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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR E APOPTOSE
NAS HEPATOPATIAS CRÔNICAS
CANINAS NÃO NEOPLÁSICAS
LEANDRO BERTONI CAVALCANTI TEIXEIRA
Botucatu - SP
Junho 2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR E APOPTOSE
NAS HEPATOPATIAS CRÔNICAS
CANINAS NÃO NEOPLÁSICAS
Dissertação apresentada junto ao
Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária para obtenção
do título de mestre.
Orientadora: Profa. Ass. Dra. Renée Laufer Amorim
Botucatu-SP
Junho 2007
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Dedico este trabalho
A Deus que me guiou, me acompanhou, me
protegeu e me iluminou para que eu pudesse chegar até aqui.
Aos meus pais José Eduardo e Maria Ileana, por terem me mostrado o valor de
uma vida honesta e sincera, sendo sempre meu espelho, porto seguro e razão
da minha força.
À minha Irmã Raffaella.
Deus me deu o privilégio de ter em minha irmã a minha melhor amiga.
Aos meus avôs, Júlio, Gianfranco e Bianca, cuja saudade me faz sempre
lembrar de onde eu vim e a minha avó Lena que ainda está conosco
representando todos eles.
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à minha orientadora Renée Laufer Amorim pela
acolhida desde os tempos de residente e por me ensinar da maneira mais doce
e alegre possível a ser um patologista.
Ao meu co-orientador Raimundo Alberto Tostes por toda a inspiração
deste trabalho, pela amizade incondicional e por me abrir os olhos às
possibilidades da vida.
A minha irmã pelos anos de convivência em Botucatu, que hoje são
passado, mas que de modo algum serão esquecidos, pois foram a essência
para que eu percebesse a sua importância na minha vida.
Ao Dr. Enio Pedone Bandarra, que junto com a minha orientadora, me
deu a oportunidade de ingressar no mundo da patologia através da minha
residência.
Aos professores do Serviço de Patologia da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia – UNESP, Noeme Sousa Rocha e Julio Lopes
Sequeira, pelos ensinamentos na patologia e na vida.
A minha namorada Tatiana, que fez do nosso pouco tempo de namoro
uma vida inteira juntos.
Aos meus colegas de residência, Camila, Marcela e Arlete, que além e
dividirem comigo o trabalho, também dividiram sonhos, angústias e alegrias.
Aos meus amigos Everton (Coiote), Bruno (Cremilda), Tiago (Bóris),
Gustavo, Bruno Menarim, Luciana Yamaguti, Pedro (Pânico) e José Roberto
(Lango-lango) pelos momentos de alegria e companheirismo.
iv
Aos meus amigos da patologia Marcela Rodrigues, Caio Burini, Giovana
Di Santis, Pedro (Pânico), Rafael Torres Neto, Fábio de Andrade, Maury Raul,
Maria do Carmo Vailati, Rômulo Lot obrigado pela amizade que se estende do
ambiente de trabalho.
Ao amigo Paulo Felipe Izique Goiozo, pelos auxílios matemáticos
deste projeto.
Aos Amigos do Unipinhal Carlos, Paulo, Ricardo, João Francisco,
Fabrício, Wagner, Beto e Ronaldo; trabalhar ao lado de vocês torna as coisas
muito mais fáceis e prazerosas.
Aos sempre presentes Cowboy e Schotch pela alegria incondicional de
todos os dias.
E a todos aqueles que por simples falta de memória minha não
constam desta lista, mas que de alguma forma me ajudaram nesta caminhada.
v
SUMÁRIO
PÁGINAS
RESUMO vii
ABSTRACT viii
1. INTRODUÇÃO 01
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Anatomia e fisiologia hepática 03
2.2. Hepatite crônica canina 05
2.2.1. Contexto histórico das hepatites crônicas em cães 06
2.2.2. Aspectos epidemiológicos das hepatites crônicas caninas
08
2.2.3. Aspectos etiológicos
08
2.2.4. Progressão da doença
13
2.3. Proliferação e apoptose dos hepatócitos 17
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Seleção do material 24
3.2. Imunoistoquímica 25
4. RESULTADOS
4.1. Dados epidemiológicos 29
4.2. Avaliação histológica 29
4.3. Análises imunistoquímicas 37
5. DISCUSSÃO 47
6. CONCLUSÕES 53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 54
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Representação esquemática das unidades morfofuncionais do
fígado: lóbulo e ácino hepático. (Fonte: adaptado de RUBIN & FARBER, 1998).
4
FIGURA 2. Esquematização da contagem de células positivas. Célula
apresentando marcação nuclear fortemente positiva (seta), célula apresentando
marcação nuclear fraca, não contada (cabeça de seta), célula negativa (seta
vasada). Imunoistoquímica, Envision, anticorpo primário PCNA, DAB, contra-
coloração Hematoxilina Obj 40X.
27
FIGURA 3. Percentual de casos de hepatite crônica distribuídos entre os graus
de fibrose
30
FIGURA 4. Percentual de casos de hepatite crônica distribuídos entre os graus
de infiltrado inflamatório.
30
FIGURA 5. FIGURA 5. Cão, Grau 1 de infiltrado inflamatório- Infiltrado
inflamatório mononuclear peri-portal discreto. HE. (Barra 100µm).
32
FIGURA 6. Cão, Grau 2 de infiltrado inflamatório. Infiltrado inflamatório
mononuclear peri-portal moderado, em meio a pontes de fibrose porto-portais.
HE. (Barra 200µm)
32
FIGURA 7. Cão, Grau 3 de infiltrado inflamatório - Infiltrado inflamatório
mononuclear peri-portal e parenquimal marcante, com destruição da placa
limitante e desarranjo das traves e hepatócitos. HE. (Barra 100µm)
33
FIGURA 8. Cão, Grau 4 de infiltrado inflamatório – Infiltrado inflamatório
mononuclear severo acompanhando a fibrose intensa do parênquima ao redor de
um nódulo de regeneração formado. HE. (Barra 100µm)
33
FIGURA 9. Cão, Grau 1 de fibrose– Fibrose discreta confinada aos espaços
porta evidenciada pela expansão fibrosa dos mesmos. Tricrômico de Masson
.
(Barra 100µm)
34
FIGURA 10. Cão, Grau 2 de fibrose – Fibrose moderada com expansão fibrosa
dos espaço porta e início de formações de pontes porto-portais. Tricrômico de
Masson. (Barra 200µm)
34
FIGURA 11. Cão, Grau 3 de fibrose – Perda parcial da arquitetura lobular com
fibrose marcante, formação de septos porto-portais e porto-centrais e
aparecimento de esboços de nódulos. (Barra 200µm)
35
FIGURA 12. Cão, Grau 4 de fibrose –
Cirrose com intensa proliferação de
tecido conjuntivo, proliferação de ductos biliares, congestão e formação de
um nódulo regenerativo. Tricrômico de Masson. (Barra 100µm)
35
FIGURA 13. A. aspecto macroscópico da face visceral de um caso de
cirrose hepática B. Face diafragmática do mesmo caso de A mostrando
em detalhe nodulações do parênquima C. Infiltrado inflamatório
mononuclear peri-portal se disseminando para região lobular. HE. D.
Colestase intra-ductal marcante em um caso de cirrose, acompanhada de
proliferação de ductos bliares. HE. E. Ducto biliar apresentando atipias
reacionais: hipercelularidade, perda da polaridade celular e nucléolos
evidentes. HE. F. Foco de células claras (seta) em um nódulo de
regeneração de um caso de cirrose (Barra 20µm),
36
FIGURA 14. Fígado normal. Imunomarcação positiva em hepatócitos.
Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário PCNA, DAB, contracoloração
hematoxilina.
37
vii
FIGURA 15. Hepatite crônica. Imunomarcação positiva nuclear forte em
hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário PCNA, DAB,
contracoloração hematoxilina
38
FIGURA 16. Carcinoma hepatocelular. Imunomarcação nuclear positiva e forte
em hepatócitos neoplásicos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário
PCNA, DAB, contracoloração hematoxilina
38
FIGURA 17. Hepatite Crônica.
A. Imunomarcação nuclear positiva e em hepatócitos de um nódulo regenerativo
de um caso de cirrose.
39
B. Imunomarcação positiva das células ductais biliares demonstrando a
proliferação de células ductais biliares em áreas de fibrose. Imunoistoquimica,
Envision, anticorpo primário PCNA, DAB, contracoloração hematoxilina.
FIGURA 18. Fígado normal. Imunomarcação positiva nuclear em hepatócitos.
Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário caspase-3, DAB, contracoloração
hematoxilina
39
FIGURA 19. Hepatite crônica. Imunomarcação positiva nuclear forte em
hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário caspase-3, DAB,
contracoloração hematoxilina
40
FIGURA 20. Carcinoma hepatocelular. Imunomarcação positiva nuclear forte em
hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário caspase-3,
40
DAB, contracoloração hematoxilina.
FIGURA 21. Fígado normal imunomarcação negativa Imunoistoquimica,
Envision, anticorpo primário p53, DAB, contracoloração hematoxilina.
41
FIGURA 22. Hepatite crônica. Imunomarcação positiva nuclear em hepatócitos.
Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário p53, DAB, contracoloração
hematoxilina.
42
FIGURA 23. Carcinoma hepatocelular. Imunomarcação positiva nuclear em
hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário p53, DAB,
contracoloração hematoxilina
42
FIGURA 24. Distribuição da marcação por PCNA dos casos de hepatite crônica
44
FIGURA 25. Distribuição da marcação por caspase-3 dos casos de hepatite
crônica
44
FIGURA 26. Distribuição da marcação por p53 dos casos de hepatite crônica
45
FIGURA 27. Percentual de positividade para caspase-3, PCNA e p53 entre os
diferentes grupos.
46
viii
LISTA DE QUADRO E TABELAS
QUADRO 1. Classificação etiológica de hepatites crônicas e cirrose em cães
11
QUADRO 2. Classificação morfológica de hepatites e cirrose em cães
12
TABELA 1. Anticorpos primários utilizados, tipo de marcação, marca, diluições
padronizadas, kit secundário e tempo de DAB.
25
TABELA 2. Distribuição das raças de cães em 38 casos de hepatite crônica
28
TABELA 3. Distribuição dos escores de atividade histológica por critério avaliado
em números absolutos e percentuais.
29
TABELA 4. Graus de fibrose e inflamação e percentagem de células marcados
pelos diferentes anticorpos nos diferentes casos de hepatites crônica.
40
TABELA 5. Percentagem de células marcados pelos diferentes anticorpos nos
diferentes grupos.
42
ix
TEIXEIRA, L.B.C. Avaliação da proliferação celular e apoptose na doença
hepática crônica canina não neoplásica. Botucatu, 2007, 61p., Dissertação
(Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
As hepatites crônicas são comumente encontradas em muitas
raças de cães na prática veterinária e independentemente da causa evoluem
para um quadro de fibrose e conseqüentemente cirrose. Nos homens os
quadros de hepatites crônicas e cirrose podem evoluir para lesões displásicas
e conseqüentemente neoplásicas. Esta evolução do processo, como ocorre
nos homens, não é bem definida nos cães. Alguns autores acreditam que
possa ocorrer uma progressão das hepatites crônicas caninas para carcinomas
hepatocelulares. Marcadores imunoistoquímicos são utilizados com o objetivo
de avaliar o potencial pré-neoplásico das hepatites crônicas caninas. No
presente trabalho, os marcadores imunoistoquímicos PCNA, caspase-3 e p53
foram utilizados com vistas a nos fornecer informações sobre a proliferação e
apoptose dos hepatócitos e possíveis alterações genéticas que induzam a
carcinogênese hepática. Os resultados obtidos mostram que as hepatites
crônicas nos cães expressam estes marcadores em maior quantidade que o
tecido hepático normal e de maneira mais próxima às lesões hepáticas
neoplásicas o que permite afirmar que estas lesões têm potencial de sofrer
alterações neoplásicas.
x
TEIXEIRA, L.B.C. Cell proliferation and apoptosis evaluation in chronic
non-neoplasic canine disease Botucatu, 2007, 61p., Dissertação
(Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
ABSTRACT
Chronic hepatitis is usually found in several breeds of dogs
in veterinary practice, and independently of the cause it progress to a stage of
fibrosis and consequently cirrhosis. In men chronic hepatitis and cirrhosis may
progress to dysplasic and neoplasic lesions. The evolution of this process, as
occurs in men is not well established in dogs. Some authors believe that the
progression of chronic canine hepatitis for hepatocellular carcinomas can occur.
Some immunohistochemical markers can be used to assess the pre-malignant
potential of the canine chronic hepatitis. In this study, the immunohistochemical
markers PCNA, caspase-3 and p53 were used to give information about the
proliferation and apoptosis index of the hepatocytes and the possible genetic
alterations that can lead the hepatic carcinogenesis. Results show that the
expression of these markers are higher in chronic canine hepatitis than in
normal hepatic tissue and closer to the expression in the hepatocellular
carcinomas, which allows us to confirm that these lesions have the potential of
undergoing neoplasic alterations.
xi
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Introdução
1. INTRODUÇÃO
As hepatites crônicas são comumente encontradas em muitas
raças de cães na prática veterinária, sendo vista como uma doença com
inevitável progressão para cirrose e conseqüentemente um prognóstico ruim
(WATSON, 2004). Apesar de ser uma das alterações mais freqüentes na
medicina interna canina, não é apenas uma doença, mas a manifestação
clínica de diferentes etiologias nas quais o fígado se torna cronicamente
lesionado (ROTHUIZEN, 2004).
Os avanços da gastroenterologia e hepatologia veterinária
determinaram um incremento no diagnóstico de doenças hepáticas crônicas na
população canina e progressivamente, a patologia veterinária vem ampliando o
espectro etiológico de doenças hepáticas caninas. Esta ampliação vem
acompanhada da necessidade de melhor entender a progressão desta doença
uma vez que a influência destes agentes etiológicos na instalação e progressão
das doenças hepáticas crônicas ainda é controversa (TOSTES & BANDARRA,
2004).
Independente da causa, as hepatites crônicas evoluem para um
quadro de fibrose e conseqüentemente cirrose (SCHEUER, 2002;
ROTHUIZEN, 2004). Nos homens os quadros de hepatites crônicas e cirrose
podem evoluir para lesões displásicas e conseqüentemente neoplásicas
(IDILMAN et al., 1998).
A carcinogênese hepática depende de vários passos, orientados
por danos genéticos e alterações epigenéticas, que ocorrem por ação de
diferentes agentes etiológicos como inflamação crônica, necrose de
hepatócitos e infecções hepáticas virais contínuas (IDILMAN et al., 1998).
Esta evolução do processo, como ocorre nos homens, não é bem
definida nos cães. A patogênese, principalmente das condições infecciosas, é
intrigante, sendo que a progressão das hepatites crônicas para carcinomas
hepatocelulares tem sido relatada por alguns autores (FUENTEALBA et al.,
1997).
1
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Introdução
Neste contexto biomarcadores prognósticos para evolução da
neoplasia se mostram úteis na identificação de fatores que possam induzir ou
promover a carcinogênese. No presente trabalho, os marcadores
imunoistoquímicos “Antígeno nuclear de proliferação celular” (PCNA), caspase-
3 e p53 foram utilizados com vistas a nos fornecer informações sobre a
proliferação e apoptose dos hepatócitos e possíveis alterações genéticas que
induzam a carcinogênese hepática.
Sendo assim este estudo tem por objetivos:
• Avaliar a expressão de PCNA, caspase-3 e p53 em amostras de fígados
caninos com hepatopatias crônicas.
• Avaliar a expressão de PCNA, caspase-3 e p53 em amostra normal de
fígado canino.
• Avaliar a expressão de PCNA, caspase-3 e p53 em amostra de
carcinoma hepatocelulares canino.
• Avaliar se os graus de proliferação e apoptose hepática e a expressão
de p53 nas hepatopatias crônicas não neoplásicas são indicativas de
quadros pré-neoplásicos.
2
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Anatomia e fisiologia hepática
O fígado é o maior órgão parenquimatoso do organismo dos
animais e tem por funções principais sintetizar macromoléculas a partir de
substâncias de pequeno peso molecular trazidas pelo sangue e metabolizar
substâncias tóxicas trazidas pela artéria hepática e veia porta, realizando a sua
excreção através do sistema biliar (ROTH, 1987).
Todas as funções químicas do fígado são realizadas pelos
hepatócitos e são dependentes de relações complexas entre o sistema
vascular (artéria hepática, ramos da veia porta, sinusóides e veias centro
lobulares), os hepatócitos e o sistema de drenagem da bile (canalículos
bililares e ductos biliares intra-hepáticos) (CRAWFORD, 2005).
Microscopicamente o fígado é composto de hepatócitos
organizados em duas subunidades funcionais: o lóbulo e ácino hepático, sendo
que o que os difere é a estrutura que é considerada o eixo central (ROTH,
1987).
O lóbulo hepático é uma estrutura hexagonal que se orienta ao
redor de uma veia centro lobular e apresenta em suas extremidades espaços
porta. Esta organização permite a divisão anatômica das camadas de
hepatócitos em zonas, sendo a que está mais próxima da veia centro-lobular
chamada de centro-lobular, a que está na periferia, mais próxima dos espaços
porta, chamada de periportal e a zona intermediária chamada de
mediozonal.(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004) (Figura1).
A segunda subunidade funcional é o ácino hepático, que se
distribui ao redor dos ramos terminais da veia porta e artéria hepática e é
definido pelo parênquima que é irrigado por estes vasos, formando assim uma
estrutura triangular. O ácino é divido em 3 zonas, sendo zona 1, onde
encontram-se os hepatócitos anexos ao espaço porta, zona 3, que refere-se
aos hepatócitos ao redor da veia centro-lobular e zona 2, sendo a região
intermediária a estas duas regiões. (ROTH, 1987; JUNQUEIRA & CARNEIRO
2004) (Figura1).
3
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
Veia
Centro-
lobular
Espaço
porta
Figura 1. Representação esquemática das unidades morfofuncionais do fígado: lóbulo
e ácino hepático. (Fonte: adaptado de RUBIN & FARBER, 1998).
O fígado possui uma reserva funcional e uma capacidade
regenerativa consideráveis. Em animais sadios, mais de dois terços do
parênquima hepático pode ser removidos sem que haja prejuízos significativos
da função hepática e a massa hepática pode se regenerar em questão de dias
(CRAWFORD, 2005).
Em todas as espécies, distúrbios da função hepática tendem a
produzir sinais semelhantes, independente da causa, mas tais sinais somente
se manifestam quando a capacidade de reserva e regeneração do fígado são
sobrepujadas. Sendo assim, somente lesões que afetam o fígado difusamente
são capazes de produzir sinais de insuficiência hepática (CRAWFORD, 2005).
4
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
2.2 Hepatite crônica canina
A hepatite crônica pode ser definida como uma doença hepática
de curso crônico e prolongado, com atividade necro-inflamatória e persistência
de alterações laboratoriais por pelo menos quatro meses (THORNBURG,1988).
As hepatites crônicas são comumente encontradas em muitas
raças de cães na prática veterinária, sendo vista como uma doença, em seu
curso natural, com inevitável progressão para cirrose e conseqüentemente um
prognóstico ruim (WATSON, 2004).
Apesar de ser uma das afecções mais freqüentes na medicina
interna canina, não é apenas uma doença, mas a manifestação clínica de
diferentes etiologias por onde o fígado se torna cronicamente lesionado
(ROTHUIZEN, 2004).
Independente da causa, as hepatites crônicas são caracterizadas
pela perda da capacidade de regeneração do fígado em combinação com a
formação de fibrose (ROTHUIZEN, 2004). A fibrose é uma resposta à agressão
hepática, normalmente decorrente de lesões de curso prolongado e
caracterizada pelo aumento da deposição de colágeno e outros componentes
da matriz extra celular no fígado (TOSTES & BANDARRA, 2004). A associação
de fenômenos de agressão hepatocelular, colapso e deposição de colágeno,
destruição da arquitetura lobular e regeneração hepatocelular formam um
conjunto de alterações que favorecem a fibrose difusa do parênquima hepático
que, somada à presença de nódulos de regeneração, define cirrose hepática
(TOSTES & BANDARRA, 2004). A cirrose constitui-se como um quadro
terminal da doença hepática crônica que é acompanhada de marcante
5
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
distorção arquitetural com alterações circulatórias e metabólicas dramáticas
para o fígado (STROMBECK et al., 1998).
2.2.1 Histórico das hepatites crônicas em cães
Os estudos das hepatites crônicas caninas têm como base as
pesquisas das hepatites crônicas em pacientes humanos. Obviamente existe
uma grande disparidade de recursos entre as pesquisas envolvendo cães e
humanos, principalmente no que diz respeito ao acompanhamento dos casos
de hepatite crônica por um longo prazo. Mas é importante valorizar os modelos
experimentais, as classificações em humanos e tentativas de classificações
veterinárias, que juntos servem de suporte para os estudos atuais de
hepatologia canina (TOSTES, 2002).
No homem as hepatites crônicas passaram a ser mais estudadas
a partir da segunda guerra mundial. Nas décadas de 50 e 60 as descobertas de
etiologias virais e auto-imunes das hepatites trouxeram à tona nomenclaturas e
conceitos relacionados à hepatite crônica, que começou a ganhar importância
(BATTS E LUDWING, 1995; LUDWING, 1995).
Nas décadas seguintes, com a descoberta de novas formas virais
de hepatite em humanos e a caracterização de um espectro etiológico mais
amplo graças a novas técnicas diagnóticas, houve um aprimoramento da
classificação das hepatites crônicas e a incorporação de novos critérios de
análise histológica (ISHAK, 1994; BATTS E LUDWIG, 1995). Em medicina
veterinária o termo hepatite crônica ativa apareceu pela primeira vez em 1976
(STROMBECK et al., 1976), e logo se sucederam as publicações de vários
6
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
trabalhos (BISHOP et al., 1979; DOIGE E LESTER, 1981; JOHNSON et al.,
1982; THORNBURG, 1982; CRAWFORD et al., 1985; SARLI, 1992).
As classificações veterinárias seguiram o rumo das classificações
das hepatites no homem, mas sem levar em consideração as inadequações de
algumas nomenclaturas. Sendo assim, HARDY (1985), SEVELIUS et al.
(1994), DILL-MACKY (1995) e FUENTEALBA (1997) compilaram alguns
achados histológicos que fundamentavam as classificações humanas e
classificaram as hepatites crônicas caninas.
Apesar destas classificações, é notória a dificuldade de se
realizar uma unificação da nomenclatura veterinária para as hepatites crônicas
caninas (TOSTES, 2002). Muitos processos crônicos que acometiam o cão
eram pobremente entendidos até a realização de trabalhos experimentais no
final da década de 80 (STROMBECK et al., 1988; TSUKAMOTO et al., 1990;
BOOTH et al., 1992). Além disso, o fato de não se dispor de acompanhamento
dos casos de hepatite crônica desde a primeira abordagem até a instituição do
tratamento, impossibilita a definição de muitas formas de hepatite em cães
(CENTER, 1995a; 1996a). No que se refere ao diagnóstico, a biópsia hepática
é amplamente utilizada nas hepatopatias para a avaliação, classificação,
estadiamento do paciente e delineamento dos seus fatores prognósticos, sendo
considerada o diagnóstico definitivo (ROTH, 1987; JOHNSON e SHERDING,
1998).
As formas crônicas de hepatites em cães têm sido classificadas
principalmente do ponto de vista morfológico (CENTER, 1995 e TOSTES,
2002). Apesar da existência de extensas descrições morfológicas de hepatites
crônicas e de uma grande variedade de classificações propostas, a maioria dos
7
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
casos de hepatites crônicas ainda é referida como idiopática (CHOUINARD et
al., 1998; BOISCLAIR et al. 2001, STERCZER et al., 2001 e VATNE, 2002).
Uma questão que tem sido relevante é se as classificações de hepatite crônica
prescindem ou não da referência à etiologia, pois nas hepatites humanas é
fundamental a indicação ou sugestão da etiologia do processo com vista a
considerar a melhor terapia. (TOSTES & BANDARRA, 2004).
2.2.2 Aspectos epidemiológicos das hepatites crônicas caninas
Do ponto de vista epidemiológico, as hepatites crônicas caninas
ocorrem com maior freqüência em animais com idade entre um e sete anos
(ANDERSSON & SEVELIUS, 1991). Algumas raças de cães são predispostas
a desenvolverem hepatites crônicas, como os Cockers Spaniel americanos,
West Highland White Terriers, Retriviers do Labrador e Doberman Pinschers
(HARDY, 1985; CENTER 1996). Em cães da raça Bedlington Terriers e West
Highland White Terriers o processo está relacionado a uma anomalia congênita
no metabolismo cúprico (THORNBURG et al., 1996).
Não há claras evidências acerca de uma possível predisposição
sexual, exceto no caso dos Doberman Pinschers, nos quais as hepatites
crônicas prevalecem nas fêmeas (SPEETI et al., 1998).
2.2.3 Aspectos etiológicos
Nos humanos, a maioria dos casos de hepatites crônicas têm
uma etiologia definida, sendo que apenas algumas permanecem idiopáticas
(hepatites criptogênicas) (WATSON, 2004). A causa mais comum de hepatite
8
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
crônica nos humanos é a viral, principalmente as hepatites B e C. Em uma
estimativa, 300 milhões de pessoas no mundo estão infectados com o vírus da
hepatite B e 120 milhões com o vírus da hepatite C (WATSON, 2004).
Em contraste, em cães, a causa é geralmente desconhecida, e o
diagnóstico então inespecífico. Ao contrário dos humanos o termo “hepatite
crônica” definida histologicamente tornou-se um diagnóstico (WATSON, 2004).
As formas definidas de hepatite crônica em cães são: hepatite
crônica ativa; hepatite crônica persistente; colangiohepatite crônica; hepatite
crônica lobular e hepatite lobular dissecante (TOSTES, 1998). Destas, a mais
comum em cães é a hepatite crônica ativa (ROTHUIZEN, 1997), que
STROMBECK e GRINBBLE (1978) definiram clinicamente como uma doença
onde um processo inflamatório crônico e agudo coexistem.
O entendimento das causas de hepatites crônicas, com exceção
da doença de armazenamento de cobre nos Bedlington Terriers, mudou muito
pouco nos últimos 30 anos, sendo na maioria dos casos consideradas
“idiopáticas”, e de tratamento inespecífico e sintomático com prognóstico
incerto (WATSON, 2004).
Dentre as principais causas de hepatites crônicas destacam-se o
vírus da hepatite infecciosa canina, leptospirose e o uso crônico de
corticosteróides e anticolvulsivantes (FUENTEALBA et al., 1997).
Doenças imunomediadas, condições inflamatórias do pâncreas e
trato gastrointestinal, doença do armazenamento hepático de cobre nos
Bedlington Terriers e West Highland White Terriers, e doenças associadas ao
cobre dos Sky Terriers também estão associados às hepatites crônicas,
culminando com o estágio final de fibrose hepática (FUENTEALBA et al.,
9
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
1997). Adicionalmente hepatites variando de aguda à crônica têm sido
observadas na Escócia ocasionadas pelo vírus de células acidófilas (JARRET
& O’NEIL, 1985, JARRET et al., 1987), um agente etiológico ainda não isolado
e cuja real importância como causador de hepatite crônica permanece uma
incógnita.
Já foram relatadas hepatites crônicas tóxicas causadas pela
utilização de fármacos anticonvulsivantes como fenobarbital e primidona
(DAYRELL-HART et al., 1991; DILL-MACKY, 1995; THOMAS et al., 1996;),
antiparasitários como associação de dietilcarbamizina e oxibendazol (HARDY
et al., 1989) e a exposição à aflatoxina (LITTLE et al., 1991).
A participação de processos metabólicos como o acúmulo de α-1
antitripsina como causador de hepatite crônica em cães e existência de
hepatites auto-imunes nesta espécie têm sido discutidas (ANDERSSON e
SEVELIUS, 1992; SEVELIUS et al., 1994).
Recentemente tem-se especulado a participação de novos
agentes etiológicos infecciosos como o Helicobacter ssp. e protozoários do
gênero Leishmania infantum no espectro de prováveis causadores de hepatites
crônicas (FOX et al., 1996; RALLIS et al., 2005). O Quadro 1 lista a
classificação etiológica atual das hepatites crônicas caninas e para fins de
comparação o Quadro 2 apresenta a classificação morfológica de hepatites e
cirrose em cães.
10
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
QUADRO 1. Classificação etiológica de hepatites crônicas e cirrose em cães
I Hepatopatia associada ao cobre
a) Primária: Bedlington terrier, West Highland White terrier, outras
b) Secundária
II Hepatite Infecciosa
a) Hepatite infecciosa canina
b) Leptospirose
c) Vírus de células acidófilas
III Hepatopatia induzida por toxinas e drogas
a) Anticonvulsivantes
b) Dietilcarbamazino-oxibendazol
c) Carprofeno (?)
d) Outras
IV Hepatopatia associada a distúrbios metabólicos
a) Deficiência de α-1 antitripsina
b) Defeito no metabolismo de glicoproteínas (?)
V Hepatites idiopáticas
Fonte: CENTER, 1996b; VATNE, 2002.
A progressão da enfermidade aguda para a cronicidade está
condicionada à etiologia do processo (TOSTES & BANDARRA, 2004). Nas
hepatites infecciosas provocadas por Leptospira ou Adenovírus Canino Tipo -1,
a lesão hepatocelular pode evoluir insidiosamente por meses ou anos até
manifestar alguma alteração clínica; quadro que encontra um evidente
paralelismo nas hepatites virais do tipo B e C em pacientes humanos (TOSTES
& BANDARRA, 2004).
A dificuldade de se estabelecer diagnósticos definitivos das
hepatites crônicas caninas fica evidenciada em um recente trabalho realizado
por Boomkens et al., (2005) que utilizaram a técnica de Reação de polimerase
em cadeia (PCR) para identificar possíveis agentes infecciosos (Hepdnavírus,
vírus da Hepatite A, C e E, Adenovírus canino, Parvovírus canino, Helicobacter
ssp, Leptospira ssp e Borrelia ssp) em 98 amostras de fígado de cães com
hepatite. Os autores não conseguiram detectar nenhum destes agentes pela
11
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
técnica de PCR nas amostras de fígado, concluindo que as hepatites nos cães
não são causadas por agentes homólogos aos agentes causadores de
hepatites em outras espécies.
Sem levar-se em consideração o Adenovírus Canino, sabe-se
muito pouco sobre as outras causas infecciosas de hepatites crônicas e
agudas. Porém sabe-se, pelo menos, que alguns poucos casos de hepatites
caninas são causados pelo Adenovírus Canino (ROTHUIZEN, 2004), e a
similaridade entre hepatites em cães e hepatites virais em humanos e outras
espécies em que elas ocorrem (esquilos, ratos, garças, castores e patos) torna
difícil acreditar que os cães são a única exceção à regra de que as hepatites
são mais comumente uma doença viral (IDILMAN et al., 1998; ROTHUIZEN,
2004).
QUADRO 2. Classificação morfológica de hepatites e cirrose em cães
Hepatite aguda
Hepatite reativa inespecífica
Outras hepatites secundárias
Hepatite crônica inespecífica
Hepatite crônica
Hepatite crônica progressiva
Hepatite crônica ativa
Hepatite crônica persistente
Hepatite crônica lobular
Hepatite crônica agressiva
Hepatite lobular dissecante
Cirrose hepática (macro e micronodular)
Colangiohepatite crônica
Colangite
Cirrose biliar
Hepatite granulomatosa
Fibrose portal
Fibrose hepática idiopática
Fonte: VATNE, 2002
12
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
2.2.4 Progressão da doença
É difícil caracterizar a transformação de uma hepatite de fase
aguda para crônica; clinicamente a transição é sutil e a avaliação histológica é
fundamental para determinar o grau de severidade da doença (CENTER,
1996a; CENTER 1996b, SCHEUER, 2002; TOSTES et al., 2002b).
Independente da causa, as hepatites crônicas evoluem para um quadro de
fibrose e consequentemente cirrose (SCHEUER, 2002).
A fibrose é a resposta à agressão hepática, normalmente
decorrente de lesões de curso prolongado e é caracterizada pelo aumento da
deposição de colágeno e outros componentes da matriz extracelular no fígado
(THORNBURG, 1983). A associação de fenômenos de agressão hepatocelular,
colapso e deposição de colágeno, desestruturação da arquitetura lobular e
regeneração hepatocelular formam um conjunto de alterações que favorecem a
fibrose difusa do parênquima hepático, que somada à presença de nódulos de
regeneração, definem a cirrose hepática (GAYOTTO & ALVES, 1995;
TOSTES, 2002).
A cirrose é o quadro terminal da doença hepática, onde ocorre
septação conjuntival cicatricial difusa do parênquima hepático com formação de
nódulos de regeneração hepatocelulares, levando a marcante distorção
arquitetural e alterações circulatórias e metabólicas dramáticas para o órgão
(ANTHONY et al., 1978; JOHNSON, 1985; TWEDT, 1985; SARLI, 1992;;
CRAWFORD, 1999).
13
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
Nos homens os quadros de hepatites crônicas e cirrose podem
evoluir para lesões displásicas e conseqüentemente neoplásicas (IDILMAN et
al., 1998). Esta evolução do processo, como ocorre nos homens, não é bem
definida nos cães, a patogênese, principalmente das condições infecciosas, é
intrigante, sendo que a progressão das hepatites crônicas para carcinomas
hepatocelulares tem sido indicada por alguns autores (FUENTEALBA et al.,
1997).
Uma relação entre uma doença viral e câncer é vista na interação
entre o vírus da hepatite B e carcinomas hepatocelulares nos humanos
(FUENTEALBA et al., 1997;) e na infecção pelo Hepadnavírus e carcinomas
hepatocelulares em castores, esquilos terrestres, patos e garças
(FUENTEALBA et al., 1997; IDILMAN et al., 1998).
Alguns estudos indicam que portadores do vírus da hepatite B
dos humanos têm 200 a 300 vezes mais chance de desenvolver carcinomas
hepatocelulares do que a população em geral (IDILMAN et al., 1998).
Em um estudo retrospectivo de 79 casos de hepatites crônicas
em cães, SEVELIUS (1995), revelou que 2,5% dos cães com hepatites
crônicas tiveram uma evolução do quadro hepático para neoplasias hepáticas.
Nos homens, os carcinomas hepatocelulares ocorrem em quase
todos os casos com um antecedente de cirrose hepática (LOGUERCIO et al.,
2003). Estudos apontam que a cirrose está presente em 90% dos pacientes
humanos com carcinomas hepatocelulares, e estes raramente ocorrem na
presença de hepatites crônicas sem cirrose (IDILMAN et al., 1998;
LOGUERCIO et al., 2003).
14
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
O carcinoma hepatocelular é uma das neoplasias fatais mais
comuns nos homens (TANNAPFEL et al., 1999). Os fatores de risco mais
importantes no desenvolvimento desta neoplasia em humanos estão
associados ao sexo (masculino), uso de hormônios sexuais (andrógenos e
progesteronas), consumo de álcool, exposição à aflatoxina B, desordens
metabólicas do fígado e principalmente a presença de cirrose e infecção
crônica pelos vírus da hepatite B e C (IDILMAN et al., 1998).
Nos cães as neoplasias hepáticas primárias perfazem 0,6 a 1,3%
de todas as neoplasias caninas, e incluem os adenomas e carcinomas
hepatocelulares e adenomas e carcinomas colangiocelulares (RAMOS-VARA
et al., 2001).
Os carcinomas hepatocelulares são as neoplasias hepáticas
primárias mais comuns em cães e perfazem cerca de 50% de todos os
tumores. Os machos são mais afetados e mais de 80% dos tumores ocorrem
em animais com mais de 10 anos (STROMBECK & GUILFORD,1996; LIPTAK
et al., 2004)
A etiologia dessa neoplasia está geralmente ligada a processos
tóxico-ambientais tais como exposição à aflatoxina; mas a utilização ou
exposição à drogas como tetracloreto de carbono, aminas aromáticas,
pesticidas organoclorados, griseofulvina e outros também têm sido indicados
como promotores de neoplasias hepáticas (STROMBECK & GUILFORD,
1996). Uma etiologia viral, assim como acontece com os homens no caso de
hepatite B e C, tem sido demonstrada em castores, mas esses indícios ainda
são fracos em cães (LIPTAK et al., 2004). Cirrose é rara em cães com
carcinomas hepatocelulares (PATNAIK & LIEBERMAN, 1980). Em um estudo,
15
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
20% dos cães com carcinoma hepatocelular apresentavam outros tipos de
tumor, principalmente tumores neuroendócrinos. Ainda não foi estabelecida
nenhuma predisposição sexual ou racial para cães com carcinoma
hepatocelular, apesar de os Schnauzers miniaturas e os machos serem
representados em maior número em alguns estudos (PATNAIK, 1980).
A localização dos tumores é um fator prognóstico para carcinoma
hepatocelular em cães, pois tumores localizados do lado direito e afetando os
lobos lateral direito e lobo caudado apresentaram prognóstico pior,
principalmente pela dificuldade de ressecção cirúrgica (LIPTAK, 2002). Outro
fator prognóstico em cães é tipo morfológico, tendo os difusos e nodulares pior
prognóstico que os massivos (LIPTAK, 2004).
A carcinogênese é um processo que depende de vários passos,
orientados por danos genéticos e alterações epigenéticas, que ocorrem por
ação de diferentes agentes etiológicos como inflamação crônica, necrose de
hepatócitos e infecções hepáticas virais contínuas (IDILMAN et al., 1998).
Neste cenário a carcinogênese hepática tem sido estudada e
alterações em genes específicos sugerem que podem ocorrer caminhos
alternativos. Três mutações genéticas específicas permitem dividir os
carcinomas hepatocelulares humanos em dois grupos, um apresentando
mutação no gene β-catenina e outro apresentando mutações nos genes p53 e
axina-1. As diferentes vias de carcinogênese destes dois grupos estão
correlacionadas à etiologia, uma vez que os do segundo grupo estão
correlacionados à presença do vírus da hepatite B e os do primeiro não
(PITOT, 2001)
16
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
2.2.5 Proliferação e apoptose dos hepatócitos
A atividade regenerativa hepatocelular e apoptose dos
hepatócitos são mecanismos importantes e necessários para a manutenção da
homeostase do fígado (FARINATI et al., 2001; CANCHIS et al., 2004). O fígado
é um órgão que apresenta renovação celular lenta, sendo a vida média dos
hepatócitos estimada em 200 a 400 dias (MAGAMI et al., 2002). Em contraste
exibe uma habilidade única de se regenerar em resposta à ressecção cirúrgica
parcial, toxicidade química e infecções virais (CANCHIS et al., 2004). A maioria
dos hepatócitos se desenvolve na vida pós-natal e a proliferação celular ocorre
em todas as regiões do lóbulo hepático não se limitando a nenhuma zona
específica (MAGAMI et al., 2002).
Para que ocorra a proliferação, as células têm que entrar em um
processo complexo, o ciclo celular. Este controla o crescimento e proliferação
das células, desenvolvimento dos organismos, regulação e reparo dos danos
do DNA, hiperplasia dos tecidos em resposta à injúria e doenças como o
câncer. Envolve inúmeras proteínas regulatórias que controlam a célula através
de seqüências específicas de eventos, que culminam com mitose e produção
de duas células filhas (SCHAFER, 1998).
Sendo assim os hepatócitos devem entrar em uma fase inicial,
um processo reversível que é necessário para a progressão da fase quiescente
G0 para a fase G1 do ciclo celular. Um balanço entre a sinalização através de
citocinas e a expressão de genes reguladores pró-inflamatórios,
transcripcionais e anti-proliferativos durante a fase inicial estimula a progressão
17
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
dos hepatócitos para a fase G1, assim progredindo para a fase S, que é
caracterizada subseqüentemente pela mitose e proliferação do hepatócito
(CANCHIS et al., 2004). Portanto, os processos inflamatórios hepáticos podem
exercer um papel crítico na promoção da proliferação hepática (CANCHIS et
al., 2004).
Como na replicação, a apoptose celular é controlada por uma
rede de mecanismos de sinalização positivos e negativos. As alterações na
morte programada das células estão implicadas na patogênese de doenças
auto-imunes, degenerativas, senis e infecções virais (FARINATI et al., 2001). A
apoptose desempenha um papel significante no curso da morte dos
hepatócitos nas hepatites crônicas e agudas, pois está envolvida na remoção
de hepatócitos lesionados ou infectados (POLAT et al., 2001).
Apoptose excessiva pode resultar em lesões celulares e
disfunção tecidual ou atrofia, enquanto que a supressão da apoptose pode
resultar em hiperplasia tecidual e promover a carcinogênese (PATEL, 2000).
A proliferação celular e a apoptose são processos altamente
regulados que têm por função manter a homeostasia em organismos
multicelulares. A perda da regulação destes processos esta envolvida
diretamente com a carcinogênese hepática bem como em outros órgãos, e
também está implicada no desenvolvimento de um amplo espectro de doenças
como infecções virais, lesões imuno-mediadas, lesões tóxicas, desordens
metabólicas e inflamatórias (PATEL, 2000; FARINATI et al., 2001; CANCHIS et
al, 2004;).
A proliferação celular anormal é uma alteração biológica inicial no
processo de carcinogênese, que pode ser particularmente importante na
18
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
ausência de um aumento concomitante da apoptose (FARINATI et al., 2001). A
desregulação da apoptose pode permitir a sobrevivência de células que
sofreram transformações malignas, e a falha dessas células transformadas em
entrarem em apoptose pode contribuir para a expansão clonal (PATEL, 2000).
Em um estudo recente, a proliferação dos hepatócitos mostrou-se
ser um fator de prognóstico confiável para o desenvolvimento de carcinomas
hepatocelulares em humanos com cirrose associada ao vírus da hepatite C
(CANCHIS et al, 2004).
Neste contexto, a utilização de técnicas de imunoistoquímica com
anticorpos monoclonais tem sido de grande valia para o reconhecimento de
epítopos de antígenos expressos por células em proliferação (MADEWELL,
2001).
O PCNA (antígeno de proliferação celular nuclear) é uma proteína
não histônica de 36-kd auxiliar da DNA polimerase que se expressa em
abundância em células em proliferação. Ele está presente somente na fase G1,
S e G2 do ciclo celular (SARLI et al., 1995; SAFTOUI et al., 2003). A sua
expressão começa no final da fase G1, atinge o seu pico máximo na fase S e
permanece alta na fase G2 e M devido à sua longa meia vida (PEÑA et al.,
1998). Ele faz parte de uma família de proteínas chamada de “família de
deslizamento da fita de DNA”, que tem como função proporcionar a ligação das
polimerases replicantes à fita de DNA, o que é necessário para a duplicação do
genoma (MAGA & HÜBSCHER, 2003).
O PCNA também está relacionado com várias proteínas
envolvidas em diversos processos relacionados com o DNA, tendo participação
na replicação do DNA, no seu reparo, no controle do ciclo celular, no
19
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
metabolismo da cromatina, na expressão gênica e na apoptose (MAGA &
HÜBSCHER, 2003).
Imunomarcação de PCNA pelo clone PC10 tem sido relatada em
vários tecidos animais e humanos, inclusive fígados, fixados em formalina e
processados em parafina (SARLI et al., 1995; ASSY, et al., 1998; PEÑA et al.,
1998; SAFTOUI et al., 2003; SHEN et al., 2003; KOUKOULIS et al., 2005;)
A marcação imunoistoquímica das células por PCNA é uma
técnica muito útil no estudo da atividade proliferativa de tecidos e tumores e se
correlaciona com o prognóstico de vários tumores malignos (SARLI et al., 1995;
SHEN et al., 2003).
Nas infecções pelo vírus da Hepatite B e C nos homens, a
expressão de PCNA tem sido utilizada como um marcador prognóstico de
desenvolvimento de carcinomas hepatocelulares associados à processos
inflamatórios, e com a presença de lesões nodulares hiperplásicas e
displásicas em pacientes cirróticos (KRONENBERGER et al., 2000).
No cão a expressão de PCNA tem sido demonstrada de grande
valia como fator prognóstico em tumores mamários, correlacionando-se com
metástase e sobrevida (PEÑA et al., 1998).
A expressão de PCNA também se correlaciona com outros
métodos de análise de proliferação celular como a expressão de Ki-67, técnica
de Agnor, porcentagem de células em fase S e índice mitótico. (SARLI et al.,
1995; PEÑA et al., 1998; SAFTOUI et al., 2003).
SAFTOUI et al. (2003) demonstraram através da análise da
expressão de PCNA, que existe uma evolução progressiva dos índices
proliferativos de nódulos regenerativos para nódulos displásicos e carcinoma
20
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
hepatocelular nas hepatites crônicas dos homens, e que na cirrose hepática a
proliferação celular é o fator preditor individual mais forte de carcinoma
hepatocelular.
Neste mesmo contexto, as caspases são mediadores cruciais no
processo de apoptose, e entre elas, a caspase-3 se destaca como a caspase
executora final, essencial para as alterações nucleares associadas à apoptose
(PORTER & JÄNICKE, 1999).
Apoptose no fígado tornou-se o foco de muitas pesquisas desde
que ficou aparente que a perda do seu controle está patofisiologicamente
envolvida nas doenças hepáticas (SCHUMANN & GALLE, 2001).
Uma variedade de técnicas podem ser utilizadas para a detecção
de células em apoptose no tecido hepático, entre elas a simples contagem de
corpos apoptóticos pela coloração de Hematoxilina e Eosina, demonstração da
clivagen de DNA pela ténica de TUNEL e a utilização de técnicas
imunoistoquímicas utilizando anticorpos principalmente contra Bcl-2 e caspase-
3 (PATEL, 2000).
Estudos recentes indicam que a ativação das caspases é o
indicador mais específico do mecanismo de morte celular programada e que,
mais ainda, a identificação da caspase-3 como agente efetor final torna a sua
detecção um indicador único e extremamente sensível de apoptose (GOWN &
WILLINGHAM, 2002).
O gene supressor de tumor p53 tem como ação característica a
indução tanto da parada do crescimento celular como da apoptose. Os níveis
de p53 rapidamente aumentam após danos no DNA (ZÖRNIG et al., 2001),
pois este gene tem a capacidade de reconhecer e se ligar a vários tipos de
21
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
danos e assim promover a parada do ciclo celular, e em casos de danos mais
severos ao material genético, induzir a apoptose da celular (SCHAFER, 1998;
ZÖRNIG et al., 2001). Após o dano no DNA, células com p53 mutante não
param o ciclo celular, assim, a habilidade da célula de reparar os erros
cromossômicos antes da mitose é perdida, e quando ocorre a mitose este erro
se fixa no genoma (SCHAFER, 1998).
É amplamente aceito que alterações que afetam o gene p53
estão entre as alterações mais comuns que ocorrerem durante a progressão
maligna em diversos tipos de neoplasias (AKYOL et al., 1999). Mutações no
p53 têm sido identificadas em 50-55% de todas as neoplasias malignas nos
homens (MÜLLAUER, 2001) Estas mutações ocorrem em regiões do p53
essenciais para a ligação com o DNA (MÜLLAUER, 2001) e resultam em
mudanças na conformação da molécula do p53 que se torna mais estável e
passível de ser identificada pelas técnicas de imunoistoquímica (SCHAFER,
1998: AKYOL et al., 1999).
Em geral as mutações do p53 são mais freqüentes em neoplasias
mais agressivas e têm relação com piores prognósticos (MÜLLAUER, 2001).
A expressão de p53 tem sido estudada em hepatites crônicas e
carcinomas hepatocelulares em humanos, e mostrou uma correlação
significativa com a proliferação celular e com a progressão das hepatites
crônicas para o carcinoma hepatocelular (AKYOL et al., 1999; LOGUERCIO, et
al., 2003). Vários trabalhos também têm estudado a significância do gene
supressor de tumor p53 na carcinogênese nos homens e cães (LEE et al.,
2004). Nos cães a expressão de p53 mostrou-se um bom indicador prognóstico
nos casos de neoplasias ósseas (LOUKOPOULOS et al., 2003), mas em
22
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Revisão de Literatura
contraste, nos mastocitomas esta correlação não foi estabelecida (GINN et al.,
2000; JAFFE et al., 2000).
23
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Material e métodos
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção do material
O presente trabalho foi aprovado pela Câmara de Ética em
Experimentação Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
UNESP de Botucatu.
O material foi selecionado de outras pesquisas com fígado canino
realizadas no Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina
Veterinária – UNESP – Botucatu, sendo triados um total de 38 casos com
diagnóstico de hepatite crônica.
Os fígados eram colhidos de cães que vieram a óbito com ou sem
história de afecção hepática, sendo a necropsia realizada no máximo 24 horas
após a morte do animal e o material coletado de regiões do órgão
representativas das lesões.
Os diagnósticos de hepatite crônica basearam-se em critérios
morfológicos com maior relevância ao infiltrado inflamatório mononuclear e
graus de fibrose. Foram utilizados também um caso de carcinoma
hepatocelular e um fígado normal que serviram de referência para a
comparação das médias de positividades dos marcadores imunoistoquímicos
dos achados de hepatites crônica.
Os blocos de parafina foram então separados e, com o objetivo
de avaliar a morfologia e reclassificar as lesões, foram confeccionados em
micrótomo rotativo, novos cortes histológicos com espessura de três µm, que
foram colocados em estufa para desparafinizar e posteriormente corados pela
coloração de Hematoxilina e eosina (HE) e Tricrômico de Masson.
A avaliação das lâminas, em microscópio óptico foi realizada
inicialmente em menor aumento (32X), seguindo-se para os aumentos
subseqüentes (100x, 250x e 400x). O aumento de 32x auxiliou a visualização
global do material, permitindo avaliar o grau de fibrose do material e a
localização do infiltrado inflamatório, e os aumentos de 100x, 250x e 400x
foram utilizados para verificação do tipo celular predominante no infiltrado
inflamatório e das alterações hepatocelulares.
24
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Material e métodos
Todos os casos que se enquadravam no diagnóstico de hepatite
crônica, independentemente da etiologia, foram incluídos no experimento e
classificados quanto ao grau de fibrose tendo como base a utilização de um
escore semi-quantitativo segundo TOTES (2002).
Os casos foram subdivididos quanto à fibrose em 4 grupos de
acordo com a proliferação de tecido conjuntivo: grupo 1 (expansão fibrosa dos
espaços porta); grupo 2 (expansão fibrosa portal com septos); grupo 3
(preservação apenas parcial da arquitetura lobular com septos porta-porta e
porta-centro e esboços de nódulos) e grupo 4 (cirrose ou predomínio de áreas
nodulares em relação á lóbulos remanescentes) e quanto ao grau de infiltrado
inflamatório em outros 4 grupos: grupo 1 (infiltrado discreto); grupo 2 (infiltrado
moderado); grupo 3 (infiltrado marcante) e grupo 4 (infiltrado severo).
3.2 Imunoistoquímica
Para realização da técnica de imunoistoquímica, os blocos de
parafina foram novamente cortados em micrótomo com espessura de três µm e
distendidos em lâminas histológicas previamente preparadas com
Organosilano (Sigma-Aldrich A3648) com o intuito de promover maior
aderência dos cortes às lâminas, evitando a perda do material durante o
procedimento imunoistoquímico. As lâminas foram estocadas em estufa com
temperatura entre 55 e 58ºC por 24 horas, e transferidas para cubas de vidro
vertical.
A técnica de imunoistoquímica seguiu o protocolo do Laboratório
de Imunoistoquímica do Serviço de Patologia da FMVZ – UNESP – Botucatu.
A desparafinização foi realizada com dois banhos em xilol de 30
minutos cada em temperatura ambiente. O processo de desidratação foi
realizado com passagens em álcool 95º, em álcool absoluto (três vezes de três
minutos), álcool 95º e álcool 85º.
Em seguida foi realizada a recuperação antigênica pelo calor,
etapa esta que tem como objetivo a liberação dos epítopos antigênicos do
tecido bloqueados pela solução fixadora (formol 10%).
Procedeu-se então a recuperação antigênica para todos os
anticorpos com a solução de citrato 10mM, pH 6,0, solução esta, pré-aquecida
25
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Material e métodos
em banho-Maria a 96ºC. Após o pré-aquecimento as lâminas foram
introduzidas na solução e mantidas por 25 minutos.
Após o resfriamento do material seguiu-se com dez lavagens em
água destilada.
O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com água
oxigenada 10 volumes, realizando-se dois banhos de 10 minutos cada e em
seguida, lavou-se o material em água destilada e posteriormente em solução
tampão de TRIS HCl pH 7,4 (Trizma base, Sigma, T1503; NaOH P.A Merck,
106404.1000) por 10 minutos em duas trocas de cinco minutos cada.
As lâminas foram retiradas das cubas de vidro e foram
depositadas em câmara úmida para incubação com BSA 1% (Albumina sérica
bovina – Sigma A7906) durante uma hora em temperatura ambiente. Este
procedimento tem a finalidade de reduzir as marcações inespecíficas (“fundo“).
O excesso de BSA 1% foi retirado e procedeu-se a incubação
com os anticorpos primários de acordo com a Tabela 1, em câmara úmida por
18 horas (“over-night”) a 4ºC.
TABELA 1: Anticorpos primários utilizados, tipo de marcação, marca,
diluições padronizadas, kit secundário e tempo de DAB.
Anticorpo
primário
Tipo de
marcação
Clone Marca Diluição
Kit
seundário
Tempo
DAB
p53 nuclear
NCL-
p53-CM1
Novocastra 1:1000 Envision 3’
PCNA nuclear PC10 Novocastra 1:100 Envision 5’
Caspase-3
clivada
nuclear ASP 175
Cell
Signaling
1:200 Envision 5’
26
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Material e métodos
Após este período, as lâminas foram lavadas em TRIS (dois
banhos de cinco minutos) para iniciar a próxima etapa.
Para incubação do anticorpo secundário foi utilizado o Kit
Envision (Dako K4065) durante 40 minutos em temperatura ambiente.
Após incubação as lâminas foram lavadas em solução tampão de
TRIS por cinco minutos.
Para a revelação da reação foi empregada solução pronta para
uso de DAB (Dako K34466), seguindo as recomendações do fabricante por
cinco minutos, em seguida lavou-se o material em TRIS e água destilada,
procedendo-se a contra-coloração com Hematoxilina de Mayer por 1 minuto.
Foi realizada nova lavagem em água corrente por 10 minutos e
passagem em bateria de desidratação com álcoois 85%, 95% e absolutos. As
lâminas foram montadas (Permount – Fischer Scientific –SP 15-500) com
lamínulas e levadas ao microscópio para avaliação da imunomarcação.
Nas baterias de imunoistoquímica foi processada uma lâmina de
controle negativo onde foi suprimido o anticorpo primário na incubação, e
imunoglobulinas de camundongo (Dako, X0903) e coelho (Dako, X0903).
As análises imunoistoquímicas de p53, PCNA e caspase-3 foram
realizadas avaliando o percentual de células marcadas em 300 células, em
aumento de 400x com auxílio do programa de análise de imagens QWin v3,0
Leica e uma câmera digital Leica DFC acoplada a um microscópio Leica
DMLD. Procedeu-se a captura dos campos e as avaliações foram feitas como
descrito a seguir.
Para a avaliação do percentual de positividade foram contados
300 hepatócitos consecutivos, independente da imunomarcação positiva ou
negativa, no aumento de 400x, iniciando-se a contagem a partir do canto
esquerdo inferior até o canto direito superior, completando o campo todo,
sendo assinalados os que apresentavam reação positiva e negativa
separadamente, como pode ser observado na Figura 2. Assim procedeu-se até
a totalização de 300 células.
Foram evitadas áreas com fibrose difusa e necrose com intuito de
evitar a contagem de célula inflamatórias imunomarcadas e focos de ligação
inespecífica da peroxidase endógena o que dificultaria a identificação de
células positivas.
27
Leandro Bertoni cavalcanti Teixeira Material e métodos
Especialmente para a marcação de PCNA só foram contadas as
células com marcação nuclear forte.
FIGURA 2 – Fígado de cão: Esquematização da contagem de células
positivas. Célula apresentando marcação nuclear fortemente positiva (seta),
célula apresentando marcação nuclear fraca, não contada (cabeça de seta),
célula negativa (seta vasada). Imunoistoquímica, Envision, anticorpo primário
PCNA, DAB, contra-coloração Hematoxilina Obj 40X.
28
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
4. RESULTADOS
4.1 Dados epidemiológicos
Os cães inclusos no experimento, totalizando 38 animais,
apresentavam média de idade de 5,6 anos e uma distribuição quanto ao sexo
com predominância de animais do gênero masculino, sendo 18 fêmeas (47,3%)
e 20 machos (52,7%). Houve uma predominância dos animais sem raça
definida totalizando 11 casos. Na tabela 2 estão expressas a distribuição das
raças e o percentual em relação ao número de casos analisados.
TABELA 2. Distribuição das raças de cães em 38 casos de hepatite crônica
Raça Número de animais Percentual
Sem raça definida 11 28,9
Doberman Pincher 5 13,1
Cocker Spaniel Americano 5 13,1
Pastor Alemão 5 13,1
Fila Brasileiro 4 10,6
Boxer 2 5,3
Husky Siberiano 2 5,3
Labrador 2 5,3
Rottweiller 2 5,3
4.2 Avaliação histológica
Das 38 amostras analisadas 21 (55,3%) foram diagnosticadas
como cirrose (grau 4 de fibrose) e 17 (44,7%) receberam o diagnóstico de
hepatite crônica (graus 1, 2 e 3 de fibrose e graus variados de inflamação).
As lesões apresentaram graus de fibrose e inflamação variados
como se evidencia na tabela 3 e figuras 3,4,5 e 6.
29
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
Quanto à inflamação foi observado um predomínio de células
mononucleares, principalmente linfócitos e macrófagos, havendo escassa
presença de plasmócitos nos graus 1 e 2 e significativa nos graus 3 e 4.
(Tabela 3 e figura 4, 5, 6, 7 e 8) .
TABELA 3. Distribuição dos escores de atividade histológica por critério
avaliado em números absolutos e percentuais.
Fibrose Infiltrado inflamatório
Grau
n % n %
1 6 15,8 4 10,5
2 6 15,8 7 18,5
3 8 21 8 21
4 17 47,4 19 50
A atividade inflamatória predominou nos espaços porta, mas
também foi constatada a presença de infiltrado inflamatório mononuclear
lobular (spill-over) (Figuras 7, 8 e 12 C) predominantemente difuso e severo
nos casos classificados como grau 3 e 4.
Os diferentes graus de fibrose estão representados nas figuras 9,
10, 11, 12. Nos cortes que apresentavam graus mais elevados de fibrose (3 e
4) constatou-se proliferação de ductos biliares variando de moderada à intensa,
sendo que alguns ductos apresentaram algum grau de atipia reacional
caracterizada por perda da polaridade celular e presença de nucléolos (Figura
13 E). Graus variados de colestase também foram identificados, principalmente
nos casos mais avançados de fibrose (Figura 13 D)
Na maioria dos casos não puderam ser evidenciados hepatócitos
isomórficos, sendo que as principais alterações encontradas foram desarranjo
trabecular, lesões degenerativas, macro e micro-goticular, focos de necrose e
nos graus mais elevados de fibrose observou-se a formação de nódulos de
regeneração. Em dois casos foram encontrados, no interior dos nódulos de
regeneração, grupos de hepatócitos com citoplasma claro e amplo, típicos de
focos de células claras (Figura 13 F).
30
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 3. Percentual de casos de hepatite crônica distribuídos entre os graus
de fibrose.
FIGURA 4. Percentual de casos de hepatite crônica distribuídos entre os graus
de infiltrado inflamatório.
31
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 5. Fígado de cão: Grau 1 de infiltrado inflamatório- Infiltrado inflamatório
mononuclear peri-portal discreto. HE. (Barra 100µm).
FIGURA 6. Fígado de cão: Grau 2 de infiltrado inflamatório. Infiltrado inflamatório
mononuclear peri-portal moderado, em meio a pontes de fibrose porto-portais. HE.
(Barra 200µm)
32
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 7. Fígado de cão: Grau 3 de infiltrado inflamatório - Infiltrado inflamatório
mononuclear peri-portal e parenquimal marcante, com destruição da placa limitante e
desarranjo das traves e hepatócitos. HE. (Barra 100µm)
FIGURA 8. Fígado de cão: Grau 4 de infiltrado inflamatório – Infiltrado inflamatório
mononuclear severo acompanhando a fibrose intensa do parênquima ao redor de um
nódulo de regeneração formado. HE. (Barra 100µm)
33
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 9. Fígado de cão: Grau 1 de fibrose– Fibrose discreta confinada aos espaços
porta evidenciada pela expansão fibrosa dos mesmos. Tricrômico de Masson
. (Barra
100µm)
FIGURA 10. Fígado de cão: Grau 2 de fibrose – Fibrose moderada com expansão
fibrosa dos espaço porta e início de formações de pontes porto-portais. Tricrômico de
Masson. (Barra 200µm)
34
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 11. Fígado de cão: Grau 3 de fibrose – Perda parcial da arquitetura lobular
com fibrose marcante, formação de septos porto-portais e porto-centrais e
aparecimento de esboços de nódulos. (Barra 200µm)
FIGURA 12. Fígado de cão: Grau 4 de fibrose – Cirrose com intensa proliferação de
tecido conjuntivo, proliferação de ductos biliares, congestão e formação de um nódulo
regenerativo. Tricrômico de Masson. (Barra 100µm)
35
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 13. Fígado de cão: A. aspecto macroscópico da face visceral de um caso de cirrose hepática B.
Face diafragmática do mesmo caso de A mostrando em detalhe nodulações do parênquima C. Infiltrado
inflamatório mononuclear peri-portal se disseminando para região lobular. HE. D. Colestase intra-ductal
marcante em um caso de cirrose, acompanhada de proliferação de ductos bliares. HE. E. Ducto biliar
apresentando atipias reacionais: hipercelularidade, perda da polaridade celular e nucléolos evidentes.
HE. F. Foco de células claras (seta) em um nódulo de regeneração de um caso de cirrose (Barra 20µm),
Fotos A e B cedida pelo Dr. Raimundo Alberto Tostes de casos que fazem parte deste trabalho.
36
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
4.3 Análises imunoistoquímica
A marcação das células em proliferação pelo o anticorpo PCNA
foi nuclear e os percentuais de marcação diferiram entre os grupos conforme
tabela 5. Algumas poucas células apresentavam marcação tanto nuclear como
citoplasmática, mas foram consideradas positivas apenas as que apresentam o
núcleo fortemente marcado como já mencionado no item material e métodos.
No fígado normal a porcentagem de células marcadas
positivamente pelo anticorpo PCNA foi de 14,6% (figura 14), no grupo das
hepatites crônicas foi de 50,51% (figura 15) e no carcinoma hepatocelular foi de
47,3% (figura 16) como se evidencia na tabela 5 e na figura 27. O padrão de
marcação de PCNA não diferiu entre os grupos, sendo que a marcação
citoplasmática só foi observada no carcinoma hepatocelular (Figura 16).
Observou-se também marcação positiva em nódulos de regeneração (Figura
17A) e em algumas células ductais biliares, principalmente em áreas de fibrose
mais avançada (figura 17B).
FIGURA 14 -
Fígado de cão: Fígado normal. Imunomarcação positiva em
hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário PCNA, DAB,
contracoloração hematoxilina (Barra 20 µm).
37
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 15 - Fígado de cão: Hepatite crônica. Imunomarcação positiva nuclear
forte em hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário PCNA,
DAB, contracoloração hematoxilina (Barra 20 µm).
FIGURA 16 -
Fígado de cão: Carcinoma hepatocelular. Imunomarcação nuclear
positiva e forte em hepatócitos neoplásicos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo
primário PCNA, DAB, contracoloração hematoxilina (Barra 20 µm).
38
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 17 - Fígado de cão: Hepatite Crônica.A. Imunomarcação nuclear
positiva e em hepatócitos de um nódulo regenerativo de um caso de cirrose
(Barra 50µm). B. Imunomarcação positiva das células ductais biliares
demonstrando a proliferação de células ductais biliares em áreas de fibrose
(Barra 10µm). Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário PCNA, DAB,
contracoloração hematoxilina.
A marcação para o anticorpo caspase-3 mostrou-se
exclusivamente nuclear (Figuras 18, 19 e 20). Os percentuais de marcação
diferiram pouco entre o fígado normal e as hepatites crônicas, mas quando
comprados ao carcinoma hepatocelualr houve maior diferença (Tabela 5 e
Figura 27). Os percentuais de marcação foram 29,3% para o fígado normal
25,13% para as hepatites crônicas e 0,1 % para o carcinoma hepatocelular.
FIGURA 18 - Fígado de cão: Fígado normal. Imunomarcação positiva nuclear em
hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário caspase-3, DAB,
contracoloração hematoxilina (Barra 10µm).
39
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 19 - Fígado de cão: Hepatite crônica. Imunomarcação positiva nuclear
forte em hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário caspase-
3, DAB, contracoloração hematoxilina (Barra 10µm).
.
FIGURA 20 -
Fígado de cão: Carcinoma hepatocelular. Imunomarcação
positiva nuclear forte em hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo
primário caspase-3, DAB, contracoloração hematoxilina(Barra 10µm).
40
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
Quanto a marcação do anticorpo p53, assim como as outras,
apresentou um padrão nuclear (Figuras 21, 22 e 23). As porcentagens de
marcação diferiram progressivamente entre os grupos sendo que o fígado
normal não apresentou positividade para p53, as hepatites crônicas
apresentaram uma média de percentual de positividade de 15% e o carcinoma
hepatocelular uma média de 19,6%, como observado na tabela 5 e figura 27.
Os graus de fibrose e infiltrado inflamatório e as médias de
marcação dos três anticorpos para cada caso de hepatite crônica estão
expressa na tabela 4.
FIGURA 21 - Fígado de cão: Fígado normal imunomarcação negativa
Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário p53, DAB, contracoloração
hematoxilina (Barra 20µm).
41
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 22 -
Fígado de cão: Hepatite crônica. Imunomarcação positiva
nuclear em hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário p53,
DAB, contracoloração hematoxilina (Barra 10µm).
FIGURA 23 -
Fígado de cão: Carcinoma hepatocelular. Imunomarcação positiva
nuclear em hepatócitos. Imunoistoquimica, Envision, anticorpo primário p53,
DAB, contracoloração hematoxilina(Barra 20µm).
42
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
TABELA 4. Graus de fibrose e inflamação e percentagem de células marcados
pelos diferentes anticorpos nos diferentes casos de hepatites crônica.
Caso
Fibrose
Grau
Inflamação
Grau
p53 % PCNA %
Caspase %
P 202/96 4 4 0 70,6 47
P 212/96 2 3 0 89,3 52
P 225/96 4 4 13,3 37 66,3
P 276/96 3 4 0 67 53,3
P 537/96 1 2 0 62,3 39,3
P 28/97 2 2 13,6 70 37,3
P 30/97 2 3 54,3 66 49,6
P 51/97 2 1 41 51 46,6
P 57/97 4 2 28,3 66 43,6
P 61/97 3 4 39 39 3,6
P 63/97 2 1 0 61,3 47,6
P 153/97 1 2 17,3 83,6 29,6
P 154/97 1 1 44,6 59,6 5
P 184/97 1 2 51,3 11 32,6
P 233/97 1 1 49,3 54 25
N 531/99 3 3 18,3 39,6 42
N 768/99 2 2 35 12,6 2,3
N 135/00 3 3 28 55,3 9
N 333/00 4 3 0 20 10,3
N 63/01 4 4 0 68,6 13,6
N 99/01 4 4 0 75,3 14,3
N 181/01 4 4 0 10 13,3
N 223/01 4 4 0 35 0
N 364/01 3 3 20,6 6,3 19
N 397/01 4 4 0 24 0
N 102/02 4 4 0 54,6 0
N 194/02 3 3 4 73 26,6
N 211/05 4 4 0 45 26,6
P 10 4 4 0 66 0
P 21 3 4 4,3 0
C1 4 4 0 63,3 17
MEL 4 4 0 27,3 14,6
B 60/01 4 4 53,6 75,3 37,6
N 162/02 4 3 0 76,6 19
CASO 32 1 2 0 47,6 26,6
PA 02/02 4 4 33 15,3 0
Labrador 3 4 0 53 45,6
Bud 4 4 21,3 37,6 39,3
43
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
A distribuição das porcentagens de marcação dos anticorpos
PCNA, caspase-3 e p53 variou muito dentro do grupo das hepatites crônicas, o
que fica evidenciado nas figuras 24, 25 e 26.
FIGURA 24. Distribuição da porcentagem de positividade para o anticorpo
PCNA nos casos de hepatite crônica canina (n=38).
FIGURA 25. Distribuição da porcentagem de positividade para o anticorpo
caspase-3 nos casos de hepatite crônica canina (n=38).
44
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 26. Distribuição da porcentagem de positividade para o anticorpo p53
nos casos de hepatite crônica canina (n=38).
TABELA 5. Percentagem de células marcados pelos diferentes anticorpos nos
diferentes grupos.
Anticorpo
Grupo
PCNA Caspase-3 P53
Fígado normal
14,6 29,3 0
Hepatite crônica
50,51 25,13 15
Carcinoma hepatocelular
47,3 0,1 19,6
45
Leandro Bertoni Cavalcanti Teixeira Resultados
FIGURA 27 - Percentual de positividade para caspase-3, PCNA e p53 entre os
diferentes grupos.
Fígado normal
Carcinoma hepatocelular
Hepatite crônica
46
Leandro Bertoni Cavalcanti Texeira Discussão
5. DISCUSSÃO
Neste estudo observou-se que a média de idade dos animais com
hepatite crônica (5,6 anos) está de acordo com outros estudos publicados,
onde as hepatites crônicas acometeram animais adultos de meia idade ou
senis (ANDERSSON E SEVELIUS, 1991; BOISCLAIR et al., 1998).
As raças mais acometidas por quadros hepáticos crônicos neste
trabalho foram os animais sem raça definida (28,9%), seguidos dos Doberman
Pinschers (13,1%), Cocker Spaniel Americanos (13,1%) e Pastrores Alemães
(13,1%). Também estiveram representados os Boxers, Labradores, Husky
Siberianos e Rottweillers.
A literatura refere marcante predisposição à hepatite crônica nas
raças Doberman Pinscher, Cocker Spaniel Americano e Inglês, Retrivier do
Labrador, West Highland Terrier e outros (CENTER, 1995; SEVELIUS, 1995;
ROTHUIZEN, 1997). Estes dados vêm de encontro com os resultados deste
estudo, pois, excetuando os animais sem raças definida, que perfazem a
maioria da população por uma questão sócio-cultural do ambiente em que o
trabalho foi desenvolvido, raças como Coker Spaniel Americano e Doberman
Pinscher estão representadas. Estes dados são corroborados por pesquisas
realizadas utilizando cães com hepatites crônicas em condições ambientais
semelhantes (TOSTES, 2003), em que a ampla maioria era de animais sem
raça definida.
Esta representação significante de cães sem raça definida dilui a
possibilidade de se estabelecer algum perfil de susceptibilidade racial.
A predisposição sexual às hepatites crônicas parece ter uma
relação principalmente com a raça dos animais. Segundo ANDERSSON E
SEVELIUS (1991), machos da raça Cocker Spaniel exibem maior tendência a
desenvolver hepatite crônica, em contrapartida, fêmeas Labradores e
Doberman Pinscher apresentam uma tendência maior que machos. Vários
trabalhos apontam uma tendência a ser mais comum em fêmeas (CRAWFOR
et al., 1985; FUENTEALBA et al., 1997; SPEETI et al., 1998; BOISCLAIR ET
AL., 2001).
47
Leandro Bertoni Cavalcanti Texeira Discussão
A predisposição sexual dos animais deste trabalho está de acordo
com outro trabalho realizado com animais do mesmo perfil. Como no trabalho
realizado por TOSTES (2003), em que a população de animais predominante
foi de machos em relação a fêmeas, este também apresentou tal inclinação.
Isto se deve principalmente à grande representatividade de animais sem raça
definida neste estudo, o que difere este trabalho dos publicados na literatura
internacional aonde a grande maioria dos animais eram de raças puras,
exibindo assim as tendências de predisposição sexual associadas às raças já
descritas anteriormente.
A análise dos graus de inflamação e fibrose dos casos de hepatite
crônica revelou uma heterogeneidade muito grande do material. A maioria dos
casos (55,3%) se enquadrou no grau 4 de fibrose e inflamação, que já constitui
um quadro cirrótico. Observa-se também que a quantidade de casos com
graduação menor (1 e 2), tanto para a fibrose quanto para inflamação foi
pequena. Em relação ao grau de fibrose obtivemos 15,8% para grau 1 e 2. E
quanto ao grau de inflamação, esse foi representado por 10,5% e 18,5%
respectivamente. Este predomínio de casos mais avançados de inflamação e
fibrose observado neste estudo, em que se utilizou fígados de cães sem
história clínica de doença hepática, possivelmente se deve à insidiosidade
destes processos e a dificuldade de se estabelecer um diagnóstico precoce nos
quadros de hepatite crônica, o que leva a intervenções diagnósticas em um
momento muito avançado da doença (CENTER, 1995).
Nas hepatites infecciosas, provocadas por Leptospira sp
(BISHOP et al., 1979; ADAMUS etal., 1997) ou Adenovírus Canino Tipo-1 –
CAV (RAKISH et al., 1986; CHOUINARD et al., 1998), a lesão hepatocelular
pode evoluir insidiosamente por meses ou anos até manifestar alguma
alteração clínica marcante (STROMBECK et al., 1998). Esta evolução
silenciosa e insidiosa encontra forte paralelismo nas hepatites virais do tipo B e
C em humanos (KAGE et al., 1997; FRIEDMAN, 1999; ZAITOUN et al., 2001).
Pela alta incidência de imunomarcação para Adenovírus Canino
Tipo 1 – CAV1, observada por RAKISH et al. (1986) e TOSTES (2003),
inclusive com amostras desse último trabalho fazendo parte deste estudo,
ficamos altamente sugestionados em acreditar que haja um grande percentual
de casos de etiologia viral no material estudado, o que corrobora com os
48
Leandro Bertoni Cavalcanti Texeira Discussão
achados de grau de fibrose e infiltrado inflamatório observados. Não pudemos
fazer uma correlação dos casos de fibrose grau 4 e inflamação grau 4 , com a
imunomarcação para adenovírus canino, pois novos casos foram incluídos
neste estudo.
Nas hepatites virais humanas B e C a persistência de partículas
virais antigênicas reconhecidamente provoca alterações hepatocelulares que
culminam em alterações displásicas e neoplásicas. Sendo assim fica saliente a
necessidade de se realizar a pesquisa de partículas virais neste material.
Como nas hepatites crônicas nos homens, observa-se no cão
uma tendência clara de vários casos em evoluir de processos crônicos
hepáticos mais brandos para alterações mais severas como a cirrose
(SCHEUER, 2002).
Levando-se em consideração este paralelo já estabelecido pode-
se inferir que marcadores imunoistoquímicos de proliferação, apoptose e
expressão de alterações genéticas como p53, que são utilizados amplamente
como fatores prognósticos em hepatites crônicas humanas (KRONENBERGER
et al., 2000; SAFTOUI et al., 2003; GOWN & WILLINGHAM, 2002; AKYOL et
al., 1999 e LOGUERCIO, et al., 2003), também se prestariam a este propósito
no material canino.
As marcações imunoistoquímicas observadas para PCNA,
caspase-3 e p53 se mostraram todas com um padrão nuclear, o que é relatado
por vários outros autores (KRONENBERGER et al., 2000; SAFTOUI et al.,
2003 e LOGUERCIO, et al., 2003).
Na marcação de PCNA, principalmente no carcinoma
hepatocelular, existiram células que apresentaram também marcação
citoplasmática. Isto, segundo SARLI et al. (1995) e SAFTOUI et al. (2003),
ocorre especialmente em células em mitose, onde a carioteca se dissolve
permitindo que as proteínas presentes no núcleo, inclusive o PCNA se
difundam no citoplasma. Para fins de estabelecer as porcentagens de
marcação imunoistoquímicas, só foram levadas em consideração as células
com marcações nucleares.
Especialmente para o PCNA, além das células com marcação
nuclear, só foram contadas as que apresentavam marcação nuclear forte. Este
procedimento, segundo SARLI et al. (1995), tem objetivo de não superestimar a
49
Leandro Bertoni Cavalcanti Texeira Discussão
quantidade de células em proliferação, pois o PCNA é uma proteína que
apresenta meia vida longa e pode estar expressa em pequenas quantidades
em células que já saíram do ciclo celular, levando a uma marcação mais fraca.
Em alguns casos de hepatite crônica mais avançada (graus de
fibrose e inflamação 3 e 4) observou-se marcação positiva das células dos
ductos biliares para PCNA. Este achado evidencia proliferação desse tipo
celular, o que corrobora com a idéia de proliferação ductal biliar em resposta à
compressão do sistema biliar e à conseqüente diminuição do fluxo de bile por
tecido conjuntivo advindo da fibrose hepática (DILL-MACKY, 1995).
Quando comparamos as marcações dos anticorpos entre o grupo
de hepatite crônica, o fígado normal e o carcinoma hepatocelular percebemos
que existiram diferenças relevantes. Quanto à marcação por PCNA,
evidenciamos que o grupo das hepatites crônicas apresentou média porcentual
de células marcadas (50,51%) maior que a do fígado normal (14,6%) e maior,
mas muito similar a porcentagem de proliferação do carcinoma hepatocelular
(47,3%). Isto pode sugerir uma evolução desse processo onde a agressão
sofrida pelo tecido hepático em associação com processos inflamatórios
estimule essa proliferação.
A expressão de caspase-3 se mostrou menor no grupo das
hepatites crônicas (25,13%) do que no fígado normal (29,3%) e foi quase nula
no carcinoma hepatocelular (0,1%). Esse quadro pode demonstrar uma perda
da capacidade de controle do ciclo celular com a evolução do processo, o que
proporcionaria um aumento da quantidade de células de um tecido pela
associação da diminuição da apoptose com aumento da proliferação.
Analisando a expressão imunoistoquímica do gene p53 mutante
observamos que as porcentagens também exibiram uma progressão entre os
grupos, onde o fígado normal não apresentou marcação, as hepatites crônicas
apresentaram uma porcentagem média de 15% e o carcinoma hepatocelular
uma média de 19,6%. A expressão de p53 tem sido estudada em hepatites
crônicas e carcinomas hepatocelulares em humanos e mostrou uma correlação
significativa com a proliferação celular e com a progressão das hepatites
crônicas para o carcinoma hepatocelular (AKYOL et al., 1999; LOGUERCIO, et
al., 2003). Sendo assim, este achado demonstra principalmente que com a
instalação do processo de hepatite crônica ocorrem mutações no gene p53
50
Leandro Bertoni Cavalcanti Texeira Discussão
assim como foi observado no carcinoma hepatocelular, e sendo assim estas
células estão sujeitas a sofrerem danos genéticos que não serão reparados e
também não entrarão em apoptose podendo originar alterações neoplásicas.
Porém como se pode observar nas figuras 16, 17 e 18 há uma
grande variação na média da positividade para os três anticorpos testados.
Essa variabilidade de médias mantém essa mesma característica mesmo
quando agrupamos os casos pelo grau de fibrose ou inflamação.
Acreditamos que a interseção do grau de fibrose com o de
inflamação possa formar subgrupos, talvez com comportamentos mais
semelhantes, porém o número de casos estudados é pequeno para
realizarmos tal abordagem.
Em suma, a soma de um aumento de proliferação hepatocelular
nas hepatites crônicas caninas quando comparadas com o fígado normal, a
diminuição da expressão de caspase-3, que denota uma diminuição da
apoptose celular, e a expressão do gene p53 mutante conferem aos casos de
hepatite crônica canina o substrato para uma potencial ocorrência de
transformações malignas. Ou seja, dentro daquilo observado neste estudo, as
hepatopatias crônicas caninas, mesmo nos graus mais avançados, não devem
ser consideradas uma lesão pré-neoplásica, porém apresentam componentes
suficientes para desenvolverem mutações gênicas, uma vez que há
proliferação com perda da regulação do ciclo celular.
Na comparação entre o grupo de 38 casos de hepatite crônica
canina com um fígado normal como padrão de normalidade, e um carcinoma
hepatocelular como referencial para biomarcadores, parece claro que a história
natural da doença hepática crônica canina envolve alterações que
morfologicamente se assemelham em um ponto final. Contudo, numa análise
pontual da resposta à estes biomarcadores, ficou evidenciado que as
alterações morfológicas não são acompanhadas de alterações moleculares de
um modo uniforme dentro do grupo. Possivelmente, a heterogeneidade da
resposta aos biomarcadores se deve às suas peculiaridades etiológicas, ao
estadiamento da lesão e às idiossincrasias individuais. Rothuizen (2004)
descreve as hepatopatias crônicas não como uma doença, mas sim como a
manifestação clínica de diferentes etiologias, na qual o fígado se torna
cronicamente lesionado, sendo assim não se pode avaliar hepatite crônica
51
Leandro Bertoni Cavalcanti Texeira Discussão
considerando-a uma entidade. Assim, os biomarcadores de prognóstico
utilizados neste trabalho (PCNA, caspase-3 e p53) talvez tenham uma resposta
mais significativa quando vinculados à etiologia do processo.
O estudo das hepatites crônicas caninas ainda envolve muitos
desafios, sobretudo aqueles que dizem respeito à definição da etiologia,
patogenia e elementos de diagnóstico viáveis técnica e economicamente,
dando possibilidade a um tratamento precoce, preciso e com prognósticos
favoráveis. A dificuldade na elucidação da história natural da doença hepática
crônica canina reflete a formidável dinâmica de reparação do fígado canino,
como adaptação à agressão. Surpreende por mostrar pontos de interseção
com as hepatites crônicas em humanos, ao mesmo tempo em que ambas
parecem seguir para resultados finais diferentes, mas aponta para um futuro
promissor com as pesquisas com biomarcadores. Futuro no qual seja possível
entender como, no limiar da agressão hepatocelular, se divorciam os homens e
os cães, seguindo caminhos distintos.
52
Leandro Bertoni Cavalcanri Teixeira Conclusões
6. CONCLUSÕES
• As lesões hepatocelulares avançadas na hepatite crônica e cirrose nos
cães, não se configuram como lesões pré-neoplásicas do ponto de vista
morfológico.
• Os biomarcadores de proliferação celular, apoptose e expressão de p53
apontam marcante potencial para a ocorrência de transformações
malignas no fígado.
• Os animais com hepatite crônica apresentam maior índice proliferativo
do que o fígado normal e similar ao carinoma hepatocelular; índice de
apoptose maior do que o carcinoma hepatocelular e menor do que o
fígado normal e expressão de p53 intermediária entre o fígado normal e
o carcinoma hepatocelular.
53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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