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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
SARA MARIA DE CARVALHO E SUZANO
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade
Estadual Paulista “Julio de mesquita Filho” –
UNESP, Campus de Botucatu, para obtenção do
título de Doutor em Medicina Veterinária, área
de Patologia Veterinária.
Orientador: Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira
BOTUCATU – SP
MARÇO, 2007
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Suzano, Sara Maria de Carvalho e.
Avaliação da proliferação, índice apoptótico e expressão do P53 nos
linfomas caninos / Sara Maria de Carvalho e Suzano. – Botucatu [s.n], 2007.
Tese (doutorado) –
Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2007.
Orientador: Julio Lopes Sequeira
Assunto CAPES: 50503006
1. Cão - Doenças 2. Linfoma 3. Câncer em cão 4. Apoptose
CDD 636.70896994
Palavras-chave: Apoptose; Canino; Linfoma; Proliferação
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TESE DE DOUTORADO
SARA MARIA DE CARVALHO E SUZANO
Composição da Banca Examinadora
______________________________________________
Orientador: Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira
______________________________________________
Prof
a
Adj. Adriana Warderley de Pinho Pessoa
_____________________________________________
Prof
a
Ana Paula Frederico Bracarense
______________________________________________
Prof
a
Ass. Dra. Renée Lauder Amorim
______________________________________________
Prof
a
Dra. Noeme Sousa Rocha
DEDICO.
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AGRADEÇO.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP,
pela concessão do auxílio financeiro que possibilitou esta pesquisa.
As docentes do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ – UNESP.
Professora Assistente Doutora Renée Laufer Amorim e Professora
Doutora Noeme Sousa Rocha muito obrigada pelos ensinamentos e amizade
e confiança, não só no decorrer deste trabalho, mas desde os meus primeiros
passos profissionais.
Ao Professor Assistente Doutor Deílson Elgui de Oliveira e ao técnico de
laboratório Marcos Roberto Franchi, por toda a ajuda na padronização da
imunoistoquímica.
Aos funcionários do Serviço de Patologia Veterinária. Ao técnico de necropsia
Maury Raul, pela inestimável dedicação na sala de necropsia e ao técnico do
Laboratório de Histologia Noel Melo, pelos ensinamentos no processamento
do material.
À pós-graduanda Camila Dias Porto por tantas vezes que pedi algo quase
impossível, e ela rapidamente fez. Por exemplo, Camila meu relatório
financeiro, com todas as notas fiscais, está pronto?
À Doutora e hoje amiga, Adriana Wanderlei de Pinho Pessoa, por toda
alegria, dedicação e companheirismo na realização dos nossos trabalhos (eles
ficaram lindos).
As Universidades Castelo Branco e do Grande Rio , principalmente aos
coordenadores de curso Marcelo Pacheco e Irineu Benevides, que
permitiram meus afastamentos, em algumas vezes freqüentes e deram além de
apoio, incentivo para a realização desta tese.
Aos queridos amigos conquistados nestes anos no Rio de Janeiro,
principalmente a Dala Kezen, uma amiga acima de tudo, sempre com uma
palavra de ânimo e coragem além do amor e carinho que é inerente a ela. Uma
pessoa maravilhosa.
À minha companheira fiel de tantos momentos maravilhosos e outros não muito
bons, Fabiana Batalha, muito obrigada pela amizade (e pela estatística, é
claro).
A Rosaura Leite Rodrigues, uma parceira dedicada nas disciplinas, com
muita responsabilidade sempre me lembrando de tudo, anotando tudo e ainda
me socorrendo nas lâminas mais estranhas.
Aos amigos muito mais que especiais, Renée, Rogério, Sofia e Cecília mais
uma vez pelos momentos “família” em que me acolheram (tantas vezes durante
muitos dias) com tanto carinho e alegria. Muito obrigada, com certeza a vida
continuou mais fácil e gostosa. Nunca me esquecerei da discussão feita a seis
mãos, eu e minhas ajudantes amadas Sofia e Ceci.
Ao Rodrigo Mannarino, por me mostrar que às vezes ele realmente tem
razão, isso não foi fácil, mas sempre necessário.
A todos os meus alunos da UCB e da UNIGRANRIO que em algum momento
me ajudaram, me compreenderam e me ensinaram durante este período de
pesquisa.
Aos Médicos Veterinários Residentes e pós-graduandos da Patologia
Veterinária pelo auxílio neste trabalho durante as minhas inúmeras ausências.
E finalmente agradeço, com muito respeito, aos animais que participaram
involuntariamente desta pesquisa. Este trabalho foi realizado, para melhorar as
condições e qualidade de vida aos nossos pacientes.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Números e padrões de distribuição dos AgNORs dentro do núcleo
celular. (VALJDOVICH et al., 2004)...................................................................07
TABELA 2: Classificação Anatômica dos Linfomas Caninos segundo JACOBS
et al. (2002)........................................................................................................13
TABELA 3: Estadiamento Clínico dos Linfomas Caninos proposto pela
Organização Mundial de Saúde (OWEN, 1980; GRAY et al, 1984)..................14
TABELA 4: Diluições estabelecidas para os anticorpos anti-CD-3, anti- CD79a,
anti-Ki-67 (MIB-1), anti-Caspase-3 e anti-p-53..................................................18
TABELA 5: Distribuição racial dos 40 animais portadores de linfomas
caninos...............................................................................................................21
TABELA 6: Distribuição por sexo dos 40 animais portadores de linfomas
caninos...............................................................................................................22
TABELA 7: Idade dos 40 animais portadores de linfomas caninos..................22
TABELA 8: O estadiamento clínico proposto pela Organização Mundial de
Saúde (OWEN, 1980; GRAY et al., 1984) nos 40 animais portadores de
linfomas caninos................................................................................................22
TABELA 9: Classificação anatômica dos linfomas caninos, nos 40 animais....22
TABELA 10: Grau de malignidade 40 casos de linfomas caninos de acordo
com a classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990)................................23
TABELA 11: Grau de malignidade 40 casos de linfomas caninos de acordo
com a classificação Working Formulation (NCI-WF, 1982)...............................23
TABELA 12: Linfomas de baixo e alto grau de malignidade de acordo com a
classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990)..........................................24
TABELA 13: Imunofenotipagem dos linfomas caninos.....................................26
TABELA 14: relação entre o imunofenótipo e a classificação de Kiel
(LENNERT & FELLER, 1990)............................................................................26
TABELA 15: Número de casos, média e desvio-padrão do número de AgNORs
nas células neoplásicas de acordo com a classificação de Kiel (LENNERT &
FELLER, 1990)..................................................................................................27
TABELA 16: Número, média e desvio-padrão do índice de proliferação celular
utilizando anticorpo anti-Ki-67 (MIB 1), de acordo com a classificação de Kiel
(LENNERT & FELLER, 1990)............................................................................28
TABELA 17: Número, média e desvio-padrão do índice de apoptose utilizando
anticorpo anti-caspase-3, de acordo com a classificação de Kiel (LENNERT &
FELLER, 1990)..................................................................................................29
TABELA 18: Número, média e desvio-padrão do índice de apoptose utilizando
anticorpo anti-caspase-3 nos linfomas de alto e baixo grau de malignidade, de
acordo com a classificação de Kiel (LENNERT & FELLER,
1990)..................................................................................................................29
TABELA 19: Número, média e desvio-padrão da expressão de p-53, de acordo
com a classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990)................................30
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Linfoma Centrocítico-centroblástico (Kiel), a população de células
neoplásicas apresentam-se às vezes pequenas com núcleo clivado e outras
grandes com núcleolos múltiplos. HE................................................................31
FIGURA 2: Linfoma Imunoblástico (Kiel). As células apresentam núcleo
redondo com um único nucléolo central. HE.....................................................31
FIGURA 3: Linfoma Centroblástico (Kiel). As células neoplásicas apresentam
nucléolos múltiplos e periféricos. HE.................................................................32
FIGURA 4: Linfoma Linfoblástico (Kiel). Presença de células médias, núcleo
redondo e sem nucléolos evidentes. HE...........................................................32
FIGURA 5: Linfoma T. Positividade para o anticorpo primário anti-CD3, ABC,
DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris...............................................33
FIGURA 6: Linfoma B. Positividade para o anticortpo primário anti-CD79a,
ABC, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris......................................33
FIGURA 7: Linfoma Imunoblástico – múltiplos AgNORs distribuídos pelo núcleo
das células neoplásicas e algumas células apresentando um único ponto
nuclear (1000x)..................................................................................................34
FIGURA 8: Linfoma Imunoblástico – múltiplos AgNORs distribuídos pelo núcleo
das células neoplásicas e algumas células apresentando um único ponto
nuclear (1000x)..................................................................................................34
FIGURA 9: Linfoma Imunoblástico (Kiel) – positividade para anticorpo anti- Ki-
67 (MIB 1), EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris............35
FIGURA 10: Linfoma T pleomórfico (Kiel) – positividade para anticorpo anti- Ki -
67 (MIB 1), EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris............35
FIGURA 11: Linfoma Imunoblástico (Kiel) – positividade para anticorpo anti-
caspase-3, EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.............36
FIGURA 12: Linfoma Centroblástico (Kiel) – positividade para anticorpo anti-
caspase-3, EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.............36
FIGURA 13: Linfoma Imunoblástico (Kiel) – positividade para anticorpo anti-
p53, EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.......................37
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................01
ASBTRACT............................................................................................02
1. INTRODUÇÃO........................................................................................03
2. REVISÃO DE LITERATURA..................................................................05
3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................13
3.1 Procedência do material....................................................................13
3.2 Processamento do Material...............................................................14
3.3 Aplicação das classificações dos lInfomas não-Hodgkin humano nos
linfomas caninos................................................................................15
3.4 Avaliação Histoquímica.....................................................................15
3.4.1 Argyrophil Nucleolar Organizer Regions – AgNORs...............15
3.5 Técnicas Imunoistoquímicas…………………………………………....16
3.5.1 Imunofenotipagem dos Linfomas Caninos……...……………..16
3.5.2 Avaliação Imunoistoquímica dos índices de proliferação
celular, de apoptose e a expressão do p-53...........................17
3.6 Análise imunoistoquímica..................................................................19
3.7 Análise Estatística.............................................................................20
4. RESULTADOS.......................................................................................21
4.1 Dados clínicos dos animais...............................................................21
4.2 Aplicação das Classificações de Kiel e Working Formulation nos
linfomas caninos................................................................................23
4.3 Imunofenotipagem.............................................................................25
4.4 Índice de proliferação celular pelo método do AgNORs....................26
4.5 Índice de proliferação celular pelo método do Ki-67 (MIB-1)............27
4.6 Índice de Apoptose pelo método da Caspase-3................................28
4.7 Expressão de p-53............................................................................30
5. DISCUSSÃO...........................................................................................38
5.1 Dados clínicos...................................................................................38
5.2 Classificação Morfológica..................................................................40
5.3 Imunofenotipagem.............................................................................41
5.4 Correlação entre a Classificação Morfológica e o Imunofenótipo.....43
5.5 Índice de proliferação celular pelo método do AgNORs....................44
5.6 Índice de proliferação celular pelo método do Ki-67 (MIB-1)............46
5.7 Índice de Apoptose pelo método da Caspase-3................................47
5.8 Expressão de p-53............................................................................49
6. CONCLUSÕES.......................................................................................52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................53
8. TRABALHO CIENTÍFICO.......................................................................63
RESUMO
SUZANO, S.M.C. Avaliação da Proliferação Celular, índice apoptótico e
expressão do p-53 linfomas caninos. Botucatu, 2007. 72p. Tese de
Doutorado, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia.
O estudo dos linfomas caninos além de abordar a classificação morfológica
e imunofenotípica necessita ser ampliado para que se tenha a avaliação da
cinética celular. Esta verificação só pode ser feita com segurança quando
são avaliados não só os parâmetros que indicam a taxa de proliferação
celular, mas também aqueles relacionados a apoptose, bem como a
expressão de proteínas responsáveis por este evento. No homem, muitas
vezes a determinação da taxa de proliferação e os marcadores de apoptose
têm influência preponderante no prognóstico e no tratamento destas
neoplasias e o mesmo deve ocorrer nos linfomas caninos, uma vez que os
linfomas nesta duas espécies possuem comportamento biológico muito
semelhante. Nesta pesquisa, foram utilizados 40 casos de linfomas caninos.
Estes foram classificados de acordo com as classificações de Kiel e Working
Formulation (WF), e realizada a imunofenotipagem utilizando marcadores
para linfócito T (CD3) e para linfócitos B (CD79a). A proliferação celular foi
avaliada pelos métodos de contagem dos AgNORs e células imunopositivas
para Ki-67 (MIB-1) e o índice apoptótico foi avaliado pela caspase-3. Foi
verificada também a expressão do p-53 mutante. De acordo com as
classificações de Kiel e WF os linfomas de alto grau foram os mais
freqüentes, a imunofenotipagem mostrou a mesma freqüência de linfomas T
e B. Quando avaliada a proliferação celular, houve diferença significativa
entre os linfomas de alto e baixo grau tanto pelo método do AgNOR como
pela expressão do KI-67 (MIB-1), mas sem significância em relação ao
imunofenótipo. Entre as neoplasias de alto grau de malignidade a média de
número de NORs por núcleo de célula neoplásica foi de 1,37 ± 0,32, e nos
casos de baixo grau de 0,98 ± 0,36. De acordo com o KI-67 a média do
percentual de células positivas foi de 43,19% ± 19,01 e 14,09% ± 11,74 nos
casos de alto e baixo grau, respectivamente.O índice de apoptose pela
caspase-3 e a expressão do p53 não apresentaram diferenças entre as
neoplasias de alto e baixo grau, nem entre os diferentes imunofenótipos.
Palavras-chaves: Linfoma; canino; proliferação; apoptose; p-53
ABSTRACT
SUZANO, S.M.C. Cellular proliferative evaluation, apoptotic index and p-53
expression in canine lymphomas. Botucatu, 2007. 72p. Tese de Doutorado,
Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia.
Lymphoma studies deals with morphological classification and
immunophenotypic features, but they have to be amplified for cellular kinetics
evaluation. This evaluation can only be safely made, when not only
proliferative index are evaluated, but also when apoptosis and some proteins
involved in this processes are studied. In men the proliferative index and
apoptosis markers have, most of the time, important influence in neoplasia
prognosis and treatment, and the same thing should happen with canine
lymphoma, once lymphoma in humans and dogs share similarities in
biological behavior. In this work it was used 40 canine lymphomas were
classified according to Kiel and Working Formulation (WF) methods and
immunophenotype was achieved with T lymphocyte marker (CD3) and B
lymphocyte marked (CD79a). Cellular proliferation was evaluated by
AgNORs and Ki-67 (MIB-1) and apoptotic index by caspase-3. Mutant p-53
expression was also verified. According to Kiel and WF classification system,
high grade lymphomas were more frequent and T and B lymphoma showed
the same frequency. When cellular proliferation was evaluated, there was a
significant difference between high grade and low grade lymphomas by
AgNOR and Ki-67 (MIB-1) methods, but did not differ when comparing
immunophenotype. Among high grade malignancy lymphomas the NORs
medium number per cell nucleoli was 1.37± 0.32 and in low grade was 0.98±
0.36. Concerning Ki-67 the positive cellular percentual was 43.19% ± 19.01 e
14.09% ± 11.74 in high and low grade, respectively. Apoptotic index and p53
expression did not show differences between high and low grade lymphoma,
neither when comparing immunophenotype.
Key-words: Lymphoma; canine; proliferation; apoptosis; p-53
1. INTRODUÇÃO
Linfoma é uma das neoplasias mais freqüentes na espécie canina e
representa cerca de 7 a 24% de todas as neoplasias caninas e 83% dos
tumores de origem hematopoiética. Anatomicamente, os linfomas caninos são
classificados em: multicêntrico, digestivo, tímico, cutâneo e solitário. Ainda
pode-se classificá-los de acordo com o grau de malignidade em linfomas de
baixo, médio e alto grau e quanto ao imunofenótipo em linfomas T, linfomas B
ou ainda em linfomas T/B.
Como os linfomas caninos apresentam características semelhantes aos
dos linfomas não-Hodgkin humanos, as classificações morfológicas destes
linfomas não-Hodgkin humanos têm sido adotadas por diversos autores no
estudo deste tipo de neoplasias em cães (GREENLEE et al., 1990; TESKE,
1994a; FOURNEL-FLEURY et al., 1997 e FOURNEL-FLEURY et al., 2002).
Nos seres humanos a associação do tipo morfológico com o índice de
proliferação celular e apoptose da neoplasia é muito importante para a
determinação do prognóstico e do tratamento (FOURNEL-FLEURY et al., 1997;
KIUPEL et al., 1999). Além destes índices, outro fator importante na evolução
da doença é a expressão da p-53 mutante pelas células neoplásicas.
Nos cães a aplicação destes índices, tanto de proliferação celular como
de apoptose, tem sido utilizada com os mesmos objetivos, sendo sempre
analisados em conjunto com o tipo celular da neoplasia, por meio das
classificações morfológicas e da determinação de seu inumofenótipo
(FOURNEL-FLEURY et al., 1997; KIUPEL et al., 1999; PHILLIPS et al., 2000).
Diante do exposto, o presente trabalho teve como principais objetivos:
Avaliar a taxa de proliferação dos linfomas caninos utilizando o
método histoquímico de AgNORs e método imunoistoquímico
para evidenciação da expressão do Ki-67 (MIB-1).
Avaliar o índice apoptótico dos linfomas caninos utilizando o
método imunoistoquímico para evidenciação da expressão da
Caspase-3.
Avaliar a expressão do p53 mutante nos linfomas caninos por
meio de método imunoistoquímico.
Correlacionar as características citológicas e imunofenotípicas
dos linfomas caninos aos seus índices proliferativos e
apoptóticos, e a expressão do p53.
2. REVISÃO DE LITERATURA
Os linfomas estão entre as neoplasias mais freqüentes na espécie
canina (CAPURRO et al., 1992; TESKE 1994a e 1994b; MILNER et al., 1996;
VONDEHAAR & MORRISON, 1998). Nesta espécie sua incidência é de 6 a 30
casos em cada 100.000 cães/ano (VONDEHAAR & MORRISON, 1998), sendo
maior que na espécie humana (APPELBAUM et al., 1984; GREENLEE et al.,
1990; JACOBS et al., 2002). Ocorrem mais freqüentemente em animais entre 5
e 11 anos (SEQUEIRA & FRANCO, 1992; VALLI et al., 1993; JONES et al.,
1997; SEQUEIRA et al., 1999 e JACOBS et al., 2002), não havendo predileção
por sexo (TESKE 1994a; VONDEHAAR & MORRISON, 1998). A etiologia
deste tipo de neoplasia é desconhecida, não tendo sido confirmada a
participação de agentes virais ou químicos no seu aparecimento (HAYES et al.,
1995; TESKE 1994a; HAYES et al., 1995; GAVAZZA et al., 2001).
Os sinais clínicos relacionados aos linfomas dos cães são, muitas
vezes, inespecíficos, mas linfadenopatia indolor, perda de peso progressiva,
caquexia, edema local ou generalizado, apatia e emese são os mais
comumente encontrados. Os sinais clínicos dependem do órgão ou órgãos
envolvidos. Anatomicamente, os linfomas caninos são classificados em:
multicêntrico, digestivo, tímico, cutâneo e solitário ou extranodal, sendo a forma
multicêntrica a mais freqüente (JACOBS et al., 2002).
Do ponto de vista etiológico, epidemiológico, clínico, morfológico e
imunofenotípico os linfomas caninos apresentam muitas semelhanças com os
linfomas não-Hodgkin humanos. Nas duas espécies, este tipo de neoplasia
mostra características comuns suficientes para embasar a proposição de se
utilizar a doença do cão como modelo experimental, permitindo o teste de
terapias e procedimentos clínico-cirúrgicos, antes de sua utilização no homem
(GREENLEE et al., 1990; TESKE 1994a e FOURNEL-FLEURY et al., 1997).
Esquemas de classificação morfológica propostos para os linfomas
não-Hodgkin humanos, como as classificações de Kiel e da Working
Formulation, têm sido aplicados com sucesso por diversos autores nos
linfomas da espécie canina, mostrando que nestes as neoplasias de alto grau
são as mais freqüentes (GREENLEE et al., 1990; TESKE 1994a; FOURNEL-
FLEURY et al., 1997 e FOURNEL-FLEURY et al., 2002). No homem, as
características morfológicas destas neoplasias servem como base para o
estabelecimento do prognóstico e de protocolos de tratamento (ASTER et al.,
1999; MILITO et al., 2002 e MELLANBY et al., 2002). No cão, a classificação
de Kiel mostrou sua importância para o prognóstico, no que diz respeito à
determinação do tempo de remissão em animais tratados, enquanto que a
classificação da Working Formulation tem importância maior no prognóstico do
tempo de sobrevida (TESKE et al., 1994b).
O emprego de técnicas imunológicas no estudo e classificação das
desordens linfoproliferativas tem se mostrado particularmente importante no
estabelecimento de um diagnóstico preciso (CANIATTI et al., 1996).
Atualmente, nos seres humanos, a imunofenotipagem é indispensável para
determinar o diagnóstico de linfoma não-Hodgkin de acordo com as
classificações mais atuais, Kiel (LENNERT & FELLER, 1990), Real (HARRIS et
al. 1994) e WHO (JAFFE et al. 2001). Em trabalho de pesquisa em nosso
laboratório, tivemos a oportunidade de padronizar a marcação imunofenotípica
de linfomas caninos utilizando o anticorpo policlonal anti-CD3 para marcar
linfomas de células T e o anticorpo monoclonal anti-mb1 (CD79a) para marcar
linfomas de células B (DE MOURA et al., 2000). Nos cães, assim como no
homem, o imunofenótipo T dos linfomas tem sido associado a um prognóstico
ruim, com sobrevida menor e períodos de remissão mais curtos, quando
comparado aos linfomas de células B (KIUPEL et al., 1999; DOBSON et al.,
2001).
Em estudos sobre neoplasias, inclusive linfomas, pode-se observar a
necessidade de avaliar, além do imunofenótipo, o índice de proliferação
celular e a taxa de apoptose das células neoplásicas (KIUPEL et al., 1999).
A proliferação celular relacionada com as neoplasias tem sido
amplamente estudada por mostrar uma boa correlação com o
comportamento biológico destes tumores e adicionar informações que
orientem o tratamento e o prognóstico (ROELS et al., 1999).
Existem muitos métodos de avaliação da proliferação celular, entre
estes podem ser citadas técnicas simples como a contagem das figuras de
mitose ou métodos mais sofisticados como a contagem dos AgNORs
(Argyrophil Nucleolar Organizer Regions) por métodos histoquímicos e a
avaliação imunoistoquímica, utilizando-se a marcação dos antígenos Ki-67
(MIB-1) e PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) (GRIFEY et al., 1999).
As figuras de mitoses são contadas no corte histológico
empregando-se colorações de rotina. Um dos maiores problemas deste
método é que o período de mitose é muito curto dentro do ciclo celular,
portanto células em proliferação podem não ser detectadas e o índice
proliferativo será subestimado (GRIFFEY et al., 1999). Deve-se ressaltar que
este método ainda é muito utilizado na rotina laboratorial para a avaliação do
comportamento biológico das neoplasias.
O índice de proliferação pode ser determinado também por meio de
métodos histoquímicos, utilizando-se a contagem dos AgNORs. Estes são
estruturas presentes nos núcleos celulares, relacionadas com a síntese de
proteínas nas células em proliferação. O grande número de AgNORs reflete
um alto índice de proliferação e a intensidade da marcação indica a
velocidade do ciclo. Esses parâmetros têm sido utilizados com grande
eficácia nos linfomas do homem e do cão. As neoplasias de grau alto de
malignidade possuem um número maior de AgNORs intranucleolares e
estes apresentam-se distribuídos difusamente enquanto os tumores de grau
baixo de malignidade possuem AgNORs agregados dentro dos nucléolos
(CROCKER et al., 1988).
De acordo com a contagem e o padrão de distribuição dos NORs
nos núcleos, Valjdovich et al., em 2004, estabeleceram três grupos que
estão descritos na tabela abaixo (Tabela 1).
TABELA 1: Números e padrões de distribuição dos AgNORs dentro
do núcleo celular. (VALJDOVICH et al., 2004).
GRUPO CARACTERÍSTICAS DOS NORs
GRUPO 1
AgNORs encontram-se agregados de forma homogênea dentro do nucléolo
(cada nucléolo apresenta apenas 1 NOR)
GRUPO 2
AgNORs estão em vários agregados somente dentro do nucléolo
GRUPO 3
Numerosos e pequenos AgNORs difusos dentro do núcleo
Este método de determinação da taxa de proliferação celular tem se
mostrado importante na classificação do grau de malignidade das
neoplasias. Os linfomas de alto grau geralmente apresentam padrão de
distribuição do grau 3. Além do grau de malignidade, a contagem dos
AgNORs estima o tempo de remissão da neoplasia e a sobrevida dos
pacientes tratados com quimioterapia (MADEWELL, 2001; VALJDOVICH et
al., 2004).
Este método histoquímico é muito utilizado na medicina veterinária,
pois além do baixo custo, da boa relação com a classificação e com o
prognóstico, é possível determinar a velocidade do processo proliferativo
(DERENZINI & PLOTON, 1991 e KIUPEL et al., 1999).
A contagem dos AgNORs é de grande valia para o prognóstico dos
linfomas caninos pois além da quantidade destas estruturas intranucleares
estar relacionada com a graduação dos tumores, um número menor de
AgNORs no núcleo das células neoplásicas é proporcional a um maior
tempo de vida do paciente, devido a evolução mais lenta da neoplasia (VAIL
et al., 1996 e KIUPEL et al., 1999).
Métodos imunoistoquímicos também têm sido empregados para a
detecção de proteínas associadas à proliferação celular tanto nas neoplasias
humanas como na Medicina Veterinária (ALVES et al., 1999; ROELS et al.,
1999). Os dois marcadores mais freqüentemente utilizados são os antígenos
PCNA e o Ki-67 (MIB-1) (FOURNEL-FLEURY et al., 1997; KIUPEL et al.,
1999).
O PCNA marca uma proteína essencial para a síntese do DNA e que
varia na sua quantidade nas diferentes fases do ciclo celular, apresentando
pico na fase S. A principal desvantagem deste marcador é o tempo de vida
útil prolongado desta proteína após a saída da célula do ciclo celular,
havendo com isso uma superestimação do índice de proliferação da
neoplasia (GRIFEY et al., 1999 e ALVES et al., 1999).
O antígeno Ki-67 (MIB-1) pode ser detectado em todas as fases do
ciclo celular menos na G
0
(GERDES et al., 1991). Este tem relação direta
com a fração de crescimento de uma população celular e é considerado,
atualmente, como o melhor marcador imunoistoquímico de proliferação
celular (ALVES et al., 1999).
A determinação da expressão do antígeno Ki-67 tem valor
prognóstico nos linfomas não-Hodgkin humanos, pois a análise desse índice
pode estabelecer um fator independente para cada caso (HALL et al., 1988).
A taxa de células neoplásicas que estão em proliferação nos
linfomas não-Hodgkin está relacionada com os diferentes tipos morfológicos
e com o grau de malignidade. Geralmente os tumores de grau alto de
malignidade possuem um índice de proliferação celular mais alto que os de
grau baixo. (FOURNEL-FLEURY et al., 1997; WANG et al., 2005).
Na espécie canina, a quantificação do antígeno Ki-67 nos diferentes
grupos de linfomas, pode resultar em um aumento na acurácia das
classificações dos linfomas caninos. Fournel-Fleury et al., (1997),
observaram uma correlação positiva entre a proporção de células
positivamente marcadas pelo Ki-67, a morfologia celular, o imunofenótipo e o
grau de malignidade.
Kiupel et al. (1999) afirmaram que a avaliação do comportamento
biológico dos linfomas caninos deve ser baseada nas classificações
citomorfológicas e imunofenotípicas. No entanto, ocorrem algumas
diferenças quanto à evolução biológica e a resposta ao tratamento entre
linfomas que apresentam o mesmo tipo celular. Estes autores sugerem que
a avaliação morfológica e imunofenotípica dos linfomas caninos devem ser
acompanhadas da determinação do índice de proliferação.
O crescimento tumoral é determinado por três fatores principais: o
tempo do ciclo celular, a porcentagem das células em proliferação e o
número de células perdidas. Portanto, além dos marcadores de proliferação
celular, outro índice muito importante relacionado com o comportamento
biológico das neoplasias é a apoptose (PHILIPS et al., 2000).
Um dos métodos de quantificar a freqüência de células tumorais que
estão em apoptose é avaliar a expressão de algumas enzimas relacionadas
diretamente com o evento da apoptose, as chamadas caspases. As
caspases estão presentes no citoplasma da maioria das células, nas formas
inativas como uma cadeia única de polipeptídeos e são ativadas quando
esta cadeia é quebrada, o que leva a apoptose (ROBERT & FRIEDLANDER,
2003).
Mais de dez tipos de caspases já foram descritos nos mamíferos,
sendo a caspase-3 a mais estudada. Esta enzima está relacionada com a
apoptose em muitos distúrbios hematopoiéticos na espécie humana,
inclusive nas leucemias e nos linfomas. A expressão da caspase-3 nos
vários tipos de linfomas não-Hodgkin já foi relatada e outros estudos
sugerem que tanto o nível da sua expressão, como a sua forma de
marcação intracitoplasmática, tem relação com a progressão tumoral. Os
linfomas de grau alto de malignidade apresentam uma expressão
citoplasmática maior de caspase-3 que as neoplasias de grau baixo
(DONOGHUE et al., 1999 e DUKERS et al., 2002).
Além da expressão de caspase-3 pelas células neoplásicas, a
localização da marcação tem sido relacionada com o prognóstico. A
localização da imunomarcação é tão importante quanto a imunopositividade.
Na espécie humana, linfomas de grau alto que possuem positividade para
caspase-3 respondem melhor aos tratamentos. Entre as neoplasias positivas
para esta enzima, aquelas com intensa marcação puntiforme citoplasmática
tendem a apresentar um prognóstico melhor do que as que apresentam
marcação difusa (DONOGHUE et al., 1999). Não existem dados na literatura
consultada sobre a determinação imunoistoquímica da expressão de
caspase-3 nas neoplasias caninas.
Outro marcador imunoistoquímico relacionado com apoptose é a
marcação da proteína p53 mutante nas células neoplásicas (ALVES et al.,
1999). O gene p53 é um gene supressor tumoral, que está localizado no
cromossoma 17 e a proteína codificada por ele atua no crescimento celular,
reparo e síntese de DNA, diferenciação celular e apoptose. Quando
detectados erros durante a transcrição, a p53 sofre fosforilação e estimula
genes que expressam proteínas inibidoras do ciclo celular. A célula então é
bloqueada na fase G1. Ao parar o ciclo celular a proteína do p53 permite que
mecanismos de reparação atuem sobre o DNA celular, corrigindo-os. Se
esses mecanismos falharem, o p53 ainda pode acionar eventos apoptóticos
levando a destruição celular. A inativação funcional do p53 é uma das
alterações mais comuns em diversas neoplasias. As mutações levam à
alterações das proteínas codificadas, que passam a ter a meia-vida maior,
se acumulam nas células neoplásicas e podem ser detectadas pela técnica
da imunoistoquímica (SCHIMTH, 1999).
As mutações neste gene são as lesões gênicas mais freqüentes nas
neoplasias da espécie humana. A expressão do p53 mutante pode ser, além
de um importante fator prognóstico nos casos de linfomas não-Hodgkin
humanos, um modulador da resposta neoplásica à quimioterapia ou
radioterapia (SOHN et al., 2003 e SOKOLOWSKA et al., 2005).
Imamura et al (1994), relataram que a expressão de p53 alterado é
superior a 30% nos linfomas de grau alto de malignidade de origem B na
espécie humana. Piris et al. (1994) observaram que entre acúmulo da
proteína p53 ocorre nos linfomas de grau alto de malignidade e nos
indivíduos que apresentam os estádios mais avançados da doença.
Aoyagi et al., (2002) relataram que em seres humanos existe relação
do acúmulo de p53 mutante no núcleo das células neoplásicas com a
resistência tumoral ao tratamento quimioterápico ou radioterápico. Os
mesmos autores verificaram que todos os linfomas não-Hodgkin de grau alto
apresentaram expressão de p53.
Na medicina veterinária o papel desempenhado pelo p53 nas
diferentes neoplasias ainda é controverso, sendo escassos os estudos que
apresentam este tipo de abordagem.
Setoguchi et al. (2001) por meio da técnica de PCR, avaliaram
mutações no gene p53 em vários tumores caninos, inclusive nos linfomas e
verificaram que, assim como no homem, existe relação entre as alterações
mutagênicas desta proteína e o aparecimento das neoplasias.
Outros autores estudando a detecção do p53 nos mastocitomas
caninos determinaram que a quantificação desta proteína não esta
relacionada com a graduação histológica, com o estadiamento clínico ou
com a resposta tumoral à quimioterapia (JAFFE et al., 2000; GINN et al.,
2000). Wolf et al., (1997), também afirmaram que a quantificação do p53 por
meio da imunoistoquímica não pode ser relacionada com prognóstico nos
tumores colorretais nos cães e que tanto os tumores malignos como os
benignos apresentam intensa expressão de p53.
No trabalho realizado em cães por GAMBLIN et al., (1997), 40% dos
linfomas foram positivos para p53. Segundo estes autores este fato pode
sugerir resistência ao tratamento, muito semelhante à verificada na espécie
humana.
De acordo com SUEIRO et al., (2004), 60% dos casos de linfomas
estudados em cães foram positivo para a expressão de p53, porém não
houve correlação deste achado com os imunofenótipos e os graus de
malignidade das neoplasias. Deve-se ressaltar, no entanto, que a expressão
da proteína p53 mutante, no núcleo das células neoplásicas, está
relacionada com o decréscimo no tempo de sobrevida do paciente
(GREENLE et al., 1990; TESKE, et al., 1994b; SUEIRO et al., 2004).
O estudo do índice apoptótico nos tumores tem sido muito
importante na determinação da agressividade tumoral e da resistência ao
tratamento (AOYAGI et al., 2002). Os quimioterápicos mais recentes,
utilizados no tratamento de vários tipos de tumores, têm como base induzir a
apoptose das células neoplásicas, portanto se existe uma neoplasia com alta
expressão de bcl-2, (gene responsável pelo controle, ou inibição da
apoptose) ou presença de gene p53 alterado, é esperado um pior
prognóstico desta neoplasia ou resistência ao tratamento. Linfomas não-
Hodgkin humanos de grau alto quando apresentam positividade para o
anticorpo anti-bcl-2 e para o anti- p53, têm um comportamento biológico
mais agressivo e pior prognóstico que aqueles que só expressam
positividade para o anticorpo anti-p53 (SONH et al., 2003).
De acordo com o que foi aqui apresentado observa-se que o estudo
dos linfomas caninos além de abordar a classificação citológica e
imunofenotípica das neoplasias necessita ser ampliado para que se tenha a
avaliação da cinética celular. A verificação desta dinâmica só pode ser feita
com segurança quando são avaliados não só os parâmetros que indicam a
taxa de proliferação celular, mas também aqueles relacionados à apoptose.
Os dados presentes na literatura referentes a estes fenômenos nas
neoplasias dos cães ainda são conflitantes, porém isto não diminui a sua
importância. No homem, muitas vezes a determinação da taxa de
proliferação e os marcadores de apoptose têm influência preponderante no
prognóstico e no tratamento dos linfomas não-Hodgkin. O mesmo tipo de
fenômeno pode ocorrer nos linfomas caninos. Da mesma forma, a expressão
de p53 já teve sua importância destacada em diversas neoplasias que
acometem os seres humanos. Nos cães, os estudos que envolvem a
influência da p53 no processo neoplásico ainda mostram resultados
incipientes e, às vezes, discrepantes. No que diz respeito aos linfomas
caninos, poucos trabalhos de pesquisa abordaram a expressão desta
proteína, que nos linfomas humanos tem sido utilizada como fator de
prognóstico.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Procedência do material
Foram utilizados casos de linfoma de animais necropsiados no Serviço
de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP,
Campus de Botucatu – SP. Este material incluiu tanto casos que constam no
arquivo do serviço, quanto casos diagnosticados durante o período de 2004 a
2006. Todo material foi proveniente dos diferentes serviços do Hospital
Veterinário da FMVZ, assim como de clínicas particulares da região.
Durante o exame clínico dos animais, além de coletados dados sobre
raça, sexo e idade foram estabelecidos a classificação anatômica e o
estadiamento clínico dos linfomas.
A classificação anatômica foi determinada segundo JACOBS et al.
(2002) e o estadiamento clínico foi realizado de acordo com o modelo
proposto pela Organização Mundial de Saúde para linfomas caninos
(OWEN, 1980; GRAY et al., 1984) (Tabelas 2 e 3).
TABELA 2: Classificação Anatômica dos Linfomas Caninos segundo
JACOBS et al. (2002).
FORMA LOCALIZAÇÃO
Multicêntrica Linfonodos periféricos e profundos podendo envolver órgãos
como fígado, baço, rins, pulmão, coração, trato gastrintestinal e
medula óssea.
Digestiva Trato gastrintestinal e linfonodos regionais. Podendo envolver
órgãos abdominais como fígado, baço e rins.
Tímica Envolve o timo e linfonodos regionais.
Cutânea Envolve a pele sob a forma de massas solitárias ou múltiplas,
estas acompanhadas ou não de envolvimento sistêmico.
Solitária Envolve apenas um órgão
TABELA 3: Estadiamento Clínico dos Linfomas Caninos proposto
pela Organização Mundial de Saúde (OWEN, 1980; GRAY et al, 1984).
ESTADIO
CRITÉRIO
I Envolvimento limitado a um único linfonodo ou tecido linfóide
de um único órgão (exceto medula óssea)
II Envolvimento de vários linfonodos regionais com ou sem
envolvimento das tonsilas
III Envolvimento generalizado dos linfonodos
IV Envolvimento do fígado e/ou baço, com ou sem envolvimento
generalizado dos linfonodos.
V Envolvimento do sangue, medula óssea e/ou outros órgãos.
Obs: Os estádios são ainda subdivididos em A (sem sinais
sistêmicos) ou B (com sinais sistêmicos), segundo GREENLEE et al. (1990).
Os sinais sistêmicos são inespecíficos, podendo ocorrer febre, letargia,
anorexia, vômitos e diarréia.
Depois de obtida a relação dos casos, as lâminas
correspondentes foram selecionadas a partir do arquivo de lâminas histológicas
do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, e novamente analisadas para a
confirmação do diagnóstico de linfoma. Posteriormente, foram selecionados os
blocos correspondentes aos 40 casos do arquivo do Laboratório de
Histopatologia da FMVZ.
3.2 Processamento do material
O material, já incluído em parafina foi novamente cortado em
micrótomo, obtendo-se cortes entre três a cinco micrômetros (µm). O
material proveniente da rotina de diagnóstico do Serviço de Patologia,
durante o desenvolvimento do projeto, foi submetido aos procedimentos de
rotina para inclusão em parafina. Os cortes corados pelo método de
Hematoxilina-eosina foram utilizados para a classificação cito-histológica dos
linfomas. Cortes do mesmo material foram submetidos à técnica de
imunoistoquímica e a coloração dos AgNORs.
3.3 Aplicação das Classificações dos Linfomas Não-Hodgkin
Humanos nos Linfomas Caninos
Para cada caso, utilizou-se a classificação histopatológica de Kiel
(LENNERT & FELLER, 1990) e Working Formulation (ERSBOL et al., 1985)
propostas para os linfomas não-Hodgkin humanos.
3.4 Avaliação histoquímica
3.4.1 Argyrophil Nucleolar Organizer Regions - AgNORs
Técnica de coloração pela prata - AgNORs
A técnica utilizada foi descrita por PLOTON et al., (1986) e segue
o roteiro da Apostila de Técnicas de Colorações Específicas do Laboratório de
Histopatologia do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ – UNESP. Para a
padronização desta técnica foram utilizados fragmentos de massas
neoplásicas, colhidos durante exame necroscópico, com diagnóstico de
linfoma.
Após processamento histológico e inclusão em parafina, foram obtidos
cortes com espessura de três micrômetros de espessura em micrótomo
rotativo. Os cortes depositados sobre as lâminas histológicas permaneceram
em estufa a 60°C por 12 horas e em seguida submetidos ao processo de
desparafinização e hidratação. Este processo constou de dois banhos em
solução de xilol à temperatura ambiente por 10 minutos, seguidas de
passagens seqüenciais, de um minuto cada, em três soluções de álcool a 95%.
O material foi mergulhado em água corrente por cinco minutos e submetido a
um banho de água destilada.
Após este processo o material foi lavado em uma solução de Triton X
0,5 % (diluído em água deionizada) a fim de remover proteínas citoplasmáticas,
que poderiam prejudicar a análise e contagem dos NOR aumentando o fundo
(background), (VIDAL, et al., 1994).
A técnica de coloração dos NORs consiste da mistura de 2 partes de
uma solução aquosa de prata a 50 % com uma parte de solução aquosa de
gelatina a 2 % em água deionizada com ácido fórmico a 1 %. Para a
diminuição dos precipitados inespecíficos de prata sobre o material, adotou-
se a coloração com lâminas invertidas. Um mililitro da mistura das soluções
foi depositado sobre uma bandeja de coloração de polipropileno e as
lâminas, com a face do material voltada para baixo eram depositadas sobre
o corante e mantidas na estufa à 57 ºC durante 20 minutos. O material
recebeu dois banhos de água deionizada a fim de cessar a reação e retirar o
excesso da solução de prata. Após a passagem nessas soluções, as
lâminas foram novamente postas em berço de coloração e submetidas ao
processo de desidratação e montagem. Foram feitas passagens seqüenciais
em soluções de álcool a 95% e absoluto de um minuto cada, e logo em
seguida três banhos de xilol, de cinco minutos cada, sucedidos por
montagem com resina sintética.
Avaliação Quantitativa de AgNORs
A avaliação quantitativa de AgNORs foi realizada por meio da
contagem direta dos pontos de AgNORs presentes nos núcleos de 100
células em cada caso analisado, utilizando o analisador de imagens semi-
automático modelo ZEISS com programa de morfometria Pro-Image 1.0. As
lâminas foram obervadas em microscópio óptico na objetiva de imersão.
3.5 Técnicas Imunoistoquímicas
3.5.1 Imunofenotipagem dos Linfomas Caninos:
A imunofenotipagem dos linfomas foi realizada utilizando-se técnica
imunoistoquímica da avidina-biotina-peroxidase (HSU, 1981) de acordo com
protocolo estabelecido pelo laboratório do Serviço de Patologia Veterinária da
FMVZ-UNESP Campus de Botucatu – SP, que inclui os seguintes
procedimentos:
Para recuperação antigênica, as lâminas foram tratadas com solução
de EDTA 10 µM, pH 8,0 previamente aquecido a 95º em cozimento à vapor
(“Steammer”) por 25 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente as
lâminas foram colocadas em solução de partes iguais de H
2
O
2
(20 volumes) em
água destilada para bloqueio da peroxidase endógena, por meia hora.
Os cortes foram incubados com os anticorpos primários em câmara
úmida, por 18 horas a 4ºC, lavadas em solução tampão de TRIS (D5637 –
Sigma Chemical CO) e incubadas com anticorpo biotinilado e solução de
avidina-biotina-peroxidase do kit ABC (Dako K0492), por 30 minutos, em
câmara úmida, a temperatura ambiente.
Para visualização da reação, as lâminas foram tratadas com solução de
3,3‘ diaminobenzidina (DAB) (1mg/ml) em TRIS e 600 µl de água oxigenada
(H
2
O
2
) 20 volumes. Os esfregaços foram contra-corados com Hematoxilina de
Harris.
Foram empregados como marcadores linfóides os seguintes anticorpos
primários:
Anti-CD3 (Dako): Anticorpo policlonal humano que reconhece uma molécula
(antígeno C3) ligada ao receptor das células T.
Anti-CD79a (Dako): Anticorpo monoclonal humano que reconhece um
polipeptídeo que faz parte do complexo receptor de antígeno dos linfócitos
B.
3.5.2 Avaliação Imunoistoquímica dos índices de proliferação
celular, de apoptose e a expressão do p-53
Padronização da técnica de Imunoistoquímica
A padronização da técnica de imunoistoquímica foi realizada no
Laboratório de Pesquisa do Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu e no
Laboratório de Patologia Molecular da Faculdade de Medicina, UNESP,
Campus de Botucatu.
Para a padronização desta técnica foram utilizados fragmentos de
linfonodos normais, reativos e linfomas caninos, fixados em solução de
formol tamponado, provenientes do Serviço de Patologia Veterinária.
Também foram utilizadas amostras de neoplasias epiteliais humanas obtidas
no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Anticorpos utilizados para a padronização do método
Ki-67 (MIB-1): o antígeno Ki-67 é uma proteína nuclear
presente durante todas as fases ativas do ciclo celular (G1, S, G2 e M),
mas ausentes nas células em repouso (Go).
p-53 (CM-1): a mutação na proteína p53 é a alteração
genética mais freqüente nos casos de malignidade. A mutação resulta
em maior expressão da proteína no núcleo celular e esse aumento pode
ser detectado por meio da imunoistoquímica.
Caspase-3: é uma das proteínas envolvidas no inicio da
apoptose, responsável pelos eventos proteolíticos. A ativação da
caspase-3 indica que a célula entrou em apoptose.
Diluição dos anticorpos utilizados
Cada anticorpo foi diluído em solução a 0,1% de albumina
sérica bovina em solução tampão de TRIS (TRIZMA base, D5637 Sigma). As
diluições estabelecidas estão representadas na tabela 4:
TABELA 4: Diluições estabelecidas para os anticorpos anti-CD-3, anti-
CD79a, anti-Ki-67 (MIB-1), anti-Caspase-3 e anti-p-53.
Anticorpos Diluição estabelecida
Anti CD-3, policlonal (Dako) 1:100
Anti CD79a, monoclonal (Dako) 1:50
Anti-Ki-67 (MIB-1), monoclonal (Dako) 1:50
Anti-Caspase-3, policlonal (Cell Signiling) 1:200
Anti-p-53, policlonal (Novocastra) 1:400
Roteiro de aplicação da técnica de imunoistoquímica
Preparação das lâminas
As lâminas foram inicialmente mergulhadas em álcool a 70% e depois
de secas, imergidas em cola líquida a base de organosilano (A3648 – SIGMA).
Obtenção dos cortes histológicos
Cortes histológicos com três micrômetros de espessura foram feitos em
micrótomo rotativo depositados em lâminas histológicas e em seguida,
permaneceram em estufa a 60°C por 24 horas para fixação do tecido à lâmina.
Após este procedimento, foram submetidos aos processos de
desparafinização e hidratação.
Bloqueio da peroxidase endógena
O bloqueio da peroxidase endógena foi feito em solução de água
oxigenada a 10 volumes por 15 minutos.
Recuperação antigênica
A recuperação antigênica dos epítopos antigênicos foi realizada com
solução tampão de citrato 10 mM, pH 6,0, em forno de microondas, na potência
máxima por 15 minutos;
Após o procedimento, o material foi resfriado até atingir a temperatura
ambiente.
Reação com os anticorpos primários e secundários
As lâminas foram incubadas com os anticorpos primários em câmara
úmida, por 18 horas a 4ºC, lavadas em solução tampão de TRIS.
Foi empregado o anticorpo secundário ligado a um polímero e
moléculas de peroxidase do kit EnVision Dual-link (Dako – K4063) durante
30 minutos a temperatura ambiente de acordo com as recomendações do
fabricante.
Revelação
Para visualização da reação as lâminas foram tratadas com solução
de 3,3´diaminobenzidina (Liquid DAB – K3466 Dako) durante cinco minutos
à temperatura ambiente. Os cortes foram contra-corados com Hematoxilina
de Harris, por 35 segundos.
3.6 Análise imunoistoquímica
Para os anticorpos anti-Ki-67, anti-caspase-3 e anti-p-53, a reação
imunoistoquímica foi estimada conforme a marcação positiva. Foi realizada a
contagem de todas as células presentes em cinco campos aleatórios em
objetiva de 40x do microscópio óptico. Nestes mesmos campos aleatórios
foram também contadas as células positivas para cada anticorpo.
Estes valores foram transformados em percentual de células positivas e
submetidos à análise estatística.
3.7 Análise estatística
Foi realizado para os anticorpos anti-Ki-67, anti-Caspase-3 e anti-p53 e
para o AgNOR, o teste t (student) a fim de verificar diferença das médias do
percentual de células positivas em cada anticorpo e para o AgNOR entre os
linfomas de alto e baixo grau, considerando o grau de significância P<0,05.
Foram analisadas também as médias dos percentuais de células positivas dos
diferentes métodos entre os imunofenótipos, linfomas B ou T/B. Para esta
análise utilizou-se o teste t (student), considerando o grau de significância P<
0,05.
4. RESULTADOS
4.1 Dados clínicos dos Animais
Dos 40 animais utilizados no presente estudo, 12 eram sem raça
definida (SRD), nove animais eram da raça Pastor Alemão, cinco animais eram
da raça Boxer e cinco animais eram da raça Rottweiller, Os outros nove
animais pertenciam a outras raças (Tabela 5).
Em relação ao sexo, entre os 40 animais portadores de linfomas, 26
eram machos e 14 eram fêmeas (Tabela 6). A idade dos pacientes variou de
dois a 13 anos, sendo que 52,5% dos animais possuíam idade entre quatro a
sete anos, 32,5 % idade acima de oito anos a 15% eram animais entre 0 a três
anos (Tabela 7).
O estadiamento e a classificação anatômica foram realizados em todos
os animais, destes, 18 animais estavam no estádio IV, 16 apresentaram
comprometimento da medula óssea, portanto se apresentavam no estádio V e
seis pacientes apresentavam apenas comprometimento dos linfonodos e foram
classificados como estádio III (Tabela 8).
Em relação à classificação anatômica, 35 animais apresentaram a
forma multicêntrica da neoplasia com comprometimento de vários órgãos, três
animais foram classificados como a forma tímica, com comprometimento do
timo e linfonodos mediastínicos e outros dois casos eram da forma solitária,
comprometendo outros órgãos como, rim e baço. (Tabela 9).
TABELA 5: Distribuição racial dos 40 animais portadores de linfomas
caninos.
RAÇAS Nº DE CASOS %
SRD 12 30
Pastor Alemão 09 22,5
Boxer 05 12,5
Rottweiller 05 12,5
Outras 09 22,5
TOTAL 40 100
TABELA 6: Distribuição por sexo dos 40 animais portadores de
linfomas caninos.
SEXO Nº DE CASOS %
Machos 26 65
Fêmeas 14 35
TOTAL 40 100
TABELA 7: Idade dos 40 animais portadores de linfomas caninos.
IDADE Nº DE CASOS %
0 a 3 anos 06 15
4 a 7 anos 21 52,5
Acima de 8 anos 13 32,5
TOTAL 40 100
TABELA 8: O estadiamento clínico proposto pela Organização Mundial
de Saúde (OWEN, 1980; GRAY et al., 1984) nos 40 animais portadores de
linfomas caninos.
ESTÁDIAMENTO CLÍNICO Nº DE CASOS %
Estádio III 06 15
Estádio IV 18 45
Estádio V 16 40
TOTAL 40 100
TABELA 9: Classificação anatômica dos linfomas caninos, nos 40
animais.
CLASSIFICAÇÃO ANATÔMICA Nº DE CASOS %
Multicêntrica 35 87,5
Tímica 03 7,5
Solitária 02 5
TOTAL 40 100
4.2 Aplicação das classificações de Kiel e Working Formulation
nos linfomas caninos:
Os casos de linfoma foram classificados de acordo com a classificação
de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990) e pela classificação proposta pelo
National Cancer Institute – Working Formulation (NCI - WF, 1982).
Quando utilizada a classificação de Kiel, foi observada a
predominância dos linfomas de alto grau de malignidade, em 29 casos (Tabela
10) e de acordo com a WF, a maioria das neoplasias também foi classificada
como de alto grau de malignidade, em 22 casos seguidos pelos linfomas de
grau intermediário em 14 casos e quatro animais com linfomas de baixo grau
(Tabela 11).
TABELA 10: Grau de malignidade 40 casos de linfomas caninos de
acordo com a classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990).
KIEL Nº DE CASOS %
Grau Alto 29 72,5
Grau Baixo 11 27,5
TOTAL 40 100
TABELA 11: Grau de malignidade 40 casos de linfomas caninos de
acordo com a classificação Working Formulation (NCI-WF, 1982).
WF Nº DE CASOS %
Grau Alto 22 55
Grau Intermediário 14 35
Grau Baixo 4 10
TOTAL 40 100
Os linfomas de alto e baixo grau de acordo com a classificação de Kiel
foram ainda classificados em tipos de acordo com as características celulares
(Tabela 12).
TABELA 12: Linfomas de baixo e alto grau de malignidade de acordo
com a classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990).
KIEL Nº DE CASOS %
Centrocítico 02 5
Centrocítico-Centroblástico 02 5
Linfocítico 02 5
Linfoplasmacítico 02 5
Linfoma T pleomórfico 03 7,5
Imunoblástico 20 47,5
Centroblástico 06 15
Linfoblástico 03 7,5
TOTAL 40 100
Os casos classificados como linfomas linfocíticos se caracterizavam
pela presença de células pequenas, de núcleos redondos e pequenos. A
cromatina apresentava padrão denso com pequenos agregados mais
grosseiros, não sendo observados nucléolos. O citoplasma era sempre
escasso. Estas neoplasias também são denominadas Linfomas linfocíticos na
WF, de baixo grau de malignidade.
Os Linfomas linfoplasmacíticos eram compostos por linfócitos ora com
citoplasma escasso semelhantes aos Linfomas linfocíticos, ora por células
pequenas com citoplasma abundante, basofílico e núcleo excêntrico. Na WF
este tipo de linfoma é classificado como linfoma linfocítico, também de baixo
grau de malignidade.
Nos linfomas centrocíticos o tipo celular predominante caracterizava-se
pelo seu tamanho pequeno, núcleo pequeno e clivado, com aspecto irregular e
cromatina densa. O citoplasma era sempre escasso. Este tipo de linfoma
equivale ao Linfoma de Pequenas Células Clivadas na classificação WF, sendo
considerado de grau intermediário nesta classificação.
Os linfomas centrocítico-centroblástico eram constituídos por uma
população celular bimórfica na qual estavam presentes células pequenas com
núcleo irregular ou clivado e células grandes com núcleo não clivado. Este tipo
de neoplasia corresponde ao Linfoma Misto de Pequenas e Grandes Células
na WF, sendo considerado como linfoma de grau intermediário (Figura 1).
Os linfomas de células T pleomórfico eram compostos por células
pequenas, citoplasma escasso e pálido. Os núcleos eram irregulares de
aspecto ora serrilhado ora liso, cromatina densa, sendo possível observar
nucléolo único e pequeno. Estas células apresentavam pleomorfismo celular.
Esta entidade não recebe uma denominação específica na WF, então foi
agrupada com os Linfomas Difusos de Pequenas Células Clivadas devido às
semelhanças citomorfológicas (TESKE, 1994; FOURNEL-FLEURY et al., 1997;
FOURNEL-FLEURY et al., 2002).
Os linfomas centroblásticos se caracterizavam pela presença de
células grandes, com núcleos redondos, cromatina vesicular e nucléolos
múltiplos e periféricos. As figuras de mitose eram freqüentes e o citoplasma
podia ser escasso ou abundante. Este tipo de linfoma equivale ao Linfoma de
Grandes Células não-Clivadas na WF, sendo considerado de grau
intermediário de malignidade nesta classificação (Figura 2).
Os linfomas do tipo imunoblástico eram constituídos por células de
tamanho médio ou grande, cromatina vesicular e nucléolo proeminente e
central. O citoplasma era variável e figuras de mitoses eram freqüentes (Figura
3).
A composição celular dos linfomas linfoblásticos se caracterizava por
pequenas células, com núcleo de forma redonda ou oval. Nestas células a
distribuição da cromatina era uniforme, não permitindo a observação de
nucléolos. As figuras de mitose eram freqüentes. Na maioria das células o
citoplasma era escasso e fracamente basofílico (Figura 4).
4.3 Imunofenotipagem
Os linfomas T e os linfomas B, neste estudo tiveram a mesma
freqüência, ocorrendo em 17 casos (42,5%) cada, seguidos pelos Linfomas T/B
em seis casos (15%) (Tabela 13) (Figuras 5 e 6).
De acordo com a classificação de Kiel, todos os 13 casos de linfomas
T de grau alto de malignidade, foram classificados como Imunoblásticos e as
neoplasias de baixo grau foram três casos de linfoma T pleomórfico.
Dentre os 17 casos de linfomas B, 11 casos são de grau alto de
malignidade e 6 casos são de baixo grau de malignidade, sendo cinco
centroblásticos, quatro Imunoblásticos, dois Linfoblásticos, dois centrocíticos-
centroblasticos, dois centrocíticos, um linfocítico e um linfoplasmacítico (Tabela
14).
TABELA 13: Imunofenotipagem dos linfomas caninos.
IMUNOFENÓTIPO Nº DE CASOS %
Linfoma T 17 42,5
Linfoma B 17 42,5
Linfoma T/B 06 15
TOTAL 40 100
TABELA 14: Relação entre o imunofenótipo e a classificação de Kiel
(LENNERT & FELLER, 1990).
4.4 Índice de proliferação celular pelo método do AgNORs
Dentre os 40 casos de linfomas, em apenas 28 casos foi realizada a
contagem deAgNOR, sendo 21 de alto grau de malignidade e sete casos de
baixo grau de malignidade. Nos outros casos o material foi inadequado para
esta técnica. No presente estudo as AgNORs apresentavam-se , na grande
maioria das células, como pontos escuros dispersos pelo núcleo,
correspondendo ao tipo II de padrão de distribuição descrito por VALDOVICH
et al., 2004 (Figura 7 e 8). Assim sendo, obtivemos uma média de número de
pontos de NORs por núcleo de células neoplásicas.
KIEL
LINFOMA T
LINFOMA B
LINFOM
A T/B
Centroblástico --- 05 01
Imunoblástico 13 04 03
Linfoblástico --- 02 01
Centrocítico --- 02 ---
Centrocítico-Centroblástico --- 02 ---
Linfocítico 01 01 ---
Linfoplasmacítico --- 01 01
Linfoma T pleomórfico 03 --- ---
TOTAL 17 17 06
Quando utilizada a classificação de Kiel, entre as neoplasias de alto
grau de malignidade a média foi de 1,37 ± 0,32, e nos casos de baixo grau de
0,98 ± 0,36, resultado estatisticamente significativo (P< 0,05) (Tabela 15).
Entre os diferentes inumofenótipos, embora não tenha sido observada
diferença estatisticamente significativa (P> 0,05), a média do número de NORs
por núcleo foi maior nos linfomas T (1,43 ± 0,28), seguido dos linfomas T/B
(1,24 ± 0,39) e linfomas B (1,07 ± 0,31).
Quando a classificação utilizada foi a Working Formulation (NCI-WF,
1982), os resultados do número médio de AgNORs por núcleo de células
neoplásicas foram, entre as 22 neoplasias de alto grau de malignidade de 1,43
± 0,34, entre as de grau intermediário, 1,17 ± 0,26 e entre as de baixo grau,
0,78 ± 0,25, resultado sem significância estatística.
TABELA 15: Número de casos, média e desvio-padrão do número de
AgNORs nas células neoplásicas, de acordo com a classificação de Kiel
(LENNERT & FELLER, 1990).
AgNOR N MÉDIA DESVIO PADRÃO
ALTO GRAU 21 1,37a 0,32
BAIXO GRAU 07 0,98b 0,36
Médias com letras minúsculas diferentes diferem estatisticamente, ao nível de 5%, pelo teste t
(Student)
4.5 Índice de Proliferação Celular pelo método do Ki-67 (MIB-1)
De acordo com a classificação de Kiel, nas neoplasias de alto grau de
malignidade a média de células em proliferação marcadas pelo Ki-67 foi de
43,19% ± 19,01, e nos casos de baixo grau de 14,09% ± 11,74, resultado
estatisticamente significativo (P<0,01) (Tabela 16). Ainda de acordo com a
classificação de Kiel, (LENNERT & FELLER, 1990), comparando os diferentes
inumofenótipos, a média do número de células positivas para o marcador Ki-67
foi maior nos linfomas B (38,45% ± 26,68), seguido dos linfomas T (35,45% ±
18,83) e linfomas T/B (25,23% ± 9,00) (Figuras 9 e 10).
Quando analisados os linfomas de alto grau de malignidade entre os
diferentes imunofenótipos e os de baixo grau entre os diferentes
imunofenótipos houve diferença estatísticamente significativa somente entre os
linfomas B e linfomas T/B de alto grau de malignidade, sendo que a média
deste último grupo foi maior que das neoplasias com imunofenótipo B (P <
0,05).
O percentual de células positivas para o Ki-67 entre os linfomas de
baixo grau variou entre 1,67 a 34,5%, sendo que o tipo de linfoma com o
percentual mais alto (34,5%) foi um centrocítico e mais baixo (1,67%), um
linfocítico. Analisando as neoplasias de alto grau de malignidade, essa variação
foi de 24,4 a 80,53%, sendo o mais alto (80,53%) classificado como
linfoblástico e o com menor percentagem (24,4%), um caso de linfoma
imunoblástico.
Quando utilizada a classificação de Working Formulation (NCI-WF,
1982), entre as 22 neoplasias de alto grau de malignidade a média de células
em proliferação marcadas pelo Ki-67 foi de 41,50% ± 19,91 seguidos pelos de
grau intermediário, 31,80% ± 28,60 e os casos de baixo grau de 14,87% ± 9,79,
o que também foi significativamente diferente (P < 0,05).
TABELA 16: Número, média e desvio-padrão do índice de proliferação
celular utilizando anticorpo anti-Ki-67 (MIB 1), de acordo com a classificação de
Kiel (LENNERT & FELLER, 1990).
Ki-67 N MÉDIA DESVIO PADRÃO
ALTO GRAU 29 43,19a 19,01
BAIXO GRAU 11 14,09b 11,74
Médias com letras minúsculas diferentes diferem estatisticamente, ao nível de 1%, pelo teste t
(Student)
4.6 Índice de apoptose pelo método da Caspase-3
Quando utilizada a classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990),
obtivemos entre as neoplasias de alto grau de malignidade a média de 6,82 ±
6,47, e nos casos de baixo grau de 6,67% ± 5,06 (Tabela 17). Entre os
diferentes imunofenótipos, a média da caspase-3 foi maior nos linfomas T (6,29
% ± 7,21), seguido dos linfomas B (7,87 % ± 5,15) e linfomas T/B (5,93 % ±
5,26) (Tabela 18), nas duas análises o resultado não foi estatisticamente
significativo (P> 0,05).
Quando empregada a classificação da Working Formulation (NCI-WF,
1982), os resultados da média pelo método da caspase-3 foram os seguintes:
entre as 23 neoplasias de alto grau de malignidade a média foi de 6,70% ± 6,13
entre as de grau intermediário, 6,54% ± 5,97 e os entre linfomas de baixo grau
de 7,26% ± 1,73, o que também não apresentou diferença estatisticamente
significativa (P> 0,05).
Todas as amostas apresentaram marcação citoplasmática difusa, não
sendo observada marcação citoplasmática puntiforme (Figura 11 e 12).
TABELA 17: Número, média e desvio-padrão do índice de apoptose
utilizando anticorpo anti-caspase-3, de acordo com a classificação de Kiel
(LENNERT & FELLER, 1990).
CASPASE - 3 N MÉDIA DESVIO PADRÃO
ALTO GRAU 19 6,82a 6,47
BAIXO GRAU 11 6,67a 5,06
Médias com letras minúsculas iguais, não diferem estatisticamente, ao nível de 5%, pelo teste t
(Student)
TABELA 18: Número, média e desvio-padrão do índice de apoptose
utilizando anticorpo anti-caspase-3 nos linfomas de alto e baixo grau de
malignidade, de acordo com a classificação de Kiel (LENNERT & FELLER,
1990).
ALTO GRAU N MÉDIA DESVIO PADRÃO
LINFOMAS T 13 6,40a 7,45
LINFOMAS B 11 7,84a 5,66
LINFOMAS T/B 05 5,69a 6,40
BAIXO GRAU
LINFOMAS T 04 8,88a 6,98
LINFOMAS B 06 5,11a 3,90
Médias com letras minúsculas iguais, não diferem estatisticamente, ao nível de 5%, pelo teste t
(Student)
4.7 Expressão de p53
Analisando os 40 casos de linfomas, 29 casos apresentaram
expressão da proteína p-53 mutante (Figuras 13 e 14), de acordo com a
classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990) os linfomas de
imunofenótipo T e B apresentaram 12 casos positivos e cinco negativos, o que
corresponde a 70,59% e 29,41% respectivamente. Entre os seis linfomas com
imunofenótipo T/B, apenas um (16,67%) não apresentou expressão da proteína
p 53 mutante.
Entre as neoplasias de alto grau de malignidade, de acordo com a
classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990) a média de células positivas
foi de 2,38% ± 2,73, e nos casos de baixo grau de 2,27% ± 3,31, resultado não
significativo estatisticamente (P> 0,05) (Tabela 19). Entre os diferentes
inumofenótipos, a média do número de células que expressaram a proteína
p53 mutante foi maior nos linfomas T/B (4,10% ± 3,97), seguido dos linfomas T
(2,12% ± 3,12) e linfomas B (1,97% ± 1,82), porém estas médias também não
foram estatisticamente diferentes (P> 0,05).
Dos 29 casos de linfomas de alto grau de malignidade, 22
apresentaram reatividade para este anticorpo e em sete casos a reação
imunoistoquímica foi negativa. Nos 11 linfomas de baixo grau sete foram
positivos e quatro negativos para a expressão de p 53.
Quando foi usada a classificação de Working Formulation (NCI-WF,
1982), obtivemos uma média do percentual de células que expressa a proteína
p-53 entre as 22 neoplasias de alto grau de malignidade foi de 2,10% ± 2,86,
entre as de grau intermediário foi de2,82% ± 3,19 e as de baixo grau de 1,71%
± 1,91, resultados estatisticamente não significativos (P> 0,05).
TABELA 19: Número de casos positivos, média e desvio-padrão da
expressão de p-53, de acordo com a classificação de Kiel (LENNERT &
FELLER, 1990).
p- 53 N CASOS
NEGATIVOS
CASOS
POSITIVOS
MÉDIA
DESVIO PADRÃO
ALTO GRAU 29
07 22 2,38a 2,73
BAIXO GRAU 11
04 07 2,27a 3,31
Médias com letras minúsculas iguais, não diferem estatisticamente, ao nível de 5%, pelo teste t
(Student).
Figura
1
:
Linfoma Centrocítico-centroblástico (Kiel), a população de células
neoplásicas apresenta-se às vezes pequenas com núcleo clivado e outras
grandes com núcleolos múltiplos. HE.
Figura
2
:
Linfoma Centroblástico (Kiel). As células neoplásicas
apresentam nucléolos múltiplos e periféricos. HE.
Figura
4
:
Linfoma Linfoblástico (Kiel). Presença de células médias,
núcleo redondo e sem nucléolos evidentes. HE.
Figura
3
:
Linfoma Imunoblástico (Kiel). As células apresentam núcleo
redondo com um único nucléolo central. HE
Figura 5: Linfoma T. Positividade para o anticorpo primário anti-CD3, ABC,
DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.
F
i
g
u
r
a
6
:
L
i
n
f
o
ma B. Positividade para o anticortpo primário anti-CD79a, ABC, DAB,
contracorado com Hematoxilina de Harris.
Figura
7
: Linfoma Imunoblástico – múltiplos AgNORs distribuídos pelo
núcleo das células neoplásicas e algumas células apresentando um único
ponto nuclear (1000x).
Figura
8
: Linfoma Imunoblástico – múltiplos AgNORs distribuídos pelo
núcleo das células neoplásicas e algumas células apresentando um único
ponto nuclear (1000x).
Figura
9
: Linfoma Imunoblástico (Kiel) – positividade para anticorpo anti-
Ki-67 (MIB 1), EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris..
Figura
10
: Linfoma T pleomórfico (Kiel) – positividade para anticorpo anti-
Ki -67 (MIB 1), EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.
Figura
11
: Linfoma Imunoblástico (Kiel) – positividade para anticorpo anti-
caspase-3, EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.
Figura
12
: Linfoma Centroblástico (Kiel) – positividade para anticorpo anti-
caspase-3, EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.
Figura
13
: Linfoma Imunoblástico (Kiel) – positividade para anticorpo
anti- p53, EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.
Figura
14
: Linfoma Linfoplasmacítico (Kiel) – positividade para anticorpo
anti- p53, EnVision, DAB, contracorado com Hematoxilina de Harris.
5. DISCUSSÃO
5.1 Dados Clínicos
Segundo a literatura, a predisposição racial neste tipo de neoplasia é
um assunto controverso e já foi relatada por diversos autores para cães da raça
Boxer, Scottish Terrier, Basset Hound, Airedale Terrier, Chow Chow, Pastor
Alemão, Poodle, São Bernardo, Beagle, Golden Retriever e Bulldog (TESKE et
al., 1994b; VONDERHAAR & MORRISON, 1998 e JACOBS et al., 2002).
Os animais portadores de linfomas no presente estudo eram
predominantemente sem raça definida (SRD) (12 casos), seguido dos animais
da raça Pastor Alemão (nove casos), animais da raça Boxer (cinco casos) e
animais da raça Rottweiller (cinco casos). Os outros nove animais pertenciam a
outras raças.
De acordo com SEQUEIRA et al. (1999) não existem dados sobre a
composição racial da população dos cães da região de Botucatu.
Provavelmente, a freqüência encontrada esteja mais relacionada à proporção
de cada raça na população canina do que à predisposição racial para o
desenvolvimento deste tipo de neoplasia.
A maioria dos animais, com raça definida, acometida pela neoplasia
neste estudo, pertencia ao grupo das raças de grande ou médio porte. Este
resultado está de acordo com o trabalho realizado por SEQUEIRA et al. (1999),
que observaram 50%, dos 34 animais avaliados, pertencente às raças de
grande ou médio porte.
Em relação à idade dos animais portadores de linfoma, neste trabalho
observou-se uma maior ocorrência da neoplasia (52,5%) em cães com idade
entre quatro e sete anos, seguido dos animais com idade superior a oito anos
(32,5%) e animais de até três anos (15%). Os dados observados neste trabalho
estão de acordo com SEQUEIRA & FRANCO (1992) que afirmam haver maior
ocorrência desta neoplasia nos animais adultos entre quatro a 13 anos.
SEQUEIRA et al. (1999), observaram que 80% dos animais apresentaram
idade acima de quatro anos e nos trabalhos realizados por TESKE (1994a) e
TESKE et al. (1994b) a idade média dos cães acometidos pela neoplasia foi de
6,4 e 7,7 anos respectivamente.
Entre os animais utilizados neste estudo encontravam-se 26 machos
(65%) e 14 fêmeas (35%). Existe grande discordância na literatura sobre a
influência do sexo no aparecimento dos linfomas caninos. TESKE et al.
(1994b), obtiveram uma prevalência maior em fêmeas, porém RALLIS et al.
(1992) e SEQUEIRA et al. (1999) observaram maior número de cães machos.
Já JACOBS et al. (2002) afirmam que não existe influência do sexo do animal.
No presente estudo foi realizado o estadiamento clínico dos linfomas
nos 40 animais, destes, 18 estavam no estádio IV da doença, 16 se
apresentaram no estádio V e seis foram classificados como estádio III. Estes
dados concordam com SEQUEIRA et al. (1999) e com Moreno, 2005 que
verificaram que a maior parte dos portadores de linfoma (94%) encontrava-se
nos estádios mais avançados da doença (III, IV e V), o que piora o prognóstico
e dificulta a determinação de um protocolo para o tratamento da neoplasia.
DOBSON et al. (2001) observaram que a maioria dos pacientes
estudados encontrava-se nos estádios III e IV da doença no momento do
diagnóstico, embora em alguns destes animais não tenha sido avaliada a
medula óssea. O comprometimento da medula óssea implica na mudança do
estadiamento clínico para o estádio V.
Os mesmos autores afirmam que embora o estadiamento clínico não
interfira na resposta tumoral à quimioterapia, modifica o tempo de sobrevida
do animal. Os animais que se apresentam na fase adiantada da doença
apresentam uma menor sobrevida quando tratados em relação aos animais
com a neoplasia em fase inicial.
Um inconveniente da avaliação clínica da doença é que o estadiamento
é realizado com base no exame clinico e de alguns exames complementares,
não havendo muitas vezes a confirmação histológica ou citológica do
envolvimento dos órgãos. Disto podem resultar classificações equivocadas
(DOBSON et al., 2001).
Dos 40 animais avaliados, 35 foram classificados como linfomas
multicêntricos, três casos como linfomas tímicos e dois linfomas solitários.
Estes dados estão de acordo com a literatura consultada. A forma
multicêntrica é considerada como a mais freqüentemente observada, sendo
seguida pelas formas digestiva, tímica, cutânea e solitária (TESKE, 1994;
MILNER et al., 1996 e VONDERHAAR & MORRISON, 1998 e JACOBS, et al.,
2002). SEQUEIRA et al. (1999), em sua casuística, observaram 91,2% de
linfomas multicêntricos, 5,9% de linfomas tímicos e 2,9% de linfomas
digestivos.
5.2 Classificação Morfológica
Os 40 casos de linfoma utilizados neste tabalho, foram classificados de
acordo com a Classificação de Kiel ( LENNERT & FELLER, 1990) e Working
Formulation (NCI, 1982). Vários autores utilizam estas classificações propostas
para os linfomas não-Hodgkin do homem para diagnosticar os linfomas dos
cães (APPELBAUM et al., 1984; CARTER et al., 1986; GREENLEE et al.,
1990; TESKE 1994; FOURNEL-FLEURY et al., 1997).
No presente estudo, quando utilizada a classificação de Kiel,
predominaram os linfomas de grau alto (72,5%) em relação aos linfomas de
grau baixo (27,5%). Este resultado é semelhante ao obtido por TESKE & VAN
HEERDER (1996) e SUZANO, 2004, que utilizaram esta mesma classificação
em material colhido pelo método da Punção Aspirativa por Agulha Fina e este
mesmo predomínio se verifica quando esta mesma classificação foi aplicada ao
exame histológico da neoplasia (APPELBAUM et al., 1984; PARODI et al.,
1988; GREENLEE et al., 1990; PONCE et al. 1994; TESKE 1994; FOURNEL-
FLEURY et al., 1997).
Os linfomas imunoblásticos (47,5%) foram os mais freqüentes em
nossa casuística, resultado diferente de diversos autores que obtiveram um
predomínio dos linfomas centroblásticos quando utilizaram essa mesma
classificação (PARODI et al., 1988; GREENLEE et al., 1990; TESKE 1994;
TESKE & VAN HEERDE, 1996; FOURNEL-FLEURY et al., 1997; SUZANO,
2004).
A utilização da classificação da Working Formulation em nossa série de
linfomas mostrou prevalência maior para os linfomas de grau alto (55%),
seguidos dos linfomas de grau intermediário (35%) e dos linfomas de grau
baixo (10%), FOURNEL-FLEURY et al., (1997) utilizando esta classificação
observaram o predomínio dos linfomas de grau intermediário, resultados
semelhante aos descrito por Suzano, em 2004, em exames citológicos. O tipo
citológico mais freqüente foi o Linfoma Imunoblástico em 55% dos animais. A
literatura consultada indica diferença significativa na freqüência dos tipos
citológicos entre os diferentes autores que utilizaram esta classificação, tanto
em exames citológicos como nos histológicos. APPELBAUM et al, (1984) e
CARTER et al. (1986), obtiveram prevalência maior para os linfomas
imunoblásticos com 37,5% e 24,9%, respectivamente. No entanto, os linfomas
de Grandes Células não-Clivadas foram apontados como os mais freqüentes
por GREENLEE et al. (1990), RALLIS et al. (1992) e FOURNEL-FLEURY et al.
(1997), em 48,3%, 36,8% e 40,2% dos casos, respectivamente.
A classificação morfológica dos linfomas caninos, bem como na
medicina humana, tem grande importância na determinação do prognóstico,
tempo de vida do paciente e principalmente na escolha do tratamento mais
adequado a cada tipo de neoplasia (CARTER et al., 1986; FISHER et al., 1995
e DOBSON et al., 2001). De acordo com a literatura os tumores de grau alto
respondem melhor ao tratamento quimioterápico, porém aumentam os índices
de recidiva.
5.3 Imunofenotipagem
Os marcadores imunológicos podem ser de grande utilidade no
diagnóstico dos linfomas, seja na sua diferenciação de outras neoplasias de
células redondas, na determinação do imunofenótipo das células que o
compõem ou mesmo para a diferenciação entre os processos reacionais e as
neoplasias de grau baixo (ROBEY et al., 1987).
No homem, uma vez feito o diagnóstico de linfoma não-Hodgkin é
obrigatório que seja realizada a imunofenotipagem, sendo raros os casos nos
quais este procedimento pode ser dispensado (SOARES e ARIAS, 1999).
O uso de marcadores para determinar o imunofenótipo dos linfomas
caninos ainda é limitado, pois a maioria dos marcadores disponíveis
comercialmente, além do alto custo, não são específicos para a espécie canina
(KIUPPEL et al., 1999).
Alguns anticorpos humanos apresentam reação cruzada com
antígenos semelhantes encontrados nos cães e foram utilizados na marcação
de epítopos de superfície de leucócitos nesta espécie (CHABANNE et al.,
1994).
No que diz respeito à determinação do imunofenótipo dos linfomas
caninos o emprego dos anticorpos CD3 e CD79a, marcadores de células T e
células B, respectivamente, tem permitido a utilização de material fixado em
formol e incluído em parafina (MILNER et al., 1996; DE MOURA, 2000;
PESSOA, 2005).
Os 40 casos deste estudo tiveram seu imunofenótipo determinado. A
determinação da origem T ou B dos linfomas não-Hodgkin tem valor
prognóstico e não pode ser definida pela morfologia celular (APPELBAUM et
al., 1984 e DOBSON et al., 2001). Os cães portadores de Linfomas T
respondem menos ao tratamento quimioterápico e têm tempo de sobrevida
menor do que os cães portadores de linfomas B (DOBSON et al., 2001).
Portanto, a classificação imunoistoquímica dos linfomas torna-se um
procedimento importante para a definição do comportamento clínico da
neoplasia e sua resposta ao tratamento quimioterápico (TESKE et al, 1994a;
TESKE et al, 1994b, FOURNEL-FLEURY et al., 1994; FISHER et al., 1995;
FOURNEL-FLEURY et al., 1997; DOBSON et al., 2001 e FOURNEL-FLEURY
et al., 2002).
Na determinação do imunofenótipo dos linfomas a avaliação da
população celular que apresenta reação positiva deve ser cuidadosa. As
neoplasias com imunofenótipo B podem mostrar células positivas para
marcadores de células T, que representam células remanescentes da
população original do órgão linfóide ou mesmo uma reação imunológica do
organismo à neoplasia. Do mesmo modo, nos linfomas T podem estar
presentes células que apresentam marcação positiva para linfócitos B, que na
verdade representam células normais não neoplásicas (CANIATTI et al., 1996).
No presente estudo, foram tomados todos os cuidados para que se evitassem
erros na determinação do imunofenótipo da neoplasia. A principal medida para
se realizar com segurança esta determinação é a classificação morfológica do
linfoma e a identificação da positividade do tipo celular que compõe a
neoplasia.
Deve-se ressaltar que a marcação de linfócitos normais em meio aos
linfócitos neoplásicos, embora possa dificultar, em alguns casos, a
classificação imunofenotípica da neoplasia, pode também funcionar como um
controle interno positivo da reação imunoistoquímica (CANIATTI et al., 1996).
Na casuística utilizada neste trabalho foi observado o mesmo número
de casos com imunofenótipo T (CD3+/CD79a-) e imunofenótipo B (CD3-
/CD79a+), sendo 17 casos (42,5%) de cada imunofenótipo seguido pelos
linfomas de imunofenótipo T/B (CD3+/CD79+) em 15% dos casos, resultados
semelhantes aos encontrados por Pessoa em 2005, com os mesmos
anticorpos. Em trabalhos realizados anteriormente em nosso laboratório com
material incluído em parafina (DE MOURA, 2000) e em material citológico
(SUZANO, 2004), detectaram a predominância dos linfomas de imunofenótipo
T. MILNER et al. (1996), referem o mesmo tipo de achado, utilizando um painel
mais amplo de anticorpos. A freqüência encontrada por estes autores foi de
60% de Linfomas T e 40% de linfomas B.
No entanto, a maioria dos autores que trabalharam com
imunofenotipagem dos linfomas caninos relata a predominância dos linfomas B
em suas casuísticas, embora também ocorra grande variação nas freqüências
encontradas e na metodologia usada (TESKE et al., 1994a; TESKE et al.,
1994b; FOURNEL-FLEURY et al., 1994; CANIATTI et al., 1996; TESKE et al.,
1996; FOURNEL-FLEURY et al., 1997 e FOURNEL-FLEURY et al., 2002).
A freqüência de linfomas B variou de 55,1% a 77,7% nas casuísticas
dos autores que verificaram o predomínio deste imunofenótipo utilizando
painéis de anticorpos amplos em material citológico ou incluído em parafina
(CANIATTI et al., 1996; TESKE, et al., 1996; FOURNEL-FLEURY et al., 1997).
Deve-se ressaltar que mesmo com o predomínio do imunofenótipo B, a
freqüência dos linfomas T pode ser alta, chegando a 42% dos casos (TESKE,
et al., 1996).
5.4 Correlação entre a Classificação Morfológica e o
Imunofenótipo
Os resultados obtidos nesta pesquisa mostram que existe correlação
entre a classificação morfológica e o imunofenótipo dos linfomas. Entre os 17
casos de linfomas T o tipo mais freqüente foi o linfoma imunoblástico (12
casos). Alguns autores citam o linfoma linfoblástico como o tipo citológico
predominante nesta categoria imunofenotípica (APPELBAUM et al., 1984;
FOURNEL-FLEURY et al., 2002). No presente trabalho, considerando-se a
classificação de Kiel, os Linfomas T mostraram-se, na maioria dos casos, como
neoplasias de grau alto. Este resultado é corroborado por APPELBAUM et al.
(1984).
Todos os linfomas centroblásticos (cinco casos) apresentaram
imunofenótipo B, seguidos pelos linfomas imunoblásticos (quatro casos). Estes
resultados confirmam vários relatos da literatura, que observaram a
predominância destes tipos citológicos entre os linfomas de imunofenótipo B
(APPELBAUM et al., 1984; GREENLEE et al., 1990; FOURNEL-FLEURY et al.,
1997).
Segundo LENNERT & FELLER (1990), a morfologia das células que
constituem as neoplasias linfóides pode indicar a sua origem T ou B. As bases
da classificação de Kiel permitem a incorporação dos conhecimentos da
imunologia experimental no estudo das neoplasias do sistema imune. Entre os
Linfomas B deve-se esperar uma maior freqüência de Linfomas
Centroblásticos, por ser este tipo celular relacionado com o sistema B. Isto foi
confirmado no presente estudo.
5.5 Índice de proliferação celular pelo método do AgNORs
Em nosso estudo, a média de número de AgNORs intranuclear nos
linfomas de alto grau de malignidade foi estatisticamente maior que nos
linfomas de baixo grau, o que corrobora os dados presentes na literatura
consultada (CROKER et a., 1987; VAIL et al., 1996; VALDOVICH et al., 2004).
Embora o número maior de AgNORs nos linfomas de alto grau de
malignidade que nos de baixo grau concorde com vários autores, as médias
encontradas no presente trabalho foram mais baixas que as da literatura
consultada. Os linfomas de baixo grau apresentaram uma media de 0,98 ± 0,36
e os de alto grau, 1,37 ± 0,32. Croker et al., em 1987, utilizando o mesmo tipo
de material, encontraram para os linfomas de baixo grau, um AgNOR por
núcleo em media e nos de alto grau, cinco AgNORS por núcleo. Já Valdovich e
et al., em 2004, usando tanto material histológico como citológico para
contagem dos AgNORs obtiveram nas amostras histológicas, a variação foi de
2,2 a 3,0 nos linfomas de baixo grau e 2,6 a 3,7 nos de alto grau. Estes
mesmos autores relatam que estas diferenças nas médias de diversos
trabalhos podem ocorrer devido a alterações durante o processamento do
material, desde a fixação, o processamento histológico e até mesmo durante a
coloração pela prata. A técnica utilizada para corar os linfomas deste estudo
seguiu o mesmo padrão descrito por PLOTON et al. (1986) No entanto, os
tempos de fixação do material, desparafinização e desidratação não foram
padronizados naqueles casos resgatados do arquivo. Estas variações podem
interferir na impregnação da prata, formando grandes agregados ao invés de
pequenos pontos, isso leva a um excesso de prata intranuclear e reduz o
número de pontos contados nos núcleos interferindo na média de AgNORs
(VALDOVICH et al., 2004).
Quando comparados os resultados deste trabalho com outro realizado
no mesmo laboratório por Pessoa em 2005, também nota-se que mesmo
havendo diferenças entre os graus de malignidade, as médias deste autor
foram maiores que no presente estudo. Esta diferença pode ser devido ao tipo
de material utilizado por Pessoa (2005), que trabalhou com amostras colhidas
por meio de citologia aspirativa. Segundo Valdovich et al.,em 2004, que
utilizaram amostras citológicas e histológicas dos mesmos casos, obtiveram
números maiores de AgNORs nos exames citológicos. De acordo com estes
autores, as células nas amostras citológicas apresentam-se íntegras e não
fatiadas pelo micrótomo como nas preparações histológicas, por isso o número
de AgNORs seria maior e os NORs pequenos seriam mais facilmente
reconhecidos. Mesmo assim, o método de contagem do AgNORs, é de grande
eficácia na determinação do grau de malignidade dos linfomas caninos, tanto
nas amostras histológicas como naquelas colhidas pela citologia aspirativa.
Quando analisados os linfomas de alto grau, CROKER et al., em 1987,
relataram que os linfomas centroblásticos apresentavam a maior média no
número de AgNORs, no presente trabalho, os tipos de neoplasia que
mostraram as maiores quantidades de pontos intranucleares foram os linfomas
imunoblásticos, seguidos pelos centroblásticos.
O padrão de distribuição encontrado em todos casos de linfoma nesta
pesquisa, corresponde ao tipo II, que apresenta vários aglomerados de NORs
no núcleo. Em 1996, LORAND-METZE & METZE, verificaram, estudando
pacientes com leucemias crônicas, que o prognóstico de leucemia progressiva
estava relacionado com um número maior de aglomerados de NORs e as
amostras com NORs únicos, os pacientes eram considerados estáveis. O
número de AgNORs nas células malignas é maior que nas hiperplásicas ou
benignas e está associado com a alta taxa de proliferação celular (CROKER et
al., 1987; TRERÈ 1994; DERENZINI & PLOTON, 1991; RABENHORST et al.,
1994; VALDOVICH et al., 2004). Estes últimos autores obtiveram cerca de 80%
das neoplasias classificadas no padrão de distribuição II e o padrão em todas
as amostras de linfonodos normais ou reativos foi I, que possui apenas um
agregado pequeno.
5.6 Índice de Proliferação Celular pelo método do Ki-67 (MIB-1)
Quando analisada a marcação com Ki-67 para proliferação celular,
pudemos notar diferença significativa dos índices de proliferação entre os
grupos de alto grau e baixo grau de malignidade e este resultado está de
acordo com a literatura, tanto para linfomas caninos como linfomas não-
Hodgkin dos seres humanos (KIUPEL et al., 1999; FOUNEL-FLEURY et al.,
1997; PHILLIPS et al., 2000; WANG et al., 2005; MADEWELL, 2001).
Fournel-Fleury et al., em 1997, analisando 92 casos de linfomas
caninos, observaram que os linfomas de baixo grau de malignidade possuíam
índices de proliferação entre 3 e 16% e os de grau alto, entre 39 e 60%.
Levando em consideração estas taxas de proliferação, os autores
estabeleceram um percentual de 21% como o limite entre os tumores de alto
grau e de baixo grau de malignidade. No presente trabalho, a variação da
proliferação entre os linfomas de baixo grau estava entre 1,67 e 34,5% e
considerando os de alto grau, esta variou entre 24,4 e 80,53%. Ainda no
mesmo trabalho, os autores relatam que dentre os linfomas de baixo grau, dois
casos, apresentaram média maior que os 21%, sendo o maior, um linfoma
Centrocítico com 30% de células positivas para o marcador Ki-67. Todos os
linfomas de alto grau apresentaram índice proliferativo maior que o limite de
21%. Utilizando esta taxa de 21% como parâmetro para dividir as neoplasias
de acordo com o grau de malignidade, obtivemos 3 casos de baixo grau com
percentual maior que o limite, sendo o maior também um linfoma Centrocítico
com 34,5% de células marcadas e todos os linfomas de alto grau
apresentaram o índice de proliferação maior que 21%, sendo o menor, um
linfoma Imunoblástico com 24,4%.
Este mesmo parâmetro de percentual de células em proliferação nos
linfomas de alto e baixo grau foi estabelecido nos seres humanos em diversos
trabalhos com valores de 20%, 25% e 26% determinados por Hall et al., (1988),
Schrape et al. (1987) e Gerdes et al. (1991), respectivamente.
Os valores observados, na literatura consultada, para os índices
proliferativos demonstram que em alguns tipos citológicos podem ocorrer
discrepâncias quanto a este parâmetro e, portanto, somente a classificação
cito-histológica dos linfomas pode não estabelecer o padrão de
comportamento biológico da neoplasia. Os linfomas de alto grau de
malignidade, humanos e caninos, com um alto índice de proliferação celular
tendem a responder melhor a quimioterapia (FOUNEL-FLEURY et al., 1997;
PHILLIPS et al., 2000). Assim sendo, os índices proliferativos devem ser
considerados, principalmente, na análise de casos individuais da rotina de
diagnóstico.
5.7 Índice de apoptose pelo método da Caspase-3
Quando analisados os resultados do índice de apoptose pelo método
da expressão da caspase-3, não obtivemos diferença estatisticamente
significativa (P > 0,05) entre os linfomas de alto e baixo grau, bem como entre
os diferentes imunofenótipos. Obtivemos resultados semelhantes nos linfomas
de alto grau (6,82%) e nos de baixo grau de malignidade (6,67%). Deve-se
ressaltar, no entanto, que nos linfomas difusos de células B em seres
humanos, já foi observado que os tumores de alto grau apresentam índices
apoptóticos maiores que os linfomas de baixo grau de malignidade
(DONOGHUE et al., 1999; DUKERS et al., 2002).
O índice de apoptose determinado pela expressão de caspase-3
apresentou desvio padrão elevado o que indica uma grande variação na
percentagem de células positivas entre os casos. Dukers et al., em 2002,
afirmaram que os linfomas difusos de grandes células B, nos seres humanos,
apresentam grande variação na marcação para este anticorpo, a média de
percentual de células marcadas destes linfomas foi de 5,8% podendo variar de
1 a 27% e os linfomas de baixo grau, apresentavam menos de 1% de células
em apoptose.
No presente estudo, os linfomas de alto grau apresentaram variações
entre 0,28% a 28,71% de células positivas para a marcação da caspase-3 e os
de baixo grau entre 0,35% e 19,2%, resultado que concorda com a literatura.
Dukers et al., em 2002, afirmam que além de uma grande variação no índice de
apoptose pela caspase-3, há variações individuais de alguns tumores, o que
pode estar relacionado à expressão da proteína p-53 mutante, e em última
análise influenciaria a resistência a quimioterapia. Estas variações também
podem ser devido às áreas de necrose que são comuns nos linfomas de alto
grau, pois não existe marcação de caspase-3 nas áreas necróticas (DUKERS
et al., 2002).
Quanto ao padrão de marcação citoplasmática do anticorpo anti-
caspase-3, em todos os casos deste trabalho a marcação foi citoplasmática
difusa. Arai et al., em 2005, avaliando linfomas B primários de sistema nervoso
central, também não relataram presença da marcação citoplasmática
puntiforme nas neoplasias linfóides. O padrão puntiforme de positividade está
relacionado a um melhor prognóstico, pois este é característico de folículos
linfóides normais ou hiperplásicos ou a uma neoplasia em estádio inicial e
indica uma melhor resposta ao tratamento quimioterápico e remissão completa
da doença (DONOGHUE et al., 1999). Deve-se considerar que a maioria dos
casos de linfoma utilizados no presente estudo encontravam-se em estágios
avançados, o que poderia explicar o tipo de marcação encontrada.
A caspase-3 tem sido considerada um dos melhores métodos de
determinação do índice de apoptose, esta percentagem é mais correta que a
contagem de corpos apoptóticos. As células apoptóticas reconhecidas por sua
morfologia, representam um índice menor que o valor real, pois várias células,
já em apoptose, podem ainda não apresentar alterações morfológicas visíveis
na microscopia óptica (DUKERS et al., 2002).
Ainda não existem dados na literatura veterinária sobre a marcação
pela caspase-3, uma vez que não existe relato de sua utilização nos linfomas
caninos, nem em outra neoplasia nesta espécie, por isso todos os resultados
apresentados foram comparados aos dados de linfomas não Hodgkin`s dos
seres humanos.
5.8 Expressão de p53
Entre os 40 casos de linfomas deste estudo, 29 (72,25%) apresentaram
reação positiva para expressão de p53. Os resultados encontrados na literatura
mostram algumas variações. Sueiro et al., em 2004, encontraram 59% de
positividade, Veldhoen et al., (1998) relataram que 60% dos linfomas
apresentaram expressão da proteína mutante e Gamblin et al., em 1997,
tiveram 40% de casos positivos. Deve-se ressaltar que todos os autores
citados empregaram o mesmo clone do anticorpo utilizado no presente estudo.
Apesar de não haver diferença estatística entre as médias de células
que expressaram o p53 mutante, no que diz respeito aos graus de malignidade
e imunofenótipo, os linfomas de alto grau de malignidade apresentaram maior
número de células positivas (2,38%) que os linfomas de baixo grau (2,27%) e
os linfomas com imunofenótipo T/B apresentaram maior número de células que
expressam p-53 (4,10 %) que os linfomas T (2,12%), que por sua vez
apresentaram positividade maior do que os linfomas B (1,97%), resultados
semelhantes aos encontrados em outros estudos desta mesma neoplasia em
cães (SOKOLOWSKA, et al., 2005)
Sueiro et al., em 2004, apesar de não encontrarem diferença
estatisticamente diferente entre os linfomas T e B, relataram um percentual de
células positivas discretamente mais alto nos linfomas T, e ainda encontraram
diferença entre as neoplasias de alto e baixo grau de malignidade.
Os linfomas T com estadiamento clínico avançado, geralmente
apresentam um percentual maior de células positivas para o p-53 (SUEIRO et
al., 2004). Pacientes portadores destas neoplasias possuem um tempo de
sobrevida menor que aqueles com linfomas B (GREENLE et al., 1990; TESKE
et al., 1994b).
No presente estudo pode-se perceber que os casos com mais de 10%
de células expressando p53 mutante, todos apresentaram idade acima dos seis
anos, resultado semelhante ao encontrado por Sueiro et al., 2004, que
obtiveram a média de idade de 7 anos entre os animais com 10% ou mais de
células positivias.
Sokolowska et al., em 2005, avaliaram a expressão de p53 em linfomas
caninos, apesar de todos os linfomas apresentarem expressão da proteína
mutante, com índice de positividade variando entre 0,87% a 3,46%. Estes
autores não encontraram amostras com mais de 10% de células positivas. No
presente estudo, 72,25% dos linfomas apresentaram positividade para p53 e
foram classificados dois casos com mais de 10% de células marcadas, mais
especificamente um linfoma imunoblástico de alto grau e um linfoma de células
T pleomórficas de baixo grau de malignidade. Nosso percentual de positividade
para a expressão de p53 foi mais próximo do encontrado por Sueiro et al., 2004
(60%), porém não detectamos diferença nesta expressão quando
consideramos o grau de malignidade da neoplasia, como afirmam os mesmos
pesquisadores.
De acordo com os estudos mais recentes sobre os linfomas, tanto na
espécie humana como nos cães, o diagnóstico, a escolha do tratamento e o
prognóstico estão relacionados não só com a morfologia celular, mas também
com o imunofenótipo, com os índices de proliferação celular e de apoptose e
em alguns casos com a expressão de p-53 mutante.
Os linfomas não-Hodgkin`s humanos, de alto grau de malignidade
apresentam uma alta taxa de células em proliferação e um índice de apoptose
maior que os de baixo grau. Isso faz com que haja, nos casos de linfoma de
alto grau, uma resposta mais rápida ao tratamento quimioterápico. Nos
linfomas caninos, as pesquisas mais recentes comprovam um comportamento
biológico semelhante às neoplasias humanas.
Outro parâmetro importante na classificação neoplásica é o índice de
células em apoptose. Um dos melhores marcadores para estas células é a
caspase-3. O percentual de células que expressam esta enzima geralmente é
maior nos linfomas de alto grau de malignidade e este resultado está
relacionado a um melhor prognóstico para os pacientes (DONOGHUE et al.,
1999).
Ainda não existem dados na literatura veterinária sobre o
comportamento das neoplasias em relação a este marcador, porém esta
pesquisa mostrou um percentual ligeiramente mais alto nos linfomas de alto
grau, semelhante ao que acontece na espécie humana. Entre os linfomas de
mesmo grau de malignidade, pode-se observar grandes diferenças individuais
em relação a sensibilidade do tumor ao tratamento e alguns autores associam
este fato a mutação do gene p-53 (IMAMURA et al., 1994).
A mutação da proteína p-53 não parece ser uma mutação importante
nos linfomas humanos nem nos cães (IMAMURA et al., 1994), mas quando as
células neoplásicas expressam essa proteína alterada, o tratamento é
ineficiente, seja ele quimioterápico ou radioterápico (SOHN et al., 2003).
Segundo nossos resultados, não existe relação entre a marcação do p-53 e o
grau de malignidade das neoplasias, mas os tumores em fases mais
avançadas mostram uma maior quantidade de células positivas para o
anticorpo anti-p-53.
Nos estudos mais recentes sobre linfomas, na espécie humana bem
como nos cães, a classificação morfológica e o imunofenótipo não são mais
suficientes para determinarem o diagnóstico e o prognóstico. Além destas
classificações, são necessários dados sobre os índices de proliferação celular
e apoptose individuais de cada neoplasia. Assim sendo, poderemos determinar
o tratamento mais adequado e aumentar a sobrevida dos pacientes,
possibilitando ainda comparar os resultados obtidos nos cães, estabelecendo,
desta forma, o linfoma canino como modelo experimental da doença dos seres
humanos.
6. CONCLUSÕES
1. O índice proliferativo, avaliado pelo método do AgNOR e da expressão
do Ki-67 (MIB-1) foi maior nos linfomas de alto grau do que nos linfomas
de baixo grau, não havendo diferença entre os imunofenótipos das
neoplasias.
2. O índice apoptótico pode ser avaliado pela expressão da caspase-3
utilizando a técnica de imunoistoquímica com o anticorpo primário anti-
caspase-3.
3. O índice apoptótico dos linfomas caninos mostra grande variação, não
havendo diferenças entre os graus e imunofenótipos das neoplasias.
4. A expressão do p-53 mutante nos linfomas caninos não é rara, não
havendo diferenças entre os graus e imunofenótipos das neoplasias.
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8. TRABALHO ENVIADO PARA PUBLICAÇÃO:
“BRAZILIAN JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH AND
ANIMAL SCIENCE”
PROLIFERAÇÃO CELULAR NOS LINFOMAS CANINOS
Autores: Sara Maria de Carvalho e Suzano
1
Julio Lopes Sequeira
2
Adriana Wanderley de Pinho Pessoa
3
Camila Dias Porto
1
Deílson Elgui de Oliveira
4
1. Pós-graduanda do Curso de pós-graduação em Medicina Veterinária, área de
Patologia Veterinária da FMVZ – UNESP, Campus de Botucatu;
2. Docente do Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP, Campus de
Botucatu;
3. Docente do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Ceará;
4. Docente do Departamento de Patologia da FMB – UNESP, Campus de Botucatu
Endereço para correspondência:
Julio Lopes Sequeira
Departamento de Clínica Veterinária
FMVZ – Unesp
Distrito de Rubião Júnior, s/n
CEP 18618-000
PROLIFERAÇÃO CELULAR NOS LINFOMAS CANINOS
PROLIFERATION IN CANINE LYMPHOMA
RESUMO: O estudo dos linfomas caninos além de abordar a classificação morfológica e
imunofenotípica necessita ser ampliado para que se tenha a avaliação da cinética celular. Esta
verificação só pode ser feita com segurança quando são avaliados os parâmetros que indicam a taxa de
proliferação celular. No homem, estes fatores têm influência no prognóstico e no tratamento dos
limfomas. Os 40 linfomas utilizados neste trabalho foram classificados de acordo com a classificação
de Kiel e a imunofenotipagem utilizou CD3 (linfócitos T) e CD79a (linfócitos B). A proliferação
celular foi avaliada pelos métodos de contagem dos AgNORs e Ki-67 (MIB-1) De acordo com a
classificação de Kiel os linfomas de alto grau foram os mais freqüentes. Quando avaliada a
proliferação celular houve diferença significativa entre os linfomas de alto e baixo grau tanto pelo
método do AgNOR como do KI-67.(MIB-1), porém não foram estatisticamente entre os
imunofenótipos Entre as neoplasias de alto grau de malignidade a média de número de NORs por
núcleo de célula neoplásica foi de 1,37 ± 0,32, e nos casos de baixo grau de 0,98 ± 0,36, de acordo
com o KI-67 a média do percentual de células positivas foi de 43,19% ± 19,01, e 14,09% ± 11,74 nos
casos de alto e baixo grau, respectivamente.
ASBSTRCT: Lymphoma studies deals with morphological classification and immunophenotypic
features and they have to be amplified for cellular kinetics evaluation. This evaluation can only be
safely made, when the proliferative index are evaluated. In men the proliferation index have, most of
the time, important influence in the neoplasia prognosis and treatment In this work it was used 40
canine lymphomas that were classified according to Kiel methods and immunophenotype was
achieved with CD3 (T lymphocyte) and CD79a (B lymphocyte). Cellular proliferation was evaluated
by AgNORs and Ki-67 (MIB-1) According to Kiel classification system, high grade lymphomas were
more frequent.When cellular proliferation was evaluated, there was a significant difference between
high grade and low grade lymphomas by AgNOR and Ki-67 (MIB-1) methods, but did not differ
when comparing immunophenotype. Among high grade malignancy lymphomas the NORs medium
number per cell nucleoli was 1.37± 0.32 and in low grade was 0.98± 0.36, concerning Ki-67 the
positive cellular percentual was 43.19% ± 19.01, e 14.09% ± 11.74 in high and low grade,
respectively
INTRODUÇÃO
Os linfomas estão entre as neoplasias mais freqüentes na espécie canina, (CAPURRO et al.,
1992; TESKE 1994a e 1994b; MILNER et al., 1996; VONDEHAAR & MORRISON, 1998). A
classificaçào cito-histológica deste tipo de neoplasia tem auxiliado na determinação do grau de
agressividade, do melhor tipo de tratamento e no prognóstico dos cães. No entanto, em estudos recentes
tem-se verificado que a associação deste tipo de avaliação com métodos de determinação da proliferação
celular permite caracterizar com maior fidelidade o comportamento biológico das neoplasias (KIUPEL et
.al, 1999; ROELS, et al., 1999).
Existem vários métodos de avaliação da proliferação celular, entre estes estão as técnicas
histoquímicas para a contagem dos AgNORs (Argyrophil Nucleolar Organizer Regions) ou ainda a
avaliação imunoistoquímica, utilizando-se a marcação do antígeno Ki-67 (MIB-1).
Os AgNORs são estruturas presentes nos núcleos celulares, relacionadas com a síntese de
proteínas nas células em proliferação. O grande número de AgNORs reflete um alto índice de
proliferação. Esses parâmetros têm sido utilizados com grande eficácia nos linfomas do homem e do
cão. As neoplasias de grau alto de malignidade possuem um número maior de AgNORs
intranucleolares e estes apresentam-se distribuídos difusamente enquanto os tumores de grau baixo de
malignidade possuem AgNORs agregados dentro dos nucléolos (CROCKER et al., 1987).
Métodos imunoistoquímicos têm sido empregados para a detecção de proteínas associadas à
proliferação celular tanto nas neoplasias humanas como na Medicina Veterinária (ALVES et al.,
1999; ROELS et al., 1999). O principal marcador da células em proliferação é o antígeno Ki-67
(MIB-1) (FOURNEL-FLEURY et al., 1997; KIUPEL et al. 1999).
O antígeno Ki-67 (MIB-1) pode ser detectado em todas as fases do ciclo celular menos na G
0
(GERDES et al., 1991). Este tem relação direta com a fração de crescimento de uma população
celular e é considerado, atualmente, como o melhor marcador imunoistoquímico de proliferação
celular (ALVES et al., 1999). E esta determinação tem valor prognóstico nos linfomas não-Hodgkin
humanos, pois a análise desse índice pode estabelecer um fator independente para cada caso (HALL et
al., 1988).
Na espécie canina, a quantificação do antígeno Ki-67 (MIB-1) nos diferentes grupos de
linfomas, pode resultar em um aumento na acurácia das classificações dos linfomas caninos. Fournel-
Fleury et al., (1997), observaram uma correlação positiva entre a proporção de células positivamente
marcadas pelo Ki-67, a morfologia celular, o imunofenótipo e o grau de malignidade.
O objetivo do presente estudo é determinar o índice de proliferação celular nos linfomas
caninos utilizando o método histoquímico de AgNOR e a expressão da proteína Ki-67 (MIB-1),
correlacinnado-o com o graus de malignidade segund a classificação de Kiel.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 40 casos de linfomas caninos, fixados em formalina 10% e submetidos ao
prcessamento histológico de rotina, corados pelo método da Hematoxilina e Eosina (HE) e classificados
de acordo com a classificação morfológica de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990).
A técnica do AgNOR utilizada foi descrita por PLOTON et al., (1986) e segue o roteiro da
Apostila de Técnicas de Colorações Específicas do Laboratório de Histopatologia do Serviço de Patologia
Veterinária da FMVZ – UNESP.
Para a determinação do imunofenótipo, foram empregados marcadores linfóides para linfócitos
T, o anticorpo policlonal anti-CD3 (Dako) na diluição de 1:100 e para linfócitos B, o anticorpo
monoclonal anti-CD79a (Dako) na diluição de 1:50. Para determinação do índice de proliferação celular o
anticorpo anti Ki-67 clone MIB-1, monoclonal (DAKO) na diluição de 1:50. Todas as amostras foram
submetidas a recuperação antigênica com solução tampão de citrato 10 mM, pH 6,0, em forno de
microondas durante 15 minutos. O bloqueio da peroxidase endógena foi feito em solução de água
oxigenada a 10 volumes por 15 minutos e o anticorpo primário foi incubado durante 18 horas na
tempreratura de 4 ºC. O sistema de detecção utilizado foi o kit EnVision Dual link (Dako) . Para
visualização da reação, as lâminas foram tratadas com solução de 3,3´diaminobenzidina (Liquid DAB –
K3466 DakoCytomation) durante cinco minutos à temperatura ambiente. Os cortes foram contra-corados
com hematoxilina de Harris, por 35 segundos. A recuperação antigênica para s anticorpos anti-CD3 e anti
CD-79a foi realizada com EDTA pH 8,0 em “steamer” durante 20 minutos e o anticorpo secundário foi
do Kit ABC (Dako).
A avaliação quantitativa de AgNORs e da expressão de Ki-67 (MIB) foi realizada utilizando-se
analisador de imagens semi-automático modelo ZEISS com programa de morfometria Pro-Image 1.0,
acoplado a microscópio de luz Imager. A1- Zeiss e captação de imagem por câmera Axiocam MRC -
Zeiss.
A avaliação quantitativa de AgNORs, foi realizada por meio da contagem direta dos pontos de
AgNORs presentes nos núcleos de 100 células em cada caso analisado. As lâminas foram obervadas em
objetiva de imersão, obtendo-se a média do número de pontos de NORs por núcleo de célula neoplásica.
Para determinação do índice de proliferação celular pela expressão de Ki-67 (MIB) foi realizada
a contagem de todas as células presentes em cinco campos aleatórios em objetiva de 40x do microscópio.
Nestes mesmos campos aleatórios foram também contadas as células positivas. Estes valores foram
transformados em percentual de células positivas e submetidos à análise estatística.
Os resultados de ambas as contagens foram submetido ao teste t (student) a fim de
verificar a diferença entre as médias de acordo com os graus de agrssividade das neoplasias segundo a
classificação de Kiel. Considerando o grau de significância P < 0,05.
RESULTADOS
Quando utilizada a classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990), foi observado a
predominância dos linfomas de alto grau de malignidade, em 29 casos (72,5%) seguido por 11 casos de
linfomas de baixo grau (27,5%).
No presente estudo obteve-se a mesma freqüência de linfomas T e linfomas B, ocorrendo em 17
casos (42,5%), seguidos pelos Linfomas T/B em seis casos (15%). Os 13 casos de linfomas T
classificados como de grau alto de malignidade, foram classificados como Imunoblásticos e as neoplasias
de baixo grau, foram três casos de linfoma T pleomórfico e um linfocítico. Dentre os 17 casos de
linfomas B, 11 casos são de grau alto de malignidade e 6 casos são de baixo grau de malignidade, sendo
cinco centroblásticos, quatro Imunoblásticos, dois Linfoblásticos, dois centrocíticos-centroblasticos, dois
centrocíticos, um linfocítico e um linfoplasmacítico
Dentre os 40 casos de linfomas a contagem dos AgNORs foi realizada em 28 casos, sendo 21 de
alto grau e 7 casos de baixo grau. Entre as neoplasias de alto grau de malignidade a média foi de 1,37 ±
0,32, e nos casos de baixo grau de 0,98 ± 0,36. A distribuição dos pontos foi dispersa pelo núcleo,
correspondendo ao tipo II de padrão de distribuição descrito por (CROKER & EGFAN, 1988). De acordo
com teste t (student) foi observada diferença estatisticamente significativa (P< 0,05) entre os grupos de
alto e baixo grau de malignidade.
Entre neoplasias de alto grau de malignidade a média de células em proliferação marcadas pelo
Ki-67 (MIB-1) foi de 43,19% ± 19,01, e nos casos de baixo grau de 14,09% ± 11,74, sendo observada
diferença estatisticamente significativa pelo teste t (student) (P < 0,01) entre os grupos.
DISCUSSÃO
Os 40 casos de linfoma utilizados neste tabalho, foram classificados de acordo com a
Classificação de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990), havendo predominância dos linfomas de grau alto
(72,5%) em relação aos linfomas de grau baixo (27,5%). Este resultado é semelhante ao obtido nos
trabalhos que utilizaram esta mesma classificação em material colhido pelo método da Punção Aspirativa
por Agulha Fina (TESKE & VAN HEERDER,1996; SUZANO, 2004), ou material incluído em parafina
(APPELBAUM et al., 1984; PARODI et al., 1988; GREENLEE et al., 1990; TESKE 1994; FOURNEL-
FLEURY et al., 1997).
No que diz respeito à determinação do imunofenótipo dos linfomas caninos, o emprego dos
anticorpos CD3 e CD79a, marcadores de células T e células B, respectivamente, tem permitido que esta
determinação seja feita em material fixado em formol e incluído em parafina (MILNER et al., 1996; DE
MOURA, 2000; PESSOA, 2005). A classificação imunocitoquímica dos linfomas torna-se um
procedimento importante na medida em que auxilia na definição do comportamento clínico da neoplasia e
sua resposta ao tratamento quimioterápico (TESKE et al, 1994a; TESKE et al, 1994b, FOURNEL-
FLEURY et al., 1994; FISHER et al., 1995; FOURNEL-FLEURY et al., 1997; DOBSON et al., 2001 e
FOURNEL-FLEURY et al., 2002). Os cães portadores de Linfomas T respondem menos ao tratamento
quimioterápico e têm tempo de sobrevida menor do que os cães portadores de Linfomas B (DOBSON et
al., 2001).
Na casuística utilizada neste trabalho foram utilizados 17 casos de linfoma que apresentaram
imunofenótipo T (CD3+/CD79a-) e 17 casos que apresentaram imunofenótipo B (CD3-/CD79a+), e três
linfomas de imunofenótipo T/B (CD3+/CD79+).
Quando analisada a marcação com Ki-67 para proliferação celular, pudemos notar diferença
significativa dos índices de proliferação entre os grupos de alto grau e baixo grau de malignidade e este
resultado concorda com a literatura, tanto para linfomas caninos como linfomas não-Hodgkin dos seres
humanos (KIUPEL et al., 1999; FOUNEL-FLEURY et al., 1997; PHILLIPS et al., 2000; WANG et al.,
2005; MADEWELL, 2001).
Fournel-Fleury et al., em 1997, analisando 92 casos de linfomas caninos, observaram que os
linfomas de baixo grau de malignidade possuíam índices de proliferação entre 3 e 16% e os de grau alto,
entre 39 e 60%. Levando em consideração estas taxas de proliferação, os autores estabeleceram um
percentual de 21% como o limite entre os tumores de alto grau e de baixo grau de malignidade. No
presente trabalho, a variação da proliferação entre os linfomas de baixo estava entre 1,67 e 34,5% e
considerando os de alto grau, esta variou entre 24,4 e 80,53%. Ainda no mesmo trabalho, os autores
relatam que dentre os linfomas de baixo grau, dois casos, apresentaram média maior que os 21%, sendo o
maior, um linfoma Centrocítico com 30% de células positivas para o marcador Ki-67. Todos todos os
linfomas de alto grau apresentaram índice proliferativo maior que o limite de 21%. Utilizando esta taxa de
21% como parâmetro para dividir as neoplasias de acordo com o grau de malignidade, obtivemos 3 casos
de baixo grau com percentual maior que o limite, sendo o maior também um linfoma Centrocítico com
34,5% de células marcadas e todos os de alto grau apresentaram o índice de proliferação maior que 21%,
sendo o menor, com 24,4% um linfoma Imunoblástico.
Este mesmo parâmetro de percentual de células em proliferação de divisão dos linfomas foi
estabelecido nos seres humanos em diversos trabalhos com valores de 20%, 25% e 26% determinados por
Hall et al., (1988), Schrape et al., (1987) e Gerdes et al., em 1984, respectivamente.
Os valores observados, na literatura consultada, para os índices proliferativos demonstram que
em alguns tipos citológicos podem ocorrer discrepâncias quanto a este parâmetro e, portanto, somente a
classificação cito-histológica dos linfomas pode não estabelecer o padrão de comportamento da neoplasia.
Os linfomas de alto grau de malignidade, humanos e caninos, com um alto índice de proliferação celular
tendem a responder melhor a quimioterapia (FOUNEL-FLEURY et al., 1997; PHILLIPS et al., 2000).
Assim sendo, os índices proliferativos devem ser considerados, principalmente, na análise de casos
individuais da rotina de diagnóstico.
Em nosso estudo, a média de número de AgNORs intranuclear nos linfomas de alto grau de
malignidade foi estatisticamente maior que nos linfomas de baixo grau, o que corrobora os dados
presentes na literatura consultada (CROKER et a., 1987; VAIL et al., 1996; VALDOVICH et al., 2004).
Embora o número maior de AgNORs nos linfomas de alto grau de malignidade que nos de baixo
grau concorde com vários autores, as médias encontradas no presente trabalho foram mais baixas que as
da literatura consultada. Os linfomas de baixo grau apresentaram uma media de 0,98 ± 0,36 e os de alto
grau, 1,37 ± 0,32. Croker et al., em 1987, utilizando o mesmo tipo de material, encontraram para os
linfomas de baixo grau, um AgNOR por núcleo em media e nos de alto grau, cinco AgNORS por núcleo.
Já Valdovich e et al., em 2004, usando tanto material histológico como citológico para contagem dos
AgNORs obtiveram nas amostras histológicas, a variação foi de 2,2 a 3,0 nos linfomas de baixo grau e
2,6 a 3,7 nos de alto grau. Estes mesmos autores relatam que estas diferenças nas médias de diversos
trabalhos podem ocorrer devido a alterações durante o processamento desde a fixação do material,
processamento histológico até mesmo durante a coloração pela prata. A técnica AgNOR utilizada para os
linfomas deste estudo seguiu o mesmo padrão descrito por diversos autores. No entanto, os tempos de
fixação do material, desparafinização e desidratação não foram padronizados naqueles casos resgatados
do arquivo. Estas variações podem interferir na impregnação da prata, formando grandes agregados ao
invés de pequenos pontos, isso leva a um excesso de prata intranuclear e reduz o número de pontos
contados nos núcleos interferindo na média de AgNORs (VALDOVICH et al., 2004).
Quando comparados os resultados deste trabalho com outro realizado no mesmo laboratório por
Pessoa em 2005, também nota-se que mesmo havendo diferenças entre os graus de malignidade, as
médias deste autor foram maiores que no presente estudo. Esta diferença pode se dever ao tipo de
material utilizado por Pessoa (2005), que utilizou amostras colhidas por meio de citologia aspirativa.
Valdovich et al.,em 2004, que utilizaram amostras citológicas e histológicas dos mesmos casos,
obtiveram números maiores de AgNORs nos exames citológicos. De acordo com estes autores, as células
nas amostras citológicas apresentam-se íntegras e não fatiadas pelo micrótomo como nas preparações
histológicas, por isso o número de AgNORs seria maior e os NORs pequenos seriam mais facilmente
reconhecidos. Mesmo assim, o método de contagem do AgNORs, é um método eficaz na determinação
do grau de malignidade dos linfomas caninos, tanto nas amostras histológicas como naquelas colhidas
pela citologia aspirativa.
Segundo CROKER et al.(1987), os linfomas Centroblásticos apresentam a maior média no
número de AgNORs. No presente trabalho, os tipos de neoplasia que mostraram as maiores quantidades
de pontos intranucleares foram os linfomas Imunoblásticos, seguidos pelos Centroblásticos.
Amostras de linfonodos normais ou reativos mostram agregados de forma homegênea dentro do
nucléolo com cada nucléolo apresentando apenas um NOR, o que corresponde ao padrão I, sendo o
padrão II, caracterizado pela presença de vários agregados somente dentro do nucléolo, observado em
cerca de 80% das neoplasias (VALDOVICH et al., 2004). O padrão de distribuição encontrado em todos
casos de linfoma nesta pesquisa, corresponde ao tipo II. LORAND-METZE & METZE (1996),
verificaram, estudando pacientes com leucemias crônicas, que o prognóstico de leucemia progressiva
estava relacionado com um número maior de aglomerados de NORs, pois as amostras com NORs únicos
correspondiam aos pacientes considerados estáveis. O número de AgNORs nas células malignas é maior
que nas hiperplásicas ou benignas e está associado com a alta taxa de proliferação celular (CROKER et
al., 1987; TRERÈ 1994; DERENZINI & PLOTON, 1991; RABENHORST et al., 1994; VALDOVICH et
al., 2004).
Os resultados apresentados no presente trabalho mostram que o método de AgNOR e a
expressão da proteína Ki-67 (MIB-1) permitem estabelecer o índice proliferativo dos linfomas caninos e
tem relação com os graus das neoplasias determinados pela classificação de Kiel.
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São Paulo, 30 de Março de 2007.
Prezado Autor
Recebemos o artigo intitulado
“Proliferação Celular nos Linfomas Caninos
(Proliferation in Canine Lymphoma)”.
de autoria de
“Sara Maria de Carvalho e Suzano, Júlio Lopes Siqueira, Adriana
Wanderley de Pinto Pessoa, Camila Dias Porto, Deílson Elgui de Oliveira”.
de Artigo completo, cadastrado com o número 037/07.
Qualquer informação a respeito deste artigo pode ser solicitada diretamente
à Seção de Publicação da FMVZ/USP, com as funcionárias da FUMVET,
Sra. Vânia de Almeida dos Santos e ou Cristiane Santos Torralba Orbêa
Telefones: 011 – 3091 – 7636/ 1230
Pelos e-mails: vania@fumvet.com.br,[email protected].br
Atenciosamente,
Cristiane Santos Torralba Orbea
Secretária da Seção de Publicação do periódico
Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science
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