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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO DA MATURAÇÃO NUCLEAR
E DE ANTIOXIDANTES SOBRE A MATURAÇÃO OOCITÁRIA,
FECUNDAÇÃO E DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO BOVINO IN
VITRO.
Pós-Graduanda: Letícia Siqueira de Sá Barretto
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Gisele Zoccal Mingoti
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como
parte das exigências para obtenção do título de
Doutor em Medicina Veterinária (Reprodução Animal).
Jaboticabal - SP
Fevereiro - 2007
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Barretto, Letícia Siqueira de Sá
B274a Avaliação dos efeitos da inibição da maturação nuclear e de
antioxidantes sobre a maturação oocitária, fecundação e
desenvolvimento embrionário bovino in vitro / Letícia Siqueira de Sá
Barretto. – – Jaboticabal, 2007
xxiv, 88 f. : il. ; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, 2007
Orientadora: Gisele Zoccal Mingoti
Banca examinadora: Joaquim Mansano Garcia, César Roberto
Esper, Cláudia Lima Verde Leal, Flávio Vieira Meirelles
Bibliografia
1. Maturação in vitro. 2. Reprodução Animal. 3. Bovinos. I. Título.
II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:612.6:636.2
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e
Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e
Documentação.
e-mail: [email protected]
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iii
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
LETÍCIA SIQUEIRA DE SÁ BARRETTO – nascida em São Paulo – SP, aos 18 dias do
mês de Setembro de 1975; concluiu o ensino médio na Escola Logos de 1º e 2º Graus,
na cidade de São Paulo – SP, em dezembro de 1993. Ingressou no curso de
Graduação em Medicina Veterinária no Centro de Ciências Agroveterinárias – CAV da
Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC em Lages – SC, em agosto de
1995. Concluiu o curso superior em Medicina Veterinária em julho de 2000. Ingressou
no curso de pós-graduação, ao nível de Mestrado, sob orientação da Profª Drª Gisele
Zoccal Mingoti, no Programa de Medicina Veterinária, Área de Concentração em
Reprodução Animal, na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Câmpus de
Jaboticabal da Universidade Estadual Paulista – UNESP, em março de 2001, com bolsa
de mestrado da FAPESP, e concluiu, em fevereiro de 2003, com a defesa da
Dissertação “Avaliação dos efeitos do 3-isobutil-1-metil-xantina (IBMX) e da roscovitina
sobre a maturação nuclear, momento de fecundação e competência no
desenvolvimento embrionário de oócitos bovinos”. Ingressou no curso de pós-
graduação, ao nível de Doutorado, sob orientação da Profª Drª Gisele Zoccal Mingoti,
no Programa de Medicina Veterinária, Área de Concentração em Reprodução Animal,
na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Câmpus de Jaboticabal da
Universidade Estadual Paulista – UNESP, em março de 2003, com bolsa de doutorado
da FAPESP.
iv
EPÍGRAFE
“Dá seu primeiro passo com fé.
Não é necessário que veja todo o caminho completo.
Só dê seu primeiro passo...”
(Martin Luther King Jr.)
v
DEDICATÓRIA
Dedico ao meu amor Edson, pela compreensão
e apoio incondicional.
E aos meus pais, Jorge Antônio Freire de Sá
Barretto e Elba Siqueira de Sá Barretto, pela
paciência, apoio e confiança em mim depositados.
vi
AGRADECIMENTOS
À Prof
a
Dr
a
Gisele Zoccal Mingoti, pela orientação, ensinamentos,
disponibilidade, amizade, confiança e dedicação.
Ao Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia, pela paciência e disposição em ajudar.
Exemplo a ser seguido em busca do conhecimento.
Ao Prof. Dr. César Roberto Esper pelos conhecimentos transmitidos e pelas
sugestões na defesa.
À Prof
a
Dr
a
Cláudia Lima Verde Leal e ao Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles pela
disponibilidade em participar da defesa e sugestões.
Ao Prof. Dr. Francisco Guilherme Leite, Prof. Dr. Gilson Hélio Toniollo, Prof. Dr.
Paulo Henrique Franceschini pela participação e sugestões na qualificação.
À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal da Universidade
Estadual Paulista, e ao departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução
Animal – DRA pela oportunidade oferecida.
À Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba da Universidade Estadual
Paulista, e ao departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal pelas instalações e
condições de trabalho.
A Profª. Drª. Sílvia Helena Venturoli Perri e ao veterinário e amigo Ricardo
Bertolla pelo auxílio na análise estatística.
vii
Aos demais professores do DRA, , Prof
a
Dr
a
Vera Fernanda Martins Hossepian
de Lima e Prof. Dr. Wilter Ricardo Russiano Vicente, pela amizade, interesse e
conhecimentos transmitidos.
Aos funcionários do DRA, em especial à Roberta Vantini e Isabel Aparecida
Penariol Natarelli pela disponibilidade em ajudar. E ao funcionário Adão da UNESP de
Araçatuba pela disponibilidade em buscar o material de trabalhado necessário aos
experimentos.
Ao meu amor e companheiro Edson, pela paciência, ensinamentos, amizade,
apoio e disponibilidade sempre!
À grande amiga Viviane Sgobbi Dias, pelo companheirismo, amizade e
cumplicidade durante esses anos.
Aos pós-graduandos Simone Cristina Méo, Alexandre Wolf, Karina Beloti Avelino,
Tatiane Drummond Tetzner, Naiara Zoccal Saraiva, Fernanda da Silva Gonçalves,
Christina Ramires Ferreira e Felipe Perecin pela amizade e disponibilidade em ajudar.
Aos demais pós-graduandos do DRA, Ana Paula Perini, Andréa Basso, Eric
Caiado Castro, Juliana Borges Correa, Lorivaldo Paz Landim Jr, Max Vitória Resende,
pelo convívio e amizade.
Às amigas Elaine e Catarina Piffer Gonçalves, Patrícia Helena Miguez e Tatiana
Catta Preta, por estar sempre presentes nas dificuldades e conquistas.
À Deus, por me mostrar que caminho seguir...
viii
APOIO FINANCEIRO
Esse projeto foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo – FAPESP, sob processo nº 04/13148-7. Bolsa concedida pela FAPESP,
sob processo n
o
03/06928-5 no período de dezembro de 2003 a novembro de 2006.
ix
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... ..xiii
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................xvi
LISTA DE ABREVIATURAS..........................................................................................xviii
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO DA MATURAÇÃO NUCLEAR E DE
ANTIOXIDANTES SOBRE A MATURAÇÃO OOCITÁRIA, FECUNDAÇÃO E
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO BOVINO IN VITRO........................................xxi
EFFECTS OF NUCLEAR MATURATION INHIBITION AND ANTIOXIDANTS ON
OOCYTE MATURATION, FERTILIZATION AND BOVINE EMBRYONIC
DEVELOPMENT IN VITRO............................................................................................xxiii
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................1
Introdução.....................................................................................................................1
Objetivos...................................................................................................................... 3
Revisão da Literatura.................................................................................................. 4
Maturação de oócitos em mamíferos .............................................................................4
Inibidores da maturação in vitro de oócitos ....................................................................6
Antioxidantes..................................................................................................................8
Apoptose ....................................................................................................................... 10
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................11
CAPÍTULO 2 – MATURAÇÃO NUCLEAR, DISTRIBUIÇÃO DE GRÂNULOS
CORTICAIS E CONCENTRAÇÃO INTRAOOCITÁRIA DE GLUTATIONA EM
OÓCITOS TRATADOS COM INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E
ANTIOXIDANTES........................................................................................................19
Resumo .......................................................................................................................19
Introdução...................................................................................................................20
Material e Métodos .....................................................................................................22
x
Obtenção dos oócitos...................................................................................................22
Seleção dos oócitos .....................................................................................................22
Maturação dos oócitos .................................................................................................22
Métodos de coloração..................................................................................................23
Coloração com gel Mowiol-Hoechst .............................................................................23
Coloração de grânulos corticais ...................................................................................24
Mensuração da concentração intraoocitária de glutationa dos oócitos maturados ......25
Construção da curva padrão da concentração de GSH...............................................26
Delineamento experimental..........................................................................................27
Experimento I: Cinética da Maturação Nuclear ............................................................28
Experimento II: Cinética da Maturação Citoplasmática ................................................28
Experimento III: Determinação da Concentração Intraoocitária de Glutationa.............29
Análise Estatística........................................................................................................29
Resultados..................................................................................................................29
Experimento I – Cinética da Maturação Nuclear ..........................................................29
Experimento II – Cinética da Maturação Citoplasmática..............................................33
Experimento III – Determinação da Concentração Intraoocitária de Glutationa...........36
Discussão ...................................................................................................................37
Experimento I – Cinética da Maturação Nuclear ..........................................................37
Experimento II – Cinética da Maturação Citoplasmática..............................................40
Experimento III – Determinação da Concentração Intraoocitária de Glutationa...........42
Conclusões.................................................................................................................44
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................45
CAPÍTULO 3 – AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO E DA QUALIDADE DE
EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO APÓS INIBIÇÃO DA MEIOSE
COM BUTIROLACTONA I E ROSCOVITINA EM MEIO SUPLEMENTADO COM
ANTIOXIDANTES........................................................................................................50
Resumo .......................................................................................................................50
Introdução...................................................................................................................51
xi
Material e Métodos .....................................................................................................52
Obtenção e seleção dos oócitos ..................................................................................52
Maturação dos oócitos .................................................................................................52
Fecundação in vitro ......................................................................................................53
Cultivo de desenvolvimento..........................................................................................54
Determinação da massa celular interna (MCI) e trofoblasto (TF).................................54
Delineamento experimental..........................................................................................55
Experimento I: Momento de fecundação......................................................................56
Experimento II: Avaliação do desenvolvimento embrionário ........................................56
Experimento III: Avaliação da qualidade embrionária ..................................................57
Análise Estatística........................................................................................................57
Resultados..................................................................................................................57
Experimento I: Momento de fecundação......................................................................57
Experimento II: Avaliação do desenvolvimento embrionário ........................................58
Experimento III: Avaliação da qualidade embrionária ..................................................60
Discussão ...................................................................................................................62
Experimento I: Momento de fecundação......................................................................62
Experimento II: Avaliação do desenvolvimento embrionário ........................................63
Experimento III: Avaliação da qualidade embrionária ..................................................66
Conclusões.................................................................................................................67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................67
CAPÍTULO 4 – AVALIAÇÃO DA FRAGMENTAÇÃO DE DNA EM EMBRIÕES
PRODUZIDOS IN VITRO APÓS FECUNDAÇÃO DE OÓCITOS TRATADOS COM
INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E ANTIOXIDANTES..............................71
Resumo .......................................................................................................................71
Introdução...................................................................................................................71
Material e Métodos .....................................................................................................73
Obtenção e seleção dos oócitos ..................................................................................73
Maturação dos oócitos .................................................................................................73
xii
Fecundação in vitro ......................................................................................................74
Cultivo de desenvolvimento..........................................................................................75
Coloração “Terminal Transferase Assay” – TUNEL .....................................................75
Ensaio Cometa.............................................................................................................76
Delineamento experimental..........................................................................................77
Experimento I: Avaliação da fragmentação de DNA pela coloração “Terminal
Transferase Assay” – TUNEL.......................................................................................78
Experimento II: Avaliação da fragmentação de DNA pelo ensaio Cometa...................79
Análise Estatística........................................................................................................79
Resultados..................................................................................................................79
Experimento I: Avaliação da fragmentação de DNA pela coloração “Terminal
Transferase Assay” – TUNEL.......................................................................................79
Experimento II: Avaliação da fragmentação de DNA pelo ensaio Cometa...................81
Discussão ...................................................................................................................83
Experimento I: Avaliação da fragmentação de DNA pela coloração “Terminal
Transferase Assay” – TUNEL.......................................................................................83
Experimento II: Avaliação da fragmentação de DNA pelo ensaio Cometa...................84
Conclusões.................................................................................................................86
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................86
xiii
LISTA DE TABELAS
Página
CAPÍTULO 2 – MATURAÇÃO NUCLEAR, DISTRIBUIÇÃO DE GRÂNULOS
CORTICAIS E CONCENTRAÇÃO INTRAOOCITÁRIA DE GLUTATIONA EM
OÓCITOS TRATADOS COM INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E
ANTIOXIDANTES........................................................................................................19
Tabela 1 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 8 horas com
inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes
(cisteamina ou β-mercaptoetanol)................................................................................30
Tabela 2 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 16 horas com
inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes
(cisteamina ou β-mercaptoetanol)................................................................................30
Tabela 3 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 24 horas com
inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes
(cisteamina ou β-mercaptoetanol)................................................................................31
Tabela 4 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 24 horas com
inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes
(cisteamina ou β-mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 8 horas.......32
Tabela 5 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 24 horas com
inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes
(cisteamina ou β-mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 16 horas.....32
Tabela 6 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 24 horas com
inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes
(cisteamina ou β-mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 24 horas.....33
Tabela 7 – Avaliação da maturação citoplasmática pela distribuição de grânulos
corticais em oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores da maturação
nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol) ...........................................................................................................34
xiv
Tabela 8 – Avaliação da maturação citoplasmática pela distribuição de grânulos
corticais em oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores da maturação
nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 16 horas ................................35
Tabela 9 – Avaliação da maturação citoplasmática pela distribuição de grânulos
corticais em oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores da maturação
nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 24 horas ................................35
Tabela 10 - Concentração de glutationa intracelular por oócito submetidos a
diferentes condições de maturação por 24 horas.........................................................36
CAPÍTULO 3 – AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO E DA QUALIDADE DE
EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO APÓS INIBIÇÃO DA MEIOSE
COM BUTIROLACTONA I E ROSCOVITINA EM MEIO SUPLEMENTADO COM
ANTIOXIDANTES........................................................................................................50
Tabela 1 - Desenvolvimento embrionário de oócitos pré-maturados durante 24
horas com inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) seguidos
do cultivo de maturação por 16, 20 ou 24 horas ..........................................................58
Tabela 2 – Desenvolvimento embrionário de oócitos pré-maturados durante 24
horas com inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e
antioxidantes (cisteamina ou β-mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação
por 20 horas
.
. ...............................................................................................................59
Tabela 3 – Porcentagem média de células da MCI e TF, em relação ao número total
de células dos blastocistos corados por meio de coloração diferencial por
fluorocromo após 168 horas de fecundação dos oócitos maturados em diferentes
meios............................................................................................................................61
CAPÍTULO 4 – AVALIAÇÃO DA FRAGMENTAÇÃO DE DNA EM EMBRIÕES
PRODUZIDOS IN VITRO APÓS FECUNDAÇÃO DE OÓCITOS TRATADOS COM
INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E ANTIOXIDANTES..............................71
xv
Tabela 1 – Porcentagem de células em apoptose verificadas pela técnica do
TUNEL e tamanho (número médio de células/blastocisto) de embriões produzidos
de oócitos maturados em diferentes meios..................................................................80
Tabela 2 – Porcentagem de fragmentação de DNA total de embriões submetidos à
técnica do Cometa provenientes de oócitos maturados em diferentes meios..............82
xvi
LISTA DE FIGURAS
Página
CAPÍTULO 2 – MATURAÇÃO NUCLEAR, DISTRIBUIÇÃO DE GRÂNULOS
CORTICAIS E CONCENTRAÇÃO INTRAOOCITÁRIA DE GLUTATIONA EM
OÓCITOS TRATADOS COM INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E
ANTIOXIDANTES........................................................................................................19
Figura 1 - Fotomicrografia das diversas fases da maturação nuclear de oócitos
bovinos observados sob microscópio de epifluorescência A) Oócitos em VG:
cromossomos descondensados; B) Oócitos em M I: cromossomos condensados; C)
Oócitos em M II: cromossomos condensados na placa metafásica e no primeiro
corpúsculo polar (1° CP) ..............................................................................................24
Figura 2 - Fotomicrografia das diversas fases da maturação citoplasmática de
oócitos bovinos observados sob microscópio de epifluorescência A) GC dispostos
em ‘’clusters’’ no interior do oócito (oócito imaturo); B) GC dispostos tanto no centro
como na periferia do oócito (oócito parcialmente maturo); C) GC dispostos na
periferia do oócito (oócito maturo)................................................................................25
Figura 3 - Curva padrão de glutationa .........................................................................27
Figura 4 – Concentração de GSH intracelular em oócitos maturados em diferentes
meios de cultura por 24 horas......................................................................................37
CAPÍTULO 3 – AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO E DA QUALIDADE DE
EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO APÓS INIBIÇÃO DA MEIOSE
COM BUTIROLACTONA I E ROSCOVITINA EM MEIO SUPLEMENTADO COM
ANTIOXIDANTES........................................................................................................50
Figura 1 – Desenvolvimento embrionário de oócitos pré-maturados durante 24
horas com inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e
antioxidantes (cisteamina ou -mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação
por 20 horas. ................................................................................................................60
xvii
Figura 2 – Blastocisto corado pela técnica de coloração diferencial, 168 horas após
FIV, observado em microscópio de epifluorescência.
Azul: núcleo de células da massa celular interna (MCI), Hoechst 33342; Rosa:
núcleo de células do trofoblasto (TF), iodeto de propídeo. ..........................................61
Figura 3 – Percentagem de células da MCI e TF dos blastocistos desenvolvidos por
168 horas provenientes de oócitos maturados in vitro em diferentes meios de
cultura. .........................................................................................................................62
CAPÍTULO 4 – AVALIAÇÃO DA FRAGMENTAÇÃO DE DNA EM EMBRIÕES
PRODUZIDOS IN VITRO APÓS FECUNDAÇÃO DE OÓCITOS TRATADOS COM
INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E ANTIOXIDANTES..............................71
Figura 1 - Classificação da integridade de DNA total (Modificado de ANDERSON et
al., 1994 e VISVARDS et al., 1997). (0) célula onde ocorreu pouca quebra de DNA e
apenas difusão do DNA no gel, (1) pequena quebra e pouca migração de DNA, (2)
quebra e migração parcial de DNA, (3) quebra e migração de DNA acetuada e (4)
grande quebra e alta migração de DNA. ......................................................................77
Figura 2 – Blstocistos corados pela técnica de coloração TUNEL, 168 horas após
FIV, observados em microscópio de epifluorescência. A) Controle Positivo TUNEL –
tratados com DNAse I; B) Controle Negativo TUNEL – tratados sem TdT; C)
Blastocisto que apresentou fragmentação do DNA. As setas demonstram locais da
quebra do DNA dentro do núcleo. (TdT – enzima “terminal deoxinucleotidyl
transferase”).................................................................................................................80
Figura 3 – Percentual de fragmentação do DNA encontradas em blastocistos
corados por TUNEL após 168 horas de fecundação dos oócitos maturados em
diferentes meios...........................................................................................................81
Figura 4 – Classes de fragmentação de DNA em blastômeros de blastocistos
produzidos 168 horas após FIV....................................................................................82
xviii
LISTA DE ABREVIATURAS
A I.......................................... Anáfase I
ANOVA……………………….. Análise de variância
ATP........................................ Trifosfato de adenosina
βME........................................ β-Mercaptoetanol
B............................................. Butirolactona I
Bl............................................ Blastocisto
BSA........................................ Albumina sérica bovina
°C........................................... Graus Celsius
cdc......................................... Ciclo de divisão celular
CDKs..................................... Cinases dependente de cilcinas
CIS......................................... Cisteamina
CIV......................................... Cultivo in vitro
CO
2
........................................ Dióxido de carbono
COC....................................... Complexo cumulus-oócito
CP.......................................... Corpúsculo polar
DNA....................................... Ácido desoxirribonucléico
EPM....................................... Erro padrão da média
FITC-LCA.............................. Lens culinaris aglutinina conjugado à isotiocianato de
fluoresceína
FIV......................................... Fecundação in vitro
FSH....................................... Hormônio folículo estimulante
GC......................................... Grânulos corticais
GVBD.................................... Quebra da vesícula germinativa
GSH....................................... Glutationa
[GSHi].................................... Concentração intracelular de glutationa
H
2
O
2
....................................... Peróxido de hidrogênio
hCG…………………………… Gonadotrofina coriônica humana
hpi.......................................... Horas pós-inseminação
xix
LH.......................................... Hormônio luteinizante
LMP....................................... “Low melting point”
mA......................................... Mili ampere
M I......................................... Metáfase I
MII.......................................... Metáfase II
MAP....................................... Proteína ativada por mitógeno
MAPK.................................... Proteína ativada por mitógeno cinase
MCI........................................ Massa celular interna
MIV......................................... Maturação in vitro
mL......................................... Mililitro
mm........................................ Milímetro
mM........................................ Milimol
MPF...................................... Fator promotor de maturação
n............................................ Número
nm......................................... Nanômetro
O
2
.......................................... Oxigênio
O
2
-
......................................... Ânion superóxido
OH
-
........................................ Radical hidroxila
OMI....................................... Inibidor de maturação oocitária
OPT....................................... “O-phthaldialdehyde”
PBS........................................ Solução salina em tampão fosfato
PHE........................................ Penicilamina, hipotaurina e epinefrina
PIV......................................... Produção in vitro de embriões
pMol....................................... Picomol
PVP........................................ Polivinil pirrolidona
R............................................ Roscovitina
RNA....................................... Ácido ribonucléico
ROS....................................... Espécies reativas ao oxigênio
SAS........................................ “Statistical analysis system”
SB.......................................... Solução de bloqueio
xx
SEAM………………………… Solução de extração de ácido meta-fosfórico
SFB........................................ Soro fetal bovino
SOF........................................ Fluido sintético do oviduto
T I........................................... Telófase I
TALP………………………….. “Tyrode’s Albumin Lactate and Pyruvate”
TCM 199................................ “Tissue culture medium 199”
TdT........................................ Enzima terminal deoxinucleotidil transferase
TF.......................................... Trofoblasto
TG.......................................... Tampão de glutationa
TUNEL................................... “In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated
dUTP nick end labeling assay”
UI…………………………….... Unidade Internacional
VG.......................................... Vesícula germinativa
µL……………………………… Microlitro
µM.......................................... Micromol
%............................................ Porcentagem
xxi
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO DA MATURAÇÃO NUCLEAR E DE
ANTIOXIDANTES SOBRE A MATURAÇÃO OOCITÁRIA, FECUNDAÇÃO E
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO BOVINO IN VITRO.
RESUMO – O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do meio
de maturação com roscovitina, butirolactona I, cisteamina e β-mercaptoetanol na
maturação oocitária e suas conseqüências na fecundação e desenvolvimento
embrionário bovino in vitro, além da variabilidade da freqüência de danos ao DNA
embrionário. Oócitos foram maturados a 38,8
o
C em atmosfera de 5% CO
2
em ar em
meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 µg FSH, 100 UI hCG e 1 µg
estradiol/mL (controle - C), adicionado de 50 µM de cisteamina (CC) ou 50 µM de β-
mercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de
SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I ou
roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com
0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100 µM de butirolactona I
(CB), 100 µM de butirolactona I + 50 µM de cisteamina (CBC), 100 µM de butirolactona
I + 50 µM de β-mercaptoetanol (CBM), 25 µM de roscovitina (CR), 25 µM de roscovitina
+ 50 µM de cisteamina (CRC) e 25 µM de roscovitina + 50 µM de β-mercaptoetanol
(CRM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio
controle para maturação por 8, 16 e 24 horas, para avaliação da maturação nuclear e
citoplasmática, e dosagem da [GSHi]. A fecundação foi realizada após 24 horas do
início do cultivo de maturação (grupos sem inibidores), e 20 horas (grupos com
inibidores). O cultivo de desenvolvimento foi realizado em meio SOF-Modificado
suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB à temperatura de 38,8ºC por 192
horas. Observou-se que a butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de
maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina, e que os antioxidantes não
interferiram na retomada da maturação nuclear. A butirolactona I, ao contrário da
roscovitina, interferiu no reposicionamento dos GC atrasando a maturação
citoplasmática. A adição de antioxidantes cisteamina e β-mercaptoetanol no cultivo de
xxii
maturação não proporcionou aumento da [GSHi] nos oócitos. Os resultados mostraram
que o bloqueio da meiose de oócitos com butirolactona I não prejudicou a subseqüente
fecundação e nem o desenvolvimento embrionário, ao contrário do bloqueio com
roscovitina que influenciou negativamente estes parâmetros. A adição dos antioxidantes
ao meio de maturação não influenciou na produção e na qualidade dos blastocistos. A
taxa de apoptose celular e fragmentação de DNA nos embriões produzidos in vitro são
maiores naqueles maturados com SFB que com butirolactona I e -mercaptoetanol.
Palavras-Chave: Maturação in vitro, fecundação in vitro, oócito, bovino, grânulos
corticais, glutationa, embrião, antioxidantes, butirolactona I, roscovitina.
xxiii
EFFECTS OF NUCLEAR MATURATION INHIBITION AND ANTIOXIDANTS ON
OOCYTE MATURATION, FERTILIZATION AND BOVINE EMBRYONIC
DEVELOPMENT IN VITRO
ABSTRACT - The aim of this work was to evaluate the effects of maturation
media supplementation with roscovitine, butyrolactone I, cysteamine and -
mercaptoethanol on oocyte maturation and the consequences on fertilization and bovine
embryo development in vitro, and also DNA damage frequency in embryos. Oocytes
were matured at 38.8°C under a 5% CO
2
in air environment, in TCM-199 medium
supplemented with 0.6% BSA, 0.5 µg FSH, 100 IU hCG and 1 µg estradiol/mL (control
group - C) and with either 50 µM cysteamine (CC group) or 50 µM β-mercaptoethanol
(CM group). The standard group of the laboratory (S group) was supplemented with
10% FCS as protein source. The oocytes in which groups were pre-incubated for 24
hours with butyrolactone I and roscovitine in TCM-199 medium supplemented with 0.3%
BSA, antibiotic and pyruvate were culturedaccording to the groups: 100 µM
butyrolactone I (CB), 100 µM butyrolactone I + 50 µM cysteamine (CBC), 100 µM
butyrolactone I + 50 µM β-mercaptoethanol (CBM), 25 µM roscovitine (CR), 25 µM
roscovitine + 50 µM cysteamine (CRC) and 25 µM roscovitine + 50 µM β-
mercaptoethanol (CRM). After the pre-incubation, the oocytes were transferred to the
control maturation medium for 8, 16 and 24 hours for evaluation of nuclear and
cytoplasmic maturation and [GSHi] dosage. For IVF, the oocytes were fertilized at 24
hours after the beginning of maturation (groups without inhibition), or 20 hours (groups
with inhibition). Embryo culture was in SOF-Modified medium supplemented with 0.5%
BSA and 2.5% FCS at 38.8ºC for 192 hours. We observed that butyrolactone I is
capable of reversibly blocking meiotic maturation more effectively than roscovitine, and
that addition of antioxidants did not interferewith resumption of nuclear maturation.
Unlike roscovitine, butyrolactone I interfered with repositioning of the cortical granules,
thus delaying cytoplasmic maturation. Addition of cysteamine and β-mercaptoethanol to
the maturation media did not increase [GSHi] in the oocytes. Results show that blocking
maturation with butyrolactone I was not prejudicial to fertilization and to subsequent
xxiv
embryo development, while roscovitine decrease both fertilization and embryo
development rates. Addition of antioxidants to the maturation media did not alter
blastocyst production or quality. Both apoptotic and DNA fragmentation rates in in vitro
produced embryos are higher when maturation media contains FCS than when it
contains butyrolactone I and β-mercaptoethanol.
Key words: In vitro maturation, in vitro fertilization, oocyte, bovine, cortical granules,
glutathione, embryo, antioxidants, butyrolactone I, roscovitine.
1
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
Introdução
O oócito adquire progressivamente a habilidade de retomar e concluir a meiose
durante a foliculogênese (LONERGAN et al., 1994), e adquire plena capacidade de
desenvolvimento somente ao final da foliculogênese. Oócitos removidos de folículos
menores que 1 mm de diâmetro podem reiniciar a meiose quando cultivados in vitro,
porém somente oócitos obtidos de folículos maiores que 2 mm são capazes de atingir o
estádio de metáfase II. Ainda, estudos têm demonstrado que a capacidade de
desenvolvimento do oócito bovino maturado in vivo é superior à do maturado in vitro.
Esta diferença é possivelmente atribuída às ações capacitantes que o folículo
dominante exerce sobre o oócito, ações estas que são abolidas durante o processo de
maturação in vitro. Trabalhos demonstraram que o oócito sofre significantes
modulações quando está incluso no folículo dominante, especialmente em relação à
sua ultraestrutura e atividades funcionais (HYTTEL et al., 1997). Devido a isto, tem-se
atribuído ao folículo um papel fundamental na aquisição da plena competência de
desenvolvimento do oócito. É durante esta fase de desenvolvimento que o oócito atinge
sua capacidade plena e, devido a este fato, o termo “capacitação oocitária” foi sugerido
(HYTTEL et al., 1997).
In vivo, oócitos meioticamente competentes são mantidos no estádio de vesícula
germinativa (VG) no ambiente folicular até que ocorra o pico pré-ovulatório de
gonadotrofinas, o que estimula a maturação do oócito. Baseado nos estudos de
HYTTEL et al. (1997), fica claro que a maturação não se trata apenas da ativação de
um gameta quiescente, sendo o apogeu de uma série de longos processos
preparatórios. Após a conclusão da maturação, o oócito secundário haplóide torna-se
equipado com toda a maquinaria celular necessária para permitir o sucesso da
fertilização e do desenvolvimento embrionário inicial.
Oócitos utilizados para fins de biotecnologia in vitro são geralmente obtidos de
folículos de 2-8 mm de diâmetro. Assim que são removidos do ambiente inibitório do
2
folículo, os oócitos meioticamente competentes retomam espontaneamente o processo
de meiose. Porém, uma fração destes oócitos não adquire plena competência
citoplasmática. Desta forma, a inibição reversível da meiose pela butirolactona I e pela
roscovitina pode ser explorada usando-se um duplo sistema de cultura com pré-
maturação com inibidores seguida de maturação, com o objetivo de aumentar a
competência de desenvolvimento dos oócitos (PONDERATO et al., 2001). Estudos de
cocristalização indicaram que a butirolactona I e a roscovitina seguem o mesmo
caminho inibitório: essas duas moléculas competem com o ATP versus o sítio de
ligação do ATP da cdc2 cinase, bloqueando a atividade de fosforilação (PONDERATO
et al., 2001).
Na maioria das espécies, o início do desenvolvimento de embriões fertilizados in
vivo ocorre no lúmen do oviduto (BATTERIDGE, 1995), o qual mantém uma pressão de
O
2
mais baixa que a da atmosfera (BISHOP, 1956; MAAS et al., 1976), protegendo
assim os embriões de mamíferos do estresse oxidativo (MASTROIANNI e JONES,
1965; LI e FOOTE., 1993; NODA et al., 1994; WATSON et al., 1994). Em sistemas de
cultivo in vitro, o estresse oxidativo ocorre quando o acúmulo de espécies reativas ao
oxigênio (ROS) ultrapassa a capacidade antioxidante do sistema. A alta concentração
de O
2
atmosférico induz a geração de radicais livres que são produzidos por várias vias
metabólicas e enzimas do oócito, embrião ou das células foliculares (células do
cumulus) co-cultivadas com estes. O estresse oxidativo danifica os embriões ao causar
peroxidação de fosfolipídeos de membrana e alterar muitos tipos de moléculas
celulares, tais como lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos (NASR-ESFAHANI et al.,
1990). As conseqüências incluem alterações mitocondriais, bloqueio de
desenvolvimento, depleção do ATP e apoptose (KOWALTOWSKI e VERCESI, 1999;
HYSLOP et al., 1988; YANG et al., 1998). Assim, a adição de antioxidantes ao meio de
cultura tem se demonstrada efetiva na manutenção e desenvolvimento embrionário in
vitro (TAKAHASHI et al., 1993; LIM et al., 1996; CAAMAÑO et al., 1996; LIM et al.,
1999).
Indubitavelmente, muitos fatores biológicos agem de forma conjunta para
preparar o oócito imaturo para um desenvolvimento bem sucedido e um embrião
3
competente depois da fecundação. Defeitos na maturação oocitária podem
possivelmente ser causados por uma inadequada maturação nuclear ou citoplasmática,
ou mesmo por uma falha em ambas (YANG et al., 1998). A compreensão exata das
necessidades metabólicas do oócito em sistemas de cultivo de maturação in vitro
pressupõe a necessidade de novas pesquisas até que seja estabelecida a condição
ideal para que o maior número possível de oócitos maturados in vitro adquira a
competência de desenvolvimento e torne-se hábil para sustentar o desenvolvimento
inicial do embrião.
Com este intuito, este trabalho busca acrescentar informações referentes às
necessidades metabólicas/fisiológicas para a adequada capacitação/maturação do
oócito e, baseado nestas necessidades, definir um sistema de cultivo que aumente a
produção e a qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro. Para isso, este
trabalho tem por objetivo principal avaliar os efeitos da suplementação do meio de pré-
maturação com Butirolactona I ou Roscovitina por 8, 16 ou 24 horas seguido do cultivo
de maturação in vitro, além da suplementação com os antioxidantes β-mercaptoetanol
ou cisteamina, sobre o retardo na maturação nuclear de oócitos, maturação
citoplasmática, momento da fecundação e competência no desenvolvimento de
embriões bovinos.
Objetivos
1. Avaliar a eficácia da roscovitina e da butirolactona I como inibidores da
maturação nuclear no meio de pré-maturação por 8, 16 ou 24 horas e relacionar a
competência oocitária e a fase da meiose nos tempos de 8, 16 e 24 horas do início do
cultivo de maturação do oócito bovino.
2. Avaliar o efeito da suplementação do meio de pré-maturação e maturação com
antioxidantes (β-mercaptoetanol ou cisteamina) sobre a competência oocitária, cinética
da maturação nuclear, fecundação e competência do desenvolvimento embrionário in
vitro.
4
3. Definir qual o melhor momento para realizar a fecundação de oócitos
maturados in vitro, em meio suplementado com roscovitina, butirolactona I, β-
mercaptoetanol e cisteamina por 16, 20 ou 24 horas.
4. Verificar a competência no desenvolvimento embrionário in vitro após a
fecundação de oócitos previamente submetidos ao retardo da maturação nuclear com
suplementação de roscovitina e butirolactona I no meio pré-maturação por 8, 16 ou 24
horas.
5. Avaliar o efeito da suplementação do meio de maturação com antioxidantes e
inibidores da maturação sobre a variabilidade da freqüência de danos no DNA.
6. Estabelecer correlações entre danos no DNA e taxa de maturação,
fecundação e de desenvolvimento de embriões até o estádio de blastocisto.
Revisão da Literatura
Maturação de oócitos em mamíferos
Denomina-se maturação meiótica a conversão de oócitos imaturos plenamente
crescidos, inclusos no folículo antral, em oócitos maturos não fecundados,
anteriormente à ovulação. A maturação meiótica refere-se à progressão nuclear do
estádio dictióteno até a M II (primeira redução meiótica), assim como às alterações
metabólicas necessárias para a ativação do oócito após a fecundação (MINGOTI,
1995).
A maturação compreende todos os eventos que permitem ao oócito expressar
seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Durante a maturação, os
oócitos sofrem várias alterações nucleares e citoplasmáticas. Os eventos nucleares
incluem: quebra da vesícula germinativa (GVBD), desaparecimento do nucléolo,
condensação da cromatina, extrusão do primeiro corpúsculo polar e formação do
segundo fuso meiótico, enquanto os eventos citoplasmáticos incluem: redistribuição das
organelas intracelulares (mitocôndrias migram para posição perinuclear e grânulos
corticais depositam-se abaixo da membrana vitelina) e maturação dos mecanismos de
liberação do Ca
2+
. A retomada da meiose coincide com a expansão das células do
5
cumulus na superfície do oócito (revisado por HE et al., 1997). Sabe-se que grânulos
corticais (GC) são grânulos secretores, cujo exsudato é capaz de alterar a função e
promover o endurecimento da zona pelúcida (CHERR et al., 1988). Baseado nestas
modificações morfológicas, o processo de maturação nuclear é dividido nos estádios da
meiose: vesícula germinativa (VG), caracterizada por um núcleo visível e proeminente,
diacinese (D), metáfase I (M I), anáfase I (A I), telófase I (T I) e metáfase II (M II)
(DONAHUE, 1968; MOTLIK e FULKA, 1976; MOTLIK et al., 1978). Ainda podemos citar
a fase de metáfase III (M III) descrita por KUBIAK (1989) e ARAKI et al. (1996) que
observaram a emissão do segundo corpúsculo polar em oócitos de camundongo.
Quando incluso no folículo ovulatório de Graaf in vivo, o oócito retoma a
maturação meiótica após o pico pré-ovulatório de gonadotrofinas (hormônio folículo
estimulante - FSH e hormônio luteinizante - LH), as quais induzem alterações
fisiológicas na atividade das células do cumulus (MASUI e CLARKE, 1979). As funções
principais do LH são a estimulação da maturação folicular final, a ativação do oócito
para que reinicie a meiose (encontra-se em prófase I), a ovulação e a luteinização das
células da granulosa e da teca que formarão o corpo lúteo (BÓ et al., 2000).
Em cultivo in vitro, os complexos-cumulus-oócito (COCs) isolados em meio
simples de cultivo retomam a meiose espontaneamente, mesmo na completa ausência
de hormônios (PINCUS e ENZMANN, 1935), provavelmente pela simples remoção de
algum fator inibitório presente no folículo íntegro. Tem sido sugerido que o inibidor da
maturação oocitária (OMI), produto das células da granulosa, mantém o oócito em
estádio dictióteno da primeira prófase meiótica (TSAFRIRI, 1985). O OMI é um
polipeptídeo que é encontrado no fluido folicular de ovários de uma variedade de
mamíferos e que impede o oócito de sofrer maturação meiótica espontânea quando
cultivado in vitro (WASSARMAN e ALBERTINI, 1994).
A segunda divisão meiótica começa em M II, mas não é completa até que ocorra
a penetração do espermatozóide. O término da segunda divisão meiótica é
acompanhado da extrusão do segundo corpúsculo polar para o espaço perivitelino
(GORDON, 1994). A retomada da meiose (M II) em oócitos mamíferos é acompanhada
de um substancial aumento na atividade de muitas cinases (CROSBY et al., 1984;
6
BORNSLAEGER et al., 1986; KASTROP et al., 1990). O componente central desta
atividade é o fator promotor de maturação (MPF). O MPF é uma serina/treonina
proteína cinase composta por uma subunidade regulatória, a ciclina B, e uma
subunidade catalítica, p34
cdc2
(LOHKA et al., 1988; LABBÉ et al., 1989). Um possível
papel da proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK) durante o início e progressão da
meiose foi reportado por FISSORE et al. (1996).
Inibidores da maturação in vitro de oócitos
Muitos inibidores químicos potentes da retomada da meiose podem ser usados
in vitro. Em bovinos e em outros animais de grande porte, a síntese protéica é requerida
para completar a maturação nuclear (SIRARD et al., 1989; MOTLIK et al., 1990;
KASTROP et al., 1991). O uso de inibidores da síntese protéica permite o cultivo de
oócitos bovinos de maneira reversível na retomada da meiose (LONERGAN et al.,
1998).
In vivo, os oócitos alcançam a aquisição da maturação do citoplasma
(capacitação) e a competência para retomar a meiose (maturação) depois de uma série
longa de processos preparatórios envolvendo transcrição e conseqüente tradução de
transcritos durante a prófase meiótica (GOSDEN et al., 1997; HYTTEL et al., 1997). A
retomada da meiose envolve a condensação dos cromossomos, que resulta em um
súbito bloqueio da transcrição e é acompanhada de profundas modificações no padrão
de neosíntese protéica (WU et al., 1996; LONERGAN et al., 1997). Os eventos
moleculares relacionados a esta diferenciação tardia do oócito não são conhecidos,
mas suspeita-se que transcritos e proteínas são estocados em uma forma estável
durante este período e têm uma importante função durante o desenvolvimento
embrionário precoce, quando o genoma embrionário permanece quiescente
(MERMILLOD et al., 2000).
Durante a maturação citoplasmática, o aumento pronunciado na atividade das
cinases inicia uma complexa cascata de fosforilação de proteína específica e
desfosforilação, envolvendo um número de cinases, como o MPF e a família da MAPK
(MOTLIK et al., 1998).
7
No caminho da tradução, o MPF é uma cinase envolvida na divisão celular e na
regulação do ciclo de transição da célula G2/M de todas as células eucarióticas. A
ativação do MPF é também um ponto chave da retomada da meiose em oócitos que
correspondem à transição da G2/M (revisto por EPPIG et al., 1996). A ativação do MPF
é um processo “two-steps” envolvendo a formação de um complexo entre a subunidade
da cinase (p34
cdc2
, homóloga ao produto do gene cdc2 da levedura) e uma subunidade
regulatória (ciclina B). Uma vez formado esse complexo pode ser ativado pela
desfosforilação da treonina 14 e resíduos da tirosina 15 da subunidade p34. Assim, em
bovinos, a atividade do MPF requer tanto a neosíntese protéica como as cascatas de
fosforilação/desfosforilação. A estabilidade da atividade do MPF pode ser prevenida por
drogas que agem nesses dois níveis (MERMILLOD et al., 2000).
A maturação nuclear do oócito não é suficiente para resultar no subseqüente
desenvolvimento embrionário. Pode-se hipotetizar que se oócitos são cultivados in vitro
antes da maturação sob condições que mantém estacionado o estádio de vesícula
germinativa (VG), estes podem ter a oportunidade de adquirir uma grande competência
no desenvolvimento. Tentativas têm sido feitas com o intuito de manter a meiose
estacionada com estabilização farmacológica (realizada pelo cicloheximide, 6-
dimetilaminopurina, butirolactona I, roscovitina) ou com inibidores fisiológicos (células
da teca) (RICHARD et al., 1997; SAEKI et al., 1997; AVERY et al., 1998; KUBELKA et
al., 2000; MERMILLOD et al., 2000).
Roscovitina, uma purina conhecida especificamente por inibir a atividade da MPF
cinase em numerosos sistemas celulares, mantém oócitos bovinos no estádio de
vesícula germinativa (MERMILLOD et al., 2000). A roscovitina é um inibidor seletivo das
cinases dependentes de ciclinas cdk 1, 2 e 5 (KNOCKAERT et al., 2002). MERMILLOD
et al. (2000) investigaram o uso de 25 µM de roscovitina por 24 horas para demonstrar
que é possível o cultivo de oócitos bovinos com inibidor de meiose sem diminuir seus
resultados no potencial de desenvolvimento.
Butirolactona I é um dos compostos que funcionam como um potente, específico
e reversível inibidor da quebra da vesícula germinativa (GVBD). Esta molécula age
como um inibidor competitivo do ATP, é um inibidor potente e específico de cinases
8
dependente de ciclinas (cdks), e tem algum efeito inibitório em outras proteínas cinases
como a MAPK (KITAGAWA et al., 1993, 1994; MOTLIK et al., 1998). Recentemente,
KUBELKA et al. (2000), demonstraram que a butirolactona I na concentração de 100
µM pode manter a meiose estacionada em bovinos por 24 a 28 horas.
Estudos de cocristalização indicaram que a butirolactona I e a roscovitina
seguem o mesmo caminho inibitório: essas duas moléculas competem com o ATP
versus o sítio de ligação do ATP da cdc2 cinase, bloqueando a atividade de
fosforilação. Esta inibição é reversível e pode ser explorada usando-se um duplo
sistema de cultura com pré-maturação com inibidores seguida de maturação, com o
objetivo de aumentar a competência de desenvolvimento dos oócitos (PONDERATO et
al., 2001). Derivados de purinas mais específicos, direcionados para a inibição do MPF,
têm sido recentemente designados e usados com sucesso para prevenir a divisão
celular e retomada da meiose em organismos menores (revisto por MEIJER, 1996;
MEIJER e KIM, 1997).
Antioxidantes
No metabolismo celular, durante o desenvolvimento embrionário, as espécies
reativas de oxigênio (ROS), que incluem ânion superóxido (O
2
-
), peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) e radical hidroxila (OH-), são constantemente liberadas do processo de quebra
de ATP (fonte energética celular) (FEUGANG et al., 2004).
Estes radicais livres são os mais importantes oxidantes biológicos, pois são
potentes eletrófilos que agem em centros nucleofílicos, com terminações –OH, –NH
2
e
grupos –SH, de pequenos componentes e macromoléculas celulares (DNA, proteínas e
polissacarídeos), causando conseqüências irreversíveis, como a morte celular
(apoptose ou necrose) (KNAPEN et al., 1999). A concentração intracelular das ROS é
aumentada nos sistemas de cultivo in vitro, onde elevadas quantidades de O
2
-
e H
2
O
2
foram detectadas (FEUGANG et al., 2004).
Está bem conhecido que as concentrações de O
2
no lúmen do trato reprodutivo
feminino estão entre um terço (3 a 9%) do encontrado nas condições in vitro
(MASTRIOANNI e JONES, 1965). O cultivo de embriões com alta tensão de oxigênio in
9
vitro (20%) pode produzir mais radical livre (FOWLER e CALLINGHAM, 1978) do que
em embriões cultivados com 5 ou 7% de O
2
(NASR-ESFAHANI et al., 1990; LIU e
FOOTE, 1995).
Parece que o balanço entre a produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS)
e sua ‘’limpeza’’ é um importante fator para a aquisição da habilidade da fecundação in
vitro (DE LAMIRANDE et al., 1997). Parece que embriões cultivados in vitro que são
expostos ao estresse oxidativo têm seu mecanismo de defesa insuficiente para proteger
sua delicada estrutura celular (ALI et al., 2003). Efeitos de radicais livres derivados do
oxigênio durante o cultivo in vitro têm sido demonstrados em muitas espécies. Tem sido
demonstrado que as ROS induzem disfunção mitocondrial, danos ao DNA, RNA e
proteínas (COMPORTI, 1989) bem como inibição da fusão espermatozóide-oócito
(AITKEN et al., 1993). Para proteger o oócito e os embriões do estresse oxidativo
durante o cultivo, muitos antioxidantes podem ser adicionados ao meio de cultivo.
Glutationa (GSH) é um antioxidante natural presente em ambos os gametas, mas
em níveis variáveis. O aumento nas concentrações intracelulares de GSH é mostrado
em oócitos que progridem da fase de vesícula germinativa para metáfase II, mas a GSH
é baixa em zigotos fecundados no estádio pró-nuclear quando comparados com oócitos
maturos (CALVIN et al., 1986; PERREAULT et al., 1988; FUNAHASHI et al., 1995;
MIYAMURA et al., 1995). Entretanto, a GSH possui um importante papel na proteção da
célula contra os danos oxidativos (DE MATOS e FURNUS, 2000). Os níveis de GSH
encontrados no oócito no final da maturação são considerados bons marcadores
bioquímicos da viabilidade oocitária (ABEYDEERA et al., 1998).
DE MATOS et al. (1996) demonstraram que a adição de cisteamina, cisteína e β-
mercaptoetanol ao meio de maturação aumentaram a síntese de GSH no oócito bovino
durante a MIV. Este aumento no conteúdo da GSH supre os oócitos maturados in vitro
de um grande estoque de GSH disponível para proteção do embrião até o estádio de
blastocisto (TELFORD et al., 1990; DE MATOS et al., 1995, 1996), melhorando a
eficiência da produção in vitro de blastocistos de oócitos imaturos.
O precursor da GSH em oócitos é a cisteína (DE MATOS e FURNUS, 2000), que
pode ter um papel importante como antioxidante quando suplementado em sistemas de
10
cultivo. A GSH é o maior composto sulfídrico não proteico em células de mamíferos e
serve como reservatório de cisteína (MEISTER e TATE, 1976).
DE MATOS et al. (1995; 1996) demonstraram que a suplementação do meio de
MIV com cisteamina aumentou o conteúdo intracelular de GSH em oócitos bovinos e
melhorou o desenvolvimento e qualidade dos embriões, produzindo mais embriões que
atingiram o estádio de blastocisto no dia 6 do que embriões produzidos em meio de
maturação sem suplementação.
Proteger embriões contra o estresse oxidativo parece ser uma das chaves em
melhorar o desenvolvimento. Tem sido demonstrado que o desenvolvimento de
embriões bovinos foi promovido pelo uso do β-mercaptoetanol, um composto tiol de
baixo peso molecular usado como agente redutor em meios de cultivo (TAKAHASHI et
al., 1993). O efeito do β-mercaptoetanol na maturação oocitária e no desenvolvimento
embrionário está correlacionado com a biosíntese intracelular de GSH (TAKAHASHI et
al., 1993; DE MATOS et al., 1996; DE MATOS e FURNUS, 2000).
Apoptose
A apoptose é a forma mais generalizada de morte celular, pois é a que ocorre
tanto no desenvolvimento embrionário-fetal como ao longo da vida adulta. O conceito
revolucionário de morte celular por apoptose, contrastando com o de necrose, foi
proposto há 26 anos por (KERR e SEARLE, 1972): “As células fisiologicamente
indesejáveis não necrosam, elas apoptosam”. A morte celular programada é
característica no desenvolvimento de animais e plantas. Esse tipo de morte celular é tão
importante quanto o processo mitótico no sentido de produzir um indivíduo.
Na apoptose há diminuição do tamanho celular e condensação do núcleo. Os
conteúdos nuclear e citoplasmático se fragmentam no fim do processo originando os
corpos apoptóticos. Esses restos são fagocitados por células vizinhas do mesmo tipo ou
por macrófagos. A condensação da cromatina na periferia do núcleo é conseqüência do
colapso da cromatina resultante do descolamento das alças cromossômicas da lâmina
nuclear que se desintegram na apoptose (OBERHAMMER et al.,1993).
11
A apoptose é caracterizada por uma série de eventos bioquímicos e morfológicos
observados no núcleo e no citoplasma das células que entram neste processo. A
condensação e fragmentação do DNA nuclear estão comumente associadas à quebra
do DNA nuclear em fragmentos de 200 pares de base. Similarmente, o citoplasma se
torna denso e com corpos apoptóticos e vesícula, e é observado ainda, peroxidação
lipídica e oxidação de proteínas e aumento do retículo endoplasmático (HALL, 1999). É
confirmada in situ por meio do ensaio TUNEL, que a enzima terminal “deoxynucleotidyl
transferase” (TdT) catalisa a incorporação de “biotinylated deoxyuridine” (dUTP) nos
locais de quebra de DNA. O sinal é amplificado por fluorescência. A reação TUNEL
preferencialmente detecta células que iniciaram o processo de morte celular. A
apoptose é observada em condições normais no desenvolvimento de embriões in vivo e
in vitro do início do desenvolvimento de embriões (NEUBER et al., 2002). O índice de
células em apoptose pode indicar a qualidade de blastocistos produzidos.
A relação entre o desenvolvimento embrionário e danos ao DNA pode ser
medida pela técnica do Cometa. O ensaio Cometa é baseado no princípio que danos ao
DNA reduzem o tamanho de fragmentos do DNA. Este efeito é detectado aplicando um
campo eletroforético para lisar as células. Os fragmentos de DNA corados formam um
típico padrão de migração semelhante a um cometa (HELMA e UHL, 2000). A detecção
de danos aos fragmentos de DNA pelo ensaio Cometa é um método proveitoso para
avaliar o estresse oxidativo ou outras condições de cultivo embrionário que podem
comprometer o desenvolvimento embrionário. O ensaio Cometa, que pode detectar
danos ao DNA de células individuais, permite a quantificação de danos ao DNA tanto
pelo monitoramento da freqüência de danos do DNA como pela extensão (TAKAHASHI
et al., 2000).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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12
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19
CAPÍTULO 2 – MATURAÇÃO NUCLEAR, DISTRIBUIÇÃO DE GRÂNULOS
CORTICAIS E CONCENTRAÇÃO INTRAOOCITÁRIA DE GLUTATIONA EM
OÓCITOS TRATADOS COM INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E
ANTIOXIDANTES
RESUMO – A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão
da meiose com progressão do estádio de vesícula germinativa (VG) da prófase I até a
metáfase II (MII). Nesta fase ocorrem todos os eventos necessários para que o oócito
expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Os inibidores
de maturação nuclear, butirolactona I e roscovitina, mantêm os oócitos bovinos no
estádio de VG de maneira reversível. Os antioxidantes (cisteamina e β-mercaptoetanol)
protegem as células do estresse oxidativo nos meios de cultivo. Objetivou-se avaliar os
efeitos da butirolactona I, roscovitina, cisteamina e β-mercaptoetanol sobre a maturação
nuclear e citoplasmática in vitro de oócitos bovinos e sobre a concentração intracelular
de glutationa [GSHi] desses oócitos. Para avaliar o bloqueio meiótico e a cinética da
maturação nuclear oócitos foram corados com Mowiol-Hoechst após 8, 16 e 24 horas
do início de MIV. Ao final das 24 horas de cultivo, os oócitos de todos os grupos
apresentaram taxas esperadas de M II variando de 73,42 a 85,36% (P>0,05),
demonstrando que a retomada da meiose foi reversível nos grupos pré-maturados com
inibidores. A maturação citoplasmática foi avaliada pela distribuição dos GC pela
coloração FITC-LCA após 16 e 24 horas de MIV, apresentando maior porcentagem
(P<0,05) dos oócitos maturos (78,52 – 82,92%) nos grupos pré-maturados com
roscovitina em comparação com os demais grupos, variando de 52,07 a 66,17%. Para
avaliar o estresse oxidativo do meio, mensuramos a [GSHi] dos oócitos com 24 horas
de MIV, sendo que o grupo SFB obteve a maior concentração (3,66 pmol/oócito;
P<0,05). A butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira
reversível e mais eficiente que a roscovitina, e a presença dos antioxidantes cisteamina
e β-mercaptoetanol não interferiu na retomada da maturação nuclear.
Palavras-Chave: Maturação in vitro, oócito, bovino, grânulos corticais, glutationa
20
Introdução
A maturação compreende todos os eventos que permitem ao oócito expressar
seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Durante a maturação, os
oócitos sofrem várias alterações nucleares e citoplasmáticas. Os eventos nucleares
incluem: quebra da vesícula germinativa (GVBD), desaparecimento do nucléolo,
condensação da cromatina, extrusão do primeiro corpúsculo polar e formação do
segundo fuso meiótico, enquanto os eventos citoplasmáticos incluem: redistribuição das
organelas intracelulares (mitocôndrias migram para posição perinuclear e grânulos
corticais depositam-se abaixo da membrana vitelina) e maturação dos mecanismos de
liberação do Ca
2+
(revisado por HE et al., 1997). Sabe-se que grânulos corticais (GC)
são grânulos secretores, cujo exsudato é capaz de alterar a função e promover o
endurecimento da zona pelúcida (CHERR et al., 1988).
Apenas a maturação nuclear do oócito não é suficiente para resultar no
subseqüente desenvolvimento embrionário. A maturação nuclear e a citoplasmática são
consideradas importantes para o desenvolvimento embrionário normal após a
fertilização (YANG et al., 1998). Pode-se hipotetizar que a competência para o
desenvolvimento de oócitos maturados in vitro aumente se estes oócitos forem
mantidos no estádio de vesícula germinativa (VG), permitindo uma oportunidade
adicional para que a maturação citoplasmática ocorra (RODRIGUEZ e FARIN, 2004).
Tentativas têm sido feitas com o intuito de manter a meiose estacionada com
estabilização farmacológica (realizada pelo cicloheximide, 6-dimetilaminopurina,
butirolactona I, roscovitina) ou com inibidores fisiológicos (células da teca) (RICHARD et
al., 1997; SAEKI et al., 1997; AVERY et al., 1998; KUBELKA et al., 2000; MERMILLOD
et al., 2000). A roscovitina é uma purina conhecida especificamente por inibir a
atividade da MPF cinase em numerosos sistemas celulares, mantém oócitos bovinos no
estádio de vesícula germinativa (MERMILLOD et al., 2000) e é um inibidor seletivo das
cinases dependentes de ciclinas cdk 1, 2 e 5 (KNOCKAERT et al., 2002). Butirolactona I
é um dos compostos que funcionam como um potente, específico e reversível inibidor
da quebra da vesícula germinativa (GVBD). Esta molécula age como um inibidor
21
competitivo do ATP, é um inibidor potente e específico de cinases dependente de
ciclinas (cdks), e tem algum efeito inibitório em outras proteínas cinases como a MAPK
(KITAGAWA et al., 1993; 1994; MOTLIK et al., 1998).
Todavia, a utilização de um sistema duplo de cultivo de oócitos (pré-maturação
com inibidores seguido de maturação), implica na manutenção dos oócitos em cultivo
por período de tempo mais prolongado que o habitual, expondo-os à prováveis efeitos
deletérios que podem ser oriundos do sistema de cultivo, como por exemplo as
elevadas concentrações de oxigênio (O
2
). Em sistemas de cultivo in vitro, o estresse
oxidativo ocorre quando o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) ultrapassa
a capacidade antioxidante do sistema. A alta concentração de O
2
atmosférico induz a
geração de radicais livres que são produzidos por várias vias metabólicas e enzimas do
oócito, embrião ou das células foliculares (células do cumulus) co-cultivadas com estes
(NASR-ESFAHANI et al., 1990). Para proteger o oócito e os embriões do estresse
oxidativo durante o cultivo, antioxidantes podem ser adicionados ao meio de cultivo.
Glutationa (GSH) é um antioxidante natural presente em ambos os gametas, mas em
níveis variáveis. Os níveis de GSH encontrados no oócito no final da maturação são
considerados bons marcadores bioquímicos da viabilidade oocitária (ABEYDEERA et
al., 1998).
Indubitavelmente, muitos fatores biológicos agem de forma conjunta para
preparar o oócito imaturo para um desenvolvimento bem sucedido e um embrião
competente depois da fecundação. Defeitos na maturação oocitária podem,
possivelmente, serem causados por uma inadequada maturação nuclear ou
citoplasmática, ou mesmo por uma falha em ambas (YANG et al., 1998). A
compreensão exata das necessidades metabólicas do oócito em sistemas de cultivo de
maturação in vitro pressupõe a necessidade de novas pesquisas até que seja
estabelecida a condição ideal para que o maior número possível de oócitos maturados
in vitro adquira a competência de desenvolvimento e torne-se hábil para sustentar o
desenvolvimento inicial do embrião.
Os objetivos deste trabalho foram avaliar a cinética da maturação nuclear e
citoplasmática (avaliada pela migração dos grânulos corticais) e produção de glutationa
22
de oócitos maturados com inibidores da maturação nuclear e antioxidantes durante a
inibição da maturação nuclear e após a sua reversão.
Material e Métodos
Obtenção dos oócitos
Os ovários de bovinos abatidos nos abatedouros de Guararapes-SP e Birigüi-SP
foram retirados das carcaças aproximadamente 20 minutos após o abate, mantidos em
solução salina estéril a 30-35°C e transportados para o laboratório em caixas térmicas,
não excedendo o limite de 6 horas desde o abate até o início das aspirações. As
punções foliculares foram realizadas manualmente por meio de agulha de calibre 18-G
adaptada a seringa de 20 mL, ambas descartáveis. Todo o material aspirado foi
transferido para tubos plásticos de 50 mL e decantado por 15 minutos para seleção dos
oócitos.
Seleção dos oócitos
O sedimento foi transferido para placas de poliestireno de 60 mm de diâmetro e
avaliado em microscópio estereoscópico. Os oócitos com cumulus compacto, possuindo
pelo menos 4 camadas de células e de aparência saudável (citoplasma de granulação
homogênea) foram selecionados para o cultivo de maturação.
Maturação dos oócitos
Os oócitos selecionados foram lavados duas vezes em meio de lavagem H-199
(meio TCM-199 suplementado com 0,2 mM de piruvato, 20 mM de HEPES, 5 mM de
bicarbonato de sódio e 75 µg/mL de amicacina) e uma vez em meio de pré-maturação
(meio TCM-199 suplementado com 75 µg/mL de amicacina, 0,3% de BSA e 0,2 mM de
piruvato). O meio de pré-maturação foi suplementado com 25 µM de roscovitina ou 100
µM de butirolactona I e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM de cisteamina. Somente
foram pré-maturados os oócitos dos grupos contendo inibidores da maturação nuclear.
Estes oócitos foram avaliados quanto à cinética de maturação nuclear após 8, 16 e 24
23
horas do início do pré-cultivo e também avaliados quanto à cinética de maturação
citoplasmática após 24 horas de pré-cultivo.
Ao término do cultivo de pré-maturação, os oócitos foram transferidos para placa
de cultura contendo meio de maturação B-199 (meio TCM-199, suplementado com 0,2
mM de piruvato, 25 mM de bicarbonato de sódio, 75 µg/mL de amicacina, 1 µg/mL de
17-β estradiol, 0,5 µg/mL de FSH, 100 UI/mL de hCG e 0,6% de BSA) suplementado ou
não com 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM de cisteamina. Os demais grupos
experimentais (sem inibidores da maturação nuclear) foram apenas cultivados em meio
de maturação B-199. Os oócitos foram avaliados quanto à cinética de maturação
nuclear após 8, 16 e 24 horas de cultivo de maturação, e quanto à cinética de
maturação citoplasmática após 16 e 24 horas de cultivo. Também foi mensurada a
concentração intracelular de glutationa dos oócitos após 24 horas do cultivo de
maturação.
Os oócitos de todos os grupos foram cultivados em microgotas de 100 µL de
meio recoberto com óleo mineral, em estufa a 38,8°C com atmosfera de 5% de CO
2
em
ar e máxima umidade.
Métodos de coloração
Coloração com gel Mowiol-Hoechst
Os oócitos foram retirados do meio de maturação, colocados em tubos de
microcentrífuga com tripsina a 0,1% e levados ao vortex para remoção das células do
cumulus por 3 a 5 minutos. Os oócitos desnudos foram fixados em solução de
formamida 4% durante 5 minutos e em seguida em solução de Triton 1% por 10
minutos. Foram corados em gel Mowiol-Hoechst (10 µg de Hoechst 33342 para 1 mL
da solução de gel) entre lâmina e lamínula (HOUSE EAR INSTITUTE, 2001). Para
análise quanto aos estádios da meiose (VG, M I e M II), as lâminas foram visualizadas
em microscópio equipado com epifluorescência (Microscópio Olympus IX51-III;
excitação 330 a 385 nm e emissão 420 nm).
A classificação dos oócitos de acordo com
as diversas fases da meiose pode ser observada na Figura 1.
24
Figura 1 - Fotomicrografia das diversas fases da maturação nuclear de oócitos bovinos
observados sob microscópio de epifluorescência A) Oócitos em VG: cromossomos
descondensados; B) Oócitos em M I: cromossomos condensados; C) Oócitos em M II:
cromossomos condensados na placa metafásica e no primeiro corpúsculo polar (1°
CP).
Coloração de grânulos corticais
Foi utilizada a metodologia descrita por CHERR et al. (1988) com algumas
modificações. A zona pelúcida foi removida por incubação em pronase 0,5% por
aproximadamente 5 minutos. Depois, os oócitos foram fixados em solução de
formaldeído em PBS a 3% por 30 minutos, e em seguida incubados durante a noite em
solução de bloqueio – SB (PBS com 1 mg/mL de BSA, 100 mM de glicina e 0,2% de
azida de sódio). Os oócitos foram permeabilizados por 5 minutos em SB acrescida de
0,1% de Triton X-100 e a seguir foram incubados em 10 µg/mL de Lens culinaris
aglutinina conjugado à isotiocianato de fluoresceína (FITC-LCA; esta lecitina se liga
especificamente à α-D-manose presente nos grânulos corticais) em SB por 15 min. Em
seguida, os oócitos foram lavados em SB 3 vezes. As lâminas foram montadas em gel
Mowiol-Hoechst e visualizadas em microscópio de epifluorescência (Microscópio
Olympus IX51-III; excitação 420 a 460 nm e emissão 515 nm) para avaliação da
distribuição dos grânulos corticais no interior dos oócitos. De acordo com o padrão de
distribuição dos grânulos corticais, os oócitos foram classificados em três grupos: GC
distribuídos em ‘’clusters’’ – oócito imaturo; GC dispersos (periféricos) e parcialmente
em ‘’clusters’’ – parcialmente maturos; GC periféricos – oócitos maturos (figura 2), de
acordo com HOSOE e SHIOYA (1996) e MÉO (2002).
A
B
C
1º CP
25
Figura 2 - Fotomicrografia das diversas fases da maturação citoplasmática de oócitos
bovinos observados sob microscópio de epifluorescência A) GC dispostos em ‘’clusters’’
no interior do oócito (oócito imaturo); B) GC dispostos tanto no centro como na periferia
do oócito (oócito parcialmente maturo); C) GC dispostos na periferia do oócito (oócito
maturo).
Mensuração da concentração intraoocitária de glutationa dos oócitos
maturados
O protocolo utilizado foi descrito por BROWNE e ARMSTRONG (1998) com
algumas adaptações. Após o cultivo de MIV, 30 oócitos de cada tratamento foram
desnudados com tripsina 0,1% e depositados em microtubo (500µL) contendo 100 µL
de solução de extração de ácido meta-fosfórico (SEAM - 1,67 g de ácido meta-fosfórico,
200 mg de EDTA e 30 g de NaCl em 90 mL de H
2
O). Para lise dos oócitos, cada
amostra foi agitada com agulha de insulina (29 G “½”) e posteriormente estocada em
freezer
–
20°C. Após a colheita de cinco repetições as amostras foram descongeladas e
centrifugadas por 4 minutos a 1.500 rpm (540xg) para precipitação dos “debris”
celulares. O sobrenadante (100 µL) de cada amostra foi transferido individualmente
para um tubo de ensaio contendo 2 mL de solução tampão de glutationa (TG - 0,1 M de
fosfato de sódio monobásico e 5 mM de EDTA em 1 L de H2O – pH 8,0). Foram
adicionados 100 µL do reagente o-phthaldialdehyde - OPT (25 mg de OPT em 25 mL
de metanol) em cada tubo de ensaio e estes foram incubados por 15 minutos no
escuro. As amostras foram lidas em espectrofotômetro (Hitachi – F-2500) ajustado para
emissão de fluorescência de 420 nm e excitação de 350 nm. A [GSHi] em pmol de cada
amostra foi determinada pela equação da reta obtida da curva padrão da concentração
B
A
C
26
de GSH. Esta concentração foi dividida pelo número de oócitos presentes em cada
amostra para se obter a [GSHi] em pmol por oócito.
Construção da curva padrão da concentração de GSH
Foi preparada uma solução padrão de GSH (0,10 mg de GSH reduzida por mL
de TG). Esta solução padrão foi diluída em água Milli-Q em concentrações
decrescentes totalizando 5 amostras (0,05, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01 mg/mL de GSH) e
uma sem GSH (branco, 0 mg/mL). De cada amostra foram retirados 100 µL e
homogeneizados com 1,9 mL de SEAM. Foram retirados 100 µL dessa solução, que foi
homogeneizada com 2 mL TG. Em cada tubo foi adicionado 100 µL do reagente OPT,
homogeneizado e incubado por exatamente 15 minutos antes da leitura em
espectrofotômetro. A leitura foi realizada com emissão de fluorescência de 420 nm e
excitação de 350 nm. Foram realizadas cinco repetições para cada amostra padrão. As
concentrações das amostras padrão foram convertidas em pmol de GSH. A partir
destas concentrações, foi elaborada uma curva padrão, sendo obtida a equação da
reta:
Equação do gráfico y = 0,1446x - 0,7374
x = (y + 0,7374)/ 0,1446
Sendo: x= concentração da amostra em pmol e y = emissão da amostra em 420 nm
27
Curva Padrão Glutationa
-10,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
0 100 200 300 400
Concentração GSH (pmol)
Emissão (420nm)
Figura 3 - Curva padrão de glutationa.
Delineamento experimental
Os oócitos foram pré-maturados em meio suplementado com 0,3% de BSA e 25
µM de roscovitina ou 100 µM de butirolactona I e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM
de cisteamina. Depois foram maturados em meio B-199 suplementado com 0,6% de
BSA e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM de cisteamina conforme grupos
experimentais abaixo:
Pré-Maturação:
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina (R);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina + 50 µM de
cisteamina (RC);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina + 50 µM de β-
mercaptoetanol (RM);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I (B);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I + 50 µM
de cisteamina (BC);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I + 50 µM
de β-mercaptoetanol (BM);
28
Maturação:
(S) →
→→
→ B-199 suplementado com 10% de SFB (PADRÃO);
(C) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA (CONTROLE);
(CC) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina;
(CM) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-mercaptoetanol;
(CR) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA
(CRC) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina
(CRM) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-
mercaptoetanol
(CB) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA
(CBC) →
→→
→ 199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina
(CBM) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-
mercaptoetanol
Experimento I: Cinética da Maturação Nuclear
Os oócitos foram avaliados quanto à cinética da maturação nuclear:
Pré-maturação (grupos com inibidores de maturação nuclear): 8, 16 e 24
horas do início da pré-maturação pela coloração com gel Mowiol-Hoechst.
Maturação: 8, 16 e 24 horas do início da maturação pela coloração com gel
Mowiol-Hoechst.
Experimento II: Cinética da Maturação Citoplasmática
Os oócitos foram avaliados quanto à cinética da maturação citoplasmática:
Pré-maturação (grupos com inibidores de maturação nuclear): 24 horas do
início da pré-maturação pela coloração dos grânulos corticais (GC) com Lens culinaris
aglutinina conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC-LCA).
Maturação: 16 e 24 horas do início da maturação pela coloração dos GC com
(FITC-LCA).
SEM
PRÉ
-
MIV
COM
PRÉ
-
MIV
29
Experimento III: Determinação da Concentração Intraoocitária de Glutationa
Os oócitos foram coletados para a determinação da concentração de glutationa
intraoocitária utilizando espectrofluorímetro com 24 horas do início da maturação.
Análise Estatística
Para avaliar o efeito da suplementação do meio de cultura com inibidores da
maturação nuclear e antioxidantes sobre a maturação os dados foram analisados pela
fração de oócitos cultivados que atingiram os estágios determinados de maturação,
reportados em termos de porcentagem (%). Como a porcentagem de oócitos maturados
não obteve distribuição normal, os dados foram transformados em arc sen % . Foi
aplicada análise de variância (ANOVA) para comparação dos tratamentos em cada uma
das fases de maturação dos oócitos e, posteriormente, foi aplicado teste de Duncan
para comparação múltipla das médias.
Para avaliar o efeito da suplementação do meio de cultura com antioxidantes
sobre a variável concentração de glutationa intracelular dos oócitos foi realizada
ANOVA para comparação dos tratamentos. Posteriormente foi aplicado teste de
Duncan para comparação múltipla das médias.
O nível de significância adotado foi de 5%. A análise estatística foi efetuada
empregando-se o sistema SAS (Statistical Analysis System).
Resultados
Experimento I – Cinética da Maturação Nuclear
Cultivo de Pré-Maturação
Após 8 horas do início do cultivo de pré-maturação observou-se que a maioria
dos oócitos estava na fase de VG para todos os grupos avaliados. Todavia, foi
observada maior porcentagem (P<0,05) de oócitos em VG (94,38 – 97,53%) nos grupos
pré-maturados com butirolactona I, ao passo que uma pequena porcentagem daqueles
pré-maturados com roscovitina escapou desta inibição e se encontravam na fase de M I
30
(11,11 – 26,33%) (P<0,05; Tabela 1). Com 16 horas do início do cultivo de pré-
maturação, a maior parte oócitos dos grupos pré-maturados com butirolactona I
encontrava-se em VG (93,06 – 96,01%), enquanto que os pré-maturados com
roscovitina estavam em M I (19,11 – 30,11%) (P<0,05; Tabela 2). Ao final das 24 horas
do cultivo de pré-maturação os oócitos dos grupos pré-maturados com butirolactona I
ainda permaneceram em VG (84,15 – 85,85%), mas parte dos oócitos pré-maturados
com roscovitina alcançou o estádio de M II (18,57 – 29,11%) (P<0,05; Tabela 3).
Tabela 1 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 8 horas com inibidores da
maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol).
Fase da meiose n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
VG M I M II
B 67
63 (94,58 ± 1,76)
ab
2 (2,56 ± 1,62)
c
2 (2,86 ± 1,84)
a
BC 79
77 (97,53 ± 1,56)
a
2 (2,47 ± 1,56)
c
0 (0,00 ± 0,00)
a
BM 64
61 (94,38 ± 2,63)
ab
3 (5,62 ± 2,63)
bc
0 (0,00 ± 0,00)
a
R 75
66 (88,89 ± 3,94)
b
9 (11,11 ± 3,94)
b
0 (0,00 ± 0,00)
a
RC 81
59 (73,67 ± 3,68)
c
22 (26,33 ± 3,68)
a
0 (0,00 ± 0,00)
a
RM 73
54 (73,98 ± 4,09)
c
18 (24,83 ± 3,68)
a
1 (1,19 ± 1,19)
a
VG: Vesícula Germinativa; M I: Metáfase I; M II: Metáfase II.
abc
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Tabela 2 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 16 horas com inibidores
da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol).
Fase da meiose n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
VG M I M II
B 62
57 (93,06 ± 4,52)
a
3 (4,17 ± 2,85)
c
2 (2,78 ± 2,78)
a
BC 75
70 (93,31 ± 2,73)
a
5 (6,69 ± 2,73)
bc
0 (0,00 ± 0,00)
a
BM 60
57 (96,01 ± 1,80)
a
2 (2,80 ± 1,78)
c
1 (1,19 ± 1,19)
a
R 73
54 (75,62 ± 7,15)
b
15 (19,11 ± 4,92)
ab
4 (5,28 ± 4,09)
a
RC 49
30 (62,11 ± 5,71)
b
16 (30,11 ± 3,93)
a
3 (7,78 ± 6,54)
a
RM 77
55 (70,84 ± 5,59)
b
17 (22,43 ± 5,87)
a
5 (6,73 ± 3,96)
a
VG: Vesícula Germinativa; M I: Metáfase I; M II: Metáfase II.
abc
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
31
Tabela 3 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores
da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol).
Fase da meiose n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
VG M I M II
B 83
71 (85,85 ± 7,26)
a
6 (7,09 ± 3,59)
a
6 (7,07 ± 5,38)
b
BC 65
55 (84,31 ± 8,19)
a
7 (11,53 ± 6,42)
a
3 (4,17 ± 4,17)
b
BM 85
72 (84,15 ± 9,16)
a
9 (11,00 ± 6,00)
a
4 (4,85 ± 3,55)
b
R 79
52 (66,41 ± 10,98)
ab
12 (15,02 ± 5,33)
a
15(18,57 ± 7,20)
ab
RC 74
44 (58,35 ± 11,25)
ab
9 (12,54 ± 5,12)
a
21 (29,11 ± 9,06)
a
RM 77
42 (54,05 ± 6,73)
b
13 16,87 ± 5,67)
a
22 (29,08 ± 6,03)
a
VG: Vesícula Germinativa; M I: Metáfase I; M II: Metáfase II.
ab
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Cultivo de Maturação
Após 8 horas do início do cultivo de maturação observou-se que os oócitos dos
grupos pré-maturados com roscovitina estavam distribuidos nas três fases avaliadas VG
(29,56 – 43,25%), M I (22,21 – 27,74%) e M II (34,54 – 42,70%), e que os demais
grupos tiveram os oócitos bloqueados em VG (70,84 – 86,86%) (P<0,05; Tabela 4).
Com 16 horas do início do cultivo de maturação a maior parte dos oócitos dos grupos
sem inibidores de maturação nuclear estava em M I (48,76 – 55,33%), ao passo que a
maioria dos oócitos dos grupos pré-maturados com butirolactona I já havia alcançado o
estádio de M II (65,64 – 69,79%) e os dos grupos pré-maturados com roscovitina
ficaram praticamente distribuídos entre as fases de M I (36,08 – 50,83%) e M II (40,41 –
51,74%; Tabela 5). Ao final das 24 horas do cultivo de maturação, observou-se que a
maioria dos oócitos estava na fase de M II (73,42 – 85,36%), para todos os grupos
avaliados (P>0,05; Tabela 6), demonstrando que o bloqueio da butirolactona I e
roscovitina foi totalmente reversível.
32
Tabela 4 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores
da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 8 horas.
Fase da meiose n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
VG M I M II
S 81
63 (78,57 ± 10,27)
a
18 (21,43 ± 10,27)
a
0 (0,00 ± 0,00)
c
C 78
67 (86,86 ± 5,31)
a
10 (11,97 ± 4,54)
a
1 (1,11 ± 1,11)
bc
CC 81
64 (80,52 ± 5,70)
a
17 (20,12 ± 6,23)
a
0 (0,00 ± 0,00)
c
CM 86
72 (84,00 ± 5,71)
a
13 (14,82 ± 5,30)
a
1 (1,19 ± 1,19)
bc
CB 80
56 (70,84 ± 10,05)
a
19 (22,84 ± 8,90)
a
5 (6,32 ± 3,08)
b
CBC 65
52 (83,18 ± 7,00)
a
9 (11,96 ± 4,96)
a
4 (4,87 ± 2,52)
bc
CBM 80
64 (80,24 ± 8,68)
a
15 (18,57 ± 7,67)
a
1 (1,19 ± 1,19)
bc
CR 72
30 (43,25 ± 5,76)
b
16 (22,21 ± 5,00)
a
26 (34,54 ± 6,31)
a
CRC 83
32 (38,61 ± 7,26)
b
20 (22,68 ± 4,92)
a
31 (37,25 ± 5,43)
a
CRM 84
24 (29,56 ± 7,05)
b
24 (27,74 ± 8,63)
a
36 (42,70 ± 6,09)
a
VG: Vesícula Germinativa; M I: Metáfase I; M II: Metáfase II.
abc
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Tabela 5 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores
da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 16 horas.
Fase da meiose n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
VG M I M II
S 69
11 (17,63 ± 10,90)
a
38 (52,22 ± 9,60)
a
20 (30,15 ± 9,99)
bc
C 70
17 (23,69 ± 6,08)
a
30 (48,76 ± 8,72)
a
18 (27,55 ± 10,74)
bc
CC 70
12 (21,67 ± 8,01)
a
39 (55,33 ± 9,55)
a
18 (23,01 ± 10,85)
c
CM 80
11 (13,42 ± 5,15)
a
44 (55,01 ± 6,01)
a
25 (31,57 ± 9,77)
bc
CB 71
8 (11,71 ± 3,88)
a
13 (18,50 ± 4,93)
b
48 (69,79 ± 7,20)
a
CBC 76
11 (13,92 ± 5,33)
a
12 (16,31 ± 4,58)
b
53 (69,77 ± 5,65)
a
CBM 72
9 (12,40 ± 3,97)
a
15 (21,96 ± 6,50)
b
48 (65,64 ± 7,16)
a
CR 72
14 (17,23 ± 6,07)
a
24 (36,08 ± 8,09)
ab
34 (46,69 ± 6,06)
abc
CRC 78
9 (11,24 ± 3,13)
a
29 (37,02 ± 6,05)
ab
40 (51,74 ± 6,82)
ab
CRM 78
7 (8,76 ± 3,53)
a
39 (50,83 ± 7,08)
a
32 (40,41 ± 7,77)
abc
VG: Vesícula Germinativa; M I: Metáfase I; M II: Metáfase II.
abc
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
33
Tabela 6 – Estádio nuclear de oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores
da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 24 horas.
Fase da meiose n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
VG M I M II
S 79
0 (0,00 ± 0,00)
a
12 (16,55 ± 5,84)
a
67 (83,46 ± 5,84)
a
C 79
0 (0,00 ± 0,00)
a
15 (18,96 ± 2,99)
a
64 (81,05 ± 2,99)
a
CC 84
2 (2,38 ± 1,51)
a
14 (16,52 ± 2,00)
a
68 (81,03 ± 2,08)
a
CM 79
1 (1,39 ± 1,39)
a
14 (18,11 ± 3,62)
a
64 (80,50 ± 4,84)
a
CB 71
2 (3,27 ± 2,18)
a
10 (12,84 ± 5,02)
a
59 (83,89 ± 4,07)
a
CBC 67
0 (0,00 ± 0,00)
a
15 (26,58 ± 9,64)
a
52 (73,42 ± 9,64)
a
CBM 78
2 (2,47 ± 1,56)
a
12 (15,53 ± 3,57)
a
64 (82,00 ± 2,68)
a
CR 84
1 (1,11 ± 1,11)
a
19 (23,58 ± 5,16)
a
64 (75,31 ± 5,12)
a
CRC 78
1 (1,28 ± 1,28)
a
10 (13,35 ± 3,40)
a
67 (85,36 ± 3,77)
a
CRM 62
2 (2,56 ± 2,56)
a
13 (17,54 ± 6,72)
a
47 (79,90 ± 7,57)
a
VG: Vesícula Germinativa; M I: Metáfase I; M II: Metáfase II.
abc
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Experimento II – Cinética da Maturação Citoplasmática
Cultivo de Pré-Maturação
Os resultados obtidos com 24 horas do início do cultivo de pré-maturação
demonstraram que os oócitos pré-maturados com butirolactona I encontraram-se
imaturos (38,85 – 49,81%) e parcialmente maturos (32,80 – 40,38%), enquanto que
aqueles pré-maturados com roscovitina estavam, na sua maioria, maturos (46,11 –
51,08%) (P<0,05; Tabela 7).
34
Tabela 7 – Avaliação da maturação citoplasmática pela distribuição de grânulos
corticais em oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores da maturação
nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-
mercaptoetanol).
Distribuição de grânulos corticais n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
Imaturo Parcialmente
Maturo
Maturo
0 h 70
34 (48,54 ± 10,50) 25 (35,32 ± 4,53) 11 (16,14 ± 7,28)
B 72
36 (49,45 ± 11,24)
a
25 (34,43 ± 5,79)
a
11 (16,12 ± 6,43)
b
BC 72
35 (49,81 ± 11,85)
a
24 (32,80 ± 8,06)
a
13 (17,39 ± 7,20)
b
BM 63
25 (38,85 ± 10,71)
a
26 (40,38 ± 8,00)
a
12 (20,77 ± 8,42)
b
R 82
17 (21,04 ± 5,84)
a
23 (27,89 ± 3,26)
a
42 (51,08 ± 8,22)
a
RC 72
19 (26,59 ± 4,31)
a
17 (25,10 ± 5,58)
a
36 (48,32 ± 9,03)
a
RM 70
17 (24,15 ± 5,69)
a
20 (29,74 ± 3,21)
a
33 (46,11 ± 4,66)
a
ab
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Cultivo de Maturação
Após 16 horas do início do cultivo de maturação observou-se que os oócitos dos
grupos sem inibidores de maturação nuclear e daqueles pré-maturados com
butirolactona I apresentaram-se imaturos (23,55 -37,53%), parcialmente maturos (25,07
– 35,00%) e maturos (28,62 – 46,96%). A diferença (P<0,05) ocorreu principalmente em
relação aos grupos pré-maturados com roscovitina em que a maioria dos oócitos estava
maturo (61,15 -71,79%; Tabela 8). Ao final das 24 horas do cultivo de maturação a
maior parte dos oócitos estava maturo (52,07 – 82,92%) para todos os grupos
avaliados. Porém, os oócitos maturados com SFB tiveram a menor porcentagem de
oócitos maturos quando comparados aos demais grupos (P<0,05; Tabela 9).
35
Tabela 8 – Avaliação da maturação citoplasmática pela distribuição de grânulos corticais
em oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores da maturação nuclear
(butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-mercaptoetanol) seguidos
do cultivo de maturação por 16 horas.
Distribuição de grânulos corticais n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
Imaturo Parcialmente
Maturo
Maturo
S 78
30 (38,43 ± 5,95)
a
26 (32,95 ± 3,03)
a
22 (28,62 ± 6,67)
d
C 81
25 (31,10 ± 10,07)
abc
24 (29,88 ± 5,48)
a
32 (39,02 ± 10,21)
bcd
CC 87
24 (27,43 ± 5,79)
abc
31 (34,79 ± 5,28)
a
32 (37,79 ± 8,19)
bcd
CM 77
18 (23,55 ± 6,74)
abc
26 (35,00 ± 7,25)
a
33 (41,45 ± 12,18)
bcd
CB 70
27 (37,53 ± 5,07)
a
19 (27,78 ± 3,38)
a
24 (34,69 ± 3,30)
cd
CBC 65
22 (27,34 ± 7,18)
abc
19 (25,70 ± 6,00)
a
24 (46,97 ± 11,07)
abcd
CBM 63
19 (30,45 ± 6,08)
ab
15 (25,07 ± 2,87)
a
29 (44,48 ± 5,97)
abcd
CR 83
14 (17,57 ± 4,96)
abc
18 (21,28 ± 3,54)
a
51 (61,15 ± 7,00)
abc
CRC 80
10 (12,09 ± 5,07)
bc
16 (19,80 ± 2,96)
a
54 (68,12 ± 7,37)
ab
CRM 77
8 (10,05 ± 4,14)
c
15 (19,45 ± 5,38)
a
55 (71,79 ± 7,13)
a
abcd
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Tabela 9 – Avaliação da maturação citoplasmática pela distribuição de grânulos corticais
em oócitos pré-maturados durante 24 horas com inibidores da maturação nuclear
(butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes (cisteamina ou β-mercaptoetanol) seguidos
do cultivo de maturação por 24 horas.
Distribuição de grânulos corticais n (%média ± EPM)
Grupos Oócitos
Cultivados
Imaturo Parcialmente
Maturo
Maturo
S 60
14 (22,07 ± 5,35)
a
15 (25,86 ± 4,08)
a
31 (52,07 ± 3,02)
c
C 70
15 (21,32 ± 5,36)
a
9 (12,78 ± 1,58)
a
46 (65,90 ± 6,70)
abc
CC 83
13 (15,00 ± 4,28)
ab
20 (24,68 ± 4,11)
a
50 (60,32 ± 2,64)
bc
CM 69
9 (13,87 ± 4,92)
ab
17 (21,53 ± 5,05)
a
43 (64,60 ± 7,09)
bc
CB 73
15 (20,88 ± 4,42)
a
10 (12,95 ± 5,58)
a
48 (66,17 ± 8,51)
abc
CBC 72
14 (20,71 ± 5,63)
a
16 (23,85 ± 6,47)
a
42 (55,44 ± 9,37)
bc
CBM 81
13 (16,63 ± 5,20)
a
21 (26,48 ± 5,21)
a
47 (56,89 ± 7,76)
bc
CR 64
4 (4,85 ± 3,55)
b
6 (12,23 ± 7,94)
a
54 (82,92 ± 8,50)
a
CRC 77
3 (4,05 ± 1,86)
b
11 (15,23 ± 5,41)
a
63 (80,73 ± 4,62)
ab
CRM 80
3 (4,17 ± 2,85)
b
14 (17,31 ± 4,47)
a
63 (78,52 ± 4,73)
ab
abc
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
36
Experimento III – Determinação da Concentração Intraoocitária de
Glutationa
A avaliação da concentração intraoocitária de GSH por oócito nos diferentes
grupos experimentais demonstrou que oócitos maturados com SFB apresentaram a
maior [GSHi] (3,66 pmol) quando comparado aos grupos CB, CBM, CR e CRM (2,18;
2,12; 2,14; 2,00 pmol) respectivamente (P<0,05; Tabela 10 e Figura 4).
Tabela 10 - Concentração de glutationa intracelular por oócito submetidos a diferentes
condições de maturação por 24 horas.
Grupo Nº de oócitos [ ] GSH [média(pmol/oócito) ± EPM]
S 150 3,66 ± 0,85
a
C 150 3,20 ± 0,33
ab
CC 150 2,91 ± 0,68
ab
CM 150 3,02 ± 0,35
ab
CB 150 2,18 ± 0,23
b
CBC 150 2,61 ± 0,34
ab
CBM 150 2,12 ± 0,16
b
CR 150 2,14 ± 0,27
b
CRC 150 2,78 ± 0,31
ab
CRM 150 2,00 ± 0,24
b
Total 1500 Média total = 2,66 pmol/oócito
ab
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
37
Figura 4 – Concentração de GSH intracelular em oócitos maturados em diferentes
meios de cultura por 24 horas.
S= SFB (10%), C= BSA (0,6%), CC= BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CM= BSA (0,6%) + βME (50 µM),
CB= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM) / MIV BSA (0,6%); CBC= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM)
+ CIS (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CBM= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM) + βME (50
µM) / MIV BSA (0,6%) + βME (50 µM), CR= pré-MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) / MIV BSA (0,6%);
CRC= pré-MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) + CIS (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CRM= pré-
MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) + βME (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + βME (50 µM).
ab
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Discussão
Experimento I – Cinética da Maturação Nuclear
O cultivo de pré-maturação na presença de inibidores meióticos é uma tentativa
de se mimetizar a capacitação oocitária que ocorre in vivo. O bloqueio meiótico visa
manter os oócitos em estádio de vesícula germinativa (VG) para que os mesmos
tenham um tempo adicional para sofrer as modificações que ocorrem antes da
maturação propriamente dita (HYTTEL et al., 1997) e adquirir maior competência para
o desenvolvimento (KUBELKA et al., 2000; MERMILLOD et al., 2000). Neste sentido, o
oócito pode ter a possibilidade de construir, modificar e armazenar novas proteínas
sintetizadas e ribonucleoproteínas que podem aumentar a competência de
desenvolvimento.
0
1
2
3
4
5
S C CC CM CB CBC CBM CR CRC CRM
GRUPOS
a
a
b
a
b
a
b
b
a
b
b
b
a
b
b
38
Um dos tratamentos usualmente utilizados é o cultivo de pré-maturação na
presença de inibidores de cinases dependentes de ciclinas (CDK) (MERMILLOD et al.,
2000; PONDERATO et al., 2001; KUBELKA et al., 2002). A butirolactona I tem
demonstrado inibir a retomada da meiose de oócitos bovinos de maneira reversível por
24 horas sem ter um efeito negativo no subseqüente estádio de blastocisto (MOTLIK et
al., 1998; IMAI et al., 1999; KUBELKA et al., 2000; LONERGAN et al., 2000). Do
mesmo modo, a roscovitina tem demonstrado ser efetiva em bovinos (MERMILLOD et
al., 2000).
O presente trabalho verificou a cinética da maturação nuclear de oócitos bovinos
maturados na presença dos inibidores butirolactona I ou roscovitina, adicionados ou
não dos antioxidantes cisteamina ou -mercaptoetanol. A cinética da maturação
nuclear foi observada durante o cultivo de pré-maturação (com os inibidores), e
também durante a maturação sem a presença destes inibidores.
Com 8 e 16 horas do cultivo de pré-maturação, observamos que a maioria dos
oócitos de todos os grupos encontrava-se no estádio de VG. Entretanto, foi observada
maior porcentagem de oócitos em VG nos grupos pré-maturados com butirolactona I,
ao passo que uma pequena porcentagem daqueles pré-maturados com roscovitina
escapou desta inibição e se encontravam na fase de M I. A roscovitina atua inibindo as
cinases específicas dependentes de ciclo celular cdc2, cdk2 e cdk5 (MEIJER et al.,
1997); e a butirolactona I atua como inibidor específico das cinases cdk2 e cdc2
(KITAGAWA et al., 1993). Ambas atuam competindo pelo sítio de ligação do ATP
dessas cinases (DAMIENS e MEIJER, 2000), e assim podem prevenir a retomada da
meiose inibindo a atividade do MPF (KUBELKA et al., 2000; KRISCHEK e MEINECKE,
2001). Esta diferença na atividade inibitória das cinases pode ser explicada por
MERMILLOD et al., (2000), que sugeriram que a roscovitina, em baixas doses, pode
ser eficiente em inibir a atividade do MPF (assim como a butirolactona I), mas não em
inibir a atividade da MAPK, permitindo a retomada da meiose pelos oócitos até o
estádio de M I.
As taxas de bloqueio meiótico usando butirolactona I (por 24 horas no cultivo de
pré-maturação) neste estudo (85,85%) foram similares aos resultados de ADONA e
39
LEAL (2004) (97,5%) e de KUBELKA et al. (2000) (89,5%). O bloqueio meiótico com a
roscovitina apresentou 66,41% dos oócitos em VG e 18,57% em M II, enquanto que
ADONA e LEAL (2004) observaram 79,9% dos oócitos em VG, e MERMILLOD et al.
(2000) 83% dos oócitos em VG. Observamos que estes inibidores são efetivos em
bloquear a meiose de oócitos bovinos, entretanto a butirolactona I se mostrou mais
eficiente neste bloqueio que a roscovitina.
Para verificar a reversibilidade do bloqueio meiótico da roscovitina e da
butirolactona I, cultivamos os oócitos pré-maturados por 24 horas por mais 8, 16 e 24
horas na ausência dos inibidores e observamos e estádio de maturação.
Após 8 horas do início do cultivo de maturação, observou-se que os oócitos dos
grupos pré-maturados com roscovitina estavam distribuídos nas três fases avaliadas
(VG, M I e M II), e que em todos os outros grupos ainda se encontravam na fase de
VG. Com 16 horas do início do cultivo de maturação, a maior parte dos oócitos dos
grupos sem inibidores de maturação nuclear estava em M I, ao passo que a maioria
dos oócitos dos grupos pré-maturados com butirolactona I já havia alcançado o estádio
de M II, e os dos grupos pré-maturados com roscovitina ficaram praticamente
distribuídos entre as fases de M I e M II. Da mesma maneira que ADONA e LEAL
(2004), foi observada uma aceleração da meiose após transferência dos oócitos para
meio sem inibidores. Essa aceleração pode ser um padrão do tipo de droga e não um
efeito da concentração, pois é observada em diferentes espécies, diferentes inibidores
de CDK (butirolactona I, roscovitina e a mistura de ambos) e concentrações diferentes
como 10 e 100 M.
Alguns estudos mostram que o bloqueio da meiose de oócitos não inibe
completamente a síntese (MARCHAL et al., 2001) e fosforilação protéicas (VIGNERON
et al., 2004) ou a transcrição (LEQUARRE et al., 2004). WU et al. (2002) ainda
observaram que a MAPK, embora inibida durante o bloqueio, é rapidamente ativada
após a remoção do inibidor. Isso indica que durante o bloqueio pode haver acúmulo de
fatores necessários à progressão meiótica.
O efeito dessa aceleração, porém, não parece ser deletério, pois as taxas de
desenvolvimento até a fase de blastocisto usando tais tratamentos não foram
40
prejudicadas (BEKER-VAN WOUDENBERG et al., 2006) e podem até melhorar o
desenvolvimento até blastocisto (COY et al., 2005a). Além disso, recentemente foi
relatado o nascimento de leitões produzidos in vitro a partir de oócitos bloqueados
antes da MIV (COY et al., 2005b). O significado da aceleração da meiose ainda não
está bem esclarecido.
Com relação à reversibilidade do bloqueio meiótico da butirolactona I ao final do
cultivo de maturação, nossos resultados (83,89% dos oócitos em M II) foram
semelhantes aos de KUBELKA et al. (2000) (91%) e de LONERGAN et al. (2000)
(93,6%). A roscovitina demonstrou-se reversível em 75,31% dos oócitos em M II,
entretanto, outros autores observaram que 89% a 96% dos oócitos atingiram o estádio
de M II (MERMILLOD et al., 2000; ADONA e LEAL 2004). Os resultados demonstram
que os oócitos pré-maturados com estes inibidores de maturação nuclear são capazes
de reverter o bloqueio meiótico e retomar a meiose chegando a M II quando retirados
do meio de cultivo com inibidores, mas que a butirolactona I é capaz de bloquear a
maturação meiótica de maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina. A
maturação ainda pode ser atingida até mesmo em tempo inferior (16 horas) quando
comparados aos oócitos cultivados normalmente.
Observamos também que a presença dos antioxidantes (cisteamina e β-
mercaptoetanol) nos meios de pré-maturação e maturação não interferiu na ação da
butirolactona I e roscovitina em bloquear e retomar a maturação nuclear, já que os
grupos contendo estes antioxidantes se comportaram da mesma maneira que os
grupos somente com inibidores. A adição de cisteamina e β-mercaptoetanol ao meio de
maturação aumenta a síntese de GSH no oócito bovino durante a MIV (DE MATOS et
al. 1996). Devido à sua ação, era esperado que estes antioxidantes não interferissem
na inibição da MIV ou na cinética da maturação nuclear pós-inibição.
Experimento II – Cinética da Maturação Citoplasmática
Sabe-se que grânulos corticais (GC) são grânulos secretores, cujo exsudato é
capaz de alterar a função e promover o endurecimento da zona pelúcida (CHERR et al.,
1988). O padrão de distribuição dos grânulos corticais pode ser utilizado na avaliação
41
da maturação citoplasmática, já que a maturação citoplasmática está associada às
mudanças celulares que ocorrem durante a maturação nuclear e a migração dos
grânulos corticais e reposicionamento das mitocôndrias (SIRARD, 2001).
O presente trabalho verificou a cinética da maturação citoplasmática de oócitos
bovinos maturados na presença dos inibidores butirolactona I ou roscovitina,
adicionados ou não dos antioxidantes cisteamina ou -mercaptoetanol. A cinética da
maturação citoplasmática foi observada ao final do cultivo de pré-maturação, seguido
de maturação sem a presença destes inibidores.
Os grânulos corticais nos oócitos imaturos estão distribuídos por todo o
citoplasma celular e sua migração para a região periférica do oócito (córtex) ocorre com
o avanço da maturação (CONNORS et al., 1998; WESSEL et al., 2001; VELILLA et al.,
2004). Nos oócitos bloqueados com butirolactona I por 24 horas não foi constatada
migração dos grânulos corticais para o córtex celular, mantendo a mesma distribuição
de oócitos imaturos. Estes resultados sugerem que a butirolactona I pode interferir no
reposicionamento dos GC bloqueando, também, a maturação citoplamática. Os oócitos
pré-maturados com roscovitina apresentaram, na sua maioria, os GC dispersos na
periferia, assim como COY et al., (2005a) que observaram que a utilização de um
enantiômero da roscovitina bloqueia a meiose, mas não totalmente a migração de
grânulos corticais, já que uma parcela dos oócitos tratados apresentou migração.
Entretanto, BARRETTO et al. (2007) sugeriram que o bloqueio meiótico em oócitos
bovinos realizado pela roscovitina não influencia na migração de grânulos corticais.
Essa contradição pode ser resultado de diferenças nas condições de cultivo, tipo de
droga ou de avaliação ou bloqueio menos eficiente.
Analisando os resultados do cultivo de maturação, após 16 horas observou-se
que os oócitos dos grupos sem inibidores de maturação nuclear e daqueles pré-
maturados com butirolactona I apresentaram-se imaturos, parcialmente maturos e
maturos. Após a retirada dos oócitos do meio com a butirolactona I, estes se
comportaram de forma semelhante aos grupos sem inibidores, sugerindo que a
butirolactona I estava influenciando os padrões de distribuição de GC. Em relação aos
grupos pré-maturados com roscovitina, a maioria dos oócitos estava maturo,
42
apresentando o mesmo comportamento do final da pré-maturação com 24 horas. Fica
bem claro que a roscovitina não interfere na distribuição dos GC e maturação
citoplasmática dos oócitos.
Em oócitos maturados in vivo ou in vitro os grânulos corticais são encontrados
em sua maioria na região do córtex celular (CONNORS et al., 1998; WESSEL et al.,
2001; VELILLA et al., 2004), sendo um dos indicativos de maturação citoplasmática. A
migração dos grânulos corticais para a região do córtex celular, nos oócitos maturados
in vitro por 24 horas após o bloqueio da meiose com butirolactona I foi similar aos
oócitos submetidos somente à maturação in vitro. Esses resultados condizem com os
descritos para oócitos maturados in vitro (VELILLA et al., 2004), sugerindo que o
bloqueio do ciclo meiótico pela butirolactona I nos oócitos bovinos não afeta a migração
dos grânulos corticais no pós-bloqueio meiótico. COY et al. (2005a) também
observaram migração normal após a MIV de oócitos bloqueados com roscovitina, assim
como em nosso estudo.
Os oócitos maturados com SFB tiveram a menor porcentagem de oócitos
maturos quando comparados aos demais grupos. Desta maneira, podemos observar
que apenas 50% oócitos maturados com SFB têm os GC distribuídos na periferia dos
oócitos. Assim, baseado especificamente na redistribuição dos GC, os resultados
demonstraram que o bloqueio meiótico, tanto com roscovitina como com butirolactona I,
dá uma oportunidade adicional para melhorar a maturação citoplasmática. A adição dos
antioxidantes parecem não interferir na maturação citoplasmática, já que os grupos
contendo estes antioxidantes se comportaram da mesma maneira que os grupos
somente com inibidores. Assim como na maturação nuclear, era esperado que estes
antioxidantes não interferissem na cinética da maturação citoplasmática já que atuam
no meio de maturação aumentando a síntese de GSH no oócito bovino durante a MIV.
Experimento III – Determinação da Concentração Intraoocitária de
Glutationa
A glutationa (GSH) é um tripeptídeo fundamental para a proteção celular contra o
estresse oxidativo e participa ativamente dos processos de maturação oocitária
43
(KNAPEN et al., 1999; ABEYDEERA et al., 1998, 1999). Sua função principal é a de
proteção da membrana celular. DE MATOS et al. (1996) demonstraram que a adição de
cisteamina, cisteína e β-mercaptoetanol ao meio de maturação aumenta a síntese de
GSH em oócitos bovinos durante a MIV. Este aumento de GSH abastece os oócitos
maturados in vitro de grande estoque de GSH disponível para a proteção do embrião
até o estádio de blastocisto (DE MATOS et al., 1995, 1996; TELFORD et al., 1990).
Avaliando as concentrações de GSH por oócito observamos que os grupos pré-
maturados somente com inibidores e sem antioxidantes (CB e CR), e também os
grupos pré-maturados e em seguida cultivados com β-mercaptoetanol (CBM e CRM)
foram os grupos com menor produção de GSH intracelular, ou ainda apresentaram
maior consumo. Como os grupos CB e CR não foram suplementados com nenhum tipo
de antioxidante, a baixa concentração intracelular de GSH era esperada. Entretanto, os
grupos CBM e CRM foram pré-maturados e em seguida maturados na presença de β-
mercaptoetanol e apresentaram apenas a concentração de GSH de 2,12 e 2,00
pmol/oócito, respectivamente. O resultado esperado era que houvesse uma
concentração de GSH similar ao grupo CM (apenas maturado com β-mercaptoetanol),
que teve uma concentração de GSH de 3,02 pmol/oócito e foi semelhante aos demais
grupos com antioxidantes e também aos grupos S e C, com 3,66 e 3,20 pmol/oócito
respectivamente. AVELINO (2004) obteve maior concentração de GSH (5,51
pmol/oócito) para os oócitos maturados com β-mercaptoetanol, todavia este autor
utilizou associação do β-mercaptoetanol com cisteína e utilizou o dobro da dose (100
µM) que utilizamos (50 µM). O mesmo ocorreu com os oócitos maturados com
cisteamina, sendo que nossos resultados foram de 2,91 pmol/oócito (50 µM) diferindo
de AVELINO (2004) com 5,51 pmol/oócito (100 µM), e de WOLF (2005) com 4,25
pmol/oócito (100 µM) (ambos com oócitos maturados com cisteamina + cisteína), assim
como outros resultados da literatura na espécie bovina (DE MATOS et al., 1996, 2002;
VAN SOOM et al., 2002). Dessa forma, parece que os inibidores butirolactona I e
roscovitina podem interferir na ação antioxidante do β-mercaptoetanol. Observamos,
ainda, que concentrações maiores de cisteamina ou β-mercaptoetanol já foram
44
avaliadas e podem ser mais eficientes em aumentar as concentrações intracelulares de
GSH em oócitos bovinos maturados in vitro.
FURNUS e DE MATOS (1999) demonstraram que a biosíntese de GSH no oócito
é limitada pela presence de L-cisteína no meio. Além disso, após a preparação do meio,
a cisteína sofre auto-oxidação formando cistina, e consequentemente a produção de
GSH pode ser prejudicada devido à carência deste substrato, e oócitos podem maturar
em condições sub-ótimas (DE MATOS e FURNUS, 2000). Estas considerações podem
explicar as diferenças observadas nos levando a pensar que a associação com a
cisteína se faz necessária para que aumente a produção intracelular de GSH em oócito
bovinos.
Conclusões
A butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira
reversível e mais eficiente que a roscovitina.
A presença dos antioxidantes cisteamina e β-mercaptoetanol influenciou de
maneira negativa o bloqueio da meiose com roscovitina, porém não interferiu na
posterior retomada da maturação nuclear.
A butirolactona I interferiu no reposicionamento dos GC atrasando, também, a
maturação citoplasmática.
A roscovitina não interferiu na distribuição dos GC e maturação citoplasmática de
oócitos bovinos.
A adição dos antioxidantes ao meio de maturação não interferiu na cinética da
maturação citoplasmática.
A adição de antioxidantes cisteamina e β-mercaptoetanol no cultivo de
maturação não proporcionou aumento da concentração de glutationa nos oócitos,
porém a adição de cisteamina durante o cultivo de pré-maturação permitiu que as
concentrações de glutationa ficassem similares às dos grupos controle.
45
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50
CAPÍTULO 3 – AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO E DA QUALIDADE DE
EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO APÓS INIBIÇÃO DA MEIOSE COM
BUTIROLACTONA I E ROSCOVITINA EM MEIO SUPLEMENTADO COM
ANTIOXIDANTES
RESUMO – Muitos fatores influenciam o desenvolvimento e viabilidade do
embrião, sendo de particular importância as condições de cultivo do oócito durante o
processo de maturação. Neste experimento, oócitos bovinos foram pré-maturados com
inibidor de maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e maturados in vitro com
antioxidante (cisteamina ou β-mercaptoetanol). Os oócitos foram subseqüentemente
fecundados e cultivados in vitro. A avaliação do desenvolvimento embrionário foi
realizada 40 horas pós-inseminação (hpi) (clivagem), 168 horas (formação de
blastocistos) e 192 horas (blastocistos eclodidos e em processo de eclosão). Os grupos
de oócitos pré-maturados com roscovitina tiveram a menor taxa de clivagem (73,33 –
75,25%), formação de blastocistos (14,17 – 19,10% com 168 hpi) (22,71 - 25,48% 192
hpi) e eclosão (6,55 – 25,51%) quando comparados aos demais grupos (P<0,05). Os
outros grupos variaram a taxa de clivagem entre 85,00 e 90,69%, formação de
blastocistos com 168 hpi entre 33,66 e 49,00%, e com 192 hpi entre 41,45 e 58,00% e
eclosão entre 24,93 e 38,23%. A qualidade embrionária foi avaliada 168 hpi pela
técnica de coloração diferencial por fluorocromo com a contagem do número total de
células e número de células da massa celular interna (MCI) e do trofoblasto (TF). Não
foi observada diferença (P>0,05) entre os tratamentos em relação ao número total de
células da MCI (27,55 – 33,85%) e do TF (66,15 – 72,45%). Os resultados mostraram
que o bloqueio da meiose de oócitos com butirolactona I não prejudicou a subseqüente
fecundação e nem o desenvolvimento embrionário. Todavia, o bloqueio com roscovitina
influenciou negativamente estes parâmetros, e a adição dos antioxidantes cisteamina
ou -mercaptoetanol ao meio de maturação não influenciou a produção e a qualidade
dos blastocistos.
Palavras-Chave: maturação in vitro, fecundação in vitro, embrião, bovino,
antioxidantes, butirolactona I, roscovitina.
51
Introdução
Nos sistemas de produção in vitro de embriões (PIV) vários parâmetros
influenciam o desenvolvimento e a viabilidade embrionária, sendo particularmente
importante a condição de cultivo do oócito durante o processo de maturação. O meio de
maturação e seus suplementos podem atuar de forma benéfica ou não no
desenvolvimento embrionário (BRISON e SCHULTZ, 1997; KRISHER e BAVISTER,
1998).
A maturação compreende todos os eventos que permitem ao oócito expressar
seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação, incluindo a progressão
da meiose (maturação nuclear) e alterações morfológicas, bioquímicas e moleculares
(maturação citoplasmática). Entretanto, a maturação nuclear do oócito não é suficiente
para resultar no subseqüente desenvolvimento embrionário. Pode-se hipotetizar que se
oócitos são cultivados in vitro antes da maturação sob condições que mantém
estacionado o estádio de vesícula germinativa (VG), estes podem ter a oportunidade de
adquirir uma grande competência no desenvolvimento. Tentativas têm sido feitas com o
intuito de manter a meiose estacionada com estabilização farmacológica, e dentre as
drogas mais utilizadas para este propósito pode-se citar o cicloheximide, 6-
dimetilaminopurina, butirolactona I e a roscovitina (RICHARD et al., 1997; SAEKI et al.,
1997; AVERY et al., 1998; KUBELKA et al., 2000; MERMILLOD et al., 2000). Esta
inibição é reversível e pode ser explorada usando-se um duplo sistema de cultura com
pré-maturação com inibidores seguida de maturação, com o objetivo de aumentar a
competência de desenvolvimento dos oócitos (PONDERATO et al., 2001).
Por outro lado, a pré-maturação implica no prolongamento do tempo em que os
oócitos são mantidos em cultivo. Em sistemas de cultivo in vitro, o estresse oxidativo
ocorre quando o acúmulo de espécies reativas ao oxigênio (ROS) ultrapassa a
capacidade antioxidante do sistema. Nesta situação, os embriões são danificados
devido a peroxidação de fosfolipídeos de membrana e à alteração de muitos tipos de
moléculas celulares, tais como lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos (NASR-
ESFAHANI et al., 1990). As ROS ainda induzem a inibição da fusão espermatozóide-
52
oócito (AITKEN et al., 1993). Assim, a adição de antioxidantes ao meio de cultura tem
demonstrado ser efetiva na manutenção do desenvolvimento embrionário in vitro
(TAKAHASHI et al., 1993; LIM et al., 1996; CAAMAÑO et al., 1996; LIM et al., 1999).
DE MATOS et al. (1995; 1996) demonstraram que a suplementação do meio de MIV
com cisteamina aumentou o conteúdo intracelular de GSH em oócitos bovinos e
melhorou o desenvolvimento e qualidade dos embriões.
Proteger embriões contra o
estresse oxidativo parece ser uma das chaves em melhorar o desenvolvimento.
Os objetivos deste trabalho foram determinar qual o melhor momento de
fecundação e avaliar o desenvolvimento e qualidade de embriões obtidos a partir de
oócitos cultivados com inibidores da maturação nuclear e antioxidantes.
Material e Métodos
Obtenção e seleção dos oócitos
Os ovários de bovinos abatidos nos abatedouros de Guararapes-SP e Birigüi-SP
foram retirados das carcaças aproximadamente 20 minutos após o abate, mantidos em
solução salina estéril a 30-35°C e transportados para o laboratório em caixas térmicas,
não excedendo o limite de 6 horas desde o abate até o início das aspirações. As
punções foliculares foram realizadas manualmente por meio de agulha de calibre 18-G
adaptada a seringa de 20 mL, ambas descartáveis. Todo o material aspirado foi
transferido para tubos plásticos de 50 mL e decantado por 15 minutos para seleção dos
oócitos.
O sedimento foi transferido para placas de poliestireno de 60 mm de diâmetro e
avaliado em microscópio esterioscópico. Os oócitos com cumulus compacto, possuindo
pelo menos 4 camadas de células e de aparência saudável (citoplasma de granulação
homogênea) foram selecionados para o cultivo de maturação.
Maturação dos oócitos
Os oócitos selecionados foram lavados duas vezes em meio de lavagem H-199
(meio TCM-199 suplementado com 0,2 mM de piruvato, 20 mM de HEPES, 5 mM de
53
bicarbonato de sódio e 75 µg/mL de amicacina) e uma vez em meio de pré-maturação
(meio TCM-199, suplementado com 75 µg/mL de amicacina, 0,3% de BSA e 0,2 mM de
piruvato). O meio de pré-maturação foi suplementado com 25 µM de roscovitina ou 100
µM de butirolactona I e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM de cisteamina. Somente
foram pré-maturados os oócitos dos grupos contendo inibidores da maturação nuclear.
Ao término do cultivo de pré-maturação, os oócitos foram transferidos para placa
de cultura contendo meio de maturação B-199 (meio TCM-199 suplementado com 0,2
mM de piruvato, 25 mM de bicarbonato de sódio, 75 µg/mL de amicacina, 1 µg/m de 17-
β estradiolL, 0,5 µg/mL de FSH, 100 UI/mL de hCG e 0,6% de BSA) suplementado ou
não com 50 µM de β-mercaptoetanol e/ou 50 µM de cisteamina. Os demais grupos
experimentais (sem inibidores da maturação nuclear) foram apenas cultivados em meio
de maturação B-199.
Os oócitos de todos os grupos foram cultivados em microgotas de 100 µL de
meio recoberto com óleo mineral, em estufa a 38,8°C com atmosfera de 5% de CO
2
em
ar e máxima umidade.
Fecundação in vitro
Após o cultivo de maturação (24 horas para os grupos sem inibidores de
maturação nuclear, e 20 horas para os grupos com inibidores), os COCs foram
submetidos à fecundação in vitro. Foi utilizado sêmen de um único doador e lote da
raça Limousin. A palheta foi descongelada em banho-maria a 35-37°C durante 30
segundos e lavada por três vezes em 2 mL de meio TL-Sêmen cada vez, adicionado de
antibiótico e 2 µL/mL do estoque C, por centrifugação a 750 rpm (270xg), durante 5
minutos. Na última lavagem, 30 µL do sedimento foi recuperado e depositado em um
microtubo com 30 µL de meio TALP-FIV, sendo feita avaliação de suas características
(motilidade e concentração espermática). A concentração foi ajustada para 25x10
6
espermatozóides vivos por mL, sendo adicionados 4 µL desta diluição para cada gota
de fecundação (concentração final de 100 x 10
3
espermatozóides por gota de meio).
Após a maturação, os oócitos de cada grupo foram lavados no meio de fecundação
54
(TALP-FIV) suplementado com 10 µg/mL de heparina, 160 µL PHE e 0,6% BSA, sendo
então transferidos para as microgotas de fecundação (20 oócitos/microgota). A
fecundação foi realizada a 38,8ºC, por 24 horas em estufa contendo 5% CO
2
em ar
atmosférico e 99% de umidade.
Cultivo de desenvolvimento
Os zigotos foram lavados duas vezes em meio TALP e uma vez no meio mSOF,
sendo então transferidos para as microgotas do cultivo de desenvolvimento in vitro
(CIV). O cultivo de desenvolvimento embrionário foi realizado em microgotas de 100 µL
de meio mSOF suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% SFB. O cultivo foi conduzido
em estufa à temperatura de 38,8°C, contendo 5% de CO
2
em ar atmosférico e 99% de
umidade, durante 7 dias. A cada 48 horas, 50% do meio de cultivo foram renovados. A
avaliação do desenvolvimento embrionário foi realizada às 40 horas (clivagem), 168
horas (formação de blastocistos) e 192 horas (blastocistos eclodidos e em processo de
eclosão) pós-inseminação (hpi).
Determinação da massa celular interna (MCI) e trofoblasto (TF)
A qualidade morfológica dos blastocistos foi avaliada pela proporção do número
de células da MCI e do TF em relação ao número total (T) de células. O número de
células da MCI e do TF foi determinado pela coloração diferencial por fluorocromo,
descrita por IWASAKI et al. (1990). A zona pelúcida dos blastocistos foi removida em
solução ácida (pH 2,5) por 5 a 10 segundos e, em seguida, estes foram lavados três
vezes em meio TCM-199 Hepes com 10% de SFB e duas vezes em meio TCM-199
Hepes sem SFB. Posteriormente, os blastocistos foram fixados em solução de PBS
com ácido pícrico (10mM) e polivinil-pirrolidona (PVP) (3mg/mL) sobre gelo, durante 10
minutos. A seguir, foram lavados em meio TCM-199 Hepes, incubados a 38,5°C por 30
minutos em soro de coelho anti-bovino na proporção de 1:10 em meio TCM-199
Bicarbonato. Após nova lavagem em meio TCM-199 Hepes com 10% de SFB, os
embriões foram incubados a 38,5°C por 30 minutos em complemento de cobaia na
proporção de 1:10 em meio TCM-199 Hepes acrescido de iodeto de propídio (10µg/mL)
55
e de Hoechst 33342 (10µg/mL). Por fim, foram lavados em PBS com 0,3% de BSA e
colocados entre lâmina e lamínula com glicerina tamponada (9:1). Os blastocistos foram
avaliados em microscópio de epifluorescência (excitação de 330-385nm e emissão de
420nm) quanto ao número de células da MCI (núcleos com fluorescência azul,
determinada pelo Hoechst 33342 – corante vital) e do TF (núcleos com fluorescência
rosa, determinada pelo iodeto de propídio – corante não vital).
Delineamento experimental
Os oócitos foram pré-maturados em meio suplementado com 0,3% de BSA e 25
µM de roscovitina ou 100 µM de butirolactona I, e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM
de cisteamina. Depois foram maturados em meio B-199 suplementado com 0,6% de
BSA e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM de cisteamina conforme grupos
experimentais abaixo:
Pré-Maturação:
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina (R);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina + 50 µM de
cisteamina (RC);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina + 50 µM de β-
mercaptoetanol (RM);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I (B);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I + 50 µM
de cisteamina (BC);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I + 50 µM
de β-mercaptoetanol (BM);
56
Maturação:
(S) →
→→
→ B-199 suplementado com 10% de SFB (PADRÃO);
(C) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA (CONTROLE);
(CC) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina;
(CM) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-mercaptoetanol;
(CR) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA
(CRC) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina
(CRM) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-
mercaptoetanol
(CB) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA
(CBC) →
→→
→ 199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina
(CBM) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-
mercaptoetanol
Experimento I: Momento de fecundação
Este experimento foi realizado para determinar qual o melhor momento de
fecundação de oócitos maturados in vitro, em meio suplementado com roscovitina ou
butirolactona I. Desta forma os oócitos foram pré-maturados por 24 horas em meio
suplementado com 0,3% de BSA e 25 µM de Roscovitina (R) ou 100 µM de
Butirolactona I (B) e em seguida maturados por 16, 20 ou 24 horas em meio B-199
suplementado com 0,6% de BSA conforme grupos experimentais (CR) e (CB). Os
grupos experimentais (S) e (C) foram apenas cultivados em meio de maturação B-199
por 24 horas. Depois foram submetidos à fecundação por 24 horas e avaliadas a
capacidade de clivagem e a competência em desenvolvimento até a fase de blastocisto.
Experimento II: Avaliação do desenvolvimento embrionário
Neste experimento, os oócitos depois de maturados (24 horas para os grupos
sem inibidores de maturação nuclear, e 20 horas para os grupos com inibidores) foram
SEM
PRÉ
-
MIV
COM
PRÉ
-
MIV
57
submetidos à fecundação por 24 horas. Foram avaliadas a capacidade de clivagem e a
competência em desenvolvimento até a fase de blastocisto.
Experimento III: Avaliação da qualidade embrionária
Neste experimento, foi avaliada a qualidade embrionária pela coloração
diferencial dos embriões (trofoblasto e massa celular interna).
Análise Estatística
Para avaliar-se o efeito da suplementação do meio de cultura com inibidores da
maturação nuclear e antioxidantes sobre o momento de fecundação (experimento I), e
sobre a fecundação e desenvolvimento do embrião (experimento II), os dados foram
analisados pela fração de oócitos cultivados que atingiram os estágios determinados de
desenvolvimento, reportados em termos de porcentagem (%). Como a porcentagem de
oócitos clivados e blastocistos não obteve distribuição normal, os dados foram
transformados em arc sen % . Foi aplicada análise de variância (ANOVA) para
comparação dos tratamentos, em cada uma das fases de desenvolvimento do embrião
e posteriormente foi aplicado teste de Tukey para comparação múltipla das médias.
Para as variáveis porcentagens de MCI e de TF em relação ao número total de células
do embrião (experimento III) foi realizada a análise de variância (ANOVA) e
posteriormente foi aplicado teste de Tukey para comparação múltipla das médias. Para
comparação entre as médias e as freqüências de blastocistos reclassificados como
superiores ou excelentes foi utilizado o teste exato de Fisher.
O nível de significância adotado foi de 5%. A análise estatística foi efetuada
empregando-se o sistema SAS (Statistical Analysis System).
Resultados
Experimento I: Momento de fecundação
Os oócitos pré-maturados com roscovitina ou butirolactona I e maturados por 16
ou 20 horas tiveram uma produção de embriões semelhante entre si e entre os grupos
58
padrão do laboratório (10% SFB) e controle (0,6% BSA) com 168 (16,67 a 41,00%) e
192 horas (23,41 a 46,63%) de cultivo. Entretanto, com 24 horas de cultivo de
maturação, os grupos dos oócitos pré-maturados com roscovitina ou butirolactona I
tiveram a menor taxa de formação de blastocistos (8,89 e 10,00%, respectivamente) ao
final das 168 horas quando comparados aos demais grupos (Tabela 1). Como não
houve diferença entre os grupos nos horários de 16 e 20 horas de maturação, optou-se
em realizar a FIV com 20 horas de maturação para os grupos pré-maturados com
inibidores de maturação nuclear, e 24 horas de maturação para os grupos maturados
sem inibidores de maturação nuclear.
Tabela 1 - Desenvolvimento embrionário de oócitos pré-maturados durante 24 horas
com inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) seguidos do cultivo
de maturação por 16, 20 ou 24 horas.
Clivagem Bl (168 h) Bl (192 h) Grupos Horário
Fiv (h)
Nº de
oócitos
n (Média (%) ± EPM)
S 24 88 79 (89,73 ± 5,29)
a
36 (41,00 ± 4,32)
a
40 (45,59 ± 6,13)
a
C 24 88 85 (96,59 ± 0,04)
a
35 (39,81 ± 1,57)
a
41 (46,63 ± 2,58)
a
CB 16 90 72 (80,00 ± 5,09)
a
16 (17,78 ± 9,09)
ab
25 (27,78 ± 13,65)
a
CR 16 89 77 (86,59 ± 5,04)
a
28 (31,57 ± 5,27)
ab
35 (39,35 ± 6,81)
a
CB 20 90 76 (84,44 ± 6,19)
a
15 (16,67 ± 3,33)
ab
29 (32,22 ± 5,88)
a
CR 20 89 72 (80,80 ± 5,09)
a
15 (16,70 ± 7,66)
ab
21 (23,41 ± 9,56)
a
CB 24 90 83 (92,22 ± 2,94)
a
9 (10,00 ± 3,85)
b
21 (23,33 ± 6,67)
a
CR 24 90 67 (74,44 ± 4,84)
a
8 (8,89 ± 7,29)
b
8 (8,89 ± 7,29)
a
ab
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Experimento II: Avaliação do desenvolvimento embrionário
Os grupos de oócitos pré-maturados com roscovitina tiveram a menor taxa de
clivagem (73,33 – 75,25%), formação de blastocistos (14,17 – 19,10% com 168 hpi)
(22,71 - 25,48% 192 hpi) e eclosão (6,55 – 25,51%) quando comparados aos demais
grupos (P<0,05). O grupo dos oócitos maturados com SFB teve a maior produção de
blastocistos com 168 hpi (49,00%) quando comparado aos grupos pré-maturados com
roscovitina (P<0,05), mas não diferiu dos demais grupos. A taxa de formação de
blastocistos com 192 hpi nos grupos sem inibidores de maturação nuclear e naqueles
pré-maturados com butirolactona I foi de 41,45 – 58,00% e a eclosão ficou entre 24,93
59
– 38,23%, diferindo apenas dos grupos pré-maturados com roscovitina (P<0,05). Os
resultados estão demonstrados na tabela 2 e figura 1:
Tabela 2 – Desenvolvimento embrionário de oócitos pré-maturados durante 24 horas
com inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes
(cisteamina ou β-mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 20 horas.
Blastocistos n (Média (%) ± EPM)
Grupos Nº de
Oócitos
Clivagem
Bl (168 h)
Bl (192 h)
Eclosão (192 h)
S 175 158
(90,22 ± 2,94)ª
86
(49,00 ± 2,49)
a
102
(58,00 ± 2,64)
a
39
(38,23 ± 5,96)
a
C 164 149
(90,69 ± 1,94)ª
61
(38,22 ± 3,08)
ab
93
(57,08 ± 3,37)
a
23
(26,18 ± 5,46)
ab
CC 174 154
(88,59 ± 1,30)
ab
65
(37,45 ± 3,92)
ab
87
(50,18 ± 1,87)
a
22
(24,93 ± 6,35)
ab
CM 160 139
(87,56 ± 2,44)
ab
57
(35,33 ± 3,85)
abc
74
(46,67 ± 3,33)
ab
20
(25,87 ± 4,84)
ab
CB 173 147
(85,00 ± 2,66)
ab
59
(34,10 ± 6,46)
abc
81
(46,68 ± 8,27)
ab
27
(26,57 ± 9,22)
ab
CBC 174 148
(85,05 ± 3,39)
ab
59
(33,66 ± 4,54)
abc
73
(41,45 ± 6,75)
abc
27
(31,85 ± 9,48)
ab
CBM 175 150
(85,89 ± 2,38)
ab
61
(34,89 ± 3,91)
abc
83
(47,56 ± 5,78)
a
31
(33,83 ± 3,06)
ab
CR 177 130
(73,33 ± 3,54)
b
25
(14,17 ± 4,19)
d
40
(22,71 ± 2,50)
c
3
(6,55 ± 4,37)
c
CRC 172 132
(77,09 ± 4,87)
ab
28
(16,41 ± 3,17)
cd
38
(22,1 ± 2,43)
c
3
(7,50 ± 3,54)
c
CRM 172 129
(75,25 ± 4,12)
b
33
(19,10 ± 3,04)
bcd
44
(25,48 ± 4,13)
bc
11
(25,51 ± 8,45)
bc
abcd
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
60
Figura 1 – Desenvolvimento embrionário de oócitos pré-maturados durante 24 horas
com inibidores da maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e antioxidantes
(cisteamina ou β-mercaptoetanol) seguidos do cultivo de maturação por 20 horas.
S= SFB (10%), C= BSA (0,6%), CC= BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CM= BSA (0,6%) + βME (50 µM),
CB= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM) / MIV BSA (0,6%); CBC= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM)
+ CIS (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CBM= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM) + βME (50
µM) / MIV BSA (0,6%) + βME (50 µM), CR= pré-MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) / MIV BSA (0,6%);
CRC= pré-MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) + CIS (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CRM= pré-
MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) + βME (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + βME (50 µM).
abcd
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Experimento III: Avaliação da qualidade embrionária
A qualidade dos blastocistos produzidos após 168 horas de cultivo in vitro,
verificada pela técnica de coloração diferencial (Figura 2), foi semelhante (P>0,05) entre
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S C CC CM CB CBC CBM CR CRC CRM
GRUPOS
% Clivagem e Blastocistos
% Clivados % Bl 168 h % Bl 192 h
a
a
ab
ab
ab
ab
ab
b
ab
b
a
ab ab
abc
abc
abc
abc
d
cd
bcd
a
a
a
ab
ab
abc
a
c
c
bc
61
os tratamentos. A porcentagem de células da MCI variou entre 27,55 – 33,85% e do TF
entre 66,15 – 72,45% (Tabela 3 e Figura 3).
Figura 2 – Blastocisto corado pela técnica de coloração diferencial, 168 horas após
FIV, observados em microscópio de epifluorescência.
Azul: núcleo de células da massa celular interna (MCI), Hoechst 33342; Rosa: núcleo
de células do trofoblasto (TF), iodeto de propídeo.
Tabela 3 – Porcentagem média de células da MCI e TF, em relação ao número total de
células dos blastocistos corados por meio de coloração diferencial por fluorocromo após
168 horas de fecundação dos oócitos maturados em diferentes meios.
Grupos MCI TF Células Totais
Média (%) ± EPM Média (n) ± EPM
S 29,33 ± 1,82
a
70,67 ± 1,82
a
50 ± 2,77
a
C 30,18 ± 2,29
a
69,82 ± 2,29
a
48 ± 2,90
a
CC 27,74 ± 1,98
a
72,26 ± 1,98
a
51 ± 2,80
a
CM 27,76 ± 2,45
a
72,24 ± 2,45
a
51 ± 3,54
a
CB 29,50 ± 2,19
a
70,50 ± 2,19
a
46 ± 2,66
a
CBC 33,85 ± 2,10
a
66,15 ± 2,10
a
47 ± 2,50
a
CBM 29,79 ± 1,78
a
70,21 ± 1,78
a
47 ± 1,60
a
CR 30,01 ± 2,49
a
69,99 ± 2,49
a
44 ± 2,37
a
CRC 30,74 ± 2,27
a
69,26 ± 2,27
a
45 ± 2,98
a
CRM 27,55 ± 1,64
a
72,45 ± 1,64
a
49 ± 4,00
a
a
Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de ANOVA (P>0,05).
62
Figura 3 – Percentagem de células da MCI e TF dos blastocistos desenvolvidos por
168 horas proveniente de oócitos maturados in vitro em diferentes meios de cultura.
S= SFB (10%), C= BSA (0,6%), CC= BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CM= BSA (0,6%) + βME (50 µM),
CB= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM) / MIV BSA (0,6%); CBC= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM)
+ CIS (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CBM= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM) + βME (50
µM) / MIV BSA (0,6%) + βME (50 µM), CR= pré-MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) / MIV BSA (0,6%);
CRC= pré-MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) + CIS (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CRM= pré-
MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) + βME (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + βME (50 µM).
a
Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de ANOVA (P>0,05).
Discussão
Experimento I: Momento de fecundação
Neste estudo foi verificado que a produção de embriões a partir de oócitos pré-
maturados com roscovitina ou butirolactona I e maturados por 16 ou 20 horas foi
semelhante entre si e entre os grupos controle com SFB e BSA, tanto as 168 quanto às
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S C CC CM CB CBC CBM CR CRC CRM
GRUPOS
% MCI e TF
% MCI % TF
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
63
192 horas de cultivo. Observamos que oócitos pré-maturados com inibidores e
posteriormente maturados por um período de 20 horas resultaram, ao final de 192
horas de cultivo, 23,41% de blastocistos (roscovitina) e 32,22% (butirolactona I).
ADONA e LEAL (2004) que obtiveram resultados semelhantes aos nossos, 24,2% de
blastocistos (roscovitina) e 32,3% (butirolactona I) com 18 horas de maturação.
Ao final das 24 horas de cultivo de maturação, os grupos dos oócitos pré-
maturados com roscovitina ou butirolactona I tiveram a menor taxa de formação de
blastocistos (8,89 e 10,00%, respectivamente) avaliados às 168 horas, quando
comparados aos demais grupos. Estes dados sugerem que o momento da fecundação
in vitro de oócitos pré-maturados com inibidores de maturação nuclear pode interferir na
qualidade do desenvolvimento embrionário. LAGUTINA et al. (2002) observou que
82,5% dos oócitos tratados com roscovitina alcançaram a maturação depois de 16
horas de MIV. As mesmas observações foram feitas por HASHIMOTO et al. (2002)
usando butirolactona I (mais de 85% dos oócitos em M II com 18 horas de MIV), assim
como ADONA e LEAL (2004) que obtiveram mais de 90% de oócitos bloqueados com
butirolactona I ou roscovitina em M II após 18 horas de MIV. Provavelmente este fato
ocorre devido à retomada da meiose destes oócitos estar acelerada após a retirada do
inibidor, e indica que estes oócitos já estão aptos a serem fecundados com 16 ou 18
horas de MIV. Outra possibilidade é a utilização de inibidores que não assegurem um
bloqueio meiótico tão efetivo, permitindo com que parte dos oócitos atinjam o estádio de
M II ao final do cultivo de inibição. A maturação nuclear destes oócitos ocorreria por um
longo período de tempo, somando-se o período de cultivo da inibição e de cultura de
maturação (mais de 42 horas). Uma proporção desses oócitos cultivados in vitro teria
ficado envelhecida, antes da FIV e CIV. KIM et al. (1996) sugeriram que oócitos que
envelhecem in vitro têm o subseqüente desenvolvimento embrionário diminuído,
principalmente por comprometer elementos do citoesqueleto.
Experimento II: Avaliação do desenvolvimento embrionário
Nos sistemas de produção in vitro de embriões (PIV) vários parâmetros
influenciam o desenvolvimento e a viabilidade embrionária, sendo particularmente
64
importante a condição de cultivo do oócito durante o processo de maturação. O meio de
maturação e seus suplementos podem atuar de forma benéfica ou não no
desenvolvimento embrionário (BRISON e SCHULTZ, 1997; KRISHER e BAVISTER,
1998). Recentemente RIZOS et al. (2002) demonstraram que o principal fator que afeta
as taxas de blastocistos é a qualidade do oócito, enquanto que as condições do sistema
de cultivo in vitro influenciam a qualidade de desenvolvimento dos blastocistos. Esta
qualidade dos oócitos pode ser relacionada ao período de capacitação observada in
vivo. Acredita-se que a competência de desenvolvimento pode ser melhorada se
oócitos forem mantidos em bloqueio meiótico por um período (cultura de pré-
maturação) antes de retomar a meiose, tentando mimetizar a capacitação (HYTTEL et
al., 1997; LONERGAN et al., 2000).
Nossos resultados demonstraram que os grupos de oócitos pré-maturados com
roscovitina tiveram a menor taxa de clivagem (73,33 – 75,25%) quando comparados
aos demais grupos, assim como a menor produção de blastocistos com 168 hpi (14,17
– 19,10%). Já a taxa de formação de blastocistos com 192 hpi após a inibição meiótica
com roscovitina foi de 22,71%, similar aos achados de ADONA e LEAL (2004) com
24%, MERMILLOD et al. (2000) com 31% e LAGUTINA et al. (2002) com 25%. A taxa
de desenvolvimento embrionário 192 hpi após a inibição meiótica com butirolactona I foi
de 46,68%, semelhante aos grupos controle SFB e BSA e melhores do que as obtidas
por ADONA e LEAL (2004) com 32% e LONERGAN et al. (2000) com 27%. Essas
diferenças entre os laboratórios pode ser o resultado de variações nas condições de
cultivo.
A melhor performance da butirolactona I pode ser atribuída a sua melhor e mais
uniforme inibição meiótica (85,85%) do que a roscovitina (66,41%), o que pode ter
implicações posteriores durante o desenvolvimento embrionário. Considerando que no
tratamento com roscovitina houve uma proporção de oócitos que escaparam do
bloqueio meiótico (18,57% em MII no final da cultura de inibição), e então iniciaram a
progressão meiótica, seria esperado que alguns desses oócitos estariam em maturação
nuclear por um longo período de tempo, somando a inibição e o período de cultura de
maturação (mais de 42 horas), sendo que parte desses oócitos in vitro estaria
65
envelhecida, antes mesmo da fecundação e do cultivo, podendo diminui o
desenvolvimento embrionário. Por outro lado, no tratamento com butirolactona I poucos
oócitos escaparam do bloqueio (7,07%) e sofreram o processo de envelhecimento,
resultando em melhor desenvolvimento (os dados referentes à inibição da maturação
nuclear estão dispostos no capítulo 2).
Parece provável que embriões cultivados in vitro que são expostos ao estresse
oxidativo têm seu mecanismo de defesa insuficiente para proteger sua delicada
estrutura celular (ALI et al., 2003). Para proteger os oócitos e os embriões do estresse
oxidativo, muitos antioxidantes podem ser adicionados ao meio de cultivo. DE MATOS
et al. (1996) demonstraram que a adição de cisteamina, cisteína e -mercaptoetanol ao
meio de maturação aumentou a síntese de glutationa (GSH) intracelular e o
desenvolvimento de blatocisto.
Nossos resultados demonstraram que a adição dos antioxidantes cisteamina ou
-mercaptoetanol ao meio de maturação não influenciaram na produção de blastocistos
em relação aos grupos controle SFB e BSA com 168 e 192 hpi. DE MATOS e FURNUS
(2000) e AVELINO (2004) relataram um aumento da produção de blastocisto 168 hpi
provenientes de oócitos maturados com 100 µM de -mercaptoetanol em relação ao
grupo controle (maturação com SFB). Essas diferenças entre os laboratórios podem ser
o resultado de variações nas condições de cultivo, pois foi previamente demonstrado
que a associação de -mercaptoetanol com cisteína, numa concentração de 100 µM de
-mercaptoetanol podem proporcionar melhores resultados do que os observados em
nosso estudo (AVELINO, 2004).
A produção de blastocistos 168 hpi provenientes de oócitos maturados com
cisteamina foi semelhante às dos grupos controle assim como para AVELINO (2004) e
WOLF (2005), apesar destes autores terem utilizado a associação de cisteamina com
cisteína, e o dobro da concentração de cisteamina na maturação que em nosso
experimento.
Em estudos anteriores, aumento do percentual de desenvolvimento embrionário
foi ressaltado após maturação dos oócitos na presença unicamente de substratos ou
precursores de GSH em diversas espécies, entre elas a bovina (DE MATOS et al.,
66
1996; DE MATOS e FURNUS, 2000). Entretanto, em alguns estudos o uso individual de
cisteamina ou -mercaptoetanol não favoreceu o desenvolvimento individual de
blastocistos da espécie bovina. GUYADER-JOLI et al. (1998) demonstraram que sua
produção de embriões não melhorou após a adição de 50, 100 ou 250 µM de
cisteamina no meio de maturação. BLONDIN et al. (1997) também não observaram
aumento no percentual de blastocistos após maturação de oócitos em meio
suplementado com 10, 100 ou 500 µM de -mercaptoetanol.
Outro fator que se evidenciou em nossos resultados foi a baixa taxa de clivagem,
produção de embriões com 168 e 192 hpi e eclosão dos grupos dos oócitos pré-
maturados com roscovitina. Parece que neste caso os antioxidantes não tiveram
influência alguma nos resultados, e que a pré-maturação com roscovitina pode ter
interferido no desenvolvimento embrionário.
Experimento III: Avaliação da qualidade embrionária
O número de células é um dos parâmetros mais utilizados para caracterizar a
qualidade de embriões produzidos in vitro. Durante o processo de desenvolvimento de
embriões pré-implantação as células embrionárias se diferenciam em TF ou MCI. As
células do TF estão localizadas externamente nos blastocistos e originam as
membranas extra-embrionárias, enquanto que as células da MCI originam o feto e
contribuem para a formação das membranas extra-embrionárias (NEUBER et al., 2002).
O desenvolvimento fetal normal é dependente do número de células do embrião (LANE
e GARDNER, 1997) e o estabelecimento de uma proporção entre MCI:TF é
considerada essencial para assegurar a viabilidade embrionária (FLEMING, 1987).
Embora não se tenha um padrão ideal para esta razão, tem se adotado os valores de
uma célula da MCI para duas de TF (AVELINO, 2004).
Neste experimento foram avaliadas as médias do número de células da MCI e do
TF. De forma geral, a qualidade dos blastocistos produzidos após 168 horas de cultivo
in vitro, verificada pela técnica de coloração diferencial, foi semelhante entre os
tratamentos. A adição dos antioxidantes cisteamina ou -mercaptoetanol não aumentou
o percentual de células na MCI, no TF e nem no tamanho do blastocisto (número total
67
de células). Da mesma maneira, WOLF (2005) não observou diferença no tratamento
com cisteína associada à cisteamina, nem AVELINO (2004) no tratamento de cisteína
associada ao -mercaptoetanol. Entretanto, este último autor verificou um aumento no
percentual de células da MCI no tratamento suplementado com cisteína associada à
cisteamina em relação ao controle. A utilização de oócitos tratados com inibidores de
maturação nuclear não influenciou no percentual de células na MCI, no TF e número
total de células dos embriões cultivados.
Conclusões
Oócitos pré-maturados com roscovitina ou butirolactona I têm menor taxa de
formação de blastocistos se maturados por longos períodos (24 horas).
O bloqueio da meiose de oócitos com butirolactona I não prejudicou a
subseqüente fecundação e nem o desenvolvimento embrionário. Todavia, o bloqueio
com roscovitina influenciou negativamente estes parâmetros.
A adição dos antioxidantes cisteamina ou -mercaptoetanol ao meio de
maturação não influenciou na produção de blastocistos.
A adição dos antioxidantes cisteamina ou -mercaptoetanol e dos inibidores de
maturação nuclear roscovitina ou butirolactona I não influenciou na qualidade dos
embriões avaliada pela coloração diferencial.
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71
CAPÍTULO 4 – AVALIAÇÃO DA FRAGMENTAÇÃO DE DNA EM EMBRIÕES
PRODUZIDOS IN VITRO APÓS FECUNDAÇÃO DE OÓCITOS TRATADOS COM
INIBIDORES DA MATURAÇÃO NUCLEAR E ANTIOXIDANTES
RESUMO – A apoptose é a forma mais generalizada de morte celular. É
caracterizada por uma série de eventos bioquímicos e morfológicos observados no
núcleo e no citoplasma das células que entram neste processo. O estresse oxidativo
danifica os embriões podendo levar à apoptose. Oócitos bovinos pré-maturados com
inibidor de maturação nuclear (butirolactona I ou roscovitina) e maturados in vitro com
antioxidante (cisteamina ou β-mercaptoetanol) foram fecundados e cultivados in vitro. A
qualidade embrionária foi avaliada com 168 hpi pela técnica de coloração TUNEL com a
contagem de células totais e apoptóticas. Os embriões do grupo cujos oócitos foram
maturados com SFB obtiveram a maior porcentagem (P<0,05) de células apoptóticas
(5,75%) quando comparado ao grupo CBM (pré-MIV com BSA, butirolactona I e -
mercaptoetanol seguido de MIV com BSA e -mercaptoetanol) com a menor
porcentagem (3,00%). A fragmentação de DNA total dos embriões foi avaliada 168 hpi
pela técnica do Cometa e não foi observada diferença significativa (P>0,05) entre os
tratamentos em relação à freqüência e extensão de danos do DNA que variou de 0 a
38,18 %. Concluímos que a taxa de apoptose celular e fragmentação de DNA nos
embriões produzidos in vitro são maiores naqueles maturados com SFB que com
butirolactona I e -mercaptoetanol.
Palavras-Chave: maturação in vitro, fecundação in vitro, embrião, bovino,
antioxidantes, butirolactona I, roscovitina, TUNEL, ensaio Cometa.
Introdução
A apoptose é a forma mais generalizada de morte celular, pois é a que ocorre
tanto no desenvolvimento embrionário-fetal como ao longo da vida adulta. O conceito
de morte celular por apoptose, contrastando com o de necrose, foi proposto há 26 anos
72
por KERR e SEARLE (1972): “As células fisiologicamente indesejáveis não necrosam,
elas apoptosam”. A morte celular programada é característica no desenvolvimento de
animais e plantas. Esse tipo de morte celular é tão importante quanto o processo
mitótico no sentido de produzir um indivíduo.
A apoptose é caracterizada por uma série de eventos bioquímicos e morfológicos
observados no núcleo e no citoplasma das células que entram neste processo. A
condensação e fragmentação do DNA nuclear estão comumente associadas à quebra
do DNA nuclear em fragmentos de 200 pares de base. Similarmente, o citoplasma se
torna denso e com corpos apoptóticos e vesículas, e é observado ainda peroxidação
lipídica, oxidação de proteínas e aumento do retículo endoplasmático (HALL, 1999).
A apoptose é confirmada in situ por meio do ensaio TUNEL, que a enzima
terminal “deoxynucleotidyl transferase” (TdT) catalisa a incorporação de “biotinylated
deoxyuridine” (dUTP) nos locais de quebra de DNA. O sinal é amplificado por
fluorescência e a reação detecta preferencialmente células que iniciaram o processo de
morte celular. A apoptose é observada em condições normais no início do
desenvolvimento de embriões in vivo e in vitro (NEUBER et al., 2002). O índice de
células em apoptose pode indicar a qualidade de blastocistos produzidos.
A técnica de eletroforese de células em microgel é aplicada em muitos estudos
relacionados à integridade de DNA e qualidade celular. O ensaio Cometa é baseado no
princípio de que danos ao DNA reduzem o tamanho de fragmentos do DNA. Este efeito
é detectado aplicando um campo eletroforético para lisar as células. Os fragmentos de
DNA corados formam um típico padrão de migração semelhante a um cometa (HELMA
e UHL, 2000). A detecção de danos aos fragmentos de DNA pelo ensaio Cometa é um
método eficiente para avaliar danos no DNA de células (oócitos ou embriões)
submetidos ao estresse oxidativo que ainda pode causar peroxidação de fosfolipídeos
de membrana e alterar muitos tipos de moléculas celulares, tais como lipídeos,
proteínas e ácidos nucléicos (NASR-ESFAHANI et al., 1990), podendo levar à
alterações mitocondriais, bloqueio de desenvolvimento, depleção do ATP e apoptose
(KOWALTOWSKI e VERCESI, 1999; HYSLOP et al., 1988; YANG et al., 1998). O
73
ensaio Cometa permite a quantificação tanto pelo monitoramento da freqüência como
pela extensão dos danos ao DNA (TAKAHASHI et al., 2000).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade de embriões através da
fragmentação de DNA, obtidos a partir de oócitos cultivados com inibidores da
maturação nuclear e antioxidantes, utilizando as técnicas do TUNEL e Cometa.
Material e Métodos
Obtenção e seleção dos oócitos
Os ovários de bovinos abatidos nos abatedouros de Guararapes-SP e Birigüi-SP
foram retirados das carcaças aproximadamente 20 minutos após o abate, mantidos em
solução salina estéril a 30-35°C e transportados para o laboratório em caixas térmicas,
não excedendo o limite de 6 horas desde o abate até o início das aspirações. As
punções foliculares foram realizadas manualmente por meio de agulha de calibre 18-G,
adaptada a seringa de 20 mL, ambas descartáveis. Todo o material aspirado foi
transferido para tubos plásticos de 50 mL e decantado por 15 minutos para seleção dos
oócitos.
O sedimento foi transferido para placas de poliestireno de 60 mm de diâmetro e
avaliado em microscópio esterioscópico. Os oócitos com cumulus compacto, possuindo
pelo menos 4 camadas de células e de aparência saudável (citoplasma de granulação
homogênea) foram selecionados para o cultivo de maturação.
Maturação dos oócitos
Os oócitos selecionados foram lavados duas vezes em meio de lavagem H-199
(meio TCM-199 suplementado com 0,2 mM de piruvato, 20 mM de HEPES, 5 mM de
bicarbonato de sódio e 75 µg/mL de amicacina) e uma vez em meio de pré-maturação
(meio TCM-199 suplementado com 75 µg/mL de amicacina, 0,3% de BSA e 0,2 mM de
piruvato). O meio de pré-maturação foi suplementado com 25 µM de roscovitina ou 100
µM de butirolactona I e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM de cisteamina. Somente
foram pré-maturados os oócitos dos grupos contendo inibidores da maturação nuclear.
74
Ao término do cultivo de pré-maturação, os oócitos foram transferidos para placa
de cultura contendo meio de maturação B-199 (meio TCM-199 suplementado com 0,2
mM de piruvato, 25 mM de bicarbonato de sódio, 75 µg/mL de amicacina, 1 µg/mL de
17-β estradiol, 0,5 µg/mL de FSH, 100 UI/mL de hCG e 0,6% de BSA) suplementado ou
não com 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM de cisteamina. Os demais grupos
experimentais (sem inibidores da maturação nuclear) foram apenas cultivados em meio
de maturação B-199.
Os oócitos de todos os grupos foram cultivados em microgotas de 100 µL de
meio recoberto com óleo mineral, em estufa a 38,8°C com atmosfera de 5% de CO
2
em
ar e máxima umidade.
Fecundação in vitro
Após o cultivo de maturação (24 horas para os grupos sem inibidores de
maturação nuclear, e 20 horas para os grupos com inibidores), os COCs foram
submetidos à fecundação in vitro. Foi utilizado sêmen de um único doador da raça
Limousin de um único lote. A palheta foi descongelada em banho-maria a 35-37°C
durante 30 segundos e lavada por três vezes em 2 mL de meio TL-Sêmen cada vez,
adicionado de antibiótico e 2 µL/mL do estoque C, por centrifugação a 750 rpm (270xg),
durante 5 minutos. Na última lavagem, 30 µL do sedimento foi recuperado e depositado
em um microtubo com 30 µL de meio TALP-FIV, sendo feita avaliação de suas
características (motilidade e concentração espermática). A concentração foi ajustada
para 25x10
6
espermatozóides vivos por mL, sendo adicionados 4 µL desta diluição para
cada gota de fecundação (concentração final de 100 x 10
3
espermatozóides por gota de
meio). Após a maturação, os oócitos de cada grupo foram lavados no meio de
fecundação (TALP-FIV) suplementado com 10 µg/mL de heparina, 160 µL PHE e 0,6%
BSA, sendo então transferidos para as microgotas de fecundação (20
oócitos/microgota). A fecundação foi realizada a 38,8ºC, por 24 horas em estufa
contendo 5% CO
2
em ar atmosférico e 99% de umidade.
75
Cultivo de desenvolvimento
Os zigotos foram lavados duas vezes em meio TALP e uma vez no meio mSOF,
sendo então transferidos para as microgotas do cultivo de desenvolvimento in vitro
(CIV). O cultivo de desenvolvimento embrionário foi realizado em microgotas de 100 µL
de meio mSOF suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% SFB. O cultivo foi conduzido
em estufa à temperatura de 38,8°C, contendo 5% de CO
2
em ar atmosférico e 99% de
umidade, durante 7 dias. A cada 48 horas, 50% do meio de cultivo foi renovado. A
avaliação do desenvolvimento embrionário foi realizada às 40 horas (clivagem), 168
horas (formação de blastocistos) e 192 horas (blastocistos eclodidos e em processo de
eclosão) pós-inseminação (hpi).
Coloração “Terminal Transferase Assay” - TUNEL
As células em apoptose dos embriões foram marcadas pela coloração “In situ
terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay” (TUNEL),
descrita por PAULA-LOPES e HANSEN (2002). Os blastocistos foram lavados por
quatro vezes em 100 µL de PBS com PVP (1 mg/mL) (PBS-PVP) e posteriormente
fixados, com a zona pelúcida intacta, em 100 µL de solução de paraformaldeído (4%
em PBS, pH 7,4) a temperatura ambiente por 1 hora. Os embriões foram lavados em
PBS-PVP e foram armazenados sob refrigeração (4°C), por 1 a 7 dias, para posterior
processamento. Estes embriões foram então permeabilizados em solução de Triton X-
100 (0,5%, v/v) em citrato de sódio (0,1%), por 30 minutos em temperatura ambiente.
Os embriões reservados para controle positivo foram incubados com DNAse I (50 UI/mL
de água Milli-Q) (RNAse free) a 37°C por 1 hora, enquanto que os embriões dos
tratamentos ficaram em gotas de 100 µL de PBS-PVP. Posteriormente, todos os
embriões foram lavados em PBS-PVP e incubados, em câmara úmida, com 15 µL da
mistura (1:9, da enzima – tubo 1 e do tampão da enzima – tubo 2, respectivamente)
para a coloração TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein, Roche
Diagnostics, Germany), por 1 hora a 37°C no escuro. Os embriões reservados para
controle negativo foram incubados na ausência da enzima “terminal deoxinucleotidyl
transferase” (TdT) (tubo 1, contida no kit). Os embriões foram incubados em RNAse A
76
(50 µg/mL de água Milli-Q) por 1 hora em temperatura ambiente, seguida por incubação
com iodeto de propídio (0,5 µg/mL de PBS-PVP) por 30 minutos em temperatura
ambiente. Por fim, estes embriões foram lavados em PBS-PVP e colocados entre
lâmina e lamínula com glicerina tamponada (9:1). Os blastocistos foram avaliados em
microscópio de epifluorescência (excitação de 510-550nm e emissão de 590nm) quanto
ao número de células com fragmentação de DNA (TUNEL positivas – fluorescência
verde ou amarela pontual dentro do núcleo) localizadas na MCI ou no TF em relação ao
número total de células do blastocisto, determinado pelos núcleos corados em vermelho
pelo iodeto de propídeo.
Ensaio Cometa
Os embriões provenientes de oócitos maturados nos diferentes meios de cultivo
foram colhidos e lavados em TCM-199 Hepes com 10% de SFB, e posteriormente
lavados em gel de agarose “low melting point” (LMP) (0,75%) a uma temperatura de
37ºC e depositados enfileirados sobre lâmina. A lâmina foi deixada sob câmera úmida a
4ºC por 10 minutos, e em seguida foi recoberta com mais 1 mL de gel de ágar (1%).
A lâmina preparada foi deixada dentro de uma câmara úmida a 4ºC por mais 30
minutos para polimerização do gel, sendo posteriormente colocada em solução de lise
[Tris (10 mM), Triton X-100 (1%), Na
2
EDTA (100 mM), Proteinase K (5 µg/mL), NaCl 2,5
(mM) por 2 horas a 50ºC. Após a lise, a lâmina foi colocada em solução de eletroforese
altamente alcalina pH 13-14 [NaOH (300 mM, Na
2
EDTA (1 mM)] por vinte minutos para
separação das fitas de DNA. Finalmente, correu-se o gel a 1,5 Volts por cm, com
amperagem de 200 a 350 mA.
A lâmina foi lavada com solução de Tris-HCl (0,4 M) para neutralizar a reação e
em seguida o gel foi corado com brometo de etídeo (10 µg/mL) durante 15 minutos. As
lâminas foram visualizadas em microscópio equipado com epifluorescência
(Microscópio Olympus IX51-III; excitação 340 a 380 nm e emissão 430 nm).
Os embriões destinados ao ensaio Cometa foram avaliados a partir do
comprimento da cauda e intensidade de coloração do núcleo. Foram classificados de
acordo com a migração do DNA: C(0) sem migração de DNA, C(1) com um pequeno
77
halo a sua volta, C(2) com uma pequena cauda e núcleo bem corado, C(3) com a
cauda de tamanho médio e núcleo parcialmente corado e C(4) com o núcleo quase
totalmente descorado e cauda longa (ANDERSON et al.,1994; VISVARDIS et al., 1997).
Esta classificação pode ser visualizada na Figura 1:
Figura 1 - Classificação da integridade de DNA total (Modificado de ANDERSON et al.,
1994 e VISVARDS et al., 1997). (0) célula onde ocorreu pouca quebra de DNA e
apenas difusão do DNA no gel, (1) pequena quebra e pouca migração de DNA, (2)
quebra e migração parcial de DNA, (3) quebra e migração de DNA acetuada e (4)
grande quebra e alta migração de DNA.
Delineamento experimental
Os oócitos foram pré-maturados em meio suplementado com 0,3% de BSA e 25
µM de roscovitina ou 100 µM de butirolactona I, e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM
de cisteamina. Depois foram maturados em meio B-199 suplementado com 0,6% de
BSA e 50 µM de β-mercaptoetanol ou 50 µM de cisteamina conforme grupos
experimentais abaixo:
Pré-Maturação:
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina (R);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina + 50 µM de
cisteamina (RC);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 25 µM de roscovitina + 50 µM de β-
mercaptoetanol (RM);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I (B);
0 1
2
3
4
78
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I + 50 µM
de cisteamina (BC);
TCM-199 suplementado com 0,3% de BSA + 100 µM de butirolactona I + 50 µM
de β-mercaptoetanol (BM);
Maturação:
(S) →
→→
→ B-199 suplementado com 10% de SFB (PADRÃO);
(C) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA (CONTROLE);
(CC) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina;
(CM) →
→→
→B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-mercaptoetanol;
(CR) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA
(CRC) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina
(CRM) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-
mercaptoetanol
(CB) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA
(CBC) →
→→
→ 199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de cisteamina
(CBM) →
→→
→ B-199 suplementado com 0,6% de BSA + 50 µM de β
ββ
β-
mercaptoetanol
Experimento I: Avaliação da fragmentação de DNA pela coloração
“Terminal Transferase Assay” - TUNEL
Neste experimento, os oócitos depois de maturados (24 horas para os grupos
sem inibidores de maturação nuclear, e 20 horas para os grupos com inibidores), foram
submetidos à fecundação por 24 horas. Os zigotos foram cultivados in vitro em meio
SOF-Modificado, suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB. Os embriões foram
avaliados as 168 hpi pela técnica do TUNEL para determinação do número de células
totais e apoptóticas.
SEM
PRÉ
-
MIV
COM
PRÉ
-
MIV
79
Experimento II: Avaliação da fragmentação de DNA pelo ensaio Cometa
Neste experimento, os oócitos foram maturados, fecundados e cultivados nas
mesmas condições descritas anteriormente. Os embriões foram avaliados as 168 hpi
pela técnica do Cometa para verificação da fragmentação de DNA total.
Análise Estatística
Para avaliação do efeito da suplementação do meio de cultura com inibidores da
maturação nuclear e antioxidantes sobre fragmentação de DNA do embrião através das
técnicas do TUNEL e Cometa, os dados foram analisados pela fração de oócitos que
atingiram o estádio de blastocisto com 168 hpi, reportados em termos de porcentagem
(%). Como a porcentagem de blastocistos não obteve distribuição normal, os dados
foram transformados em arc sen
%
. No experimento I, foi aplicada análise de
variância (ANOVA) para comparação dos tratamentos e posteriormente foi aplicado
teste de Tukey para comparação múltipla das médias. No experimento II, foi aplicada
análise de variância (ANOVA) para comparação dos tratamentos, em cada uma das
classes de fragmentação de DNA do embrião, e posteriormente foi aplicado teste de
Tukey para comparação múltipla das médias.
O nível de significância adotado foi de 5%. A análise estatística foi efetuada
empregando-se o sistema SAS (Statistical Analysis System).
Resultados
Experimento I: Avaliação da fragmentação de DNA pela coloração
“Terminal Transferase Assay” – TUNEL
Os blastocistos desenvolvidos após 168 horas de cultivo in vitro foram
observados pela coloração TUNEL em microscópio epifluorescente, sendo que as
células TUNEL positivas apresentaram fluorescência verde ou amarela pontual dentro
do núcleo, localizada na MCI ou no TF em relação ao número total de células do
blastocisto, determinado pelos núcleos corados em vermelho pelo iodeto de propídeo
(Figura 2). O grupo de oócitos pré-maturados com SFB apresentou maior porcentagem
80
(5,75%) de células em apoptose quando comparado com o grupo CBM (pré-MIV BSA +
B + βME / MIV BSA + βME) que obteve apenas 3,00% (P<0,05), não diferindo dos
demais grupos (Tabela 1 e Figura 3).
Figura 2 – Blastocistos corados pela técnica de coloração TUNEL, 168 horas após FIV,
observados em microscópio de epifluorescência. A) Controle Positivo TUNEL – tratados
com DNAse I; B) Controle Negativo TUNEL – tratados sem TdT; C) Blastocisto que
apresentou fragmentação do DNA. As setas demonstram locais da quebra do DNA
dentro do núcleo. (TdT – enzima “terminal deoxinucleotidyl transferase”).
Tabela 1 – Porcentagem de células em apoptose verificadas pela técnica do TUNEL e
tamanho (número médio de células/blastocisto) de embriões produzidos de oócitos
maturados em diferentes meios.
Apoptose (TUNEL) Grupos
Média (%) ± EPM
Média Células/Bl ± EPM
S 5 (5,75 ± 0,82)
a
81 ± 3,85
a
C 3 (3,93 ± 0,64)
ab
79 ± 2,89
a
CC 4 (4,53 ± 0,48)
ab
81 ± 2,74
a
CM 4 (4,62 ± 0,64)
ab
83 ± 3,26
a
CB 3 (3,87 ± 0,49)
ab
77 ± 2,65
a
CBC 3 (3,24 ± 0,34)
ab
81 ± 2,53
a
CBM 2 (3,00 ± 0,23)
b
77 ± 2,52
a
CR 4 (5,38 ± 0,84)
ab
82 ± 4,35
a
CRC 3 (3,68 ± 0,62)
ab
77 ± 3,87
a
CRM 3 (3,32 ± 0,44)
ab
79 ± 5,32
a
ab
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
A
B
DNA Fragmentado
C
81
Figura 3 – Percentual de fragmentação do DNA encontradas em blastocistos corados
por TUNEL após 168 horas de fecundação dos oócitos maturados em diferentes meios.
S= SFB (10%), C= BSA (0,6%), CC= BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CM= BSA (0,6%) + βME (50 µM),
CB= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM) / MIV BSA (0,6%); CBC= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM)
+ CIS (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CBM= pré-MIV BSA (0,3%) + B (100 µM) + βME (50
µM) / MIV BSA (0,6%) + βME (50 µM), CR= pré-MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) / MIV BSA (0,6%);
CRC= pré-MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) + CIS (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + CIS (50 µM), CRM= pré-
MIV BSA (0,3%) + R (25 µM) + βME (50 µM) / MIV BSA (0,6%) + βME (50 µM).
ab
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de ANOVA (P<0,05).
Experimento II: Avaliação da fragmentação de DNA pelo ensaio Cometa
Os blastocistos foram corados pela técnica do Cometa após 168 horas de cultivo
in vitro, observados em microscópio epifluorescente e avaliados a partir do comprimento
da cauda e intensidade de coloração dos núcleos (Figura 4). A classificação foi feita em
classes de acordo com a de ANDERSON et al.,1994 e VISVARDIS et al., 1997. Os
blastocistos não apresentaram diferença significativa (P>0,05) entre os tratamentos em
relação à freqüência e extensão de danos do DNA. Os percentuais e as médias da
fragmentação de DNA total dos embriões estão demonstrados na tabela 2.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
S C CC CM CB CBC CBM CR CRC CRM
GRUPOS
a
a
b
ab
ab
ab
ab
b
a
b
ab
ab
82
Figura 4 – Classes de fragmentação de DNA em blastômeros de blastocistos
produzidos 168 horas após FIV.
Tabela 2 – Porcentagem de fragmentação de DNA total de embriões submetidos à
técnica do Cometa provenientes de oócitos maturados em diferentes meios.
Grupos Classificação Cometa
Média (%) ± EPM
Classe 0 Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4
S 5
(7,05 ± 4,32)
a
18
(23,79 ± 8,89)
a
19
(27,72 ± 5,99)
a
12
(18,98 ± 6,82)
a
18
(22,47 ± 12,93)
a
C 4
(6,41 ± 2,11)
a
12
(20,43 ± 6,32)
a
22
(38,18 ± 5,69)
a
12
(19,14 ± 3,01)
a
10
(15,84 ± 6,61)
a
CC 1
(1,52 ± 1,52)
a
7
(24,53 ± 15,50)
a
14
(26,71 ± 7,90)
a
15
(29,25 ± 6,87)
a
11
(17,99 ± 8,48)
a
CM 4
(5,74 ± 4,46)
a
9
(17,47 ± 10,21)
a
19
(33,26 ± 6,99)
a
14
(29,84 ± 8,19)
a
4
(13,69 ± 8,27)
a
CB 5
(10,48 ± 5,04)
a
13
(22,76 ± 6,29)
a
17
(27,38 ± 4,46)
a
21
(30,57 ± 7,42)
a
6
(8,81 ± 4,67)
a
CBC 11
(17,39 ± 8,04)
a
17
(27,51 ± 7,52)
a
17
(26,27 ± 7,16)
a
12
(18,29 ± 7,95)
a
6
(10,54 ± 7,05)
a
CBM 14
(23,36 ± 10,96)
a
12
(21,87 ± 6,38)
a
15
(26,22 ± 8,50)
a
11
(21,13 ± 8,81)
a
4
(7,41 ± 4,04)
a
CR 7
(27,50 ± 9,46)
a
4
(14,17 ± 10,03)
a
6
(19,44 ± 9,04)
a
10
(31,35 ± 12,22)
a
3
(7,54 ± 5,01)
a
CRC 1
(3,33 ± 3,33)
a
7
(20,69 ± 5,49)
a
13
(36,67 ± 4,71)
a
11
(33,19 ± 6,24)
a
2
(6,11 ± 3,89)
a
CRM 6
(18,06 ± 6,24)
a
5
(15,28 ± 6,94)
a
9
(31,94 ± 4,52)
a
9
(34,72 ± 10,19)
a
0
(0,00 ± 0,00)
a
a
Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de ANOVA (P>0,05).
0
1
3
4
2
83
Discussão
Experimento I: Avaliação da fragmentação de DNA pela coloração
“Terminal Transferase Assay” – TUNEL
O número de células embrionárias e o percentual de morte celular ou apoptose
são usuais indicadores da qualidade embrionária. Quanto maior o número de células e
menor a taxa de apoptose, melhor a qualidade do embrião. A apoptose no início do
desenvolvimento embrionário é observada sob condições in vivo e in vitro. O embrião
pode apresentar apoptose em blastômeros inviáveis, durante a formação da blastocele,
ou ainda em condições de estresse durante o cultivo in vitro. A apoptose é
caracterizada por uma série de eventos bioquímicos e morfológicos observados no
núcleo e no citoplasma das células que entram neste processo. A condensação e
fragmentação do DNA nuclear estão comumente associadas à quebra do DNA nuclear
em fragmentos de 200 pares de base (HALL, 1999). A reação TUNEL (GAVRIELI et al.,
1992) possibilita a detecção in situ de células apoptóticas apontando uma extensiva
fragmentação de DNA oligonucleossomal gerada pela atividade de DNAse endógena
durante o processo de apoptose.
O percentual reduzido de células em apoptose observadas em todos os
tratamentos indicou que nossas condições de cultivo embrionário foram satisfatórias. O
grupo de oócitos maturados com SFB apresentou maior porcentagem de células em
apoptose quando comparado àqueles maturados com butirolactona I e -
mercaptoetanol. BAVISTER et al. (1992) relataram que o SFB possui citocinas e fatores
de crescimento que estimulam a divisão mitótica. Desta maneira, embriões
provenientes de oócitos maturados com SFB clivam mais rapidamente, e
provavelmente, essa velocidade de clivagem tenha correlação com maior taxa de
fragmentação de DNA, e consequentemente com apoptose. Outro fator importante
relacionado à apoptose se refere ao estresse oxidativo, que pode variar dependendo do
sistema de cultivo e dos fatores de crescimento presentes no SFB (YOUNG et al.,
1998). VAN SOOM et al. (2002) relataram que a apoptose in vitro pode ser induzida
pela presença de radicais livres do oxigênio. Desta maneira, a maior porcentagem de
84
células em apoptose dos embriões de oócitos maturados com SFB pode ter ocorrido
por duas hipóteses: 1) o SFB possui fatores de crescimento que estimulam a divisão
mitótica levando os embriões à clivagem mais rapidamente e maior taxa de
fragmentação de DNA e 2) algumas substâncias presentes no SFB, de composição
indefinida, e o sistema de cultivo podem levar ao estresse oxidativo e induzir a
apoptose.
Apesar de ser o grupo com maior taxa de apoptose, os oócitos maturados com
SFB produziram o maior número de blastocistos com 168 e 192 horas de cultivo.
PORTER et al. (2001) colocaram que o fato de oócitos maturados com SFB produzir
mais embriões seja devido aos fatores de crescimento e proteínas que este possa
conter, entretanto esses embriões têm menor integridade de DNA e estão mais
suscetíveis à apoptose, o que é um indicativo de menor qualidade embrionária.
A adição de antioxidantes exerce uma influência positiva sobre o
desenvolvimento embrionário de bovinos, aumentando a concentração intracelular de
GSH no oócito e o número de células (VAN SOOM et al., 2002). Em nosso estudo, a
associação da butirolactona I e -mercaptoetanol foi benéfica aos embriões que
apresentaram menor porcentagem de células em apoptose. Entretanto, não
observamos um efeito positivo da GSH sobre as taxas de produção embrionária e
redução das células em apoptose para os grupos de oócitos maturados com cisteamina
e -mercaptoetanol que apresentaram as mesmas taxas de células apotóticas dos
grupos controle com BSA e SFB, assim como VAN SOOM et al. (2002) e WOLF (2005)
que não observaram este efeito positivo. As condições de cultivo, como a tensão de
oxigênio e a composição do meio, podem ter influência no efeito positivo da adição dos
antioxidantes no desenvolvimento embrionário.
Experimento II: Avaliação da fragmentação de DNA pelo ensaio Cometa
A detecção de danos nos fragmentos de DNA pelo ensaio Cometa é um método
proveitoso para avaliar um dos efeitos prejudiciais ocasionados pelo estresse oxidativo
ou outras condições de cultivo embrionário que podem comprometer o desenvolvimento
85
embrionário. O ensaio Cometa permite a quantificação dos danos de DNA monitorando
tanto a freqüência como a extensão dos danos ao DNA (TAKAHASHI et al., 2000).
Em nosso estudo, os blastocistos não apresentaram diferença entre os
tratamentos em relação à freqüência e extensão de danos causados ao DNA.
Observamos que a incidência de fragmentação de DNA de classe 4 (que caracteriza
grande quebra e alta migração de DNA) não foi muito alta para todos os grupos,
indicando que nossas condições de cultivo embrionário foram satisfatórias. TAKAHASHI
et al. (2000) relatam que o ensaio Cometa é uma boa técnica para se avaliar a
qualidade do meio de cultura e seus aditivos.
Apesar de não haver diferença entre os tratamentos, observamos que a grande
fragmentação e alta migração de DNA representada pela classe 4 foram maiores no
grupo de oócitos maturados com SFB, ao passo que, pouca quebra de DNA (classe 0)
foi verificada nos grupos com butirolactona I e -mercaptoetanol e com roscovitina. Este
resultado teve uma correlação com os nossos achados dos embriões submetidos à
técnica do TUNEL, no qual o grupo de oócitos maturados com SFB apresentou maior
porcentagem de células em apoptose que o grupo com butirolactona I e -
mercaptoetanol. Observamos que as duas técnicas utilizadas (TUNEL e Cometa) foram
igualmente eficientes e demonstraram resultados coerentes. Estas considerações são
relevantes quando YANG et al., 1998 relataram que os danos causados ao DNA
possam resultar em apoptose. Como visto anteriormente, embriões cultivados em SFB
clivam mais rapidamente podendo ter correlação com maior taxa de fragmentação de
DNA, e consequentemente com apoptose (BAVISTER et al., 1992).
Parece que a fragmentação de DNA e a apoptose podem sem prejudiciais ao
desenvolvimento embrionário. Entretanto, o grupo do SFB apresentou a maior produção
de blastocistos. HARDY (1999) colocou que a morte celular nos embriões pode ser um
mecanismo para eliminar células anormais e células com potencial de desenvolvimento
impróprio. Os embriões maturados em SFB, por clivarem mais rapidamente, necessitam
de um mecanismo fisiológico que elimine o excesso de células (principalmente as de
má qualidade) para garantir a sua produção.
86
Além da quantidade de embriões produzidos, a morte celular pode estar
relacionada com a qualidade do embrião. Acredita-se que blastocistos com grande
número de células tenham maior probabilidade de implantar e dar origem à
descendência (VAN SOOM et al., 1997). Blastocistos com número reduzido de células
tem uma incidência alta e variável de fragmentação de DNA (BYRNE et al., 1999;
HARDY et al., 1989). Entretanto, HARDY, (1999) e JURISICOVA et al. (1998)
levantaram a hipótese de que a morte celular, após certo patamar, é prejudicial para o
desenvolvimento embrionário.
Conclusões
A taxa de apoptose celular e fragmentação de DNA nos embriões produzidos in
vitro são maiores naqueles maturados com SFB que com butirolactona I e -
mercaptoetanol.
O bloqueio meiótico e a associação aos antioxidantes cisteamina e -
mercaptoetanol não interferiram na apoptose.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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antioxidants and other modifying agents on oxygen-radical-generated DNA damage in
human lymphocytes in the Comet Assay. Mutation Research, v. 307, p. 261-271, 1994.
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vitro matured/in vitro fertilized bovine embryos into morulae and blastocysts in defined
culture media. Theriogenology, v. 37, p. 127-146, 1992.
BYRNE, A.T.; SOUTHGATE, J.; BRISON, D.R.; LEESE, H.J. Analysis of apoptosis in
the preimplatation bovine embryo using TUNEL. Journal of Reproduction and
Fertility, v. 117, p. 97-105, 1999.
GAVRIELI, Y.; SHERMAN, Y.; BEN SASSON, S.A. Identification of programmed cell
deth in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. Journal of Cellular
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Clinical Investigation, v. 29, p. 238-245, 1999.
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