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FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO
FATORES DE RISCO E COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS DE
DIAGNÓSTICO PARA CAMPILOBACTERIOSE GENITAL BOVINA
EM TOUROS DO MUNICÍPIO DE PRESIDENTE PRUDENTE-SP
ROGÉRIO GIUFFRIDA
BOTUCATU-SP
Agosto 2007
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FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO
FATORES DE RISCO E COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS DE
DIAGNÓSTICO PARA CAMPILOBACTERIOSE GENITAL BOVINA
EM TOUROS DO MUNICÍPIO DE PRESIDENTE PRUDENTE-SP
ROGÉRIO GIUFFRIDA
Tese apresentada junto ao Programa de Pós-
Graduação em Medicina Veterinária para
obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof. Adjunto José Rafael Modolo
Co-orientador: Prof. Dr. Andrey Pereira Lage
BOTUCATU-SP
Agosto 2007
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ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Giuffrida, Rogério.
Fatores de risco e comparação de técnicas de dianóstico para
campilobacteriose genital bovina em touros do município de
Presidente Prudente-SP / Rogério Giuffrida. – Botucatu : [s.n.], 2007.
Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, 2007.
Orientador: Prof. Dr. José Rafael Modolo.
Co-orientador: Andrey Pereira Lage
Assunto CAPES: 50502050
1. Reação em cadeia de polimerase. 2. Bovino. 3. Campylobacter
fetus.
4. Presidente Prudente (SP). 5. Saúde animal.
CDD 636.08969
Palavras chave: Bovinos; Campylobacter fetus venerealis; Cultura
microbiologia; Imunofluorescência direta.
iii
Nome: Rogério Giuffrida
Título: FATORES DE RISCO E COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
PARA CAMPILOBACTERIOSE GENITAL BOVINA, EM TOUROS DO MUNICÍPIO DE
PRESIDENTE PRUDENTE-SP
Comissão Examinadora
Prof. Adjunto José Rafael Modolo
Presidente e Orientador
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu
Prof. Doutor Marcelo George Mungai Chacur
Membro
Departamento de Reprodução Animal da Faculdade do Curso de Medicina
Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade do Oeste
Paulista, Presidente Prudente
Prof. Assistente Doutor Antônio Carlos Paes
Membro
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu
Prof. Assistente Doutor Ary Fernandes Junior
Membro
Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências da
UNESP, Campus de Botucatu
Prof. Adjunto Luis Carlos de Souza
Membro
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu
iv
Dedicado a Renato Giuffrida (“in memorian”)
v
Agradecimentos
A todos que contribuíram para a realização deste trabalho, em especial:
Ao Prof. Adjunto José Rafael Modolo, do Departamento de Higiene Veterinária
e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootécnica da UNESP-
Botucatu, pela orientação deste trabalho;
Ao Prof. Doutor Andrey Pereira Lage, do Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas
Gerais, pela co-orientação deste trabalho;
À Universidade do Oeste Paulista por ter permitido e incentivado a realização
deste trabalho;
À Prefeitura de Presidente Prudente, que financiou parte deste projeto de
pesquisa e forneceu apoio logístico para sua realização;
Ao Laticínio Santa Clara, que prestou apoio e auxílio a este projeto de
pesquisa;
Aos alunos de Graduação do Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de
Ciências Agrárias da Unoeste, Vinícius Zamberlan, Wagner Junior, Marcelo Shlinz
Carvalho e Rodrigo Almeida de Sá, que auxiliaram nas colheitas de material nas
fazendas;
Ao Prof. Titular Carlos Roberto Padovani, do Departamento de Bioestatística
do Instituto de Biociências da UNESP-Botucatu, por prestar auxílio no planejamento
estatístico deste trabalho;
As Técnicas do Laboratório de Planejamento em Saúde Pública e Saúde
Animal, Tânia Maria Martins e Adriana Cristina Pavan Vieira, por prestar auxílio em
alguns procedimentos deste trabalho;
À minha irmã, jornalista Patrícia Helena Giuffrida, pelas correções efetuadas
no texto deste trabalho;
A todos os criadores de animais que colaboraram para realização desta
pesquisa, permitindo a colheita de amostras de seus animais;
vi
Ao colega pós-graduando Wellington Borges da Silva, pela amizade e
consideração durante a minha estadia na cidade de Botucatu;
A todos aqueles que, de forma direta ou indireta, prestaram colaboração ou
incentivo para realização deste trabalho.
vii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1
Levantamentos epidemiológicos sobre a
ocorrência de
CGB no Brasil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
Quadro 2
Chave taxonômica utilizada
para classificação fenotípica
das espécies de Campylobacter
de importância para a
reprodução de bovinos, (Organização
Mundial de Saúde
Animal, 2004) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .
36
Quadro 3
Chave taxonômica utilizada
para classificação fenotípica
das espécies de Campylobacter
de importância médica,
(On, 1996) . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Resultados do teste exato de Fisher e estimativas das razões
de chance por ponto (OR) e intervalos com 95% de confiança
para associação entre fatores de risco e positividade para
CGB em rebanhos produtores de leite na região de Presidente
Prudente,SP,2006-2007..............................................................
47
Tabela 2 Associação entre problemas reprodutivos em rebanhos
produtores de leite na região de Presidente Prudente e
positividade para Campylobacter fetus subesp. venerealis,
2006-2007..................................................................................
48
Tabela 3 Resultados dos contrastes pelo método de Dunn para escores
de densidade bacteriana observados em três meios de cultura
para isolamento de C. fetus subesp. venerealis, Presidente
Prudente,2006-2007...................................................................
50
Tabela 4 Coeficientes de Spearman para correlação entre densidades
bacterianas em três meios de cultura e escores de parâmetros
avaliados no lavado prepucial, Presidente Prudente, 2006-
2007............................................................................................
51
Tabela 5 Coeficientes Kappa estimados por ponto e intervalo com 95%
de confiança para concordância entre as técnicas diagnósticas
de PCR, cultura microbiológica e IFD em 104 amostras de
lavados prepuciais de 102 rebanhos leiteiros da região de
Presidente Prudente, 2006-2007 ...............................................
53
Tabela 6
Comparação entre resultados positivos para isolamentos de C.
fetus subesp. venerealis em três meios de cultura diferentes,
PCR e IFD, Presidente Prudente, 2006-2007.............................
54
ix
SUMÁRIO
Página
RESUMO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .
10
ABSTRACT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.
INTRODUÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
2.
REVISÃO DE LITERATURA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
3.
OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
4.
MATERIAL E MÉTODO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
4.1
População estudada e amostragem. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .
30
4.2
Avaliação das car
acterísticas sanitárias das propriedades
estudadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
4.3
Colheita de lavado prepucial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
4.4
Análise microbiológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
4.4.1
Semeadura do lavado prepucial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. .
33
4.4.2
Identificação fenotípica das estirpes bacterianas. . . . . . . . . . . . .
. .
33
4.4.3
Avaliação das características do lavado prepucial. . . . . . . . . . . .
. .
38
4.4.4
Avaliação da densidade de contaminantes nas placas de cultura. .
39
4.5
Teste de imunofluorescência direta (IFD) para diagnóstico da
CGB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
4.6
Reação da polimerase em cadeia (Polymerase Chain Reaction -
PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
4.6.1
Extração de DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. .
40
4.6.2
Amplificação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .
41
4.6.3
Detecção do material amplificado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .
41
4.7
Análise estatística . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
5.
RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
5.1
Perfil da amostra de fazendas e fatores epidemiológicos . . . . . . .
44
5.2
Comparação entre testes diagnósticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
5.2.1
Comparação entre meios de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .
48
5.2.2
Comparação entre PCR, IFD e cultura microbiológica . . . . . . . .
. . .
51
6.
DISCUSSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
54
x
6.1
Epidemiologia da CGB em rebanhos leiteiros da região de
Presidente Prudente-SP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
6.2
Comparação entre meios de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
6.3
Comparação entre PCR, cultura microbiológica e
Imunofluorescência direta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
7.
CONCLUSÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
8.
BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .
73
9.
TRABALHO CIENTÍFICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .
86
Resumo
GIUFFRIDA, R. Fatores de risco e comparação de técnicas de diagnóstico
para campilobacteriose genital bovina em touros do município de
Presidente Prudente-SP. Botucatu, 2007. 105 p. Tese (doutorado em
Medicina Veterinária), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista..
RESUMO
Para verificar os fatores de risco e a viabilidade de métodos diagnósticos para
a campilobacteriose genital bovina (CGB), amostras prepuciais de touros de
102 rebanhos leiteiros de Presidente Prudente, São Paulo, foram avaliadas
por testes bacteriológicos, reação da polimerase em cadeia (PCR) e
imunofluorescência direta (IFD). Durante a colheita de lavados prepuciais, um
questionário sobre desordens reprodutivas nas fêmeas e condições sanitárias
foi aplicado aos proprietários das fazendas. As amostras foram plaqueadas
em ágar seletivo de Skirrow, ágar Brucella verde brilhante e ágar tioglicolato
com 20% do sangue. As características seletivas dos três sistemas da cultura
foram comparadas pela avaliação de escores de densidade de contaminantes
bacterianos nas placas e a capacidade de suportar diferentes fontes de
contaminantes. A PCR foi conduzida usando seqüências dos nucleotídeos que
amplificam um fragmento com 835 pares das bases do DNA ribossomal
bacteriano. A IFD foi executada usando o conjugado anti-C. fetus subesp.
venerealis marcado com isotiocianato de fluoresceína. Resultados positivos
foram obtidos para culturas microbianas, PCR e IFD de 7,8% , 5,8% e 1,9%
das fazendas, respectivamente. Detectou-se associação significativa entre
touros positivos e rebanhos cujas vacas apresentavam taxas de concepção
abaixo de 85% (OR=7,6). A concordância entre a PCR e as culturas
bacteriológicas foi considerada ótima (Kappa = 0,847), mas foi pobre entre a
IFD e os outros testes. Apenas o ágar seletivo de Skirrow não foi influenciado
por contaminantes do lavado prepucial. Conclui-se que a CGB está presente
em rebanhos leiteiros de Presidente Prudente, onde é associada com os
distúrbios reprodutivos.
Palavras-chave: Campylobacter fetus venerealis, cultura microbiológica, PCR,
imunofluorescência direta, bovinos.
Abstract
GIUFFRIDA, R. Risk factors and laboratory diagnostic methods for genital
bovine campylobacteriosis in bulls from Presidente Prudente region, São
Paulo State. Botucatu, 2007. 105 p. Tese (Doutorado), Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista.
ABSTRACT
To verify the risk factors and viability of diagnostic methods for genital bovine
campylobacteriosis (GBC), preputial samples from bulls from 102 dairy herds
from Presidente Prudente, São Paulo State, were evaluated using
bacteriological tests, polymerase chain reation (PCR) and direct
immunofluorescence (DFA). During the preputial sampling, some questions
were made about female reproductive disorders and sanitary conditions of the
farms. The preputial samples were plated in Skirrow´s agar, Brucella Brilliant
green agar and Thioglycolate agar with 20% of blood. The selective
characteristic of the three systems of culture was compared by the evaluation
of bacterial density scores in the plates and for the capacity to support bacterial
contaminants of different sources. The PCR was conducted using sequences
of nucleotides that amplify a fragment with 835 pairs of bases of the ribossomal
DNA. Direct immunofluorescence was performed using anti-C. fetus subesp.
venerealis conjugated with fluorescein isothiocyanate. Positive results were
obtained by microbial cultures, PCR and DFA results of 7,8%, 5,8% and 1,9%
of the farms, respectively. Statistical association between positive bulls and low
fertility of the herd cows was detected (OR= 7,6). The overall agreement
between the PCR and bacteriological cultures was excellent (Kappa = 0,847),
but poor between DFA and the other tests. The Skirrow´s media was the only
that was not influenced by contaminant characteristics of preputial fluid
samples. It is concluded that GBC is present in dairy herds from Presidente
Prudente, where was associated with reproductive disturbances.
Key-words: Campylobacter fetus venerealis, Bacteriológica culture, PCR,
direct immunofluorescence, bovines.
INTRODUÇÃO
1. Introdução
14
A campilobacteriose genital bovina (CGB) é uma enfermidade infecciosa
transmissível causada pela bactéria Campylobacter fetus subespécie
venerealis e, ocasionalmente, por Campylobacter fetus subespécie fetus. A
bactéria foi inicialmente estudada por Smith e Taylor em 1919 a partir de
amostras isoladas de um feto bovino abortado, sendo preliminarmente
denominada de Vibrio fetus. Posteriormente, após estudos taxonômicos
baseados nos ácidos nucléicos que compõem seu material genético, passou a
ser denominada de Campylobacter fetus (SMIBERT, 1978).
A CGB causa muitos prejuízos econômicos aos pecuaristas em
decorrência de transtornos reprodutivos em bovinos de corte ou leite, tais
como repetições de estro, diminuição da taxa de concepção em vacas,
endometrites e abortamentos, entre outros. A enfermidade comumente se
manifesta de forma crônica, causando subfertilidade nos animais acometidos
(HOFFER, 1981).
A CGB tem sido diagnosticada no Brasil desde a década de 50 (DÁPICE,
1956), sendo uma enfermidade, depois da brucelose, das mais importantes
para reprodução de bovinos no país. Ela é uma doença essencialmente
venérea, sendo transmitida durante a monta natural por touros que portam
cronicamente o C. fetus subesp. venerealis no aparelho genital. Esta forma de
transmissão é importante em países que mantêm grandes rebanhos bovinos
em regime de monta natural, como é o caso do Brasil, da Austrália e da
Argentina. Nestes países, ela é responsável pelas baixas taxas de desfrute e
produtividade observadas nos rebanhos onde é endêmica (LAGE e LEITE,
2000).
A doença encontra-se disseminada em muitos rebanhos de corte e leite
espalhados pelos estados de São Paulo, Rio Grande do Sul, Minas Gerais,
Paraná, Bahia, Goiás, Rio de Janeiro e Mato Grosso do Sul (PELLEGRIN,
1999). Apesar de endêmica no Brasil, ainda não existem normas estatuárias
que versem sobre o controle da CGB em rebanhos nacionais. A legislação
1. Introdução
15
abrange apenas restrições quanto á importação de sêmen de países
extramercosul, exigindo três exames consecutivos de material prepucial
negativos intervalados de, no mínimo, sete dias para animais com idade acima
de seis meses (BRASIL, 2003).
Um dos obstáculos ao controle da CGB no país é o pouco conhecimento
que os produtores rurais têm a seu respeito. Por ser uma enfermidade crônica
e que se manifesta em longo prazo com conseqüências negativas nos índices
reprodutivos do rebanho, a enfermidade passa despercebida a muitos deles.
Na prática, muitos atuam apenas resguardando a eficiência reprodutiva de
seus rebanhos com vacinas contendo formulações de antígenos que
combatem um número variado de doenças infecciosas da reprodução, sem
saber se o rebanho está infectado ou não.
Outro obstáculo ao controle da CGB é a dificuldade de isolar o agente
causador em razão de sua fragilidade as condições adversas ambientais,
principalmente quando exposto ao oxigênio atmosférico, e a dificuldade de
classificá-lo por testes bioquímicos por necessitar de meios específicos para
seu crescimento. A maioria dos laboratórios veterinários, especialmente os
particulares, não está familiarizada com a metodologia de isolamento e
classificação para o agente, nem dispõe de prática e equipamentos para
realização de diagnósticos mais sensíveis e específicos do que a cultura
microbiana.
A região do Oeste do Estado de São Paulo é caracterizada por ocupar
9,6% da área estadual, tendo economia fortemente atrelada à pecuária de
leite e corte. Ela possui o maior número de unidades de produção de leite
bovino do estado (RUBEZ, 2006), mas informações sobre a prevalência da
CGB nesses rebanhos não estão disponíveis. Neles, a enfermidade é
especialmente importante em razão de diversos fatores. Um dos principais é a
intensificação do comércio local de animais leiteiros em razão do
reaquecimento da atividade pecuária de leite, fomentada pela recente alta nos
preços dos produtos lácteos (LEITE, 2007), e que pode propiciar a
disseminação de C. fetus subesp. venerealis se animais portadores forem
colocados à venda.
Outro fato que pode ser relevante para ocorrência da CGB nessa região
do estado paulista é o intenso uso do sistema de monta natural adotado pelos
1. Introdução
16
produtores locais, sendo que, comparativamente ao restante do estado,
poucos programam inseminação artificial para perpetuar seus rebanhos
(ROSOLEN, 2006). Nota-se também intensa miscigenação entre animais de
leite e corte, principalmente no que tange à pratica de cruzamentos entre
fêmeas leiteiras mestiças e touros da raça nelore, fato freqüente
principalmente nos assentamentos da região. O objetivo dos criadores que
adotam este sistema é propiciar o nascimento de bezerros mestiços mais
vigorosos e de maior valor agregado no mercado e ainda aproveitar o leite das
vacas lactantes (JUNQUEIRA FILHO et al., 1992). Na maioria destes casos,
este fato é observado em fazendas e assentamentos da região que utilizam
mão-de-obra familiar.
O intenso uso de touros de corte para cruzamentos com vacas de
aptidão mista ou leiteira pode predispor a CGB, especialmente se forem
utilizados machos adquiridos de rebanhos oriundos de grandes efetivos onde
não há o controle da enfermidade (PELLEGRIN et al., 2002).
Outro fato que merece atenção é a baixa produtividade dos animais
leiteiros da região. A média, em 2006, de produção de litros por produtor sob
inspeção federal foi de 51 litros/dia, bem inferior à média estadual que se situa
em 129 litros/dia (RUBEZ, 2006). Esta baixa produtividade pode ser reflexo da
baixa eficiência reprodutiva dos bovinos da região, inclusive em decorrência
da presença de enfermidades infecciosas da reprodução como a CGB.
O desconhecimento sobre a epidemiologia da CGB na região do Oeste
Paulista implica necessidade de pesquisar sobre sua ocorrência e importância
nos rebanhos locais, considerando que a região é um pólo pecuário
importante para o país. Além disso, há a necessidade constante de aprimorar
as metodologias diagnósticas disponíveis para a CGB para que o diagnóstico
nos rebanhos seja feito de maneira correta e concatenado com medidas de
controle efetivas.
REVISÃO DE LITERATURA
2. Revisão de literatura
18
O gênero Campylobacter compreende, até o momento, 30 espécies,
(GARRIT et al., 2004), muitas consideradas patogênicas para seres humanos
e animais. Dentre as reconhecidamente patogênicas para os bovinos
domésticos, a C. fetus é considerada uma das mais importantes. Ela está
subdividida em duas subespécies: o C. fetus subesp. fetus e o C. fetus
subesp. venerealis, esta última relacionada à CGB, doença reemergente nos
rebanhos nacionais, caracterizada por transtornos reprodutivos que levam a
importantes perdas econômicas para os criadores (PELLEGRIN, 1999).
O C. fetus subesp. venerealis é uma bactéria gram-negativa, com
aspecto de espirilo, possuindo um ou mais fragelos em uma das
extremidades, o que confere a elas grande mobilidade. Esta mobilidade pode
ser facilmente observada por meio de microscopia de contraste de fase. São
microaerófilas, necessitando para seu crescimento nos meios de cultura, de
atmosfera com baixos teores de oxigênio (QUINN et al., 1994).
O C. fetus subesp. venerealis tem como habitat a cavidade prepucial dos
touros. Neste local, as bactérias permanecem imersas no muco prepucial
presente no interior das criptas prepuciais, sem que o sistema imune do
animal seja capaz de depurá-las, e sem causar problemas clínicos aos
animais. Touros com idade superior a quatro anos, que possuem grande
quantidade de criptas prepuciais profundas, apresentam uma maior
probabilidade de portarem a bactéria neste local (DUFTY et al., 1975). Os
touros contraem a bactéria quando copulam com vacas portadoras, e, uma
vez infectados, permanecem assintomáticos e transmitem a bactéria à outras
fêmeas pela monta natural (FIVAZ et al., 1978).
Os touros podem ser portadores vitalícios da bactéria na cavidade
prepucial. A colonização persistente deste sítio anatômico pode estar ligada à
variabilidade molecular dos antígenos de superfície de C. fetus subesp.
venerealis, alvos de anticorpos que os neutralizariam. Estes antígenos, ao
sofrerem modificação na sua composição molecular, contribuem para a
2. Revisão de literatura
19
bactéria escapar da resposta imune local (WESLEY e BRYNER, 1989). Por
suas características epidemiológicas de portador do microrganismo, os touros
são os animais de escolha para a realização do diagnóstico nos rebanhos
endêmicos.
Em centrais de inseminação, a CGB foi relatada em vacas cobertas por
touros vasectomizados para detecção de cio (MODOLO et al, 2000). A cama
empregada para os touros, desde que esteja contaminada com excretas de
animais portadores, pode servir como veículo para a infecção. É possível que
vaginas artificiais e vaginoscópios possam servir de veículo para a doença
(LAGE e LEITE, 2000).
Ao ser depositado na vagina das fêmeas, o C. fetus subesp. venerealis,
após um período variável, migra para a cérvix e atinge o útero gravídico,
gerando processos de infertilidade nas vacas ou abortos precoces. A
infertilidade ocorre por que o C. fetus subesp. venerealis, ao infectar a mucosa
endometrial, provoca modificações no ambiente uterino, interferindo com o
processo de nidação dos embriões ou tornando o ambiente inóspito para os
embriões implantados (GENOVEZ, 1997). Entre estas modificações,
alterações nos receptores de lecitina do sistema reprodutivo podem ser
responsáveis pelas falhas na concepção e implantação dos embriões
(CIPOLLA et al., 1998). Outros fatores de virulência importantes na gênese da
infertilidade são os lipopolissacarídeos (LPS) de membrana da bactéria,
menos potentes que os de bactérias como Salmonella, porém com papel
fundamental nas gêneses de transtornos inflamatórios que levam aos abortos
precoces (MORAN et al., 1996).
Nas fêmeas infectadas que se recuperam, a resposta imune celular no
lúmen vaginal e uterino, evocada durante os estros dos ciclos reprodutivos
seguintes, representada por neutrófilos, depura as bactérias do trato
reprodutivo (CORBEIL et al., 1975). Há necessidade de repouso sexual da
fêmea infectada de 4 a 6 meses para que o microrganismo desapareça por
completo do lúmen vaginal das vacas (GENOVEZ, 1997). Os animais, nestas
condições, podem voltar a atividade reprodutiva normal.
Os prejuízos com os transtornos reprodutivos causados pelo C. fetus
subesp. venerealis são relacionados às perdas na produção de bezerros e
custos com profilaxia. A enfermidade, ao provocar subfertilidade nas vacas,
2. Revisão de literatura
20
pode passar despercebida, caso uma análise mais detalhada dos indicadores
e índices representativos da fertilidade dos animais da fazenda não sejam
convenientemente monitorados. Os touros infectados, portadores vitalícios da
bactéria, devem ser tratados para eliminar o microrganismo da cavidade
prepucial, principalmente se forem ativamente empregados para a reprodução,
como é o caso dos animais pertencentes a centrais de inseminação artificial
(GARCIA et al., 1983).
Entre os fatores de risco para a ocorrência da bactéria são relatados:
utilização de touros com idade superior a 4-5 anos no rebanho, presença de
touros sem controle sanitário para CGB e manejo reprodutivo que emprega
monta natural o ano inteiro ao invés de um período limitado de estação de
monta (STOESSEL, 1982).
O uso da inseminação artificial associado ao uso restrito de touros no
manejo reprodutivo das fazendas leiteiras diminui a probabilidade da CGB se
disseminar entre os animais. Mesmo se o sêmen utilizado nesta técnica for
contaminado com C. fetus subesp. venerealis durante sua coleta, o uso de
antimicrobianos no seu processo de congelamento pode prevenir a infecção
nas vacas inseminadas (CHEN et al., 1990; EAGLESOME e GARCIA, 1997).
Por outro lado, quando as fêmeas não emprenham pela inseminação
artificial, são submetidas a coberturas com machos denominados de touros de
repasse. Estes touros, por serem utilizados para cobrir vacas com problemas
de infertilidade, se expõem mais intensamente ao C. fetus subesp. venerealis,
e caso se tornem portadores da CGB, agem como amplificadores eficientes da
CGB dentro de um rebanho (STYNEN et al., 2003).
No Brasil, a CGB é considerada uma enfermidade comum. As regiões do
país e respectivas prevalências aferidas em diversos estudos estão descritas
no Quadro 1.
2. Revisão de literatura
21
QUADRO 1-Levantamentos epidemiológicos sobre a ocorrência de CGB no
Brasil.
Local
Prevalência
(por animal)
Técnica diagnóstica
Condição
estudada
Referência
SP
Primo-
isolamento no
Brasil
Isolamento
bacteriano
Feto abortado DÁPICE, 1956
RS 27%
Mucoaglutinação
vaginal
Vacas MIES FILHO, 1960
SP 8,2%
Mucoaglutinção
vaginal
Vacas
CASTRO et al.,
1967
SP, PR,
MG
14,4%
Mucoaglutinação
vaginal
Vacas
CASTRO et al.,
1971
BA 66,9%
Mucoaglutinação
vaginal
Vacas COSTA, 1976
RJ 12,95%
Mucoaglutinação
vaginal
Vacas
RAMOS e GUIDA,
1978
SP 23,9% Isolamento prepucial
Rebanhos com
problemas
reprodutivos
GENOVEZ et al.,
1989
MG 27,92%
Imunofluorescência
direta
Rebanhos com
problemas
reprodutivos
LAGE et al., 1997
RJ, MG 46,9%
Mucoaglutinação
vaginal
Vacas sadias JESUS et al., 1999
MT 52,3%
Imunofluorescência
direta
Touros de
rebanhos de
corte
PELLEGRIN et al.,
2002
MG 25,5%
Imunofluorescência
direta
Rebanhos com
problemas
reprodutivos
STYNEN et al.,
2003
Conforme se observa no Quadro 1, a prevalência estimada, tanto quando
se considera como unidade amostral as propriedades onde a enfermidade
esteve presente, quanto o número absoluto de animais testados, é quase
sempre bastante elevada nos estados onde foi pesquisada. No entanto, é
importante observar que em muitos dos trabalhos relatados os pesquisadores
mostram que seus levantamentos foram baseados em estudos sobre
2. Revisão de literatura
22
rebanhos que já apresentavam problemas de fertilidade ou foram baseados
em levantamentos de casuística laboratorial, fatos que podem levar a uma
superestimativa da ocorrência da CGB nestes rebanhos (PELLEGRIN et al.,
2002).
A prevalência da enfermidade pode variar segundo a região pesquisada
(JESUS et al.,1999) e em razão das diferentes práticas de manejo aplicadas
aos animais de leite ou corte (McFADDEN et al., 2004). No município de
Varginha-MG, a prevalência nos rebanhos leiteiros foi de 100% e, em média,
cerca de 25% dos animais de cada propriedade apresentavam a infecção
(STYNEN et al., 2003). Já em bovinos de corte pertencentes ao Pantanal
Mato-Grossense, a prevalência considerando propriedade como unidade
amostral, utilizando amostragem probabilística e uma única colheita por
animal, foi de 89,5% (PELLEGIN et al., 2002).
A CGB também tem sido descrita em países vizinhos ao Brasil. Na
Argentina, cujo sistema de criação de animais é bastante similar às condições
brasileiras, a prevalência da CGB em rebanhos varia de 21 a 43% e em touros
de 15 a 23% (VILLAR e SPINA, 1982; SOTO e DI ROCO, 1984; CIPOLLA et
al., 1994).
Pelas características epidemiológicas da enfermidade, o touro portador é
o animal de eleição para diagnosticar o agente infeccioso, o que é essencial
para o controle da infecção nos rebanhos onde é endêmica. Muitas técnicas
têm sido preconizadas para detectar a CGB nesses animais. O diagnóstico
pode ser realizado por métodos diretos que visam à demonstração da
presença do agente e pelos indiretos, que normalmente empregam testes de
sorologia. Como a resposta imune na mucosa prepucial de touros que portam
a bactéria é fugaz, os testes indiretos para touros não podem ser aplicados
com sucesso. Ao contrário, nas vacas enfermas, há uma forte resposta imune
de anticorpos locais na mucosa vaginal e/ou uterina. Particularmente em
fêmeas que apresentaram abortamento, estas técnicas imunológicas são
valiosas. Um teste de ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de
imunoglobulinas da classe IgA no muco vaginal de vacas que abortaram por
CGB foi empregado com sucesso para diagnosticar a doença (HUM et al.,
1991).
2. Revisão de literatura
23
Quando a maioria das pesquisas sobre a ocorrência da CGB foi iniciada
no Brasil, a técnica de mucoaglutinação cérvivo-vaginal foi uma das mais
utilizadas (MIES FILHO, 1960; CASTRO et al., 1967; COSTA, 1976; JESUS et
al., 1999). Esta técnica, apesar de amplamente utilizada, pode propiciar
resultados falsos negativos em razão do tempo prolongado para que os
anticorpos aglutinantes apareçam no muco vaginal, o que ocorre em média
após 60 dias da infecção, com títulos detectáveis somente até sete meses
pós-infecção. Há também possibilidade de resultados falsos positivos quando
o muco contém sangue ou pus (HOFFER, 1981).
Os métodos diretos são mais comumente empregados para avaliar a
presença de C. fetus subesp. venerealis no prepúcio de touros portadores. Os
mais empregados são os baseados em técnicas de cultivo bacteriano, biologia
molecular como a amplificação de cadeias de DNA (PCR) e
imunofluorescência direta. Para qualquer uma destas técnicas podem ser
empregados, para obter amostras da cavidade prepucial dos animais, suabs
estéreis com esmegma prepucial ou lavados prepuciais com meios
preservantes.
Considerando-se os métodos de colheita empregados, é importante
salientar que os microrganismos podem estar presentes em sítios anatômicos
pouco acessíveis aos suabs. Mesmo quando se empregam lavados
prepuciais, podem não ser obtidas amostras bacterianas representativas, se
os focos de infecções estiverem próximos ao fórnix prepucial (FINLAY et al.,
1985).
Para que se obtenha máxima sensibilidade nos testes diretos para CGB,
o touro deve permanecer em repouso sexual por no mínimo 7 a 14 dias antes
da colheita, sendo recomendadas pelo menos três colheitas para diminuir a
probabilidade de resultados falsos negativos (PELLEGRIN, 1999). Em
levantamentos epidemiológicos, nem sempre este procedimento é possível,
em razão da interferência com o manejo de cobertura nas propriedades ou
pela dificuldade em retornar às propriedades de difícil acesso (PELLEGRIN et
al., 2002).
Quando consideradas as técnicas bacteriológicas, diversos fatores
podem influenciar no processo de recuperação da bactéria nos meios de
cultura, entre os quais: 1.) método de colheita; 2.) método de transporte das
2. Revisão de literatura
24
amostras para o laboratório de diagnóstico; 3.) composição química dos
substratos dos meios diagnósticos empregados para o crescimento
bacteriano; 4.) composição da atmosfera em que são incubados e 5.) meios
antibióticos empregados para inibir a microbiota contaminante do prepúcio.
As principais desvantagens das técnicas microbiológicas, em relação aos
outros testes diretos, estão relacionadas às características fastidiosas do
microrganismo que, com raras exceções, não tolera a presença do oxigênio
atmosférico, o que dificulta seu crescimento nos meios de cultura utilizados
para seu isolamento primário ou classificação por comportamento bioquímico
(ON e HOLMES-a, 1991; ON e HOLMES-b, 1991; ON e HOLMES, 1992).
Outro fator que dificulta seu isolamento é o fato da cavidade prepucial ser
um local rico em bactérias (RODRIGUES et al., 1997), que podem contaminar
as amostras de lavados e se sobrepor ao crescimento do C. fetus subesp.
venerealis.
A composição dos meios de colheita de lavado prepucial e cultura
bacteriológica empregados para diagnóstico deve prezar pela presença de
agentes redutores, que diminuem a presença de oxigênio no meio, prejudicial
ao crescimento da bactéria. O tioglicolato de sódio é um agente redutor que
propicia resultados satisfatórios na preservação do microrganismo, assim
como a adição de cisteína a 0,1% no meio de cultura é considerada
estimulatória para o crescimento da bactéria (VAN DER WALT, 1987).
Muitos meios de cultura empregados para isolamento do C. fetus subesp.
venerealis, como o meio de Skirrow, ágar verde brilhante e ágar sangue,
apresentam resultados similares quanto à capacidade de recuperar bactérias
das amostras clínicas. O meio de Skirrow pode proporcionar um crescimento
melhor para este patógeno e ser mais efetivo na eliminação de bactérias
contaminantes indesejáveis (MONKE et al., 2002).
O conhecimento do perfil de sensibilidade antimicrobiana de C. fetus
subesp. venerealis é importante por três motivos: 1.) para que os touros,
portadores vitalícios do microrganismo, sejam corretamente tratados; 2.) para
empregar fármacos eficazes com o objetivo de eliminar a bactéria do sêmen
de touros, e 3.) para serem empregados antibióticos, nos meios seletivos,
capazes de inibir a microbiota contaminante do prepúcio, sem prejudicar o
crescimento de C. fetus subesp. venerealis.
2. Revisão de literatura
25
Quando empregados meios seletivos contendo antibióticos, visando ao
isolamento das bactérias a partir do esmegma prepucial, há dificuldade de
obter substratos que permitam apenas o crescimento da subespécie subesp.
venerealis, causadora da CGB. Isto ocorre por que este gênero bacteriano é
fastidioso, e por vezes, sensível aos antimicrobianos seletivos (BOLTON et al.,
1987). A subespécie fetus, de importância clínica em algumas situações, mas
não relacionada à CGB, também é capaz de crescer nestes meios seletivos e
deve ser diferenciada da subespécie subesp. venerealis por métodos de
classificação fenotípica (ON, 1996).
O C. fetus subespécie fetus apresenta algumas vantagens competitivas
sobre o C. fetus subesp. venerealis, como por exemplo, maior resistência a
antibióticos empregados em meios seletivos e maior aerotolerância. A
rifampicina, por exemplo, na concentração de 10 µg/mL é capaz de inibir o
crescimento de C. fetus subesp. venerealis mas não de C. fetus subesp. fetus
(BALLABENE e TERZOLO, 1992).
Alguns pesquisadores aferiram que a polimixina B, em concentrações
iguais ou superiores a 0,25 UI/mL em meios de cultura para isolamento de C.
fetus subesp. fetus a partir de lavados prepuciais, é capaz de inibir o
crescimento de C. fetus subesp. venerealis, (BALLABENE e TERZOLO,
1992). No entanto, o agente é comumente isolado no meio de Skirrow, que
contem polimixina B (VARGAS et al., 2005), o que sugere que esta bactéria
tem sensibilidade variável a diferentes concentrações deste antibiótico.
Outras substâncias de efeitos antimicrobiano não pertencentes à classe
dos antibióticos podem ser empregadas para isolamento seletivo. O triclosan,
em concentrações iguais ou superiores a 10 µg/mL em meios ricos
suplementados com sangue ou em concentrações iguais ou superiores a 6
µg/mL em ágar-Brucella ou 3 µg/mL em ágar Mueller-Hinton, é útil para
isolamento de ambas subespécies (BALLABENE e TERZOLO, 1992). O ágar
tioglicolato de sódio adicionado do corante verde brilhante já foi utilizado com
sucesso para isolar o agente de touros portadores (MODOLO et al., 2000).
2. Revisão de literatura
26
Uma vez isolada a bactéria, é necessária sua caracterização fenotípica
baseada em testes bioquímicos com o objetivo de diferenciar C. fetus subesp.
venerealis de C. fetus subesp. fetus. Existem diferentes técnicas de
classificação fenotípicas, variando em função das condutas diagnósticas dos
laboratórios microbiológicos que as adotam. Essas variações interferem na
acuidade dos testes diagnósticos e são colocadas como causa de resultados
díspares encontrados entre os diversos trabalhos de levantamentos
epidemiológicos (VAN BERGEN et al., 2005-c). Neste sentido, as provas
diagnósticas baseadas em imunofluorescência direta (IFD) e biologia
molecular, como as técnicas de amplificação de cadeias de DNA (PCR) e a
análise dos padrões genômicos bacterianos, são úteis para diferenciar estas
duas subespécies (HUM et al., 1997; ON e HARRINGTON, 2001; VARGAS et
al, 2003).
O teste de imunofluorescência direta (IFD), empregando desde 1960,
com conjugado produzido com a cepa de referência NCTC 10354, apresenta
sensibilidade de 92,59% e especificidade de 88,89%, sendo capaz de resultar
positivo com cerca de 10
4
Unidades Formadoras de Colônia por mL (UFC/mL)
de lavado prepucial. Este teste sofre pouca interferência da presença de
bactérias da microbiota prepucial, mas pode resultar falso positivo quando no
prepúcio existir o C. fetus subesp. fetus (FIGUEIREDO et al., 2002).
Outros problemas relatados para o teste de IFD são a subjetividade na
interpretação das lâminas preparadas com os conjugados, principalmente
quando existirem muitos debris celulares nos campos microscópicos, e a
diminuição da sensibilidade do teste em razão de amostras de lavado
prepucial com baixa concentração de microrganismos (FIGUEIREDO et al.,
2002).
O teste de amplificação das cadeias de DNA bacteriano (PCR) tem sido
desenvolvido para aumentar a probabilidade de detecção do microrganismo
em lavados prepuciais. Entre os iniciadores selecionados para amplificação
das cadeias de DNA bacteriano, um fragmento do gene que codifica o RNA
16S ribossomal possui boa aplicabilidade em discriminar a espécie C. fetus de
outras espécies comensais de Campylobacter, (BLOM et al., 1995), que
podem estar presentes na cavidade prepucial.
2. Revisão de literatura
27
Um outro fragmento amplificador referente à seqüência 23S do DNA
ribossomal apresenta vantagens em oferecer mais informações em relação ao
anterior, pois possui maior número de regiões variáveis, o que é interessante
quando se pretende distinguir espécies de Campylobacter (STYNEN, 2000).
A epidemiologia molecular tem sido empregada para avaliar os padrões
genéticos das espécies relacionadas a transtornos reprodutivos em rebanhos
bovinos. Duim et al., 2001, estudaram os padrões genômicos de diversas
espécies de Campylobacter de importância em medicina veterinária,
analisando o polimorfismo de fragmentos de DNA marcados com fluorocromos
(Amplifield Fragment Lenght Polymorphism-AFLP). Os padrões genômicos
das subespécies C. fetus subesp. fetus e C. fetus subesp. venerealis,
permitiram gerar um dendrograma capaz de diferenciá-las.
Em rebanhos em que ocorrem infecções persistentes pela mesma estirpe
bacteriana, as variações no DNA genômico bacteriano são mínimas quando
os fragmentos de DNA são avaliados pela técnica de AFLP. Essas variações
não estão correlacionadas às modificações nos antígenos de superfície
bacteriana (WESLEY e BRYNER, 1989).
A técnica de análise de fragmentos de DNA bacteriano em gel de
eletroforese, após a digestão com enzimas de restrição (Restriction Fragment
Length Polymorphism -RFLP) também pode ser empregada em estudos
sobre a epidemiologia molecular do microrganismo. No Brasil, Vargas et al.,
2003, submeteram 33 estirpes ao RFLP, separando os fragmentos de DNA
em gel por meio de eletroforese empregando campos elétricos pulsáteis.
Obtiveram de 7 a 10 fragmentos de DNA com peso molecular variando de 40
a 373 kb, totalizando 12 diferentes padrões. Uma análise mais acurada dos
fragmentos gerou um dendrograma que permitiu observar dois padrões
genéticos distintos do microrganismo.
OBJETIVOS
3. Objetivos
29
Pelo exposto, o presente trabalho pretendeu estimar a prevalência da
CGB em rebanhos leiteiros comerciais da região de Presidente Prudente-SP e
os possíveis fatores de risco inerentes às características regionais de criação
dos animais que podem influenciar na sua ocorrência.
Objetivou também associar a CGB com problemas reprodutivos relatados
pelos criadores dos animais na região e comparar as técnicas diagnósticas
para enfermidade, incluindo isolamento bacteriano empregando três bases
seletivas diferentes, amplificação de cadeias de DNA (PCR) e
imunofluorescência direta.
MATERIAL E MÉTODOS
4. Material e métodos
31
4.1 População estudada e amostragem
O experimento foi conduzido entre março de 2006 e junho de
2007. Considerou-se como unidade amostral as propriedades que
comercializam leite em um universo populacional de 160 distribuídas
geograficamente em torno do município de Presidente Prudente-SP e
filiadas aos laticínios presentes no local.
Para que o levantamento fosse mais fidedigno possível, utilizou-se
como critério a colheita de lavados prepuciais de todos os touros das
propriedades participantes até o limite máximo de cinco animais por
unidade amostral. Os touros incluídos na pesquisa foram selecionados
com base nas seguintes condições: a.) possuir mais de 40 meses de
idade; b.) estar em regime de monta natural ou ser utilizado como animal
de repasse após inseminação artificial para cobertura exclusiva de
animais leiteiros; c.) não ter coberto nenhum animal nos últimos sete dias.
Para determinar a prevalência da CGB em touros da região, foi
empregada amostragem aleatória simples, sorteando-se as propriedades
dentre as aproximadamente 160 existentes que aderiram à participação
na pesquisa. Adotou-se como parâmetros: amostragem casual sem
reposição quanto à escolha da propriedade; nível de 95% de confiança;
10% de erro de estimação; uma população finita composta por 160
propriedades leiteiras, e uma estimativa de proporção média calculada
com base nos estudos citados no Quadro1 de 31% de propriedades
positivas para CGB. Com base nestes dados, utilizou-se para cálculo do
tamanho amostral mínimo a fórmula abaixo descrita com seus respectivos
componentes (LUIZ e MAGNANINI, 2000).
)1()1(
)1(
2
2/
2
2
2/
PPZN
PNPZ
n
−+−
−
=
α
α
ε
4. Material e métodos
32
n
= número de propriedades amostradas
2/
α
Z = valor da estatística Z para = 2,5%
N
= tamanho populacional
P
= estimativa da proporção de propriedades positivas para CGB
ε
= erro padrão
Com base nesta fórmula, chegou-se ao tamanho amostral mínimo
de 55 propriedades. Na possibilidade de utilização de mais rebanhos para
inferir sobre a prevalência da CGB nos animais da região estudada e
diminuir erros aleatórios, optou-se por utilizar o tamanho amostral máximo
capaz de ser obtido, que, considerando as propriedades que se
recusaram a participar e as que não possuíam touros nas condições
previamente estabelecidas, se situou em 102 propriedades.
Optou-se por colher apenas uma amostra por animal ao invés de
colheitas seriadas, pois existiam dificuldades relacionadas à necessidade
de impor repouso sexual aos animais por sete dias, sendo que os
criadores necessitavam dos animais para cobrir as vacas.
4.2 Avaliação das características sanitárias das
propriedades estudadas
As propriedades sorteadas e selecionadas para a pesquisa foram
submetidas a um inquérito na forma de questionário para avaliar suas
características sanitárias e outras que poderiam estar relacionadas à
CGB. Foram abordadas as questões mais relevantes ao manejo sanitário,
manejo reprodutivo e características de criação das propriedades.
Os seguintes itens foram pesquisados com relação ao manejo
sanitário: vacinação para enfermidades que afetam a reprodução de
bovinos tais como CGB, tricomonose, brucelose, rinotraqueíte infecciosa
bovina (RIB), complexo diarréia viral bovina-enfermidade das mucosas
4. Material e métodos
33
(CDVB-EM), leptospirose e outras, controle de enfermidades infecciosas
por monitoramento (CGB, leptospirose e brucelose) e rotatividade de
animais na propriedade (aquisição recente de animais, participação em
eventos, empréstimos de touros de outras propriedades).
Os seguintes itens foram pesquisados com relação ao manejo
zooténico na propriedade: número de animais na propriedade e por lote
de animais leiteiros, sistema de criação (exclusivo leite ou misto
leite/corte) e apuramento das raças utilizadas.
Os seguintes itens foram pesquisados com relação ao manejo
reprodutivo: presença de local em separado para parição (piquete
maternidade), percentual estimado de vacas repetidoras de estro,
percentual estimado de abortamentos nos últimos 12 meses, sistema de
cobertura (monta natural ou inseminação artificial seguida de repasse),
relação touro-vaca, utilização de touros com exame andrológico, co-
habitação do touro examinado com outros touros, idade do touro e seu
tempo de permanência na fazenda.
4.3 Colheita de lavado prepucial
O lavado prepucial foi colhido segundo especificações de Leite et
al., 1995, com algumas modificações. Após introduzir 60 a 80 mL de
tioglicolato fluído estéril na cavidade prepucial dos animais, com auxílio de
um equipo plástico esterilizado, o prepúcio externo foi massageado por
cerca de 3 a 5 minutos para retirar o esmegma. O lavado obtido foi
recolhido em frascos de vidro estéreis e/ou em seringas plásticas
descartáveis, que foram armazenados a 4
o
C até o momento do exame.
4. Material e métodos
34
4.4 Análise microbiológica
4.4.1 Semeadura do lavado prepucial
Para a semeadura, as amostras de lavado prepucial foram
centrifugadas a 2.500 rotações por minuto (RPM) durante vinte minutos, e
após desprezar-se o sobrenadante, o sedimento foi semeado em
duplicata em três meios diferentes:
a.) ágar base tioglicolato enriquecido com 20% de sangue bovino
desfibrinado (ATSB);
b.) ágar base Columbia adicionado de suplemento seletivo de Skirrow
adquirido comercialmente (Campylobacter Suplemento Seletivo-
Oxoid ®) e composto por sulfato de polimixina B na concentração
de 2,5UI/mL
c.) , trimetoprim na concentração de 5 µg/mL, vancomicina na
concentração de 10µg/mL e ciclohexamida na concentração de
50µg/mL (AAS);
d.) ágar base Brucella suplementado com 20% de sangue bovino
desfibrinado e suplementado com 50 µg/mL de verde brilhante
(ABVB).
As placas foram mantidas a temperatura de 37
o
C, em jarras com
ambiente de microaerofilia obtido por gerador de atmosfera próprio
(Microaerobac-Probac®), durante 72 horas.
4.4.2 Identificação fenotípica das estirpes bacterianas
As colônias bacterianas suspeitas foram submetidas ao exame de
contraste de fase e coloração de Gram para identificação presuntiva do
gênero. Sendo as características morfo-tintoriais e de movimento, típicas
dos espirilos do gênero, as colônias foram semeadas em meio de Tarozzi,
4. Material e métodos
35
e incubadas a 37
o
C por 72 horas para formarem um inóculo compatível
com a escala 1 de Mac Farland. As bactérias presentes no inóculo foram
submetidas aos seguintes testes para sua diferenciação com outras
espécies (ON , 1996; OMSA, 2004):
a.) Produção da enzima oxidase. Realizada mediante a captura de uma
pequena alíquota da colônia bacteriana presente no meio de
isolamento e sua emulsificação na superfície de uma tira de papel
contendo substratos colorimétricos para enzima oxidase (Labclin®).
Foram consideradas positivas colônias que mudaram para coloração
púrpura na tira de papel em até 2 minutos de leitura;
b.) Produção de enzima catalase. Realizada mediante a adição de 1 mL
do inóculo de Campylobacter a 1 mL de água oxigenada a 3%. A
leitura foi feita cinco minutos após, sendo positiva, quando ocorreu
produção de bolhas de gás;
c.) Produção de enzima hipuricase. Uma alçada do inóculo foi semeada
em um microtubo, contendo solução aquosa com 1% de hipurato de
sódio, e incubada em banho-maria, a 37
o
C, por duas horas. Foi então
adicionada ninhidrina em acetona e n-butanol (1:1), sendo novamente
incubada por mais 15 minutos. A reação foi positiva, quando ocorreu a
formação de cor púrpura;
d.) Produção de enzima uréase. Três gotas do inóculo foram semeadas
em tubos contendo caldo urease, que foram incubados a 37
o
C por 72
horas, considerando-se positivas as reações que resultaram em
coloração púrpura do caldo após a incubação;
e.) Produção de H
2
S em TSI (Triplice Sugar Iron-ágar tríplice açúcar
ferro). Uma alçada do inóculo foi semeada por picada em profundidade
em tubos contendo ágar TSI, considerando-se positivas as amostras
que produziram coloração negra ao redor da picada, típica da
produção de gás sulfídrico, após 72 horas de incubação;
f.) Tolerância à glicina a 1%. Três gotas do inóculo foram semeadas, em
meio contendo 1% de glicina, e incubadas, a 37
o
C, por 72 horas. A
4. Material e métodos
36
amostra foi considerada positiva, quando ocorreu crescimento da
bactéria;
g.) Tolerância ao cloreto de sódio a 3,5%. O teste foi realizado mediante
a inoculação de três gotas do inóculo, em meio de cultura contendo
3,5% de NaCl, a 37
o
C, por 72 horas. A amostra foi considerada positiva
quando ocorreu crescimento da bactéria;
h.) Capacidade de crescimento a 25º C ou a 43º C. Três gotas do inóculo
foram semeadas em duplicata, no meio de Tarozzi: a primeira duplicata,
incubada a 37
o
C, e a segunda, a 43
o
C, por 72 horas. Consideraram-se
como positivos, os tubos com meio onde ocorreu crescimento da
bactéria;
i.) resistência ao ácido nalidixico, cefalexina, carbenicilina e cefoperazona.
Com zaragatoa estéril, o inóculo foi semeado em meio tioglicolato,
enriquecido com sangue bovino, acrescido de discos de antibiograma de
ácido nalidíxico, cefalexina, carbenicilina e cefoperazona nas
concentração respectivas de 30 mcg, 30 mcg, 100 mcg, e 75 mcg de
potência, e incubado a 37
o
C, por 72 horas, em microaerofilia. O
resultado foi considerado positivo quando ocorreu um halo de inibição
inferior ao diâmetro de 3 mm.
A chave de classificação prioritariamente utilizada foi a
recomendada pela Organização Mundial de Saúde Animal, 2004. Em
casos de dúvidas sobre a taxonomia do microrganismo isolado, procedeu-
se aos exames complementares contidos nas chaves de classificação
descritas por On, 1996. As interpretações das provas bioquímicas
utilizadas estão descritas nos Quadros 2 e 3.
4. Material e métodos
37
QUADRO 2- Chave taxonômica utilizada para classificação fenotípica das espécies de Campylobacter de importância
para a reprodução de bovinos, (Organização Mundial de Saúde Animal, 2004).
Espécie Oxi Cat
Produção de
H
2
S (TSI)
Crescimento a
25
o
C
Crescimento
a 42
o
C
Tolerância
à glicina
1%
Tolerância
ao NaCl a
3,5%
CEF AN
C. fetus sub. veneralis + + - + V - -
S V
C. fetus sub. fetus + + - + V + -
S R
C. jejuni + + - - + + -
R V
C. sputorum biov
sputorum
+ - + - + + V
S V
C. sputorum biov.
faecalis
+ + + - + + V
S V
C. sputorum biov
paraureolyticus
+ - + - + + V
S V
Oxi- prova da oxidase; Cat- prova da catalase; CEF- sensibilidade ou resistência à cefalotina; AN- sensibilidade ou
resistência ao ácido nalidíxico; V- padrão de atividade variável; S- sensível; R- resistente
4. Material e métodos
38
QUADRO 3- Chave taxonômica utilizada para classificação fenotípica das espécies de Campylobacter de importância
médica, (On, 1996).
Espécie Ox Cat
Produção de
H
2
S (TSI)
Hipuricase
Urease AN CEF CPZ CAR
Arcobacter butzleri + V - - - V R R R
Arcobacter. cryarophilus + + - - - S R R R
C. coli + + - - - S R R S
C. concisus V - - - - V S S S
C. fetus veneralis + + - - - S S S S
C. fetus subesp. fetus + + - - - V S R S
C. gracilis + V - - - V S S S
C. hyointestinalis
sub hyointestinalis
+ + + - - R V R S
C. jejuni sub doylei + V - + - S S S V
C. jejuni sub. Jejuni + + - + - S R R S
C. lari + + - - V V R R V
C. rectus + V - - - V S S S
C. upsaliensis + - - - - S S S S
Helicobacter + V - - + V V V V
Oxi- prova da oxidase; Cat- prova da catalase; CEF- sensibilidade ou resistência à cefalotina; AN- sensibilidade ou
resistência ao ácido nalidíxico; CPZ- sensibilidade ou resistência à cefoperazona; CAR- sensibilidade ou resistência à
carbenicilina; V- padrão de atividade variável; S- sensível; R- resistente
4. Material e métodos
39
4.4.3 Avaliação das características do lavado prepucial
Antes e durante o preparo das amostras de lavado prepucial para
semeadura, foram analisados diversos parâmetros relacionados às
características físicas dos mesmos que poderiam denunciar a presença de
potenciais fontes de contaminação bacteriana nas placas semeadas. Os
parâmetros estudados foram de ordem endógena (presença de urina e
turvação por muco) e de ordem exógena (partículas de fibras vegetais e de
solo). Para facilitar a análise estatística, cada amostra de lavado prepucial foi
classificada segundo escores que identificaram a intensidade com que a
característica estava presente. Os critérios de julgamento dos escores foram
baseados em observações de colheitas de material a campo, pregressas à
presente pesquisa. Foram avaliadas:
a.) Turvação por muco. A turvação observada no fluído obtido pelo lavado
prepucial foi comparada e classificada segundo a escala de
turbidimetria de Mac Farland, que é dividida em escores que variam de
0 a 10;
b.) Presença de urina. Avaliada de acordo com a cor e seguindo-se o
critério: (0)- sem cor aparente, (1) -cor ligeiramente amarelada, (2) -cor
marcadamente amarelada;
c.) Contaminação por partículas do solo. Após a centrifugação do material
em tubos tipo Falconi, classificou-se as amostras de acordo com a
deposição de sedimento formado por partículas identificáveis como
sendo de solo no fundo do tubo, seguindo-se o seguinte critério: (0)-
sem presença aparente, (1)- volumes de partículas correspondentes a
0,1 a 0,5 mL de sedimento, (2)- acima de 0,5 ml;
d.) Presença de filamentos vegetais. A inspeção dos líquidos obtidos foi
avaliada da seguinte maneira: (0)- sem presença aparente de fibras
vegetais; (1)- presença de até 10 partículas de fibras vegetais e; (2)-
mais de 10 partículas vegetais presentes.
4. Material e métodos
40
4.4.5 Avaliação da densidade de contaminantes nas placas de
cultura
Para avaliar a densidade de microrganismos nas amostras de lavado
prepuciais, semeadas nos meios de cultura citados, utilizou-se o seguinte
critério: escore (1)- densidades estimadas entre 1 e 10 unidades formadoras de
colônia por placa; (2)- para densidades estimadas entre 10 e 100 unidades
formadoras de colônias por placa e, escore (3)- densidades estimadas em
valores acima de 100 unidades formadoras de colônia por placa.
4.5 Teste de imunofluorescência direta (IFD) para diagnóstico
da CGB
O teste de imunofluorescência direta foi realizado conforme as
especificações de Figueiredo et al., 2002. Os lavados prepuciais colhidos foram
centrifugados a 600 x g por 10 minutos. A seguir, o sobrenadante foi transferido
para um tubo de polipropileno e centrifugado novamente a 13.000 x g a 4
o
C
por 30 minutos. O sobrenadante resultante foi descartado e o sedimento obtido
empregado para elaborar a lâmina de IFD. Nas lâminas foram testadas até oito
amostras. Como controle positivo foi empregado a cepa C. fetus subesp.
venerealis NCTC 10354 e como negativo, uma cepa de campo de C. sputorum
biovar bubulus. As lâminas foram fixadas em acetona pura a – 20
o
C por 30
minutos. A seguir foram tratadas com conjugado produzido em coelhos,
utilizando-se a amostra EV 1980 de C. fetus subesp. venerealis. As lâminas
foram secadas em estufa a 37
o
C em câmara úmida por 30 minutos e lavadas
três vezes com tampão salina-fosfato por 10 minutos. A última lavagem foi com
água destilada. Após a secagem da lâmina, foi realizada sua montagem,
colocando sobre o esfregaço uma gota de glicerina tamponada com 50% V/V
de PBS, pH 7,2 e sobre a gota uma lamínula. A leitura foi realizada em
microscópio de imunofluorescência de lâmpada HBO de alta pressão de
mercúrio de 50 U e filtro de seleção de onda de 450 nm.
4. Material e métodos
41
4.6 Reação da polimerase em cadeia (Polymerase Chain
Reaction - PCR)
4.6.1 Extração de DNA
As amostras de DNA foram extraídas utilizando-se a técnica de
purificação em colunas (Pure link genomic DNA – Invitrogen ®). Optou-se pelo
uso do kit baseado no método de colunas pela facilidade de processar grande
número de amostras e obter material altamente purificado. Os fabricantes do
Kit não dilvulgaram nos prospectos técnicos as formulações de todos os
tampões empregados no processos de extração do DNA.
Cada amostra de lavado prepucial foi previamente submetida à
centrifugação a 2.500 RPM para concentração do material suspenso. O
sedimento concentrado obtido foi colocado em um microtubo plástico livre de
DNAases e RNAases. O material concentrado foi ressuspendido em 180 µl de
tampão de extração fornecido pelo kit, tratado com 20 µl proteinase K (20
mg/mL) e mantido em água aquecida a 55
o
C por 120 minutos para digestão
das paredes celulares bacterianas e liberação do DNA genômico.
Após este período, foram adicionados a cada amostra 20 µl de RNAse
(20 mg/mL) para eliminar as moléculas de RNA presentes. Após dois minutos
em temperatura ambiente, adicionou-se 200 µl de tampão de lise/ligação
fornecido pelo kit e 200 µl de etanol a 96-100%.
O material lisado obtido foi colocado no interior do tubo contendo a
coluna de purificação fornecido com o kit e centrifugado a 14.000 RPM por 1
minuto na temperatura ambiente. Após este procedimento, adicionou-se 500 µl
do primeiro tampão de lavagem fornecido com o kit e centrifugou-se a coluna
por um minuto a 14.000 RPM. Em seguida, adicionou-se ao microtubo 500 µl
do segundo tampão de lavagem fornecido com kit e centrifugou-se a coluna por
3 minutos a 14.000 RPM.
Para eluir o DNA purificado presente na coluna, adicinou-se a cada
microtubo 100 µl de tampão de eluição (10 mM tris-HCl, pH 9,0, 0,1 mM
EDTA) fornecido com o kit. Após um minuto na temperatura ambiente, a coluna
4. Material e métodos
42
foi centrifugada a 14.000 RPM por um minuto e meio para obtenção final do
DNA purificado.
Dois microlitros do DNA purificado, obtidos após a última centrifugação,
foram submetidos a eletroforese em gel de ágar a 1% acrescido de 2 µl de
brometo de etídio para verificação da integridade dos ácidos nucléicos. As
leituras foram realizadas em transluminador de luz ultra-violeta, sendo aceitas
para os passos seguintes, as amostras que se permaneceram com bandas
visíveis.
4.6.2 Amplificação
Para amplificação foram empregados indicadores sugeridos por
STYNEN, 2000, na padronização do teste. Os oligonucleotídeos foram
sintetizados pela invitrogen Brasil ®, sendo consituídos pelas seguintes bases:
FET1 (5’ - CTC ATA ATT TAA TTG CAG TCA TA - 3’) e 69ar (5’- CTT AGG
ACC GTA TAG TTA – 3’). Este par de indicadores aplificam um fragmento de
835 pares de base (pb) da região hipervariável da sequência 23S do DNA
ribossomal de C. fetus subesp. venerealis. As reações foram realizadas em um
volume total de 25 µl contendo 20 pmol de cada iniciador, 200µM de cada
desoxiribonucleotídeo (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), 10 mM tirs-Hcl (pH 8,3),
50 mM de KCl, 2,0 mM de MgCl
2
, 1 UI de Taq DNA polimerase e 10 µl do DNA
extraído. A mistura foi submetida a um ciclo de 3 minutos a 94
o
C, 30 ciclos de 1
minuto a 58,1
o
C, 1 minuto a 72
o
C e 1 minuto a 94
o
C e um ciclo final composto
de 1 minuto a 58,5
o
C e 10 minutos a 72
o
C.
4.6.3 Detecção do material amplificado
Para detecção do material amplificado, 10 µl do material obtido foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1% acrescido de 2 µl de
brometo de etídeo para cada 40 mL de gel. Uma cepa de C. fetus subesp.
venerealis NCTC 10354 foi empregada como controle positivo. Foram
consideradas positivas, as amostras que permitiram a visualização no gel, em
comparação com marcadores moleculares de 100 pares de base, de bandas
correspondentes a 835 pares de base.
4. Material e métodos
43
4.7 Análise estatística
Objetivando obter uma estimativa de prevalência mais próxima possível
da realidade, utilizou-se como critério para classificação de uma propriedade
como positiva para C. fetus subesp. venerealis, quando o touro pertencente a
ela resultou em positivo em pelo menos duas das três modalidades de testes
pesquisados.
A associação de fatores de risco e problemas reprodutivos pesquisados
com a ocorrência de touros positivos, segundo o critério acima descrito, foi
avaliada pelo teste exato de Fisher (CURI, 1997). Adicionalmente, as razões de
chance (ODDS RATIO) e respectivos intervalos de confiança foram calculados
para cada um dos fatores pesquisados (KALE et al., 2002).
Para comparar as médias de número de animais por fazenda, número
de animais leiteiros por lote, idade dos touros e proporção vaca:touro entre
fazendas com diagnóstico positivo e negativo para C. fetus subesp. venerealis,
utilizou-se o teste t não pareado (CURI, 1997).
Para comparar a concordância entre os testes diagnósticos de cultura
microbiológica, IFD e PCR, utilizou-se o cálculo do coeficiente Kappa estimado
por ponto e por intervalo com 95% de confiança (PAGANO e GAUVREAU,
2004). A medida de confiabilidade conferida pelos coeficientes calculados foi
interpretada segundo os critérios descritos por Thrusfield, 2004: >0,81-
concordância quase perfeita; 0,61 a 0,8- concordância substancial; 0,41 a 0,6-
concordância moderada; 0,21 a 0,4- concordância razoável; 0 a 0,2-
concordância fraca, e 0- concordância pobre.
Para comparar os diferentes escores de densidades bacterianas obtidas
para os três meios de cultura pesquisados, utilizou-se o teste não paramétrico
de Friedman para amostras relacionadas (CURI, 1997) com contrastes
realizados pelo método de Dunn.
Para correlacionar os escores de diferentes densidades bacterianas com
os escores para características físicas do lavado prepucial, foram calculados
coeficientes de correlação não paramétrica de Spearman (PAGANO e
GAUVREAU, 2004).
Todas as análises foram efetuadas utilizando-se o pacote computacional
estatístico GraphPad Instat ® 3.0 e ao nível de 5% de significância.
RESULTADOS
5. Resultados
45
5.1 Perfil da amostra de fazendas e fatores epidemiológicos
Resultados positivos pelos testes de cultura bacteriana, PCR e IFD
foram obtidos de 7,8%, 5,8% e 1,9% das fazendas, respectivamente.
Considerando positividade em pelo menos dois dos testes utilizados, a
prevalência estimada para a enfermidade se situou em 5,8%.
Foram incluídas 102 propriedades na pesquisa, das quais foram
amostrados 104 touros. Com relação à vocação, 21 (20,5%) eram produtoras
de leite e 81 (79,5%) de vocação mista leite/corte. O tamanho dos rebanhos,
independente da vocação corte/leite, variou entre 11 e 1.500 cabeças de gado
(média = 339,25 e mediana = 300).
Considerando-se apenas os lotes de animais utilizados para produção
de leite dentro de cada propriedade, o número de cabeças de gado variou entre
11 e 215 animais (média = 56,49 e mediana =26,5).
Das propriedades amostradas, 27 (26,4%) foram consideradas como
constituídas predominantemente por animais europeus leiteiros e 75 (73,5%)
por bovinos de diferentes cruzamentos. Observou-se que em 88 (86,2%)
propriedades os touros eram da raça Nelore ou Gir, e em 14 (13,7%), de raças
européias especializadas em leite (Holandês e Jersey). Todas as propriedades
mantinham seus animais em regime exclusivo de pastejo com suplementação
mineral e concentrados de diversas composições.
Em todas as propriedades as fêmeas eram vacinadas contra brucelose
entre 3 e 8 meses de idade, porém apenas 5 (4,9%) referiram vacinar contra
outras enfermidades da reprodução, como leptospirose, RIB e CDVB-EM.
Nenhuma das propriedades amostradas fazia controle sanitário ou vacinação
para CGB, tricomoníase e leptospirose e ocasionalmente referiram testar
sorologicamente alguns animais para brucelose nos últimos 12 meses.
Com relação à rotatividade de animais nas fazendas, 36 (35,2%)
referiram ter adquirido animais entre uma semana e 3 meses a partir da data
da colheita de lavado prepucial do touro, quatro (3,9%) entre 3 e 6 meses, oito
(7,8%) entre 6 e 12 meses e 54 (52,9%) há mais de 12 meses. Nenhum dos
proprietários referiu enviar animais para leilões e/ou exposições.
5. Resultados
46
Vinte e uma (20,58%) propriedades utilizavam programas de
inseminação artificial para perpetuação de seus rebanhos associada ao
repasse com touros. O restante das 81 (79,5%) fazendas utilizava apenas
touros em sistema de monta natural de maneira continua o ano todo, sendo a
proporção média entre touros e vacas de 1:37,2. Cinqüenta e sete (55,8%) das
propriedades utilizavam piquetes exclusivos para parições (maternidade).
Dos touros amostrados, apenas 34 (32,6%) foram pregressamente
submetidos a exame andrológico e considerados aptos para a reprodução. A
idade média dos touros pesquisados se situou em 49,5 meses. Em 68 (66,6%)
propriedades, os touros utilizados para cobertura das vacas foram comprados
de outra fazenda, sendo que haviam chegado na propriedade onde
permaneciam, em média há 26,5 meses. Em trinta e oito (37,2%) propriedades,
os touros eram mantidos em piquetes exclusivos a maior parte do tempo e em
64 (62,7%) permaneciam o tempo todo em piquetes com vacas. Em 75 (73,5%)
propriedades, os touros chegaram a compartilhar piquetes com outro touro nos
últimos 12 meses.
Com relação ao percentual estimado de fertilidade das fêmeas, 33
(32,3%) proprietários se queixaram da presença de vacas que retornavam ao
cio frequentemente em comparação às restantes do rebanho. Taxas de
concepção menores do que 85% foram referidas por 24 (23,5%) produtores.
Percentual de casos confirmados de abortamentos nos últimos 12 meses,
acima de 2% foram relatados por 27 (26,4%) dos produtores. A maioria não
sabia informar a idade gestacional em que os abortamentos ocorreram. Não
foram registradas, no momento da colheita dos lavados prepuciais dos touros,
presença de fêmeas com endometrites nos rebanhos pesquisados.
Observou-se associação significativa entre positividade para C. fetus
venerealis e dois fatores pesquisados: taxas de concepção inferiores a 85% e
touros que co-habitavam com outros em um período de 12 meses (Tabelas 1 e
2).
Não foram detectadas diferenças significativas entre rebanhos positivos
e negativos para C. fetus subesp. venerealis quando comparados: tamanho
médio dos rebanhos, tamanho médio dos lotes de animais leiteiros, idade dos
touros e proporção touro:vaca.
5. Resultados
47
TABELA 1- Resultados do teste exato de Fisher e estimativas das razões de
chance por ponto (OR) e intervalos com 95% de confiança para
associação entre fatores de risco e positividade para CGB em
rebanhos produtores de leite na região de Presidente Prudente-SP,
2006-2007.
Variáveis
CV+
n(%)
CV-
n(%)
OR IC 95%
p-value
Leite
1(0,98) 20 (19,61)
Sistema de
produção
Corte
5 (4,90) 76 (74,51)
0,7600 0,08393 – 6,882
1,0000
Europeus
1 (0,98) 26 (25,49)
Raças do rebanho
Cruzados
5 (4,90) 70 (68,63)
0,5385 0,06001 – 4,832
1,000
Bos indicus
5 (4,90) 83 (81,37)
Espécie/raça dos
Touros Bos taurus
1 (0,98) 13 (12,75)
0,7831 0,08457 – 7,252
1,0000
Há menos de
12 meses
5 (4,90) 43 (42,16)
Histórico de
ingresso de
animais na
propriedade
Há mais de 12
meses
1 (0,98) 53 (51,96)
6,163 0,6932 – 54,788
0,0970
Inseminação e
repasse
2 (1,96) 19 (18,63)
Sistema de
cobertura Monta o ano
todo
4 (3,92) 77 (75,49)
2,026 0,3450 – 11,902
0,6004
Sim
3 (2,94) 54 (52,94)
Piquete
maternidade não
3 (2,94) 42 (41,18)
0,7778 0,1493 – 4,053 1,0000
Sim
1 (0,98) 33 (32,35)
Touro com exame
andrológico Não
5 (4,90) 63 (61,76)
0,3818 0,04280 – 3,406
0,6607
Sim
2 (1,96) 32 (31,37)
Touro nascido na
fazenda Não
4 (3,92) 64 (62,75)
1,000 0,1738 – 5,755 1,0000
Solitário
4 (3,92) 34 (33,33)
Piquete do touro Conjunto com
as vacas
2 (1,96) 62 (60,78)
3,647 0,6347 – 20,958
0,1921
Sim
2 (1,96) 73 (71,57)
Co-habitação com
outros touros nos
últimos 12 meses
Não
4 (3,92) 23 (22,55)
0,1575*
0,0270 – 0,9169
0,0409
CV(+)- positivo para C. fetus subesp. venerealis; CV(-)- negativo para C. fetus subesp.
venerealis; *- significância estatística
5. Resultados
48
TABELA 2- Associação entre problemas reprodutivos em rebanhos produtores
de leite na região de Presidente Prudente e positividade para
Campylobacter fetus subesp. venerealis , 2006-2007.
Variáveis
CV+
n (%)
CV-
n (%)
OR IC 95%
p-value
Sim 4 (3,92)
29 (28,43)
Presença de vacas
que retornam ao cio
Não 2(1,96) 67 (65,68)
4,621 0.8007 – 26,666
0,0843
< 85% 4(3,92) 20 (19,60)
Taxas de
concepção
> 85% 2(1,96) 76 (74,50)
7,600* 1,297 - 44,522 0,0263
2% 3 (2,94) 24 (23,52)
Abortamentos nos
últimos 12 meses
> 2% 3 (2,94) 72 (70,58)
3,000 0,5670 – 15,874
0,1876
CV(+)- positivo para C. fetus subesp. venerealis; CV(-)- negativo para C. fetus subesp.
venerealis; *- significância estatística
5. Resultados
49
5.2 Comparação entre testes diagnósticos
5.2.1 Comparação entre meios de cultura
Os escores de densidade bacteriana observados diferiram
significativamente entre os meios de cultura pesquisados (Fr=30,540,
p<0,0001). Pelos contrastes detectaram-se diferenças estatísticas entre o ASS
e o ABVB e o ASS e ATSB. Os dados estão sumarizados na Tabela 3.
Observou-se correlação positiva significativa entre escores de turvação
por muco nos fluídos prepuciais e escores de densidade de bactérias
contaminantes apenas para o ABVB. Foram observadas correlações positivas
entre escores de filamentos vegetais e os escores de densidade bacteriana
observados nos meios de ABVB e ATSB. Os respectivos coeficientes de
correlação de Spearman calculados estão descritos na Tabela 4.
5. Resultados
50
TABELA 3- Resultados dos contrastes pelo método de Dunn para escores de
densidade bacteriana observados em três meios de cultura para
isolamento de C. fetus subesp. venerealis, Presidente Prudente,
2006-2007.
Comparação
Diferenças das Soma de
Postos
p-value
ATSB vs. ABVB 20.500 P>0,05
ATSB vs. ASS 60.500 P<0,001
ABVB vs. ASS 40.000 P<0,05
ATSB- ágar tioglicolato de sódio enriquecido com sangue bovino; ABVB- ágar
Brucella suplementado com verde brilhante, ASS- ágar seletivo de Skirrow
(Fr=30,540, p-value < 0,0001)
5. Resultados
51
TABELA 4- Coeficientes de Spearman para correlação entre densidades
bacterianas em três meios de cultura e escores de parâmetros
avaliados no lavado prepucial, Presidente Prudente, 2006-2007.
Coeficiente de correlação de Spearman
(r)
Parâmetro
ATSB ABVB ASS
Turvação - 0,1416 0,8012* 0,1388
Presença de partículas do solo - 0,03121 0,1603 6,664 x 10
9
Presença de filamentos vegetais 0,4943* 0,2855* 0,02906
Urina - 0,1447 - 0,1547 - 0,1328
ATSB- ágar tioglicolato de sódio enriquecido com sangue bovino; ABVB- ágar
Brucella suplementado com verde brilhante, ASS- ágar seletivo de Skirrow; r-
coeficiente de correlação de Spearman, *- correlação significativa ao nível de
5%.
5. Resultados
52
5.2.2 Comparação entre PCR, IFD e cultura microbiológica
No que concerne à comparação entre testes diagnósticos pesquisados,
observou-se concordância considerada quase perfeita para cultura
microbiológica em pelo menos um dos meios de cultura pesquisados e a PCR
(Kappa= 0,847). A concordância entre a IFD e positividade em pelo menos um
dos meios de cultura estudados foi considerada moderada (Kappa = 0,381). A
concordância entre a PCR e a IFD foi considerada moderada (Kappa = 0,485).
Os resultados das análises sobre a concordância dos testes diagnósticos estão
sumarizados nas Tabelas 5 e 6.
5. Resultados
53
TABELA 5- Coeficientes Kappa estimados por ponto e intervalo com 95% de
confiança para concordância entre as técnicas diagnósticas de
PCR, cultura microbiológica e IFD em 104 amostras de lavados
prepuciais de 102 rebanhos leiteiros da região de Presidente
Prudente, 2006-2007.
Comparação Kappa IC95%
Cultura microbiológica x PCR 0,847 0,636 -1,000
Cultura microbiológica x IFD 0,381 0,003 - 0,758
IFD x PCR 0,485 0,061 - 0,909
PCR- Polymerase chain reaction; IFD- imunofluorescência direta
5. Resultados
54
TABELA 6- Comparação entre resultados positivos para isolamentos de C.
fetus subesp. venerealis em três meios de cultura diferentes, PCR e
IFD, Presidente Prudente, 2006-2007.
Amostras positivas
ATSB ABVB ASS PCR IFD
1 - - + - -
2 - - + + +
3 - - + + -
4 + - + + +
5 - - + + -
6 - - + + -
7 + - + + -
8 + - + - -
ATSB- ágar tioglicolato de sódio enriquecido com sangue; ABVB- ágar Brucella
suplementado com verde brilhante, ASS- ágar seletivo de Skirrow; PCR-
Polymerase chain reaction; IFD- imunofluorescência direta.
DISCUSSÃO
6. Discussão
56
6.1 Epidemiologia da CGB em rebanhos leiteiros da região de
Presidente Prudente-SP
As culturas microbiológicas, PCR e IFD resultaram positivas para C.
fetus subesp. venerealis em respectivamente 7,8%, 5,8% e 1,9% das
propriedades pesquisadas. As três modalidades de testes diagnósticos
apresentaram resultados variáveis no que concerne ao percentual de animais
positivos para CGB na região. Estas variações devem ter ocorrido em
decorrência de diferenças entre padrões de sensibilidade e especificidade
inerentes aos testes diagnósticos estudados e que podem influenciar
diretamente no resultado final de um estudo de prevalência (GREINER &
GARDNER, 2000; CANNON, 2001). Em razão disto, adotou-se o critério de
considerar positividade simultânea em no mínimo duas modalidades
diagnósticas aplicadas aos touros dos rebanhos pesquisados visando à
melhoria do grau de confiança nos resultados aferidos. Segundo este critério,
5,8% dos rebanhos possuem touros portadores da CGB.
Os testes diagnósticos que apresentaram melhores resultados para
estimar a prevalência foram a PCR e a cultura microbiológica em razão da boa
concordância entre eles.
A prevalência de C. fetus subesp. venerealis situada em 5,8 % nas
propriedades leiteiras da região de Presidente Prudente é menor do que a
maioria dos percentuais de ocorrências previamente descritos no Brasil
(Quadro 1). Porém, é possível que a prevalência estimada nos diferentes
levantamentos realizados no país esteja superestimada. Esta consideração é
baseada no fato de que algumas das pesquisas descritas, em comparação à
presente pesquisa, foram realizadas com base em rebanhos que já
apresentavam problemas reprodutivos, ou se basearam em demanda por
diagnósticos laboratoriais para rebanhos com problemas de infertilidade
(COSTA, 1976; JESUS et al., 1999; GENOVEZ et al., 1993; LAGE et al., 1997;
STYNEN et al., 2003), sendo esperado um percentual mais elevado de
rebanhos e animais positivos. Ainda contribui para uma estimativa elevada o
fato de que algumas destas pesquisas utilizaram a técnica laboratorial para
diagnóstico baseada em aglutinação muco-cérvico vaginal para vacas, que
6. Discussão
57
pode levar a resultados falsos positivos em comparação a outros testes
diagnósticos (HOFFER, 1981).
Apesar da prevalência relativamente baixa da enfermidade e da
capacidade limitada da mesma de se difundir pelos rebanhos locais que não
por via venérea, há de se considerar que a CGB está presente em rebanhos
leiteiros da região de Presidente Prudente, podendo apresentar o risco de
expandir-se e em razão do reaquecimento do comércio de bovinos leiteiros na
região, fomentada pela atual alta nos preços do leite (LEITE, 2007).
Considera-se que, para obter máxima sensibilidade das provas
diagnósticas baseadas em isolamento de C. fetus subesp. venerealis do
prepúcio de touros, são necessárias três colheitas seriadas do mesmo animal
em intervalos mínimos de 1 a 2 semanas, sendo que durante este período, o
macho deve permanecer em repouso sexual (PELLEGIN, 1999). Na presente
pesquisa, não foi possível estabelecer esta estratégia, uma vez que os
proprietários necessitavam dos touros para cobertura das vacas. Assim é
possível que a prevalência estimada seja ainda superior aos 5,8% aferidos.
A probabilidade de existirem animais positivos no estado de São Paulo,
em comparação a outros estados, é relativamente baixa. A maioria dos
levantamentos realizados no estado paulista detectou prevalências inferiores a
10% (CASTRO et al., 1967, CASTRO et al., 1971), considerando os trabalhos
que utilizaram amostragem probabilística para selecionar as propriedades
participantes.
Em outros estados, a prevalência estimada para CGB tem sido bastante
elevada em comparação à observada na presente pesquisa. Em estudos
conduzidos Ramos e Guida, 1978, que pesquisaram 4.092 mucos vaginais de
251 propriedades agropastoris situadas no estado do Rio de Janeiro, a
prevalência estimada foi de 53,38% para C. fetus subesp. venerealis. Estes
autores não discriminaram quais propriedades eram de corte ou leite.
Em estudos mais recentes, Jesus et al., 1999, aferiram que 95,2% de 21
propriedades situadas nos estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro foram
positivas para CGB, no entanto, as mesmas apresentavam muitos problemas
da esfera reprodutiva, como abortamentos, repetições de cio, retenção de
placenta e endometrites, o que aumentou a probabilidade de detectarem
resultados positivos. Ainda com relação ao mesmo trabalho, os pesquisadores
6. Discussão
58
aferiram que 39,1% dos touros testados eram positivos aos testes de
isolamento bacteriano.
Na Bahia, Costa, 1976, refere 66,8% de positividade ao teste de
mucoaglutinação vaginal em 148 vacas pertencentes a 10 diferentes lotes de
animais. Este autor não referiu se os lotes eram de gado de leite ou corte.
Em 157 bovinos leiteiros de nove rebanhos com problemas reprodutivos
da região de Varginha, Minas Gerais, pesquisados por aglutinação muco-
cérvico vaginal, Stynen et al., 2003, referem 25,5% de prevalência para CGB,
diferindo dos resultados da presente pesquisa, apesar dos autores terem
estudado apenas animais com desordens reprodutivas.
Discrepâncias entre resultados de diferentes regiões são perfeitamente
esperadas para a CGB, pois a difusão da enfermidade depende dos manejos
zoosanitário e reprodutivo empregados em cada local (McFADDEN et al.,
2004). No Brasil este fato foi comprovado por Jesus et al., 1999, que
detectaram diferenças estatísticas significativas entre os percentuais de
positividade estudados para o estado de Minas Gerais e Rio de Janeiro.
Em algumas regiões do país, como o Pantanal, Mato Grosso do Sul, a
existência de grandes rebanhos de corte criados de forma extensiva parece
favorecer a ocorrência da enfermidade, como referem Pellegrin et al., 2002,
que detectaram prevalência de 89,5% para propriedades e de 52,3% para
touros, utilizando como diagnóstico a imunofluorescência direta para C. fetus
subesp. venerealis. Neste estudo, baseado em amostragem probabilística, a
prevalência foi bastante superior a da presente pesquisa, indicando que
rebanhos de corte criados em grandes extensões de áreas agropastoris estão
aparentemente mais sujeitos a disseminação da enfermidade.
Diferenças na prevalência da CGB em gado de leite e corte podem
ocorrer em decorrência das práticas de manejo a que os animais são
submetidos. Em animais leiteiros, o manejo intenso permite o
acompanhamento mais freqüente de parâmetros reprodutivos, o que leva o
criador a fazer intervenções mais freqüentes no rebanho, como descarte de
touros e vacas com desempenho reprodutivo insatisfatório, o que tende a
diminuir a probabilidade dos animais de se exporem ao agente. Em
contrapartida, grandes contingentes de bovinos de corte, criados em grandes
áreas agropastoris sob condições extensivas e sem monitoramento freqüente
6. Discussão
59
de parâmetros reprodutivos, podem propiciar a difusão silenciosa da
enfermidade.
No presente estudo, C. fetus subespécie fetus não foi detectado nos
lavados prepuciais dos touros. Este microrganismo está presente no trato
intestinal de muitos mamíferos domésticos, inclusive no dos bovinos (INGLIS et
al., 2003), e pode, raramente, provocar abortamentos nesta espécie (GIORGI
et al., 1986; BONDURANT, 2005). Na presente pesquisa, apesar de algumas
das amostras de lavado prepucial conter filamentos vegetais sugestivos de
material fecal, sua presença na cavidade prepucial não foi confirmada pelos
testes da PCR e daa cultura microbiológica.
A co-habitação com ovinos pode ser um fator de risco para que bovinos
se infectem pela subespécie C. fetus subesp. fetus (McFADDEN et al., 2004).
Comparativamente aos bovinos, os ovinos são muito mais suscetíveis à
infecção do trato genital pelo C. fetus subesp. fetus (FENWICK et al., 2000).
Esta subespécie apresenta vantagens competitivas sobre C. fetus subesp.
venerealis por ser capaz de colonizar um espectro maior de hospedeiros (VAN
BERGEN et al., 2005-c). Ela pode ser confundida com C. fetus subesp.
venerealis em muitos testes diagnósticos, principalmente se forem baseados
em sorologia (McFADDEN et al., 2004). Vale ressaltar que na presente
pesquisa não observou-se a presença de ovinos em pastejo conjunto com os
bovinos de leite.
Apesar das duas subespécies de C. fetus poderem reagir cruzadamente
no teste de IFD (MELLICK et al., 1965, RUCKERBAUER et al., 1974), é
improvável que os dois resultados positivos na IFD, observados na presente
pesquisa, sejam decorrentes deste fato. Pela observação da Tabela 6, nota-se
que em ambos os casos, a positividade a IFD foi acompanhada de resultados
positivos para a subespécie venerealis em outros testes.
Não foi possível, na presente pesquisa, em ordem aos custos elevados e
interferência com a rotina de manejo dos animais nas fazendas pesquisadas,
proceder à investigação das fêmeas provenientes das propriedades positivas
para C. fetus subesp. venerealis. É possível que uma fração das mesmas seja
portadora do agente infeccioso, que pode persistir por longos períodos no trato
genital de fêmeas infectadas (HOFFER, 1981). A avaliação de fêmeas
procedentes de rebanhos cujo macho é portador de C. fetus subesp. venerealis
6. Discussão
60
pode auxiliar na investigação epidemiológica para caracterizar a CGB em lotes
fechados de animais.
Não foram detectadas, na presente pesquisa, associações estatísticas
significativas entre positividade para C. fetus subesp. venerealis e os seguintes
fatores: raça ou espécie do rebanho ou dos touros, sistema de cobertura,
vocação da unidade de produção (mista ou leite), segregação de touros em
piquetes, utilização de piquete em separado para parição (piquete
maternidade), utilização de touros com exame andrológico, utilização de touros
comprados, ingresso de bovinos na propriedade há menos de 12 meses,
presença de vacas que retornam ao estro no rebanho e taxas de abortamentos
anuais maiores do que 2%. Apesar destes fatores não terem sido associados
estatisticamente à ocorrência da enfermidade, o percentual de 5,8% observado
na presente pesquisa pode ter contribuído para diminuir a sensibilidade do
teste estatístico utilizado (teste exato de Fisher), sendo possível que as
variáveis com tendências a significância possam ser associadas à CGB se
números amostrais maiores forem investigados.
Os touros que não co-habitavam com outros nos últimos 12 meses
apresentaram positividade ao C. fetus subesp. venerealis na PCR
significativamente maior do que touros que permaneceram em co-habitação
(Tabela 1, OR = 0,1575). Este fato pode ser explicado pelo manejo utilizado
nas propriedades pesquisadas. A maioria delas utilizava apenas um touro para
cobertura de suas vacas. Esses touros, que solitariamente cobriam as vacas,
devem ter permanecido em atividade sexual intensa e prolongada o ano todo e,
provavelmente, se expuseram de maneira mais intensa ao agente infeccioso, o
que é considerado um fator de risco importante para a ocorrência da
enfermidade (CIPOLLA et al., 1994).
Há de se considerar que mesmo os touros que co-habitam juntos podem
entrar em contato entre si, mas isto só favorece a disseminação da
enfermidade se houver possibilidade de ingresso do agente pelo orifício
prepucial por meio de material contaminado e a fresco, como cama e excretas
(DUFTY, 1975) e de maneira relativamente rápida em decorrência da
fragilidade da bactéria às adversidades ambientais (FERNÁNDEZ et al., 1985).
Este fato pode até ocorrer em centrais de coleta de sêmen, onde os animais
são intensamente manejados e podem entrar em contato uns com os outros
6. Discussão
61
em piquetes ou baias com espaços relativamente limitados, mas é improvável
que possa ocorrer nos animais das fazendas estudadas na presente pesquisa,
pois em nenhuma delas foram observados bovinos machos em espaços
pequenos ou em baias. Ao contrário, todos os animais eram mantidos em
áreas pastoris abertas e secas, sendo ocasionalmente encaminhados a currais
para algum tipo de manejo.
Destaca-se na presente pesquisa que duas das propriedades avaliadas,
positivas para C. fetus subesp. venerealis, utilizavam sistema de inseminação
artificial seguida de repasse (Tabela 1). A inseminação artificial, conjuntamente
com o tratamento dos touros infectados, vacinação do rebanho contra a CGB,
uso de touros virgens e descarte de animais infectados, tem sido preconizada
como uma das formas eficazes de prevenir e conter a disseminação da
enfermidade (LEITE et al., 1980; HOFFER, 1981). Os touros de repasse, em
geral, por serem destacados para cobertura de vacas previamente com
problemas de fertilidade, são animais que se infectam facilmente com o agente
infeccioso, transmitindo-o sequencialmente para as fêmeas e disseminando a
CGB no rebanho. Quando infectados, estes touros podem, inclusive, anular os
benefícios que um programa de inseminação artificial traria para prevenção da
CGB em um rebanho leiteiro (STYNEN et al., 2003).
Na presente pesquisa, rebanhos com taxas de concepção estimadas
como abaixo de 85% apresentaram 7,6 vezes mais chances de positividade
para C. fetus subesp. venerealis do que rebanhos com taxas de concepção
iguais ou superiores a este valor (OR=7,6). O valor de 85% foi utilizado como
referência por que é considerado como o mínimo esperado para classificar
bovinos como dentro dos padrões normais de eficiência reprodutiva
(JUNQUEIRA e ALFIERI, 2006). É bastante provável que esta associação
detectada na presente pesquisa seja fruto da presença do C. fetus subesp.
venerealis nos rebanhos estudados. Os touros positivos devem ter transmitido
o agente para as vacas por monta natural, e estas, cronicamente infectadas,
eventualmente conceberam, mas com uma tendência detectável ao aumento
de intervalos entre partos, o que é perfeitamente esperado quando
enfermidade está presente em rebanhos bovinos (LEITE et al., 1980).
Na presente pesquisa observou-se rebanhos cujo touro foi positivo para
C. fetus subesp. venerealis, mas que apresentavam taxas de fertilidade, de
6. Discussão
62
retorno ao estro e abortamentos dentro dos parâmetros considerados
economicamente sustentáveis para os padrões nacionais. Este fato é esperado
para rebanhos em que a enfermidade tenha ingressado há algum tempo e se
tornado endêmica, possivelmente provocando taxas de concepção e fertilidade
subótimas e que passam despercebidas por um exame menos minucioso
(HOERLEIN et al., 1964).
Não foi detectada associação estatística entre rebanhos com fêmeas
repetidoras de estro e positividade para C. fetus subesp. venerealis, sendo
observada apenas uma tendência à significância (p-value=0,0843). Em tese, na
presente pesquisa, proporções elevadas de repetições de estro deveriam ser
uma tendência que acompanha as baixas taxas de concepção pesquisadas,
pois é reconhecido o potencial da bactéria de diminuir a capacidade de
implantação de embriões recém-concebidos (WARE, 1980). Possivelmente o
percentual de 5,8% de animais positivos não foi suficiente para conferir
sensibilidade ao teste estatístico, apesar da tendência observada. Há também
a probabilidade dos dados a respeito das estimativas de retorno ao estro,
obtidos durante as entrevistas com os criadores, terem apresentado algum
grau de inconsistência, pois a observação do período de cio nas fêmeas
bovinas é influenciada por diversos fatores que podem tornar esta atividade
subjetiva (ÁVILA PIRES et al., 2003; GALINA e ORIHUELA, 2007).
Não foram observadas diferenças entre os percentuais de abortamentos
nos últimos 12 meses, entre propriedades positivas e negativas ao agente
infeccioso (p-value=0,1876), apesar das baixas taxas de concepção
observadas para rebanhos positivos. Ao contrário das observações sobre o
retorno ao estro, os abortamentos são incomuns na CGB, ocorrendo de
maneira mais proeminente entre o 4 e 6
o
mês de gestação (HOFFER, 1981).
Abortamentos por C. fetus subesp. venerealis ocorrem nos rebanhos leiteiros
do estado paulista, mas em pequeno percentual em comparação a outras
enfermidades infecciosas (GENOVEZ et al., 1993). Na presente pesquisa, a
indisponibilidade e a imprecisão de dados relacionados à idade gestacional das
vacas que abortaram e às condições dos fetos abortados nos rebanhos
pesquisados não permitiram um estudo mais apurado deste problema.
Observou-se, apesar de não significante (p-value=0,0970), uma
tendência à ocorrência de positividade para C. fetus subesp. venerealis em
6. Discussão
63
propriedades onde ingressaram animais, por compra ou empréstimo, há menos
de 12 meses. Este fato pode ser relevante, uma vez que a introdução de
animais portadores sadios do microrganismo é, possivelmente, a forma mais
comum de ingresso da CGB em um rebanho. Soma-se a isso a possibilidade
dos animais ingressos nas propriedades terem sido touros emprestados entre
propriedade diferentes para cobertura de vacas, fator considerado de risco para
a perpetuação da enfermidade entre rebanhos (GENOVEZ, 1997).
Nenhuma das propriedades pesquisadas referiu vacinar contra a CGB.
As vacinas contra esta enfermidade, disponíveis no Brasil, são comercializadas
em formulações polivalentes associadas com outros antígenos e quando
utilizadas para touros positivos podem funcionar como estimulantes específicos
da imunidade que levam ao desaparecimento do C. fetus subesp. venerealis da
cavidade prepucial dos touros (LEITE et al., 1980).
Os resultados da análise estatística observados para diferentes fatores
de risco e transtornos reprodutivos observados para enfermidade reiteram a
importância dos machos como fontes de infecção dentro de rebanhos leiteiros.
Desde que os touros estejam infectados, eles podem ocasionar reflexos
negativos no desempenho reprodutivo das vacas, sendo os mais perceptíveis,
os relacionadas às baixas taxas de concepção. Em decorrência disso, há a
necessidade de monitoramento constante de parâmetros que refletem a
fertilidade do rebanho para auxiliar na detecção e prevenção da CGB em
rebanhos leiteiros.
6.2 Comparação entre meios de cultura
Na presente pesquisa, a densidade de contaminantes nos três meios de
cultura estudados diferiu significativamente (Tabela 3). O meio seletivo de
Skirrow apresentou os melhores resultados, com escores de densidades
significativamente menores que os outros meios. Estes dados concordam com
as observações de Monke et al., 2002, que classificaram este meio como
sendo um dos que apresentam menor concentração de microrganismos
contaminantes na superfície quando utilizado para diagnosticar C. fetus
subesp. venerealis a partir de amostras de lavado prepucial de touros.
Considerando-se que uma quantidade menor de contaminantes significa uma
6. Discussão
64
maior acuidade dos testes diagnósticos, este meio pode ser indicado para
cultura primária de lavados prepuciais de touros.
O ágar seletivo de Skirrow também foi o que apresentou o maior índice
Kappa de concordância (Tab. 5) com a PCR em relação aos outros.
Considerando-se que a PCR apresenta sensibilidade e especificidade muito
superior á cultura microbiana (ON, 1996), pode-se afirmar que o meio de
cultura em questão proporcionou resultados muito bons.
Soma-se aos resultados acima descritos, o fato de que o ágar seletivo
de Skirrow foi o único que não apresentou correlações positivas com quaisquer
dos parâmetros físicos do lavado prepucial indicativos de possíveis fontes de
contaminação endógenas e exógenas (Tabela 4).
Apesar disso, este meio pode apresentar problemas relacionados ao uso
de antibióticos aos quais C. fetus subesp. venerealis pode ser sensível, como é
o caso da polimixina B (BALLABENE e TERZOLO, 1992). No Brasil, estirpes
sensíveis à polimixina B já foram descritas, mas paradoxalmente foram
isoladas em meios contendo esta base antibiótica (VARGAS et al., 2005). A
concentração de polimixina B nas bases seletivas adicionadas ao meio de
Skirrow, na presente pesquisa, possivelmente se situou em patamares
inferiores a concentração inibitória mínima para o microrganismo, permitindo
assim seu isolamento.
Os meios de cultura que utilizam bases antibióticas seletivas para C.
fetus são amplamente empregados para isolamento primário deste agente
infeccioso (DUFTY, 1967, SKIRROW, 1977, CLARK e DUFTY, 1978, LANDER,
1990-a, LANDER, 1990-b). Mesmo com o advento de técnicas mais precisas
como o PCR, eles são indispensáveis para obter células viáveis de C. fetus
subesp. venerealis, importantes para realização de testes de sensibilidade
antimicrobiana. A busca por bases seletivas capazes de inibir contaminantes
deve ser sempre consubstanciada com testes de sensibilidade dos agentes, o
que só é possível se os mesmos forem isolados em cultura pura.
O ABVB, empregado para isolamento dos microrganismos na presente
pesquisa, apresentou os piores resultados, com índice Kappa nulo, em
comparação à PCR. Ao que tudo indica, as estirpes de C. fetus subesp.
venerealis presentes nos lavados prepuciais não foram tolerantes à
concentração de verde brilhante adicionada ao ágar base Brucella (50 µg/ ml).
6. Discussão
65
Uma possível explicação para este fato é que o gênero Campylobacter é
menos tolerante ao verde brilhante quando inoculado no meio de ágar Brucella
do que em outros tipos de bases (ON e HOLMES, 1991-a). Mesmo com esses
problemas, o verde brilhante tem sido utilizado com sucesso associado a
outras bases microbiológicas para isolamento de C. fetus subesp. venerealis a
partir de amostras de esmegma de touros infectados pelo microrganismo
(MODOLO et al., 2000). Isto pode significar que há variação quanto à
sensibilidade da bactéria ao verde brilhante e mais pesquisas devem ser feitas
com relação ao seu uso como suplemento seletivo para C. fetus subesp.
venerealis. Em razão disto, na região de Presidente Prudente, não se
recomenda o uso do verde brilhante em associação com o ágar Brucella em
razão da possibilidade das estirpes que ocorrem nos rebanhos serem sensíveis
a esse corante.
Outra desvantagem observada para o ABVB é que, na presente
pesquisa, ele não foi capaz de suprimir ou diminuir o crescimento de
microrganismos contaminantes em função da presença de turvação aparente e
presença de filamentos vegetais no lavado prepucial (tabela 4). A turvação
observada nos lavados prepuciais é decorrente da presença de células
descamadas no epitélio peniano, muco produzido pelas glândulas locais e
microrganismos saprofíticos. Os filamentos vegetais observados no lavado
prepucial estão presentes em decorrência da contaminação da cavidade
prepucial por fibras vegetais do ambiente ou por partículas fecais contendo
estas fibras. O ABVB não apresentou impediência adequada para limitar os
microrganismos contaminantes oriundos destas fontes, não agindo, portanto,
como força oposta ao seu crescimento.
Na presente pesquisa, o ATSB mostrou-se eficaz na recuperação de
alguns dos agentes infecciosos. Possivelmente os efeitos redutores do
tioglicolato de sódio (VAN DER WALT, 1987) favoreceram o crescimento de C.
fetus subesp. venerealis. Apesar disso, não apresentou boa impediência
quando o lavado prepucial possuía muitas fibras vegetais (Tabela 4),
possivelmente oriundas de fezes ou do ambiente, indicando o que o meio
seletivo de Skirrow ainda é o melhor dos meios presentemente pesquisados.
Considerando-se que as partículas de fibras vegetais presentes nas
amostras de lavado prepucial influenciaram a presença de contaminantes em
6. Discussão
66
dois dos meios de cultura pesquisados, há a necessidade de observar a
qualidade dos fluídos encaminhados aos laboratórios de microbiologia. Estas
partículas vegetais podem ser oriundas de material fecal ou do ambiente que
podem ingressar através do orifício prepucial. Quando presentes deve ser
considerado o descarte do material colhido ou priorizar o uso de meios
seletivos com antibióticos impedientes para semeá-lo. O mesmo pode ser
recomendado para amostras que se apresentam demasiadamente turvas
devido à presença de muco prepucial.
Desde que nos meios de cultura inoculados com os lavados prepuciais
ocorra mínima contaminação, cerca de 90% dos touros positivos podem ser
identificados com uma única amostra (DUFTY, 1967; HUM et al., 1994), o que
reitera a necessidade do uso de antibióticos seletivos em meios de cultura para
Campylobacter objetivando o isolamento do agente infeccioso.
6.3 Comparação entre PCR, cultura microbiológica e
Imunofluorescência direta
O teste de reação de polimerase em cadeia, utilizando a seqüência 23S
do DNA ribossomal de C. fetus subesp. venerealis, mostrou-se, na presente
pesquisa, uma técnica factível de ser empregada em animais a campo
expostos ao agente da CGB. Na presente pesquisa ela foi capaz de identificar
5,8% de touros portadores de C. fetus subesp. venerealis. As culturas
microbiológicas, considerando-se a obtenção de C. fetus subesp. venerealis
em pelo menos um dos meios de cultura pesquisados, resultaram em 7,8% das
amostras positivas. O índice Kappa entre cultura microbiológica e PCR foi de
0,847, considerado muito bom.
Observaram-se coeficientes Kappa de concordância entre a IFD e os
outros testes classificados apenas como moderados (tabela 5). As duas únicas
amostras positivas na IFD também foram positivas na PCR e cultura
microbiológica, indicando que podem ter ocorridos problemas que levaram os
supostos resultados falsos negativos.
A IFD é uma técnica que depende essencialmente da qualidade da
amostra remetida ao laboratório. Ao contrário da PCR, que utiliza DNA
6. Discussão
67
purificado, e da cultura microbiológica, que prima pelo uso de meios de cultura
com impedientes seletivos, a IFD utiliza apenas as técnicas de centrifugações
para remover os debris celulares presentes nos lavados prepuciais. Partículas
bacterianas envolvidas por restos celulares remanescentes podem passar
despercebidas durante a leitura das lâminas. Há também a possibilidade de
resultados negativos em amostras com concentrações bacterianas inferiores a
10
1
unidades formadoras de colônias por mililitro de lavado prepucial
(FIGUEIREDO et al., 2002) e a necessidade de certo treinamento por parte dos
leitores para classificar corretamente as amostras estudadas (WINTER et al.,
1967).
Apesar do desempenho da IFD na presente pesquisa não ter ser
satisfatório em comparação aos outros testes, o número reduzido de amostras
positivas aferidas nos rebanhos pesquisados não fornece informações
suficientes para desconsiderar seu uso como ferramenta diagnóstica e de
pesquisa sobre a CGB. Leva-se em conta também que a IFD é um teste
comumente utilizado por diversos países que buscam diagnosticar a CGB
(VAN BERGEN et al., 2005-b) e a rapidez com que pode ser executada
imprime vantagens sobre testes mais demorados como a cultura bacteriológica.
As duas amostras positivas na cultura e negativas a PCR podem ter
ocorrido em razão de resultados falsos positivos na cultura ou falsos negativos
na PCR. Em comparação à cultura, a PCR é considerada um teste de ótimo
limiar de detecção, sendo capaz de acusar positividade entre 3 e 10
2
UFC/ mL
de C. fetus subesp. venerealis (EAGLESOME et al., 1995; STYNEN, 2000). Ela
também possui boa especificidade, desde que se utilize para amplificação na
reação, seqüências de oligonucleotídeos específica.
A PCR ainda apresenta como vantagens sobre as culturas
microbiológicas o uso de controles positivos confiáveis baseados em estirpes
padronizadas e a simplicidade na interpretação de resultados Em vista disso,
há motivos para crer que as duas bactérias classificadas como C. fetus subesp.
venerealis em duas amostras negativas na PCR, na presente pesquisa, sejam
microrganismos de outras espécies e que propiciaram resultados falsos
positivos nos testes fenotípicos desenvolvidos, o que levou à exclusão das
mesmas das análises estatísticas efetuadas.
6. Discussão
68
As reações de amplificação de cadeias de DNA têm sido muito utilizadas
para confrontar diagnósticos microbiológicos com classificação por biologia
molecular em se tratando de C. fetus subesp. venerealis. Classificações
equivocadas de C. fetus baseadas em caracterização fenotípica são descritas
com freqüência em diversas pesquisas que utilizaram técnicas de biologia
molecular para comprovação da espécie. Vargas et al., 2003, aferiram que os
testes de classificação bioquímica concordam com o de biologia molecular para
C. fetus em 90,9% das vezes. Hum et al., 1997, detectaram concordância de
82,7% entre estes mesmos testes aplicados a 99 amostras suspeitas de serem
C. fetus, sendo as espécies C. sputorum e C. hyointestinalis as mais
frequentemente confundidas. Em outros estudos, Wagenaar et al., 2001,
relataram sete de 54 estirpes de C. fetus subesp. fetus classificadas por testes
de PCR, que haviam sido previamente classificadas com base em testes
fenotípicos como C. fetus subesp. venerealis.
Mesmo com boa margem de vantagens em relação à cultura
microbiológica, a PCR pode eventualmente falhar em decorrência da natureza
da amostra colhida. Sais biliares, produtos de degradação de hemoglobina,
complexos polissacarídeos, compostos fenólicos oriundos de tecidos vegetais,
partículas de solo e urina podem inibir a reação de PCR, principalmente por
prejudicar a ação da enzima Taq DNA-polimerase (MILLER et al., 1999;
WIDJOJOATMODJO et al., 1992; MONTEIRO et al., 1997; KOONJUL et al.,
1999; BRINKMAN et al., 2004). Nos lavados prepuciais colhidos dos animais
da presente pesquisa, alguns desses materiais estranhos capazes de interferir
nos testes de biologia molecular estavam presentes nos lavados prepuciais,
mas é improvável que eles tenham prejudicado a PCR em razão dos
procedimentos de extração de DNA baseados em colunas de purificação,
considerados os melhores para purificação de amostras contaminadas por
urina e solo (MILLER et al., 1999; BERGALLO et al., 2006).
Variações nas técnicas de amplificação das cadeias de DNA de C. fetus
surgiram nos últimos anos visando, inclusive, a aumentar sua especificidade e
sensibilidade. A técnica que emprega oligonucleotídeos simultâneos de C. fetus
subesp. fetus e C. fetus subesp. venerealis (multiplex PCR) tem sido utilizada
com sucesso para diferenciar as duas subespécies (HUN et al., 1997).
6. Discussão
69
Outra variação bastante sensível é a PCR em tempo real (real-time
PCR) que, teoricamente, é capaz de detectar e quantificar DNA de uma única
célula bacteriana de C. fetus (McMILLEN et al, 2006).
As técnicas de biologia molecular são, até o momento, as melhores
ferramentas para diferenciar entre as subespécies e espécies de
Campylobacter. Além da PCR, existem alternativas, tais como caracterização
de polimorfismo de fragmentos amplificados de DNA das subespécies (VAN
BERGEN et al., 2005-c), sequenciamento de genes (VAN BERGEN et al.,
2005-a), hibridização de DNA (ROOP et al., 1984) e ribotipagem (DENES et al.,
1997), porém são tidas como mais trabalhosas que a primeira, sendo mais
indicadas para pesquisas com epidemiologia molecular do que para rotina
diagnóstica.
Há ainda técnicas para classificação pouco utilizadas, como as
baseadas em sorotipagem (PEREZ-PEREZ et al., 1986,) e análise de ácidos
graxos celulares (BLASER et al., 1980).
A possibilidade de resultados falsos positivos nas culturas microbianas,
observados na presente pesquisa, podem ter ocorrido por diversos fatores.
Uma possibilidade é a classificação errônea de outras espécies de
Campylobacter como sendo C. fetus subesp. venerealis em decorrência de
resultados falsos positivos e negativos nos testes bioquímicos utilizados. Um
agente comumente confundido com a subespécie venerealis é a subespécie
fetus. Ambas são geneticamente muito similares (VAN BERGEN et al., 2005-a),
e quando isoladas da cavidade prepucial de touros, podem ser facilmente
confundidas entre si, quando identificadas exclusivamente por testes baseados
no seu comportamento bioquímico.
Os dois testes bioquímicos mais aplicados para diferenciar as
subespécies são a tolerância a 1% de glicina (OMSA, 2004) e a resistência a
cefoperazona (ON, 1996). Apesar de amplamente utilizado por laboratórios de
microbiologia, o teste de tolerância à 1% de glicina pode apresentar limitações,
como presença de estirpes mutantes de C. fetus subesp. venerealis tolerantes
a este aminoácido (CHANG e OGG, 1971) ou ainda, estirpes de C. fetus
subesp. fetus incapazes de crescer em sua presença (WAGENAAR et al.,
2001). O teste de sensibilidade à cefoperazona pode eventualmente falhar nos
6. Discussão
70
casos em que as estirpes de Campylobacter isoladas forem resistentes a este
antimicrobiano.
Uma outra espécie comumente confundida com C. fetus subesp.
venerealis é C. sputorum, que pode estar presente na cavidade prepucial de
touros (OYARZABAL et al., 1997). Esta espécie não é amplificada pelos
inicializadores utilizados na presente pesquisa (STYNEN, 2000), nem é
detectada pelo teste de IFD (FIGUEIREDO et al., 2002), mas pode ser
confundida nos testes bioquímicos com C. fetus subesp. venerealis por que
apresenta como diferencial apenas as provas de catalase e produção de H
2
S
em meio TSI (Quadro 2 e 3), que podem ser subjetivamente interpretadas (ON
e HOLMES, 1991-b).
A confusão entre as espécies de Campylobacter, durante sua
caracterização fenotípica, pode ocorrer em função de artefatos técnicos, como
preparo do inóculo para semeadura nos painéis de testes bioquímicos. Inóculos
equivalentes a 10
7
-10
8
unidades formadoras de colônia por mililitro utilizados
para testes de tolerância ou para caracterização de suscetibilidade a
antibióticos podem propiciar resultados falsos positivos (ON e HOLMES, 1991-
a). Na presente pesquisa, procurou-se utilizar inóculos que correspondiam à
escala um de Mac Farland para classificação fenotípica dos microrganismos.
No entanto, pela natureza do meio de Tarozzi, que nem sempre apresenta-se
translúcido na observação direta, é possível que inóculos mais ou menos
carregados tenham sido utilizados, propiciando resultados falsos positivos e
falsos negativos. Isto pode comprometer inclusive os testes baseados na
atividade enzimática de Campylobacter que possuem boa reprodutibilidade,
tais como hipuricase, oxidase, catalase e urease (ON e HOLMES, 1992).
Outra possibilidade para explicar uma possível classificação equivocada
de Campylobacter, na presente pesquisa, é a baixa reprodutibilidade dos testes
empregados para caracterização fenotípica baseados em efeitos inibitórios de
algumas substâncias. A classificação de Campylobacter, ao contrário de muitos
dos gram-negativos que possuem capacidade sacarolítica, é baseada na
tolerância e resistência a determinadas substâncias. Fatores como idade das
culturas, formulações dos meios de classificação e condições atmosféricas em
que os meios são incubados podem propiciar resultados errôneos no momento
de julgar a presença e a ausência de crescimento nos meios de classificação
6. Discussão
71
(ON e HOLMES, 1991-b). Soma-se a este fato a característica fastidiosa e
exigente em termos de nutrientes para se desenvolver nos meios de cultura.
Na presente pesquisa, nem sempre foi possível preparar inóculos a partir de
culturas com idades similares, pois os testes eram realizados em baterias para
evitar desperdício de tempo e material.
Apesar dos problemas decorrentes da identificação fenotípica de C.
fetus, a cultura bacteriana, na presente pesquisa, foi suficiente para classificar
as propriedades positivas para a infecção, apresentando concordância
satisfatória com a PCR, se considerado o meio seletivo de Skirrow como
ferramenta de isolamento primário. A cultura microbiológica ainda é um dos
métodos mais utilizados pelos laboratórios que visam ao diagnóstico de C.
fetus subesp. venerealis em rebanhos com suspeita da infecção (VAN
BERGEN et al., 2005-b), sendo indispensável por permitir que as estirpes
isoladas sejam submetidas a testes de sensibilidade antimicrobiana e
epidemiologia molecular. Recomenda-se, em razão destes fatos, que seu uso
seja complementado com testes de biologia molecular para comprovação final
da espécie.
CONCLUSÕES
7. Conclusões
73
Com base nos resultados do presente trabalho conclui-se que a CGB
está presente em touros da região de Presidente Prudente-SP, sendo
associada à diminuição de fertilidade nos rebanhos a que pertencem. Para
diagnosticá-la, culturas microbiológicas podem ser empregadas ou a PCR,
existindo boa concordância entre ambas. Considerando-se as técnicas para
isolamento bacteriológico, o meio seletivo de Skirrow, em comparação ao
tioglicolato de sódio e o ágar Brucella verde brilhante apresenta os melhores
resultados.
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Trabalho científico a ser enviado
para a revista Arquivos do
Instituto Biológico
Trabalho Científico
88
Ocorrência e fatores de risco para campilobacteriose genital bovina em touros do
município de Presidente Prudente-SP
Occurrence and risk factors for genital bovine campylobacteriosis in bulls from
Presidente Prudente region, São Paulo State
Rogerio Giuffrida
I
, Andrey Pereira Lage
2
, José Rafael Modolo
3
1
Doutorando em Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar - FMVZ/UNESP -
Botucatu/SP.
2
Prof. Dr. Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais – Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva.
3
Professor Adjunto da Disciplina de Planejamento de Saúde Animal e Veterinária Preventiva.,
Orientador do Pós-graduando - FMVZ/UNESP - Botucatu/SP.
RESUMO
Para verificar os potenciais fatores de risco e problemas reprodutivos para a
campilobacteriose genital bovina (CGB), 104 amostras de lavados prepuciais de touros de
102 rebanhos leiteiros da região de Presidente Prudente, São Paulo, foram avaliadas por meio
de culturas bacteriológicas e reação da polimerase em cadeia (PCR). Durante a colheita das
amostras, informações sobre as condições sanitárias das fazendas foram levantadas. As
amostras de lavados prepuciais foram semeadas em ágar seletivo de Skirrow, ágar verde
brilhante e ágar tioglicolato enriquecido com 20% de sangue bovino. A PCR foi realizada
utilizando-se seqüências de nucleotídeos que amplificam um fragmento de 835 bp do DNA
ribossomal bacteriano. As razões de chances (OR) foram calculadas para os fatores de risco
associados com resultados positivos nos testes. A prevalência da CGB foi estimada em 5,8%
considerando os resultados da PCR e da cultura microbiológica. Associação significativa foi
detectada entre resultados positivos nos testes diagnósticos e rebanhos cujas vacas
I
Endereço para correspondência: Caixa Postal 524. CEP.: 18.618-000, Botucatu-SP.
Endereço Eletrônico: [email protected]
Trabalho Científico
89
apresentavam baixa fertilidade (OR=7,6). Conclui-se que a CGB está presente em rebanhos
leiteiros da região de Presidente Prudente onde é associada com distúrbios reprodutivos.
Palavras-chave:
Campylobacter fetus venerealis
, Presidente Prudente, diagnóstico
ABSTRACT
To verify the potential risk factors and reproductive disorders related to genital
bovine campylobacteriosis (GBC), 104 preputial samples from bulls from 102 dairy herds
from Presidente Prudente, São Paulo State, were evaluated by bacteriological tests and
polymerase chain reaction (PCR) assay. During the preputial sampling, some questions were
made about sanitary conditions of the farms. The preputial samples were plated in Skirrow´s
agar, Brilliant green agar and Thioglycolate agar with 20% of blood. The PCR was
conducted using nucleotides sequences that amplify a fragment with 835 pairs of bases of the
ribossomal DNA. Odds ratios (OR) were calculated to determine the effect of the risk factor
of interest on the outcome of the tests (positive or negative). The prevalence of GBC
according to culture and PCR results was 5,8%. Significant association was detected between
positive results in the diagnostic tests and herds whose cows presented low fertility
(OR=7,6). It concluded that GBC is present in dairy herds of the region of Presidente
Prudente where it is associated with reproductive disturbances.
Key words:
Campylobacter fetus verealis
, Presidente Prudente, Diagnostic methods
Trabalho Científico
90
INTRODUÇÃO
A campilobacteriose genital bovina (CGB) é uma enfermidade infecciosa
transmissível causada pela bactéria
Campylobacter fetus
subespécie
venerealis
e
ocasionalmente por
Campylobacter fetus
subespécie
fetus.
A CGB causa muitos prejuízos
econômicos para a pecuária de leite e corte em decorrência de transtornos reprodutivos em
bovinos, como repetições de estro, diminuição das taxas de concepção em vacas,
endometrites e abortamentos, entre outros. Geralmente se manifesta de forma crônica,
causando subfertilidade nas fêmeas acometidas e causando aumento no intervalo entre partos
(HOFFER, 1981; PELLEGRIN, 1999).
Nos rebanhos em que é endêmica, a CGB é transmitida por monta natural com
touros que portam assintomaticamente e de maneira vitalícia o microrganismo na cavidade
prepucial (DUFTY et al., 1975; FIVAZ et al., 1978). A bactéria também pode estar presente
no trato gastrointestinal de bezerros que a eliminam para o ambiente (MODOLO et al.,
1988), apesar da transmissão por contato com fezes não ter sido comprovada. Entre os
fatores de risco para a ocorrência da infecção nos rebanhos são relatados: utilização de touros
com idade superior a 4 anos para cobertura das vacas, presença de touros sem controle
sanitário para CGB e manejo reprodutivo que emprega monta natural o ano inteiro ao invés
de um período limitado de estação de monta (STOESSEL, 1982).
No Brasil, a CGB foi descrita em diversos estados (CASTRO et al., 1971; COSTA,
1976; GENOVEZ et al., 1989; LAGE et al., 1997; PELLEGRIN et al., 2002; STYNEN et al.,
2003), sendo sua prevalência variável segundo a região pesquisada (JESUS et al.,1999) e em
razão das diferentes práticas de manejo aplicadas aos animais de leite ou corte (McFADDEN
et al., 2004).
Por suas características epidemiológicas de portador do microrganismo, os touros são
os animais de escolha para a realização do diagnóstico da CGB nos rebanhos suspeitos. Os
principais métodos para diagnosticá-la são baseados em técnicas de cultivo bacteriano,
Trabalho Científico
91
biologia molecular como, por exemplo, a amplificação de cadeias de DNA (PCR) e
imunofluorescência direta. Para qualquer uma destas técnicas podem ser empregados, para
obter amostras da cavidade prepucial dos animais, lavados prepuciais com meios
preservantes.
O presente trabalho pretendeu avaliar a ocorrência da CGB em bovinos leiteiros da
região de Presidente Prudente por meio da identificação de
C. fetus
subesp.
venerealis
em
amostras de lavados prepuciais de touros e os possíveis fatores de risco inerentes a sua
ocorrência e sua associação com problemas reprodutivos dos rebanhos.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram estudados 104 touros distribuídos em 102 propriedades que comercializam leite
no município de Presidente Prudente. Os touros foram incluídos na pesquisa pelos seguintes
critérios: a.) possuir mais de 40 meses de idade; b.) estar em regime de monta natural ou ser
utilizado como animal de repasse após inseminação artificial para cobertura exclusiva de
vacas leiteiras; c.) não ter coberto nenhum animal nos últimos sete dias.
Nas propriedades leiteiras participantes, um inquérito na forma de questionário foi
utilizado para avaliar as características sanitárias e problemas reprodutivos. Optou-se por
colher apenas uma amostra por touro, pois existiam dificuldades em realizar colheitas
seriadas em razão da necessidade do repouso sexual prolongado dos animais e interferência
com o manejo reprodutivo das propriedades.
Para diagnosticar a presença de
C. fetus
subesp.
venerealis
nos touros, amostras de
lavado prepucial foram colhidas segundo especificações de LEITE et al., 1995, com algumas
modificações. Após introduzir de 60 a 80 mL de tioglicolato fluído estéril na cavidade
prepucial dos animais com auxílio de um equipo plástico esterilizado, o prepúcio externo foi
massageado por cerca de 3-5 minutos. O lavado obtido foi recolhido em frascos de vidro
estéreis ou em seringas plásticas descartáveis, que foram armazenados a 4
o
C até o momento
do exame.
Trabalho Científico
92
Para semeadura, após centrifugação a 2.500 rotações por minuto (RPM) durante vinte
minutos, o sedimento foi semeado em duplicata em três meios diferentes: ágar base
tioglicolato enriquecido com 20% de sangue bovino desfibrinado; ágar base Columbia
adicionado de suplemento seletivo de Skirrow (sulfato de polimixina B na concentração de
2,5UI/mL, trimetoprim na concentração de 5 µg/mL, vancomicina na concentração de
10µg/mL e ciclohexamida na concentração de 50µg/mL) e ágar base
Brucella
suplementado
com 20% de sangue bovino desfibrinado e com 50 µg/mL de verde brilhante. As placas foram
mantidas a temperatura de 37
o
C, em jarras com ambiente de microaerofilia obtido por
gerador de atmosfera próprio (Microaerobac-Probac®), durante 72 horas.
As colônias bacterianas foram classificadas segundo as chaves taxonômicas descritas
para espécies de
Campylobacter
relevantes para a reprodução de bovinos (OMSA, 2004) e,
ocorrendo dúvidas, segundo chaves classificatórias mais abrangentes (ON, 1996). Foram
utilizados os seguintes testes: produção das enzimas oxidase, catalase, hipuricase e urease;
produção de H
2
S em TSI (triplice sugar iron); tolerância a glicina a 1% e ao cloreto de sódio a
3,5%; capacidade de crescimento a 25º C ou a 43º C, e resistência ao ácido nalidíxico,
cefalexina, carbenicilina e cefoperazona.
Para a extração do DNA, em razão da grande quantidade de materiais estranhos nos
lavados prepuciais, tais como partículas de solo, urina e outros, optou-se pelo uso de kits de
extração de DNA gênomico comerciais (Pure link genomic DNA – Invitrogen ®) baseados
em colunas de purificação. Para amplificação foram empregados indicadores sugeridos por
STYNEN, 2000. Os oligonucleotídeos foram consituídos pelas seguintes bases: FET1 (5’ -
CTC ATA ATT TAA TTG CAG TCA TA - 3’) e 69ar (5’- CTT AGG ACC GTA TAG TTA
– 3’). As reações foram realizadas em um volume total de 25 µl contendo 20 pmol de cada
iniciador, 200µM de cada desoxiribonucleotídeo (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), 10 mM tris-
HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 2,0 mM de MgCl
2
, 1 UI de Taq DNA polimerase e 10 µl do
Trabalho Científico
93
DNA extraído. A mistura foi submetida a um ciclo de 3 minutos a 94
o
C, 30 ciclos de 1 minuto
a 58,1
o
C, 1 minuto a 72
o
C e 1 minuto a 94
o
C e um ciclo final composto de 1 minuto a 58,5
o
C
e 10 minutos a 72
o
C. Para detecção do material amplificado, 10 µl do material obtido foram
submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1% acrescido de 2 µl de brometo de etídeo para
cada 40 mL de gel. Uma cepa de
C. fetus
subesp.
venerealis
NCTC 10354 foi empregada
como controle positivo. Foram consideradas positivas as amostras que permitirem a
visualização no gel, em comparação com marcadores moleculares de 100 pares de base, de
bandas correspondentes a 835 pares de base.
Para fins de comparação, foram considerados portadores da bactéria os touros que
resultaram positivos no teste de PCR e de cultura microbiológica simultaneamente. A
associação de fatores de risco e problemas reprodutivos nos rebanhos com a ocorrência de
touros positivos foi avaliada pelo teste exato de Fisher (CURI, 1997). Adicionalmente, as
razões de chances (Odds Ratio) e respectivos intervalos de confiança foram calculados para
cada um dos fatores pesquisados (KALE et al., 2002). Todas as análises foram efetuadas
utilizando-se o pacote computacional estatístico GraphPad Instat ® 3.0 e ao nível de 5% de
significância.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A prevalência de
C. fetus
subesp.
venerealis
nas propriedades amostradas,
considerando-se os resultados positivos simultâneos da PCR e da cultura microbiológica se
situou em 5,8 %, sendo menor que o da maioria das pesquisas sobre a ocorrência da CGB
previamente descritas no Brasil (CASTRO et al., 1971; COSTA, 1976; GENOVEZ et al.,
1989; LAGE et al., 1997; PELLEGRIN et al., 2002; STYNEN et al., 2003). Porém, há de se
considerar que algumas das pesquisas descritas, em comparação à presente pesquisa, foram
realizadas com base em rebanhos que já apresentavam problemas reprodutivos ou se
Trabalho Científico
94
basearam em demanda por diagnósticos laboratoriais para rebanhos com problemas de
infertilidade (COSTA, 1976; JESUS et al., 1999; GENOVEZ et al., 1993; LAGE et al., 1997;
STYNEN et al., 2003), sendo esperado, portanto, um percentual mais elevado de rebanhos e
animais positivos. Além disso, algumas destas pesquisas utilizaram a técnica laboratorial para
diagnóstico baseada em aglutinação muco-cérvico vaginal para vacas, que propicia resultados
falsos positivos em comparação a outros testes diagnósticos (HOFFER, 1981).
Considera-se que, para obter máxima sensibilidade das provas diagnósticas baseadas
em isolamento de
C. fetus
subesp.
venerealis
do prepúcio de touros, são necessárias três
colheitas seriadas do mesmo animal em intervalos mínimos de 1 a 2 semanas, sendo que
durante este período, o macho deve permanecer em repouso sexual (PELLEGIN, 1999). Na
presente pesquisa, não foi possível estabelecer esta estratégia, uma vez que os proprietários
necessitavam dos touros para cobertura das vacas. Assim é possível que a prevalência
estimada seja ainda superior aos 5,8% aferidos.
Apesar da prevalência relativamente baixa da enfermidade e da capacidade limitada da
mesma de se difundir pelos rebanhos locais que não por via venérea, há de se considerar que a
CGB está presente em rebanhos leiteiros da região de Presidente Prudente, podendo
apresentar o risco de expandir-se e em razão do reaquecimento do comércio de bovinos
leiteiros na região, fomentada pela atual alta nos preços do leite (LATICÍNIO, 2007).
Não foram detectadas, na presente pesquisa, associações estatísticas significativas
entre positividade para
C. fetus
subesp.
venerealis
e os seguintes fatores: raça ou espécie do
rebanho ou dos touros, sistema de cobertura, vocação da unidade de produção (mista ou leite),
segregação de touros em piquetes, utilização de piquete em separado para parição (piquete
maternidade), utilização de touros com exame andrológico, utilização de touros comprados,
ingresso de bovinos na propriedade há menos de 12 meses, presença perceptível de vacas que
retornam, e taxas de abortamentos anuais maiores do 2%. Apesar destes fatores não terem
sido associados estatisticamente à ocorrência da enfermidade, o pequeno percentual de
Trabalho Científico
95
positividade observado (5,8%) pode ter contribuído para diminuir a sensibilidade do teste
estatístico utilizado, sendo possível que as variáveis com tendências à significância possam
ser associadas à CGB se números amostrais maiores forem investigados.
Os touros que co-habitavam com outros nos últimos 12 meses apresentaram
positividade ao
C. fetus
subesp.
venerealis
na PCR significativamente maior do que touros
que permaneceram em co-habitação (OR = 0,1575). O contato direto entre touros não parece
ser um fator importante para a manutenção da enfermidade em um rebanho, apesar do agente
já ter sido isolado das fezes de bezerros (MODOLO et al., 1988). Nas propriedades
pesquisadas, este fato pode ser explicado pelo manejo adotado pelas mesmas, pois a maioria
utilizava apenas um touro para cobertura de suas vacas. Estes touros, que solitariamente
cobriam as vacas, devem ter permanecido em atividade sexual prolongada o ano todo, e
provavelmente, se expuseram de maneira mais intensa ao agente infeccioso, o que é
considerado um fator de risco importante para a ocorrência da enfermidade (CIPOLLA et al.,
1994).
Destaca-se na presente pesquisa que duas das propriedades avaliadas, positivas para
C.
fetus
subesp.
venerealis,
utilizavam sistema de inseminação artificial seguida de repasse. A
inseminação artificial, conjuntamente com o tratamento dos touros infectados, vacinação do
rebanho contra a CGB, uso de touros virgens e descarte de animais infectados, tem sido
preconizada como uma das formas eficazes de prevenir e conter a disseminação da
enfermidade (LEITE et al., 1980; HOFFER, 1981). Os touros de repasse, em geral por serem
destacados para cobertura de vacas previamente com problemas de fertilidade, são animais
que se infectam facilmente com o agente infeccioso, transmitindo-o sequencialmente para as
fêmeas e disseminando a CGB no rebanho. Quando infectados, esses touros podem inclusive
anular os benefícios que um programa de inseminação artificial traria para prevenção da CGB
em um rebanho leiteiro (STYNEN et al., 2003).
Trabalho Científico
96
Na presente pesquisa, rebanhos com taxas de concepção estimadas como abaixo de
85% apresentaram positividade para
C. fetus
subesp.
venerealis
significativamente superiores
aos rebanhos com taxas de concepção acima deste valor (OR= 7,6). O valor de 85% foi
utilizado como ponto de corte porque é considerado como o mínimo esperado para classificar
bovinos como dentro dos padrões mínimos de eficiência reprodutiva desejável (JUNQUEIRA
e ALFIERI, 2006). Os touros positivos devem ter transmitido o agente para as vacas por
monta natural, e estas, cronicamente infectadas, eventualmente conceberam, mas com uma
tendência ao aumento de intervalos entre partos, o que é perfeitamente esperado quando a
enfermidade está presente em rebanhos bovinos (LEITE et al., 1980), refletindo nos índices
reprodutivos pesquisados.
Na presente pesquisa há de se destacar que foram observados rebanhos, cujo touro foi
positivo para
C. fetus
subesp.
venerealis,
mas que apresentavam taxas de fertilidade, de
retorno ao cio e abortamentos dentro de parâmetros considerados ideais para a viabilidade
econômica da atividade pecuária. Este fato é esperado para rebanhos em que a enfermidade
tenha ingressado há algum tempo e se tornado endêmica, possivelmente provocando taxas de
concepção e fertilidade subótimas e que passam despercebidas por um exame menos
minucioso (HOERLEIN et al., 1964).
Em contrapartida, não foram detectadas diferenças nas proporções de fêmeas com
repetições de estro entre rebanhos positivos e negativos (
p-value
= 0,0843). Os percentuais
elevados de retorno do cio deveriam, em tese, ser uma tendência que acompanha as baixas
taxas de concepção aferidas, pois é reconhecida a capacidade da bactéria de diminuir a
capacidade de implantação de embriões recém-concebidos (WARE, 1980). Possivelmente os
dados a respeito das estimativas de retorno ao cio, obtidos durante as entrevistas com os
criadores, devem ter apresentado algum grau de inconsistência, pois a observação do período
de estro nas fêmeas bovinas é influenciada por diversos fatores que podem tornar esta
atividade subjetiva (ÁVILA PIRES et al., 2003; GALINA e ORIHUELA, 2007).
Trabalho Científico
97
Também não foram observadas diferenças entre os percentuais de abortamentos nos
últimos 12 meses, entre propriedades positivas e negativas ao agente infeccioso (
p-value
=
0,1876), apesar das baixas taxas de concepção observadas para rebanhos positivos. No
entanto, ao contrário das observações sobre o retorno ao estro, os abortamentos não são tão
comuns na CGB. Na maioria das vezes, as vacas que abortam são primíparas ou primo-
infectadas e no rebanho as taxas de abortamentos são inferiores a 10% (HOFFER, 1981).
Nenhuma das propriedades pesquisadas referiu vacinar contra a CGB. As vacinas
contra esta enfermidade, disponíveis no Brasil, são comercializadas em formulações
polivalentes associadas com outros antígenos e, quando utilizadas para touros positivos,
podem funcionar como estimulantes específicos da imunidade que levam ao desaparecimento
do
C. fetus
subesp.
venerealis
da cavidade prepucial dos touros (LEITE et al., 1980).
A existência de touros como fontes de infecção para
C. fetus
subesp.
venerealis
dentro
de rebanhos leiteiros locais pode ocasionar reflexos negativos no desempenho reprodutivo das
vacas leiteiras da região, sendo as mais perceptíveis as relacionadas às baixas taxas de
concepção. Em decorrência disso e da crescente importância do comércio de animais leiteiros
na região, há a necessidade de monitoramento constante de parâmetros que refletem a
fertilidade do rebanho para auxiliar na detecção e prevenção da CGB em rebanhos leiteiros.
Conclui-se que a CGB está presente em touros de rebanhos leiteiros comerciais da região de
Presidente Prudente, sendo associada à diminuição de fertilidade nos animais.
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Trabalho Científico
101
TABELA 1- Resultados do teste exato de Fisher e estimativas das razões de chance por ponto
(OR) e intervalos com 95% de confiança para associação entre fatores de risco e
positividade para CGB em rebanhos produtores de leite na região de Presidente
Prudente-SP, 2007.
Variáveis CV+
CV-
OR IC 95%
p-value
Leite 1 20 Sistema de
produção Corte 5 76
0,7600 0,08393 – 6,882 1,0000
Europeus 1 26
Raças do rebanho
Cruzados 5 70
0,5385 0,06001 – 4,832 1,000
Bos indicus
5 83 Espécie/raça dos
Touros
Bos taurus
1 13
0,7831 0,08457 – 7,252 1,0000
Inseminação e
repasse
2 19 Sistema de
cobertura
Monta o ano todo
4 77
2,026 0,3450 – 11,902 0,6004
Há menos de 12
meses
5 43
Histórico de
ingresso de
animais na
propriedade
Há mais de 12
meses
1 53
6,163 0,6932 – 54,788 0,0970
Sim 3 54 Piquete
maternidade não 3 42
0,7778 0,1493 – 4,053 1,0000
Sim 2 32 Touro nascido na
fazenda Não 4 64
1,000 0,1738 – 5,755 1,0000
Sim 1 33 Touro com exame
andrológico Não 5 63
0,3818 0,04280 – 3,406 0,6607
Solitário 4 34
Piquete do touro Conjunto com as
vacas
2 62
3,647 0,6347 – 20,958 0,1921
Sim 2 73
Co-habitação com
outros touros nos
últimos 12 meses
Não 4 23
0,1575*
0,0270 – 0,9169 0,0409
CV(+)- positivo para
C. fetus
subesp.
venerealis
; CV(-)- negativo para
C. fetus
subesp.
venerealis; *-significância estatística
Trabalho Científico
102
TABELA 2- Associações entre problemas reprodutivos em rebanhos produtores de leite na
região de Presidente Prudente e positividade para
Campylobacter fetus
subesp.
venerealis
, 2007.
Variáveis CV+
CV-
OR IC 95%
p-value
Sim 4 29
Presença de vacas
que retornam ao
cio
Não 2 67
4,621 0.8007 – 26,666
0,0843
< 85% 4 20
Taxas de
concepção
> 85% 2 76
7,600*
1,297 - 44,522 0,0263
2% 3 24
Abortamentos nos
últimos 12 meses
> 2% 3 72
3,000 0,5670 – 15,874
0,1876
CV(+)- positivo para
C. fetus
subesp.
venerealis
; CV(-)- negativo para
C. fetus
subesp.
venerealis * - Significância estatística
Trabalho Científico
103
Normas de publicação da revista Arquivos do Instituto Biológico
Revista Arquivos do Instituto Biológico
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