( PDF ) Características fenotípicas e funcionais da células natural killer em pacientes com síndrome da hiperimunoglobulinemia E

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DEBORA CRISTINA ROCHA

CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS E FUNCIONAIS DE CÉLULAS

NATURAL KILLER EM PACIENTES COM SÍNDROME DA HIPER-

IMUNOGLOBULINEMIA E

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola Paulista

de Medicina para obtenção do título de

Mestre em Ciências.

São Paulo

2007

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DEBORA CRISTINA ROCHA

CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS E FUNCIONAIS DE CÉLULAS

NATURAL KILLER EM PACIENTES COM SÍNDROME DA HIPER-

IMUNOGLOBULINEMIA E

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola Paulista

de Medicina para obtenção do título de

Mestre em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Esper Georges Kallás

São Paulo

2007

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Rocha, Debora Cristina

Características fenotípicas e funcionais da células natural killer

em pacientes com síndrome da hiperimunoglobulinemia E. / Debora

Cristina Rocha. -- São Paulo, 2007.

xvi, 72 f.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola

Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Doenças

Infecciosas e Parasitárias.

Título em inglês: Phenotypic and functional characteristics of natural

killer cells in patients with hyperimmunoglobulinemia E syndrome.

1. Células natural killer. 2. Síndrome da hiperimunoglobulinemia E.

3. NKp30. 4. Perforina.

iii

“Por menor que seja a ação de nós para o exterior,

Se for o nosso melhor, vindo do máximo que possamos alcançar,

Isso pode ser considerado grande

Porque cada um tem um tesouro guardado dentro de si

Mesmo que quase ninguém enxergue

Ele existe, e pode ser útil a alguém

Por isso não podemos nos intimidar

Seja quem for, seja você no seu melhor.”

Dedicatória

Ao Criador do universo, que transforma e renova sempre o desejo de

sermos pessoas melhores. Se não fosse por ele eu jamais teria chegado aqui, me

faz forte e útil, traz a esperança, a felicidade, e a coragem, que todos os meus

caminhos sejam ao seu lado, este é o sucesso que desejo acima de tudo na vida.

À família maravilhosa que me foi concedida, sempre me apóia e

incentiva com desejo de me ver feliz, meu pai Pedro Rocha, minha mãe Leonor

Robles Rocha, meus irmãos Luis Gustavo Rocha, Cesar Augusto Rocha e às

minhas cunhadas Marina Correa Paixão Rocha, e Lilia Nunes Pinto.

Ao meu orientador Professor Doutor Esper Georges Kallás, por

determinação divina enriqueceu meu conhecimento com toda a paciência,

consideração e respeito tão necessários para se concluir uma tese, pronto a

resolver cada dificuldade que surgia antes e durante o curso. Mostrou que os

valores reais do ser humano não estão nos títulos ou na inteligência acadêmica

que se pode desenvolver, apesar de enriquecido também nesta área, sua

humildade, simplicidade, educação e caráter mostram seu alto grau de potencial

espiritual, que o torna alguém realmente especial.

Aos meus amigos, colegas e a cada pessoa que faz parte da minha

vida. Especialmente à Adriana Francisco Constantino, a todo pessoal da Unifesp,

da Santa Casa e à comunidade cristã a qual pertenço.

Agradecimentos

Ao meu orientador, Prof. Dr. Esper Georges Kallás, Por sua generosidade em me

aceitar na pós-graduação e cuidar de todas as dificuldades que eu teria para fazer

o mestrado. Apesar de tantas ocupações grandes ele se importa com os

pequenos, um grande profissional e ser humano.

Aos pacientes e seus responsáveis por permitirem a utilização de seus materiais

biológicos para a realização deste trabalho.

À Dra Beatriz Tavares Costa Carvalho por disponibilizar seus pacientes e

colaborar conosco nesta pesquisa.

Ao grupo da Imunopediatria pelas coletas e apoio dados, em especial à Karina

Mescouto de Melo.

Ao grupo de colegas da Universidade da Califórnia em San Francisco,

principalmente Brian Long, por compartilhar os testes que realizamos para definir

a função e marcadores das células NK.

Ao Prof. Dr. Douglas Nixon, por proporcionar suporte e a transferência de

tecnologia para a realização dos experimentos.

À Dra. Denise do Socorro da Silva Rodrigues pela ajuda e comprometimento na

maioria dos experimentos que realizei no laboratório de Imunologia II.

Aos colegas do Laboratório de Imunologia I, Prof. Dr. Reinaldo Salomão, Maria da

Luz, Leandro, Milena K. C. Brunialti, e Marta Anésia Vianna pelo apoio e ensino

que me dedicaram.

Aos meus colegas da UNIFESP, Helena Tomiyama sempre atenciosa e

preocupada conosco, à Tânia Maria da Silva tão prestativa, organizada, pronta

para nos auxiliar e aconselhar. Karina Inácio L. de Carvalho Salmazi e Fernanda

Romano Bruno com exemplo de beleza, simpatia e competência. À minha amiga

Priscilla Ramos Costa, inteligente e esforçada, me oferecendo ajuda no que fosse

preciso, tanto na parte experimental como na pessoal. À Maria Teresa Maidana

que é uma pessoa sábia capaz de inspirar qualquer um com sua vida. Ao Hugo

Marcelo Ribeiro Barbosa por colaborar com sua tese e conhecimentos de Word

para me ajudar, além de ser um ótimo colega. Ao Ricardo Gomes Palácios pelas

críticas construtivas nas aulas, à Mariana M.Sauer, Hernán Bermudez Asa e

Ricardo T. Russo que trabalham com a pesquisa clínica por sempre estarem

abertos e prontos a ajudar. À Rafaela Goulart pelo coleguismo, ao Issler Moraes

da Silva e Cristiane da Silva Gomes, Angela Alencar de Lima, Cândida de Souza

Dantas, Zelinda Maria B. Nakagawa, que têm muitos papéis para cuidar e ainda

conseguem atender à nós pós-graduandos com toda gentileza. Agradeço a cada

um que direta ou indiretamente estiveram presentes neste período, estagiários,

funcionários do Cintergen e da DIPA que fazem parte agora da minha carreira

profissional mesmo que nem me conheçam.

A todos os meus professores, que desde a infância me fizeram amar o

conhecimento e a leitura, abriram meus olhos para um mundo maior do que eu

poderia ver sozinha.

Aos meus amigos da Santa Casa, sempre me animando a ser mais ativa e a viver

bem, Dayse Meirelles Bamboukian, Suzete Cleusa Ferreira, Fabiana Lima Maia

Fernandes, Audria Ângela Calixto, Christiane O. de Carvalho, Kelly Tosca Ferrari,

Carla Amorim, Roseli Tieko, Adriana Lopes Urquiza que me trouxe para a

UNIFESP, e muitos mais, os aprimorandos com quem convivi por pouco tempo,

mas também aprendi muito e antigos colegas que hoje nem vejo mais, porém

fizeram parte da minha vida.

vii

À família da amiga Suzete, pelo carinho com que me acolheram, principalmente à

sua irmã Gerenice Esdras Ferreira, que se tornou também minha amiga pela

grande ajuda que me deu durante a confecção da tese.

Aos meus amigos e parentes, principalmente Adriana Francisco presente nos

maus e bons momentos de minha vida e de qualquer forma fiel e pronta, pessoa

admirável. À Regiane Alves, Ademir Lagoeiro, Paulo Constantino, Andréia Maria,

Edimália, entre outros bons amigos que fazem parte da minha vida não por eu

possuir algo que lhes interesse, mas simplesmente me consideram como uma

pessoa que eles decidiram amar. Aos meus tios, avós, primos, padrinhos, aos que

estão na terra ou já partiram dela, mas estão no meu coração, devo muito a cada

um que cruzou em minha vida.

A minha gratidão eterna e especial é à minha família, meu pai Pedro Rocha que

sempre cuidou de nós dando o sustento que precisávamos, o seu trabalho árduo

nos proporcionou estudo e incentivo profissional, é o nosso exemplo de caráter e

esforço. Minha mãe Leonor Robles Rocha, amorosa, gentil, além de ser a melhor

mãe do mundo é minha amiga fiel, o seu amor incondicional me ajuda a acreditar

nas pessoas e em mim, preocupada em cuidar educar os filhos da melhor forma

possível. Aos meus irmãos e cunhadas Luis Gustavo Rocha, César Augusto

Rocha, Marina Correa Paixão Rocha e Lilia Nunes Pinto, que são meus amigos e

irmãos queridos, eles me fazem feliz, cada um de seu jeito particular e único.

À Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), pela oportunidade de conhecer

sobre pesquisa e ciência.

À Disciplina de Infectologia pela oportunidade de realizar meu mestrado e

conhecer pessoas incríveis, que eu jamais teria contato.

viii

Índice

AGRADECIMENTOS..........................................................................................................................V

LISTA DE FIGURAS.........................................................................................................................XII

LISTA DE QUADROS......................................................................................................................XIII

LISTA DE TABELAS ...................................................................................................................... XIV

RESUMO.......................................................................................................................................... XV

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................................. 1

1.1. HISTÓRICO .................................................................................................................................. 2

1.2. AUTOSSÔMICA DOMINANTE (AD-HIES).................................................................................. 4

1.2.1. Características clínicas ............................................................................................. 6

1.2.2. Etiologia..................................................................................................................... 7

1.2.3. Genética .................................................................................................................... 8

1.3. SÍNDROME AUTOSSÔMICA RECESSIVA (AR-HIES) ............................................................ 10

1.3.1. Características clínicas na AR-HIES....................................................................... 10

1.3.2. Diagnóstico AR-HIES.............................................................................................. 11

1.3.3. Etiologia da AR-HIES.............................................................................................. 11

1.3.4. Genética AR-HIES .................................................................................................. 11

1.4. DIFERENCIAÇÃO CLÍNICA E LABORATORIAL ENTRE AD-HIES E AR-HIES .................... 12

1.5. TERAPIA DA HIES..................................................................................................................... 12

1.6. PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS E HIES................................................................................ 15

1.6.1. Imunoglobulinas ...................................................................................................... 15

1.6.2. Linfócitos B e Anticorpos......................................................................................... 15

1.6.3. Imunoglobulina E..................................................................................................... 17

1.6.4. IgG4......................................................................................................................... 18

1.6.5. Linfócitos T .............................................................................................................. 19

1.6.6. Eosinófilos ............................................................................................................... 20

1.6.7. Células Natural Killer (NK) ...................................................................................... 20

1.6.8. Citocinas.................................................................................................................. 23

1.6.9. TNF

....................................................................................................................... 23

1.6.10. IFN

......................................................................................................................... 25

1.7. PATOGÊNESE DA HIES ........................................................................................................... 26

1.8. OBJETIVOS..............................................................................................................................29

2.0. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................................30

2.1.

CASUÍSTICA.............................................................................................................................. 31

2.2. RECRUTAMENTO ..................................................................................................................... 33

2.3. COLETA DAS AMOSTRAS....................................................................................................... 33

2.4. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS..................................................................................... 33

2.4.1. Separação de células mononucleares do sangue periférico .................................. 33

2.4.2. Imunofenotipagem................................................................................................... 34

2.4.3. Expansão de células K562...................................................................................... 36

2.4.4. Protocolo para estimulação e marcação do painel funcional das células NK ........ 36

2.5. ANÁLISE DE DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................... 38

3. RESULTADOS ........................................................................................................................... 40

3.1. CARACTERÍSTICAS DOS VOLUNTÁRIOS ............................................................................. 41

3.2. PORCENTAGEM DE CÉLULAS NK ......................................................................................... 41

3.3. ANÁLISE FENOTÍPICA DE CÉLULAS NK............................................................................... 43

3.4. MARCADORES FUNCIONAIS DE CÉLULAS NK.................................................................... 45

4. DISCUSSÃO............................................................................................................................... 47

5. CONCLUSÕES........................................................................................................................... 51

6. ANEXOS..................................................................................................................................... 53

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................... 60

Lista de Abreviaturas

AD Autossômica dominante

AR Autossômica recessiva

APC Allophycocyanin

APC Célula apresentadora de antígeno

APC-Cy7 Allophycocyanin carbocin 7

BSA Bovine serum albumine

CD Marcador de diferenciação celular

CTL Linfócito T citotóxico

CXC Grupo de proteínas com pontes de dissulfeto entre resíduos

de cisteína

CXCL-11 Quimiocina do grupo CXC

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

ENA-78 Peptídeo de ativação de neutrófilos endoteliais

F Sexo feminino

FACS Fluorescence activated cell sorting

FITC Tio- cianato de fluoresceína

FMO Fluorescence minus one

GM-CSF Fator estimulante de colônias granulócitos- macrófagos

HIES Síndrome hiperimunoglobulinemia E

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

HLA Antígeno leucocitário humano

HSV2 Vírus herpes simples 2

IFNγ

Interferon gama

IgE Imunoglobulina E

IL Interleucina

K562 Linhagem de células humanas de eritroleucemia,

L Ligante

M Sexo masculino

MCP-3 Proteína quimiotática dos macrófagos

MHC Complexo de histocompatibilidade principal

MIF Média de intensidade de fluorescência

NK Natural killer/matadoras naturais

OBS Observação

PBMC/CMSP Pheripheral blood mononuclear cells/Células mononucleares

do sangue periférico

PBS Phosphate Buffered Saline

PE Phycoerythrin

PE-Cy7 Phycoerythrin carbocin 7

PerCP Piridin chlorophyll protein

PFA Paraformaldeido

PHA Fitohemaglutinina A

RNA Ácido ribonucléico

RNAm RNA mensageiro

SNC Sistema nervoso central

STAT Signal transducer and activator of transcription

TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido

TCR T Receptor de células T/ T helper

TGFβ

Fator de crescimento transformante β

Th Linfócitos T auxiliares/ T auxiliares

TNF Fator de necrose tumoral

UI Unidades internacionais

VN Valor de normalidade

xii

Lista de Figuras

Figura 1. Estratégia de análise de células NK por citometria de fluxo. 42

Figura 2. Expressão dos receptores NKp44, NKp30 e NKp46 em Células NK. 44

Figura 3. Expressão de perforina nas células NK. 45

xiii

Lista de Quadros

Quadro 1. Sistema de contagem com testes clínicos e laboratoriais para pessoas

com parentesco com HIES................................................................................... 3

Quadro 2. Designação de classe - responsabilidade com base na contagem do

fenótipo HIES........................................................................................................ 4

Quadro 3. Dados clínicos e laboratoriais da AD-HIES. ........................................... 6

Quadro 4. Tabela das principais diferenças entre AD-HIES e AR-HIES ............... 12

xiv

Lista de Tabelas

Tabela 1. Painéis utilizados na marcação de superfície e ensaios funcionais com

células NK ............................................................................................................. 34

Tabela 2. Estímulos para verificação da funcionalidade de células NK. ............... 37

Tabela 3. Distribuição do percentual de sub-populações das células NK no grupo

controle e em pacientes com AD-HIES. ................................................................ 43

Resumo

Foi realizado o estudo qualitativo e quantitativo das células NK em pacientes com

síndrome hiper-imunoglobulinemia E autossômica dominante (AD-HIES), uma

imunodeficiência rara. Em uma análise pelo National Institutes of Health foi

apresentada como uma doença multissistêmica, tendo dezenove

característicasclínicas vistas em 30 pacientes [1]. Propomo-nos a estudar células

NK para auxiliar a elucidar a patologia da HIES. Constatamos um declínio na

quantidade total das células NK nos pacientes HIES. Foram constituídos painéis

com marcadores da atividade citotóxica, de adesão, de ativação e de inibição.

Observamos um aumento dos marcadores de atividade citotóxica NKp44, NKp46

e, principalmente, NKp30 em pacientes com AD-HIES, em conjunto com maior

expressão constitutiva de perforina e CD107a, este último após estímulo com

células da linhagem K562. Estes resultados sugerem que, embora com

percentuais circulantes diminuídos de células NK, os pacientes com AD-HIES

apresentam maior atividade citotóxica inata, que pode ser conseqüência das

múltiplas infecções a que estão sujeitos.

xvi

Abstract

Qualitative and quantitative study of the NK cells was performed in patients with

autossomal dominant hyperimmunoglobulinemia syndrome (AD-HIES) a rara

immunodeficiency. An evaluation by the National Institutes of Health has

described it as a multisystemic desease, with nineteen clinical characteristics saw

in thirty patients [1]. We did perform several observations trying to explain the role

of NK cells in such disease, helping the understanding of its pathogenesis. We

were able to show a lower frequency of NK cells in AD-HIES. After constituting

panels to address NK cytotoxic, adhesion, activation, and inhibition function, we

were able to detect that cytotoxic markers NKp44, NKp46, and NKp30 are

upregulated in AD-HIES, along with along with higher expression of perforin and

CD107a, the latter after stimulation with K562 lineage cells. These results suggest

that, even in the context of diminished percentages of circulating NK cells, the

patients with AD-HIES present higher innate cytotoxic activity, which can be a

consequence of the recurrent multiple infections.

1. INTRODUÇÃO

Introdução

A Síndrome da hiper-imunoglobulinemia E (HIES), também conhecida

como Síndrome de Jó ou Síndrome de Burkley é uma imunodeficiência primária

rara, caracterizada por níveis sorológicos flutuantes de IgE (imunoglobulina E) e

eosinofilia. Os pacientes apresentam infecções recorrentes pulmonares, dermatite

crônica, candidíase mucocutânea, pneumonias com formação de cistos e muitas

vezes superinfecção por fungos e outros microorganismos oportunistas,

anomalias faciais, defeitos na dentição, ossos frágeis e anomalias nos tecidos

conectivos (Grimbacher et al., 1999; Grimbacher et al., 2005; Sordet et al., 2005;

Bonilla and Geha, 2006). A HIES tem sido estudada por cerca de trinta e cinco

anos, permanecendo sua etiologia desconhecida(Reis R. C., 2001). Há algumas

especulações sugerindo as possíveis causas das disfunções encontradas nessa

síndrome,serão citadas a seguir.

1.1. Histórico

Em 1966 Davis, Schaller e Wedgwood relatam o caso de duas garotas

com infecções pulmonares freqüentes, dermatites e infecções cutâneas

recorrentes por Staphylococcus aureus. As lesões não apresentavam

características inflamatórias, como o calor, e por isso foram chamados de

abscessos frios, o que motivou sua nomenclatura como Síndrome de Jó

baseando-se na Bíblia (Davis et al., 1966; Buckley, 2001).

Por volta de 1970, Buckley et al, notam infecção similar em dois

garotos, com dermatite grave, características faciais incomuns e elevados níveis

séricos de IgE, e denominam a esse conjunto de manifestações clínicas como

Síndrome de Buckley (Buckley et al., 1972). Logo em seguida constata-se nas

duas garotas já citadas elevação de IgE e deficiência na quimiotaxia neutrofílica,

mostrando que a Síndrome de Jó e de Buckley representavam a mesma condição

(Hill et al., 1974; Hill and Quie, 1974).

Introdução

Em uma análise do National Institutes of Health, foi definida a HIES,

caracterizada como uma doença multi-sistêmica, baseada em manifestações

clínicas e laboratoriais de trinta pacientes e de suas famílias, desenvolveram

assim um sistema de contagem fenotípica que contribuiu para o diagnóstico da

patologia (Grimbacher et al., 1999).

Quadro 1. Sistema de contagem com testes clínicos e laboratoriais para pessoas

com parentesco com HIES

Decisões clínicas 01234567810

Níveis séricos altos de IgE (IU/ml)

<200 200-500 501-1,000 1,001-2,000 >2,000

Abcessos na pele nenhum .1-2 .3-4 >4

Pneumonias (episódios durante a vida) nenhum 1 2 3 >3

Anomalias no parênquima pulmonar ausente broncoestasia pneumatocele

Retenção da dentição primária nenhum 1 2 3 >3

Escoliose (curvatura máxima) <10° 10-14° 15°-20° >20°

Pequenas fraturas nenhum .1-2 >2

Contagem eosinofílica alta (células/µl)

<700 700-800 >800

Características faciais ausente

Presença média

presente

Anomalias medianas

ausente presente

Erupção no recém nascido ausente presente

Eczema (estágio pior) ausente leve moderado grave

Infecções no trato respiratório superior por ano 1/fev 3 4/jun >6

Candidíases nenhum oral

Unhas das mãos

sistêmica

Outras infecções graves nenhum graves

Infecção fatal ausente presente

Hiperextensibilidade ausente presente

Linfoma ausente presente

Largura nasal aumentada

<1SD 1-2 SD >2 SD

Palato alto ausente presente

Correção em idade jovem >5 anos 2-5 anos 1-2 anos ≤1 ano

Pontos

Adaptado de Grimbacher et al.,.1999

O registro na coluna correta superior está fixado para apontuação máxima permitida para cada decisão

Normal <130 UI/ml.

700./µl= 1SD, 800/µl= 2 SD da média do valor dos indivíduos normais

Por exemplo, palato fendido, língua fendida, hemivertebrados, outras anomalias vertebrais, etc.

Comparativo de idade e sexo entre os controles.

Introdução

Quadro 2. Designação de classe - responsabilidade com base na contagem do

fenótipo HIES

Fenótipo w/w w/m m/m

≥61 Afetado .00 .999 .999

51-60 Afetado .01 .99 .99

41-50 Afetado .02 .98 .98

31-40 Afetado .03 .97 .97

21-30 Afetado .05 .95 .95

18-20 Afetado .10 .90 .90

15-17 Afetado .20 .80 .80

10-14 Não afetado ---- ---- ----

8-9 Não afetado .80 .20 .20

6-7 Não afetado .90 .10 .10

4-5 Não afetado .98 .02 .02

0-3 Não afetado .99 .01 .01

---- Cônjuge não afetado .999 .00 .00

---- Não avaliado, desconhecido ---- ---- ----

Contagem de

pontos clínicos

Penetrância

Frações que representam a probabilidade do genótipo autossomal dominante da HIES. Abreviações w/w=

tipo selvagem homozigótico, w/m= heterozigótico tipo selvagem/ mutante, e m/m= homozigótico mutante.

Em 2003 foi descrita a forma de transmissão hereditária: a forma

autossômica recessiva da HIES (AR-HIES) em famílias consangüíneas turcas e

mexicanas, com eosinofilia, elevação dos níveis de IgE, e algumas outras

características que a diferenciam da síndrome autossômica dominante (AD-HIES)

(Renner et al., 2004).

1.2. Autossômica Dominante (AD-HIES)

AD-HIES afeta o sistema imunológico, tecido conjuntivo, esquelético e

o desenvolvimento dentário, cujas características clínicas e laboratoriais incluem

eczema, abscessos periódicos na pele, pneumonia com formação de

pneumatoceles, candidíase mucocutânea, elevação dos níveis séricos de IgE,

eosinofilia, e outras características. Tipicamente a primeira manifestação de HIES

em recém-nascidos é a erupção cutânea(Buckley, 2001).

Introdução

Espectro de infecções: HIES é caracterizado por infecções causadas

por bactérias do gênero Staphylococcus (Davis et al., 1966). Os principais

agentes etiológicos de pneumonias nesses pacientes são Staphylococcus aureus,

Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae. As pneumatoceles que

surgem em associação às pneumonias bacterianas, freqüentemente são

resultantes de superinfecções por Pseudomonas aeruginosa e Aspergillus

fumigatus. A infecção oportunista mais comum em HIES é a candidíase

mucocutânea, porém, foram identificados vários casos de Pneumocystis jiroveci,

criptococose e histoplasmose (Jacobs et al., 1984; Alberti-Flor and Granda, 1986;

Desai et al., 1996; Grimbacher et al., 1999). Foram diagnosticadas infecções

pouco comuns, incluindo as infecções disseminadas pelo bacilo Calmette-Guérin

após a vacinação em um recém-nascido com HIES (Pasic, 2002). Infecções

graves por herpes simples raramente acontecem nos casos de AD-HIES, sendo

mais comum na HIES autossômica recessiva (Hershko et al., 2002).

O sistema esquelético nesses pacientes comumente apresenta

anormalias faciais(Borges et al., 1998), hiperextensibilidade de membros(Davis et

al., 1966; Buckley et al., 1972), e fraturas patológicas periódicas afetando os

ossos longos e costelas evidenciando a natureza multisistêmica da HIES, . A

escoliose é vista em aproximadamente dois terços dos pacientes, ocorrendo

espontaneamente na adolescência, como é o caso da escoliose idiopática, ou em

conseqüência de diferença no comprimento das pernas após cirurgias (após

toracotomia, remoção de um cisto pulmonar ou por anormalidade do corpo

vertebral), que são relativamente freqüentes em pacientes com HIES(Smithwick et

al., 1978; Hoger et al., 1985).

As anomalias do sistema dentário, características de HIES, estão

relacionadas com a reabsorção reduzida de suas raízes, com retenção dos

dentes primários, impedindo assim a troca apropriada para os dentes

permanentes(O'Connell et al., 2000).

Nos olhos foram identificados casos de estrabismo, e também tumores

(Orhan et al., 2001). São observados vários tipos de tumores em pacientes com

HIES, especialmente linfomas, relatos recentes incluíram linfoma anaplásico de

Introdução

células gigantes, linfoma periférico de células T e adenocarcinoma pulmonar

(Chang et al., 2002; Lee et al., 2003; Leonard et al., 2004; Oztop et al., 2004;

Grimbacher et al., 2005).

Quadro 3. Dados clínicos e laboratoriais da AD-HIES.

Manifestações clínicas e laboratoriais Freqüência de ocorrência

Manifestações imunológicas e infecciosas

Eczema 100%

Abscessos de pele 87%

Pneumonia recorrente (3 ou mais vezes) 87%

Pneumatoceles 77%

Candidíase mucocutânea 83%

Sintomas esqueléticos

Alterações faciais 83%

Alargamento nasal 65%

Falha na dentição 72%

Hiperextensibilidade 68%

Fraturas patológicas recorrentes 57%

Escoliose 63%

Índices laboratoriais

IgE (> 2000ul/ml) 97%

Eosinofilia (> 2 SD do normal) 93%

Adaptado de Grimbacher et al., 2005.

1.2.1. Características clínicas

Vários sintomas graves da HIES lideram a condição de diagnóstico,

especialmente nos pacientes jovens e de apresentação inicial atípica,, e nos

casos menos graves (formas variantes de HIES) (Grimbacher et al., 2005). A falta

de testes específicos torna o diagnóstico do HIES bastante difícil, sendo

necessário a compilação dos sintomas e acompanhamento dos pacientes muitas

vezes durantes anos. O National Institutes of Health desenvolveu parâmetros para

acompanhar os pacientes e seus familiares e os múltiplos casos de HIES

(Grimbacher et al., 2005).

Introdução

O diagnóstico consiste no reconhecimento dos defeitos do sistema

imunológico e somático, reenfatizando a natureza complexa da doença.

A importância da elevação policlonal do IgE na patologia do HIES é

sutil. Os níveis de IgE de 10.000 a >100.000 UI/mL são característicos de HIES,

mas os níveis não são estáticos.

Flutuações substanciais têm sido documentadas nos níveis sorológicos

elevados de IgE no decorrer do tempo sem nenhuma resposta óbvia na

apresentação clínica. Além disso, alguns indivíduos com manifestações clínicas

podem ter declínio de IgE para níveis normais, quando eles atingem a terceira

década de vida.

Altos níveis de IgE não estão correlacionados com eosinofilia ou

suscetibilidade para infecções graves; alguns pacientes mais velhos com níveis

de IgE abaixo de 2.000 UI/mL sofrem infecções recorrentes. Para recém

nascidos, os níveis normais de IgE são muito baixos ou indetectados. Já no em

crianças lactentes, valores entre 100 e 200 UI/mL é patológico. O nível de IgE

fisiológico aumenta lentamente após o nascimento e se eleva gradativamente

com a idade. Desta forma, somente pode-se diagnosticar a HIES quando se tem

elevação de 10 vezes acima do percentil 95 do valor normal para a idade.

A maior parte dos pacientes com HIES tem eosinofilia aproximada de

dois desvios padrão acima do normal (geralmente maior que 700 células/µL). De

qualquer modo, não há correlação entre eosinofilia e níveis de IgE ou entre

eosinofilia e complicações infecciosas da HIES. A contagem total de células

brancas no sangue é geralmente normal, quando não estão elevadas nas

infecções, embora freqüentemente falham na contenção de infecções agudas.

1.2.2. Etiologia

A causa da HIES não é muito conhecida Hill et al acreditaram que falha

na quimiotaxia de neutrófilos desencadeariam uma susceptibilidade à infecções,

mas esta provou ser inconsistente(Hill et al., 1974; Montoya et al., 2003).

Introdução

Estudos recentes têm focado no desequilíbrio das citocinas produzidas

pelas células Th1/Th2, uma resposta Th2 predominante ou uma falha na resposta

Th1 favoreceria a indução da síntese das citocinas IL-4, IL-10 e IL-13, levando a

troca de classe de imunoglobulina para IgE. Esses achados foram pesquisados

em uma família holandesa com HIES, cujos membros apresentavam alteração do

fenótipo Th2 reduzindo significativamente a razão do IFNγ/IL-10, após estímulo

com S. aureus ou Candida albicans mortos pelo calor(Netea et al., 2002).

Borges et al. examinaram o sangue de 10 pacientes com HIES e

encontraram uma diminuição in vitro na produção de IL-12, particularmente após

a estímulo específico com antígeno de Staphylococcus aureus, patógeno

importante na HIES (Borges et al., 2000).

1.2.3. Genética

Mais de 200 pacientes com HIES estão descritos na bibliografia

médica. Inicialmente, os relatos eram restritos a caucasianos, porém atinge

todos os grupos étnicos e tem distribuição praticamente igual em indivíduos do

sexo masculino e feminino. Genealogias de famílias com HIES estudadas são

compatíveis com uma doença autossômica dominante, a transmissão de pai

para filho em algumas famílias exclue a possibilidade de estar ligada ao

cromossomo X (Grimbacher et al., 1999; Buckley, 2001).

Um paciente HIES com retardo mental apresentou deleção parcial do

cromossomo 4q, chamando atenção para esta região. A análise da linhagem de

dezenove famílias com cinqüenta e sete pacientes com HIES demonstrou ligação

do braço proximal no cromossomo 4q. Seis das dezenove famílias não

apresentaram ligação nesta região, sugerindo que a HIES possuía significativa

heterogeneidade genética(Grimbacher et al., 1999).

Hershey et al. identificaram um polimorfismo no gene do receptor

de IL-4 (Q576R) no cromossomo 16, que está ligado à eczema atópico,

sugerindo uma ligação com a HIES. As análises com estes pacientes e seus

familiares não mostraram correlação do alelo Q576R com o fenótipo de HIES

(Hershey et al., 1997; Grimbacher et al., 1998).

Introdução

Recentes estudos têm mostrado que mutações no gene STAT 3 pode

ser a causa predominante da HIES familiar e esporádica. Um deles foi realizado

com 50 pacientes AD-HIES e 48 membros de suas famílias, onde alguns

achados os levou a investigação mais detalhada e ao seqüenciamento do STAT

no DNA deles. Sete pacientes apresentaram mutação de novo (sem ser por

transmissão familiar) no STAT, 17 tinham transmissão familiar da mutação neste

gene, 26 tiveram mutação esporádica do STAT 3, e um apresentou quimerismo

para mutação do gene referido (Holland et al., 2007).

O STAT 3 pode ser ativado por IL-6 e IL-23, tem função crítica no

sistema imunológico, como o controle da produção de células dendríticas,

inibição da sinalização de macrófagos inflamatórios e a regulação da

granulopoiese. As proteínas STAT são a chave para a diferenciação Th1 e Th

(Yang et al., 2007).

Experimentos com ratos nos levam a admitir o quanto esta mutação

é significativa para a explicação de várias caracterísitcas da patologia HIES.

O STAT 3 nestes animais mostrou-se importante para a organogênese,

preservação orgânica, e inflamação em órgãos específicos e hematopoiese.

Foram evidenciadas as seguintes característica: inflamações no epitélio

pulmonar e aumento dos espaços aéreos (Hokuto et al., 2004), a expressão

do STAT 3 no pulmão é importante para controle da resposta inflamatória em

resposta a lipopolissacarídeos (Welte et al., 2003), o que pode explicar a

formação de pneumatoceles após infecção nestes pacientes.

Nos ratos houve aumento da hematopoiese e eosinofilia (Panopoulos

et al., 2006), a depleção do STAT 3 específica para hematopoiese está

associada com osteopenia (Zhang et al., 2005).

As células epiteliais (pele e pulmão) possuem um mecanismo de

defesa mediado pelo STAT 3 pode-se assim explicar as freqüentes infecções

nestes locais em pacientes HIES (Wolk et al., 2004; Wolk and Sabat, 2006).

O defeito do gene referido em monócitos cadíacos está associado ao

aumento da produção TNF-α por estas células resultando em inflamação e

disfunção cardíacas (Jacoby et al., 2003; Ling et al., 2007). Quando a deficiência

no gene era localizada no cérebro dos ratos, havia aumento de inflamações ,

desmielinização e lesão nervosa (Okada et al., 2006; Freeman et al., 2007).

Introdução

A alteração do STAT 3 leva ao aumento da secreção de citocinas

Th1e diminuição das citocinas inflamatórias e antiinflamatórias como IL-6 e IL-10

(Welte et al., 2003). Este gene também atua como mediador da sinalização do

receptor de IL-21, ratos sem este receptor apresentaram aumento dos níveis de

IgE (Ozaki et al., 2002; Holland et al., 2007; Minegishi et al., 2007).

A HIES pode ser causada pela mutação de um só gene, ou mutações

em diferentes genes de uma mesma via (heterogeneidade genética), sendo mais

provável a segunda hipótese. A elucidação das combinações destas mutações,

ou ainda o esclarecimento das bases genéticas da HIES ainda precisa ser

realizado, o que facilitaria grandemente seu diagnóstico.

1.3. Síndrome Autossômica Recessiva (AR-HIES)

Seis famílias consangüíneas com treze pacientes com AR-HIES foram

estudadas em 2004, que apresentavam várias infecções recorrentes (pneumonias

e abscessos), eczema, aumento do IgE e eosinofilia (Renner et al., 2004).

1.3.1. Características clínicas na AR-HIES

No estudo acima citado, as infecções dos pacientes com AR-HIES

tiveram várias recorrências de diversos tipos de infecções por Staphylococcus

aureus, Haemophyllus influenzae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e

Cryptococcus, enquanto que alguns tiveram somente infecção crônica extensa

por Molluscum contagiosum, sete de treze apresentaram infecção recorrente de

herpes simples e um paciente apresentou infecção recorrente por Varicela zoster

(Renner et al., 2004).

Alguns destes tinham alterações neurológicas, como a paralisia facial

parcial e hemiplegia, sendo que quatro morreram em consequência de

complicações neurológicas. Estas complicações podem ser devido a

manifestações de uma possível vasculite por hiper-eosinofilia ou infecções

Introdução

ocultas, porém suas causas não estão claras. Não houve descrição de anomalias

esqueléticas, fraturas, anomalias dentárias, ou características faciais vistas no

AD-HIES (Renner et al., 2004).

Há uma maior suscetibilidade dos pacientes com AR-HIES para

infecções virais e fúngicas e por isso é possível que haja um defeito nas células T.

Não é descrita a formação de pneumatoceles após pneumonias, que é uma das

características da AD-HIES, o que é utilizado na diferenciação entre as duas

formas de HIES. Dois pacientes apresentaram anemia hemolítica e um deles

derrame, provavelmente devido a auto-imunidade, que consiste em mais um

diferencial entre as duas apresentações (Renner et al., 2004).

1.3.2. Diagnóstico AR-HIES

Todos pacientes com AR-HIES tiveram níveis séricos elevados de IgE,

além de outros isotipos de imunoglobulinas também aumentadas, sugerindo uma

estimulação não específica da resposta humoral. A eosinofilia foi mais elevada

que na AD-HIES, com valores de 17.500cel/µl (Renner et al., 2004).

1.3.3. Etiologia da AR-HIES

O fenótipo destes pacientes foi normal com relação ao número de

células, mas apresentou deficiência com relação às respostas proliferativas com

antígenos específicos, sugerindo que alguns defeitos linfóides no AR-HIES são

qualitativos e envolvem linfócitos T. Esta hipótese é sustentada pelas infecções

virais e fúngicas, enquanto que a função neutrofílica parece ser normal

(Grimbacher et al., 2005).

1.3.4. Genética AR-HIES

Os pacientes AR-HIES eram de pais consangüíneos, portanto foi

considerada uma doença de herança autossômica recessiva, de difícil análise

devido a alta mortalidade, levando a acreditar no envolvimento de mais de um loci

gênico (Grimbacher et al., 2005).

Introdução

1.4. Diferenciação clínica e laboratorial entre AD-HIES e AR-HIES

Considerando as diferenças entre as duas apresentações de HIES, é

importante rever como identificar as duas formas, revisto no Quadro 2

Quadro 4. Quadro das principais diferenças entre AD-HIES e AR-HIES

HIES forma clássica HIES forma consangüínea

familiar

Herança Autossomal dominante Autossomal recessiva

Eczema crônico sim sim

Abscessos recorrentes sim sim

Pneumonia. recorrente sim sim

Pneumatoceles sim não

IgE (IU/ml) 1875 - 58200 1700 - 45000

Eosinófilos

726 – 2034/µl 2500 – 18000/µl

Sintomas cerebrais sim sim

Vasculites não sim

Molusco contagioso não sim

Complicações devido a

infecção do vírus da herpes

não freqüente

Fraturas ósseas recorrentes sim não

Escoliose sim não

Hiperextensibilidade sim não

Retardo da dentição primária sim não

Letalidade Adulto Infância

Adaptado de Grimbacher et al., 2005.

1.5. Terapia da HIES

Ainda não há cura para o HIES e os tratamentos realizados são

profiláticos e baseados nos sintomas. Cuidados intensivos com as lesões

cutâneas, antibióticos para tratar as infecções e drenagem cirúrgica dos

Introdução

abscessos são algumas das condutas nesta síndrome. O uso de antibióticos

profiláticos contra Staphylococcus reduz o índice de abscessos cutâneos e

pneumonias por esta bactéria, as dermatites são freqüentemente agravadas por

superinfecção com S. aureus. Antibióticos sistêmicos são administrados em

adição com agentes antibacterianos tópicos tal como, cremes hidratantes,

esteróides tópicos (como na dermatite atópica). Pouco se sabe à respeito do uso

de drogas imunossupressoras na HIES, como o tracolinus. Candidíases

mucocutâneas, que se manifestam como onicomicoses, candidíase vaginal,

entre outros são normalmente muito responsivas ao uso de antifúngicos via oral

(Grimbacher et al., 2005).

Em relação à presença de pneumonia ou graves patologias

dermatológicas, os pacientes podem não apresentar febre e sentir-se bem,

provavelmente devido à ausência de inflamação nos abscessos frios. Isso

pode dificultar que um paciente se submeta a testes diagnósticos ou a terapia

de curso prolongado, com altas doses de antibióticos intravenosos para

eliminar o agente infeccioso (Davis et al., 1966; Hill and Quie, 1974).

A identificação correta do agente deve ser feita antes de começar com

os antibióticos. Se isso não for possível, o uso empírico dos antibióticos contra

patógenos infecciosos comuns (S. aureus, H. influenzae e S. pneumoniae) nesta

síndrome é válido, sendo frequentemente necessário a drenagem cirúrgica dos

abscessos e empiemas (Buckley, 2001).

A complicação típica na pneumonia em pacientes com HIES é a

formação de cistos pulmonares, que ocasionalmente podem desaparecer, mas

freqüentemente persistem e são locais, propícios para o desenvolvimento das

superinfecções. Estas infecções são mais difíceis de tratar, pois é necessária a

expansão do resíduo pulmonar na lobectomia e retirada dos cistos (Buckley, 2001).

A terapia profilática por longo prazo feita com antibióticos não foi muito

bem investigada, mas o consenso favorece esta abordagem com um antibiótico

anti-estafilocócico, como o co-trimoxazol, ou ainda penicilina semi-sintética ou

cefalosporina oral. A ocorrência de infecções por patógenos resistentes pode levar

a perpetuação do quadro e destruição pulmonar grave (Grimbacher et al., 2005).

Introdução

O uso de moduladores imunológicos tem sido frustrante nestes pacientes,

o Levamisole foi a única substância testada até agora, porém com efeitos colaterais

significativos quando comparado a um placebo (Donabedian et al., 1982).

O IFNγ tem sido usado em pacientes AD-HIES, mas não apresenta

efeitos duráveis quanto aos níveis de IgE e à susceptibilidade às infecções, e

pode apresentar risco para alguns pacientes, pois o IFNγ foi usado em dois

pacientes japoneses, e desencadeou trombocitopenia auto-imune em um deles

(King et al., 1989; Aihara et al., 1998).

A ciclosporina A tem sido usada nestes pacientes com sucesso tanto

na Espanha como em Israel (Wolach et al., 1996; Etzioni et al., 1997; Wakim et

al., 1998; Bilora et al., 2000), mas depende de estudos com número maior de

participantes para conclusões definitivas.

Terapias de infusão intravenosa de imunoglobulinas (IVIG) podem

influenciar os níveis de IgE devido à um aumento induzido do catabolismo Ig ou

neutralização do IgE via uma rede anti-idiotipo. Como a formação de anticorpos

no HIES provavelmente é defeituosa contra organismos encapsulados, o uso do

IVIG pode ser considerado(Wakim et al., 1998; Bilora et al., 2000).

A aparente desordem no sistema imunológico levou à tentativa de

transplante de medula óssea em dois pacientes com AD-HIES, e em um dos

casos os valores de IgE séricos caíram e não ocorreram infecções características

do HIES; no entanto, o paciente morreu seis meses depois do transplante devido

à uma pneumonia intersticial. No outro caso, os níveis de IgE mostraram

inicialmente uma queda significativa e a melhora das lesões cutâneas, mas após

cessar a supressão imunológica os níveis de IgE retornaram aos vistos antes do

transplante e o paciente voltou à ter abscessos na pele (Nester et al., 1998;

Gennery et al., 2000).

Introdução

1.6. Parâmetros imunológicos e HIES

Como visto anteriormente, as manifestações mais comuns da

disfunção imunológica nos pacientes com HIES são a elevação dos níveis séricos

de IgE e hiper eosinofilia, com diminuição da produção de IFNγ e defeito na

quimiotaxia neutrofílica. Há diversos estudos que revelam possíveis causas da

patogênese e outras alterações imunológicas.

1.6.1. Imunoglobulinas

Os níveis aumentados de IgE são muito freqüentes, mas não são

essenciais para o diagnóstico de HIES. Pacientes com apresentação clínica grave

de AR-HIES podem apresentar também altos níveis de outras imunoglobulinas

(Grimbacher et al., 2005).

A hiper produção de IgE nos portadores HIES é provavelmente

independente das linfocinas endógenas, das interações dos linfócitos T e B ou de

adesões celulares, mas deve ser conseqüência de uma população de células B

pré-ativadas e diferenciadas, funcionalmente autônomas (Vercelli et al., 1990).

O IFNγ exerce um efeito inibitório na síntese de IgE (importante nas

reações inflamatórias), então a deficiência desta produção seria responsável

pela sua hiperprodução, contribuindo assim para as infecções nos pacientes

(Ito et al., 2003).

A detecção de menor expressão dos genes de IFNγ e TGFβ em

pacientes com HIES sugere que pode afetar a produção de IgE dependente de

IL-4 (Ohga et al., 2003).

1.6.2. Linfócitos B e Anticorpos

A imunidade humoral é mediada por anticorpos, que são produzidos

pela linhagem de células chamadas linfócitos B. A função dos anticorpos é

neutralizar e eliminar os antígenos que induziram sua formação.

Introdução

Os linfócitos B são as únicas células que sintetizam moléculas de

anticorpos, estão presentes nos compartimentos ligados à membrana

citoplasmática (retículo endoplasmático e complexo de Golgi) e na superfície onde

são expressos como proteínas da membrana integral. As formas secretadas de

anticorpos estão presentes no plasma, nas secreções das mucosas e, em menor

quantidade no líquido intersticial dos tecidos. Os anticorpos secretados pelos

linfócitos B muitas vezes se inserem na superfície de outras células efetoras

imunológicas, tais como fagócitos mononucleares, células NK e mastócitos, que

possuem receptores específicos capazes de ligar-se a moléculas de anticorpo

(Gold and DeFranco, 1994; De Vos et al., 2006).

A maioria dos anticorpos encontra-se no terceiro grupo de globulinas

de migração mais rápida, as gamaglobulinas ou imunoglobulinas (Ig) ou

anticorpos. Essas glicoproteínas presentes no plasma ou no soro, por suas

características de solubilidade são tradicionalmente separadas em albuminas e

globulinas pela migração em um campo eletroforético (Abbas et al., 2003).

Todas as moléculas de anticorpos exibem as mesmas características

estruturais básicas, mas têm notável variação nas regiões que se ligam aos

antígenos. Possuem duas cadeias leves idênticas e duas pesadas também

iguais na estrutura central, ambas consistem de regiões variáveis (V) de

aminos terminais (N-terminal) e de regiões constantes (C) de carboxiterminais.

O reconhecimento do antígeno e as funções efetoras das moléculas de

anticorpos são segregadas entre a região V e a região C, respectivamente

(Schwartz et al., 1977; Gold and DeFranco, 1994).

A maioria das diferenças das seqüências entre os diferentes anticorpos

é confinada a três curtas extensões nas regiões V das cadeias leves e pesadas,

chamadas segmentos hiper-variáveis (Gold and DeFranco, 1994).

As classes de moléculas de anticorpos que constituem os isotipos são

designadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. No homem os subtipos IgA e IgG podem ser

subdivididos em subclasses ou subtipos, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Os

diferentes subtipos constituem diferentes funções efetoras (Rajewsky, 1996;

Snapper et al., 1997).

Introdução

A resposta do anticorpo ao antígeno protéico requer a presença de

linfócitos T e B, para produzir os anticorpos contra estes antígenos o linfócito B

precisa ser estimulado pelos linfócitos T, que é assim chamado de T auxiliar. Já

nas respostas aos antígenos não protéicos, como os polissacarídeos e os

lipídeos, não há necessidade da presença de linfócitos T auxiliares antígeno-

específico. A resposta imunológica humoral aos antígenos protéicos dependentes

de células T auxiliares altamente especializadas, geram anticorpos de diferentes

isotipos, incluindo IgE, IgA e diversos subtipos de imunoglobulina G, cada um

mediando distintas funções efetoras (Parker, 1993; Delves and Roitt, 2000;

Delves and Roitt, 2000).

A resposta imunológica humoral induz tanto à formação de anticorpos

quanto à de células de memória, que é caracterizada pela rápida formação de

anticorpos quando exposta ao antígeno. Estas respostas se iniciam em órgãos

linfóides periféricos.

Os linfócitos T auxiliares ativados secretam citocinas que atuam em

conjunto com o CD40 L (ligante CD40) para estimular a proliferação de células B

e a produção de anticorpos de diferentes isotipos (Foy et al., 1996).

As citocinas servem a duas funções principais nas respostas de

anticorpos, proporcionam amplificação dos mecanismos por aumento da

proliferação e diferenciação das células B e determinam os tipos de anticorpos

produzidos por promoverem seletivamente a troca de isotipos de diferentes

cadeias pesadas (Abbas et al., 2003).

Uma parte das células B produz ativamente anticorpos, exercendo

função efetora, em decorrência à exposição aos antígenos. A interação de

moléculas como CD40 e as citocinas, auxilia algumas células B a passar pelo

processo de troca de isotipo das cadeias pesadas, induzindo a formação de

anticorpos de diferentes classes (Abbas et al., 2003).

1.6.3. Imunoglobulina E

Desde a identificação da IgE como molécula responsável pelas

manifestações alérgicas, a sua determinação sérica se tornou rotineira na

Introdução

avaliação destas condições (Berg and Johansson, 1969). Assim como ocorre com

as demais imunoglobulinas, o nível de IgE no soro é flutuante, dentro de ampla

margem da normalidade. Vários fatores podem contribuir para elevação de IgE

total, como parasitoses, infecções, tabagismo, entre outros (Johansson et al.,

1968; Jones et al., 1974). Este fato nem sempre é compreendido e com

freqüência a elevação de IgE é interpretada como sinônimo de processo alérgico

(Spalding et al., 2000).

É difícil definir os valores normais de IgE sérica. Baseado em estudos de

freqüência, pode-se afirmar que nível de IgE inferior a 20 UI/mL não sugere

diagnóstico de atopia, embora não o afaste. Da mesma forma, IgE superior a 100

UI/mL não indica necessariamente quadro atópico, embora seja mais comum entre

pacientes alérgicos. É natural que níveis extremos estejam significativamente

associados a uma ou outra possibilidade (Spalding et al., 2000).

Estudos clínicos realizados para estabelecer os valores de IgE em

indivíduos normais têm demonstrado valores levemente diferentes em adultos e

crianças. De modo geral observa-se diminuição no nível de IgE com o aumento

da idade. Em alguns países do hemisfério norte, a IgE teria importância na

discriminação entre não atópicos e atópicos quando o nível sérico fosse inferior a

20 UI/mL ou superior a 250 UI/mL, respectivamente. Para Hamilton e Adkinson,

valores superiores a 333 kU/L estão consistentemente associados à presença de

atopia (Spalding et al., 2000).

1.6.4. IgG4

Vários pesquisadores têm atribuído uma atividade de proteção às

subclasses de IgG, principalmente IgG4, que é produzida como resultado de uma

longa exposição antigênica e atuaria como um fator inibitório da reação de

hipersensibilidade mediada por IgE (Carballido et al., 1994; Akdis et al., 1997).

Desta forma, acredita-se que IgG4 poderia neutralizar o antígeno ou bloquear o

anticorpo, melhorando, deste modo, a função da imunoterapia (Mori et al., 2001).

Introdução

1.6.5. Linfócitos T

O processo pelo qual os precursores pluripotentes da medula óssea

se desenvolvem em linfócitos B e T virgens, expressando receptores de

antígenos que povoam os tecidos linfóides periféricos é efetuado em locais

especializados da medula óssea (para as células B) e no timo (para as células

T) (Fu and Chaplin, 1999).

Quando os linfócitos virgens são estimulados por antígenos,

diferenciam-se em linfócitos efetores, tais como células B secretoras de anticorpos,

células T auxiliares e linfócitos T citotóxicos. Os linfócitos efetores apresentam

marcadores de superfície que os diferenciam dos linfócitos virgens, possibilitando a

identificação do seu estágio de ativação (Sprent, 1994; Cantrell, 1996).

As células T medeiam a resposta imunológica adaptativa. Os

linfócitos T amadurecem no timo, circulam no sangue, povoam os tecidos

linfóides secundários e são recrutados para os sítios periféricos de exposição à

antígenos. Expressam receptores de antígenos (TCRs) que reconhecem

fragmentos de peptídeos de proteínas estranhas ligadas às moléculas do

complexo de histocompatibilidade principal (MHC) próprios. As subpopulações

de células funcionais que participam desse processo de ativação incluem as

células T CD4+ (linfócitos T auxiliares) e os linfócitos T CD8+( linfócitos T

citotóxicos) (Bradley and Watson, 1996).

O linfócito T auxiliar é uma subpopulação funcional que desenvolve

como principais funções efetoras, a ativação dos macrófagos na resposta

imunológica celular e contribuição na produção de anticorpos pelas células B na

resposta imunológica humoral. Essas funções efetoras são mediadas por

citocinas secretadas e pela interação da molécula CD40 com seu ligante (CD40 L)

na célula B (Foy et al., 1996).

Os linfócitos T CD8+ virgens, não executam funções efetoras, porém

se diferenciam em CTL quando estão sob ativação desencadeada por antígenos

e pela interação de moléculas co-estimulatórias, tornando-se capazes de lisar a

célula-alvo e secretar citocinas.

Introdução

1.6.6. Eosinófilos

Os eosinófilos são granulócitos derivados da medula óssea,que são

abundantes nos infiltrados inflamatórios das reações de fase tardia e

contribuem em muitos processos patológicos nas doenças alérgicas, após sua

maturação circulam no sangue. São células de menor poder fagocítico, menor

mobilidade, mas com potente ação lítica, são compostos por proteínas líticas

eosinofílicas (proteínas dos gânglios), tóxica para parasitas tecidos dos

hospedeiros (Abbas et al., 2003).

As citocinas produzidas pelas células Th2 promovem a ativação dos

eosinófilos e seu recrutamento para o sítio de inflamação, reação de fase tardia.

Modulam reações de hipersensibilidade, uma vez que seu conteúdo granular tem

a capacidade de neutralizar a histamina e inibir a degranulação de mastócitos

(Abbas et al., 2003).

1.6.7. Células Natural Killer (NK)

Descobertas em 1975 (Herberman et al., 1975; Kiessling et al., 1975),

as células NK são derivadas de precursores da medula óssea. Embora se

pareçam com linfócitos T e B em muitos aspectos, estas células não expressam

antígenos que passaram por processo de recombinação gênica e, portanto, são

componentes da resposta imunológica inata (Raulet, 2004). São consideradas,

também, células de transição da imunidade inata e adaptativa, atuando na

supressão tumoral (Diefenbach and Raulet, 2002) e também na resposta

imunológica contra patógenos (Bukowski et al., 1983; Biron et al., 1999).

A ativação das células NK é regulada através dos sinais que vêem de

seus receptores de ativação e de seus receptores inibitórios. Reconhece células

revestidas de anticorpos e células que não expressam o MHC classe I,

decorrentes dos mecanismos de escape do patógeno ali presentes(Lanier, 1998).

As células NK possuem vários receptores de citotoxidade natural

(NCR) incluindo NKp46 (NCR1), NKp44 (NCR2), e NKp30 (NCR3). As

proteínas de NCR são membros da superfamília de imunoglobulinas, cujos

ligantes são desconhecidos.

Introdução

O receptor NKp30 foi descrito em 1999, junto com sua atividade

citotóxicica natural mediada por células NK (Pende et al., 1999) e pode ser inibido

pela proteína pp65 do citomegalovírus humano (Arnon et al., 2005). O ligante do

receptor NKp30 ainda não está determinado. Embora esteja presente em

humanos, é um pseudogene expresso na maioria das espécies de camundongos

(Moretta et al., 2001; Aktas et al., 2005; Lanier, 2005; Di Santo, 2006)

Também um receptor envolvido na citotoxicidade induzida por células

NK, o NKp44 foi descrito em 1998 por Vitale et al. Suspeita-se que seu ligante

seja algum tipo de hemaglutinina viral, o que sugere seu papel na citotoxicidade

em células infectadas por patógenos (Vitale et al., 1998)

O receptor NKp46 foi descrito em 1998 por Pessino et al. como um

novo membro da superfamília de imunoglobulinas, envolvido no

desencadeamento da citotoxicidade natural de células NK (Pessino et al., 1998) e

está presente em humanos e camundongos.

As células NK possuem grânulos com perforina que cria poros na

célula e granzimas que atravessam esses poros induzindo à lise da célula alvo

(Yu et al., 1992), além destas há também uma substância que age como

antibiótico, a granulosina, podendo matar os microorganismos intracelulares

diretamente. O IFNγ é precocemente produzido, tendo influencia na resposta por

linfócitos T (Martin-Fontecha et al., 2004) e na ativação dos macrófagos

potencializando a capacidade de destruição dos patógenos fagocitados.

A perforina é uma toxina presente em grânulos intracelulares, incluindo

em células NK, que, juntamente com as granzimas, são secretadas por exocitose

e induzem a apoptose da célula alvo. Esse mecanismo de citotoxicidade é

largamente descrito em células NK e a marcação para perforina é um método

largamente utilizado para identificar ação citotóxica por essas células (Smyth et

al., 2005). CD107a é um marcador de exocitose de grânulos de lisossoma e

correlaciona-se bem com citotoxicidade por linfócitos T CD8+ (Betts et al., 2003),

além disso já foi utilizado para verificar atividade citotóxica por células NK (Betts

et al., 2003; Alter et al., 2004; Alter et al., 2004). Acreditamos, portanto, que há

elementos bastante fortes, porém não definitivos, para respaldar a hipótese de

maior citotoxicidade por células NK nos pacientes com AD-HIES.

Introdução

As citocinas envolvidas na imunidade inata, IL-12 e IL-15 contribuem

na ativação das células NK logo no início da infecção viral, antes dos CTL serem

ativados, controlando a infecção até que se desenvolva a imunidade adaptativa

para erradicar a infecção (Abbas et al., 2003).

O conhecimento destas células ainda é restrito em comparação ao

leque de possibilidades que elas oferecem, seus receptores específicos são

pouco entendidos quanto aos seus ligantes e seu papel nas sinalizações. As NKs

possuem receptores de citotoxidade NKp30 (1C7), NKp44, NKp46 que

provavelmente em breve terão suas funções antitumoral e antiviral esclarecidas.

(Abbas et al., 2003; Lanier, 2005; Di Santo, 2006).

A maioria das células NK no sangue periférico humano são expressas

fenotípicamente por CD3

CD56

CD16

de acordo com a expressão da

densidade de CD56, as células NK podem ser divididas em subpopulações como

CD56

dim

a maioria das nossas células e CD56

bright

pequena parte da população de

células NK e que não expressam CD16, possuindo assim fraca atividade

citotóxica(Jacobs et al., 2001).

Algumas propriedades das CD56

dim

são por exemplo a de expressar

receptores KIR ( receptores de imunoglobulinas das NK), CD94/NKG2, CD161,

possuem grânulos com três vezes mais perforina e granzima A, têm maior efeito

citolítico e maior capacidade de se juntar às células alvo(Cooper et al., 2001).

Já as CD56

bright

, possuem alta afinidade com receptores de IL-12,

expressam também CD94/NKG2 e CD161, possuem maior produção de citocinas

proinflamatórias (IFN-g e TNF-a) e regulam os mecanismos das respostas

imunológicas (Cooper et al., 2001).

As células NK CD56

bright

dos linfonodos através do IFN-g influenciam as

células T que por sua vez através do IL-2 coestimulam a produção de citocinas

nas células NK, propiciando uma dinâmica entre sistema imune inato e adaptativo

(Fehniger et al., 2003).

Introdução

1.6.8. Citocinas

As citocinas são proteínas secretadas pelas células envolvidas na

resposta imunológica inata e adaptativa, são responsáveis por muitas das funções

dessas células, sendo produzidas principalmente em respostas a antígenos,

estando envolvidas também na ativação da resposta imunológica estimulando o

crescimento e a diferenciação dos linfócitos, na fase efetora tanto da imunidade

inata quanto na adaptativa, ativando diferentes células efetoras para combater

microorganismos e outros imunógenos, estimulando também as células

hematopoiéticas, sendo importantes agentes terapêuticos ou alvos para

antagonistas específicos em numerosas doenças imunológicas e inflamatórias

(Abbas et al., 2003).

As citocinas produzidas por fagócitos mononucleares são denominadas

monocinas, às provenientes dos linfócitos, linfocinas. Após a clonagem molecular

sabe-se que uma mesma citocina pode ser produzida por diversos tipos de

células, incluindo células endoteliais e epiteliais, o termo citocina tornou-se o mais

comumente utilizado. Muitas citocinas produzidas pelos leucócitos e atuantes em

outros leucócitos são conhecidas como interleucinas(Abbas et al., 2003).

As diversas citocinas são estruturalmente diferentes, mas elas

compartilham várias propriedades, como por exemplo, sua secreção é um evento

breve e autolimitado, uma vez sintetizadas são rapidamente secretadas,

resultando em uma liberação explosiva quando necessário. Suas ações podem

ser locais ou sistêmicas, além de poder atuar sobre diferentes tipos celulares e

muitas delas produzirem o mesmo efeito funcional, influenciando freqüentemente

na síntese e função de outras citocinas. Seus sinais externos regulam a

expressão dos receptores de citocinas e sua responsividade, que consiste na

maioria das vezes na alteração da expressão gênica da célula alvo (Beutler, 1995;

Abbas et al., 1996; Baggiolini, 1998).

1.6.9. TNFα

O TNF é um fator de necrose tumoral, que se classifica em dois

subtipos com diferentes funções, como o TNFα e TNFβ. A célula produtora

principal do TNFα são os fagócitos mononucleares ativados, embora as células

T ativadas, as células NK e os mastócitos também podem secretar esta

Introdução

proteína. O mais importante estímulo para despertar a produção do TNFα pelos

macrófagos é o lipopolissacarídeo (LPS), liberado por bactérias gram-negativas

encontradas na maioria das infecções, desencadeando assim a produção em

grande quantidade desse fator. A citocina interferon gama (IFNγ) é produzida

pelas células T e NK, induzem os macrófagos ativados pelo LPS a sintetizar

mais TNFα (Abbas et al., 2003).

A principal função fisiológica do TNFα é estimular o recrutamento de

neutrófilos e monócitos para os sítios de infecção. O TNFα exerce esses efeitos

por atuar sobre as células endoteliais vasculares na indução da expressão das

moléculas de adesão, que tornam a superfície endotelial adesiva para os

leucócitos. Inicialmente aos neutrófilos e depois para os monócitos e linfócitos, as

moléculas de adesão mais importantes são os ligantes para as integrinas

leucocitárias e as selectinas endoteliais (Abbas et al., 2003).

O TNFα estimula as células endoteliais e os macrófagos a secretarem

quimiocinas, citocinas que induzem a quimiotaxia e recrutamento dos leucócitos.

Esse fator atua também na indução dos fagócitos mononucleares a secretar a

interleucina-1 (IL-1), que atua de modo semelhante. Acredita-se numa possível

contribuição do TNFα na redução da morte celular programada (apoptose) de

alguns tipos celulares, apesar desse mecanismo não ser bem elucidado. Suas

ações sobre o endotélio e os leucócitos são essenciais para as respostas

inflamatórias locais e aos microorganismos, a diminuição ou a ausência do TNFα

altera a capacidade de deter as infecções. Nas infecções graves, o TNFα é

produzido em grande quantidade e provoca anormalidades clínicas e patológicas

sistêmicas (Abbas et al., 2003).

Essa molécula atua sobre os hepatócitos aumentando a síntese de

certas proteínas séricas, cujo aumento constitui numa resposta de fase aguda aos

estímulos inflamatórios. A produção prolongada do TNFα determina alterações

metabólicas levando à caquexia (perda de células musculares e adiposas), que é

muitas vezes produzida pela supressão do apetite. Quando produzida em grande

quantidade, o tônus dos músculos lisos vasculares e a contratilidade do miocárdio

Introdução

são inibidos, resultando em queda da pressão sangüínea ou choque. Pode

provocar trombose vascular pela perda de propriedades anticoagulantes normais

do endotélio, causar sérios distúrbios metabólicos, como queda da concentração

da glicose no sangue em níveis incompatíveis com a vida, isso devido a super

utilização da glicose pelos músculos e insuficiência do fígado para repor a glicose

(Beutler, 1995).

A complicação da sepse bacteriana gram-negativa conhecida como

síndrome do choque séptico ou choque endotóxico, é caracterizada por colapso

vascular, coagulação intravascular disseminada e distúrbios metabólicos, devido à

produção do TNFα e outras citocinas, incluindo IL-12, IFNγ e IL-1 induzidos pelo

LPS. A concentração sérica de TNFα pode ser preditiva do prognóstico das

infecções gram-negativas graves, este é um exemplo de distúrbio no qual a

medida dos níveis de uma citocina circulante é informativa (Abbas et al., 2003).

1.6.10. IFNγ

O IFNγ é a principal citocina ativadora de macrófagos que proporciona

os meios pelos quais os linfócitos T e as células NK ativam os macrófagos para

matar os microorganismos fagocitados, exercendo assim funções criticas na

imunidade inata e adaptativa. O IFNγ é principalmente produzido pela

subpopulação de células Th1, também chamado IFN do tipo II. Possui pouca

atividade antiviral, funcionando principalmente como uma citocina efetora de ação

microbicida. As células NK secretam IFNγ em resposta ao reconhecimento de

componentes desconhecidos de microorganismos ou em resposta a IL12, assim,

o IFNγ funciona como mediador da imunidade inata. Na imunidade adaptativa as

células T produzem IFNγ em resposta ao reconhecimento de antígenos, e isso é

acentuado pela IL12 (Stark et al., 1998).

Essa citocina está envolvida na síntese de intermediários reativos do

oxigênio e do óxido nítrico, induzindo a transcrição e a produção de enzimas

necessárias, que são respectivamente a oxidase dos fagócitos e síntese de óxido

nítrico induzível, as moléculas reativas são produzidas nos lisossomos e destroem

os microorganismos contidos nos fagolisossomos(Abbas et al., 2003).

Introdução

O IFNγ estimula a expressão das moléculas MHC de classe I e II e dos

fatores co-estimulatórios presentes nas células apresentadoras de antígenos

(APCs), promovendo também a diferenciação das células T CD4+ virgens em

subpopulação Th1, e inibindo a proliferação das células Th2 (Boehm et al., 1997).

1.7. Patogênese da HIES

Desde a sua descoberta em 1966, a HIES permanece como uma

patogênese obscura. Vários estudos relatam hipóteses de como se estabeleceu

esta imunodeficiência.

As mais comuns disfunções imunológicas encontradas nos pacientes

HIES são: a elevação sorológica da IgE, a eosinófilia, diminuição da produção de

IFNγ e defeito na quimiotaxia neutrofílica. Outros trabalhos revelam outras possíveis

causas da patogênese (Jung et al., 1995; Wang et al., 2001; Kamali et al., 2003).

Para compreender melhor essa síndrome é fundamental rever conceitos

de resposta Th1 e Th2 na defesa do hospedeiro contra as infecções, embora

sujeita a críticas quando aplicadas em modelos de doenças em humanos(O'Garra,

1998). A resposta Th1 está relacionada com a defesa contra protozoários, bactérias

intracelulares e vírus, enquanto a resposta Th2 é mais efetiva contra os helmintos e

bactérias extracelulares. Essas respostas são também antagônicas, já que o IFNγ

modula negativamente a resposta Th2, comprometendo a síntese das interleucinas,

IL-4 e IL-10, que modulam negativamente a resposta Th1, permitindo uma

homeostasia no sistema imunológico. Dentre a população de linfócitos T há os que

expressam as moléculas CD4 e CD25, denominado linfócitos T regulatórios,

produtores de IL-10 e/ou fator β de crescimento transformante TGFβ, estando

envolvidas na modulação da resposta imunológica, impedindo ou diminuindo as

conseqüências das reações de hipersensibilidade e das doenças auto-imunes (Del

Prete et al., 1989; Ito et al., 2003; Ohga et al., 2003; Martinez et al., 2004; Daniels et

al., 2005; Netea et al., 2005).

Introdução

Imaizumi et al. e Chehimi et al. acreditam que ocorra um desequilíbrio

na relação Th1 e Th2 na HIES. Esses estudos relataram um aumento de IL-12, e

uma baixa expressão de ENA-78, MCP-3 e quimiocinas, o que poderia explicar

várias características da HIES, oferecendo um novo paradigma para a

compreensão desta desordem (Imaizumi et al., 1997; Chehimi et al., 2001).

O efeito inibitório exercido pelo IFNγ na resposta Th2, leva a acreditar

que a deficiência dessa citocina poderia estar envolvida na hiperprodução de IgE,

contribuindo para as complicações clínicas dos pacientes. A diminuição do IFNγ

pode estar relacionada com o desequilíbrio das subpopulações de linfócitos T

CD4+, Th1/Th2, constatado através dos níveis de citocinas e quimiocinas

características destes respectivos linfócitos, produzindo uma resposta inflamatória

defeituosa (Chehimi et al., 2001; Netea et al., 2005).

A detecção de menor expressão dos genes de IFNγ e TGFβ em células

T ativadas dos pacientes com síndrome hiper IgE demonstra que ocorre o

aumento da produção de IgE pode depender de IL-4 (Ohga et al., 2003).

Quanto a eosinofilia observada, há um relato muito interessante

onde se verificou a produção aumentada de IL-5, em células estimuladas de

indivíduos com a síndrome hiper IgE quando comparado com os controles,

esta citocina é responsável pela produção e regulação das funções dos

eosinófilos (Montoya et al., 2003).

A interleucina-18 (IL-18) é uma citocina pró-inflamatória, induz a

produção IFNγ por células T ou NK, induz Th1 e a diferenciação e supressão IgE

sintetizado pelas células B, quando atuam na resposta das células com IL-12. A

IL-18 também exibe atividades biológicas relacionadas aos eosinófilos em lesões

alérgicas (Wang et al., 2001).

Del Prete et al. têm demonstrado que as células T de pacientes HIES

ao serem estimuladas com PHA tiveram menor concentração de IFNγ do que os

indivíduos sadios. Foram estudados os mecanismos que geram este defeito e

constatou-se que não havia alteração na transcrição do m-RNA de IFNγ e nem na

tradução deste, porém, a secreção seletiva destas moléculas nos pacientes foi

insuficiente, havia acúmulo citoplasmático da citocina nos linfócitos destes

indivíduos (Del Prete et al., 1989; Ito et al., 2003).

Introdução

Netea et al. (2005) estudaram sete pacientes com HIES e sete

controles sadios, quando realizaram cultura de sangue estimulada com S. aureus

e C. albicans. Observaram uma resposta predominante Th2 e Th1 deficiente, com

diminuição da razão IFNγ /IL-10 e IL-12.

Gudmundsson et al, observaram o aumento da expressão de IL-13 nas

células T CD4+ em pacientes HIES, apresentando aumento de IgG4 e IgE

(Gudmundsson et al., 2002).

Alguns estudos revelam baixa expressão dos genes IL-17 e CXCL 11

em pacientes HIES. A IL-17 induz à produção de IL-1β e TNFα por macrófagos, e

IL-6, IL-8 e GM-CSF por células estromais, por isso, ocorre à migração e

maturação de neutrófilos e produção de proteínas pró-inflamatórias por

queratinócitos, que também estão envolvidas na osteoclastogênese. A causa

genética desta síndrome ainda não está identificada, mas sabe-se que o CXCL 11

está no cromossomo 4q 21, é uma quimiocina produzida por monócitos e

queratinócitos após estímulo com IFNγ, está envolvida na resposta inflamatória

induzindo a quimiotaxia de monócitos e ativação das células T (Grimbacher et al.,

1999; Tanaka et al., 2005). A redução da quimiotaxia neutrofílica freqüentemente

descrita tem origem provavelmente nos defeitos das células T (Hill et al., 1974;

Donabedian and Gallin, 1982; Larsen et al., 1989). A diminuição da expressão de

ENA-78 e IL-8 podem contribuir para a deficiência na atividade da quimiotaxia

neutrofílica (Larsen et al., 1989; Imaizumi et al., 1997).

Estudos mostram que há uma sensível melhora na quimiotaxia dos

neutrófilos se forem incubados com IFNγ recombinante, mostrando assim o papel

desta citocina também na quimiotaxia (Hill, 1993).

Até o momento, não existem trabalhos que descrevem como células

NK se comportam na HIES. Como a síndrome frequentemente envolve infecção

por bactérias como o S. aureus, é pertinente questionar se as células NK podem

estar alteradas nesse contexto, tanto participando dos eventos desencadeadores,

como em conseqüência das infecções recorrentes. O presente trabalho utilizou

um modelo de avaliação de células NK desenvolvido em nosso laboratório para

estudar três casos da rara AD-HIES, identificados no Departamento de Pediatria

da UNIFESP.

Introdução

1.8 Objetivos

1. Caracterizar fenotipicamente as células NK em pacientes com AD-

HIES, comparando com grupo de controles normais.

2. Avaliar funcionalmente as células NK em pacientes com AD-HIES,

comparando com grupo de controles normais.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e Métodos

2.1. Casuística

O projeto seguiu os trâmites exigidos pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Foram incluídos três

pacientes portadores de AD-HIES, e onze voluntários saudáveis. Todos os

participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE)

antes de serem incluídos no estudo (Anexo I).

Paciente número 1: Criança do sexo masculino, nascida em

02/12/2000, residente em Fortaleza, CE, cuja amostra do sangue utilizada foi

obtida em 07/03/2006. Teve pré-natal e nascimento sem intercorrências,

evolução mental normal, sem consangüinidade e nem imunodeficiências na

família, mas sofre com infecções de repetição desde os 4 meses de vida,

quando apresentou seu primeiro episódio de pneumonia. Outros episódios se

repetiram aos 7 meses, 1 ano e 2 meses, 2 anos e 9 meses, e com 2 anos e 11

meses. Na última vez, apresentou sepse, derrame pleural, pneumatocele e

pneumotórax. Apresentou também otites de repetição a partir de 1 ano,

bronquite catarral por quatro vezes, amidalites e infecções cutâneas em cerca

de 5 vezes cada, e sinusites por quatro vezes. Apresentou eczema facial desde

os dois meses de idade. Atualmente faz uso constante de antibióticos. O

diagnóstico de HIES foi feito em março de 2003 quando o nível sérico de IgE

atingiu o valor de 2130 UI/mm

, a contagem de eosinófilos constou 370, os dados

obtidos no histórico do paciente permitiu uma pontuação no sistema de contagem

fenotípica constatando a doença autossômica dominante, e entre 2004 e 2005

apresentou outras intercorrências como infecção por Rotavírus, piora de eczemas

e pústulas, infecções das vias aéreas superiores, constipações, gastrenterites,

vômitos, diarréias, entre outras. Os exames laboratoriais mostraram apenas IgE

aumentada superior à 1150 UI/ml ( valor de referência é inferior à 60 UI/ml),

além de ausência de anticorpos antitetânicos e antipneumocócicos após

vacinação, com número adequado de linfócitos T totais, células CD4+ com

contagens normais e células T CD8+ abaixo do normal. Contagem de linfócitos

B mantém-se normais, mas apresenta redução do número de células NK 85,2

células/mm

(valor de normalidade_VN para a idade é de 130-720).

Materiais e Métodos

Paciente número 2: Adulto de vinte anos, do sexo masculino, nasceu

em 27/02/1987, com amostra sangüínea para o estudo obtida em 16/09/2005.

Residente de São Gonçalo, RJ, relata ausência de consangüinidade e de

imunodeficiências na família. Com doença granulomatosa crônica, dermatites,

infecções secundárias, apresentaram três fraturas ósseas em dois meses.

Exames mostram IgE elevado, em 1993 IgE de 11160 UI/ml, 1999 23348 UI/ml, e

depois >4000, em 2005 1084 UI/ml a ausência de viragem sorológica após

vacinação, quimiotaxia neutrofílica e fagocitose normais, radiografia de tórax com

imagem cicatricial no pulmão direito de abscesso pulmonar. Histórico compatível

com quadro de contagem fenotípica para HIES autossomal dominante, células NK

94,0 células/ mm

(VN 70-480).

Paciente número 3: Adulto de vinte e nove anos, do sexo masculino,

que nasceu em 02/04/1978 e forneceu amostra de sangue para este trabalho em

09/09/2005. Natural de Cruzeiro, SP, com um mês de vida apresentou dermatite

no couro cabeludo, face e pescoço, e no segundo mês bronquite. Dos quatro

meses a 1 ano, teve episódios repetidos de otites, diarréias, pneumonias,

monilíase, estomatite, além de dermatites seborrécas atópicas graves. Entre um e

três anos de vida apresentou abscessos freqüentes necessitando de drenagem

cirúrgica e várias pneumonias, sendo que uma causou derrame pleural com

drenagem torácica. A partir dos quatro anos, os quadros de abscessos evoluíram,

inclusive hepático, que complicou com colite, orquite, meningite e sepse. Com 10

anos, a psoríase e abscesso no hipogástrio conduziram a uma investigação mais

detalhada e foi diagnosticada HIES, quando começou a fazer uso profilático de

antibióticos por três anos com uma resposta regular. Em 1995 foi indicado o uso

de imunoglobulina intravenosa devido à deficiência grave de resposta humoral.

Apesar disso e do uso de co-trimoxazol contínuo, desenvolveu abscesso

pulmonar em 2003, que evoluiu crônica e gravemente, de modo que ainda

permanece com a cavidade pulmonar aberta. Na última cultura de secreção

pulmonar, houve crescimento de C. albicans em julho de 2005, e a infecção já

está controlada. O quadro do Scoring (contgem) fenotípica valida este diagnóstico

também como AD-HIES, valor das células NK estava em torno de 120 células/

(VN 70-480).

Materiais e Métodos

2.2. Recrutamento

Os voluntários portadores de AD-HIES foram recrutados no

Ambulatório de Imunopediatria, do DIPA (Disciplina de Infectologia), UNIFESP, e

os voluntários saudáveis foram recrutados no próprio laboratório, após assinatura

de TCLE.

2.3. Coleta das amostras

Foram coletados 5 à 10 ml de sangue dos participantes através de

punção de veia periférica em membro superior, após cuidadosa assepsia local e

encaminhada ao laboratório de Imunologia II, para a separação de células

mononucleares do sangue periférico (PBMC), que após o processamento foram

armazenadas em criotubos, na quantidade de 1 x 10

por criotubo, sendo

preservadas em nitrogênio líquido até a realização dos experimentos.

2.4. Procedimentos laboratoriais

Os ensaios laboratoriais foram realizados no Laboratório de Imunologia

II da Disciplina de Infectologia da UNIFESP.

2.4.1. Separação de células mononucleares do sangue periférico

Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram preparadas

a partir da obtenção de amostras de sangue periférico coletadas em EDTA,

utilizando-se a técnica de gradiente de densidade de sedimentação pelo ficoll

paque plus.

O sangue coletado foi diluído em solução balanceada de Hank (HBSS,

Gibco, Grand Island, NY, EUA) na proporção 1:1 e cuidadosamente depositada

sobre camada de gradiente de densidade (Ficoll-Paque, Pharmacia LKB

Biotechnology Inc., Uppsala, Suécia), sendo centrifugado 2000 rpm por 40

minutos. Após separação pelo gradiente de densidade, forma-se uma camada

Materiais e Métodos

esbranquiçada que são as células de PBMC, são transferidas para outro tubo, e

lavada duas vezes com HBSS, resuspendidas em meio de cultura R10, composto

de RPMI 1640 (Gibco), suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado

pelo calor (HyClone Laboratories, Inc. Logan, UT, EUA), 2mM L-glutamina

(Gibco), 10mM de tampão Hepes (Gibco), 100U/mL penicilina e 100ug/mL

estreptomicina. A suspensão de células é diluída 1:10 em Azul de Tripan e são

contadas em Câmara de Neubawer, novamente centrifugadas, e ressuspensas

em RPMI são congeladas em criotubos na quantidade de 1 x 10

por criotubo em

soro fetal bovino, suplementado com 10% de dimetil-sulfóxido (DMSO, Sigma),

distribuídas em criotubos e congeladas a –70ºC. Após 24 horas, foram

transferidas para tanque de nitrogênio líquido.

2.4.2. Imunofenotipagem

Com o objetivo de estudar a expressão funcional das células NK, as

amostras colhidas foram processadas para a realização de imunofenotipagem

através da técnica de citometria de fluxo, utilizando-se o FACSCanto, equipado com

software FACSDiva (BD Biosciences). Anticorpos conjugados com cromógenos

específicos foram utilizados, de acordo com os painéis descritos na Tabela 2.

Tabela 1. Painéis utilizados na marcação de superfície e para ensaios funcionais

com células NK

Fluorocromo* Painel 1 Painel 2 Painel 3 Painel 4 Painel 5

FITC

DX9(KIR3DL) CD94 CD57 Perforina CD107

Z27(DL1/DS1) NKG2C NKp44 NKp30 TNF-α

APC

NKG2D NKG2A CD161 NKp46

IFNγ

PerCP

Coquetel de

CD14, CD19 e

CD3

Coquetel de

CD14, CD19 e

CD3

Coquetel de

CD14, CD19 e

CD3

Coquetel de

CD14, CD19 e

CD3

Coquetel de

CD14, CD19 e

CD3

PE-Cy7

CD56 CD56 CD56 CD56 CD56

APC-Cy7

CD16 CD16 CD16 CD16 CD16

* FITC: tio-cianato de fluoreceína; PE: fico-eritrina; APC: Aloficocianina; PerCP: proteína clorofila

peridina; PE-Cy7: fico-eritrina carbocina 7; APC-Cy7: Aloficocianina carbocina 7.

Materiais e Métodos

Abaixo, estão especificados os clones e quantidades de anticorpos

monoclonais utilizados nos painéis.

Painel comum:

- Foi composto de 1ml de CD3 PerCP (catálogo número 347344, Becton

Dickinson [BD]), 1ml de CD14 PerCP (BD 340585) e 1ml de CD19 PerCP (BD

340421);

- 500ul do CD16 APC-Cy7(BD 557758);

- 500ul de CD56 PE-Cy7 (BD 557747).

Painel 1:

- Além do painel comum, 1ml de DX9 (BD 340483), 1ml de Z27 (Beckman

Coulter-PN IM3292), e 1ml do NKG2D e (Bioscience FAB139A).

Painel 2:

- Além do painel comum, 2ml de CD94 (BD 555888), 1ml de NKG2C (FAB 138P),

e 1ml do NKG2A (FAB1059A).

Painel 3

- Além do painel comum, 1ml de CD57 (BD 347393), 1ml de NKp44 (PN IM3710),

e 2ml do CD161 (BD 550968).

Painel 4

- Além do painel comum, Perforina (catálogo número 11-9994-73, e Biosciences),

1ml de NKp30 (PN IM3709), e 2ml do NKp46 (BD 558051).

Painel 5:

- Além do painel comum, 2ml de CD107a (BD 555800), 1ml de TNF-α (BD

340512), e 500ul de IFNγ (BD 554702).

Materiais e Métodos

Os materiais adicionais necessários para a realização desta

imunofenotipagem foram meio R15 (RPMI suplementado com 15% de soro fetal

bovino), tampão FACS (PBS/ 0,5% BSA / 2mM EDTA), esferas para

compensação FACS (anti-Ig de rato, K/ partículas de compensação e controle

negativo, BD Biosciences catálogo número 552843), PFA 2% em PBS, FACS 1x

(solução de permeabilização FACS 2 (10x, BD340973), brefeldina A (Sigma B-

7651, 5mg. preparada em 10 mg/ml em DMSO), Golgi Stop (BD 554724, usado a

1:6400), IL-12 (recombinante humano, 100ng/ml, células K-562, a 1 x 10

/ml em

meio R15, placas com 96 poços fundo-V e placas com 96 poços fundo-U.

2.4.3. Expansão de células K562

As células K 562 são de linhagem de célula leucemia humana crônica,

de crescimento rápido, mantidas em suspensão em cultura. Quando as células

atingiram o seu crescimento total, foram coletadas em um tubo cônico estéril e

centrifugadas 1500 rpm por 8 minutos. As células foram suspendidas em 5 ml de

RPMI, desta suspensão diluiu-se 10µl em 90µl de Azul de Tripan para a

quantificação em hemocitômetro, onde após contagem em microscópio

multiplicamos pelo título da diluição feita, pelo volume da suspensão e pelo fator

de correção da Câmara de Neubawer. O volume correspondente à 1.10

células

foi transportado para um novo frasco e mantido em cultura com o meio de cultura

RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal, até a utilização nos

experimentos de estimulação de células NK.

2.4.4. Protocolo para estimulação e marcação do painel

funcional das células NK

Os PBMCs foram descongelados de acordo com o protocolo padrão e

as células foram contadas. Ressuspendemos em 4 x 10

células/ml (na placa

colocamos 100µl da suspensão celular ou 4 x 10

células / poço). Foram

colocados 100µl da suspensão celular por poço em placa com fundo U para

cultura. Os estímulos celulares foram diluídos em meio R15 conforme a Tabela 2:

Materiais e Métodos

Tabela 2. Estímulos para verificação da funcionalidade de células NK

Estímulo Concentração

do estoque

Concentração

final

Concentração

final em dobro

Máster mix

(adicionado

estoque)

Anti-CD107

FITC

Nenhum 1:25

SEB 100 µl/ml 1,0 µg/ml 2,0 µg/ml 20 µl/ml 1:25

IL-12 2,0 mg/ml 50 ng/ml 100 ng/ml 2,0 µl/ml 1:25

Células K-562 8,0x10

/ml 8,0x10

/100µl 1:10

Foram adicionados 100µl do meio de estimulação por poço, e no poço

apropriado foi pipetado e homogeneizado com a pipeta 2-3 vezes. As amostras

FMO não foram estimuladas e claro não se colocou anti-CD107 FITC no poço

controle FMO FITC.

FMO é realizado para uma melhor definição das regiões (gates) que

serão separados, constituído de células marcadas com anticorpos conjugados

com as fluoresceínas presentes no painel analisado menos uma das

fluorecências, isso é feito para cada cor presente no experimento, possibilitando

assim a confirmação das regiões escolhidas para determinação das populações

marcadas para análise.

A placa foi incubada à 37ºC, 5% CO

por 18 horas, centrifugada após

em 1500 rpm por cinco minutos. Removeu-se o sobrenadante da superfície dos

poços, com cuidado para não desprender as células do fundo. Adicionou-se 50µl

de uma solução R15 contendo brefeldina A 4% e Golgi Stop. Foi pipetada a

mistura de anticorpos monoclonais contra marcadores de superfície celular. Após

o final da incubação de 5 horas, as células foram transferidas para a placa de 96

poços com fundo em V, sendo centrifugadas e lavadas com tampão FACS.

Acrescentou-se 50µl de esferas de compensação (beads de

compensação) para os poços destinados para esse fim. Para preparar as esferas

de compensação, adicionou-se 7 a 8 gotas de cada partícula de compensação e

esferas controles (BD Biosciences Cat.# 552843) em 500µl de tampão FACS.. Foi

preparado o mix de anticorpos para cada painel de controle e para os poços FMO

Materiais e Métodos

preparou-se uma mistura de anticorpos que incluíam anticorpos CD3, CD56,

CD16, CD14, CD19.

A placa de amostras foi centrifugada por três minutos a 1750 rpm, a

4ºC. Aspirou-se o sobrenadante. Foi adicionado 50µl dos anticorpos de marcação

nos poços apropriados. Para as amostras FMO foram adicionados 50µl de mistura

para o FMO e 5µl de cada anticorpo indicado. Adicionou-se 1µl do anticorpo

indicado nos poços de compensação.

As amostras foram incubadas no gelo por 30 minutos e lavadas 3x com

tampão FACS. Fixadas as células com 150µl de PFA 2%, deixadas no gelo por 15

minutos. Lavou-se uma vez com tampão FACS. As células para os painéis 1, 2, e

3 foram finalizadas colocando-se 150µl de PFA 2%, transferidas para os tubos de

análise FACS. As amostras têm um prazo de 72 horas para serem analisadas. O

painel 4 requer marcação intracelular que foi processada de acordo com o

próximo passo.

Ressuspendidas as células em 50µl de solução de permeabilização,

elas foram deixadas em temperatura ambiente por 10 minutos. Foram

acrescentados 150µl de tampão FACS, centrifugou-se e aspirou-se o

sobrenadante. Neste estágio as células são muito escorregadias, devido ao

tampão de permeabilização não formando o sedimento celular no poço. Então, o

sobrenadante foi aspirado com muito cuidado. As células foram ressuspendidas

em 50µl da solução de anticorpos contendo o TNFα PE 1:20 e IFNγ APC 1:2000

(diluídos em tampão FACS). Incubou-se no escuro e no gelo por 30 minutos,

foram então lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspendidas em 150µl

de PFA 2% e transferidas para os tubos FACS para análise no citômetro de fluxo.

2.5. Análise de Dados e Análise Estatística

A análise dos dados adquiridos a partir de cada amostra foi realizada

através do software FlowJo (Tree Star), transformando a representação gráfica

Materiais e Métodos

gerada a partir da captação da intensidade das cores em porcentagens, na

subpopulação pré-selecionada, baseada nas suas propriedades físicas de

dispersão frontal e lateral de luz.

Os resultados dos ensaios laboratoriais foram analisados descrevendo

a proporção das subpopulações de células NK, bem como a média de intensidade

de fluorescência (MFI) do fluorocromo de interesse, por meio de um programa

construído em ambiente Windows para posterior transferência ao programa

Statistica, versão 6.0 (StaSoft, Inc., Tulsa, OK, EUA).

A análise estatística dos resultados obtidos a partir dos voluntários

saudáveis e portadores do HIES, foi realizada através de método não paramétrico

de classificação de valores de Mann-Whitney. Para variáveis com p<0,05 foi.

3. RESULTADOS

Resultados

3.1. Características dos voluntários

Foram incluídos 14 voluntários neste estudo, sendo 11 voluntários

saudáveis e três portadores de HIES. Informação referente ao sexo, e número de

CD3, CD4 e CD8 por mm

de cada voluntário não foram relevantes nesta tese.

Não houve diferença significante no número de CD3, CD4 ou CD8 dentre os

voluntários pertencentes aos grupos Controle e HIES.

3.2. Porcentagem de células NK

Os eventos adquiridos em citômetro de fluxo com dispersão frontal e

lateral de luz característico de linfócitos foram selecionados através da criação de

uma região de análise, sendo caracterizados como linfócitos T, Linfócitos B,

granulócitos, monócitos e macrófagos, que foram excluídos da análise. Desta

forma, a subpopulação que nos interessa é a CD56+ e ou CD16+, de acordo com

o demonstrado na Figura 1.

Em um segundo momento, foi realizada a categorização dos subgrupos

de células NK, baseados na expressão os marcadores CD56 e CD16. Foram

identificados três grupos de células: CD56

high

, expressando altos níveis de CD56

e CD16 negativo ou baixo, CD56

dim

, a maioria das células NK, e CD56-, que

expressam também CD16 (Figura 1).

Resultados

Figura 1. Estratégia de análise de células NK por citometria de fluxo. (A) Os linfócitos foram

identificados empregando a dispersão lateral de luz (side scatter) e coquetel de anticorpos

para exclusão de células T, B e monócitos. A seguir, foram excluídas as células CD56-

CD16- e identificadas as populações de células NK CD56

high

, CD56

dim

e CD56-. (B) Os

marcadores específicos de células NK foram avaliados com anticorpos monoclonais

específicos conjugados com fluorocromos FITC, PE e APC. Para determinar a região de

positividade, foi empregada a estratégia de fluorescence minus one (Roederer, 2001), e

foram identificadas as amostras positivas para os diferentes receptores.

Área de

linfócitos

Exclusão de

células T, B e

monócitos

Exclusão de

CD56-CD16-

Sub-popoulações

de células NK

Determinação de

área de análise

utilizando

fluorescence

minus one (FMO)

Marcação com

anticorpos

específicos e

determinação de

positivos

Canal FITC Canal PE Canal APC

Resultados

3.3. Análise fenotípica de células NK

Inicialmente, avaliamos a freqüência de células NK nos pacientes com

AD-HIES, comparando com os controles. Enquanto que a mediana do percentual

de células NK entre os linfócitos totais foi de 20,7% (variação inter-quartil 25-75%:

15,2 - 24,4%), os três pacientes apresentaram percentuais de 10,3%, 9,46% e

4,9% para os casos 1, 2 e 3, respectivamente (p<0,05). A distribuição, contudo,

das proporções dos fenótipos CD56

high

, CD56

dim

e CD56- não foi diferente quanto

comparamos o grupo controle com os pacientes com AD-HIES (Tabela 3).

Tabela 3. Distribuição do percentual de subpopulações das células NK no grupo

controle e em pacientes com AD-HIES.

% CD56

high

% CD56

dim

% CD56-

Controles/ mediana/ 3,0 76,9 19,0

(interquartis 25-75%) (1,8 - 4,0) (75,1 - 80,7) (12,6 - 21,5)

Caso 1 2,66 84,1 12,8

Caso 2 1,47 76,6 21,5

Caso 3 3,07 85,7 10,9

Uma vez efetuada a mensuração do número de células no sangue

periférico, foi realizada a análise dos gráficos das CD56+ e também das CD16+

em cada painel com relação à cada marcador utilizado nos painéis de

fenotipagem de superfície.

Dentre os diferentes receptores de células NK, dois mostraram-se com

expressão diferente em pacientes com AD-HIES. O receptor que apresentou

resultados mais discrepantes entre os pacientes e controles foi o NKp30,

relacionado com a proteção viral ou tumoral desempenhado pela célula NK. Sua

expressão foi superior nos pacientes quando analisamos as células NK totais,

resultado explicado pela maior expressão em CD56

dim

e CD56

high

(Figura 2) O

receptor NKp44, expressado em maior nível na superfície de células NK CD56

high

Resultados

de pacientes quando comparado com controles (p=0,0128, Figura 2). O

percentual de células NK que expressaram o receptor NKp46 também foi maior

nos pacientes com AD-HIES quando comparado com o grupo controle, mas não

foi diferente quando as subpopulações de células NK foram analisadas

separadamente (Figura 2). Não foi identificada diferença na expressão dos

demais marcadores de superfície empregados nos painéis de fenotipagem.

Figura 2. Expressão dos receptores NKp30, NKp44 e NKp46 em células NK. As

subpopulações de NK CD56

dim

, CD56

bright

e CD56-. Os valores estão expressos em

percentuais. A significância estatística das diferenças foram determinadas pelo teste não

paramétrico de Mann-Whitney.

Control Hyper IgE

p=0.0618

Control Hyper IgE

p=0.0868

Control Hyper IgE

p=0.0128

Control Hyper IgE

p=0.1612

Control Hyper IgE

p=0.0430

Control Hyper IgE

p=0.0293

Control Hyper IgE

p=0.0196

Control Hyper IgE

p=0.6404

Células NK

totais

Sub-populações de células NK

CD56

dim

CD56

high

CD56-

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

neg

% de céls. NK CD56

high

Controle HIES

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

NKp44

Control Hyper IgE

p=0.2130

Control Hyper IgE

p=0.0618

Control Hyper IgE

100

p=1.000

Control Hyper IgE

p=0.7555

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

HIES HIES

Controle

NKp46

% de céls. NK

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

HIES HIES

Controle

NKp30

Control Hyper IgE

p=0.0618

Control Hyper IgE

p=0.0868

Control Hyper IgE

p=0.0128

Control Hyper IgE

p=0.1612

Control Hyper IgE

p=0.0430

Control Hyper IgE

p=0.0293

Control Hyper IgE

p=0.0196

Control Hyper IgE

p=0.6404

Células NK

totais

Sub-populações de células NK

CD56

dim

CD56

high

CD56-

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

neg

% de céls. NK CD56

high

Controle HIES

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

NKp44

Control Hyper IgE

p=0.2130

Control Hyper IgE

p=0.0618

Control Hyper IgE

100

p=1.000

Control Hyper IgE

p=0.7555

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

HIES HIES

Controle

NKp46

Control Hyper IgE

p=0.2130

Control Hyper IgE

p=0.0618

Control Hyper IgE

100

p=1.000

Control Hyper IgE

p=0.7555

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

HIES HIES

Controle

NKp46

% de céls. NK

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

HIES HIES

Controle

NKp30

Resultados

3.4. Marcadores funcionais de células NK

Para avaliar seu comportamento funcional em ambos os grupos,

avaliamos a produção constitucional de citocinas pelas células NK após

incubação, sem a utilização de estímulos, com os resultados apresentados na

Figura 3.

Figura 3. Expressão de perforina e CD107a nas células NK. A produção de CD107a foi

determinada após incubação, sem ou com estímulo com células K562. Os valores estão

expressos em percentuais. A significância estatística das diferenças foram determinadas

pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney.

A expressão de perforina foi inferior entre as células NK CD56- nos

pacientes com AD-HIES, quando comparados aos controles (Figura 3), embora

não tenha sido entre as células NK totais e CD56

high

ou CD56

dim

Control Hyper IgE

p=0.0293

Control Hyper IgE

p=0.0196

Control Hyper IgE

p=0.0128

Control Hyper IgE

p=0.3502

Control Hyper IgE

CD56

CD107

Control Hyper IgE

p=0.0430

Control Hyper IgE

p=1.000

Control Hyper IgE

p=0.5334

Control Hyper IgE

p=0.0868

Células NK

totais

Sub-populações de células NK

CD56

dim

CD56

high

CD56-

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

neg

% de céls. NK CD56

high

Controle HIES

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

CD107a

s/ estímulo

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

Controle HIES Controle

HIES Controle HIES HIESControle

CD107a

após K562

% de céls. NK

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

HIES HIES

Controle

Perforina

Control Hyper IgE

p=0.0293

Control Hyper IgE

p=0.0196

Control Hyper IgE

p=0.0128

Control Hyper IgE

p=0.3502

Control Hyper IgE

CD56

CD107

Control Hyper IgE

p=0.0430

Control Hyper IgE

p=1.000

Control Hyper IgE

p=0.5334

Control Hyper IgE

p=0.0868

Células NK

totais

Sub-populações de células NK

CD56

dim

CD56

high

CD56-

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

neg

% de céls. NK CD56

high

Controle HIES

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

CD107a

s/ estímulo

% de céls. NK

% de céls. NK CD56

dim

% de céls. NK CD56

high

% de céls. NK CD56

neg

Controle HIES Controle

HIES Controle HIES HIESControle

CD107a

após K562

% de céls. NK

Controle

HIES

Controle

HIES

Controle

HIES HIES

Controle

Perforina

Resultados

Após a incubação sem estímulo específico, não foi observada diferença

na percentagem de células marcadas com CD107, marcador de degranulação

celular. Por outro lado, observou-se aumento significante no percentual de células

CD107a+ nas células NK totais e entre as sub-populações CD56

dim

, CD56

high

CD56

nos pacientes com AD-HIES em comparação aos controles.

4. DISCUSSÃO

Discussão

Os resultados apresentados neste trabalho confirmam as suspeitas de

redução de células NK em pacientes com HIES. Fomos capazes de demonstrar

redução significativa do percentual destas células, mas não foi possível identificar

se essa diferença estaria concentrada em alguma subpopulação particular de

células NK, separadas baseado na expressão diferencial de CD56 e CD16.

Foi também possível verificar que a freqüência de células NK positivas

para os receptores NKp44, NKp30 e NKp46, associados a citotoxicidade, estava

aumentada entre diferentes subpopulações de células NK, em percentual maior

nos pacientes com HIES.

Quando avaliamos a atividade funcional das células NK, verificamos

que apresentam, em geral, maior atividade em pacientes com HIES,

especialmente quando as células foram estimuladas com a linhagem K562

sensíveis à ação citotóxica mediada por células NK.

Inicialmente, fica claro que as células NK estão envolvidas na

fisiopatogênese da HIES. Sua diminuição percentual poderia sugerir que

estivessem reduzidas em conseqüência da doença. Os dados complementares de

nosso trabalho, entretanto, demonstrando o aumento de receptores da sinapse

imunológica de células NK, maior expressão de perforina e maior expressão do

marcador de degranulação CD107a em resposta ao estímulo com a linhagem

K562, apontam para a possibilidade de que tais células continuam funcionais e

estão estimuladas no contexto da HIES. A redução percentual das células NK

vista nos pacientes pode refletir migração celular para sítios que requerem sua

ação, em contraponto à simples “perda” destas células. De fato, as células NK

estão distribuídas por todo o corpo, constituindo 5-20% dos linfócitos no baço,

fígado e sangue periférico, além de estarem presentes em menor proporção na

medula óssea, timo e linfonodos (Lian et al., 2002). É natural imaginar que podem

ser ativadas de forma diferente nos diferentes compartimentos teciduais, em

especial os agredidos durante o processo infeccioso ou que concentram maior

quantidade de patógenos e antígenos.

Discussão

O aumento da expressão destes três receptores, NKp30, NKp40 e

NKp46, sugerem que as células NK de pacientes com HIES devem estar

desempenhando forte atividade citotóxica. Esta hipótese pode ser reforçada pela

maior expressão de perforina, além de CD107 em resposta ao estímulo com

células da linhagem K562. O que não é possível afirmar é se essa maior atividade

citotóxica é conseqüência direta da HIES ou secundária a infecções repetidas

vistas nesses pacientes. Talvez nos ajudaria responder essa pergunta se outro

grupo controle, representativo de outra doença ou condição com infecções

recorrentes, fosse incluído em nosso estudo. De fato, é natural imaginar que as

células NK seriam muito exigidas na ocorrência de diferentes infecções

bacterianas, fúngicas e, principalmente, virais.

Hoje está claro que as células NK reconhecem alvos que apresentam

níveis reduzidos ou formas anormais de moléculas do complexo principal de

histocompatibilidade (major histocompatibility complex, MHC) da classe I

(Ljunggren et al., 1985) e/ou proteínas “induzidas pelo stress” (Bauer et al., 1999).

Ao contrário do que acontece com os linfócitos T CD8+ citotóxicos, as células NK

não necessitam de reconhecimento de antígenos específicos derivados dos

patógenos para executar sua atividade citotóxica; ao contrário, sua ativação

depende da ligação a receptores de superfície em combinação com ação de

citocinas pró-inflamatórias. A expressão dos diversos receptores na superfície das

células NK é resultado de um equilíbrio muito preciso entre moléculas com sinal

inibitório ou de ativação em resposta a muitos receptores das família de

imunoglobulinas e da família de lectinas do tipo C (Takeichi et al., 1997; Lanier,

1998; Cerwenka and Lanier, 2001; Takei et al., 2001; Borrego et al., 2002).

É possível que outras doenças ou condições que cursem com

infecções de repetição cursem com aumento da capacidade funcional de células

NK. Vários grupos foram capazes de demonstrar que são importantes na

limitação da replicação do vírus da hepatite C (Li et al., 2004; Koziel, 2006), vírus

da imunodeficiência humana (Fauci et al., 2005), vírus da dengue (Shresta et al.,

2004) e vírus da febre amarela (Quaresma et al., 2006). As células NK, portanto,

são importantes para o controle de diversas viroses e, curiosamente, diversas

Discussão

viroses vêm desenvolvendo estratégias para dissuadir a resposta por essas

células (Crotta et al., 2002; Tseng and Klimpel, 2002; Meier et al., 2005).

Uma crítica cabível aos resultados é que não temos elementos para

demonstrar que as células NK dos pacientes com HIES que estudamos

desempenham maior atividade citotóxica. A expressão de perforina e CD107a são

tidos por retratar atividade citotóxica. Com isso, pela primeira vez, estamos sendo

capazes de sugerir que a imunidade inata nestes pacientes pode estar tentando

compensar o defeito imunitário secundário à doença. A ação destas células

parece estar fortemente relacionada a maior atividade citotóxica, que pode ser

compensatória ao defeito imunológico visto em pacientes com HIES.

5. CONCLUSÕES

Conclusões

1. O percentual de células NK entre os linfócitos totais está reduzido

em pacientes com AD-HIES quando comparado com voluntários

saudáveis.

2. Não foi possível identificar diferenças na distribuição das

subpopulações CD56

high

, CD56

dim

e CD56- de células NK de

pacientes com AD-HIES.

3. O percentual de diferentes subpopulações de células NK que

expressam os receptores NKp30, NKp44 e NKp46 está aumentado

em pacientes com HIES quando comparados a voluntários

saudáveis, especialmente o receptor NKp30.

4. A expressão de perforina está aumentada em células NK CD56

high

CD56

dim

de pacientes com AD-HIES, quando comparados com

voluntários saudáveis. Um percentual maior dessas mesmas

subpopulações de células NK de pacientes com AD-HIES expressa

CD107a após estímulo com células da linhagem K562.

5. Estes resultados apontam para maior atividade citotóxica de células

NK em pacientes com HIES, quando comparado com voluntários

saudáveis.

6. ANEXOS

Anexos

Carta de submissão do projeto ao CEP

Anexos

Amostra Grupo

Sexo

Idade

Freq de linf

NK Total

Freq de

CD56bright

cel NK

Freq de

CD56dim

cel NK

Freq de

CD56 neg

cel NK

CD107 sem

estímulo

IFN-g sem

estímulo

TNF-a sem

estímulo

CD107est

com K-562

IFN-g est

com K-562

TNF-a est

com K-562

CD107 est

com HSV2

IFN-g est

com HSV2

CN101

CONTROLE

31.50

21 1.1 77.7 21.3 55.0 0.3 0.2 49 1.1 1.3 72 0.5

CN102

CONTROLE

29.90

20.7 5.34 81.4 12.3 33.7 1.8 0.15 52.1 2.44 1.91 34.1 1.82

CN103

CONTROLE

48.47

13.8 3.7 76.9 19.0 55.5 1.4 0.4 61.3 1.2 2.2 55.2 1.2

CN104

CONTROLE

40.52

23.5 8.36 75 12.8 33.3 1.70 0.21 62.7 3.23 1.62 34.8 1.4

CN105

CONTROLE

35.01

26.9 4.26 87.2 7.07 39 1.81 0.27 52.9 2.94 1.09 31.7 1.57

CN106

CONTROLE

49.03

13 2.4 72.2 25.6 45.0 0.5 0.2 60 0.7 1.0 60.5 0.7

CN EC

CONTROLE

13 1.3 57.3 41.7 56.5 1.0 0.3 58 0.4 1.0 63 0.6

CN 202

CONTROLE

21.15

16.6 2.97 75.1 21.7 43.5 0.33 1.03 56.6 1.56 3.43 60.7 0.39

CN 204

CONTROLE

31.92

22 3.7 76.9 19.1 51.4 0.9 0.51 74 0.39 1.3 54.5 0.44

CN 203 CONTROLE

24.25

25.2 2.64 89.4 7.9 53.8 0.45 0.29 44.7 1.15 1.5 56.1 0.5

CN 421

CONTROLE

M21

37.5 0.990 79.9 18.5 49.1 0.42 0.25 67.7 0.29 0.79 53 0.31

Amostra Grupo

Sexo

Idade

Freq de linf

NK Total

Freq de

CD56bright

cel NK

Freq de

CD56dim

cel NK

Freq de

CD56 neg

cel NK

CD107 sem

estímulo

IFN-g sem

estímulo

TNF-a sem

estímulo

CD107est

com K-562

IFN-g est

com K-562

TNF-a est

com K-562

CD107 est

com SEB

IFN-g est

com SEB

Caso 1 Hiper IgE

M27

10.3 2.66 84.1 12.8 41.5 0.18 0.33 62.7 0.31 0.92 41.2 0.28

Caso 2 Hiper IgE

M19

9.46 1.47 76.6 21.5 41.1 0.18 0.370 77.9 0.35 1.23 46.7 0.28

Caso 3 Hiper IgE

4.9 3.0785.710.963.50.530.5882.70.932.0864.50.65

PLANILHA COM OS DADOS DE CÉLULAS NK NA SÍNDROME HIPER IgE

Anexos

Amostra

TNF-a est

com HSV2

CD107 est

com HIV

IFN-g est

com HIV

TNF-a est

com HIV

Total NK

DX9+

Total NK

NKG2D+

Total NK

Z27+

CD56bright

DX9+

CD56bright

NKG2D+

CD56bright

Z27+

CD56dim

DX9+

CD56dim

NKG2D+

CD56dim

Z27+

CD56neg

DX9+

CD56neg

NKG2D+

CN101 0.1 56 0.8 0.3 8.9 4.9 11.3 3.0 20.2 4.0 11.9 5.6 14.5 1.6 2.0

CN102 0.2 35.7 4.47 0.41 6.04 3.71 6.84 3.77 17.1 4.05 6.88 3.33 7.89 1.76 0.55

CN103 0.4 58.8 2.5 0.4 9.1 2.9 12.6 8.9 15.0 14.1 10.9 3.1 15.4 3.4 1.7

CN104 0.24 36.7 4.67 0.62 2.7 2.8 3.08 2.77 8.25 3.21 2.64 2.51 3.44 3.65 1.01

CN105 0.3336.33.930.4715.13.4415.910.117.211.115.92.9517.110.61.71

CN106 0.2 55 0.2 0.2 0.6 4.2 2.0 1.3 5.0 3.8 0.6 4.4 4.6 1.6 3.5

CN EC 0.3 65 1.7 0.3 3.3 1.7 6.0 5.9 0.0 5.9 6.4 2.2 10.1 0.7 1.0

CN 202 3.11 37.7 1.65 1.01 4.57 37.8 2.24 0.12 92.3 9.02 4.53 41.9 2.16 4.57 37.8

CN 204 0.44 58.6 1.16 0.63 8.05 19.9 11 1.83 93 4.18 9.42 19.7 13.5 8.05 19.9

CN 203

0.45 55.1 0.990 1.07 8.64 15.2 10.7 1.24 86.1 2.39 9.37 14.5 11.6 8.64 15.2

CN 421 0.18 54.3 1.72 0.65 1.37 21.5 3.55 3.52 23.4 14.1 1.57 23.9 4.24 0.38 11.5

Amostra

TNF-a est

com SEB

CD107 est

com IL-12

IFN-g est

com IL-12

TNF-a est

com IL-12

Total NK

DX9+

Total NK

NKG2D+

Total NK

Z27+

CD56bright

DX9+

CD56bright

NKG2D+

CD56bright

Z27+

CD56dim

DX9+

CD56dim

NKG2D+

CD56dim

Z27+

CD56neg

DX9+

CD56neg

NKG2D+

Caso 1 0.47 39.2 0.17 0.45 3.57 16 17.1 0.77 53.9 36.6 3.33 16.4 18.5 5.45 5.83

Caso 2 0.9 43.2 0.093 0.8 1.41 9.79 2.72 4.35 47.8 28.8 1.47 11.2 2.93 0.85 1.93

Caso 3 0.75 54.6 0.42 1.06 9.12 29.2 9.51 0.8 65.6 23.2 9.3 29.3 9.9 9.89 18.7

PLANILHA COM OS DADOS DE CÉLULAS NK NA SÍNDROME HIPER IgE

Anexos

Amostra

CD56neg

Z27+

Total NK

CD94+

Total NK

NKG2A+

Total NK

NKG2C+

CD56bright

CD94+

CD56bright

NKG2A+

CD56bright

NKG2C+

CD56dim

CD94+

CD56dim

NKG2A+

CD56dim

NKG2C+

CD56neg

CD94+

CD56neg

NKG2A+

CD56neg

NKG2C+

Total NK

CD57+

Total NK

CD161+

CN101 6.9 34 10.7 12.5 88 38.3 71.6 44.8 8.2 17.9 4.5 2.2 0.5 26 36.5

CN102 1.4854.34.9154.489.148.727.164.53.6266.83.451.354.5253.89.71

CN103 5.5 22.0 13.5 5.2 69.7 50.3 29.5 27.8 14.5 6.9 1.6 3.4 0.4 27.6 32.2

CN104 1.66 15.5 6.89 7.4 58.4 30.7 3.52 15 6.38 5.66 6.68 2.28 14.8 22.3 37.6

CN105 6.3 55.3 16.9 31.3 80.5 54.2 11.8 57.8 16.9 33.1 26.6 4.06 18.5 51.1 25.8

CN106 6.6 16 9.5 9.1 70 25.4 52.4 22.7 6.6 14.0 1.9 3.7 21.1 33 30.6

CN EC 4.9 10 2.9 7.5 71 24.2 56.6 16.6 2.1 13.5 1.8 0.9 3.8 9 8.6

CN 202 2.2428.312.47.0584.260.2 23 33.211.66.730.7412.75.1731.537.6

CN 204 11 20.3 10.4 16.2 88.5 83.9 8.05 24.9 9.87 15.1 1.01 7.3 19.8 34.9 46

CN 203

10.7 26.2 7.57 30 88.3 82.8 16.7 27.5 6.88 32.1 1.13 2.39 13.6 32.8 40.1

CN 421 0.083 28.2 13.7 6.78 66.1 43.8 38.2 30.2 14.3 6.67 4.41 1.44 0.38 29.9 32.9

Amostra

CD56neg

Z27+

Total NK

CD94+

Total NK

NKG2A+

Total NK

NKG2C+

CD56bright

CD94+

CD56bright

NKG2A+

CD56bright

NKG2C+

CD56dim

CD94+

CD56dim

NKG2A+

CD56dim

NKG2C+

CD56neg

CD94+

CD56neg

NKG2A+

CD56neg

NKG2C+

Total NK

CD57+

Total NK

CD161+

Caso 1 4.01 22.2 6.81 2.93 72.3 52.8 22.1 24.2 6.9 2.68 7.4 1.77 2.18 37.3 41.9

Caso 2 0.11 10.7 3.66 9.29 66.7 30 25 13.5 4.52 11.6 0.88 0.24 2.41 5.15 6.86

Caso 3 2.4732.318.67.3691.967.632.433.218.87.2515.18.033.4121.235.6

PLANILHA COM OS DADOS DE CÉLULAS NK NA SÍNDROME HIPER IgE

Anexos

Amostra

Total NK

NKp44+

CD56bright

CD57+

CD56bright

CD161+

CD56bright

NKp44+

CD56dim

CD57+

CD56dim

CD161+

CD56dim

NKp44+

CD56neg

CD57+

CD56neg

CD161+

CD56neg

NKp44+

Total NK

NKp30+

Total NK

NKp46+

NK total

Perforina+

CD56bright

NKp30+

CD56bright

NKp46+

CN101 0.9 3 55.6 14.3 35.4 46.9 0.8 1.3 8.2 0.9 14.5 17.5 29.0 23.1 69.2

CN102 0.98 4.73 44.5 13.6 65.4 9.35 0.58 2.54 5.41 0.7 4.15 5.5 33 7.89 68.1

CN103 2.3 20.0 56.3 7.3 37.4 41.3 2.5 2.1 6.0 1.1 10.3 8.3 38.0 17.5 57.9

CN104 1.12 5.06 54.9 8.13 26.2 40.9 0.52 9.14 17.2 2.16 12.7 12.6 31.5 16.7 71.9

CN105 1.33 9.28 53.2 26.7 54.9 26.4 0.8 16 13.1 2 12.4 16.8 18.3 22.8 70.2

CN106 1.5 27 47.8 6.0 47.1 41.2 1.1 1.4 5.3 2.2 12.7 12.6 18.3 3.8 39.6

CN EC 1.2 2 56.7 13.3 16.7 15.4 1.1 1.9 1.6 1.2 7.9 8.1 37.3 10.7 57.1

CN 202 3.8 31.4 79 17.7 40.4 41 4.03 2.86 23.7 1.19 17.1 13.8 58.4 39.7 93.8

CN 204 1.37 0.44 77.7 9.37 44.6 53.1 1.15 3.62 16.4 0.370 8.49 17.6 61.6 16.1 96.8

CN 203

0.75 1.17 65.6 1.04 36.5 42.3 0.74 3.69 15.1 0.48 9.84 13.2 63.8 13.9 95

CN 421 2.55 18.1 44.8 25.7 33.8 36.6 2.36 3.29 3.98 0 23.7 11.8 63.4 57.7 63.8

Amostra

Total NK

NKp44+

CD56bright

CD57+

CD56bright

CD161+

CD56bright

NKp44+

CD56dim

CD57+

CD56dim

CD161+

CD56dim

NKp44+

CD56neg

CD57+

CD56neg

CD161+

CD56neg

NKp44+

Total NK

NKp30+

Total NK

NKp46+

NK total

Perforina+

CD56bright

NKp30+

CD56bright

NKp46+

Caso 1 3.18 3.75 58.2 49.1 44.6 48.9 2.54 9.14 8.9 0.30 27.6 20.2 53.3 72.2 70.8

Caso 2 1.77 4.1 38.5 39.5 5.64 7.72 1.64 3.11 1.36 0.090 13.4 9.3 27.6 46.6 40.6

Caso 3 4.9 3.7 35.6 50.4 23.7 38.9 3.82 10.6 17.4 0.97 32.8 32.6 57.3 60.7 87.9

PLANILHA COM OS DADOS DE CÉLULAS NK NA SÍNDROME HIPER IgE

Anexos

Amostra

CD56bright

Perforina+

CD56dim

NKp30+

CD56dim

NKp46+

CD56dim

Perforina+

CD56neg

NKp30+

CD56neg

NKp46+

CD56neg

Perforina+

CN101 0.0 15.3 18.8 29.1 11.0 11.3 30.0

CN102 1.24 3.47 3.5 33.9 9.84 3.8 36.2

CN103 7.9 12.6 9.2 40.5 3.7 1.9 32.7

CN104 5.26 12.9 11 30.6 10.9 6.63 42.1

CN105 2.61 12.3 16.4 18.9 10.8 8.81 15.7

CN106 5.7 16.5 13.2 17.6 3.3 9.9 20.8

CN EC 0.0 13.1 11.8 34.8 2.3 3.3 40.7

CN 202 62.1 22.1 15.6 69.9 3.55 3.85 31.3

CN 204 61.8 10.7 19.5 75 3.74 8.91 36.4

CN 203

48.6 11 13.1 70.3 4.63 5.89 38.2

CN 421 12.7 25.3 11.4 68.7 3.82 2.34 35.5

Amostra

CD56bright

Perforina+

CD56dim

NKp30+

CD56dim

NKp46+

CD56dim

Perforina+

CD56neg

NKp30+

CD56neg

NKp46+

CD56neg

Perforina+

12 Caso 1 18.5 33.6 23.8 66.3 4.34 3.83 15.8

Caso 2 52.6 20.5 13.9 41.5 0.97 0.57 5.25

Caso 3 77.6 38 36.2 66 9.76 11.1 22.9

PLANILHA COM OS DADOS DE CÉLULAS NK NA SÍNDROME HIPER IgE

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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