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DÉBORAH SERRA SOUSA BUI
Papel da N-acetilcisteína, como agente protetor da membrana
peritoneal na lesão provocada por solução de diálise
hipertônica
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Área de Concentração: Nefrologia
Orientador: Prof. Dr. Hugo Abensur
São Paulo
2007
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DÉBORAH SERRA SOUSA BUI
Papel da N-acetilcisteína, como agente protetor da membrana
peritoneal na lesão provocada por solução de diálise
hipertônica
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Área de Concentração: Nefrologia
Orientador: Prof. Dr. Hugo Abensur
São Paulo
2007
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AGRADECIMENTOS
Antes e acima de tudo, agradeço a Deus, meu constante guia e
protetor.
Ao Prof. Dr. Hugo Abensur, meu orientador, pelo incentivo e
persistência neste projeto. Seu conhecimento foi imprescindível em todos os
momentos. Chegamos ao fim após termos trilhado, juntos, uma longa
caminhada. A ele, minha eterna admiração.
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Seguro, que forneceu a ferramenta
principal, o conhecimento dos modelos experimentais, ao qual fui iniciada no
LIM-12. Obrigada pelos primeiros passos.
À Dra. Maria Heloisa Shimizu – Helô -, por me ter ensinado o
necessário de forma carinhosa e paciente. Agradeço-lhe principalmente pelo
grande ensinamento: a ciência requer persistência.
A toda a equipe do LIM-12, com especial menção à Heloá, ao
Nivaldo e à Ciça, sempre tão pacientes e incentivadores.
À minha família - meu pai, minha mãe e meus irmãos -, que tem
sido um forte pilar em minha vida. Obrigada, desde o começo desta jornada.
Sem seu precioso apoio, nada disso seria realidade hoje.
A meu esposo, Jelson Bui Júnior, cujo apoio recebi antes de
todos. Foi ele quem sofreu o maior reflexo de minhas ausências, foi nele que
encontrei o maior incentivo, não só como esposo, mas também como amigo
e como médico. A vida confirma e abençoa nossas escolhas.
À Prof
a
. Maria Socorro Amorim e ao Prof. Fernando Frattini Neto,
colegas mestres, nefrologistas e incentivadores desta pesquisa. A confiança
de ambos possibilitou minhas horas ausentes de Jundiaí.
Agradeço ao Dr. Dino Martino Filho por sua participação, que
engrandeceu este projeto.
“Não se iluda com a fábula do talento,
pois na ciência não há lugar para príncipes.
Lembre-se sempre de que gênio é trabalho”
Vinícius Bittencourt
Normalização adotada
Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no
momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals
Editors (Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Annelise Carneiro Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F.
Crestana, Marinalva de Sousa Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria
Vilhena. 2ª ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2005.
Abreviatura dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals
Indexed in Index Medicus
SUMÁRIO
Lista de ilustrações
Lista de tabelas
Lista de abreviaturas
Lista de símbolos
Resumo
Summary
1 INTRODUÇÃO 16
MEMBRANA PERITONEAL......................................................................................17
INFLAMAÇÃO...........................................................................................................23
GLICOSE E PROCESSO OXIDATIVO .....................................................................24
ANTIOXIDANTES E N-ACETILCISTEÍNA................................................................27
MARCADORES DO PROCESSO OXIDATIVO.........................................................28
MODELOS EXPERIMENTAIS DE DIÁLISE PERITONEAL.......................................29
OBJETIVOS..............................................................................................................37
OBJETIVOS PRINCIPAIS .................................................................................37
OBJETIVOS SECUNDÁRIOS ...........................................................................37
2 MATERIAL E MÉTODO 38
ESTUDO...................................................................................................................38
ANIMAIS...................................................................................................................38
GRUPOS DE ESTUDO.............................................................................................39
CRONOGRAMA DE SEIS SEMANAS DE ESTUDO.................................................39
INFUSÃO PERITONEAL DE SOLUÇÃO HIPERTÔNICA. ........................................41
GAIOLEIRO METABÓLICO......................................................................................42
TESTE
FUNCIONAL DA MEMBRANA......................................................................42
BIÓPSIA
PERITONEAL............................................................................................43
TESTES LABORATORIAIS ......................................................................................45
DOSAGEM
DE URÉIA E GLICOSE .......................................................................... 46
CITOLOGIA
E CULTURA DA AMOSTRA DA SOLUÇÃO DE DIÁLISE.....................46
SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS .....................................................................................46
ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS .........................................................47
3 RESULTADOS 48
AVALIAÇÃO FUNCIONAL DA MEMBRANA PERITONEAL......................................49
SUBSTÂNCIAS REATIVAS COM ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS) URINÁRIO 53
HISTOLOGIA PERITONEAL:...................................................................................55
4 DISCUSSÃO 57
5 CONCLUSÃO 63
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA...............................................................................64
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 - Diagrama de Trabalho............................................................................41
Gráfico 1 - Resultados D/P uréia dos grupos ........................................................... 50
Gráfico 2 - Resultados D1/D0 dos grupos ................................................................50
Gráfico 3 - Resultados de TBARS urinário dos grupos.............................................54
Gráfico 4 - Resultados do TBARS plasmático dos grupos........................................ 55
Gráfico 5 - Resultados da medida de espessamento peritoneal dos grupos............56
Figura 1 - Medidas da Espessura parietal nos quatro grupos..................................56
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Média do peso inicial, final e ganho de peso dos grupos.........................48
Tabela 2 - D/P uréia, D1/D0 e avaliação citológica do líquido peritoneal..................51
Tabela 3 - TBARS urinário e plasmático dos grupos................................................54
LISTA DE SIGLAS
DP Diálise Peritoneal
IRC Insuficiência Renal Crônica
DPAC Diálise Peritoneal Ambulatorial Contínua
D/P Uréia Dialisato/Plasmático de uréia
D/D0 Dialisato (tempo) - Dialisato (inicial)
ON Óxido Nítrico
AGEs Produtos Avançados de Glicosilação
EROs Espécies Reativas do Oxigênio
O
2
-
Superóxido
H
2
O
2
Peróxido de Hidrogênio
-
OH Radicais Hidroxilas
RAGE Receptores de AGEs
NAC N-acetilcisteína
MDA Malondialdeído
TBARS Espécies Reativas do Ácido Tiobarbitúrico
GPx Glutationa Peroxidase
TG Glutationa Total
GSHRx Glutationa Redutase
SOD Superóxido Dismutase
LIM 12 Laboratório de Investigação Médica
RL Ringer Lactato
SDH Solução de Diálise Hipertônica
TCA Ácido Tricloroacético
PET Teste de Equilíbrio Peritoneal
SPAR Standard Peritoneal Permeability Analysis in
Rabbits
SPART Standard Peritoneal Permeability Analysis in Rats
LISTA DE SÍMBOLOS
% valor percentual
m2 metros quadrados
A Angstrom
ml/min mililitros por minuto
mg/dl miligramas por decilitros
mOsm/L miliosmol por litro
ml mililitros
cm2 centímetros quadrados
g gramas
ml/g mililitros por gramas
céls/mm3 células por milímetros cúbicos
ml/Kg mililitros por quilogramas
mg/L miligramas por litros
Cº graus Celsius
mg/dia miligramas por dia
cm centímetros
µm micrômetros
RPM rotações por minuto
nm nanômetros
mg/100g.Kg/dia miligramas por cem gramas por quilo por dia
nmols/24h nanomoles por 24 horas
nmols/ml nanomoles por mililitros
> maior que
< menor que
p.ex. por exemplo
pH potencial hidrogeniônico
5/6 cinco sextos
® marca registrada
G Gauge
RESUMO
Bui DSS. N-acetilcisteína protetora da membrana peritoneal na lesão
provocada por solução de diálise hipertônica [dissertação]. São Paulo:
Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2007.
Em 2006, a Diálise Peritoneal representou, no Brasil, o método de
tratamento de 9,3% dos pacientes com Insuficiência Renal Crônica Terminal.
A terapia dialítica provoca uma lesão na membrana peritoneal de
característica inflamatória, com grave desbalanço do processo oxidativo.
Associa alto transporte de solutos e perda da capacidade de ultrafiltração da
membrana. Vários fatores contribuem para a lesão, tais como a
bioincompatibilidade das soluções de diálise peritoneal e sua elevada
concentração de glicose. O objetivo do presente estudo é avaliar o efeito
protetor da N-acetilcisteína na lesão provocada pelo uso de solução dialítica
hipertônica em modelo experimental de diálise peritoneal. Foram estudados
22 ratos Wistar, machos, não-urêmicos, divididos em quatro grupos, sendo:
um grupo-controle, não submetido à infusão de SDP; o grupo RL, que
recebeu infusão diária de solução ringer lactato; o grupo SDH, que recebeu
infusão de SDP e, finalmente, o grupo SDH+NAC, que recebeu infusão de
SDP e tratamento com N-acetilcisteína via oral, diariamente (600mg/L). Após
seis semanas, foi realizada avaliação funcional da membrana peritoneal pela
relação uréia do dialisato, com uma hora de permanência na cavidade
peritoneal, e plasma (D/P uréia), assim como pela razão entre a
concentração de glicose no líquido peritoneal após uma hora de
permanência na cavidade e a concentração de glicose na solução de diálise
infundida (G1/G0). As substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS)
foram utilizadas como marcadores no processo oxidativo. A concentração de
TBARS foi avaliada em amostra de urina 24hs e dosagem no plasma.
Comparada ao grupo-controle, a avaliação funcional do grupo SDH
apresentou aumento do transporte peritoneal com D/P uréia de 0,67±0,1 vs
0,46 ± 0,05 (p: 0,03) e G1/G0 de 0,27±0,07 vs 0,44±0,08 (p: 0,01),
demonstrando lesão funcional importante. Quando avaliado o grupo
SDH+NAC, tratado com N-acetilcisteína e o grupo não tratado SDH, foi
observado maior transporte de solutos do grupo não tratado, com D/P uréia
0,67±0,1 vs 0,51 ± 1(p: 0,03) e G1/G0 de 0,27± 0,07 vs 0,35 ± 0,06 (p:0,01).
Portanto, foi constatada maior lesão de membrana comparada ao grupo
tratado. Comparados ao controle, os grupos SDH e SDH+NAC
apresentaram maiores concentrações de TBARS, seja pela dosagem
urinária (p:0,002), seja pelo TBARS plasmático (p:0,0001). O grupo tratado
SDH+NAC apresentou menores concentrações de TBARS, comparado ao
grupo não tratado SDH, provavelmente por um efeito protetor da N-
acetilcisteína. Quando avaliada a membrana peritoneal parietal, o grupo
tratado apresentou menor espessamento de membrana, medido em
micrômetro, em relação ao grupo não tratado (p:0,01) O presente estudo
sugere que a lesão da membrana peritoneal provocada pelo uso de solução
dialítica hipertônica sofre uma forte influência do processo oxidativo e que o
uso contínuo de N-acetilcisteína, por via oral, pode ter efeito redutor dessa
lesão.
Descritores: 1.Diálise Peritoneal 2.Estresse oxidativo 3.Acetilcisteína
4.Modelos animais
SUMMARY
Bui DSS Peritoneal membrane protecting N-acetylcysteine on lesion induced
by hypertonic dialysis solution [dissertation].São Paulo Faculty of Medicine,
University of São Paulo; 2007
Peritoneal Dialysis represents the modality of treatment for 9.3% of end
stage renal disease patients in Brazil. During the period of treatment, the
solution induced a peritoneal membrane lesion of inflammatory characteristic.
Oxidative stress has been implicated in the development of endothelial
damage. It associates the high transport of solutes and loss of ultrafiltration
capacity of the membrane. The lesion is caused by several factors as follows:
peritoneal dialysis solution incompatibility (PDS) and its increased
concentration of glucose. The aim of the present study was to evaluate the
N-acetylcysteine protecting effect on lesion aggravated by the use of
hypertonic dialytic solution in peritoneal dialysis experimental model. Twenty
two male, non-uremic Wistar rats were divided in four groups as follows: (I)
control group, not submitted to PDS infusion; (II) RL group receiving daily
infusion of ringer lactate; (III) HDS group, receiving PDS infusion, and; (IV)
HDS+NAC group receiving PDS infusion and treated with N-acetylcysteine
(600mg/L) orally. The peritoneal membrane functional evaluation was
performed six weeks later by the dialisate-to-plasma urea, ratio (D/P), and
glucose reabsorption determined by the ratio of glucose concentration in
peritoneal fluid after one hour of solution permanence in the cavity (G1/GO).
The thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were used as markers
on studying the oxidative process. The TBARS concentration was assessed
in 24h sampling urine and plasmatic dosage. The functional evaluation for
the HDS group showed increased peritoneal transport compared to the
control group with urea D/P of 0.67±0.1 versus 0.46±0.05 (p:0.03), and
G1/GO 0.27±0.07 versus 0.44±0.08 (p:0.01), demonstrating functional lesion.
When evaluating the HDS+NAC group, treated with N-acetylcysteine and the
HDS non-treated group, a greater transport of solutes was observed for the
non-treated group, with urea D/P 0.67±0.1 versus 0.51 ± 1 (p: 0.03), and
G1/GO 0.27±0.07 versus 0.35±0.06 (p: 0.01), therefore greater lesion
present on the membrane than for the treated group. Compared to the
control group, the HDS and HDS+NAC presented greater TBARS
concentrations either for urine dosage (p: 0.002) or for plasmatic TBARS (p:
0.0001). The HDS+NAC treated group showed lower TBARS concentrations
compared to the non-treated HDS group, a probable protective effect of N-
acetylcysteine on the treatment. In the treated group, peritoneal membrane
demonstrate lower trickiness compared with untreated group.(p:0,01) The
present study suggests that the peritoneal membrane lesion induced by the
use of hypertonic dialytic solution undergoes strong influence from the
oxidative process and that the continuous use of N-acetylcysteine can
preserve these alterations by inhibiting the oxidative stress within the
peritoneal membrane.
Descriptors: 1.Peritoneal dialysis 2.Oxidative stress 3.Acetilcysteine
4.Animal models
16
1 INTRODUÇÃO
A Doença Renal Crônica constitui grave problema de saúde
pública no Brasil e no mundo. Entre nós, a prevalência de pacientes em
programas de tratamento dialítico dobrou nos últimos dez anos.
1
No Brasil, a incidência de pacientes em diálise cresce 8%
anualmente.
1
Em 2006, o número de pacientes em programas de diálise foi
de 70.872. Destes, 6.566 pacientes (ou seja, 9,3%), estavam em programas
de diálise peritoneal (DP).
2
Nos países desenvolvidos, a DP representa o método de
tratamento de aproximadamente 15% dos pacientes com Insuficiência Renal
Crônica (IRC) Avançada.
3
A distribuição dos pacientes em diálise peritoneal
ao redor do mundo não é homogênea. Existem países onde a prevalência
em Diálise Peritoneal Ambulatorial Contínua (DPAC), modalidade de diálise
peritoneal, chega a alcançar aproximadamente 90% dos pacientes dialíticos,
como é o caso, por exemplo, do México.
4
Apesar dos avanços que o método peritoneal vem apresentando
ao longo do tempo, principalmente após introdução das máquinas
cicladoras, pelos implementos nos sistemas de bolsas de diálise e sistemas
fechados de troca, a sobrevida obtida por tal técnica é baixa, chegando a
50% no período de seis anos.
5
Quando se trata da sobrevida de pacientes,
encontramos dados na literatura que mostram sobrevidas semelhantes para
ambos os métodos - diálise peritoneal e hemodiálise.
6
Para subgrupos de
pacientes jovens, não diabéticos, o método peritoneal parece estar
17
relacionado a uma melhor sobrevida, particularmente nos dois primeiros
anos de tratamento.
5,7
Os principais fatores que limitam a sobrevida pela Diálise
Peritoneal como Terapia Substitutiva Renal são as infecções peritoneais e
as alterações da membrana peritoneal ao longo do tempo de tratamento,
que modificam suas características de permeabilidade e sua capacidade de
ultrafiltração, alterando o método.
8
O aparecimento da lesão da membrana peritoneal está
diretamente relacionado ao tempo de duração do tratamento. Sua incidência
eleva-se de 3% após o primeiro ano em DPAC para 50% após seis anos,
encontrando-se associada ao aumento da mortalidade desses pacientes.
5, 7,8
O desenvolvimento da lesão peritoneal nos pacientes em
programa tem etiologia multifatorial. Os episódios de peritonites repetitivos e
a bioincompatibilidade das soluções de diálise são seus principais fatores
determinantes.
5,7,8
MEMBRANA PERITONEAL
O peritônio é uma membrana serosa que recobre a parede e
órgãos da cavidade abdominal. A área de superfície peritoneal é semelhante
à área de superfície corpórea do adulto, variando de 1 a 2 m
2
.
9
O peritônio visceral corresponde a 80% da área de superfície
peritoneal total. É irrigado pela artéria mesentérica superior, e sua drenagem
venosa é feita para o sistema portal. O peritônio parietal recebe sangue
18
através das artérias lombares, intercostais e epigástricas, drenando pela
veia cava inferior.
9
A membrana peritoneal é constituída pelo mesotélio e pelo
interstício, contendo vasos sanguíneos e linfáticos. O mesotélio é composto
por uma camada única de células achatadas com microvilosidades em sua
superfície. Logo abaixo do mesotélio encontra-se o interstício, constituído
por matriz de colágeno, onde se encontram os vasos linfáticos e capilares
peritoneais.
10
A membrana peritoneal caracteriza-se por ser semipermeável,
possibilitando o transporte de água e pequenos solutos do sangue para a
cavidade peritoneal.
9,10
Está dividida, didaticamente, em seis níveis de
resistência ao transporte peritoneal. São eles :
- uma película de líquido estagnado, que recobre o endotélio capilar
peritoneal ;
- o endotélio capilar ;
- a membrana basal endotelial ;
- o interstício ;
- o mesotélio ;
- uma camada de líquido estagnado, que recobre o mesotélio.
O transporte de água e solutos do interior dos vasos para a
cavidade peritoneal ocorre através de todas essas barreiras fisiológicas e
anatômicas, sendo a principal delas a parede capilar peritoneal.
11
Os capilares contidos na membrana peritoneal são do tipo
contínuo. Nestes últimos, as células endoteliais estão ligadas por junções
19
íntimas (“tight junction”), apresentando vesículas citoplasmáticas que podem
participar no transporte de solutos. Tais vesículas formam, entre si, canais
abertos através do endotélio. A superfície das células endoteliais é recoberta
por um glicocálixe que acarreta eletronegatividade e funciona como uma
barreira fisiológica à passagem de proteínas aniônicas.
12,13
O modelo de três poros explica a característica de ultrafiltração por
diferentes canais na diálise peritoneal.
14
Este modelo assume as dimensões
de poros grandes, pequenos e ultrapequenos. Os poros grandes são
representados por vesículas ou cadeias de vesículas, ou mesmo poros
grandes intercelulares (raio até 250 A), realizando transportes unidirecionais
de moléculas do sangue para o peritônio. Os poros pequenos, com raio de
40 a 50 A, são representados pelas junções intercelulares, permeáveis à
maioria dos solutos pequenos e água. Os poros ultrapequenos, por sua vez,
com raio de 3 A, chamados aquaporinas endoteliais
14
, permitem apenas a
passagem de água.
A aguaporina tipo 1 é a estrutura responsável por parte da
passagem de água através da membrana. Alterações nessa proteína estão
associadas à falha de ultrafiltração na diálise peritoneal.
O transporte através da membrana peritoneal acontece pelo
processo de difusão, ultrafiltração e absorção linfática. No primeiro processo,
os solutos urêmicos e o potássio difundem-se do capilar peritoneal para a
solução de diálise, obedecendo a um gradiente de concentração, enquanto
que glicose, lactato e cálcio difundem-se em direção oposta.
11
No segundo
processo, ultrafiltração, a hiperosmolaridade da solução de diálise leva à
20
passagem de água e solutos através da membrana. No terceiro processo, a
absorção de água e solutos é feita principalmente pelos linfáticos
diafragmáticos.
15,16
Ocorre simultaneamente aos processos de difusão e
ultrafiltração, sendo responsável pela absorção de 1ml/min de líquido da
cavidade em adultos.
17
O grau de vascularização do peritônio, a distribuição dos capilares
e sua proximidade ao mesotélio representam características principais para
se determinar a área de superfície peritoneal efetiva para trocas. Quanto
maior o número de capilares e mais próximos do mesotélio, menor a
distância que água e solutos terão a percorrer até a superfície dos capilares.
Não há uniformidade na distribuição dos capilares no peritônio, sendo
bastante variável em número, inclusive dentro de uma mesma espécie.
18,19
A capacidade de transporte peritoneal pode ser avaliada
utilizando-se relações de equilíbrio de solutos permeáveis entre o dialisato e
o plasma.
As relações medem o efeito combinado dos processos de difusão
e ultrafiltração. Poderá aqui ocorrer influência do peso molecular do soluto
estudado, pela permeabilidade da membrana e pela área de superfície
peritoneal efetiva para trocas.
13,14
Apresentar alta capacidade de transporte peritoneal significa
alcançar mais rapidamente o equilíbrio completo de solutos entre os
compartimentos peritoneal e plasmático. Significa ter um aumento da área
efetiva de troca peritoneal, à custa de aumento do número de pequenos
poros e capilares peritoneais, como observado nos processos inflamatórios.
21
A relação Dialisato/Plasmático de uréia ou creatinina representa tal
processo. Quando se avalia o transporte de glicose através da membrana,
ou seja, o rápido equilíbrio entre compartimentos, é constatada perda de
glicose da solução dialítica para o compartimento plasmático, com
conseqüente perda da força osmótica para ultrafiltração. Uma baixa relação
Dialisato (tempo 2) - Dialisato (inicial) D/D0 de glicose significa perda da
capacidade de ultrafiltração, podendo até mesmo significar aumento da área
de superfície peritoneal efetiva.
14,16
Menor capacidade de transporte representa equilíbrio mais lento
de solutos, significando baixa permeabilidade ou menor área de superfície
peritoneal. Observam-se menores relações de uréia e creatinina e alta
relação de glicose D/D0.
A área de superfície peritoneal reflete a capacidade de transporte
peritoneal. A média da variação dessa superfície intra-individual é de 7%,
medidos pelo MTAC de creatinina em pacientes estáveis em Diálise
Peritoneal Ambulatorial Crônica.
18
A área de superfície peritoneal efetiva pode se apresentar
aumentada em situações tais como: ocorrência de peritonite,
19
administração
intraperitoneal de vasodilatadores (p.ex. nitroprussiato)
20
e na falência de
ultrafiltração tardia em pacientes de DPAC.
10
Na peritonite, ocorre vasodilatação causada pelo aumento de
mediadores inflamatórios locais, como prostaglandinas E2 e interleucinas-6,
21,22
além de aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase
endotelial, isoforma endotelial da enzima que sintetiza óxido nítrico (ON) a
22
partir de seu precursor L-arginina. Em termos moleculares, o ON parece
exercer papel fundamental na reatividade, no tônus vascular e interação com
fatores de crescimento, influenciando na neoangiogênese. Esta condição
representa um processo agudo e parcialmente reversível, após tratamento
da infecção. Também é aguda a vasodilatação provocada pela infusão de
nitroprussiato intraperitoneal.
20
A condição mais importante, com maior
impacto na terapia dialítica, por alterar de forma irreversível a capacidade de
transporte e ultrafiltração da membrana, é a falência tardia de ultrafiltração,
provocada pelo aparecimento da inflamação peritoneal ao longo do
tratamento. Histologicamente, a membrana peritoneal apresenta-se com
aumento do número de capilares, neoangiogênese, duplicação e
espessamento de membrana basal capilar, deposição de colágeno IV e
proliferação de matriz extracelular.
19
A relação direta entre o tempo de
tratamento e o tempo de surgimento das lesões sugere que o principal fator
etiológico envolvido seja a exposição do peritônio às soluções dialíticas
bioincompatíveis com a membrana. A bioincompatibilidade das soluções
dialíticas constitui um dos principais fatores lesivos à membrana.
23, 24
A incompatibilidade das soluções dialíticas é devida ao baixo pH
(5,5); à presença do tampão Lactato; à elevada concentração de glicose
(1500-4250mg/dl); à elevada osmolalidade (334-486 mOsm/L) e aos
produtos de degradação da glicose (aldeídos), gerados a partir da
esterilização a quente dos fluidos. A elevada concentração de glicose parece
ser a causa mais importante de toxicidade para a membrana peritoneal, com
23
deposição de produtos finais de glicosilação ao longo do tempo de
programa.
23,24
INFLAMAÇÃO
A lesão da membrana peritoneal caracteriza-se por ser
inflamatória, com denudação de células mesoteliais, neoangiogênese,
vasodilatação, espessamento de membrana basal, com surgimento de
fibrose intersticial e hialinização da parede vascular.
19
Foi demonstrada,
através de estudos imunohistoquímicos, presença de importantes fatores de
crescimento na membrana, aumento da geração de citocinas, IL-6, VEGF,
21
TGF-b pelas células mesoteliais e macrófagos, Colágeno tipo 4 e CA 125.
22
A glicose hipertônica das soluções de diálise e os produtos
avançados de glicosilação (AGEs), gerados a partir do metabolismo da
glicose, são provavelmente os fatores mais importantes envolvidos na
etiologia da lesão.
25,26
Já foi descrito o acúmulo de produtos avançados da
glicosilação em tecidos peritoneais, especialmente em paredes de capilares.
27
Dados experimentais demonstraram, em modelo de diálise peritoneal,
com duração de quatro semanas, que a glicose é mais tóxica às células
mesoteliais do que o baixo pH, o lactato e a hiperosmolaridade das soluções
de diálise.
28
As lesões histológicas dos capilares peritoneais assemelham-se
às lesões diabetiformes da microangiopatia diabética. Fatores de
crescimento VEGF e TGFb, moléculas importantes na lesão microvascular
24
diabética, foram observados também no efluente peritoneal., com provável
produção local de VEGF.
25,26
Além do mecanismo inflamatório, o desbalanço do sistema
oxidativo tem sido apontado no desenvolvimento de lesões estruturais,
endoteliais e de membrana em pacientes com Insuficiência Renal Crônica e
naqueles em tratamento substitutivo, seja hemodiálise ou diálise peritoneal.
GLICOSE E PROCESSO OXIDATIVO
O processo oxidativo é o resultado do desbalanço entre a geração
de espécies oxidantes e a diminuição da defesa antioxidativa. Implica na
patogênese de várias doenças, incluindo aterosclerose, diabetes,
insuficiência renal, anemia, hemocromatose, injúria da isquemia de
reperfusão, artrite reumatóide e no processo fisiológico do envelhecimento.
29
Evidências sugerem o envolvimento da geração de radicais livres
na fisiopatogenia da lesão inflamatória da membrana peritoneal.
30
Muitas vias são responsáveis pelo aumento do processo oxidativo
e geração de radicais livres: a formação dos AGEs, a peroxidação lipídica,
principalmente da LDL pequena e densa, a atividade poliol alterada e o
desequilíbrio redox.
30,31,32
Radical Livre é toda espécie química que contém um ou mais
elétrons não pareados ocupando orbitais atômicos. São instáveis e reagem a
diversos componentes protéicos e estruturas moleculares.
29
O oxigênio
25
pode dar origem a diversas espécies reativas, chamadas Espécies Reativas
do Oxigênio (EROs), incluindo radicais livres e espécies não radicalares. Na
redução do oxigênio à água, ocorre a formação do radical superóxido (O
2
-),
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radicais hidroxilas.
(-OH), que interagem no sistema redox
27
.
As membranas celulares são compostas de ácidos graxos
poliinsaturados. Suas características físico-quimicas estão relacionadas à
presença de cadeias insaturadas de fosfolipídios e colesterol. As EROs,
reagindo com esses compostos lipídicos, retiram um átomo de hidrogênio do
grupo metileno das cadeias de ácido graxo poliinsaturado e dão início ao
processo de peroxidação lipídica. Os radicais formados reagem com o
oxigênio e formam radicais peroxilas, propagando a cadeia da peroxidação
lipídica. Átomos de hidrogênio são abstraídos, formando hidroperóxidos e
novos radicais de carbono.
29
A reatividade com lipoproteínas circulantes de baixo peso
desencadeia o processo de aterosclerose e a formação de placas nos vasos.
31
Na insuficiência renal, o aumento da peroxidação lipídica parece ser um
dos mecanismos responsáveis pelo elevado índice de complicações
cardiovasculares desse grupo.
32
No diabetes, o processo oxidativo resulta das alterações
metabólicas advindas da hiperglicemia e da glicação não-enzimática de
proteínas, gerando produtos avançados da glicosilação (AGEs).
33
Tais
compostos apresentam atividade redox e interagem com protéicas
plasmáticas e lipídicas, contribuindo para a catalisação da peroxidação
26
lipídica.
30
Este é o mecanismo que ocasiona elevado risco de alterações
ateroscleróticas no diabetes.
No diabetes mellitus, os cofatores da síntese de óxido nítrico
encontram-se reduzidos pelo aumento de seu consumo. Sua via de
recuperação, através da fosfato-pentose, fica bloqueada pela hiperglicemia.
O metabolismo da glicose acontece, em parte, pela via poliol, na
qual a glicose é metabolizada em sorbitol. Tal reação, acoplada à oxidação
de NADPH para NADP+, gera o aparecimento de mais radicais livres.
29, 31,33
Na Diálise Peritoneal Crônica, a exposição da membrana
peritoneal a soluções com elevadas concentrações de glicose e a produtos
de degradação da glicose geram lesões semelhantes às do diabetes.
A glicose das soluções dialíticas aumenta a geração de AGEs
intraperitoneal.
30,33
Parte das alterações inflamatórias e estruturais
relacionadas à ação dos AGEs são mediadas via receptores de AGEs
(RAGE) em membrana mesotelial.
35
Ratos RAGE knock out apresentaram
menor lesão peritoneal quando expostos a uma solução dialítica hipertônica
glicosada, em comparação a controles submetidos à mesma exposição.
36
Foram identificados receptores de superfície para os AGEs que podem ativar
funções inflamatórias nas células endoteliais, musculares lisas e
macrófagos, havendo aumento concomitante do estresse oxidativo de forma
sistêmica.
30, 35
Previamente à infusão intraperitoneal da solução de diálise na
cavidade peritoneal, parte da glicose é transformada em compostos reativos,
aldeídos, metilglioxal, glioxal e 3-glioxiglucosone, ainda durante a
27
esterilização a quente do fluido.
34, 37
O nível de compostos carbonados é
elevado no efluente peritoneal, sugerindo também sua produção
intraperitoneal. Referidos compostos atuam como radicais livres, agindo
sobre a membrana.
38
O aumento da glicose peritoneal de forma crônica acarreta, ainda,
diminuição da disponibilidade de cofatores da síntese de óxido nítrico, como
oxigênio, cálcio, calmodulina e fosfato dinucleotídeo adenina nicotinamida
(NADPH).
29
A glicose hipertônica das soluções parece ser o fator mais
importante na vasodilatação em capilares peritoneais, se comparada ao pH
ácido e à presença de lactato
28
.
ANTIOXIDANTES e N-ACETILCISTEÍNA
O determinante do processo oxidativo é o desbalanço entre a
geração de substâncias reativas oxidantes e a presença das assim
chamadas substâncias antioxidantes, que a ele se contrapõem.
Os antioxidantes podem ser intracelulares (glutationa, superóxido
dismutase, catalase, peroxidases), ou agirem em membrana celular como
betacaroteno, flavonóides e as vitaminas C e E.
29
O antioxidante endógeno mais importante é a glutationa
peroxidase, forma reduzida que, ao reagir com os radicais, forma glutationa
oxidada e água. A glutationa peroxidase atua sobre os peróxidos de lipídeos
e sobre a água oxigenada (H
2
O
2
), reduzindo-os. A degradação da H
2
O
2
origina radical hidroxila (OH
-
), iniciador da peroxidação lipídica. No estresse
28
oxidativo, ocorre redução da atividade do sistema da glutationa –
antioxidante.
29, 31, 32
A N-acetilcisteína (NAC) é um tiol, composto precursor da L-
cisteína e glutationa reduzida nas células.
39
É uma fonte de grupos sulfidril e
removedores de substâncias reativas com o oxigênio (OH-e H
2
O
2
), geradas
pela reação dos peroxinitritos, como NO e superóxidos. A NAC tem
demonstrado efeito protetor na disfunção endotelial e inflamação, no
tratamento pela desintoxicação ao paracetamol e na diminuição da lesão
provocada pelo tempo de isquemia do enxerto e dos níveis de
malondialdeído (MDA) em pacientes renais crônicos.
39
A N-acetilcisteína (NAC) tem sido empregada na proteção renal
em modelos animais de insuficiência renal aguda isquêmica, em estudos da
lesão por contraste iodado, pelo uso de drogas nefrotóxicas e na
insuficiência renal crônica.
40,41,42,43,44
Tem sido demonstrado, em modelos
animais, que o uso da N-acetilcisteína pode estar relacionado ao menor
aparecimento de lesões funcionais e estruturais em membranas peritoneais.
37
Outros agentes com características antioxidantes têm
demonstrado preservação estrutural e funcional da membrana, como
trimetazidine
45
e bloqueadores do receptor de angiotensina II, piridoxamina,
vitaminas C e E.
45,46,47
MARCADORES DO PROCESSO OXIDATIVO
29
Os compostos oxidantes são elementos altamente reativos, tendo
como meia vida apenas alguns segundos. Por este motivo, sua
determinação in vivo não é viável.
48
Contudo, os lipídeos, proteínas, ácidos nucléicos e carboidratos,
após serem oxidados, têm sua meia vida em torno de horas ou semanas,
funcionando como marcadores do processo oxidativo mais estáveis e
mensuráveis, como as espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS).
49
O malondoaldeído é um aldeído de cadeia curta, sendo um dos
compostos medidos pela reação com o ácido tiobarbitúrico. A formação do
malondoaldeído ocorre pela decomposição dos hidroperóxidos lipídios. Sua
concentração tem sido usada para estimar a intensidade da peroxidação
lipídica em sistemas biológicos, em células e tecidos.
49
O processo oxidativo tem sido estudado através da concentração
de várias substâncias marcadoras, tais como: espécies reativas derivadas
do ácido tiobarbitúrico (TBARS), Glutationa Peroxidase (GPx),Glutationa
Total (TG), Glutationa Redutase (GSHRx), Superóxido Dismutase (SOD) ou
associação com metais como selênio, cobre e zinco.
48,49,50
A concentração de TBARS tem sido utilizada como marcador de
oxidação tecidual, seja pela facilidade do método de mensuração, seja pela
boa correlação com o processo de peroxidação. A concentração urinária é o
método de escolha para avaliação em modelos animais.
50
MODELOS EXPERIMENTAIS DE DIÁLISE PERITONEAL
30
Nas últimas duas décadas, o desenvolvimento dos modelos
experimentais em diálise peritoneal possibilitou modificações importantes na
compreensão de mecanismos fisiológicos, no estudo da biocompatibilidade
da membrana e nas intervenções terapêuticas do tratamento de diálise
peritoneal.
Existe uma publicação de modelos experimentais em ratos e
suínos Quinea-piggs que datam de 1975, apresentando método de infusão
intraperitoneal com duração de 48 horas.
51
Somente nas últimas décadas parece ter havido avanços
significantes nos modelos de pesquisa para diálise peritoneal. Um grande
número de publicações foi alcançado em diferentes grupos, principalmente
na Europa, Canadá e Japão, particularmente direcionados ao estudo do
impacto da biocompatibilidade em novas soluções dialíticas e das alterações
morfológicas e funcionais da inflamação.
No Brasil, ainda não existem publicações de modelos
experimentais de diálise peritoneal.
Os modelos atuais apresentam grandes variações em seus
protocolos. Diferentes condições de estudo encontram-se associadas, como
por exemplo: tempo de duração do modelo, espécime estudado, tipos de
acessos peritoneais, variáveis volumes de infusão intraperitoneal, profilaxias
antimicrobianas, diferentes critérios para caracterização de processos
infecciosos e obtenção de amostras peritoneais parietais e viscerais, dentre
outras condições.
31
A maioria dos estudos é realizada em ratos Winstar e Spragle-
Dowley. Existem, igualmente, modelos de diálise peritoneal elaborados em
camundongos, cobaias, cachorros e coelhos.
51, 52
Os camundongos são animais de difícil manipulação, devido a seu
pequeno porte, principalmente para uso de cateteres e punções. Os coelhos
apresentam, como vantagem, longevidade maior que a dos ratos e a razão
da superfície corpórea e área de superfície peritoneal semelhantes à dos
humanos, possibilitando infusão de maior volume intraperitoneal. No entanto,
apresentam a desvantagem de serem animais com difícil adaptação às
condições de criadouro.
50, 53
O mesmo ocorre também em relação aos
suínos e caninos.
Os modelos em ratos mostraram-se inadequados para o estudo
envolvendo icodextrina, como agente osmótico intraperitoneal, devido à
elevada degradação ocorrida pelos altos níveis de amilase intraperitoneal de
sua espécie.
54
Os modelos podem ser caracterizados como não-urêmicos e
urêmicos. Nos modelos urêmicos, os ratos são submetidos a nefrectomia
unilateral e ablação renal a 5/6, previamente ao início do período de
infusões. Sua dificuldade constitui-se na necessidade de sobrevida a longo
prazo. Alguns modelos europeus relatam sobrevida de oito semanas dos
espécimes urêmicos em diálise peritoneal.
55
De forma geral, o tempo de duração dos modelos varia entre
quatro e vinte semanas.
56,58
A duração do experimento correlaciona-se ao
tempo necessário ao aparecimento das lesões peritoneais. O surgimento de
32
neovascularização, infiltrado celular perivascular e denudação mesotelial
tem sido observado precocemente nos modelos com ratos não-urêmicos.
57, 60
Na prática, os modelos de diálise também podem ser classificados
em modelos com sistema peritoneal aberto e fechado. A diferenciação se dá
pelos métodos que expõem ou não o peritônio ao meio externo. Os modelos
abertos utilizam cateteres intraperitoneais tunelizados, para infusão diária de
solução. Nos modelos fechados, a infusão de solução é realizada através de
punções diárias na parede abdominal ou através de cateteres
intraperitoneais tunelizados, com bolsa subcutânea implantada no dorso do
animal, para acesso através de punção, mantendo o sistema fechado. São
chamados Rat-o-Port®.
60-63
O número de infusões intraperitoneais diárias também é variável.
Poucos modelos utilizam duas ou mais infusões ao dia. Em sua maioria,
prevalece uma infusão única, com período médio de duração de 8 a 12
semanas.
58-62
Os modelos que utilizaram duas infusões diárias, em período
de oito semanas, apresentaram resultados semelhantes quando
comparados aos modelos que realizam infusão única diária no período de
dezesseis semanas.
O volume de solução para infusão intraperitoneal, por punção,
varia entre 10, 20 e 25 ml.
60
Em ratos com peso até 350 g., a área de superfície peritoneal é,
em média, de 600cm
2
.
55
Neste caso, o volume de infusão calculado para o
rato é de até 70-100ml. Para que não haja interferência no desempenho
33
respiratório do animal, o volume tolerável situa-se entre 30 - 40 ml. Sabe-se
ainda que grandes infusões são responsáveis pelo aparecimento de lesões
mesoteliais agudas. O volume para infusão adotado na maioria dos
protocolos varia entre 10 e 20 ml, ou 3ml/100g.
Os modelos que realizam punção peritoneal utilizam agulhas de
22 a 26 gauge. Essa técnica apresenta a desvantagem de não permitir
acesso à coleta do líquido efluente, sem abertura cirúrgica da cavidade
peritoneal, pois todo o volume infundido é absorvido pela cavidade. A
punção peritoneal diária é realizada sob anestesia, na tentativa de evitar
punção acidental de alças, bexiga, vísceras abdominais e hematomas de
parede, propiciando infecções peritoneais indesejáveis para o estudo. O uso
local de anestésico parece influenciar a permeabilidade peritoneal quando
avaliado através do clearance de uréia e inulina in vitro.
65
Os cateteres intraperitoneais experimentais surgiram com três
diferentes intuitos: diminuir as complicações secundárias às punções
peritoneais, obter acesso aos líquidos efluentes e facilitar os processos de
infusão. São implantados previamente ao início das infusões, com intervalo
de uma semana para sua utilização, e mantidos sob instilação diária de
solução fisiológica, para evitar a obstrução, enquanto é aguardada uma
cicatrização no implante peritoneal. O implante do catéter peritoneal por si só
induz alterações mesoteliais inflamatórias, que podem durar até um mês.
57,58
Modelos abertos com cateteres peritoneais apresentam, em média, duração
de 20 semanas. Como freqüente complicação, observa-se a obstrução do
34
acesso pelo omento, fibrinas ou infecções peritoneais. O aparecimento das
complicações é proporcional ao tempo de duração do modelo.
66,67
As principais complicações referentes ao uso de cateteres são a
obstrução e tamponamento pelo omento, impedindo seu funcionamento
adequado. Alguns pesquisadores fazem omentectomia previamente às
infusões, associando heparina ao preenchimento do lúmem do cateter.
68,69
A ocorrência de peritonite é uma grave complicação associada aos
modelos. A peritonite induz o aparecimento de lesões na membrana
peritoneal, semelhantes às estudadas nos processos inflamatórios crônicos,
inviabilizando sua diferenciação histológica e funcional na membrana e
comprometendo a interpretação dos resultados. A peritonite altera o
transporte de solutos, através do aparecimento de capilares na membrana,
proporcionando vasodilatação. Conseqüentemente, ocorre aumento do
número de poros pequenos e ultrapequenos, gerando aumento do transporte
de soluto e água através da membrana.
69
O diagnóstico de peritonite é
realizado através da identificação de microorganismos na cultura do líquido
peritoneal e aumento de contagem celular, com predomínio
polimorfonuclear.
69,70
A celularidade peritoneal dos ratos é mais elevada que a do
homem. Os modelos estudados têm demonstrado níveis celulares tão
elevados quanto 3500 células/mm3, sem ocorrência associada de infecção.
57, 58
Não há critério estabelecido experimentalmente, ou adotado
unanimemente, para determinação da celularidade peritoneal normal para os
ratos. Grande parte dos trabalhos adota a contagem celular ideal no rato
35
como menor que 1000células/mm3.
54,57,59,60
Faltam, contudo, dados que
comprovem este parâmetro. Alguns fatores modificam a contagem celular do
líquido peritoneal, como, por exemplo, a quantidade de líquido infundido, o
tempo de permanência da solução na cavidade intraperitoneal e associação
com trauma mecânico, como cateteres e punções.
57,59
A associação de antibióticos de forma profilática aos modelos
diminuiu a incidência de peritonite. São usadas comumente associações
antibióticas via intraperitoneal: cefazolina, gentamicina, oxacilina e
vancomicina, fracionadas de acordo com o peso do animal. Não se
evidenciou qualquer alteração peritoneal decorrente do uso desses
antibióticos.
57,68,68, 70
Novos marcadores de infecção estão surgindo como critério para
identificação de peritonite, como a albumina e alfa-2-macroglobulina.
71
A amostra peritoneal a ser obtida para avaliação histológica
também constitui assunto controverso no estudo dos modelos animais. A
avaliação do peritôneo parietal e visceral em humanos submetidos à diálise
peritoneal mostra que o peritôneo parietal expressa alterações inflamatórias
de forma mais pronunciada. Portanto, torna-se preferível para biópsias e
análises. Nos modelos animais, principalmente em ratos, não se pode fazer
a mesma afirmativa. No peritôneo visceral, a avaliação histológica pode
diferenciar, apresentando diferentes graus de lesões na dependência do
segmento do tubo intestinal a ser avaliado.
59-61, 62
Pode-se afirmar a necessidade urgente de se estabelecer
consensos entre os diferentes modelos de diálise peritoneal disponíveis.
36
Infelizmente, o número de questões ainda é grande. A reprodutibilidade da
lesão funcional e histopatológica da membrana peritoneal necessita de
substratos clínicos comparativos nos quais se apóie a pesquisa de terapias
racionais.
Esse estudo pretende avaliar o processo oxidativo causado pelo
uso de soluções hipertônicas dialíticas peritoneais através da dosagem das
espécies reativas do ácido tiobarbitúrico urinário, além de avaliar o possível
papel protetor da N-acetilcisteína na lesão da membrana peritoneal em um
modelo experimental de infusão peritoneal de solução de diálise peritoneal
em ratos, em período com duração de oito semanas.
37
OBJETIVOS
OBJETIVOS PRINCIPAIS
Avaliar o efeito da N-acetilcisteína como agente protetor
antioxidante sobre as alterações do padrão de transporte peritoneal de
solutos e alterações histopatológicas da membrana peritoneal de ratos,
submetidos à infusão intraperitoneal diária, de solução de diálise hipertônica,
no período de oito semanas.
OBJETIVOS SECUNDÁRIOS
Desenvolver, em nosso meio, um modelo experimental em ratos
Wistar, para o estudo das alterações da membrana peritoneal na situação de
diálise peritoneal.
38
2 MATERIAL E MÉTODO
ESTUDO
Estudo prospectivo, aleatorizado, em ratos Wistar, com duração
de 6 semanas, implantado no Laboratório de Investigação Médica - LIM 12,
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, no período de
fevereiro de 2004 a fevereiro de 2007.
Este estudo foi analisado e aprovado pela Comissão de Ética em
Pesquisa em Animais - Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo.
ANIMAIS
Foram estudados 22 ratos Wistar, machos, cedidos pela
Diretoria Técnica de Apoio ao Ensino e Pesquisa da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo. Os espécimes pesavam, inicialmente, entre
250-300g. Não eram urêmicos e foram mantidos em gaioleiro. Receberam
dieta basal padronizada do LIM-12, em temperatura ambiente, com total
liberdade de acesso ao bebedouro. Para o presente estudo, os animais
foram divididos em quatro grupos.
39
GRUPOS DE ESTUDO
Grupo1 (Controle - CONT): 4 ratos – grupo-controle, não submetido à
infusão intraperitoneal.
Grupo 2 (Ringer Lactato - RL): 4 ratos - receberam infusão diária de solução
Ringer Lactato (Anexo 2) - 30ml/Kg.
Grupo 3 (Solução de Diálise Hipertônica - SDH): 7 ratos - receberam infusão
diária de solução hipertônica 3,86% (Anexo 3) - 30ml/Kg.
Grupo 4 (N-Acetilcisteína - SDH+NAC): 7 ratos - receberam infusão diária
de solução de diálise hipertônica 3,86% - 30ml/Kg + N-acetilcisteína
(600mg/L) na água que bebiam.
CRONOGRAMA DE SEIS SEMANAS DE ESTUDO
Foi realizada pesagem diária dos quatro grupos. A solução a ser
infundida, ringer lactato (ou solução dialítica hipertônica a 3,38%) foi
aquecida a 37Cº em banho-maria, acrescida de antibiótico e fracionada de
acordo com o peso do animal.
Após anestesia do animal e assepsia abdominal, foi realizada,
uma vez ao dia, a punção da cavidade peritoneal, no quadrante inferior
direito. No tempo de seis semanas de infusão diária, foi obedecido intervalo
de 48 horas após a última punção, e realizada coleta de urina 24h. em
gaioleiro metabólico. Após a coleta de urina 24h., foi realizado teste
40
funcional da membrana peritoneal. Foi aplicada anestesia para coleta de
amostras do líquido peritoneal, via laparotomia. Foram colhidas amostras de
sangue, por punção cardíaca, e biópsia do peritôneo parietal a céu aberto. O
animal foi, então, sacrificado com anestésico em excesso.
41
Quadro 1 - Diagrama de Trabalho.
6semanas
48hs ao término
de 6 semanas
Peso diário (g)
SDP 3,38%, a 37C - 30ml/Kg - 26g
ATB Æ Assepsia
Anestesia Æ Punção QID
INFUSÃO
PERITONEAL
DIÁRIA
URINA 24HS
AVALIAÇÃO FUNCIONAL
Gaioleiro metabólico - urina 24h
TBARS- ensaios
com ácido
tiobarbitúrico
Incisão:Citológico / Cultura
Punção Cardíaca
Bx Peritoneal
Sacrifício
+
+
INFUSÃO PERITONEAL DE SOLUÇÃO HIPERTÔNICA.
A infusão diária de solução dialítica (ou ringer lactato a 30mL/Kg, a
37
o
C) era realizada por punção peritoneal com agulha 26 gauge, uma vez ao
dia, sob anestesia, na parede abdominal inferior direita, após tricotomia local
e assepsia com degermante clorexidine 2% . A pesquisadora sempre tomou
o cuidado de fazer uso de máscara facial, além de ter se precavido com
lavagem das mãos e troca de todo o material estéril em cada punção
efetuada. À solução peritoneal infundida foram acrescentadas, diariamente,
gentamicina 0,04mg/d e oxacilina 2,5mg/d de forma profilática. O mesmo
não ocorreu, entretanto, em duas ocasiões: no dia da realização do teste
funcional e no momento da coleta das amostras para análise laboratoriais,
conforme protocolo.
42
GAIOLEIRO METABÓLICO
A coleta de urina 24h. teve como finalidade a dosagem de
substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico - TBARS urinário -, utilizado
como marcador do processo oxidativo no estudo.
Os animais foram levados ao gaioleiro metabólico individualizado,
com livre acesso ao bebedouro provido de água, e estando eles com
cavidade abdominal vazia. Portanto, sem infusão intraperitoneal de líquido
por 24h.
TESTE FUNCIONAL DA MEMBRANA
A avaliação funcional da membrana peritoneal foi realizada por
meio do estudo do transporte peritoneal de uréia e glicose. A relação da
uréia estudada ateve-se à sua concentração no líquido peritoneal após uma
hora de permanência da solução de diálise hipertônica a 2,27% na cavidade
(D Uréia) e à sua concentração plasmática (P Uréia) na mesma hora. Isso
está expresso na relação D/P Uréia. A D/P de Uréia aumentada significa
maior transporte peritoneal, refletindo um rápido equilíbrio difusional entre
soluções e solutos, e maior lesão de membrana.
A relação de glicose estudada foi realizada através de sua
concentração no tempo zero, ou seja, concentração da glicose na solução
de diálise peritoneal a 2,27% e a concentração de glicose no líquido
peritoneal após uma hora de permanência na cavidade. Isso está expresso
43
na relação D1/D0. A diminuição da relação D1/D0 correlaciona-se a um
decaimento maior da concentração de glicose na cavidade peritoneal, com
dissipação maior do gradiente osmótico e menor ultrafiltração, refletindo uma
membrana peritoneal inflamada e hipervascularizada, com maior número de
poros pequenos. A avaliação da relação da uréia, como marcador funcional
da membrana peritoneal, é preferível à creatinina em ratos não-urêmicos. O
baixo valor da creatinina dosada nesses animais e a interferência
metodológica da glicose podem ocasionar erros de mensuração. Da mesma
forma, não seria apropriado aumentar o tempo de permanência da solução
na cavidade peritoneal (superior a 1 hora), pois, no rato Wistar, em
particular, ao término de 2 horas, a concentração da uréia na solução
dialítica encontra-se praticamente em equilíbrio com a concentração
plasmática.
Não foi realizada medida de ultrafiltração por não ser possível
realizá-la com o emprego de métodos peritoneais de acesso fechado.
BIÓPSIA PERITONEAL
Foi aberta a cavidade peritoneal na linha mediana, e realizada
biópsia do peritônio parietal esquerdo, a mais ou menos 2 cm.,
contralateralmente ao local das punções diárias.
As amostras peritoneais foram imersas em formalina a 10% e
encaminhadas ao Hospital São Joaquim, da Real e Benemérita Sociedade
Portuguesa de Beneficência, São Paulo. Foi avaliada a espessura da
44
membrana peritoneal parietal medida em micrômetros em avaliação óptica e
calculadas as médias das mensurações em cada grupo.
O processamento do material para exame histológico foi realizado
no Laboratório de Patologia do Hospital São Joaquim (CIP - Centro
Integrado de Patologia). O tecido obtido foi fixado em solução de formalina a
10%, por um período mínimo de 24 horas. Para o exame de microscopia
óptica, após a fixação dos fragmentos, estes foram desidratados,
diafanizados, embebidos em parafina e cortados na espessura de 2 a 3
micra. Os cortes foram corados por hematoxilina-eosina e tricrômico de
Masson.
A documentação fotográfica foi realizada no Departamento de
Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo, através de equipamento digital Zeiss, modelo
AXIOSKOP 40, acoplado à câmera digital Sony Cyber Shot, 3,3 mega pixel.
Utilizando-se o programa Carl Zeiss Vision Imaging Systems - Axio Vision
3.0, através de documentação fotográfica, foram analisadas imagens das
lâminas peritoneais capturadas ao acaso, em quatro campos (conforme
fotos), sendo três em preparados histológicos corados pela Hematoxilina &
Eosina, e um corado pelo tricrômico de Masson. Em cada foto foram
realizadas três medições, em locais aleatórios. No total, foram obtidas 12
medidas de espessura peritoneal para cada amostra de cada espécime.
Foram avaliadas a média das 12 medidas obtidas para cada espécime, e
também a média de cada grupo.
45
TESTES LABORATORIAIS
DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS COM ÁCIDO
TIOBARBITÚRICO (TBARS)
As concentrações urinárias de TBARS foram determinadas
utilizando-se o método colorimétrico do ácido tiobarbitúrico. As amostras de
urina foram diluídas em água destilada, onde foi adicionado 1 ml. de ácido
tricloroacético (TCA) a 17.5%. Em seguida, foi agregado 1 ml. de ácido
tiobarbitúrico a 0,6%, pH 2. As amostras foram colocadas em banho de água
fervente por 15 minutos, e resfriadas a seguir. Após isso, foi adicionado a
esta mistura 1 ml. de TCA a 70%, com incubação por 20 minutos. As
amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 2000 RPM, e a densidade
óptica do sobrenadante lida em espectrofotômetro com comprimento de
onda de 543 nm, contra reagente branco. A concentração dos produtos da
peroxidação lipídica foi calculada pelo coeficiente de extinção molar
equivalente para malondialdeído (MDA-equivalente), de 1,56x105 M–1 cm–1
(utilizado para o complexo malondialdeído e ácido tiobarbitúrico). Os níveis
de TBARS urinário foram expressos em nanomoles/24h. A medida da
concentração do TBARS plasmático seguiu a mesma metodologia aplicada à
dosagem urinária, expressa em nanomoles/ml.
46
DOSAGEM DE URÉIA E GLICOSE
As dosagens de uréia e glicose, sanguíneas e peritoneais, foram
realizadas por espectrofotometria, através do Kit Labtest. (LIM-12 / FM-
USP).
CITOLOGIA E CULTURA DA AMOSTRA DA SOLUÇÃO DE DIÁLISE
A avaliação do líquido peritoneal foi realizada no Laboratório
Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo, com a finalidade de avaliar a ocorrência de infecção
desenvolvida no período das infusões.
Foi realizada citologia quantitativa e diferencial de cada amostra,
assim como cultura para bactérias, com identificação de espécies, quando
possível.
Não foram realizados antibiogramas nas amostras com
crescimento positivo ou análise quantitativa do crescimento bacteriano.
SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS
Após a finalização dos experimentos propostos, os animais foram
sacrificados com injeção endovenosa de anestésico em excesso -
pentobarbital sódico.
47
ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
Os dados foram analisados utilizando-se análise de variância –
ANOVA e pós-teste Newman-Keuls multiple comparison pelo programa de
estatística GRAPHPAD (versão 3.0). Os resultados foram apresentados com
média ± desvio padrão, sendo considerado significante p < 0.05.
48
3 RESULTADOS
Grupos de animais-controle (CONT), ringer lactato (RL), solução hipertônica
dialítica (SHD) e solução hipertônica dialítica +
N-acetilcisteína (SHD+NAC) avaliados após seis semanas de tratamento:
PESO CORPÓREO:
A TABELA 1 mostra as médias (± DP) do ganho de peso
corpóreo (diferença entre peso final e inicial), expressas em gramas,
semelhantes entre os grupos (p=0,2).
A média do peso inicial dos grupos foi de 240,75 g., e do peso
final foi de 348,39 g., para espécimes da mesma idade.
Tabela 1 - Média do peso inicial, final e ganho de peso dos grupos
GRUPOS PESO INICIAL (g) PESO FINAL (g) ∆ PESO (g) *
CONT
248,2 340,7
92,5±10,8
RL
243,7 347
103±13,1
SDH
238 349,8
111,8±7,3
SDH+NAC
233 356
120,3±8,5
MÉDIA
240,7 348,3 107,6
CONT: grupo-controle; RL: grupo ringer lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica;
SDH+NAC:solução de diálise hipertônica tratado com N-acetilcisteína; g: gramas. *p =
0,2.Os resultados estão expressos em média ± DP. One way ANOVA post test Newman-
Keuls.
No grupo tratado – Grupo SDH + NAC -, a ingestão de
49
N-acetilcisteína via oral, através da água de beber, variou entre 14,0 ± 0.8 e
16,3 ± 0,2 mg/100gKg/dia; p value 0,2. Não houve, portanto, diferença na
dose de tratamento oferecida aos espécimes do mesmo grupo tratado.
AVALIAÇÃO FUNCIONAL DA MEMBRANA PERITONEAL
A avaliação funcional foi estudada pela relação de uréia e glicose
em uma hora de permanência da solução dialítica na cavidade peritoneal.
Foi observada diferença significante da relação D/P uréia entre os
grupos (p<0,03)
O grupo CONT apresentou menor D/P de uréia quando
comparado aos demais. Houve diferença significante quando comparado ao
grupo SDH (p<0,03).
Entre os grupos SDH + NAC (grupo tratado) e SDH (não tratado)
houve diferença estatisticamente significante, com menor D/P de uréia do
grupo tratado, demonstrando menor lesão funcional de membrana e
resposta ao tratamento empregado no grupo (Gráfico 1).
O grupo RL, apesar de tender a apresentar maior transporte do
que o controle, não diferiu estatisticamente do mesmo.
A avaliação da relação D1/D0 foi diferente entre os grupos (p<0,01)
(Gráfico 2).
O grupo CONT mostrou maior relação quando comparado ao grupo
SDH (p<0,01). O grupo tratado - SDH+NAC -, apresentou maior relação em
50
comparação ao grupo não tratado, SDH, indicando menor alteração funcional de
membrana no grupo tratado.
Gráfico 1 - Resultados D/P uréia dos grupos
CONT: grupo-controle; RL: grupo ringer lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica;
SDH+NAC:solução de diálise hipertônica tratado com N-acetilcisteína; g: gramas One way
ANOVA post test Newman-Keuls *p = 0,03
Gráfico 2 - Resultados D1/D0 dos grupos
CONT: grupo-controle; RL: grupo ringer lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica;
SDH+NAC:solução de diálise hipertônica tratado com N-acetilcisteína; g: gramas Os
resultados estão expressos em média One way ANOVA post test Newman-Keuls *p = 0,01
*p = 0,03
*p = 0,01
51
A avaliação celular do líquido peritoneal foi feita através de
contagem total de células nucleadas e percentuais neutrofílicos realizados
na amostragem dos quatro grupos. Não foram apresentadas diferenças
entre eles. Foram observadas contagem celular mínima de 900
células/mm3 e máxima de 2800 células/mm3. Na tabela 2, é possível notar
que, com exceção de alguns ratos RL, a maioria deles apresentou
percentual de neutrófilos menor que 50%.
Tabela 2 - D/P uréia, D1/D0 e avaliação citológica do líquido peritoneal
CONT
(1)
RL
(2)
SDH
(3)
SDH+NAC
(4)
p<
D/P Uréia
0,46±0,05 0,53±0,1 0,67±0,1 0,51±0,1
0,03
(1vs3, 3vs4)
D1/D0
0,44±0,08 0,4±0,04 0,27±0,07 0,35±0,06
0,01
(1vs3, 1vs4,
2vs3, 3vs4)
Contagem
Leucocitária
(mm
3
)
1.350±173 1.425±917 1.867±680 1.929±573
ns
Neutrófilos
(%)
25±13 41,5±7 27,67±20 12,57±12
0,04
(2vs4)
CONT: grupo-controle; RL: grupo ringer lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica;
SDH+NAC:solução de diálise hipertônica e tratado com N-acetilcisteína;D/P: relação
dialisato e plasmática do soluto; G1/G0:relação glicose no dialisato no tempo 1 e inicial;g:
gramas Os resultados estão expressos em média ± DP. One way ANOVA post test
Newman-Keuls
A contagem celular média entre os espécimes que obtiveram
resultado de cultura positiva é de 1.767 células/mm3. Os resultados foram:
contagem mínima de 1200 células/mm3 e máxima de 2200 células /mm3.
52
Entre os espécimes com resultados de cultura negativos, a média
da contagem foi de 1680 células/mm3, com contagem mínima de 900
células/mm3 e máxima de 2800 células/mm3. Não houve diferença no
estudo comparativo entre o grupo com cultura positiva e aquele com cultura
negativa (t test, p =0.11).
Pelos critérios de exclusão adotados, não houve saída por
peritonite em nenhum dos grupos. Não foi encontrada conjugação de dois
dos três critérios em um mesmo espécime, caracterizando a ocorrência de
peritonite em ratos Wistar.
De forma isolada, foi encontrado um total de seis culturas
positivas do líquido em cada um dos seis espécimes entre os grupos,
representando 28% da amostragem total. Isoladamente, o critério de
contagem celular acima de 2500 células/mm3 foi observado em 14% da
amostragem total (três espécimes).
Avaliando os dois critérios de maneira conjugada (contagem
celular elevada e cultura positiva), é possível constatar que não houve
correlação a ser realizada ao término do estudo. A explicação seria uma
possível característica da espécie, e não uma infecção que tivesse
influenciado o aumento da celularidade do líquido peritoneal.
O crescimento positivo de bactérias no líquido peritoneal mostrou
predominância entre os Gram positivos do tipo Streptococcus de variadas
espécies. Houve crescimento de Gram negativos em menor número, e
nenhum anaeróbio.
53
Houve a ocorrência de mortalidade de um espécime do grupo
SDH (ou seja, 4,5%), por meio de excesso de anestésico.
SUBSTÂNCIAS REATIVAS COM ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)
URINÁRIO (NMOLES/24H) E PLASMÁTICO (NMOLS/ML)
A avaliação do processo oxidativo entre os quatro grupos foi
realizada através da dosagem de TBARS Urinário e Plasmático.
Foi observada diferença da excreção de TBARS Urinário, TBARS
(U) entre os quatro grupos, sendo p value <0,002. (Gráfico 3).
O grupo CONT, comparado ao SDH, apresentou menor valor. Foi
menor ainda em relação ao grupo RL, que, por sua vez, entre os quatro
grupos estudados, foi o que mostrou maior elevação de TBARS (U).
O grupo tratado SDH+NAC mostrou menor TBARS (U) em
comparação ao grupo RL. Em relação ao grupo SDH, não apresentou
diferença estatística.
A avaliação plasmática dos TBARS, TBARS(P) mostrou-se
significante entre os grupos, sendo p< 0,0001 (Gráfico 4).
Foi observada menor concentração de TBARS (P) do grupo
CONT em relação ao grupo SDH, assim como aos demais. O grupo tratado
- SDH+NAC -, também apresentou menor valor TBARS(P) quando
comparado ao GLIC e RL.
54
A análise do TBARS plasmático correlacionou-se à análise
urinária, em que o grupo não tratado, comparado ao tratado, obteve
resultados mais elevados dos valores encontrados, com aumento da
concentração, sugerindo a ocorrência de maior evento oxidativo.
Tabela 3 - TBARS urinário e plasmático dos grupos
CONT
(1)
RL
(2)
SDH
(3)
SDH+NAC
(4)
p <
TBARS U
(nmols/24h)
57,7±9,5 231.3±61 160,1±8,5 107,6±10,8
0,002 (1vs2, 2vs4)
0,05(1vs3)
TBARS P
(nmols/ml)
3,77±0,19 5,12±0,5 5,5±0,4 4,0±0,3
0,0001 (1vs3)
0,001 (1vs2, 3vs4)
PESO (g)
92,5±10,8 103±13,11 111,8±7,3 122,3±8,5
ns
CONT: grupo-controle; RL: grupo ringer lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica;
SDH+NAC:solução de diálise hipertônica tratado com N-acetilcisteína; g: gramas Os
resultados estão expressos em média One way ANOVA post test Newman-Keuls*
Gráfico 3 - Resultados de TBARS urinário dos grupos
TBARS: espécies reagentes ao ácido tiobarbitúrico CONT: grupo-controle; RL: grupo ringer
lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica; SDH+NAC:solução de diálise hipertônica
e tratado com N-acetilcisteína. Os resultados estão expressos em média One way ANOVA
post test Newman-Keuls *p = 0,002
*p=0,002
55
Gráfico 4 - Resultados do TBARS plasmático dos grupos
TBARS: espécies reagentes ao ácido tiobarbitúrico. CONT: grupo-controle; RL: grupo ringer
lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica; SDH+NAC:solução de diálise hipertônica
e tratado com N-acetilcisteína. Os resultados estão expressos em média One way ANOVA
post test Newman-Keuls p = 0,001
HISTOLOGIA PERITONEAL:
A avaliação da membrana peritoneal mostra, através da medida
de sua espessura, que a diferença entre os grupos é significativa e
importante. Com uma análise feita através da média obtida em 12
medidas de segmentos diferentes de cada amostra peritoneal, o grupo-
controle obteve uma média de 7,7 µm, no RL 7,4µm, no SDH 9,7µm e no
SDH+NAC 7,6µm. Quando comparado o grupo-controle aos grupos que
receberam infusão peritoneal, o grupo SDH apresentou-se de forma distinta
(p=0,01). Na avaliação entre grupos tratados com NAC, SDH+NAC, e o
grupo não tratado – SDH -, também foi encontrada diferença (p=0,01). Ficou
*p=0,001
56
demonstrada a ação protetora do tratamento sob a estrutura peritoneal
parietal.
Gráfico 5 - Resultados da medida de espessamento peritoneal dos grupos
MEMBRANA PERITONEAL
CONT RL SDP NAC
0
5
10
15
um
pvalue = 0.01 pvalue = 0.01
CONT: grupo-controle; RL: grupo ringer lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica;
SDH+NAC:solução de diálise hipertônica e tratado com N-acetilcisteína. Os resultados
estão expressos em média One way ANOVA post test Newman-Keuls**p value = 0,01
Figura 1 - Medidas da espessura parietal nos quatro grupos.
SDP
CONT RL
SDP+NAC
57
Microscopia óptica da membrana peritoneal nos quatro grupos, corados em hematoxilina
eosina e com medidas expressas em micrômetros (µm). CONT: grupo-controle; RL: grupo
ringer lactato; SDH:grupo solução de diálise hipertônica; SDH+NAC:solução de diálise
hipertônica e tratado com N-acetilcisteína.
4 DISCUSSÃO
O presente estudo sugere que o uso contínuo de solução de
diálise glicosada hipertônica a 3,86 % seja um dos fatores responsáveis pela
falha funcional da membrana peritoneal, estando associada a um grave
processo inflamatório oxidativo. Sugere, também, que o uso contínuo de N-
acetilcisteína, agente antioxidante, pode atenuar o processo.
A lesão inflamatória peritoneal, resultante de fatores agressivos da
solução de diálise hipertônica, já foi demonstrada em modelos de diálise
peritoneal experimental, em diferentes espécimes e diferentes protocolos.
Utilizando-se soluções hipertônicas glicosadas,
14,19
novas soluções dialíticas
biocompatíveis,
72
tais como icodextrina
54
e soluções não glicosadas,
58-60
foi
possível reproduzir a lesão inflamatória na membrana em estudos
experimentais na situação de diálise peritoneal, à semelhança da lesão
clínica presente nos tratamentos crônicos. É sabido que o ringer lactato é
também lesivo à membrana peritoneal, assim como o é, e já foi demonstrada
experimentalmente, a infusão de solução fisiológica e de novas soluções
dialíticas.
73
Fica, portanto, reforçada a afirmação de que a glicose não é
exclusivamente o único fator responsável pela inflamação da membrana.
A duração de seis semanas do estudo foi suficiente para o
aparecimento de alguns tipos de alterações na membrana peritoneal, tais
58
como de natureza funcional, de marcadores biológicos do processo
oxidativo e, finalmente, histológicas.
60-64,73,74,75
Já foi observado, em outros
estudos, o tempo precoce das alterações de transporte e histológicas
peritoneais. Há protocolos de curta duração - quatro semanas,
74
por
exemplo -, em modelos crônicos com SDH, utilizando igual volume e número
de infusões diárias. Sabe-se que, de forma precoce, estão presentes as
alterações de transporte de solutos, o evidente aumento da celularidade do
efluente peritoneal, o aumento nas concentrações de marcadores
inflamatórios e a duplicação de membrana basal, assim como o
aparecimento de um número maior de capilares, a neoangiogênese.
55, 57, 59
A avaliação funcional realizada através do transporte de uréia e
glicose mostrou que os animais expostos à infusão peritoneal de solução
hipertônica glicosada apresentaram maiores alterações funcionais da
membrana - avaliadas na relação G1/G0 menor e D/P Uréia maior – em
comparação aos animais-controle e àqueles que fizeram infusão de ringer
lactato. A avaliação funcional da membrana peritoneal em modelos animais
tem sido discutida em diferentes espécimes, sobretudo em ratos e coelhos.
O transporte de solutos através da membrana peritoneal, em modelos, é
avaliado através do equilíbrio da concentração de pequenos solutos entre
compartimentos até a determinação de seu equilíbrio. Em ratos, sabe-se que
o equilíbrio de uréia é alcançado no prazo de duas horas de permanência da
solução na cavidade, obtendo-se equilíbrio plasmático e peritoneal. No
entanto, não se podem comparar processos ou quantificá-los, à semelhança
dos processos de difusão, convecção ou ultrafiltração dos modelos clínicos,
59
avaliados pelo Teste de Equilíbrio Peritoneal (PET), através do transporte de
creatinina. Nos modelos animais, a avaliação funcional em membrana tem
sido realizada através de suas principais formas, quais sejam: pela avaliação
de equilíbrio de pequenos solutos entre compartimentos demonstrados no
presente estudo e pelo Standard Peritoneal Permeability Analysis in Rabbits
(SPAR),
76
ou do Standard Peritoneal Permeability Analysis in Rats
(SPART).
62, 63
Consistem em testes funcionais onde, além do equilíbrio de
solutos, acrescenta-se à análise a avaliação de fluidos e ultrafiltração. Neste
caso, um implante prévio de cateteres intraperitoneais para infusão e
drenagem é requerido.
Os animais que foram tratados com NAC apresentaram aparente
proteção, preservando relação D/P uréia menor e D1/D0 maior, comparados
aos do grupo não tratado.
A ação dos agentes antioxidantes, sob a permeabilidade da
membrana peritoneal a pequenos solutos, vem sendo demonstrada em
modelos experimentais. A ação da N-acetilcisteína na membrana peritoneal
parece estar relacionada à diminuição do estímulo formador de
neovascularização e aumento capilar peritoneal. Com o mesmo efeito, já
foram demonstradas as ações da trimetazidine, piridoxamina e enalapril.
43,
44, 45,46
A avaliação do processo oxidativo, no presente estudo, pela
geração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico em urina e plasma,
mostra, de forma concludente, que existe um grande desbalanço do
processo oxidativo nos espécimes submetidos à infusão peritoneal, seja com
60
soluções glicosadas, seja com soluções ringer lactato. Estudos em modelos
peritoneais demonstram boa correlação deste marcador com o processo
inflamatório, evidenciado, na análise óptica da membrana peritoneal e na
marcação de mediadores inflamatórios, pela imunohistoquímica.
43, 44, 45,46
A avaliação do processo oxidativo, seja em humanos (através de
estudo clínico ou experimental), seja in vitro, é feita através da quantificação
de marcadores pró e antioxidantes, visto que se trata da avaliação de um
sistema em desequilíbrio. Nos modelos em ratos, a avaliação do processo
oxidativo comumente tem sido realizada pelo estudo comparativo, entre
concentrações de TBARS em meios urinários e plasmáticos.
43, 44, 45,46
A
avaliação em fluido peritoneal, contudo, não tem sido demonstrada.
No presente estudo, quando avaliado o aumento da dosagem
plasmática de TBARS, evidencia-se que a N-acetilcisteína diminui
significativamente sua concentração plasmática no grupo tratado,
protegendo-o. O grupo não tratado apresenta concentrações mais elevadas
de TBARS plasmático, tanto pela exposição ao RL, quanto pela exposição à
glicose hipertônica.
A contagem celular normal no líquido peritoneal e a contagem a
ser relacionada à presença de processo infeccioso inflamatório não está
definida para os modelos experimentais. de diálise peritoneal. No presente
estudo, a contagem celular observada nos quatro grupos apresentou médias
inferiores a 2000células/mm3, incluindo espécimes com cultura positiva.
Espécimes com cultura positiva ou negativa não apresentaram significância
estatística, quando avaliados separadamente. Não foi encontrada diferença
61
quanto à celularidade ou percentual de neutrófilos, não podendo ser
evidenciada a distinção entre contaminação das amostras positivas e
ocorrência de peritonites.
O diagnóstico de peritonite apresenta grande variabilidade quanto
ao limite superior da contagem celular do líquido peritoneal 856 células/mm3
a 2500 células/mm3 entre os vários estudos.
56,57,58
A celularidade peritoneal
descrita pode variar, dependendo de muitos fatores. Entre eles, o volume
infundido, o tempo de permanência na cavidade, o tamanho da amostra de
líquido adotada para contagem, o trauma relacionado a implante de
cateteres ou punções peritoneais.
57
Tem sido demonstrado aumento celular
com duração de até oito dias após implante de catéter peritoneal, com
celularidade do líquido tão elevada quanto 3500 células/mm3, sem
crescimento bacteriano associado.
57
Portanto, qualquer critério adotado
para limites de contagem celular deverá ainda ser considerado. Constituirá
uma escolha arbitrária do pesquisador, necessitando de estudos que
consolidem novos parâmetros a serem adotados.
A avaliação histológica peritoneal demonstra, de forma clara, a
diferença entre os grupos. Principalmente, a ação lesiva da SDH sobre a
membrana peritoneal parietal. O aumento de espessura é importante. Da
mesma forma, é significativo que, devido à lesão sofrida, o grupo tenha
apresentado maior média em comparação aos demais. Os modelos em
diálise peritoneal analisam segmentos peritoneais viscerais para avaliação
de vasos e neoangiogênese, não possível neste estudo. Demonstram,
também, que o aparecimento de vasos é precoce, correlacionando-se o
62
aumento de marcadores inflamatórios. A alteração está demonstrada, na
membrana peritoneal, através de técnica imunohistoquímica.
43,46, 56
63
5 CONCLUSÃO
O presente estudo mostra que a infusão peritoneal diária de
solução dialítica hipertônica glicosada a 3,38%, aplicada no período de 6
semanas, em modelo animal, utilizando ratos não-urêmicos, gera uma lesão
aguda na membrana peritoneal de característica inflamatória. Foi observado,
nesta lesão, um alto transporte de solutos pela membrana, um grave
processo oxidativo, avaliado pela dosagem de TBARS urinário e plasmático.
Também foram observadas importantes alterações de membrana peritoneal
parietal nesses espécimes. O uso contínuo de N-acetilcisteína, via oral,
protege a membrana peritoneal, diminuindo a expressão do processo
oxidativo e a geração de TBARS.
64
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