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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
BIOLOGIA MOLECULAR
EXPRESSÃO DE URICASE DE Bacillus subtilis
Em Escherichia coli
Pollyanna Pfrimer
Brasília–DF
2007
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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
BIOLOGIA MOLECULAR
EXPRESSÃO DE URICASE DE Bacillus subtilis
EM Escherichia coli
Pollyanna Pfrimer
Dissertação apresentada ao programa
de Pós-graduação em Biologia
Molecular da Universidade de Brasília,
como requisito parcial para a obtenção
do título de Mestre em Biologia
Molecular.
Orientador: Prof. Dr. Fernando Araripe G. Torres
Brasília–DF
2007
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Pollyanna Pfrimer
EXPRESSÃO DE URICASE DE Bacillus subtilis
EM Escherichia coli
Esta dissertação foi apresentada à banca como exigência parcial para a obtenção
do título de Mestre em Biologia Molecular da Universidade de Brasília.
Brasília, 15 de fevereiro de 2007
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Fernando Araripe G. Torres
Universidade de Brasília – UnB
Presidente da banca
Profa. Dra. Lucília Helena Marcelino
Embrapa Cenargen
Membro efetivo
Profa. Dra. Beatriz Dolabela de Lima
Universidade de Brasília – UnB
Membro efetivo
AGRADECIMENTOS
Agradeço
Ao meu orientador, Prof. Dr. Fernando Araripe Gonçalves Torres, e à Profa. Dra.
Lídia Maria Pepe de Moraes, por terem me transmitido seus conhecimentos e
experiências.
Ao Prof. Carlos Bloch e à Profa. Beatriz Dolabela de Lima, por terem sido sempre
prestativos e por terem me cedido o uso de seus laboratórios para a realização
deste estudo.
Aos professores da Biologia Molecular, Élida, Márcio, Suelly e Ildinete, que direta
ou indiretamente me ajudaram nos momentos de dúvidas com os seus
conhecimentos.
Aos meus colegas de laboratório, Alexsandro, Andrelisse, Camila, David, Fátima
Gaúcho, Gil, Hugo, Ivonildes, Juliana, Loise, Marciano, Paty Vet, Paty Luíza,
Saulo e Vera, pela ajuda e esclarecimentos. E, em especial, à Vivis e Janice, que
sempre estiveram presentes nas dificuldades no laboratório.
Aos meus colegas, Luciano Paulino e Ângelo Basile, por me ajudarem na
montagem das figuras e na formatação desta dissertação.
À Isabel Quixabeira, que me ensinou a fazer da vida um caminho mais fácil e
fascinante quando estamos abertos ao auto-conhecimento.
À Prof. Me. Suzana Oellers, que compartilhou comigo as suas experiências de
vida e os seus conhecimentos tão ricos.
À minha amiga, Maria Elisa, que sempre esteve presente em todos os momentos,
felizes ou difíceis, e sempre me estendeu a sua mão amiga.
Às minhas amigas, Natália, Dasy e Kílvia, pela presença reconfortante e pelos
momentos de descontração e lazer.
Aos meus tios, Armim, Marlene e Magda Pfrimer, pela presença amiga e pelos
cuidados para comigo.
Dedico esta dissertação de mestrado
Aos meus pais, Amadeus e Araci, pelo amor incondicional, a presença sempre
amiga e dura quando necessária para o fortalecimento dos meus valores e
caráter.
Aos meus irmãos, Matheus e André, à minha cunhada, Linda, e ao meu sobrinho,
Luca, pelos momentos felizes e pelas experiências de vida que eles me
proporcionaram.
RESUMO
A uricase, uma enzima que converte ácido úrico em alantoína, é comumente
usada em kits comerciais de dosagem de ácido úrico. Com a finalidade de
produzir esta enzima em grande escala por técnicas de Engenharia Genética, o
gene da uricase de Bacillus subtilis subtilis foi clonado e expresso em Escherichia
coli. Para tanto, foi feita uma PCR utilizando-se como template o DNA
cromossomal de B. subtilis e primers específicos para amplificação do gene
pucLM. O amplicon foi sub-clonado seguindo-se seqüenciamento para a
confirmação da seqüência do gene e clonagem do gene pucLM no vetor de
expressão pET21a. Esse vetor de expressão permite a fusão do gene da uricase
com uma cauda de histidina His
6x
. O vetor resultante, pETURI, foi usado para
transformar as linhagens de E. coli BL21 DE3λ pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21
(DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL e SURE, e a indução da expressão. Amostras da
linhagem de E. coli BL21 DE3λ pLysS foram selecionadas para o presente
estudo. Essas células foram coletadas em diversos tempos de indução e
analisadas por SDS-PAGE, que revelou a presença de uma proteína de indução
de ~63 kDa. A espectrometria de massa foi utilizada para determinar a massa
molecular da enzima recombinante, tendo detectado um íon com massa
molecular de 58,67 kDa. Análises de Western Blot confirmaram a presença da
cauda de histidina na proteína de indução e detectaram degradação da enzima
recombinante na porção N-terminal. A purificação foi realizada em uma coluna de
afinidade Ni-NTA. Ensaios enzimáticos detectaram uma proteína estável com pH
ótimo 8,0, temperatura ótima entre 25ºC e 37ºC e atividade uricásica na fração
eluída com atividade específica de 39 U/mg.
Palavras-chave: uricase; ácido úrico; hiperuricemia; Bacillus subtilis.
A
A
B
B
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S
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T
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R
A
A
C
C
T
T
Bacillus subtilis URICASE EXPRESSION IN Escherichia coli
Uricase, an enzyme that converts uric acid into allantoin, is commonly used in
commercial kits for uric acid detection. Aiming to produce this enzyme in industrial
scale using Genetic Engineering techniques, the uricase gene of Bacillus subtilis
subtilis was cloned and expressed in Escherichia coli. In order to achieve this, a PCR
was performed using B. subtilis cromossomal DNA as template and specific primers
to amplify the gene pucL. The amplicon was sub-cloned following sequencing to
confirm the gene sequence and cloning of the gene pucL in vector of expression
pET21a. This vector of expression permits the fusion of the uricase gene with a
histidine tag His
6x
. The resulting vector, pETURI, was used to transform the strains of
E. coli BL21 DE3λ pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL,
and SURE, and the expression was induced by adding IPTG to the culture media.
Samples of E. coli BL21 DE3λ pLysS strain were selected to be used in the present
study. These cells were collected in several induction times and analyzed by SDS-
PAGE, which revealed the presence of a ~63-kDa induction protein. Mass
espectrometry was used to determine the molecular mass of the recombinant
enzyme, having detected an ion with molecular mass of 58,67 kDa. Western Blot
analyses confirmed the presence of the histidine tag in the induction protein and
detected degradation of the recombinant enzyme in the N-terminal portion.
Purification was carried out in Ni-NTA affinity column. Enzymatic essays detected a
stable protein with optimum pH 8.0, optimum temperature ranging from 25ºC and
37ºC, and uricase activity in the eluding fraction with specific activity of 39 U/mg.
Key words
:
: uricase; uric acid; hyperuricemia; Bacillus subtilis.
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D
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Figura 1.
Mapa metabólico da via de novo e de salvação da síntese de
purina, nucleotídeos, nucleosídeos e bases nitrogenadas. ....... 18
Figura 2.
Via de novo do metabolismo das purinas. ................................. 19
Figura 3.
Estrutura terciária da enzima UOX de A. flavus. ........................ 21
Figura 4.
Reação de degradação do ácido úrico em alantoína pela
enzima uricase. ..........................................................................
23
Figura 5.
Via da purina. A Rasburicase® catalisa a oxidação do ácido
úrico a alantoína. ........................................................................
25
Figura 6.
Ensaio colorimétrico baseado na formação da quinoneimina. ... 27
Figura 7.
Esquema das reações ocorridas na formação da
quinoneimina. ............................................................................. 27
Figura 8.
Primers PUCL5 e PUCL3. .......................................................... 38
Figura 9.
Seqüência primária e tradução predita do gene pucLM de B.
subtilis. Os nucleotídeos sublinhados correspondem à região
de anelamento dos primers PUCL5e PUCL3. ........................... 39
Figura 10.
Mapa físico do vetor pGEM-T (Promega). ................................. 40
Figura 11.
Mapa físico do vetor pET21a e região de múltipla clonagem. ... 41
Figura 12.
Análise em gel de agarose 0,8% do gene pucL amplificado por
PCR utilizando Taq Platinum. .................................................... 52
Figura 13.
Análise de restrição em gel de agarose 0,8% do vetor
pGEMURI. .................................................................................. 53
Figura 14.
Resultado da análise Blast-n da seqüência do produto de
PCR. ........................................................................................... 54
Figura 15.
Análise em gel de agarose 0,8% de plasmídios isolados após
transformação com sistema de ligação pET21a + gene pucL. .. 55
Figura 16.
Análise de restrição em gel de agarose 0,8% do vetor pETURI. 56
Figura 17.
Análise em gel SDS-PAGE 12% da indução de expressão da
uricase em E. coli BL21 DE3λ pLysS. ........................................ 57
Figura 18.
Seqüência teórica da enzima recombinante produzida em E.
coli. ............................................................................................. 57
Figura 19.
Comparação da indução de expressão da uricase em E. coli
BL21 DE3λ pLysS sem e com a adição de rifampicina. ............ 58
Figura 20.
Análise em gel SDS-PAGE 10% do perfil protéico de células
BL21 DE3λ pLysS transformadas com os vetores pET21a e
pETURI e submetidas a indução com IPTG. .............................. 59
Figura 21.
Western Blot de culturas de E. coli BL21 DE3λ pLysS
expressando uricase de B. subtilis. ............................................ 60
Figura 22.
Análise em gel SDS-PAGE 12% das etapas de purificação da
enzima recombinante em coluna de afinidade Ni-NTA. ........... 61
Figura 23.
Análise em gel SDS-PAGE 12% das proteínas eluídas por step
gradiente com o tampão de eluição contendo diferentes
concentrações de imidazol (50, 100, 150 e 200 mM).. .............. 62
Figura 24.
Análise das etapas de purificação da enzima recombinante em
gel SDS-PAGE 12%................................................................... 63
Figura 25.
Espectrometria de massa. Detecção de um íon com massa
molecular de 58,67 kDa. ............................................................ 64
Figura 26.
Determinação do pH ótimo da enzima recombinante. ............... 64
Figura 27.
Determinação da temperatura ótima da enzima recombinante. 65
Figura 28.
Determinação da estabilidade da enzima recombinante. .......... 66
L
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I
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E
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A
B
B
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página
Tabela 1.
Condições da PCR utilizadas para a amplificação do gene da
uricase com a Taq polimerase (Cenbiot). .................................. 43
Tabela 2.
Condições da PCR utilizadas para a amplificação do gene da
uricase com a Taq Platinum (Invitrogen). .................................. 44
L
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I
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Q
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Quadro
1
1
.
.
Linhagens e genótipos de E. coli utilizados no presente
estudo. ........................................................................
3
3
7
7
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ADA – adenosina deaminase
AMP – adenina 5’ monofosfato
APB – tampão para fosfatase alcalina
ATP – adenosina trifosfato
4-AAP – 4-aminoantipirina
BCIP – fosfato de bromo cloroindolil
BSA – albumina sérica bovina
cDNA – DNA complementar
CMOS – metal óxido semicondutor complementar
CRF – 5-formamidoimidazol-4-carboxamida ribonucleotídeo
Cys – cisteína
DNA – ácido desoxirribonucléico
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
EtBr – brometo de etídeo
g – força da gravidade
GMP – guanina 5’ monofosfato
GPRT – guanina fosforibosiltransferase
GTP – guanina 5’ trifosfato
h – Hora
HGPRT – hipoxantina guanina fosforribosiltransferase
HGPT – hipoxantina guanina fosforiltransferase
His-tag – cauda de histidina
HPRT – hipoxantina fosforribosiltransferase
Hz – Hertz
IMP – inosina 5’ monofosfato
IPTG – isopropil-β-tio-galactosídeo
kb – quilobase
kDa – quilodalton
LB – Luria-Bertoni
mA – miliAmpère
min – minuto
mL – mililitro
µL – microlitro
M – molar
mM – milimolar
NBT – azul de nitro tetrazólio
nm – nanômetro
Ni-NTA – resina de agarose ligada a níquel
N
10
-formil THF – N
10
-formil-tetra-hidrofolato
Pb – pares de bases
PBS – salina tamponada com fosfato
PBS-T – salina tamponada com fosfato-Tween
PCR – reação em cadeia da polimerase
pH – potencial hidrogeniônico
pI – ponto isoelétrico
pmol – picomoles
PMSF – fluoreto de fenilmetilsulfonil
PNP – purina nucleosídeo fosforilase
PRPP – 5-fosforribosil-1-pirofosfato
PRPS – fosforribosilpirofosfato sintetase
RNAse – ribonuclease
rpm – rotações por minuto
s – segundo
SDS – sulfato de sódio dodecil
SDS-PAGE – gel de poliacrilamida desnaturante
t – tempo
TLS – síndrome da lise tumoral
Tm – temperatura média
uox – gene pucL
UOX – Uricase de Bacillus subtilis
UV – ultravioleta
V – volts
X-gal – 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-galactosídeo
XMP – xantosina 5’ monofosfato
XO – xantina oxidase
W – watts
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S
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U
M
M
Á
Á
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I
O
O
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE QUADROS
LISTA DE ABREVIATURAS
1
1
INTRODUÇÃO ...............................................................................................
1
1
5
5
2
2
OBJETIVOS ..................................................................................................
1
1
6
6
2.1 Objetivo geral ...........................................................................................
1
1
6
6
2.2 Fluxograma ..............................................................................................
1
1
6
6
3
3
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .........................................................................
1
1
7
7
3.1 Metabolismo das purinas .........................................................................
1
1
7
7
3.2 Hipouricemia ............................................................................................
2
2
2
2
3.2.1 Hipouricemia primária ....................................................................
2
2
3
3
3.2.2 Hipouricemia adquirida ...................................................................
2
2
3
3
3.3 Hiperuricemia ...........................................................................................
2
2
4
4
3.4 Urato oxidase ...........................................................................................
2
2
4
4
3.4.1 Urato oxidase de Bacillus ...............................................................
2
2
6
6
4
4
METODOLOGIA ............................................................................................
2
2
9
9
4.1 Meio de cultura, tampões de reação e soluções utilizados .....................
2
2
9
9
4.1.1 Meio de cultura LB (pH 7,2) ...........................................................
2
2
9
9
4.1.2 Tampões de reação .......................................................................
2
2
9
9
4.1.3 Soluções .........................................................................................
3
3
2
2
4.2 Linhagens de B. subtilis e E. coli .............................................................
3
3
7
7
4.3 Primers .....................................................................................................
3
3
8
8
4.4 Marcadores de massa molecular .............................................................
3
3
8
8
4.5 Plasmídios ...............................................................................................
4
4
0
0
4.6 Ferramentas de bioinformática ................................................................
4
4
0
0
4.7 Extração do DNA cromossomal de B. subtilis .........................................
4
4
1
1
4.8 Análise do DNA em gel de agarose .........................................................
4
4
2
2
4.9 PCR .........................................................................................................
4
4
3
3
4.10 Purificação do produto de PCR .............................................................
4
4
4
4
4.11 Purificação do DNA plasmidial ...............................................................
4
4
4
4
4.12 Purificação do DNA plasmidial com fenol-clorofórmio ...........................
4
4
5
5
4.13 Digestão do DNA com enzimas de restrição .........................................
4
4
6
6
4.14 Sistema de ligação .................................................................................
4
4
7
7
4.15 Transformação de células de E. coli ......................................................
4
4
7
7
4.16 Indução da expressão da enzima recombinante ...................................
4
4
8
8
4.17 Análise de proteína em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-
PAGE) ............................................................................................................
4
4
8
8
4.18 Western Blot ..........................................................................................
4
4
9
9
4.19 Purificação da enzima recombinante .....................................................
4
4
9
9
4.20 Determinação da atividade uricásica .....................................................
5
5
0
0
4.21 Seqüenciamento ....................................................................................
5
5
1
1
4.22 Espectrometria de massa ......................................................................
5
5
2
2
5
5
RESULTADOS ..............................................................................................
5
5
3
3
5.1 Clonagem do gene da uricase de B. subtilis ............................................
5
5
3
3
5.2 Expressão de uricase em E. coli ..............................................................
5
5
6
6
5.3 Purificação da enzima recombinante .......................................................
6
6
1
1
5.4 Caracterização da enzima recombinante ................................................
6
6
4
4
6
6
DISCUSSÃO ..................................................................................................
6
6
8
8
7
7
CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS .............................................
7
7
5
5
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F
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8
8
2
2
15
INTRODUÇÃO
Atualmente, o Brasil depende de matéria-prima importada para a produção de
kits de diagnósticos, o que torna o mercado interno totalmente dependente do
mercado externo, além de resultar em custo elevado do produto final. O país gasta
cerca de US$ 4 milhões por ano no mercado externo apenas com a compra de
enzimas para diagnóstico. Uma alternativa para aliviar essa dependência é a
produção nacional das enzimas utilizadas nos kits utilizando técnicas de engenharia
genética. Para que isso seja possível, os genes correspondentes a essas enzimas
devem ser clonados e expressos em células hospedeiras. Dentre essas células,
destacam-se as leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris e a bactéria
Escherichia coli como as principais células hospedeiras eucarióticas e procarióticas,
respectivamente.
Para esta dissertação foi proposto o desenvolvimento de tecnologia nacional
para produção de uricase recombinante em E. coli visando compor o kit de dosagem
de ácido úrico, essencial para o acompanhamento médico de pacientes com quadro
clínico de gota ou hiperuricemia. Com isso, o Brasil ganhará autonomia na produção
biotecnológica dessa enzima, diminuindo as importações e o custo de produção dos
kits para o mercado nacional. Esta pesquisa previu, ainda, a transferência de
tecnologia para a empresa goiana Bioshop Produção e Comércio de Reagentes
Biológicos para Laboratório Ltda., que deverá produzir e comercializar o kit nacional.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
• Obter uma linhagem de Escherichia coli que expresse o gene pucL de B.
subtilis correspondente à uricase.
• Utilização da enzima em kits de dosagem de ácido úrico.
2.2 Fluxograma
1) Isolar DNA cromossomal de B. subtilis subespécie subtilis LMD 69.3;
2) Amplificar o gene pucL (~1,5 kb) por PCR utilizando primers específicos;
3) Clonar o gene pucL no vetor pGEM-T;
4) Isolar o gene pucL clonado após digestão do vetor com as enzimas de
restrição BamHI e XhoI;
5) Sub-clonar o gene pucL no vetor de expressão pET21a digerido com
BamHI e XhoI;
6) Transformar diferentes linhagens de E. coli e selecionar uma delas para
expressão induzida;
7) Realizar ensaios de expressão e detecção da enzima recombinante;
8) Purificar e caracterizar a uricase recombinante obtida.
17
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Metabolismo das purinas
O metabolismo das purinas, principalmente nos seres humanos, converte na
formação do ácido úrico, o qual é um composto que em altas concentrações provoca
doenças como a gota e a hiperuricemia. O conhecimento das vias do metabolismo
das purinas se mostra importante para o controle da produção do ácido úrico.
Os nucleotídeos são constituídos por uma pentose, grupos fosfato e bases
nitrogenadas, podendo estas ser pirimidinas (timina e citosina) ou purinas (adenina e
guanina). Os nucleotídeos purínicos, formados na via de novo, são importantes para
os organismos vivos por estarem envolvidos em muitos processos fundamentais,
dentre os quais se encontram a síntese de ácidos nucléicos e a biossíntese de
vários aminoácidos e vitaminas, como a riboflavina, além de servirem como
suplemento de energia. O anel purínico é sintetizado a partir de aminoácidos, como:
a glicina, que fornece os carbonos 4 e 5 e o nitrogênio 7; o aspartato, que fornece o
nitrogênio 1; e a glutamina, que fornece outros dois átomos de nitrogênio (N-3 e N-
9), os quais estão presentes no grupamento amida da cadeia lateral da glutamina.
Os derivados ativos do tetra-hidrofolato fornecem dois átomos de carbono (C-2 e C-
8), enquanto o CO
2
fornece o carbono 6 para o anel purínico (ZHANG; DIXON,
1992).
A via de novo inicia-se com a ribose 5-fosfato, formada principalmente na via
da pentose-fosfato, em presença da enzima ribose fosfato pirofosfoquinase e de
adenosina trifosfato (ATP), dando origem a 5-fosforribosil-1-pirofosfato (PRPP). O
grupo pirofosfato é transferido do ATP para o carbono 1 da ribose 5-fosfato. Na via
de salvação, o PRPP é utilizado para reciclar as bases purínicas em uma reação
com menos gasto de energia do que as reações da via de novo. Os ácidos nucléicos
e os nucleotídeos sofrem degradação hidrolítica, liberando as bases purínicas que
se ligam à porção da ribose fosfato do PRPP para formar o nucleotídeo
correspondente. A enzima adenina fosforribosil transferase, em presença de adenina
e PRPP, catalisa a formação de adenina 5’ monofosfato (AMP), e a enzima
hipoxantina guanina fosforribosiltransferase (HGPRT), em presença de PRPP e
18
hipoxantina ou guanina, catalisa a formação de inosina 5’ monofosfato (IMP) e
guanina 5’ monofosfato (GMP), respectivamente (BECERRA; LAZCANO, 1998;
KEOUGH et al., 2005). A enzima hipoxantina fosforribosiltransferase (HPRT), da via
de salvação, catalisa a transferência da fosforibose de PRPP para a posição 9 da
hipoxantina ou da guanina. Essa enzima possui 217 resíduos de aminoácidos e é
expressa em baixos níveis em todos os tecidos, apresentando-se em altos níveis
apenas no cérebro (OGASAWARA, 1996), como pode ser observado na Figura 1.
Figura 1. Mapa metabólico da via de novo e de salvação da síntese de purina, nucleotídeos,
nucleosídeos e bases nitrogenadas. 1. PRPP sintetase; 2. PRPP amidotransferase; 3. succinil-AMP
sintetase; 4. succinil-AMP liase; 5. guanosina-inosina quinase; 6. 5’ nucleotidase; 7. AMP glicosilase;
8. adenina fosforibosiltransferase; 9. purina nucleosídeo fosforilase; 10. adenina deaminase; 11.
adenosina deaminase (ADA); 12. HPRT e guanina fosforibosiltransferase (GPRT); 13. IMP
dehidrogenase; 14. GMP sintetase; 15. GMP redutase; XMP, xantosina 5’ monofosfato.
Fonte: Modificada de Matsui et al. (2001).
A via de novo é regulada pela formação de 5-fosforribosilamina a partir de
PRPP e de glutamina e esta reação, demonstrada na Figura 2, é catalisada pela
enzima glutamina PRPP amidotransferase. Após a formação de 5-fosforribosilamina,
o anel purínico é montado sobre a ribose fosfato. O último átomo do anel purínico é
19
fornecido pelo N
10
-formil-tetra-hidrofolato (N
10
-formil THF) formando o 5-
formamidoimidazol-4-carboxamida ribonucleotídeo (CRF). Em seguida, esse
composto sofre desidratação e ocorre o fechamento do anel purínico formando IMP,
que contém o anel purínico completo (MURRAY et al., 2000). Em seres humanos, os
genes ou ácidos desoxirribonucléicos complementares (cDNAs) de todas as enzimas
envolvidas na via de novo foram isolados (PATTERSON et al., 1999).
Figura 2. Via de novo do metabolismo das purinas.
Fonte: King (2003).
O IMP é o precursor do AMP e do GMP, e os três são retroinibidores da
biossíntese de nucleotídeos purínicos, pois inibem a enzima 5-fosforribosil-1-fosfato
sintase, regulando, assim, os níveis de PRPP.
A próxima etapa também é regulada por AMP, GMP e pela formação de
ribonucleotídeos purínicos pela inibição da enzima glutamina PRPP amido
transferase (MURRAY et al., 2000; BONSDORFF et al., 2004). O precursor imediato
para a biossíntese da riboflavina é a guanina 5’ trifosfato (GTP), formada na via das
Glutamina – PRPP
amidotransferase
adenilsuccinato
liase
20
purinas e responsável por vários mecanismos regulatórios em diferentes etapas da
via (JIMENEZ et al., 2005). Quando em altos níveis, o IMP se liga à enzima HGPRT,
promovendo sua inibição por feedback (CHEN et al., 2005).
A via de degradação das purinas continua quando o IMP perde a ribose
fosfato e forma hipoxantina, a qual se transforma em xantina. A xantina sofre a ação
irreversível da enzima denominada xantina oxidase (XO) e se transforma em ácido
úrico, e este, em urato de sódio. O ácido úrico é um poderoso antioxidante e a sua
forma ionizada, o urato monossódico, é a encontrada no plasma humano, no líquido
extracelular e na sinóvia (AMES et al., 1981). A maior parte dos uratos é produzida
no fígado e proveniente do desdobramento das proteínas endógenas e exógenas. A
XO, quando ativa, promove a liberação de peróxido de hidrogênio, um radical livre,
que contribui para a ocorrência de disfunção vascular em pacientes com hipertensão
(WARING, MAXWELL, WEBB, 2002). A velocidade e a quantidade de ácido úrico
formado a partir das purinas dependem da XO e, quanto maior a quantidade desta
enzima, maior será a formação de ácido úrico.
A urato oxidase, também conhecida como uricase, é uma enzima de origem
não humana que geralmente possui ligações de cobre capazes de catalisar a
oxidação do urato (ácido úrico) em alantoína, um produto altamente solúvel no
túbulo renal (LEHNINGER, NELSON, COX, 2000; CHU et al., 1996). Na evolução
das espécies, o gene da uricase (uox) de seres humanos se tornou não funcional em
decorrência das mutações que ocorreram, inicialmente no promotor e, depois, na
região codificadora, embora o gene continue a ser transcrito no fígado (WU et al.,
1992; ODA et al., 2002). A proteína uricase (UOX) é constituída por dois domínios
contínuos de conformação em túnel (T-fold), que é uma estrutura pequena composta
de uma β-sheet antiparalela e quatro fitas seqüenciais com um par de α-hélices
antiparalelas entre a segunda e a terceira fita (COLLOC´H, MORNON, CAMADRO,
2002). A Figura 3 mostra a estrutura terciária da UOX de A. flavus.
Alguns animais, como aves, répteis e peixes, conservaram a uricase e
conseguem oxidar o ácido úrico em alantoína, uma substância 80 a 100 vezes mais
solúvel do que o ácido úrico e facilmente excretada pelo rim. Isso permite que esses
animais tenham níveis muito baixos de ácido úrico e seus produtos de excreção
sejam menos tóxicos do que a uréia, como nos peixes teleósteos, os quais excretam
alantoína, e nos répteis terrestres e aves, que excretam urato (STRYER, 1992).
21
Figura 3. Estrutura terciária da enzima UOX de A. flavus.
Fonte: Colloc´h,
Mornon, Camadro (2002).
A via de degradação das purinas em humanos termina quando há formação
do ácido úrico, que é eliminado na urina. Nos seres humanos, à temperatura normal
do corpo, o limite de solubilidade dos uratos é de 6,8 mg/dL, e estes se depositam
com facilidade nas articulações periféricas, tais como joelhos, calcanhares e
artelhos, cuja temperatura é mais baixa, provocando inflamações e a doença
denominada gota (DINCER, DINCER, LEVINSON, 2002).
A gota é uma doença que afeta adultos entre 30 e 50 anos de idade e ocorre
quando há altas concentrações de ácido úrico no sangue e nos tecidos, provocando
inflamações nas articulações e nos rins em decorrência do depósito de cristais de
urato de sódio. Essa condição patológica decorre de dieta com excesso de purina
(dieta rica em carnes), degradação acelerada de ATP e/ou um problema enzimático
por deficiência de hipoxantina guanina fosforiltransferase (HGPT) ou por
hiperatividade da fosforribosilpirofosfato sintetase (PRPS) (LEHNINGER, NELSON,
22
COX, 2000). A doença pode se originar de baixa excreção renal do ácido úrico,
causada por disfunção renal que iniba sua secreção pelos túbulos renais, devido à
presença de ânions competitivos ou à reabsorção tubular aumentada de ácido úrico
(BROGARD et al., 1972).
Atualmente, existem vários estudos sobre o uso de urato oxidase para a
detecção da concentração de ácido úrico e para o tratamento de gota ou de
hiperuricemia (LE TISSIER, PETERS, SKIDMORE, 1994; CALICETI, SCHIAVON,
VERONESE, 1999; MULHBACHER, MCGEENEY, ISPAS-SZABO, 2002), doença
que ocorre quando as taxas de ácido úrico encontram-se aumentadas.
As dosagens de ácido úrico no sangue e na urina de 24 horas são de grande
valor para o diagnóstico das alterações do metabolismo desta substância. A coleta
sangüínea adequada para detecção de ácido úrico requer jejum de pelo menos 4
horas antes do exame (GOCHMAN, SCHMITZ, 1971). Algumas substâncias ou
medicamentos que podem alterar para mais o resultado do exame também devem
ser suspensos, tais como: álcool, vitamina C, cafeína, diuréticos, teofilina e
fenotiazidas. Índices de ácido úrico no sangue menores do que o real podem ocorrer
quando são usados alopurinol, clofibratos, corticóides, estrógenos e anticoagulantes.
O ácido úrico é excretado pelo rim, bile e sucos intestinais. Por ser muito
hidrossolúvel, o urato é facilmente eliminado pelo rim em quantidades entre 600 e
700 mg/dia quando há ingestão de dietas normais. Em um indivíduo normal, um
terço do ácido úrico é degradado e excretado pelo intestino e dois terços pelo rim.
Na falência de um rim, a degradação e a eliminação do ácido úrico pelo intestino são
extremamente aumentadas.
3.2 Hipouricemia
A hipouricemia é uma síndrome clínica assintomática em que as
concentrações de ácido úrico encontram-se inferiores a 2,5 mg/dL, e em cuja
ocorrência há uma grande excreção de urato pela urina proveniente da deficiência
de enzimas, como a XO e a purina nucleosídeo fosforilase (PNP), e do composto
PRPP (IWAHANA, ITAKURA, 1996). A hipouricemia pode ser primária (permanente)
ou adquirida (intermitente).
23
3.2.1 Hipouricemia primária
A hipouricemia primária ocorre em casos hereditários ou quando há grandes
perdas de xantina pela urina (hiperxantinúria), o que diminui muito o substrato
necessário para a transformação desta substância em ácido úrico, ocorrendo a
diminuição deste último no sangue.
3.2.2 Hipouricemia adquirida
A urato oxidase catalisa a oxidação do ácido úrico em presença de oxigênio
formando a alantoína (produto mais solúvel) e o peróxido de hidrogênio. A Figura 4
mostra a degradação do ácido úrico em alantoína, um produto mais solúvel e que é
facilmente excretado na urina.
Figura 4. Reação de degradação do ácido úrico em alantoína pela enzima uricase.
A liberação de ácido úrico em grandes quantidades pela urina pode decorrer
do uso de substâncias uricosúricas, como aspirina em altas doses, benziodarona,
citrato, probenecida, ácido ascórbico, estrógenos, entre outras. O uso indiscriminado
e não controlado de alopurinol (inibidor da ação da XO) provoca o tipo de
hipouricemia denominado adquirida. O alopurinol é um análogo da xantina que inibe
a enzima XO e possui propriedades antioxidantes, impedindo a transformação de
hipoxantina e xantina em ácido úrico e promovendo a diminuição da concentração
deste último composto (RICARDO, BERTRAM, RYAN, 1995).
Urato + H
2
0 + 0
2
Alantoína + H
2
0
2
uricase
24
3.3 Hiperuricemia
A hiperuricemia acontece quando a concentração de ácido úrico no plasma
está acima de 6 mg/dL nas mulheres e acima de 7 mg/dL nos homens. A elevação
de urato ocorre devido a: hiperatividade da PRPP sintetase, deficiência de HPRT e
uso de diuréticos que promovem a deficiência da xantina dehidrogenase e da PNP
(AKAOKA, KAMATANI, 1996). A hiperuricemia está relacionada a outras doenças,
como: diabetes do tipo 2, em que os níveis elevados de ácido úrico aumentam a
resistência dos tecidos à ação da insulina; aumento na progressão de nefropatias; e
síndrome da lise tumoral (TLS) (MODAN et al., 1987; BO et al., 2001; KANG et al.,
2002).
3.4 Urato oxidase
A urato oxidase foi originalmente isolada de mamíferos e, atualmente, o
interesse sobre ela está voltado para as preparações oriundas de microrganismos,
tais como fungos filamentosos, leveduras e bactérias. Existem vários relatos sobre
microrganismos produtores de urato oxidase, como Micrococcus (KIDA, KUNIHISA,
1996), Brevibacterium (KIDA, KUNIHISA, 1996), Streptomyces (WATANABE,
FUKUMOTO, 1970), Candida (TANAKA et al., 1977), Bacillus (BONGAERTS,
VOGELS, 1976) e Aspergillus (LEGOUX et al., 1992; CHEVALET et al., 1993).
A urato oxidase extraída e purificada da cepa industrial de Aspergillus flavus
AF1734 é utilizada no tratamento de gota (CHEVALET et al., 1993). Em situações
em que a gota está associada a complicações renais, a aplicação intravenosa da
urato oxidase proporciona tratamento mais eficaz e rápido. A aplicação intravenosa
também é utilizada para prevenir e resolver as desordens provocadas pela
hiperuricemia que pode se manifestar durante os tratamentos quimioterápicos (PUI
et al., 2001).
A urato oxidase não-recombinante obtida de A. flavus (PUI et al., 1997) é
comercialmente conhecida como Uricozyme
®
(Sanofi-Synthelabo, Paris, França).
Essa enzima é um tetrâmero com subunidades idênticas, que não são unidas por
25
pontes dissulfeto, e massa molecular de 34 kDa. O aminoácido N-terminal do
monômero é um resíduo de serina N-α-acetilado (CONLEY, PRIEST, 1980;
LEGOUX et al., 1992). Apesar de estar associada com o desenvolvimento de
reações de hipersensibilidade aguda, mesmo em pacientes sem histórico de alergia,
a Uricozyme
®
é um agente uricolítico mais efetivo do que o alopurinol (MASERA et
al., 1982; MASSON et al., 1996).
Rasburicase
®
(Fasturtec
®
/Elitek
TM
) é o nome comercial dado para a urato
oxidase de A. flavus recombinante expressa em Saccharomyces cerevisiae. Bayol et
al. (2002) realizaram um estudo comparativo com a Rasburicase
®
e a Uricozyme
®
e
observaram que a primeira
possui atividade específica maior e, por conseqüência,
maior pureza do que a segunda. Isso é explicado por uma modificação que ocorre
durante a purificação da Uricozyme
®
, a qual forma Cys
35
, uma ponte dissulfeto com
resíduos de cisteína (Cys) livre.
Outro aspecto importante da Rasburicase
®
é que este medicamento, além de
ser mais efetivo no tratamento de gota e hiperuricemia, resultou em incidência mais
baixa de reações de hipersensibilidade (PUI et al., 2001; VOGT, 2005).
A Figura 5 mostra a ação da Rasburicase
®
e do alopurinol na via da purina.
Figura 5. Via da purina. A Rasburicase
®
catalisa a oxidação do ácido úrico a alantoína.
Fonte: Vogt (2005).
XANTINA OXIDASE
ÁCIDO ÚRICO
()
excreção na urina
Catabolismo da purina
XANTINA
endpoint normal do catabolismo
da purina em humanos
A
LOPURINOL
Rasburicase (urato oxidase)
26
3.4.1 Urato oxidase de Bacillus
Um aspecto interessante do B. subtilis é a presença do operon pucJKLM,
responsável pela codificação de proteínas fundamentais para a entrada intracelular e
a oxidação do ácido úrico. O alto grau de identidade entre a seqüência de
aminoácidos das xantinas permease codificadas pelos genes pucJ, pucK e pbuX de
B. subtilis é um forte indicativo de que estas proteínas estejam envolvidas no
transporte do ácido úrico para o interior da bactéria (CHRISTIANSEN et al., 1997),
uma vez que a proteína de membrana PbuX, um tipo de transportador, promove a
difusão facilitada das bases de purina e pirimidina.Os genes pucL e pucM codificam
funções requeridas para a atividade da uricase em B. subtilis. A proteína codificada
pelo gene pucL tem 494 resíduos de aminoácidos e é homóloga a várias uricases.
Há especulações de que a porção N-terminal dessa proteína possa representar uma
peróxido redutase responsável pela remoção do peróxido de hidrogênio formado na
oxidação do ácido úrico. Não se sabe ao certo a função da proteína codificada pelo
gene pucM na oxidação do ácido úrico. Conforme Schultz, Nygaard, Saxild (2001), o
gene pucM está envolvido na formação de alguns tipos de superestruturas,
compreendendo os transportadores, a uricase e as subunidades da peróxido
redutase, e a correta união dessas estruturas é necessária para a atividade da
uricase do tipo selvagem.
A uricase de B. subtilis é também produzida comercialmente e utilizada como
reagente em kits para a detecção da concentração de ácido úrico (ASANO et al.,
1971). Esses kits se baseiam em ensaios bioquímicos utilizando a uricase pura e um
sistema acoplado contendo peroxidase e indicadores [4-aminoantipirina (4-AAP) e o
ácido (DCHBS)] (FRAISSE et al., 2002). O ácido úrico, obtido do plasma sangüíneo
ou da urina do paciente, é adicionado a esse sistema, dando início a uma série de
reações até a formação da quinoneimina (composto de cor avermelhada). Assim,
quanto mais intensa for a coloração, maior é a concentração de ácido úrico no
organismo do paciente. As Figuras 6 e 7 mostram a formação da quinoneimina.
Recentemente foi desenvolvido um sistema baseado em um biochip
polimérico óptico no qual foram imobilizadas a uricase de B. subtilis e a peroxidase a
fim de detectar a concentração de ácido úrico por intermédio de um fotossensor
27
contendo um metal óxido semicondutor complementar (CMOS) (HUANG et al.,
2004).
Figura 6. Ensaio colorimétrico baseado na formação da quinoneimina.
Fonte: Modificada de Huang e Wu (2004).
Figura 7. Esquema das reações ocorridas na formação da quinoneimina.
Fonte: Modificada de Fraisse et al. (2002).
28
Outra uricase utilizada comercialmente é a codificada por um gene mutado de
um Bacillus sp. termofílico (TB-90) e que apresentou alta atividade e
termoestabilidade em vários valores de pH situados entre 6 e 9 (HUANG, WU,
2004). Esse gene foi clonado e seqüenciado (YAMAMOTO et al., 1996) e a
seqüência completa do DNA do gene uao foi analisada, tendo sido observado que a
open read frame é responsável pela codificação de 502 resíduos de aminoácidos
(NISHIYA, HIBI, ODA, 2000).
29
4 METODOLOGIA
4.1 Meio de cultura, tampões de reação e soluções utilizados
4.1.1 Meio de cultura LB (pH 7,2)
Composição: extrato de levedura – 0,5% (p/v); peptona de caseína – 1,0%
(p/v); NaCl – 1,0% (p/v). Ao meio sólido foram adicionados 1,5% (p/v) de ágar
bacteriológico.
4.1.2 Tampões de reação
4.1.2.1 NEB 2 10X (New England Biolabs)
Tampão Tris-HCl (pH 7,9) 10 mM
MgCl2 10 mM
DTT 1 mM
4.1.2.2 Tampão da Taq DNA polimerase 10X (CENBIOT)
Tris-HCl (pH 8,3) 0,1 M
KCl 0,5 M
BSA 0,1% (p/v) (albumina sérica bovina)
4.1.2.3 Tampão da T4 DNA ligase 10X (Biolabs)
Tris-HCl (pH 7,5) 0,5 M
MgCl
2
0,1 M
DTT 0,1 M
ATP 10 mM
BSA 25 µg/mL
30
4.1.2.4 Tampão ”High Fidelity” PCR (Invitrogen™)
Tris-HCl (pH 8,3) 0,1 M
KCl 0,5 M
BSA 0,1% (p/v)
4.1.2.5 Tampão de lise
NaH
2
PO
4
0,05 M
NaCl 0,3 M
Imidazol 10 mM
Ajustar o pH para 8,0 usando NaOH.
4.1.2.6 Tampão de lavagem
NaH
2
PO
4
0,05 M
NaCl 0,3 M
Imidazol 20 mM
Ajustar o pH para 8,0 usando NaOH.
4.1.2.7 Tampão de eluição
NaH
2
PO
4
0,05 M
NaCl 0,3 M
Imidazol 0,25 mM
Ajustar o pH para 8,0 usando NaOH.
4.1.2.8 Tampão TEN
Tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)
EDTA 10 mM
NaCl 0,1 M
31
4.1.2.9 Tampão de eletroforese TEB 10X (pH 8,2)
Trizma base 108 g/L
Ácido bórico 55 g/L
EDTA 30 g/L
4.1.2.10 Tampão de eletroforese TAE 10X (pH 8)
Trizma base 108 g/L
Ácido bórico 55 g/L
EDTA 30 g/L
4.1.2.11 Tampão de eletroforese SDS-PAGE 10X (gel de poliacrilamida
desnaturante)
Trizma base 125 mM
SDS 0,5% (sulfato de sódio dodecil)
Glicina 0,96 M
4.1.2.12 Tampão de amostra 6X
Azul de bromofenol 0,25%
Sacarose em água 40% (p/v)
4.1.2.13 Tampão de amostra SDS-PAGE 2X (pH 6,8)
Tris-HCl 0,2 M
SDS 4%
β-mercaptoetanol 4%
Azul de bromofenol 0,1%
Glicerol 20% (v/v)
A solução foi estocada a -20ºC em alíquotas de 1 mL.
32
4.1.2.14 Tampão TE
Tampão Tris-HCl (pH 8,0) 25 mM
EDTA 20 mM
4.1.2.15 Tampão PBS 10X (salina tamponada com fosfato pH 7,4)
NaCl 137 mM
Na
2
HPO
4
7 mM
NaN
3
0,02%
4.1.2.16 Tampão PBS-T (salina tamponada com fosfato-Tween pH 7,4)
Tampão PBS 1X
Tween 20 0,1% (v/v)
4.1.3 Soluções
4.1.3.1 dNTP
Mistura de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, na concentração de 8 a 10 mM cada.
4.1.3.2 RNAse A (ribonuclease)
RNAse A 0,01%
A RNAse A foi dissolvida em água destilada e a solução foi incubada em
água fervente por 20 min.
4.1.3.3 Ampicilina
Ampicilina 50 mg/mL (500X)
A solução foi dissolvida em água e esterilizada por filtração.
33
4.1.3.4 Cloranfenicol
Cloranfenicol 50 mg/mL (500X)
A solução foi dissolvida em etanol 100%.
4.1.3.5 Rifampicina
Rifampicina 50 mg/mL (500X)
A solução foi dissolvida em metanol 100%.
4.1.3.6 Brometo de etídeo (EtBr)
EtBr 10 mg/mL
A solução foi dissolvida em água.
4.1.3.7 X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo)
X-gal 20 mg/mL
A solução foi diluída em N,N dimetilformamida.
4.1.3.8 Solução de lise (pH 6,0)
EDTA 10 mM
NaCl 10 mM
SDS 1% (p/v)
4.1.3.9 Fenol saturado (pH 6,0)
Fenol
EDTA 10 mM
NaCl 10 mM
A solução foi incubada a 65
o
C por 10 min.
34
4.1.3.10 Clorofane (pH 6,0)
Fenol 1v
Clorofórmio 1v
β-hidroxiquinolina 0,05%
A solução foi equilibrada com tampão TEN.
4.1.3.11 Solução II
NaOH 0,2 M
SDS 1%
4.1.3.12 Solução III (pH 4,8-5,0)
Acetato de sódio 3 M
Ácido acético 2 M
4.1.3.13 SDS-PAGE 10%
Acrilamida/Bisacrilamida (29:1) 10%
Tris-HCl (pH 8,8) 375 mM
SDS 0,1%
APS 0,05%
Temed 0,05%
4.1.3.14 SDS-PAGE 12%
Acrilamida/Bisacrilamida (29:1) 12%
Tris-HCl (pH 8,8) 375 mM
SDS 0,1%
APS 0,05%
Temed 0,05%
35
4.1.3.15 SDS-PAGE 4%
Acrilamida/Bisacrilamida (29:1) 4%
Tris-HCl (pH 6,8) 125 mM
SDS 0,1%
APS 0,05%
TEMED 0,1%
4.1.3.16 Solução Corante SDS-PAGE
Metanol 40%
Ácido acético glacial 10%
Comassie blue 0,25%
4.1.3.17 Ponceau S 2X (Sigma)
Ponceau S 2%
Ácido tricloroacético 30%
Ácido sulfossalicílico 30%
4.1.3.18 Solução descorante SDS-PAGE
Metanol 40%
Ácido acético glacial 10%
4.1.3.19 Solução secadora SDS-PAGE
Metanol 30%
Glicerol 10%
36
4.1.3.20 Solução de transferência (pH 8,3)
Tris-HCl 48 mM
Glicina 39 mM
SDS 0,037%
Metanol 20%
4.1.3.21 Solução de Bradford
Coomassie Brilliant Blue G-250
Etanol 95%
Ácido fosfórico 85%
4.1.3.22 APB (tampão para fosfatase alcalina - pH 9,5)
Tris-HCl 0,1 M
NaCl 0,1 M
MgCl
2
5 mM
4.1.3.23 Solução reveladora
APB 10 mL
BCIP 66 µL (fosfato de bromo cloroindolil)
NBT 33 µL (azul de nitro tetrazólio)
A diluição deve ser feita nesta ordem para evitar a formação de precipitado
insolúvel.
4.1.3.24 Solução reagente (pH 8,0)
4-aminoantipirina 4mM
3,5 Dicloro 2mM
Perosidase de Raiz Forte 2mM
Tampão Tris HCl 10mM
37
4.2 Linhagens de B. subtilis e E. coli
Todas as linhagens celulares empregadas nesta pesquisa, relacionadas no
Quadro 1, foram estocadas a -80
o
C em meio LB (item 4.1.1) contendo 25% de
glicerol.
Quadro 1. Linhagens e genótipos de E. coli utilizados no presente estudo.
Bactéria Linhagem Genótipo
E. coli
DH5α
EndA1, recA1, hsdR17,
supE44, gyrA96, thi-1,
relA1, AlacU169
(φ80lacZ∆M15)
E. coli
BL21 DE3λ pLysS F ompT hsdSB (rB mB)
gal dcm (DE3) pLysS
(Cam)
(WEINER; MODEL, 1994)
E. coli
BL21 – Códon Plus®-RIL Cepa de clonagem geral,
contendo o plasmídio
pRIL (ileW, leuY, proL)
Stratagene, La Jolla, US
E. coli
C41 (DE3) F ompT gal hsdSB (rB
mB) dcm lon λDE3 e uma
mutação não
caracterizada
(STUDIER, 1991;
MIROUX; WALKER, 1996)
E. coli
C43 (DE3) F ompT gal hsdSB (rB
mB) dcm lon λDE3 e duas
mutações não
caracterizadas
(MIROUX; WALKER,
1996)
E. coli
SURE E 14 (McrA) ∆ (mcrCB
hsdSMR mrr) 171 end A1
supE44 thi 1 gyrA96 relA1
lac recB recJ sbcC umuC::
Tn5 (kan
r
) uvr C [F` pro
AB lacl
q
Z∆ (M15 Tn10
(Tet
r
)]
Stratagene, La Jolla, US
B. subtilis subtilis
LMD 69.3, também
conhecida como 168
(ATCC 6051)
Linhagem selvagem
38
4.3 Primers
A seqüência dos primers desta pesquisa foi desenhada a partir do gene
pucLM de B. subtilis (LMD 69.3 – ATCC 6051) presente no GeneBank (gi:
32468813). Dois primers foram sintetizados, PUCL5 e PUCL3 (Figura 8), que se
anelam nas regiões 5´ e 3´ do gene pucLM, respectivamente (Figura 9). O primer
PUCL5 contém o códon de iniciação e o sítio de restrição para BamHI na
extremidade 5´. Já o primer PUCL3 contém um sítio para XhoI, mas não possui o
códon de terminação, uma vez que se desejava que a proteína produzida tivesse
uma cauda His
6x
, cuja seqüência seria fornecida pelo vetor de expressão pET21a.
Primer PUCL5 (Tm = 60ºC)
5` – CGGATCCATGTTCACAATGGATGACCTG – 3`
BamH I
Primer PUCL3 (Tm = 60ºC)
5` – GCTCGAGGGCTTTCAGGCTCCGACAT – 3`
Xho I
Vermelho: códon de iniciação
Sublinhado: sítios de restrição
Figura 8. Primers PUCL5 e PUCL3.
4.4 Marcadores de massa molecular
O marcador de massa molecular para DNA utilizado neste estudo foi o 1kb
Ladder (Invitrogen). Os marcadores de massa molecular para proteína empregados
foram: BenchMark™ Prestained Protein Ladder (Invitrogen) e SigmaMARKER™
(Sigma).
39
1 M F T M D D L N Q M D T Q T L T D T L G
1 ATGTTCACAATGGATGACCTGAACCAAATGGACACACAAACACTGACAGACACACTTGGC
PUCL5
21 S I F E H S S W I A E R S A A L R P F S
61 TCTATTTTTGAACACTCTTCATGGATTGCGGAGAGATCCGCAGCACTACGGCCGTTTTCG
41 S L S D L H R K M T G I V K A A D R E T
121 TCCCTTTCTGATCTTCACCGCAAAATGACTGGCATTGTAAAAGCTGCGGATCGCGAGACA
61 Q L D L I K K H P R L G T K K T M S D D
181 CAGCTTGATTTAATCAAAAAGCATCCCCGGCTCGGAACAAAGAAAACAATGAGCGATGAC
81 S V R E Q Q N A G L G K L E Q Q E Y E E
241 TCGGTACGAGAGCAGCAGAACGCAGGGCTCGGCAAATTAGAACAGCAGGAATACGAGGAG
101 F L M L N E H Y Y D R F G F P F I L A V
301 TTTCTCATGCTGAATGAACACTATTATGATCGCTTCGGCTTTCCTTTTATTTTAGCGGTG
121 K G K T K Q D I H Q A L L A R L E S E R
361 AAGGGAAAGACGAAACAGGACATTCACCAAGCCCTGCTGGCAAGGCTTGAGAGCGAACGA
141 E T E F Q Q A L I E I Y R I A R F R L A
421 GAAACGGAGTTCCAGCAGGCCCTTATAGAAATTTACCGAATCGCCCGCTTTCGTCTGGCT
161 D I I T E K G E T Q M K R T M S Y G K G
481 GACATCATCACTGAAAAAGGAGAGACGCAAATGAAAAGAACCATGTCTTATGGCAAAGGA
181 N V F A Y R T Y L K P L T G V K Q I P E
541 AATGTATTTGCATACCGAACGTATTTAAAACCGCTCACTGGAGTGAAGCAAATCCCGGAA
201 S S F A G R D N T V V G V D V T C E I G
601 TCATCTTTTGCCGGAAGAGATAATACCGTTGTCGGCGTTGATGTGACATGCGAAATTGGC
221 G E A F L P S F T D G D N T L V V A T D
661 GGAGAAGCCTTCCTGCCATCATTTACAGACGGAGACAACACTCTCGTCGTGGCAACGGAT
241 S M K N F I Q R H L A S Y E G T T T E G
721 TCAATGAAAAACTTTATCCAGCGCCATCTCGCATCCTATGAAGGAACGACAACCGAGGGG
261 F L H Y V A H R F L D T Y S H M D T I T
781 TTCCTACACTATGTAGCTCACCGATTTTTAGATACCTATTCTCATATGGACACGATCACT
281 L T G E D I P F E A M P A Y E E K E L S
841 CTGACTGGCGAAGACATTCCGTTTGAAGCAATGCCTGCATACGAGGAGAAAGAGCTCAGC
301 T S R L V F R R S R N E R S R S V L K A
901 ACAAGCCGCCTCGTCTTCAGAAGATCGCGTAATGAACGAAGCCGCTCTGTGCTGAAAGCA
321 E R S G N T I T I T E Q Y S E I M D L Q
961 GAACGAAGCGGGAATACCATAACGATTACAGAGCAATACAGCGAAATCATGGATCTTCAG
341 L V K V S G N S F V G F I R D E Y T T L
1021 CTCGTCAAGGTGAGCGGCAACTCCTTCGTCGGCTTCATCCGGGACGAATATACGACTCTC
361 P E D G N R P L F V Y L N I S W Q Y E N
1081 CCGGAAGACGGCAACCGCCCGCTGTTTGTCTATTTAAACATCAGCTGGCAATATGAAAAT
381 T N D S Y A S D P A R Y V A A E Q V R D
1141 ACAAATGACTCATACGCTTCTGATCCAGCACGCTACGTTGCGGCTGAACAAGTCCGCGAC
401 L A S T V F H E L E T P S I Q N L I Y H
1201 TTAGCGAGCACCGTTTTTCACGAGCTCGAAACCCCTTCAATCCAAAACCTAATCTATCAT
421 I G C R I L A R F P Q L T D V S F Q S Q
1261 ATCGGCTGCAGAATATTAGCGAGGTTCCCGCAGCTCACTGATGTCAGCTTCCAATCTCAA
441 N H T W D T V V E E I P G S K G K V Y T
1321 AATCACACGTGGGATACGGTTGTCGAAGAAATCCCGGGCTCAAAAGGAAAAGTCTACACC
461 E P R P P Y G F Q H F T V T R E D A E K
1381 GAACCGCGCCCGCCATACGGTTTCCAACATTTTACCGTGACAAGAGAAGACGCCGAGAAA
481 E K Q K A A E K C R S L K A -
1441 GAAAAACAGAAAGCCGCTGAAAAATGTCGGAGCCTGAAAGCCTGA
PUCL3
Figura 9. Seqüência primária e tradução predita do gene pucLM de B. subtilis. Os nucleotídeos
sublinhados correspondem à região de anelamento dos primers PUCL5e PUCL3.
40
4.5 Plasmídios
O vetor para a clonagem de produto da reação em cadeia da polimerase
(PCR) (pGEM-T) e o vetor de expressão em E. coli (pET21a) estão representados
nas Figuras 10 e 11, respectivamente. As células contendo os plasmídios
recombinantes foram estocadas a -80
o
C em meio LB (Luria-Bertoni) com 25% de
glicerol.
Figura 10. Mapa físico do vetor pGEM-T (Promega).
4.6 Ferramentas de bioinformática
A análise da seqüência do gene clonado foi feita usando o programa Blast-n
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); para as análises de restrição foi empregado o
programa NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php); a tradução
predita do gene foi feita com os programas do pacote Molecular Toolkit
(http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/index.html); a massa molecular da proteína foi
estimada pelo programa Protein Calculator v3.2
(http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html); e a atividade enzimática foi
calculada utilizando a fórmula matemática disponível no site da empresa Kikkoman
(http://www.kikkoman.co.jp/bio/e/common/rinsyou.html).
41
Figura 11. Mapa físico do vetor pET21a e região de múltipla clonagem.
4.7 Extração do DNA cromossomal de B. subtilis
No presente estudo, o DNA cromossomal de B. subtilis foi extraído de acordo
com o protocolo de Marmur e Schildkraut (1961). A bactéria foi semeada em meio
LB ágar e, após 24 h, uma colônia isolada foi transferida para um tubo Falcon de 15
mL contendo 5 mL de meio LB. A seguir, 1 mL desse pré-inóculo foi transferido para
um Erlermeyer de 150 mL contendo 29 mL de meio LB e incubado a 37
o
C sob
agitação (200-250 rpm) por 15 h. Foram coletados 15 mL do inóculo por
42
centrifugação (3.000 x g/10 min/4
o
C), o sobrenadante foi descartado e o pellet de
células foi ressuspendido em 5 mL de tampão TEN e novamente centrifugado (3.000
x g/10 min/4
o
C). O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em
2,5 mL de tampão TEN contendo 376 µL de lisozima (20 mg/mL), ao que se seguiu
incubação a 37
o
C por 30 min.
Após a lise celular, foram adicionados 12,5 µL de RNAse A (4 mg/mL) (item
4.1.3.2) e incubou-se por mais 15 min. A seguir, foi realizada uma incubação a 65
o
C
por 1 h após a adição de 100 µL de SDS 20% e 25 µL de proteinase K (10 mg/mL).
Em seguida, foi realizada extração de proteínas pela adição de 2,5 mL de fenol
saturado seguindo-se homogeneização por inversão do tubo por 10 min e
centrifugação a 2.000 rpm/10 min. A fase aquosa foi transferida para um outro tubo,
seguindo-se uma extração com 2,5 mL de clorofane e outra com o mesmo volume
de clorofil nas mesmas condições descritas anteriormente. A precipitação do DNA foi
realizada ao se ajustar a concentração final de cloreto de sódio para 300 mM na fase
aquosa e pela adição de 2,5 volumes de etanol 100% a -20
o
C.
O DNA cromossomal precipitado foi enrolado em um bastão de vidro por meio
de movimentos circulares no sentido horário e, depois, lavado em etanol 70%
gelado. O material foi deixado à temperatura ambiente até secar, após o que foi
dissolvido em 1,5 mL de Tampão R. Após isolamento do DNA cromossomal, este foi
quantificado em espectrofotômetro por leitura no comprimento de onda de 260 nm.
4.8 Análise do DNA em gel de agarose
O gel de agarose na concentração desejada foi feito em tampão TEB 0,5X ou
TAE 1X. A solução de agarose foi aquecida até dissolver-se por completo e, a
seguir, foi adicionado 0,5 µg/mL de EtBr. As amostras de DNA foram preparadas
adicionando-se tampão de amostra em concentração final de 1X e aplicadas no gel.
Em seguida, o gel foi submetido a eletroforese em tampão de corrida TEB 0,5X ou
TAE 1X. A visualização dos ácidos nucléicos foi feita sob a luz ultravioleta (UV) de
um transiluminador.
43
4.9 PCR
As condições da PCR utilizadas para a amplificação do gene da uricase com
a Taq polimerase (Cenbiot) a volume final de 50 µL são apresentadas na Tabela 1.
Condições da PCR: 1) 94
o
C/1 min; 2) 50
o
C/45 s; 3) 72
o
C/1,5 min; 4) 72
o
C/5 min; 5)
4
o
C. Os passos 1, 2 e 3 foram repetidos 30 vezes.
Tabela 1. Condições da PCR utilizadas para a amplificação do gene da uricase com a Taq
polimerase (Cenbiot).
Reagente
Volume (µL)
Concentração final
Tampão (CENBIOT) 5 1X
dNTP 10 X 5 1X
Cloreto de magnésio 50 mM 2,5 2,5 mM
Primers 5 pmol/µL
2 10 pmol
DNA cromossomal (10 ng/µL) 1 10 ng
Taq polimerase (CENBIOT) 1 1 U
A PCR utilizando a Taq Platinum (Invitrogen) foi realizada com o mesmo
material e na mesma concentração descritos acima a volume final de 50 µL. As
condições da PCR são apresentadas na Tabela 2. Condições da PCR: 1) 94
o
C/30 s;
2) 50
o
C/30 s; 3) 68
o
C/1,5 min; 4) 4
o
C. Os passos 1, 2 e 3 foram repetidos 30 vezes.
Para o cálculo do Tm foi utilizada a fórmula empírica: Tm (ºC)= 4(G+C) +
2(A+T).
44
Tabela 2. Condições da PCR utilizadas para a amplificação do gene da uricase com a Taq Platinum
(Invitrogen).
Reagente
Volume (µL)
Concentração final
Tampão 5 1X
dNTP 10 mM 1 0,2 mM cada
Sulfato de magnésio 50 mM 2 2 mM
Primers 10 µM cada
1
0,2 µM cada
DNA cromossomal 10 ng/µL
0,5 5 ng
Taq Platinum (Invitrogen) 0,2 1 U
4.10 Purificação do produto de PCR
Para a remoção dos primers não incorporados, assim como do óleo mineral,
os produtos de PCR foram purificados utilizando o QIAquick PCR Purification kit
(QIAGEN), seguindo-se as recomendações do fabricante. Foram adicionados 5
volumes de Tampão PBS (item 4.1.2.15) à reação de PCR, a qual foi colocada em
uma coluna QIAquick, que é encaixada em um microtubo de 2 mL presente no kit, e
a amostra foi centrifugada (13.000 rpm/45 s). O líquido eluído foi descartado e a
coluna encaixada no mesmo microtubo. A coluna foi lavada com 750 µL de Tampão
TE (item 4.1.2.14) e centrifugada (13.000 rpm/45 s). O líquido eluído foi descartado e
a coluna encaixada no mesmo microtubo, tendo sido o material centrifugado (13.000
rpm/1 min). A seguir, a coluna foi encaixada em tubo de 1,5mL e o DNA foi eluído
com 30 µL de água Milli Q.
4.11 Purificação do DNA plasmidial
O protocolo de extração de plasmídios de E. coli foi baseado na técnica de
lise alcalina descrita por Birboim e Dolly (1979) com algumas modificações. Colônias
individuais de E. coli foram incubadas em meio L (4-5 mL) com o antibiótico
45
ampicilina (100 µg/mL) a 37
o
C, sob agitação (200-250 rpm), durante 18 h. A cultura
de células foi centrifugada (10.000 x g/2 min) e o sedimento foi, então,
ressuspendido em 200 µL de TE. Em seguida, foram adicionados 360 µL de Solução
II (item 4.1.3.11), invertendo-se gentilmente o tubo várias vezes e incubando-se à
temperatura ambiente por 5 min. Posteriormente, foram adicionados 300 µL de
Solução III (item 4.1.3.12), o tubo foi invertido gentilmente por várias vezes e
incubado em gelo por 5 min. O material foi centrifugado (10.000 x g/5 min) e o
sobrenadante transferido para um novo tubo ao qual foram adicionados 750 µL de
isopropanol 100%, procedendo-se à centrifugação (10.000 x g/5 min). O
sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em 200 µL de TE. Foram
adicionados 110 µL de acetato de amônia 7,5 M misturando-se vigorosamente. A
solução foi centrifugada (10.000 x g/10 min) e o sobrenadante transferido para um
novo tubo. O DNA foi precipitado por adição de 750 µL de etanol 100% e o sistema
foi centrifugado (10.000 x g/5 min). O sobrenadante foi descartado e o precipitado
lavado com etanol 70%, sendo novamente centrifugado (10.000 x g/2 min). O
sobrenadante foi descartado e, após secagem a vácuo, o precipitado foi
ressuspendido em 50 µL de TE e 0,5 µL de RNAse A.
A purificação plasmidial também foi realizada utilizando-se o QIAPrep Spin
Mini Kit (QIAGEN) seguindo-se as recomendações do fabricante quando era
necessária maior pureza para seqüenciar o material.
4.12 Purificação do DNA plasmidial com fenol-clorofórmio
Colônias individuais de E. coli foram incubadas em 100 mL de meio L com o
antibiótico ampicilina (100 µg/mL) e as células foram crescidas a 37
o
C, sob agitação
(200-250 rpm), durante 20 h. A cultura celular foi centrifugada (5.000 x g/10 min) e o
sedimento ressuspendido em 2 mL de TE. A seguir, foram adicionados 6 mL de
Solução II preparada na hora, invertendo-se gentilmente o tubo várias vezes, o qual
foi incubado por 5 min à temperatura ambiente. Posteriormente, foram adicionados 6
mL de Solução III, o tubo foi invertido gentilmente por várias vezes e incubado em
gelo por 10 min. O material foi centrifugado (10.000 x g/10 min) e o sobrenadante
filtrado com gaze e transferido para um novo tubo ao qual foram adicionados 10 mL
46
de clorofane. Esse material foi centrifugado (2.000 rpm/10min), a fase aquosa foi
transferida para um novo tubo e, a seguir, foi adicionado um volume igual de
isopropanol. O material foi homogeneizado gentilmente e centrifugado (10.000 x
g/10 min). O sobrenadante foi descartado e o pellet lavado com etanol 70%
procedendo-se à centrifugação (10.000 x g/5 min). O sobrenadante foi descartado e,
após secagem a vácuo, o precipitado foi ressuspendido em 200 µL de TE e 20 µL de
RNAse A.
Para obter maior grau de purificação de DNA, 15 µg de solução plasmidial
foram dissolvidos em 250 µL de água destilada e a este volume adicionaram-se 15
µL de EtBr e 140 µL de acetado de amônio 7,5 M. A solução foi homogeneizada e
mantida fora da luz UV. A seguir, foram adicionados 420 µL de fenol-clorofórmio, o
tubo foi invertido gentilmente várias vezes e foi realizada uma rápida centrifugação
(12.000 x g/2 min). A fase aquosa foi removida para um tubo novo, foram
adicionados 2 volumes de etanol 100%, incubando-se por 2 min à temperatura
ambiente e, em seguida, o sistema foi submetido a centrifugação (12.000 x g/5 min).
O sobrenadante foi descartado e o pellet foi lavado com etanol 70% e centrifugado
(12.000 x g/5min). O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em
tampão TE contendo RNAse A.
4.13 Digestão do DNA com enzimas de restrição
Todas as digestões realizadas neste estudo foram feitas com as enzimas de
restrição XhoI (Promega) e BamHI (Qbiogene), com tampão NEB2 e em presença
de BSA, de acordo com as recomendações dos fabricantes. A concentração do
material utilizado variou entre 500 ng e 5 µg e o sistema foi incubado em banho-
maria a 37ºC por 2-3 h.
O produto da digestão foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8% a
2% preparado com tampão TAE 1X, de acordo com o tamanho do fragmento a ser
purificado. A região do gel que continha o fragmento de interesse foi cortada e
submetida a purificação utilizando o kit GeneClean (Bio101), seguindo-se as
recomendações do fabricante.
47
4.14 Sistema de ligação
Os sistemas de ligação foram feitos na proporção de 1:3 (vetor/inserto) para
ligação de extremidades coesivas. O volume do sistema de ligação foi entre 10-20
µL e a quantidade de T4 DNA ligase foi de 400 U. Nos ensaios de ligação utilizou-se
enzima T4 DNA ligase proveniente da New England Biolabs Inc., que recomenda
incubação a 16ºC, e da Promega, que recomenda incubação a 4ºC. O sistema foi
incubado por 16-24 h.
4.15 Transformação de células de E. coli
As células da linhagem de E. coli foram inoculadas em 5 mL de meio LB e
incubadas a 37ºC, sob agitação (200-250 rpm), durante 16 h. Em seguida, 1 mL do
pré-inóculo foi adicionado a 30 mL de meio LB e a cultura foi incubada a 37ºC, sob
agitação (200-250 rpm) até atingir a OD
600
de 0,2-0,3. As células foram coletadas por
centrifugação (5.000 x g/10 min/4ºC), o pellet ressuspendido em 10 mL de solução
de cloreto de cálcio 100 mM e, novamente centrifugado (5.000 x g/10 min/4ºC). As
células foram ressuspendidas em 1 mL de solução de cloreto de cálcio 100 mM. As
células DH5α foram estocadas em presença de 15% de glicerol em alíquotas de 100
µL a -80 ºC e as células BL21 DE3λ pLysS, BL21 [DE3] C41, BL21 [DE3] C43, BL21
[DE3]) PRILL e SURE foram utilizadas logo após esse experimento em alíquotas de
50 µL.
Foi adicionado às células competentes metade do volume do sistema de
ligação e o sistema foi incubado em gelo por 30 min. O choque térmico foi realizado
a 42ºC por 90 s, adicionou-se 1mL de meio LB e, a seguir, foi feita incubação em
banho-maria a 37ºC por 1 h. Foram plaqueadas de 50-200 µL de células
transformadas em cada placa de Petri contendo meio LB-ágar acrescido de
ampicilina (100 µg/mL). Quando necessário, 40 µL de uma solução de X-gal 2%
foram espalhados na superfície das placas contendo LB-ágar.
48
4.16 Indução da expressão da enzima recombinante
Células de E. coli (BL21 DE3λ pLysS, BL21 [DE3] C41, BL21 [DE3] C43,
BL21 [DE3] PRILL e SURE) contendo o vetor com o inserto (controle positivo) e
outra sem o vetor (controle negativo) foram inoculadas em 50-100 mL de meio LB
com ampicilina (100 µg/mL) e incubadas a 37ºC, sob agitação (200-250 rpm), por 2
h. Coletou-se 1 mL da cultura (tempo de indução = 0) a 8.000 rpm/2 min,
descartando-se o sobrenadante; o pellet for ressuspendido em 50 µL de tampão de
amostra 2X para proteína. Ao material restante foi adicionado isopropil-β-tio-
galactosídeo (IPTG) 1 mM (item 4.1.3.24), seguindo-se incubação a 37ºC, sob
agitação (200-250 rpm), por 2 h. Foram coletadas amostras de 1 mL nos tempos de
15, 30, 60, 90 e 120 min após a indução com IPTG. Essas amostras foram, então,
coletadas e tratadas como descrito anteriormente.
O mesmo experimento de indução da expressão da enzima recombinante,
citado acima, foi modificado com a adição de rifampicina na concentração final de
200 µg/mL depois de 25 min de indução. O material coletado e tratado da mesma
forma citada acima foi comparado em SDS-PAGE com o material obtido sem a
adição de rifampicina.
4.17 Análise de proteína em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE)
O gel de poliacrilamida foi preparado nas concentrações de 10% ou 12%. As
amostras de proteínas foram preparadas adicionando-se tampão de amostra
desnaturante (item 4.1.2.13) na concentração final de 1X, fervidas por 5 min e
aplicadas no gel. Em seguida, o gel foi submetido a eletroforese a 120 V em tampão
de corrida Tris-glicina com SDS 1X (item 4.1.2.11). No final da eletroforese, o gel foi
corado com Coomassie Blue R-250 por 20 min e descorado com solução descorante
(item 4.1.3.18) até as bandas de proteína ficarem nítidas.
49
4.18 Western Blot
Após a eletroforese, o gel de poliacrilamida foi colocado em solução de
transferência (item 4.1.3.20) por 15 min. Para a transferência foi empregado
equipamento de transferência da Bio-Rad. Para a montagem foram colocados 6
papéis de filtro, uma membrana de nitrocelulose, o gel de poliacrilamida e mais 6
papéis de filtro, nesta ordem. Todo o material citado acima havia sido mergulhado
anteriormente em tampão de transferência. A transferência foi realizada a 10 V por
30 min e a amperagem não excedeu 5,5 mA/cm
2
. Após a transferência, a membrana
de nitrocelulose foi corada com Ponceau S 1X e o gel transferido foi corado com
Coomassie Blue R-250 e descorado com solução descorante. Marcaram-se na
membrana de nitrocelulose as posições dos poços, do marcador de proteína e da
proteína esperada e, em seguida, retirou-se o Ponceau S (item 4.1.3.17) com água
destilada. A membrana foi lavada com PBS e bloqueada com Blotto (5 g de leite em
pó diluído em PBS-T) a 16ºC durante a noite. A membrana foi lavada três vezes com
PBS-T por 5 min. Foi adicionado o anticorpo anti-His-tag conjugado com fosfatase
alcalina (Sigma) na diluição de 1:1.000, seguindo-se incubação à temperatura
ambiente, sob agitação, por 2 h. Após esse período, a membrana foi lavada três
vezes por 5 min com PBS e uma vez com APB (item 4.1.3.22). A solução reveladora
(item 4.1.3.23) foi adicionada e, ao aparecer a proteína marcada com o anticorpo, a
reação foi parada com água destilada.
4.19 Purificação da enzima recombinante
Após a expressão da enzima recombinante (item 4.16), foi realizada a
purificação da uricase recombinante. Primeiramente, a purificação foi realizada em
uma escala menor, seguindo o protocolo 14 (The QIAexpressionist – 06/2003) e,
depois, em uma escala maior, de 100 mL, seguindo os protocolos 6, 8 e 11 (The
QIAexpressionist – 07/1997).
Para a purificação em uma escala menor utilizou-se 1 mL de cultura induzida,
que foi coletada (15.000 x g/1 min) e o sobrenadante descartado. O pellet foi
ressuspendido em 100 µL de tampão de lise (item 4.1.2.5) e foi adicionada lisozima
50
(1 mg/mL). O sistema foi incubado em gelo por 30 min e, em seguida, misturado
vigorosamente, evitando-se a formação de bolhas, e centrifugado (15.000 x g/10
min). O sobrenadante foi transferido para um tubo de 1,5 mL e foram adicionados 20
µL de resina de agarose ligada a níquel (Ni-NTA) (slurry 50%), misturando-se
gentilmente por 30 min a 4
o
C. O material foi centrifugado (1.000 x g/10 s) e o
sobrenadante transferido para um novo tubo. A resina foi lavada duas vezes com
100 µL de tampão de lavagem (item 4.1.2.6) e a proteína foi eluída três vezes com
20 µL de tampão de eluição (item 4.1.2.7).
Para a purificação em uma escala maior foram utilizados 100 mL de meio de
cultura induzida por IPTG. A cultura foi coletada (4.000 x g/20 min/4
o
C),
descartando-se o sobrenadante e o pellet foi armazenado a -80
o
C por 16 h. O pellet
foi ressuspendido em 4 mL de tampão de lise contendo lisozima (1 mg/mL) e
incubado por 30 min no gelo. Em seguida, o material foi submetido a sonicação com
seis vezes pulsos de 10 s a 200-300 W, mantendo-se o sistema no gelo durante este
procedimento. Em seguida, esse material foi aplicado em coluna cromatográfica,
constituída por uma seringa hipodérmica de 5 mL contendo 1 mL de Ni-NTA (slurry
50%), já equilibrada com o tampão de lise a 4
o
C. O mesmo material foi aplicado
através da resina por cinco vezes e, depois, coletado em microtubos de 1,5 mL. O
tampão de lavagem foi adicionado à coluna de 1 mL em 1 mL, e cada amostra de 1
mL foi coletada separadamente em microtubo até volume final de eluição de 8 mL.
Na etapa de eluição da enzima recombinante, o tampão de eluição (volume final de
4 mL) foi adicionado à coluna e 500 µL foram coletados separadamente em 4
microtubos.
As amostras obtidas após a cromatografia de Ni-NTA foram dialisadas contra
água destilada, liofilizadas e ressuspendidas em 4 mL de tampão 10 mM Tris-HCl,
pH 8,0. Com esse material foi realizada cromatografia de troca iônica em coluna
contendo 60 mL de resina Q-Sepharose com fluxo de 1,5 mL/1 min.
4.20 Determinação da atividade uricásica
O ensaio de atividade enzimática foi realizado com a incubação da enzima em
tampão Tris HCl 10mM, pH 8,0 a 37º C por 15 min. Em seguida, foi adicionada a
solução reagente (item 4.1.3.24) e realizada a leitura da absorbância em
51
espectrofotômetro de luz visível a 555 nm à temperatura ambiente por 5 min. Os
ensaios foram realizados três vezes e em triplicata. Uma unidade enzimática é
definida como a quantidade de enzima que degrada 1,0 µmol de ácido úrico em 1
min à temperatura ambiente. Utilizou-se a fórmula matemática descrita em Kikkoman
(http://www.kikkoman.co.jp/bio/e/common/rinsyou.html) para o cálculo da atividade
enzimática, como segue:
U/mL = (∆As – ∆Ao) x 1mL x Fd/32,8 x 0,5 x (volume da amostra)
sendo:
U = unidade enzimática;
∆As = média da absorbância em presença da enzima uricase;
∆Ao = média da absorbância em ausência da enzima uricase (branco);
32,8 = coeficiente de extinção molar da quinoneimina sob as condições do ensaio
(cm
2
/µmol);
Fd = fator de diluição;
1 mL = volume final do ensaio;
0,5 = fator baseado no fato de que 1 mol de peróxido de hidrogênio produz 0,5 de
quinoneimina.
E, finalmente, o método de Bradford foi utilizado para a determinação da
proteína (BRADFORD, 1976).
4.21 Seqüenciamento
O produto de PCR obtido com Taq Platinum foi seqüenciado
automaticamente utilizando-se o MegaBACE Dye Terminator kit (GE Helthcare) e
analisado em seqüenciador MegaBACE 1000 (GE Healthcare). A quantidade de
amostra submetida ao seqüenciamento automático foi de 200 ng de DNA, utilizando-
se 1 µL de solução de primer 5 pmol/mL (Anexo D). A análise da qualidade do
seqüenciamento foi realizada pelos programas Phrad e Phred e a análise das
seqüências foi realizada pela comparação com a seqüência depositada em banco de
dados com o auxílio do programa Blast-n.
52
4.22 Espectrometria de massa
As amostras obtidas após a cromatografia de afinidade em resina de níquel
(item 4.19) foram dialisadas em água destilada e liofilizadas.
A fração liofilizada obtida foi dissolvida em água nanopura, misturada em uma
solução saturada de uma matriz constituída por ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (1:3
= 2 µL de amostra para cada 6 µL de matriz), depositada em uma placa do tipo
Anchorchip com 600 mm (0,5 µL por spot) e posta para secar à temperatura
ambiente. Os componentes tiveram suas massas moleculares exatas determinadas
utilizando espectrômetro de massa MALDI-TOF/TOF UltraFlex II (Bruker Daltonics,
Alemanha), utilizando calibração externa sob modo de operação linear (positivo) em
freqüência de 50 Hz.
53
5 RESULTADOS
5.1 Clonagem do gene da uricase de B. subtilis
Para clonar o gene pucL, que codifica a enzima uricase de B. subtilis, foi
utilizada a técnica de PCR. Após isolamento de DNA cromossomal de B. subtilis, a
concentração deste foi estimada em 3,15 µg/µL e a solução foi diluída para uma
concentração de trabalho de 10 ng/µL. Para amplificação do gene da uricase foi
realizada uma PCR com primers desenhados a partir da seqüência publicada do
gene pucL de B. subtilis. Inicialmente, foi feita uma PCR com Taq polimerase
obtendo-se um fragmento de ~1,5 kb (dados não mostrados), tamanho consistente
com o gene pucL. Para reduzir a possibilidade de erros durante a PCR, o
experimento foi repetido usando-se, desta vez, a DNA polimerase Taq Platinum
(uma mistura de Taq polimerase e Pfu polimerase), uma enzima de alta fidelidade.
Mais uma vez, foi obtido um fragmento de ~1,5 kb utilizado para os ensaios
seguintes. A Figura 12 mostra o resultado desse experimento.
Figura 12. Análise em gel de agarose 0,8% do gene pucL amplificado por PCR utilizando Taq
Platinum. 1) Marcador de massa molecular 1 kb DNA Ladder (Invitrogen); 2) Gene da uricase
amplificado (~1,5 kb).
1,6 kb
1 2
54
O produto de PCR foi purificado e, em seguida, ligado ao plasmídio pGEM-T,
seguindo-se a transformação de E. coli DH5α. A seguir, foi realizada uma mini prep
de clones transformantes selecionados e os plasmídios obtidos foram submetidos a
uma digestão com as enzimas BamHI e XhoI para verificar a presença do inserto de
~1,5 kb. Um dos plasmídios que continha o inserto de tamanho esperado foi
selecionado (pGEMURI) para a continuação do trabalho (Figura 13).
Figura 13. Análise de restrição em gel de agarose 0,8% do vetor pGEMURI. 1) pGEMURI intacto; 2)
pGEMURI digerido com as enzimas BamHI e XhoI; 3) Marcador de massa molecular 1 kb DNA
Ladder (Invitrogen).
A clonagem do gene da uricase foi confirmada por seqüenciamento das
extremidades do produto da PCR obtido com a Taq Platinum. Para o
seqüenciamento foram utilizados os primers PUCL5 e PUCL3. As duas seqüências
obtidas foram submetidas à análise Blast-n e o resultado foi uma alta identidade com
o gene pucLM de B. subtilis (Figura 14).
1 2 3
1,6 kb
55
gi|32468813|emb|Z99120.2|BSUB0017 Bacillus subtilis complete genome (section 17 of 21): from 3213330 to 3414388
Length = 201059
Score = 646 bits (326), Expect = 0.0
Identities = 382/390 (97%), Gaps = 8/390 (2%)
Strand = Plus / Plus
Query: 38 attgcggagagatccgcagcactacggccgttt-cgtccctttctgatcttcacncgaca 96
||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| || ||
Sbjct: 118943 attgcggagagatccgcagcactacggccgttttcgtccctttctgatcttcac-cg-ca 119000
Query: 97 aaatgactggcattgtaaaagctgcggatcgcgagacacagcttgatttaatcaaaaagc 156
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 119001 aaatgactggcattgtaaaagctgcggatcgcgagacacagcttgatttaatcaaaaagc 119060
Query: 157 atccccgtgctcgtgaacaaacgaaaacaatgacgcgatgactcggtacgagagcagcag 216
||||||| ||||| ||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 119061 atccccg-gctcg-gaacaaa-gaaaacaatga-gcgatgactcggtacgagagcagcag 119116
Query: 217 aacgcagggctcggcaaattagaacagcaggaatacgaggagtttctcatgctgaatgaa 276
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 119117 aacgcagggctcggcaaattagaacagcaggaatacgaggagtttctcatgctgaatgaa 119176
Query: 277 cactattatgatcgcttcggctttccttttattttagcggtgaagggaaagacgaaacag 336
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 119177 cactattatgatcgcttcggctttccttttattttagcggtgaagggaaagacgaaacag 119236
Query: 337 gacattcaccaagaccctgctggcaaggcttgagagcgaacgagaaacggagttccagca 396
||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 119237 gacattcaccaag-ccctgctggcaaggcttgagagcgaacgagaaacggagttccagca 119295
Query: 397 ggcccttatagaaatttaccgaatcgcccg 426
||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 119296 ggcccttatagaaatttaccgaatcgcccg 119325
>gi|32468813|emb|Z99120.2|BSUB0017 Bacillus subtilis complete genome (section 17 of 21): from 3213330 to
3414388
Length = 201059
Score = 664 bits (335), Expect = 0.0
Identities = 335/335 (100%)
Strand = Plus / Minus
Query: 1 gaaaccgtatggcgggcgcggttcggtgtagacttttccttttgagcccgggatttcttc 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 120262 gaaaccgtatggcgggcgcggttcggtgtagacttttccttttgagcccgggatttcttc 120203
Query: 61 gacaaccgtatcccacgtgtgattttgagattggaagctgacatcagtgagctgcgggaa 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 120202 gacaaccgtatcccacgtgtgattttgagattggaagctgacatcagtgagctgcgggaa 120143
Query: 121 cctcgctaatattctgcagccgatatgatagattaggttttggattgaaggggtttcgag 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 120142 cctcgctaatattctgcagccgatatgatagattaggttttggattgaaggggtttcgag 120083
Query: 181 ctcgtgaaaaacggtgctcgctaagtcgcggacttgttcagccgcaacgtagcgtgctgg 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 120082 ctcgtgaaaaacggtgctcgctaagtcgcggacttgttcagccgcaacgtagcgtgctgg 120023
Query: 241 atcagaagcgtatgagtcatttgtattttcatattgccagctgatgtttaaatagacaaa 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 120022 atcagaagcgtatgagtcatttgtattttcatattgccagctgatgtttaaatagacaaa 119963
Query: 301 cagcgggcggttgccgtcttccgggagagtcgtat 335
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 119962 cagcgggcggttgccgtcttccgggagagtcgtat 119928
Figura 14. Resultado da análise Blast-n da seqüência do produto de PCR.
56
5.2 Expressão de uricase em E. coli
Para a expressão do gene da uricase em bactéria foi escolhido o vetor de
expressão pET21a (Novagen), que foi amplificado em E. coli DH5α. O vetor obtido
foi submetido a duas digestões. A primeira foi realizada com a enzima de restrição
XhoI (Promega) e a segunda, com a enzima de restrição BamHI (Qbiogene). Após a
confirmação da linearização do vetor, este foi eluído em gel de agarose 0,8%. Esse
mesmo procedimento foi realizado para obter o fragmento de ~1,5 kb presente no
vetor pGEMURI. Logo após, foi feito o sistema de ligação seguindo-se
transformação de E. coli DH5α por choque térmico. Quatro clones foram
amplificados e submetidos a análises. Uma análise preliminar dos plasmídios
intactos em gel de agarose revelou que os clones 1, 2, 3 e 5 poderiam ter o inserto
devido a um retardamento eletroforético em comparação com o vetor pET21a intacto
(clone 4), enquanto o clone 6 aparentemente não possuía inserto (Figura 15).
Figura 15. Análise em gel de agarose 0,8% de plasmídios isolados após transformação com sistema
de ligação pET21a + gene pucL. 1) clone 1; 2) clone 2; 3) clone 3; 4) pET21a intacto; 5) clone 4; 6)
clone 5.
1
2
3
4
5
6
57
Os clones 1, 2 e 5 foram submetidos a uma digestão com as enzimas de
restrição XhoI e BamHI e a presença do inserto foi confirmada pela liberação de
fragmento de ~1,5 kb (dados não mostrados). A Figura 16 mostra a análise de
restrição do clone 1, denominado pETURI, o qual foi selecionado para a continuação
do trabalho.
Figura 16. Análise de restrição em gel de agarose 0,8% do vetor pETURI. 1) 1 kb DNA Ladder
(Invitrogen); 2) pETURI digerido com BamHI e XhoI; 3) pETURI intacto.
O vetor pETURI foi usado para transformar as linhagens de E. coli BL21 DE3λ
pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL e SURE. Colônias
transformantes isoladas foram submetidas à análise de indução por adição de IPTG
1 mM. Amostras de culturas de células de E. coli BL21 DE3λ pLysS contendo o vetor
pETURI foram coletadas no tempo zero (antes da indução) e nos tempos de 30, 60,
90 e 120 min após a indução. A Figura 17 mostra o resultado do ensaio de indução,
podendo-se notar a presença de uma banda protéica de ~63 kDa que aumenta em
intensidade após a indução com IPTG (a massa molecular teórica da proteína
recombinante foi calculada em 58,9 kDa) (Figura 18).
1 2 3
1,6 kb
58
Figura 17. Análise em gel SDS-PAGE 12% da indução de expressão da uricase em E. coli BL21
DE3λ pLysS. Amostras de extrato de células expressando uricase foram coletadas em diversos
tempos e analisadas em gel de poliacrilamida 12%. 1) Marcador BenchMarker – Invitrogen. 2) t = 0; 3)
t = 15 min; 4) t = 30 min; 5) t = 60 min; 6) t = 90 min; 7) t = 120 min.
MASMTGGQQM GRGSMFTMDD LNQMDTQTLT DTLGSIFEHS SWIAERSAAL RPFSSLSDLH 60
RKMTGIVKAA DRETQLDLIK KHPRLGTKKT MSDDSVREQQ NAGLGKLEQQ EYEEFLMLNE 120
HYYDRFGFPF ILAVKGKTKQ DIHQALLARL ESERETEFQQ ALIEIYRIAR FRLADIITEK 180
GETQMKRTMS YGKGNVFAYR TYLKPLTGVK QIPESSFAGR DNTVVGVDVT CEIGGEAFLP 240
SFTDGDNTLV VATDSMKNFI QRHLASYEGT TTEGFLHYVA HRFLDTYSHM DTITLTGEDI 300
PFEAMPAYEE KELSTSRLVF RRSRNERSRS VLKAERSGNT ITITEQYSEI MDLQLVKVSG 360
NSFVGFIRDE YTTLPEDGNR PLFVYLNISW QYENTNDSYA SDPARYVAAE QVRDLASTVF 420
HELETPSIQN LIYHIGCRIL ARFPQLTDVS FQSQNHTWDT VVEEIPGSKG KVYTEPRPPY 480
GFQHFTVTRE DAEKEKQKAA EKCRSLKALG HH HHHH 516
Massa molecular (Isotopically Averaged) = 58933,0547
pI estimado = 6,34
Carga estimada a pH 7,0 = -7,5
Figura 18. Seqüência teórica da enzima recombinante produzida em E. coli. Em preto, a seqüência
da uricase codificada pelo gene pucL de B. subtilis. Em vermelho, os resíduos de aminoácidos
introduzidos à seqüência do gene pucL após clonagem no vetor pET21a. As características da
proteína indicadas abaixo da seqüência foram determinadas pelo programa Protein Calculator v3.2 (s.
d.).
1 2 3 4 5 6 7
~63kDa
60kDa
59
Nos ensaios de indução com as linhagens E. coli BL21 (DE3) C41, BL21
(DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL e SURE, contendo o vetor pETURI, notou-se a
presença de uma banda protéica de ~63 kDa que aumenta de intensidade após a
indução com IPTG.
O ensaio de indução de expressão de uricase em E. coli BL21 DE3λ pLysS foi
realizado com a adição de rifampicina na concentração final de 200 µg/mL na
tentativa de diminuir a síntese protéica de proteínas intracelulares produzidas pela
bactéria e, desta forma, facilitar a purificação da enzima recombinante. A Figura 19
mostra diminuição da banda protéica expressa, bem como das demais proteínas
com a adição de rifampicina.
Figura 19. Comparação da indução de expressão da uricase em E. coli BL21 DE3λ pLysS sem e com
a adição de rifampicina. Amostras de extrato de células expressando uricase foram coletadas em
diversos pontos e analisadas em gel de poliacrilamida 12%. 1) t = 0; 2) t = 60 min sem rifampicina; 3) t
= 60 min com rifampicina; 4) t = 120 min sem rifampicina; 5) t = 120 min com rifampicina; 6) t = 180
min sem rifampicina; 7) t = 180 min com rifampicina; 8) Marcador BenchMarker – Invitrogen.
Para confirmar que a proteína de indução é específica para células contendo
o vetor pETURI foi feita indução com células transformadas com o vetor pET21a. As
amostras foram coletadas no tempo zero (antes da indução) e depois de 3 h de
12 34
5
67
8
50kDa
60kDa
60
indução. A Figura 20 mostra que a proteína de indução de ~63 kDa é específica em
células transformadas com o vetor pETURI.
Figura 20. Análise em gel SDS-PAGE 10% do perfil protéico de células BL21 DE3λ pLysS
transformadas com os vetores pET21a e pETURI e submetidas a indução com IPTG. 1) Marcardor
BenchMarker; 2) BL21/pET21a, t = 0; 3) BL21/pET21a, t = 3 h; 4) Marcardor BenchMarker; 5)
Marcador SigmaMARKER™; 6) BL21/pETURI, t = 3 h, 7) BL21/pETURI, t = 0.
A linhagem de E. coli BL21 DE3λ pLysS foi escolhida para os ensaios
seguintes por produzir uma proteína recombinante estável e solúvel em grandes
quantidades. Para confirmar que a banda de indução correspondia a uma espécie
protéica contendo uma cauda de histidina (His-tag), foi realizado o ensaio de
Western Blot com as amostras obtidas no ensaio de indução (Figura 17), utilizando-
se o anticorpo anti-His-tag (Sigma). O resultado do Western Blot (Figura 21) revelou
que o anticorpo foi capaz de reconhecer a principal proteína de indução de ~63 kDa
e que outras espécies menores também foram reconhecidas.
1 2 3 4 5 6 7
50kDa
60kDa
61
Figura 21. Western Blot de culturas de E. coli BL21 DE3λ pLysS expressando uricase de B. subtilis.
Extratos de células expressando uricase foram coletados em diversos tempos de indução e a proteína
recombinante foi detectada com anticorpo anti-His-tag. 1) Marcador Bench Marker; 2) t = 0; 3) t = 15
min; 4) t = 30 min; 5) 60 min; 6) 90 min; 7) 120 min.
5.3 Purificação da enzima recombinante
A enzima recombinante obtida da cultura de E. coli BL21 DE3λ pLysS foi
submetida a uma primeira etapa de purificação em coluna contendo Ni-NTA. Para
tanto, 100 mL de uma cultura de células induzidas com IPTG 1 mM por 3 h foram
lisados e o sobrenadante foi aplicado na coluna de afinidade. Após lavagem, a
enzima foi eluída com tampão de eluição contendo imidazol 200 mM. A Figura 22
mostra o perfil protéico das amostras coletadas da coluna Ni-NTA.
12
3
45
6
7
~
63kD
62
Figura 22. Análise em gel SDS-PAGE 12% das etapas de purificação da enzima recombinante em
coluna de afinidade Ni-NTA. 1) Marcador Bench Marker; 2) Células antes da indução (t = 0); 3)
Células após 3 h de indução; 4) Amostra do extrato celular antes da aplicação na coluna (input); 5)
Flow-thru; 6) Lavagem; 7) Terceira fração de 500 µL eluída com imidazol 200 mM; 8) Quarta fração
de 500 µL eluída com imidazol 200 mM; 9) Marcador Bench Marker.
A presença da proteína de indução foi detectada em todas as frações eluídas,
embora sua maior concentração tivesse sido verificada nas frações eluídas com
imidazol. Isso revela que houve saturação da coluna. Também foi verificada a
presença de outras espécies protéicas menores do que 60 kDa, as quais poderiam
ser produtos de degradação no N-terminal da proteína, pois o C-terminal contém o
His-tag responsável pela interação com a coluna.
Nessa etapa de purificação parcial foi realizado o ensaio de atividade
enzimática das amostras eluídas com imidazol 200 mM, obtendo-se atividade
específica de 39 U/mg. Uma nova tentativa de purificação foi realizada com
diferentes concentrações de imidazol presente no tampão de eluição, com a
finalidade de reduzir a quantidade de espécies protéicas menores do que 60 kDa
presentes na fração eluída. A eluição foi feita por step gradiente com concentrações
crescentes de imidazol de 50, 100, 150 e 200 mM. A Figura 23 mostra a eluição da
1
234 5
67
89
50kDa
60kDa
63
proteína em todas as frações contendo diferentes concentrações de imidazol
presente no tampão de eluição. A atividade enzimática também foi detectada em
todas as frações citadas acima. Todavia, o step gradiente de imidazol não foi
suficiente para otimizar a purificação devido à degradação enzimática.
Figura 23. Análise em gel SDS-PAGE 12% das proteínas eluídas por step gradiente com o tampão
de eluição contendo diferentes concentrações de imidazol (50, 100, 150 e 200 mM). 1) Amostras de
células 3 h após indução; 2) Eluição com imidazol 50mM; 3) Eluição com imidazol 50mm; 4) Eluição
com imidazol 100 mM; 5) Eluição com imidazol 100 M; 6) Marcador Bench Marker; 7) Eluição com
imidazol 150 mM; 8) Eluição com imidazol 150 mM; 9) Eluição com imidazol 200 mM; 10) Eluição com
imidazol 200 mM.
Uma nova etapa de purificação utilizando resina de troca iônica (Q-
Sepharose) foi realizada com a amostra obtida após purificação em coluna contendo
Ni-NTA na tentativa de melhorar a purificação da enzima uricase. Esse material foi
dialisado, liofilizado e ressuspendido em tampão 10 mM Tris-HCl pH 8,0 antes de ser
aplicado na resina de troca iônica. A coluna continha 60 mL de resina Q-Sepharose
e a cromatografia foi realizada em fluxo de 1 mL/min. A Figura 24 mostra o perfil
protéico da amostra após a eluição da proteína de resina Q-Sepharose.
1
2
34 5
6789
10
~
63kD
64
Figura 24. Análise das etapas de purificação da enzima recombinante em gel SDS-PAGE 12%. 1)
Amostra aplicada na coluna – 4mL; 2) Lavagem da resina com 50 mL de tampão Tris-HCl, pH 8,0; 3)
Lavagem da resina com mais 30 mL de tampão Tris –HCl, pH 8,0; 4) Amostra eluída da resina na
concentração de 0,45 a 0,5M, dialisada, liofilizada e ressuspendida em 100µL de água destilada; 5)
Amostra eluída da resina na concentração de 0,4-0,5M, dialisada, liofilizada e ressuspendida em
100µL de água destilada; 6) Marcador SigmaMARKER™ (Sigma).
5.4 Caracterização da enzima recombinante
A espectrometria de massa foi realizada para se determinar a massa
molecular precisa da enzima recombinante. O ensaio detectou a presença de um íon
de massa molecular igual a 58,67 kDa, bem próxima daquela calculada a partir da
seqüência obtida pelo seqüenciamento do gene da uricase amplificado por PCR do
banco de dados, que é de 58,9 kDa. A Figura 25 mostra a detecção de um íon de
massa molecular de 58,67 por espectrometria de massa com a amostra purificada
por step gradiente.
O ensaio para a determinação do pH ótimo foi realizado utilizando os
seguintes tampões na concentração final de 50 mM: citrato de sódio pH 2,5; citrato
de sódio pH 3,0; acetato de sódio pH 4,5; acetato de sódio pH 5,0; fosfato de sódio
pH 6,0; fosfato de sódio pH 7,0; Tris-HCl pH 8,0; Tris-HCl pH 9,0; e Tris-HCl pH 10,0.
O ensaio enzimático foi realizado à temperatura ambiente, como descrito no item
1 2345
6
65
4.20. A Figura 26 mostra que o pH ótimo da enzima recombinante é 8,0 e que a
atividade é especifica para este pH.
Figura 25. Espectrometria de massa. Detecção de um íon com massa molecular de 58,67 kDa.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
234567891011
pH
Atividade Enzimática (U/mL)
Figura 26. Determinação do pH ótimo da enzima recombinante.
66
O ensaio para a determinação da temperatura ótima foi realizado incubando-
se a enzima por 30 min a diferentes temperaturas (4ºC, 25ºC, 37ºC, 40ºC, 60ºC e
80ºC) e, em seguida, foi determinada a atividade enzimática como citado no item
4.20. A Figura 27 mostra que a temperatura ótima da enzima recombinante é em
torno de 37ºC.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 102030405060708090
Temperatura ( º C )
Atividade Enzimática (U/mL)
Figura 27. Determinação da temperatura ótima da enzima recombinante.
No ensaio de estabilidade enzimática, a enzima recombinante foi armazenada
a diferentes temperaturas (-20ºC, 4ºC e 37ºC) e foram coletadas alíquotas nos
tempos 0, 0,5, 1, 3, 12, 24, 48 e 72 h para o ensaio enzimático descrito no item 4.20.
A Figura 28 mostra a estabilidade da enzima recombinante quando armazenada a
diferentes temperaturas.
67
0
5
10
15
20
25
30
35
40
020406080
Temperatura ( º C )
Atividade Enzimática (U/mL)
-20 C
4 C
37 C
Figura 28. Determinação da estabilidade da enzima recombinante.
68
6 DISCUSSÃO
O tratamento de pacientes com gota e hiperuricemia nos Estados Unidos é
realizado com a utilização do alopurinol, alcalinização da urina e hidratação
(TERKELTAUB, 2006). O alopurinol é uma pró-droga que se transforma em um
metabólito mais ativo no fígado, o oxipurinol, que por sua vez promove a inibição da
enzima XO e, conseqüentemente, a formação do ácido úrico. A utilização
prolongada do alopurinol provoca efeitos colaterais, como a hepatotoxicidade
decorrente da elevação de transaminases, e a síndrome da hipersensibilidade, com
20% de taxa de mortalidade (TERKELTAUB, 2003).
Na Europa, em 1975, a Uricozyme
®
(urato oxidase não-recombinante) passou
a ser utilizada no tratamento da hiperuricemia e se mostrou eficaz na redução dos
níveis de ácido úrico (CAIRO, 2002). A Rasburicase
®
derivada da expressão do
cDNA da urato oxidase de uma cepa modificada de A. flavus e expresso em S.
cerevisiae, passou a ser utilizada em 2002 no controle dos níveis de ácido úrico no
plasma de pacientes com hiperuricemia (SANOFI-AVENTIS, 2002).
A Rasburicase
®
difere do alopurinol por promover a redução dos níveis de
ácido úrico no plasma, enquanto o segundo só é efetivo no combate do ácido úrico
produzido durante o tratamento ao inibir a enzima XO (UENG et al., 2005).
Diante do relevante papel terapêutico e de diagnóstico da uricase, o principal
objetivo deste estudo foi o de desenvolver, por meio de técnicas de Engenharia
Genética, uma linhagem de bactéria que expressasse esta enzima em altos níveis. A
enzima recombinante deverá ser utilizada futuramente em ensaio de diagnóstico
para detecção de ácido úrico em pacientes com gota e em seu tratamento.
Dentre as fontes de uricase consideradas para a produção comercial desta
enzima destaca-se Bacillus subtilis. Um estudo feito por Schultz et al. (2001) mostrou
que a principal atividade da uricase de B. subtilis LMD 69.3 está associada ao gene
pucL (494 resíduos de aminoácidos). Além desse, o gene pucM, com 121 resíduos
de aminoácidos, mostrou uma seqüência que apresenta alta similaridade com a
proteína de ligação ao hormônio da tireóide (JUNG et al., 2006). O gene pucM
provavelmente está envolvido na remoção do produto final da reação da uricase e
atuando como um ativador desta enzima (LEE et al., 2005).
69
Huang e Wu (2004) realizaram um estudo com uma linhagem de B. subtilis
termofílica (TB-90) com o objetivo de obter uricase recombinante mais resistente
para ser utilizada em ensaio colorimétrico em microplaca de 96 poços. Essa enzima
está sendo considerada para uso futuro em kits de diagnóstico para detecção de
ácido úrico em pacientes com gota.
A primeira etapa realizada para a obtenção da uricase nesta pesquisa foi o
desenho de primers específicos para a amplificação do gene que codifica uricase em
B. subtilis. O desenho dos primers foi baseado na seqüência publicada do gene
pucLM. Os primers foram desenhados de tal forma que toda a região codante do
gene seria amplificada, enquanto sítios de restrição seriam introduzidos nas
extremidades para facilitar a clonagem direcionada no vetor de expressão (Figuras
8, 9 e 11). Embora o DNA cromossomal extraído de várias linhagens de B. subtilis
tenha sido usado como template para PCR (dados não mostrados) somente foi
possível a amplificação de um produto de PCR com o tamanho esperado quando se
utilizou o DNA cromossomal da linhagem de B. subtilis subtilis LMD 69.3. Isso pode
ser explicado pelo fato de que a seqüência publicada do gene pucLM é baseada na
seqüência completa do genoma de B. subtilis subtilis LMD 69.3 (KUNST et al.,
1997), uma das linhagens utilizadas neste trabalho (Figura 9). Pequenas variações
de seqüência encontradas nos genes pucLM de outras linhagens podem ter
impedido uma eficiente amplificação deste gene utilizando os primers desenhados
nesta pesquisa.
Como a presença de introns é rara em bactérias, o gene que codifica a
uricase pôde ser amplificado por PCR usando-se DNA cromossomal extraído de B.
subtilis. A PCR foi realizada com DNA polimerase de alta fidelidade (Taq Platinum)
para minimizar a introdução de mutações durante a amplificação (Tabela 2). Um
fragmento de ~1,5 kb foi obtido, consistente com o tamanho esperado para o gene
pucLM de B. subtilis (Figura 12). A identidade do gene pucLM foi confirmada pelo
seqüenciamento das extremidades do amplicon clonado (Figura 14).
Para expressão do gene da uricase em E. coli foi escolhido um vetor de
expressão da série pET, o plasmídio pET21a, por ser um sistema altamente
controlável de expressão da proteína-alvo (Figura 11). O controle da expressão
nesse plasmídio é realizado em nível transcricional pelo promotor T7–lac.
70
O genoma da E. coli BL21 DE3 possui o gene que codifica para a T7 RNA
polimerase sob controle do promotor lacUV5. Além desse gene, o genoma possui o
gene lacI, que codifica para o repressor lac, o qual se liga ao promotor lac,
impedindo, assim, que a T7 RNA polimerase seja produzida em ausência de IPTG.
O gene lacI também está presente no vetor pET. Sob condições de repressão
(ausência do indutor IPTG), tanto o gene da T7 RNA polimerase quanto o gene-alvo
estão transcricionalmente bloqueados por causa da ligação do repressor lacI na
região operadora. Após a adição do indutor IPTG, a repressão é eliminada.
A presença do plasmídio pLysS na linhagem de E. coli BL21 DE3 promove
maior controle da produção da proteína-alvo, pois ele produz a T7 lisozima, que inibe
a T7 RNA polimerase. O gene da T7 RNA polimerase, que está sob controle do
promotor lacUV5 nas células das linhagens λDE3, pode ser expresso em pequenas
quantidades no estado não induzido. Assim, o plasmídio pLysS seria mais uma
forma de controle de produção da proteína-alvo no estado não induzido
(MIERENDORF et al., 1994).
No vetor pET21a há, ainda, uma seqüência de seis histidinas logo após o sítio
múltiplo de clonagem (XhoI), possibilitando que a proteína recombinante seja
sintetizada com uma cauda de poli-His na sua porção C-terminal (Figura 11). Essa
seqüência de seis histidinas presente na proteína expressa facilita a sua purificação
por cromatografia de afinidade em Ni-NTA, além de propiciar a sua detecção por
Western Blot (McCORMICK; MIERENDORF, 1994).
O vetor pETURI (Figura 10) foi usado para a transformação da várias cepas
de E. coli (Quadro 1) visando avaliar a melhor hospedeira para a expressão do gene
pucL. O sistema E. coli é um dos mais utilizados para a expressão heteróloga de
proteínas e várias cepas com características especiais estão disponíveis (JANA;
DEB, 2005). De todas as cepas utilizadas para o ensaio de indução, destacaram-se
a BL21/pLysS e a PRIL, embora este estudo tenha se concentrado na primeira
(Quadro 1).
Após indução com IPTG, foi observado o surgimento de uma abundante
espécie protéica com massa molecular aparente de aproximadamente 63 kDa
(Figura 17), valor superior à massa molecular esperada para a proteína
recombinante, que era de 58,9 kDa (Figura 18).
71
A análise por Western Blot das amostras de indução mostrou que a banda
observada de ~63 kDa era reconhecida pelo anticorpo anti-His tag, o que revela que
esta proteína possui uma His-tag (Figura 21). Além dessa proteína, a análise de
Western Blot também revelou uma outra banda menos abundante um pouco abaixo
do marcador de 60 kDa (Figura 21), espécie protéica que deve ser um produto de
degradação proteolítica na porção N-terminal da proteína recombinante, pois o C-
terminal contém o His-Tag responsável pela interação com o anticorpo.
Na tentativa de impedir a degradação da enzima após a indução, o pellet
celular foi ressuspendido em solução de lise celular contendo um cocktail de
inibidores, como PMSF, leupeptina e EDTA. Em seguida, esse material foi aplicado à
coluna NI-NTA para melhorar a purificação. O resultado obtido não foi satisfatório
por não ter impedido a degradação da enzima recombinante, sendo necessários
novos testes com outros inibidores para reduzir o problema da degradação.
Uma possível explicação para a discrepância entre os valores de massa
molecular obtido e esperado se deve ao fato de que a análise por SDS-PAGE não é
um ensaio preciso para a determinação da massa molecular por causa dos diversos
artefatos de migração. Esses artefatos podem ocorrer por efeito do sal presente no
tampão das amostras, causando retardamento na migração das proteínas entre as
malhas do gel de poliacrilamida.
Um ensaio mais acurado para a determinação da massa molecular é baseado
em espectrometria de massa, uma técnica que determina a massa molecular de
componentes ionizáveis presentes em uma determinada amostra.
A técnica de espectrometria de massa denominada MALDI-TOF consiste na
aplicação do material em pequenas quantidades (geralmente em concentrações da
ordem de nanomolar) em uma placa metálica contendo uma matriz que promove a
sua protonação. As macromoléculas cristalizadas com essa matriz são submetidas à
incidência de um laser que possibilita a aceleração dos componentes moleculares ao
longo de um analisador de massas até a chegada em um detector, e o tempo
necessário para esse processo é diretamente proporcional à massa molecular dos
íons formados. A visualização gráfica se dá sob a forma de um espectro com o eixo
da abscissa (x) representando a razão massa/carga (grau de protonação das
macromoléculas) e com o eixo da ordenada (y) representando a abundância dos
íons que atingem o detector.
72
Neste trabalho, a espectrometria de massa foi realizada para determinar a
massa molecular da proteína recombinante. Este ensaio detectou a presença de um
íon com 58,67 kDa, ou seja, com massa molecular calculada próxima daquela
esperada (58,9 kDa) (Figuras 18 e 25). Uma possível explicação para essa pequena
diferença de ~230 Da na massa molecular da proteína detectada por espectrometria
de massa se deve a uma provável degradação na porção N-terminal que já havia
sido observada no ensaio de Western Blot (Figura 21).
Em outros estudos, realizados por Yamamoto et al. (1996) e Huang e Wu
(2004), a clonagem e a expressão do gene da uricase a partir de uma bactéria
termofílica de Bacillus sp. TB-90 e de B. subtilis em E. coli resultou em duas
proteínas de massas moleculares diferentes. A proteína obtida de Bacillus sp. TB-90
apresentou massa molecular de 37,99 kDa e a de B. subtilis, 55 kDa, enquanto na
presente pesquisa a proteína recombinante obtida de B. subtilis apresentou massa
molecular de aproximadamente 59 kDa.
Na tentativa de diminuir a síntese de proteínas intracelulares produzidas pela
bactéria hospedeira (E. coli BL21 DE3λ pLysS) nos ensaios de indução e facilitar a
purificação da enzima recombinante, foi realizado um novo ensaio de indução com a
adição de rifampicina (Figura 19). A rifampicina é um antibiótico semi-sintético que
inibe a RNA polimerase da E. coli de forma específica, impedindo a produção
adicional de proteínas da célula hospedeira. Todavia, a inibição não se estende à
produção da proteína recombinante, pois sua transcrição é dirigida pela T7 RNA
polimerase, enzima de origem viral não inibida por rifampicina. O resultado obtido
neste estudo mostrou que, pelo menos neste caso, o tratamento com rifampicina não
foi eficaz para a diminuição significativa da síntese protéica.
Kuderová et al. (1999) utilizaram em seus estudos a mesma concentração de
rifampicina (200 µg/mL) e obtiveram resultados satisfatórios na diminuição do
background de proteínas intracelulares quando a β-glicosidase foi expressa. Uma
possível explicação para o fato da rifampicina não ter sido eficaz na presente
pesquisa pode ser a concentração de metanol utilizada na sua diluição, que pode ter
tido efeito deletério sobre as bactérias, dessa forma diminuindo a expressão da
proteína recombinante.
Para a purificação da uricase recombinante foi utilizada a técnica de
cromatografia de afinidade usando-se Ni-NTA, que permite a purificação em uma
73
única etapa. NISHIYA et al. (2002) utilizaram em seus estudos uma única etapa de
purificação para a uricase recombinante de Bacillus sp. TB-90 que continha seis
histidinas na porção C-terminal. Após a remoção das proteínas que não se ligaram à
resina, a proteína recombinante foi eluída com proteinase K para promover a quebra
específica da His-tag sem afetar as propriedades enzimáticas da uricase
recombinante.
No presente trabalho, a purificação da proteína recombinante foi realizada em
coluna contendo Ni-NTA, seguindo-se uma única eluição com imidazol (250 mM). A
fração contendo a proteína purificada apresentou atividade específica de 39 U/mg
(Figura 22). Neste estudo não foi utilizada proteinase K, pois acarretaria custo
adicional ao processo e uma etapa a mais para a obtenção da enzima na indústria.
Com a finalidade de melhorar o processo de purificação da enzima, decidiu-se
realizar a eluição por step gradient de imidazol. O ensaio assim realizado mostrou
melhor purificação em decorrência da redução da síntese protéica (Figura 23). Outro
ensaio de purificação utilizando resina de troca iônica (Q-Sepharose) também foi
realizado para tentar obter frações mais puras e com maior atividade específica,
porém, o resultado obtido não foi satisfatório por não ter promovido a purificação da
enzima (Figura 24).
As amostras obtidas após a purificação por step gradient foram utilizadas para
os ensaios de caracterização enzimática. O pH ótimo obtido da uricase
recombinante foi específico, pois apresentou alta atividade enzimática em pH 8,0 e
resquício de atividade em pH 7,0 (Figura 26). A temperatura ótima obtida não
apresentou variação considerável da atividade enzimática entre 25ºC e 37ºC (Figura
27). Esses resultados são semelhantes aos obtidos por Huang e Wu (2004) com a
uricase de B. subtilis expressa de forma heteróloga em E. coli; a enzima
recombinante obtida naquela pesquisa apresentou atividade enzimática alta em uma
faixa de temperatura entre 20ºC e 40ºC, com pH ótimo de 8,5. Aqueles
pesquisadores conseguiram obter uma uricase mutante de B. subtilis termofílico com
atividade específica de 13,1 U/mg e atividade enzimática em diferentes valores de
pH (pH 6-9).
A uricase recombinante obtida neste estudo apresentou atividade específica
alta, de 39 U/mg, quando comparada com aquela de B. subtilis termofílico (HUANG;
WU, 2004). Por outro lado, a uricase alvo desta pesquisa não apresentou atividade
74
enzimática em ampla faixa de pH e temperatura. A estabilidade da enzima
recombinante também não apresentou alteração considerável quando armazenada
às temperaturas de -20ºC e 4ºC, e quando armazenada a 37ºC, a atividade
enzimática foi detectada em até 24 horas (Figura 28).
75
7 CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS
Nesta pesquisa foi possível clonar o gene da uricase no vetor pET21a. A
indução da BL21 foi eficiente ao produzir a enzima intracelularmente em forma
solúvel e estável, com pH ótimo de 8,0 e temperatura ótima entre 25
o
C e 37
o
C.
Uma nova clonagem do gene pucLM será realizada no vetor pET28a(+) na
tentativa de acabar com a degradação da enzima ao colocar uma proteção na
porção N-terminal da enzima, a His-taq.
A enzima recombinante obtida neste estudo apresentou estabilidade à
temperatura de 4
o
C, a mesma utilizada para armazenar a uricase de kits de
diagnóstico já comercializados. Futuramente, a enzima obtida nesta pesquisa poderá
ser utilizada em ensaios de diagnóstico para a detecção de ácido úrico por ser
estável e apresentar alta atividade específica. Possivelmente, poderá ser empregada
também no tratamento de pacientes com gota, embora para isso seja necessária
melhor purificação, pois este tratamento é feito por via endovenosa.
76
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