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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
ESTUDO DO PAPEL DO ESTRESSE OXIDATIVO EM CÓRTEX CEREBRAL DE
RATOS SUBMETIDOS AO MODELO EXPERIMENTAL DE HIPERPROLINEMIA
TIPO II
DANIELA DELWING
ORIENTADORA
Profª. Drª. Angela Terezinha de Souza Wyse
CO-ORIENTADOR
Prof. Dr. Carlos Severo Dutra-Filho
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas –
Bioquímica, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em Bioquímica
Porto Alegre, 2003
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Dedico este trabalho à minha família, pelo
incentivo constante e ao meu namorado pela
compreensão, apoio e amor.
II
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“A vida só vale a pena ser vivida quando
se faz alguma coisa pela vida em vida.
Servindo ao semelhante com
sensibilidade de artista, com ciência e
conhecimento de profissional e com amor e
dedicação de ser humano.”
(Autor desconhecido)
III
AGRADECIMENTOS
À querida orientadora e amiga Profa. Dra. Angela T. S. Wyse pela oportunidade,
presença constante, ensinamentos, paciência, compreensão e carinho com que
orientou este trabalho.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Carlos Severo Dutra-Filho pela colaboração,
atenção e ensinamentos.
Aos Profs. Clóvis M. D. Wannmacher e Moacir Wajner pelos ensinamentos e
amizade.
Aos bolsistas e colegas alunos de pós-graduação pela amizade,
companheirismo, trabalhos e festas realizadas.
Aos meus pais (Ciro e Dalila) por me incentivarem sempre e por acreditarem em
meus sonhos.
Ao meu namorado Nicássio por estar sempre presente, pelo carinho e
principalmente pela compreensão.
À minha irmã Débora por estar ao meu lado em mais um passo de minha vida.
Ao meu irmão Fábio pelo apoio constante e carinho.
A todos os funcionários e professores deste Departamento pela atenção e
dedicação.
A Deus, pela oportunidade de viver.
IV
RESUMO
A hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva causada pela
deficiência severa na atividade da enzima ∆
1
– pirrolino-5-carboxilato desidrogenase,
o que resulta em acúmulo tecidual de prolina. Muitos pacientes apresentam
manifestações neurológicas como epilepsia e retardo mental. Embora as
manifestações neurológicas sejam encontradas em um considerável número de
pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais estas ocorrem são pouco
compreendidos.
O estresse oxidativo é um importante processo que vem sendo relatado na
patogênese de algumas condições que afetam o sistema nervoso central (SNC),
como é o caso das doenças neurodegenerativas, epilepsia e demência. Este fato
torna-se facilmente compreensível, visto que o SNC é altamente sensível ao estresse
oxidativo, em face do alto consumo de oxigênio; do alto conteúdo lipídico,
principalmente de ácidos graxos poliinsaturados, dos altos níveis de ferro e da baixa
defesa antioxidante.
Considerando que: a) pouco se sabe a respeito dos altos níveis de prolina no
SNC, b) a prolina ativa receptores NMDA e é epileptogênica e c) o estresse oxidativo
está associado com doenças que afetam o SNC, no presente estudo investigamos os
efeitos in vivo e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo,
como a quimiluminescência, o potencial antioxidante total (TRAP), e sobre as
atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px)
e superóxido dismutase (SOD) em córtex cerebral de ratos Wistar.
V
Os resultados mostraram que a administração aguda de prolina aumentou
significativamente a quimiluminescência e reduziu o TRAP em córtex cerebral de
ratos de 10 e 29 dias. Em contraste, a administração crônica de prolina não alterou
estes parâmetros. Todavia, a presença de prolina no homogeneizado de córtex
cerebral de ratos de 10 e 29 dias aumentou significativamente a quimiluminescência e
reduziu o TRAP em concentrações de prolina semelhantes àquelas encontradas nos
tecidos de pacientes hiperprolinêmicos (0,5 – 1,0 mM).
Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de prolina
não alterou as atividades das enzimas GSH-Px e SOD em córtex cerebral de ratos de
10 e 29 dias, mas diminuiu significativamente a atividade da CAT em ratos de 29 dias.
Por outro lado, a administração crônica de prolina não alterou a atividade da enzima
SOD, mas significativamente aumentou a atividade da CAT e reduziu a atividade da
GSH-Px. Em adição, a presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral
reduziu significativamente a atividade da SOD em ratos de 10 dias, permanecendo as
atividades da CAT e GSH-Px inalteradas. Todavia, as atividades das enzimas
antioxidantes não foram alteradas na presença de prolina no homogeneizado de
córtex cerebral de ratos de 29 dias.
Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que o estresse oxidativo
induzido pela prolina pode estar envolvido na disfunção cerebral observada na
hiperprolinemia tipo II.
VI
ABSTRACT
Hyperprolinemia type II is an autosomal recessive disorder caused by the severe
deficiency of ∆
1
– pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase activity, resulting mainly in
tissue accumulation of proline. Most patients detected so far show neurological
manifestations including epilepsy and mental retardation. Although neurological
dysfunction is commonly found in a considerable number of hyperprolinemic patients,
the mechanisms by which this occurs are poorly understood.
Oxidative stress is an important event that has been related to the pathogenesis
of some conditions affecting the central nervous system (CNS) such as
neurodegenerative disorders, epilepsy and dementia. This is understandable since the
CNS is highly sensitive to oxidative stress due to its high oxygen consumption, its high
iron and lipid contents, especially polyunsaturated fatty acids, and the low activity of
antioxidant defenses.
Considering that: a) very little is known about the role of high sustained levels of
proline in CNS, b) proline activates NMDA receptor and is epileptogenic and c) the
oxidative stress is associated with diseases that affect the CNS, in the present study
we determined the in vivo and in vitro effects of proline on some parameters of
oxidative stress, such as chemiluminescence, total radical-trapping antioxidant
potential (TRAP) and the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT),
glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) in Wistar rat
cerebral cortex.
VII
The results showed that acute administration of proline significantly increased
chemiluminescence and decreased TRAP in cerebral cortex of 10-day-old and 29-day-
old rats. In contrast, chronic administration of proline did not alter these parameters.
Furthermore, the presence of proline in the homogenates of cerebral cortex of 10-day-
old and 29-day-old rats significantly increased chemiluminescence and decreased
TRAP at proline concentrations similar to those observed in tissues of hyperprolinemic
patients (0.5 – 1.0 mM).
Our results also showed that acute administration of proline did not alter the
activities of GSH-Px and SOD in cerebral cortex of 10-day-old and 29-day-old rats, but
significantly decreased CAT activity in 29-day-old rats. On the other hand, chronic
administration of proline did not alter SOD, but significantly increased CAT and
decreased GSH-Px activities. In addiction, the presence of proline in the homogenates
of cerebral cortex significantly reduced SOD activity in 10-day-old-rats, but did not alter
CAT and GSH-Px activities. However, the activities of the antioxidant enzymes were
not affected by the presence of proline in the homogenates of cerebral cortex of 29-
day-old rats.
The results obtained in our study suggest that oxidative stress induced by proline
may be involved in the brain dysfunction observed in hyperprolinemia type II.
VIII
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................01
1.1 Erros Inatos do Metabolismo........................................................................01
1.2 L-Prolina..........................................................................................................04
1.3 Hiperprolinemias............................................................................................10
1.3.1 Conceito e Classificação...............................................................................10
1.3.2 Hiperprolinemia Tipo II..................................................................................11
1.3.2.1 Conceito.....................................................................................................11
1.3.2.2 Diagnóstico................................................................................................13
1.3.2.3 Manifestações clínicas...............................................................................14
1.3.2.4 Tratamento.................................................................................................16
1.4 Modelo animal de hiperprolinemia tipo II.....................................................17
1.5 Radicais Livres...............................................................................................18
1.5.1 Definição e generalidades.............................................................................18
1.5.2 Espécies Reativas do Oxigênio.....................................................................21
1.5.3 Espécies Reativas do Nitrogênio...................................................................25
1.6 Estresse Oxidativo.........................................................................................28
1.6.1 Mecanismos de Dano Celular por Estresse Oxidativo..................................29
1.6.1.1 Lipoperoxidação.........................................................................................29
1.6.1.2 Dano às proteínas......................................................................................31
1.6.1.3 Dano ao DNA..............................................................................................31
1.6.2 Sistema de Defesa Antioxidante...................................................................32
IX
1.6.2.1 Enzimas Antioxidantes...............................................................................33
1.6.2.2 Vitaminas Antioxidantes.............................................................................37
1.7 Estresse oxidativo e Doenças neurodegenerativas....................................39
2 OBJETIVOS......................................................................................................42
3 ARTIGOS..........................................................................................................43
4 DISCUSSÃO.....................................................................................................45
5 CONCLUSÕES.................................................................................................55
6 PERSPECTIVAS...............................................................................................57
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................58
X
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Estrutura geral de um α-aminoácido.........................................................04
FIGURA 2. Estrutura da prolina...................................................................................05
FIGURA 3. Rotas metabólicas de biossíntese e degradação da prolina.....................09
FIGURA 4. Rota metabólica da prolina, indicando o local de bloqueio na
hiperprolinemia tipo II..................................................................................................12
FIGURA 5. Reação entre dois radicais livres - ligação covalente...............................20
FIGURA 6. Desintegração homolítica do peróxido de hidrogênio..............................23
FIGURA 7. Produção do radical hidroxila através da Reação de Fenton...................23
FIGURA 8. Reação de redução do íon ferro...............................................................23
FIGURA 9. Produção do radical hidroxila através da Reação de Fenton...................24
FIGURA 10. Produção do radical hidroxila através da Reação de Haber-Weiss........24
FIGURA 11: Formação de ROS a partir do oxigênio molecular...................................27
FIGURA 12. Estresse oxidativo x mecanismos de defesa...........................................28
FIGURA 13. Reação de dismutação do radical superóxido.........................................33
FIGURA 14. Reação de decomposição do peróxido de hidrogênio pela enzima
catalase........................................................................................................................34
FIGURA 15. Reação catalisada pela enzima glutationa peroxidase. Outros
hidroperóxidos podem ser utilizados como substrato da reação.................................36
FIGURA 16. Reação de redução da glutationa pela glutationa redutase....................36
FIGURA 17. Redução do oxigênio
à água...................................................................37
XI
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA: (RS)-α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionato
ATP: adenosina 5’-trifosfato
CAT: catalase
Cu
+
: íon cuproso
Cu
++
: íon cúprico
CuZn-SOD: cobre-zinco superóxido dismutase
Mn-SOD: manganês superóxido dismutase
Fe-SOD: ferro superóxido dismutase
DNA: ácido desoxirribonucléico
EIM: erros inatos do metabolismo
FAD: flavina adenina dinucleotídio
Fe
2+
: íon ferroso
Fe
3+
: íon férrico
GR: glutationa redutase
GSH: glutationa (forma reduzida)
GSH-Px: glutationa peroxidase
GSSG: glutationa (forma oxidada)
H
2
O: água
H
2
O
2
: peróxido de hidrogênio
NAD
+
:
nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NADP
+
: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma oxidada)
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)
NMDA: N-metil-D-aspartato
NO: óxido nítrico
O
2
: oxigênio molecular
O
2
-
: ânion superóxido
O
2
2-
: íon peróxido
XII
OH
•
: radical hidroxila
OH
-
: ânion hidroxila
ONOO
-
: ânion peroxinitrito
P5C: pirrolino-5-carboxilato
PROT: transportadores de prolina
R•: radical livre
RNA: ácido ribonucléico
RNAm: ácido ribonucléico mensageiro
RNS: espécies reativas do nitrogênio
ROS: espécies reativas do oxigênio
SNC: sistema nervoso central
SOD: superóxido dismutase
TRAP: potencial antioxidante total
XIII
1. INTRODUÇÃO
1.1 Erros Inatos do metabolismo
Os erros inatos do metabolismo (EIM) são alterações genéticas que se
manifestam pela síntese de uma proteína anômala, geralmente uma enzima, ou por
uma diminuição ou mesmo ausência de sua síntese. Estas alterações resultam em
deficiência da atividade da enzima envolvida, ocasionando bloqueio de rotas
metabólicas. Como conseqüência, pode ocorrer tanto o acúmulo de metabólitos
tóxicos como a falta de produtos essenciais, ambos com doença subseqüente (Bickel,
1987).
A partir do conceito “um gene – uma enzima” expresso na década de 40 por
Beadle e Tatum, foi possível estabelecer uma relação mais definida entre os aspectos
bioquímicos e genéticos. Considerando este conceito, estipula-se que todos os
processos bioquímicos no organismo estão sob controle gênico, portanto, sujeitos a
serem realizados de forma deficiente, sempre que uma mutação se manifestar
(Stambury et al., 1983).
O termo “erro inato do metabolismo” foi sugerido por Sir Archibald Garrod em
1908. Atualmente, ele é usado para descrever mais de 500 defeitos (Scriver et al.,
2001), a maioria deles envolvendo processos de síntese, degradação, transporte e
armazenamento de moléculas no organismo (Benson e Fensom, 1985).
Abaixo, encontra-se descrita a classificação dos EIM conforme a área do
metabolismo afetado:
EIM dos aminoácidos
EIM dos ácidos orgânicos
EIM dos carboidratos
EIM dos lipídios
EIM dos glicosaminoglicanos
EIM das glicoproteínas
EIM das purinas e pirimidinas
EIM das enzimas eritrocitárias
EIM dos metais
EIM das lipoproteínas
EIM dos hormônios
Embora individualmente raros, os EIM são relativamente freqüentes em seu
conjunto, estimando-se que possam ocorrer em até 1 em cada 1000 recém-nascidos
(Giugliani, 1988). Estudos realizados em grupos considerados de alto risco indicam
uma freqüência de EIM mais de 100 vezes maior nesses indivíduos, em relação à
população em geral (Wannmacher et al., 1982).
Os EIM geralmente são doenças graves que podem resultar em morte neuronal.
Estas doenças manifestam-se na infância. Por outro lado, os EIM podem ser
absolutamente assintomáticos (Holtzman, 1978).
2
O tratamento dos EIM será mais bem sucedido quanto mais precoce for o
diagnóstico.
Existem diversas maneiras de abordar terapeuticamente os EIM (Stambury et
al., 1983):
a) limitando a entrada do precursor;
b) suplementando o metabólito ausente;
c) inibindo a formação da substância acumulada;
d) inibindo o acúmulo de uma determinada substância;
e) controlando os fatores desencadeantes;
f) aumentando a atividade enzimática;
g) suplementando a proteína não enzimática deficiente; ou
h) suplementando a enzima deficiente.
Os EIM mais comuns são os de aminoácidos, sendo exemplos a fenilcetonúria, a
homocistinúria e a hiperprolinemia, que apresentam acúmulo tecidual de fenilalanina,
homocisteína e prolina, respectivamente.
3
1.2 L-Prolina
Os aminoácidos são conhecidos como α-aminoácidos porque possuem um
grupo amino primário (-NH
2
) e um grupo carboxílico (-COOH) como substituintes do
mesmo átomo de carbono (o carbono α) (Voet et al., 2000).
COO
-
+
H
3
N C H
R
Figura 1. Estrutura geral de um α-aminoácido.
A análise de um grande número de proteínas mostrou que elas são compostas
de 20 aminoácidos-padrão. Porém, não são todas as proteínas que contêm todos os
20 aminoácidos, mas grande número delas contêm a maioria deles (Voet et al., 2000).
Os aminoácidos diferem uns dos outros através de suas cadeias laterais, que
variam em estrutura e carga elétrica (Lehninger et al., 2001).
De acordo com Voet e colaboradores (2000), os aminoácidos são classificados
pela polaridade de suas cadeias laterais. São descritos três tipos principais de
aminoácidos: os com grupos R apolares, os com grupos R polares não carregados e
os com grupos R polares carregados.
4
A L-prolina (prolina) é classificada como aminoácido de cadeias laterais
apolares, possuindo um grupo pirrolidina cíclico na cadeia lateral (Voet et al., 2000).
COO
-
C H
HN CH
2
H
2
C CH
2
Figura 2. Estrutura da prolina
A prolina é um aminoácido não essencial em crianças e adultos, e
condicionalmente essencial em prematuros (Phang et al., 2001). A prolina possui um
grupo amino secundário (-NH) em sua estrutura química, o qual forma uma base de
Schiff (imino), considerada uma reação bioquímica importante entre uma amina e um
aldeído, o que lhe confere a denominação de iminoácido (Voet e Voet, 1999).
A prolina, em sua rota metabólica, pode ser sintetizada a partir de ornitina e
glutamato, tendo como intermediários comuns pirrolino-5-carboxilato (P5C) ou
glutamato -γ-semialdeído (Phang et al., 2001) (Figura 3).
A prolina oxidase, que se localiza no fígado, rim e cérebro, é a primeira enzima
envolvida na degradação da prolina, dando origem ao P5C, que pode ser degradado
5
a glutamato pela pirrolino-5-carboxilato-desidrogenase (P5C desidrogenase). Esta
enzima localiza-se na matriz mitocondrial (Phang et al., 2001).
A conversão de glutamato em prolina envolve a redução do grupo γ-carboxil a
um aldeído, seguido da formação de uma base de Schiff interna, cuja redução
posterior leva à formação da prolina. A redução do grupo γ-carboxil do glutamato em
um aldeído caracteriza-se por ser um processo endoergônico facilitado,
primeiramente pela fosforilação do grupo carboxila em uma reação catalisada pela γ-
glutamil-quinase. Presume-se que o glutamato-5-fosfato seja o substrato para a
redução seguinte. O glutamato-5-semialdeído resultante cicliza espontaneamente
para formar a base de Schiff interna, ∆
1
-pirrolino-5-carboxilato, o qual é reduzido à
prolina pela enzima pirrolino-5-carboxilato-redutase (P5C redutase) (Voet et al., 2000;
Marks et al., 1996).
A enzima bifuncional, pirrolino-5-carboxilato-sintase, é responsável pela
conversão de glutamato a P5C. Esta enzima caracteriza-se por ser ATP e NADPH
dependente, e também por possuir alta atividade na mucosa do intestino delgado e
atividade mensurável no cólon, pâncreas, timo e cérebro. A enzima P5C redutase,
que catalisa a conversão de P5C em prolina, tem como cofator NADH ou NADPH e é
encontrada em todos os tecidos (Phang et al., 2001, Flynn et al., 2002).
A enzima ornitina-γ-aminotransferase (OAT) catalisa a conversão de ornitina a
P5C, com um α-cetoácido, como o α-cetoglutarato, como aceptor amino (Phang et al.,
2001).
Cabe ressaltar que o P5C, além de ser um intermediário intracelular no
metabolismo da prolina, também é um constituinte do plasma humano. Os níveis de
6
P5C oscilam de 0,2 mM (manhã) à cerca de 2,0 mM (noite), estando associados com
as refeições (Phang et al., 2001).
A função metabólica das rotas da prolina é fornecer prolina para a síntese de
proteínas, para a gliconeogênese hepática e para a síntese de ornitina e arginina,
tendo P5C como intermediário (Phang et al., 2001).
Prolina e P5C também possuem função importante na transferência redox entre
compartimentos celulares. Esta função se deve a localizações celulares e
distribuições teciduais das enzimas que catalisam as interconversões de P5C e
prolina (prolina oxidase, localizada na membrana mitocondrial interna e P5C redutase,
localizada no citosol) (Phang et al., 2001).
A concentração de prolina no plasma e no fluido cérebro-espinhal de indivíduos
normais é de 50-270 µM e de 1-4 µM, respectivamente. Iminoglicinúria neonatal e
prolinúria pós-natal são achados normais e ocorrem devido à imaturidade do sistema
de reabsorção tubular de prolina (Phang et al., 1995).
Interessantemente, a prolina se enquadra em vários critérios clássicos utilizados
para definir um neurotransmissor no sistema nervoso central (SNC) de mamíferos,
tais como:
♦ biossíntese em sinaptossomas,
♦ acúmulo em sinaptossomas por mecanismo de transporte Na
+
-dependente de
alta afinidade após despolarização induzida por K
+
(Cohen e Nadler, 1997).
♦ distribuição regional no cérebro, principalmente em certas rotas
glutamatérgicas (Phang et al., 2001).
7
Dados na literatura mostram que os RNAm que codificam transportadores de
prolina (PROT ) são expressos em subpopulações de neurônios glutamatérgicos em
cérebro de ratos, o que indica que a prolina pode ser um substrato natural na
modulação de rotas específicas de transmissão sináptica excitatória no SNC
(Fremeau et al., 1992, Velaz-Faircloth et al., 1995). A alta afinidade destes
transportadores para captação de prolina extracelular pode indicar seu papel na
potencialização de transmissão excitatória naquelas sinapses que expressam PROT
(Cohen e Nadler, 1997).
Outros autores descrevem que a prolina bloqueia a liberação de glutamato,
alterando a permeabilidade da membrana neuronal ao sódio e diminuindo a
condutibilidade local, levando a uma falha na transmissão nervosa e amnésia (Keller
et al., 1981).
8
Mitocôndria
PROLINA PROLINA
6 1
P5C P5C
2
4
SEMIALDEÍDO-γ-GLUTAMATO ORNITINA
3 5
Citosol GLUTAMATO
1. Prolina Oxidase
2. Reação não enzimática
3. ∆
1
-Pirrolino-5-carboxilato desidrogenase
4. Ornitina-aminotransferase
5. P5C sintase
6. P5C redutase
Figura 3. Rotas metabólicas de biossíntese e degradação da prolina.
9
1.3 Hiperprolinemias
1.3.1 Conceito e Classificação
Hiperprolinemias são EIM da prolina causados pela deficiência de enzimas
envolvidas na sua rota de degradação, o que resulta no acúmulo tecidual de prolina. A
degradação da prolina envolve sua conversão em P5C pela prolina oxidase e de P5C
a glutamato pela P5C desidrogenase (Phang et al., 2001).
As hiperprolinemias caracterizam-se pela elevação anormal de prolina no
plasma e no fluido cérebro-espinhal (Phang e Scriver, 1989) e são classificadas em
tipo I e II.
A hiperprolinemia tipo I é causada pela deficiência na atividade da enzima
prolina oxidase, impossibilitando assim a oxidação de prolina a P5C (Efron, 1965;
Phang et al., 2001).
Registros científicos indicam que não existem relações causais entre a
deficiência da prolina oxidase e manifestações clínicas. O diagnóstico da
hiperprolinemia tipo I é feito por exclusão, uma vez que a desordem não é confirmada
pela demonstração direta da deficiência da prolina oxidase, já que a atividade desta
enzima não é expressa em leucócitos ou em cultura de fibroblastos, os quais são
considerados testes adequados para a realização dos exames. Por outro lado, a P5C
desidrogenase, enzima que se encontra deficiente na hiperprolinemia tipo II, é
expressa em leucócitos e em cultura de fibroblastos. Portanto, detecta-se a
hiperprolinemia tipo I se os pacientes não apresentarem deficiência na atividade da
10
enzima P5C desidrogenase (Phang et al., 2001). A concentração plasmática de
prolina na hiperprolinemia tipo I oscila entre 700 e 2400 µM (Phang et al., 2001).
A hiperprolinemia tipo II é causada pela deficiência na atividade da enzima ∆
1
–
pirrolino-5-carboxilato-desidrogenase; enzima responsável pela conversão de P5C a
glutamato (Phang et al., 2001).
Ambos os tipos de hiperprolinemia são caracterizados pelo acúmulo de prolina
nos tecidos. Todavia, os níveis de prolina no plasma dos pacientes com
hiperprolinemia tipo II são mais elevados (Phang et al., 2001).
O presente trabalho deteve-se no estudo da hiperprolinemia tipo II, em face de
sua associação com manifestações neurológicas e também a fim de dar continuidade
a outros estudos realizados no nosso grupo de pesquisa.
1.3.2 Hiperprolinemia Tipo II
1.3.2.1 Conceito
É uma doença autossômica recessiva do metabolismo de aminoácido causada
pela deficiência hepática na atividade da ∆
1
–pirrolino-5-carboxilato-desidrogenase
(P5CDh), o que resulta no acúmulo tecidual de prolina (Phang et al., 2001) (Figura 4).
11
PROLINA
5 4
∆
1
-
pirrolino-5-carboxilato semialdeído-γ-glutamato
1
3
2
Glutamato
Ornitina
Ciclo da
α-cetoglutarato Uréia
1. ∆
1
- Pirrolino-5-carboxilato desidrogenase
2. ∆
1
- Pirrolino-5-carboxilato sintase
3. Ornitina amino transferase
4. ∆
1
- Pirrolino-5-carboxilato redutase
5. Prolina oxidase
Figura 4. Rota metabólica da prolina, indicando o local de bloqueio na
hiperprolinemia tipo II.
12
1.3.2.2 Diagnóstico
O diagnóstico da hiperprolinemia tipo II é baseado nos níveis aumentados de
prolina sérica e no fluido cérebro-espinhal, os quais oscilam entre 500- 3700 µM
(valores indivíduos normais: 50-270 µM) e 20-50 µM (valores indivíduos normais: 1-4
µM), respectivamente (Phang et al., 2001; Emery et al., 1968; Phang e Scriver, 1989).
Embora ocorra aumento nos níveis plasmáticos e urinários de P5C, cujas
concentrações encontram-se de 10 a 40 vezes mais elevadas do que os valores
normais (Phang et al., 2001) e de glutamato no líquor (Van Harreveld e Fifková, 1973;
Rhoads et al., 1983; Phang et al., 2001), o principal metabólito acumulado
quantitativamente na hiperprolinemia tipo II é a prolina.
Na hiperprolinemia tipo II homozigótica, os valores de prolina sérica geralmente
excedem 1500 µM; em contraste com os heterozigóticos em que os valores de prolina
são normais (Phang et al., 2001).
A prolina é o único aminoácido com concentrações plasmáticas anormais nos
pacientes hiperprolinêmicos, enquanto que na urina ocorre aumento de prolina,
hidroxiprolina e glicina (Phang et al., 2001).
Outro aspecto notável é a iminoglicinúria, que pode se estabelecer pela
competição da prolina com outros aminoácidos que compartilham um sistema comum
de transporte renal (Applegarth et al., 1974; Goodman et al., 1974). Quando os níveis
de prolina plasmáticos excedem 800 µM, a iminoglicinúria presente nos pacientes
torna-se diretamente proporcional à concentração de prolina plasmática. A
iminoglicinúria, portanto, desencadeia-se pelo fato de prolina, glicina e hidroxiprolina
13
utilizarem o mesmo transportador; assim quando a prolina estiver em altas
concentrações, o transporte dos outros substratos será inibido por competição. O
excesso de prolina satura o mecanismo de transporte tubular, ocasionando a
prolinúria (Phang et al., 2001).
A excreção de P5C na urina pode ser qualitativamente identificada pela reação
com O-aminobenzaldeído e ácido tricloroacético em álcool, o que produz coloração
amarela (Phang et al., 2001). A análise quantitativa do P5C no plasma e na urina
pode ser obtida em testes específicos (Mixon et al., 1991; Fleming et al., 1984). O
P5C também pode ser determinado no plasma pela confirmação da deficiência na
atividade da enzima P5C desidrogenase em extrato de cultura de fibroblastos ou de
leucócitos. A enzima é responsável por catalisar o segundo passo na degradação da
prolina e da hidroxiprolina (Phang et al., 2001).
Um segundo metabólito é excretado na urina, o ∆
1
-pirrolino-3-hidroxi-5-
carboxilato, composto derivado do 4-hidroxi-L-prolina. Através de teste realizado com
4-hidroxi-L-prolina (100 mg/kg/marcada) ocorre aumento urinário de ∆
1
-pirrolino-3-
hidroxi-5-carboxilato, o que se associa com o clearance de hidroxiprolina plasmático
(Phang et al., 2001).
1.3.2.3 Manifestações clínicas
Embora ainda não esteja estabelecido se a hiperprolinemia tipo II é uma
desordem benigna ou uma doença que afeta o SNC, os dados na literatura
evidenciam que a hiperprolinemia tipo II tem associação causal com manifestações
14
neurológicas (Phang et al., 2001). Mesmo sendo tais manifestações encontradas em
um considerável número de pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais
ocorrem são pouco compreendidos (Fremeau et al., 1992).
Alguns autores sugerem que níveis elevados de prolina no plasma e no fluido
cérebro-espinhal não são suficientes para causar dano neurológico, uma vez que
pacientes com hiperprolinemia tipo I e II apresentam aumento nos níveis teciduais de
prolina. No entanto, tem sido reportada uma relação causal entre altos níveis de
prolina e convulsões recorrentes em pacientes hiperprolinêmicos, o que sugere que
altas concentrações de prolina podem predispor a convulsões (Flynn et al., 1989).
Neste contexto, dados na literatura mostram que a administração subcutânea ou
intracerebral de prolina em ratos prejudica a formação da memória e aprendizado
(Moreira et al., 1989; Cherkin et al., 1976), o que pode refletir os efeitos neurotóxicos
da prolina e as conseqüências funcionais das alterações fisiopatológicas que ocorrem
no cérebro destes animais (Olton e Markowska, 1994).
O papel da prolina sobre a função do SNC é incerto. Porém, manifestações
neurológicas encontradas em pacientes hiperprolinêmicos sintomáticos, aliadas ao
aparente papel que elevados níveis de prolina exercem no SNC, ativando receptores
do glutamato (Ault et al., 1987; Henzi et al., 1992; Martin et al.,1992; Pace et al., 1992;
Nistri e Morelli, 1978), apresentando transportadores próprios expressos
principalmente em neurônios glutamatérgicos (Fremeau et al., 1992; Fremeau et al.,
1996; Shafqat e Fremeau, 1995; Velaz-Faircloth et al., 1995; Fremeau et al., 1992;
Nadler et al., 1992; Nadler e Cohen, 1995) e aparentemente modulando a
neurotransmissão glutamatérgica, sugerem uma possível ação excitotóxica de altas
15
concentrações de prolina, o que parece contribuir para as disfunções neurológicas
características de indivíduos com hiperprolinemia tipo II.
1.3.2.4 Tratamento
Até o presente momento, parece não existir tratamento específico para as
hiperprolinemias. De acordo com Phang e colaboradores (2001), o tratamento para
pacientes com hiperprolinemia não é indicado, uma vez que estas desordens são
consideradas condições benignas, provavelmente não causando doença. Por outro
lado, Benson e Fensom (1985) acreditam que existem variantes nas hiperprolinemias,
e defendem a idéia de tentar reduzir os níveis de prolina nos indivíduos afetados.
Porém, a prolina é um aminoácido não essencial, sintetizado a partir de outros
precursores. Além disso, a maioria das proteínas contém resíduos de prolina, o que
torna a restrição dietética deste aminoácido difícil, resultando apenas em um modesto
controle nos valores plasmáticos de prolina, não causando dano ao paciente e não
provocando impacto nas manifestações clínicas da doença (Phang et al., 2001). Por
outro lado, a literatura aponta que com a restrição de prolina não são atendidas as
necessidades metabólicas, particularmente na infância, tornando este aminoácido
insuficiente durante o crescimento (Phang et al.,1995).
16
1.4 Modelo animal de hiperprolinemia tipo II
O modelo animal de hiperprolinemia tipo II utilizado neste trabalho foi o mesmo
utilizado em outros trabalhos do nosso grupo de pesquisa e baseia-se no modelo
experimental desenvolvido por Moreira e colaboradores (1989). O modelo tem como
objetivo reproduzir, em ratos, níveis de prolina semelhantes àqueles encontrados em
pacientes com hiperprolinemia tipo II (Phang et al., 2001).
No modelo químico experimental crônico de hiperprolinemia tipo II, os ratos são
tratados do 6° ao 28° dia de vida, sendo a prolina administrada por via subcutânea,
duas vezes ao dia em intervalos de 10 horas entre as injeções. As doses de prolina
variam de acordo com o peso e a idade dos ratos e foram determinadas de acordo
com os parâmetros farmacocinéticos da prolina, com o objetivo de obter níveis
plasmáticos similares àqueles encontrados em pacientes hiperprolinêmicos. Os ratos
controles recebem igual volume de solução salina 0,9% (1ml/100g de peso corporal)
(Moreira et al., 1989).
Tem sido demonstrado que altas concentrações de prolina (≥ 100µM) ativam
receptores NMDA (Ault et al., 1987; Henzi et al., 1992; Martin et al., 1992; Pace et al.,
1992), AMPA (Henzi et al., 1992) e glicina-sensível à estricnina (Henzi et al., 1992;
Nistri e Morelli, 1978) em cérebro de ratos. Baseado nesta constatação e
considerando que a prolina apresenta alta afinidade por transportadores Na
+
/Cl
-
-
dependentes localizados no cérebro, especialmente em terminais glutamatérgicos
(Fremeau et al., 1992; Fremeau et al., 1996; Shafqat e Fremeau, 1995; Velaz-
Faircloth et al., 1995), propõe-se que a prolina atue como modulador da
17
neurotransmissão glutamatérgica, indicando assim sua possível ação excitotóxica
quando em altas concentrações (Nadler, 1987; Cohen e Nadler, 1997).
Estudos realizados mostram que a prolina despolariza células hipocampais
piramidais da região CA1 (Nadler et al., 1989) e de neurônios da medula espinhal em
ratos (Ault et al., 1987; Helm et al., 1990; Henzi e MacDermott, 1991), principalmente
por ativação de receptores NMDA.
Por outro lado, estudos realizados em nosso laboratório mostraram que a
administração de prolina diminui a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase em cérebro de ratos
(Pontes et al., 2001), o que, possivelmente, leva ao rompimento do gradiente iônico, o
qual é necessário para a estimulação neural e potencialização da excitotoxicidade
secundária (Lees, 1993).
Experimentos realizados em nosso grupo também mostraram que a prolina
diminui in vivo e in vitro a atividade da enzima acetilcolinesterase em córtex cerebral
de ratos, o que provavelmente possa ocorrer devido à formação de radicais livres,
uma vez que o pré-tratamento com vitaminas E e C previniu este efeito (Delwing et
al., 2003).
1.5 Radicais Livres
1.5.1 Definição e generalidades
Nos átomos, os elétrons ocupam regiões do espaço conhecidas como orbitais ou
níveis de energia, os quais apresentam diferentes estados energéticos. Cada orbital é
18
freqüentemente associado a uma determinada região do átomo e um orbital pode
suportar no máximo dois elétrons com spins opostos. O spin é a propriedade do
elétron de girar em torno do seu próprio eixo, o que produz um campo magnético em
torno de si. Os elétrons são capazes de girar tanto no sentido horário (1/2) quanto no
sentido anti-horário (-1/2), sendo que dois elétrons em um mesmo orbital devem
possuir spins opostos, criando desta forma campos magnéticos opostos. Quando dois
elétrons ocupam o mesmo orbital, dizemos que eles estão pareados e quando um
elétron está sozinho em um orbital dizemos que está não pareado (Halliwell e
Gutteridge, 1990).
Um radical livre, por sua vez, é definido como qualquer espécie capaz de uma
existência independente, por mais breve que seja e que contenha um ou mais
elétrons não pareados. São considerados exemplos de radicais livres os metais de
transição como o ferro, cobre e manganês e o oxigênio molecular por possuir dois
elétrons não pareados, localizados em diferentes orbitais e que possuem o mesmo
número de spin (Halliwell e Gutteridge, 1984; Bergendi et al., 1999).
Dados na literatura citam o Dr. Comberg como um dos primeiros pesquisadores
a referir-se aos radicais livres. Este fato ocorreu em 1900 quando ele descreveu a
decomposição do hexa-feniletano em dois radicais trifenilmetil (Bergendi et al., 1999).
Em 1929, Paneth e Hofeditz descreveram a decomposição do tetrametil em
radicais livres. A degradação de moléculas primárias em radicais livres necessita de
grande quantidade de energia de ativação, já a decomposição subseqüente requer
pouca energia. Por sua vez, os radicais livres necessitam de pouca energia para
iniciar as reações em cadeia (Bergendi et al., 1999).
19
Em 1930, Michaelis investigou a atividade dos radicais livres na área da
bioquímica; logo depois, em 1940 foram descritos outros estudos de importância
biológica, onde teve origem a técnica para “electron spin resonance” (ESR) e em 1962
foram desenvolvidas técnicas para o estudo de reações cinéticas envolvendo radicais
livres (Bergendi et al., 1999).
Os radicais livres são capazes de reagir com outras moléculas de diversas
maneiras. Um radical pode doar um elétron desemparelhado para outra molécula
(radical redutor) ou pode receber um elétron de outra molécula estabilizando-o
(radical oxidante). Porém, se um radical doar um elétron, receber um elétron ou unir-
se por adição a um não-radical, este não-radical transforma-se em um radical. Deste
modo, as reações de radicais livres com não-radicais têm por característica dar
origem às reações em cadeia onde um radical a fim de se estabilizar, dá origem a
outro radical e assim sucessivamente. As reações em cadeia são finalizadas somente
quando dois radicais livres se encontram, uma vez que eles podem combinar seus
elétrons sem par e se unir para formar uma ligação covalente (Halliwell e Gutteridge,
1999; Peres, 1994).
R. + R. R R
Figura 5. Reação entre dois radicais livres - ligação covalente.
20
1.5.2 Espécies Reativas do Oxigênio (ROS)
Através da cadeia de transporte de elétrons (cadeia respiratória), o oxigênio é
reduzido à água por ação da citocromo oxidase mitocondrial (Marks et al., 1996).
Quando o oxigênio molecular for reduzido por um, dois ou três elétrons, formar-
se-ão o radical ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila,
respectivamente. Ressaltando, os radicais livres são capazes de reagir com outras
moléculas, extraindo seus elétrons e produzindo novos radicais através das reações
em cadeia (Bergendi et al., 1999).
O termo “espécies reativas do oxigênio” foi proposto porque existem espécies
envolvidas nas reações de radicais que não possuem número ímpar de elétrons ou
elétrons desemparelhados. Porém, sua ação pode ser tão prejudicial quanto a ação
dos radicais livres (Halliwell e Gutteridge, 1999).
O radical ânion superóxido contém três elétrons no orbital (π
*
, 2p) e quando
dissolvido em solventes orgânicos, torna-se extremamente reativo. É considerado um
radical altamente reativo, porém possui solubilidade limitada em lipídios (Marks et al.,
1996). Este radical é formado pela redução do oxigênio molecular por apenas um
elétron, mediante aporte de energia. Por ser um radical livre e, por conseguinte, muito
reativo, deve ser removido rapidamente dos tecidos pela reação de dismutação,
realizada pela enzima superóxido dismutase, em que dois ânions superóxido reagem
entre si; sendo um oxidado a oxigênio e o outro reduzido a peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) (Bergendi et al., 1999; Halliwell e Gutteridge, 1984).
21
O ânion superóxido (O
2
-
) é formado em quase todas as células aeróbias
(Fridovich, 1975; Fridovich, 1978; Halliwell e Gutteridge, 1984). Alguns superóxidos
podem ser produzidos por “acidentes químicos”, em que muitas moléculas no
organismo reagem diretamente com o oxigênio, como é o caso das catecolaminas,
tetraidrofolatos e alguns constituintes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial
(Halliwell e Gutteridge, 1989; Liochev e Fridovich, 1994). O radical superóxido
também pode ser proveniente da reação catalisada pela enzima xantina oxidase,
responsável pela conversão de xantina em ácido úrico, e de outras flavoproteínas
oxidases. (Robinson e Badwey, 1995). O superóxido pode ser protonado para formar
HO
2
•
, o radical perhidroxil. Todavia, em pH fisiológico, predomina o O
2
-
(Weiss, 1986).
A adição de um segundo elétron ao O
2
-
leva à formação do íon peróxido (O
2
2-
), o
qual não possui elétron não-pareado e por definição não é um radical. O O
2
2-
formado
em pH fisiológico é imediatamente protonado a H
2
O
2
. Em solução aquosa, o H
2
O
2
é
formado a partir da reação de dismutação do O
2
-
(Halliwell e Gutteridge, 1984).
O H
2
O
2
, por ser um agente oxidante, na presença de ferro (Fe
2+
) ou de outro
metal de transição, ou através da reação com O
2
-
, gera o radical hidroxila (OH
•
). Por
esse motivo, as enzimas catalase e glutationa peroxidase têm como função remover
rapidamente o H
2
O
2
(Marks et al., 1996; Halliwell e Gutteridge, 1989).
A adição de um elétron ao H
2
O
2
leva à formação do OH
•
, considerado um
oxidante extremamente poderoso e capaz de reagir com quase todos os substratos
biológicos (Wilson, 1979; Halliwell e Gutteridge, 1984). O OH
•
pode ser gerado, pelo
menos, por dois mecanismos (Marshall e Bangert, 1995, Halliwell e Gutteridge, 1984):
22
- o primeiro é pela desintegração homolítica do H
2
O
2
por radiação:
H
2
O
2
2 OH
•
Figura 6. Desintegração homolítica do peróxido de hidrogênio.
- o segundo é através da reação com metais de transição (Reação de Fenton):
Fe
2+
+ H
2
O
2
Fe
3+
+ OH
•
+ OH
-
Figura 7. Produção do radical hidroxila através da Reação de Fenton.
Na presença de pequenas quantidades de ferro, o O
2
-
é capaz de reduzir o Fe
3+
a oxigênio molecular e Fe
2+
.
Fe
3+
+ O
2
-
Fe
2+
+ O
2
Figura 8. Reação de redução do íon ferro.
Para limitar a presença de ferro disponível e evitar a formação de radicais livres,
o ferro é seqüestrado e transportado por uma variedade de proteínas, como a
transferrina e a hemopexina; após, pelos receptores de transferrina, endossomas e
por fim pela ferritina e hemosiderina (Marshall e Bangert, 1995).
23
O cobre também é capaz de reagir com o H
2
O
2
e originar o OH
•
(Halliwell e
Gutteridge, 1984).
.
Cu
+
+ H
2
O
2
Cu
2+
+ OH
•
+ OH
–
Figura 9. Produção do radical hidroxila através da Reação de Fenton.
O OH
•
também pode se formar pela reação do H
2
O
2
com o O
2
-
, denominada
reação de Haber-Weiss (Halliwell e Gutteridge, 1984).
O
2
-
+ H
2
O
2
O
2
+ OH
•
+ OH
-
Figura 10. Produção do radical hidroxila através da Reação de Haber-
Weiss.
Outra ROS é o oxigênio singlet, o qual existe em dois estados: o oxigênio
∆
-
singlet que possui elétrons pareados, com spins opostos, que se encontram em
apenas um orbital, ficando o outro orbital desocupado; e o oxigênio
σ
-singlet que
possui dois elétrons, que se encontram em diferentes orbitais, como no estado
fundamental, mas com spins opostos (Bergendi et al., 1999).
O oxigênio singlet é capaz de oxidar muitas moléculas, incluindo membranas
lipídicas. O oxigênio ∆-singlet é mais comum porque é termodinamicamente mais
24
estável, enquanto que o oxigênio σ-singlet é rapidamente convertido ao ∆-singlet
(Bergendi et al., 1999).
O oxigênio singlet é uma forma que sofreu um rearranjo de elétrons que permite
que ele reaja com moléculas biológicas mais rapidamente do que o oxigênio “normal”.
Esta espécie se encontra em um estado de maior energia do que o oxigênio
molecular, e pode ser formada pela reação entre o ânion hipoclorito e o H
2
O
2
, pela
reação de Haber Weiss e através do radical O
2
-
e OH
•
(Peres, 1994; Bergendi et al.,
1999).
O ânion hipoclorito também é considerado um poderoso agente oxidante e é
produzido pelas células fagocitárias através da ação da enzima mieloperoxidase
(Weiss, 1986).
As ROS podem reagir com outros átomos ou moléculas e dar origem aos
radicais alcoxil e peroxil em lipídios (Bergendi et al., 1999).
1.5.3 Espécies Reativas do Nitrogênio (RNS)
O termo espécies reativas do nitrogênio engloba o radical óxido nítrico (NO), o
ânion peroxinitrito (ONOO
-
) e os íons nitrosônio (NO
+
) e nitroxila (NO
-
) (Bergendi et
al., 1999).
Em 1992, a revista “Science” fez referência ao NO como sendo “a molécula do
ano”.
O NO é formado em todas as células do SNC pela ação da enzima óxido nítrico
sintase (NOS). Essa reação enzimática requer L-arginina, oxigênio molecular e
25
NADPH como co-substratos. Os cofatores envolvidos nesta reação são flavina
adenina dinucleotídio (FAD), flavina mononucleotídio (FMN) e tetraidrobiopterina
(BH4); e os grupos prostéticos são a calmodulina e o heme (Knowles, 1997; Lincoln et
al., 1997).
O NO é um radical livre e em muitos sistemas biológicos possui tempo de meia-
vida curto, devido à sua reatividade com outros constituintes intracelulares, como o
O
2
-
(Beckman et al., 1993). A reação entre o NO e o O
2
-
resulta na formação de ânion
peroxinitrito (ONOO
-
). Esta reação é extremamente favorável, uma vez que o NO
compete efetivamente com a enzima superóxido dismutase pelo O
2
-
(Beckman et al.,
1993; Lipton et al., 1993).
A formação do ONOO
-
a partir de NO e O
2
-
é três vezes mais rápida que a
reação catalisada pela superóxido dismutase, enzima responsável pela dismutação
do O
2
-
em H
2
O
2
(Radi et al., 1991). O ONOO
-
é formado em meio ácido, e
posteriormente protonado a ácido peroxinítrico que, espontaneamente, forma o OH
•
, o
qual é um radical extremamente citotóxico. Os produtos finais desta reação são os
nitratos (Bergendi et al., 1999).
O ONOO
-
é considerado um potente oxidante e é capaz de reagir prontamente
com sulfidrilas (Radi et al., 1991).
26
O
2
e
-
O
2
-
e
-
,2H
+
H
2
O
2
e
-
, H
+
H
2
O + OH
•
e
-
, H
+
2H
2
O
Figura 11: Formação de ROS a partir do oxigênio molecular (adaptado de Marks
et al., 1996).
27
1.6 Estresse Oxidativo
O estresse oxidativo foi definido em 1991 como “um distúrbio do equilíbrio pró-
oxidante/antioxidante em favor do pró-oxidante, levando ao dano potencial” (Halliwell
e Gutteridge, 1999) (Figura 12).
ROS
V
itamina
E,
Enzimas,
Defesas
celulares
Figura 12. Estresse oxidativo x mecanismos de defesa (adaptado de Marks et
al., 1996).
Em princípio, o estresse oxidativo pode resultar de uma diminuição dos
antioxidantes e/ou da produção aumentada de ROS/RNS. A diminuição dos
antioxidantes pode ser causada pela diminuição da atividade das enzimas de defesa
antioxidante [cobre-zinco superóxido dismutase (CuZnSOD), manganês superóxido
dismutase (MnSOD), catalase (CAT) ou glutationa peroxidase (GSH-Px)] ou pela
deficiência nutricional de antioxidantes e/ou outros constituintes dietéticos essenciais
(alfa-tocoferol, ácido ascórbico, aminoácidos contendo enxofre necessário para a
síntese de glutationa, ou riboflavina, necessária para a produção de FAD, um cofator
28
da glutationa redutase). A produção aumentada de ROS/RNS pode ser causada pela
exposição elevada ao oxigênio, pela presença de toxinas que são metabolizadas para
produzir ROS/RNS, ou pela excessiva ativação de sistemas “naturais” de produção de
ROS/RNS (ativação inapropriada de células fagocíticas em doenças inflamatórias
crônicas, como na artrite reumatóide e colite ulcerativa) (Halliwell e Gutteridge, 1999).
1.6.1 Mecanismos de Dano Celular por Estresse Oxidativo
1.6.1.1 Lipoperoxidação
A lipoperoxidação é um processo fisiológico que ocorre nas membranas
celulares. Além de ser um fator de renovação da membrana, este processo é
essencial na síntese de prostaglandinas e leucotrienos, bem como na fagocitose e
pinocitose (Halliwell, 1992).
Membranas celulares e organelas subcelulares são particularmente sensíveis ao
dano oxidativo devido à presença de ácidos graxos poliinsaturados em suas
membranas fosfolipídicas (Weiss, 1986).
O OH
•
é provavelmente o mais potente das ROS e possui a habilidade de reagir
com uma ampla variedade de constituintes celulares. É o provável iniciador das
reações em cadeia a partir do ataque a membranas lipídicas, fato conhecido como
peroxidação lipídica (Marshall e Bangert, 1995). A iniciação da peroxidação lipídica
pode ocorrer também na presença de radicais peroxil, alcoxil e perhidroxil
(Cheeseman, 1993).
29
A peroxidação lipídica, classicamente se procede em três etapas: iniciação,
propagação e terminação.
Nas reações de iniciação, ocorre a remoção do átomo de hidrogênio do ácido
graxo alvo para formar um radical lipídico (L
•
). O produto da reação, agora contendo
um elétron não pareado no carbono, reage com o oxigênio para formar o radical
peroxil (LOO
•
), o qual é capaz de reagir com outros ácidos graxos poliinsaturados e
dar origem a uma nova cadeia de oxidação, formando assim o lipídio hidroperóxido
(LOOH). Este, por sua vez, geralmente é considerado o produto primário da
peroxidação lipídica. A iniciação de uma nova cadeia a partir de radicais peroxil é
definida como o estado de propagação da peroxidação lipídica. Os hidroperóxidos
não são tão estáveis e são particularmente instáveis na presença de metais de
transição como o ferro e o cobre. Os sais ferrosos reagem rapidamente com os
lipídios hidroperóxidos para gerar radicais alcoxil e os sais férricos para dar origem
aos radicais peroxil. Os íons metálicos conduzem à desintegração dos hidroperóxidos,
levando à geração de espécies de radicais livres capazes de iniciarem novas cadeias
de peroxidação lipídica. A decomposição dos hidroperóxidos na presença de íons
ferro ou cobre leva à formação de aldeídos citotóxicos, como o malondialdeído, o qual
é capaz de modificar quimicamente as proteínas e o DNA. Por fim, as reações de
terminação têm como objetivo formar um produto estável, o que ocorre quando dois
radicais livres reagem entre si, anulando seus elétrons solitários (Cheeseman, 1993;
Marshall e Bangert, 1995; Boveris, 1998).
30
1.6.1.2 Dano às Proteínas
O ataque dos RL às proteínas causa, principalmente, a oxidação de
grupamentos sulfidril e metionil, formando ligações cruzadas entre proteínas, o que
leva à desnaturação (Webster e Nunn, 1988). Nas proteínas, os aminoácidos prolina,
histidina, arginina, cisteína e metionina são suscetíveis ao ataque do OH
•
e ao dano
oxidativo. A oxidação destes aminoácidos nas proteínas resulta em fragmentação
protéica e suscetibilidade à digestão proteolítica (Marks et al., 1996). O ataque das
RNS sobre a tirosina tem como produto a nitrotirosina, que pode ser detectada em
lesões ateroscleróticas (Halliwell e Gutteridge, 1999).
1.6.1.3 Dano ao DNA
O aumento de ROS/RNS pode causar dano ao DNA através do ataque químico
direto (como por exemplo, a ação das ROS sobre as bases do DNA) e/ou através de
mecanismos indiretos (como por exemplo, a ação das ROS sobre enzimas que
replicam ou reparam o DNA). Todavia, quando o O
2
-
, o NO ou o H
2
O
2
se encontram
em níveis fisiológicos, estes não reagem com as bases do DNA ou do RNA, ou com a
ribose ou desoxirribose em razões significativas. Em relação ao OH
•
, este na
presença do DNA, é capaz de gerar vários produtos, uma vez que ele ataca açúcares,
purinas e pirimidinas (Halliwell e Gutteridge, 1999).
A literatura descreve que as ROS, bem como as RNS estão envolvidas no
desenvolvimento do câncer, não apenas por exercerem efeitos diretos ao DNA, mas
31
também por afetarem a transdução de sinais, a proliferação celular, a comunicação
intracelular e por causar morte celular (Halliwell e Gutteridge, 1999).
1.6.2 Sistema de Defesa Antioxidante
O organismo possui mecanismos de defesa contra a ação tóxica dos radicais
livres e ROS, diminuindo ou eliminando as conseqüências negativas de seus efeitos
no organismo.
O sistema de proteção que diminui a influência negativa de ROS no organismo
compreende:
A) compostos que catalisam a remoção de radicais livres e outras “espécies
reativas” – por exemplo: superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase e
antioxidantes-tióis-específicos,
B) proteínas que minimizam a disponibilidade de pró-oxidantes como os íons
ferro, cobre e o heme – por exemplo: transferrinas, haptoglobulinas, hemopexina.
Este grupo inclui a ceruloplasmina, que tem como função oxidar os íons ferrosos,
C) proteínas que protegem biomoléculas contra o dano,
D) agentes de baixo peso molecular que removem ROS/RNS – por exemplo:
glutationa, ácido ascórbico, α-tocoferol e provavelmente bilirrubina e ácido úrico
(Halliwell e Gutteridge, 1999; Bergendi et al., 1999).
As defesas celulares localizam-se dentro das células, nos compartimentos
hidrofílicos e hidrofóbicos. A maioria das enzimas citoprotetoras localiza-se dentro das
32
células e os antioxidantes são encontrados nos meios intra e extracelulares (Marshall
e Bangert, 1995).
1.6.2.1 Enzimas Antioxidantes
SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD)
A enzima SOD tem como função catalisar a dismutação de íons superóxido em
oxigênio e H
2
O
2
(Fridovich, 1975).
.
SOD
O
2
-
+ O
2
-
+ 2H
+
H
2
O
2
+ O
2
Figura 13. Reação de dismutação do radical superóxido.
Existem três tipos de SOD de acordo com os metais localizados no sítio ativo: as
que contêm cobre e zinco (CuZn-SOD), manganês (Mn-SOD) e ferro (Fe-SOD) no
sítio ativo (Halliwell e Gutteridge, 1999).
A) CuZn-SOD: São constituídas por duas subunidades protéicas, as quais
contêm no sítio ativo um íon cobre e um íon zinco. Localizam-se em todas as células
eucarióticas, sendo que nas células animais, a enzima se localiza no citosol e em
menor proporção nos lisossomas, núcleo e no espaço entre a membrana mitocondrial
33
interna e externa. A CuZnSOD também se encontra nos peroxissomas. Possui
estabilidade ao calor, ao ataque de proteases e à desnaturação.
B) Mn-SOD: São constituídas por quatro subunidades protéicas, contendo
usualmente um íon manganês por subunidade e localizam-se na matriz mitocondrial.
C) Fe-SOD: Geralmente são constituídas por duas subunidades protéicas, as
quais contêm um ou dois íons ferro por molécula de enzima e localizam-se em
bactérias, algas e plantas.
CATALASE (CAT)
A reação de dismutação do O
2
-
gera o H
2
O
2
, que deve ser rapidamente removido
do organismo. A remoção desta ROS é feita por ação de duas enzimas (CAT e
glutationa peroxidase).
A CAT catalisa a decomposição do H
2
O
2
em duas moléculas de água e uma de
oxigênio. É constituída por quatro subunidades protéicas, contendo um grupo-férrico-
heme ligado ao sítio ativo e localiza-se principalmente nos peroxissomas, e em menor
quantidade no citosol e fração microssomal da célula (Aebi, 1984; Halliwell e
Gutteridge, 1999; Marks et al., 1996).
CAT
2H
2
O
2
2H
2
O
+ O
2
Figura 14. Reação de decomposição do peróxido de hidrogênio
pela
enzima catalase.
34
GLUTATIONA PEROXIDASE (GSH-Px)
A GSH-Px foi descoberta como uma enzima que, semelhante a CAT, metaboliza
o H
2
O
2
. Localiza-se em todos tecidos animais e é considerada o maior sistema de
proteção contra a peroxidação lipídica induzida. A enzima é constituída por quatro
subunidades protéicas e contém um átomo de selênio no sítio ativo (Halliwell e
Gutteridge, 1999).
A GSH-Px catalisa a redução do H
2
O
2
e também de lipídios peróxidos (LOOH).
A glutationa (GSH) é um importante tripeptídio e se localiza em elevadas
concentrações em muitos tecidos, porém no cérebro esse tripeptídio se encontra em
baixas concentrações. A GSH tem como função proteger o organismo contra o
estresse oxidativo, uma vez que atua na remoção de radicais livres e é o substrato
para a GSH-Px (Boyland e Chasseaud, 1970). Os grupamentos sulfidrila da GSH
doam seus elétrons e são oxidados a dissulfito (GSSG) durante a reação. A glutationa
redutase (GR) é responsável pela redução do dissulfito formado, a fim de originar
novamente a forma reduzida. Os elétrons necessários para a reação são provenientes
do NADPH, o qual é gerado pela rota pentose-fosfato (Halliwell e Gutteridge, 1999;
Marks et al., 1996; Wendel, 1981).
Existem dois tipos de GSH-Px, uma que utiliza o selênio como cofator e que se
encontra na mitocôndria e no citosol da célula e outra que não depende de selênio,
que se encontra somente no citosol e que é responsável pela metabolização de
hidroperóxidos orgânicos (Mills, 1960; Maiorino et al., 1990).
35
GSH-Px
2GSH + H
2
O
2
GSSG + H
2
O
Figura 15. Reação catalisada pela enzima glutationa peroxidase. Outros
hidroperóxidos podem ser utilizados como substrato da reação.
GSSG + NADPH + H
+
GR
2GSH + NADP
+
Figura 16. Reação de redução da glutationa pela glutationa redutase.
36
O
2
Fe
2+
Fe
3+
2O
2
-
SOD
H
2
O
2
OH
.
2H
+
O
2
H
2
O
2
2 GSH NADP
+
CAT GSH-Px
GR
GSSG NADPH
H
+
2H
2
O + O
2
2H
2
O
Figura 17. Redução do oxigênio
à água (adaptado de Marks et al., 1996).
1.6.2.2 Vitaminas Antioxidantes
ÁCIDO ASCÓRBICO
O ácido ascórbico (vitamina C) é considerado um importante antioxidante, pois é
capaz de reagir rapidamente com muitas ROS/RNS, especialmente com o radical
37
peroxil, levando à formação de um radical menos reativo: o radical
semideidroascorbato, o qual pode ser regenerado a ascorbato através de um sistema
enzimático (Bergendi et al., 1999).
O ascorbato é um importante antioxidante na ausência de metais de transição,
enquanto que na presença destes, possui propriedades pró-oxidantes (Bergendi et al.,
1999).
α-TOCOFEROL
O α-tocoferol (vitamina E) é o mais potente antioxidante e possui a propriedade
de finalizar a propagação de reações dos radicais livres nas membranas lipídicas,
uma vez que forma um radical livre estável (α-tocoferol -O•). Este radical é pouco
reativo e não ataca os ácidos graxos. Tem sido sugerido que o α-tocoferol -O• migra
para a superfície da membrana para ser reoxidado a α-tocoferol pela ação do ácido
deidroascórbico. Outros contribuintes importantes para a reoxidação do radical α-
tocoferol são a GR e o ubiquinol (Marshall e Bangert, 1995; Marks et al., 1996).
β-CAROTENO
O β-caroteno é também considerado um antioxidante, auxiliando desta forma na
remoção de radicais livres. Embora grande parte do β-caroteno seja convertida em
vitamina A nas células da mucosa intestinal, os carotenóides também são absorvidos
38
e podem proteger os lipídios contra a peroxidação, por reagirem com os radicais
alcoxil e peroxil (Marshall e Bangert, 1995; Marks et al., 1996). O β-caroteno é capaz
de inativar moléculas eletronicamente excitadas através do processo de quenching
(quando a substância é capaz de absorver a energia de excitação dos radicais,
neutralizando-os). Assim sendo, os carotenóides podem fazer quenching de oxigênio
singlet (Krinsky, 1989).
1.7 Estresse oxidativo e Doenças neurodegenerativas
O estresse oxidativo pode resultar em adaptação ou injúria celular. Na
adaptação, as células podem tolerar um grau leve de estresse oxidativo, o que,
freqüentemente, resulta na regulação dos sistemas de defesa antioxidante com o
objetivo de restabelecer o equilíbrio oxidante/antioxidante. A injúria celular é definida
como “o resultado de um estímulo químico ou físico” que, em excesso ou deficiente, é
capaz de alterar provisoriamente ou permanentemente a homeostasia da célula. A
resposta à injúria celular pode ser reversível, este processo ocorre quando a célula
entra em um prolongado e temporário “steady-state” que não conduz à morte celular.
Porém, em alguns casos pode resultar em dano irreversível (Halliwell e Gutteridge,
1999).
A célula quando exposta a um grau severo de estresse oxidativo pode sofrer
danos severos levando-a à morte. A ativação excessiva da poli (ADP-ribose)
polimerase (PARP) leva à depleção dos níveis intracelulares de NAD
+
/NADP
+
, de
39
forma que a célula não consegue mais produzir ATP e acaba morrendo. Este efeito
muitas vezes é chamado de “suicide response”, visto que o reparo do DNA não é
eficiente, assim ocorrerá morte celular, para que esta não se torne uma célula
cancerosa. A morte celular resulta principalmente de dois mecanismos: necrose e
apoptose (Halliwell e Gutteridge, 1999).
O estresse oxidativo pode causar dano em diferentes tipos de biomoléculas,
incluindo o DNA, proteínas e lipídios (Halliwell e Gutteridge, 1999).
O estresse oxidativo é um importante processo que vem sendo relatado na
patogênese de algumas condições que afetam o SNC, tais como epilepsia, esclerose
múltipla, demência e doenças de Alzheimer e Parkinson (Halliwell e Gutteridge, 1985;
Reznick e Packer, 1993). Este fato torna-se facilmente compreensível, visto que o
SNC é altamente sensível ao estresse oxidativo, em face ao alto consumo de
oxigênio; ao alto conteúdo lipídico, principalmente de ácidos graxos poliinsaturados,
os quais servem de substrato para a peroxidação lipídica; aos altos níveis de ferro, os
quais favorecem a lipoperoxidação; e à baixa defesa antioxidante (Halliwell, 1996).
De acordo com Marshall e Bangert (1995) muitas doenças neurodegenerativas,
como as doenças de Alzheimer e Parkinson, apresentam níveis elevados de ferro. Na
doença de Parkinson, os elevados níveis de ferro reagem com o H
2
O
2
levando à
geração do OH
•
. O OH
•
pode oxidar lipídios, proteínas e atuar sobre as bases do DNA
(Jenner, 1994). Riobo e colaboradores (2002) propõem um papel direto do NO, e de
seu produto peroxinitrito, na fisiopatologia da doença de Parkinson.
Deve-se ressaltar também que com o avanço da idade a eficiência da cadeia de
transporte de elétrons diminui, o que acarreta um aumento na produção de ROS,
40
como, por exemplo, o H
2
O
2
e o O
2
-
. Estes, por sua vez, podem desencadear a
produção de espécies reativas, como o OH
•
e o peroxinitrito, os quais danificam
proteínas celulares, lipídios e o DNA (Cassarino e Bennett Jr., 1999).
Evidências na literatura mostram que pacientes com fenilcetonúria, um EIM,
apresentam um aumento na formação de radicais livres no sangue (Vilaseca et al.,
1997). Por outro lado, estudos realizados no nosso grupo mostraram que modelos
químicos experimentais de hiperargininemia (Wyse et al., 2001), fenilcetonúria (Hagen
et al, 2002) e homocistinúria (Streck et al., 2003) em ratos aumenta a formação de
radicais livres e diminui a capacidade antioxidante, o que sugere uma indução do
estresse oxidativo.
41
2. OBJETIVOS
Considerando que o atual mecanismo aceito para morte neuronal depende, pelo
menos em parte, da formação de radicais livres, que a prolina ativa receptores NMDA
o que pode levar à formação de radicais livres e que pacientes com hiperprolinemia
tipo II apresentam disfunção neurológica, este trabalho teve como objetivos:
• Avaliar alguns parâmetros de estresse oxidativo (quimiluminescência e TRAP)
em córtex cerebral de ratos submetidos à administração aguda e crônica de prolina;
• Verificar o efeito in vitro de diferentes concentrações de prolina sobre alguns
parâmetros de estresse oxidativo (quimiluminescência e TRAP) em córtex cerebral de
ratos.
• Avaliar as atividades das enzimas antioxidantes (catalase, glutationa
peroxidase e superóxido dismutase) em córtex cerebral de ratos submetidos à
administração aguda e crônica de prolina;
• Verificar o efeito in vitro de diferentes concentrações de prolina sobre as
atividades das enzimas antioxidantes (catalase, glutationa peroxidase e superóxido
dismutase) em córtex cerebral de ratos.
42
3. ARTIGOS
Proline induces oxidative stress in cerebral cortex of rats
Daniela Delwing, Caren S. Bavaresco, Clóvis M.D. Wannmacher, Moacir Wajner,
Carlos S. Dutra-Filho, Angela T.S. Wyse.
International Journal of Developmental Neuroscience, 21: 105-110, 2003.
43
In vivo and in vitro effects of proline on some parameters of
oxidative stress in rat brain
Daniela Delwing, Caren S. Bavaresco, Fábria Chiarani, Clóvis M.D. Wannmacher,
Moacir Wajner, Carlos S. Dutra-Filho, Angela T.S. Wyse.
Brain Research, 991: 180-186, 2003.
44
4. DISCUSSÃO
Hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva do metabolismo da
prolina causada pela deficiência severa na atividade da enzima ∆
1
–pirrolino-5-
carboxilato-desidrogenase, o que resulta no acúmulo tecidual de prolina (Phang et al.,
2001).
Embora não esteja bem definido se a hiperprolinemia tipo II é uma desordem
benigna ou uma doença que afeta o SNC, verifica-se que alguns pacientes com
quadro bioquímico de hiperprolinemia tipo II apresentam os sintomas neurológicos da
doença, como retardo mental e epilepsia, enquanto que outros pacientes são
clinicamente normais (Phang et al., 2001). Os níveis plasmáticos de prolina
encontram-se elevados em ambos os pacientes, o que indica que altos níveis de
prolina não são suficientes para causar dano neurológico. Por outro lado, a literatura
correlaciona os altos níveis de prolina encontrados nos pacientes hiperprolinêmicos
com manifestações neurológicas, sugerindo que elevadas concentrações de prolina
podem predispor a convulsões (Flynn et al., 1989). A alta incidência de convulsões
durante a infância na hiperprolinemia tipo II pode ser explicada pelo fato da prolina
possuir propriedades neuroexcitatórias e neurotóxicas (Flynn et al., 1989).
Dados na literatura mostram que a administração aguda subcutânea ou
intracerebral de prolina em ratos causa alterações na formação da memória e no
aprendizado (Cherkin et al., 1976; Moreira et al., 1989), o que pode refletir os efeitos
neurotóxicos dos altos níveis de prolina no cérebro (Olton e Markowska, 1994). Uma
45
possível explicação para tais alterações seria o fato de que altos níveis deste
aminoácido no SNC interferem na liberação do glutamato do neurônio, o que
secundariamente poderia afetar o processo de memória. Também tem sido
demonstrado que a liberação de glutamato durante a atividade neuronal está
envolvida com os mecanismos de memória (Moreira et al., 1989).
Dados na literatura mostram que altas concentrações de prolina (≥ 100µM) ativa
receptores NMDA (Ault et al., 1987; Henzi et al., 1992; Martin et al., 1992; Pace et al.,
1992), AMPA (Henzi et al., 1992) e glicina-sensível à estricnina (Henzi et al., 1992;
Nistri e Morelli, 1978) em cérebro de ratos. Com base nesta afirmação e sabendo-se
que a prolina tem alta afinidade por transportadores Na
+
/Cl
-
-dependentes, os quais
são encontrados em neurônios glutamatérgicos (Fremeau et al., 1992; Fremeau et
al.,1996; Nadler et al., 1992; Nadler e Cohen, 1995), propõe-se que a prolina atue
como um modulador da neurotransmissão glutamatérgica.
Evidências também sugerem que a prolina pode ser considerada um possível
neurotransmissor ou neuromodulador no SNC porque os terminais nervosos são
capazes de sintetizar, acumular e liberar prolina, a qual possui ação neuronal seletiva
e estereoespecífica (Ault et al., 1987). Níveis aumentados de prolina e de glutamato
no fluído cérebro-espinhal de pacientes hiperprolinêmicos reforçam a possível ação
excitotóxica da prolina quando em altas concentrações no cérebro (Van Harreveld e
Fifkova, 1973; Rhoads et al., 1983; Phang et al., 2001).
Alguns autores mostram que a prolina despolariza neurônios hipocampais em
ratos por ativação de receptores glutamatérgicos, sugerindo que este aminoácido
46
pode prejudicar os neurônios do SNC através de mecanismos excitotóxicos (Nadler et
al., 1988). Outros autores também mostram que a despolarização neuronal
ocasionada pela prolina parece ocorrer, em parte, por ativação de receptores NMDA
(Ault et al., 1987). A ação excitotóxica da prolina também tem sido associada com
sintomas neuropsiquiátricos encontrados em pacientes com hiperprolinemia tipo II
(Nadler et al., 1988).
Resultados obtidos em nosso laboratório têm mostrado que a prolina diminui as
atividades das enzimas Na
+
,K
+
-ATPase, acetilcolinesterase e creatina quinase em
córtex cerebral de ratos (Pontes et al., 1999; Delwing et al., 2003; Kessler et al.,
2003). Por outro lado, também mostramos que a administração de vitaminas E e C
previniram a inibição das atividades das enzimas Na
+
,K
+
-ATPase e acetilcolinesterase
em cérebro de ratos submetidos à administração de prolina (Franzon et al., 2003,
Delwing et al., 2003), o que sugere o envolvimento dos radicais livres nestas
inibições.
O radical livre é definido como um átomo ou molécula que contém um ou mais
elétrons não pareados e que existe independentemente. Os radicais livres são
altamente reativos e podem iniciar as reações em cadeia através da extração de
elétrons de moléculas com o objetivo de se tornarem estáveis (Bergendi et al., 1999;
Bowling e Beal, 1995; Marks et al., 1996).
Na cadeia de transporte de elétrons, o oxigênio é reduzido à água por ação da
enzima citocromo oxidase. Esta reação necessita de quatro elétrons para ser
executada.
O
2
+ 4H
+
+
4e
-
2H
2
O
47
Porém, quando o oxigênio molecular for reduzido por um, dois ou três elétrons,
ocorrerá a formação do radical O
2
-
, do H
2
O
2
e do OH
•
, respectivamente. O OH
•
é
considerado altamente reativo e também pode ser gerado quando o H
2
O
2
entra em
contato com íons cobre e íons ferro (Bergendi et al., 1999).
A ação tóxica das ROS é neutralizada por uma ampla variedade de enzimas
antioxidantes, as quais limitam o dano causado por estas espécies (Marshall e
Bangert, 1995). As principais defesas enzimáticas contra as ROS são a SOD, enzima
responsável pela reação de dismutação do O
2
-
e considerada a primeira defesa contra
o estresse oxidativo e as enzimas CAT e GSH-Px, as quais são responsáveis pela
remoção do H
2
O
2
gerado na remoção do O
2
-
. Deve-se ressaltar que o H
2
O
2
deve ser
rapidamente removido para impedir a formação do OH
•
. Os principais antioxidantes
não enzimáticos são a vitamina E, vitamina C, GSH e possivelmente os carotenóides
– todos capazes de finalizar as reações dos radicais livres (Marks et al., 1996).
O estresse oxidativo ocorre quando as ROS produzidas excedem a capacidade
de remoção realizada pelo mecanismo de defesa celular, o qual inclui as enzimas
antioxidantes e os antioxidantes não enzimáticos (Halliwell e Gutteridge, 1999).
Conforme a literatura, todos os organismos aeróbicos podem sofrer dano
oxidativo, porém, o tecido nervoso é mais suscetível devido ao alto consumo de
oxigênio, à alta concentração de ácidos graxos poliinsaturados, à baixa defesa
antioxidante e aos altos níveis de ferro (Halliwell e Gutteridge, 1999; Halliwell, 1996).
O envolvimento dos radicais livres e do estresse oxidativo na fisiopatologia de
várias situações que comprometem o SNC vem sendo cada vez mais estudado.
Neste contexto, o aumento dos radicais livres tem sido associado a doenças
48
neurodegenerativas, tais como, doença de Alzheimer, doença de Parkinson,
demência, isquemia cerebral e epilepsia (Bondy, 1996; Delanty e Dichter, 1998).
Evidências também sugerem que em muitas doenças neurodegenerativas, como, por
exemplo, na doença de Parkinson, existe um acúmulo de ferro secundário a lesão
inicial, o qual pode estar envolvido na geração de ROS (Marshall e Bangert, 1995).
Os modelos animais de EIM embora incapazes de mimetizar completamente
uma doença humana, dão uma idéia do quadro clínico apresentado durante a sua
instalação e desenvolvimento. A possibilidade de isolar cada etapa das alterações
metabólicas para estudá-las, comparando a um controle, parece ser a principal
vantagem destes modelos.
As aminoacidopatias e as acidemias orgânicas parecem ser os EIM mais
freqüentes. Em nosso laboratório desenvolvemos modelos químicos experimentais
pós-natais para a fenilcetonúria, hiperprolinemia tipo II, metilmalonicacidemia e
propionicacidemia a partir de parâmetros farmacocinéticos de fenilalanina, prolina,
ácidos metilmalônico e propiônico, respectivamente (Wyse et al., 1995; Moreira et al.,
1989; Dutra et al., 1991).
No modelo experimental de hiperprolinemia tipo II, para atingir níveis séricos de
prolina em ratos, similares àqueles encontrados em pacientes hiperprolinêmicos,
foram administradas por via subcutânea, várias doses de prolina, as quais variavam
de acordo com o peso e a idade dos ratos. Os animais controles receberam igual
volume de solução salina 0,9% (1ml/100 g de peso corporal). As soluções foram
administradas duas vezes ao dia, com intervalos de 10 horas. O esquema final para
49
administração crônica de prolina foi calculado de acordo com parâmetros
farmacocinéticos da prolina (Moreira et al., 1989).
Os modelos químicos experimentais pós-natais, desenvolvidos em nosso
laboratório, para fenilcetonúria, hiperprolinemia tipo II, metilmalonicacidemia e
propionicacidemia (Wyse et al., 1995; Moreira et al., 1989; Dutra et al., 1991)
demonstraram que ratos tratados quimicamente com estes aminoácidos ou ácidos
orgânicos apresentaram diminuição na atividade da Na
+
,K
+
-ATPase (Wyse et al.,
1995; Wyse et al., 1998; Wyse et al., 2000, Pontes et al., 1999). Também foi mostrado
que animais submetidos à administração de ácido metilmalônico apresentam déficit
no metabolismo energético cerebral (Dutra et al., 1991) e que a administração crônica
de prolina, ácido metilmalônico e ácido propiônico causaram alterações
comportamentais em ratos (Moreira et al., 1989; Dutra et al., 1991; Brusque et al.,
1999).
Estudos realizados recentemente em nosso laboratório mostraram que a
administração de fenilalanina (Hagen et al., 2002), arginina (Wyse et al., 2001) e
homocisteína (Streck et al; 2003) provocaram a indução do estresse oxidativo em
cérebro de ratos. Outros investigadores também relataram alterações em alguns
parâmetros de estresse oxidativo em pacientes fenilcetonúricos (Vilaseca et al.,
1997).
No presente trabalho, primeiramente avaliamos alguns parâmetros de estresse
oxidativo (quimiluminescência e TRAP) e as atividades das enzimas antioxidantes
(CAT, GSH-Px e SOD) em ratos de 10 dias submetidos à administração aguda de
prolina. Foram também estudados os efeitos in vitro da prolina sobre estes
50
parâmetros. Ressalta-se que as enzimas citadas acima são consideradas as
principais defesas enzimáticas no cérebro e demais tecidos contra a geração de
radicais livres.
Os resultados obtidos mostraram que a administração aguda de prolina
aumentou 78% a quimiluminescência e reduziu 29% o TRAP em homogeneizado de
córtex cerebral de ratos de 10 dias de idade, sugerindo que a prolina induz a
produção de radicais livres e compromete a capacidade antioxidante total do tecido
nervoso. Por outro lado, não observamos alterações significativas nas atividades das
enzimas CAT, GSH-Px e SOD em homogeneizado de córtex cerebral de ratos de 10
dias submetidos à administração aguda de prolina.
Nos experimentos in vitro observamos que a prolina nas concentrações de 0,5 e
1,0 mM aumentou significativamente a quimiluminescência (124% e 205%),
respectivamente e reduziu o TRAP (33% e 61%), respectivamente. A prolina in vitro
(0,5 e 1,0 mM) também reduziu significativamente a atividade da enzima SOD (34% e
27%), respectivamente, permanecendo as demais enzimas inalteradas. Neste caso, a
inibição na atividade da SOD pela prolina em ratos de 10 dias pode ser devido a uma
interação direta do aminoácido com a enzima, resultando desse modo em inibição da
SOD. Ressalta-se também que as alterações obtidas nos parâmetros analisados
foram dose dependente.
Posteriormente, avaliamos os mesmos parâmetros de estresse oxidativo acima
citados em ratos de 29 dias submetidos à administração aguda e crônica de prolina.
Para a realização do estudo crônico, utilizamos o modelo químico experimental de
hiperprolinemia tipo II desenvolvido por Moreira e colaboradores (1989) onde a
51
administração de prolina inicia no 6° dia de vida, período em que o cérebro apresenta
maturação equivalente à de um ser humano recém-nascido e finaliza no 28° dia de
vida, período em que o cérebro apresenta maturação equivalente à de uma criança de
dois a oito anos de vida (Loo et al., 1980). Também foram investigados os efeitos in
vitro da prolina sobre os mesmos parâmetros em ratos de 29 dias. Salienta-se que
estes experimentos visam estender nossos estudos anteriores. Foram utilizados ratos
mais velhos porque as defesas antioxidantes são mais bem expressas, e também
para poder avaliar os efeitos da administração crônica de prolina sobre as defesas
antioxidantes não enzimáticas e enzimáticas em córtex cerebral de ratos.
Nossos resultados mostraram que no tratamento crônico, onde os animais foram
tratados do 6° ao 28° dia de vida com duas injeções diárias de prolina e foram
sacrificados 12 horas após a última injeção, não houve alterações nos parâmetros de
estresse oxidativo testados: quimiluminescência e TRAP. Em contraste, a
administração crônica de prolina aumentou significativamente a atividade da CAT
(44%) e reduziu significativamente a atividade da GSH-Px (33%) em homogeneizado
de córtex cerebral de ratos. Porém, a atividade da SOD não foi alterada. O aumento
na atividade da CAT após administração crônica de prolina pode ser conseqüência de
uma adaptação enzimática, uma vez que a literatura descreve que as enzimas
antioxidantes podem responder ao aumento do estresse oxidativo aumentando suas
atividades, a fim de reduzir o dano (Travacio e Llesuy, 1996). Por outro lado, a
redução na atividade da GSH-Px encontrada neste trabalho não é conhecida, mas
uma possível explicação seria o fato de que a prolina poderia indiretamente diminuir a
síntese ou aumentar a degradação da enzima.
52
Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de prolina em
ratos de 29 dias de idade aumentou significativamente a quimiluminescência (23%) e
reduziu significativamente o TRAP (41%). Em relação às enzimas antioxidantes
testadas, ocorreu redução significativa na atividade da CAT (43%), permanecendo as
atividades das enzimas GSH-Px e SOD inalteradas. A redução da CAT in vivo sinaliza
o efeito indireto da prolina sobre a atividade da enzima.
Uma possível explicação para os diferentes resultados da quimiluminescência e
do TRAP encontrados em nosso trabalho é a presença da prolina, visto que na
administração aguda da prolina os animais são sacrificados uma hora após a injeção
e no tratamento crônico eles são sacrificados 12 horas após a última injeção.
Em relação aos experimentos in vitro realizados em ratos de 29 dias, verificamos
um aumento significativo da quimiluminescência na concentração de 1,0 mM (100%)
e uma redução significativa do TRAP nas concentrações de 0,5 e 1,0 mM (37% e
59%), respectivamente. Quanto às enzimas antioxidantes analisadas, não
observamos alterações nas atividades das mesmas.
Considerando que a quimiluminescência é um método de medida de
peroxidação lipídica, o qual é induzido por formação de radicais livres e que o TRAP
mede a defesa antioxidante total não enzimática tecidual, pode-se sugerir que a
prolina induz a produção de radicais livres e compromete a capacidade antioxidante
total do tecido nervoso. Uma vez que o estresse oxidativo é definido como um
desequilíbrio entre a produção de radicais livres e as defesas antioxidantes, a
alteração de ambos os parâmetros é um importante indicativo de que a prolina induz o
estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos.
53
Considerando que as concentrações de prolina utilizadas em nossos
experimentos são semelhantes às encontradas em pacientes hiperprolinêmicos,
nossos resultados sugerem que a indução do estresse oxidativo em cérebro de ratos
causada pela prolina pode, possivelmente, representar um dos mecanismos pelos
quais ocorre dano cerebral nos pacientes hiperprolinêmicos.
54
5. CONCLUSÕES
1) Os animais submetidos à administração aguda de prolina apresentaram um
aumento significativo na quimiluminescência e uma redução significativa no TRAP em
córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias.
2) Não houve alteração significativa na quimiluminescência e no TRAP em
córtex cerebral de ratos submetidos à administração crônica de prolina .
3) A prolina in vitro, nas concentrações de 0,5 e 1,0 mM, aumentou
significativamente a quimiluminescência e reduziu significativamente o TRAP em
córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias.
4) A administração aguda de prolina em ratos de 10 dias não apresentou
alterações significativas nas atividades das enzimas antioxidantes (superóxido
dismutase, catalase e glutationa peroxidase). Porém, verificamos uma redução
significativa na atividade da catalase em córtex cerebral de ratos de 29 dias.
5) Os animais submetidos à administração crônica de prolina apresentaram um
aumento significativo na atividade da catalase e uma diminuição significativa na
atividade da glutationa peroxidase, permanecendo inalterada a atividade da
superóxido dismutase.
55
6) A prolina in vitro, nas concentrações de 0,5 e 1,0 mM, reduziu
significativamente a atividade da superóxido dismutase em córtex cerebral de ratos de
10 dias. As atividades das enzimas catalase e glutationa peroxidase não foram
alteradas. Porém, em ratos de 29 dias não observamos alterações significativas em
nenhuma das enzimas antioxidantes testadas.
Os resultados obtidos em nosso trabalho indicam que o estresse oxidativo pode
estar envolvido na etiopatogenia da hiperprolinemia tipo II. Acreditamos que o
estresse oxidativo possa contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da
disfunção neurológica observada em pacientes hiperprolinêmicos tipo II.
56
6. PERSPECTIVAS
Nossos resultados abrem a perspectiva de continuarmos nossa investigação
com os seguintes objetivos:
1) verificar o efeito in vivo e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros de
estresse oxidativo (quimiluminescência, TRAP e TBA-RS) em plasma de ratos.
2) verificar o efeito in vivo e in vitro da prolina sobre as atividades das enzimas
antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) em eritrócitos
de ratos.
3) verificar se o tratamento de antioxidantes (vitaminas E e C) previne o efeito da
administração de prolina sobre o estresse oxidativo em córtex cerebral e/ou sangue
de ratos.
57
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923: 50-57, 2001.
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