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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
Determinação de ácidos graxos trans e modulação da expressão de receptores ativadores da
proliferação de peroxissomos (PPARs) em tecido adiposo de obesos e não obesos
Josiane Woutheres Bortolotto
Orientadora: Prof
a
Regina Maria Vieira da Costa Guaragna
Co-orientador: Prof Rogério Margis
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Biológicas: Bioquímica.
Porto Alegre
2007
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1
"Se eu pudesse deixar algum presente à você, deixaria aceso o sentimento de amar a vida dos
seres humanos. A consciência de aprender tudo o que foi ensinado pelo tempo a fora. Lembraria
os erros que foram cometidos para que não mais se repetissem. A capacidade de escolher novos
rumos. Deixaria para você, se pudesse, o respeito aquilo que é indispensável. Além do pão, o
trabalho. Além do trabalho, a ação. E, quando tudo mais faltasse, um segredo: o de buscar no
interior de si mesmo a resposta e a força para encontrar a saída."
--Mahatma Gandhi
I
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2
AGRADECIMENTOS
A professora Regina Guaragna, pela orientação, pelo carinho, pela confiança e pelos
ensinamentos.
Ao professor Rogério Margis, pela orientação e pelos ensinamentos de biologia molecular.
A professora Fátima pelas dicas, pelos auxílios e pelo interesse.
Ao professor André Souto por abrir as portas da pesquisa, por todos os ensinamentos, pelos
vários incentivos e pelo exemplo.
Aos colegas de laboratório (21 e 23) pela convivência, cafezinhos, chimas, empréstimos, bate-
papos e auxílio. Agradecimento especial à Ângela, iniciação cinetífica e amiga, que sempre
incansável me auxiliava nas coletas e extrações. A Claúdia por estar sempre disposta a ajudar,
auxiliar e ensinar tudo que sabe. A Silvia pelos cafezinhos, bate papo e ajuda na bibliografia.
Obrigada pela amizade.
A dona Lia, cujo trabalho é essencial para que o nosso ande bem. Obrigada por todas as
autoclavagens e pelo constante bom humor.
A todos os amigos que fiz neste PPG, em especial a Carol (27) e a Vanessa (22), companheiras
de disciplinas, amigas para desabafos. Obrigada por tudo.
Aos meus pais pelo suporte emocional e financeiro, por todas as coletas de tecidos que
realizaram, pelo interesse, pelo incentivo e pelo amor.
Ao Dr. Pedro Furian que sempre lembrava de guardar tecido adiposo dos magrinhos.
Ao Dr. Mottin e sua equipe pelos tecidos dos obesos mórbidos.
A minha irmã por suportar meu humor quando os experimentos não davam certos, pelo interesse
desprendido mesmo sem entender bem o que eram AG trans e PPARs, pelas caronas e pelo
amor.
Ao Pablo, por ouvir meus desabafos, pelo suporte emocional, pelos diversos empréstimos do seu
notebook e acessória de informática, pelos incentivos e acima de tudo por suportar minhas
ausências.
As Cruzgirls pelo carinho, pelo companheirismo, pelo interesse e por sempre entenderem minhas
ausências nas nossas junções.
II
3
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação está apresentada no formato de artigos científicos e organizada da
seguinte forma:
PARTE I
Introdução, contendo uma revisão da literatura sobre os aspectos que fundamentam este
trabalho.
Objetivos gerais e específicos do trabalho.
PARTE II
Capítulo 1, contendo artigo científico publicado em periódico internacional
Capítulo 2, contendo manuscrito com aceite para publicação em periódico internacional.
PARTE III
Discussão, contendo interpretação geral dos resultados apresentados nos dois capítulos.
Conclusões finais.
Perspectivas originadas a partir deste trabalho
REFERÊNCIAS
Referências bibliográficas citadas nas Partes I e III
ANEXOS
Anexo 1, contendo lista de figuras.
Anexo 2, contendo lista de tabelas.
Anexo 3, contendo Termos de Consentimento informado apresentado aos pacientes.
III
4
SUMÁRIO
PARTE I...................................................................................................................................05
RESUMO .................................................................................................................................06
ABSTRACT .............................................................................................................................07
LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................................08
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................09
1.1 Obesidade ...........................................................................................................................09
1.1.1 Obesidade Mórbida ..........................................................................................................10
1.2 Tecido adiposo ...................................................................................................................12
1.3 Ácidos graxos trans ............................................................................................................16
1.4 PPAR..................................................................................................................................21
1.4.1 PPARα ............................................................................................................................22
1.4.2 PPARβ/δ ..........................................................................................................................23
1.4.3 PPARγ ............................................................................................................................24
2 OBJETIVOS..........................................................................................................................26
2.1 Objetivos específicos ..........................................................................................................26
PARTE II..................................................................................................................................28
CAPÍTULO I............................................................................................................................29
CAPÍTULO II...........................................................................................................................36
PARTE III ................................................................................................................................55
3 DISCUSSÃO.........................................................................................................................56
4 CONCLUSÕES .....................................................................................................................68
5 PERSPECTIVAS...................................................................................................................70
REFERÊNCIAS .......................................................................................................................71
ANEXOS..................................................................................................................................89
IV
5
PARTE I
6
RESUMO
A obesidade é uma síndrome metabólica complexa de etiologia multifatorial, que afeta um
número progressivo de indivíduos. Estudos epidemiológicos confirmam que a síndrome
metabólica está relacionada com obesidade abdominal, resistência à insulina, diabetes e outros
fatores de risco metabólicos para doenças cardíacas. O tipo de alimentação, em especial os
ácidos graxos (AG) consumidos, podem estar relacionados com os distúrbios da obesidade. Os
ácidos graxos trans (AG trans) são obtidos pela dieta, em produtos contendo gorduras
hidrogenadas e derivados dos animais ruminantes. Estes AG são bem absorvidos pelo
organismo, e a composição destes no tecido adiposo (TA) reflete o consumo a longo prazo. Na
obesidade, o metabolismo do TA é alterado e o restabelecimento da homeostase energética
requer a identificação e regulação de genes envolvidos no metabolismo de lipídeos e
carboidratos. Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) estão
envolvidos na modulação do metabolismo e são ativados por AG. Os objetivos deste trabalho
foram determinar o conteúdo total de AG trans no TA subcutâneo (TAS), retroperitoneal (TAR)
e visceral (TAV) de obesos e não obesos submetidos à cirurgia bariátrica ou cirurgia abdominal;
analisar o padrão de expressão do PPARβ/δ e PPARγ1-3 nos diferentes depósitos destes TA; e
comparar a expressão destes receptores em obesos e não obesos. Os TA foram obtidos por
cirurgia. Para quantificar os AG trans, os lipídeos foram extraídos, saponificados e esterificados.
Os níveis de AG trans foram medidos por FTIR-ATR. Para quantificar o mRNA, o RNA total
foi extraído com TRIzol, foi reverso transcrito e determinado quantitativamente pela reação em
cadeia da polimerase (qRT-PR). A média de AG trans em pacientes obesos foi de 6.3% no TAR
e 8.7% no TAV. Nos pacientes não obesos, os resultados foram 6.9% no TAS e 9.3% no TAV.
Não houve diferença estatística entre os grupos. No entanto, o depósito de AG trans no TAV foi
maior nos pacientes obesos mórbidos (P<0.001) e nos não obesos (P<0.05). Por outro lado, a
quantidade de mRNA do PPARβ/δ nos diferentes depósitos de TA de obesos mórbidos mostrou
uma diminuição significativa no TAV (p<0.05). No grupo de não obesos, os níveis de PPARβ/δ
foram mais altos no TAS (p<0.05). Os níveis de PPARγ1-3 não diferiram estatisticamente entre
os depósitos de TA tanto de obesos quanto não obesos. Quando obesos e não obesos foram
comparados, os resultados revelaram uma diminuída expressão de PPARβ/δ no TAS (p=0.058) e
TAV (p=0.094) de obesos mórbidos. A expressão de PPARγ1-3 foi significantemente aumentada
no TAS (p=0.022) e diminuída no TAR (p=0.034) nos obesos mórbidos. A expressão de
PPARβ/δ no TAS e TAV correlacionou negativamente com a medida do quadril e com os níveis
de insulina, respectivamente. Os níveis de mRNA PPARγ1-3 no TAR correlacionaram
negativamente com a medida da cintura e do quadril e no TAV correlacionou positivamente com
a medida da cintura. Os valores encontrados de AG trans em todos os TA analisados são maiores
do que os reportados em outros países. Nós encontramos maior depósito destes AG no TAV do
que nos outros estoques. Os níveis elevados no TAV preocupam devido à alta taxa de lipólise
deste tecido e sua forte associação com alterações metabólicas. Os altos níveis de AG trans
encontrados refletem, ainda, o alto consumo destes na dieta dos brasileiros. Os resultados da
expressão de PPARs demonstram que PPARβ/δ e PPARγ1-3 são quantitativamente diferentes
nos depósitos de TA de obesos mórbidos comparados a não obesos e que o padrão de expressão
do PPARβ/δ é característico de cada depósito de TA. Os dados de correlação reforçam a relação
destes receptores com a obesidade.
7
ABSTRACT
Obesity is a complex metabolic syndrome of multifactorial etiology affecting a progressively
increasing number of individuals globally. Epidemiological studies have confirmed that this
metabolic syndrome is related to abdominal obesity and insulin resistance, diabetes and other
metabolic risk factors for coronary heart disease. The dietary intake, in special intake of specific
fatty acids, could be related with the disturbance of obesity. Trans fatty acids (TFAs) are present in
solid fats produced by partial hydrogenation of oils, and are naturally found in products originating from
ruminants. They are well-absorbed by the body, and long-term intake is reflected in the fatty acid
composition of adipose tissue (AT). In obesity, the AT metabolism is altered in obese subjects and
the reestablishment of energy homeostasis requires the identification and regulation of genes
with altered in lipid and glucose metabolism. The peroxisome proliferator-activated receptors
(PPARs), are involved in metabolism modulation and presented FA like ligand. The purpose of
this study was to determine the total content of TFAs in subcutaneous (SAT), retroperitoneal
(RAT) and visceral (VAT) adipose tissue of morbidly obese and non-obese patients submitted to
bariatric surgery or abdominal surgery; analysed the expression pattern of PPARβ/δ and
PPARγ1-3 in different depots of AT; and, compare mRNA expression of these receptors in
morbidly obese and non-obese patients. The Ats were obtained surgery. To quantify the TFAs,
lipids were extracted, saponified and esterified. TFA were measured by FTIR-ATR
spectroscopy. To measure the mRNA, total RNAs were extracted using TRIzol, and PPARs
reverse transcripts were determined by quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). The
TFA average in obese patients was 6.3% for RAT and 8.7% for VAT. For non-obese patients,
the figures were 6.9% SAT and 9.3% VAT. There was no difference between the groups.
However, the TFA depot in VAT was higher than other fatty tissues for morbidly obese
(P<0.001) and non-obese (P<0.05) patients. The amounts of PPARβ/δ mRNA in different depots
of morbidly obese AT showed a significant decrease in VAT (p<0.05). In the non-obese group,
the level of PPARβ/δ was higher in SAT (p<0.05). The levels of PPARγ1-3 was not
differentially expressed in obese and non-obese depots. When comparing obese and non-obese,
the results revealed a decrease in PPARβ/δ expression in SAT (p=0.058) and VAT (p=0.094) of
the morbidly obese. PPARγ1-3 mRNA expression was increased significantly in SAT (p=0.022)
and decreased in RAT (p=0.034) in morbidly obese subjects. PPARβ/δ expression in SAT and
VAT correlated negatively with hip size and insulin serum respectively. PPARγ1-3 expression
in RAT correlated negatively with waist and hip size and in VAT correlated positively with waist
size. Our values for TFA content in all adipose tissues analyzed are higher than reported in other
countries. We showed more TFA in VAT than in other abdominal fat. The VAT level is
worrisome because the higher rate of lipolysis in this tissue appears to be an important indicator
of metabolic alterations. The levels of TFA found in AT presumably reflect the higher dietary
intake of TFA by Brazilians. In PPARS expression the results demonstrates that PPARβ/δ and
PPARγ1-3 mRNAs are quantitatively different in AT of morbidly obese individuals compared to
non-obese and that PPARβ/δ mRNA levels are characteristic for each AT depot. Correlation
data stregthen the relationship with this receptors and obesity.
8
LISTA DE ABREVIATURAS
AG, ácidos graxos
AG trans, ácidos graxos trans
DM2, diabetes mellitus tipo II
FDA, Food and Drug Administrtion
FTIR-ATR, Fourier Transform Infrared - Attenuated Total Reflectance
PPARs, receptores ativadores da proliferação de peroxissomos
qRT-PCR, Real-Time Quantitative PCR
SBCB, Sociedade Brasileira de Cirurgia Bariátrica
TA, tecido adiposo
TAS, tecido adiposo subcutâneo
TAR, tecido adiposo retroperitoneal
TAV, tecido adiposo visceral
TZD, tiazolidinediona
9
1 INTRODUÇÃO
1.1 Obesidade
A obesidade é definida como um estado de aumento de peso corporal, mais
especificamente, tecido adiposo (TA) (Kuczmarski et al, 1994). É uma doença crônica, de difícil
tratamento, cuja prevalência vem aumentando em proporções epidêmicas nas últimas décadas
(Deitel, 2005; Manson et al, 2004). No Brasil, Monteiro e colaboradores (1998) realizaram um
estudo comparando três avaliações transversais de base populacional nos anos de 1975, 1989 e
1996. Estes autores descreveram um aumento na velocidade de crescimento da obesidade no
nosso país. Dados recentes do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), em 2003,
revelaram que o excesso de peso afetava 41,1% dos homens e 40% das mulheres, sendo que a
obesidade afetava 8,9% dos homens e 13,1% das mulheres adultas do país. Sendo assim, os
obesos representavam 20% do total de homens e um terço das mulheres com excesso de peso.
Atualmente, estima-se que existam no mundo cerca de 300 milhões de obesos, e esse número
tende a dobrar até 2025, se medidas eficazes não forem tomadas (Formiguera & Canton, 2004).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) descreve a obesidade como um problema de
saúde pública, de proporções alarmantes, que está no mesmo patamar que a hipertensão e a
aterosclerose (WHO, 2000). Estudos recentes caracterizam a obesidade como uma desordem
multifatorial, pois seu início e progressão têm sido atribuídos a: 1-fatores genéticos ainda não
bem conhecidos; 2-fatores ambientais como o aumento da ingestão de alimentos e dieta rica em
gordura; 3-fatores de conduta como o sedentarismo, doenças subjacentes e 4-situação
socioeconômica (Hausman et al, 2001).
10
Estudos mostram que a etiologia da obesidade está ligada a um desequilíbrio entre
energia consumida e energia gasta (Grundy, 2000; Lean, 2000; Bray 2004). O excesso de
energia, proveniente deste desequilíbrio, é estocado nas células adiposas que aumentam no
tamanho (hipertrofia) e/ou aumentam no número (hiperplasia). Os adipócitos hipertróficos que
acomodam a massa extra de gordura aumentam a secreção de AG livres e numerosos peptídeos.
Como conseqüência desses dois mecanismos, têm-se alterações no perfil lipídico, no
metabolismo da glicose, nos níveis da pressão arterial e, em alguns casos, na função renal e nas
doenças cardiovasculares. O conjunto dessas alterações é hoje conhecido como síndrome
metabólica (Kopelman, 2000; Bray, 2004), também denominada síndrome X ou síndrome de
resistência à insulina (DeFronzo & Ferrannini, 1991; Reaven, 1993; Einhorn 2003).
Em 1998, a OMS propôs critérios para o diagnóstico clínico da síndrome metabólica
baseado na resistência à insulina (Alberti & Zimmet, 1998). Em 2001, o “Third Report of the
National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment
of High Blood cholesterol in Adults (Adults Treatment Panel III [NCEP/ATPIII])” simplificou
os critérios da OMS requerendo três dos cinco parâmetros clínicos citados a seguir para
diagnóstico da síndrome: aumento da circunferência da cintura (102 cm para homens e 88 cm
para mulheres), triglicerídeos elevados (≥150 mg/dl), reduzido HDL (<40mg/dl em homens e
<50 mg/dl em mulheres), elevada pressão sanguínea (130/85 mmHg), elevada glicose (≥ 100
mg/dl). Atualmente a Associação Cardíaca Americana (Grundy et al, 2005) assim como a
Federação Internacional de Diabetes (Alberti et al, 2005) utilizam estes critérios para diagnóstico
da Síndrome Metabólica.
1.1.1 Obesidade Mórbida
A obesidade mórbida ou severa é uma desordem crônica, multifatorial e congênita, com
excessiva deposição de gordura e associada a problemas médicos, fisiológicos, físicos e sociais
(Martin et al, 1995). O termo obesidade severa ou mórbida se aplica aos pacientes que estejam
11
100% ou mais acima do peso ideal, ou pelo menos, 45,5 Kg acima do seu peso ideal, ou tenham
um IMC maior ou igual a 40 Kg/m
2
(Clivingston, 2005; Pavelka et al, 2004).
As formas extremas da obesidade dificilmente respondem às terapias convencionais
como dieta e medicamentos (Martin et al, 1995). A quase totalidade dos pacientes recupera o
peso perdido em um período de cinco anos, ocasionando uma flutuação do peso corpóreo, com
aumento da mortalidade por complicações cardiovasculares. O mais eficaz tratamento em longo
prazo tem sido a cirurgia bariátrica. Nos EUA, o número de cirurgias bariátricas tem aumentado
drasticamente: de 16.000 no início da década de 1990 para cerca de 103.000 em 2003
(Steinbrook, 2004). No Brasil, não seria diferente, dados da Sociedade Brasileira de Cirurgia
Bariátrica (SBCB) mostram um aumento destas cirurgias no nosso país (25.000 cirurgias/ano).
Doenças de ordem psicológica, como depressão, são comuns em obesos mórbidos. Além
disso, o extremo excesso de peso causa agravo na qualidade de vida (Duval et al, 2006).
Indivíduos com IMC ≥ 40 Kg/m2, em comparação àqueles com peso normal, têm risco de morte
pelo menos duas vezes maior (Bender et al, 2006; Folsom et al, 1993). Tal achado se justifica
pela elevada prevalência de diversas condições graves em obesos mórbidos, tais como
hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), hiperlipidemia, problemas
cardíacos (doença coronariana, fibrilação atrial, insuficiência cardíaca, morte súbita, etc.), apnéia
do sono, hipertensão pulmonar, osteoartrite degenerativa, cirrose e esteatose não alcoólica,
infecções de pele, incontinência urinária, refluxo gastroesofágico, desequilíbrio dos hormônios
sexuais, acompanhados por dismenorréia, hisurtismo e infertilidade. Nesses pacientes, há ainda o
aumento da incidência de certos tipos de câncer como mama, fígado, cólon, colo uterino,
próstata, entre outros (Proietto & Bauer, 2004; Rosen et al, 2004; Wang et al, 2004).
É provável que muitas das co-morbidades da obesidade severa estejam relacionadas ao
aumento da pressão intra-abdominal secundário à distribuição da gordura central (Surgeman et al
1997). Schein e colaboradores (1995) demonstraram que a elevação da pressão intra-abdominal
na obesidade está fortemente relacionada com o aumento da pressão venosa central, a
12
diminuição da pressão dos capilares pulmonares, a resistência vascular sistêmica, a fraca pressão
de ar, a pressão intrapleural e da veia renal, diminuído retorno venoso, entre outros (Schein et al,
1995). Além disso, com o aumento progressivo da obesidade, ocorre acúmulo de lipídeos em
outros órgãos, além do TA. A deposição de gordura no fígado, no músculo esquelético, nas
células β pancreáticas e no tecido cardíaco pode levar à resistência à insulina, piora da secreção
deste hormônio culminando em DM2 e possivelmente agravo da função cardíaca em obesos
mórbidos (Molavi et al, 2006).
1.2 Tecido adiposo
A visão tradicional do TA como uma reserva passiva de energia não é mais válida. Já em
1987, o TA foi identificado como o maior sítio para o metabolismo dos hormônios esteróides
sexuais (Siiteri, 1987) e como produtor de adipsina, um fator endócrino que é regulado
negativamente em roedores obesos (Flier et al, 1987). A subseqüente identificação e
caracterização da leptina, responsável pela regulação do apetite e gasto energético, em 1994,
estabeleceu firmemente o TA como órgão endócrino (Zhang et al, 1994). O TA é atualmente
conhecido por expressar e secretar uma variedade de peptídeos bioativos conhecidos como
adipocitocinas (Kershaw & Flier, 2004). Entre eles estão: angiotensinogênio, proteína que
estimula acilação, adiponectina, proteína ligadora de retinol, fator de necrose tumoral α (TNF-α),
interleucina 6 (IL-6), inibidor da ativação de plasminogênio 1 (PAI-1), resistina, fator tecidual
(Trayhurn & Beattie, 2001). Algumas dessas proteínas são citocinas inflamatórias, algumas,
ainda, exercem papel no metabolismo de lipídeos, enquanto outras estão envolvidas na
homeostase vascular ou sistema do complemento. Em 2005, Fukuhara e colaboradores clonaram
do tecido adiposo a visfatina, um fator de crescimento que mimetiza a ação da insulina e também
mostraram que tanto em camundongos quanto em humanos os níveis de visfatina aumentam em
paralelo com a expansão do TA (Fukuhara et al, 2005).
13
A importante função endócrina do TA é enfatizada pelas conseqüências metabólicas
adversas causadas pelo excesso e distribuição deste tecido no corpo (Grundy et al, 2004; Nielsen
et al, 2004). Originalmente, Vague em 1947 formulou o conceito da contribuição regional do
tecido adiposo com complicações metabólicas. Ele descreveu dois padrões de distribuição de
gordura baseado no tipo corporal, isto é, andróide, ou padrão masculino e ginecóide, ou padrão
feminino (Vague, 1947). Subseqüentemente Vague, em 1956, analisando pacientes obesos,
associou o risco de complicações metabólicas com diferentes padrões de distribuição de gordura
corporal. Em comparação com a obesidade ginecóide, a obesidade andróide foi mais
freqüentemente associada com o DM2, doenças coronarianas, pedra nos rins, gota e
hiperlipidemia (Vague, 1956). Atualmente o padrão andróide vem sendo referenciado como
distribuição de gordura superior, obesidade central ou abdominal, e o padrão ginecóide vem
sendo descrito como distribuição de gordura inferior, glúteo-femoral ou obesidade periférica.
Estudos prospectivos realizados posteriormente aos estudos de Vague confirmaram seus achados
relacionando fortemente o excesso de gordura abdominal com as desordens metabólicas da
obesidade central (Larsson et al, 1984; Björntorp, 1989; Kissebah & Krakower, 1994).
A gordura abdominal é composta de distintos depósitos anatômicos: tecido adiposo
subcutâneo (TAS) que pode ser dividido em anterior e posterior ou camada superficial e
profunda; tecido adiposo intra-abdominal que pode ser subdividido nos sítios visceral (TAV) e
retroperitoneal (TAR). A gordura visceral, também conhecida como gordura intraperitoneal, é
composta da gordura mesentérica (intestino delgado, cólon e reto) e omental (conhecida
antigamente por epiplon, é subdivida em omento maior e menor) (Klein, 2004; Tchernof et al,
2006).
O exato mecanismo pelo qual o excesso de TA abdominal é responsável por alterações
metabólicas ainda não está claro. Sabe-se que o aumento da gordura corporal eleva a taxa de
lipólise, acarretando um aumento da mobilização de AG e dos níveis de AG livres circulantes
(Frayn et al, 1996). Nielsen e colaboradores (2004) revelaram que mulheres obesas têm
14
aproximadamente 20% mais AG livres na circulação quando comparadas com mulheres não
obesas (Nielsen et al, 2004). O excesso de AG livres na circulação é um determinante crítico da
resistência à insulina devido a seu efeito “lipotóxico” (Unger, 1995).
Sabe-se que e captura de AG é regulada diferentemente, dependendo da região do TA e
da obesidade. Um estudo do metabolismo de AG provenientes da alimentação demonstrou uma
maior captura de AG da refeição no TA mesentérico e omental (TAV) do que na gordura
subcutânea abdominal de indivíduos obesos (IMC 45,9 Kg/m
2
) e não obesos (IMC 22.6 Kg/m
2
)
(Jensen et al, 2003). Arner (2001), estudando diferenças regionais na produção de proteínas pelo
tecido adiposo, concluiu que existem diferenças na função endócrina entre os vários depósitos
deste tecido, e que esta variação tem um papel importante nas alterações metabólicas em
pacientes com obesidade abdominal (Arner, 2001). Ainda, estudos in vitro mostraram que os
adipócitos viscerais são lipoliticamente mais ativos do que adipócitos subcutâneos (Mauriege et
al, 1987; Rebuffe-Scrive et al, 1989). Outros autores sugerem que a associação entre o excesso
de gordura visceral e as complicações metabólicas da obesidade ocorra em função dos AG livres
originados da lipólise do TAV (Kissebah & Peiris, 1989). Li e colaboradores (2003) analisaram
mudanças na distribuição da gordura, por medidas de ultrasonografia, após 14 dias de restrição
calórica em pacientes obesos, e encontraram uma diminuição da massa de TAV, enquanto que o
TAS não variou nesses pacientes (Li et al, 2003).
No entanto, existem discussões crescentes a respeito de outros sítios do TA abdominal,
como por exemplo, o TAS (Goodpaster et al, 1997; Tai et al, 2000; Garg, 2004), por
contribuírem significantemente com a resistência à insulina e demais complicações metabólicas
da obesidade. É claramente determinado que o TAS e TAR liberam AG para a circulação
sistêmica, diferentemente do TAV que o faz para a circulação porta, diretamente para o fígado.
A hipótese portal da lipotoxidade dos AG livres foi baseada na atividade lipolítica do TAV,
liberação destes para o fígado bem como liberação sistêmica. A Hipótese de Randle discute que
o aumento de AG livres sistêmicos pode causar resistência à insulina por inibir a captura de
15
glicose pelo músculo esquelético (Randle et al, 1963). De fato, o TAV contribui com somente
15% do influxo de AG livres; a maioria, cerca de 75%, é resultado da liberação pelo TA da
região abdominal, como por exemplo, TAS e TAR (Jensen & Johson, 1996). Abate e
colaboradores (1994; 1995), após validação da Imagem de Ressonância Magnética para medida
dos depósitos de TA abdominal, concluíram que o TAS exerce um papel maior na obesidade
relacionada à resistência à insulina, enquanto os depósitos TAV e TAR são menos importantes
(Abate et al, 1994; Abate et al, 1995). Outros autores, como Tai e colaboradores (2000),
encontraram também uma forte associação do TAS com os níveis de insulina em obesos (Tai et
al, 2000). Curiosamente, Goodpaster e colaboradores (1997) realizaram um estudo “cross-
seccional” em obesos e não obesos e concluíram que tanto o TAV como o TAS possuem
associação similar à resistência à insulina (Goodspaster et al, 1997). Em 2000, Kelley e
colaboradores também encontraram relação da insulina com TAS e TAV tanto em obesos quanto
não obesos e, ainda, diferente correlação da insulina com o TAS profundo e o TAS abdominal
(Kelley et al, 2000). Um estudo recente demonstrou que, em mulheres, os adipócitos
subcutâneos são maiores, possuem maior atividade da lípase lipoprotêica (LPL), e são mais
lipolíticos que os adipócitos provenientes da gordura omental (Tchernof et al, 2006).
Na literatura, o TAR é pouco estudado. Alguns trabalhos reportam à gordura abdominal
total sem distinguir o compartimento retroperitoneal do visceral. Mãrin e colaboradores (1992)
encontraram uma fraca correlação deste depósito de lipídeos com as variáveis sistêmicas
envolvidas na obesidade (Mãrin et al, 1992). Abate e colaboradores (1994) analisaram a gordura
intra-abdominal e notaram que indivíduos magros apresentaram 58% de massa visceral e 42% de
massa retroperitoneal, enquanto pacientes obesos apresentaram 69% e 31%, respectivamente. É
possível que fatores anatômicos, assim como a reduzida atividade metabólica do TAR, possam
limitar seu aumento de tamanho (Abate et al, 1994).
16
1.3 Ácidos graxos trans
Evidências do último século revelaram mudanças comportamentais da humanidade em
relação à alimentação, caracterizadas por um aumento no consumo de alimentos, diminuição na
ingestão de AG polinsaturados da série ômega-3, aumento no consumo de alimentos
industrializados, ricos em gordura trans, que provocaram um aumento nas taxas de obesidade em
36 países (Popkin & Gordon-Larsen, 2004; Simopoulos, 1999).
Os lipídeos da dieta têm recebido muita atenção dos profissionais da saúde e do público
em geral, mais do que qualquer outro suprimento energético. Não somente a quantidade, mas
também a qualidade da gordura vêm sendo estudadas em relação ao desenvolvimento de doenças
coronarianas (Semma, 2002). Além disso, estudos populacionais sugerem que os lipídeos da
dieta têm um papel chave na obesidade (Bray & Popkin, 1998; Astrup et al, 2000). Dentre os
tipos de gorduras consumidas, estão os ácidos graxos trans (AG trans), que ocorrem
naturalmente em derivados do leite e gorduras animais, através da hidrogenação biológica no
estômago de ruminantes, ou pelo processo de hidrogenação catalítica de óleos vegetais e
marinhos, e desodorização de óleos, formas comumente mais consumidas (Larqué et al, 2001;
Craig-Schmidt, 2006).
A hidrogenação de óleos vegetais e marinhos teve início em 1919, quando um químico
francês descobriu que o óleo líquido poderia ser convertido em gordura sólida adicionando
átomos de hidrogênio sobre pressão no óleo previamente aquecido (Bailey, 1951). Inicialmente,
a gordura hidrogenada era utilizada em baixa escala. Com o passar do tempo, a utilização pela
indústria de alimentos e pelas padarias aumentou o consumo desse tipo de gordura que chegou a
6,27g/percapita/dia em 1990 nos Estados Unidos (EUA). Em 2003, o FDA (Food and Drug
Administration) estimou que o consumo de AG trans nos EUA seria de 6,86g/percapita/dia para
homem e 4,77g/percapita/dia para mulheres (Dietary references intakes). Ratnayake e Chen
(1995) estimaram que a população canadense em geral consumia de 0,5 a 26,1g de AG trans
com uma média de 8,4g/percapita/dia (Ratnayake & Chen, 1995). No norte da Europa, o
17
consumo foi estimado em 4,5-17g/percapita/dia; no sul da Europa, em 1,34-9g/percapita/dia e
em Israel, 6,5g/percapita/dia (Stender & Dyeberg, 2003). Os países em desenvolvimento também
apresentaram um alto consumo de AG trans. Foi estimado que na Argentina, no Chile, no Peru,
no Equador e no Brasil, o consumo variou de 3 a 19g/percapita/dia (Roger et al, 1998).
Os AG trans são AG insaturados com pelo menos uma ligação dupla na configuração
trans, isto é, os dois átomos de hidrogênio dos carbonos adjacentes à ligação dupla apontam para
direções opostas, diferentemente da configuração cis, na qual onde os átomos de hidrogênio
permanecem do mesmo lado da molécula (Bailey, 1951). Em adição, a ligação dupla pode se
distribuir ao longo da cadeia carbônica, assim surgindo diferentes isômeros de posição. O ângulo
da ligação dupla dos AG trans é menor do que a configuração isomérica cis, a cadeia acil é mais
linear, resultando em uma molécula mais rígida com diferentes propriedades físicas como um
ponto de fusão mais alto e melhor estabilidade termodinâmica (Martin & Synge, 1941). Os
maiores isômeros trans na dieta são os AG com dezoito carbonos monoinsaturados (C18:1)
encontrados na gordura vegetal hidrogenada e gordura de ruminantes, enquanto os AG
polinsaturados trans aparecem apenas em traços. O isômero trans presente na gordura derivada
do ruminante é o AG vaccênico (C18:1 t11), que possui a ligação dupla no carbono 11. Por outro
lado, o AG elaídico (C18:1 t9), predominante, mas não exclusivo isômero trans da gordura
hidrogenada, possui a ligação dupla no carbono nove (Meijer et al, 2001).
18
Figura 1: Representação do ácido graxo oléico, elaídico e esteárico; destaque para os
isômeros cis e trans. Adaptado de Costa e colaboradores (2006).
A atenção dos pesquisadores para os efeitos adversos dos AG trans começou em 1990
quando Mensink e Katan mostraram que a ingestão elevada destes aumentava os níveis da
lipoproteína de baixa densidade (LDL), de maneira similar aos AG saturados. Entretanto, foi
observado que os AG trans reduziam os níveis da HDL, alterando significativamente a razão
entre LDL/HDL (Mensink & Katan, 1990). Judd e colaboradores (1994) comprovaram estes
resultados utilizando, em homens e mulheres, uma dieta com 6,6% de AG trans. Observaram
aumento dos níveis de LDL em 9% e diminuição dos níveis de HDL em 2,8% (Judd et al, 1994).
Aro e colaboradores (1997) dosaram as lipoproteínas no soro de indivíduos recebendo dieta com
AG esteárico ou AG trans durante cinco semanas. Eles notaram uma diminuição similar no
colesterol total com as duas dietas, porém a dieta contendo AG trans diminuiu HDL (17%) e
apoliproteína (apo) A-I (15%) mais significativamente do que a dieta de AG esteárico (11% e
12%, respectivamente) (Aro et al, 1997). Sundam e colaboradores (1997) alimentaram pacientes
com ácido elaídico (5,5%) por cinco semanas e observaram um aumento de LDL e lipoproteína a
(Lp(a)) e redução de HDL (Sundram et al, 1997). Uma recente meta-análise confirmou que os
AG trans afetam os níveis de lipídeos de uma forma mais negativa que os AG saturados, por
aumentar LDL e diminuir HDL colesterol (Mensink, 2003). Desta forma, esses dados colocam
os AG trans entre os fatores dietéticos de risco para doenças cardiovasculares.
19
Outras pesquisas têm associado os AG trans à presença de marcadores sistêmicos
inflamatórios, ou seja, estes AG têm sido considerados pró-inflamatórios. Alta ingestão de AG
trans está associada com o aumento nos níveis sistêmicos de TNF-α, IL-6 e proteína C reativa
(CRP). Mozaffarian e colaboradores (2004) sugeriram que o efeito pró-inflamatório pode ser
parcialmente mediado pelo TA. Foi observado que a relação entre a ingestão de AG trans e os
níveis circulatórios de IL-6 e CRP pode ser modificada pelo índice de massa corporal (IMC). Os
AG trans podem ainda influenciar a função endotelial (Mozaffarian et al, 2004). Uma análise
com 730 mulheres associou o alto consumo de AG trans com elevados níveis de moléculas de
adesão solúveis (ICAM-1 e VCAM-1) e concentrações plasmáticas de E-selectina, que são
marcadores da disfunção endotelial (Lopez-Garcia et al, 2005).
Além de o consumo de AG trans estar fortemente associado ao risco de doenças
cardiovasculares e inflamatórias, dados epidemiológicos do “Nurses Health Study” reportaram
que estes AG aumentam o risco de desenvolver DM2 (Salmeron et al, 2001). Bray e
colaboradores (2002), revisando a influência de diferentes AG sobre a obesidade, resistência à
insulina e inflamação, constataram que o AG elaídico pode aumentar a razão insulina/glicose
(Bray et al, 2002). Lefevre e colaboradores (1999) sugerem que este AG trans pode induzir à
resistência à insulina (Lefevre et al, 1999). Além disso, Storlien e colaboradores (2000)
mostraram que os AG da dieta têm um papel importante na indução da resistência à insulina,
possivelmente devido às alterações na composição de AG dos lipídeos estruturais, das células do
músculo esquelético e TA (Storlien et al, 2000). Christiansen e colaboradores (1997) reportaram
que AG saturados e AG trans induziram resistência à insulina em pacientes obesos (Christiansen
et al, 1997). Um estudo recente, realizado em ratos, demonstrou que dietas contendo AG
saturados ou AG trans, provenientes de gordura vegetal hidrogenada, aumentaram os níveis de
insulina e triglicerídeos de jejum. Além disso, estas duas dietas diminuíram os níveis de AG
araquidônico nos fosfolipídeos da membrana plasmática dos adipócitos. No entanto, somente nos
20
ratos alimentados com AG trans, houve diminuição de fluidez da membrana plasmática (Ibrahim
et al, 2005).
Mahfouz e colaboradores (1984) alimentaram ratos com gordura hidrogenada e notaram
uma diminuição na conversão de ácido linoléico para araquidônico devido ao efeito inibitório
nas enzimas delta 5 e 6 desaturases. Estes resultados se devem à ação do ácido elaídico (C18:1t9)
quando comparado aos lipídeos provenientes da gordura de ruminantes que contém somente
isômero trans na posição 11 (C18:1t11- ácido vaccênico) (Mahfouz et al, 1984). Mais tarde,
realizando um estudo in vitro, estes mesmos autores confirmaram a inibição da delta 5 e 6
desaturases por isômeros trans C18:1, excluindo o isômero C18:1t11 (Mahfouz et al, 1999). Um
trabalho mais recente realizado por Kummerow e colaboradores (2004) demonstraram que os
fosfolipídeos da aorta de porcos alimentados com gordura hidrogenada como fonte de lipídeos,
apresentaram maior concentração de ácido linoléico, menor de ácido araquidônico e AG
polinsaturados de cadeia longa (PUFA) quando comparados com os porcos alimentados com
manteiga ou dieta controle. Essa mudança na composição da aorta indica que a gordura trans
inibe a conversão metabólica do ácido linoléico para araquidônico e demais PUFA da série n-6 e
n-3 (Kummerow et al, 2004).
Os mecanismos pelos quais os AG trans exercem seus efeitos deletérios à saúde não
estão esclarecidos. Possivelmente diversos componentes estão envolvidos, como alteração das
propriedades físico-química das membranas, controle da expressão de genes e conseqüente
modificação do metabolismo de lipídeos e carboidratos (Risérus, 2006). Trabalhos recentes
mostram que AG provenientes da dieta podem regular a expressão de genes envolvidos no
metabolismo, principalmente de lipídeos e da glicose (Clarke, 2001; Pegorier et al, 2004). Entre
os receptores nucleares regulados por AG, estão os receptores ativadores da proliferação de
peroxissomos (PPARs).
Recentemente, um estudo em animais revelou que a ingestão de AG trans altera a
expressão gênica do receptor ativador da proliferação de peroxissomas-γ (PPAR-γ), resistina e
21
LPL no tecido adiposo (Saravanan et al, 2005) e influencia o metabolismo dos AG nos
adipócitos (Matthan et al, 2001). Análogos a outros AG, os trans podem atuar como ligantes de
receptores nucleares (PPARs, LXR e SREBP-1) regulando genes que afetam o metabolismo em
adipócitos e outros tecidos.
1.4 PPAR
Os peroxissomos são organelas subcelulares primordialmente envolvidas na remoção do
oxigênio molecular. Mais tarde no processo evolutivo, foram envolvidos na metabolização do
peróxido de hidrogênio e em diversas vias anabólicas e catabólicas de lipídeos, incluindo síntese
de glicerolipídeos, metabolismo do colesterol e oxidação de AG (Vamecq & Latruffe, 1999). Em
1990, Isseman & Green descobriram o mecanismo pelo qual a proliferação de peroxissomos é
induzida no fígado de roedores por drogas hipolipidêmicas e plastificadoras (Isseman & Green,
1990). A proliferação de peroxissomos ocorre somente em roedores como conseqüência da
ativação de alguns receptores nucleares por moléculas específicas, assim denominadas de
proliferadores de peroxissomos. Mais tarde, verificou-se que os, então, PPARs (receptores
ativadores da proliferação de peroxissomos) estão presentes também em humanos, no entanto
com funções distintas, caracterizadas por ligar as seqüências específicas de DNA e regular a
expressão de genes (Neve et al, 2000).
Desde sua descoberta, os PPARs receberam grande atenção por serem alvo e terem
elevado potencial farmacológico para o combate da obesidade e do diabetes (Auwerx et al,
1996). Os PPARs são membros da superfamília de receptores nucleares e, em humanos, vem
sendo descritas três isoformas: PPARα, PPARδ (também conhecido como PPARβ) e PPARγ
(Auboeuf et al, 1997; Escher et al, 2001). Os PPARs são ativados por ligantes endógenos ou
exógenos, sendo que, após ativação, sofrem uma mudança conformacional, que permite a
heterodimerização com o receptor retinóico (RXR), e a subseqüente heterodimerização com o
elemento responsivo ao PPAR (PPRE) induzindo o desligamento do correpressor, e recrutando
22
um ou mais coativadores. (Kota et al, 2005). Este processo de ativação resulta no aumento da
atividade transcricional de genes envolvidos em diferentes processos biológicos (Kahn e Flier,
2000) (Figura 2).
Figura 2: Mecanismo de transcrição gênica de PPARs. No estado não ligado, PPARs vão
interagir com co-repressor. No estado ligado (agonista como TZD ou AG), PPARs
heterodimeriza com RXR, liga ao PPRE, recruta coativador facilitando transcrição de vários
genes. Adaptado de Kota e colaboradores (2005).
Os PPARs estão presentes em diferentes órgãos, mas encontram-se fortemente
concentrados em áreas metabólicas chaves, incluindo TA, músculo esquelético, fígado, pâncreas
e células imunes (Desvergne & Wahli, 1999). Esta família de receptores nucleares tem um papel
chave na regulação da adipogênese, no metabolismo de lipídeos e carboidratos, na sensibilidade
à insulina e na inflamação. Evidências apontam para uma relação entre a atividade de PPARs e a
síndrome metabólica incluindo resistência à insulina, intolerância à glicose, obesidade,
dislipidemia, hipertensão e aterosclerose (Guri et al, 2006).
1.4.1 PPARα
αα
α
O PPARα é principalmente expresso no fígado, no TA marrom, no intestino delgado, no
músculo esquelético e cardíaco (Grimaldi, 2001)
e nas células vasculares (Diep et al, 2000). Esta
isoforma de receptor tem um papel chave na regulação da β-oxidação no fígado (Wahli et al,
PPRE
Transcrição
Coativador
Correpressor Núcleo
Citosol
Ligante
endógeno
Ligante
exógeno
PPAR RXR
23
1995) e também estimula a captura de AG, pois aumenta a expressão da proteína de transporte de
AG (FATP) e translocase de AG (FAT) (Motojima et al, 1998). Mais recentemente tem-se
associado a ativação do PPARα aos efeitos antiinflamatórios e de melhora na aterosclerose
(Chinetti et al, 2001; Goya et al, 2004). Os fibratos, fármacos hipolipidêmicos, usados na clínica
são agonistas de PPARα (Wahli et al, 1995).
1.4.2 PPARβ/δ
δδ
δ
O PPARβ/δ é expresso em diversos tecidos do corpo, em altos níveis, como por exemplo,
no músculo cardíaco e esquelético e no TA branco (Grimaldi,
2001). Esse subtipo de receptor
nuclear inicialmente recebeu menos atenção que outros PPARs devido ao seu largo padrão de
expressão e a não disponibilidade de um ligante seletivo. Recentemente, estudos em TA e
músculo começaram a descobrir as funções metabólicas deste receptor nuclear. A expressão
transgênica de uma forma ativada do PPARβ/δ no TA de camundongos produz camundongos
magros resistentes à obesidade, à hiperlipidemia e à esteatose, induzidas geneticamente ou por
uma dieta rica em gordura (Wang et al, 2003). No entanto, estudos moleculares que
desenvolveram um agonista sintético do PPARβ/δ têm ajudado a revelar o seu papel como
poderoso regulador do catabolismo de AG e homeostase energética. Oliver e colaboradores
(2001) demonstraram que a ativação por 4 semanas por um novo, potente e específico agonista
(GW501516) induz à correção dos níveis de triglicerídeos, diminui a hiperinsulinemia e aumenta
HDL em macacos obesos (Oliver et al, 2001), justificando a iniciação de ensaios clínicos para
verificar sua eficácia em pacientes hiperlipidêmicos e obesos (Gross et al, 2005).
Vários AG saturados e insaturados são ligantes de PPARβ/δ, sendo que eicosanóides,
prostaciclinas e ácido retinóico são ativadores deste receptor (Xu et al, 1999; Shaw et al, 2003).
Holst e colaboradores (2003), estudando a regulação nutricional do PPARβ/δ em camundongos,
observaram que, após 24 horas de inanição, os níveis de mRNA do PPARβ/δ foram
drasticamente regulados positivamente no músculo gastrocnêmico e retornando a níveis de
24
mRNA normais após realimentação (Holst et al, 2003). Jehl-Pietri e colaboradores (2000) e
Bastie e colaboradores (2000), após investigarem o papel do PPARβ/δ no controle da
proliferação de fibroblastos e pré-adipócitos por AG, sugerem que a modulação da atividade
deste receptor pode afetar respostas adaptativas do tecido adiposo branco diante de mudanças
nutricionais (Bastie et al, 2000; Jehl-Pietri et al, 2000).
1.4.3 PPARγ
O PPARγ é expresso no TA branco, TA marrom, placenta, intestino e macrófagos
(Grimaldi, 2001). O gene deste receptor nuclear contém três promotores distintos denominados
PPARγ1, PPARγ2 e PPARγ3. A transcrição do PPARγ1 e PPARγ3 geram uma proteína idêntica
(Kota
et al, 2005), enquanto que a transcrição do PPARγ2 forma uma proteína que contém 28
aminoácidos adicionais (Meirhaeghe & Amouyel, 2004). O PPARγ é o maior regulador da
diferenciação de adipócitos (Spiegelman, 1998). Além disso, promove apoptose de adipócitos
maduros, estimula a adipogênese e aumenta o número de adipócitos menores sensíveis à insulina
(Okuno et al, 1998; Hallakou et al, 1997). Investigações in vivo também mostraram que a
ativação de PPARγ provoca efeito oposto à expressão de TNF-α, afeta diversos genes
envolvidos na ação da insulina (Shibasaki et al, 2003), como por exemplo, aumento da expressão
de GLUT 4 (Shimaya et al, 1997), inibição da secreção de resistina (Shojima et al, 2002) e
modulação de adiponectina (Berger et al, 2001; Rangwala et al, 2003). Outras pesquisas
também mostraram um aumento na expressão do PPARγ1 em macrófagos e células tumorais,
revelando possíveis funções adicionais deste receptor na aterosclerose, na inflamação e no câncer
(Desvergne & Wahli, 1999; Ricote et al, 1999).
A maioria dos genes alvo do PPARγ está envolvida no metabolismo da glicose e dos
lipídeos. Muitos ligantes sintéticos do PPARγ, como tiazolidinedionas (TZD), medeiam ações
antidiabéticas por aumentar a sensibilidade à insulina. No entanto, a precisa natureza de ligantes
endógenos ainda não é clara, vários AG e seus metabólitos são capazes de ativar PPARγ (Wilson
25
et al, 2001). Forman e colaboradores (1995) mostraram que prostaglandinas da série J como, por
exemplo, 15-deoxi-delta12-14-PGJ2 (15d-PGJ2) são ativadores de PPARγ (Forman et al, 1995).
Assim como Nagy e colaboradores (1998) determinaram que lipídeos oxidados como o ácido 9-
hidróxi-ocatadecadienóico (9-HODE) e o ácido 15-hidroxieicosatetraenóico (15-HETE) são
também ativadores efetivos deste receptor nuclear (Nagy et al, 1998). Um estudo mais recente,
realizado por Chambrier e colaboradores
(2002), verificou que AG, particularmente os
polinsaturados, regulam diretamente a expressão do gene PPARγ em tecido adiposo humano de
obesos. Eles notaram um aumento significativo da expressão do mRNA PPARγ1 na presença de
ácido eicosapentaenóico (C20:5n-3) sugerindo que este AG pode participar na regulação da
expressão de PPARγ em tecido humano (Chambrier et al, 2002). Bastard e colaboradores (1999)
e também Vidal Puig e colaboradores (1997) relataram anteriormente uma diminuição na
expressão de PPARγ no TAS de obesos após restrição calórica (Bastard et al, 1999; Vidal-Puig
et al, 1997). Em adição, Vidal-Puig e colaboradores (1996), analisando expressão de PPARγ em
roedores, notaram que tanto o jejum quanto a realimentação afetam a expressão deste receptor
em TA diminuindo e aumentando a expressão, respectivamente (Vidal-Puig et al, 1996).
Enquanto que Nisole e colaboradores (2000) mostraram que a infusão na região glúteo-femoral
de uma mistura de triglicerídeos por 5 horas foi capaz de promover o aumento da expressão de
PPARγ em TA de humanos (Nisole et al, 2000). Esses resultados sugerem que a expressão de
PPARγ pode ser controlada, pelo menos em parte, pela regulação nutricional. No entanto, a
natureza dos AG que poderiam participar na regulação transcricional do gene PPARγ não é
totalmente conhecida (Chambrier et al, 2002).
26
2 OBJETIVOS
O mecanismo pelo qual AG trans causam os efeitos deletérios à saúde não está
completamente entendido e tampouco sua relação com os diferentes depósitos de TA e com a
obesidade. Com isso, nosso trabalho pretende analisar e quantificar a concentração total de AG
trans, depositados no tecido adiposo (TAS, TAR e TAV), numa amostra constituída de pacientes
obesos mórbidos e não obesos. Em vista da ação direta de nutrientes, entre eles os AG, sobre a
modulação da expressão de alguns genes envolvidos no metabolismo de lipídeo e da glicose,
procuramos determinar a expressão de mRNA dos PPARs no TA. Os PPARs estão associados à
síndrome metabólica incluindo resistência à insulina, intolerância à glicose, obesidade
abdominal, dislipidemia, hipertensão e aterosclerose. Desta forma, procuramos analisar e
quantificar a expressão dos PPARs nos diferentes depósitos de tecido adiposo (TAS, TAR e
TAV) em obesos mórbidos e não obesos e verificar sua relação com a obesidade.
2.1 Objetivos específicos
1- Quantificar o conteúdo de AG trans no TAS, TAR e TAV de indivíduos obesos mórbidos
e não obesos;
2- Comparar o conteúdo de AG trans entre os diferentes depósitos de TA;
3- Inferir o consumo de AG trans através do depósito destes no TA de indivíduos obesos
mórbidos e não obesos;
4- Analisar o perfil de expressão do PPARβ/δ nos diferentes depósitos de TA (TAS, TAR e
TAV) em pacientes obesos mórbidos e não obesos;
27
5- Analisar o perfil de expressão do PPARγ1-3 nos diferentes depósitos de TA (TAS, TAR e
TAV) em pacientes obesos mórbidos e não obesos;
6- Comparar a expressão de mRNA de PPARβ/δ e PPARγ1-3 entre os diferentes depósitos
de TA (TAS, TAR e TAV);
7- Verificar se a obesidade modula a expressão destes receptores em TAS, TAR e TAV
comparando pacientes obesos com pacientes não obesos;
8- Correlacionar as variáveis antropométricas e bioquímicas dos indivíduos obesos com a
expressão dos PPARβ/δ e PPARγ1-3.
28
PARTE II
29
CAPÍTULO I
Higher content of Trans Fatty Acids in abdominal visceral fat of morbidly obese
individuals undergoing bariatric surgery compared to non-obese subjects
(artigo publicado)
Referência: Obesity Surgery, v.15, p. 1265-1270, 2005.
30
31
32
33
34
35
36
CAPÍTULO II
Adipose Tissue distribution and Quantification of PPARβ
ββ
β/δ
δδ
δ and PPARγ1-3 mRNAs:
discordant gene expression in subcutaneous, retroperitoneal and visceral adipose tissue of
morbidly obese patients
(manuscrito aceito para publicação)
Referência: Obesity Surgery
37
Adipose Tissue distribution and Quantification of PPARβ
ββ
β/δ
δδ
δ and PPARγ1-3 mRNAs:
discordant gene expression in subcutaneous, retroperitoneal and visceral adipose tissue of
morbidly obese patients
Josiane Woutheres Bortolotto
1
, Rogério Margis
1
PhD, Ângela Cristina Ferreira
1
, Alexandre
Vontobel Padoin
2
MB, Cláudio Cora Mottin
2
PhD, Regina Maria Guaragna
1
PhD,
1
Departamento de Bioquímica – UFRGS.
2
Centro de Obesidade Mórbida – PUCRS.
Regina Maria Guaragna
Address: Departamento de Bioquímica. ICBS. UFRGS.
Rua Ramiro Barcelos 2600 – anexo
CEP 90.035-003. Porto Alegre. RS.
Brazil.
e-mail: [email protected]
Tel: 55 51 3316 5546 or 55 51 3316 5539
FAX number : 55 51 3316 5540
Adipose Tissue Distribution and Quantification of PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNAs
38
Abstract
Background: Adipose tissue (AT) metabolism is altered in obese subjects and the
reestablishment of energy homeostasis requires the identification and regulation of genes with
altered patterns. The aim of this study was to compare mRNA expression of PPARβ/δ and
PPARγ1-3 in morbidly obese and non-obese patients. The expression pattern of these receptors
in various abdominal tissues (AT), subcutaneous (SAT), retroperitoneal (RAT) and visceral
(VAT), was also evaluated.
Methods: The AT depots were obtained by surgery; total RNAs were extracted using TRIzol,
and PPARs reverse transcripts were determined by quantitative polymerase chain reaction (qRT-
PCR).
Results: The amounts of PPARβ/δ mRNA in different depots of morbidly obese AT showed a
significant decrease in VAT (p<0.05). In the non-obese group, the level of PPARβ/δ was higher
in SAT (p < 0.05), but PPARγ1-3 was not differentially expressed in obese and non-obese
depots. When comparing obese and non-obese, the results revealed a decrease in PPARβ/δ
expression in SAT (p= 0.058) and VAT (p= 0.094) of the morbidly obese. PPARγ1-3 mRNA
expression was increased significantly in SAT (p= 0.022) and decreased in RAT (p= 0.034) in
morbidly obese subjects. PPARβ/δ expression in SAT and VAT correlated negatively with hip
size and insulin serum respectively. PPARγ1-3 expression in RAT correlated negatively with
waist and hip size and in VAT correlated positively with waist size.
Conclusions: The present study demonstrates that PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNAs are
quantitatively different in AT of morbidly obese individuals compared to non-obese and that
PPARβ/δ mRNA levels are characteristic for each AT depot.
Key words: adipose tissue depots, PPARβ/δ, PPARγ1-3, morbid obese, non-obese.
39
Introduction
Obesity is defined as a state of pathologically excessive adipose tissue (AT) mass,
conferring a higher risk of cardiovascular and metabolic disorders
1
. Morbid obesity is an
important public health problem
2-4
, and is associated with serious co-morbid effects, including
hypertension, diabetes, peripheral resistance insulin and dyslipidemia
2
.
There is growing evidence that the distribution of body fat influences the metabolic
consequences of obesity. Abdominal adipose tissue depots – intra-abdominal adipose tissue
(visceral or intraperitoneal and retroperitoneal) and subcutaneous adipose tissue - are
metabolically active and appear to be important for the pathogenesis of insulin resistance,
dyslipidemia, glucose intolerance, hypertension, hypercoagulable state and cardiovascular risk
5
.
These depots are metabolically different and have profound differences in their gene expression
profile
6
.
The peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are members of the nuclear
receptor superfamily
7
and there are three related PPAR isoforms: PPARα, PPARγ, and
PPARβ/δ, with different ligand specificities and tissue distribution
8
. PPARα is mainly expressed
in liver, brown AT, small intestine, skeletal muscle and heart. PPARγ is expressed in white and
brown AT, placenta, large intestine and macrophages. PPARβ/δ is the most widely expressed
gene but has higher levels in skeletal and cardiac muscle and white AT
9
.
The PPARγ gene contains three promoters that yield three isoforms, namely, PPARγ1,
PPARγ2, and PPARγ3. PPARγ1 and PPARγ3 transcripts translate into the identical PPARγ1
protein
10
while PPARγ2 protein contains an additional N-terminal 28 amino acid exon
11
.
PPARγ1 is found in a broad range of tissues, whereas PPARγ2 is restricted to AT. PPARγ3 is
abundant in macrophages, large intestine and white AT
10
. PPARγ regulates the formation and
function of fat cells. The effect of PPARγ activation is seen in all aspects of the mature cell
phenotype, including morphological changes, lipid accumulation and acquisition of insulin
40
sensitivity
12
. Their ligands include dietary fatty acids, prostaglandins of the J series, including
15d-PGJ
2
13
, and antidiabetic compounds of the thiazolidinedione (TZD) class
9
.
PPARβ/δ initially received much less attention than the other PPARs. However genetic
studies and the recent development of synthetic PPARβ/δ agonist have helped to reveal its role
as a powerful regulator of fatty acid catabolism and energy homeostasis. The PPARβ/δ agonist
GW501516 was shown to lower plasma triglyceride levels in obese monkeys while raising high-
density lipoprotein levels (HDL), prompting the initiation of clinical trials to assess its efficacy
in hyperlipidemic patients
14
. Transgenic expression of an activated form of PPARβ/δ in AT
produces lean mice that are resistant to obesity, hyperlipidemia and tissue steatosis induced
genetically or by a high fat diet
15
. The activated receptor induces genes required for fatty acid
catabolism and adaptive thermogenesis
14
.
Morbidly obesity is associated with disturbances in lipid and glucose metabolism. We
investigated whether the expression of PPARβ/δ and PPARγ1-3 was modulated in morbidly
obesity. The aim of this work was thus to evaluate the mRNA levels of these receptors in morbid
obese patients and compare them with normal weight subjects. As AT depots have metabolic
variables and play a yet unknown role in obesity, we compared PPARβ/δ and PPARγ1-3 in
different abdominal AT: subcutaneous, retroperitoneal and visceral.
Materials and Methods
Samples
Samples of VAT (omentum), RAT and SAT were obtained from 10 morbidly obese
patients who underwent bariatric surgery. The extensive clinical and laboratory data routinely
collected for each patient is shown in Table 1. Apart from obesity, all subjects were in good
health and were not taking any medication affecting adipocyte metabolism. Similar samples of
41
VAT, RAT and SAT were obtained from 10 non-obese patients who underwent elective surgery.
The age range was from 23 to 52 years, and the body mass index (BMI) from 17.9 to 29.0
Kg/m
2
. Samples were collected during surgery and were immediately immersed in TRIzol
reagent. The study was approved by the Ethics Committee of the University Federal of Rio
Grande do Sul. All subjects gave written informed consent.
Analysis of human PPARs gene expression
Approximately 2 µg of total RNA were added to each cDNA synthesis reaction using the
SuperScript-II RT preamplication system (Invitrogen). Reactions were performed at 42ºC for 1 h
using the primer T23V (5’ TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV). Quantitative polymerase
chain reaction (qRT-PCR) amplification was carried out using specific primer pairs designed
with Oligo Calculator version 3.02 (http://www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html) and
synthesized by RW-Genes (RJ, Brazil). The sequences of the primers used are listed in Table 2.
qRT-PCRs were carried out in an Applied-Biosystem 7500 real-time cycler. Reaction settings
were composed of an initial denaturation step of 5 min at 94ºC followed by 40 cycles of 10 s at
94ºC, 15 s at 60ºC, 15 s at 72ºC and 35 s at 60ºC; samples were held for 2 min at 40ºC for
annealing and then heated from 55 to 99ºC with a ramp of 0.1ºC/s to acquire data to produce the
denaturing curve of the amplified products. qRT-PCRs were carried out in 20 µl final volume
composed of 10 µl of each reverse transcription sample diluted 50 to 100 times, 2 µl of 10 times
PCR buffer, 1.2 µl of 50 mM MgCl
2
, 0.1 µl of 5 mM dNTPs, 0.4 µl of 10 µM primer pairs, 4.25
µl of water, 2.0 µl of SYBR green (1:10.000 Molecular Probe), and 0.05 µl of Platinum Taq
DNA polymerase (5 U/µl) (Invitrogen).
Data analysis
42
We quantified gene expression using the 2
-∆∆Ct
(threshold cycle) method
16
. For each
sample, analyzed in triplicate, a ∆C
T
value was obtained by subtracting the β-actin C
T
value from
the C
T
of the gene of interest. Relative PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNA intra-tissue expression
levels were normalized to PPARβ/δ and PPARγ1-3 mean expression of VAT. To compare
morbidly obese and non-obese expression, PPARβ/δ and PPARγ1-3 levels were normalized to
the average expression values of non-obese AT for each tissue depot.
Statistical analysis
Data is shown as mean ± SE. Mean values for PPARs expression in SAT, RAT and VAT
in obese or non-obese group were compared by the non-parametric Friedman test. PPARs
expression in obese and non-obese patients in the same AT depot was assessed using the Mann-
Whitney U and correlation coefficients determined using the Spearman statistical package.
Differences between groups were considered statistically significant at p ≤ 0.05.
Results
The expression of PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNA in SAT, RAT and VAT of morbidly
obese and non-obese subjects was assessed by qRT-PCR. Table 3 reflects the expression profile
of three distinct AT depots (SAT, RAT and VAT) in morbidly obese and non-obese tissues. The
morbidly obese group showed significant differences in the pattern of PPARβ/δ mRNA
expression in AT depots. We observed a decreased expression of this receptor in the VAT of
obese subjects (p= 0.025). The PPARγ1-3 mRNA distribution in various AT depots in this group
showed no differences in mRNA expression.
The non-obese group presented a different expression profile of PPARβ/δ mRNA in the
AT depots analyzed. In this group, SAT revealed a more pronounced expression (p= 0.021) of
43
the receptor than RAT and VAT. However, the PPARγ1-3 mRNA expression profile in non-
obese subjects did not differ in three AT depots.
Table 4 represents the mRNA expression of PPARβ/δ and PPARγ1-3 in different depots
of AT in morbidly obese compared to non-obese patients. There was a PPARβ/δ decrease in
SAT of morbidly obese subjects (p= 0.058) and a tendency for decreased expression of this
receptor in the VAT of the obese group (p=0.094). However, no significant differential
expression of this nuclear receptor was observed when RAT from morbidly obese was compared
to non-obese subjects.
We also compared PPARγ1-3 in the same depots of AT from morbidly obese and non-
obese patients. PPARγ1-3 mRNA expression was significantly increased (p= 0.022) in SAT of
morbidly obese compared to non-obese subjects. In contrast, RAT presented a significant
decrease of PPARγ1-3 mRNA levels in the morbidly obese (p= 0.034). The expression was not
different in VAT from both groups of patients.
In obese AT depots with anthropometric and biochemical variables there was a
significant negative correlation between PPARβ/δ SAT expression with hip size (r =-0.886, p=
0.019), and a tendency for negative correlation with waist size (r =-0.771, p= 0.072). There was
also a significant negative correlation between PPARβ/δ VAT expression with insulin serum
level (r =-0.900, p= 0.037). No correlation was found with PPARβ/δ RAT expression. PPARγ1-3
expression correlated with anthropometric variables. A negative correlation was found between
PPARγ1-3 RAT expression and waist (r = -1.000, p< 0.0001) and hip size (r = -0.900, p= 0.037).
However, a positive correlation was found between PPARγ1-3 VAT expression and waist size (r
=0.900, p= 0.037).
44
Discussion
Obesity is a heterogeneous disorder and a knowledge of the regional distribution of AT is
important to understand the relationship between obesity and disturbances in glucose and lipid
metabolism
17
. PPARs transcriptional factors are nuclear receptors and the major gene regulators
of lipid and glucose metabolism, allowing adaptation to the prevailing nutritional environment
18
.
Information on site-related gene expression of PPARs in different human AT depots is limited
19
PPARβ/δ enhances fatty acid catabolism and energy uncoupling in AT and muscle and
may potentially be used to control weight gain
20
. Surprisingly, no studies have examined
PPARβ/δ mRNA expression in different depots of human AT. Our results showed that morbidly
obese subjects had difference in PPARβ/δ mRNA expression pattern when analyzed in three
different depots. VAT of individuals from this group showed a minor expression of PPARβ/δ
and there was no difference between SAT and RAT. These could be contributing to the visceral
obesity typical of the morbidly obese. Non-obese patients had a higher expression of PPARβ/δ
mRNA in SAT. The SAT of normal weight subjects may have a more pronounced up-regulation
of genes involved in fatty acid oxidation and energy dissipation, but further investigations are
needed to clarify this.
PPARγ is an adipocyte master transcription factor that, when activated by natural or
synthetic agonists
13
, triggers expression of terminal differentiation-related genes and
adipogenesis
21
. Unlike PPARβ/δ expression, PPARγ1-3 receptor transcripts did not differ
significantly between the three AT of morbidly obese, or of non-obese, patients. These results
agree with a previous study of total PPARγ expression in SAT and VAT of nondiabetic subjects.
Normolipidemic morbidly obese men revealed a similar intensity of this receptor
22
. Lefebvre et
al
23
and Montague et al
24
also found no difference between total PPARγ expression in omental
and SAT.
45
A different scenario appeared when the two groups of individuals, normal weight and
morbidly obese, were compared for amounts of PPARγ1-3 and PPARβ/δ mRNA isoforms in the
same depot-specific AT. For the first time, PPARs expression in RAT has been analyzed and no
significant difference in PPARβ/δ expression found between obese and non-obese subjects.
However, PPARγ1-3 expression was down-regulated in obese subjects in this tissue. In
corroboration, correlation analysis revealed a negative coefficient between PPARγ1-3 RAT and
waist and hip size. Studies in men with a wide range of adiposity showed that intra-abdominal
AT mass was changed in obesity. Lean subjects had 58% visceral mass and 42% retroperitoneal
mass, while these tissues in obese subjects were 69% and 31%, respectively
25
. This could be
explained by down-regulation of PPARγ1-3, adipogenic transcriptional factor, and the lack of
difference in PPARβ/δ in RAT found in our obese study group.
Our results revealed reduced PPARβ/δ expression in SAT and a tendency for decreased
expression in VAT of morbidly obese patients compared to non-obese. Activation of PPARβ/δ
in AT specifically induces expression of genes required for FA oxidation and energy dissipation,
which reduces adiposity
15
. Down-regulation of PPARβ/δ SAT could be implicated in obesity, as
it was correlated negatively with hip and waist size in morbidly obese patients. PPARβ/δ
expression in VAT could be associated with visceral obesity and metabolic syndrome since it
was correlated negatively with serum insulin levels.
PPARγ1-3 expression was increased in obese SAT but no difference was found in VAT
for either group. Previous studies compared nuclear receptor expression in obese and non-obese
humans and results are still controversial
21,22,26
. These studies used semi-quantitative RT-PCR or
Northern blots to measure mRNAs, and there was a large individual variation in PPARγ
expression. In the present study, PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNA levels were quantified using a
highly sensitive quantitative Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) assay.
46
The increase of PPARγ1-3 mRNA expression found in SAT of the morbidly obese group
is in agreement with the paradox of TZD
27
. TZD are agonists of PPARγ, commonly used in the
treatment of diabetes mellitus, improving insulin sensitivity while simultaneously causing weight
gain. This effect is markedly enhanced in subcutaneous fat, with less effect in visceral fat
28,29
.
However, there is relationship between this receptor expression in VAT and anthropometric data,
waist size. It is important to remember that we used PPARγ1-3 to understand its relationship
with obesity. In view of this, we examined the assembly of PPARγ1 and PPARγ3 expressions
(PPARγ1-3) that differ in their 5´ non-translated region but encode the same protein sequence
10
.
Our correlation data suggests an effective participation of SAT, VAT and PPARβ/δ
expression in obesity. At this time, GW501516, a selective activator of PPARβ/δ, has been
proposed as a pharmacological target for the treatment of dyslipidemia, obesity, insulin
resistance and vascular inflammation, and is now in clinical development
30
. Connecting the
possible function of this agonist with the low level of PPARβ/δ mRNA found in our research in
the obese group, it is possible to suggest that this pharmacological target could be effective in the
treatment of obesity.
Obesity could be a result of imbalance of many genes related to metabolism. Microarray
studies have shown a deregulated expression of genes in human obesity
31-33
. A study in morbidly
obese subjects revealed that 85.5% of genes were up-regulated and 14.5% down-regulated
31
. Our
data suggest a probable imbalance in PPARβ/δ and PPARγ1-3 expression regulating adipocyte
development: down regulated genes involved in fatty acid oxidation and energy dissipation and
increased genes related to adipogenesis.
In conclusion, the present study demonstrates that PPARβ/δ and PPARγ1-3 are
differentially expressed in the AT of morbidly obese individuals compared to non-obese. These
patterns of gene expression will contribute to the understanding of the pathogenesis of obesity-
related disorders and provide potential targets for future therapy. A knowledge of the distribution
47
of the nuclear receptors in different AT depots may be important to implement therapeutic
researches in a specific manner.
Acknowledgements
The authors thank Doctors José F. Bortolotto and Pedro Furian for non-obese AT for the
analyses. Thanks too for the Nurses' time in all the hospitals cited above and Dr. Maria Luisa
Pereira for lending Real-time PCR apparatus. This work was supported by research grants from
Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) and Fundação de Apoio a Pesquisa do Rio Grande do
Sul (FAPERGS). Dr. R. Margis is the recipient of a research fellowship from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
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51
Tables:
Table 1: Anthropometric and biological parameters of morbidly obese patients (n=10)
Mean (±SE) Range
Age (years) 33.9 (±1.6) (24-39)
BMI (Kg/m
2
) 50.3 (±2.3) (40.7-63.6)
Waist (cm) 132.4 (±4.6) (108-149)
Hip (cm) 144.7 (±4.4) (125-170)
Glicemia (mg/dL) 104.2 (±7.6) (77-153)
Total cholesterol (mg/dL) 199.3 (±12.0) (141-273)
HDL cholesterol (mg/dL) 50.0 (±5.0) (22-82)
LDL cholesterol (mg/dL) 115.2 (±6.8) (70-151)
Triglycerides (mg/dL) 195.2 (±20.6) (104-289)
Insulin (mcU/mL) 26.2 (±3.2) (14.0-43.4)
ALT (U/L) 32.9 (±2.7) (21-43)
AST (U/L) 27.4 (±6.2) (13-79)
52
Table 2: Oligonucleotides used in qRT-PCR reactions, 5’ to 3’
Gene Forward primer Reverse primer
PPAR β/δ
AATGCCTACCTGAAAAACTT
CAAC
GTGCACGCTGATTCCTTGT
PPARγ1-3
AGGCCATTTTCTCAAAC AGAAATGCTGGAGAAGTCAAC
A
β-actin CCACGAAACTACCTTCAACT
CC
TCATACTCCTGCTGCTGCTTGC
TGATCC
53
Table 3: Expression of PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNA in various abdominal AT in obese and
non-obese subjects
Adipose tissue SAT RAT VAT p
PPARβ/δ (Mean±SE)
Obese 5.21±1.58 5.24±1.80 1.85±0.80 0.025
Non-obese 7.60±2.97 1.58±0.66 0.72±0.18 0.021
PPARγ1-3(Mean±SE)
Obese 6.48±2,93 4.07±0.97 3.36±1.25 NS
Non-obese 2.58±1.23 4.90±1.76 2.02±0.66 NS
To compare the expression pattern of PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNA in different abdominal
AT: subcutaneous (SAT), retroperitoneal (RAT) and visceral (VAT) tissues of morbidly obese or
non-obese subjects, relative expressions were normalized against β-actin (∆Ct) and the mean of
visceral adipose tissue (2
-∆∆Ct
). NS = Not Significant
54
Table 4: PPARβ/δ and PPARγ1-3 expression in morbidly obese compared to non-obese subjects
in different depots of AT .
Obese Non-obese p
PPARβ/δ (Mean±SE) (Mean±SE)
SAT 0.61±0.20 3.60±2.03 0.058
RAT 4.37±1.43 3.58±1.62 NS
VAT 1.27±0.50 8.68±4.18 0.094
PPARγ1-3 (Mean±SE) (Mean±SE)
SAT 5.60±2.45 1.19±0.27 0.022
RAT 0.34±0.08 2.59±1.03 0.034
VAT 1.31±0.51 1.62±0.57 NS
To obtain the relative quantity of PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNA in different abdominal AT:
subcutaneous (SAT), retroperitoneal (RAT) and visceral (VAT) of morbidly obese compared to
non-obese, relative expressions were normalized against β-actin (∆Ct) and the mean of each
respective non-obese adipose tissue (2
-∆∆Ct
). NS = Not Significant
55
PARTE III
56
3 DISCUSSÃO
A função de óleos e gorduras na nutrição humana tem sido intensamente pesquisada nas
últimas décadas. Não somente a quantidade, mas também a qualidade da gordura da dieta vêm
sendo discutidas em relação à obesidade, resistência à insulina e desenvolvimento de doenças
cardíacas (Semma, 2002; Bray et al 2002; Martin et al, 2004).
Os AG trans sempre estiveram presentes na alimentação humana, através do consumo de
alimentos provenientes de animais ruminantes. Entretanto, a substituição da gordura animal pela
gordura vegetal hidrogenada, aumentou significativamente a presença destes isômeros na dieta
humana (Feldman et al, 1996). No Brasil, a hidrogenação de óleos vegetais começou por volta
de 1960. Nos últimos anos, a indústria nacional de gordura hidrogenada esteve mais voltada para
o desenvolvimento de produtos que atendessem às necessidades da indústria de alimentos
(textura, estabilidade à oxidação e menor custo), sem se preocupar com os níveis de isômeros
trans (Basso et al, 1999).
Os isômeros trans podem ser incorporados aos tecidos e metabolizados de maneira
semelhante aos AG de configuração cis, competindo inclusive pelos mesmos sistemas
enzimáticos envolvidos na síntese de AG polinsaturados e eicosanóides (Mahfouz &
Kummerow, 1999). O TA é considerado um biomarcador apropriado para se determinar o
consumo de AG não sintetizados pelo organismo, como por exemplo, os AG trans. A
composição de AG, neste tecido, representa o consumo a longo prazo, refletindo a ingestão
destes durante meses e até anos (Garland et al, 1998).
57
Neste trabalho, nós utilizamos diferentes depósitos do TA: subcutâneo, retroperitoneal e
visceral de pacientes obesos submetidos à cirurgia bariátrica e pacientes não obesos submetidos a
cirurgias eletivas abdominais. O conteúdo total de AG trans foi medido através da
Espectroscopia de Infravermelho acoplado ao Acessório de Refletância Total Atenuada (Fourier
Transform Infrared - Attenuated Total Reflectance FTIR-ATR). A determinação dos isômeros
trans através de espectroscopia de infravermelho está baseada na vibração da deformação C-H
fora do plano característico da ligação trans que é absorvida na banda de 966 cm
-1
(Adam et al,
2000; Mossoba et al, 2004).
Os resultados da nossa pesquisa revelaram, em pacientes obesos, um maior depósito de
AG trans no TAV (8,74% ±0,29) do que no TAR (6,40% ±0,50), com uma diferença
significativa para p=0,001. No grupo de pacientes não obesos, também foi encontrada uma
diferença significativa no conteúdo de AG trans, comparando TAV (9,29% ±0,59) e TAS
(6,94% ±0,72; p=0,05). O TAR de pacientes não obesos não foi analisado, visto que a retirada
deste tecido não é protocolo das cirurgias abdominais eletivas. Ao se comparar obesos e não
obesos, não observamos diferença estatística na quantidade de AG trans depositada entre os
TAV, bem como entre TAR e TAS dos respectivos grupos.
No grupo de pacientes obesos, também foi analisada a concentração de AG trans no TAS
(6,52% ±0,69%, n=3). Entretanto, devido ao método cirúrgico aplicado (inúmeras vezes por
vídeolaparoscopia e por questões plásticas) o TAS não foi retirado, ocasionando um menor
número de amostras. Comparando-se o conteúdo de AG trans encontrado neste tecido com o
TAR, observamos quantidades similares, o que nos permite sugerir que o TAR se comporta de
forma semelhante ao TAS quanto ao depósito de AG trans.
O conteúdo de AG trans depositado nos diferentes TA dos pacientes obesos e não obesos
estudados foi elevado quando comparado com outros países. Na década de 80, na Suécia, Katan
e colaboradores (1986) e Van Staveren e colaboradores (1986) revelaram uma média de 4,9% de
AG trans total depositados no TAS (Katan et al, 1986; Van Staveren et al, 1986). Na antiga
58
União Soviética, Thomas e colaboradores (1983), analisando TAS de pacientes com óbito por
doença cardíaca isquêmica, encontraram 3,1% de AG trans total nestes indivíduos contra 3,3%
no grupo controle (Thomas et al, 1983). Nos EUA, em 1991, Hudgins e colaboradores
encontraram 4,1% de AG trans total no TAS de pacientes com risco para doença cardiovascular
(Hudgins et al, 1991). Também nos EUA, London e colaboradores (1991), analisando o TAS de
mulheres pós-menopausa, encontraram 4,3% de AG trans (London et al, 1991). Mamalakis e
colaboradores (2002), analisando TA abdominal (subcutâneo) e TA da região gluteal de crianças,
encontraram concentrações de AG trans de 1,8% ± 0,6% e 1,5% ± 0,4%, respectivamente
(Mamalakis et al, 2002). Também Dlouhý e colaboradores (2003), analisando TAS de pacientes
com aterosclerose na artéria coronária encontraram um total de 2,88 ± 1,19 % de AG trans neste
grupo de pacientes e 2,56 ± 0,89% no grupo controle (Dlouhý et al, 2003).
Fritsche e colaboradores (1998) constataram que os níveis de AG trans, no TA de
humanos, são usualmente maiores quando determinados por Espectroscopia de Infravermelho
(FTIR-ATR) do que por Cromatografia Gasosa. Eles encontraram, em TAS, 2,59 ± 0,20% de
AG trans total por cromatografia e 3,07 ± 0,27% por FTIR-ATR (Fritsche et al, 1998). O
método cromatográfico subestima o isômero trans C18:1 a favor do isômero cis C18:1 uma vez
que as bandas podem se justapor por essa metodologia. Apesar de a Cromatografia Gasosa
subestimar os valores deste AG, Garland e colaboradores (1998), utilizando este método,
encontraram no TAS de mulheres americanas níveis de AG trans total de 6,1% ± 1,3% (Garland
et al, 1998). Resultado que se aproxima aos valores encontrados neste trabalho para o tecido
subcutâneo, mesmo utilizando a técnica de FTIR-ATR. Observa-se que, na década de 90, em
outros países, os resultados ainda eram mais elevados, pois não existia uma política de redução
deste AG na indústria de alimentos. Acredita-se que, no futuro, tenhamos também este índice
reduzido.
O tecido adiposo retroperitoneal é ainda pouco estudado e não se tem relato da análise de
conteúdo de AG trans neste tecido. Abate e colaboradores (1994 e 1997) sugeriram que existem
59
diferenças metabólicas entre TAV e TAR e encontraram uma diminuição do TAR na obesidade
(Abate et al, 1994 e 1997). Dados da literatura mostram que o TAR se distingue do TAV por
suas conexões vasculares. Enquanto o TAV drena os AG para a veia porta, o TAR libera para a
veia cava, disponibilizando seus AG para a circulação sistêmica, como o TAS (Garg, 2004). Os
resultados encontrados neste trabalho nos permitem sugerir que o depósito de AG trans no TAR
dos pacientes obesos, comporta-se de maneira semelhante ao depósito destes AG no TAS,
possivelmente por questões vasculares.
Igualmente, revisando a literatura, não foi encontrada nenhuma pesquisa que
determinasse o conteúdo de AG trans no TAV, apesar de ser um tecido envolvido com a
síndrome metabólica. Nosso trabalho registrou níveis elevados de AG trans no TAV tanto de
pacientes obesos quanto não obesos. Estudos in vitro revelaram que os adipócitos viscerais são
lipoliticamente mais ativos do que os adipócitos subcutâneos (Mauriege et al, 1987; Rebuffe-
Scrive et al, 1989) e que in vivo liberam AG direto para a veia porta (Garg, 2004). Nielsen e
colaboradores (2004), avaliando o efeito da lipólise do TAV em obesos e não obesos, concluíram
que obesos contribuem com um maior aporte de AG para a circulação porta, provavelmente pelo
aumento da massa de tecido adiposo e subseqüente lipólise (Nielsen et al, 2004).
O acúmulo de TA dentro da cavidade abdominal, ou obesidade visceral, tem sido
associado a uma série de alterações metabólicas como resistência à insulina, hiperinsulinemia,
elevado níveis de triglicerídeos, baixo HDL e hipertensão como principais características (Expert
Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults; Arner,
1995). Como os AG trans estão envolvidos na modulação do perfil lipídico, na resistência a
insulina (Ibrahim et al, 2005; Risérus, 2006) e na hipertensão (Mozaffarian, 2006), pode-se
sugerir que um maior depósito destes AG graxos na cavidade abdominal dos pacientes obesos
pode estar relacionado às complicações metabólicas da obesidade. Para confirmar esta sugestão,
mais estudos devem ser realizados.
60
Visto que os AG trans não são sintetizados pelo organismo humano, ou seja, são
provenientes da dieta, nossos resultados também apontam para um alto consumo de produtos
alimentícios ricos nestes AG na população estudada. Trabalhos mostram que, com o
desenvolvimento das técnicas de hidrogenação, a gordura vegetal hidrogenada desbancou
rapidamente o consumo de gordura animal na dieta do povo Brasileiro (Martin et al, 2005).
Segundo Larqué e colaboradores (2001), os alimentos contendo gordura vegetal hidrogenada
contribuem, atualmente, com cerca de 80% a 90% da ingestão diária de AG trans. Nos alimentos
provenientes de animais ruminantes, esta contribuição é bem menor, sendo estimada em torno de
2% a 8% (Larqué et al, 2001). Os óleos refinados apresentam níveis razoavelmente pequenos
(1,0-1,5%) de AG trans, mas a reutilização, principalmente no preparo de alimentos fritos, pode
tornar significativa a sua contribuição na ingestão de AG trans (Aro et al, 1998).
Estudos conduzidos no Brasil mostram que alimentos como margarinas (Soares &
Franco, 1990), biscoitos (Martin et al, 2005), batata frita, massa, sorvete, bolos e outros
alimentos que utilizam gordura vegetal hidrogenada para sua manufatura (Azevedo, 1999)
apresentam altos níveis de AG trans. Basso e colaboradores (1999) e Azevedo (1999)
mostraram ainda que o conteúdo de AG trans em gordura vegetal hidrogena manufaturada no
nosso país apresenta altos níveis desses AG, variando de 30 a 50% de AG trans. Analisando
esses dados, pode-se sugerir que o consumo de AG trans pela população brasileira é elevado
(Martin et al, 2004)
.
Recentemente, em países da Europa e da América do Norte, vem sendo observada uma
diminuição do percentual de AG trans na dieta, provavelmente por modificações no
processamento industrial das gorduras ou por mudanças comportamentais dos consumidores na
escolha de alimentos. Produtos alimentícios desses países estão sendo reformulados para que
fiquem livres ou com baixo teor de gordura trans (Craig-Schmidt, 2006). No Brasil, como
medida de redução na dieta, está sendo exigida a rotulagem dos níveis de trans em todos os
61
alimentos industrializados (Brasil, RDC n° 360). Entretanto, não existe ação efetiva na redução
destes isômeros nos alimentos.
Os mecanismos pelos quais os AG trans exercem seus efeitos deletérios à saúde ainda
não estão elucidados. Acredita-se que estes AG influenciam na alteração das propriedades físico-
química das membranas, controle da expressão de genes e conseqüente modificação do
metabolismo de lipídeos e carboidratos (Risérus, 2006). Trabalhos utilizando AG provenientes
da dieta, como por exemplo, AG trans, podem regular a expressão de genes envolvidos no
metabolismo, principalmente de lipídeos e da glicose (Clarke, 2001; Pegorier et al, 2004).
Saravanan e colaboradores (2005) mostraram que a ingestão de AG trans em ratos altera
negativamente a expressão gênica do PPAR-γ no TA (Saravanan et al, 2005). Além disso,
trabalhos mostram que diferentes AG como saturados, PUFA, alguns eicosanóides análogos aos
AG trans (15-deoxi-∆-prostaglandina J2, leucotrieno B4), são ligantes potentes dos PPARs
(Pegorier et al, 2004; Desvergne & Wahli, 1999).
Na segunda fase deste trabalho, analisamos a expressão de PPARβ/δ e PPARγ1-3 nos
diferentes depósitos de TA (TAS, TAR e TAV) tanto em obesos mórbidos e não obesos.
Avaliamos se estes receptores nucleares são modulados na obesidade mórbida, comparando com
a expressão destes em indivíduos não obesos.
Os receptores nucleares (PPARs) controlam a expressão de vários genes que são cruciais
no metabolismo de lipídeos e da glicose (Wahli et al, 1995; Kota et al, 2005). Na última década,
pesquisas envolvendo estes receptores têm proposto novos mecanismos para a regulação do
metabolismo de lipídeos e seu papel como possível determinante molecular de desordens
metabólicas como DM2 e obesidade (Kota et al, 2005).
A obesidade e suas complicações, além de estarem associadas a distúrbios do
metabolismo de lipídeos e da glicose, sofrem a influência do tipo e distribuição de tecido adiposo
(Shen et al, 2003). Este tecido possui depósitos regionais específicos com distintas funções
62
fisiológicas (Ross et al, 1996) e por esse motivo, existe um intenso e crescente interesse em
entender estes compartimentos regionais (Shen et al, 2003).
Poucas informações estão disponíveis a respeito da expressão de PPARs nos diferentes
depósitos de tecido adiposo humano (Giusti et al, 2003). Revisando a literatura, foi possível
constatar que não existem dados referentes à expressão PPARβ/δ nesses depósitos. Os resultados
encontrados neste trabalho, demonstram uma variação no padrão de expressão do PPARβ/δ em
TAS, TAR e TAV tanto em pacientes obesos quanto não obesos. Analisando o grupo de obesos,
observamos uma diminuída expressão deste receptor nuclear no TAV (1.85 ± 0.80; p=0.025)
comparado ao TAS (5.21 ± 1.58) e TAR (5.24 ± 1.80). Avaliando o grupo de não obesos,
também, encontramos uma variação nos níveis de mRNA do PPARβ/δ, sendo o TAS, o que
apresentou uma pronunciada expressão deste receptor (7.60 ± 2.97; p=0.021), sem haver
diferença estatística na expressão no TAR (1.58 ± 0.66) e TAV (0.72 ± 0.18).
Levando em consideração que o PPARβ/δ é um fator de transcrição, que modula genes
envolvidos na oxidação de AG e dissipação energética no TA, pode-se sugerir que os pacientes
não obesos apresentam uma série de genes oxidativos aumentados no TAS, e, com isso,
controlando o depósito de lipídeo neste tecido. Nos indivíduos obesos, a menor expressão de
mRNA observada no TAV pode estar relacionada com o acúmulo de lipídeos neste tecido,
resultando nas co-morbidades associadas à obesidade. Estas conclusões se baseiam nos estudos
que utilizam agonista específico de PPARβ/δ em modelos experimentais, o GW501516. Estudos
que utilizam este agonista revelam poderosas funções deste receptor sobre o metabolismo do TA
e controle de peso (Evans et al, 2004; Barish et al, 2006; Luquet et al, 2005; Wang et al, 2003).
Em modelo celular e animal, o GW501516 apresentou eficiência terapêutica na síndrome
metabólica, pois aumentou o consumo de AG no músculo esquelético e no tecido adiposo
(Luquet et al, 2005; Tanaka et al, 2003). Este agonista está, atualmente, sendo testado para uso
em humanos no tratamento da dislipidemia e, futuramente, no da obesidade, da resistência à
insulina e da inflamação vascular (Gross et al, 2005). No entanto, apesar de nossos resultados
63
revelarem uma diferença na expressão deste receptor nuclear nos diferentes TA, outras
investigações serão necessárias para esclarecer sua ação no controle da lipólise.
Além da expressão de PPARβ/δ, nós analisamos o padrão de expressão do PPARγ1-3 nos
diferentes depósitos de tecido adiposo em obesos mórbidos e não obesos. O PPARγ é um fator
de transcrição encontrado principalmente nos adipócitos e está ligado à adipogênese, à regulação
da homeostase de lipídeos e da glicose (Rangwala & Lazar, 2004). A transcrição do PPARγ pode
ser induzida no tecido adiposo em resposta à hiperinsulinemia ou à dieta rica em gordura
(Grimaldi, 2001). Nossos resultados demonstram que o padrão de expressão de PPARγ1-3, nos
TAS, TAR e TAV de indivíduos obesos e não obesos, não variam estatisticamente, ou seja, a
expressão deste receptor nuclear é similar entre os depósitos de tecido adiposo estudado nesses
dois grupos de pacientes.
Ao contrário do PPARβ/δ, já existem dados na literatura referentes ao padrão de
expressão do PPARγ e suas isoformas no tecido adiposo. Estudos prévios, realizados por outros
autores, revelam intensidade similar na quantificação da expressão de PPARγ total nos TAS e
TAV (Vohl et al, 2004). Lefevre e colaboradores (1998) e Montague e colaboradores (1998) não
encontraram diferenças entre a expressão de PPARγ total em TA omental (visceral) e subcutâneo
em pacientes obesos (Lefevre et al, 1998; Montague et al, 1998).
Dados a respeito da expressão das isoformas de PPARγ (γ1 e γ2) no TAS e TAV
apresentam resultados conflitantes. Muitos autores concluem que o PPARγ1 é expresso em
níveis mais altos do que o PPARγ2 no TAS e TAV (Auboeuf et al, 1997; Sewter et al, 2002,
Yanase et al, 1997). Em contraste, Giusti e colaboradores (2003) encontraram que o PPARγ2 é
mais abundante que o PPARγ1 na gordura subcutânea e visceral. Em adição, o nível de PPARγ1,
nestes dois depósitos, está implicado na variabilidade da medida da cintura, e esta isoforma pode
ainda estar associada aos níveis plasmáticos de insulina (Giustie et al, 2003). O PPARγ3, uma
terceira isoforma identificada, é também expressa no tecido adiposo (Kota, 2005). Porém, dados
sobre a distribuição desta isoforma nos diferentes depósitos de tecido adiposo e sua associação
64
com a obesidade, ainda, não estão disponíveis. Salientamos que, em nossa pesquisa, foi
determinado o padrão de expressão do PPARγ1 e PPARγ3 (PPARγ1-3) que encodam a mesma
proteína (Kota, 2005). Desta forma, podemos sugerir que os TAS, TAR e TAV apresentam a
mesma capacidade adipogênica no que depender destas isoformas de PPARγ (1-3) tanto nos
tecidos dos pacientes obesos mórbidos quanto não obesos. Porém, outras abordagens
experimentais precisam ser realizadas para constatar esta hipótese.
Para investigar se a obesidade modula a expressão de PPARs, nós analisamos a expressão
PPARγ1-3 e PPARβ/δ em pacientes obesos mórbidos comparados a pacientes não obesos nos
distintos depósitos de TA (TAS, TAR, e TAV). Pela primeira vez, foi analisada a expressão de
PPARγ1-3 e PPARβ/δ no tecido adiposo retroperitoneal. A gordura retroperitoneal representa de
18 a 33% do volume de tecido intra-abdominal e parece involuir com o desenvolvimento da
obesidade (Abate et al, 1995; Abate et al, 1994).
Nossos resultados mostraram que a expressão do PPARβ/δ não varia estatisticamente
entre obesos e não obesos no TAR. No entanto, a expressão do PPARγ1-3 mostrou-se diminuída
nos pacientes obesos mórbidos neste tecido. Dados de correlação revelaram que a expressão de
PPARγ1-3 em TAR de obesos mórbidos correlaciona negativamente com a medida da cintura
(r=-1.000, p< 0.001) e do quadril (r=-0.900, p=0.037). Esses dados indicam que a diminuída
expressão de PPARγ1-3 no TAR está relacionada fortemente com a obesidade. Além disso,
estudos de adiposidade encontraram que a gordura intra-abdominal é regulada pela obesidade.
Indivíduos magros apresentaram 58% da massa de gordura visceral e 42% da massa de gordura
retroperitoneal, enquanto que indivíduos obesos apresentaram 69% e 31% respectivamente. Essa
variabilidade parece ser principalmente devido a fatores anatômicos, assim como à reduzida
atividade metabólica do TAR (Abate et al, 1994). Levando em consideração que o PPARγ regula
a adipogênese, os dados citados acima corroboram com a diminuída expressão de PPARγ1-3
encontrada no grupo de obesos mórbidos.
65
Nossos resultados apresentaram ainda uma reduzida expressão de PPARβ/δ no TAS
(p=0.058) de pacientes obesos mórbidos comparados a não obesos, e uma tendência à
diminuição da expressão deste receptor nuclear no TAV (p= 0.094) do grupo de obesos.
Diferentemente, a expressão de PPARγ1-3 mostrou-se aumentada no TAS (p=0.022) de
pacientes obesos mórbidos e não houve diferença estatística na expressão deste receptor entre
TAV de pacientes obesos mórbidos comparados a não obesos. Assim, no TAS dos obesos
mórbidos, o aumento da expressão de PPARγ1-3 contra a diminuição de PPARβ/δ pode
justificar o aumento de massa adiposa subcutânea nestes indivíduos. Por outro lado, a não
diferença na expressão do PPARγ1-3 no TAV, entre obesos ou não obesos, sugere que ambos os
grupos estão suscetíveis ao aumento deste tecido. Este fato é observado na clínica, pois o
aumento de gordura visceral pode existir independente do grau de obesidade. Entretanto, no caso
do obeso mórbido, a tendência em diminuir a expressão do receptor PPARβ/δ no TAV pode
agravar esta patologia.
Dados da literatura a respeito da expressão de PPARs comparando obesos e não obesos
não relatam diferença estatística na expressão destes (Auboeuf et al, 1997; Vidal et al, 1997;
Krempler et al, 2000). Entretanto, esses estudos utilizaram (RT-PCR e Northen Blots) técnicas
semiquantitativas para medir mRNA. No nosso trabalho utilizamos o PCR em tempo real,
técnica quantitativa, bem mais sensível, para analisar a expressão dos receptores nucleares, o que
pode justificar as diferenças encontradas com dados prévios da literatura.
Além disso, nossos cálculos de correlação reforçam que a modulação destes receptores
nucleares está associada à obesidade. A expressão de PPARγ1-3 no TAV está relacionada
fortemente com a medida da cintura (r=0.900, p=0.037). Também a expressão diminuída de
PPARβ/δ no TAS correlacionou negativamente com a medida do quadril (r=-0.886, p=0.019), e
possui uma forte tendência de correlacionar, também negativamente, com a medida da cintura
(r=-0.771, p=0.072). Interessantemente, nossos dados revelam que a expressão de PPARβ/δ no
TAV de obesos está relacionado negativamente com os níveis de insulina encontrado nestes
66
pacientes (r=-0.900, p=0.037). Observando-se os dados de correlação e a diminuída expressão de
PPARβ/δ, pode-se sugerir, futuramente, o uso do agonistas, como por exemplo GW501516, no
tratamento da obesidade e da resistência à insulina.
O aumento da expressão de PPARγ1-3 encontrada no TAS de obesos mórbidos está de
acordo com o paradoxo das TZD (Fonseca, 2003). As TZD são ligantes de PPARγ e o efeito
benéfico deste fármaco parece estar ligado à ativação deste receptor nuclear e estímulo da
adipogênese (Spiegelman, 1998). Em humanos, as TZD mostraram aumentar a massa de tecido
adiposo subcutâneo e com efeito reduzido no visceral, resultando em ganho de peso (Albrektsen
et al, 2002; Akazawa et al, 2000; Nakamura et al, 2001). Diversos estudos têm tentado elucidar
o mecanismo do aparente paradoxo da TZD que, enquanto melhora a resistência à insulina, causa
simultaneamente ganho de peso (Fonseca, 2003). Buch e colaboradores (2002) mostraram que,
em obesos mórbidos, além do aumento de peso, ainda ocorre edema periférico (Buch et al,
2002).
Como já foi relatado, os AG podem modular a transcrição de genes. Desta forma,
podemos inferir que a elevada concentração de AG trans no TAV dos indivíduos estudados,
esteja modulado negativamente a expressão de PPARβ/δ. Além disso, este AG depositado no TA
pode estar ativando a transcrição do PPARγ1-3, motivo pelo qual não observamos diferença
significativa de expressão entre os tecidos estudados. Entretanto, mais estudos são necessários
para validar esta observação.
Trabalhos indicam ainda, que na obesidade pode ocorrer um disbalanço de genes
relacionados ao metabolismo (Baranova et al, 2005; Lee et al, 2005; Von Eyben et al, 2004).
Um estudo em obesos mórbidos revelou que genes relacionados ao metabolismo de lipídeos e da
glicose, transporte de membrana e genes promotores do ciclo celular estão 85,5% regulados
positivamente e 14,5% regulados negativamente (Baranova et al, 2005). Através desses
resultados, pode-se sugerir que a expressão diferencial dos PPARs, na obesidade, esteja
obedecendo a este disbalanço encontrado por outros autores. E, não podemos deixar de citar que,
67
possivelmente, este disbalanço na expressão de genes associados com o metabolismo de lipídeos
e da glicose, obedeça à regionalidade do tecido adiposo, se subcutâneo, retroperitoneal ou
visceral.
68
4 CONCLUSÕES
Os resultados encontrados neste trabalho apontam para as seguintes conclusões:
- Altos níveis de AG trans foram encontrados nos tecidos adiposos analisados tanto em
obesos quanto não obesos;
- O TAV apresentou maior concentração de AG trans que os depósitos TAS e TAR nos
dois grupos de pacientes estudados;
- Com os altos níveis de AG trans encontrados, pode-se sugerir um elevado consumo
destes AG na população estudada;
- O perfil de expressão do PPARβ/δ, nos diferentes depósitos de tecido adiposo
estudados, apresentou variações tanto em obesos quanto em não obesos;
- O perfil de expressão do PPARγ1-3, nos diferentes depósitos de tecido adiposo, não
variou no grupo de obesos e no de não obesos;
- Comparando a expressão de PPARβ/δ nos diferentes depósitos de tecido adiposo, pode-
se concluir que em obesos, o TAV apresentou o menor nível de expressão, enquanto que não
houve diferença entre TAS e TAR. E, em não obesos, o TAS apresentou maior nível de
expressão e não houve diferença entre TAR e TAV;
- Analisando a expressão do PPARβ/δ entre obesos e não obesos, pode-se observar uma
diminuída expressão deste receptor em TAS e TAV de obesos. A expressão de PPARγ1-3, por
outro lado, mostrou-se aumentada no TAS e diminuída no TAR de obesos.
- Os níveis de expressão do PPARβ/δ e PPARγ1-3 correlacionaram negativamente com
dados antropométricos dos pacientes obesos, fortificando sua relação com a obesidade. O
69
receptor PPARβ/δ correlacionou ainda com os níveis de insulina destes pacientes, apontando
para uma associação na modulação.
70
5 PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos neste trabalho apontam para um alto depósito de AG trans no
tecido adiposo, tanto de obesos quanto de não obesos. Também apontam para uma regulação
diferente dos PPARs na obesidade. No entanto, muitas questões ainda necessitam ser
esclarecidas, as quais geram as seguintes perspectivas de trabalho:
1. Estudar a influência direta de AG trans sobre o controle do metabolismo dos
adipócitos, através da expressão do mRNA dos PPARs e da tradução das respectivas
proteínas destes;
2. Estudar se esta influência respeita a regionalidade do tecido adiposo;
3. Avaliar se a modulação dos PPARs, via AG trans, é influenciada pela obesidade.
71
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89
ANEXO 1 – LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 1. Representação do ácido graxo oléico, elaídico e esteárico .........................................18
Figura 2. Mecanismo de transcrição gênica de PPARs.............................................................22
CAPÍTULO 1
Figure 1. Individual distribution of total TFA in different tissues of obese and non-obese
patients .....................................................................................................................................32
90
ANEXO 2 – LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Table 1. Content of trans fatty acids in subcutaneous, retroperitoneal and visceral adipose tissue
of obese and non-obese individuals. ..........................................................................................33
CAPÍTULO 2
Table 1. Anthropometric and biological parameters of morbidly obese patients........................51
Table 2. Oligonucleotides used in qRT-PCR reactions, 5’ to 3’ ................................................52
Table 3. Expression of PPARβ/δ and PPARγ1-3 mRNA in various abdominal AT in obese and
non-obese subjects ....................................................................................................................53
Table 4. PPARβ/δ and PPARγ1-3 expression in morbidly obese compared to non-obese subjects
in different depots of AT ..........................................................................................................54
91
ANEXO 3
Termo de Consentimento Informado
O projeto de pesquisa intitulado: “Análise e quantificação dos ácidos graxos trans
depositados no tecido adiposo” será realizado através do Departamento de Bioquímica do ICBS
da UFRGS, em parceria com o Instituto de Química, da PUC-RS, o Centro de Obesidade
Mórbida, do Centro Clínico do Hospital São Lucas da PUC e Centros de Cirurgias
Reconstrutivas.
O tecido adiposo ou gorduroso, utilizado nesta pesquisa, habitualmente descartado, será
obtido por procedimentos cirúrgicos executados nos Hospitais São Lucas da PUC-RS , Moinhos
de Ventos, Divina Providência etc. Os pesquisadores responsáveis são: Dra. Regina Maria Vieira
da Costa Guaragna, Dr. André Arigony Souto, Dr. Cláudio Corá Mottin, Dra. Sirlei Costa, Cíntia
Reis e Josiane Bortolotto.
Esta pesquisa tem por objetivo geral determinar quantitativamente os ácidos graxos trans
(lipídeo) depositados no tecido adiposo, numa amostra da população porto alegrense. Também
tem por objetivos específicos: 1- analisar a possível correlação da quantidade de ácidos graxos
trans no tecido adiposo com o tipo de dieta; 2- analisar a possível correlação da quantidade de
ácidos graxos trans com certas doenças. Este trabalho também tem objetivo acadêmico, pois se
trata de tema da tese de mestrado e trabalhos de Iniciação Científica das alunas Josiane
Bortolotto e Cíntia Reis.
O presente estudo utilizará tecido gorduroso retirado e descartado de cirurgias plásticas,
de redução de mama, lipoaspiração e gastroplastia. Os pacientes são previamente informados
pelo médico cirurgião a respeito dos procedimentos, sendo a cirurgia de livre escolha dos
pacientes. O processo de análise laboratorial dos ácidos graxos trans não envolve nenhum risco
de vida para os pacientes.
Os participantes do estudo aderirão ao mesmo voluntariamente, podendo a sua
participação ser interrompida em qualquer etapa, sem nenhum prejuízo ou punição. A qualquer
momento, os participantes poderão solicitar informações sobre os procedimentos ou outros
assuntos relacionados a este estudo. Todos os cuidados serão tomados para garantir o sigilo e a
confidencialidade das informações, preservando a identidade dos participantes. Haverá
divulgação dos resultados, de forma coletiva através de comunicações científicas, para as
instituições envolvidas na pesquisa e comunidade científica.
Desde já, agradecemos sua contribuição para o desenvolvimento desta atividade de
pesquisa e colocamo-nos à disposição para esclarecimentos adicionais.
------------------------------------------------------
Regina Maria Vieira da Costa Guaragna
Coordenadora do Projeto. Depto Bioquímica UFRGS
Telefone: 3332-2129/9984-4286
92
Eu, ------------------------------------------------------------------------------------------fui informado dos
objetivos especificados acima e da justificativa desta pesquisa de forma clara e detalhada. O
presente estudo utilizará tecido adiposo que será descartado durante a cirurgia, executada por
meu livre arbítrio. Recebi informações específicas sobre cada procedimento no qual estarei
envolvido, tanto quanto dos benefícios esperados. Todas as minhas dúvidas foram respondidas
com clareza e sei que poderei solicitar novos esclarecimentos a qualquer momento. Além disto,
sei que novas informações obtidas durante o estudo me serão fornecidas e que terei liberdade de
retirar meu consentimento de participação na pesquisa. Fui informado também que caso existam
gastos adicionais, estes serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.
Frente ao que foi acima exposto, expresso meu consentimento em relação à execução desta
pesquisa, no que se refere à coleta e análise do tecido adiposo.
______________________________, ______ de _____________ de 2005.
________________________________________________________
Assinatura do voluntário
93
Termo de Consentimento Informado
O projeto de pesquisa intitulado: “Análise e quantificação dos ácidos graxos trans
depositados no tecido adiposo e o efeito destes ácidos na indução da expressão do receptor
ativador da proliferação de peroxissomos (PPAR)” será realizado através do Departamento de
Bioquímica do ICBS da UFRGS, em parceria com o Centro de Obesidade Mórbida, do Centro
Clínico do Hospital São Lucas da PUC e Centros de Cirurgias Reconstrutivas.
O tecido adiposo ou gorduroso, utilizado nesta pesquisa, habitualmente descartado, será
obtido por procedimentos cirúrgicos executados nos Hospitais São Lucas da PUC-RS , Moinhos
de Ventos. Os pesquisadores responsáveis são: Dra. Regina Maria Vieira da Costa Guaragna, Dr.
André Arigony Souto, Dr. Cláudio Corá Mottin, Dra. Sirlei Costa, Ângela C.B. Ferreira e
Josiane Bortolotto.
Esta pesquisa tem por objetivo geral determinar quantitativamente os ácidos graxos trans
(lipídeo) depositados no tecido adiposo, numa amostra da população porto alegrense e verificar a
ação reguladora dos AG trans sobre a expressão dos PPARs nas células adiposas de indivíduos
obesos e não obesos. Também tem por objetivos específicos: 1- analisar a possível correlação da
quantidade de ácidos graxos trans no tecido adiposo com o tipo de dieta; 2- analisar a possível
correlação da quantidade de ácidos graxos trans com certas doenças. Este trabalho também tem
objetivo acadêmico, pois se trata de tema da tese de mestrado e trabalhos de Iniciação Científica
das alunas Josiane Bortolotto e Ângela Ferreira.
O presente estudo utilizará tecido gorduroso retirado e descartado de cirurgias plásticas,
de redução de mama, lipoaspiração e gastroplastia. Os pacientes são previamente informados
pelo médico cirurgião a respeito dos procedimentos, sendo a cirurgia de livre escolha dos
pacientes. O processo de análise laboratorial dos ácidos graxos trans e dos PPARs não envolve
nenhum risco de vida para os pacientes.
Os participantes do estudo aderirão ao mesmo voluntariamente, podendo a sua
participação ser interrompida em qualquer etapa, sem nenhum prejuízo ou punição. A qualquer
momento, os participantes poderão solicitar informações sobre os procedimentos ou outros
assuntos relacionados a este estudo. Todos os cuidados serão tomados para garantir o sigilo e a
confidencialidade das informações, preservando a identidade dos participantes. Haverá
divulgação dos resultados, de forma coletiva através de comunicações científicas, para as
instituições envolvidas na pesquisa e comunidade científica.
Desde já, agradecemos sua contribuição para o desenvolvimento desta atividade de
pesquisa e colocamo-nos à disposição para esclarecimentos adicionais.
------------------------------------------------------
Regina Maria Vieira da Costa Guaragna
Coordenadora do Projeto. Depto Bioquímica UFRGS
Telefone: 3332-2129/9984-4286
94
Eu, ------------------------------------------------------------------------------------------fui informado dos
objetivos especificados acima e da justificativa desta pesquisa de forma clara e detalhada. O
presente estudo utilizará tecido adiposo que será descartado durante a cirurgia, executada por
meu livre arbítrio. Recebi informações específicas sobre cada procedimento no qual estarei
envolvido, tanto quanto dos benefícios esperados. Todas as minhas dúvidas foram respondidas
com clareza e sei que poderei solicitar novos esclarecimentos a qualquer momento. Além disto,
sei que novas informações obtidas durante o estudo me serão fornecidas e que terei liberdade de
retirar meu consentimento de participação na pesquisa. Fui informado também que caso existam
gastos adicionais, estes serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.
Frente ao que foi acima exposto, expresso meu consentimento em relação à execução desta
pesquisa, no que se refere à coleta e análise do tecido adiposo.
______________________________, ______ de _____________ de 200__ .
________________________________________________________
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