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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIENCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÃNICA
CONSTITUINTES QUÍMICOS E A ATIVIDADE BIOLÓGICA DE
Eupatorium macrocephalum Less (Astearaceae) e Annona dióica St.
HILL (Annonaceae):
UMA CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DE PLANTAS MEDICINAIS
NO PARAGUAY
MARIA RAQUEL GARCIA VEGA
Sob orientação do professor
Raimundo Braz-Filho
e co-orientação do Professor
Mario Geraldo de Carvalho
Seropédica, RJ
Março de 2007
Tese submetida como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Ciências, no
Programa de Pós -
graduação em Química
Orgânica. Área de concentração Produtos
Naturais.
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2
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIENCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÃNICA
MARIA RAQUEL GARCIA VEGA
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências,
no Curso de Pós-graduação em Química Orgânica, área de concentração em Produtos
Naturais.
TESE APROVADA EM 19/03/2007
Prof. Dr. Raimundo Braz-Filho (Orientador)
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Mario G. de Carvalho (Co-Orientador-Presidente)
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Ivo José Curcino Vieira ( LCQ-CCT-UENF)
______________________________________________________________________
Prof. Profa. Dra. Maria Auxiliadora Coelho Kaplan (NPPN-UFRJ)
______________________________________________________________________
Prof. Dr. Victor Marcos Rumjanek (DEQUIM-UFRRJ)
______________________________________________________________________
Profa. Dra. Heloisda de Mello (UFS-Itabaiana –Núcleo de Química)
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3
FICHA CATALOGRAFICA
Vega, Maria Raquel Garcia.
Constituintes químicos de Eupatorium macrocephalum Less e Annona dioica:
Uma contribuição ao estudo de plantas medicinais no Paraguai.
Seropédica. Rio de Janeiro. Instituto de Ciências Exatas. 2007.
Tese de Doutorado
Orientadores:
Prof. Dr. Raimundo Braz-Filho
Prof. Dr. Mário Geraldo de Carvalho
Instituição:
Universidade Federal do Rio de Janeiro (ICE-DQ)
4
Os químicos são uma estranha classe de mortais, impelidos por um impulso
quase insano a procurar seus prazeres em meio a fumaça e vapor, fuligem e
chamas, venenos e pobreza e, no entanto, entre todos esses males, tenho a
impressão de viver tão agradavelmente que preferiria morrer a trocar de
lugar com o rei da Pérsia.........
J. J. Becher, Physica subterrânea (1667)
5
Aos meus pais Beto e Agripina
exemplos de amor, desprendimento e perseverança
Todo meu tributo e reconhecimento
Á luz que ilumina meus dias:
Á luz que ilumina meus dias:Á luz que ilumina meus dias:
Á luz que ilumina meus dias:
Ana Victória , Ernesto José e Luciano
Ana Victória , Ernesto José e LucianoAna Victória , Ernesto José e Luciano
Ana Victória , Ernesto José e Luciano
6
AGRADECIMENTOS
- Aos Professores Dr. Raimundo Braz-Filho e Dr. Mário G. de Carvalho, pela
orientação amizade e ensinamentos fundamentais à minha formação.
- À Professora Dra. Áurea Echevarria, grande ser humano, pelo auxílio e incentivo
constantes, pela valiosa amizade e também pela realização de testes biológicos junto
com a Dra. Andressa Esteves.
- Ao Professor Marcor Eberlin (UNICAMP) pela obtenção de espectros de massas de
alta resolução.
- Ao Professor Edilberto e o técnico Daniel (CENAUREMN – UFC) pela obtenção de
espectros RMN 500 MHz.
- À Professora Claudia do Ó Pessoa (Laboratório de Oncologia Experimental - UFC) e
sua equipe pela realização de testes biológicos.
- Aos Professores Ivo J. Curcino e Leda Mathias (UENF) pelo incentivo, amizade e pela
acolhida no laboratório.
- À Professora Dra. Annelise Wilken do curso Farmácia (FMC) pelo incentivo e
confiança.
- À todo o corpo docente da PPGQO da UFRRJ pelos ensinamentos e agradável
convivência que muito acrescentaram na minha formação.
- A todos os técnicos do ICE-UFRRJ, Osmar, Renato, Francis, Eli, Carlão, Áurea
Tatagiba (in memorian), Conceição, Fábio, Rui, Rogéria, Mauricio e Aldir.
- Aos alunos de Iniciação cientifica Sandro Sant’Anna (UFRRJ) e Marcelo de Araújo
(UENF) que me acompanharam durante a realização deste trabalho.
- Aos colegas de laboratório da Rural, Cássia, Bia, Patrícia, Lucinha e Tania
- Aos colegas do Laboratório da UENF, Marcelo, Vinicius, Lara, Ju, Priscila, Devora,
Adriana pela amizade e agradável convivência.
- Aos amigos e alunos do curso de Farmácia, Inácio, Marquinhos, Rhamon e Anna
Joyce pela amizade e confiança.
- Aos colegas e amigos pós - graduação da Rural, Heloísa, Marcinha, Edson, Miguel,
Javier, Tânia, Rosane,André, Andressa e Geisi Jane.
- Aos amigos do alojamento da Ecologia a todos sem exceção.
- A Maronsi, Denise, Jamil e o Valdo que me fizeram sentir parte da familia aliviando,
confortando e dando forças para meu caminhar.
- Aos amigos Ricardinho e Claudia pelo auxilio no cuidado das crianças.
7
- Aos amigos da UENF, Carlos, Arnoldo e Ana, Fabinho, Cláudio e Lia, pelo carinho e
estimulo sempre.
- E por fim a minha familia, Beto, Agripina, Marilen, Alberto, Jorge, Karen, Jorgito,
Fabrício, Anna Paula e Guadalupe, pelo apoio e compreensão que fizeram possível este
trabalho.
- Ao meu companheiro Luciano, pelas sugestões e paciência durante a realização de
todo o trabalho.
- A TODOS os que acreditaram, torceram, e colaboraram de alguma maneira para que
este trabalho seja possível:
MUITO OBRIGADA....
MUCHAS GRACIAS...
AGUIJE..!!
8
SUMÁRIO pág.
INDICE GERAL IX
INDICE DE ESQUEMAS FIGURAS E TABELAS XI
ABREVIATURAS E SIMBOLOS XVII
RESUMO XIX
ABSTRACT XX
SUBSTÂNCIAS NATURAIS ISOLADAS NESTE TRABALHO XXI
DERIVADOS OBTIDOS NESTE TRABALHO XXIV
9
INDICE GERAL Página
1. Introdução 1
1.1. A Diversidade biológica no Paraguai 3
1.2 Plantas medicinais no Paraguai 6
2. Objetivos 9
3. Plantas estudadas 10
3.1 Eupatorium macrocephalum Less
3.1.1 Aspectos botânicos 10
3.1.2 A química do gênero Eupatorium 12
3.1.3 Constituintes químicos isolados 15
3.2 Annona dioica
3.2.1 Aspectos botânicos 17
3.2.2 A química do gênero Annona 19
3.2.3 Constituintes químicos isolados 25
4. Parte experimental
4.1 Equipamentos e reagentes 27
4.2 Acetilação com anidrido acético e piridina 28
4.3 Isolamento e purificação dos constituintes químicos de Eupatorium
macrocephalum Less – Coleta e obtenção de extratos 28
4.3.1 Parte aére (caule+folhas) 29
4.3.2 Flores 30
4.4 Isolamento e purificação dos constituintes químicos de Annona dióica St Hill
– Coleta e obtenção de extratos 33
4.4.1 Folhas 33
4.4.2 Raiz 33
5. Resultados e Discussão – PARTE A
5.1 Determinação estrutural dos constituintes de Eupatorium macrocephalum
Less
5.1.1 Triterpenos 39
5.1.2 Esteroides e Saponinas esteroidais 56
5.1.3 Diterpeno 67
5.1.4 Derivados do Ácido cinâmico 79
5.1.5 Flavonóide 95
10
5.2 Resultados e Discussão – PARTE B
5.2.1 Determinação estrutural dos constituintes químicos de
Annona dioica St. Hill
5.2.1 Flavonóides 102
5.2.2 Acetogeninas 124
6. Testes biológicos
6.1 Avaliação de Citotoxicidade frente à Artemia salina Leach 148
6.2 Avaliação de Citotoxicidade frente ao carcinoma de Erhlich 150
6.3 Avaliação inibição da enzima humana DNA-Topoisomerase II 152
6.4 Triagem para avaliação da atividade antitumoral nas linhagens celulares
[MDA-MB435 (mama), HL-60 (leucemia) e SF295 (cérebro)] 155
7. Conclusões 157
8. Referências 158
11
INDICE DE ESQUEMAS FIGURAS E TABELAS. Pág.
ESQUEMAS e QUADROS
Quadro 1 8
Esquema 1 32
Esquema 2 36
Esquema 3 37
FIGURAS
Figura 1: Mapa eco-regiões 5
Figura 2: Mapa área compreendida pela Mata atlântica 4
Figura 3: Utensílios usados na preparação do tereré 7
Figura 4: Distribuição do gênero Eupatorium no Paraguai 11
Figura 5: Distribuição do gênero Annona no Paraguai 19
Figura 6a: Espectro de IV da substância 16 42
Figura 6b: Espectro RMN
1
H (200 MHz) da substância 16 43
Figura 6c: Espectro RMN
13
C (50 MHz) da substância 16 44
Figura 6d: Espectro de IV da substância 15 42
Figura 6e: Espectro de RMN de
1
H (200 MHz) da substância 15 45
Figura 6f: Espectro de RMN de
13
C (50 MHz) da substância 15 45
Figura 7a: Espectro de IV da substância 17 47
Figura 7b: Espectro de IV da substância 18 47
Figura 7c: Espectro RMN
1
H (200 MHz) da substância 17 48
Figura 7d: Espectro RMN
1
H (200 MHz) da substância 18 48
Figura 7e: Espectro RMN
13
C (75 MHz) das substâncias 17 e 18 52
Figura 8a: CG da fração contendo as substâncias 16, 19 e 20 52
Figura 8b: Espectro de massas para a substância 19 52
Figura 8c: Espectro de massas para a substância 20 52
Figura 8d: RMN
1
H (400 MHz) das substâncias 16, 19 e 20 52
Figura 8d: Espectro de RMN
13
C (100 MHz) e expansão
13
C-APT
para as substâncias 16, 19 e 20 53
Figura 9a: Espectro de IV da substância 9 61
Figura 9b: Espectro de RMN
1
H (200 MHz, CDCl
3
) da substância 9 61
Figura 9c: Espectro de RMN
13
C(50 MHz, CDCl
3
) da substância 9 62
12
Figura 10a: Espectro de IV da mistura de 10 e 11 63
Figura 10b: Espectro de RMN
1
H (200 MHz, CDCl
3
) e
13
C
da mistura de 10 e 11 63
Figura 11a: Espectro de IV para 12+14 64
Figura 11b: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) para 12 + 14
64
Figura 11c: Espectro RMN
13
C (100 MHz, CDCl
3
) para 12+14 65
Figura 12a: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) para 13 66
Figura 12b: Espectro de RMN
13
C (100 MHz, CDCl
3
) para 13 66
Figura 14b: Espectro de RMN
1
H-
1
H-COSY (400 MHz, MeOD) de 1 55
Figura 13a: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD) para 1 70
Figura 13b: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD+piridina) para 1 71
Figura 13c: Expansão do espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD) para 1 72
Figura 13e: Expansão do espectro de RMN HMQC (400 MHz, MeOD) de 1. 73
Figura 14a: Espectro de RMN HMBC (400 MHz, MeOD) de 1 75
Figura 15a: Modelos da literatura utilizados para a comparação de dados
e atribuição dos δc para as substâncias 3,4 e 5 80
Figura 15b: Cromatograma obtido para a amostra contendo 3, 4 e 5 84
Figura 15c: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD) para 3, 4 e 5 85
Figura 15d: Expansão do espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD)
para as substâncias 3, 4 e 5 86
Figura 15e: Expansão do espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD)
para 3, 4 e 5. 86
Figura 15f: Espectro de RMN
13
C para a amostra contendo 3, 4 e 5 87
Figura 16a: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD) para 6-8 88
Figura 16b: Expansão do espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD)
para 6-8 89
Figura 16c: Expansão do espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD)
para 6-8 89
Figura 16d: Espectro de RMN
13
C-APT para 6-8 90
Figura 16e: Espectro RMN HMQC para 6-8 91
Figura 16f: Espectro RMN HMBC para 6-8 92
Figura 16h: Espectro de RMN
1
H-
1
H-COSY e
1
H-
1
H-NOESY
para as substância 6, 7 e 8 93
13
Figura 17 a: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, DMSO-d
6
)
para o flavonóide 22 97
Figura 17 b: Expansão da região de hidrogênios aromáticos
no espectro de RMN
1
H (400 MHz, DMSO-d
6
) para o flavonóide 22 98
Figura 17 c: Espectro de RMN
1
H-
1
H-NOESY (400 MHz, DMSO-d
6
)
na região dos sinais das metoxilas para o flavonóide 22 99
Figura 17d: Espectro de RMN
13
C (100 MHz, MeOD) para o 22. 100
Figura 18a: Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, MeOD) do flavonóide 21
106
Figura 18b: Expansão do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, MeOD)
do flavonóide 21 106
Figura 18c: Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, MeOD) do flavonóide 21 107
Figura 19a: Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, acetona-d
6
) do flavonóide 21 109
Figura 19b: Expansão do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, acetona-d
6
)
do flavonóide 21 109
Figura 19c: Expansões do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, acetona-d
6
)
para o flavonóide 22 110
Figura 19d: Expansão do espectro RMN de
1
H-
1
H NOESY (400 MHz, acetona-d
6
)
para o flavonóide 22 111
Figura 19e: Expansão do espectro RMN de
1
H-
1
H COSY (400 MHz, acetona-d
6
) do
flavonóide 22 112
Figura 19f: Expansão do espectro RMN de
1
H-
1
H COSY (400 MHz, acetona-d
6
)
do flavonóide 22 112
Figura 20a: Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, acetona-d
6
) do flavonóide 22 113
Figura 20b: Espectro de RMN
13
C - APT (100 MHz, acetona-d
6
) do flavonóide 22 113
Figura 20c: Expansão do espectro bidimensional de correlação heteronuclear
RMN
1
H -
13
C - HMBC (100 MHz, acetona-d
6
) do flavonóide 22 114
Figura 20d: Expansão do espectro bidimensional RMN
1
H -
13
C - HMBC
(100 MHz, acetona-d
6
) do flavonóide 22 115
Figura 20e: Expansão do espectro bidimensional RMN
1
H -
13
C - HMQC
(100 MHz, acetona-d
6
) do flavonóide 22 115
Figura 21a: Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, MeOD) do flavonóide 23 117
Figura 21b: Expansão do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, MeOD)
do flavonóide 23 117
14
Figura 21c: Expansão do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, MeOD)
do flavonóide 23 118
Figura 21d: Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, MeOD) do flavonóide 23 118
Figura 22a: Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, MeOD) do flavonóide 24
120
Figura 22b: Expansão do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, MeOD) de 24 120
Figura 22c: Expansão do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, MeOD)
do flavonóide 24 121
Figura 22d: Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, MeOD) do flavonóide 24 121
Figura 22e: Expansão do espectro bidimensional de RMN
1
H -
13
C – HMBC
(100 MHz, MeOD) do flavonóide 24 122
Figura 22f: Expansão do espectro bidimensional de RMN
1
H -
13
C - HMQC (100 MHz,
MeOD) do flavonóide 24 123
Figura 23: Modelos usados na comparação de dados da literatura para determinação
estrutural e configuração relativa dos Fragmentos A e B de acetogeninas 128
Figura 24: Proposta de estereoquímica relativa para as acetogeninas isoladas 129
Figura 25a: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) das acetogeninas 27 + 28. 133
Figura 25b: Espectro de RMN
1
H (500 MHz, piridina-d
5
) das acetogeninas 27 + 28
133
Figura 25c: Expansões do espectro de RMN
1
H -1H COSY (500 MHz, piridina-d
5
) das
acetogeninas 27 + 28 134
Figura 25d: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) do derivado acetilado
das acetogeninas 27 + 28. 135
Figura 26a: Espectro de RMN
13
C -APT (100 MHz, CDCl
3
) das acetogeninas 27 + 28
135
Figura 26b: Expansões do espectro de RMN
13
C (400 MHz, CDCl
3
) das acetogeninas
27 + 28 na região correspondente ao Fragmento B. 136
Figura 26b: Expansões do espectro de RMN
13
C (400 MHz, CDCl
3
) das acetogeninas
27 + 28 na região correspondente ao Fragmento A. 136
Figura 26c: Espectro de RMN
13
C total (125 MHz, piridina-d
5
) das acetogeninas
27 + 28 e expansão para a região referente ao fragmento A. 137
Figura 27a: Espectro de massas obtido por inserção direta das acetogeninas 27+28 138
Figura 27b: Espectro de massas ES-EM das acetogeninas 27 e 28 138
Figura 27c: Proposta de fragmentação de massas para as acetogeninas 27 e 28 139
15
Figura 28a: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) da acetogenina 28 140
Figura 28b:Espectro de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) do derivado acetilado 28Ac. 140
Figura 28c: Espectro de RMN
13
C – APT (100 MHz, CDCl
3
) da acetogenina 28
141
Figura 28d: Espectro de RMN
13
C –APT (100 MHz, CDCl
3
) do derivado
acetilado 28Ac. 141
Figura 28e: Espectro de RMN HMQC (400 MHz, CDCl
3
) e expansão do espectro
de RMN HMQC (400 MHz, CDCl
3
) da acetogenina 28 142
Figura 30a: Espectro de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) dos esteroides 25 e 26 145
Figura 30b: Espectro de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) do esteroide 29 145
Figura 30c: Espectro de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) do esteroide 29 146
Figure 31. Atividade antiproliferativa dose-dependente dos flavonóides 21, 22 e 23 na
cultura de células do carcinoma de Ehrlich. 151
Figura 32: Atividade dos flavonóides sobre o DNA-topoisomerase -Topo I 153
Figura 33: Atividade dos flavonóides sobre DNA-topoisomerase - Topo II-a 2 154
TABELAS
Tabela 1: Espécies do gênero Annona estudadas quimicamente e classe
de compostos isolados 23
Tabela 2: Dados de RMN de
1
H (200 MHz) e
13
C (50 MHz)
das substâncias 15 e 16 em CDCl
3
41
Tabela 3: Dados de RMN de
1
H ( 200 MHz) e
13
C ( 50 MHz) das
substâncias 18 e 17 em CDCl
3
46
Tabela 4: Dados de RMN de
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz)
das substâncias 19 e 20 em CDCl
3
51
Tabela 5: Dados de RMN
13
C (50 MHz, CDCl
3
) para as
substâncias 9, 10 e 11 57
Tabela 6: Dados de RMN
13
C (100 MHz, CDCl
3
) para as
saponinas esteroidais 12, 13 e 14. 60
Tabela 7: Dados de RMN uni e bidimensionais de
1
H (400 MHz) e
13
C
(100 MHz, MeOD e MeOD+Piridina) do diterpeno 1 69
Tabela 8: Dados RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em MeOD
para as substâncias 3, 4 e 5 80
Tabela 9: Dados de RMN uni e bidimensionais
1
H (400MHz, MeOD) e
16
13
C (100 MHz) dos compostos 6, 7 e 8 83
Tabela 10: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz)
em DMSO-d
6
obtidos para o flavonóide 22. 96
Tabela 11: Dados de RMN
13
C (100 MHz, MeOD e Acetona-d
6
) dos
Flavonóides 21 – 24 104
Tabela 12: Dados de RMN
1
H e 13 C (400 e 100 MHz, MeOD)
para o flavonóide 21 105
Tabela 13: Dados de RMN
1
H e
13
C (400 MHz e 100 MHz, Acetona-d
6
)
para 22 108
Tabela 14: Dados de RMN
1
H e 13 C (400 e 100 MHz, MeOD)
para o flavonóide 23 116
Tabela 15: Dados de RMN
1
H e 13 C (400 e 100 MHz, MeOD)
para o flavonóide 24 119
Tabela 16: Dados de RMN de
1
H e
13
C (500 MHz e 125.75 MHz, CDCl
3
) dos modelos
utilizados para comparação dos valores de δ de acetogeninas. 128
Tabela 17: Dados de RMN
1
H e
13
C (400 MHz e 100 MHz, CDCl
3
)
das acetogeninas 27, 28 129
Tabela 18: Dados de RMN
1
H e
13
C (400 MHz e 100 MHz, CDCl
3
)
das acetogeninas 27 e 28 130
Tabela 19: Dados de RMN de
1
H e
13
C (500 MHz, 125 MHz, piridina-d
5
)
das ACGs 27 +28 131
Tabela 20: Dados de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
)e
13
C (100 MHz, CDCl
3
) das 28 e
seu derivado acetilado 28ac 132
Tabela 21: dados de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) e
13
C (100 MHz, CDCl
3
)
do esteroide 29 144
Tabela 22: Resultados obtidos no ensaio de citotoxicidade com
Artemia salina Leach 149
Tabela 23 : Valores de IC
50
(µM and ng/mL) para os flavonóides 21-24 e a fração FF
contra células do carcinoma de Erhlich. 151
17
ABREVIATURAS E SIMBOLOS
M
+
Pico do íon molecular
δ Deslocamento químico (ppm)
Ac Acetila
AcOEt Acetato de etila
aq aquoso
APT Attached Próton Test
CC Cromatografia em coluna
CCF Cromatografia em camada fina
CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica
CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa
CG-EM Cromatografia em fase Gasosa acoplada ao Espectrômetro de
Massas
COLOC Correlation spectroscopy Long-range Couplings
COSY Correlated spectroscopy
d dupleto
dd duplo dupleto
dl dupleto largo
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO
d6
Dimetilsulfóxido deuterado
EM Espectroscopia de Massas
EMAR Espectroscopia de Massas de Alta Resolução
HBBD Hydrogen Broad Band Decouplet
HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence
Hz Hz
IV Infravermelho
J Constante de acoplamento em Hertz
m Multipleto
m/z Relação massa/carga
MeOH Metanol
MHz Mega Hertz
18
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NOE Nuclear Overhauser Effect
NOESY Nuclear Overhauser Effect Correlation Spectroscopy
PND Proton Noise Decoupling
q quarteto
RMN
1
H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN
13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
s simpleto
sl simpleto largo
t tripleto
OBS: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constan nesta
relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas
universalmente.
19
Título: CONSTITUINTES QUÍMICOS E A ATIVIDADE BIOLÓGICA DE
Eupatorium macrocephalum Less (Astearaceae) e Annona dióica St. HILL
(Annonaceae): UMA CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DE PLANTAS MEDICINAIS
NO PARAGUAY
Resumo
Eupatorium macrocephalum Less (Asteraceae) e Annona dioica (Annonaceae) são
arbustos de grande dispersão na América do Sul e largamente usados na medicina
popular no Paraguai. O presente trabalho relata o estudo químico de extratos de
Eupatorium macrocephalum Less. (coletada no Dpto. Central Paraguay) que levou ao
isolamento e identificação de vinte substâncias; seis triterpenos: acetato de lupeoila e
lupeol (constituintes majoritários), taraxasterol e acetato de taraxasterila alem de α- e β-
amirina; seis esteróides: estigmasterol, sitosterol, epinasterol, 3-O-β-D-glicopiranosil
estigmasterol, 3-O-β-D-glicopiranosil epinasterol e 3-O-β-D-glicopiranosil sitosterol;
um diterpeno: (-) 9,15-diidroxicauran-19-ato de β-D-glicopiranosila; um flavonóide:
3’,4’,5-triidroxi-6,7-dimetoxiflavona e seis derivados do ácido cinâmico.
Estudo químico do extrato metanólico das folhas de um espécime de Annona dioica
coletada no cerrado de Horqueta (Dpto. de Concepción, Paraguay) conduziu ao
isolamento e à identificação de nove substâncias; quatro flavonóides: canferol, 3-O-
[3”,6”-di-O-p-hidroxicinamoil]-β-galactopiranosil-canferol, 6”-O-p-hidroxicinamoil-β-
D-galactopiranosil-canferol e 3-O-β-D-galactopiranosil-canferol; além da mistura de
sitosterol + estigmasterol e do 3-O-β-D-glicopiranosil sitosterol. Do extrato em
clorofórmio das raízes obteve-se duas acetogeninas sendo uma delas inédita na
literatura. Todas as substâncias isoladas são descritas pela primeira vez para as
respectivas espécies vegetais.As elucidações estruturais basearam-se na análise de dados
espectrométricos, principalmente RMN
1
H e
13
C, uni e bidimensionais, alem de CG-
EM, EMAR e comparação com dados da literatura.Foram realizados ensaios de
toxidade frente a Artemia salina Leach com extratos das plantas em estudo. Os
resultados mostraram atividade significativa apenas em extratos de A. dióica. As frações
obtidas a partir destes extratos e os flavonóides isolados tiveram a atividade citotóxica
avaliada utilizando-se células do carcinoma de Erhlich bem como avaliação da inibição
da enzima humana DNA-Topoissomerase I e II. As frações obtidas do extrato
metanólico das raízes foram submetidas a triagem de atividade antitumoral in vitro em
linhagens de células tumorais humanas [MDA-MB435, HCT8, HL60 e SF295]. Os
resultados mostraram atividade de todas as frações testadas em pelo menos uma das
linhagens utilizadas na triagem.
Palavras chaves: Plantas medicinais, atividade biológica, Eupatorium macrocephalum,
Annona dióica, terpenóides, flavonóides.
20
ABSTRACT
Eupatorium macrocephalum Less (Asteraceae) and Annona dioica (Annonaceae) are
distributed throughout South America and have long been used as paraguayan folk
medicine. The present work relates the chemical investigation of the extracts of
Eupatorium macrocephalum Less (colleted in Dpto. Central-Paraguay) which resulted
in the isolation and identification of twenty compounds: six triterpenoids; lupeol and
lupeol acetate (the main chemical components), taraxasterol and taraxasterol acetate
together with α- and β-amiryn; six steroids; stigmasterol, sitosterol, epinasterol, 3-O-β-
D-glicopyranosylstigmasterol, 3-O-β-D-glicopyranosylepinasterol and 3-O-β-D-
glicopyranosylsitosterol; one diterpenoid, -9,15-diidroxikauren-3-O-β-D-glicopiranosyl;
one flavonoid, 3’,4’,5-triidroxi-6,7-dimetoxiflavone and six ác. cynnamyc derivates.
The methanolic extract from the leaves of Annona dioica specimens collected in the
cerrado of Horqueta city (Dpto. Concepción-Paraguay) led to the isolation and
identification of nine compounds: four flavonoids: kaempferol, 3-O-[3”,6”-di-O-p-
hydroxycynnamoyl]-β-galactopyranosyl-kaempferol, 6”-O-p-hydroxycinnamoil-β-
galactopyranosyl-kaempferol and 3-O-β-galactopyranosyl-kaempferol. Three steroids,
sitosterol, stigmasterol and 3-O-β-D-glicopyranosylsitosterol.The CHCl
3
extract from
the root furnished two acetogenines, one known as “motrilin” and a new isomer epi-
motriline.The structures were established using. IV, Mass and NMR spectral data,
including 2D NMR experiments of natural substances or by the comparison of spectral
and physical data with those described in the literature.
Biological tests using the brine shrimp lethality test in Artemia salina Leach for
screening with all extract revealed good activity so for A. dioica extracts. The cytotoxic
effects of the flavonoids and flavonoidic fractions (FF) were evaluated by MTT (3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay against Ehrlich
carcinoma cells. The inhibitory action on DNA-topoisomerase I and II of all the
flavonoids was evaluated by relaxation assays on pBR322 plasmid DNA.
The obtained fractions of the metanolic extract of the roots were submitted the
screening of activity antitumoral in vitro in lineages of cells human tumorais [MDA-
MB435, HCT8, HL60 and SF295]. The results showed activity of all of the fractions
tested in at least one of the lineages used in the screening.
21
SUBSTÂNCIAS NATURAIS IDENTIFICADAS NESTE TRABALHO
De Eupatorium macrocephalum Less
OR
OR
OR
5 R= H
8 R=Glic.
4 R= H
7 R= Glic
3 R=H
6 R=Glic.
2
1 R=Glic
OH
O
HO
O
OH
O
O
O
CH
3
O
CH
3
O
OH
OH
OH
CH
2
OH
OH
H
O
OR
9 R=H, ∆
7/8, 22/23
, 5/6 diidro
10 R=H, ∆
5/6
, 22/23 diidro
11 R=H, ∆
5/6, 22/23
12 R=Glic., ∆
7/8, 22/23
, 5/6 diidro
13 R=Glic., ∆
5/6
, 22/23 diidro
14 R=Glic., ∆
5/6, 22/23
23
22
RO
17 R= OH
18 R= OAc
15 R= OH
16 R=OAc
R
R
HO
HO
19
20
22
De Annona dioica St Hill
3'
2'
H
O
OO
HO
O
OH
H
O
OO
HO
OH
OH
6'
5'
4'
3'
2'
1'
8
7
6
5
10
9
4
3
2
1
21
6''
4''
3''
2''
1''
7''
8''
9''
6'''
1'''
7'''
8'''
9'''
6g
5g
4g
3g
2g
1g
6'
5'
4'
1'
8
5
10
9
4
3
2
1
22
O
O
HO
OH
OH
O
OH
1
2
3
4
9
10
5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1g
2g
3g
4g
5g
6g
9'''
8'''
7'''
1'''
2'''
3'''
23
O
OH
HO
OH
OH
24
1
2
3
4
9
10
5
6
7
8
1'
4'
5'
6'
1g
2g
3g
4g
5g
6g
H
O
OO
HO
O
OH
2'
3'
O
O
HO
O
OH
O
OH
O
OH
H
O
OO
HO
O
OH
HO
22
23
25 ∆
5/6
, 22-23 diidro
26 ∆
5/6, 22/23
5
6
23
OH
OH
O
O
O
O
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
15
14
13
12
11
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
37
36
35
34
33
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
11
12
13
14
15
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
OH
O
O
OH
OH
O
O
27
28
O
O
OH
HO
HO
HO
29
DERIVADOS OBTIDOS NESTE TRABALHO
24
Tetra-acetato de 3-O-β-D-glicopiranosil Estigmasterol
AcO
AcO
O
AcO
AcO
O
12a
10a
Tetra-acetato de 3-O-β-D-glicopiranosil Epinasterol
AcO
AcO
O
AcO
AcO
O
OR
OR
OR
19a R= Glic-(OAc)
4
18a R= Glic-(OAc)
4
17a R= Glic-(OAc)
4
OH
O
HO
O
OH
O
13a R= Glic-(OAc)
4
CH
2
OH
OH
H
O
OR
OAc
OAc
O
O
O
O
OAc
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
15
14
13
12
11
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
37
36
35
34
33
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
11
12
13
14
15
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
OAc
O
O
OAc
OAc
O
O
27 -Ac
28 -Ac
1. Introdução
25
A abordagem etnofarmacológica é uma estratégia para investigação de
plantas medicinais que consiste em combinar as informações das comunidades
locais, usuárias da flora medicinal, com os estudos químicos e farmacológicos
realizados em laboratórios especializados. Segundo a Organização Mundial da
Saúde, 80 % da população dos países em desenvolvimento dependem da
medicina tradicional para suas necessidades básicas de saúde, representando
entre 3,5 a 4 bilhões de pessoas no mundo que dependem das plantas como
fonte de drogas (Simões, C.M.O. et al, 2000)
, o que justifica plenamente este
tipo de estudo. Fatores sócio-culturais e econômicos concorrem para a
substituição de fármacos industrializados pelas plantas medicinais seja pelo
alto custo das drogas sintéticas, ou por habitar longe dos centros urbanos. Com
respeito aos fatores sócio-culturais relaciona-se a idéia equivocada de que a
chamada “medicina alternativa” não apresente perigo ao usuário, ou seja,
ausência de efeitos colaterais e toxides. Neste ponto cabe ressaltar a
importância da orientação técnico - científica na padronização de mudas de
plantas a serem utilizadas num canteiro de plantas medicinais bem como sobre
a preparação, emprego e dosagem de fitoterápicos.
O conhecimento tradicional pode despertar interesse para a ciência visto
que, trata-se de relatos verbais da observação sistemática de fenômenos
biológicos feito por pessoas, quiçá freqüentemente iletrados, mas seguramente
algumas tão perspicazes como o são alguns cientistas. A ausência de
educação e cultura formais não significa ausência de conhecimento; de fato,
somos todos ignorantes em relação às culturas que desconhecemos.
Os produtos naturais são de extrema significância na descoberta de
novas drogas e desenvolvimento de novos processos. No tratamento de
doenças humanas é particularmente notória sua influência na terapia de
doenças infecciosas e câncer nas quais entre 75 % e 65 % das drogas usadas,
respectivamente, teve origem em produtos naturais. Em drogas usadas como
antihipertensivos 48 das 74 drogas sintéticas do mercado tiveram origem nos
produtos naturais (Newman, J.D.; Gordon, M.G. e Snader, K.M., 2003). Grande
parte dessas descobertas tem como ponto de partida a informação obtida de
comunidades tradicionais que incorporam produtos naturais em suas práticas
de sobrevivência e manejo do meio ambiente.
26
O respeito ao meio ambiente, bem como ao estilo tradicional de vida das
comunidades tradicionais são essenciais ao desenvolvimento sustentável e
manutenção da biodiversidade do planeta (Cordell, A.G., 2002).
E. O. Wilson, um dos responsáveis pela popularização do termo
biodiversidade, estabeleceu um plano de cinco pontos relacionados a sua
preservação: 1) caracterização dos componentes da biodiversidade; 2) geração
da riqueza a partir destes componentes; 3) promoção do desenvolvimento
sustentado; 4) conservação da biodiversidade remanescente; 5) restauração da
biodiversidade em áreas degradadas (Wilson, E.O.; Organizador., 1997). É
fundamental a conscientização de que embora a biodiversidade seja aceita
como uma herança da humanidade, os países devem ter direitos e obrigações
em relação a mesma. Não se pode entender, respeitar ou saber usar aquilo
que se desconhece.
O Professor Otto R. Gottlieb observou que, uma redução na
biodiversidade pode alterar o desempenho de um ecossistema, daí a
importância transcendental do mapeamento da diversidade. Estudos sobre as
interações e influências recíprocas entre o homem e a natureza permitem à
humanidade, por meio do aprendizado da linguagem da natureza, entender,
participar e interferir em seu funcionamento. Sem dúvidas, esta linguagem é,
essencialmente, química (Gottlieb, O.; Kaplan, M.A.C.; Borin, M.R., 1996).
Neste ponto, a fitoquímica ainda tem muito a desvendar visto que, das 350 a
500 mil espécies estimadas de plantas existentes, apenas entre 5 e 8 % foram
estudadas quimicamente; considerando que a produção de substâncias do
metabolismo secundário ou especializado das plantas é influenciada por vários
fatores como, tipo de solo, irradiação, microrganismos e outros e, ainda, que
uma mesma espécie pode variar sua composição química dependendo da
época da coleta, a percentagem acima referida pode-se reduzir ainda mais.
A escolha das plantas para este trabalho baseou-se em critérios
etnofarmacológicos. Foi realizado o estudo fitoquímico de duas espécies
vegetais utilizadas na medicina popular no Paraguai, bem como ensaios
biológicos preliminares realizados com os extratos obtidos e com os
flavonóides isolados de uma delas.
O Paraguai têm uma cultura fortemente influenciada pelos Guaranis e,
ainda hoje, bastante preservada pela população em comparação com outras
27
culturas indígenas sul americanas. O país possui 45,8 % de população rural, a
taxa mais alta de América do Sul o que também favorece a preservação dessa
memória cultural.
1.1 A diversidade biológica no Paraguai
A diversidade biológica ou biodiversidade pode ser definida como a
variedade e variabilidade existentes dos organismos vivos e as complexidades
ecológicas nas quais eles ocorrem. Ela pode ser entendida como uma
associação de vários componentes hierárquicos: ecossistemas, comunidades,
espécies, populações e genes em uma área definida (ENPAB, Secretaria del
Ambiente, 2003). Uma das principais características da biodiversidade é a
distribuição relativa desigual dos seus componentes no espaço geográfico, ou
seja, a abundância de espécies é variável num determinado ambiente com a
existência de gradientes geográficos da biodiversidade.
Do ponto de vista químico isto também pode ser observado visto que
constituintes químicos de vegetações de florestas e savanas, por exemplo, são
bem diferenciados. Considerando que macro e micromoléculas vegetais sejam
biossinteticamente inter-relacionadas é possível esperar que a variação
química seja menor em áreas de florestas do que em áreas de campinas em
função do maior estresse oxidativo, origem universal da biodiversificação
(Gottlieb, O.; Borin, M.R, Kaplan, M.A.C.; 1995). Sem dúvida, no entanto, o
resultado mais dramático refere-se à interrupção de todos os gradientes
micromoleculares ao longo da interface floresta/cerrado, uma turbulência
química deve ter lugar em tais ecótonos bióticos.
O estudo da flora e da fauna no Paraguai teve seu inicio na época da
Colônia. Apesar dos muitos esforços isolados para aumentar o conhecimento
sobre a diversidade biológica do país, até o presente não existem catálogos
completos de ecossistemas, de espécies de flora e de fauna que permitam
conhecer e valorizar estas riquezas. Do ponto de vista ecogeográfico o
Paraguai é considerado como uma área de transição ou ecotono, apresentando
um mosaico dos mais diversos tipos de ecossitemas e, inclusive, uma área
conservada de Mata Atlântica (Figura 1). Adaptando estudos generalizados
feitos por Dinerstein e colaboradores para América Latina (Figura 2), podemos
28
reconhecer, em nível regional, que o Paraguai apresenta as seguintes eco-
regiões (Dinerstein et al.,1995):
a) Mata Atlântica do Alto Paraná
b) Chaco
c) Pantanal
d) Cerrado
Figura 1: Mapa área compreendida pela Mata atlântica (Fonte: ONG WHO)
29
Figura 2: Mapa ecorregiões Paraguay
Nas décadas de 1970 -1980 a pesquisa da flora no Paraguai toma novo
rumo, e são realizadas listagens de espécies vegetais principalmente pelo
Departamento de Botânica da Facultad de Ciências Químicas da Universidad
Nacional de Asunción (FAQ – UNA) e outros órgãos do governo (Mereles,
F.,1990). Segundo relatório do Ministério de Agricultura estima-se que o
número de espécies vegetais é de aproximadamente 13 000, embora outros
estudos sugerem que este número pode chegar a 20 000. O projeto “Flora Del
Paraguay”, de acordo com a coleção do herbário de Genebra, sugere que as
famílias melhor representadas quanto ao número de gêneros são: Asteracaee:
95; Fabaceae: 94; Poaceae: 86; Rubiaceae: 37 e Orchidaceae: 35 (Ministério
de Agricultura e Ganaderia, 1995).
A capacidade do país de levar a cabo pesquisas sobre a diversidade
biológica é restrita, a maior parte desta capacidade se limita ao estudo
taxonômico. O país conta com três locais de coleta e estudo taxonômicos
reconhecidos internacionalmente:
Chaco
Pantanal
Mata Atlântica
Cerrado
30
O Herbário (PY) do Museu Nacional de Historia Natural da Secretaria do
Ambiente.
Herbário do Departamento de Botânica da Facultad de Ciências
Químicas da Universidad Nacional de Asunción (FAQ – UNA)
Herbário Histórico da Prefeitura de Asunción.
A partir do ano 2000, com a criação de um convênio destas três instituições
com o Missouri Botanical Garden dos Estados Unidos são iniciadas a
sistematização da fauna e flora com a realização de um inventário baseado em
amostras-testemunha localizadas em museus e herbários nacionais e
estrangeiros.
A “Política Nacional de Ciência e Tecnologia”, aprovada por decreto do
poder executivo n°. 19.000/2002, estabelece: “A proteção da biodiversidade
como uma das áreas prioritárias e, para tanto serão promovidos a pesquisa e
desenvolvimento a ela relacionados”.
1.2 Plantas medicinais no Paraguai
O Paraguai, situado no centro do continente sul-americano é, portanto,
um país mediterrâneo, pluricultural e bilíngüe no qual 95 % da população é
mestiça e os 5 % restantes são indígenas e imigrantes de várias origens. No
Paraguai vivem atualmente 19 povos indígenas pertencentes a cinco famílias
lingüísticas, todos eles têm legado um pouco de seus conhecimentos para o
grande acervo de plantas medicinais utilizadas pela população. Esse
conhecimento foi transmitido de geração para geração e persiste atualmente.
As plantas medicinais são consumidas diariamente pela grande maioria
da população no “tereré” (Figura 3). A planta é macerada e colocada em água
gelada e logo transferida para um recipiente (“guampa”) contendo erva mate
(Ilex paraguariensis) e depois bebida com ajuda de uma “bonbilha” ou no
“mate” no qual é feita a deccoção da planta e colocada em um recipiente
contendo a erva mate e servida quente. Estes costumes são uma clara
influência dos Guaranis, que dividiam as plantas medicinais em:
Pohã ro’ysã (remédios refrescantes): diuréticos febrífugos ou
hepatoprotetores, plantas geralmente utilizadas no tereré.
31
Pohã rakú (remédios quentes): utilizados para doenças do sistema
respiratório geralmente consumido no mate ou na forma de infusão, chá ou
cataplasma.
Pohã pochy (remédios bravos) que devem ser utilizados com cuidado
como os repelentes, antídotos etc.
A
Figura 3: A: recipiente térmico onde a planta macerada é colocada em
água gelada e guampa com bombilla; B: a água contendo o sumo da planta
medicinal é colocada na guampa contendo erva mate, C: guampa com erva
e bombilla prontas para o consumo.
Os Guaranis possuem uma surpreendente precisão científica e
descritiva da classificação da flora e conhecimento de suas propriedades,
alguns confirmados mais tarde pela ciência. São encontrados registros de 1100
gêneros botânicos e mais de 40 famílias botânicas Guaranis
(Gonzáles, T.D.,
1992). Atualmente, as plantas medicinais do Paraguai são, praticamente,
desconhecidas pela comunidade científica, assim como o estado geral da flora
do país
(Basualdo, I. et al, 1995). Na literatura é possível observar estudos de
plantas usadas na medicina tradicional do Paraguai, na maioria dos casos
estudos farmacológicos de extratos brutos (Li, Y. et al, 2004; Velásquez, E.,
2003; Portillo et al., 2001).
A importância econômica do conhecimento da biodiversidade e da
tecnologia a ela relacionada é ilustrada no quadro abaixo onde são
encontradas algumas espécies endêmicas de alto valor comercial. O número
de espécies da flora nativa usada como medicinais pode chegar a 1500, muitas
delas extraídas de forma extensiva o que coloca em risco a sobrevivência das
espécies sendo, portanto, prioritário o estudo das mesmas.
.
B C
32
Ilex paraguarienis, Ka’a
(extração das folhas)
Stevia rebaudiana , Ka’a he’e
(folha, adoçante)
Citrus aurantium, Apepú
(extração de óleo essencial)
Lippia citriodora, Cedron paraguay.
(exportação da planta seca e extração de óleo
essencial)
Quadro 1: Espécies nativas do Paraguay de elevada importância econômica
33
2. OBJETIVOS
Contribuir para o conhecimento químico de espécies utilizadas na
medicina tradicional do Paraguai, isolar e identificar os principais
metabólitos especiais de Eupatorium macrocephalum Less; isolar e
identificar os principais metabólitos especiais de Annona dioica St. Hill.
Avaliar atividades biológicas através de ensaios de citotoxides frente a
Artemia salina Leach, carcinoma de Erhlich e inibição da enzima
topoisomerase I e II de extratos e/ou substâncias naturais isoladas.
34
3. Plantas estudadas:
3.1 Eupatorium macrocephalum Less.
3.1.1 Aspectos botânicos
Familia: Asteraceae
Tribo: Eupatorieae
Subtribo: Eupatoriinae
Gênero: Eupatorium
Espécie: Eupatorium macrocephalum Less
35
A família Asteraceae compreende cerca de 1100 gêneros com
aproximadamente 25000 espécies (Barroso, G.M., et al, 1991a). A subtribo
Eupariinae inclui quatro gêneros Eupatorium, Austroeupatorium, Stomatanches
e Hatschbiella, segundo a clasassificação de King e Robinson (King, R.M.,
Robinson, H., 1970). Durante as décadas de 70 e 80 o gênero Eupatorium
sofreu várias fragmentações feitas por estes autores. O gênero Eupatorium é
amplamente distribuído na América do Norte e América do Sul e no Leste da
Ásia. No Paraguai (Figura 4) este gênero é representado por 74 espécies
aproximadamente (Spichiger, R., 1983a). Eupatorium macrocephalum Less. é
uma espécie Sul Americana distribuída no sul do Brasil, Paraguai e norte e
centro da Argentina, é conhecida popularmente no Paraguai como “Teju Ka’a”
(erva de lagarto) e é utilizada pela população como antiinflamatório, sedativo,
em afecções cardíacas e no tratamento de hipertensão
(Cataldo. J.,1969) .
Figura 4: Distribuição do gênero Eupatorium no Paraguai
36
3.1.2 O gênero Eupatorium
Outras espécies deste gênero também são usadas na medicina popular
como E. purpureum, utilizada como anti-reumático, e E.salvia utilizada no Chile
como antisséptico; desta última foi comprovada, através de ensaios biológicos,
a atividade antimicrobiana do extrato diclorometânico e da resina desta planta.
O estudo fitoquímico levou ao isolamento de dois diterpenos caracterizados
como componentes majoritários e como principio ativo desta planta
(Habtemariam, S., 1998; Urzua, A. et al, 1998). Plantas do Nordeste do Brasil
que são incluídas neste gênero, tais como: E. ballotaefolium H. B. K. (picão-
roxo), E. betonicaeforme Baker e E. pauciflorum Kunth (cambara, botão azul)
foram estudadas fitoquímicamente levando ao isolamento de sesquiterpenos
lactônicos, diterpenos, triterpenos , esteróides e flavonóides (Silveira, E.R.,
Pessoa, O.D.L, 2001).
Estudos fitoquímicos de espécies deste gênero conduziram ao isolamento
de uma variedade de tipos estruturais como descrito a seguir:
Lactonas sesquiterpênicas: esta classe de compostos é amplamente
encontrada no gênero Eupatorium como, por exemplo, (Herz, W., 2001;
Zdero, C., Bohlmann, F., 1987; Jakupovic, J. et al, 1987)as seguintes
substâncias:
O
O
OH
E. cannabinum
O
O
O
CO
2
H
O
Elemadienolide
isolada de E. serotinum
O
O
O
O
H
OH
O
E. altissimum
37
Diterpenos: foram isolados diterpenos dos tipos labdanos, clerodanos e
kaurenicos ( Herz, W.,2001; Herz, W. et al 1979 e 1976).
O
O
O
O
E. cannabinum
OH
HO
H
CO
2
H
H
H
E. petaloideum
OH
OH
O
O
H
H
E. album
Triterpenos: são também muito comuns principalmente como
constituintes químicos das flores de plantas deste gênero (Militão,
G.C.G., et al, 2004; Albuquerque, M.R.J.et al,2006).
E. betonicaeforme
α-amirina : R=CH
3
; R
1
=
H
β−amirina : R=H; R
1
=CH
3
R
R
1
HO
Taraxasterol
isolada de E. ballataefolim
HO
Flavonóides (Albuquerque, M.R.J., et al, 2006; Oliveira, B.H., et al
2001).
O
OOH
OH
OH
Camferol
E. betonicaeforme
O
OOH
HO
OH
O
OH
O
HO
OH
OH
OH
Quercetina glicosilada
E. ballotaefolium
O
OOH
OH
OH
HO
CH
3
O
Eupafolin
E. littorale
38
Alcalóides pirrolizidínicos (Liu, K. et al, 1992; Lang, G., 2001)
N
OH
H
O
O
H
OH
CH
3
H
3
C
CH
3
HO
Rinderine
E. fortunei
N
H
OH
OCH
3
O
Tussilagin
E. semialatum
Benzofuranos, diidrobenzofuranos, cumarinas e cromonas
(Habtemarian, S., 1998; Liu, K. et al 1992; Herz, W. et al 1981).
O
O
O
O
HO
E. purpureum
O
O
O
O
E. fortunei
O
O
O
HO
O
E. lancifolium
3.1.3 Constituintes químicos isolados de Eupatorium
macrocephalum Less
Do estudo químico de extratos de Eupatorium macrocephalum Less.
(coletada no Dpto. Central, Paraguai) foram isolados e identificados seis
triterpenos: acetato de lupeoíla (1) e lupeol (2) (constituintes majoritários)
taraxasterol (3) e acetato de taraxasterila (4) além de α- e β- amirina (5 e 6);
três esteróides: estigmasterol (9), sitosterol (8), epinasterol (7), três saponinas
esteroidais: acetato de 3-O-β-D-glicopiranosil estigmasterol (12), acetato de 3-
O-β-D-glicopiranosil epinasterol (10) e acetato de 3-O-β -D-glicopiranosil
39
sitosterol (11); um diterpeno: (-) 9,15-diidroxikauranato de β-D-glicopiranosila
(13); um flavonóide: 3’, 4’, 5-triidroxi-6,7-dimetoxiflavona (20) e seis derivados
do ácido cinâmico (14-19). As elucidações estruturais basearam-se nas
análises de dados fornecidos por métodos espectrométricos, principalmente,
RMN
1
H e
13
C, uni e bidimensionais alem de CG-EM e comparação com dados
da literatura.
40
Constituintes químicos isolados de E. macrocephalum Less
3 R= OH
4 R= OAc
1 R= OAc
2 R=OH
R
R
HO
HO
7 R=H, ∆
7/8, 22/23
, 5/6 diidro
8 R=H, ∆
5/6
, 22/23 diidro
9 R=H, ∆
5/6, 22/23
10 R=Glic., ∆
7/8, 22/23
, 5/6 diidro
11 R=Glic., ∆
5/6
, 22/23 diidro
12 R=Glic., ∆
5/6, 22/23
23
22
RO
5
6
13 R=Glic
CH
2
OH
OH
H
O
OR
OR
OR
OR
16 R= H
19 R= Glic.
15 R= H
18 R= Glic.
14 R= H
17 R= Glic.
OH
O
HO
O
OH
O
20
O
O
H
3
CO
H
3
CO
OH
OH
OH
41
3.2 Annona dióica St. Hill
3.2.1 Aspectos botânicos
Familia: ANNONACEAE
Subfamília: Annonoideae
Tribo: Unoneae
Gênero: Annona
Espécie: Annona dioica St. Hill.
42
A família Annonaceae compreende cerca de 130 gêneros com
aproximadamente 2300 espécies Esta família é de apreciável importância
econômica como fonte de frutos comestíveis, aminoácidos e proteínas. O
gênero Annona possui 120 espécies catalogadas no mundo (Barroso, G.M., et
al., 2002). No Paraguai esta família é representada por cinco gêneros incluindo
16 espécies nativas das quais 11 pertencentes ao gênero Annona além de
cinco espécies introduzidas (Spichiger, R. et al, 1983b) (Figura 5).
Annona dioica, é um arbusto de vasta dispersão na América do Sul
estendendo-se da Bolívia ao Paraguai e no Brasil principalmente no Pantanal
considerada planta do cerrado e conhecida popularmente como “Aratikú-ñu”
(fruto do céu do campo) (Pavetti, C. et al, 1983). Esta planta é largamente
usada pela população na medicina tradicional, no Brasil os frutos e folhas são
utilizados contra reumatismo e as sementes contra diarréia (Pott & Pott; 1994)
já no Paraguai os frutos, além de comestíveis, lhe são atribuídas propriedades
sedativas e as sementes maceradas são usadas como inseticidas ou em
aplicações locais para a limpeza de parasitas da pele (sarna e piolho) e as
folhas são utilizadas na forma de chá ou como gargarejo como anticatarral
(Basualdo, I.; Soria, N.; 1996). Na literatura encontra-se descrito o estudo do
extrato etanólico da madeira de um espécime de Annona dioica coletada na
Serra da Moeda (MG, Brasil) registrando o isolamento de seis alcalóides (Dos
Santos, P. et al., 2003).
43
Figura 5: Distribuição do Gênero Annona no Paraguai
3.2.2 O gênero Annona
A família Annonaceae é caracterizada pela presença de
alcalóides e mais recentemente acetogeninas, flavonóides foliares também são
considerados como marcadores quimiotaxonomicos desta família (Santos,
D.Y.C.; Salatino, M.L.F., 2000). O gênero Annona é nativo da América tropical
e subtropical, possui 120 espécies catalogadas sendo estudadas até hoje
quimicamente e/ou farmacológicamente aproximadamente 33 espécies (Tabela
1) das quais foram isoladas as mais diversas classes estruturais e com amplo
espectro de atividades biológicas comprovadas sendo este gênero, portanto,
uma importante fonte de moléculas bioativas. A seguir são mostrados alguns
exemplos de produtos naturais isolados de plantas do gênero Annona
44
Alcalóides (Leboeuf, M. et al.,1982;Chang, F. et al,1998; Chang, F., et
al., 2000a):
N
N
N
NH
2
N
OH
A. foetida
Atividade antileishmania
N
OH
OCH
3
CH
3
O
CH
3
O
H
3
CO
OCH
3
CH
3
A. purpurea
Atividade sobre PAF
O
O
N
O
A. hipoglauca
Diterpenos (Leboeuf, M. et al., 1982; Wu, Y., et al 1996; Chen, C., et al.,
2004)
OH
COOH
OH
A. squamosa
Atividade Anti - HIV
H
H
COOH
H
HO
A. glabra
Flavonóides (Santos, D. Y. A.C., et al., 2000; Kotkar, H., et al., 2002)
O
OOH
O
OH
OH
Gli
A. tormentosa
O
OH
OH
OR
OOH
HO
R= arabinose
R= ramnose
A. crassiflora A. warmingiana
Peptídeos (Wélé, A. et al., 2004; Morita, H. et al., 2006)
45
HN
C
HC
HN
H
2
C
C
N
C
C
C
C
NH
C
CH
NH
C
N
O
CH
3
O
H
H
O
OH
Ser
5
O
O
Ala
6
Pro
1
Gly
2
O
Phe
2
Annomuricatin C
(isolado das sementes de A. muricata)
H
CONH
2
H
H
H
N
N
N
N
N
NH
N
N
O
O
O
O
O
HO
O
O
O
MeS
H
IIe
Gly
Thr
Leu
Met
Gln Pro
Pro
Cyclosquamosin B
(isolado das sementes de A. squamosa
Atividade vasorelaxante)
Acetogeninas: são considerandos importantes produtos naturais
encontrados exclusivamente na família Annonaceae, vêm sendo intensamente
estudada nos últimos anos e apresentam uma ampla gama de propriedades
biológicas, tais como: citotóxica, antitumoral, antiparasitária, pesticida,
antimicrobial e atividade imunosupressora (Alali, F.Q., et al., 1999) O gênero
Annona se apresenta como uma importante fonte desta classe de compostos
considerando que dos 417 compostos conhecidos até 2004, 289 foram isolados
a partir de 20 espécies de Annona (Bermejo, A., et al., 2005) destacando as
espécies: Annona muricata para a qual foram isoladas 81 acetogeninas (38 das
sementes, 20 da raiz, 18 das folhas e 5 do caule) e Annona squamosa na qual
foram descritas 32 acetogeninas (8 das cascas e 24 das sementes). A seguir
alguns exemplos de acetogeninas encontradas em plantas do gênero Annona:
46
OH
O
O
OH
OH
O
O
34
24
15
6
37
A. squamosa
Atividade citotoxica para seis linhanhens de células tumorais humanas
Uvaria acuminata
Uvaricin primeira acetogenina isolada de Annonaceas
Atividade antitumoral para células de leucemia linficítica em ratos
37
6
15
24
34
OAc
O
O
OH
OH
O
O
A. muricata
Atividade citotoxica seletiva duas linhanhens de células tumorais humanas
OH
OH
OH
O
HO H
O
O
35
4
15
19
26
27
32
47
Tabela 1: Espécies de Annona estudadas quimicamente, parte estudada entre
parêntesis e as classes de produtos naturais descritos para cada espécime.
Espécie
Compostos isolados
Referência
A. acuminata
Alcalóides
BORUPGROCHTMANN, I., et al.,1982
A. aff. spraguei (
sementes
) Acetogeninas
CHAHBOUNE, N., et al., 2006
A. atemoya
(raiz e sementes)
Acetogeninas
Alcalóides
BERMEJO, A., et al., 2005
WU, Y., et al., 2005
A. ambotay Alcalóides
DE OLIVEIRA, A.B., et al., 1987
A. bullata
(casca)
Acetogeninas
BERMEJO, A., et al., 2005
A. cherimolia
(caule, raiz e
sementes)
Acetogeninas, Alcalóides,
Peptídeos, Esteroides,
Lignanas, Diterpenos,
Proteínas, Ác. Graxos e Amidas
LEBOEUF, M.,et al., 1982
BERMEJO, A., et al., 2005
CHEN, C., et al., 1997 / 1998 / 1999/
2001a-b
WELE, A., et al., 2005a
A. coriacea
(raiz)
Acetogeninas, Diterpenos
Clicoproteinas
BERMEJO, A., et al., 2005
COELHO, M.B., et al., 2006
FERRARI, M., et al., 1971
A. cornifolia
(sementes)
Acetogeninas
DOS SANTOS, L.A.R., et al., 2006
A. crassiflora
(sementes)
Acetogeninas, Flavonóides.
SANTOS, D.Y.A.C.; et al., 2000
BERMEJO, A., et al., 2005
A. cristalensis Alcalóides
FAUST, J., et al., 1981
A. densicoma
(caule,
sementes)
Acetogeninas
BERMEJO, A., et al., 2005
A. dioica
(galhos)
Alcalóides
DOS SANTOS, P., et al., 2003
A. diversifolia
(sementes)
Ác. Graxos, Flavonóides.
PEREZ AMADOR, M.C. et al., 1997
A. elliptica Alcalóides
SANDOVAL, D., et al., 1985
A. foetida Alcalóides
COSTA, E., et al., 2006
A. hayesii Alcalóides
RASAMIZAFY, S. et al., 1987
A. glabra
(folhas e sementes)
Acetogeninas, Alcalóides,
Flavonóides, Amidas,
Esteroides, Antraquinona, Di-,
Sesqui- e Mono-terpeno
LEBOEUF, M.,et al., 1982
CHEN, C., et al., 2000 / 2004
BERMEJO, A., et al., 2005
SANTOS, A.S., et al., 1998
CHANG, F.R., et al 2000b
HSIEH, T.J., et al., 2004
CHAO-MING, I., et al., 1998b
XIAO-XI, L., et al., 1999
A. glauca
(raiz e sementes)
Acetogeninas
Ciclopeptideos
BERMEJO, A., et al., 2005
WELE, A., et al., 2005b
A. itcrassiflora Acetogeninas
SANTOS, L. P., et al., 1996
48
A. jahnii
(galhos)
Acetogeninas
BERMEJO, A., et al., 2005
A. lutescens Ac. Graxos e
Flavonóides
PEREZ AMADOR, M.C. et al., 1997
A. montana
(folhas, frutos e
sementes)
Acetogeninas
Alcalóides
LEBOEUF, M.,et al., 1982
BERMEJO, A., et al., 2005
WU, Y.C., et al., 1993
A. montícola Flavonóides
SANTOS, D.Y.A.C.; et al., 2000
A. muricata
(caule, folhas,
raiz e sementes)
Acetogeninas, alcalóides,
Ciclopeptideos
LEBOEUF, M.,et al., 1982
WELE, A., et al., 2004
BERMEJO, A., et al., 2005
CHAO-MING, L., et al., 1998a
HASRAT, J.A., et al., 1997a-b
A. nutans
(raiz)
Acetogeninas
BERMEJO, A., et al., 2005
A. purpurea
(folhas e
sementes)
Acetogeninas, Alcalóides;
Amidas, Esteroides,
Ác. Graxos e Flavonóides
LEBOEUF, M.,et al., 1982
CHANG, F.R., et al 1998 / 2000a
BERMEJO, A., et al., 2005
CHAHBOUNE, N., et al., 2006
A. reticulata
(casca, folhas e
sementes)
Acetogeninas
LEBOEUF, M.,et al., 1982
BERMEJO, A., et al., 2005
MAEDA, U., et al., 1993
A. salzmanii
(raiz)
Acetogeninas
Alcalóides
BERMEJO, A., et al., 2005
QUEIROZ, E., et al., 2003
PAULO, M.D., et al, 1992
A. senegalensis
(sementes)
Acetogeninas, Alcalóides,
Flavonóides, Ciclopeptideos
Diterpenos
LEBOEUF, M.,et al., 1982
BERMEJO, A., et al., 2005
ESHIET, I.T.U., et al., 1971
YOU, M., et al., 1995
WELE, A., et al., 2002
A. spinescens
(sementes)
Acetogeninas
Alcalóides
BERMEJO, A., et al., 2005
QUEIROZ, E., et al., 1996
A. squamosa
(casca e
sementes)
Acetogeninas, Alcalóides,
Lignanas, Ciclopeptideos,
Esteroides, Diterpenos
Flavonóides
LEBOEUF, M.,et al., 1982
WU, Y.C., et al., 1996
KOTKAR, H.M., et al., 2002
MORITA, H., et al., 2006
BERMEJO, A., et al., 2005
RAHMAN, M.M., et al., 2005
YEH, S.H., et al., 2005
YANG, Y.L., et al., 2004a / 2005
MORITA, H., et al., 1999
A. tormentosa Flavonóides
SANTOS, D.Y.A.C.; et al., 2000
A. warmingiana Flavonóides
SANTOS, D.Y.A.C.; et al., 2000
49
3.2.3 Constituintes químicos isolados de Annona dioica St.
Hill
O presente trabalho relata o estudo do extrato metanólico das folhas de um
espécime de Annona dioica coletada no cerrado de Horqueta (Dpto. de
Concepción, Paraguai) que conduziu ao isolamento e identificação de quatro
flavonóides 21-24 além da mistura de sitosterol + estigmasterol (25 e 26). Do
extrato em clorofórmio das raízes obtiveram-se duas acetogeninas 27- 28 além
do esteróide glicosilado: 3-O- β-D-glicopiranosil sitosterol (29).
Constituintes químicos isolados de Annona dioica St. Hill
3'
2'
H
O
OO
HO
O
OH
H
O
OO
HO
OH
OH
6'
5'
4'
3'
2'
1'
8
7
6
5
10
9
4
3
2
1
21
6''
4''
3''
2''
1''
7''
8''
9''
6'''
1'''
7'''
8'''
9'''
6g
5g
4g
3g
2g
1g
6'
5'
4'
1'
8
5
10
9
4
3
2
1
22
O
O
HO
O
OH
O
OH
O
OH
O
O
HO
OH
OH
O
OH
1
2
3
4
9
10
5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1g
2g
3g
4g
5g
6g
9'''
8'''
7'''
1'''
2'''
3'''
23
O
OH
HO
OH
OH
24
1
2
3
4
9
10
5
6
7
8
1'
4'
5'
6'
1g
2g
3g
4g
5g
6g
H
O
OO
HO
O
OH
H
O
OO
HO
O
OH
2'
3'
50
HO
22
23
25 ∆
5/6
, 22-23 diidro
26 ∆
5/6, 22/23
5
6
OH
OH
O
O
O
O
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
15
14
13
12
11
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
37
36
35
34
33
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
11
12
13
14
15
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
OH
O
O
OH
OH
O
O
27
28
O
O
OH
HO
HO
HO
29
51
4.
Parte experimental
4.1 Equipamentos e reagentes
Os pontos de fusão foram determinados em aparelho digital MQAPF –
301 e os valores obtidos não foram corrigidos. Os espectros de infravermelho
foram obtidos em Perkin-Elmer 1605 FT-IR; os espectros foram registrados em
filme sobre cristal de NaCl (amostras não sólidas) ou incorporadas em pastilhas
de KBr (amostras sólidas). Os espectros de RMN
1
H e
13
C foram obtidos em
espectrômetros: Bruker DRX-500, 500 e 125 MHz para
1
H e
13
C
respectivamente; Bruker ACX-200 (200 e 50 MHz) e JEOL Eclipse (400 e 100
MHz).Como referencia interna foi usado Tetrametilsilano. Os espectros de
massas de alta resolução EM-ESAR em aparelho Varian VG Autospec
Autospectrometer, operando com íon no modo positivo (UNICAMP). Os
espectros de massas de baixa resolução foram obtidos por impacto de elétrons
(70 eV) foram registrados em CG-EM Shimatzu modelo QP-5050 (UENF).
As cromatografias foram realizadas em coluna de vidro de diversos
diâmetros e eluidas a pressão atmosférica, tendo como suportes: sílica gel
(230-400 e 70-230 mesh); RP-C
18
e para cromatografia por exclusão foi
utilizado gel de sephadex LH-20. A cromatografia em camada delgada
preparativa (CCDP) foi realizada em placas de sílica gel 60 PF
254
, sobre
suporte de vidro e espessura de 1mm. A analise comparativa das frações
obtidas foi realizada por cromatografia em camada fina (CCF) observadas por
irradiação UV (254 e 366 nm) e utilizando reveladores como vapores de iodo,
vanilina e/ou reagente de Draggendorff.
52
4.2 Acetilação com anidrido acético e piridina
As substâncias acetiladas foram dissolvidas em anidrido acético e
piridina (1:1) e a solução deixada em repouso por 48 horas. Após este tempo
foi lavada com água destilada gelada e colocada em funil de separação para
extração da fase orgânica com clorofórmio. A fase orgânica assim obtida foi
seca com sulfato de sódio anidro. Após a evaporação do solvente obtiveram-se
as substâncias acetiladas.
4.3 Isolamento e purificação dos constituintes químicos de E.
macrocephalum Less.
A coleta e a classificação do material vegetal foram realizadas no Paraguai
(Cidade de Luque - Departamento Central) em fevereiro de 1999, com a
colaboração das professoras Rosa Degen e Nélida Soria do Departamento de
Botânica da Univesidad Nacional de Asunción (UNA).
O material botânico partes aéreas (1,1 Kg) e flores (220,0 g) após seco e
moído foi submetido à extração com solventes orgânicos (hexano e metanol)
através de maceração exaustiva a temperatura ambiente. Após destilação a
pressão reduzida obtiveram-se as quantidades relacionadas a seguir:
Hexano Metanol
Parte aérea (caule+ folhas)
26,5 g 38,7 g
Flores
9,7 g 15,2 g
53
4.3.1 Tratamento cromatográfico do extratos hexânico e metanólico
da Parte aérea (caule + folhas)
O extrato em hexano da parte aérea foi submetido ao fracionamento
cromatográfico em coluna com gel de sílica, usando-se como eluentes
hexano, clorofórmio e metanol e misturas binárias dos mesmos em ordem
crescente de polaridade. Foram recolhidas 65 frações que, após
evaporação dos solventes a pressão reduzida, foram analisadas por
cromatografia em camada delgada analítica e reunidas em grupos de
acordo com a semelhança de perfil observado.
As frações reunidas 15 - 22 foram purificadas por cromatografia em
coluna flash e cromatografia em camada delgada preparativa fornecendo as
substâncias 2 (147,9 mg; Pf: 140-145
o
C ) e 1 (1,320 g ; Pf: 160-165
o
C ). A
purificação das frações 37- 38 por cristalização em hexano e acetona
forneceu as substâncias 8 e 9 em mistura (47,5 mg, Pf: 144-146
o
C ). Da
reunião das frações 59-65 obteve-se substância a 7 (31,2 mg; Pf; 148-149
o
C ) por cromatografia em camada delgada preparativa utilizando hexano e
acetato de etila como solventes.
O extrato metanólico foi submetido à partição com solventes acetato
de etila e metanol:água (9:1), fornecendo as frações em acetato de etila
(11,09 g) e hidroalcoólica (26,5 g). A porção solúvel em acetato de etila
forneceu um precipitado insolúvel em solventes orgânicos e foi acetilado
com piridina e ácido acético (como descrito na seção 4.3), extraído com
clorofórmio e purificado por cristalização em acetona e forneceu dois
derivados de esteróides glicosilados 10 e 12 (28.4 mg); o restante da fração
em acetato de etila foi cromatografado em sílica gel usando-se clorofórmio e
metanol como solventes e obtendo-se 35 frações que foram analisadas por
CCDA e reunidas em grupos. A reunião das frações 17- 24 foi submetida à
cromatografia por exclusão em Sephadex LH-20 utilizando metanol como
solvente e resultando no flavonóide 20 (3,8 mg) e três derivados do ácido
cinâmico: 14, 15 e 16 em mistura (12,2 mg) e um do diterpeno glicosilado
13 (8,9 mg; Pf: 218-220
o
C).
54
A fração metanólica foi submetida à cromatografia por exclusão em
gel de Sephadex LH-20 fornecendo o diterpeno glicosilado 13 (27,0 mg). As
demais frações foram analisadas por CCDA e combinadas em grupos e
separadas por cromatografia em coluna usando sílica RP-18 e eluidas com
metanol:água (2:1) fornecendo os derivados glicosilados 17, 18 e 19 (27,6
mg)
A purificação destas frações e os resultados obtidos encontram-se
resumidos no Esquema 1.
4.3.2 Fracionamento cromatográfico dos extratos hexânico e
metanólico das Flores.
O extrato hexânico das flores foi submetido a fracionamento por
cromatografia de adsorção em coluna aberta, utilizando como adsorvente
sílica gel e como eluentes diclorometano, acetato de etila e metanol e
misturas destes solventes em ordem crescente de polaridade. Coletaram-se
31 frações que, após destilação dos solventes sob pressão reduzida, foram
analisadas por cromatografia em camada delgada analítica e reunidas em 4
grupos. O grupo 1 forneceu uma mistura de ácidos graxos não identificados.
O grupo 2 foi submetido `a CC de sílica gel utilizando mistura de
hexano:diclorometano como eluentes em ordem crescente de polaridade. A
reunião das frações 10-15 após recristalização forneceu o triterpeno 4
(147,1 mg; Pf: 152-155
o
C). O grupo 3 foi submetido a CCDP utilizando
como eluentes hexano:clorofórmio (1:1) e forneceu a substância 3 (28,4 mg
; Pf.: 149-153
o
C). O grupo 4 foi submetido à CC de sílica gel utilizando
como eluentes diclorometano : acetato de etila (8 : 2) fornecendo as
substâncias 1 (23,5 mg) e 2 (73,5 mg) e três esteróides 8 e 9 em mistura
(25,4 mg) e 11 (44,3 mg).
O extrato metanólico das flores foi submetido à cromatografia por
exclusão em gel de Sephadex LH-20 usando como eluentes clorofórmio:
metanol (50:50 até 0:100). Obtiveram-se 23 frações que foram analisadas
por CCDA e reunidas em grupos. As frações obtidas foram analisadas por
CG-MS e RMN
1
H e
13
C verificando a presença dos compostos 2, 5 e 6. A
55
purificação destas frações e os resultados obtidos estão resumidos no
Esquema 1.
As elucidações estruturais foram baseadas em dados físicos e
espectrais e por comparação destes dados com os descritos na literatura.
56
Esquema 1:
Marcha geral para o isolamento de substâncias dos extratos
hexânico e metanólico das partes aéreas e das flores de Eupatorium
macrocephalum Less.
57
4.4 Isolamento e identificação dos constituintes químicos de Annona
dioica St. Hill
A coleta do material vegetal foi realizada no Paraguai no cerrado de
Horqueta – Concepción (Folhas em fevereiro/1999 e Raiz em abril/2003). A
classificação botânica da espécie foi realizada pelas professoras Rosa Degen e
Nélida Sória do Dep. de Botânica da Universidad Nacional de Asunción (UNA).
O material botânico após seco e moído foi submetido à extração com
solventes orgânicos mediainte maceração exaustiva a temperatura ambiente.
Após destilação do solvente a pressão reduzida obteve-se as quantidades
relacionadas abaixo:
Hexâno Metanol
Folhas
12,4 g
**
.
25,7 g.
Raiz -
120,0g
*
*
Extrato hidroalcoólico (MeOH + 10% H
2
O)
** Extrato trabalhado pelo aluno de IC UFRRJ Sandro Sant’ Anna (PIBIC/CNPq 1999-2000)
4.4.1 Fracionamento cromatográfico dos extratos metanólicos das folhas
e raiz de Annona dioica St. Hill.
O extrato metanólico foi submetido à partição utilizando como solventes
MeOH:H
2
O (9:1) e CHCl
3
. A fração hidroalcoólica 18.4 g foi submetida à
cromatografia em coluna filtrante utilizando como solventes CHCl
3
, MeOH e
MeOH:H
2
O (9:1). A porção solúvel em metanol (12.3 g) foi submetida à
cromatografia em coluna utilizando gel de sílica e, como eluentes, clorofórmio,
acetona e metanol e misturas destes solventes em ordem crescente de
polaridade. Foram obtidas 72 frações que, após retirada do solvente usando
destilação a pressão reduzida, foram analisadas por cromatografia em camada
delgada analítica (CCDA) e reunidas em grupos de acordo a semelhança de
perfil observado. As placas foram reveladas com vanilina obtendo-se três
grupos (G-1, G-2 e G-3).
O grupo G-1 foi novamente submetido à cromatografia em coluna com
gel de sílica usando sílica “flash” e como eluentes hexâno, clorofórmio e
metanol e misturas destes solventes em ordem crescente de polaridade
fornecendo os esteróides 5+6 (14,1 mg) e 9 (25,4 mg, Pf.: 230-235
o
C).
58
O grupo G-2 foi submetido á cromatografia em gel de sílica usando
como eluentes CH
2
Cl
2
:AcOEt:MeOH obtendo-se 25 frações. O grupo de
frações 7-12 foi submetido à cromatografia em coluna flash utilizando como
eluentes CH
2
Cl
2
:acetona (1:1). A reunião das frações 1-3 desta coluna foi
purificada por cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) usando
como eluentes Acetona : AcOEt (3:1) fornecendo o flavonóide 2 (16,1 mg, Pf:
181-183
o
C ).
O grupo G-3 foi submetido à cromatografia por exclusão em gel de
Sephadex LH-20 com MeOH : H
2
O (9:1) obtendo-se 29 frações analisadas por
CCDA e reveladas com sulfato cérico e vanilina. A purificação da fração 13
desta coluna por cristalização em MeOH:CH
2
Cl
2
forneceu o flavonóide 3 (29.1
mg, Pf: 269-271
o
C). O grupo de frações 15-19 desta coluna foi purificado por
CCDP utilizando-se como solventes CH
2
Cl
2
: AcOEt: acetona (1:1:1) e obtendo-
se os flavonóides 4 (17,2 mg, Pf.: 230-232
o
C) e 1 (6,1 mg, Pf.: 185-186
o
C ).
O extrato hidroalcoólico da raiz foi particionado com CHCl
3
e MeOH. A
fração solúvel em clorofórmio (25,40 g) foi submetida à cromatografia de sílica
gel utilizando como eluentes CH
2
Cl
2
:MeOH e mistura destes em ordem
crescente de polaridade. Obteve-se 48 frações que após evaporação dos
solventes, foram analisadas por CCDA e reunidas em grupos de acordo com a
semelhança de perfil observado. As placas foram reveladas com vanilina e
reagente de Dragendoff indicando a presença de alcalóides e/ou acetogeninas
nas amostras. As frações foram reunidas em 14 grupos
1
.
O grupo G-4 obtida da reunião das frações 30-31 (541,4 mg) foi
submetida à cromatografia em coluna com gel de sílica eluída com CH
2
Cl
2
+
1% até 5% de MeOH. Obtendo-se 77 frações que, após análise por CCDA,
foram reunidas em grupos. A purificação da reunião das frações 59-65 desta
coluna, por CCDP (eluente Acetato de etila 100%) forneceu a acetogenina 8E
(46,5 mg, óleo amarelo). Ainda nesta coluna, a reunião das frações 66-70 foi
submetida à cromatografia por exclusão em gel de Sephadex LH-20 e eluída
com MeOH:CHCl
3
(9:1) obtendo-se as acetogeninas 7 e 8 em mistura (126,8
mg, óleo marrom).
1
Frações reunidas em 13 grupos desta coluna foram enviadas para triagem de atividade antitumoral
in
vitro
em 3 linhagens de
células tumorais humanas. Estes ensaios foram realizados na UFC, ver seção TESTES BIOLÓGICOS.
59
O tratamento cromatográfico a purificação das frações e os resultados
obtidos estão resumidos nos Esquemas 2 e 3.
60
Esquema 2
: Marcha geral para o isolamento de constituintes químicos das folhas
Annona dioica St. Hill
61
Esquema 3
: Marcha geral para o isolamento de constituintes químicos da raiz
Annona dioica St. Hill
62
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Parte A
63
5.1
Determinação estrutural dos constituintes químicos
isolados de Eupatorium macrocephalum Less
5.1.1 TRITERPENOS
O espectro obtido no IV da substância 1 (Figura 6a) apresentou sinais de
absorção em 2942 e 2850 cm
-1
referentes à
ν
C-C
CH
3
e CH
2
, em 1735 cm
-1
correspondente a
ν
C=O
e em 1642 cm
-1
sinal de absorção
ν
C=C
característica de
dupla ligação. O espectro de RMN
1
H (Figura 6b) mostra sinais
correspondentes a metilas terciárias: δ
H
: 0,76; 0,81; 0,83; 0,90; 0,98 e 1,03
sendo o sinal em δ
H
: 1,65 (s) atribuído a freqüência de metila ligada a carbono
sp
2
além de dois simpletos largos em δ
H
4,52 e 4,65 referentes a hidrogênios
vinílicos. Sinais em δ
C
150,89 e 109,33 bem como os dados fornecidos pelo
experimento DEPT no espectro de RMN
13
C (Figura 6c) no qual pode ser
observado o número de CH, CH
2
e CH
3
e permitiram propor a estrutura de um
triterpeno da classe dos lupanos.
A presença de sinais em δ
H
2,01 (s) e δ
C
170,43 características de
grupo acetoxila permitiu sugerir a estrutura do composto 1 como sendo o
acetato de lupeoíla. As comparações com dados da literatura confirmam esta
proposta (Sobrinho, D.C., et al., 1991). A substância 2 apresenta espectro na
região do IV (Figura 6d) se apresenta muito semelhante podendo ser
destacado a ausência do sinal correspondente a C=O; já no espectro de RMN
1
H observa-se apenas diferenças no maior deslocamento para a H-3 e a
ausência do sinal em δ
H
2,01 CH
3
COO no espectro de RMN
1
H e do sinal em
170,9 no espectro RMN
13
C (Figuras 6e e 6f) . Isto permitiu sugerir a estrutura
do Lupeol para 2 (Tabela 2). As comparações com dados da literatura
confirmam esta proposta (Mahato, S., et al., 1994).
A análise dos espectros registrados na região de IV das substâncias 3 e
4 (Figuras 7a e 7b) revelou sinais de absorções características de estiramentos
de CH de carbono sp
3
em 2857 e 2855 cm
-1
e em 2946 e 2930 cm
-1
; sinais de
absorção de estiramento de carbonila de éster (1739 cm
-1
) para a substância 4
64
e sinal de absorção correspondente ao estiramento O-H de álcool em 3388 cm
-
1
para a substância 3; para ambas as substâncias foi possível observar a sinais
de absorção característica de ligação dupla em 1642 cm
-1
.
O espectro de RMN de
1
H (Figuras 7c e 7d) também apresentou-se
semelhante, porém diferenciando-se no deslocamento químico δ
H-3
: 4,48
multipleto para 4 e δ
H-3
: 3,20 para a substância 3. Um sinal simpleto intenso em
δ
H
: 2,04 correspondente ao grupo CH
3
do grupo acetoxila de 4 e que aparece
no espectro de RMN
13
C em δ
C
80,8 no qual pode-se observar também o δ
C
170,8 correspondente ao carbono quaternário da carbonila (Tabela 3). O
conjunto de dados e a comparação destes com valores descritos na literatutra
(Patra, A., et al, 1981), permitiram propor as estruturas do taraxasterol para 3 e
acetato de taraxasterol para 4.
Os triterpenos 5 e 6 foram identificados pela análise de dados obtidos por CG-
EM (Figura 8 a-c) em combinação com dados de RMN de
1
H e
13
C (Figuras 8
d-e, Tabela 4). A comparação dos δc observados com os valores descritos na
literatura (Olea, R.S., Roque, N.F.; 1990), confirmam a proposta estrutural de
acetato de α-amirina para a substância 5 e de acetato de β-amirina para a
substância 6.
65
Tabela 2: Dados de RMN de
1
H (200 MHz) e
13
C (50 MHz) das substâncias 1 e
2 em CDCl
3
O
O
HO
Acetato de Lupeol
Lupeol
Tipo lupanos
2 1
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
H
1 38,3 38,6
Axial:0,91 (t), Equatorial:1,65 (d)
2 21,3 27,3
Axial:1,57 (d), Equatorial:1,54 (q)
3
80,9
78,8
3,1 (dd)
4 37,7 38,7
5 55,2 55,2 0,67 (d)
6 17,9 18,2
Axial:1,40 (m), Equatorial:1,54 (d)
7 34,1 34,2 1,4 (m)
8 39,9 40,7
9 50,2 50,3 1,2 (d)
10 37,0 37,0
11 20,8 20,8
Axial:1,25 (q), Equatorial:1,49 (d)
12 25,0 25,0
Axial:1,1 (q), Equatorial:1,63 (d)
13 37,9 37,9 1,5 (t)
14 42,7 42,7
15 27,3 27,3
Axial:1,04 (d), Equatorial:1,65 (t)
16 35,5 35,5 1,38 (dt)
17 42,9 42,9
18 48,2 48,2 1,3 (t)
19 47,9 47,9 2,3(m)
20
150,8
150,8
21 29,7 29,7
Axial:1,32 (m), Equatorial:1,87 (m)
22 39,9 39,9
Axial:1,22 (m), Equatorial:1,44 (m)
23 28,0 27,9 0,97 (s)
24 15,9 15,3 0,73 (s)
25 16,1 16,0 0,84 (s)
26 16,4 15,9 1,07 (s)
27 14,4 14,5 0,94 (s)
28 17,4 17,9 0,76 (s)
29
109,3
109,3
Axial:4,53 (d), Equatorial:4,66 (d)
30 19,2 19,2 1,60 (s)
OCOCH
3
170,9
21,2
-
-
66
Figura 6a: Espectro de IV da substância 2
Figura 6d: Espectro de IV da substância 1
67
Figura 6b : Espectro RMN
1
H ( 200 MHz) da substância 2
68
Figura 6c : Espectro RMN
13
C ( 50 MHz) da substância 2
69
Figura 6e: Espectro de RMN de
1
H (200 MHz) da substância 1
Figura 6f: Espectro de RMN de
13
C (50 MHz) da substância 1
70
Tabela 3: Dados de RMN de
1
H (200 MHz) e
13
C (50 MHz) das substâncias 3 e
4 em CDCl
3.
O
O
HO
Acetato de Taraxasterol
Taraxasterol
Tipo taraxastanos
4
3
4 3
C
δ
δδ
δ
C
Literatura
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
Literatura
δ
δδ
δ
C
1 38,3 38,4 38,7 37,7
2 23,6 23,6 27,3 27,3
3
80,8
80,8
79,0 78,9
4 37,7 37,7 38,8 38,7
5 55,3 55,4 55,3 55,3
6 18,1 18,1 18,2 18,2
7 33,9 33,9 34,0 34,0
8 40,8 40,8 39,3 40,8
9 50,3 50,3 50,4 50,4
10 36,9 37,0 37,1 37,0
11 21,4 21,4 21,4 21,3
12 25,5 25,5 25,5 25,5
13 38,7 38,8 38,7 38,7
14 41,9 41,9 42,0 41,9
15 26,5 26,6 26,6 26,6
16 39,0 39,1 39,1 39,1
17 34,4 34,4 34,2 34,4
18 48,5 48,6 48,6 48,5
19 38,3 38,3 38,3 38,2
20
154,3 154,4 154,5
154,4
21 25,4 25,5 25,5 25,4
22 39,3 39,3 39,1 39,2
23 27,8 27,8 27,9 27,9
24 16,4 16,4 15,3 15,2
25 15,8 15,8 16,2 15,8
26 16,2 16,2 16,2 16,1
27 14,6 14,6 15,0 14,6
28 26,0 26,1 26,1 26,1
29 19,4 19,4 19,4 19,3
30
107,1 107,0 107,1 107,0
OCOCH
3
170,8
21,2
170,8
21,1
-
-
-
71
Figura 7a : Espectro de IV da substância 3
Figura 7b: Espectro de IV da substância 4
72
Figura 7c: Espectro RMN
1
H (200 MHz) da substância 3
Figura 7d: Espectro RMN
1
H (200 MHz) da substância 4
73
Figura 7e: Espectro RMN
13
C (75 MHz) das substâncias 3
74
Figura 7f: Espectro RMN
13
C (75 MHz) das substâncias 4
75
Tabela 4: Dados de RMN de
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) das substâncias 5
e 6 em CDCl
3
em comparação com dados da literatura (Handbook of Natural
Products Data, 1994)
Tipo ursano
Tipo oleanólico
acetato de β
ββ
β- amirina
acetato de α
αα
α- amirina
CH
3
COO
CH
3
COO
5 6
α
αα
α
-
amirina
β
ββ
β
-
amirina
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
1 38,34 38,25 38,27 38,27
2 26,60 26,10 26,78 26,49
3 80,86 80,86
78,54 78,54
4 37,64 37,64 38,11 38,14
5 55,20 55,39 54,70 54,75
6 17,46 18,15 17,86 17,96
7 32,81 31,20 32,17 30,78
8 39,10 39,74 39,17 39,34
9 47,94 47,58 47,23 47,28
10 36,65 36,73 36,44 36,46
11 23,18 23,32 22,89 23,04
12
124,25 121,58 123,95 121,26
13
139,55 145,11 139,10 144,68
14 42,12 41,63 41,26 41,62
15 27,95 27,90 27,68 27,64
16 26,55 26,10 26,49 26,16
17 33,68 31,02 33,26 31,99
18 59,00 47,49 58,63 47,18
19 39,55 46,72 39,15 46,37
20 39,55 31,02 39,15 30,57
21 31,20 33,29 31,82 33,26
22 41,49 36,78 41,05 36,68
23 27,89 27,89 27,89 27,89
24 15,50 15,68 15,17 15,12
25 15,50 15,68 15,17 15,12
26 16,75 16,82 16,39 16,34
27 23,32 25,89 23,20 25,56
28 28,02 27,55 28,15 27,64
29
16,29 32,53 16,39 32,83
30
21,36 22,49 20,89 22,78
CH
3
COO
170,85
21,42
170,85
21,42
76
Figura 8a: CG da fração contendo as substâncias 2, 5 e 6
Figura 8b: Espectro de massas para a substância 5
Figura 8c: Espectro de massas para a substância 6
Figura 8d: RMN
1
H (400 MHz) da fração contendo as substâncias 2, 5 e 6
77
Figura 8d: Espectro de RMN
13
C (100 MHz) para a amostra contendo as
substância 2, 5 e 6
78
Figura 8e: Expansão no espectro de RMN
13
C da fração contendo as
substâncias 2, 5 e 6
79
Figura 8f: Expansão para a mesma região no espectro de
13
C-APT da fração
contendo as substâncias 2, 5 e 6
80
5.1.2 ESTERÓIDES e SAPOPNINAS ESTEROIDAIS
O espectro de IV (Figura 9a) da substância 7 apresenta um sinal de
absorção em 3352 cm
-1
(ν
OH
), sinais de absorção intensas em 2930 e 2856 cm
-
1
correspondentes a estiramentos C-H de CH
3
e CH
2
respectivamente e sinais
de absorção características de ν
C=C
em 1650 cm
-1
.
O espectro de RMN
1
H (Figura 9b) revelou feição característica de
esqueleto esteroidal com vários sinais entre 0,8 e 2,0 ppm. Esses sinais podem
ser atribuídos a grupos metílicos, metilênicos e metínicos do esteróide; o um
multipleto em δ
H
3,5 foi atribuída ao H-3 ligado ao carbono que sustenta o
grupo hidroxila. Os sinais dos hidrogênios olefínicos aparecem em δ
H
5,1 (sl) e
em δ
H
4,8 (m) que justifica a atribuição aos hidrogênios H-22/H-23. Espectro de
RMN
13
C (Figura 9c) apresenta, sinais de carbonos sp
2
envolvidos nas ligações
duplas que aparecem em 129,3 (CH) correspondentes aos C-22 e C-23. Os
valores em δ
C
117,3 (CH) e 139,7 (C) e em 138,1 (CH) são compatíveis com
duplas nos carbonos 7/8 ou 9/11 , comparação desses valores com modelos da
literatura (Braz-Filho, R., et al., 1986) permitiram localizar a dupla em 7/8 e
propor a estrutura do Epinasterol para 7 (Tabela 5).
O espectro no IV (Figura 10a) da mistura de 8 e 9 revelou um sinal de
absorção em 3400 cm
-1
correspondente a ν
OH
, sinais de absorção em 2936,
2866 e 1461 cm
-1
referentes à presença de ν
C-H
de CH, CH
2
e CH
3
e em 1127
cm
-1
correspondente a estiramento C-O. A parte esteroidal definida pelo
espectro de RMN
1
H (Figura 10b) apresenta sinais entre δ
H
0,65 e 2,2 ppm
além dos sinais típicos de fitoesteróides observados em δ
H
3,5 (m)
correspondente ao H-3, o multipleto em δ
H
5,05 correspondente H-22/H-23 e o
dupleto largo em δ
H
5,30 referente ao H-6. Estes dados em conjunto com os
fornecidos pelo espectro de RMN
13
C (Tabela 5) permitiram a identificação
destes esteroides como sendo o sitosterol 8 e o estigmasterol 9.
As comparações dos dados obtidos com valores descritos na literatura
(Kojima, H. et al., 1990) confirmam esta proposta.
81
Tabela 5 : Dados de RMN
13
C (50 MHz) para as substâncias 7, 8 e 9 em
CDCl
3
HO
HO
9
8
Estigmasterol
Sitosterol
HO
7
Epinasterol
7 8 9
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
1 37,0 37,2 37,2
2 28,4 31,6 31,6
3 70,8 71,8 71,8
4 34,1 42,3 42,3
5 40,1
140,7 140,7
6 29,6
121,6 121,6
7
117,3
31,9 31,6
8
1394
31,9 31,9
9 49,3 50,1 50,1
10 34,1 36,5 36,5
11 21,4 21,1 21,1
12 39,4 39,6 39,7
13 43,1 42,3 42,3
14 55,7 56,8 56,8
15 22,9 24,3 24,3
16 28,8 28,2 28,9
17 55,7 56,7 55,9
18 12,1 11,8 12,0
19 12,9 19,4 19,4
20 40,7 36,1 40,5
21 21,2 18,8 21,2
22
138,1 33,9 138,3
23
129,3 26,0 129,2
24 51,1 45,8 51,2
25 31,8 28,9 39,1
26 21,4 19,3 21,1
27 18,9 19,8 21,1
28 25,3 23,0 25,4
29 12,1 12,2 12,2
O precipitado obtido da Fração AcEOt. foi tratado com anidrido acético e
piridina (como descrito na seção 4.3) e forneceu o produto natural solúvel em
clorofórmio. O espectro de IV deste produto apresentou absorções fortes em
3400 cm
-1
(
ν
OH
), 1160-1000 cm
-1
(ν
C-O
). Os sinais de absorção em 2850 e
2950 cm
-1
são compatíveis com o esqueleto esteroidal do material (Figura 11a).
A parte aglicona foi definida com padrão esteroidal pelo espectro de RMN de
82
1
H (Figura 11b) que apresentou sinais entre δ
H
0,50 e 1,92 ppm
correspondentes aos grupos metílicos característicos de esteróides e em δ
H
1,97 e 2,19 ppm são observados os sinais correspondentes aos grupamentos
acetoxila.
A diferença na intensidade dos sinais observados nos espectros de RMN
13
C (Figura 11c) e a presença de sinais correspondentes a seis carbonos sp
2
sendo quatro deles mais intensos levaram a deduzir a presença de uma
mistura de esteróides glicosilados.
A localização das ligações duplas nos carbonos C-7/C-8 [δ 117,2 e 139,5
(CH=C)]; e C-22/C-23 [δ 138,2 e 129,4 (CH=CH)] para a saponina esteroidal
10a e nos carbonos C-5/C6 [δ 122,1 e 140,3 (CH=C)]; e C-22/C-23 [δ 138,2 e
129,2 (CH=CH)] para a saponina esteroidal 12a decorreu, principalmente, da
análise dos deslocamentos químicos e das feições dos sinais correspondentes
aos átomos de carbono sp
2
. Esta proposta foi confirmada pela comparação
com dados de substâncias modelo descritas na literatura (Agrawal, P.K., et al.,
1985; Akihisa, T., et al., 1988). Ainda para a parte aglicona, os carbonos sp
2
de
maior intensidade envolvidas em duas ligações duplas foram atribuídas ao
estigmasterol para 12a, identificado como componente majoritário na mistura.
Os sinais de intensidade menor foram atribuídos ao epinasterol 10a.
A caracterização da unidade glicosil foi feita pela análise dos dados no
espectro de RMN de
13
C. O sinal intenso em δ 99,66 de HC-1’, carbono
anomérico, e sinais correspondentes a outros quatro CH em δ
C
71,6 (CH-2’);
71,5 (CH-3’); 68,4 (CH-4’) e 72,8 (CH-5’) além do sinal em 62,0 (CH
2
-6’); ainda
pode-se observar no espectro de RMN
13
C sinais referentes a quatro carbonos
quaternários, característicos de carbonila do grupo acetoxila, além dos sinais
das metilas correspondentes a estes grupos em 19,3; 20,5; 21,0 e 21,3
respectivamente (Tabela 6). Estes dados permitiram propor para 12a e 10a a
mistura de tetra-O-acetil-3-O-
β
-D-glicopiranisil estigmasterol e tetra-O-acetil-3-
O-
β
-D-glicopiranisil epinasterol. Isso permitiu concluir que o precipitado obtido
na fração analisada e a mistura de 3-O-
β
-D-glicopiranisil estigmasterol (12) e 3-
O-
β
-D-glicopiranisil epinasterol (10)
A substância 11 foi identificada através da análise dos espectros do seu
derivado acetilado (11a). O espectro de RMN de
1
H (Figura 12a) apresentou
83
sinais característicos de esteroide com sinais entre δ
H
0,68 e 1,23 ppm de
metilas terciárias, secundárias e primárias e sinais simples em 1,85 e 2,05 ppm
correspondentes as metilas dos grupos acetoxila, foi possível observar,
também, multipletos em δ
H
3,64 (H-3), 4,13 e 5,04 referentes aos hidrogênios
da unidade glicopiranosídica; já no espectro de RMN de
13
C (Figura 12b) foram
observados os sinais referentes a quatro carbonos de C=O em δ
C
169,27 (sinal
intenso atribuído a duas carbonilas); 169,37; 170,31. O sinal em δ
C
99,60
referênte ao carbono anomérico e os sinais correspondentes aos carbonos
olefínicos aparecem em δ
C
140,32 e 122,12 ppm (C-5/C-6). A análise dos
dados em conjunto com a comparação com dados da literatura permitiram
propor a estrutura de 11a como tetra-O-acetil-3-O-
β
-D glicopiranosilsitosterol
(Pessoa, O.D., et al., 1995), e portanto, a substância natural contida nessa
fração é o 3-O-
β
-D glicopiranosilsitosterol (11). Os dados foram resumidos na
Tabela 6.
84
Tabela 6: Dados de RMN
13
C (100 MHz, CDCl
3
) para as saponinas esteroidais
10, 11 e 12.
RO
RO
O
RO
RO
10 R= H
10a R= Ac
3-O-β-D -glicopiranosil Estigmasterol
3-O-β-D -glicopiranosil Epinasterol
3-O-β-D -glicopiranosil Sitosterol
RO
RO
O
RO
RO
RO
RO
O
RO
RO
O
O
O
11 R= H
11a R= Ac
12 R= H
12a R= Ac
10a 11a 12a
β
ββ
β
-D-glicopiranosideo
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
C
C
δ
δδ
δ
C
1 36,6 37,16 37,0 1’ 99,6
2 28,4 29,12 31,9 2’ 71,6
3 80,0 80,04 79,5 3’ 71,5
4 34,4 38,88 39,5 4’ 68,4
5 40,1 140,32 140,3
5’ 72,8
6 29,6 122,12 122,1
6’ 62,0
7 117,2 29,67
29,6 C=O
170,7; 170,4
169,4; 169,3
8 139,5 32,00
31,8
CH
3
19,3
9 49,3 50,14 50,1 20,5
10 34,4 36,09 36,6 21,0
11 21,4 21,01 21,1 21,3
12 39,4 39,71 40,1
13 43,0 42,18 42,0
14 55,8 56,02 56,7
15 22,9 24,00 24,3
16 28,4 28,20 28,8
17 55,8 56,72 56,7
18 12,2 11,81 11,9
19 12,9 18,74 19,3
20 40,8 36,69 40,4
21 21,0 18,94 21,3
22
138,2 33,91 138,2
23
129,4 25,40 129,2
24 51,1 45,81 51,1
25 31,8 29,41 31,8
26 21,4 19,77 21,1
27 18,9 19,00 20,7
28 25,4 26,04 25,4
29 12,2 11,94 12,2
85
Figura 9a: Espectro de IV da substância 7
Figura 9b: Espectro de RMN
1
H (200 MHz, CDCl
3
) da substância 7
86
Figura 9c: Espectro de RMN
13
C(50 MHz, CDCl
3
) da substância 7
87
Figura 10a: Espectro de IV da mistura de 8 e 9
Figura 10b:
Espectros de RMN
1
H e
13
C (200 e 50 MHz, CDCl
3
) da mistura de 8 e 9
88
Figura 11a: Espectro de IV para 10a+12a
Figura 11b: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) para 10a + 12a
89
Figura 11c: Espectro RMN
13
C (100 MHz, CDCl
3
) para 10a+12a
90
Figura 12a: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, CDCl
3
) para 11a
Figura 12b: Espectro de RMN
13
C (100 MHz, CDCl
3
) para 11a
91
5.2.3 DITERPENO
A determinação estrutural da substância 13 foi feita pelas análises dos
espectros de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) 1D (RMN RMN
1
H,
13
C-
HBBD,
13
C-APT) e 2D [
1
H-
1
H-COSY, HMQC, HMBC-
n
J
CH
(n=2 e 3) e
1
H-
1
H-
NOESY], (Figuras 13a -13i) alteração do solvente utilizado para obtenção de
espectros de melhorou a resolução dos sinais observados principalmente para
RMN
1
H (Tabela 7).
A feição e valores de freqüência dos sinais no espectro RMN
1
H indica a
presença de um composto de natureza glicosídica reconhecida pelos sinais
entre δ
H
3,35 – 3,37 ppm (H-2’ – H-5’) e o sinal dupleto em δ
H
5,41 (d, J= 7.8)
que no espectro HMQC correlaciona com o sinal em δ
C
95,49 de carbono
anomêrico correspondente ao CH-1’ confirmando a presença de uma unidade
de açúcar. O sinal observado no espectro de
13
C-APT como um CH
2
em δ
C
62,42 e que mostra interação no espectro HMQC com os hidrogênios em δ
H
3,82 (dl,11.8,) e 3,58 (dd, 11,8, 4,0) foram atribuídos ao CH
2
-6’ da unidade
glicopiranosídica.
Análise comparativa dos espectros de RMN
13
C totalmente desacoplado
e
13
C-APT permitiu propor a fórmula parcial C
6
(CH)
8
(CH
2
)
10
(CH
3
)
2
totalizando
26 carbonos sendo seis deles da unidade açúcar e os 20 restantes
correspondentes a um esqueleto diterpênico. Os sinais referentes aos grupos
metil observados em δ
C
29,16 e 18,39 apresentam correlação no espectro de
HMQC com os simpletos em δ
H
1,23 e 1,09 e foram atribuídos as metilas CH
3
-
18 e CH
3
-20 respectivamente. Os grupos carbonila e vinila foram
caracterizados pelos δ
C
178,66 (C=O -19), 160,8(=C -16) e 108,69 (=CH
2
-17) e
pelos sinais para dois hidrogênios metilênicos de carbonos sp
2
em δ
H
5,14 (s) e
5,05 (s) presentes no espectro RMN
1
H. A confirmação pode ser observada
pelas interações no espectro HMQC entre estes hidrogênios e o C-17.
A interação dos hidrogênios H-17 foram observadas no espectro HMBC
a três ligações com os carbonos em δ
C
42,44 e 78,73 atribuídos aos carbonos
C-13 e C-15 caracterizando a estrutura de um diterpeno caurênico com
oxigenação na posição C-15 mostrando interação no espectro HMQC com o
hidrogênio em δ
H
4,50 (s, CH-15) que apresenta correlação observada no
92
espectro HMBC a duas ligações com o carbono C-16 e a três ligações com 2H-
17. Os valores atribuídos e as correlações observadas estão resumidos na
Tabela 7.
As correlações observadas no espectro
1
H-
1
H-COSY [Figura 13i(1)] e as
interações espaciais observadas no espectro
1
H-
1
H-NOESY permitiram propor
a estereoquímica relativa. A medida obtida de rotação óptica [α]
25
D
= - 87 (em
MeOH) e comparação com dados descritos na literatura para o diterpeno 13
permitiu deduzir a estrutura do (-) – 4R,5S,10R,9R,8R,13R,15R - 9,15-
diidroxicauran-16 em-19-ato de
β
-D-glicopiranosila (Torrenegra, R.; et al.,
1999).
OH
H
HO
H
H
H
H
H
H
CH
3
H
3
C
O
H
H
13
12
14
8
7
6
5
4
3
2
1
10
9
11
17
15
16
20
O
HO
OH
HO
HO
H
H
O
5'
Figura 13i(1): Correlações observadas no espectro
1
H-
1
H-COSY e as
interações espaciais observadas no espectro
1
H-
1
H-NOESY
93
Tabela 7: Dados de RMN uni e bidimensionais de
1
H (400 MHz) e
13
C (100
MHz, MeOD-d
4
e MeOD-d
4
+piridina-d
5
) do diterpeno 13, multiplicidade e
constante de acoplamento J em Hz em ( ).
13a =Derivado acetilad
o
13
1
2
3
4
19
18
10
5
9
6
7
8
14
13
12
16
17
15
20
OH
OH
H
O
O
H
O
OH
OH
OH
OH
13 (MeOD)
HMBC 13 (MeOD+Py)
HMQC
2
J
CH
3
J
CH
HMQC
C
δ
δδ
δ
c
δ
δδ
δ
H
δ
δδ
δ
c
δ
δδ
δ
H
4 45,26 -
3H-18
45,17 -
8 54,14 -
H-15
54,13 -
9 78,05 -
3H-20
77,82 -
10 45,73 -
3H-20
48,35 -
16 160,80 -
H-15; 2 H-17
160,92
-
19 178,66 -
H-1’, 3H-18
178,44
-
CH
5 51,48
1,69
3H-18,
3H-20
51,39 1,83 (m)
13 42,44
2,64 (sl) 2H-17
42,39 2,63 (sl)
15 78,73
4,50 (s) 2H-17
78,89 4,64 (s)
1’ 95,59
5,41 (d; 7,8)
95,67 5,58 (d,7,8)
2’ 74,08
74,14 3,53 (m)
3’ 78,73
78,89 3,49 (m)
4’ 71,12
71,18 3,55 (m)
5’ 78,35
78,28 3,58 (m)
CH
2
1 33,30
1,46 (ddl) 3H-20
33,00 1,21 (dl)
2 20,12
1,67
20,14 1,75 (m)
3 38,85
1,94 3H-18
39,00 2,18
6 22,14
1,89 (s)
22,17 1,79 (m)
7 31,17
1,27 (s)
32,00 1,96 (s)
11 30,76
30,00 1,93 (m)
12 34,88
35,00 1,79 (m)
14 37,71
2,16 H-15
37,50 2,19 (m)
17 108,69
5,14 (s)
5,05 (s)
108,59
5,20 (s)
5,16 (s)
6’ 62,42
3,82 (dl; 11,8)
3,58 (dd; 11,8;
4,0)
62,42
3,94 (dd,2.2)
3,80 (dd,
4.8)
CH
3
18 29,16
1,23 (s)
29,19 1,14 (s)
20 18,39
1,09 (s)
18,44 1,30 (s)
94
Figura 13a: Espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD-d
4
+piridina-d
5
) para 13
95
Figura 13b: Expansão do espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD-d
4
+piridina-
d
5
) para 13
96
Figura 13c: E
spectro de RMN
1
H (400 MHz,
MeOD-d
4
) para o composto 13
97
Figura 13d: Espectro de RMN
13
C (100 MHz, MeOD-d
4
) para o diterpeno 13
98
Figura 13e:
Expansão do espectro de RMN HMQC (400 MHz, MeOD-d
4
) de 13.
99
Figura 13f: Expansão do espectro de RMN HMBC (400 MHz, MeOD-d
4
) de 13.
100
Figura 13g: Expansão do espectro de RMN HMBC (400 MHz, MeOD-d
4
) de
13.
101
Figura 13h: Expansões do espectro de RMN HMBC (400 MHz, MeOD-d
4
) de
13
102
Figura 13i(2): Espectro de RMN
1
H-
1
H-COSY (400 MHz, MeOD-d
4
) de 13.
103
5.2.4 DERIVADOS DO ÁCIDO CINÂMICO
Os derivados do ácido cinâmico isolados neste trabalho são importantes
intermediários para a biossíntese de cumarinas, xantonas e cromonas. A
fotoisomerização da ligação dupla do ácido cinâmico E → Z leva a formação de
cumarina por lactonização espontânea do isômero Z.
As substâncias 14, 15 e 16 foram identificadas em mistura. A elucidação
das estruturas para estes compostos foi possível através da analise dos
espectros de RMN
1
H e
13
C (Figura 15c-f). O cromatograma (Figura 15b) obtido
para a amostra contendo estas substâncias mostrou três picos sendo um deles
majoritário na mistura. O espectro de RMN
1
H mostrou vários sinais duplicados
na região de hidrogênios aromáticos com intensidades diferentes. A análise
dos deslocamentos químicos, a multiplicidade e os valores das constantes de
acoplamento (J) dos sinais em δ
H
6.97 (dl, 7,7; H-3E), 6.98 (dd, 7,7, 1,8, H-4E),
7,85(tl, H-5E) e 7,37 (dd, 8,6, 2,9, H-6E); 6,81 (d, 7,0, H-3Z), 7,14 (dd, 7,0, 1,8,
H-4Z), 7,16 (tl, 7,0, H-5Z) e 7,62 (dd, 8,8, 1,6, H-6Z) além dos sinais 6,78 (dl, H-
3D), 7,05 (dd, 7,8, 1,6, H-4D), 6,76 (tl, H-5D) e 7,45 (dd, 7,8, 1,6, H-6D)
permitiram reconhecer a presença de três anéis aromáticos orto-dissubstituídos
atribuídos para os compostos 14, 15 e 16, respectivamente.
Sinais correspondentes a hidrogênios olefínicos conjugados observados
em δ
H
7,86 (d, 16,1, H-7E), 6,55 (d, 16,1, H-8E) e 7,94 (d, 9,4, H-7Z), 6,42 (d,
H-8Z) foram atribuídos para os isômeros E (14) e Z (15), respectivamente. Para
a substância 16 (Diidro) os deslocamentos referentes aos hidrogênios H-7 e H-
8 foram observados em 2.84 (t, 7,2, H-7D) e 2,51 (t, 7,2, H-8D). As
intensidades dos sinais referentes aos hidrogênios H-7 e H-8 para as três
moléculas permitiu deduzir que a substância 14 é o componente majoritário na
mistura seguida de 16 e tendo a substância 15 como componente minoritário.
No espectro de RMN
13
C pode-se observar sinais referentes a presença
de carbonila em δc 173,51 (C=O-9, 14 e 15) e 162,50 (C=O-9, 16). A
comparação dos dados com os modelos descritos na literatura (POURCHERT,
C.J.; et al., 1993) serviram de referência para as atribuições dos
deslocamentos químicos de
13
C. Na Tabela 8 encontram-se os valores
104
atribuídos para δ de
1
H e
13
C para as substâncias 14, 15 e 16 derivados do
ácido cinâmico orto-hidroxilados.
Tabela 8: Dados RMN
1
H e
13
C (400 e 100 MHz, MeOD-d
4
) para as
substâncias 14, 15 e 16, multiplicidade e valores de constante de acoplamento
em ().
OH
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
O
14
15
16
14
E
15
Z
16
Diidro
C
δ
C
δ
H
δ
C
δ
H
δ
C
δ
H
1 121,89
- 123,37
- 132,73
-
2 157,81
- 157,81
- 156,34
-
9 173,51
- 173,51
- 162,50
-
CH
3 116,62
6,97 (dl, 7,7) 116,92
6,81 (d, 7,0) 115,74
6,78 (dl)
4 128,21
6,98 (dd, 7,7, 1,8) 129,51
7,14 (dd, 7,0, 1,8)
130,57
7,05 (dd, 7,8, 1,6)
5 120,66
7,85 (tl) 120,66
7,16 (tl, 7,0) 121,89
6,76 (tl)
6 129,51
7,37 (dd, 8,6, 2,9) 131,81
7,62 (dd, 8,8, 1,6)
131,13
7,45 (dd, 7,8, 1,6)
7
139,95
7,86 (d, 16,1) 139,95
7,94 (d, 9,4)
- -
8
120,66
6,55 (d, 16.1) 116,92
6,42 (d, 9,4)
- -
CH
2
7 -
27,59 2,84 (t, 7,2)
8 -
37,56 2,51 (t, 7,2)
OH
O
OMe
HO
O
OMe
138
.
93
1
1
2
23
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
130
.
85
157
.
71
120.52
122.25
111
.
20
131.36
119.11
128.18
168.11
172.02
118
.
91
141
.
4
123
.
55
157
.
09
110
.
25
130
.
68
119
.
95
Figura 15a:
Modelos utilizadas para a comparação de dados e atribuição dos
δ
c
105
A elucidação estrutural das substâncias 17, 18 e 19 baseou-se na
análise de dados fornecidos por métodos espectrométricos, principalmente,
RMN
1
H (400MHz) e
13
C (100 MHz) 1D (RMN RMN
1
H,
13
C-HBBD,
13
C-APT) e
2D [
1
H-
1
H-COSY, HMQC, HMBC-
n
J
CH
(n=2 e 3) e
1
H-
1
H-NOESY], (Figuras 16
a-h). As substâncias 17-19 foram identificadas em mistura.
A feição do espectro RMN
1
H apresenta sinais entre 3,38 e 3,90 ppm
sugerindo a presença de açúcar na molécula, o que pode ser confirmado pelos
sinais referentes aos carbonos anoméricos em δc 102,43 e 102,58 este último
com intensidade consistente para a sobreposição de dois carbonos CH-1’ de
unidades glicosídicas. Estes dados junto com os sinais observados em 62,55 e
62,48 (sinal forte) identificados no espectro de
13
C-APT como carbonos
metilênicos e que mostram correlações a uma ligação no espectro HMQC com
os hidrogênios em δ
H
3,91-3,84 e 3,72-3,65 confirmam a presença de três
unidades glicopiranosídicas. Interações a três ligações observadas no espectro
HMBC entre o H-1’ [δ
H
4,97 (d, 7,7 para 17), 4,92 (d, 7,7 para 18) e 4,90 (d, 7,5
para 19)] e os carbonos em δc 157,49, 156,53 e 157,00 atribuídos aos
carbonos quaternários aromáticos C-2 para 17, 18 e 19, respectivamente,
confirmam a posição do glicopiranosil no carbono -2.
Os espectros unidimensionais RMN
1
H (subtraindo-se os sinais
referentes as unidades de açúcar) são semelhantes aos espectro RMN
1
H para
as moléculas 14 – 16 observadas pelos sinais em δ
H
2,60 (t, 7.8) e 2,95 (m)
correspondentes aos CH
2
-7 D e CH
2
-8 D que no espectro HMQC apresenta
correlação com os carbonos em δc 27,07 e 35,63 identificados no espectro de
13
C-APT como carbonos metilênicos atribuídos aos C-7 e C-8 para o composto
19 derivado do ácido cinâmico hidrogenado. Sinais característicos para os
isômeros E e Z foram observados no espectro RMN
1
H em δ
H
8,08 (d, 16,1),
6,52 (d, 16,1) e 7,22 (d, 12,5) 5,97 (d, 12,5) que apresentam correlação a uma
ligação observadas no espectro HMQC com os carbonos em δc 140,72, 120,19
e 137,57, 122,43 respectivamente, estes sinais são identificados no espectro
de
13
C-APT como carbonos metínicos atribuídos aos CH-7 e CH-8
respectivamente para os isômeros 17 e 18, ainda neste espectro podem ser
observados os sinais correspondentes a carbonos quaternários em δc 171,71,
171,33 e 177,93 referentes aos C=O – 9 para 17, 18 e 19 respectivamente.
106
Na Tabela 9 estão resumidas as atribuições dos deslocamentos
químicos observados para
1
H e
13
C e as correlações observadas nos espectros
bidimensionais. Espectros de
1
H-
1
H- COSY e
1
H-
1
H-NOESY forneceram
informações das interações dos hidrogênios que serviram para confirmar as
atribuições dos δ
H
para os compostos 17, 18 e 19 (Figura 16h).
107
Tabela 9:
Dados de RMN 1 e 2D
1
H (400MHz, MeOD) e
13
C (100 MHz) dos
compostos 17, 18 e 19 [multiplicidade e constantes de acoplamento J em Hz em ( )].
OH
O
O
HO
O
OH
OH
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
6'
5'
4'
3'
2'
1'
8
7
6
5
4
3
2
1
O
HO
O
OH
OH
OH
HO
O
6'
5'
4'
3'
2'
1'
9
8
7
6
5
4
3
2
1
O
HO
O
OH
OH
OH
OH
O
17
18
19
17
E
18
Z
19
Diidro
C HMQC HMBC HMQC HMBC HMQC
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
H
1 125,55
-
H-5, H-8
126,97
-
H-8
131,51
-
2 157,49
-
H-1’,
H-4,H-6
156,53
-
H-1’
157,00
-
9 171,71
-
H-7
171,33
-
H-4,
H-6
177,83
-
CH
3 116,90
7,24 (dl, 8.0) H-4 H-5
116,41
7,17
(dl, 7,7)
116,28
7,15 (d, 7,3)
4 132,64
7,35 (dl, 8,0,
1,8)
H-6
131,06
7,27
(dt, 7,7,
1,1)
H-6
128,70
7,27 (tl)
5 123,58
7,04 (tl, 8,0)
H-3
122,78
6,94
(tl, 7,7)
H-3
123,39
6,92 (dd)
6 128,25
7,61 (dd, 8,0,
1,8)
H-4,H-7
131,43
7,54
(dd,
7,7;1,1)
H-4
130,97
6,90
7 140,72
8,08 (d, 16,1)
H-6
137,57
7,22
(d, 12,5)
H-6
-
2,95 (m)
8 120,19
6,52 (d, 16,1)
122,43
5,97
(d, 12,5)
-
2,60 (t, 7,8)
1’ 102,43
4,97 (d, 7,7)
102,58
4,92
(d, 7,7)
102,58
4,90 (d, 7,5)
2’ 75,00
3,56 (dd, 7,7,
8,8)
74,89
3,50-3,43
74,86
3,56 (dd)
3’ 78,12
3,50-3,43
78,08
3,00-3,43
78,16
3,00-3,43
4’ 71,37
3,42-3,38
71,28
3,42-3,38
71,28
3,42-3,38
5’ 78,25
3,42-3,38
78,14
3,42-3,38
78,20
3,42-3,38
CH
2
6’ 62,55
3,91-3,84
3,72-3,65
62,48
3,91-3,84
3,72-3,65
62,48
7
-
-
-
-
27,07
2,95 (m)
8
-
-
-
-
35,63
2,60 (t,7.8)
108
.
Figura 15b: Cromatograma obtido para a amostra contendo 14, 15 e 16
109
Figura 15c:Espectro de RMN
1
H (400 MHz, MeOD-d
4
) obtido para 14, 15 e 16
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