de plantas e está representada em

Arabidopsis por mais de 100 genes (Riechmann et al., 2000). O papel de

proteínas NAC em resposta ao estresse abiótico e biótico tem sido

descrito na literatura e várias proteínas NAC têm sido identificadas por

causa da sua interação com outras proteínas de importância biológica

nestes processos. As Proteínas da família NAC GRAB 1 e GRAB2

(Gemnivirus REP A Binding ) foram identificadas pela sua habilidade em

interagir com a proteína REP A de Wheat dwarf geminivirus (Xie et al.,

1999). Além disto, foi demonstrado em Arabidopsis que a proteína TIP

(TCV-interacting protein, uma proteína NAC-like) é essencial para a via de

resposta e resistência ao TCV (turnip crinkle virus) (Ren et al., 2000). A

função de proteínas da família NAC na resposta ao estresse biótico foi

evidenciado pela indução do gene StNAC de Solanum tuberosum na

infecção por Phytophtora infestans (Collinge and Boller, 2001) e pela

indução de vários genes NAC de Brassica napus por ataque de insetos

herbívoros e por infecção por fungos. (Hegedus et al., 2003).

Várias proteínas desta família de transativadores também foram

associadas à resposta contra diferentes estresses abióticos. A expressão

de diferentes genes NAC de Brassica napus foi induzida por choque

térmico, frio e por desidratação (Hegedus et al., 2003). Recentemente, foi

demonstrado que plantas transgênicas superexpressando 3 diferentes

genes NAC de Arabidopsis (ANAC019, ANAC055 e ANAC072)

mostraram um significante aumento da tolerância à seca (Tran et al.,

2004), além de ligarem à seqüência CATGTG e regular vários genes

induzidos por estresse (Tran et al., 2004). Esses estudos indicam o

possível papel das proteínas NAC em resposta a estresses.

As proteínas NAC consistem de dois domínios, sendo que o

domínio NAC situado na porção N-terminal da proteína pode ser subdivido

em cinco subdomínios conservados (A-E), exibindo uma carga livre

negativa onde se situa a região de ligação ao DNA. O domínio C-terminal

tem a função de transativação e são carregados positivamente (Xie et al.,

1999). Subdomínios A, C e D são altamente conservados em proteínas

NAC de diferentes espécies, enquanto os subdomínios B e E são mais

diversos (Ooka et al., 2003). O domínio não conservado C-terminal, de

proteínas NAC, possui atividade de ativação transcricional (Ren et al.,

2000; Xie et al., 2000; Duval et al., 2002).

Membros da família de genes NAC de plantas estão envolvidos em

muitos processos de desenvolvimento da planta (Olsen et al. 2005),

incluindo a manutenção do meristema do broto apical (SAM) (Aida et al.,

1997; Weir et al., 2004), sinalização através de hormônios (Aida et al.,

2002; Che et al., 2002;Greve et al., 2003; Xie et al., 2000), resposta de

infecção por patógeno (Collinge and Boller 2001; Ren et al., 2000; Selth et

al., 2005; Xie et al., 1999), senescência foliar (John et al., 1997),

desenvolvimento do embrião (Duval et al., 2002), transporte do mRNA por

grandes distâncias através do floema (Ruiz-Medrano et al.,1999) e

resposta a diferentes estresses abióticos (Hegedus et al., 2003; Tran et

al.,2004).

CAPÍTULO 1

UM NOVO RAMO DE SINALIZAÇÃO DO ESTRESSE NO

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO INTEGRA COM O SINAL

OSMÓTICO ATRAVÉS DE UMA RESPOSTA APOPTÓTICA

DEPENDENTE DAS PROTEÍNAS NRPs

INTRODUÇÃO

As plantas estão constantemente submetidas a condições adversas do

meio ambiente que restringem profundamente o desenvolvimento,

crescimento e produtividade. Em respostas a estresses, as células

vegetais desenvolveram um conjunto complexo de mecanismos de defesa

que operam para aumentar a tolerância contra estas condições restritivas

e são críticos para garantir a sobrevivência das plantas em geral. Em

condições de campo, é provável que diversas condições de estresses

atuem simultaneamente limitando o crescimento e a produtividade. A

identificação de vias de sinalização de resposta em células afetadas por

diferentes estresses, bem como das interações entres estas vias, constitui

um dos interesses majoritários de pesquisas na área de interações das

células vegetais com o meio ambiente. O nosso conhecimento sobre

integração de vias de sinalização de respostas a diferentes estresses

fisiológicos tem aumentado consideravelmente na última década com as

análises de expressão gênica de alcance genômico em plantas

submetidas a diversas condições de estresses (

Kreps et al., 2002; Seki et

al., 2002; Denekamp & Smeekens, 2003; Houde et al., 2006

Recentemente, por meio de análises de microarray em soja, nossa equipe

de pesquisadores identificou uma possível via de convergência que

integra as respostas ao estresse osmótico e ao estresse causado pelo

acúmulo de proteínas mal dobradas no retículo endoplasmático (UPR-

unfolded response pathway) (Irsigler et al., 2007).

Em plantas, sabe-se muito pouco a respeito dos componentes de

sinalização da UPR. Recentemente foi identificado em A. thaliana dois

homólogos a Ire1 que são proteínas associadas à membrana do retículo e

que estão envolvidas na detecção de proteínas mal dobradas presentes

no lúmen desta organela, além de um fator de transcrição chamado de

AtbZIP60 que é induzido pelo estresse no retículo e é capaz de induzir a

expressão dos genes CALENEXINA e BIP que são alvos conhecidos da

via UPR (Iwata e Koizumi, 2005). Embora alguns componentes tenham

sido descritos faltam informações sob o modo de atuação destas

proteínas em condições de estresse (Urade, 2007), e os mecanismos

moleculares da sinalização da UPR.

Apesar do potencial da via UPR em acomodar respostas

adaptativas para sobrevivência, esta via de sinalização tem sido pouco

explorada em plantas como estratégias para melhorar tolerância a

estresses. Evidência sob a possível comunicação entre a via UPR e vias

de resposta a estresse osmótico foram anteriormente fornecidas pela

demonstração da indução em soja de uma isoforma do chaperone

molecular BiP, residente no RE, por tunicamicina (um ativador potente da

via UPR) e por estresse hídrico (Cascardo et al., 2000). Embora esta

indução coordenada de BiP pareça ocorrer por meio de vias de

sinalização distintas, tem sido observado que superexpressão de BiP em

tabaco confere às plantas transgênicas maior tolerância à seca (Alvim et

al., 2001). Mais recentemente, a análise, em escala genômica, do

transcriptoma diferencialmente regulado por estresses osmótico e do

retículo endoplasmático identificou 10 genes co-regulados com expressão

aumentada e 75 co-regulados com expressão diminuída, sendo que

destes últimos, aproximadamente 70% deles estão envolvidos com o

processo fotossintético (Irsigler et al. 2007). A indução coordenada dos

genes co-induzidos pelos estresses osmótico e do retículo ocorreu com

cinética similar. Além disto, sete dos genes co-induzidos (NAM, ATAF2,

N-rich1, N-rich2, UBA, GST e GST2) tiveram um aumento sinergístico na

expressão quando as plantas foram submetidas a uma combinação de

AZC e PEG, sendo considerados alvos desta nova via de integração entre

os estresses do retículo e osmótico (Irsigler et al., 2007). Entre eles, os

dois genes N-rich1 e N-rich2 exibiram as mais fortes induções

sinergísticas pela combinação dos estresses.

As ESTs que representam os genes N-rich1 e N-rich2 codificam

proteínas com domínios N-terminal (N-rich1) e C-terminal (N-rich2)

similares `a proteína NRP (N-Rich Protein), que é induzida durante a

resposta de hipersensibilidade (HR) em soja infectada com bactérias

incompatíveis (Ludwig & Tenhaken, 2001), e contém em sua região C-

terminal um domínio relacionado com processos de morte celular e

desenvolvimento (DCD – Development and Cell Death). A indução de

NRP está especificamente associada ao evento de PCD (morte celular

programada) induzido por patógenos incompatíveis e, provavelmente,

NRP participa em uma via de sinalização que leva a resposta

hipersensitiva.

A morte celular programada (PCD) é um processo com

características morfológicas e bioquímicas distintas e envolvem vias de

sinalização que controlam a destruição das células com o mínimo dano as

células vizinhas (Steller, 1995; Pallavan-Unsal et al. 2005). Assim como

em outros organismos, em plantas a PCD ocorre durante diferentes

processos de desenvolvimento, tais como senescência, embriogênese,

desenvolvimento do tecido vascular e processos de interação da planta

com patógenos (Pennell & Lamb, 1997; Danon et al., 2000; Lam et al.,

2001). Em mamíferos existem duas vias que controlam a PCD. Uma é

independente da mitocôndria e envolve a participação de receptores

específicos e a outra é dependente da mitocôndria, que libera vários

fatores apoptóticos no espaço intermembranas que controlam a atividade

de proteínas da família Bcl-2. Nos dois casos, o resultado final é a

ativação de caspases efetoras da morte celular. Em plantas, muitas

características morfológicas e bioquímicas de PCD têm sido

caracterizadas apesar de membros da família das Blc-2 ainda não terem

sido descritos (Danon et al., 2000; Balk & Leaver, 2001; Lam et al., 2001;

Hoeberichts & Woltering, 2003; Urade, 2007).

Baseado nas funções putativas dos genes N-rich, o objetivo

principal dessa investigação foi avaliar se a via integrativa pudesse

transduzir um sinal de morte celular programada gerado por estresses

prolongados do retículo e/ou osmótico. Para isso, os genes N-rich, alvos

da via integrativa, foram clonados, e o seu envolvimento na indução de

morte celular programada foi diretamente avaliado em células de soja em

suspensão e em folhas de tabaco.

MATERIAIS E MÉTODOS

Células de soja em suspensão e Tratamentos

Cultura de células de soja em suspensão anteriormente preparadas

(Cascardo et al, 2001) foram cultivadas em meio MS Soja (Finer &

Nagasawa, 1988) mantendo-se o procedimento de subcultivos sucessivos

semanais. Os tratamentos foram realizados em culturas de células cinco

dias após repicagem.

As células foram tratadas com Polietilenoglicol 10% (p/v) (PEG;

MW 8000), Tunicamicina (Sigma) 10 μg/mL, Ciclohexamida (Sigma) 0,5

μg/mL, BAP (6-benzilaminopurina), Zeatina 10 μM ou ABA 100. μM, pelo

período de tempo indicado nas respectivas figuras. Após os tratamentos,

as células foram filtradas sob vácuo e lavadas com uma solução isotônica

de NaCl 0,25 M e, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido para

análises subseqüentes.

Extração de RNA e síntese de cDNA

O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen),

tratado com 3 unidade de DNAse livre de RNAse (Promega) para

eliminação do DNA contaminante e purificado com colunas RNeasy Mini

Kit (QIAGEN). Após a extração e purificação, o RNA foi quantificado (DU

650 BECKMAN Spectrophotometers) e sua identidade avaliada em gel de

agarose desnaturante 1,5 %. A síntese de cDNA foi realizada utilizando 2

μg de RNA total, oligo dT e a Trancriptase Reversa MMLV (Invitrogen)

segundo recomendações do fabricante.

PCR em tempo real (qRT-PCR)

Todo o procedimento de PCR em tempo Real, incluindo testes,

validações e experimentos foram conduzidos seguindo manuais da

Applied Biosystems. As reações de PCR em tempo real foram conduzidas

utilizando o aparelho 7500 Real Time PCR Systems (Applied Biosystems),

oligonucleotídeos específicos (Tabela 1), cDNAs dos tratamentos e o

SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Para a quantificação

da expressão gênica, foi utilizado o método comparativo de Ct: 2

-ΔΔCt

e 2

ΔCt

. Como controle endógeno para normalização dos dados do qRT-PCR,

foi utilizado RNA da helicase de soja, que apresentou baixa variação nos

valores de expressão entre os tratamentos.

Clonagem molecular do cDNA completo do gene NRP-B

A seqüência 3’ do gene N-rich 1 foi obtida por RACE ( Rapid

Amplification of cDNA Ends) usando o Gene Racer Kit (Invitrogen). Para

isso, inicialmente foi preparado um cDNA de plantas, a partir de RNA

extraído de folhas de soja, tratadas com PEG por 10h, utilizando

transcriptase reversa (Invitrogen) e oligo dT especial fornecido pelo

GeneRacer Kit (Invitrogen), que insere uma seqüência conhecida no final

do gene. O gene N-rich1 foi designado NRP-B.

Tabela 1 – Lista dos Oligonucleotídeos específicos para qRT-PCR

Primer Seqüência (5’ – 3’) Gene alvo

NAMFW ACGGAGACTTCAGATTCGGTGC NAM

NAMRV CATCGTTATTCCACTTGGGGTCGC

NRP-BFW TACAGGCATCCAATTTGGCGAACC NRP-B

NRP-BRV TGACTTGAAAGAGTTGATCTCACCCC

NRP-AFW GGCACAAAGACTGGTGCTGAGA NRP-A

NRP-ARV CTCTGTATCGTGGAGGCAGACC

HELICFW TAACCCTAGCCCCTTCGCCT HELIC

HELICRV GCCTTGTCGTCTTCCTCCTCG

CALNFW TGATGGGGAGGAGAAGAAAAAGGC CALN

CALNRV CACTTGGGTTTGGGATCTTGGCTC

BIPDFW ATCTGGAGGAGCCCTAGGCGGTGG BIPD

BIPDRV CTTGAAGAAGCTTCGTCGTAAAACTAAG

LTPFW CCCATGGCACATGCAGCTAT LTP

LTPRV GGCGGCATTGAGGCTCTTC

SMPFW GCCGAACTGAGGAAAAGACGAACC SMP

SMPRV CTTGGGCTGTTTGTTGGGTCTTC

Os primers foram desenhados utilizando o programa Primer Express 3.0 (Applied

Biosystems)

A partir do cDNA, foi realizada uma amplificação utilizando um

oligonucleotídeo que ancora nesta seqüência alvo e o oligonucleotídeo

Forward de N-rich 1 (NRP-B) utilizado no PCR em tempo real (Tabela 2).

O fragmento obtido foi clonado segundo informações fornecida pelo

TOPO TA CLONING (Invitrogen), originando o clone pUFV826, que foi

seqüenciado, obtendo a extremidade 3’ do gene. Para realização das

construções, foram utilizadas as técnicas padrões de clonagem, conforme

descrito por Sambrook et al., (1989).

Para a expressão transiente em protoplastos, os genes NRP-B e

NRP, aqui designado NRP-A (Ludwig & Tenhaken, 2001, gi:57898928),

foram amplificados utilizando oligonucleotideos que inserem sítios para

BglII e EcoRI (Tabela 2), e clonados nos sítios correspondente no vetor

pMON921, originando os clones pUFV967 e pUFV849, respectivamente.

Para a expressão transiente em folhas de tabaco, os genes NRP-B

e NRP-A foram amplificados e clonados utilizando oligonucleotídeos que

amplificam o cDNA completo (Tabela 2), sendo seus respectivos

fragmentos clonados segundo informações fornecidas por

pCR8/GW/TOPO TA CLONING (Invitrogen), originando os vetores de

entrada pUFV908 e pUFV874. A partir deles por LR clonase (Invitrogen),

o fragmento de cada gene foi recombinado para o vetor 35S-cassB-YFP-

NOS terminator:pCAMBIA1300 (gentilmente cedido por Steve Slocombe

da Universidade de Lerds – Inglaterra) originando os clones pUFV937 e

pUFV938, que contém os cDNAs de NRP-B e NRP-A sob o controle do

promotor 35S, respectivamente.

Tabela 2 – Oligonucleotídeos específicos para clonagem em diferentes vetores.

Primer Seqüência (5’ – 3’) Vetor de

destino

FwNRich1 TACAGGCATCCAATTTGGCGAACC

Oligo dT Primer GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24

pCR4

FwNRP-Cl

GAAGATCT

ATGGACAACAACAATGACTTTTG

RvNRP-Cl

CGGAATTC

CTATGCTGGAATGGCTTTGAAA

pMON921

FwNRich1-Cl

GAAGATCTATGGAGAATAATAATCAGTCGTT

RvNRich1-Cl

CGGAATTCTTATGCCGGCAAAGCCTTAAAAG

pMON921

FwGt NRich1

ATGGAGAATAATAATCAGTCGTT

RvGt NRich1

TTATGCCGGCAAAGCCTTAAAAG

pCR8/GW/TO

FwGtNRP

ATGGACAACAACAATGACTTTTG

RvGtNRP

CTATGCTGGAATGGCTTTGAAA

pCR8/GW/TO

FwGmNRP

AAAAAGCAGGCTTC

ACAATGGACAACAACAATGA

RvGmNRP

AGAAAGCTGGGTCTTCTATGCTGGAATGGCTTG

pDONR201

GtNRichFw

AAAAAGCAGGCTTC

ACAATGGAGAATAATAATCA

RvNRichGt AGAAAGCTGGGTC

TGCCGGCAAAGCCT

pDONR201

* Nucleotídeos em negrito correspondem à star/stop códon. Nucleotídeos grifados

representam sítios para enzimas de restrição. Nucleotídeos tachados representam attB

parcial.

O cDNA de NRP-B foi amplificado com oligonucleotídeos que

introduziram extensões adaptadoras apropriadas, necessárias para a

recombinação gênica, mediada pela enzima BP Clonase no vetor

pDONR201, originando o clone pUFV921. Por LR Clonase (Invitrogen), o

fragmento em pUFV921 foi transferido para o vetor pK7WG2, originando o

clone pUFV940 que contém o cDNA de NRP-B sob o controle do

promotor 35S.

Para localização subcelular de NRP-B, o cDNA foi amplificado

utilizando os oligonucleotideos específicos (Tabela 2) para clonagem por

recombinação no vetor de entrada pDONR201, exceto que a sequência

do oligonucleotídeo reverso não continha o códon de parada. O fragmento

amplificado foi clonado no vetor pDONR201, originando o clone pUFV977

e transferido para o vetor pK7FWG2. O clone resultante pUFV1002

contém o cDNA de NRP-B fusionado a GFP e sob o controle do promotor

35S.

Expressão transiente em protoplastos de soja

Protoplastos foram preparados em ambiente estéril a partir de

células de soja essencialmente como descrito previamente (Fontes et al.,

1994). Cinco dias após a repicagem, as células foram lavadas duas vezes

com manitol 0,6 M, centrifugadas a 500 rpm por 2 minutos,

ressuspendidas em igual volume de solução enzimática [celulase 0,5%

(p/v), macerozima R-10 0,5% (p/v), pectoliase Y23 0,1% (p/v) em tampão

de lavagem (manitol 0,6M; MES 20 mM; pH 5,5] e incubadas por 3 horas

sob agitação de 40 rpm. A digestão foi acompanhada a cada 30 minutos

por microscopia. Em seguida, os protoplastos foram filtrados em peneira

de 65 μm e coletados por centrifugação a 500 rpm por 2 minutos, sendo

lavados 2 vezes com tampão de lavagem. Os protoplastos foram então

novamente coletados por centrifugação por 2 minutos a 500 rpm,

ressuspendidos em 2 mL de tampão de lavagem e transferidos para um

outro tubo contendo tampão gradiente [sacarose 20% (p/v); manitol 0,6M;

MES 20 mM; pH 5,5]. O material foi centrifugado por 5 minutos a 500 rpm,

sendo coletada a banda na interface, que corresponde aos protoplastos

viáveis. Estes foram lavados 2 vezes com tampão de eletroporação

(25mM Hepes-KOH pH 7,2, 10 mM KCl, 15 mM MgCl

e 0,6M de manitol)

e ressuspendidos em 2 mL do mesmo tampão. Os protoplastos foram

contados em microscópio usando uma câmara de Neubauer. Os ensaios

de expressão foram conduzidos por meio de eletroporação a 25 μF de

capacitância e 250 volts (Gene Pulser – BIORAD) de 10 μg de DNA

(cassete de expressão) e 40 μg de ssDNA, para 2 x 10

– 5 x 10

protoplastos em um volume final de 0.8 mL. O material foi mantido no gelo

por 15 minutos e plaqueado em 7-9 mL de MS Soja + 0,6 M de manitol pH

5,5. Para a expressão transiente o material foi incubado por 36 horas.

Ensaio de Caspase-3

Para a dosagem da atividade de caspase-3, após expressão

transiente, foi utilizado o ApoAlert® Caspase-3 Colorimetric Assay Kit

(Clontech) seguindo recomendações do fabricante. O substrato da enzima

foi o DEVD-pNA e o inibidor irreversível da atividade de caspase-3

utilizado foi o tetrapeptídeo sintético DEVD-fmk, ambos fornecidos pelo

fabricante.

Agroinoculação em folhas de tabaco

Agrobactéria transformadas com os vetores de interesse foram

crescidas por 16 horas, e centrifugadas por 5 min a 8000 RPM. O

sobrenadante foi removido e as células foram lavadas em 1 mL meio de

infiltração (10 mM MgCl

, 10 mM MES pH 5,6 e 10 μM de

acetoseringona). Estas foram centrifugadas por 5 min a 8000 rpm, e

ressuspendidas em 1 mL do mesmo tampão, sendo diluídas em meio de

infiltração para OD de 0,2-0,4. Utilizando seringas estéreis sem agulha,

folhas jovens de tabaco foram infiltradas por uma gentil pressão através

do estômato na epiderme inferior.

Localização celular de NRP-B (N-rich)

Folhas de tabaco foram inoculadas com agrobactérias

transformadas com a construção pUFV1002, pK7FWG2-N-rich. Três dias

após a inoculação, as folhas transformadas foram observadas no

microscópio LSM 510 META invertido (ZEISS) para obtenção das

imagens. Foi utilizada a objetiva de imersão de óleo de 40x1,4 e o laser

de argônio. O GFP foi excitado a 488 nm, e sua emissão foi coletada a

505-530 nm na facilidade de uma trilha. A fenda do microscópio foi fixada,

fornecendo uma faixa óptica de 1,5 a 2,0 μm. As imagens foram

processadas com auxílio do software “LSM Image Browser 4” (ZEISS) e

posteriormente editadas no programa Adobe Photoshop.

Técnicas de Biologia Molecular:

Todas as técnicas de Biologia Molecular como preparação de

plasmídeos, transformação de bactérias, digestão de DNA por enzimas de

restrição, extração de RNA, DNA genômico, DNA plasmidial, síntese de

cDNA, dentre outros foram conduzidos segundo protocolos fornecidos

pelos fabricantes ou contidos em Sambrook et al.(1989)

Análises de Bioinformática

Análises de homologia foram realizadas utilizando o programa

BLAST (Altschul et al., 1990). As seqüências de proteínas foram

analisadas utilizando ferramentas como o programa MEGA (Kumar et al.,

2001), ferramentas contidas no Expasy (www.expasy.ch/tools), CBS

(http://www.cbs.dtu.dk/services/) e SDSC Biology Workbench

(http://workbench.sdsc.edu).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Clonagem do cDNA completo de N-rich1, designado NRP-B, e análises de

bioinformática

Análises de comparação, utilizando o programa Blast, do EST de

N- rich1 mostraram que a seqüência estava incompleta, faltando a região

3’ do gene, que foi obtida através da técnica de RACE (Rapid

Amplification of cDNA Ends). A. análise da seqüência obtida demonstrou

que ela continha os ESTs N-rich1 e N-rich2 (Figura 2), indicando que

representavam o mesmo gene, designado NRP-B (N-rich protein-B). A

proteína deduzida tem um peso molecular estimado de 37092.28 Da e pI

7.05 (Figura 3) e compartilha com a proteína NRP de soja, aqui designada

NRP-A, alta similaridade de seqüência na região carboxi, que contém o

domínio DCD, além de um conteúdo do aminoácido asparagina acima do

normal na região amino-terminal, mais divergente (Figura 4). A região

interna de NRP-B delimitada pelos resíduos 102 a 164 não possui

similaridade com qualquer outra proteína do Banco de Dados, e, portanto,

o significado funcional e estrutural dessa região permanece para ser

determinado (Figuras 2 e 3).

Além da presença do domínio rico em asparagina e do DCD

(Figura 4), foram evidenciados, por meio de bioinformática, putativos sítios

de fosforilação, glicosilação e miristorilação na seqüência de NRP-B,

como possíveis substratos de enzimas conhecidas. .A proteína deduzida

NRP-B também compartilha com NRP-A (Ludwig & Tenhaken, 2001) um

>NRP-B

TTTTATATACCAACACTAGTGATTTCTTATCAAAATTTTCTCATTCCAACCTGAACCTGCTCTGAATCCAATT

CTTCTTCTTCTTGTTCTCTGTTTAAGGCAATACAACATTTACTACTCATACTCAAAGTAGCTTAGTGTTTTGT

TTAGCATATCATGGAGAATAATAATCAGTCGTTTTGGCAATTCAGTGACCAGCTGAGGTTACAGGCATCCAAT

TTGGCGAACCTTTCTCTAAACGATTCGATTTGGAGCAACAATTACATCTCCAAGAGGCGTGATGAAAGGATTA

ATTTTGACATCAAAGTGGGGGGTGAGATCAACTCTTTCAAGTCAAAGGATCCAGCTTGTGATTACAACGATAA

CGTGAATGGATCTCTTCTTGCCATGCCTTACAACAACAACAACAACAACAACATTATTTTGGGTTTTGGTGGA

GTTGGTCTCAATGGAGGCTTCAACAAGGGAATTTACTCCAAGCCTGCCTTTGCCAATCTCAACAACAATATTA

ATCTCAATATCAATCCTAAGGGACACAAGGGCAAGGTTGAAGATGAGCTTTTTCACCCATCCAAATCTTCCAA

GAAAAACAACAACCTCAACAAAAAACATGGGGACAACAACAACAATGATAACAATAAGGATTCCAAGGCTGCT

GGCGACAAGAGATTCAAAACGCTGCCACCATCAGAGTCTCTTCCTAGGGATGAAACCATTGGAGGCTATATCT

TTGTTTGCAACAATGATACCATGGCTGAGAATCTCAAGAGACAACTCTTCGGTCTGCCTCCACGATACAGAGA

TTCTGTTCGGGCCATTACTCCGGGGTTGCCCCTTTTCCTTTACAACTATTCCACTCACCAACTCCATGGAATC

TTTGAGGCTGCAAGTTTTGGAGGGTCAAATATTGATCCATCAGCTTGGGAGGATAAGAAGTGCCCTGGTGAAT

CTCGTTTCCCCGCTCAGGTACGAGTGATAACTAGGAAAACTTGTGAACCACTGGAGGAGGATTCCTTCAGGCC

AATCCTTCACCACTATGATGGTCCCAAGTTCCGTCTTGAGCTGAATGTGCCCGAGGCGTTGTCTCTGCTGGAT

ATTTTTGCAGAACAAGACACCTTCAGTGACACTTTTAAGGCTTTGCCGGCATAAAAGGAGATAAATAGCAAAA

TAATACAACAAGAAGAACATCACTCACAGAGGCAATAGATAATTAGAGGTTTGGGTTGGTTTGAAAGTTATTA

AGTATGGACTTAAGAAGAGAGTCCGAAAGACAAAACAAAATGAATATAACGGAGGACGCTTGGATATTCAACA

ACCTATATATTTATTACTAGTACTTTTGTATAGAGGATGGTCTATTATACTCATATTATTAAGAGAGAATAGA

ATAAGGATGAACTATTTTTGCATATGGGTTCTTGTACAAAAACTACAAATTGGCGACAAATGGAAGCCTATAT

GTTGTAGCTTGTGTTGTGTTCAGAAGGAACTCAAAATATAGTGGAGAAGTGTGAAACCATGGTGGTCCATTTC

AGTGTTATTCATACATTATATACGTGTGCTTTAAACNTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAANGAAAA

Figura 2 – Seqüência de nucleotídeos de NRP-B obtida pelo RACE. A região

sublinhada evidencia uma região que não tem similaridade com nenhuma proteína no

banco de dados. Em vermelho é mostrada a região de similaridade entre NRP-B e NRP-

A. A região entre as duas marcações azul é a região da EST de NRich 1 enquanto a

região entre as duas marcações verde representa a localização de NRich 2.

>NRP-B

MENNNQSFWQFSDQLRLQASNLANLSLNDSIWSNNYISKRRDERINFDIKVGGEINSFKSKDPACD

YNDNVNGSLLAMPYNNNNNNNIILGFGGVGLNGGFNKGIYSKPAFANLNNNINLNINPKGHKGKVE

DELFHPSKSSKKNNNLNKKHGDNNNNDNNKDSKAAGDKRFKTLPPSESLPRDETIGGYIFVCNNDT

MAENLKRQLFGLPPRYRDSVRAITPGLPLFLYNYSTHQLHGIFEAASFGGSNIDPSAWEDKKCPGE

SRFPAQVRVITRKTCEPLEEDSFRPILHHYDGPKFRLELNVPEALSLLDIFAEQDTFSDTFKALPA

Figura 3 – Seqüência de aminoácidos de NRP-B. As asparaginas estão em vermelho,

enquanto o domínio DCD é marcado em cinza. A região sublinhada evidencia uma

região que não tem similaridade com nenhuma proteína no banco de dados.

Figura 4 – Domínios encontrados em NRP-B. Os domínios em destaque foram

identificados por meio de análise da seqüência de aminoácidos realizada com o

PROSITE retirando os filtros de baixa complexidade.

perfil similar de hidropatia (Figura 5) e, assim como NRP-A, não forma

hélices transmembrana e nem tem homologia com proteínas de

membrana de Arabidopsis thaliana (Figura 6). Por meio de fracionamento

celular, a proteína NRP-A foi localizada na parede celular (Ludwig &

Tenhaken, 2001) e devido à similaridade estrutural entre as duas

proteínas, é possível que NRP-B também esteja localizada na parede

celular. Entretanto, análises da localização celular pelo PREDOTAR

indicam que a seqüência não contém sinal de exportação na região

amino-terminal para o aparelho secretor. Ressalta-se que apesar de não

ter sido descrito ainda nenhuma proteína da família de Bcl-2 em plantas,

uma descrita em humanos, e muito diferente de NRP-B, possui na região

amino uma seqüência de cinco Asparaginas que acredita-se ter um papel

importante (Chen et al., 1999).

Análise comparativa de seqüência com proteínas de outras

espécies de plantas evidenciou a presença do domínio DCD altamente

conservado entre os homólogos na região C-terminal, e alta divergência

na região amino-terminal (Figura 7). As espécies que possuem o domínio

DCD no C-terminal foram previamente classificadas como representativos

do subgrupo I dessa família de proteínas (Tenhaken et al; 2005). O

agrupamento hierárquico baseado na conservação de seqüência de

aminoácidos evidenciou a separação desses representativos do subgrupo

I em dois ramos caracterizados pelo tipo de seqüência conservada

presente no amino-terminal, seqüência verde e amarela destacada na

Figura 7 (Figura 8). As proteínas NRP-A e NRP-B de soja foram

agrupadas sob o mesmo sub-ramo e em proximidade com uma proteína

de função desconhecida de A. thaliana (At5g42050). Análise por meio das

ferramentas disponíveis no TAIR (banco de dados de A. thaliana)

demonstrou que o locus At5g42050 é muito induzido por ciclohexamida,

estresse osmótico, salino e em folhas em senescência (Tenhaken et al.,

2005), sendo, portanto um interessante alvo de estudo futuro.

Figura 5 – Padrão de Hidropatia de NRP-B. Análise da seqüência de aminoácidos

realizada com o programa GREASE evidenciou a presença de dois domínios distintos

com polaridades diferentes

Figura 6 – Formação de Hélices Transmembranas por NRP-B. Análise da seqüência

de aminoácidos realizada com o programa TMHMM mostra que o gene não forma hélice

transmembrana, provavelmente não sendo localizado na membrana plasmática

GDA2 P. sativum --------------------------------------------------

Citrus_ MDNMH----SFWQLGDELRGQSRTSEDQSWLRAASRLAEQTRFKGERMNN

gda-1_A. thaliana ---MD----SFWQLGDELRGQTRASEDHKWSTVATKLAEQTRMKGERMNN

A. _thaliana 2 ---MD----SFWQLGDELRGQTRASEDHKWSTVATKLAEQTRMKGERMNN

S. tuberosum MENMQ----SYWQFGDELRGQSKASEDHKWSTAALKLSEQMKYKGERRNN

O. sativa 5 ---MD----NLWHLGDEFRGQSKVVEDRQWSLMTSKLAEINKSKAERTNE

O._sativa 4 ---MD----NLWHLGDEFRGQSKVVEDRQWSLMTSKLAEINKSKAERTNE

V. vinifera ------------MAHQLIMGATAASQYQTWRIPATRVAHNGQTQWPDDDH

O. sativa 3 MEGYD---REFYQFSDQLRLQTASFSGLSLGD-SIWSSPS------DRRN

O._sativa 2 MEGYD---REFYQFSDQLRLQTASFSGLSLGD-SIWSSPS------DRRN

O. sativa 1 MEGYD---REFYQFSDQLRLQTASFSGLSLGD-SIWSSPS------DRRN

GDA2_O. sativa MEGYD---REFYQFSDQLRLQTASFSGLSLGD-SIWSSPS------DRRN

NRP _G._max MDNNN---D-FWKFSDQLRLESG-LANLSLNDYSIWSNSYSSKRPDQRRN

NRICH_Glycine_max MENNN---QSFWQFSDQLRLQASNLANLSLND-SIWSNNYISKRRDERIN

A._thaliana 3 MEYNNNNQQSFWQFSDQLRVQTPNLANLSLND-SIWSTNSVFK---ERRN

GDA2 P. sativum --------------------------------------------------

gi Citrus_ LDLSKG--MTEIRPRDKIMYHEDNNF-ESFNFNFNMMNLDNKVVEN----

gda-1_A. thaliana LDLSKG--YTEFRPSEKFSFQENN-------LNFNMLNLDGKFGES----

A. _thaliana 2 LDLSKG--YTEFRPSEKFSFQENN-------LNFNMLNLDGKFGES----

S. tuberosum LDLSKS--SAEIRPRGNHMFQEDNKW-ES--LNFNMLNLESKMTEN----

O. sativa 5 LDYARMNTIPDVKQWDKVSYHQDES--KMDHLNLGLMNLDLKMNDIRMND

O._sativa 4 LDYARMNTIPDVKQWDKVSYHQDES--KMDHLNLGLMNLDLKMNDIRMND

V. vinifera HRLTRP-------------------------IDEPMRNWDTKLQHY----

O. sativa 3 -EPAFDGEYHHFSSPSPAKNAIANINGVAGNLDGPGLIGSGKLAFGATKA

O._sativa 2 -EPAFDGEYHHFSSPSPAKNAIANINGVAGNLDGPGLIGSGKLAFGATKA

O. sativa 1 -EPAFDGEYHHFSSPSPAKNAIANINGVAGNLDGPGLIGSGKLAFGATKA

GDA2_O. sativa -EPAFDGEYHHFSSPSPAKNAIA------------------------TKA

NRP _G._max FDVK-GSDFNNNNNSSKAFDDDFNDGWKITNSNGPLFSMPHNNNNNTLEV

NRICH_Glycine_max FDIKVGGEINSFK--SKDPACDYND-----NVNGSLLAMPYNNNNNNNII

A._thaliana 3 LDIAATTDKNNNQIDYYQKKTTSDN----INSNWNWKSSGSNNDMG----

GDA2 P. sativum MN------------------------KNSLRNGVYNMNAVYQKSNANFVG

Citrus_ VT------------------------KSSLRNGIYNMNAVYQKNSGHNMG

gda-1_A. thaliana IMG-----------------------KTSMQSNVYNMNTVFQKNDFKSGG

A. _thaliana 2 IMG-----------------------KTSMQSNVYNMNTVFQKNDFKSGG

S. tuberosum MS------------------------KNRIMDSIYNANPVYLNPNFNSLG

O. sativa 5 AAM-----------------------KNPFRGMAYNMNQLYPKGGNGNVN

O._sativa 4 AAM-----------------------KNPFRGMAYNMNQLYPKGGNGNVN

V. vinifera ----------------------------------FHLHQP----------

O. sativa 3 DRYNSVNLPVDNNNNNKSYGGAAKINNNNVNAFGFNKMGGYNNSSNGGGN

O._sativa 2 DRYNSVNLPVDNNNNNKSYGGAAKINNNNVNAFGFNKMGGYNNSSNGGGN

O. sativa 1 DRYNSVNLPVDNNNN-KSYGGAAKINNNNVNAFGFNKMGGYNNSSNGGGN

GDA2_O. sativa DRYNSVNLPVDNNNNNKSYGGAAKINNNNVNAFGFNKMGGYNNSSNGGGN

NRP _G._max GGFNKGGGIYSNTNTTISSYHPNNLNNNAFGGFNKGIYSNTTSSPYLNNN

NRICH_Glycine_max LGFGGVG-----------------LN----GGFNKGIYS----KPAFAN-

A._thaliana 3 LGFGPVGSKSTVDLNPIDKFNSPFNDTWKFNSVNVNVNGYSPSSAVNGD-

GDA2 P. sativum ----NMNSNKY----SGNVQLNKDPH--------------------SNNN

Citrus_ ----NLMVNKY----GGNNLSVKEAE--------------------NNNN

gda-1_A. thaliana ----NMKVNKY----NGNIVANKEMS--------------------NNKH

A. _thaliana 2 ----NMKVNKY----NGNVVANKEMS--------------------NNKH

S. tuberosum ----NSSLSKF----NASNYT-KEPS--------------------KNNN

O. sativa 5 SFKMNVGVNKYLHSPNGKDVNGKNSG--------------------ANSN

O._sativa 4 SFKMNVGVNKYLHSPNGKDVNGKNSG--------------------ANSN

V. vinifera --------------------------------------------------

O. sativa 3 YGGNGGDVKSYFNKSVGRPASNNNNNNSNGGGGYYGKKGGDGAGGKKKHA

O._sativa 2 YGGNGGDVKSYFNKSVGRPASNNNNNNSNGGGGYYGKKGGDGAGGKKKHA

O. sativa 1 YGGNGGDVKSYFNKSVGRPASNNNNNNSNGGGGYYGKKGGDGAGGKKKHA

GDA2_O. sativa YGGNGGDVKSYFNKSVGRPASNNNNNNSNGGGGYYGKKGGDGAGGKKKHA

NRP _G._max HHHLDDNNNLNRNNLKGYKTYFKGEDQFHTPKSAKKKNTTNNTNNKKHGD

NRICH_Glycine_max ---LNNNINLN-INPKGHKGKVED-ELFHPSKSSKK----NNNLNKKHGD

A._thaliana 3 ---FNKGVYTS-MKKYGYNVNLKNNNKNKGIDEDHQIQKGGKKNRKNQQN

GDA2 P. sativum NNNNENNTNAT---DKRFKTLPAAETLPRNEVLGGYIFVCNNDTMQEDLK

Citrus_ NNNNNNDSNANSALDKRFKTLPATETLPRNEVLGGYIFVCNNDTMQEDLK

gda-1_A. thaliana NNNCNDNGNMNLAVDKRFKTLPASETLPRNEVLGGYIFVCNNDTMQEDMK

A. _thaliana 2 NNNCNDNGNMNLAVDKRFKTLPASETLPRNEVLGGYIFVCNNDTMQEDMK

S. tuberosum NNVESTNGNNS--VDKRFKTLPAAETLPKNEVLGGYIFVCNNDTMQEDLK

O. sativa 5 GSNSSGNNSSNSAVDKRFKTLPTSEMLPRNEVLGGYIFVCNNDTMQEDLK

O._sativa 4 GSNSSGNNSSNSAVDKRFKTLPTSEMLPRNEVLGGYIFVCNNDTMQEDLK

V. vinifera --------------DRWYRTLPPSEMLPRNEALGGYIFVCNNDTMQEDLR

O. sativa 3 KNS----DSGAQASDKRFKTLPASEALPRDEAIGGYIFVCNNDTMEENLK

O._sativa 2 KNS----DSGAQASDKRFKTLPASEALPRDEAIGGYIFVCNNDTMEENLK

O. sativa 1 KNS----DSGAQASDKRFKTLPASEALPRDEAIGGYIFVCNNDTMEENLK

GDA2_O. sativa KNS----DSGAQASDKRFKTLPASEALPRDEAIGGYIFVCNNDTMEENLK

NRP _G._max NTNN--NDGTKTGAEKKFKTLPPSESLPKNETIGGYIFVCNNDTMAENLQ

NRICH_Glycine_max NNNNDNNKDSKAAGDKRFKTLPPSESLPRDETIGGYIFVCNNDTMAENLK

A._thaliana 3 NNNQRNEDDKNNGLDKRFKTLPPAEALPRNETIGGYIFVCNNDTMEENLK

:: ::***.:* **::*.:************ *:::

GDA2 P. sativum RQLFGLPPRYRDSVRAITPGLPLFLYNYTTHQLHGIFE----ATCFGGSN

Citrus_ RQLFGLPPRYRDSVRAITPGLPLFLYNYTTHQLHGIFE----ATGFGGSN

gda-1_A. thaliana RHLFGLPPRYRDSVRAITPGLPLFLYNYTTHQLHGIFE----ATTFGGTN

A. _thaliana 2 RHLFGLPPRYRDSVRAITPGLPLFLYNYTTHQLHGIFE----ATTFGGTN

S. tuberosum RLLFGLPPRYRDSVRAITPGLPLFLYNYTTHQLHGIFE----ASSFGGSN

O. sativa 5 RQLFGLPARYRDSVRAIIPGLPLFLYNYTTHQLHGVFE----ASSFGGSN

O._sativa 4 RQLFGLPARYRDSVRAIIPGLPLFLYNYTTHQLHGVFE----ASSFGGSN

V. vinifera RQLFGLPQKYKDSVRAITPGLPLFLYNYTAHQLHGVYQ----AMSFGGSN

O. sativa 3 RQLFGLPSRYRDSVRAIRPGLPLFLYNYSTHQLHGIFE----AASFGGTN

O._sativa 2 RQLFGLPSRYRDSVRAIRPGLPLFLYNYSTHQLHGIFECIYNAASFGGTN

O. sativa 1 RQLFGLPSRYRDSVRAIRPGLPLFLYNYSTHQLHGIFEYIYNAASFGGTN

GDA2_O. sativa RQLFGLPSRYRDSVRAIRPGLPLFLYNYSTHQLHGIFE----AASFGGTN

NRP _G._max RQLFGLPPRYRDSVRTITPGLPIFLYNYSTHQLHGIFE----AASFGGSN

NRICH_Glycine_max RQLFGLPPRYRDSVRAITPGLPLFLYNYSTHQLHGIFE----AASFGGSN

A._thaliana 3 RQLFGLPPRYRDSVRAITPGLPLFLYNYSTHQLHGIYE----AASFGGTN

* ***** :*:****:* ****:*****::*****::: * ***:*

GDA2 P. sativum IDPTAWEDKKCKGESRFPAQVRIRVRKICKALEEDSFRPVLHHYDGPKFR

Citrus_ IDPTAWEDKKCKGESRFPAQVRIRVRKLCKALEEDAFRPVLHHYDGPKFR

gda-1_A. thaliana IDATAWEDKKCKGESRFPAQVRIRVRKICKALEEDSFRPVLHHYDGPKFR

A. _thaliana 2 IDATAWEDKKCKGESRFPAQVRIRVRKICKALEEDSFRPVLHHYDGPKFR

S. tuberosum IDPTAWEDKKCKGESRFPAQVRIRVRKVCNPLEEDAFRPVLHHYDGPKFR

O. sativa 5 IDPTAWEDKKCKGESRFPAQVRIRIRKLCKPLEEDAFRPVLHHYDGPKFR

O._sativa 4 IDPTAWEDKKCKGESRFPAQVRIRIRKLCKPLEEDAFRPVLHHYDGPKFR

V. vinifera IDPTAWEDKKCRGESRFPAQVRIRTKKKCKPLDEDAFRPILYHYDGPKFR

O. sativa 3 IDPTAWEDKKCPGESRFPAQVKVATRKIYDPLEEDAFRPILHHYDGPKFR

O._sativa 2 IDPTAWEDKKCPGESRFPAQVKVATRKIYDPLEEDAFRPILHHYDGPKFR

O. sativa 1 IDPTAWEDKKCPGESRFPAQVKVATRKIYDPLEEDAFRPILHHYDGPKFR

GDA2_O. sativa IDPTAWEDKKCPGESRFPAQVKVATRKIYDPLEEDAFRPILHHYDGPKFR

NRP _G._max IDPTAWEDKKCPGESRFPAQVQVITRKVCEPLEEDSFRPILHHYDGPKFR

NRICH_Glycine_max IDPSAWEDKKCPGESRFPAQVRVITRKTCEPLEEDSFRPILHHYDGPKFR

A._thaliana 3 IELNAFEDKKCPGESRFPAQVRAITRKVCLPLEEDSFRPILHHYDGPKFR

*: .*:***** *********: :* .*:**:***:*:********

GDA2 P. sativum LELSVPETLDLMDLCEQAGSAA-------------------

Citrus_ LELSVPETLDLMDLCEQAGSAA-------------------

gda-1_A. thaliana LELSVPETLDLLDLCEQAGSA--------------------

A. _thaliana 2 LELSVPETLDLLDLCEQAGSA--------------------

S. tuberosum LELSVPETLDLLDLCEKAGV---------------------

O. sativa 5 LELSIAEVVHYVLMFVKRKLLVAPCKDLSTPRREPQNGGIL

O._sativa 4 LELSIAETLSLLDLCEKEGV---------------------

V. vinifera LQLSVPEALALLDLFEEEDP---------------------

O. sativa 3 LELSVAEALSLLDIFADKDDA--------------------

O._sativa 2 LELSVAEALSLLDIFADKDDA--------------------

O. sativa 1 LELSVAEALSLLDIFADKDDA--------------------

GDA2_O. sativa LELSVAEALSLLDIFADKDDA--------------------

NRP_G._max LELSVPEALSLLDIFANQNSFDDIFKAIPA-----------

NRICH_G._max LELNVPEALSLLDIFAEQDTFSDTFKALPA-----------

A._thaliana 3 LELSVPEVLSLLDIFADQNP---------------------

*:*.:.*.: : : .

Figura 7 – Alinhamento múltiplo de NRP-B com seqüências homólogas do

Genbank. Seqüências similares a NRP-B foram obtidas utilizando o programa BLASTp

com um cutoff de 10

-50

e utilizadas para a realização de um alinhamento múltiplo

utilizando o ClustalW. Foram selecionadas as seguintes proteínas com seus respectivos

números de acesso: GDA2_Pisum_sativa (21665866), Citrus_x_paradisi (2369766), gda-

1_A. thaliana (21592623), A. _thaliana 2 (15232081), S. tuberosum (77999240), O.

sativa 5 (125552863), O._sativa 4 (115464703), V. vinifera (147787081), O. sativa 3

(57899411), O._sativa 2 (125570775), O. sativa 1 (125526370), GDA2_O. sativa

(57899412), NRP_Glycine_max (57898928), NRICH_Glycine_max e A._thaliana3

(18422167). NRICH G. max corresponde a NRP-B e NRP G.max a NRP-A. A seqüência

em destaque no C-terminal corresponde o domínio DCD. As seqüências em destaque

em verde e amarelo representam seqüências conservadas no amino terminal.

Figura 8 – Agrupamento hierárquico entre NRP-B e seqüências homólogas. Para a

construção do agrupamento hierárquico por UPGMA o alinhamento anteriormente

mostrado foi utilizado para a construção da árvore pelo programa MEGA3. Os números

representam valores de bootstrap. NRICH Glycine max corresponde a NRP-B e NRP

Glycine max a NRP-A.

gi|2369766|Citrus x paradisi

gi|21665866|GDA2 Pisum sativum

gi|15232081|Arabidopsis thaliana

gi|21592623|gda-1 Arabidopsis thaliana

gi|77999240|Solanum tuberosum

gi|115464703|Oryza sativa

gi|125552863| Oryza sativa

NRICH Glycine max

gi|57898928|NRP Glycine max

gi|18422167| Arabidopsis thaliana

gi|125570775|Oryza sativa

gi|57899412|GDA2 Oryza sativa

gi|57899411|GDA2 Oryza sativa

gi|125526370| Oryza sativa

gi|147787081|Vitis vinifera

100

Regulação dos genes NRP-A e NRP-B por indutores da UPR ocorre via

um novo ramo de sinalização de estresses no retículo endoplasmático

O gene NRP-B foi previamente identificado pela sua co-regulação

por indutores da via UPR (tunicamina e AZC) e por estresse osmótico

(Irsigler et al., 2007). Com a finalidade de avaliar se a regulação do gene

NRP-B é sinalizada por componentes da via UPR, a indução do gene

NRP-B por tunicamicina foi avaliada sob condições que impedem a

ativação da via UPR. Além de NRP-B, foram incluídos no ensaio os genes

NRP-A pela homologia com NRP-B (Figura 7), e o gene NAM, também

co-regulado por estresses osmótico e do RE (Isrgler et al., 2007). Tanto

em células de mamíferos quanto em células de plantas, tem sido

demonstrado que expressão ectópica de BiP inibe a ativação da via UPR

em condições que promovem o acúmulo de proteínas anormais no RE

(Leborgne-Castel et al., 1999; Bertolotti et al., 2000; Okamura et al.,

2000). Plantas jovens de soja superexpressando o gene soyBiPD foram

tratadas com tunicamicina e a ativação da via UPR avaliada por Real

Time RT-PCR utilizando os marcadores específicos BiPD e calnexina

(Figura 9). Expressão ectópica de BiP em soja atenua a ativação da via

UPR, conforme demonstrado pela diminuição da indução dos genes BiPD

e calnexina, em condições que promovem estresse no retículo (compare

WT e Transgênica, T, tratadas com tunicamicina). Em contraste, inibição

da via UPR por superexpressão de BiP não inibe a indução dos genes

NRP-B, NRP-A e NAM que, em condições normais, parece serem

ligeiramente induzidos por BiP (Figura 10).

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

BIPD CALN

mRNA / Helicase

WTH2O TH2O WTDMSO TDMSO

WTTUN TTUN WTPEG TPEG

Figura 9 - Ativação dos genes controle. Após tratamento das plântulas de soja, foi

verificada por PCR em tempo real a expressão dos genes controles O valor de

expressão foi calculado usando o método 2

–ΔCt

, utilizando como controle endógeno a

Helicase. Os cDNAs utilizados foram obtidos a partir de um pool de 7 réplicas biológicas

devidamente validadas individualmente (+DP, n = 2 réplicas manuais). BIPD

corresponde a chaperona molecular endógena BIP, isoforma D. CALN corresponde à

Calnexina.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

NAM NRP-B NRP-A

mRNA / Helicase

WTH2O TH2O WTDMSO TDMSO WTTUN TTUN WTPEG TPEG

Figura 10 - Ativação dos genes NAM, NRP-A e NRP-B. Após tratamento das plântulas

de soja, foi verificada por PCR em tempo real a expressão dos genes. O valor de

expressão foi calculado usando o método 2

–ΔCt

, utilizando como controle endógeno a

Helicase. Os cDNAs utilizados foram obtidos a partir de um pool de 7 réplicas biológicas

devidamente validadas individualmente (+DP, n = 2 réplicas manuais).

Estes resultados indicam que a indução dos genes NRP-B, NRP-A e NAM

por tunicamicina ocorre por uma via de sinalização distinta da UPR.

Uma vez que os genes NRP-A, NRP-B e NAM são induzidos por

estresse osmótico, foi de interesse avaliar se esta regulação era

dependente de vias de sinalização mediadas pelo acido abscísico (ABA).

Entretanto, tratamento de células de soja em suspensão com ABA não

promoveu aumento significativo no acúmulo dos transcritos NRP-A, NRP-

B e NAM (Figura 11). A efetividade do tratamento pode ser comprovada

pela indução significativa do gene marcador SMP (da família Lea), que é

induzido por PEG ou desidratação através de uma via de sinalização

dependente de ABA (Chandler & Robertson, 1994). Estes resultados

indicam que a regulação dos genes NRP-A, NRP-B e NAM por estresse

osmótico é possivelmente independente do hormônio ABA.

0,1

1,0

10,0

100,0

1000,0

NAM NRP-B NRP-A SMP

Relative Quantification

ABA 1h ABA 2h ABA 4h ABA 8h ABA 12h

Figura 11 – Regulação por estresse osmótico ocorre em uma via independente de

ABA. Foi medida a expressão dos genes por PCR em tempo real em células de soja em

suspensão tratadas com ABA no tempo indicado na figura. O valor de expressão foi

calculado usando o método 2

–ΔΔCt

, utilizando como controle endógeno a Helicase, e

normalizando com o tratamento controle. O gráfico está em escala logarítmica, sendo

que os valores representam quantas vezes cada gene no tratamento é mais expresso do

que no controle (não representado). Os cDNAs utilizados foram obtidos a partir de um

pool de 2 réplicas biológicas (n = 2 réplicas manuais).

NAM, NRP-B e NRP-A são genes precocemente induzidos por indutores

de morte celular e reprimidos por inibidores de senescência.

A presença de um domínio DCD em NRP-A e NRP-B, e a rápida

indução de NRP-A durante HR levantaram a possibilidade de que

ativação da via integrativa pudesse transduzir um sinal de morte celular

gerado por estresses prolongados. Para avaliar se os referidos genes

componentes da via de integração estão envolvidos em processos de

morte celular, inicialmente, foi determinada a variação da expressão

gênica por PCR em tempo real em condições de estresse causado por

tratamento com ciclohexamida, indutor de morte celular em células de

soja em suspensão (Wertz & Hanley, 1996), e com os hormônios

antagonistas BAP e Zeatina, que são citocininas inibidoras de

senescência (Figura 12).

Tratamento com ciclohexamida resultou em um aumento

significativo nos níveis de transcritos de NRP-A, NRP-B e NAM (Figura

12). Em contraste, os hormônios BAP e Zeatina reprimiram fortemente a

expressão dos genes NRP-A, NAM e ligeiramente a expressão de NRP-B.

Além disto, a cinética de indução dos três genes em células de soja

tratadas com PEG, tunicamicina e ciclohexamida demonstrou que os três

genes são rapidamente induzidos, 30 min após os tratamentos (Figura

13). Como genes precoces, é possível que estejam agindo anteriormente

às proteínas efetoras na sinalização destes fenômenos.

0,1

1,0

10,0

100,0

NAM NRP-A NRP-B

Relative Quantification

BAP 2h Zeatina 2h CICLO 2h

Figura 12 – Indutores de morte celular e inibidores de senescência ativam e

reprimem os genes da via integrativa, respectivamente. Foi medida a expressão dos

genes por PCR em tempo real em células de soja em suspensão tratadas com BAP,

Zeatina e Ciclohexamida por 2 horas. O valor de expressão foi calculado usando o

método 2

–ΔΔCt

, utilizando como controle endógeno a Helicase, e normalizando com o

tratamento controle. O gráfico está em escala logarítmica, sendo que os valores

representam quantas vezes cada gene no tratamento é mais expresso do que no

controle (não representado). Os cDNAs utilizados foram obtidos a partir de um pool de 1

réplicas biológica (n = 1 réplica manual).

100

NAM NRP-B NRP-A

Relative Quantification

TUN 30` TUN 1h TUN 4h PEG 30` PEG 1h PEG 4h Ciclo 30` Ciclo 1h Ciclo 4h

Figura 13 – Cinética de indução dos genes indicados. Cinética de indução medida por

PCR em tempo real em células de soja em suspensão tratadas com Tunicamicina, PEG

e Ciclohexamida. O valor de expressão foi calculado usando o método 2

–ΔΔCt

, utilizando

como controle endógeno a Helicase, e normalizando com o tratamento controle. O

gráfico está em escala logarítmica, sendo que os valores representam quantas vezes

cada gene no tratamento é mais expresso do que no controle (não representado). Os

cDNAs utilizados foram obtidos a partir de um pool de 2 réplicas biológicas (+SD, n = 2

réplicas biológicas).

Expressão transiente de NRich induz morte celular em protoplastos de

soja

Com a finalidade de acessar diretamente o envolvimento de NRP-B

em morte celular, o cDNA de NRP-B foi transferido para um cassete de

expressão de plantas, sob o controle do promoter 35S, e transientemente

expresso em protoplastos de soja (Figura 14). A fim de avaliar o efeito da

expressão do gene NRP-B sobre morte celular foi monitorado a atividade

de caspase, que é um marcador bioquímico de morte celular. Expressão

transiente de NRP-B em protoplastos de soja induziu a atividade de

caspase-3-like (Figure 15). Extratos de células de soja superexpressando

NRP-B (Figura 14) apresentaram um aumento de duas vezes na atividade

de caspase-3 comparada com as células-controle, transformadas com o

vetor pMON921 (Figura 15). Além disso, a inclusão de um inibidor

específico de caspase-3 inibiu a ativação da enzima. Caspase-3 tem sido

caracterizada como uma protease downstream na fase efetora dos

processos de PCD em mamíferos (Morishima et al., 2002) e evidências

recentes demonstram seu possível envolvimento em PCD em plantas

(Zuppini et al., 2004).

Além disto, foi examinado o efeito de expressão de NRP-B na

ativação/repressão dos genes da via integrativa (Figura 16). Os genes

controles especificamente induzidos por tunicamicina (calnexina) ou por

PEG (LTP) não foram afetados por expressão de NRP-B. Similarmente, a

expressão do gene NRP-B em protoplastos não altera a expressão do

GST da via integrativa, com cinética de indução tardia (Irsigler et al.,

2007). Em contraste, expressão de NRP-B aumenta o acúmulo dos

transcritos de NRP-A e NAM na ordem de duas a três vezes. Estes

resultados sugerem que NRP-A e NAM possam ser alvos de ativação do

gene NRP-B na via de integração, embora a cinética de indução similar

dos três genes não suporta totalmente esta hipótese.

0,0

4,0

8,0

12,0

16,0

20,0

24,0

28,0

32,0

36,0

pMON NRP-B

mRNA / Helicas

Figura 14 – Superexpressão de NRP-B em protoplastos. Após expressão transiente,

foi verificada por PCR em tempo real a expressão de NRP-B em protoplastos

transformados com o vetor vazio (pMON) e o cassete de expressão NRP-B (pMON-

NRP-B).contendo o gene NRP-B. O valor de expressão foi calculado usando o método 2

–ΔCt

, utilizando como controle endógeno a Helicase (+DP, n = 5 réplicas biológicas).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

pMON NRP-B NRP-B + Inhibitor

Caspase Unit

Figura 15 – Atividade de Caspase-3. A atividade da caspase-3 foi determinada em

extratos de protoplastos transformados com o vetor vazio pMON921 (pMON) e o

cassete de expressão, pMON-NRP-B, na ausência (NRP-B) e presença do inibidor

específico de caspase-3 (NRP-B + inhibitor). (+DP, n = 4 réplicas biológicas)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

CA LN LTP GST NA M NRP-A

mRNA / Helicase

pMON NRP-B

Figura 16 – Ativação dos genes pela superexpressão de NRP-B. A expressão de

Calnexina, LTP, GST, NAM e NRP em protoplastos transformados com o vetor vazio

(pMON921) ou com o cassete de expressão NRP-B (pMON- NRP-B) foi determinada por

RT-PCR em tempo real. O valor de expressão foi calculado usando o método 2

–ΔCt

utilizando como controle endógeno a Helicase (+DP, n = 5 réplicas biológicas)

O gene NRP-A também é co-regulado pelos estresses osmótico e do

retículo e assim como NRP-B induz morte celular em protoplastos de soja

Baseado na conservação de domínios estruturais e devido ao fato

de a expressão de NRP-A ser dependente de NRP-B, é possível que

ambos estejam em uma mesma via de transdução de sinais. Para avaliar

esta possibilidade, foi examinado o efeito da combinação dos tratamentos

de PEG e AZC sobre a expressão de NRP-A, conforme descrito por

Irsigler et al (2007). Os resultados claramente evidenciaram a

potencialização da ativação de expressão de NRP-A quando submetido

simultaneamente aos dois estresses, indicando a possível participação

deste gene na via de integração (Figura 17).

Resultados de expressão gênica indicam que NRP-A está

envolvido em morte celular (Ludwig & Tenhaken, 2001). Ensaios de

expressão transiente em protoplastos também foram conduzidos com o

gene NRP-A para avaliar qual a sua participação em fenômenos de morte

celular. Inicialmente, foi verificada a eficiência da expressão transiente do

gene NRP exógeno em protoplastos (Figura 18), Expressão de NRP-A em

protoplastos induziu a atividade de caspase-3 similarmente ao efeito do

gene NRP-B (Figura 19), evidenciando que NRP-A, assim como NRP-B,

participa ativamente em processos de morte celular. Do mesmo modo,

também foi avaliado o efeito da superexpressão de NRP nos genes

controles e da via integrativa (Figura 20). Os resultados demonstram que

expressão de NRP-A causa inibição de NAM na ordem de três vezes, mas

não altera a expressão de NRP-B.

Uma vez que NRP-B induz a expressão de NRP-A (Figura 16), é possível

que NRP-B esteja anteriormente a NRP-A em uma mesma via de

transdução que sinaliza morte celular programada e que é ativada como

resultado de estresses prolongados no retículo endoplasmático e

osmótico. Por outro lado, a expressão do gene NAM, é reprimida por

NRP-A e induzida por NRP-B. Provavelmente a repressão de NAM por

NRP-A esteja associada a um controle da ativação da via de sinalização

por retroinibição direto ou indireto.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

NRP-A

Relative Quantification

PEG AZC A Z C+PEG

Figura 17 – Indução sinergística de NRP-A em resposta a uma combinação de

tratamentos com PEG e AZC.. Plantas de soja foram tratadas por 6 horas somente com

AZC e depois adicionado PEG, deixando por 10 horas (Irsigler et al., 2007). O resultado

é representado em variação de expressão em relação ao controle H

O usando o método

de 2

–ΔΔCt

. (+DP, n = 3 réplicas biológicas)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

pMON NRP-A

mRNA / Helicase

Figura 18 – Expressão transiente de NRP-A em protoplastos. Foi verificada por PCR

em tempo real a expressão de NRP em protoplastos transformados com o vetor vazio

(pMON) e com o cassete de expressão NRP-A (pMON-NRP-A). O valor de expressão foi

calculado usando o método 2

–ΔCt

, utilizando como controle endógeno a Helicase (+DP, n

= 6 réplicas biológicas)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

pMON NRP-A NRP-A + Inibidor

Caspase Unit

Figura 19 – Atividade de Caspase-3. A atividade de caspase-3 foi determinada pelo

ApoAlert® Caspase-3 Colorimetric Assay Kit em extratos de protoplastos transformados

com o vetor pMON921 (pMON) e com o cassete de expressão pMON-NRP-A (NRP-A)

na ausência (NRP-A) e presença (NRP-A + Inibidor) de inibidor de caspase-3. (+DP, n =

5 réplicas biológicas)

0,1

1,0

10,0

100,0

1.000,0

CALN GST LTP NAM NRP-B

Relative Quantification

pMON NRP

Figura 20 – Efeito da expressão de NRP-A sobre os genes indicados. A expressão

de Calnexina, LTP, GST, NAM e NRP-B foi determinada por RT-PCR em tempo real em

protoplastos transformados com o vetor vazio (pMON) ou com o cassete de expressão

pMON921-NRP-A (NRP-A). O valor de expressão foi calculado usando o método 2

–ΔCt

utilizando como controle endógeno mRNAs de Helicase (+DP, n = 6 réplicas biológicas)

Expressão transiente dos genes NRP-A e NRP-B em folhas de tabaco

induzem senescência.

Com a finalidade de explorar in planta o fenômeno de morte celular

induzido por NRP-A e NRP-B, os respectivos cDNAs foram transferidos

para vetores binários de transformação de plantas mediada por

Agrobactéria, e a expressão transiente dos genes foi induzida por

agroinoculação em folhas de tabaco (Figura 21). Após duas semanas a

20 ºC, as seções foliares agroinfiltradas com as construções YFP-NRP-B

(seção 1), YFP-NRP-A (seção 2) e pk7WG2-NRP-B (seção 3)

apresentaram o fenótipo de clorose característico de senescência foliar

que é associada à diminuição do teor de clorofila e, conseqüente,

amarelecimento das folhas. O desenvolvimento de clorose nas seções

infiltradas foi um resultado direto da expressão das proteínas e não

devido à presença de agrobactéria, uma vez que na seção infiltrada com

um cassete de expressâo não relacionado (seção 4) não ocorreu

amarelecimento. Estes resultados substanciam os argumentos de que

ambas as proteínas estão funcionalmente envolvidas em processos de

morte celular, uma vez que a expressão dos genes correspondentes de

alguma forma acelerou processos de senescência na planta de tabaco.

Figura 21 – Agroinoculação em folhas de tabaco. Plantas de tabaco foram inoculadas

com agrobactérias transformadas com: 1- YFP-NRP-B, 2- YFP-NRP-A, 3. pk7WG2-NRP-

A e 4. Controle (pk7FWG2-NAP)

A proteína NRich está localizada na membrana plasmática

Ensaios de fracionamento celular indicam que a proteína NRP esta

na parede celular (Ludwig & Tenhaken, 2001). Com a finalidade de

determinar a localização subcelular de NRP-B, o gene foi transientemente

expresso como uma proteína quimérica fusionada a GFP e sua

localização celular determinada por microscopia confocal em folhas de

tabaco (Figura 22). Intensa fluorescência foi observada ao longo da

superfície celular. A fim de avaliar a localização precisa da proteína na

membrana plasmática ou parede celular, foi realizada uma plasmólise

com KCl 0,8 M para o descolamento da membrana plasmática (Figura

23). Apesar de ter um sinal não específico na parede celular,

aparentemente fica evidenciado por estas análises que a proteína NRP-B

está localizada na membrana plasmática, provavelmente ancorada com

complexos sistemas de sinalização, responsáveis pelo desencadeamento

dos processos de PCD.

GFP NRP-B:GFP

Figura 22 – Localização subcelular de NRP-B. 72 horas após a agroinoculação de

folhas de tabaco com pK7FWG2 e pK7FWG2-NRP-B, a expressão da proteína NRP-B

foi monitorada através da fluorescência emitida pela proteína GFP (green fluorescense

protein) por meio de microscopia confocal. As fotos foram editadas no Adobe Photoshop

para retirada de regiões como cloroplasto e borrões sem contanto alterar o resultado.

Figura 23 – Localização subcelular de NRP-B após plasmólise. Após 3 dias de

expressão transiente em folhas de tabaco transformadas com pK7FWG2-NRP-B, foi

realizada uma plasmólise com KCl 0,8 M, e a expressão da proteína NRP-B foi

monitorada através da fluorescência emitida pela proteína GFP (green fluorescense

protein) por meio de microscopia confocal.. Setas brancas mostram a membrana

plasmática.

CONCLUSÕES

Os resultados da presente investigação forneceram evidências

conclusivas de que as proteínas NRP-A e NRP-B participam funcionalmente

em um processo de morte celular em células vegetais. Inicialmente, foi

observada que ambas as proteínas possuem um domínio DCD,

caracterizado como domínio funcionalmente ativo em eventos

desenvolvimento ou morte celular (Tenhaken et al; 2005). Os genes

correspondentes são rapidamente induzidos por estresses osmótico e do

retículo endoplasmático que induzem o processo de morte celular em plantas

com características apoptóticas (Zuppini et al., 2004, Mahajan & Tuteja,

2005, Pallavan-Unsal et al. 2005). Além disso, foi demonstrado que NRP-A e

NRP-B são induzidos por cicloheximida, um indutor clássico de morte celular,

e reprimidos pelos inibidores de senescência, zeatina e BAP. Evidências

diretas da função de NRP-A e NRP-B em morte celular foram fornecidas em

ensaios de expressão transiente em protoplastos de soja e folhas de tabaco.

Expressão de ambos os genes em células de soja em suspensão induziu a

atividade de caspase-3-like. Assim também, expressão dos genes NRP-A e

NRP-B em folhas de tabaco acelerou o processo de senescência como

evidenciado pelo aparecimento de clorose acentuada.

Previamente foi observado que as respostas a estresses osmótico e

do RE convergem em uma via integrativa. Nesta investigação, foi identificado

que a ativação dos genes alvos NAM, NRP-A e NRP-B é sinalizada por

estresses no RE por meio de uma via distinta da via UPR. Indução de

estresses no RE em plantas superexpressando BiP e, portanto, defeituosas

para ativação da via UPR, induzem a expressão dos genes da via integrativa

com a mesma intensidade do controle. Por outro lado, foi demonstrado que a

indução da via integrativa por um sinal osmótico é independente do hormônio

ABA, já que a expressão dos genes alvos não é afetada por tratamento com

este hormônio.

Coletivamente, os resultados dessa investigação e os resultados

anteriores da nossa equipe suportam o modelo proposto de integração das

respostas a estresses osmótico e no RE que convergem na transdução de

sinais de morte celular dependente das proteínas NRPs (Figura 24). Neste

modelo, estresses prolongados no retículo endoplasmático ativam uma via

de sinalização independente da via UPR que integra o sinal osmótico por

meio de uma via independente do hormônio ABA, resultando na ativação dos

genes NAM, NRP-A e NRP-B. Provavelmente, o gene NRP-B atua

anteriormente aos genes NAM e NRP-A, uma vez que expressão ectópica de

NRP-B ativa a expressão desses genes. Ativação dessa via integrativa

resulta na transdução de um sinal de morte celular que é dependente das

proteínas NRP-A e/ou NRP-B, sendo a sinalização conectada ao retículo

endoplasmático, mas não específica de estresses nessa organela. Esta

argumentação é substanciada pelo fato de que a via converge com a

resposta ao estresse osmótico e a ativação dos genes alvos afeta atividade

de caspase-3-like envolvida na resposta apoptótica iniciada na mitocôndria.

Além disso, a localização celular de NRP-B na membrana plasmática é

consistente com sua participação em eventos de sinalização de morte celular

mais generalizados.

Figura 24 - Modelo de transdução de sinais proposto – Sinalização proposta segundo

evidências que 1) Indutores de PCD, estresse osmótico e do RE induzem a transcrição

de NAM, NRP-A e NRP-B. 2) Inibidores de senescência inibem a transcrição de NAM,

NRP-A e NRP-B. 3) NRP-A e NRP-B induzem morte celular. 4) NRP-B está na

membrana plasmática e 5) Superexpressão de BiP atenua processos de morte celular. 6)

Superexpressão de BiP aumenta ligeiramente a expressão de NAM, NRP-A e NRP-B. 7)

Via de estresse osmótico independente de ABA que conecta com 8) Via de estresse no

retículo independente da UPR.

CAPÍTULO 2

SUPEREXPRESSÃO DO CHAPERONE MOLECULAR BiP

ATENUA PROCESSOS DE MORTE CELULAR

INTRODUÇÃO

Diferentes estratégias para aumentar a tolerância a estresses em

plantas têm sido desenvolvidas, como a manipulação e a reprogramação

da expressão de genes endógenos relacionados com estresse (Mahajan

& Tuteja, 2005). Em muitos casos, são utilizados genes cujas proteínas

atuam funcionalmente em vias de desintoxicação de produtos gerados em

condições de estresses (Rodrigues et al., 2005) ou genes relacionados

com vias de reparo de proteínas e estruturas celulares, como chaperones

moleculares (Gupta et al., 1993; Badawi et al., 2004), que são induzidos

por uma variedade de estresses fisiológicos (Pelham, 1989; Hammond &

Helenius, 1995).

O retículo endoplasmático (RE) é o principal sítio para a síntese e

enovelamento de proteínas e, consequentemente, a capacidade de

processamento de proteínas na organela depende de um sistema de

chaperones moleculares atuando diretamente na via produtiva de

dobramento de proteínas secretórias (Pilon & Schekman 1999). Qualquer

perturbação em sua homeostase pode promover o acúmulo de proteínas

mal dobradas, induzindo uma via de sinalização, denominada UPR, cuja

ativação acredita-se ser dependente do chaperone molecular BiP (Ron &

Walter, 2007). Uma vez que as proteínas induzidas pela UPR estão

envolvidas no dobramento das proteínas secretórias, acredita-se que elas

tenham uma função protetora dentro do RE evitando a agregação

incorreta de proteínas. De fato, a superexpressão de BiP em culturas de

células de mamíferos (Morris et al., 1997) e protoplastos de fumo

(Leborgne-Castel et al., 1999) previne a ativação da via UPR e aumenta a

tolerância das células a estresses, sugerindo que BiP atua diretamente

atenuando o estresse no RE. O nível de investigação sobre o papel

protetor de BiP contra o estresse no RE tem sido estendido para

organismos multicelulares intactos, por meio de repressão antisenso e

hiperexpressão de genes BiP em plantas transgênicas (Alvim et al., 2001).

Estes estudos demonstraram que níveis elevados de BiP em plantas

transgênicas conferiram tolerância a tunicamicina durante germinação e a

estresse hídrico durante crescimento da planta. Sob condições de

estresse hídrico, os níveis de BiP nas folhas correlacionaram com a

manutenção de turgor e do conteúdo relativo de água. O efeito protetor

resultante da hiperexpressão de BiP foi anulado por meio de repressão

antisenso. Este resultados são consistentes com um mecanismo de

tolerância a estresse hídrico mediado por BiP.

Tem sido demonstrado que ativação prolongada da via UPR pode

desencadear processos de morte celular (Rao et al., 2002; Zhang &

Kaufman, 2004; Zuppini et al., 2004). A superexpressão de BiP em

mamíferos atenua a ativação da UPR (Bertolotti et al., 2000; Okamura et

al., 2000), e protege a célula contra apoptose mediada por estresses no

retículo endoplasmático, ocorrendo o oposto quando se tem uma

repressão de BiP (Zhang & Kaufman, 2004). Entretanto os eventos da

sinalização celular que conectam estresse no RE e morte celular não são

muitos bem compreendidos (Urade, 2007). Em plantas, tem sido

demonstrado que tratamentos que causam distúrbios na homeostasia do

RE induzem um programa de morte celular (Zuppini et al., 2004).

Similarmente, os resultados do capítulo anterior demonstraram que o

retículo endoplasmático participa em programas de morte celular através

da percepção e transmissão de sinais apoptóticos gerados por estresses

prolongados na organela. Neste capítulo, foi avaliado o efeito protetor de

BiP contra sinais de morte celular. Para isso, estresses prolongados do

retículo endoplasmático e sinais de morte celular foram induzidos em

plantas transgênicas de soja e de tabaco superexpressando o gene

soyBIPD.

MATERIAIS E MÉTODOS

Material Vegetal e Tratamentos

Foram utilizadas plantas de soja do cultivar Conquista

transformadas com o gene BiPD (soyBiPD) na orientação senso e plantas

controle. As plantas foram inicialmente germinadas em terra na casa de

vegetação e após uma semana (ou estágio VC) foram retiradas do solo,

procedendo-se a lavagem da raiz e colocadas em solução contendo

Polietilenoglicol 10% (p/v) (PEG; MW 8000), Tunicamicina (Sigma)

10μg/mL, e os respectivos controles H

O e DMSO (Sigma).

O material vegetal foi coletado após os tratamentos e

imediatamente congelado em nitrogênio líquido sendo armazenado em

freezer a -80

C até o processamento das amostras, salvo casos em que

o protocolo exigia análise imediata.

Para os ensaios de agroinoculação de genes indutores de morte

celular, foram utilizadas plantas transgênicas de tabaco expressando o

gene soyBiPD nas orientações senso e antisenso. A obtenção e

caracterização molecular dessas plantas foram previamente descritas

(Alvim et al., 2001).

Extração de RNA e síntese de cDNA

O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen),

tratado com três unidade de DNAse livre de RNAse (Promega) para

eliminação de DNA contaminante e purificado com colunas RNeasy Mini

Kit (QIAGEN). Após a extração e purificação, o RNA foi quantificado (DU

650 BECKMAN Spectrophotometers) e analisado em gel de agarose

desnaturante 1,5 %. A síntese de cDNA foi realizada utilizando 2 μg de

RNA total, oligo dT e Trancriptase Reversa MMLV (Invitrogen), segundo

especificações do fabricante.

Fragmentação de DNA genômico

Após tratamento e extração do DNA de acordo com Della-Porta

(1983), o DNA genômico foi corrido em gel de agarose 2% contendo

brometo de etídeo e visualizado e fotografado sob luz UV (Eagle Eye II ).

Monitoração de morte celular por Azul de Evans

Após tratamentos, foram extraídos quatro discos foliares de cada

planta e realizado ensaio de exclusão do corante vital segundo Backer &

Mock (1994)

Detecção in-vivo de H

O teor de H

foi monitorado nas folhas de plantas tratadas com

PEG e tunicamicina usando o 3,3-diaminobenzidina DAB (Sigma)

segundo Orozco-Cardenas & Ryan (1999) com modificações. As plântulas

foram colocadas em solução contendo 1 mg/mL de DAB, pH 3,8 por 8

horas sob luz. Em seguida, as plântulas foram submetidas aos estresses

analisados sendo transferidas para solução de tunicamicina, DMSO, PEG

ou H2O por 48 horas. Após este período, foram descoradas com etanol

96% fervente por 15 minutos, e transferidas para uma nova solução de

etanol 96 % por 24 horas. A remoção gradual do etanol por um gradiente

decrescente permitiu reidratação das plântulas para realização das

fotografias.

Malondialdeído (MDA)

A peroxidação dos lipídeos foi dosada pela determinação do

conteúdo de malondialdeído, que é o principal composto formado pelo

processo. Para tal, quatro discos foliares de 1,4 cm de diâmetro foram

macerados em 2 mL de Ácido Tricloroacético 0,1 % (p/v) e centrifugados

a 10000g por 15 minutos a 4 ºC. 500 μL do sobrenadante foram

incubados por 20 minutos a 90 ºC junto com 1,5 mL da solução de Ácido

Tiobarbitúrico (TBA 0,5 % em TCA 20 %) e a reação foi parada em banho

de gelo. Após centrifugação a 13000 RPM por 4 minutos, o sobrenadante

foi lido a absorvância a 532 nm em espectrofotômetro (DU 650 BECKMAN

Spectrophotometers).

Agroinoculação em folhas de tabaco

Agrobactéria transformadas com os vetores de interesse foram

crescidas por 16 horas, e centrifugadas por 5 min a 8000 RPM. O

sobrenadante foi removido e as células foram lavadas em 1 mL meio de

infiltração (10 mM MgCl

, 10 mM MES pH 5,6 e 10 μM de

acetoseringona). Estas foram centrifugadas por 5 min a 8000 rpm, e

ressuspendidas em 1 mL do mesmo tampão, sendo diluídas em meio de

infiltração para OD de 0,4. Utilizando seringas estéreis sem agulha, folhas

jovens de tabaco foram infiltradas por uma gentil pressão através do

estômato na epiderme inferior.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Expressão ectópica de BiP em plantas transgênicas atenua o processo de

morte celular induzida por estresses no RE e osmótico.

As plantas transgênicas de soja expressando ectopicamente o

gene soyBiPD foram anteriormente obtidas e selecionadas por

immnoblottings (dado não mostrado). Plântulas transgênicas (35S-BiP-9,

T) e controles (WT) foram submetidas aos tratamentos com PEG por 48

horas (Figura 1) e TUN por 36 horas (Figura 2). Consistente com o

fenótipo de tolerância à seca mediado por BiP em tabaco transgênicos

(Alvim et al, 2001), as plântulas de soja transgênicas (T) mantiveram o

turgor foliar em condições de desidratação promovido pelo tratamento

com PEG (Figura 01, compare T PEG com WT PEG). Precedentes na

literatura demonstram que a superexpressão de chaperonas moleculares

tem efeito protetor contra estresses osmótico e hídrico (Alvim et al., 2001;

Cho & Hong 2005).

O efeito protetor de BiP contra estresses típicos do retículo

endoplasmático também foi avaliado por meio de tratamento das plântulas

de soja com tunicamicina (Figura 2). Enquanto que tratamento com

tunicamicina causou lesões foliares necróticas nas folhas cotiledonares de

plântulas controle, a expressão ectópica de BiP em plantas transgênicas

preveniu o aparecimento de necrose foliar. Similarmente, tunicamicina

induziu o aparecimento de clorose nas folhas controle, mas não nas

Figura 1 – Tratamento com PEG induz perda de turgor foliar. Plântulas de soja

Transgênicas (T), linhagem 35S-BiP-C9, e controles (WT) foram tratadas com 1% PEG

por 48 horas em meio de Hoagland.

Figure 2 – Lesões foliares induzidas por tunicamicina. Plântulas de soja controle

(WT) e transgênica (T), linhagem 35S-BiP-C9, foram tratadas com 10 μg/mL de

tunicamicina por 36h (A) e então transferidas para meio de Hoagland sem tunicamicina

por 24 horas (B)

WT PEG T PEG

folhas das plantas transgênicas. Estes fenótipos, necrose e murchamento

foliar, parecem estar associados com o processo de morte celular.

A porcentagem de células mortas, induzidas pelas condições de

estresse, foi avaliada pelo método de exclusão do corante vital Azul de

Evans, que permite monitorar a integridade da membrana nas plantas sob

estresse (Figuras 3 e 4). A retenção do corante em células mortas medida

espectrofotometricamente é uma estimativa do teor de células mortas.

Esta quantificação demonstrou que tratamento com tunicamicina induz

morte celular a partir de 24 horas, enquanto que tratamento com PEG

promove o máximo de perda de viabilidade celular já nas primeiras 24

horas de tratamento. Entretanto, as plântulas transgênicas tratadas com

tunicamicina apresentaram um percentual de células em morte muito

inferior do que as plantas controle ao longo do experimento (Figura 3).

Tratamento com PEG promoveu um efeito similar (Figura 4), ficando

evidente a diferença relativa de células mortas entre as plantas

transgênicas e controle após 24 horas de tratamento. O aparente efeito

reversível na porcentagem de células mortas após 48 horas de tratamento

contínuo por PEG reflete a severidade do tratamento ao invés de

recuperação do estresse. Assim, é provável que o período de 48 horas

sob desidratação promova lesões intensas na membrana plasmática,

tornando-a estruturalmente incapaz de reter o corante em seu interior

durante os processos de lavagens no experimento, comprometendo o

valor absorvância lido.

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

12h 24h 48h

Abs (600nm

)

WTDMSO TDMSO WTTUN TTUN

Figura 3 – Efeito da Tunicamicina na morte celular em plantas superexpressando

BiP. Plântulas de soja controle (WT) e transgênicas (T) tratadas com tunicamicina

durante 12h, 24 h e 48 h foram utilizadas para ensaio segundo Backer & Mock (1994).

(SD+; n= 5 réplicas biológicas). Como controle do tratamento, as plantas também foram

tratadas com DMSO.

0,00

0,40

0,80

1,20

1,60

2,00

12h 24h 48h

Abs (600nm)

WTH2O TH2O WTPEG TPEG

Figura 4 – Efeito da desidratação celular. Plântulas de soja controle (WT) e

transgênicas (T) tratadas com PEG 1% durante 12h, 24 h e 48 h foram utilizadas para

ensaio segundo Backer & Mock (1994). (SD+; n= 5 réplicas biológicas)

A fim de caracterizar o fenômeno de morte celular induzida por

PEG e tunicamicina, foi avaliada a fragmentação de DNA como

característica de morte celular programada e um dos marcadores finais do

processo de PCD (Figura 5). O resultado confirma a hipótese de que a

superexpressão de BiP atenua a indução de vias de morte celular, já que

a degradação do DNA genômico nas plantas expressando BiP foi muito

inferior do que nas plantas controle. Entretanto, a ausência de

fragmentações definidas do DNA (aproximadamente em intervalos de 50

pb) não permite excluir a possibilidade de que a morte celular induzida

nas condições experimentais seja devido à necrose celular.

Figura 5 – Fragmentação de DNA genômico.O DNA genômico foi extraído de folhas de

plantas controles (WT) e transgênicas (T) tratadas com tunicamicina e PEG. M= 1kb, 1=

Control WT, 2=Control T, 3= WT TUN, 4= T TUN, 5= WT PEG and 6= T PEG

M WT T WT T WT

Normal TUN PEG

Plantas transgênicas submetidas ao tratamento com tunicamicina

produzem maior quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS)

Várias condições de estresse promovem o aumento na produção

de ROS em plantas. Estas moléculas são sinalizadoras de processos de

morte celular, mas quando presentes em altas concentrações podem

atuar desencadeando desordem na homeostasia da planta por provocar

estresse oxidativo (Hu et al., 2006). A produção de H

foi monitorada

com o corante DAB (Figura 6)

Em condições normais, a proporção de H

em plantas

transgênicas e controle é equivalente. Similarmente, plantas transgênicas

ou controle tratadas com PEG produziram H

em proporções similares

(dados não mostrados). Entretanto, a quantidade de H

produzida pela

planta senso sob tratamento com tunicamicina foi muito maior do que as

plantas controle. Estes resultados aparentemente contradizem a maior

tolerância das plantas senso a morte celular induzida por tunicamicina,

uma vez que H

parece agir como molécula sinalizadora em diversas

vias de PCD em plantas (Breusegem & Dat, 2006; Hu et al., 2006)

Figura 6 – Determinação de espécies reativas de oxigênio. Plântulas de soja

transgênicas (T) e controles (WT) foram submetidas aos tratamentos com tunicamicina e

DMSO e tratadas com DAB segundo Orozco-Cardenas & Ryan (1999).

BiP não afeta o nível de peroxidação de lipídeos resultante de acúmulo

excessivo de ROS

Uma vez que estresse típico do RE causa um acúmulo excessivo

de ROS em plantas transgênicas superexpressando BiP, foi dosado a

peroxidação dos lipídeos, como resultado direto da ação de ROS. Os

ensaios foram realizados utilizando plantas estressadas por 24 horas e os

níveis de peroxidação de lipídeos foram avaliados com base no acúmulo

do aldeído MDA (Figura 7). Tratamento com PEG por 24 horas acarretou

em um aumento dos níveis de aldeídos reativos derivados da peroxidação

de lipídeos, não havendo diferença significativa nos níveis de MDA entre

as plantas transgênicas e controle. Consistente com estes resultados, a

coloração com DAB de folhas estressadas osmoticamente foi

significativamente superior às folhas não tratadas, não havendo diferença

entre as plantas transgênicas e controle (dados não mostrados). Estes

resultados indicam que BiP não atenua diretamente a peroxidação de

lipídeos causada por acúmulo de ROS em resposta ao estresse osmótico.

Em contraste, tratamento com tunicamicina não promoveu estresse

oxidativo tão acentuado,e não causou um aumento significativo nos níveis

de MDA. De fato, a coloração de folhas de soja estressadas por

tunicamicina com DAB não demonstrou alterações nos níveis de ROS

causadas por estresse no RE em plantas controle (Figura 6). Embora o

tratamento com tunicamicina tenha promovido um aumento nos níveis de

ROS em folhas transgênicas, este aumento não foi suficientemente alto

para causar peroxidação de lipídeos, conforme julgado pelos níveis de

MDA (Figura 7).

24h

Lipid Peroxides

nmol x g-1 fw

WTH2O TH2O WTDMSO TDMSO WTTUN

TTUN WTPEG TPEG

Figura 7 – Peroxidação de lipídeos expressão como conteúdo de MDA. Plântulas de

soja foram submetidas aos tratamentos por tunicamicina e PEG por 24 horas e as folhas

foram utilizadas para dosagem de MDA. (SD+; n= 5 réplicas biológicas).

Superexpressão de BiP atenua os processos de morte celular induzidos

pelas proteínas NRP-A e NRP-B em plantas de tabaco.

No capitulo anterior, foi demonstrado que as proteínas NRP-A e

NRP-B induzem o processo de morte celular com características de PCD

de mamíferos. Além disso, expressão dessas proteínas em folhas de

tabaco acelerou o processo de senescência com o desenvolvimento de

clorose. Para avaliar o efeito de BiP em PCD induzida por NRPs, folhas

de tabaco expressando o gene soyBiPD nas orientações senso e anti-

senso e plantas controle foram agroinfiltradas com cassetes de expressão

para os genes NRP-A e NRP-B (Figura 8). A expressão de ambas as

proteínas provocou o amarelecimento acelerado das folhas infiltradas nas

folhas controle (WT). Entretanto, nas folhas transgênicas senso (S),

expressão de NRP-A e NRP-B não alterou o teor de clorofila, conforme

julgado pela manutenção da cor verde durante o período do experimento.

Em contraste, nas folhas anti-senso, o desenvolvimento de clorose como

resultado da expressão de NRP-A e NRP-B foi acentuado e o processo de

senescência acelerado em comparação com plantas controle. Estes

resultados substanciam o argumento de que BiP atua prevenindo o

processo de morte celular em células vegetais. Experimentos adicionais

serão necessários para elucidar o mecanismo pelo qual BiP alivia morte

celular.

Figura 8 - Agroinoculação em folhas de tabaco. Plantas de tabaco controle (Wt) e

superexpressando soyBIPD na orientação senso (S) e antisenso (AS) foram infiltradas

com agrobactérias transformadas com 1- NRP-A (YFP-NRP), 2- Unrelated protein

(pK7FWG2 – NAP), 3- NRP-B (YFP-NRP-B) e NRP-A (pK7WG2-NRP-A). As fotografias

foram tiradas cinco dias após a inoculação.

CONCLUSÕES

Os resultados demonstraram que a superexpressão do chaperone

molecular BiP confere resistência a estresses abióticos em plântulas de

soja, além de prevenir morte celular. Expressão ectópica de BiP em

plantas transgênicas diminuiu as lesões foliares necróticas induzidas por

tunicamicina, e manteve o turgor foliar em condições de desidratação

induzida por PEG, enquanto que as folhas controle murcharam

completamente sob as mesmas condições de desidratação. O teor

relativo de células mortas foi inferior em plantas transgênicas submetidas

aos estresses osmótico e do RE. Assim também superexpressão de BiP

protegeu o DNA genômico de degradação induzida pelos estresses

abióticos. O envolvimento de BiP na prevenção de morte celular foi

adicionalmente demonstrado por meio dos fenótipos desenvolvidos pela

expressão dos genes NRP-A e NRP-B, indutores de morte celular, em

folhas de tabaco transformadas com o gene soyBiPD nas orientações

senso e anti-senso. Expressão aumentada de BiP em plantas

transgênicas senso inibiu clorose induzida por NRP-A e NRP-B, enquanto

que inibição de BiP endógeno pela construção anti-senso acelerou o

processo de senescência. Embora experimentos adicionais serão

necessários para elucidar o mecanismo pelo qual BiP regula morte

celular, os resultados permitiram excluir as possibilidades que BiP esteja

atuando diretamente na regulação do estado redox sinalizador de morte

celular e em peroxidação de lipídeos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aharon R, Shahak Y, Wininger S, Bendov R, Kapulnik Y, Galili G. (2003).

Overexpression of a plasma membrane aquaporin in transgenic tobacco

improves plant vigor under favorable growth conditions but not under drought

or salt stress. The Plant Cell 15, 439–447.

Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M. (1997) Genes involved in

organ separation in Arabidopsis, An analysis of the cup-shaped cotyledon

mutant. Plant Cell 9:841–857.

Alvim FC, Carolino SMB, Cascardo JCM, Nunes CC, Martinez CA, Otoni WC,

Fontes EPB (2001) Enhanced accumulation of BiP in transgenic plants

confers tolerance to water stress. Plant Physiology 126: 1042-1054

Badawi G, Yamauchi Y, Kawano N, Tanaka K, Tanaka K (2004) Enhanced

tolerance to water deficit and high salt stress by overexpressing superoxide

dismutase and ascorbate peroxidase in tobacco chloroplasts. Plant and Cell

Physiology 45: S230-S230

Bartels D (2001) Targeting detoxification pathways: an efficient approach to

obtain plants with multiple stress tolerance? Trends in Plant Science 6: 284-

286

Bertolotti A, Zhang YH, Hendershot LM, Harding HP, Ron D (2000) Dynamic

interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response.

Nature Cell Biology 2: 326-332

Binsfeld, P.C (2000) Análise diagnóstica de um produto transgênico.

Biotecnologia v 34.

Bray E (1993) Molecular response to water deficit. Plant Physiology 103:1035-

1040

Breusegem FV, Dat JF (2006) Reactive Oxygen Species in Plant Cell Death.

Plant Physiology 141:384–390

Buzeli RAA, Cascardo JCM, Rodrigues LAZ, Andrade MO, Almeida RS,

Loureiro ME, Otoni WC, Fontes EPB (2002) Tissue-specific regulation of BiP

genes: a cis-acting regulatory domain is required for BiP promoter activity in

plant meristems. Plant Mol Biol 50, 757–771.

Calfon M, Zeng HQ, Urano F, Till JH, Hubbard SR, Harding HP, Clark SG,

Ron D (2002) IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity

by processing the XBP-1 mRNA. Nature 415: 92-96

Casolo V, Petrussa E, Krajnakova J, Macrı F and Vianello A (2005)

Involvement of the mitochondrial K1 ATP channel in H2O2- or NO-induced

programmed death of soybean suspension cell cultures. Journal of

Experimental Botany 56:997-1006

Chandler PM, Robertson M (1994) Gene expression regulated by abscisic acid

and its relation to stress tolerance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 45:

113-141

Che P, Gingerich DJ, Sonia L, Howell SH. (2002) Global and hormone-induced

gene expression changes during shoot development in Arabidopsis. Plant Cell

14:2771–2785.

Chen X, Shen J, Prywes R (2002) The luminal domain of ATF6 senses

endoplasmic reticulum (ER) stress and causes translocation of ATF6 from the

ER to the Golgi. Journal Of Biological Chemistry 277: 13045-13052

Chen G, Cizeau J, Velde CV, Park JH, Bozek G, Bolton J, Shi L, Dubik D,

Greenber A (1999) Nix and Nip3 Form a Subfamily of Pro-apoptotic

Mitochondrial Proteins. The Journal of Biology Chemistry. 277:1-10

Chichkova NV, Kim SH, Titova ES Kalkum M, Morozov VS, Rubtsov YP,

Kalinina NO, Taliansky ME and Vartapetian AB (2004) A plant caspase-like

protease activated during the hypersensitive response. The Plant Cell 16: 157-

171.

Collinge M, Boller T. (2001) Differential induction of two potato genes, Stprx2

and StNAC, in response to infection by Phytophthora infestans and to

wounding. Plant Mol Biol 46:521–9.

Cox JS, Walter P (1996) A novel mechanism for regulating activity of a

transcription factor that controls the unfolded protein response. Cell 87: 391-

404

Danon A, Delorme V, Mailhac N, Gallois P, (2000) Plant programmed cell

death: A common way to die. 38:647-655

Delauney AJ, Verma DP. (1985). Proline biosynthesis and osmoregulation in

plants. The Plant Journal 4, 215–223.

Denecke, J. (1996) Soluble endoplasmatic reticulum resident proteins and their

function in protein syntesis and transpot. Plant Physiol. Biochem., v.34, p.197-

205.

Denekamp M, Smeekens SC (2003) Integration of wounding and osmotic stress

signals determines the expression of the AtMYB102 transcription factor gene.

Plant Physiology 132: 1415-1423

Duval M, Hsieh T, Kim S, Thomas T (2002) Molecular characterization of

AtNAM: a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily. Plant

Molecular Biology 50: 237-248

Greenberg JT, (1996) Programmed cell death: A way of life for plants, PNAS

93:12094-12097

Ghoshroy S, Lartey R, Sheng JS, Citovsky V (1997) Transport of proteins and

nucleic acids through plasmodesmata. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol

48, 25–48.

Gorham J, Jones RGW, McDonnell E. (1985). Some mechanisms of salt

tolerance in crop plants. Plant and Soil 89, 15–40.

Greve K, La Cour T, Jensen MK, Poulsen FM, Skriver K. (2003) Interactions

between plant RING-H2 and plant-specific NAC (NAM/ATAF1/2/CUC2)

proteins: RING-H2 molecular specificity and cellular localization. Biochem J

371:97–108.

Gupta A, Heinen J, Holaday A, Burke J, Allen R (1993) Increased resistance to

oxidative stress in transgenic plants that overexpress chloroplastic Cu/Zn

superoxide-dismutase. Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America 90: 1629-1633

Haas, I.G.; Meo, T. (1988) cDNA cloning of the immunoglobulin heavy chain

binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., . v.85, p. 2250-2254.

Hammond C, Helenius A. (1995) Quality control in the secretory pathway. Curr.

Opin. Cell Biol., 7, 523-529.

Harding HP, Zhang YH, Bertolotti A, Zeng HQ, Ron D (2000) Perk is essential

for translational regulation and cell survival during the unfolded protein

response. Molecular Cell 5: 897-904

Haze K, Yoshida H, Yanagi H, Yura T, Mori K (1999) Mammalian transcription

factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by

proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Molecular Biology Of

The Cell 10: 3787-3799

Hegedus D, Yu M, Baldwin D, Gruber M, Sharpe A, Parkin I, et al., (2003)

Molecular characterization of Brassica napus NAC domain transcriptional

activators induced in response to biotic and abiotic stress. Plant Mol

Biol;53:383–397.

Hsieh T, Lee J, Charng Y, Chan M (2002) Tomato plants ectopically expressing

Arabidopsis CBF1 show enhanced resistance to water deficit stress. Plant

Physiology 130: 618-626

Hollien J, Weissman JS (2006) Decay of endoplasmic reticulum-localized

mRNAs during the unfolded protein response. Science 313: 104-107

Houde M, Belcaid M, Ouellet F, Danyluk J, Monroy AF, Dryanova A, Gulick

P, Bergeron A, Laroche A, Links MG, MacCarthy L, Crosby WL and

Sarhan F, (2006) Wheat EST resources for functional genomics of abiotic

stress. BMC Genomic, 7:149.

Hu CAA, Delauney AJ, Verma DPS (1992) A Bifunctional Enzyme (Delta-1-

Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase) Catalyzes The 1st 2 Steps In Proline

Biosynthesis In Plants. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of

The United States Of America 89: 9354-9358

Hu X , Zhang A , Zhang J, Jiang M (2006) Abscisic Acid is a Key Inducer of

Hydrogen Peroxide Production in Leaves of Maize Plants Exposed to Water

Stress Plant Cell Physiol. 47: 1484–1495

Irsigler AST, Costa MDL, Zhang P, Braga PA, Dewey RE, Boston RS, Fontes

EPB (2007) Transcriptional profiling reveals integration of ER- and osmotic-

stress pathways. BMC Genomics (enviado para publicação).

Iwata Y, Koizumi N (2005) An Arabidopsis transcription factor, AtbZIP60,

regulates the endoplasmic reticulum stress response in a manner unique to

plants. Proc Natl Acad Sci USA 102, 5280–5285.

Jaglo-Ottosen K, Gilmour S, Zarka D, Schabenberger O, Thomashow M

(1998) Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances

freezing tolerance. Science 280: 104-106

Jelitto-Van Dooren EPWM, Vidal S & Denecke J (1999) Anticipating

endoplasmic reticulum stress: a novel early response before pathgenesis-

related gene induction. Plant Cell 11, 1935–1943.

John I, Hackett R, Cooper W, Drake R, Farrell A, Grierson D (1997) Cloning

and characterization of tomato leaf senescence-related cDNAs. Plant

Molecular Biology 33: 641-651

Jones, A. (2000). Does the plant mitochondrion integrate cellular stress

andregulate programmed cell death? Trends Plant Sci. 5, 225-230.

Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1999)

Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a

single stress-inducible transcription factor. Nature Biotechnology 17: 287-291

Knarr, G.; Gething, M.J.; Modrow, S.; Buchner, J. (2002) BiP-binding

sequences in antibodies. J. Biol. Chem., v.270, p. 27589-27594

Kozutsumi Y, Segal M, Normington K, Gething MJ, Sambrook J (1988) The

Presence Of Malfolded Proteins In The Endoplasmic-Reticulum Signals The

Induction Of Glucose-Regulated Proteins. Nature 332: 462-464

Kreps JA, Wu YJ, Chang HS, Zhu T, Wang X, Harper JF (2002) Transcriptome

changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress. Plant

Physiology 130: 2129-2141

Leborgne-Castel N, Jelitto-Van Dooren E, Crofts AJ, Denecke J (1999)

Overexpression of BiP in tobacco alleviates endoplasmic reticulum stress.

Plant Cell 11: 459-469

Lemasters JL. (1999). Mechanisms of hepatic toxicity. V. Necrapoptosis and

mitochondrial permeability transition: shared pathways to necrosis and

apoptosis. American Journal of Physiology 276, G1–6.

Liu CY, Wong HN, Schauerte JA, Kaufman RJ (2002) The protein

kinase/endoribonuclease IRE1 alpha that signals the unfolded protein

response has a luminal N-terminal ligand-independent dimerization domain.

Journal Of Biological Chemistry 277: 18346-18356

Liu, S.Y.; Kaufman, (2003)R.J. The unfolded protein response. Cell science, v.

116, p. 1861-1862.

Ludwig A, Tenhaken R (2000) Defence gene expression in soybean is linked to

the status of the cell death program. Plant Molecular Biology 44: 209–218

Ludwig AA, Tenhaken R, (2001). A new cell wall located N-rich protein is

strongly induced during the hypersensitive response in Glycine max L.

European Journal of Plant Pathology. 107:323-336.

Mahajan S and Tuteja N (2005) Cold, salinity and drought stresses: An

overview. Archives Of Biochemistry And Biophysics. 444: 139-158

McKay, D.B. (1993) Structure and mechanism of 70-kDA heat-shock-related

proteins. Adv Prot. Chem., v. 44, p. 67-80.

Morishina N, Nakanishi K, Takenouchi H, Shibata T, Yasuhiko Y, (2002) An

endoplasmic reticulum stress-specific caspase cascade in apoptosis.

Cytochrome c-independent activation of caspase-9 by caspase-12. J Biol

Chem 277: 34287-94.

O’Brien IEW, Baguley BC, Murray BG, Morris BAM and Ferguson IB (1998).

Early stages of the apoptotic pathway in plants are reversible. The Plant

Journal. 13 (6), 803-814.

Oda Y, Hosokawa N, Wada I, (2003) Nagata K. Edem as an acceptor of

terminally misfolded glycoproteins released from calnexin. Science, v.299,

p.1394-1397.

Okamura K, Kimata Y, Higashio H, Tsuru A, Kohno K (2000) Dissociation of

Kar2p/BiP from an ER sensory molecule, Ire1p, triggers the unfolded protein

response in yeast. Biochemical And Biophysical Research Communications

279: 445-450

Olsen AN, Ernst HA, Lo Leggio L, Skriver K (2005) NAC transcription factors:

structurally distinct, functionally diverse. Trends In Plant Science 10: 79-87

Ooka H, Satoh K, Doi K, Nagata T, Otomo Y, et al. (2003) Comprehensive

analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana. DNA

Res 10: 239–247.

Orrenius S, Zhivotovsky B and Nicotera P (2003) Regulation of cell death: the

calcium-apoptosis link. Nature 4:

Palavan-Unsal N, Buyuktuncer E and Tufekci MA (2005) Programed cell death

in plants. Journal of Cell and Molecular Biology 4: 9-23

Pelham HRB. (1989) Control of protein exit from the endoplasmic reticulum.

Annu. Rev. Cell Biol., 5, 1-23.

Pennell RI and Lamb C (1997) Programmed cell death in plants. Plant Cell, 9,

1157-1168.

Pérez-Alfocea F, Estan˜ MT, Caro M, Guerrier G. 1993. Osmotic adjustment in

Lycopersicon esculentum and L. pennellii under NaCl and polyethylene glycol

6000 iso-osmotic stresses. Physiologia Plantarum 25, 493–498.

Pilon M.; Shechekman R. (1999) Protein translocation: how Hsp 70 pulss it off.

Cell, V.7, p. 679-682.

Rao RV, Castro-Obregon S, Frankowski H, Schuler M, Stoka V, Rio G,

Bredesen DE and Ellerby HM (2002) Coupling Endoplasmatic reticulum

stress to the cell death program. Journal of Biology Chemistry 244:21826-

21842.

Ren T, Qu F, Morris TJ. HRT (2000) Gene function requires interaction between

a NAC protein and viral capsid protein to confer resistance to turnip crinkle

virus. Plant Cell 12:1917–25.

Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang C, Keddie J, Adam L,

Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR, Creelman R, Pilgrim M, Broun P,

Zhang JZ, Ghandehari D, Sherman BK, Yu G. (2000). Arabidopsis

transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes.

Science. 15;290(5499):2105-10

Rodrigues SM, Andrade MO, Gomes APS, DaMatta FM, Baracat-Pereira MC,

Fontes EPB (2006) Arabidopsis and tobacco plants ectopically expressing the

soybean antiquitin-like ALDH7 gene display enhanced tolerance to drought,

salinity, and oxidative stress. Journal Of Experimental Botany 57: 1909-1918

Ron D and Walter P (2007) Signal integration in the endoplasmatic reticulum

unfolded protein response. Nature Reviews (Molecular cell biology)

Ruiz-Medrano R, Xoconostle-Cazares B, Lucas WJ. (1999) Phloem long-

distance transport of CmNACP mRNA: Implications for supracellular

regulation in plants. Development 126:4405-4419.

Selth LA, Dogra SC, Rasheed MS, Healy H, Randles JW, Rezaiana MA.

(2005) A NAC domain protein interacts with tomato leaf curl virus replication

accessory protein and enhances viral replication. Plant Cell 17:311–325.

Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. (2000). Molecular response to

dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two

stress signalling pathways. Current Opinion in Plant Biology 3, 217±223.

Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. (2006). Transcriptional Regulatory

Networks in Cellular Responses and Tolerance to Dehydration and Cold

Stresses Annu. Rev. Plant Biol. 57:781–803

Shirasu K, Nakajima H, Krishnamachari-Rajasekhar VK, Dixon RA and

Lamb C (1997) Salicylic acid potentiates an agonist-dependent gain control

that amplifies pathogen signals in the activation of defense mechanisms. Plant

Cell 9: 261–270

Sitia R, Braakman I (2003) Quality control in the endoplasmic reticulum protein

factory. Nature 426

Solomon M, Belengui B, Delledonne M, Menachem E and Levine A (1999)

The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the

regulation of programmed cell death in plants

Tenhaken R, Doerks T, Bork. P, (2005) DCD – a novel plant specific domain in

proteins involved in development and programmed cell death. BMC

Bioinformatics. 6:169

Tran LP, Nakashima K, Sakuma Y, Simpson SD, Fujita Y, Maruyama K, et al.,

(2004) Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC

transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early

responsive to dehydration stress 1 promoter. Plant Cell 16:2481–2497.

Travers KJ, Patil CK, Wodicka L, Lockhart DJ, Weissman JS, Walter P

(2000) Functional and genomic analyses reveal an essential coordination

between the unfolded protein response and ER-associated degradation. Cell

101: 249-258

Tsujimoto Y, Shimizu S (2000) Bcl-2 family: life-or-death switch. FEBS Letters

466, 6–10.

Ueda A, Kathiresan A, Mayumi I, Narita Y, Nakamura T, Shi W, Tetsuko T

and Bennett J (2004) Osmotic stress in Barley regulates expression of a

different set of genes than salt stress does. Journal of Experimental Botany

55:2213-2218.

Urade R (2007) Cellular response to unfolded proteins in the endoplasmatic

reticulum of plants. FEBS Journal

Vaux DL. (1993) Toward an understanding of the molecular mechanisms of

physiological cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 786–789.

Xu C, Bailly-Maitre B and Reed JC (2005) Endoplasmatic reticulum stress: cell

life and death decisions.The journal of clinical investigation 115: 2656-2664

Wang S, Narenda S and Fedoroff N (2007) Heterotrimeric G protein signaling in

the Arabidopsis unfolded protein response. PNAS 104:3817-3822

Weir I, Lu J, Cook H, Causier B, Schwarz-Sommer Z, Davies B. (2004)

CUPULIFORMIS establishes lateral organ boundaries in Antirrhinum.

Development 131:915–922.

Wertz IE and Hanley MR (1996) Diverse molecular provocation of programmed

cell death. Trend Biochem. Sci. 21,359-364

Yanjun, M; Hendershot, L. M, (2003) ER chaperone functions during normal

and estresse conditions. Journal of Chem. Neuroanatomy, p. 1-13.

Xie Q, Sanz-Burgos AP, Guo H, Garcia JA, Gutierrez C. (1999). GRAB

proteins, novel members of the NAC domain family, isolated by their

interaction with a geminivirus protein. Plant Mol Biol. Mar; 39 4:647-56.

Xie Q, Frugis G, Colgan D, Chua NH (2000) Arabidopsis NAC1 transduces

auxin signal posterior of TIR1 to promote lateral root development. Genes &

Development 14: 3024-3036

Xiong L and Zhu JK (2002) Molecular and Genetic aspects of plant response to

osmotic stress. Plant Cell Environ. 25:131-139.

Yeo AR, Lee KS, Izard P, Boursier PJ, Flowers TJ. 1991. Shortand long-term

effects of salinity on leaf growth in rice (Oryza sativa L.). Journal of

Experimental Botany 25, 881–889.

Zhang K, Kaufman RJ (2004) Signaling the Unfolded Protein Response from the

Endoplasmatic Reticulum. The Journal of Biology Chemistry v279, nº25

25935-25938

Zhu J (2001) Plant salt tolerance. Trends in Plant Science 6: 66-71

Zuppini A, Navazio L and Mariani P (2004) Endoplasmatic Reticulum stress-

induced programmed cell death in soybean cells. Journal of Cell Science 117:

2591-2598.

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