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Universidade de Brasília
Departamento de Biologia Celular
Curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular
Busca de Genes Envolvidos na Resistência de
Amendoim Silvestre ao Nematóide das Galhas
(Meloidogyne arenaria)
Karina Proite
Orientador: Dr. David John Bertioli
Co-orientadora: Dra. Patrícia Messenberg Guimarães
Brasília – DF
2007
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ii
Universidade de Brasília
Departamento de Biologia Celular
Curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular
Busca de Genes Envolvidos na Resistência de
Amendoim Silvestre ao Nematóide das Galhas
(Meloidogyne arenaria)
Karina Proite
Orientador: Dr. David John Bertioli
Co-orientadora: Dra. Patrícia Messenberg Guimarães
Tese apresentada ao Departamento de
Biologia Celular do Instituto de Biologia,
da Universidade de Brasília, como
requisito parcial para obtenção do grau
de Doutor em Biologia Molecular, Área de
concentração: Biologia Molecular.
Brasília-DF, 2007
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iii
AGRADECIMENTOS
Essa tese foi realizada através do apoio de diferentes pessoas e
instituições, em especial gostaria de agradecer:
À CAPES pelo bolsa de estudo tanto no país quanto à “bolsa-sanduíche” .
À Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, pela infra-estrutura de
trabalho e pelo apoio recebido;
Ao BIRD/PRODETAB, à União Européia e ao Generation Challenge
Program pelo suporte financeiro e aos Drs. David, Patrícia e Soraya pelo
empenho na gestão desses projetos, cuidando do fornecimento dos meios
necessários para a realização dessa tese;
Ao Departamento de Biologia Celular da UnB, pela concessão desse
treinamento e aos professores da UnB, pelos ensinamentos;
Ao meu querido orientador, Dr. David Bertioli, pela amizade, orientação,
sugestões e apoio durante a realização desse trabalho;
À minha querida orientadora, Dra. Patrícia Messenberg Guimarães, pela
amizade, orientação, acompanhamento, respeito e coleguismo ao longo de todo
este trabalho;
À querida, Dra. Soraya Leal-Bertiloi, pela amizade, organização e
manutenção de toda estrutura laboratorial. Pelo acompanhamento e sugestões
para realização deste trabalho;
À Dra. Regina Carneiro, pela amizade, orientação e ensinamentos do
valioso estudo com os nematóides;
Ao Dr. Márcio Moretzsohn, pela amizade e análise dos EST-SSRs;
Às queridas colegas e amigas do Laboratório de Microscopia, Ana Cristina
Gomes e Rosana Falcão pelo suporte técnico neste trabalho;
Ao Olivier Garsmeur, pelo apoio e dedicação na geração das bibliotecas
BAC.
Ao Leandro, pelo capricho e cuidado com as plantas nas casas de
vegetação;
Ao Dr. Valls pela concessão dos acessos de Arachis utilizados;
iv
Aos colegas de trabalho do Laboratório Planta-Praga III da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia; Carol, Fernando, Stephan, Maíra e Maria
Laine, pela boa convivência durante todo trabalho;
Aos queridos colegas do Laboratório de Nematologia, Fabiane, Marcilene,
Pedro e Luís pelos bons momentos neste trabalho;
Às minhas queridas Alessandra e Lisangêla pela amizade,
companherismo e divertidos momentos;
Aos amigos, Rob, Ana Cristina, Lúcio, Stéphane, Guta, Glyn Mara,
Giovana, Alexandre, Maju, PC, Inácio, Leandro, Vieira, Karen, Carol e Renato
que me proporcionaram bons momentos durante a execução deste trabalho;
Aos colegas e examinadores, Francisco Aragão, Robert Miller, Simone
Ribeiro e Fátima Grossi pelas excelentes sugestões na finalização deste
manuscrito;
À toda a equipe envolvida nos projetos de amendoim, pela colaboração;
À minha família, pelo amor e apoio em toda minha vida;
Aos queridos João e Caio, pelo amor.
v
Índice
Resumo 1
Abstract 2
1. INTRODUÇÃO GERAL 3
1.1. O gênero Arachis 3
1.2. Cultura do Amendoim 4
1.2.1. Cenário Internacional 4
1.2.2. Cenário Nacional 5
1.3. Espécies Silvestres de Arachis 5
1.4. Principais Doenças e Parasitas do Amendoim 6
1.4.1. Nematóides 7
1.4.1.1. O gênero Meloidogyne 7
1.4.1.1.1. Biologia dos nematóides das galhas 8
1.4.1.2. Nematóides no Brasil 10
1.4.1.3. Nematóides no Amendoim 10
1.4.1.4. Estratégias de Controle dos Nematóides no Amendoim 11
1.5. Genes de Resistência 12
1.5.1. Resistência 12
1.5.2. Genes R e suas proteínas 13
1.5.2.1. Genes R e a identificação destas resistências aos nematóides
Meloidogyne spp. 14
1.5.2.2. Prospecção de Genes de Resistência 16
1.6. ESTs de Leguminosas 18
1.7.Análise da Expressão Gênica 19
1.8. BAC -Bacterial Artificial Chromosome 20
2. PROBLEMA 22
3. HIPÓTESE 24
4. JUSTIFICATIVAS 24
5. OBJETIVO GERAL 26
5.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 26
Capítulo 1 - Desenvolvimento Pós-infecção e Histopatologia de Meloidogyne
arenaria raça 1 em Arachis spp.
1. INTRODUÇÃO 29
2. MATERIAL E MÉTODOS 31
2.1. Nematóide e Preparação do Inóculo 31
2.2. Avaliação do Fator de Reprodução do Nematóide em Arachis spp. 31
2.3. Estudos Histopatológicos 32
3. RESULTADOS 33
3.1. Avaliação do Fator de Reprodução do Nematóide em Arachis spp. 33
3.2. Observações Histológicas das Raízes Infectadas das Espécies
Suscetíveis, A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST e A. duranensis K7988 33
vi
3.3. Observações Histológicas das Raízes Infectadas da Espécie
Resistente A. stenosperma V10309 34
4. DISCUSSÃO 36
Capítulo 2 - Análise in silico da expressão gênica diferencial de Arachis
stenosperma inoculado com Meloidogyne arenaria e o desenvolvimento de
marcadores microssatélites
1. INTRODUÇÃO 43
2. MATERIAL E MÉTODOS 47
2.1. Construção das Bibliotecas de cDNA 47
2.2. Seqüenciamento dos ESTs 50
2.3. Análise Computacional dos ESTs 50
2.4. Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites 51
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 51
3.1. ESTs Diferencialmente Expressos 51
3.2. Marcadores Microssatélites Desenvolvidos 56
4. CONCLUSÕES 57
Capítulo 3 - Análise da expressão diferencial de genes de raízes de Arachis
stenosperma e de A. hypogaea infectadas com o fitonematóide Meloidogyne
arenaria raça 1.
1. INTRODUÇÃO 60
1.1. Gene da Protéina Reprimida por Auxina - arp 61
1.2. Gene da enzima citocinina-oxidase/desidrogenase - ckx 63
1.3. Interação Auxina-Citocinina 64
1.4. Metalotioneínas– MT 66
1.5. Resveratrol sintase - RS 67
1.6. Proteínas Hipotéticas – HP1 e HP2 68
2. MATERIAL E MÉTODOS 70
2.1. Plantas de Arachis e bioensaio com Meloidogyne arenaria raça 1 70
2.2. Validação da análise in silico por Northern Blot 70
2.3. Análise das Proteínas Preditas 71
3. RESULTADOS 73
3.1. Análise temporal da expressão do gene arp (proteína reprimida por
auxina, contig 821) 73
3.1.1. AsARP e outras proteínas ARP 73
3.2. Análise temporal da expressão do gene ckx (gene da enzima citocinina-
oxidase/desidrogenase, contig 433) 75
3.2.1. AsCKX e outras proteínas CKXs 76
3.3. Análise temporal da expressão do gene mt2 (gene da enzima
metalotioneína 2, contig 154) 78
3.3.1. AsMT2 e outras proteínas MT2s 79
3.4. Análise temporal da expressão do gene rs (gene da enzima resveratrol
sintase, contig 440) 80
3.4.1. AsRS e outras proteínas RS 80
vii
3.5. Análise da expressão temporal dos genes Ashp1 e Ashp2 (genes
homólogos às proteínas hipotéticas de Nicotiana tabacum e Oryza sativa,
contigs 214 e 185) 81
4. DISCUSSÃO 85
4.1. Expressão do gene Asarp 85
4.2. Proteínas ARP 87
4.3. Expressão do gene Asckx 88
4.4. AsCKX e outras proteínas CKXs 89
4.5. Interação dos genes Asarp e Asckx 91
4.6. Expressão do gene Asmt2 e a reação de hipersensibilidade 92
4.7. AsMT2 e outras proteínas MT2s 96
4.8. Expressão do gene Asrs 97
4.9. AsRS e outras enzimas resveratrol sintase 98
4.10. Expressão dos genes das proteínas hipotéticas AsHP1 e AsHP2 99
5. CONCLUSÕES 100
Capítulo 4 - Bibliotecas BAC dos genomas ancestrais diplóides do amendoim
cultivado alotetraplóide
1. RESUMO 103
2. INTRODUÇÃO 104
3. MATERIAL E MÉTODOS 107
3.1. Plantas Utilizadas 107
3.2. Isolamento do DNA de Alto Peso Molecular 107
3.3. Construção das Bibliotecas BAC 108
3.4. Screening das Bibliotecas BACs e Isolamento do DNA 109
3.5. Sondas Genômicas 110
4. RESULTADOS 110
4.1. Isolamento do DNA de Alto Peso Molecular 110
4.2. Bibliotecas BAC 111
5. DISCUSSÃO 113
PERPECTIVAS 119
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 120
ANEXOS
ANEXO I - Proite et al., 2007 (manuscrito em preparação) 158
ANEXO II - Martins et al., 2006 176
ANEXO III - Proite et al., 2007 177
ANEXO IV - Alinhamentos 178
ANEXO V - Guimarães et al., 2007 (manuscrito em preparação) 194
1
RESUMO
O amendoim cultivado (Arachis hypogaea) é uma espécie importante,
amplamente cultivada nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. É bastante
suscetível a diversos estresses bióticos e abióticos, para os quais muitas das
espécies silvestres são resistentes. Neste trabalho foram avaliadas as duas
espécies silvestres A. duranensis e A. stenosperma e selecionadas quanto à
resistência ao nematóide Meloidogyne arenaria raça 1. O estudo histopatológico
mostrou que A. stenosperma é uma espécie resistente sendo esta caracterizada
por uma reação de hipersensibilidade (HR). A. duranensis é uma espécie
suscetível, mas possui ciclo de infecção diferenciado da espécie hospedeira
típica, A. hypogaea. Bibliotecas de cDNA de raízes de A. stenosperma foram
construídas para a formação de um banco de ESTs. Os ESTs de bibliotecas de
raízes de A. stenosperma inoculadas e não inoculadas com o nematóide foram
analisados in silico para a expressão diferencial de genes durante a infecção. A
estratégia do estudo dos ESTs evidenciou oito genes diferencialmente expressos
e foi uma primeira tentativa de procura dos fatores responsáveis pela resistência
ao nematóide em A. stenosperma. A análise da expressão de seis ESTs foi
testada por Northern blot para a confirmação da análise in silico e identificação
do possível envolvimento destes genes com a resistência.
Neste trabalho ainda, foram construídas e validadas duas bibliotecas BAC
(Bacterial Artificial Chromosome) das espécies silvestres diplóides, A. duranensis
e A. ipaënsis que são as possíveis espécies parentais do alotetraplóide A.
hypogaea. Estas bibliotecas servirão como importantes ferramentas genéticas
que possibilitarão o isolamento de genes de interesse do amendoim silvestre e
sua comparação com o genoma de outras leguminosas.
2
ABSTRACT
Arachis hypogaea, the cultivated peanut, is an important crop, widely
grown in tropical and subtropical regions of the world. It is highly susceptible to
several biotic and abiotic stresses to which wild species are resistant. In this
work, two wild species, A. duranensis and A. stenosperma were evaluated and
selected based upon resistance to the root-knot nematode Meloidogyne arenaria
race 1. Histopathological studies showed that A. stenosperma is a resistant
species. Its resistance is characterized by a hypersensitive response (HR). A.
duranensis is susceptible but the evolution of the nematode cycle is different to
the host species, A. hypogaea. cDNA libraries of roots were constructed for the
development of an EST databank for wild Arachis species. ESTs generated from
non inoculated and M. arenaria race 1 inoculated roots of A. stenosperma were
analyzed in silico for differential gene expression during infection. This strategy
revealed eight clones differentially expressed and represented a first attempt to
search for factors that are responsible for resistance in A. stenosperma.
Expression analysis of six of these ESTs was conducted by Northern blot to
confirm and validate the in silico analysis for the possible involvement of these
genes in resistance.
In this study two BAC (Bacterial Artificial Chromosome) libraries of the wild
progenitors of A. hypogaea, A. duranensis and A. ipaënsis were also constructed
and validated. These libraries will function as genetic tools and may help with the
isolation of genes of interest in wild Arachis and in comparison with others
legume genomes.
3
1. INTRODUÇÃO GERAL
O presente trabalho visou o estudo da interação do nematóide Meloidogyne
arenaria raça 1 (Neal) Chitwood (Koenning e Barker, 1992; McSorley et al.,
1992) com duas espécies de Arachis silvestres, A. stenosperma, Krapov. e W.C.
Gregory (acesso V10309) e A. duranensis Krapov. e W.C. Gregory (acesso
K7899), com a espécie cultivada A. hypogaea L. (cultivar IAC-Tatu-ST), a
identificação e análise de genes diferencialmente expressos durante o processo
de infecção deste nematóide em raízes da espécie silvestre resistente A.
stenosperma, e a construção de duas bibliotecas BAC (Bacterial Artificial
Chromosome) de espécies silvestres de Arachis, A. duranensis (acesso V14167)
e A. ipaënsis Krapov. e W.C. Gregory (acesso KG30076) visando o isolamento
de genes de interesse.
1.1. O gênero Arachis
O gênero Arachis (Fabaceae) reúne cerca de 80 espécies, está dividido
em nove seções botânicas de acordo com a morfologia, distribuição geográfica e
viabilidade de cruzamentos (Krapovickas e Gregory, 1994; Valls e Simpson,
2005). As nove seções são: Trierectoides, Erectoides, Extranervosae,
Triseminatae, Heteranthae, Caulorrhizae, Procumbentes, Rhizomatosae e
Arachis. A distribuição natural do gênero é restrita ao Brasil, Bolívia, Paraguai,
Argentina e Uruguai (Valls e Simpson, 1994).
Arachis é um gênero originário da América do Sul, com provável centro de
origem nas regiões de maior altitude do Brasil Central (Gregory et al., 1980). A
difusão do amendoim iniciou-se pelos indígenas para as diversas regiões da
América Latina, América Central e México. No século XVIII foi introduzido na
Europa. No século XIX difundiu-se do Brasil para a África e do Peru para as
Filipinas, China, Japão e Índia (Hammons, 1982 in Wynne et al., 1991). O
amendoim cultivado, Arachis hypogaea, é uma espécie alotetraplóide, composto
de dois genomas distintos (genoma A e B), (2n= 4x= 40) que surgiu de um
eventual cruzamento entre as duas espécies silvestres diplóides, A. duranensis e
A. ipaënis (Kochert et al., 1996; Lavia et al., 2001; Jung et al., 2003; Seijo et al.,
4
2004), resultando em um híbrido estéril, cujos cromossomos foram duplicados, o
que resultou na restauração da fertilidade (Kochert, et al., 1996). A seção
Arachis, à qual pertence o amendoim, apresenta outras 30 espécies descritas,
que são classificadas nessa seção por geneticamente compatíveis com A.
hypogaea.
O amendoim possui sementes, ricas em óleo e proteínas, que são
produzidas abaixo da superfície do solo e podem ser consumidas cruas
(Brücher, 1989). A importância econômica do amendoim está relacionada ao fato
de suas amêndoas possuírem sabor agradável e serem ricas em óleo
(aproximadamente 50%) e proteína (22 a 30%). Além disso, contêm
carboidratos, sais minerais e vitaminas, constituindo-se num alimento altamente
energético (585 calorias/100 gramas de sementes) (Conab, 2004). Sua folhagem
é utilizada como forragem nas pastagens (Machado et al., 2005) e a torta
resultante da extração do óleo, juntamente com o farelo, é usada como ração
animal (Evangelista et al., 2004). O óleo de amendoim, bem como outros óleos
vegetais, está dentre as fontes de biomassa prontamente disponíveis, e tem sido
largamente investigado como candidato a programas de energia renovável,
como os dos biocombustíveis (Ramos et al., 2003). Além disso, a raiz do
amendoim tem a capacidade de fixar nitrogênio, mantendo a fertilidade do solo
(Miranda et al., 2003; Pimratch et al., 2004).
1.2. Cultura do Amendoim
1.2.1. Cenário Internacional
O amendoim é a quarta maior cultura oleaginosa mundial, ficando
atrás apenas, na safra de 2005/06, da soja, canola e algodão. Nessa safra, o
amendoim participou com 10,23% do total da safra mundial de oleaginosas, com
uma produção de 33,08 milhões de toneladas (USDA, 2006).
Os maiores produtores mundiais de amendoim nas safras 2005/06
foram: China (43,3% da produção mundial); Índia (19,9%); Estados Unidos
(6,6%); Nigéria (4,6%); Indonésia (3,5%); e demais com 21,9% (USDA, 2006).
5
1.2.2. Cenário Nacional
O Brasil já foi um grande produtor de amendoim. A cultura se
expandiu a partir dos anos 50, quando as gorduras animais começaram a ser
substituídas pelos óleos vegetais, especialmente de amendoim e algodão.
Porém, com o crescimento da cultura da soja, mais barata e abundante, as áreas
de cultivo e a produção de amendoim foram diminuindo gradativamente,
estabilizando-se na faixa de 90 a 100 mil hectares cultivados, com volume de
produção entre 171 e 217 mil toneladas/ano, entre os anos de 1998 a 2003 e
produção entre 288 a 301 mil toneladas/ano, entre os anos de 2004 e 2006
(Tabela 1). (Conab, 2004 e 2006). Os principais fatores que explicam a redução
da atividade econômica do amendoim, no período de 1998-2000, no Brasil
foram: i) a concorrência crescente da soja, cujo processo de produção é
totalmente mecanizado, desde a semeadura até a colheita; ii) a baixa
produtividade por área em alguns anos, devido a adversidades climáticas e
ocorrência de doenças foliares para as quais há carência de genótipos
resistentes; iii) baixa qualidade do produto quanto aos níveis permitidos de
ocorrência de aflatoxina nos grãos entre outros (Câmara, 2000).
Tabela 1. Produção área e produtividade da cultura do amendoim entre os anos 1998-2006.
1998 1999 2000 2001 2002 2003/04
2004/05
2005/06
Produção
(em 1000 t)
183,5 172,4 171,6 196,7 189,4 217,2 301,7 288,3
Área (em 1000 ha)
100,0 96,7 104,0 102,4 93,9 98,2 120,3 119,6
Produtividade
(em kg/ha)
1.835,0
1.782,8
1.650,0
1.920,9
2.017,0
2.213 2.330,0
2.367,0
Fonte: Conab.
No entanto, a partir de 2000, o Brasil tem expandido a produção da cultura
do amendoim nas regiões Sul e Sudeste, graças a expressivos aumentos de
produtividade devido à introdução de novas cultivares. As variedades mais
utilizadas de sementes de amendoim nos cultivos atuais, no Brasil, são
originárias do Instituto Agronômico de Campinas que mantém a atividade de
pesquisa e desenvolvimento de sementes. (Conab, 2004).
1.3. Espécies Silvestres de Arachis
A coleta, manutenção, caracterização e avaliação de fontes de
germoplasma de espécies silvestres de Arachis, ocorreu relativamente tarde
6
comparado às outras culturas tais como tabaco, milho e trigo (Stalker e Simpson,
1995). A coleta de germoplasma de espécies de Arachis tem sido conduzida de
forma disciplinada nos últimos 40 anos, na maior parte sob a liderança de
Antonio Krapovickas (IBONE-
Instituto de Botánica del Nordeste, Argentina),
Walton C. Gregory (NCSU- North Carolina State University, EUA), Charles E.
Simpson (TAES- Texas Agricultural Experiment Station, EUA) e José F. M. Valls
(EMBRAPA- Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasil).
A descoberta de que plantas possuem centros de origem, onde reside
uma enorme diversidade genética, e de que plantas e patógenos co-evoluiram,
estimulou uma série de programas de melhoramento com a finalidade de
identificar genes de resistência em parentes silvestres de muitas plantas-alvo e
assim poder introgredí-las (Leppik, 1970).
O Brasil contém alguns dos centros de diversidade genética mais ricos do
mundo, sendo o centro de origem de um número de plantas de importância
sócio-econômica (ex. mandioca, amendoim, caju, abacaxi e cacau), assim como
de parentes silvestres de muitas outras plantas (ex. diversos representantes de
solanáceas). A EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia possui um banco
de germoplasma silvestre de Arachis, com mais de 1000 acessos de espécies
silvestres e outros 1000 de variedades primitivas, algumas das quais já
identificadas como fontes de resistência para fungos e nematóides (Leal-Bertioli
et al. 1999; Bertioli et al., 2000; Fávero 2004). Outras espécies silvestres
possuem grande valor como plantas forrageiras, (ex. A. glabrata, A. pintoi) e alto
potencial como cobertura para controle de erosões e como plantas ornamentais
(ex. A. repens, A. helodes, A. kempff-mercadoi) (Valls, 2000). Temos ainda, A.
villosulicarpa e A. stenosperma que permanecem sendo cultivadas para
produção de grãos alimentícios por indígenas brasileiros (Stalker e Simpson,
1995; Freitas et al., 2003).
1.4. Principais Doenças e Parasitas no Amendoim
Arachis hypogaea é suscetível a várias doenças e patógenos tanto no
Brasil quanto em todo mundo. Entre as principais doenças fúngicas e foliares
temos: (i) Cercospora arachidicola ou mancha parda; (ii) Cerscosporidium
personatum ou mancha preta; (iii) Puccinia arachidis ou ferrugem e Phoma
7
arachidicola ou mancha barrenta. E entre os fitoparasitas de solo temos os
nematóides como os mais importantes (Barreto, 2005)
1.4.1. Nematóides
Nematóides são tipicamente vermes cilíndricos não segmentados que
formam o filo Nematoda. São considerados organismos primitivos
evolucionalmente e diversificados e estão entre os mais abundantes de todos os
metazoários. Em números, eles representam de 80-90% de todos os animais
(Boucher e Lambshead, 1994; Blaxter et al., 1998). Nematóides ocupam todos
os nichos ecológicos, a maioria das espécies, incluindo o modelo animal
Caenorhabditis elegans, é de vida livre e se alimenta de bactérias e de outros
organismos microscópicos (Williamson e Kumar, 2006). No entanto, os
nematóides parasitas de plantas e animais são os que recebem maior atenção
por terem grande impacto nos seres humanos, porque são responsáveis por
doenças em animais domésticos e em muitas culturas de plantas (Bird e Koltai,
1999). Nas mais diferentes culturas do mundo, os nematóides fitoparasitas têm
sido responsáveis por uma parcela significativa de perdas provocadas pela
destruição do sistema radicular. Os prejuízos para a agricultura podem chegar a
valores acima de 100 bilhões de dólares em todo o mundo (Opperman e Bird,
1998).
Muitos grupos diferentes de nematóides são fitoparasitas, com
aproximadamente 0,3 mm a 10 mm de comprimento e de 20 a 60 mm de
diâmetro. Todas as espécies possuem estágios do seu ciclo de vida no solo,
mas são essencialmente aquáticos (Perry, 1996). Nematóides são normalmente
bissexuais, mas em algumas espécies, onde os machos são raros ou
desconhecidos ou não funcionais, a reprodução é partenogênica. Os nematóides
fitoparasitas mais prejudiciais e mais importantes economicamente são os
nematóides das galhas, Meloidogyne spp., e os nematóides de cisto, Heterodera
e Globodera spp. (Mitreva et al., 2005).
1.4.1.1. O gênero Meloidogyne
Os nematóides das galhas, Meloidogyne spp. são endoparasitas
sedentários e obrigatórios, alimentam-se exclusivamente no citoplasma de
8
células vegetais (Williamson e Gleason, 2003). Todos Meloidogyne spp., seja
hospedeiro-específico ou polifágico, têm parasitismo caracterizado pelo
estabelecimento de sítios de alimentação permanentes que compreendem as
células gigantes no córtex, endoderme, periciclo e o parênquima vascular da raiz
da planta hospedeira (Trudgill e Blok, 2001). Estes sítios de alimentação são
como escoadores dos nutrientes produzidos através da fotossíntese pela planta,
causam deformações e bloqueiam os tecidos vasculares limitando a
translocação de água e nutrientes, impedindo assim, o crescimento e o
desenvolvimento da planta.
1.4.1.1.1. Biologia dos nematóides das galhas
O ciclo de vida dos Meloidogyne spp. inicia-se com a liberação de
centenas de ovos numa matriz gelatinosa na superfície da raiz por uma fêmea
madura (Fig. 1). Em seguida a primeira muda que ocorre dentro do ovo, larvas
móveis, denominadas juvenis de segundo estágio (J2), são liberadas no solo e
geralmente re-infectam a mesma planta. Os J2s, no solo, não se alimentam e
têm seu desenvolvimento bloqueado. Podem permanecer neste estágio por
semanas ou até meses sobrevivendo de suas reservas lipídicas. As larvas são
atraídas pelas raízes das plantas e penetram através da região de elongação.
Os juvenis de segundo estágio migram então intercelularmente, separando as
células na lamela média no córtex (Fig. 1). Eles continuam a migrar até a zona
de diferenciação na região vascular, chamada cilindro central podendo causar
pouca ou nenhuma lesão. Este processo inclui tanto forças mecânicas quanto
secreções enzimáticas do nematóide. Na região do cilindro central, o nematóide
estabelece o seu sítio de alimentação. Em resposta aos sinais do nematóide, as
células adjacentes à sua cabeça se desenvolvem em “células gigantes”. Dali em
diante, os J2s sofrem três mudas e se tornam adultos. A fêmea adulta se
mantém sedentária, produzindo grandes massas de ovos e galhas, enquanto
machos migram para o solo. Na maioria das vezes a reprodução é
partenogênica. O crescimento e a reprodução do nematóide dependem da
indução das células gigantes, as quais se acredita ser a sua única fonte de
alimentação. Observações citológicas indicam que estas células gigantes são
resultantes de sucessivas mitoses sem que haja a citocinese, ou seja, não há
9
J2s o sítio
de alimentação induzindo
as células gigantes
estabelecem
Nematóides se
desenvolvem nos
estágios J3, J4 e adulto.
As galhas se formam em
resposta ao parasitismo
Fêmeas adultas
produzem > 1000 ovos.
Os machos não são
necessários na maioria
das spp., Mas, algumas
vezes, há o
acasalamento
Os ovos são
das
fêmeas adultas
dentro de massas
de ovos
liberados
Massas
de ovos
Raiz bastante
“galhada” impedindo a
nutrição do resto da
planta
Ovo
J2s entram nas raízes e
migram para região de
elongação
J1 sofre sua
primeira muda
dentro do ovo
A forma
infectiva, J2 é
atraída pela
raízes
crescentes
Figura 1- Ciclo de vida de Meloidogyne spp. Este gênero possui seis estágios de
desenvolvimento: um estágio de ovo, um estágio larval dentro do ovo (= juvenil de 1
o.
estágio ou
J1), três estágios larvais que se alimentam da planta (= juvenis de 2
o.
, 3
o.
e 4
o.
estágio ou J2, J3 e
J4). O J2 é a forma infectiva e induz a formação do sitio de alimentação e das células gigantes,
nos estágios de J3 e J4 pode-se observar o intumescimento da raiz devido às galhas formadas.
E por último, um estágio adulto (= fêmea) que se alimenta da planta e produz ovos, geralmente,
por partenogenia. Os ovos são liberados no solo em uma massa gelatinosa iniciando novo ciclo,
i, (Figura adaptada do site: http: www.apsnet.org/education/lessonsPlantPath/RootKnot
Nema/discycleFull.htm).
divisão do citoplasma celular para formar células filhas. Consequentemente, as
células se tornam multinucleadas com grandes núcleos e nucléolos. Estas
células gigantes, comparadas às células normais, apresentam ainda, aumento
na densidade do citoplasma por causa da proliferação das organelas e os
vacúolos se tornam anormais (Huang, 1985, Bird e Kaloshian, 2003).
10
1.4.1.2. Nematóides no Brasil
O número de nematóides fitoparasitas encontrados no Brasil chega à pelo
menos 238 espécies, sendo alguns deles largamente distribuídos por culturas de
grande importância econômica. Em geral, os nematóides do gênero Meloidogyne
são os que acarretam os problemas mais graves, o que pode ser decorrente da
grande capacidade de adaptação de tais fitoparasitas aos diversos
agrossistemas (Costa e Campos, 2001). A lavoura mais atingida, no Brasil,
segundo esta pesquisa, é a cana-de-açúcar com perda de 15,3% no período de
1999, e prejuízo de R$ 781 milhões. No arroz, as perdas alcançaram 10% e o
prejuízo foi de R$ 378,7 milhões e na soja, até outubro de 1999 (10,6% e R$
926,6 milhões). (Costa e Campos, 2001).
No Brasil, os nematóides do gênero Meloidogyne não são um problema
grave para a cultura do amendoim. No entanto, para algumas espécies
forrageiras como Arachis pintoi e A. glabrata são atacadas por M. javanica raça 4
(Carneiro et al., 2003). Já em outros países como nos Estados Unidos e Índia
Meloidogyne spp. chegam a causar 12% de perdas para o amendoim cultivado
(Bailey, 2002). Os principais nematóides são os nematóides das galhas,
Meloidogyne arenaria raça 1 (Neal) Chitwood (Koenning e Barker, 1992;
McSorley et al., 1992), M. hapla Chitwood (Culbreath et al., 1992; Schmitt e
Barker, 1998) e M. javanica (Treub) Chitwood (Nelson et al.,1989 e Sharma e
McDonald, 1990, Tomaszewski et al., 1994, Lordello et al., 1997).
1.4.1.3. Nematóides no Amendoim
Meloidogyne arenaria raça 1, M. hapla, M. javanica, e M. haplanaria n. sp.
(Eisenback et al., 2003) impedem o desenvolvimento das plantas de amendoim,
provocando sua murcha, perda de cor, podridão dos ginóforos, das vagens e das
raízes. E ainda em associação com fungos de solo que incluem Pythium,
Rhizoctonia, Aspergillus, ocasionam perdas da ordem US$ 5 bilhões por ano nos
Estados Unidos (Williamson e Hussey, 1996). As galhas que se formam podem
ter o tamanho de uma cabeça de alfinete (Meloidogyne hapla) ou de
intumescências com o dobro do diâmetro da raiz (Meloidogyne arenaria) (Figura
2) (Williamson e Hussey, 1996).
11
Figura 2. Galhas do fitonematóide Meloidogyne arenaria formadas nas raízes do amendoim.
1.4.1.4. Estratégias de Controle dos Nematóides no Amendoim
O controle de nematóides na cultura do amendoim se baseia
principalmente em (i) rotação de culturas com espécies não hospedeiras ou
antagonistas. Gramíneas como a grama batatais (Paspalum notatum), a grama
seda (Cynodon dactylon), milheto (Pennisetum americanum), sorgo (Sorghum
bicolor) e Crotolaria estão entre as culturas mais efetivas na redução de
populações de Meloidogyne e devem ser plantadas pelo menos durante um ano,
mas preferencialmente dois anos antes de se retornar com a cultura do
amendoim (Wang et al., 2002, Rich e Kinloch, 2005). Infelizmente, as rotações
têm pouco efeito sobre outro nematóide que também ataca o amendoim,
Pratylenchus spp. (ii) A utilização de nematicidas fumigantes e não fumigantes é
uma outra estratégia de combate aos nematóides das galhas mas tem ação
limitada e indicação restrita por poluir muito o solo (Rich e Kinloch, 2005). (iii) A
estratégia de busca por genótipos resistentes tem sido empregada em diversas
culturas importantes, porém, dentro do germoplasma de A. hypogaea não foi
encontrado nenhuma cultivar ou subespécie resistente a M. arenaria (Holbrook
et al., 1983). A resistência a este nematóide foi encontrada em diversas espécies
silvestres de Arachis (Nelson et al., 1989; Holbrook e Noe, 1990), então a
utilização de parentes silvestres na introgressão desta resistência para
amendoim cultivado é uma estratégia promissora (Simpson et al., 2003).
12
1.5. Genes de Resistência
1.5.1. Resistência
As plantas necessitam se defender contra o ataque de patógenos, ou
melhor, de organismos que causam doenças, incluindo, bactérias, fungos, vírus
e nematóides. O controle das doenças de plantas é de fundamental importância
e um dos principais objetivos de agricultores, programas de combate a doenças
e da indústria agro-química. Plantas não possuem células de defesa móveis,
mas ao contrário, suas defesas se baseiam em uma imunidade inata de cada
célula e em um sistema de sinais que são originados a partir dos sítios de
infecção (Jones e Dangl, 2006). Elas resistem ao ataque de patógenos através
de respostas de defesa pré-formadas e também através de respostas induzidas
(Hammond-Kosack e Jones, 1997). O patógeno emprega uma das três principais
estratégias de ataque às plantas que são: (1) necrotrofia, (2) biotrofia, ou (3)
hemibiotrofia. Os necrotróficos primeiramente matam as células hospedeiras e
depois metabolizam seus nutrientes (Walton, 1996 in Hammond-Kosack e Jones,
1997). Os patógenos biotróficos e hemibiotróficos invadem células vivas e
subvertem o metabolismo a favor do seu próprio crescimento e reprodução
(Hammond-Kosack e Jones, 1997).
Flor (1971) utilizando a interação entre o linho (Linum usitatissimum) e o
seu fungo Melampsora lini, observou que não era somente a resistência da
planta que era herdada, mas também a virulência do patógeno. Este trabalho
originou o clássico modelo “gene-a-gene”, que propõe que para a resistência
ocorrer, pares complementares de genes dominantes, um na planta hospedeira
e outro no patógeno, são necessários. Uma perda ou uma alteração tanto no
gene de resistência (R) da planta quanto no gene de avirulência (Avr) do
patógeno resultará na doença (=compatibilidade). Este simples modelo serve
para muitos patógenos biotróficos, como fungos, bactérias, vírus e nematóides
(Hammond-Kosack, 1997). O reconhecimento da invasão do patógeno mediado
pelas proteínas R, inicia uma resistência forte e efetiva, impedindo o crescimento
do patógeno (isto é denominado de interação incompatível ou incompatibilidade,
onde a planta é resistente e o patógeno é avirulento). A ausência de
reconhecimento específico permite o crescimento e difusão do patógeno (isto é
13
denominado de interação compatível ou compatibilidade, onde a planta é
suscetível e o patógeno virulento) (Nimchuk et al., 2003). No entanto, mesmo
sem haver um reconhecimento específico, o sistema de defesa da planta estará
ativado até certo nível, o nível basal, limitando assim a propagação da doença. O
reconhecimento específico ao contrário, na maioria dos casos, promove uma
super ativação das respostas de defesa basais, e frequentemente vêm
acompanhadas por uma forma de morte celular programada, a chamada
resposta de hipersensibilidade (HR) (Van der Hoorn e Jones, 2004). A morte
celular localizada associada à HR impede o avanço do patógeno nos tecidos não
infectados. Concomitantemente com o aparecimento da HR ocorre o aumento da
síntese de várias famílias de proteínas relacionadas à patogênese ou proteínas
PR (Pathogenesis-related proteins), (Durrant e Dong, 2004). Muitas dessas
proteínas exibiram atividade antimicrobiana tanto in vitro quanto in vivo. As
proteínas PR são expressas em regiões não inoculadas da planta permitindo um
maior espectro da resistência conhecido como resistência sistêmica adquirida ou
SAR (Systemic Acquired Resitance), (Ryals et al., 1996) e por causa desta
correlação, o aumento da expressão de genes PR é frequentemente utilizado
como marcadores para SAR (Durrant e Dong, 2004).
1.5.2.Genes R e suas proteínas
As proteínas codificadas pela maioria dos genes de resistência R já
caracterizados, possuem motivos encontrados em outras proteínas receptoras e
de transdução de sinal. As proteínas R estão dividas em cinco classes: classe 1
formada pela proteína PTO de tomate, possui uma região catalítica com uma
serina-treonina quinase e o motivo de miristilação no amino-terminal (Loh et al.,
1998 in Martin et al., 2003). A classe 2 engloba o maior grupo de proteínas de
resistência (exs.: MI de tomate e RPS2 de Arabidopsis que conferem resistência
à Meloidogyne incognita e Pseudomonas syringae respectivamente), possui uma
região com repetições de leucina (LRRs- Leucine Rich-repeats) na porção do
carboxi-terminal e um domínio de ligação a nucleotídeos (NBS - Nucleotide-
binding site) na porção amino-terminal (Bent et al., 1994; Milligan et al., 1998;
Martin et al., 2003). Enquanto a região LRR é muito variável, a região NBS
apresenta motivos conservados (Kobe e Deisenhofer, 1994; Belkhadir et al.,
14
2004). Estes genes que codificam para estas proteínas são muito abundantes
nos genomas de plantas, sendo estimado em 1% no genoma de Arabidopsis
(Meyers et al., 1999). Nenhuma outra função, além, da resistência a doenças
lhes foi atribuída até o momento (Belkhadir et al., 2004). A classe NBS-LRR dos
genes de resistência podem ainda ser subdividida. Esta divisão é baseada na
sua habilidade de codificar para outros domínios reconhecíveis. Uma subclasse
(ou também classificada como classe 3 por Martin et al., 2003) codifica para o
domínio TIR, que tem homologia com o domínio Toll do gene de Drosophila e
homologia com os receptores interleucina-1 (Interleukin-1 Receptor) de genes de
mamíferos na porção N-terminal da proteína (Hulbert et al., 2001). As proteínas
NBS-LRR sem o domínio TIR codificam tipicamente para uma estrutura coiled-
coil próxima ao N-terminal, e algumas vezes na forma de zíper de leucina
(leucine zipper). As proteínas R das três primeiras não possuem domínios
transmembrânicos (TM) e têm localização intracelular (Martin et al., 2003). A
classe 4 é formada pelas proteínas CF (Cladosporium fulvum) de tomate. Elas
não possuem domínio NBS, no entanto, possuem domínio transmembrana e um
domínio LRR extracelular, bem como uma pequena porção putativamente
citoplasmática sem motivos conhecidos (Martin et al., 2003). A classe 5 é
formada pela proteína XA21 de arroz que além de possuir o domínio TM e LRR
extracelular possui uma região serina-treonina quinase (STK) citoplasmática
(Song et al., 1995). Algumas poucas proteínas R não se agrupam nas cinco
classes anteriores porque possuem motivos estruturais diferentes, as agem
especificamente contra certos patógenos, como exemplos temos: MLO de
cevada e RPW8 de Arabidoposis que conferem resistência ao fungo Blumeria
graminis (Buschges et al., 1997; Xiao et al., 2001), HS1
PRO1
de beterraba que
confere resistência ao nematóide de cisto Heterodera schachtii (Cai et al., 1997).
Os produtos dos genes de resistência não atuam sozinhos no controle das
reações de defesa, outros genes estão envolvidos na resistência mediada pelos
genes R (von Loon et al., 2006).
1.5.2.1. Genes R e a identificação destas resistências aos
nematóides Meloidogyne spp.
Em nematologia o termo resistência é usado para descrever a habilidade
de uma planta de inibir ou suprimir o desenvolvimento ou reprodução de um
15
nematóide (Trudgill, 1991). Esta resistência pode ir de baixa ou moderada a
elevada. Uma planta altamente ou completamente resistente não permite a
reprodução de nematóides ou qualquer vestígio de infecção. Plantas
parcialmente ou moderadamente resistentes permitem algum nível de
reprodução dos nematóides. Já as plantas susceptíveis permitem o seu
desenvolvimento normal (Cook e Evans, 1987 in Davis et al., 2000).
Diversos genes de resistência a nematóides (Nem-R) foram isolados a
partir de plantas, todos conferindo resistência aos endoparasitas sedentários
(Tabela 2) (Williamson e Kumar, 2006). O primeiro gene de resistência a ser
clonado foi Hs1
pro-1
de beterraba e que confere resistência ao nematóide de cisto
Tabela- 2 – Genes de resistência a nematóides (Nem-R) já clonados e mapeados. (Tabela
adaptada do artigo Williamson e Kumar, 2006)
Genes
Classe de Gene R
Planta Nematóide Referência
Clonado
Hs1
pro-1
- Beterraba Nematóide de cisto de beterraba:
Heterodera schachtii
Cai et al., 1997
Mi-1 NBS-LRR não-TIR Tomate Nematóides das galhas: Meloidogyne
incógnita, M. javanica, M. arenaria;
Afídeo de Batata: Macrosiphum
euphoribiae;
Mosca-branca: Bemisia tabaci
Milligan et al. (1998);
Vos, et al. (1998)
Hero A NBS-LRR não-TIR Tomate Nematóide de cisto da batata:
Globodera rostochiensis (Ro1, Ro3 e
Ro5)
Bleve-Zacheo, et al.
(1998); Ernst et al.
(2002)
Gpa2 NBS-LRR não-TIR Batata Nematóide de cisto da batata:
populações específicas de G. pallida
Van der Vossen,et al.,
2000
Gro1-4 NBS-LRR não-TIR
Batata Nematóide de cisto da batata: G.
rostochiensis (Ro1)
Paal et al., 2004
Rhg1 e Rhg4 LRR (Domínio Transmembrânico
Extracelular e Domínio Citossólico
Serina-Treonina Quinase
Soja Nematóide de cisto da soja:
Heterodera glycines Tipo 0
Hauge et al., 2001;
Lightfoot e Meksem,
2002
Mapeado
H1 - Batata Nematóide de cisto da batata: G.
rostochiensis (Ro1 e Ro4)
Bakker et al., 2004
Mi-3 - Tomate Nematóides das galhas: M. incognita,
M. javanica, M. arenaria
Yaghoobi et al., 2005
Mi-9 - Tomate Nematóides das galhas: M. incognita
Ammiraju et al., 2003
Cre1 - Trigo Nematóide de cisto de cereal:
Heterodera avenae
De Majnik et al., 2003
Cre3 - Trigo Nematóide de cisto de cereal:
Heterodera avenae
De Majnik et al., 2003
Ma - Ameixa Nematóides das galhas – todas as
espécies testadas
Claverie et al., 2004
Has-1
Og
- Arroz Nematóide de cisto: Heterodera
sacchari
Lorieux. et al., 2003
Me3 - Pimenta Nematóides das galhas: M. incognita,
M. javanica, M. arenaria e alguns
isolados de M. hapla
Djian-Caporalino et al.,
2001
Rmc1 - Batata Nematóides das galhas: M. chitwoodi,
M. falax e alguns isolados de M. hapla
Rouppe van der Voort,
et al., 1999
16
Heterodera schachtii (Cai et al., 1997). Os genes NemR clonados a partir de
tomate como o Mi-1 e o Hero A, conferem resistência a várias espécies de
nematóides das galhas (Milligan et al., 1998 ; Vos et al., 1998) e a outras duas
espécies de nematóide de cisto que atacam batata (Ernst et al., 2002),
respectivamente. Muitas das variedades modernas de tomate possuem o gene
dominante e único Mi. Este gene tem sido um exemplo clássico mostrando que o
uso de gene de resistência reduz a necessidade de aplicação de pesticidas
(Barker, 2003). Todos esses genes são membros da classe NBS-LRR dos genes
R, que não contem o domínio TIR no amino-terminal (Williamson e Kumar,
2006).
O primeiro sucesso alcançado na geração de plantas resistentes a
nematóides de interesse comercial foi com a introgressão do gene Mi
identificado na espécie silvestre Solanum peruvianum (ex-Lycopersicon
peruvianum), (Smith, 1944; Spooner et al. 1993; Peralta e Spooner 2001; Peralta
et al., 2005), e transmitido para Solanum esculentum (tomate). Este gene
confere resistência aos nematóides das galhas: M. incognita, M. hapla e M.
arenaria.
Outros genes de resistência aos nematóides das galhas também já foram
identificados. O gene Me identificado em Phaseolus vulgaris, feijão (Omwega e
Roberts, 1992), em Capsicum annuum, pimenta (Hendy et al., 1985 in Bleve-
Zacheo et al.,1998) e o gene N, também identificado em pimenta (Hare et al.,
1957 in Thies et al., 2000), conferem resistência aos nematóides M. arenaria
raça 1 e 2, M. hapla e M. javanica. Já o gene Mex-1 confere resistência a M.
exigua em café (Noir et al., 2003)
1.5.2.2. Prospecção de Genes de Resistência
Genes R têm diversas similaridades estruturais, independentemente da
espécie da planta da qual são isolados ou do tipo de patógeno que reconhecem.
Apesar de já haver genes de resistência a nematóides identificados em espécies
silvestres e cultivares resistentes derivados destas, eles ainda são poucos
(Vrain, 1999 e Roberts, 2002). Existe a necessidade de se identificar um maior
número de genes e de cloná-los, para assim, poder estudar os mecanismos de
defesa, ou seja, a natureza destas defesas e também para desenvolver
17
cultivares resistentes (Vrain, 1999). Uma estratégia básica para se localizar
genes de resistência em plantas é a construção de um mapa genético baseado
em marcadores moleculares associados ao gene de resistência encontrado
(Vrain, 1999). Estes marcadores podem ser RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphisms), RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphisms), ou SSRs (Simple Sequence
Repeats) que estão associados com um fragmento de DNA que sempre co-
segrega com a característica de resistência nos cruzamentos (Vrain, 1999).
Outra metodologia amplamente empregada é a utilização das seqüências
de genes candidatos que utiliza regiões conservadas dos genes que se deseja
isolar para a construção de primers de PCR (Reação de Polimerase em Cadeia).
A similaridade das seqüências de aminoácidos das regiões NBS e LRR permite
a construção de primers para isolar regiões de genes R de outras espécies por
amplificação de DNA através da técnica de PCR (Aarts et al., 1998). Em alguns
trabalhos, primers foram construídos para a região NBS e o produto da provável
tradução indica similaridade com genes de resistência conhecidos. Regiões
análogas a genes de resistência de diversas espécies de Arachis foram isoladas
e clonadas e serão utilizadas como marcadores moleculares para o isolamento
de genes de resistência (Bertioli et al., 2003, Yüksel et al., 2005).
Uma outra estratégia ainda, pode ser a geração de ESTs (Expressed
Sequence Tags). Os ESTs são uma forma complementar, mas extremamente
rápida de identificação de novos genes (Höfte et al., 1993). ESTs são
seqüências curtas de DNA produzidas a partir de clones de cDNA escolhidos
aleatoriamente e sequenciados uma única vez (Gautheret et al., 1998). Além de
serem amplamente explorados na identificação de genes novos, vêm também
sendo utilizados para a criação de extensos catálogos de genes (Aaronson et al.,
1996 in Gautheret et al., 1998; Zafar et al., 2002). Estes catálogos permitem a
comparação de similaridades de seqüências a genes já conhecidos sugerindo
assim sua função (Matthews et al., 2001). Estes clones de cDNA podem ser
mapeados assim como clones genômicos têm sido mapeados. O mapeamento
dos clones de cDNA indica a posição dos genes, alguns com função e padrão de
expressão conhecidos, em regiões do genoma que podem ser correlacionadas
com fenótipos. Assim, a associação de marcadores gerados pelo clone de cDNA
com fenótipos pode aumentar o entendimento ou o relacionamento com as vias
18
e mecanismos bioquímicos que afetam características agronômicas como
resistência (Matthews et al., 2001). ESTs podem ser convertidos em marcadores
baseados em PCR através de primers desenhados a partir de suas seqüências.
Se estes primers se mostrarem polimórficos, o clone definido é chamado de STS
(Sequenced Tagged Site) (Matthews et al., 2001).
1.6. ESTs de Leguminosas
Os genomas da maioria das culturas entre as leguminosas são grandes e
complexos. Por exemplo, soja é um poliplóide formado possivelmente há 15 mil
anos atrás (Schlueter et al., 2004 in Doyle et al., 2004) e alfafa é um
autotetraplóide com genomas de aproximadamente 1200 Mb e 1600 Mb
respectivamente. O amendoim cultivado tem um genoma de 2800 Mb e a ervilha
de 4000 Mb (Boerma et al. 2001). Genomas destes tamanhos dificultam
significantemente o desenvolvimento de mapas físicos ordenados, bem como a
identificação e a localização de genes importantes. Relações de sintenia dentro
de famílias botânicas possibilitam o uso de espécies com genomas bem
menores para facilitar no entendimento das espécies com genomas muito
grandes. Alguns exemplos foram o seqüenciamento completo dos genomas
menores como o de Arabidopsis thaliana (128 Mb) (The Arabidopsis-Genome
Iniciative, 2000) e arroz (425 Mb) (Sasaki e Burr, 2000) que promoveram uma
plataforma para a análise do genoma de espécies mais complexas como milho,
canola e trigo.
Para simplificar a análise de genomas entre as leguminosas, foram
propostas, em paralelo, duas espécies como modelos de estudo, ambas
diplóides, autocompatíveis, com genoma pequeno e ciclo de vida curto. A
primeira, Medicago truncatula, (2n = 4x = 32), tem genoma de 450 Mb, parece
ter sintenia com alfafa (importante forrageira) e algum grau de sintenia com
ervilha e soja (Bell et al., 2001) e a segunda espécie, Lotus japonicus, (2n = 12),
e genoma de 472,1Mb (Handberg et al., 1992 in Sato et al., 2001).
O seqüenciamento de todo genoma de M. truncatula está sendo
executado (Cheung et al., 2006) e até o momento (março/2007) já foram gerados
225.487 ESTs, e concomitantemente foram gerados 150.631 ESTs para L.
japonicus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html).
19
Como os genomas de soja e amendoim são muito grandes, uma
alternativa é o seqüenciamento de ESTs ao invés do genoma todo. Shoemaker
et al. (2002) já geraram 12.000 ESTs não-redundantes de soja. O estudo destes
ESTs já permitiu a identificação de genes de diferentes bibliotecas (situações) e
também permitiu a construção do quadro histórico da evolução genética da soja
(Nelson e Shoemaker, 2006). Neste trabalho apresentamos a primeira geração
de ESTs de espécie silvestre de amendoim Arachis stenosperma.
1.7. Análise da expressão gênica
O estudo da expressão gênica tem demonstrado ser uma importante
ferramenta no entendimento dos processos biológicos em nível molecular. Por
exemplo, estes estudos podem ser utilizados na identificação de rede de genes
expressos de fundamental importância no desenvolvimento de determinada
estrutura, ou na resposta de um organismo a um estímulo externo. O estudo da
expressão gênica diferencial pode contribuir para a caracterização de
resistências, pois possibilita a identificação de genes–chave de redes pela
comparação da expressão gênica durante o desenvolvimento de uma estrutura
sob condições normais e em organismos carregando uma mutação ou
submetidos a algum tipo de estresse (Park et al., 2006; Cheung et al., 2006;
Jeong et al., 2006; Gorantla et al., 2006; Li et al., 2007). O conjunto de dados da
expressão diferencial de vários genes sob diferentes condições, pode ser usado
para reconstruir as vias reguladas por estes genes, predizer onde eles atuam e
identificar novos genes associados ao processo. Para o entendimento da função
de um gene, é fundamental o estudo de onde e quando ele é expresso.
Recentemente, várias estratégias foram desenvolvidas para permitir o estudo da
função de vários genes simultaneamente, entre elas: a genética reversa
(geração de mutações específicas em genes de interesse), screens mutagênicos
(geração de mutações randômicas e screening de um pool de mutantes para se
identificar fenótipos de interesse) e bioinformática (a análise dos dados gerados
por todas as estratégias acima) (Guimarães et al., 2005). As estratégias acima,
associadas aos projetos genoma, que têm como objetivo o seqüenciamento do
genoma inteiro de vários organismos, têm possibilitado o estudo sistemático da
expressão diferencial de genes em nível de genoma como um todo. A análise da
20
expressão diferencial de genes em resposta ao ataque de um patógeno constitui,
portanto, ferramenta importante no isolamento de genes de resistência ou de
fatores envolvidos com a interação patógeno-hospedeiro (Guimarães et al.,
2005).
1.8. BAC -Bacterial Artificial Chromosome
No final dos anos 80, com a criação dos YACs (Yeast Artificial
Chromosome) (Burke et al., 1987), se tornou possível a clonagem de grandes
fragmentos de DNA (Mbp) e consequentemente, a exploração de genomas
baseada em bibliotecas de grandes genomas se tornou factível. No entanto, os
YACs possuíam sérios inconvinientes como vetores de clonagem (Anderson,
1993), pois 50% dos clones eram quimeras ou possuíam rearranjos nos insertos,
tais como deleções, transposições e inversões (Neil et al., 1990; Burke, 1990;
Venter et al., 1996; Cai, et al., 1998). Tais clones não poderiam ser usados nas
pesquisas de seqüenciamento e mapeamento. E ainda outra desvantagem era
que a manipulação e isolamento dos insertos em YACs era muito difícil (Woo et
al., 1994).
No início dos anos 90, uma nova alternativa surgiu com o
desenvolvimento dos vetores BAC (Bacterial Artificial Chromosome) (Shizuya et
al., 1992). Ao contrário do seu nome, BACs não são realmente cromossomos
artificiais de bactéria, mas sim fatores F modificados. Embora possam
transportar insertos de até 500 kb de comprimento, os mais comuns possuem
entre 80-200 kb (Shizuya et al., 1992; Zhang et al., 1996; Tomkins et al., 1999).
A grande maioria dos vetores BAC possui as características normais de seleção
de plasmídeos como gene de resistência a antibióticos, sítios de clonagens
múltiplas e gene repórter (Choi e Wing, 1999 in Peterson et al., 2000). Os clones
BACs têm diversas vantagens em relação aos YACs, tais como, eficácia de
transformação, não apresentam os quimerismos e nem rearranjos dos insertos;
estes são bastante estáveis e relativamente fáceis de manipular e de serem
propagados comparados aos clones baseados em vírus e leveduras; Marra, et
al., 1997; Yüksel e Paterson, 2005). Por tais motivos estes vetores suplantaram
os YACs e se tornaram o vetor dominante, sendo usado em grande escala no
seqüenciamento e no mapeamento físico (Cai et al., 1998; Kelley et al., 1999).
21
Nas bibliotecas BAC, cada clone é armazenado individualmente e
ordenadamente, tornando-as um grande instrumento da pesquisa da genética
moderna. Estas bibliotecas foram desenvolvidas para diversas espécies vegetais
de importância econômica: amendoim (Yüksel e Paterson, 2005); milho (Messing
et al., 2004); soja (Danesh et al., 1998; Tomkins et al., 1999); arroz (Ammiraju et
al., 2006); trigo (Akhunov et al., 2005; Devos et al., 2005); café (Noir et al., 2004)
entre vários outros.
As bibliotecas BACs podem ser utilizadas em várias aplicações, entre
elas:
(a) Isolamento de genes de interesse: a propriedade de ser o próprio molde
para seqüenciamento de DNA e molde para reações de PCR permitiu o
desenvolvimento do seqüenciamento de BAC-ends (Venter et al., 1996),
promoveu avanços no mapeamento baseado em STS (Sequence Tagged Site)
(Venter et al., 1998) e permitiu uma maneira rápida de procurar regiões
genômicas bem definidas em genes fenotipicamente significantes (Bouck et al.,
1998).
(b) Mapeamento físico: o vetor BAC trouxe comodidades para clonagens de
grandes fragmentos que combinadas com o desenvolvimento de métodos de
grande escala para DNA fingerprinting (Marra et al.,1997), com o agrupamento
das seqüências em contigs (Ding et al., 1999), o seqüenciamento de
extremidades do BAC (BAC-end), e o mapeamento baseado em STS auxiliaram
na ligação entre marcadores de DNA no mapeamento físico. Consequëntemente
muitos genes interessantes e importantes têm sido isolados (Cai et al.,1998;
Sanchez et al.,1999). O mapeamento físico em larga escala já resultou na
construção de vários contigs de BAC, englobando cromossomos inteiros e/ou
grupos de cromossomos completos (Mozo et al.,1999; Janda et al., 2006).
(c) Ligação entre mapas genéticos e físicos: muitas sondas de DNA usadas
para construir mapas genéticos podem ser localizadas diretamente nos BACs
permitindo uma maneira de superpor mapas genéticos diretamente nos mapas
físicos baseados em BACs. Esta característica facilita a clonagem baseada em
mapas de genes responsáveis por fenótipos específicos (Sanchez et al.,1999;
Lamoureux et al., 2006), bem como o estudo de sintenia, ou seja, comparação
de regiões homólogas entre genomas (Rana et al., 2004; Choi et al., 2004; Jakse
et al., 2006).
22
(d) Identificação de regiões cromossomais de interesse: BACs têm sido
empregados com sucesso como sondas de experimentos de hibridização de
fluorescência in situ (FISH- Fluorescence in situ hybridization) (Gómez et
al.,1997; Mokros et al., 2006). A localização no cromossomo de seqüências de
DNA clonadas baseada em FISH permite que os mapas físicos e moleculares
sejam diretamente sobrepostos nas estruturas dos cromossomos, e
subsequentemente permite informações úteis sobre as relações entre estrutura
cromossomal, seqüência de DNA e recombinação genética (Peterson et
al.,1999; Messing et al., 2004; Rana et al., 2004; Akhunov et al., 2005).
(e) Seqüenciamento de genomas: muitos seqüenciamentos de genomas
completos têm empregado a estratégia de clonagem em BACs (Venter et
al.,1998; Zhang et al., 2001; Yu et al., 2002; Sato et al., 2006) e muitos outros.
(f) Comparação entre genomas.
O mapeamento físico permite uma visão de como os clones de mapas
genéticos estão distribuídos pelo genoma. Estes mapas fornecem maneiras para
clonagem posicional, já que na essência são como andar sobre os
cromossomos. O mapeamento físico de Arachis possibilitará a localização
cromossômica de genes de interesse, o que auxilia no processo de
melhoramento assistido, além de possibilitar a análise genômica comparativa
entre Arachis e outras espécies, especialmente aquelas da família das
leguminosas, possibilitando seleção assistida por marcadores e isolamento de
genes de interesse.
2. PROBLEMA
O amendoim cultivado foi originado a partir de um ou poucos eventos de
hibridização entre espécies de Arachis de genomas diferentes (A e B). Essas
plantas sofreram alotetraploidização espontânea e se tornaram geneticamente
distantes de seus parentes silvestres. O amendoim cultivado apresenta pequena
base genética e alta suscetibilidade a doenças e seca, enquanto que seus
parentes silvestres apresentam altos níveis de resistência. Visando aumentar a
base genética do amendoim cultivado, busca-se a identificação de genes de
resistência em germoplasma silvestre para sua introgressão em amendoim.
23
Ainda são poucos os estudos em genética e genômica de Arachis, e poucos os
genes de resistência isolados a partir dessas espécies.
24
3. HIPÓTESES
- Espécies silvestres de Arachis apresentam maior diversidade genética do
que o amendoim cultivado e contêm genes de resistência a fatores bióticos.
- A análise da expressão gênica diferencial de plantas de A. stenosperma
inoculadas com M. arenaria possibilitará a identificação de genes associados à
resistência ao nematóide.
- O desenvolvimento de ferramentas genéticas, como bibliotecas do tipo
BAC, possibilitarão o isolamento de genes de interesse do amendoim silvestre e
sua comparação com o genoma de outras leguminosas.
4. JUSTIFICATIVAS
Da planta modelo:
1) O amendoim cultivado é a quarta cultura entre as oleaginosas, sendo
importante na produção de amêndoas para consumo em natura ou produção de
óleo para dieta e indústria. É muito suscetível a pragas e doenças e as perdas
com os patógenos são bastante expressivas economicamente e merecem um
combate alternativo, isto é, sem o uso de agroquímicos grande tão prejudiciais
ao meio ambiente.
2) Existe um banco de germoplasma de mais de 100 espécies silvestres de
Arachis sendo estas consideradas, a grande fonte de novos genes de
resistências aos patógenos do amendoim cultivado, e aquele está disponível
para o seu estudo.
3) Há falta de conhecimento sobre genes de resistência dentro da família
das leguminosas. O Arachis apesar de possuir um grande genoma, possui
particularidades importantes que podem ser extrapoladas para outras espécies,
se tornando também um modelo paralelo de estudo dentro da família, ao lado de
Lotus japonicus e Medicago truncatula.
4) Os clones gerados nas bibliotecas poderão ser usados diretamente como
marcadores ligados a genes ou gerar seqüências microsatélites e assim auxiliar
25
no mapeamento genético de Arachis, contribuindo assim com os resultados
gerados para os projetos dos quais este trabalho está inserido.
Da praga modelo:
1) M. arenaria é um fitoparasita de grande importância econômica. É uma
praga de amplo espectro, que agride várias culturas, amendoim, milho, maçã,
pimenta, tabaco, ervillha, várias hortaliças e está distribuído no mundo todo.
2) M. arenaria raça 1 consegue infectar as espécies silvestres deste estudo.
Muitas outras, inclusive M. arenaria raça 2, M. incognita e M. javanica raça 4
(esta última, infecta algumas espécies silvestres), foram testadas sem sucesso
quanto ao parasitismo. É parasita biotrófico obrigatório e também, hospedeiro
natural do tomateiro tornando sua manutenção (multiplicação) e manipulação
relativamente fácil.
Da estratégia escolhida:
1) Projetos que envolvem a produção e análise de ESTs estão aflorando
pelo mundo, gerando um grande volume de informações básicas a respeito da
expressão gênica diferencial em diferentes situações de várias espécies.
2) A geração de ESTs permitirá o acúmulo de informação através da criação
de um banco de dados de genes diferencialmente expressos, o que não está
disponível em Arachis. Este banco de dados será um recurso com diversas
utilidades, como o desenvolvimento de marcadores moleculares, busca de
homólogos de genes já identificados como importantes na interação planta-
patógeno e etc.
3) A Embrapa e a Universidade Católica de Brasília oferecem a estrutura
necessária para a produção de bibliotecas de cDNA, para o seqüenciamento em
larga escala e para a análise através de bioinformática das seqüências.
4) Colaboração com CIRAD- Centre de Coopération Internationale en
Recherche Agronomique pour le Développement). Este centro possui estrutura
física e técnica adequada para a geração, manipulação e manutenção de grande
26
número de clones, como aparelhos de robótica. Estes são imprescindíveis
durante o processo de construção e validação das bibliotecas BAC.
5. OBJETIVO GERAL
Desenvolver ferramentas para o isolamento de genes relacionados com
resistência.
5.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Estudar a interação planta-nematóide (M. arenaria raça 1) através do
estudo histopatológico.
2) Estudar a expressão gênica de plantas sabidamente resistentes e
susceptíveis através de seqüenciamento massal de cDNA.
3) Gerar um banco de dados de genes expressos de Arachis relacionados
com a resistência a M. arenaria raça 1.
4) Validação da expressão diferencial de alguns genes candidatos através
da técnica de Northern blot.
5) Construção, validação e procura de RGAs (Genes Análogos de
Resistência - Resistance Gene Analogs) em bibliotecas BAC dos parentais
silvestres do amendoim cultivado.
27
Este trabalho é parte integrante dos projetos, “Prospecção e análise da
expressão de genes envolvidos com resistência a nematóides do gênero
Meloidogyne em germoplasma silvestre de Arachis spp.” e do projeto ARAMAP,
“The identification of resistances to biotic stress in wild Arachis germoplasm, and
the development of tools for breeding by genetic mapping and comparative
genomics”. O primeiro é financiado pelo Banco Mundial e Embrapa e o segundo
pela Comunidade Européia.
Vários grupos estão envolvidos neste estudo: Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia (DF-Brasil), Universidade Católica de Brasília (DF-
Brasil), Unesp-Botucatu (SP-Brasil), Universidade de Aarhus (Dinamarca),
Sainbury´s Laboratory (Inglaterra) e Instituto de Botânica Del Nordeste
(Argentina). Cada grupo está desenvolvendo uma parte deste estudo
multidisciplinar que uma vez integrado permitirá a criação de um mapa genético,
de um mapa físico e da identificação de genes de resistência em Arachis spp.
Este trabalho também permite a excelente combinação da biotecnologia e
dos recursos genéticos. A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia é
possuidora de um dos bancos de germoplasma de espécies silvestres de
Arachis mais completos do mundo.
O trabalho foi dividido em quatro partes: inicialmente se estudou a
interação do nematóide M. arenaria raça 1 com duas espécies silvestres
diplóides e com o amendoim cultivado. Procurou-se estudar como se dá o
desenvolvimento do nematóide nestas espécies e identificar o mecanismo de
defesa na espécie resistente, visou-se ainda a quantificação da reprodução do
nematóide nas espécies analisadas. A segunda parte do trabalho visou a
identificação in silico de genes diferencialmente expressos entre bibliotecas de
raízes A. stenosperma (espécie resistente) inoculadas e não inoculadas com o
nematóide. A terceira parte visou a validação através de experimentos de
Northern blot dos genes diferencialmente expressos identificados na análise in
silico. A expressão destes mesmos genes foi investigada num sistema
compatível. A quarta parte do trabalho procurou desenvolver uma ferramenta
genômica - bibliotecas BAC- das espécies parentais do amendoim cultivado, que
entre outras aplicações, permitirá o isolamento dos genes diferencialmente
expressos identificados e analisados.
28
Capítulo 1
Desenvolvimento Pós-infecção e Histopatologia
de Meloidogyne arenaria raça 1 em Arachis spp.
Este capítulo contém a tradução do manuscrito em preparação referente aos
resultados do estudo histopatológico (Anexo I).
1. INTRODUÇÃO
29
Os nematóides das galhas (Meloidogyne spp.) são endoparasitas obrigatórios
que induzem transformações complexas nas suas plantas hospedeiras. Os
juvenis de segundo estágio (J2) invadem as raízes pela zona de elongação, e
migram entre as células e estabelecem um sítio de alimentação na zona de
diferenciação do cilindro vascular (Wyss et al., 1992; Williamson e Hussey,
1996). Meloidogyne arenaria raça 1 (Neal) Chitwood (Koenning e Barker, 1992;
McSorley et al., 1992); M. hapla Chitwood (Culbreath et al., 1992; Schmitt et al.,
1998); M. javanica (Treub) Chitwood (Tomaszewski et al., 1994) e M. haplanaria
(Eisenback et al., 2003) são as quatro espécies descritas que parasitam o
amendoim cultivado (Arachis hypogaea L.). Entre estes, o que causa maiores
danos à cultura nos Estados Unidos é M. arenaria raça 1. As perdas na
produção podem exceder 50 % em campos infestados (McSorley et al., 1992).
O controle dos nematóides das galhas é limitado e inclui a aplicação de
nematicidas no solo, os quais são economicamente dispendiosos, têm baixa
eficácia e ainda, são prejudiciais à saúde humana e ao meio ambiente (Bird e
Kaloshian, 2003). Como existem diversos efeitos negativos associados ao uso
destes químicos, o emprego de plantas resistentes é bastante considerado como
uma forma de controle para os nematóides das galhas. A resistência ao
nematóide M. arenaria raça 1, M. javanica e M. hapla foi observada em muitas
espécies silvestres de amendoim (Banks, 1969; Nelson et al., 1989; Holbrook e
Noe, 1990; Sharma et al., 1999).
M. arenaria raça 1, conhecido como o nematóide do amendoim, é o mais
agressivo dentre as quatro espécies de nematóides das galhas que ataca esta
cultura. A resistência a este nematóide foi caracterizada em duas espécies
silvestres, A. cardenasii e A. batizocoi. A primeira espécie inibe completamente o
desenvolvimento do nematóide e esta resistência foi acompanhada por uma
reação de hipersensibilidade (Nelson et al.,1990). A segunda provocou a
redução do número total de nematóides invasores que conseguiram chegar à
maturidade, produzir ovos e aumentou o período do ciclo de vida do nematóide.
Nesta espécie não foi observada reação de hipersensibilidade (Nelson et
al.,1990). As duas espécies foram usadas para a geração dos cultivares
resistentes de A. hypogaea COAN e NemaTAM através da introgressão dos
30
genes (Simpson, 1991) envolvendo um complexo de híbridos anfidiplóides inter-
específicos (Simpson et al., 2001; Simpson et al., 2003).
Foi realizada uma busca dentre várias espécies silvestres de Arachis do
banco de germoplasma de Arachis da EMBRAPA Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Brasília, Brasil, para se identificar e caracterizar novas fontes de
resistências e também para identificar parentais contrastantes quanto a
resistência à M. arenaria raça 1 que poderiam ser usados na formação de uma
população e na construção de um mapa genético (Moretzsohn et al., 2005).
Numa primeira sondagem as espécies. A. stenosperma (acesso V10309) e A.
duranensis (acesso K7988) pareciam ser resistente e suscetível respectivamente
(Leal-Bertioli, S.C.M., comunicação pessoal).
As espécies silvestres de Arachis são tidas como importantes fontes de
genes para resistência a vários fungos, vírus e nematóides (Stalker, 1984,
Wynne et al., 1991). Os objetivos do presente trabalho são: i) confirmar a
resistência ou a susceptibilidade de A. stenosperma (acesso V10309) e A.
duranensis (acesso K7988), utilizando A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST como
controle de susceptibilidade; ii) examinar a interação de M. arenaria raça 1 com
A stenosperma, A. duranensis e A. hypogaea, para determinar quando e como a
resistência é expressa; iii) compreender os mecanismos de resistência à M.
arenaria raça 1 comparando as respostas histológicas de resistência e
susceptibilidade nas espécies de Arachis.
31
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Nematóide e Preparação do Inóculo
Todos os experimentos foram conduzidos na Quarentena da EMBRAPA
Recursos Genéticos e Biotecnologia e com o nematóide M. arenaria raça 1
isolado de amendoim e gentilmente cedido pelo Dr. D. W. Dickson (Universidade
da Flórida, Gainesville, EUA). Foi efetuada uma eletroforese da enzima esterase
fenótipo A2 para confirmar a identidade do nematóide (Carneiro e Almeida,
2001). Os nematóides foram multiplicados alternadamente em amendoim
(Arachis hypogaea cv. IAC-Tatu-ST) e tomate (Solanum esculentum cv. Santa
Cruz). Os ovos foram extraídos de raízes infectadas utilizando-se 0,5% NaOCl
(Hussey e Barker, 1973). Os ovos foram eclodidos em funis modificados de
Baermann e os juvenis de segundo estágio (J2) foram coletados por
centrifugação e contados em lâminas de Peter sob microscópio de luz (Vrain,
1977).
2.2. Avaliação do Fator de Reprodução do Nematóide em Arachis spp.
Duas espécies silvestres de Arachis (A stenosperma acesso V10309 e A.
duranensis acesso K7988) foram avaliadas quanto à resistência ao nematóide
M. arenaria raça 1 sob condições de casa de vegetação (25 – 30 °C). A espécie
comercial e suscetível Arachis hypogaea cv. IAC-Tatu-ST foi utilizada como
controle. Plantas das diferentes espécies foram crescidas e mantidas em vasos
plásticos (3000 cm
3
) contendo uma mistura de solo de estéril. As plantas com
quatro semanas de idade foram inoculadas com 10.000 ovos/planta (Pi -
população inicial). Os ovos foram introduzidos a 3 cm de profundidade ao redor
da base do caule das plantas. Os vasos foram dispostos num delineamento em
blocos completamente casualizados com oito repetições. Setenta e cinco dias
após inoculação (DAI), os diferentes tratamentos foram avaliados através da
extração dos ovos e dos J2s a partir de todo sistema radicular, utilizando-se 1%
NaOCl. A população final (Pf) foi quantificada utilizando-se lâmina de Peter sob
32
microscópio de luz e o fator de reprodução (Fr= Pf/Pi) foi calculado (Oostenbrink,
1966). As médias dos fatores de reprodução foram comparadas pelo Teste de
Tukey com diferença de probabilidade de 5%. Os tratamentos com Fr < 1,00
foram considerados como resistentes à M. arenaria raça 1.
2.3. Estudos Histopatológicos
Quarenta e cinco plântulas cada espécie de Arachis foram transplantadas
para copos plásticos de 200 cm
3
contendo a mistura estéril de duas partes de
MaxPlant e uma parte de areia fina. Plantas com duas semanas de idade
contendo de seis a oito folhas expandidas foram inoculadas com 5000 juvenis de
segundo estágio (J2)/planta. Foram utilizadas uma planta como controle para
cada espécie. As plantas controles receberam somente água destilada com o
mesmo volume do inóculo. As raízes inoculadas foram removidas e lavadas
cuidadosamente nos seguintes pontos: 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 32, 48
e 63 dias após inoculação (DAI). Várias pontas de raiz, (segmentos de 1 a 3 cm
de comprimento) foram analisadas sob uma lupa esteroscópica e sob o
microscópio de luz (Axiophoto, Zeiss) utilizando-se a técnica de clarificação com
NaOCl e coloração com fucsina ácida (Byrd et al., 1983). Esta técnica foi
utilizada para facilitar a identificação dos sítios de infecção. Para os cortes finos,
as pontas das raízes com algum intumescimento foram cortadas e fixadas em
2% glutaraldeído em 0,1 M tampão cacodilato de sódio pH 7,0 a 4 °C por 48
horas. As pontas foram lavadas três vezes por dez minutos em 0,1 M cacodilato
de sódio pH 7,0. Pós-fixadas em 2% tetróxido de ósmio em 0,1 M cacodilato de
sódio pH 7,0 por duas horas e lavadas novamente por três vezes por cinco
minutos cada vez no mesmo tampão. O material sofreu desidratação seriada por
30 minutos cada em etanol (20% - 100%), seguida de duas desidratações
adicionais com 100% etanol. As amostras foram infiltradas com resina Spurr em
um volume constante de 100% etanol por 4-6 h (1V:3V; 2V:3V; 3V:3V; 4V:3V) e
polimerizadas a 70 °C por 24 h. Os tecidos emblocados foram cortados com
ultramicrótomo em secções de 0,5 – 1,4 µm de espessura e colocados em
lâminas de vidro, corados com azul de toluidina (1% w/v, em bórax, pH 8,9). Os
cortes foram examinados em microscópio de luz (Axiophoto, Zeiss).
33
3. RESULTADOS
3.1. Avaliação do Fator de Reprodução do Nematóide em Arachis spp.
O fator de reprodução (Fr) de M. arenaria raça 1 após 75 DAI (Tabela 1)
nas três espécies de Arachis mostrou que o controle Arachis hypogaea cv. IAC-
Tatu-ST é suscetível (Fr = 16,4), A. duranensis (K7988) é moderadamente
suscetível (Fr = 3,5) e que A. stenosperma (V10309) é altamente resistente ou
imune (Fr = 0). Estes resultados são adequados para o objetivo de se encontrar,
entre as espécies silvestres, parentais contrastantes em relação à resistência a
nematóides.
3.2. Observações Histológicas das Raízes Infectadas das Espécies
Suscetíveis A. hypogaea cv IAC-Tatu-ST e A. duranensis K7988
Observações macroscópicas aos 3-8 DAI das raízes clarificadas e
coradas com fucsina ácida revelaram que vários J2 penetraram com sucesso as
raízes através da região apical de ambas as espécies. Muitos J2 entraram nas
raízes e migraram em grupos através do córtex (Fig. 1a e 1b). A penetração foi
observada até 11 dias. Aos nove DAI, J2/J3 em forma de salsicha, foram
observados no cilindro vascular iniciando o estabelecimento do sítio de
alimentação. Aos 11-13 DAI, as raízes infectadas começaram a aumentar o seu
diâmetro nas duas espécies de amendoim. Foi possível observar juvenis de
terceiro estágio (J3) em A. duranensis (Fig. 1c) e suas raízes começaram a
formar pequenos intumescimentos, já nas raízes de A. hypogaea, foram
observados J3-J4 e galhas maiores e mais largas nos sítios de infecção do
nematóide (Fig. 1d). Aos 15-19 DAI, observações macroscópicas mostraram que
nas duas espécies o sítio de alimentação já estava estabelecido. Aos 32 e 48
DAI, fêmeas com massas de ovos já foram observadas em A. hypogaea,
enquanto até 63 DAI foram observadas fêmeas com forma globóide nas raízes
de A. duranensis (Figs. 1e e 1f). O desenvolvimento de M. arenaria raça 1 nas
raízes de A. hypogaea foi mais rápido que em A. duranensis. Análises
microscópicas mostraram claramente o atraso na evolução do desenvolvimento
34
dos nematóides nas raízes da espécie silvestre suscetível, A. duranensis
comparado com o amendoim cultivado. Nas duas espécies, os nematóides foram
localizados perto dos tecidos vasculares indicando que a formação das galhas
foi iniciada em células pouco diferenciadas do parênquima. As células
hospedeiras de A. hypogaea que se encontravam na porção anterior da cabeça
do nematóide começaram a aumentar de tamanho a partir de 8 DAI (Fig. 2a),
prevendo o estágio final de diferenciação em células gigantes. Aos 16-19 DAI, as
células gigantes que constituíam o sítio de alimentação em A. hypogaea
possuíam uma forma oval e continham um grande vacúolo e outros vários
pequenos e também muitos pequenos núcleos (três a nove por célula gigante),
(Figs. 2b e 2c). Porém apenas aos 16 DAI, foi possível observar o nematóide
iniciando a indução da formação de célula gigante em A. duranensis. A parede
celular estava começando o processo de espessamento (Fig. 2d). Aos 19 DAI foi
observado célula gigante induzida com muitos vacúolos (Fig. 2e) e aos 32 DAI,
células gigantes bem desenvolvidas em A. duranensis. Suas células gigantes
também apresentaram uma forma oval e eram multinucleadas (Fig. 2f). Os
nematóides induziram um maior número de células gigantes, entre oito e dez em
A. duranensis que em A. hypogaea com quatro a seis.
3.3. Observações Histológicas das Raízes Infectadas da Espécie
Resistente A. stenosperma V10309
Observações macroscópicas aos 3-9 DAI revelaram um número reduzido
de J2 na região sub-apical das raízes de A. stenosperma (Fig. 1g) comparado
com a distribuição dos nematóides nas raízes das espécies suscetíveis. Foram
observados nematóides na superfície da raiz com suas cabeças localizadas nas
primeiras camadas de células, indicando que a penetração teve progresso até 17
e 19 DAI (Figs. 1h e 1i). Nestes pontos, bem perto da região anterior dos
nematóides localizados dentro do cilindro vascular das raízes, as células
hospedeiras foram coradas com fucsina ácida e mostraram uma coloração
marrom-amarelada escura. Nestas amostras, quando o J2 (corado com cor de
rosa) tentou induzir o sítio de alimentação, ocorreu uma reação de
hipersensibilidade (Figs. 1h) e os J2s parecem estar mortos no local da necrose,
mostrando uma coloração marrom; talvez todo o tecido estivesse ficando
35
oxidado (Fig. 1i). A análise macroscópica demonstrou que os J2s levaram de oito
a19 DAI para penetrar na ponta da raiz e migrar até o cilindro vascular. A reação
de hipersensibilidade nunca foi observada na região do córtex durante o início da
penetração. Todo J2 encontrado no cilindro vascular estava associado com uma
reação de hipersensibilidade.
A análise microscópica aos 8 DAI mostrou J2 no cilindro vascular. As
células hospedeiras próximas da porção anterior do nematóide mostraram
coloração azul-escura e com citoplasma desorganizado e sem núcleos visíveis
(Fig. 2g). A maioria dos nematóides observada também mostrou o conteúdo
celular desorganizado, contendo o acúmulo de um material com cor azul escuro
(dados não mostrados). Os cortes finos mostraram J2s na epiderme, córtex e na
região vascular. As regiões necrosadas apresentaram coloração cor azul-escura
(Fig. 2h). Não foram observados nematóides em forma de salsicha e nem sítios
de alimentação estabelecidos nas raízes infectadas. Conseqüentemente
nenhuma célula gigante foi induzida em qualquer dos pontos analisados.
Também não foram observados hipertrofia do tecido e hiperplasia das células. A
reação de hipersensibilidade ocorreu ao redor das células da cabeça do
nematóide no cilindro vascular e nunca no córtex ou na epiderme, mesmo
durante seu trajeto até os vasos (Fig. 2i). Não foi possível encontrar nematóides
após 19 DAI e o sistema radicular analisado aos 32-63 DAI mostrou algumas
raízes necrosadas.
36
4. DISCUSSÃO
No presente trabalho, apresentamos pela primeira vez, um estudo em
nível histopatológico do desenvolvimento do ciclo de infecção de M. arenaria
raça 1 em raízes de duas espécies silvestres de amendoim, A. stenosperma
(V10309) e A. duranensis (K7988); e nas raízes do amendoim cultivado, A.
hypogaea cv. IAC-Tatu-ST. Os primeiros objetivos do trabalho foram a
confirmação de genótipos contrastantes entre as espécies silvestres de Arachis
(A. stenosperma e A. duranensis) com relação à resistência ao nematóide M.
arenaria raça 1 e a comparação destes com A. hypogaea. Foi realizada também
a comparação da penetração do nematóide das galhas e o seu desenvolvimento
nas espécies de amendoim.
A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST é a variedade mais plantada no Brasil e foi
escolhida como espécie suscetível controle. O fator de reprodução (Fr) desta
variedade (Fr = 16,4) é semelhante ao Fr da variedade comercial americana,
Florunner (Fr = 15,5), um dos amendoins mais cultivados nos EUA (Holbrook e
Noe, 1990).
Apesar de A. duranensis K7988 ter apresentado um fator de reprodução
(Fr = 3,5) inferior a A. hypogaea, foi mesmo assim, considerado suscetível, pois
de acordo com Oostenbrink (Fr < 1) ou com o conceito de Hussey e Jansen
(2002), que diz que para um genótipo ser considerado resistente tem que
apresentar reprodução do nematóide menor que 10% do genótipo suscetível. Foi
demonstrado que A. stenosperma V10309 tem alto nível de resistência ou pode-
se dizer que é imune pois não ocorreu reprodução de M. arenaria raça 1 nas
suas raízes (Fr = 0), (Tabela 1).
Os juvenis de segundo estágio de M. arenaria raça 1 penetraram nas
raízes da espécie suscetível A. duranensis, estabeleceram sítio de alimentação e
induziram a formação de células gigantes, com algumas diferenças da espécie
comercial suscetível, sendo elas: (i) o desenvolvimento dos nematóides após
penetração foi bastante afetado pelo genótipo hospedeiro, com 32 DAI para
completar o ciclo de vida em A. hypogaea e mais de 63 DAI A. duranensis; (ii) o
tamanho das galhas: pequenas galhas em A. duranensis e grandes em A.
37
hypogaea; (iii) o número de células gigantes: maior em A. duranensis (8-10) que
em A. hypogaea (4-6).
Os dados aqui obtidos sugerem que A. stenosperma apresenta pelo
menos dois tipos de resistência ao nematóide M. arenaria raça 1. Um dos tipos
de resistência suprimiu a penetração dos J2s e o outro impediu o
desenvolvimento após penetração. A resistência em plantas pode ocorrer em
diversos níveis. O fracasso do J2 em penetrar na espécie resistente, A.
stenosperma talvez esteja indicando que existam barreiras físicas e químicas em
suas raízes. Tais barreiras foram sugeridas previamente para raízes resistentes
de uva (Anwar e McKenry, 2000), uma cultivar de algodão (Anward et al, 1994),
uma cultivar de soja (Dropkin e Nelson, 1960), uma cultivar de pimenta (Pegard
et al., 2005) e de café (Anthony et al., 2005). Esta resistência indica também que
as raízes de A. stenosperma, não atraíram os J2s ou talvez que até os repeliram.
Uma outra alternativa é que os J2s poderiam ter penetrado e depois saído das
raízes, apesar disto não ter sido observado. Foi mostrado que o exsudado de
Curcumis sativus possui um triterpeno, substância que repele J2 de Meloidogyne
(Hayene e Jones, 1976). Da mesma forma, Tanda e colaboradores (1989)
demonstraram que o exsudado de raízes de gergelim (Sesamun indicum) tinha
efeito nematicida ao J2 de Meloidogyne.
Nelson et al., (1990) não observaram diferenças durante a penetração nas
raízes das espécies resistentes silvestres de Arachis, A. cardenasii e A.
batizocoi, e uma espécie suscetível. Isto também foi observado em soja (Glycine
max) (Herman et al., 1991) e feijão (Phaseolus vulgaris), (Sydenham et al.,
1996).
Além disso, na espécie resistente, A. stenosperma, os J2s permaneceram
na forma de vermes e reunidos nas células do cilindro vascular. Não foi
observado, desenvolvimento dos J2s, nem formação de galhas e nem massas
de ovos. Isto sugere que este amendoim silvestre tenha um mecanismo de
defesa bioquímico, pós-penetração, o qual bloqueia o desenvolvimento e a
reprodução do nematóide. A resposta pós-penetração de incompatibilidade nas
raízes de A. stenosperma foi considerada uma clássica reação de
hipersensibilidade (HR). Esta HR ocorreu mais tarde no ciclo de infecção (8-19
DAI). Diversos trabalhos mostraram que HR é responsável pela resistência ao
nematóide em outras espécies de plantas, como em tomate (Dropkin, 1969),
38
tabaco (Ghannam et al., 2005), café (Rodrigues et al., 2000, Anthony et al.,
2005), pimenta (Bleve-Zacheo et al., 1998, Pegard et al., 2005), e a HR nestas
espécies difere no tempo que leva para aparecer (ocorrer); algumas em horas
após penetração e noutras apenas após dias. Pesquisadores têm proposto que
plantas resistentes que expressam HR logo no início do ciclo (12-48h após
infecção) e nos tecidos mais externos da raiz (i.e., epiderme e córtex), teriam sua
resistência facilmente quebrada por nematóides com nova virulência (Bleve-
Zacheo et al., 1998, Castagnone-Sereno et al., 2001). Ao contrário, se a HR
ocorrer mais tarde no ciclo de infecção e em tecidos mais internos da raiz (i.e.,
perto ou dentro do cilindro vascular), bloquearia irreversivelmente o
desenvolvimento do nematóide, prevenindo assim, a seleção de um genótipo
virulento. A resposta de hipersensibilidade foi também um mecanismo de
resistência para A. cardenasii (Nelson et al., 1990), e semelhantemente à A.
stenosperma, esta HR, ocorreu mais tarde no ciclo de infecção, 7 DAI e 8 DAI,
respectivamente.
Como a resistência da espécie silvestre pode ser transferida para A.
hypogaea, A. stenosperma e A. duranensis foram utilizadas como parentais,
resistente e suscetível, numa população segregante (Moretzsohn et al., 2005).
Genes de resistência serão mapeados e uma estratégia molecular foi escolhida,
uma biblioteca de ESTs foi construída para se tentar identificar genes de
resistência em A. stenosperma (Proite et al., 2007; Cap. 2). A comparação dos
genes expressos em raízes não inoculadas e inoculadas com M. arenaria
mostrou oito genes diferencialmente expressos que podem estar envolvidos com
a resistência na espécie silvestre. A expressão diferencial foi confirmada por
Northern blot (Cap. 3).
39
Tabela 1- Análide da reprodução de M. arenaria raça 1 em Arachis spp
a
. e a reação das
variedades.
Arachis spp. Peso
fresco de
Raiz (g)
Nematóides/
Peso fresco de
Raiz (g)
Número de
Ovos e J2s
b
Fator de
Reprodução
c
A. stenosperma
(V10309)
8.7 0 3038 0 c (R)
A. duranensis
(K7988)
17.0 1781
470 3.5 b (MS)
A. hypogaea cv
IAC-Tatu-ST
11.7 13811
0 16.4 a (S)
a
escala de reação de variedades segundo Moura e Régis (1987):
Resistente (R) = 0 – 40 ovos e J2s;
Moderadamente Resistente (MR) = 41 – 267 ovos e J2s;
Moderadamente Suscetível (MS) = 268 – 688 ovos e J2s;
Suscetível (S) > 689 ovos e J2s.
b
média do número de ovos produzidos a partir de 8 plantas analisadas após 75 DAI.
c
números com diferentes letras minúsculas, diferem uma da outra pelo teste de Tukey com 5 % de probabilidade. S =
suscetível, MS = moderadamente suscetível, R = resistente.
40
Figura 1- Processo de infecção de Meloidogyne arenaria raça 1 nas raízes infectadas
de Arachis spp. As preparações de fucsina ácida mostram o atraso no ciclo de vida do
nematóide em A. duranensis acesso K7988 (a, c, f) em relação a A. hypogaea cv. IAC-
Tatu-ST (b, d, e) e a resistência ao nematóide em A. stenosperma acesso V10309 (g,
h, i) devida à baixa penetração e à reação de hipersensibilidade (g, h e i). (b) A.
hypogaea - 6 DAI, observam-se vários juvenis de 2
o.
estágio (J2) penetrando na raiz; (d)
A. hypogaea - 11 DAI, observa-se juvenil de 4
o.
estágio (J4) e o intumescimento da raiz
ou galha formada; (e) A. hypogaea - 32 DAI, observa-se fêmea madura liberando ovos,
indicando final de um ciclo de infecção). (a) A. duranensis - 8 DAI; observam-se vários
J2s penetrando na raiz; (c) A. duranensis - 11 DAI; é observado J3; (f) A. duranensis -
63 DAI, observa-se fêmea não madura e células gigantes. (g) A. stenosperma - 8 DAI;
observam-se poucos J2s penetrando na raiz; (h) A. stenosperma - 17 DAI, continua-se
a se observar a penetração de juvenis de 2
o.
estágio e a oxidação do tecido da raiz no
eixo vascular quando os J2s tentaram induzir sitio de alimentação (coloração marrom-
amarelada); (i) A. stenosperma - 19 DAI, observam-se nematóides no interior do
cilindro vascular com coloração marrom evidenciando que estão oxidados e mortos.
DAI= dias após inoculação, Ne= Necrose causada pela reação de hipersensibilidade,
N= nematóide.
41
Figura 2- Desenvolvimento do nematóide Meloidogyne arenaria raça 1 analisado
através de seções longitudinais de raízes infectadas de Arachis spp. coradas com azul
de toluidina. (a) A. hypogaea - 8 DAI, é observado células gigantes indicando que o
sítio de alimentação já está instalado. (b) A. hypogaea - 16 DAI, células gigantes
multinucleadas e com forma oval (setas indicam vacúolos e nucléolos) e (c) A.
hypogaea - 19 DAI, observa-se fêmea imatura com células gigantes com citoplasma
bastante denso. (d) A. duranensis - 16 DAI, observa-se o início da indução de formação
das células gigantes indicado pelo espessamento da parede celular (seta); (e) A.
duranensis - 19 DAI, observa-se célula gigante bem formada com muitos vacúolos e
multinucleada; (f) A. duranensis - 32 DAI, é observado nematóide em forma larval –
juvenil de quarto estágio (J4) e várias células gigantes com citoplasma bastante denso.
(g) A. stenosperma - 8 DAI, observa-se juvenil de segundo estágio (J2) no cilindro
vascular e o início de uma reação de hipersensibilidade - HR (seta); (h) e (i) A.
stenosperma - 16 DAI e 19 DAI, é observado típica necrose no tecido radicular na
região do cilindro vascular indicando reação de hipersensibilidade à infecção do
nematóide. DAI= dias após inoculação, N= nematóide e Ne= Necrose – HR.
42
Capítulo 2
Análise in silico da expressão gênica diferencial
de Arachis stenosperma inoculado com
Meloidogyne arenaria raça 1 e o
desenvolvimento de marcadores moleculares
*
Os resultados apresentados neste capítulo gerou o artigo publicado na revista BMC Plant
Biology (Proite K, Leal-Bertioli SC, Bertioli DJ, Moretzsohn MC, da Silva FR, Martins NF,
Guimarães PM. ESTs from a wild Arachis species for gene discovery and marker
development. 2007 Feb 15;7:7.- (Anexo III).
43
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, os genomas de Medicago truncatula e Lotus japonicus estão
sendo seqüenciados (Young et al., 2005; Mun et al., 2006). Estas duas espécies
representam os dois principais modelos de leguminosas que possuem genomas
relativamente pequenos (450 Mpb e 472 Mpb, respectivamente). Os genomas de
outras leguminosas são bem maiores, chegando até mais de 100 vezes o
genoma de Lotus (Bennett e Smith,1976). O transcriptoma de uma espécie
particular pode ser amostrado através de coleções de ESTs (Expressed
Sequence Tags) gerados a partir de tecidos diferentes e de estágios diferentes
de desenvolvimento ou de organismos sujeitos a diferentes condições de
estresse (Zhang et al., 2004). Os ESTs são pequenos fragmentos de cDNA
parcialmente seqüenciados que representam a expressão gênica em um dado
momento e que depois podem ser comparados a um banco de dados. A
similaridade entre as seqüências permite que suas possíveis funções sejam
identificadas, promovendo assim, a acumulação de informação genética e a
identificação de novos genes.
O crescimento, o desenvolvimento e as respostas das plantas ao ataque
de patógenos são caracterizados por diferenciações dos tecidos e das células.
Estas mudanças globais são reguladas pela expressão específica de genes.
A análise de ESTs tem sido empregada intensivamente numa variedade
de projetos genomas, principalmente com o objetivo de identificar novos genes e
realizar o mapeamento genético (Eujayl et al., 2002 e 2004). Os dados de ESTs
têm sido usados na comparação quantitativa da expressão de genes entre duas
bibliotecas de cDNA distintas. A acumulação exponencial de seqüências ESTs
em banco de dados públicos permite uma outra oportunidade de se obter um
número muito grande de genes diferencialmente expressos, através da análise in
silico (Jeong et al., 2006). Tanto a análise in silico, quanto a de coleções de
perfis de expressão de ESTs têm sido conduzidos a fim de se identificar genes
envolvidos em vários aspectos do desenvolvimento e crescimento da planta,
bem como em respostas aos estresses em inúmeros exemplos vegetais
(Federova et al., 2002; Zhang et al., 2004; Cho et al., 2005; Jeong et al., 2006) e
outros. Os perfis de expressão são inferidos pela freqüência de ocorrência de um
EST qualquer. A redundância do transcrito (ou melhor, o conjunto de ESTs
44
reunidos em clusters/número total de ESTs) é medida pela abundância de um
cDNA em bibliotecas não normalizadas (Cho et al., 2005). Em outras palavras, a
informação adquirida pela escolha aleatória de cDNAs representa os níveis
relativos de expressão dos genes numa dada biblioteca. A significância desta
análise de expressão digital, que novamente, é feita através do cálculo das
freqüências de ESTs em diferentes bibliotecas de cDNA foi anteriormente,
validada estatisticamente (Audic et al., 1997, Ewing et al., 1999; Stekel et al.,
2000; Jeong et al., 2006).
ESTs também são valiosos marcadores moleculares, especialmente em
projetos de mapeamento comparativo, pois são mais conservados entre
diferentes espécies (Ma et al., 2004). Constituem uma nova fonte de marcadores
porque estão fisicamente associados com regiões codificadoras do genoma
(Eujayl et al., 2002). Os marcadores contemporâneos que se utilizam dos dados
de ESTs são os polimorfismos de base única (SNPs – Single Nucleotide
Polymorphisms) (Picoult-Newberg, et al., 1999), os conjuntos de ortólogos
conservados (COSs – Conserved Orthologue Sets) (Fulton et al., 2002), e os
marcadores microssatélites (SSR- Simple Sequence Repeats) derivados de
ESTs (ESTs-SSRs) (Cordeiro et al., 2001 e 2006). Os marcadores microssatélite
ou SSRs (Simple Sequence Repeats), estão sempre presentes nos genomas
eucarióticos e consistem em repetições de 2-5 nucleotídeos num segmento
contínuo (Fraser et al., 2004), e são amplamente utilizados como marcadores
moleculares. Entre as vantagens de se empregar os SSRs como marcadores
temos: alto conteúdo informativo, herança co-dominante, reprodutibilidade e
especificidade de locus (Powell et al., 1996). Este último tem especial
importância e relevância quando se é considerado sua aplicação na
genotipagem dos SSRs para coleções de germoplasma, para o qual geralmente
se necessita um grande investimento na aquisição de dados de diferentes fontes
(Eujayl et al., 2002).
Os ESTs-SSRs possuem a vantagem sobre outros sistemas de
marcadores gênicos de serem marcadores baseados em PCR, o que os torna
mais eficientes que os marcadores baseados em hibridização como os
marcadores RFLP (Sledge et al., 2005). Os primers de microssatélites
desenhados a partir dos bancos de ESTs são tanto de baixo custo quanto
eficientes de serem gerados, desde que já haja bibliotecas de cDNA
45
sequenciadas. Como são gerados a partir de seqüências de genes expressos,
em geral são mais informativos que os gerados a partir de seqüências
genômicas, as quais podem ser derivadas de seqüências de DNA não
codificadoras (Cordeiro et al., 2001; Eujayl et al., 2002). Além disso, uma
porcentagem alta de primers de EST-SSRs poderão amplificar seqüências
através de várias espécies comparadas com os microssatélites genômicos
(Eujayl et al., 2004; Yi et al., 2006), tornado-os mais aplicáveis em estudos de
comparação genética.
A análise de ESTs associados às respostas de resistência em
germoplasma silvestre, e seu mapeamento em mapa genético de Arachis,
recentemente desenvolvido por este grupo (Moretzsohn et al. 2005), possibilitará
a seleção assistida por marcadores genéticos, o que acelerará o melhoramento
da cultura. Desta forma, será possível, em cada fase da seleção, a escolha dos
indivíduos que contêm o máximo do genótipo desejado, diminuindo o tempo do
processo de seleção. Além disso, estas seqüências poderão ser utilizadas no
isolamento de genes de resistência e sua transferência direta para espécies
cultivadas através da transformação de plantas.
Até o momento, apenas 25.000
ESTs, todos oriundos de amendoim
cultivado A. hypogaea, estavam disponíveis no GenBank (GenBank update).
Destes, menos de 10% têm função putativa associada à resistência. Desta
forma, uma maior varredura do genoma de Arachis, incluindo principalmente
espécies silvestres com resistência comprovada a fungos e nematóides, se faz
necessária.
No presente capítulo, descrevemos pela primeira vez, os padrões de
expressão dos genes da espécie silvestre e resistente a fungos e nematóides A.
stenosperma acesso V10309. Os ESTs analisados foram gerados a partir de três
bibliotecas de cDNAs de raiz, sob as seguintes condições; (1) raiz sem estresse
(2) raiz após inoculação com o fitonematóide M. arenaria raça 1. As bibliotecas
raiz inoculada com nematóide e raiz não inoculada foram geradas com RNAs
extraídos em três pontos distintos e específicos do ciclo do nematóide, onde
sabidamente ocorre uma reação de defesa (ver Cap. 1). Objetivou-se
caracterizar, principalmente, genes responsáveis pela resistência a M.arenaria
em A.stenosperma. A escolha do método da análise de ESTs in silico visou
identificar genes cuja expressão é modificada durante desafio com o patógeno,
46
de genética muito complexa, mas cujo nível de expressão determina resistência
ou suscetibilidade (Ellingboe, 2000).
47
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Construção das bibliotecas de cDNA
Sementes de A. stenosperma (acesso V10309) foram germinadas e as
plantas foram mantidas em casa de vegetação por três meses. RNA total foi
extraído de (i) raízes sadias e não inoculadas; (ii) raízes infectadas com 10.000
juvenis de segundo estágio (J2) de M. arenaria raça 1 por planta. As raízes
inoculadas e raízes não inoculadas foram coletadas nos pontos 2, 6 e 10 dias
após a inoculação (DAI). Todo o material coletado foi imediatamente congelado
em N
2
líquido.
O RNA total das raízes de cada ponto foi extraído e reunido após extração
individual. Para a extração de cerca de um miligrama de RNA total de cada
conjunto (inoculado e não inoculado) utilizou-se o protocolo de extração do
reagente Trizol Reagent
(Invitrogen), com algumas modificações para se
eliminar a grande quantidade de polissacarídeos existente nas raízes: (i) utilizou-
se a proporção de 200mg de raiz para cada mL de Trizol; (ii) o RNA foi
centrifugado a 14.000 g após a homogeneização com Trizol e o sobrenadante foi
precipitado com 0,8 M de citrato de sódio e 1,2 M NaCl juntamente com o
isopropanol; (iii) a qualidade e limpeza do RNA foi analisada por espectrometria
e em gel de agarose utilizando-se tampão de amostra com 1% formamida; (iv)
quando necessário realizou-se limpeza do RNA com o RNeasy Plant Mini Kit
(Qiagen); Para a extração de RNA poli A
+
utilizou-se 1 mg de RNA total de cada
ponto (dia) e o kit Oligotex Spin Column (Qiagen) de acordo com as orientações
do fabricante, salvo algumas modificações: (i) incubou-se RNA total e resina de
oligo-dT por 30 minutos sob agitação; (ii) nas três eluições, ressuspendeu-se a
resina com o volume máximo recomendado (100µL) da solução OEB e pipetou-
se a solução a 70 °C.
As bibliotecas de cDNA foram confeccionadas com SMART
TM
cDNA
Library Construction Kit (BD Clontech/USA), de acordo com as instruções do
fabricante. Foram obtidos cDNAs longos e completos preservando a seqüência
5’ do mRNA. Utilizou-se uma seqüência de oligo-dT modificada denominada
48
CDSIII/3’PCR Primer, que inicia a síntese da primeira fita do cDNA a partir da
intersecção da cauda poli-A com a região codante. Ao alcançar a extremidade 5’
do mRNA a enzima acrescenta algumas deoxi-cistidinas na extremidade 3’ do
cDNA. Então, um outro oligonucletotídeo chamado SMART IV Oligo, que serve
com um pequeno e curto molde estendido se anela às deoxi-cistidinas na
extremidade 5’ do mRNA. Como o SMART IV Oligo possui uma seqüência de Gs
na sua extremidade 3’ forma com a seqüência de Cs um molde estendido. Desta
forma foram gerados cDNAs fita simples com extremidade 5’ completas do
mRNA, bem como, uma seqüência complementar ao SMART IV Oligo, que
serve então, como um sítio de iniciação universal (âncora SMART) para as
amplificações subseqüentes. Os cDNAs foram fracionados e clonados no vetor
Lambda TriplEx2 do kit SMART
TM
c-DNA Library Construction (BD
Clontech/USA).
Ver figura 1.
49
Figura 1- Esquema de clonagem do kit SMART cDNA Library Construction- (PT3000-1). O lado
direito do esquema mostra o destino dos transcritos incompletos causado pela degradação de
RNA ou pela terminação prematura da transcriçao reversa.
50
O sequenciamento foi efetuado a partir de plasmídeos. Para isto foi
efetuada a excisão em massa in vivo e a circularização dos plasmídeos. Os
plasmídeos foram excisados dos fagos recombinantes através da mediação da
enzima Cre recombinase. Como a bactéria hospedeira E.coli BM 25.8 não possui
o sistema de seleção dos transformantes via Lac-Z, após a excisão foi efetuada
uma midi-preparação de plasmídeos e transformação em E. coli XL1-Blue Tet
R
.
2.2. Seqüenciamento dos ESTs
Os plasmídeos selecionados, randomicamente, foram isolados por mini-
preparação de plasmídeos pelo método de lise alcalina e os insertos de cDNA
foram seqüenciados a partir da extremidade 5´ utilizando-se o primer específico
PT2F2 – 5´-GCGCCATTGTGTTGGTACCC-3’. Foi utilizado o seqüenciador
automático (Applied Biosystems Automated DNA Sequencer 3100 e 377) pelo
método dideoxy-terminator usando o kit BigDye terminator cycle Sequencing
(Applied Biosystem). Para análise de controle de qualidade dos fragmentos
seqüenciados utilizou-se o programa PHRED (Ewing et al. 1998). A qualidade
mínima de cut-off foi definida para uma qualidade média 20 dentro da janela de
comprimento de 50 bases. Para corte de seqüência de vetor foram usados
Pregap4 (http://staden.sourceforge.net/.) nos módulos: (a) sequencing vector clip
e (b) cloning vector clip.
2.3. Análise computacional dos ESTs
Para retirada de DNA ribossomal, cauda poli-A
+
, seqüências de baixa
qualidade, vetor e adaptador utilizou-se a metodologia descrita em Telles e da
Silva (2001). Para formação dos clusters utilizou-se o programa CAP3 (Huang e
Madan, 1999). A anotação foi baseada no BLASTx (Altschul et al., 1990), contra
o banco de dados de todos os organismos e mínimo e-value de 10
-6
. As
seqüências mais abundantes foram aglomeradas em contigs únicos e
classificadas de acordo com KOG (Clusters of Orthologous Groups of Proteins),
segundo suas funções putativas (http://www.ncbi.nih.gov/COG/new/shokog.cgi).
Para as seqüências geradas a partir das bibliotecas de raízes de A.
stenosperma inoculada e não inoculada com M. arenaria raça 1, após a
51
construção dos contigs, foi realizada a subtração eletrônica que permitiu a
identificação de genes expressos diferencialmente nos conjuntos, resistente e
suscetível em resposta à infecção por M. arenaria raça 1(Teste de Fisher, P <
0.005).
2.4 Desenvolvimento de Marcadores Microssatélite
Marcadores microssatélite ou SSRs foram buscados nos bancos de ESTs
através do programa TROLL, foram analisados e processados pelo software
desenvolvido por Martins et al., 2006 (Anexo II). Os ESTs selecionados foram
convertidos em marcadores baseados em PCR através de primers desenhados
a partir das seqüências flanqueadoras aos microssatélites. Os marcadores EST-
SSRs foram caracterizados para polimorfismos numa população de genoma AA
e em dezesseis acessos de amendoim cultivado com representantes de cada
uma das seis variedades de amendoim descritas. As condições das reações de
PCR e dos géis de prata foram descritas em Moretzsohn et al., (2005).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. ESTs diferencialmente expressos
A fim de se identificar os fatores moleculares envolvidos na resistência de
A. stenosperma a M. arenaria raça 1, foram construídas três bibliotecas de cDNA
de raízes não inoculadas (1) e inoculadas com o nematóide (2). Foram
seqüenciados 8000 clones dos quais 5704 seqüências (71,3%) foram
aproveitadas após análise de qualidade, formando um total de 3500 clusters.
Foram obtidos 2537 singlets (seqüências únicas) e o total de contigs
(agrupamentos) foi de 963. Estas seqüências foram depositadas no GenBank
(EH41934 – EH048197). Dos 3500 clusters analisados, 44,1% não apresentaram
similaridade com genes com funções conhecidas. Através de uma análise in
silico, foi feita a comparação dos genes expressos nas duas bibliotecas
contrastantes (raízes inoculadas e não inoculadas com nematóide) utilizando-se
52
o teste de Fisher (P < 0.005). Na figura 2 é apresentada uma classificação
funcional nas diversas categorias de expressão gênica da biblioteca de raízes
inoculadas (RM) de acordo com KOG (http://www.ncbi.nih.gov/COG/
new/shokog.cgi).
Oito genes apresentaram expressão diferencial significativa pelo teste de
Fisher e alguns estão relacionados à defesa (Tabela 1). O contig 821 contém
seqüências que têm sua expressão inibida pelo fitohormônio auxina; auxin-
repressed protein like (ARP). Este gene foi induzido em raízes inoculadas com
nematóide (Tabela 1). O hormônio vegetal auxina, representado pelo ácido indol-
3-acético (IAA) regula uma variedade de processos fisiológicos e do
desenvolvimento, incluindo, dominância apical, respostas de tropismo, formação
de raiz lateral, diferenciação vascular, divisão embrionária e alongamento de
brotos (Davies, 1995 in Okushima et al., 2005). Em nível celular, a auxina
modula o alongamento, divisão e diferenciação celular através da regulação
transcricional de genes específicos (Leyser, 2002 in Okushima et al., 2005). No
entanto, se conhece pouco sobre os genes que têm expressão reprimida pela
auxina. É sabido que a auxina é importante para a infecção de raízes por
nematóides das galhas e de cisto, nas primeiras horas do processo de infecção
(De Almeida Engler et al., 1999), modula também a expressão da citocinina na
formação de raízes laterais que por sua vez é necessária para o estabelecimento
do sítio de alimentação do nematóide (Lohar et al. 2004). O gene da citocinina
oxidase/desidrogenase, contig 433, aparece 20 vezes mais expresso na
biblioteca RN (raízes não inoculadas) Esta enzima é responsável pela
degradação do hormônio citocinina (Schmülling et al., 2003), (Tabela 1). Outro
gene importante que apresentou diferença na sua expressão é o da proteína
metalotioneína do tipo 2, que aparece mais expressa nas raízes não inoculadas
(RN) que nas inoculadas. Potenza et al. (2001) demonstraram através de
Northern blot que em raízes de alfafa inoculadas com M. incognita, ocorre uma
diminuição da expressão de metalotioneína, quando comparada com a raiz não
inoculada. Acredita-se que estas proteínas funcionem como “coletoras de
metais” e que são induzidas por pequenas GTPases (Racs) que são importantes
na regulação de sinais de transdução em eucariotos (Wong et al., 2004). Além
disso, em experimentos com células de arroz, a expressão das metalotioneínas
foi diminuída quando estas foram tratadas com os indutores de respostas
53
associadas à defesa como a fosforilação oxidativa-ROS (caliculina A e/ou quito-
oligossacarídeo), indicando a associação desta proteína com a resposta de
hipersensibilidade (Wong et. al. 2004). Por outro lado, quando houve um
aumento da expressão da metalotioneína, ocorreu a diminuição de ROS e
conseqüentemente uma diminuição da resistência a doenças (Wong et al. 2004).
Temos ainda como ESTs diferencialmente expressos, o gene da enzima
revesratrol sintase (rs) que teve expressão aumentada na biblioteca de raízes
inoculadas (RM); gene da enzima álcool desidrogenase com maior expressão
em na biblioteca de raízes não inoculadas (RN); uma outra metalotioneína, agora
do tipo 3 expressa somente na biblioteca de raízes inoculadas (RM) e ainda dois
genes com homologia a proteínas hipotéticas, um com homologia à proteína de
arroz e outra de tabaco, para estas duas a análise in silico revelou um aumento
na expressão quando as raízes foram inoculadas com o nematóide.
A enzima álcool desidrogenase faz parte do metabolismo primário em
plantas e cataliza a redução do acetoaldeído em etanol sob anoxia. Teve
expressão induzida em folhas de Arabidopsis infectadas com fungo Alternaria
(Schenk et al., 2000) e seu mRNA foi rapidamente acumulado durante a
resposta de hipersensibilidade em batata (Matton et al., 1990), ao contrário do
observado na biblioteca de raízes inoculadas com o nematóide que teve sua
expressão reprimida. Esta enzima está também bastante correlacionada com a
deposição de lignina em Arabidopsis (Zhang et al., 2006). A enzima
metalotioneína do tipo 3 geralmente é mais expressa em raízes e tem função
associada à desintoxicação de metais como cádmio, zinco e cobre a fim de
prevenir mutações celulares. Plantas que expressam esta metalotioneína, bem
como a do tipo 2, têm grande tolerância a solos ricos em metais pesados como
zinco e cádmio, acredita-se que são responsáveis pela mitigação dos danos
causados por ROS (Chiang et al., 2006). Foi proposto por estes autores que tais
genes poderiam ser usados como candidatos na fitorremediação de solos
contaminados. Metalotioneína do tipo 3 (MT3) também está envolvida com
respostas de defesa em plantas. Foi induzida em arroz quando inoculado com o
fungo Magnaporthe grisea (Kim et al., 2001; Jantasuriyarat et al., 2005). Esta
(MT3), somente foi expressa nas raízes inoculadas de A. stenosperma com
nematóide, evidenciando possível papel na resposta de defesa desta espécie. O
gene da enzima resveratrol sintase também foi exclusivo de uma das bibliotecas,
54
sendo que somente foi expresso na de raízes não inoculadas. Esta enzima é
responsável pela formação da fitoalexina resveratrol. Esta por sua vez, está
envolvida com respostas à infecção de fungos, e foi identificado primeiramente
em amendoim e videira (Hart, 1981; Arora e Strange, 1991). Como este gene
está associado a respostas de defesa, é de se estranhar não ter sido identificado
em raízes inoculadas da espécie resistente A. stenosperma, pode ser que
somente seja induzido especificamente ao ataque de fungos. Os genes com
homologia aos genes de proteínas hipotéticas não têm função conhecida.
Foram observados ainda, outros genes relacionados à resistência que
somente foram expressos na RM (raízes inoculadas) como PR-10 - proteínas
relacionadas à patogênese, proteínas germin-like (GLP), proteínas heat-shock,
peroxidases (Tabela 1).
Figura 2- Representação gráfica das funções dos genes expressos das bibliotecas de raízes de
Arachis stenosperma inoculadas com o nematóide Meloidogyne arenaria raça 1.
RM
2%
3%
5%
1%
3%
0%
7%
2%
2%
17%
2%
0%
1%
18%
4%
3%
7%
3%
6%
5%
1%
2%
7%
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
O
P
Q
R
S
T
U
V
Z
non conclusive
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
O
P
Q
R
S
T
U
V
Z Non
55
PROCESSO CELULARES E DE SINALIZAÇÃO
M Parede Celular/membrana/biogênese de envelope
N Motilidade Celular
O Modificação Pós-Transcricional, Turnover Protéico, Chaperonas
T Mecanismos de Transdução de Sinal
U Tráfego Intracelular, Secreção e Transporte Vesicular
V Mecanismos de Defesa
W Estruturas Extracelulares
Y Estrutura Nuclear
Z Citoesqueleto
PROCESSAMENTO E ESTOCAGEM DE INFORMAÇÃO
A Processamento e Modificação de RNA
B Estrutura e Dinâmica da Cromatina
J Tradução, Estrutura Ribossomal e Biogênese
K Transcrição
L Replicação, Recombinação e Reparo
METABOLISMO
C Produção e Conversão de Energia
D Controle do Ciclo Celular, Divisão Celular, Divisão Cromossômica
E Transporte e metabolismo de Aminoácidos
F Transporte e metabolismo de Nucleotídeos
G Transporte e metabolismo de Carboidratos
H Transporte e metabolismo de Coenzimas
I Transporte e metabolismo de Lipídeos
P Transporte e metabolismo de Íons Inorgânicos
Q Biossíntese, Transporte e Catabolismo de Metabólicos Secundários
POUCO CARACTERIZADO
R Apenas Função Geral Predita
S Função Desconhecida
56
Tabela 1 - ESTs diferencialmente expressos nas bibliotecas de raízes de Arachis stenosperma
RN (raízes não inoculadas) e RM (raízes inoculadas com Meloidogyne arenaria raça 1)
associados com possíveis respostas de defesa.
a
Número de leituras (reads) encontrados nas bibliotecas inoculadas (RM) e não inoculadas (RN).
b
Número de acesso no GenBank.
c
ESTs diferencialmente expressos e estatisticamente validados pelo Teste de Fisher (P < 0.005).
3.2. Marcadores microssatélite desenvolvidos
Além dos clones diferencialmente expressos, foi possível identificar 206
microssatélites dentro das seqüências dos ESTs. Sendo 119 deles formados
por dinucleotídeos e 79 por trinucleotídeos. A maioria dos microssatélites
encontrados era curta, com apenas 6-10 repetições. Os dinucleotídeos eram
formados por TC ou AT (102/119). Cento e oitenta e oito primers foram
desenhados e 165 caracterizados. Sessenta e sete marcadores EST-SSRs
tiveram polimorfismo numa população diplóide AA e quatro para o amendoim
cultivado (Moretzshon et al., 2005, Proite et al., 2007). Estes ESTs podem ser
Contig N° de
Leituras
Bibliotecas Homologia com
BLASTx
Função putativa Teste de
Fisher
c
821 115
RN (9)
a
, 1RM
(25), 2RM (81)
(AAX84677.1)
b
Proteína
Reprimida por Auxina - ARP1
Regulação do Crescimento
e Desenvolvimento
X
154 60
RN (50), 1RM
(2), 2 RM (8)
(P43390- MT2_ACTCH)
Proteína Metalotioneína do tipo
2
Reação Oxidativa
Seqüestrador de ROS
Resistência
X
433 44
RN (40), 1RM
(2), 2RM (2)
(CAB79732.1) Enzima
Citocinina
Oxidase/Desidrogenase
Análise do hormônio
citocinina
X
532 39
RN (35), 1RM
(2), 2RM (2)
(AAO72531.1) Enzima Álcool
Desidrogenase ADH1
Lignificação e defesa em
Plantas
X
874 38
1RM (18), 2RM
(20)
(AAT02527) Proteína
Metalotioneína do tipo 3b
Desintoxicação de Metais e
defesa em plantas
X
185 25
RN(1), 1RM
(11), 2RM(13),
(BAD83567.1) Proteína
Hipotética [Nicotiana tabacum]
Gene com homologia a
genes mitocondriais e
Sem função conhecida
X
214 20
1RM (11), 2RM
(9)
(NP_919162.1) Proteína
Hipotética [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)]
Sem função conhecida X
440 18
RN (17),
1RM (1)
(AAF71253) Enzima
Resveratrol Sintase
Síntese da Fitoalexina
Resveratrol
X
37 5 1RM (3), 2RM
(2)
(CAA69931.1) Proteína de
Resistência - PR10-1
Resistência e defesa em
plantas
61 4 1RM (2), 2RM
(2)
(T07629) Proteína heat shock
Classe I
Resistência e defesa em
plantas e manutenção
celular (house-keeping
genes)
143 3 1RM (1), 2RM
(2)
(AAC83463.1) Peroxidase ROS – Espécies de
Oxigênio Reativo
156 3 1RM (1), 2RM
(2)
(CAB65369.1) Proteína
Germin-like - GLP
Resistência e defesa em
plantas
57
utilizados como marcadores gênicos em mapas genéticos de Arachis,
contribuindo para o melhoramento genético através de seleção assistida por
marcadores moleculares da cultura. Estes marcadores estão sendo mapeados
assim como clones genômicos, indicando a posição dos genes, alguns com
função e padrão de expressão conhecidos, em regiões do genoma que podem
ser correlacionadas com os diferentes fenótipos. Assim, a associação de
marcadores gerados pelo clone de cDNA com fenótipos poderá aumentar o
entendimento ou o relacionamento com as vias e mecanismos bioquímicos que
afetam características agronômicas como resistência (Matthews et al. 2001).
Os ESTs selecionados serão convertidos em marcadores baseados em PCR
através de primers desenhados a partir de suas seqüências STS (Sequenced
Tagged Site) (Matthews et al. 2001).
4. CONCLUSÕES
Através da análise da expressão diferencial identificou-se o grande
aumento de genes reprimidos pelo hormônio auxina, o que talvez, seja uma
indicação de que a infecção do nematóide induziu o gene arp o que
hipoteticamente poderia estar evidenciando uma diminuição do hormônio na
planta impedindo assim o estabelecimento do sítio de alimentação do nematóide.
No entanto, não há relatos identificando a auxina como fator iniciador de uma
resposta de hipersensibilidade, como foi observado nas raízes infectadas. A
diminuição da expressão do gene de citocinina oxidase/desidrogenase pode ser
um indício da escassa presença de citocinina, hormônio chave para a
manutenção dos sítios de alimentação dos nematóides (Schmülling et al., 2003).
Os genes das metalotioneínas do tipo 2 e 3 parecem estar envolvidas com
reação de hipersensibilidade e respostas de defesa, respectivamente. Os outros
genes diferencialmente expressos observados neste trabalho têm funções
atribuídas com defesa, no entanto, sua expressão nas raízes inoculadas não foi
induzida, como talvez fosse o esperado. A análise in silico, permitiu a escolha de
genes que foram utilizados como sondas em experimentos de Northern blot
(Cap. 3), utilizando-se o RNA total de plantas resistentes desafiadas e não
58
desafiadas com o nematóide para confirmação da expressão diferencial dos
mesmos e sua distribuição temporal.
A análise da expressão gênica diferencial utilizando-se Northern blot é um
método eficiente para se identificar genes cuja expressão é modificada durante
desafio com o patógeno. A identificação e isolamento de diferentes genes de
resistência oriundos de germoplasma silvestre e sua introgressão em material
cultivado possibilitará o acúmulo (piramidização) de genes de resistência,
dificultando a quebra da resistência pelo patógeno. Considerando-se que genes
de resistência encontram-se distribuídos no genoma em clusters (Aarts et al.
1998), há grande chance de se encontrar vários genes próximos que confiram
resistência a outras pragas (ex. M. incognita, M. arenaria e M. hapla) através de
“chromosome walking” (Stein et al. 2000) e também através do estudo da
segregação. Pretende-se, numa etapa posterior, isolar os genes candidatos,
caracterizá-los e transferí-los para outras espécies de importância econômica
por transformação direta de plantas. A transformação dos ESTs-SSRs em
marcadores gênicos bem como seu mapeamento permitirá elucidar ou
corroborar seu possível papel na resistência aos nematóides.
Considerando que estes patógenos causam danos expressivos à cultura
do amendoim, o isolamento de genes de resistência e sua introgressão para
cultivares comerciais do amendoim contribuirão para o aumento da
produtividade, beneficiando os produtores, a agroindústria e o meio ambiente
que será poupado da aplicação massiva de agroquímicos.
59
Capítulo 3
Análise da expressão diferencial de genes de
raízes de Arachis stenosperma e de A. hypogaea
infectadas com o fitonematóide Meloidogyne
arenaria raça 1
60
1. INTRODUÇÃO
As plantas possuem mecanismos tanto pré-formados quanto induzidos
para impedir a invasão de patógenos (Van Loon et al., 2006). Barreiras
mecânicas existentes, metabólitos secundários e proteínas antimicrobianas
devem ser evitadas ou subjugadas pelos patógenos para que estes consigam
invadir com sucesso e colonizar os tecidos vegetais. Uma vez havendo o
contato, os patógenos produzem e liberam compostos que induzem outras
defesas tais como, o reforço da parede celular, produção de fitoalexinas e
síntese de proteínas de defesa entre vários outros (Van Loon et al., 2006). Todas
as plantas possuem uma resistência basal, mas são suscetíveis quando o
patógeno consegue vencer esta resistência ou são resistentes quando impedem
que o patógeno tenha sucesso no seu ataque. O que determina se uma planta
se torna suscetível ou resistente é a rapidez e magnitude com que tais
mecanismos de defesa são ativados e expressos e também pela eficácia com
que estes mecanismos de defesa funcionam contra patógenos com diferentes
modos de ataque (Wan et al., 2002).
A infecção por nematóides resulta em danos físicos aos tecidos vegetais,
particularmente durante a fase de migração, mas também durante a fase de
estabelecimento e expansão do sítio de alimentação (Gheysen e Fenoll, 2002).
O processo de infecção causa mudanças severas na estrutura radicular da
planta como conseqüência de alterações da expressão de genes na raiz
hospedeira (Wang, et al., 2003). A transformação das células normais da raiz em
estruturas de alimentação inclui mudanças morfológicas e fisiológicas complexas
(Escobar et al., 1999; Williamson e Hussey, 1996). A complexidade e o
dinamismo deste sistema sugerem que deva haver o envolvimento de vários
genes. Alterações na expressão de genes correlacionados com respostas de
defesa foram observadas em inúmeras interações planta-nematóide, incluindo
extensinas (Van der Eycken et al., 1996), catalases (Niebel, et al., 1995; Goellner
et al., 2001), ciclinas (de Almeida Engler et al., 1999), fitohormônios (Goverse et
al., 2000b) e outros (Gheysen e Fenoll, 2002).
Vários estudos elucidaram diferentes etapas desta interação e a análise
de ESTs é uma ferramenta adicional aos métodos de genética e bioquímica
61
tradicionais. A análise de ESTs tem sido empregada extensivamente numa
variedade de projetos, primeiro com a finalidade de identificação de genes e seu
mapeamento (Jeong et al., 2006), mas também têm sido utilizados na
comparação quantitativa da expressão de genes entre diferentes bibliotecas de
cDNA (Maleck et al., 2000; Fernandes et al., 2002; Cho et al., 2004; Tian et al.,
2004; Zhang et al., 2004). A acumulação exponencial de seqüências ESTs em
bancos de dados públicos permite se obter um número massivo de genes
diferencialmente expressos, via análise in silico (Fedorova et al., 2002;
Fernandes et al., 2002; Casu et al., 2004; Alkharouf et al., 2004; Jeong et al.,
2006). As duas análises, tanto in silico, quanto do perfil de expressão gênica dos
tecidos têm conduzido à identificação de genes envolvidos nos vários aspectos
das interações planta-nematóide (Alkharouf et al., 2004 e 2006). O resultado
destas análises, o qual é efetuado pelo cálculo das freqüências dos ESTs em
diferentes bibliotecas, já foi previamente validado estatisticamente (Audic e
Claverie, 1997; Ewing et al., 1999; Stekel et al., 2000). Uma vantagem adicional
em se usar a freqüência de dados de ESTs para estimar a expressão gênica é a
capacidade de se poder distinguir diferenças entre seqüências bastante
relacionadas, similares, o qual não é possível através de outras técnicas de
estudo de expressão, incluindo análise de micro-arranjos (Park et al., 2006).
Na análise in silico dos ESTs de raízes de Arachis stenosperma (Cap. 2),
foram identificados oito genes com expressão diferenciada, sendo os mais
expressos os genes arp, ckx e mt2 que possuem homologias com os genes da
proteína reprimida por auxina, da enzima citocinina oxidase/desidrogenase e da
proteína metalotioneína do tipo 2, respectivamente.
1.1. Gene da Protéina Reprimida por Auxina - arp
Depois de penetrado na raiz, o J2 migra entre as células até alcançar o
eixo vascular. Os fatores que determinam a seleção de uma célula pelo
nematóide para formação do sítio de alimentação ainda não são bem conhecidos
(Goverse et al., 2000a). Não se sabe o que faz com que uma dada célula esteja
propícia para ser escolhida e induzida a se tornar uma célula gigante, talvez o
nematóide reconheça tipos celulares e/ou seu estado de diferenciação (Scheres
et al., 1997 in Goverse, et al., 2000a). Associado ao fato de que a formação das
células gigantes envolve processos de diferenciação celular, diversos trabalhos
62
mostram a manipulação de genes ligados ao ciclo celular pelos nematóides. Os
padrões de expressão de duas ciclinas quinases-dependentes (CDKs- cdc2aAt e
cdc2bAt) e duas ciclinas mitóticas (Arath;cycB1;1 e Arath;cycA2;1) foram
analisados (de Almeida Engler et al., 1999). A expressão destes genes está
associada com a divisão ativa de células e, quando infectadas por nematóides,
as células gigantes passam a super-expressar tais genes nos sítios de
alimentação durante as primeiras horas de infecção (Niebel et al., 1996; de
Almeida Engler et al., 1999).
Os fitohormônios auxina e citocinina são considerados fatores chave no
controle do progresso do ciclo celular em plantas, através da regulação da
expressão e/ou da atividade dos genes CDKs e ciclinas-mitóticas (Goverse et al.,
2000a). Diversas observações apontaram para um papel da auxina na indução
do sítio de alimentação por nematóides das galhas e de cisto (Goverse et al.,
2000a, b). Sugere-se que os nematóides de fato, induzam o acúmulo local de
auxina controlando sua distribuição na raiz. Isto poderia ser parte de uma série
de eventos que resultariam na indução da formação do sítio de alimentação
(Balasubramanian e Rangarwami, 1962 in Goverse et al., 2000a, b; Hutangura et
al., 1999).
O gene da proteína reprimida por auxina, arp, (Auxin-repressed protein,
ARP) e o seu papel no crescimento e desenvolvimento das plantas é
relativamente pouco estudado. Depois que este gene foi isolado de morango
(Reddy e Poovaiah, 1990), outros genes homólogos ao arp também foram
isolados de ervilha (Stafstrom et al., 1998), de falsa-acácia, uma leguminosa
arbórea (Park and Han, 2003), tabaco (Steiner et al., 2003) e pimenta (Hwang et
al., 2005).
Os genes arp têm relações estreitas com genes relacionados a
dormência (drm), isto é, têm seqüências muito parecidas e respondem
similarmente aos mesmos estímulos (Reddy e Poovaiah, 1990). Já foi mostrado
que a expressão do gene drm é reprimida pela auxina exógena em receptáculos
de morango (Reddy e Poovaiah, 1990), em hipocótilos de Robinia pseudoacacia
e de pepino (Park e Han, 2003; Shimizu et al., 2006), e também em Pinus
contorta (Brinkler et al., 2004). No entanto, em outros trabalhos, de modo
contrário, este gene foi induzido pela ação direta deste fitohormônio (Kim et al.,
2007; Rocha et al., 2007). De um modo geral, a ativação da expressão do gene
arp está relacionada a respostas de estresse, tanto biótico, como exemplos
63
causado por: fungos (Jung e Hwang, 2000; Skiba et al., 2005; Luo et al., 2005;
Coram e Paing, 2006), rizóbio (Manthey et al., 2004) e nematóides (Alkharouf et
al., 2004); Yin et al., 2006; quanto abiótico, por exemplo: estresse hídrico (Kohler
et al., 2003), estresse à luz UV (Liu et al., 2002), estresse salino e de baixa
temperatura (Hwang et al., 2005) e estresse químico por BHT (di-terc-butil metil
fenol), um indutor artificial de SAR (Resistência Sistêmica Adquirida ) (De Nardi
et al., 2006).
1.2. Gene da enzima citocinina-oxidase/desidrogenase - ckx
As citocininas (CK) são uma classe de hormônio vegetal que tem papel
em vários aspectos do crescimento e desenvolvimento das plantas, incluindo
regulação da divisão celular, dominância apical, formação e atividade dos
meristemas de brotos, senescência de folhas, crescimento de raízes e respostas
ao estresse (Mok e Mok, 2001; Brenner et al., 2005; Gonzalez-Rizzo et al.,
2006). Sua homeostase é regulada pela taxa de síntese de novo, taxa de
importação, quebra dos conjugados de citocininas, os quais na sua maioria, são
glicosídeos, e ainda pela taxa de exportação e catabolismo (Mok e Mok, 2001).
Grande parte do conhecimento que se tem hoje sobre a atividade biológica
das citocininas é baseada em experimentos que estudaram os efeitos da adição
exógena deste hormônio a um sistema ou ao aumento do conteúdo endógeno
(Faiss et al., 1997 e Rupp et al., 1999 in Werner et al., 2003). Apesar dos
experimentos de “ganho de função” terem resultado em informações
significativas sobre os processos influenciados pelas citocininas, eles nem
sempre refletem as verdadeiras funções in vivo. A adição de citocininas poderia
desencadear processos que podem não estar sob o controle de citocininas. Já
plantas que têm seu conteúdo endógeno reduzido parecem ser mais
informativas, pois a falta de CK causa perda de função o que é evidenciado por
fenótipos com características fisiológicas e de desenvolvimento específicas de
plantas deficientes deste hormônio (Werner et al., 2003).
Genes que codificam para as proteínas citocinina oxidase/desidrogenes
(CKXs) foram isolados de milho (Houba-Hérin et al., 1999; Morris et al., 1999,
Brugière et al., 2003; Massonneau et al., 2004), Arabidopsis (Bilyeu et al., 2001;
Werner et al., 2001; Schmülling et al., 2003), Dendrobium, uma espécie de
64
orquídea (Yang et al., 2003a), arroz (Ashikari et al., 2005; Hirose et al., 2007),
cevada e trigo (Laloue e Fox, 1989; Galuszka et al., 2004).
A enzima, citocinina oxidase/desidrogenase foi inicialmente identificada como
uma oxidase (Pačes et al., 1971), mas atualmente é classificada como uma
desidrogenase (Galuszka et al., 2004; Popelková et al., 2006). Os genes de ckx
de milho foram os primeiros a serem clonados (Houba-Hérin et al., 1999; Morris
et al., 1999). São responsáveis pela maioria do catabolismo e inativação do
hormônio citocinina em uma reação irreversível e de uma única etapa enzimática
(Fig. 1). A degradação de citocinina é importante na regulação da sua
acumulação e na distribuição dos seus metabólitos nos tecidos vegetais
(Galuszka et al., 2000, 2004; Davies, 2004). Citocinina tem papel importante
para formação e manutenção do sítio de alimentação de nematóides nos
estágios mais avançados do ciclo de infecção (Lohar et al., 2004).
Figura 1 - Reação analítica (degradação) do hormônio citocinina pela enzima citocinina
oxidase/desidrogenase (CKX). [Figura retirada do artigo Popelková et al., 2006]
1.3. Interação Auxina-Citocinina
Fitohormônios geralmente agem de forma conjunta, um influenciando o
outro. Interações entre citocinina e auxina já foram descritas diversas vezes e
podem ter tanto efeito sinergístico, quanto antogonístico, havendo um controle
mútuo na sua expressão ou na sua abundância (Coenen e Lomax, 1997; Li et
al., 2006). Em raízes de milho, tabaco e ervilha já foi demonstrado que citocinina
induz a expressão de auxina (Bourquin et al., 1990 e Bertel e Eliasson, 1992 in
Citocinina
Receptor Final
Putativa imina
Intermediário
Adenina
Aldeído
65
Coenen e Lomax, 1997). Acredita-se que a auxina age diretamente sobre CKX
(Palni
et al., 1988; Zhang et al., 1995; Swarup et al., 2002), controlando assim
seus níveis e ainda, que dessa forma os dois hormônios juntos regulariam a
expressão dos componentes do ciclo celular (Hemerly et al., 1993; Soni et al.,
1995). Auxina e citocinina têm papel importante no ciclo celular controlando a
regulação transcricional de vários genes envolvidos no processo (Guo et al.,
2007). Já foi demonstrado que a expressão dos genes do ciclo celular cdc2a e
cycD3 é aumentada pela ação conjunta destes dois hormônios (Hemerly et al.,
1993, Nogué et al., 2000; Pozo et al., 2005), (Fig. 2) e um dos efeitos desta
regulação é a modulação da taxa de proliferação das células. Niebel et al. (1996)
mostraram que tanto o nematóide das galhas quanto os nematóides de cisto
induzem a expressão do gene cdc2a logo nas primeiras horas de iniciação do
sítio de alimentação. Sua expressão se mantém alta até 7 DAI e depois diminui
até cessar.
Figura 2- Influência de auxina e citocinina nas células vegetais. Citocinina e auxina regulam a
proliferação de células vegetais através (1) do controle da expressão dos componentes cdc2 e
cycD3 do ciclo celular (Hemerly et al., 1993; Nogué et al., 2000), (2) enquanto a abundância dos
dois hormônios é controlada através de enzimas que regulam estes hormônios tal como a CKX
(Zhang et al., 1995). [Figura adaptada do artigo Swarup et al., 2002].
66
De Almeida Engler e colegas (1999) também mostraram que a expressão
deste gene ocorre no meristema radical, bem como no cilindro vascular quando
J2s dos nematóides das galhas ou os nematóides de cisto estão migrando pelas
raízes. A atividade deste gene se manteve até 9 DAI nas células gigantes,
galhas e sincícios. Estes autores acreditam que a indução destes genes durante
a infecção seja devida ao aumento dos níveis de auxina causado pelos
nematóides, o que está de acordo com outros trabalhos que também
observaram alterações nos níveis dos hormônios citocinina e auxina em raízes
infectadas com nematóides (Bird, 1962; Yu e Viglierchio, 1964; Viglierchio e Yu,
1968 in De Almeida Engler et al., 1999; Lohar et al., 2004).
1.4. Metalotioneínas– MT
Metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixo peso molecular (4–8 kDa),
ricas em cisteínas (Cys) que, contêm grupamentos tiol responsáveis pela ligação
das MTs à vários metais, tais como: cádmio, zinco, cobre, alumínio e outros
(Coyle et al., 2002). Estudos demonstraram que as MTs estão envolvidas na
manutenção da homeostase de metais essenciais bem como na desintoxicação
de metais do organismo (Cobbett e Goldsbrough, 2002; Hall, 2002; Delhaize et
al., 2004), mas também estão envolvidas em diversos processos fisiológicos,
incluindo a retirada de espécies reativas oxidativas (ROS), (Akashi et al.,2004;
Wong et al., 2004), regulação do crescimento celular, proliferação e atividade de
metaloenzimas e de fatores de transcrição (Palmiter, 1998; Haq et al., 2003). E
ainda, estão envolvidas no metabolismo de drogas metálicas, respostas de
estresse, bem como, apoptose celular (Thornalley e Vasak, 1985).
As MTs, possuem composição bastante heterogênea e estão agrupadas em
15 famílias definidas de acordo com critérios taxonômicos
(http://www.unizh.ch/;mtpage/classif.html; Binz e Kagi, 1999). As MTs de plantas
que pertencem à família 15, geralmente possuem dois domínios curtos ricos em
resíduos de cisteína (quatro a oito resíduos cada um) e uma região espaçadora
mais longa (30-50 resíduos) que não possui este aminoácido. A distribuição dos
resíduos de cisteínas e o comprimento da região espaçadora são usados para
subdividir as MTs de plantas em quatro tipos, MT 1 a 4 (Robinson et al., 1993;
Cobbett e Goldsbrough, 2002). Os genes das MTs do tipo 1 são mais expressos
67
nos tecidos vasculares de folhas e raízes, enquanto as do tipo 2 são expressas
principalmente nas partes aéreas, folhas, brotos e em algumas espécies em
raízes (Zhou e Goldsbrough, 1994, 1995; Hsieh et al., 1995, 1996 in Guo et al.,
2003).
As MT3 são expressas predominantemente em folhas e em frutos frescos
maduros (Ledger e Gardner, 1994 in Guo et al., 2003). MTs do tipo 4 diferem das
outras MTs de plantas por terem três domínios ricos em cisteínas que são
separados por regiões espaçadoras que contêm de 10 a 15 resíduos. Este tipo é
o que tem menor número de proteínas identificadas. A expressão de genes
desta MT é restrita a sementes (Kawashima et al., 1992; White e Rivin, 1995 in
Guo et al., 2003). A grande maioria de MTs identificadas em plantas são de
angiospermas (Cobbett e Goldsbroug, 2002).
1.5. Resveratrol sintase - RS
Fitoalexinas são metabólitos secundários antimicrobianos e de baixo peso
molecular produzidos por plantas após ataque de patógenos (Hammerschmidt,
1999). A fitoalexina, trans-resveratrol, pertence ao grupo dos estilbenos o qual
ocorre naturalmente num número limitado de plantas de famílias distantes
(Schröder et al., 1988). Sua síntese é induzida em plantas pelo ataque de fungos
patogênicos (Morrissey e Osbourn, 1999), e sua função seria de impedir o
desenvolvimento do patógeno. Estilbeno sintases são enzimas chaves na
síntese de estilbenos e são distinguíveis de acordo com a especificidade ao
substrato. Resveratrol é sintetizado pela enzima resveratrol sintase (RS)
utilizando como substrato uma molécula de 4-coumaroil-CoA e três moléculas de
malonil-CoA, ambas comuns em plantas (Schröder et al., 1988) (Fig. 3).
Resveratrol sintase (RS) foi inicialmente identificada em amendoim (A.
hypogaea, Fabaceae) (Schöppner e Kindl, 1984) e depois em videiras (Vitis
vinifera, Vitaceae) (Sparvoli et al., 1994); Festuca versuta e F. arundinacea
(Poaceae) (Powell et al., 1994); na planta medicinal ruibarbo, Rheum palmatum e
R. tataricum (Poligonaceae) (Kashiwada et al., 1988; Samappito et al. 2003); e
em sorgo (Yu et al. 2005).
Em amendoim foram isolados quatro genes rs (Lanz et al., 1990; Schroder
et al., 1988) e juntamente com rs de videiras foram transferidos para outras
espécies que não os possuem como: tabaco, canola, arroz, trigo, cevada e alfafa
68
Figura 3 - Reação de síntese do estilbeno resveratrol pela enzima resveratrol sintase.
Estes transgênicos mostraram aumento na resistência contra vários fungos
incluindo, Botrytis cinerea, Magnaporthe grisea, Phytophthora infestans e Phoma
medicaginis (Hain et al., 1993; Powell et al., 1994; Stark-Lorenzen et al., 1997;
Leckband, e Lorz, 1998; Hipskind e Paiva, 2000).
1.6. Proteínas Hipotéticas – HP1 e HP2
O gene Ashp1 de A. stenosperma, tem proteína deduzida com homologia à
uma proteína hipotética mitocondrial. E o gene Ashp2 com proteínas hipotéticas
de arroz sem função definida.
A aquisição da mitocôndria através de endosimbiose, e do subseqüente “re-
embaralhamento” da informação genética durante a evolução, produziu os
genomas mitocondriais modernos, os quais codificam apenas um pequeno
subconjunto de produtos gênicos necessários para suportar as funções
mitocondriais (Burger et al., 2003; Reichert e Neupert, 2004).
Chalcona
Resveratrol
(Estilbeno)
69
Consequentemente, genomas nucleares têm papéis cruciais na biogênese e na
função mitocondrial (Chinnery, 2003). Estima-se que 10% dos genes
eucarióticos codifiquem proteínas que são dirigidas, ou melhor, que têm como
alvo a mitocôndria, após a sua síntese nos ribossomos citoplasmáticos (Reichert
e Neupert, 2004). Reciprocamente, vias de sinalização mitocondriais influenciam
a expressão de genes nucleares, um processo denominado regulação
retrógrada, (Butow e Narayan, 2004; Chase, 2007) e também regulam outras
funções celulares, mais notadamente nas vias de sinalização de morte celular
(Bras et al. 2005)
.
Uma idéia que vem sendo sedimentada é que a transcrição
nas mitocôndrias de plantas é um processo “relaxado” que em geral, exibe
pouco controle e modulação (Holec et al., 2006). Ao contrário, eventos pós-
transcricionais tais como processamento e controle da estabilidade do mRNA
parecem ser os principais mecanismos envolvidos no controle da expressão
gênica nas mitocôndrias de plantas (Finnegan e Brown, 1999; Johnson et al.,
2005).
Sabe-se que o metabolismo da planta geralmente representa uma mistura
de mudanças entre respostas de defesa, ao ataque do nematóide sejam elas,
respostas que resultem em resistência ou respostas que resultem em
susceptibilidade. Neste capítulo temos como objetivos, (i) analisar a expressão,
através de análise por Northern blot, de alguns dos genes diferencialmente
expressos encontrados pela análise in silico dos ESTs gerados a partir de
bibliotecas de raiz do acesso resistente Arachis stenosperma V10309 inoculada
com o fitonematóide, Meloidogyne arenaria raça 1. (Cap. 2), (ii) verificar e
comparar a expressão destes mesmos genes em raízes infectadas e não
infectadas de A. hypogaea cv IAC-Tatu-ST, cultivar suscetível a este nematóide
e (iii) tentar correlacionar a expressão ao fenótipo observado.
70
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Plantas de Arachis e bioensaio com Meloidogyne arenaria raça 1
Foram utilizadas doze plantas de cada espécie, A. stenosperma (V10309),
e A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST com dois meses de idade. Seis plantas serviram
como controles, e seis plantas tiveram suas raízes inoculadas com 10.000
juvenis de segundo estágio (J2) de M. arenaria raça 1 por planta. Os dois
conjuntos (inoculado e não inoculado) foram coletados nos pontos 4, 9 e 16 dias
após a inoculação (DAI), seguindo o resultado do estudo histopatológico. As
raízes foram coletadas e congeladas em N
2
líquido até a extração do RNA total.
2.2. Validação da análise in silico por Northern Blot
O RNA total foi isolado a partir das raízes não inoculadas e inoculadas
das espécies suscetível e resistente conforme descrito no cap. 2. Depois foi
fracionado por 5 h a 50 V em gel desnaturante 1,2% agarose, 0,77 M
formaldeído 37% em tampão 1X MOPS pelo método-padrão, transferido para
membrana de nylon Hybond-N (Amersham, Arlington, IL), e a membrana foi
fixada através de exposição à luz UV. As membranas foram hibridizadas com os
seguintes ESTs diferencialmente expressos: (1) proteína reprimida por auxina
(Auxin-Repressed Protein, contig 821), (2) citocinina-oxidase/desidrogenase
(Cytokinin-oxidase/dehydrogenase, contig 433), (3) metalotioneína tipo 2 (type-2
Metallothionein, contig 154), (4) resveratrol sintase (Resveratrol Synthase, contig
440), (5) proteína hipotética com homologia a proteína hipotética de fumo
(Hypothetical Protein Nicotiana tabacum, contig 185) e (6) proteína hipotética
com homologia a proteína hipotética de arroz (Hypothetical Protein Oryza sativa,
contig 214). Os ESTs foram re-amplificados por PCR utilizando-se os primers
direto, PT2F2 – 5´-GCGCCATTGTGTTGGTACCC-3’ e reverso, PT2R2- 5´-
CCGCATGCATAAGCTTGCTC-3’. Os produtos das reações de PCR foram
purificados para retirada de excesso de primer, enzima e de outros reagentes
com a coluna S-400 HR MicroSpin Column (Amersham, Arlington, IL). Estes
clones foram re-sequenciados para se certificar sua identidade. Os ESTs foram
71
marcados com o kit Ready-to-Go (Pharmacia) pelo método random priming
(Sambrook e Russell, 2001). Todos os filtros foram pré-hibridizados a 65°C por
no mínimo 3 h e hibridizados a 65 °C por 16-20 h em 5 X SSC, 5 X Solução de
Denhardt, 0,5% SDS e 0,02 mg/mL de esperma de salmão desnaturado. Após
hibridização as membranas foram lavadas 2 vezes a 65 °C por 15 min. em 1 X
SSC e 0,1% SDS e depois em 0,1 X SSC e 0,1% SDS. As membranas foram
expostas em filme de raio-X, (BIOMAX – Kodak). Para a quantificação, os sinais
de hibridização foram corrigidos pela normalização da intensidade do rRNA 28S
corado com brometo de etídeo através de métodos de densitometria, utilizando-
se o programa BioImage Intelligent Quantifier (Intelligent Quantifier, BioImage
Systems, Inc., Jackson, MI, USA). Foi gerado um gráfico com valores arbitrários
para esta correção.
2.3. Análise in silico das Proteínas Preditas
A tradução dos genes diferencialmente expressos foi realizada através do
programa ExPASy Translate Tool (http://ca.expasy.org/tools/dna.html; Gasteiger
et al., 2003). Para o alinhamento múltiplo das proteínas preditas dos ESTs
diferencialmente expressos e suas proteínas homólogas foi utilizado o programa
Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/; Thompson et al., 1994) e utilizado o
programa BOXSHADE 3.21 para melhor visualização dos motivos e domínios
similares entre as proteínas (http://www.ch.embnet.org/software/ BOX_
form.html). Programa BLAST 2 Sequences foi empregado para a comparação de
identidades entre as seqüências protéicas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
/bl2seq/wblast2.cgi; Tatusova e Madden, 1999). Os programas TargetP 1.1,
WolfPSORT e PSORT foram utilizados para procurar possíveis endereçamento e
localização das proteínas preditas (http://www.cbs. dtu.dk/services/TargetP/-
Emanuelsson et al. 2007; http://wolfpsort.org/-Horton et al., 2006;
http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html). Para identificação dos sítios de
glicosilação foi utilizado o programa NetNGly (http://www.cbs.dtu.dk/
services/NetNGlyc/). Para o cálculo da massa molecular foi usado o programa
Peptide-mass tool (http://ca.expasy.org/tools/peptide-mass.html; Wilkins et al,
1997) e os programas PROSITE e MotifScan para procurar motivos, domínios,
72
famílias ou sítios que indicassem função da proteína
(http://br.expasy.org/prosite/-de Castro et al., 2006; http://myhits.isb-sib.ch/cgi-
bin/motif_scan: Falquet et al., 2002).
73
3. RESULTADOS
3.1. Análise temporal da expressão do gene arp (proteína reprimida
por auxina, contig 821)
Em raízes inoculadas de A. stenosperma com nematóide, o gene da
proteína reprimida por auxina, a partir daqui denominado Asarp, foi o EST mais
abundante com 115 seqüências (Cap. 2). A análise in silico mostrou que este
gene é diferencialmente expresso, sendo sua expressão induzida nas raízes
inoculadas (Tabela 1). Na análise temporal, foi observado que este gene foi
expresso nas duas espécies, A. stenosperma, resistente, e A. hypogaea,
suscetível. Quando as raízes foram inoculadas com nematóide ocorreu a
indução da expressão do Asarp nos dois sistemas. Uma diferença é a
intensidade desta expressão, sendo mais forte na espécie resistente (Fig. 4). E
de modo similar, nas raízes não infectadas, esta expressão foi mais intensa em
A. stenosperma (Fig. 4), sendo quase duas vezes maior que em A. hypogaea
(Fig. 5).
3.1.1. AsARP e outras proteínas ARP
Uma análise da seqüência protéica predita do gene arp de A.
stenosperma mostrou grande homologia de seqüência com membros da família
da proteína ARP/DRM (auxin-repressed/dormancy protein). A proteína deduzida
tem 120 aminoácidos e uma massa molecular com cerca de 12,5 kDa, calculada
pelo programa peptide-mass tool (http://ca.expasy.org/tools/peptide-mass.html).
Através do programa PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html) foi predito
que a proteína AsARP está localizada no citoplasma. Não foram encontrados
motivos de sinalização para alvo organelar ou de seqüências de peptídeo sinal.
Um alinhamento múltiplo das seqüências protéicas deduzidas de AsARP e de
todas as outras ARP/DRM disponíveis nos bancos de dados, através do
programa Clustal W, revelou a presença de duas regiões conservadas, uma na
extremidade N-terminal (Motivo 1) e outra na
74
Tabela 1 – Comparação entre os resultados da expressão de genes de raízes de Arachis
stenosperma inoculadas com o nematóide Meloidogyne arenaria através da análise in silico dos
ESTs e Northern blot.
Gene
Análise in silico Northern blot
Proteína reprimida por auxina (Asarp)
Induzida Induzida
Citocinina oxigenase/desidrogenase (Asckx)
Reprimida 4 DAI
a
-Induzida
9 e 16 DAI-Reprimida
Metalotioneína do tipo 2 (Asmt2)
Reprimida Reprimida
Resveratrol sintase (Asrs)
Reprimida Induzida
Proteína hipotética 1 (N. tabacum) (Ashp1)
Induzida Induzida
Proteína hipotética 2 (Oryza sativa) (Ashp2)
Induzida Induzida
a
DAI= dias após inoculação.
extremidade C-terminal (Motivo 2). (Anexo IV – Fig.1).
Figura 4 - Análise temporal da expressão do gene Asarp em raízes de Arachis stenosperma e A.
hypogaea não inoculadas (NI) e inoculadas (I) com Meloidogyne arenaria raça 1. Os pontos
avaliados foram 4, 9 e 16 dias após a inoculação. BrEt = rRNA 28S corado com brometo de
etídeo correspondente a cada amostra aplicada no gel.
75
Figura 5- Quantificação das bandas dos sinais de hibridização do gene Asarp durante a análise
temporal da expressão dos genes; os valores correspondem a densitometria realizada pelo
programa BioImage Intelligent Quantifier. Ah= Arachis hypogaea; As= A. stenosperma; NI= não
inoculado; I= inoculado.
3.2. Análise temporal da expressão do gene ckx (gene da enzima
citocinina-oxidase/desidrogenase, contig 433)
O gene ckx foi um dos genes diferencialmente expressos na análise dos
ESTs de bibliotecas de raízes não inoculadas e inoculadas de A. stenosperma
com o nematóide M. arenaria. Na análise temporal da expressão do gene ckx, (a
partir daqui denominado Asckx), observamos que em raízes de A. stenosperma
inoculadas (4 DAI), houve uma indução na expressão do gene comparado às
raízes não inoculadas, no entanto aos 9 e 16 DAI, a expressão foi reprimida (Fig.
6). Este resultado discorda em parte com o apresentado pela análise in silico dos
ESTs, visto que nesta análise a expressão do gene Asckx era reprimida em
raízes inoculadas de A. stenosperma (Tabela 1). Todavia, esta diferença pode
ser função do conjunto de RNAs analisados em cada experimento, uma vez que
as bibliotecas de ESTs foram desenvolvidas com o conjunto de transcritos entre
os dias 2, 6 e 10 DAI, enquanto a análise da expressão pelo Northern blot foi
feita individualmente ponto a ponto entre os dias 4, 9 e 16 DAI. De qualquer
maneira, a análise in silico pôde nos orientar na escolha dos genes
diferencialmente expressos, pois teve natureza qualitativa (diferencialmente
expresso). Um padrão de expressão diferente foi observado nas raízes da
espécie suscetível, A. hypogaea, onde a expressão de Asckx foi induzida em
todos os pontos observados durante a infecção com nematóide (Fig. 6).
Adicionalmente cabe destacar que a expressão deste gene foi maior nas raízes
0
2
4
6
8
10
12
14
Ah-NI Ah-I As-NI As-I
4 DAI
9 DAÍ
16 DAÍ
76
de A. hypogaea não inoculadas que nas de A. stenosperma também não
inoculadas.
Figura 6 - Análise temporal
da expressão do gene Asckx em raízes de Arachis stenosperma e A.
hypogaea não inoculadas (NI) e inoculadas (I) com Meloidogyne arenaria raça 1. Os pontos
avaliados foram 4, 9 e 16 dias após inoculação (DAI). BrEt = rRNA 28S corado com brometo de
etídeo correspondente a cada amostra aplicada no gel.
3.2.1. AsCKX e outras proteínas CKXs
A busca por genes que codificam CKX de plantas no banco de dados
GenBank através do programa BLAST search, mostrou que há 28 genes
anotados (Tabela 2). A massa molecular predita para Asckx é de 59,7 kDa e
segundo programa TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/;
Emanuelsson et al. 2007) e parece ser secretada (Tabela 2). A comparação
através do programa BLAST2 Sequences, entre as seqüências das diferentes
CKXs e a CKX de A. stenosperma (AsCKX) mostrou baixa identidade entre elas,
que varia de 34% com a OsCKX8 de arroz a 45% com a AtCKX3 de Arabidopsis.
A. stenosperma A. hypogaea
NI
I
16 9 4
NI
16 9
4 16 9 4
I
16 9 4
BrEt
Asckx
77
Tabela 2- Características das proteínas CKXs de plantas.
Nome
do
Gene
a
Número de
Acesso
b
Tamanho
(aa)
Massa
c
(kDa)
Localização
Subcelular
(TargetP)
d
Localização
Subcelular
(WolfPSORT)
e
Sítios de
Glicosilação
f
Referências
g
AsCKX
532 59,7 S/1 Citoplasma/RE 4/4 -
AtCKX1
NM_129714 575 64,9 M/2 Cloroplasto 8/5 1,2
AtCKX2
NP_565455 501 55,6 S/5 Mitocôndria 3/3 1,2
AtCKX3
NP_200507 523 59,4 M/5 Vacúolo 4/2 1,2
AtCKX4
NM_119120 524 58,1 S/2 Extracelular 4/4 1,2
AtCKX5
NP_177678 540 60,4 S/1 Vacúolo 3/2 1,2
AtCKX6
Q9LY71 504 56,5 S/1 Extracelular 4/4 1,3
AtCKX 7
NP_850863 524 57,9 - Citoplasma 6/6 1
OsCKX1
Q9LDE6 532 56,0 S/3 RE 6/5 4
OsCKX2
AB205193 565 60,0 S/5 Cloroplasto 2/1 4
OsCKX3
AK103272 527 58,4 S/2 Cloroplasto Nenhum
sítio predito
4
OsCKX4
AK121317 525 58,0 S/1 RE 3/3 4
OsCKX5
AK101022 534 58,2 S/1 Citoplasma/RE 2/1 4
OsCKX6
BAD17196 527 57,4 S/2 Cloroplasto 3/3 4
OsCKX7
BAD17197 524 56,9 S/2 Cloroplasto 4/4 4
OsCKX8
CAE05712.2 532 57,6 S/1 Cloroplasto Nenhum
sítio predito
4
OsCKX9
AAT58842 521 58,3 S/4 Cloroplato/Núcl
eo/Citoplasma
5/5 4
OsCKX10
BAD61939 550 59,9 S/4 Cloroplasto 1/1 4
OsCKX11
BAD09964 518 55,3 - Citoplasma Nenhum
sítio predito
4
ZmCKX1
AF044603 534 57,2 S/5 Citoplasma/RE 8/5 5,6
ZmCKX2
CAE55200 519 57,9 S/1 Cloroplasto 3/3 5,6
ZmCKX3
CAE55201 525 58,5 S/1 Cloroplasto 3/3 5,6
HvCKX1
AF362472 137 15,6 - Citoplasma 1/1 7
HvCKX2
AAN16383 526 58,8 S/2 Citoplasma 5/5 7
HvCKX3
AAO50082 520 58,2 S/3 Cloroplasto 5/5 7
TaCKX
AF362471 137 15,5 S/5 Mitocôndria - 7
DsCKX
CAC17752 536 60,4 - Cloroplasto 2/2 8
StCKX
ABH01255 130 15,3 M/4 Mitocôndria 1/1 9
a
Nome dos genes é dado seguindo denominações do GenBank: As- Arachis stenosperma, At- Arabidopsis thaliana, Os- Oryza
sativa, Zm- Zea mays, Hv- Hordeum vulgare, Ta- Triticum aestivum, Ds- Dendrobium spp., St- Solanum tuberosum;
b
Seqüências podem ser encontradas com o número de acesso no endereço
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide);
c
Massa
Molecular calculadas com o peptide-mass tool (http://ca.expasy.org/tools/peptide-mass.html; WIlkins et al., 1997);
d
Localização Subcelular/Classe de segurança (1= alta até 5 = baixa) calculado com TargetP 1.1
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/; Emanuelsson et al. 2007); S= via de secreção, M = mitocôndria, e C = cloroplasto e “–“ =
sem predição;
e
Localização Subcelular calculada com WolfPSORT (http://wolfpsort.org/; Horton et al., 2006);
f
Todos os sítios de N-glicosilação preditos/ Os sítios preditos de glicosilação com mais de 50% de probabilidade calculados com
NetNGly (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/);
g
Referências:1- Bilyeu et al. 2001; 2- Werner et al. 2001; 3- Werner et al., 2003; 4- Ashikari et al.,2005; 5- Morris et al. 1999; 6-
Houba-Hérin et al. 1999; 7- Submetido diretamente ao CoreNucleotide Bank por Galuszka et al., 2001; 8- Yang et al. 2002; 9-
Submetido diretamente ao Protein Bank por Nisha,K.K. e Purushothama,M.G. (26/06/2006).
O alinhamento de AsCKX com outras seqüências de CKXs de plantas
pelo programa Clustal W mostrou que o domínio de ligação ao FAD - Flavina
adenina dinucleotídeo (Fig. 7) é bem conservado no N-terminal.
78
Figura 7 - Domínios conservados entre as diferentes CKXs de plantas. [Figura desenhada pelo
site de busca de seqüências protéicas BLASTp (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Outros dois domínios conservados são o domínio de glicosilação e o de ligação
à citocinina. (Fig. 7 e Anexo IV – Fig. 2). No motivo GHS do domínio de ligação
ao FAD, a proteína AsCKX teve a histidina substituída por uma alanina (Anexo
IV – Fig. 2). As massas moleculares das CKXs calculadas a partir das
seqüências protéicas são uniformes variando entre 56-64,9 kDa (Tabela 2). As
CKXs da maioria das plantas mostraram ser glicoproteínas, possuindo sítios
preditos de glicosilação com probabilidade acima de 50% (Tabela 2).
3.3. Análise temporal da expressão do gene mt2 (gene da
metalotioneína 2, contig 154)
Entre os ESTs diferencialmente expressos foi identificado o gene da
metalotioneína do tipo 2, denominado aqui, Asmt2. O gene desta MT2 foi o
segundo gene com maior número de clones identificados entre os ESTs. E de
acordo com a análise in silico teve expressão reprimida nas raízes inoculadas de
A. stenosperma (Tabela 1). Na análise temporal da sua expressão, foi observado
que este gene tem forte expressão em raízes de A. stenosperma (Fig. 8), tecido
que geralmente apresenta expressão mais acentuada de MTs do tipo 1. Após
inoculação o gene Asmt2 foi reprimido (Fig. 8). Nas raízes de A. hypogaea, no
entanto, não foi observada a expressão deste gene, em nenhuma das
condições, nem na condição não inoculada e nem na condição inoculada com
nematóide (Fig. 8).
79
Figura 8 - Expressão temporal da expressão do gene Asmt2 em raízes de Arachis stenosperma
e A. hypogaea não inoculadas (NI) e inoculadas (I) com Meloidogyne arenaria raça 1. Os pontos
avaliados foram 4, 9 e 16 dias após a inoculação. BrEt = rRNA 28S corado com brometo de
etídeo correspondente a cada amostra aplicada no gel. O tempo de exposição do filme foi de
duas horas.
3.3.1. AsMT2 e outras proteínas MT2s
A proteína AsMT2, deduzida a partir da seqüência do gene Asmt2 tem 82
aminoácidos e uma massa molecular com cerca de 7,99 kDa, calculada pelo
programa peptide-mass tool (http://ca.expasy.org/tools/peptide-mass.html;
Wilkins et al. 1997). Através dos programas TargetP
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/; Emanuelsson et al. 2007) e
WolfPSORT (http://wolfpsort.org/; Horton et al., 2006), foi predito que esta
proteína está localizada no cloroplasto. A análise das proteínas mostrou grande
variação entre as seqüências de AsMT2 e MT2s de outras espécies. As
identidades variam de 41% com OsMT2b de arroz até 73% com MtMT2 de
Medicago truncatula. O alinhamento múltiplo de diversas seqüências protéicas
de MT2 através do programa Clustal W, mostrou alta conservação nos dois
domínios de resíduos de cisteína, β-domíno, na extremidade N-terminal e α-
domíno no C-terminal (Anexo IV, Fig. 3).
80
3.4. Análise temporal da expressão do gene rs (gene da enzima
resveratrol sintase, contig 440)
O gene da enzima resveratrol sintase (rs) foi um dos genes
diferencialmente expressos nas bibliotecas de raízes de A. stenosperma
inoculada e não inoculada com nematóide. Na análise in silico dos ESTs este
gene (Asrs), teve a expressão reprimida em raízes inoculadas de A.
stenosperma (Tabela 1). Já na análise temporal, a expressão do gene Asrs nas
raízes desafiadas foi induzida como observado através do Northern blot, sendo
mais pronunciada em A. hypogaea (Fig. 9). Pôde-se ainda observar que este
gene foi expresso nas raízes não inoculadas de ambas as espécies (Fig. 9).
Figura 9 – Análise temporal da expressão do gene Asrs em raízes de Arachis stenosperma e A.
hypogaea não inoculadas (NI) e inoculadas (I) com Meloidogyne arenaria raça 1. Os pontos
avaliados foram 4, 9 e 16 dias após a inoculação. BrEt = rRNA 28S corado com brometo de
etídeo correspondente a cada amostra aplicada no gel.
3.4.1. AsRS e outras proteínas RS
A proteína AsRS é constituída por 389 aminoácidos e tem massa
molecular predita pelo programa peptide-mass tool (http://ca.expasy.org/tools
/peptide-mass.html; Wilkins et al. 1997), de 42,8 kDa. Não teve predição de
localização subcelular pelo programa TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services
81
/TargetP/; Emanuelsson et al. 2007), mas foi indicada como citoplasmática de
acordo com o programa WolfPSORT (http://wolfpsort.org/; Horton et al., 2006).
Uma comparação da seqüência de AsRS e outras enzimas resveratrol sintases
mostrou que esta tem grande homologia com as RSs de A. hypogaea, com 95%,
96% e 98% de identidade com AhRS1, AhSTS2 e AhRS3, respectivamente. A
menor identidade observada foi de 65% com RtSTS de Rheum tataricum. O
alinhamento múltiplo de várias seqüências protéicas de resveratrol sintases é
mostrado no anexo IV- Fig. 4. Por toda seqüência há segmentos idênticos e a
seqüência como um todo mostra homologia com a enzima chalcona sintase,
outra estilbeno sintase.
3.5. Análise da expressão temporal dos genes Ashp1 e Ashp2 (genes
homólogos às proteínas hipotéticas de Nicotiana tabacum e
Oryza sativa, contigs 214 e 185)
Os outros dois genes diferencialmente expressos identificados nas
bibliotecas de raízes inoculadas e não inoculadas de A. stenosperma são
homológos a genes de proteínas hipotéticas de Nicotiana tabacum, Arabidopsis
thaliana, Medicago truncatula e Oryza sativa. Foram aqui, denominados: Ashp1
e Ashp2 (A. stenosperma hypothetical protein). Segundo a análise in silico
ambos tiveram sua expressão induzida nas raízes de A. stenosperma inoculadas
com nematóide (Tabela 1).
Gene Ashp1
A expressão temporal do gene Ashp1 de raízes de A. stenosperma e A.
hypogaea inoculadas e não inoculadas com nematóide foi monitorada através de
experimentos de Northern blot (Fig. 10). O gene Ashp1 foi expresso e acumulado
tanto em raízes de A. stenosperma e A. hypogaea não inoculadas, quanto nas
inoculadas com M. arenaria. Porém este acúmulo foi maior nas raízes da
espécie resistente (Fig. 10).
82
Figura 10 - Análise temporal da expressão do gene Ashp1 em raízes de Arachis stenosperma e
A. hypogaea não inoculadas (NI) e inoculadas (I) com Meloidogyne arenaria raça 1. Os pontos
avaliados foram 4, 9 e 16 dias após a inoculação. BrEt = rRNA 28S corado com brometo de
etídeo correspondente a cada amostra aplicada no gel.
O gene Ashp1 somente tem homologia com os genes ArthMp003 de
Arabidopsis; NitaMp027 de N. tabacum e MtrDRAFT_AC138017g30v2 de M.
truncatula, respectivamente e foram identificados como genes mitocondriais sem
função conhecida. Este é o primeiro relato da expressão deste gene
mitocondrial, demonstrando que ele, não somente, é transcrito como tem forte
acúmulo em raízes de A. stenosperma e de A. hypogaea (Fig. 10).
AsHP1 e outras proteínas hipotéticas
O gene Ashp1 tem 94%, 92% e 90% de identidade com os genes
mitocondriais: ArthMp003 de Arabidopsis; NitaMp027 de N. tabacum e
MtrDRAFT_AC138017g30v2 de M. truncatula, respectivamente (Anexo IV - Fig.
5). Todas as proteínas preditas destes genes possuem um motivo conservado
“PWITDGISPWPFASESVLPSQCPGIHP” (Anexo IV - Fig. 5). No entanto, não
existem domínios caracterizados para estas proteínas. Na busca por motivos
que indicassem o endereçamento destas proteínas somente foi possível predizer
a localização subcelular em duas das quatro seqüências analisadas,
evidenciando que os motivos, na região N-terminal, utilizados para prever a sub-
localização estão ausentes em algumas das seqüências (Tabela 3). Outras
83
Tabela 3- Características das proteínas hipotéticas similares à AsHP1.
Nome do Gene
a
Número de
Acesso
b
Tamanho
(aa)
Massa
c
(kDa)
Localização
Subcelular
(TargetP)
d
Referências
e
Ashp1 59 6,5 M/4 -
ArthMp003 NP_085475
107 11,9 - 1
NitaMp027 YP_173374
92 10,7 - 2
MtrDRAFT_AC138017g30v2 ABO79948
95 10,7 M/4 3
a
Nome dos genes é dado seguindo denominações do GenBank: As- Arachis stenosperma, ArthMp003- Arabidopsis
thaliana, NitaMp027- Nicotiana tabacum, MtrDRAFT_AC138017g30v2- Medicago truncatula;
b
Seqüências podes ser encontradas com o número de acesso no endereço
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide);
c
Massa
Molecular calculadas com o peptide-mass tool (http://ca.expasy.org/tools/peptide-mass.html; Wilkins et al. 1997);
d
Localização Subcelular/Classe de segurança (1= alta até 5 = baixa) calculado com TargetP
1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/; Emanuelsson et al. 2007); S= via de secreção, M = mitocôndria, e C =
cloroplasto e “–“ = sem predição.
e
Referências de submissão das seqüências: 1 - Unseld et al., 1997; 2- Sugiyama et al., 2005; 3 – Submissão direta por
Shaull, S., Lin, S., Dixon, R., May, G., Sumner, L., Gonzales, B., Cook, D., Kim, D. e Roe, B.A., 2002 (The International
Medicago Genome Annotation Group).
características das proteínas hipotéticas mitocondriais são apresentadas na
tabela 3.
Gene Ashp2
O segundo gene homólogo a proteínas hipotéticas identificado nas
analises in silico das bibliotecas de raízes inoculadas e não inoculadas de A.
stenosperma foi o gene, aqui denominado Ashp2. Este gene apresentou
homologia somente com genes de proteínas hipotéticas de arroz. Embora a
função do gene Ashp2 seja desconhecida, observamos que foi transcrito e teve
maior acúmulo nas raízes inoculadas com nematóide da espécie resistente. No
entanto, na espécie suscetível, A. hypogaea, este acúmulo foi maior nas raízes
não inoculadas (Fig. 11).
84
Figura 11 – Análise temporal da expressão do gene Ashp2 em raízes de Arachis stenosperma e
A. hypogaea não inoculadas (NI) e inoculadas (I) com Meloidogyne arenaria raça 1. Os pontos
avaliados foram 4, 9 e 16 dias após a inoculação. BrEt = rRNA 28S corado com brometo de
etídeo correspondente a cada amostra aplicada no gel.
AsHP2 e outras proteínas hipotéticas
A proteína AsHP2 predita do gene Ashp2 apresenta 47-75% de identidade
com proteínas hipotéticas sem função conhecida, de O. sativa (Anexo IV – Fig.
6). A tabela 4 mostra algumas características dessas proteínas. Como em alguns
Tabela 4- Características das proteínas hipotéticas similares à AsHP2.
Nome do Gene
a
Número de
Acesso
b
Tamanho
(aa)
Massa
c
(kDa)
Identidade
com AsHP2
d
(%)
Ashp2 137 15,1 -
OsI_003050
EAY75203
136 15,0 75
Os01g0652700
NP_001043739
178 19,9 74
OsI_020349
EAY99116
179 20,0 74
Os11g0683600
NP_001068462
198 18,9 56
Os12g0563600
NP_001067038
203 21,9 47
a
Nome dos genes é dado seguindo denominações do GenBank: As- Arachis stenosperma, ArthMp003- Arabidopsis
thaliana, NitaMp027- Nicotiana tabacum, MtrDRAFT_AC138017g30v2- Medicago truncatula;
b
Seqüências podes ser encontradas com o número de acesso no endereço
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide);
c
Massa
Molecular calculadas com o peptide-mass tool (http://ca.expasy.org/tools/peptide-mass.html; Wilkins et al. 1997);
d
Identidade da proteína predita AsHP2 com outras proiteínas hipotéticas de arroz dado pelo programa BLAST 2
Sequences.
dos casos anteriores, não foi encontrado nenhum domínio conservado que
pudesse prever a sub-localização celular.
85
4. DISCUSSÃO
4.1. Expressão do gene Asarp
Diversos trabalhos relacionam a formação dos sítios de alimentação com
a presença e abundância do hormônio auxina
.
Hutangura e colaboradores (1999)
mostraram que há uma acumulação de auxina nas células precursoras das
células gigantes e que esta foi eliminada nas primeiras 96h de infecção do
nematóide das galhas, sugerindo que este hormônio deva ter papel na formação
das galhas em Trifolium repens. Este resultado, segundo Doyle e Lambert (2003)
é consistente com a sua hipótese de que a proteína corismato mutase I de M.
javanica seja responsável pela diminuição dos níveis de auxina nas células
gigantes recém formadas. Goverse et al. (2000b) e Mazarei et al. (2004)
mostraram também que a auxina atua de forma proeminente nos estágios
iniciais do desenvolvimento das células de alimentação induzidas por
nematóides de cisto através da sua acumulação rápida e local. Esses autores
sugerem que o balanço entre o transporte de auxina e a sua síntese seja crítico
na formação e no desenvolvimento do sítio de alimentação. Demonstraram,
ainda, que plantas mutantes, insensíveis à auxina, são resistentes aos
nematóides. Voisin et al. (1999) observaram que concentrações elevadas de
auxina permitiram a quebra de resistência ao nematóide M. arenaria em Prunus
cerasifera.
Considerando os relatos da literatura, que descrevem uma relação inversa
entre a presença de auxina e a expressão do gene arp, pode-se supor que
houve uma diminuição dos níveis de auxina nos pontos 4, 9 e 16 DAI nas raízes
inoculadas com nematóides das galhas, tanto em A. stenosperma (resistente)
como em A. hypogaea (suscetível) (Fig. 4). Neste sentido, os resultados aqui
observados estão de acordo com os dados da literatura, que mostraram que a
partir de 4 DAI os níveis de auxina diminuem durante a infecção com
nematóides. Cabe ressaltar que este resultado foi sempre descrito em sistemas
compatíveis, onde a indução e formação de células gigantes ou sincícios se dão
geralmente, em até 4 DAI. Entretanto para a espécie resistente, A. stenosperma,
o desenvolvimento do ciclo de infecção do nematóide não se enquadra nestes
períodos, não havendo então, sinalização para a redução dos níveis de auxina.
86
Isto claro, tomando-se a premissa de que os níveis do hormônio auxina estão
elevados durante os primeiros estágios da infecção. Plantas desta espécie
devem, de alguma forma, ter o transporte de auxina nas raízes bloqueado,
impedindo assim que os juvenis que penetraram no sistema radicular não
consigam induzir o sítio de alimentação De fato, foi observado no estudo
histopatológico que a incapacidade de induzir sítio de alimentação, realmente é
um dos pontos de resistência desta espécie (Cap. 1).
Os resultados aqui obtidos mostraram que ocorreu um acúmulo da
expressão do gene Asarp nas raízes tanto da espécie suscetível (sistema
compatível), quanto da espécie resistente (sistema incompatível). O aumento do
sinal do gene Asarp pode ser devido tanto ao aumento transcricional da
expressão do gene, quanto ao aumento da vida média do seu mRNA. Em A.
hypogaea, observamos que este gene foi induzido, mas teve uma expressão
quase duas vezes menor que em A. stenosperma (Fig. 5). É importante salientar
que mesmo nas raízes não inoculadas de A stenosperma, a expressão do Asarp
já se mostrava bem mais elevada que em A. hypogaea. Considerando estes
resultados, podemos supor que o gene Asarp deve ter papel nesta resposta de
defesa e o seu nível de expressão pode estar associado à resistência.
Corroborando esta suposição, a indução do gene arp já foi demonstrada em
respostas a vários estresses. Em folhas e caules lesionados de pimenta foi
observada a indução do gene arp tanto num sistema compatível (inoculado com
Xanthomonas campestris), quanto num sistema incompatível (inoculado com
Phytophthora capsici), enquanto em plantas controles, não inoculadas, não foi
observado a sua expressão (Jung e Hwang, 2000). Em outro estudo com um
sistema compatível, foi observada a indução do gene arp em raízes de soja
inoculadas com o nematóide de cisto Heterodera glycines (Alkharouf et al.,
2004). O gene arp também foi induzido em vagens imaturas infectadas com
fungo de uma variedade de A. hypogaea que é resistente à seca e também
tolerante à aflatoxina (Luo et al., 2005). Ainda, em outros estudos de genes
expressos em situação de estresse biótico, onde o gene arp foi induzido temos:
plântulas de Brassica napus tratada com oligoquitosano, substância que
mimetiza estresse biótico (Yin et al., 2006); folhas e caules da leguminosa
Lathyrus sativus (Chícharo) infectadas com Mycospharella pinodes (Skiba et al.,
2005); em grão-de-bico (Cicer arietinum) após ser inoculado com o fungo
87
Ascochyta rabiei (Coram e Paing, 2006) e raízes de Medicago trunculata
noduladas com rizóbio e micorriza arbuscular (Manthey et al., 2004).
Outros trabalhos demonstraram que o gene arp também é induzido em
respostas a estresses abióticos. Como exemplos podem ser citados, folhas de
café tratadas com BHT (di-terc-butil metil fenol), um indutor artificial de SAR,
resistência sistêmica adquirida
(Systemic Acquired Resistance), (De Nardi et al.,
2006); raízes de álamo que sofreram estresse hídrico (Kohler et al., 2003); folhas
de ervilha irradiadas com luz UV-B (Liu et al., 2002) e raízes de pimenta
submetidas ao estresse salino (Hwang et al., 2005). Também é interessante
notar que a expressão do gene arp foi induzida em raízes de pimenta com
estresse de baixa temperatura (4 °C) e foi reprimido em folhas de Brassica rapa
sob condições de estresse de alta temperatura (32 °C) (Hwang et al., 2005, Lee
et al., 2003).
Os resultados aqui obtidos mostraram que indução do gene Asarp pode ter
papel na resposta de defesa à infecção de raízes por nematóides em A.
hypogaea e em A. stenosperma. No entanto, o aumento do seu acúmulo na
espécie suscetível, demonstra tão somente uma reação de resistência basal,
mas ainda, insuficiente para conferir resistência. A expressão de alguns genes
relacionados com defesa é mais rápida e/ou pronunciada em interações
incompatíveis que em compatíveis (Chittoor et al. 1997), como observado em A.
stenosperma, que teve uma expressão quase duas vezes maior.
4.2. Proteínas ARP
Através do programa PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html) foi
predito que a proteína ARP esta localizada no citoplasma. Esta mesma
localização foi descrita para a ARP de Elaeagnus umbellata (EuNOD-ARP), (Kim
et al., 2007). A proteína AsARP tem 100% de identidade com a ARP de A.
hypogaea e 35% de identidade com AtARP2 de A. thaliana. Utilizando-se o
programa MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan: Falquet et al.,
2002), não foi possível a identificação de similaridades entre os motivos
conservados (Motivo 1 e 2) observados na maioria das proteínas ARP (Anexo IV
– Fig.1), e outros motivos estruturais já conhecidos. Porém, considerando o grau
de identidade/similaridade entre as proteínas ARP das diversas espécies
88
analisadas, esses segmentos possivelmente devem corresponder a domínios
estruturais.
4.3. Expressão do gene Asckx
O padrão de atividade e os níveis de transcritos de ckx sugerem que o
controle transcricional da expressão deste gene seja feito pelo hormônio
citocinina (Brugière et al., 2003; Gaudinová, et al., 2005; Hirose et al., 2007).
Diversos trabalhos mostraram que tanto citocinina endógena quanto a aplicação
exógena, estimulam a atividade, ou seja, a indução do gene citocinina
oxidase/desidrogenase - ckx. Esta indução foi observada em culturas de células
de fumo (Terrine e Laloue, 1980), em culturas de calos de várias plantas
(Chatfield e Armstrong, 1986; Palmer e Palni, 1987; Motyka et. al., 1996), em
raízes de Arabidopsis, Dendrobium, milho, trigo, cevada e arroz (Schmülling et
al., 2001, 2003; Brugière et al., 2003; Aval’baev et al., 2006; Yang et al., 2003b;
Galuszka et al., 2004; Hirose et al., 2007). No conjunto, estes resultados
demonstram uma resposta de retroalimentação negativa, indicando que a própria
citocinina induz sua degradação, pelo menos em parte, pela indução da
expressão do gene ckx, modulando assim os níveis de citocinina e
conseqüentemente sua ação no tecido (Kakimoto, 2003; Lee et al., 2007). Com
base nesses trabalhos é possível inferir que a indução da expressão de Asckx
em raízes de A. hypogaea (4, 9 e 16 DAI) e A. stenosperma (4 DAI) inoculadas
com nematóide pode ser devida à presença de citocinina no tecido, o que
provoca sua rápida degradação.
Foi observado que durante a infecção de raízes com nematóides, na
formação do sítio de alimentação e durante os estágios mais desenvolvidos das
galhas, a planta produz citocinina (Lohar et al., 2004). Esta produção foi
demonstrada através da indução do promotor do gene ARR5 (Arabidopsis
response regulator), que é um gene que responde ao hormônio citocinina (Lohar
et al., 2004). Outros trabalhos mostraram que a citocinina também é produzida
pelo próprio nematóide na infecção (Bird e Loveys, 1980; Meutter et al., 2003),
mas o seu papel durante o parasitismo ainda não está esclarecido (Bird, 2004).
Lohar e colaboradores (2004) super-expressaram o gene ckx de milho e de
Arabidopsis em raízes transgênicas de Lotus japonicus e observaram que houve
89
uma redução de 50% no número de galhas, indicando que raízes com
resistência à citocinina, ou seja, insensíveis ao hormônio citocinina eram menos
suscetíveis aos nematóides das galhas. Os mesmos autores demonstraram que
num sistema compatível, a expressão e/ou acumulação de citocinina não ocorre
durante a penetração e migração dos J2s, mas somente, na formação do sítio e
nas células adjacentes às células gigantes nos estágios mais avançados do ciclo
de infecção. Os pontos nos quais observamos aumento da expressão de Asckx
correspondem, na espécie suscetível, aos estágios de instalação e
desenvolvimento do sítio de alimentação (Cap. 1). No entanto, na espécie
resistente (sistema incompatível) ocorreu a indução do gene Asckx aos 4 DAI,
que segundo, o estudo histopatológico (Cap. 1) corresponde ao período de
penetração dos J2s. Esta indução pode ser um indício de que neste momento
havia uma maior concentração do hormônio citocinina nas raízes infectadas.
Como nesta espécie não há formação de sítio de alimentação, foi possível
observar a repressão deste gene nos pontos seguintes analisados (9 e 16 DAI).
Em função do exposto, pode-se inferir que A. stenosperma, de alguma forma
impede a acumulação de citocinina durante a infecção com nematóide, o que
pode estar promovendo ou contribuindo para sua resistência a este patógeno.
4.4. AsCKXs e outras proteínas CKXs
A lista de organismos que tem atividade CKX inclui algumas espécies não
vegetais tais como, Dictyostelium discoideum (Armstrong e Firtel, 1989) e
Saccharomyces cerevisiae (Van Kast e Laten, 1987).
Grande parte das proteínas CKXs possuem estruturas similares como o
domínio de ligação ao FAD, o domínio de ligação à citocinina e um domínio de
glicosilação (Fig. 7). Algumas diferenças nas seqüências podem ser explicadas
por modificações pós-transcricionais (Schmülling et al., 2003). As CKXs da
maioria das plantas mostraram ser glicoproteínas, no entanto, nem todas são
glicosiladas e foi sugerido que esta diferença seja importante para a localização
da enzima, bem como para a regulação da sua expressão (Motyka et al., 2003).
Estas enzimas utilizam o FAD (Flavina Adenina Dinucleotídeo) como cofator e
como qualquer cofator, este elemento não participa diretamente da reação, mas
é fundamental para que a mesma ocorra. No caso das CKXs o domínio FAD
90
serve como carreador de elétrons. Flavinas são bem conhecidas como cofatores
nos sítios ativos de muitas enzimas (flavoproteínas). As enzimas CKXs são
flavoproteínas que não utilizam o oxigênio como receptor de elétrons e por isso
foram reclassificadas como citocininas desidrogenases -EC. 1.5.99.12 (Galuszka
et al., 2001). Dentro do domínio de ligação ao FAD, o motivo GHS foi encontrado
nas posições 92-94 da maioria das CKXs, sugerindo que a enzima deve se ligar
covalentemente (Morris et al.1999; Bilyeu et al. 2001) ao FAD através do resíduo
de histidina (Houba-Hérin et al., 1999). Na AsCKX a glicina deste motivo foi
substituída por alanina, outro aminoácido alifático. Dentre todas as seqüências
analisadas e que possuíam este motivo, AsCKX foi a única que apresentou uma
substituição nessa posição (Anexo IV – Fig. 2).
A análise das seqüências das diferentes CKX mostrou haver baixa
identidade entre elas, mas apesar das diferenças, pelo menos um terço de todas
as posições são altamente conservadas (Schmülling et al., 2003). Existem ainda
motivos curtos encontrados nas duas extremidades que também são bem
conservados, como as seqüências GLWEVPHPWLNL no N-terminal e PGQXIF
no C-terminal (Schmülling et al., 2003). Mesmo com um alto grau de
variabilidade entre as seqüências, a existência de posições conservadas indica
que os aminoácidos conservados são funcionalmente importantes. Algumas
dessas seqüências parecem ser específicas das enzimas CKX, podendo ter
papel no reconhecimento do substrato e no transporte de elétrons (Schmülling et
al., 2003). Existem ainda vários outros sítios de reconhecimento para diferentes
proteínas quinases e sítios de miristoilação, mas que não são bem conservados
entre as diferentes CKXs (dado não mostrado).
Através dos programas TargetP (Emanuelsson et al., 2007) e WolfPSORT
(Horton et al., 2006) foram feitas análises das seqüências para predição da
localização subcelular de cada uma das CKXs (Tabela 2). E ainda a mesma
análise mas com outro programa, PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.
html), indicou que todas as CKXs analisadas tem endereçamento extracelular
(dados não mostrados). Segundo estes programas as chances de acerto são de
até 96%, no entanto, muito dos resultados foram ambíguos. Estas falhas
ocasionais ou ambigüidades nas predições podem ser devido ao fato de que
algumas proteínas não tenham destino exclusivo, mas sim, alvos duplos ou
múltiplos. Isto já havia sido observado em outros estudos (Emanuelsson et al.,
91
2001; Schwacke et al., 2003). Uma análise feita por Werner et al., (2003)
também mostrou a necessidade de experimentos in vivo para a confirmação das
predições.
Um papel para as CKXs extracelulares pode ser o controle da quantidade
de citocinina (CK) importada de algum tecido ou exportada dos tecidos
produtores de CKs (Jones and Schreiber 1997; Mok and Mok 2001). Outra
importante função seria a degradação das CKs derivadas do ciclo celular. O
nível de CKs aumenta drasticamente durante curtos períodos do ciclo celular
entre as fases G
2
e M (Redig et al., 1996). Não se sabe como o nível original de
CKs é reajustado rapidamente, mas acredita-se que CKXs extracelulares devam
estar envolvidas, através do transporte de CKs associadas com ciclo celular para
fora da célula. Uma vez no meio extracelular, poderiam ser degradadas (Redig et
al., 1996; Werner et al., 2003). O transporte de CKs para fora da célula em
divisão permitiria que células vizinhas fossem informadas que uma divisão
celular estaria ocorrendo (Werner et al., 2003)
A CKX de A. stenosperma (AsCKX) foi predita ser endereçada para o
retículo endoplasmático e ser secretada (Tabela 2). Se este for o caso, poderia
ser uma CKX extracelular e estaria atuando, de alguma forma, durante o
processo de endoreduplicação celular iniciado pelos nematóides justamente na
formação do sítio de alimentação e na indução das células gigantes. Neste
sentido, o gene Asckx foi induzido nas raízes de A. hypogaea após a infecção
(Fig. 6).
4.5. Interação dos genes Asarp e Asckx
Os resultados aqui obtidos estão de acordo com os dados obtidos por
outros autores quanto a interação de auxina e citocinina durante o processo de
infecção do nematóide. Foi observado, presente no trabalho, uma baixa
expressão do gene Asarp, indicando talvez, que houvesse a presença de auxina
e uma forte expressão de Asckx, sugerindo também que houvesse a presença
de citocinina nas raízes infectadas com nematóides na espécie suscetível, A.
hypogaea. Já nas raízes infectadas de A. stenosperma, que é resistente,
observamos o contrário, ou seja, alta expressão do gene Asarp, indicando a
ausência de auxina e baixa expressão do gene Asckx, indicando ausência de
92
citocinina. Os dois hormônios, como já ressaltado, são importantes no processo
de infecção dos nematóides. A resistência em A. stenosperma pode ser derivada
desta regulação, pela planta, dos níveis destes hormônios tão importantes
durante a infecção.
4.6. Expressão do gene Asmt2 e a reação de hipersensibilidade
Genes de resistência a nematóides têm sido identificados em várias
espécies de plantas e a maioria está associada com uma típica resposta de
hipersensibilidade nas células da raiz ao redor do nematóide (Nelson et al.,
1990; Bleve-Zacheo et al., 1998; Rodrigues et al., 2000; Ghannam et al., 2005;
Anthony et al., 2005; Pegard et al., 2005).
Como descrito em mais detalhes no capítulo 1, a expressão fenotípica de
resistência nas raízes de A. stenosperma infectadas com M. arenaria foi
caracterizada por uma resposta de hipersensibilidade (HR), (Fig. 12). A HR é
uma ativação local do programa de morte celular (PCD – Programmed Cell
Death) em resposta ao ataque de patógenos (Mittler et al., 1999). Acredita-se
que a HR atue como um mecanismo de defesa que inibe o crescimento de
patógenos dentro dos tecidos vegetais infectados. Por matar as células no sítio
ou ao redor do sítio de infecção, este processo gera uma barreira física
composta por células vegetais mortas e limita a disponibilidade de nutrientes ao
patógeno, por causa da rápida desidratação que acompanha a morte celular
(Dangl et al., 1996; Greenberg, 2004). A morte programada de células que
ocorre durante a HR é acompanhada pelo aumento da produção de espécies ou
intermediários de oxigênio reativos, os ROS ou ROI (Reactive Oxygen Species
ou Reactive Oxygen Intermediates). Estes por sua vez, são formas reduzidas do
oxigênio atmosférico (O
2
) (Mittler, 2002). Ao contrário do oxigênio atmosférico,
ROS são capazes de oxidações irrestritas de vários componentes celulares que
podem resultar na destruição oxidativa da célula (Dat, et al., 2000; Hammond-
Kosack e Jones, 1996). A rápida geração e acumulação de ROS, como
superóxido (O
2
-
) e peróxido de oxigênio (H
2
O
2
), durante os estágios iniciais da
sinalização de defesa das plantas é conhecido como queima oxidativa (Apel e
Hirt, 2004). No entanto, a acumulação de ROS isoladamente não é suficiente
para iniciar resistência a doenças e patógenos (Heath, 2000). Adicionalmente, os
93
ROS agem ainda como agentes de transdução de sinal induzindo outros
mecanismos de defesa como as proteínas PRs (Hammond-Kosack e Jones,
1996) e SAR (Knight e Knight 2001).
Vários trabalhos mostraram que para ocorrer a HR é necessário não
somente a produção como também o acúmulo de ROS (Lamb e Dixon, 1997;
Mittler et al., 1999; Hückelhoven e Kogel, 2003; Melillo et al., 2006). Porém sob
estresse oxidativo, plantas, muitas vezes, respondem ativando também um
complexo sistema enzimático e não enzimático de seqüestradores de ROS, para
poder manter a homeostase de oxi-redução e assim proteger as células contra
os danos oxidativos (Mittler, 2002). Estes seqüestradores de ROS (ROS
scavengers) são responsáveis pela desintoxicação celular (Apel e Hirt, 2004).
Alguns seqüestradores, como ascorbato peroxidase e catalase são suprimidos
durante a HR, um processo que potencializa a indução do programa de morte
celular (PCD) e de outras defesas por permitir o aumento de ROS e diminuir a
capacidade das células de retirar o H
2
O
2
durante a reação (Mittler et al., 1998;
Apel e Hirt, 2004).
As metalotioneínas são também conhecidas por estar envolvidas no
seqüestro de ROS, bem como na homeostase de metais conferindo proteção
contra danos no DNA celular (Thornalley e Vasak, 1985; Kägi et al., 1991;
Hussain et al., 1996; Akashi et al., 2004; Cobbett e Goldsbrough, 2002, Wong et
al., 2004; Melillo et al., 2006; Lü et al., 2007). Trabalhos recentes mostraram que
as MTs do tipo 2, são reprimidas durante o processo de resposta de
hipersensibilidade (Mittler et al, 1999; Wong et al., 2004; Melillo et al., 2006). Nos
ensaios deste trabalho, a quantidade de expressão do gene Asmt2 foi menor que
o apresentado pelas raízes não infectadas e diminuiu ao longo do tempo em
raízes de A. stenosperma infectadas com o nematóide (Fig.8), sendo que essa
diminuição acompanhou a HR observada por volta dos 16 DAI (Fig. 12 e Cap. 1).
De modo semelhante, Wong e colaboradores (2004) mostraram que a OsMT2b
de arroz era expressa em vários tecidos, sendo mais forte em raízes,
inflorescências imaturas e culturas de células. Observaram que em mutantes
lesion mimics a expressão de OsMT2b era reduzida, ou seja, durante a fase de
queima oxidativa em células induzidas ocorria a repressão da expressão do
gene OsMT2b. Para confirmar este resultado, super-expressaram
94
Figura 12 – Reação de hipersensibilidade na raiz de Arachis stenoperma infectada com
Meloidogyne arenaria 16 DAI. N = Nematóide; Ne = Necrose (HR) e Cv = Cilindro vascular.
o gene OsMT2b em plantas transgênicas e observaram que houve um aumento
na susceptibilidade de plantas de arroz ao fungo Magnaporthe grisea e à
bactéria Xanthomonas oryzae.
A resposta de hipersensibilidade em raízes infectadas com nematóides
geralmente ocorre em interações incompatíveis entre uma planta resistente e um
nematóide avirulento. Na interação incompatível entre A. thaliana e o nematóide
de cisto Heterodera glycines foram observados os sintomas de HR e a produção
de H
2
O
2
(Waetzig et al., 1999), e na interação entre tomate e M. incognita foi
também observado a expressão de peroxidases e de superóxido dismutase,
enzimas envolvidas na produção e neutralização de ROS (Zacheo e Bleve-
Zacheo, 1988).
Para avaliar se a oxidação por ROS em raízes de tomate infectadas por
nematóides das galhas, num sistema incompatível, era inibida por
seqüestradores de ROS,
Melillo et al., (2006) trataram raízes infectadas com
95
inibidores específicos para os diferentes tipos de ROS. Como resultado da
inibição de ROS obtiveram a supressão da reação de hipersensibilidade.
Observaram ainda que durante a HR, não somente, altos níveis de concentração
de ROS foram produzidos, mas que a produção de H
2
O
2
(um tipo de ROS) era
mais acentuada, sugerindo um papel direto deste componente como agente
antimicrobiano. Nos resultados aqui apresentados, na resposta da interação
incompatível entre A. stenosperma e M. arenaria, a diminuição da expressão do
gene Asmt2 e a ocorrência de reação de hipersensibilidade nas raízes infectadas
(Figs. 8 e 12) sugerem que esta metalotioneína do tipo 2 em A. stenosperma
atue como um seqüestrador de ROS. Ou seja, sua repressão pode estar
associada à supressão dos mecanismos de desintoxicação de ROS, que por sua
vez é crucial para que ocorra a morte celular (HR), como foi observada nos
estudos histológicos. Num sistema compatível foi observado que também ocorre
a queima oxidativa, no entanto, tem curta duração (menos de 24 horas); está
limitada ao primeiro estágio da infecção; parece estar ligada à supressão da
morte celular ou de outras defesas e resulta na infecção da planta hospedeira
(Melillo et al., 2006). Todavia, no sistema compatível, analisado neste trabalho,
não foi possível observar a expressão de Asmt2 na espécie suscetível A.
hypogaea (Fig. 8). Não observamos expressão nem na condição não inoculada,
o que não era esperado, pois, este gene, de acordo com a literatura tem em
geral, expressão forte em raízes de várias plantas (Guo et al., 2003; Wong et al.,
2004; Melillo et al., 2006; Lü et al., 2007). Luo e colaboradores (2005)
observaram a indução de MT em vagens imaturas de A. hypogaea resistente à
seca e a aflatoxina submetidas ao estresse. Outros trabalhos mostraram
diferentes tipos de MTs, bem como, diferentes padrões de expressão para
respostas de defesa tanto à infecção com nematóides quanto a outras interações
planta-patógeno. Ainda nas interações planta-nematóide, Potenza et al. (2001)
também identificaram uma MT diferencialmente expressa em bibliotecas de
cDNA de raízes de uma espécie suscetível de alfafa, inoculadas e não
inoculadas, com M. incognita. Numa análise temporal da expressão (24-98 h
após a inoculação), observaram que a metalotioneína do tipo 1 era expressa
tanto na espécie suscetível quanto na resistente. A expressão na espécie
suscetível não se alterou após a inoculação, enquanto na espécie resistente
houve um aumento em 72 h e depois uma forte diminuição em 98 h. Neste último
96
ponto esse resultado se assemelha ao observado em A. stenosperma, embora
os sistemas sejam distintos, as MTs de diferentes tipos e não ocorra HR na
interação entre alfafa e nematóide. Um padrão diferente de expressão de MTs foi
observado em outras interações planta-nematóide. Nas interações de soja (MT1)
e arroz com H. glycines e tomate (MT2) com Globodora rostochiensis, foi
observado uma indução na expressão de MTs (Klink et al., 2005; Alkharouf et al.,
2006; Uehara et al., 2007). A indução de MTs também foi observada em outras
interações planta-patógeno ou em outros tipos de estresses, incluindo, MT1 em
folhas de arroz infectadas com M. grisea (Kim et al., 2001); tabaco infectado com
vírus (Choi et al., 1996); MT2 em trigo infectado com Fusarium graminearum
(Golkari et al., 2007); MT2 em tomate infectado com Pseudomonas syringae
(Mysore et al., 2003) e tabaco na resposta ao estresse do tratamento com cobre,
e durante senescência (Thomas et al., 2005).
Como exposto, as MTs estão envolvidas em diversos aspectos da biologia
das plantas incluindo senescência, homeostase de metais e respostas de
defesa. Como interpretação dos resultados deste trabalho, tendo como base os
dados da literatura descritos acima, é possível supor que: (i) AsMT2 funcione
como um seqüestrador de ROS na interação entre a espécie resistente, A.
stenosperma, e o nematóide, M. arenaria; (ii) a diminuição da sua expressão
após inoculação proporcione o acúmulo de elementos ROS, ou seja, que não
sejam retirados da resposta de infecção permitindo assim, o surgimento da
resposta de hipersensibilidade e conseqüentemente a morte celular no sítio de
de alimentação do nematóide.
4.7. AsMT2 e outras proteínas MT2s
A homologia existente entre as proteínas MT2s é devida, principalmente,
aos domínios ricos em cisteína, β-domíno, na extremidade N-terminal e ao α-
domíno no C-terminal (Anexo IV – fig. 3). As identidades das MT2 e AsMT2
variam muito e pode ir de 41% a 73% entre MT2 de arroz e de M. truncatula,
respectivamente. O tamanho da região espaçadora é bem variável entre as
diferentes MT2s, como já descrito na literatura (Cobbett e Goldsbroug, 2002).
Através do programa TargetP foi possível a inferência sobre a localização
97
protéica de AsMT2. Esta proteína foi predita estar localizada no cloroplasto, no
entanto, para as demais MT2s analisadas, nenhuma localização foi determinada.
4.8. Expressão do gene Asrs
A síntese da fitoalexina resveratrol é regulada diretamente através da ação
da enzima resveratrol sintase (RS), que por sua vez é regulada pelo controle
transcricional dos genes rs, isto é, maior expressão do gene rs implica em maior
produção de resveratrol (Chung et al., 2003).
A regulação da expressão do gene rs e conseqüentemente a síntese de
resveratrol foi estudada em sistemas de culturas de células de amendoim e
videira (Fritzemeier et al., 1983; Keen and Ingham, 1976 in Chung et al., 2001;
Commun et al., 2003) bem como in planta (Chung et al., 2001). Foi observado
por Chung e colaboradores que o gene rs não foi expresso em folhas mas em
raízes e vagens de plantas de amendoim saudáveis sob condições de campo e
sem sintomas aparentes de infecção. Já em plantas mantidas sob condições
mais controladas como plantas crescidas em meio de cultura semi-sólido e
estéril, não foi observada tal expressão. Outros trabalhos já demonstraram que a
produção de resveratrol somente ocorre sob condições de estresse, seja por
infecção com microorganismos, irradiação UV, estresse hormonal, ou injúria do
tecido (Hain et al., 1993; Ingham, 1976 e Arora e Strange, 1991 in Chung et al.,
2001). Sendo assim, Chung et al. (2001) acreditam que a expressão observada
em raízes sadias (não infectadas) tenha sido devido ao meio onde as plantas
foram crescidas (campo). No solo existem microorganismos que ali habitam
comumente. Como também observou a expressão em plantas crescidas em
meio de cultura com ágar mais sólido, os autores inferiram que o próprio
crescimento da raiz no solo poderia causar pequenos ferimentos, o que seria
suficiente para induzir a expressão do gene da RS. Neste sentido, é possível que
a baixa expressão observada em raízes não inoculadas de Arachis, apresentada
no presente estudo, também seja conseqüência do atrito das raízes com o solo
durante o crescimento.
Diversos trabalhos mostraram a indução do gene rs como resposta à
infecção por fungos como: B. cinerea (Hain et al., 1993; Adrian et al., 1997),
Phytophtora infestans (Thomzik et al., 1997), Rhizopus stolonifer (Sarig et al.,
98
1997), Plasmopara viticola (Langcake, 1981), Septoria nodorum e Puccinia
recondita (Serazetdinov et al., 2005). A indução também foi observada devida a
estresses abióticos incluindo luz UV e ferimento em folhas e raízes de amendoim
e em resposta aos hormônios AS (ácido salicílico), JA (ácido jasmônico), e
etefon (liberador de etileno), (Chung et al., 2003). No entanto não existem relatos
onde haja a correlação da indução do gene rs em resposta à infecção com
nematóides das galhas. Observamos que nas
raízes inoculadas de A.
stenosperma ocorreu uma leve indução deste gene e uma expressão um pouco
mais acentuada em A. hypogaea (Fig. 9). Porém, caso exista alguma relação
entre a expressão da RS e a resistência a nematóides, esta expressão não foi
suficiente em A. hypogaea para conferir proteção, uma vez que nessa espécie
ocorreu uma infecção típica. Uma possibilidade é que a indução tenha sido
apenas uma resposta aos ferimentos causados pelos nematóides durante a
penetração. Neste sentido, a menor expressão do gene rs observada em A.
stenosperma pode ser devido a menor taxa de penetração dos nematóides
nessa espécie, como observado nos ensaios histopatológicos, resultando em
menos danos às raízes. Em videira, a enzima resveratrol sintase foi expressa em
raízes não inoculadas e inoculadas com Phylloxera, nematóide parasita dessa
planta, que como Meloidogyne é biotrófico obrigatório. Porém não houve
diferenças na sua expressão (Kellow et al., 2004).
O estudo da expressão do gene resveratrol sintase tem sido importante
uma vez que é a enzima responsável pela catálise do resveratrol, que atua não
somente como uma fitoalexina, mas também pelo seu papel na saúde humana.
Já foi mostrado que o resveratrol possui atividades antioxidantes, na prevenção
do câncer e na diminuição da pressão arterial, aliviando problemas
cardiovasculares (Pettit et al., 2000; Leiro et al., 2004, 2005; Campos-Toimil et
al., 2005).
4.9. AsRS e outras enzimas resveratrol sintase
As diferentes proteínas resveratrol sintase têm 313-395 aminoácidos, e com
massa molecular em torno de 43 kDa. A localização subcelular não foi possível
ser predita pelo programa TargetP, no entanto pelo programa WolfPSORT foi
predito para todas as RSs localização no citoplasma, como também inferido para
99
AsRS. A identidade entre RSs da mesma espécie é sempre maior que entre as
espécies, como foi observado pelo alinhamento múltiplo. Todas as RSs têm
grande homologia com a estilbeno sintase, chalcona sintase.
4.10. Expressão dos genes das proteínas hipotéticas Ashp1 e
Ashp2
Considerando que Ashp1 corresponde a priori a um gene mitocondrial e
que o RNA mitocondrial corresponde apenas a uma pequena parcela do RNA
total extraído para o experimento da análise temporal da expressão, a expressão
do gene Ashp1 deve ser alta para ser detectada pelo Northern blot. A
identificação dos genes homólogos das outras espécies se deu através do
seqüenciamento total do genoma mitocondrial de Arabidopsis e de N. tabacum e
não há relatos sobre sua expressão (Unseld et al., 1997; Sugiyama et al., 2005).
Como a função dessas proteínas hipotéticas é desconhecida não é possível
fazer nenhuma inferência para explicar o acúmulo dos mRNAs do gene Ashp1
nas raízes inoculadas com nematóide, apenas podemos ressaltar que é um gene
mitocondrial expresso e que tem expressão diferencial entre raízes infectadas e
não infectadas nos sistemas compatível e incompatível.
Pela comparação das seqüências protéicas observamos que a proteína
predita a partir da seqüência do gene Ashp2 faz parte da família de proteínas
denominada DUF538 (Marchler-Bauer et al., 2005). Esta família é formada por
várias proteínas sem função conhecida. Nas raízes de A. hypogaea, espécie
suscetível foi observado maior acúmulo de mRNA de Ashp2 nas raízes não
inoculadas, ao contrário, nas raízes de A. stenosperma, espécie resistente, este
maior acúmulo foi observado nas raízes quando inoculadas com nematóide.
Uma possibilidade é que este gene possa estar relacionado com a resistência
em A. stenosperma, porém não é possível qualquer inferência adicional mais
embasada.
100
5. CONCLUSÕES
A partir do que foi exposto podemos concluir que a análise in silico e a
validação dos genes diferencialmente expressos pelo tratamento estatístico do
teste de Fisher, foram eficientes no contexto da seleção dos genes com
expressão diferencial nas raízes de A stenosperma durante a infecção com o
nematóide M. arenaria raça 1. A comprovação desta expressão diferencial
através dos experimentos de Northern blot foi possível para a maioria dos genes
analisados, evidenciando que esta estratégia é válida, principalmente se for
considerado a informação qualitativa, ou seja, genes diferencialmente expressos.
Na análise da expressão destes genes nos sistemas compatível (A.
hypogaea x M. arenaria) e incompatível (A. stenosperma x M. arenaria) é
possível inferir que, principalmente, os genes Asarp, Asckx, Asmt2 e Ashp2
estejam envolvidos no processo de resistência de A. stenosperma. A indução ou
repressão destes genes tanto na espécie suscetível quanto na resistente,
juntamente com a expressão fenotípica observada durante todo o processo de
infecção com o nematóide corroboram esta idéia. O esquema a seguir mostra o
resumo geral de como se dá a resistência e suceptibilidade em A. stenosperma e
A. hypogaea a M. arenaria raça 1 (Fig. 13).
101
Figura - 13 Esquemas das possíveis funções dos genes Asarp, Asckx, Asmt2 e Ashp2 nas
raízes de A. stenosperma e A. hypogaea em relação ao processo de infecção com
nematóide.
102
Capítulo 4
Bibliotecas BAC dos genomas ancestrais
diplóides do amendoim cultivado alotetraplóide
Este capítulo contém a tradução do manuscrito em preparação referente aos
resultados da construção das bibliotecas BAC (Anexo V).
103
Bibliotecas BAC dos genomas ancestrais diplóides do amendoim cultivado
alotetraplóide
P. M. Guimarães
1*
, K. Proite
1,2
, O. Garsmeur
3
, A. D’Hont
3
, S. C. M. Leal-
Bertioli
1
, e D. J. Bertioli
4
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.P. 02372, CEP 70.770-900,
Brasília, DF, Brasil;
2
Departamento de Biologia Celular IB-Universidade de
Brasília – (UnB), Campus Universitário, CEP 70.910-900, Brasília, DF, Brasil;
3
CIRAD Centre de Coopération International en Recherche Agronomique pour le
Developpement (CIRAD), UMR 1096, Avenue Agropólis, TA 40/03, 34398
Montpellier Cedex 5, France.
4
Universidade Católica de Brasília, Campus II,
SGAN 916, CEP 70.790-160, Brasília, DF, Brasil;
*E-mail: messenbe@cenargen.embrapa.br
Tel.: +55 61 3448 4787
Fax: +55 61 3340 3624
1. RESUMO
O amendoim cultivado, Arachis hypogaea é um alotetraplóide de origem recente,
com genoma do tipo AABB. Como em vários outros poliplóides parece ter sido
imposto a um gargalo genético na origem da espécie, através da hibridização de
duas espécies silvestres diplóides, seguido da duplicação espontânea dos
cromossomos. Portanto, o estudo do genoma do amendoim é dificultado tanto
pela baixa diversidade genética da cultura quanto pela sua poliploidia. Ao
contrário do amendoim cultivado, a maioria das espécies silvestres de Arachis é
diplóide com alta diversidade genética. O estudo de genomas diplóides de
Arachis é por isso, atrativo, pois simplifica a construção de mapas genético e
físico, e o isolamento de alelos silvestres. Os dois prováveis genomas silvestres
parentais do amendoim cultivado são A. duranensis Krapov. e WC Gregory, e A.
ipaënsis Krapov. e WC Gregory, com genomas do tipo AA e BB
respectivamente. Portanto, foram construídas e caracterizadas duas bibliotecas
de grandes insertos clonados em vetores do tipo BAC - Bacterial Artificial
104
Chromosome, uma para cada espécie. As bibliotecas possuem conteúdo
equivalente a 7,4 e 5,3 genomas respectivamente. Possuem baixa contaminação
com DNA de organelas e um tamanho médio de inserto de 106 kb. As duas
bibliotecas foram, ainda, usadas para o isolamento de clones contendo genes de
cópia única já mapeados geneticamente e genes análogos de resistência.
2. INTRODUÇÃO
O amendoim cultivado (Arachis hypogaea) é a segunda cultura mais
importante dentre as leguminosas em todo mundo ficando atrás somente da
soja. Teve uma produção de 33 milhões de toneladas em 2003/04 (USDA-FAS
2006). O amendoim é produzido em todas as regiões tropicais e subtropicais,
mas é particularmente importante na África, Ásia e nos Estados Unidos
(FAOSTAT, 2003). É uma espécie alotetraplóide (AABB) com uma estreita base
genética (Halward et al., 1991; Young et al., 1996). Esta baixa diversidade
genética resultou na ausência de variabilidade para algumas características
importantes, limitada disponibidade de combinações alélicas e
conseqüentemente restrições na produtividade. Ademais, níveis muito baixos de
polimorfismo no amendoim cultivado têm dificultado a caracterização genética e
genômica. Já as espécies silvestres diplóides, ao contrário do amendoim
cultivado possuem alta diversidade genética e têm sido selecionadas durante a
evolução em diferentes ambientes e estresses bióticos, constituindo uma rica
fonte de diversidade alélica (Nelson et al., 1990).
O amendoim cultivado foi pouco estudado por causa das dificuldades de
se trabalhar com o seu genoma. Apenas alguns poucos mapas de ligação foram
publicados. Todos utilizaram espécies silvestres para que se pudesse permitir a
geração suficiente de marcadores polimórficos. Mapas construídos com
marcadores do tipo RFLP foram desenvolvidos por Halward et al., (1993),
baseados no cruzamento de duas espécies silvestres com genoma AA, A.
stenosperma e A. cardenasii, e um mapa tetraplóide baseado no cruzamento
entre TxAG-6 (um anfidiplóide sintético) e A. hypogaea (Burow et al. 2001).
Recentemente, o nosso grupo desenvolveu um mapa do genoma AA de Arachis
105
com marcadores microssatélites baseado no cruzamento entre as espécies
diplóides silvestres A. stenosperma e A. duranensis (Moretzsohn et al., 2005) e
um mapa do genoma BB, baseado no cruzamento entre as espécies A. ipaënsis
e A. magna (Oliveira et al., 2007 e dados não publicados). Para o amendoim há
ainda relativamente, poucos dados de ESTs (Expressed Sequence Tags)
disponíveis em bancos de dados. Existe apenas 13.525 ESTs para A. hypogaea
no GenBank (Luo et. al., 2005a, b e c), e recentemente foram adicionados 6264
para o genoma AA da espécie silvestre A. stenosperma. (Cap. 2; Martins et al.,
2006; Proite et al., 2007).
Complementando os mapas genéticos e os ESTs, as bibliotecas
baseadas nos vetores do tipo cromossomo artificial de bactéria (Bacterial
Artificial Chromosome – BAC) são ferramentas fundamentais para os estudos
genômicos, sendo importantes para o mapeamento físico, na clonagem
posicional, baseada em mapa e na análise da estrutura e função de genes. A
fácil manipulação e propagação dos clones, sua alta estabilidade, e baixo grau
de quimerismo comparado com os vetores do tipo cromossomo artificial de
levedura (Yeast artificial chromosome- YAC), têm feito das bibliotecas BAC o
sistema de clonagem escolhido (Dvorak et al., 2004; Chalhoub et al., 2004).
Várias estratégias têm sido propostas para o mapeamento físico com clones
contendo grandes insertos, como: métodos baseados em hibridização como a
hibridização interativa usando clones individuais de cDNA ou clones genômicos
como sondas (Mozo et al., 1999), métodos baseados em perfil de restrição
(Hong, 1997), métodos que integram sequenciamento da extremidade de clones
BAC, perfil de restrição e sequenciamento de genoma (Mayer et al., 1999); ou
ainda recentemente foi desenvolvido um método baseado em oligonucleotídeos,
os overgos (Gardiner et al., 2004).
As bibliotecas BAC têm sido construídas para muitas culturas importantes
e estão sendo desenvolvidas também para culturas economicamente menos
importantes, como melão (Luo et al., 2001), beterraba (Gaafar et al., 2005),
pepino (Nam et al., 2005), girassol (Bouzidi et al., 2006) e quinoa (Stevens et al.,
2006). Dentre as leguminosas, bibliotecas BAC estão disponíveis para
Phaseolus vulgaris (Vanhouten e MacKensie, 1999), Vigna radiata (Liu et al.,
2004), Glycine max (Danesh et al., 1998), Trifolium pretense (Sato et al., 2005) e
os legumes modelos Lotus japonicus (Kawasaki e Murakami, 2000) e Medicago
106
truncatula (Meksem et al., 2000). Dentro do gênero Arachis, foi desenvolvida
uma biblioteca BAC para o amendoim cultivado (Yüksel e Paterson, 2005).
Como complemento para este recurso, descrevemos aqui a produção de
bibliotecas BAC de espécies diplóides para os genomas silvestres AA e BB de
Arachis. As duas espécies A. duranensis Krapov. e W.C. Gregory (genoma AA) e
A. ipaënsis Krapov. e W.C. Gregory (genoma BB) foram identificadas como os
prováveis ancestrais do amendoim (Kochert et al., 1996. Seijo et al., 2004), e por
isso foram as espécies escolhidas para a construção das bibliotecas BACs.
Estas bibliotecas permitirão, por exemplo, o isolamento de alelos silvestres que
conferem grande resistência a doenças e pragas, e também facilitará a
construção de um mapa físico. As bibliotecas BAC das espécies silvestres
juntamente com a do amendoim cultivado permitirão excelentes comparações
entre os genomas silvestres e cultivado e, ainda, poderá trazer uma maior
compreensão da evolução dos genomas poliplóides.
107
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Plantas Utilizadas
As sementes foram obtidas da coleção do banco de germoplasma de
Arachis mantido na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia- CENARGEN
(Brasília-DF, Brasil). Plantas de A. duranensis V14167 (genoma AA) e A.
ipaënsis KG30076 (genoma BB) foram crescidas e mantidas em condições
controladas de casa de vegetação. Para a extração do DNA de alto peso
molecular, folhas novas foram coletadas e congeladas em nitrogênio líquido e
mantidas a 80 ºC negativos.
3.2. Isolamento do DNA de alto peso molecular
Os núcleos foram isolados a partir de folhas de acordo com Zhang et al.,
(1995) com algumas modificações: 50 g de folhas novas foram maceradas em
nitrogênio líquido e os núcleos liberados foram incubados em tampão 1X HB (10
µM de Tris-base, 10 µM de EDTA, 1 µM de Espermidina, 1 µM de Espermina,
800 µM de KCl e 500 µM de Sacarose) a 4°C adicionado de 0,2% de PVP 40.
Polivinilpirrolidona foi acrescentada ao tampão de extração para reduzir a
produção de polifenóis oxidados durante a homogeneização das folhas. Foi
também acrescentado 1,5 mL/L de β-mercaptoetanol. Para eliminar o restante
celular, este extrato foliar foi filtrado através de quatro camadas de fralda e duas
camadas de Miracloth (250 µm), (Calbiochem, UK). Uma centrifugação a 850 g
por 8 min. a 4 °C foi seguida por um gradiente de P ercoll (37,5%) para separar
os núcleos da matriz de pectina (Peterson et al., 2000). Os núcleos foram
ressuspensos no tampão de extração 1X HB sem β-mercaptoetanol e sem Triton
100X; centrifugado como anteriormente e o sedimentado foi ressuspenso num
volume final de 1 mL de 1X HB previamente filtrado em filtro de 0,2 µm. A
suspensão de núcleos foi embebida numa matriz gelatinosa de 1,2 % de agarose
de baixo ponto de derretimento. (InCert Agarose, Cambrex-Bioscience,
Rockland, Inc.). Uma alíquota da extração de núcleos foi avaliada em
microscópio utilizando-se coloração DAPI para observar a integridade e pureza
da preparação em relação à contaminação por organelas. Os plugs de agarose
108
contendo o DNA de alto peso molecular foram incubados por 16 h a 50 °C num
tampão de lise (5% Sódio Lauril Sarcosil, 0.625 M EDTA pH 9,1, 50 mg
Proteinase K), lavados por 1 h a 4 °C na solução de inativação (0,5M EDTA, pH
8.0, 0.1 µM PMSF), quatro vezes por 30 min. em TE 10/10 (10 mL/L Tris-HCl pH
8,0, 20 mL/L EDTA pH 8,0), quatro vezes por 30 min em TE 10/1 (10 mL/L Tris-
HCl pH 8,0, 2 mL/L EDTA pH 8,0), e mantidos em TE 10/10 a 4 °C. Uma etapa
extra de purificação do DNA de alto peso molecular foi conduzida entre as duas
etapas de lavagem, a qual consistiu numa eletroforese em gel de campo pulsado
(PFGE) em 1 % GTG SEAKEM agarose em tampão 0,5 X TBE. A eletroforese foi
efetuada com o aparelho CHEF Mapper
TM
XA apparatus (Bio-Rad, U.K.) no
seguinte programa: 6 V/cm, com 3 s de tempo de mudança e um ângulo de 120°
por 40 min a 14 °C, com o objetivo de eliminar impu rezas e fragmentos de
tamanho pequeno.
3.3. Construção das Bibliotecas BAC
Os plugs de agarose contendo o DNA de alto peso molecular foram
cortados em pequenos pedaços e incubados por três vezes em tampão da
enzima de restrição 1X HindIII (Invitrogen, USA), no gelo com agitação. Este
tampão foi trocado a cada 30 min. Sete unidades da enzima de restrição HindIII
foi adicionada a cada plug cortado e incubado por quarto horas no gelo para
permitir difusão da enzima para dentro dos plugs. Para as digestões parciais, as
reações foram incubadas por 15 min. a 37 °C e depoi s para finalizar a reação foi
adicionado 1/10 do volume total de 0,5 M EDTA, pH 8,0 e incubado em gelo por
10 min. O DNA de alto peso molecular parcialmente digerido foi separado e
selecionado por tamanho em géis de 1 % GTG SEAKEM agarose em duas
etapas a 14 °C num tampão 0,5X TBE: primeira seleçã o através do PFGE a 6
V/cm, com tempo de mudança de 1 s a 50 s, ângulo de 120° por 20 h; segunda
seleção através de duas regiões selecionadas – TOP (fragmentos de 150 a 250
kb) e BOTTOM (80-150 kb) do gel da primeira seleção e estes fragmentos
retirados do primeiro gel foram corridos num PFGE com seguinte programa, 6
V/cm, com tempo de mudança de 3 s e um ângulo de 120° por 20 h a 14 °C. Os
fragmentos TOP e BOTTOM correspondendo a fragmentos, em média, de 100
kb foram então cortados do segundo gel e o DNA recuperado através de um
109
eletro-eluidor (BIO-RAD/electro-eluter, UK). A concentração do DNA foi estimada
em gel 1% agarose em 1X TAE e algumas reações de ligação contendo
diferentes razões de vetor/inserto foram testadas. (Vetor/Inserto). Todas as
ligações tiveram volume final de 70 µL e foram utilizados 30 ng de vetor
comercial “pIndigo BAC-5 HindIII-Cloning Ready” (Epicentre, USA). Nos
diferentes testes se variou a quantidade de inserto, que foi de 100 a 900 ng de
DNA de alto peso molecular. Foram utlizadas para transformação, pelo processo
de eletroporação, células competentes de Escherichia.coli (ElectroMAX DH10B)
(Invitrogen, USA), os transformantes foram selecionados em placas de 2YT-X-
gal-IPTG contendo 12.5 µg/mL cloranfenicol. Colônias brancas positivas foram
repicadas utilizando-se o robô Q-bot 2XY (Genetix) e transferidas para placas de
384 poços contendo 80 µL de meio de cultura 2YT-cloranfenicol e 7% glicerol. As
placas foram incubadas por 18-20 h a 37 °C e mantid as a -80 °C.
3.4. Screening das Bibliotecas BACs e Isolamento de DNA
Para se estimar o tamanho dos insertos nos clones BAC, clones
individuais foram randomicamente selecionados, crescidos num pré-inóculo com
100 µL de meio líquido 2YT contendo cloranfenicol (12,5 µg/mL), incubado por
20-22 h a 37 °C. Três mililitros do mesmo meio fora m inoculados com 3 µL do
pré-inóculo e incubado por 20h a 37 °C e 350 rpm O DNA dos clones BAC foram
isolados utilizando-se o robô QIAGEN BIO-ROBOT 9600 (Qiagen GmbH,
Germany). O DNA extraído foi digerido com 10 U da enzima NotI para liberação
dos insertos. Os clones digeridos foram separados em 1 % GTG SEAKEM
agarose pelo PFGE a 14 °C, no tampão 0,5X TBE segui ndo o programa, 6 V/cm,
mudança de tempo de 5 s para 15 s, com ângulo de 120° por 15 h. Filtros de alta
densidade foram montados utilizando-se o robô Q-bot 2XY (Genetix). Cada filtro
de alta densidade continha 18432 clones com uma réplica de cada clone. As
hibridizações foram conduzidas seguindo protocolo BAC de Clemson
(http://www.genome.clemson.edu/protocols). Os filtros foram expostos por 1 dia
em filme Fuji Medical X-Film (Super RX-100 NIF).
3.5. Sondas Genômicas
110
Para se estimar a contaminação com organelas, as duas bibliotecas foram
hibridizadas com sondas do gene de cloroplasto de espinhafre, Rubisco (1,3 kb)
e com o gene mitochondrial de trigo, citocromo oxidase, cox I (1,3 kb),
(Vilarinhos et al., 2003). As bibliotecas BAC foram também hibridizadas com
sondas de genes de cópia única que foram definidas como marcadores-âncora
em leguminosas. (Fredslund et al 2006) e com o gene análogo de resistência
(RGA) de Arachis S1_A_36 (Genbank accession AY157808, Bertioli et al 2003).
Este RGA foi isolado a partir do genoma AA de A. stenosperma e está co-
localizado com um QTL para resistência ao fungo foliar Cercosporidium
personatum (Moretzsohn, 2006 e dados não publicados).
4. RESULTADOS
4.1. Isolamento do DNA de Alto Peso Molecular
Para reduzir os altos níveis de carboidratos e polifenóis presentes nas
folhas, tanto de A. duranensis, quanto de A. ipaënsis, foi realizada uma
moficação no protocolo de isolamento de núcleos onde se incluiu a combinação
do tampão contendo PVP-40, filtração em Miracloth e centrifugação através do
gradiente de Percoll. Foi também incluída uma etapa extra de purificação, onde
os plugs de agarose foram submetidos a uma eletroforese de campo pulsado por
40 min. antes das digestões. Esta eletroforese promoveu a eliminação de
fragmentos menores e de impurezas que não foram retiradas durante a extração,
permitindo assim, uma maior eficiência de clonagem. A análise dos extratos de
núcleos permitu uma correta avaliação da quantidade e da qualidade da
preparação de núcleos.
4.2. Bibliotecas BAC
A dupla seleção por tamanho usada produziu insertos de tamanho
satisfatório que variaram de 100 a 120 kb para as duas bibliotecas, enquanto a
razão 1:4 (vetor:inserto) nas ligações resultou num número maior de
transformantes. A biblioteca BAC para o genoma AA (A. duranensis) contém
111
84096 clones advindos de cinco ligações diferentes, já a biblioteca do genoma
BB (A. ipaënsis) contém 75648 clones originados também a partir de cinco
ligações (Tabela 1). Uma análise foi feita com uma amostragem aleatória de
cada biblioteca através da digestão dos clones com a enzima de restrição NotI e
o tamanho médio dos insertos foi 112 e 100 kb para A. duranensis e A. ipaënsis
respectivamente (Fig.1a e 1b).
A contaminação das bibliotecas BAC com organelas foi avaliada através
do screening dos filtros de alta densidade com sondas específicas para
mitocôndria e cloroplasto. Para A. duranensis, a contaminação dos clones BAC
com cloroplasto foi de 0,363 % e de 0,016 % com mitocôndria. Em A. ipaënsis
ocorreu uma contaminação de 0,081
% com cloroplasto e de 0,21% com DNA
mitocondrial. Estes valores juntamente com as observações da coloração DAPI
da preparação de núcleos refletiram um nível alto de pureza obtido com as
modificações do protocolo de extração de núcleos de Arachis.
Baseado no tamanho médio dos insertos na biblioteca e no genoma
haplóide de A. duranensis equivalente a 1260 Mb (Temsch e Greilhuber, 2001),
a cobertura estimada para a biblioteca do genoma AA é de 7,4 genomas
haplóides. Porém para A. ipaënsis, a determinação do conteúdo de DNA é
controversa. É possível que o equivalente ao genoma haplóide de 2830 Mb
descrito por Singh et al, (1996) esteja duas vezes super-estimado por causa de
inconsistências de mensuração, como já foi descrito para outras espécies de
Arachis (Temsch e Greillhuber, 2000; Temsch e Greillhuber, 2001).
Considerando este aspecto, a biblioteca BAC do genoma BB de A. ipaënsis
representa equivalentes a genomas haplóides que vão de 2,7 a 5,3 para esta
espécie. Para se confirmar experimentalmente a estimativa teórica da cobertura
do genoma nuclear de ambas espécies, os filtros de alta densidade foram
hibridizados com sondas que correspondiam a marcadores-âncora. Estes são
genes de cópia única em leguminosas que já foram localizados no mapa
genético do genoma AA de Arachis (dados não publicados). Uma média de 5,6
clones por sonda foi identificada para o genoma AA e 4,5 clones para o genoma
BB (Tabela 2). A hibridização das duas bibliotecas com o RGA de Arachis,
S1_A_36, permitiu a identificação deste clone no genoma AA, mas de nenhum
no genoma BB (Fig. 2).
112
113
5. DISCUSSÃO
O amendoim cultivado é um alotetraplóide com componentes genômicos
AA e BB. Apesar de haver uma concordância de que estes genomas sejam
derivados de ancestrais diplóides, as exatas espécies envolvidas têm sido objeto
de estudo. Esta questão ainda não está completamente esclarecida, mas a
análise de dados de marcadores moleculares, citogenética, morfologia e
distribuição geográfica suportam que A. duranensis e A. ipaënsis sejam os
ancestrais diretos do amendoim cultivado (Kochert et al. 1996, Seijo et al., 2004).
O estudo das espécies diplóides parentes é portanto atrativo de várias
maneiras: evita as complexidades do genoma tetraplóide, proporciona um
caminho para o isolamento de alelos silvestres que conferem, por exemplo,
resistência a doenças e poderá facilitar o estudo de elementos repetitivos
distintos, bem como a evolução dos genomas AA e BB. Neste trabalho, duas
bibliotecas BAC foram construídas representando os dois mais prováveis
ancestrais do amendoim cultivado, A. duranensis e A. ipaënsis. Acrescentando
ao fato de serem os ancestrais, estas espécies possuem resistências a doenças
fúngicas (Subrahmanyam et al., 1983). O representante do genoma AA, A.
duranensis, é a mesma espécie parental da população que foi utilizada para a
construção de um mapa genético baseado em marcadores microssatélites.
(Moretzsohn et al., 2005) e, A. ipaënsis é o parental da população utilizada para
mapear o genoma BB (Oliveira et al., 2007). Este estudo irá facilitar o
desenvolvimento de um mapa físico baseado em marcadores e da integração
dos mapas genético e físico.
Algumas etapas foram adicionadas ao protocolo padrão de extração de
núcleos a fim de se obter um DNA de alto peso molecular sem contaminação de
polifenóis e carboidratos, os quais são abundantes em folhas de Arachis. Entre
elas, as mais relevantes foram: a adição de PVP-40 ao tampão de extração de
núcleos, a centrifugação do extrato foliar através do gradiente de Percoll
(37.5%), a remoção das impurezas e dos fragmentos de pequeno tamanho dos
plugs de agarose através do PFGE e a extensão do tempo de incubação dos
plugs com o tampão da enzima anteriormente a digestão. O screening com
sondas específicas para cloroplasto e mitocôndrias mostraram que a
contaminação com DNA organelar foi baixa comparada com outras bibliotecas
114
BAC construídas também a partir de folhas (Ming et al., 2001; Akhunov et al.,
2005; Nam et al., 2005).
A cobertura da biblioteca do genoma AA foi teoricamente equivalente a
7,4 genomas haplóides. A fim de testar ainda mais esta cobertura foram
utilizados marcadores-âncora, que consistem em seqüências gênicas que
definem um locus único nos mapas de ligação de várias espécies dentre as
leguminosas (Fredslund et al., 2006). As sondas utilizadas foram amplificadas
por PCR a partir do DNA de Arachis e foram mapeadas em diferentes grupos de
ligação no mapa genético do genoma AA (dado não publicado). O número de
clones identificados por quarto marcadores-âncoras usados na biblioteca AA foi
5,6; que de alguma forma é menor que o esperado pelo cálculo teórico da
cobertura do genoma. De acordo com Zhang e Wu (2001) em alguns casos a
cobertura real das bibliotecas BAC de grandes insertos é menor que a calculada,
isto é devido particularmente à densidade alta ou baixa dos sítios de restrição da
enzima utilizada em certas regiões do genoma ou ainda, devido a dificuldades na
clonagem de inserto muito grandes ou muito pequenos. Por outro lado, é
amplamente aceito que 99 % de cobertura já é alcançada com 4,7 vezes, o
genoma haplóide (Zhang et al., 1995). Portanto, o genoma de A. duranensis está
bem representado e a sua biblioteca será bastante apropriada para diversas
aplicações. A cobertura do genoma BB é mais difícil de se estimar. De acordo
com Singh et al. (1996), os valores médios 2C de DNA (tamanho do genoma)
para A. ipaënsis é de 5,6 pg (densitometria de Feulgen) onde C representa a
constância da quantidade de DNA de um genoma haplóide não replicado (Swift,
1950). O mesmo estudo indicou que os valores 2C para A. duranensis, A.
hypogaea e A. monticola variaram de 1,7 até 2,0 vezes maior que os dados
obtidos por citometria de fluxo (Temsch e Greillhuber, 2001). Como o novo dado
para A. ipaënsis através de citometria de fluxo não está disponível, foi
considerado o valor C para as espécies entre 2,8 a 5,3 pg, e por isso, a
biblioteca BAC teve cobertura a equivalentes de 2,8 a 5,3 do genoma haplóide.
O número de clones na biblioteca BAC do genoma BB que foram identificados
com marcadores-âncora foi de 4,5 clones, e este resultado parece suporta que
houve uma cobertura maior que a estimada Como os marcadores-âncora são
cópia única, os BACs identificados permitirão comparações com regiões
115
ortólogas dos diferentes genomas AA e BB de Arachis e de outros genomas
como os das leguminosas e Lotus e Medicago.
A biblioteca de A. duranensis hibridizou com o RGA, S1_A_36, um RGA
que co-segrega com um QTL para resistência a C. personatum (Moretzsohn,
2006 e dados não publicados). Esta simples comparação pôde indicar a
presença de alelos genoma-específicos, contudo mais experimentação se faz
necessária para confirmar esta inferência. O sequenciamento dos clones BAC
contendo o RGA pode possibilitar a identificação de microssatélites ligados ao
RGA de interesse, e promover assim mais marcadores para trilhar o QTL nas
populações segregantes.
Em resumo, descrevemos aqui a produção de bibliotecas BAC para os
genomas AA e BB de Arachis. Estas bibliotecas serão uma excelente fonte para
o isolamento de genes, construção e correlação dos mapas físico e genético,
isolamento de sondas para análise de citogenética, o estudo da evolução dos
dois tipos de genoma e pela comparação com o genoma tetraplóide, para o
estudo da evolução de genomas poliplóides.
Tabela 1: Características das bibliotecas BAC de A. duranensis e A. ipaënsis derivadas de
colônias aleatoriamente escolhidas.
Espécie
Número
de
Ligações
Tamanho
do
Genoma
(Mb)
Número
de
Clones
Tamanho
médio de
inserto(kb)
DNA
Mitocondrial(%)
DNA de
Cloroplasto(%)
Cobertura
Estimada
do
Genoma
A. duranensis
5
1260
a
84096
112
0,21
0,016
7.4x
A. ipaënsis
5
1415-
2830
b
75648
100
0,081
0,363
5.3-2.8
b
x
a
Temsch e Greilhuber, 2001
b
Singh et al, 1996
116
Tabela 2: Clones utilizados para hibridização de DNA com os filtros de alta densidade das
bibliotecas BAC e número de clones positivos.
Sondas
Número de clones que hibridizaram com as bibliotecas
BAC
A. duranensis
A. ipaënsis
RGA S1_A_36
1
0
Leg083
2
5
Leg128
4
4
Leg092, Leg149, Leg178
(combinação)
19
Não testado
117
a
b
Figura 1 - Gel de eletroforese de campo pulsado de clones selecionados randomicamente das
bibliotecas BAC de A. duranensis (a) e A. ipaënsis (b). Os insertos foram liberados do vetor
pIndigo BAC-5 HindIII após digestão com a enzima Not I. O marcador utilizado foi o Lambda
Ladder PFG Marker (New England Biolabs) e os tamanhos são dados em kb.
150
50
Vetor
150
50
Vetor
kb
kb
118
Distribution of BAC Clone Insert Sizes
0
5
10
15
20
25
30
35
<50 50-74 100-124 125-149 150-174 >175
Insert size (kb)
% of clones
A. duranensis
A. ipäensis
Figura.2 – Distribuição do tamanho de insertos a partir dos clones BAC selecionados
randomicamente.das bibliotecas BAC de A. duranensis e A. ipaënsis. Os insertos foram liberados
após digestão com NotI.
119
PERSPECTIVAS
O presente estudo permitiu a identificação de (i) uma espécie silvestre de
Arachis resistente ao nematóide das galhas, (ii) seu mecanismo de resistência,
bem como, (iii) a identificação de genes envolvidos na resistência. Desenvolveu,
ainda, bibliotecas BAC que são importantes ferramentas genômicas.
Temos como perspectivas deste trabalho:
→ A fenotipagem para identificação da resistência ao nematóide nas populações
de Arachis silvestres (F3);
→ A utilização dos ESTs para o estudo da expressão de genes em outros
tratamentos através de experimentos de macro-arranjos;
→ O isolamento de genes: RGAs, ESTs, retro-elementos através dos clones
BAC;
→ Estudar os genes diferencialmente expressos através de outras abordagens:
- Real time-PCR, macro-arranjos com outros tratamentos;
- Verificar se estes genes expressam suas proteínas;
- Testar se realmente estão envolvidos na resistência onde pode-se
utilizar experimentos como: RNA interferente, transformação de plantas
susceptíveis, (se o gene estiver isolado);
→ Seqüenciamento das extremidades dos clones BAC permitirá:
- Desenvolvimento de marcadores para saturação do mapa genético;
- Comparações entre os genomas AA e BB de Arachis (Marcadores-
âncora)
→ O sequenciamento completo de clones BAC que permitirá identificação de
micro-estruturas conservadas entre Arachis e outras leguminosas.
→ Produção de um mapa Físico – BAC-FISH.
120
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158
ANEXO I
(Artigo em preparação)
159
Post-Infection Development and Histopathology of Meloidogyne
arenaria race 1 on Arachis spp.
Karina Proite
1,2§
, Regina M.D.G. Carneiro
2
, Rosana Falcão
2
, Ana Cristina M.
Gomes
2
, Soraya C.M. Leal-Bertioli
2
, Patrícia M. Guimarães
2
, David J.
Bertioli
3
§ Corresponding author
1
Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília, Campus I, Brasília,
DF, Brazil.
2
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, Final
W5 Norte, CP 02372, Brasília-DF, Brazil.
3
Universidade Católica de Brasília, Pós-graduação, Campus II, SGAN 916,
Brasília, DF, Brazil.
E-mail addresses:
RMDGC: recar@cenargen.embrapa.br
RF: falcao@ cenargen.embrapa.br
ACMG: [email protected]a.br
SCML: [email protected]r
PMG: [email protected]rapa.br
DJB: [email protected]
160
Abstract
The reproductive behaviour of the root-knot nematode Meloidogyne
arenaria race 1 was compared on two wild species of Arachis (A. duranensis and
A. stenosperma) and cultivated peanut (A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST). The three
species were considered moderately susceptible, resistant, and susceptible
respectively. Penetration and development of the root-knot nematode in the
resistant species was reduced in comparison with susceptible plants. Several cell
features, including dark-blue cytoplasm and altered organelle structure were
observed in the central cylinder of A. stenosperma, indicating a hypersensitive
response (HR) of the infested host cells. Neither giant cells, nor nematodes
developed beyond the second-stage were found on A. stenosperma. A.
duranensis showed a delay in the development of nematodes in the roots
compared to A. hypogaea. The two wild peanut species were chosen to be the
contrasting parents of a segregating population for mapping and further
investigation of resistance genes.
Keywords: Arachis spp., Meloidogyne arenaria, hypersensitive response,
resistance.
Introduction
Root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) are sedentary endoparasites
that have very complex biotrophic relationships with their host plants. Second-
stage juveniles (J2) invade roots in the zone of elongation and then migrate
intercellularly and establish a feeding site in the zone of differentiation of the
vascular cylinder (Wyss et al., 1992; Williamson and Hussey, 1996). Meloidogyne
arenaria race 1 (Neal) Chitwood (Koenning and Barker, 1992; McSorley et al.,
1992); M. hapla Chitwood (Culbreath et al., 1992; Schmitt et al., 1998); M.
javanica (Treub) Chitwood (Tomaszewski et al., 1994) and M. haplanaria
(Eisenback et al., 2003) are the four described Meloidogyne species that
parasitise cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). The most damaging
161
nematode species for peanut in the United States is M. arenaria race 1. Losses
to this nematode can exceed 50 % in severely infested fields (McSorley et al.,
1992).
Control of root-knot nematodes is difficult, soil nematicides are costly, not
always effective and they are detrimental to the environment and human health
(Bird and Kaloshian, 2003). Because of this, plant resistance is currently
considered as the method of choice for controlling root-knot nematodes.
Resistance to M. arenaria race 1, M. javanica and M. hapla has been observed in
many wild species of peanut (Banks, 1969; Nelson et al., 1989; Holbrook and
Noe, 1990; Sharma et al., 1999). The most damaging of these four species is the
peanut root-knot nematode M. arenaria race 1. Resistance against this nematode
has been characterized for two wild species, A. cardenasii and A. batizocoi. The
first one, completely inhibits nematode development and resistance was
accompanied by a hypersensitive host reaction (Nelson et al., 1990). The second
one, caused a reduction in the total number of invading nematodes that reached
maturity and produced eggs, and increased the time required for M. arenaria to
complete its life cycle. No hypersensitive reaction associated with this resistance
was observed (Nelson et al., 1990). Both species were used to generate resistant
A. hypogaea cultivars COAN and NemaTAM by a backcross introgression
pathway (Simpson, 1991) involving a complex interspecific amphiploid hybrid
(Simpson et al., 2001; Simpson et al., 2003).
In order to identify and characterize new sources of resistance, and to
identify contrasting parents that would be suitable for the construction of a
population and genetic mapping, an initial screening of a number of wild Arachis
spp. resistant to M. arenaria race 1 was done using plants of the Arachis
Germoplasm Bank of EMBRAPA, Brazil. A. stenosperma accession V10309 and
A. duranensis accession K7988 were found to be resistant and susceptible
parents, respectively. The objectives of the present work were: i) to confirm the
resistance or susceptibility of A. stenosperma accession V10309 and A.
duranensis accession K7988, using A. hypogaea as a control for susceptibility; ii)
to examine the interaction of M. arenaria race 1 with A. stenosperma, A.
duranensis and A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST, to determine when and how
resistance is expressed; iii) understand resistance mechanisms to M. arenaria
162
race 1 comparing histological responses of the resistant and susceptible Arachis
spp.
Materials and Methods
Nematode and Inoculum preparation
All experiments were conducted at the Quarantine of EMBRAPA Genetic
Resources and Biotechnology and with M. arenaria race 1 isolate from peanut,
kindly provided by Dr. D. W. Dickson (University of Florida, Gainesville, USA). To
confirm the identification, an electrophoresis was conducted (Carneiro and
Almeida, 2001) and the esterase phenotype A2 was confirmed. Nematodes were
multiplied alternately on peanut (Arachis hypogaea cv. IAC-Tatu-ST) and tomato
(Solanum esculentum cv. Santa Cruz). Eggs were extracted from infected roots
using 0,5% NaOCl (Hussey and Barker, 1973). Second-stage juveniles (J2) were
collected from the roots and eggs suspension, using modified Baermann funnels.
Eggs or freshly hatched J2 were collected by centrifugation and counted using
Peter’s slides under a light microscope (Vrain, 1977).
Nematode reproductive behaviour
Two wild species of Arachis (A. stenosperma accession V10309 and A.
duranensis accession K7988) were evaluated under greenhouse conditions (25 -
30 °C) for resistance to Meloidogyne arenaria race 1. The susceptible
commercial A. hypogaea variety Tatu was used as control. Plants were grown
from seed in plastic pots (3000 cm
3
volume) containing a moist, steam-sterilized
soil (85 % sand, 10 % of silt and 5% of clay). When plants were four weeks-old,
they were inoculated with 10,000 eggs/plant (Pi=initial inoculum level), extracted
from infected tomatoes, using 0.5 % of NaOCl solution following Hussey and
Barker’s method (1973), but using a mixer instead of manual agitation. Nematode
eggs were introduced into 3-cm-deep holes around the collar region of the plant.
163
The pots were arranged in a complete randomised block design with 8
replications. Seventy five days after plant inoculation (DAI), the different
treatments were evaluated by extracting eggs and J2 from the entire root system,
using 1% of NaOCl. The final population density (Pf) was quantified using a
Peters slide under the microscope and the nematode reproductive factor (RF=
Pf/Pi) was calculated
(Oostenbrink, 1966). Averages of reproduction factors were
compared by the Tukey test with significant difference at the 5% probability level.
We considered treatments with RF < 1.00 as resistant to Meloidogyne spp.
Histopathological studies
Fifteen seedlings with two replicates of each Arachis species were
transplanted to 200 cm
3
plastic cups containing a sterilized mixture of 2 parts of
peat and 1 part of fine sand. Two week old plants with six to eight expanded
leaves were inoculated with 5,000 J2/plant. Distilled water without nematodes
was added in control plants. Roots were removed from the cups and carefully
washed at the following sampling times: 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 32,
48 and 63 days after inoculation (DAI). Several root tips (1-3 cm segments) were
analysed using stereomicroscopy and light microscopy (Axiophoto, Zeiss) using
the technique for clearing (NaOCl) and staining (acid fucsin) plant tissues
described by Byrds et al. (1983). This technique was used to facilitate localisation
of the infection sites. For fine cuttings, root-tips with swellings were excised and
fixed in 2% glutaraldehyde in 0,1 M sodium cacodylate buffer pH 7,0 at 4 °C for
48 hours. They were rinsed three times for ten minutes in 0,1 M sodium
cacodylate buffer pH 7,0, post-fixed in 2% osmium tetroxide in 0,1 M sodium
cacodylate buffer pH 7,0 for two hours and rinsed again in the same buffer three
times for five minutes each. After dehydration in a graded series of ethanol (20%
to 100%) followed by two additional steps in absolute ethanol, samples were
infiltrated with increasing volumes of Spurr’s resin in a constant volume of 100%
ethanol for 4-6 h (1V:3V; 2V:3V; 3V:3V; 4V:3V) and polymerized at 70 °C for 24
h. Embedded tissues were cut into 0.5-1.4-µm-thick sections with an
ultramicrotome and the sections were placed on glass slides, stained with
164
toluidine blue (1% (w/v) in borax, pH 8.9). The sections were examined with the
light microscope (Axiophoto, Zeiss).
Results
Reproduction of Meloidogyne arenaria race 1 on Arachis spp.
The reproductive behaviour (RF) of M. arenaria race 1 after 120 DAI
(Table 1) in three species of Arachis showed that the control A. hypogaea cv.
IAC-Tatu-ST was considered susceptible (RF=16.4), A. duranensis, (K7988)
moderately susceptible (RF= 3.5) and A. stenosperma (V10309) highly resistant
or immune (RF=0). These results fit well with the objective to find among the wild
species contrasting in their response to challenge with nematodes.
Histological observations of infected susceptible A. hypogaea cv. IAC-Tatu-
ST and A. duranensis K7988
At 3-8 DAI macroscopic observation of cleared root stained with acid
fuchsin revealed that many J2s had successfully penetrated roots through the
apical region in both species. Many J2s entered into the roots and migrated in
groups through the cortex (Fig 1a and 1b). Penetration features were still
observed until 11 days. At 9 DAI swollen J2/J3 were observed in the vascular
cylinder initiating the establishment of the feeding site. At 11-13 DAI, infected
roots began to enlarge in both peanut species and we could observe J3 in A.
duranensis with slightly swollen roots (Fig 1c) and J3-J4 in A. hypogaea roots
forming large galls at the nematode infection sites (Fig 1d). At 15-19 DAI,
macroscopic observation showed that in both species feeding sites had already
been established. At 32 and 48 DAI females with egg-masses were observed in
A. hypogaea, while at 63 DAI, in A. duranensis’ roots, we still observed a globose
female (Figs 1e and 1f). The development of M. arenaria race 1 in A. hypogaea
roots was faster than in A duranensis.
165
Microscopic analysis showed clearly the delay in nematode development
in the moderately susceptible wild species, A. duranensis, compared to the
susceptible cultivated peanut. In both species, nematodes were localised close to
vessels indicated that the formation of galls was initiated in weakly differentiated
parenchyma cells. A. hypogaea host cells in front of the nematode head began to
increase in size at 8 DAI (Fig 2a), predicting their final step of differentiation to
giant cells. The giant cells formed feeding sites with a regular oval shape, each
one containing one large vacuole, several small vacuoles and some small nuclei
(three to nine per giant cell) at 16 DAI (Fig 2b) and at 19 DAI (Fig 2c). However, it
was only at 16 DAI, that we could observe nematodes beginning to induce the
formation of giant cells in A. duranensis. At 16 DAI the cell wall was beginning to
undergo a thickening process and to form ingrowths (Fig 2d). At 19 DAI we could
observe induced giant cells with many vacuoles (Fig 2e) and at 32 DAI well
developed giant cells. These giant cells in A. duranensis also presented an oval
shape and multiple nuclei (Fig 2f). Nematodes induced more giant cells, eight to
ten each, in A. duranensis and four to six each in A. hypogaea.
Histopathological observations of resistant wild peanut, A. stenosperma
V10309 challenged roots
At 3-9 DAI macroscopic observation revealed a much reduced number of
J2 in the sub-apical region (Fig 1g) compared with the distribution of nematodes
in infected susceptible roots. Nematodes were observed at the root suRFace with
their heads located in the first cell layers, indicating that penetration was in
progress until 17 and 19 DAI (Figs 1h and 1i). Close to the head region of
nematodes localised inside the vascular cylinder of the roots, host cells stained
with acid fuchsin showed a dark yellow-brown stained color, indicating that when
J2 nematodes (colored in pink) tried to induce a feeding site, a hypersensitive
reaction (HR) occurred (Fig 1h). The J2s at these sites of necrosis were brown,
indicating that they had died, it is possible that the whole region around the
nematode was oxidizing (Fig 1i). Macroscopic examination at 8 -19 DAI,
demonstrated that J2s took about this time to penetrate and migrate from the root
tip through cortex into developing vascular cylinder. The HR never occurred in
166
the cortex region in the beginning of invasion. Every J2 found in the vascular
cylinder were associated with a hypersensitive reaction.
Microscopic analysis at 8 DAI showed J2 in the vascular cylinder. Close to the
anterior portion of nematode, host cells showed a dark-blue-stained and collapsed
cytoplasm in which nuclei were not visible (Fig 2g). Most of the nematodes observed
also displayed a disorganized cellular content showing accumulation of dark-blue
stained material (data not shown). Observations by thin sections showed J2s in the
epidermis, cortex and vascular region and embedded tissue stained with toluidine blue
showed dark blue coloration at the necrosis sites (Fig 2h). No swollen nematodes or
feeding sites were established in infected roots and consequently no giant cell was
induced at any time sample analysed. We neither observed hypertrophy of the tissue
or hyperplasia of the cells. The hypersensitive reaction occurred around the cells of
the nematode head in the vascular cylinder and never in cortex or epidermis, even
through its pathway to vessels (Fig 2i). We did not find any nematode beyond 19 DAI
although the root system analysed at 32-63 DAI showed some degraded and necrotic
roots.
Discussion
Here we present a time course histological study of the development of the
infective cycle of M. arenaria race 1 on roots of two wild species of peanut, A.
stenosperma and A. duranensis and the cultivated peanut, A. hypogaea cv. IAC-
Tatu-ST. Firstly this work aimed to confirm contrasting genotypes between two
wild Arachis species (A. stenosperma and A. duranensis) with regard to M.
arenaria race 1 resistance and to compare them with the commercial A.
hypogaea cv. IAC-Tatu-ST. Secondly we compared the root-knot nematode
penetration and subsequent development in these peanut species.
A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST is one of the most traditional cultivated
peanut varieties in Brazil and it was chosen as a susceptible control for M.
arenaria race 1. Considering the reproduction factor (RF), this data showed that
the Brazilian commercial peanut (RF=16.4) presented similar RF to the American
167
commercial variety Florunner (RF=15.496), one of most cultivated peanuts in the
U.S.A. (Holbrook et al., 2000).
Although A. duranensis K7988 had inferior reproduction factor (RF=3.5)
than A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST, it was considered susceptible: according to
the Oostenbrink or Hussey and Janssen (2002) concepts: only plants with RF<1
or <10% of the replication in the susceptible genotype, respectively, are
considered to be resistant. We demonstrated that A. stenosperma V10309 has
high level of resistance (immunity) showing no nematode reproduction (RF=0)
(Table1).
Second stage juveniles of M. arenaria race 1 penetrated roots of the
susceptible wild species A. duranensis, established the feeding sites and induced
giant cells in the same way as the cultivated species. Nevertheless, there were
some differences: (i) 32 DAI for a complete life cycle in A. hypogaea, and over 63
DAI in A. duranensis; (ii) galls were small in A. duranensis and large in A.
hypogaea and (iii) giant cells were larger in A. duranensis (8-10).
Our data suggested that A. stenosperma has at least two kinds of
resistance to M. arenaria race 1. One kind of resistance suppressed nematode
penetration by J2 and the other kind blocked development after penetration. Plant
resistance can occur at several levels. Failure of J2 to penetrate the resistant A.
stenosperma may indicate physical or chemical root barriers. Such barriers were
suggested previously for resistant grape rootstock (Anward and McKerry, 2000;
Ferris et al., 1982), cotton (Anward et al, 1994), soybean (Dropkin and Nelson,
1960), pepper (Pegard et al., 2005) and coffee cultivars (Anthony et al., 2005). It
also may indicate that the roots did not attract or perhaps even repelled the J2s,
or that J2s penetrated and then left the roots. Such protection has been shown
for Curcumis sativus where a triterpene, curcubitacin that repelled Meloidogyne
J2 was isolated from root exudates (Hayene and Jones, 1976). Similarly, amino
acids exuded from Sesamun indicum roots have a nematostatic effect on
Meloidogyne J2 (Tanda et al., 1989).
Some authors reported no differences in nematode penetration, between
susceptible and resistant roots, for instance of two wild Arachis, A. cardenasii and
A. batizocoi, both resistant to M. arenaria (Nelson et al., 1990). This was also
observed in soybean, Glycine max (Herman et al., 1991) and on common bean,
Phaseolus vulgaris, (Sydenham et al., 1996),
168
Moreover, in the resistant species A. stenosperma, the J2s that did
penetrate remained vermiform and clustered in vascular cylinder cells. No
development, no galling and no egg masses were observed. This suggested that
this wild peanut also has a very active post–penetration biochemical defense
mechanism which blocked nematode development and reproduction. The post-
penetration response of the incompatible A. stenosperma roots was considered a
classical HR. This HR occurred after 8-19 DAI. There are many reports in other
plants that show HR is responsible for resistance to nematodes, for instance in
tomato (Dropkin, 1969), tobacco (Ghannam et al., 2005), coffee (Rodrigues et al.,
2000, Anthony et al., 2005), and pepper (Bleve-Zacheo et al., 1998, Pegard et
al., 2005). The time that HR occurs differs between plants, for some it occurs
hours after penetration, and others only after days. Researchers have proposed
that early HR occurring in the outer tissues of the root (i.e., the epidermis and
root cortex) and immediately after penetration 12h-48h, would be relatively easily
overcome by newly virulent nematodes (Bleve-Zacheo et al., 1998, Castagnone-
Sereno et al., 2001). Instead, if the HR occurs later and deeper in the root (i.e.
close to or within the vascular cylinder) this would irreversibly block any further
nematode development, thus making selection of new virulent genotypes less
likely. The hypersensitive response was also the mechanism of nematode
resistance for the wild A. cardenasii (Nelson et al., 1990), and similarly to A.
stenosperma, its reaction was a late HR, occurring after 7 days post inoculation..
In order to enable the mapping of the genes responsible for nematode
resistance, A. stenosperma and A. duranensis were used as resistant and
susceptible parentals to produce a segregating F2/F3 population. This population
was used to make the first microsatellite-based genetic map in Arachis
(Moretzsohn et al., 2005). Bioassays in F3 will allow the mapping of the
resistance genes, although these bioassays have not yet been done because of
the difficulties doing a large bioassay in quarantine conditions. In a parallel
approach to identify genes that are responsive to nematode challenge ESTs have
been generated from inoculated and control roots of A. stenosperma (Proite et
al., 2007). An analysis of the genes expressed in control and inoculated roots will
be published elsewhere.
169
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173
Table 1- Reproduction of M. arenaria race 1 on Arachis spp. accessions in a greenhouse test.
Arachis spp. Fresh Root
weight/g
Nematodes/g fresh
root weight
Reproduction Factor
a
A. stenosperma (V10309)
8.7 0 0 c (R)
A. duranensis (K7988)
17.0 1781
3.5 b (MS)
A. hypogaea cv. IAC-Tatu-
ST
11.7 13811
16.4 a (S)
a
numbers with different lower-case differ from one another by Tukey test at the level of 5 %. S = susceptible, MS =
moderately susceptible, R = resistant.
174
Figure 1- Acid fucsin preparations of the development of Meloidogyne. arenaria on infected roots
of cultivated peanut A. hypogaea cv. IAC-Tatu-ST, (b = 6 DAI; d = 11 DAI; e = 32 DAI), wild
peanut A. duranensis acession K7988, (a = 8 DAI; c = 11 DAI; f = 63 DAI), and wild peanut A.
stenosperma acession V10309, (g = 8 DAI; h = 17 DAÍ – Ne = Necrosis; i = 19 DAI- N -
Nematode).
175
Figure 2- Longitudinal sections of infected roots of Arachis hypogaea, A. duranensis and A.
stenosperma with Meloidogyne arenaria race 1. Sections were stained with toluidine blue and
show the different timing through nematode infection process in the susceptible species A.
hypogaea - a- 8 DAI, b- 16 DAI, (arrows show vacuoles and nucleoles) and c- 19 DAI -; A.
duranensis -d- 16 DAI, (arrow shows thickening of the cell wall), e- 19 DAI and f- 32 DAI), A.
stenosperma - g- 8 DAI, h- 16 DAI and i- 19 DAI- (N= Nematode and Ne = Necrosis – HR).
176
ANEXO II
Artigo publicado na revista Nucleic Acids Reserch:
Martins, W.; Sousa, D.; Proite, K.; Guimarães, P.M.; Moretzsohn, M.; Bertioli, D.
New softwares for automated microsatellite marker development. Nucleic Acids
Research, v.34, e31, 2006.
doi:10.1093/nar/gnj030
177
ANEXO III
Artigo publicado na revista BMC Plant Biology:
Proite, K.; Leal-Bertioli, S.C.; Bertioli, D.J.; Moretzsohn, M.C.; da Silva, F.R.;
Martins, N.F. and Guimarães, P.M. ESTs from a wild Arachis species for gene
discovery and marker development. BMC Plant Biology 2007 Feb 15; 7:7.
doi:10.1186/1471-2229-7-7
Este artigo está disponível no endereço eletrônico:
http://www.biomedcentral.com/1471-2229/7/7
178
ANEXO IV
Alinhamentos
179
180
181
Figura 1- Alinhamento múltiplo de AsARP e outras proteínas da família ARP/DRM identificadas
anteriormente. O alinhamento das seqüências e os resíduos conservados foram realizados utilzando-
se os programas CLUSTAL W. e BOXSHADE Os resíduos idênticos estão na caixa preta. As
proteínas da família ARP/DRM usadas neste alinhamento e seu número no GenBank são: AsARP, A.
stenosperma (este estudo, EH046598); AhARP, A. hypogaea (39877909); PaARP, P. acutifolius
(CX129764); PvARP, P. vulgaris (42575416); RpARP, R.pseudoacacia (AY009094, Park e Han,
2003); GmARP2, Glycine max (BU547869); PsDRM1, P.sativum (AF029242; Stafstrom et al., 1998);
SaARP, Saccharum officinarum (CA127125, Rocha et al., 2007); EoARP, Elaeis oleifera (45325591);
PtARP, Populus trichocarpa x Populus deltóides (CA823076, Kohler et al., 2003); SAR5, Fragaria
ananassa (FRRARP, Reddy e Poovaiah, 1990); GhARP, Gossypium hirsutum (CD485647);
CofaARP, Coffea arabica (AM232164, De Nardi et al., 2006); SlARP, Solanum lycopersicon
(DQ672601); SvARP, Solanum virginianum (AY572222); CaARP2, Capsicum annuum (AAR83888);
EuARP, Elaeagnus umbellata, (AF091513, Kim et al., 2007); BoARP, Brassica oleracea (AF458410);
BrARP, Brassica rapa (AY185352, Lee et al., 2003); AtARP4, Arabidopsis thaliana (NM_128942);
AtARP5, Arabidopsis thaliana (DQ447038); AtARP1, Arabidopsis thaliana DRM1 (NM_179389);
CiaARP, Cicer arietinum (36380786); PsDRM3, P.sativum (AF515795); LsARP, Lathyrus sativus
(36302027, Skiba et al., 2005); GmARP1, G. max (BE609714); PsDRM4, P. sativum (AF515796);
ParARP, Prunus armeniaca (U93273); AtARP5, Arabidopsis thaliana (AT1G56220); CaARP1, C.
annuum (AF082729, Jung e Hwang, 2000); PcARP, Pinus contorta (AW010624, Brinkler et al., 2004);
NtARP1, Nicotiana tabacum (AY183722); AtARP2, Arabidopsis thaliana (AT1G54070).
182
Dom
ínio de ligaç
ão ao FAD
183
Dom
ínio de ligaç
ão ao FAD
184
Dom
ínio de ligaç
ão ao FAD
185
186
187
Figura 2- Alinhamento múltiplo de AsCKX e outras proteínas CKX identificadas anteriormente. O
alinhamento das seqüências e os resíduos conservados foram realizados utilizando-se os
programas CLUSTAL W. e BOXSHADE As seqüências de aminoácidos idênticas encontram-se
na caixa preta. A lista de seqüências protéicas e número de acesso se encontram na tabela 2.
188
189
Figura 3- Alinhamento múltiplo de AsMT2 e outras MT2 da família 15. O alinhamento
das seqüências foi realizado utilizando-se os programas CLUSTAL W. e BOXSHADE.
Os resíduos de aminoácidos idênticos estão marcados na caixa preta. As MT2 da
família 15 usadas neste alinhamento e seu número no acesso no endereço
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) são: VaMT2, Vigna
angularis (BAD18379); VrMT2, V. radiata (BAD18375); CiaMT2, Cicer arietinum
(Q39459); MtMT2, Medicago truncatula (ABE78034); TrMT2, Trifolium repens
(P43398); VbMT2, Vicia faba (Q41657); AhMT2, A. hypogaea (ABA08415); NgMT2,
Nicotiana glutinosa (Q40396); SolMT2b, Solanum lycopersicon (Q40158); RcMT2,
Ricinus communis (P30564); EuMT2, Elaeagnus umbellata (AAC62105); AcMT2,
Actinidia chinensis (P43390); MdMT2, Malus domestica (O24058); AsMT2, A.
stenosperma (este estudo); BjMT22, Brassica .juncea (P69163); BrMT2, B. rapa
(P69164); ); BrpMT2, B. rapa subsp. pekinensis (Q39269); AtMT2a, Arabidopis thaliana
(P25860); BjMT21, B. juncea (P56168); BjMT25, B. juncea (P56172); BjMT23, B.
juncea (P56170); AtMT2b, A. thaliana (Q38805); PotdMT2b, Populus trichocarpa X
Populus deltóides (AAT02525); TaMT2, Triticum aestivum (AF470355); HvMT2,
Hordeum vulgare (CAD54080); OsMT2a, Oryza sativa (P94029); MuacMT2, Musa
acuminata (O22319); SolMT2z, S. lycopersicon (Q43515); SlMT2, S. lycopersicon
(Z68185); NpMT2, N. plumbaginifolia (NPU35225); SolMT2y, S. lycopersicon
(AI775811); SolMT2a, Solanum lycopersicon (Q40157); SolMT2x, S. lycopersicon
(Q43512); OsMT2b, O. sativa (Q5JM82); OsMT2c, O. sativa (P93433); ClMT2, Citrullus
lanatus (AB182918); FaMT2 Fragaria ananassa (P93134); TabzMT2, Triticum aestivum
vr.Bezostaja (AY688468); OsMT21a, O. sativa (Q109B0); ZmMT2, Zea mays (Z34469).
190
191
Figura 4- Alinhamento múltiplo de AsRS e outras RS. O alinhamento das seqüências foi
realizado utilizando-se o programa CLUSTAL W. Os resíduos de aminoácidos idênticos estão
marcados na caixa preta. As RS utilizadas neste alinhamento e seu número de acesso no
endereço (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) são: VlSTS1, Vitis
labrusca (AB046374); VrSTS1, V. riparia (AB046373); VvSTS1, V. vinifera (P28343); VvSTS2, V.
vinifera (P51070); SbSTS1, Sorghum bicolor (AY069951); AsRS, Arachis stenosperma (presente
estudo); AhRS3, A. hypogaea (AAF71253); AhSTS1, A. hypogaea (AF227963); AhRS1, A.
hypogaea (P20178); AhSTS2, A. hypogaea (P20077); RtSTS, Rheum tataricum (AF508150);
RpBAS, R. palmatum (AF326911); PcRS3, Polygonum cuspidatum (EF090604).
192
Figura 5 – Alinhamento das únicas seqüências que possuem identidade com AsHP1. Para o
alinhamento foram utilizados os programas CLUSTAL W e BOXSHADE. O motivo 1 está
presente em todas elas. As seqüências protéicas podem ser encontradas pelos números de
acesso:
AsHP1, Arachis stenosperma; ArthMp003, Arabidopsis thaliana (NP_085475);
NitaMp027, Nicotiana tabacum (YP_173374); MtrDRAFT_AC138017g30v2, Medicago
truncatula (ABO79948).
193
Figura 6 – Alinhamento das seqüências protéicas preditas que possuem identidade com AsHP2.
Para o alinhamento foram utilizados os programas CLUSTAL W e BOXSHADE. As seqüências
protéicas podem ser encontradas pelos números de acesso: AsHP2, Arachis stenosperma;
OsI_003050, Oryza sativa (EAY75203); Os01g0652700, O. sativa (NP_001043739);
OsI_020349, O. sativa (EAY99116); Os11g0683600, O. sativa (NP_001068462); Os12g0563600,
O. sativa (NP_001067038)
194
ANEXO V
(Artigo em preparação)
195
BAC libraries from the ancestral diploid genomes of the allotetraploid
cultivated peanut.
P. M. Guimarães
1*
, K. Proite
1,2
, O. Gausmer
3
, A. D’Hont
3
, S. C. M. Leal-
Bertioli
1
, and D. J. Bertioli
4
1
Embrapa Genetic Resources and Biotechnology, C.P. 02372, CEP 70.770-900,
Brasília, DF, Brazil;
2
Cellular Biology Department, IB-University of Brasília (UnB),
Campus Universitário, CEP 70.910-900, Brasília, DF, Brazil;
3
CIRAD Centre de
Coopération International en Recherche Agronomique pour le Developpement
(CIRAD), UMR 1096, Avenue Agropólis, TA40/03, 34398 Montpellier Cedex, 5
France.
4
Catholic University of Brasília, Campus II, SGAN 916, CEP 70.790-160,
Brasília, DF, Brazil;
*E-mail: messenbe@cenargen.embrapa.br
Tel.: +55 61 3448 4787
Fax: +55 61 3340 3624
Abstract
Cultivated peanut, Arachis hypogaea is an allotetraploid of recent origin, with an
AABB-type genome. In common with many other polyploids, it seems that a
severe genetic bottle-neck was imposed at the species origin, via hybridisation of
two wild species and spontaneous chromosome duplication. Therefore, the study
of the genome of peanut is hampered both by the crop’s low genetic diversity and
its polyploidy. In contrast to cultivated peanut, most wild Arachis species are
diploid with high genetic diversity. The study of diploid Arachis genomes is
therefore attractive, both to simplify the construction of genetic and physical
maps, and for the isolation and characterization of wild alleles. The most
probable wild ancestors of cultivated peanut are A. duranensis Krapov. & WC
Gregory and A. ipaënsis Krapov. & WC Gregory, with genome types AA and BB
respectively. Therefore, we constructed and characterized two large-insert
libraries in Bacterial Artificial Chromosome (BAC) vector, one for each of the
diploid species. The libraries are respectively c. 7.4 and c. 5.3 genome
196
equivalents with low organelle contamination and average insert sizes of 106 kb.
Both libraries were used for the isolation of clones containing genetically mapped
legume anchor markers (single copy genes), and resistance gene analogues.
Introduction
Cultivated peanut (Arachis hypogaea) is the second-most important grain
legume crop worldwide after soybean, with a production of 33 million tons in
2003/04 (USDA-FAS 2006). Peanut is produced throughout the tropics and
warmer regions of the subtropics, but is particularly important in Africa, Asia and
in the United States (FAO, 2003). It is an allotetraploid (AABB) with a very narrow
genetic base due to an extreme genetic bottleneck at the origin of the species
(Halward et al., 1991; Young et al., 1996). This low genetic diversity has led to
lack of variability in some important traits, limited availability of allelic
combinations and consequently restrictions in productivity. In addition, the very
low levels of polymorphism in cultivated peanut has hampered genetic and
genomic characterization. In contrast, peanut diploid wild relatives have high
genetic diversity and have been selected during evolution by a range of
environments and biotic stresses, constituting a rich source of allele diversity
(Nelson et al., 1990).
Because of the difficulties of working with cultivated peanut, its genome
has been relatively little studied. Only a few linkage maps have been published.
All of them have used wild species to enable the generation of sufficient
polymorphic markers. RFLP maps were developed by Halward et al. (1993)
based on a cross of two AA genome species, A. stenosperma and A. cardenasii,
and a tetraploid map based on a cross of TxAG-6 (a synthetic amphiploid) and A.
hypogaea was published by Burow et al. 2001..Recently we developed an SSR-
based map for the AA genome of Arachis based on a cross of A. stenosperma
and A. duranensis (Moretzsohn et al., 2005) and a map of the BB genome, based
on a cross of A. ipaënsis and A. magna (Gobbi et al., 2007 and unpublished
data). For peanut there is also relatively little EST data publicly available with only
13525 ESTs for A. hypogaea in Genbank (Luo et. al. 2005a, b and c), and
197
recently 6264 for the wild AA genome A. stenosperma. (Proite et al., 2007;
Martins et al., 2006).
In addition to genetic maps and ESTs, Bacterial Artificial Chromosome
(BAC) libraries are fundamental tools for genomic studies, being important for
physical mapping, map-based gene cloning and analysis of gene structure and
function. The easy handling and propagation of the clones, their relatively stability
and low degree of chimerism compared with yeast artificial chromosome (YAC)
vectors have made BAC vectors the cloning system of choice (Dvorak et al,
2004; Chalhoub et al, 2004). A number of strategies have been proposed for
physical mapping with large-insert clones: hybridisation-based methods such as
interactive hybridisation using individual cDNA or genomic clones as probes
(Mozo et al., 1999), restriction-based fingerprinting methods (Hong, 1997),
integrated BAC end sequencing, fingerprinting and genome sequencing methods
(Mayer et al., 1999); or more recently, oligonucleotide-based “overgos” (Gardiner
et al., 2004).
BAC libraries have now been constructed for many of the world’s most important
crops and are now being developed for crops of lesser economic importance,
such as melon (Luo et al., 2001), mungbean (Miyagi et al., 2004), sugar-beet
(Gaafar et al., 2005), cucumber (Nam et al., 2005), sunflower (Bouzidi et al.,
2006) and quinoa (Stevens et al., 2006). Within the Leguminosae, BAC libraries
are available for Phaseolus vulgaris (Vanhouten & MacKensie, 1999), Vigna
radiata (Liu et al., 2004), Glycine max (Danesh et al., 1988), Trifolium pretense
(Sato et al 2005) and the model legumes Lotus japonicus (Kawasaki & Murakami,
2000) and Medicago trunculata (Meksem et al, 2000). Within the genus Arachis,
one BAC library for cultivated peanut has been developed (Yuksel & Paterson,
2005). As a complement to this resource, here we describe the production of
diploid BAC libraries for wild AA and BB genomes of Arachis. Two diploid wild
species A. duranensis Krapov. & WC Gregory (AA genome) and A. ipaënsis
Krapov. & WC Gregory. (BB genome) have been identified as the most probable
ancestors of peanut (Kochert et al, 1996), and therefore we chose these species
for BAC construction. These diploid BACs will enable, for instance, the isolation
of wild alleles conferring strong disease resistance, and will facilitate the
construction of a physical map. The wild and cultivated BAC libraries together
198
would also allow some fascinating comparisons between wild and cultivated
genomes and perhaps insights into the evolution of polyploid genomes.
199
Materials and Methods
Plant Material
Seeds were obtained from the Arachis germplasm collection, maintained at
Embrapa Genetic Resources and Biotechnology — CENARGEN (Brasília-DF,
Brazil). For HMW DNA isolation, A. duranensis V14167 (genome AA) and A.
ipaënsis KG30076 (genome BB) were grown under greenhouse conditions.
Young leaves were collected in liquid nitrogen then stored at -80 ºC.
HMW DNA isolation
Nuclei were isolated from leaves according to Zhang et al., (1995) with some
modifications. In brief, 50 g of young leaves were ground in liquid nitrogen and
nuclei were liberated by incubating with agitation the cell extract at 4°C in HB 1X
buffer, plus 0,2% of PVP 40. Polyvinylpyrrolidone was added to the extraction
washing buffer to reduce the production of oxidized polyphenolics in the leaf
homogenate. To eliminate cell debris, the leaf homogenate was filtered through
four layers of cheesecloth and two layers of Miracloth (250 µm), (Calbiochem,
UK). Centrifugation at 850G for 8 min at 4°C was fo llowed by a Percoll gradient
(37.5%) to separate nuclei from the pectin matrix (Peterson et al.,2000). The
nuclei were resuspended in HB 1X extraction buffer without β-mercaptoethanol
and Triton-100X, centrifuged as before and the pellet resuspended to a final
volume of 1ml of filtered HB 1X. The nuclei suspension was then embedded in
1,2% low-melting-point agarose plugs (InCert Agarose , Cambrex-Bioscience,
Rockland, Inc.). An aliquot of the nuclei extraction was evaluated under a
microscope using DAPI staining to observe the integrity of the nuclei and the
purity of the preparation in terms of organelle contamination. Agarose plugs
containing HMW DNA were incubated for 16 h at 50°C in lysis buffer (5% Sodium
Lauryl Sarcosyl, 0.625M EDTA pH 9.0, 50 mg proteinase K), washed for 1 h at
4°C in inactivation solution (0.5M EDTA, pH 8.0, 0. 1µM PMSF), four times for 30
min in TE 10/10, four times for 30 min in TE 10/1 and finally stored in TE 10/10 at
4°C. An extra HMW DNA purification step was conduct ed between the two wash
steps, which consisted of a pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using a
CHEF Mapper
TM
XA apparatus (Bio-Rad, U.K.) at 6 V/cm, with 3 s of switch time,
200
and an angle of 120° for 40 min aiming to eliminate impurities and low size
fragments.
BAC library construction
Agarose plugs containing HMW DNA were chopped into small pieces and
incubated on ice, with agitation, three times in 1X HindIII restriction buffer (Gibco
BRL, USA), with buffer exchange every 30 min. Seven units of HindIII was added
to each chopped plug and allowed to diffuse for 4 hours on ice. For partial
digestions, the reactions were incubated for 15 min at 37°C and then stopped by
adding one-tenth of the total volume of 0,5 M EDTA, pH 8,0 and placing on ice.
Partially digested HMW DNA was size-selected in 1% GTG SEAKEM agarose
gels in two steps at 14°C in 0,5X TBE buffer: first –sizing by PFGE at 6 V/cm, with
1 s to 50 s of switch-time, and an angle of 120° fo r 20 h; second-sizing by
selecting two regions TOP (150 -250 Kb) and BOTTOM (80-150 Kb) from the
above gel and running the excised agarose plugs at 6 V/cm, with 3 s of switch
time, and an angle of 120° for 20 h. The regions of TOP and BOTTOM
corresponding to 100 kb were then cut out from the latter gel and the DNA
recovered through electro-elution (BIO-RAD/electro-eluter, UK). The DNA
concentration was estimated in 1% agarose gel in 1X TAE and a number of
ligation reactions containing different ratios of vector to insert (V/I) were tested. A
constant 30 ng of the commercial vector “pIndigo BAC-5 HindIII-Cloning Ready”
(Epicentre, USA) was used, and varying amounts of insert ranging from 100 to
900 ng of HMW DNA were used in 70 µL reactions. Competent E.coli cells
(ElectroMAX DH10B) (Invitrogen) were transformed by electroporation and
transformants were selected on a 2YT-X-gal-IPTG plates containing 12.5 µg/mL
cloramphenicol. White colonies were picked using a Q-bot 2XY Genetix colony
picker robot (Genetix) and transferred to 384 well-plates containing 80 µL of 2YT
and 7% glycerol. The plates were incubated for 18-20 h at 37 °C and stored at -
80 °C.
BAC library screening and DNA isolation
For estimation of BAC clone insert sizes, random individual clones were grown in
100
µL pre-innoculum and then in 3 mL 2YT liquid medium containing
201
chloramphenicol (12,5 µg/mL). BAC DNA was isolated using a QIAGEN BIO-
ROBOT 9600 (Qiagen GmbH, Germany). BAC DNA was digested with NotI to
release the inserts. The digested clones were separated by PFGE at at 14°C in
0,5X TBE buffer, 6 V/cm, a switch time from 5 to 15 s, an angle of 120° and run
for 15 h. High-density filters were made using a Q-bot 2XY Genetix Robot
(Genetix). Each high-density filter contained 18,432 double-spotted clones.
Hybridisations were performed as described in the Clemson BAC protocols
(http://www.genome.clemson.edu/protocols). Filters were exposed for 1 day on
Fuji Medical X-Film (Super RX-100 NIF).
Genomic probes
Estimation of organelle contamination in both libraries was evaluated by using a
spinach chloroplast gene, the large Rubisco subunit (1.5 kb) and a wheat
mitochondrial gene of cytochrome oxidase cox I (1.3 kb) (Vilarinhos et al., 2003).
BAC libraries were also hybridized to probes from single-copy genes that have
been defined as legume anchor markers (Fredslund et al 2006) and the Arachis
resistance gene analogue S1_A_36 (Genbank accession AY157808, Bertioli et al
2003). This RGA was isolated from the AA genome species A. stenosperma and
has been found to co-localize with a QTL for resistance to the late-leaf spot
Cercosporidium personatum (Moretzsohn, 2006 and unpublished data).
Results
HMW DNA isolation
In order to eliminate high levels of carbohydrate and polyphenols present in both
A. duranensis and A. ipaënsis leaves, a modified nuclei isolation protocol
including a combination of PVP-40 buffer, filtration in Miracloth and centrifugation
through Percoll gradient (37.5%) was used. The inclusion of an extra purification
step, consisting of PFGE of agarose plugs for 40 min before digestion, enabled
the purging of smaller fragments and eliminated impurities, increasing cloning
efficiency. The analysis of the extracts by DAPI-staining microscopy enabled the
correct evaluation of the amount and quality of the nuclei preparation.
202
BAC libraries
The double size selection used produced satisfactory DNA insert sizes ranging
from 100-120 kb, for both libraries, whilst a 1/4 Vector/Insert ratio in ligation
reactions showed the greatest number of transformants. The BAC library for the
AA genome (A. duranensis) contained 84,096 clones from five different ligations,
whilst the BB genome library (A. ipaënsis) consisted of 75,648 clones originated
from five ligations (Tab. 1). A random sample of each library was analyzed by
NotI digestion, and the average insert size was 112 and 100 kb for A. duranensis
and A. ipaënsis respectively (Fig.1 a and b).
The organelle contamination in the BAC libraries was evaluated by
screening the high–density filters with mitochondrial and chloroplast specific
probes. For A. duranensis, the contamination of BAC clones with chloroplast
sequences was of 0.363% and mitochondrial sequences of 0.016 %. For A.
ipaënsis 0.081
% was contaminated with chloroplast sequences and 0.21% of the
clones with mitochondrial DNA. These values, together with the microscopic
DAPI-staining observations, reflect the high level of purification of the Arachis
nuclei obtained with the modified protocol.
Based on the library average insert size and A. duranensis haploid
genome, equivalent to 1260 Mb (Temsch & Greilhuber, 2001), the estimated
coverage of the AA genome BAC library is of 7.4 haploid genome equivalents.
However, for A. ipaënsis, the DNA-content determination is controversial. It is
possible that the haploid genome equivalent of 2,830 Mb reported by Singh et al,
1996 is a 2.0 fold overestimate because of measurement inconsistencies, as
already described for other Arachis species (Temsch & Greillhuber, 2001;
Temsch & Greillhuber, 2000). Considering this aspect, the BB genome BAC
library for A. ipaënsis represents from 2.7 to 5.3 the haploid genome equivalents
of the species. To experimentally confirm the theoretical estimate of nuclear
genome coverage in both libraries, high-density filters were screened with probes
corresponding to genic single copy legume anchor markers that have been
placed on the Arachis AA genetic map (unpublished data). An average of 5.6
clones per probe was identified in the AA genome and 4.5 in the BB (Table 2).
The hybridization of both BAC libraries with an Arachis RGA S1_A_36 identified
two clones in the AA genome but none in the BB genome (Fig. 2).
203
Discussion
Cultivated peanut is an allotetraploid with two cytoplasmic genomic
components, AA and BB. Although it is generally agreed that these component
genomes are derived from diploid wild ancestors, the exact species involved has
been a matter of some research. Although the evidence is not completely clear
cut, analysis of data from molecular markers, cytogenetics, morphology and
geographical distributions support that A. duranensis and A. ipaënsis are the
direct ancestors of cultivated peanut (Kochert et al. 1996; Seijo et al., 2004).
The study of peanut’s diploid wild relatives is therefore attractive in a
number of ways: it avoids the complexities of a tetraploid genome, provides a
route to the isolation of wild alleles conferring, for instance, disease resistance
and will facilitate the study of the distinct repetitive elements, and evolution of the
AA and BB genomes. In this work, two BAC libraries representing the most
probable diploid ancestors of peanut, A. duranensis and A. ipaënsis were
successfully constructed. In addition to being ancestral, the species harbor
resistances to nematode and fungal diseases (Subrahmanyam et al., 1983). The
AA genome representative, A. duranensis, is of the same species as the parent
of the mapping population used for the construction of the Arachis SSR-based
map (Moretzsohn et al., 2005) and, A. ipaënsis is a parent of the BB mapping
population (Oliveira et al., 2007). This will facilitate the development of a marker-
based physical map and the integration of genetic and physical maps.
A number of steps needed to be added to the standard protocols of nuclei
extraction in order obtain HMW DNA without contamination from polyphenols and
carbohydrates which are abundant in Arachis leaves. Among them, the addition
of PVP-40 to the extraction buffer, the centrifugation of the leaf homogenate
through Percoll gradient (37.5%), purging the agarose plugs from impurities by
PFGE and extending the time of incubation with the enzyme buffer prior to
digestion were the most relevant. Screening with chloroplast and mitochondrial
probes showed that organelle DNA contamination was very low and comparable
to other BAC libraries constructed from plant leaves (Akhunov et al., 2005; Nam
et al., 2005; Ming et al., 2001).
204
The genome coverage of the AA genome BAC library was theoretically 7,4
haploid genome equivalents. In order to test the genome coverage further, we
used “anchor” markers: gene-based sequences that define unique loci in the
genetic linkage maps of multiple species (Fredslund et al 2006). The probes used
were PCR amplified from Arachis DNA and have been mapped to different
linkage groups in the AA genetic map (unpublished data). The number of clones
identified by the four anchor markers used as probes in the AA library was 5.6,
somewhat lower than expected from the theoretical genome coverage. According
to Wu and Zhang (2001) in some cases the actual coverage of a large-insert BAC
library is lower than its theoretical genome coverage due to particularly high or
low density of restriction sites in certain genome regions or difficulties in cloning
too large or too small fragments. On the other hand, it is largely accepted that
99% coverage is equivalent to 4,7X haploid genomes (Zhang et al., 2001).
Therefore, the A. duranensis genome is well represented and the library will be
suitable for many applications.
The coverage for the BB genome library is more difficult to estimate.
According to Singh et al. (1996), the 2C DNA mean values (genome size) for A.
ipaënsis is 5,6 pg (Feulgen densitometry). The same study indicated 2C values
for A. duranensis, A. hypogeae and A. monticola from 1.7 to 2.0-fold higher than
data obtained utilizing flow cytometry (Temsch & Greillhuber, 2001). As new data
on flow cytometry for A. ipaënsis is not yet available, we have considered the C
value for the species between 2,8 to 5,6 pg, and therefore, the BAC genomic
library covering from 2,7 to 5,3 haploid genome equivalents. The number of
clones in the BB library identified by two anchor markers used as probes
identified an average of 4,5 clones, and this result seems to support a coverage
at the higher end of the estimated range. Because anchor markers are single
copy, the BACs identified will enable comparisons of orthologous regions of
different genomes, AA and BB of Arachis and other legume genomes such as
Lotus and Medicago.
The two BAC libraries were also probed with S1_A_36, an RGA that co-
segregates to a QTL for resistance to C. personatum (Moretszohn, 2006 and
unpublished data). Two hybridizing clones were found in the A. duranensis
library, but none in the A. ipaënsis library. This single comparison may indicate
the presence of genome-specific alleles, although more work is needed to
205
confirm this. Sequencing of the RGA containing BAC clones should enable the
identification of microsatellites tightly linked to the RGA of interest, thus providing
more convenient markers for tracking the QTL in segregating populations.
In summary, here we describe the production of BAC libraries for the AA
and BB genomes of Arachis, the libraries will be a useful resource for, the
isolation of genes, the construction and correlation of physical and genetic maps,
the isolation of probes for cytogenetic analysis, the study of the evolution of the
two genome types, and by comparison with the allotetraploid genome of
cultivated peanut, for the study of the evolution of polyploidy genomes.
Acknowledgments
This work was funded by the CGP Challenge program and host institutions.
Karina Proite had a doctoral fellowship granted by the Coordenação de
Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES).
The authors would like to thank Dr.José.F.M.Valls for his valuable advice and for
providing seeds from EMBRAPA’s Germplasm Bank, also thanks are due to
Xavier Sabau for robotic technical assistance.
Table 1: Characteristics of the A. duranensis and A. ipaënsis BAC libraries
derived from randomly picked colonies.
Species
Ligations
(no.)
Genome
size (Mb)
Clones
(no.)
Average
insert
size (kb)
MtDNA(%)
cpDNA(%)
Estimated
genome
coverage
B. duranensis
5
1260
a
84,096
112
0.21
0.016
7.4x
B. ipaënsis
5
1415-2830
b
75,648
100
0.081
0.363
5.3-2.7
b
x
a
Temsch & Greilhuber, 2001
b
Singh et al, 1996
206
Table 2: Clones used for DNA hybridisation with BAC high-density screening
membranes, and number of positive colonies.
Probe
Number of clones hybridizing in BAC library
A. duranensis
A. ipaënsis
RGA S1_A_36
2
0
Leg083
2
5
Leg128
4
4
Leg092, Leg149, Leg178
(mixed)
19
Not tested
207
A
B
Fig. 1: Pulsed Field Gel Electrophoresis of randomly selected clones from the A.
duranensis (a) and A. ipaënsis (b) HindIII libraries. The inserts were released
from the plasmid pIndigo BAC-5 HindIII-Cloning Ready by digestion with Not I.
The size of the marker Lambda Ladder PFG Marker (New England Biolabs) are
given in kilobase (kb).
150
50
Vector
150
50
Vector
kb
kb
208
Distribution of BAC Clone Insert Sizes
0
5
10
15
20
25
30
35
<50 50-74 100-124 125-149 150-174 >175
Insert size (kb)
% of clones
A. duranensis
A. ipäensis
Fig.2 Distribution of insert sizes from randomly selected BAC clones from the A.
duranensis and A. ipaënsis libraries. Inserts were excised by digestion with NotI.
209
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