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Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias, UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte
das exigências para a obtenção do Título de Doutor em
Cirurgia Veterinária.
88
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ii
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
ANDRIGO BARBOZA DE NARDI – nascido em 21 de março de 1978, em Curitiba,
Paraná, é Médico Veterinário formado pela Universidade Federal do Paraná - UFPR,
Campus de Curitiba, em 26 de março de 2002. Durante o curso de graduação, foi
bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq,
na modalidade de Iniciação Científica, durante três programas consecutivos, no
período de 1º de setembro de 1999 a 25 de março de 2002, sob a orientação da
Profª Suely Rodaski. Em 1º março de 2002 iniciou um estágio de aperfeiçoamento na
área de Oncologia e Clínica Cirúrgica de Pequenos Animais, sob a orientação da
Prof
essora
Suely Rodaski, junto ao Hospital Veterinário da Universidade Federal do
Paraná - UFPR, Campus de Curitiba, o qual concluiu em 28 de fevereiro de 2003. É
autor do livro Quimioterapia Antineoplásica em Cães e Gatos, lançado em 2004 pela
Editora Maio e reimpresso no ano de 2006 pela Bio Editora. Em 27 de julho de 2004
recebeu o título de Mestre em Cirurgia Veterinária pela comissão examinadora assim
constituída, Prof. Dr. Carlos Roberto Daleck (orientador), Prof. Dr. Áureo Evangelista
Santana e Profa. Dra. Cláudia Sampaio Fonseca Repetti, junto a Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), da Universidade Estadual Paulista
(UNESP), campus de Jaboticabal. Em 2 de agosto de 2004, iniciou o curso de
Doutorado em Cirurgia Veterinária (UNESP, Campus de Jaboticabal) sob a
orientação do Prof. Dr. Carlos Roberto Daleck e co-orientação da Profa. Dra. Renée
Laufer Amorin da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (UNESP, Campus
de Botucatu). Entre os meses de maio e julho de 2006, realizou um estágio de
aperfeiçoamento em Oncologia Veterinária no Centro de Oncologia Veterinária da
Universidade Estadual de Michigan, nos Estados Unidos, sob supervisão da Profa.
Dra. Barbara Kicthell.
iii
VIDA
“Já perdoei erros quase imperdoáveis,
tentei substituir pessoas insubstituíveis e
esquecer pessoas inesquecíveis.
Já fiz coisas por impulso.
Já me decepcionei com pessoas quando nunca pensei me decepcionar, mas
também já decepcionei alguém.
Já abracei pra proteger e
já dei risada quando não podia.
Já fiz amigos eternos.
Já amei e fui amado,
mas também
já fui rejeitado.
Já fui amado e não soube amar.
Já gritei e pulei
de tanta felicidade,
já vivi de amor
e fiz juras eternas.
Já chorei ouvindo música e vendo fotos,
já liguei só pra escutar uma voz,
já me apaixonei por um sorriso.
Já pensei que fosse morrer de tanta saudade
e...
...tive medo de perder alguém especial
(e acabei perdendo)! Mas sobrevivi!
Bom mesmo é ir a luta com determinação,
abraçar a vida e viver com paixão,
porque o mundo pertence a quem se atreve
e
A VIDA É MUITO
para ser insignificante"
Charles Chaplin
iv
Dedico este trabalho a meu tio, Nei,
ao meu irmão, Marcel e as minhas irmãs, Nabile, Paula e Fernanda,
pelo amor, carinho e por estarem sempre ao meu lado.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, por sempre me tratar como seu filho, estando presente em cada momento
da minha vida.
Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Daleck, pela amizade, confiança, apoio e dedicação ao
aceitar esta orientação, possibilitando a realização de um grande sonho.
À Profa. Dra. Renée Laufer Amorin que abriu as portas da UNESP – Campus de
Botucatu, pela amizade, incentivo e auxílio prestado.
Á Profa. Suely Rodaski, pela confiança, paciência e ensinamentos transmitidos ao
longo da minha vida acadêmica.
À Profa. Dra. Mirela Tinucci Costa pela amizade, ensinamentos e ajuda
indispensável.
Ao Prof. Carlos Henrique de Mello Souza meu sincero reconhecimento pela
oportunidade concedida.
Ao Prof. Dr. Metry Bacila, pela confiança e estímulos constantes ao longo destes
anos.
Ao Prof. Dr. Alberto Cargnelutti Filho pela valiosa contribuição na análise estatística
dos resultados deste estudo.
vi
Aos demais Professores do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária pelos
ensinamentos e momentos agradáveis proporcionados durante a realização do
doutorado.
Aos meus avós, Carlos, Olinda e Adelino, pelo exemplo de vida.
À minha mãe pelo amor, carinho e educação. Mesmo após sua ausência ela
continua sempre ao meu lado.
Aos meus tios ODILON e NEIVA, que hoje são mais do que nunca os meus
verdadeiros pais, pelo amor, força e proteção.
À minha noiva Caroline, pelo amor, confiança, e por ser a pessoa que é, linda, alegre
e companheira.
Aos meus tios Nivo e Regina e aos meus primos, Henrique, Daniela e César
Augusto, pelo carinho e apoio.
À amiga Christine Hauer Piekarz pela ajuda na seleção dos casos.
Aos colegas Rafael, Marcela e Pedro pelo desprendimento e colaboração na
realização dos exames de imunoistoquímica.
Aos amigos e irmãos de república: Sandro, Daniel Gerardi, João Paulo, Gustavo,
Daniel Orlato, Alexandre Martini, Beto, Márcio, Marco, André, Daniel Paulino,
Alexandre Ribeiro, Thiago, Emílio, Serginho, pessoas com as quais passei alguns
dos melhores momentos da minha vida.
À grande amiga Cida Catarina Dias pelo carinho e companheirismo.
vii
Aos amigos da pós-graduação: Marcos, Fábio, Márcio, Juliana, Sabrina Calazans,
Simone, Jane, Sabrina Rodigheri, João Humberto, André, Patrícia Rodrigues, Milena,
Virgínia, Lígia, Tatiana, Rosana, Everton, Fábio Brito, Márcia, Ana Letícia, Juan
Pablo, Fabrício, pela presença constante, carinho e incentivo na busca de mais uma
conquista.
Ao apoio incondicional dos residentes Renato, Geórgia, Nicole, Camila, Sabrina e
Tiago.
Aos funcionários do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel pelo auxílio.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de estudos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela
concessão do auxílio pesquisa.
À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista –
Campus de Jaboticabal, em especial ao programa de Pós-Graduação em Cirurgia
Veterinária por ter me acolhido.
À Universidade Federal do Paraná, professores e funcionários, pela agradável
convivência, incentivo e compreensão.
A todos aqueles que contribuíram com a realização deste estudo.
viii
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
ABC
AVIDINA BIOTINA PEROXIDASE
AINEs
ANTIINFLAMÁTORIOS NÃO ESTERÓIDES
BSA
ALBUMINA SÉRICA BOVINA
CNPq CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E
TECNOLÓGICO
COX
CICLOOXIGENASE
DAB
DIAMINOBENZIDINA
EGF
FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL
FCAV FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
FGF
FATOR DE CRESCIMENTO DE FIBROBLASTOS
FMVZ
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
NK
NATURAL KILLER
OMS
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE
P53 PROTEÍNA P53
p53
GENE P53
PG
PROSTAGLANDINA
SAS
STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM
SP
SÃO PAULO
TNM TUMOR/ NÓDULO/ METÁSTASE
TRIS
TRIZMA BASE
TX
TROMBOXANO
UFPR
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
UNESP
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
UVB RAIO ULTRAVIOLETA TIPO B
VEGF
FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR
x
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1-
Relação dos casos
de acordo com a classificação
histopatológica e evolução clínica das neoplasias mamária
s
de cadelas atendidas no Hospital Veterinário da UFPR,
câmpus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a
dezembro de 2004. UFPR – Curitiba, PR, 2006......................
27
TABELA 2-
Relação dos anticorpos primários, clone e código,
marca,
recuperação antigênica e diluição utilizada
nos cortes de
neoplasias mamárias de cadelas atendidas no Hospital
Veterinário da UFPR, câmpus de Curit
iba, no período de
janeiro de 2002 a dezembro de 2004. UNESP –
Botucatu,
SP, 2006..................................................................................
29
TABELA 3-
Valor da pontuação de acordo com o número de células
marcadas (imunorreativas) por campo,
nas neoplasias
mamárias de cadelas atendidas no Hospital Veterinário da
UFPR, câmpus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a
dezembro de 2004. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006..............
30
TABELA 4- Valor da pontuação de
acordo com a intensidade de
coloração das células marcadas, por campo,
nas neoplasias
mamárias de cadelas atendidas no Hospital Veterinário da
UFPR, câmpus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a
dezembro de 2004. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006..............
31
xi
LISTA DE QUADROS
Página
QUADRO 1-
Classificação dos tumores mamários em cadelas segundo
a
Organização Mundial da Saúde, citada por MISDORP et al.
(1999).......................................................................................
04
QUADRO 2-
Estágio clínico dos adenomas mamários em cadelas
seguindo o Sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/ Metástase)
proposto pela OMS (OWEN, 1980). UFPR –
Curitiba, PR,
2006.........................................................................................
34
QUADRO 3-
Estágio clínico dos carcinomas mamários
com prognóstico
bom, em cadelas, seguindo o Sistema TNM (Tumo
r/
Linfonodo/ Metástase) proposto pela OMS
(OWEN, 1980).
UFPR – Curitiba, PR, 2006......................................................
35
QUADRO 4-
Estágio clínico dos carcinomas mamários
com prognóstico
ruim, em cadelas, seguindo o Sistema TNM
(Tumor/
Linfonodo/ Metástase) proposto pela OMS
(OWEN, 1980).
UFPR – Curitiba, PR, 2006......................................................
35
xii
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1-
Esquema do metabolismo do ácido araquidônico pela via da
ciclooxigenase. Adaptado de CALDERON (2005)...................
07
FIGURA 2-
Distribuição da incidência das neoplasias mamárias em
cadelas de acordo com a idade. UFPR – Curitiba, PR, 2006..
33
FIGURA 3-
P
revalência de neoplasias mamárias, distribuídas conforme
o tamanho do tumor, em cadelas atendidas no Hospital
Veterinário da UFPR, câmpus de Curitiba, no período de
janeiro de 2002 a dezembro de 2004. UFPR –
Curitiba, PR,
2006.........................................................................................
36
FIGURA 4-
Distribuição das neoplasias mamárias de acordo com a
sobrevida observada no pós-
operatório, em cadelas
atendida
s no Hospital Veterinário da UFPR, câmpus de
Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
UFPR – Curitiba, PR, 2006......................................................
37
FIGURA 5-
Expressão da ciclooxigenase-2 nas neoplasias mamá
rias de
cadelas. UFPR – Curitiba, PR, 2006........................................
38
FIGURA 6- Em A -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de
um adenoma mamário em cadela. Observar que não houve
marcação das células para a atividade da ciclooxigenase-
2.
Aumento: 400 vezes. Em B -
Fotomicrografia de preparação
imunoistoquímica de um carcinoma mamário com
prognóstico ruim em cadela. Observar as células
neoplásicas marcadas para atividade da ciclooxigenase-
2
(seta vermelha). Atentar para a pre
sença de
imunorreatividade para atividade da ciclooxigenase-
2 na
parte epitelial (seta vermelha) e ausência na área
mesenquimal (seta azul) desta neoplasia. Contra-
coloração:
Hematoxilina de Mayer. Aumento: 200 vezes. UNESP –
Jaboticabal, SP, 2006..............................................................
40
FIGURA 7-
Em
A
-
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica
onde se verifica um grande número de células neoplásicas
marcadas para atividade da ciclooxigenase-
2 (seta
vermelha) e
m um caso de carcinoma primário metastático
em cadela. Aumento: 100 vezes. Em B -
Fotomicrografia de
xiii
preparação imunoistoquímica na qual se observa inúmeras
células neoplásicas marcadas para atividade da
ciclooxigenase-2 em um caso de metástase pulmonar em
cadela. Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer.
Aumento:
400 vezes. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006...........................
40
FIGURA 8- Em A -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica na
qual se observa moderada marcação das células
neoplásicas no interior do vaso linfático (seta vermelha),
para atividade da ciclooxigenase-
2 em um carcinoma
inflamatório de cadela. Contra-
coloração: Hematoxilina de
Mayer. Aumento: 200 vezes. Em B –
Mesmo caso descrito
em A, no entanto, com aumento de 400 vezes. UNESP –
Jaboticabal, SP, 2006..............................................................
41
FIGURA 9-
Expressão do índice de proliferação celular Ki-
67 nas
neoplasias mamárias de cadelas. (*) Grupo onde houve
correlação com a ciclooxigenase-2. UFPR –
Curitiba, PR,
2006.........................................................................................
43
FIGURA 10-
Em A -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica na
qual está demonstrada intensa marcação das célul
as
neoplásicas no interior do vaso linfático (seta vermelha),
para atividade do Ki-
67 em um carcinoma inflamatório de
cadela. Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer.
Aumento:
200 vezes. Em B – Mesmo caso descrito em A
, no entanto,
com aumento de 400 vezes. UNESP –
Jaboticabal, SP,
2006.........................................................................................
44
FIGURA 11-
Em A -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica
onde se verifica a presença de inúmeros núcleos marcado
s
para atividade do Ki-
67 (seta vermelha) em um caso de
carcinoma primário metastático em cadela. Contra-
coloração: Hematoxilina de Mayer.
Aumento: 40 vezes. Em
B – Mesmo caso descrito em A
, no entanto, com aumento
de 200 vezes. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006......................
44
FIGURA 12-
Expressão da proteína P53 nas neoplasias mamárias de
cadelas. (*) Grupo onde houve correlação com a
ciclooxigenase-2. UFPR – Curitiba, PR, 2006.........................
45
FIGURA 13-
Em A - Fotomicro
grafia de preparação imunoistoquímica de
um carcinoma mamário com prognóstico ruim em cadela.
Observar a presença de células imunorreativas para a
proteína P53 (seta vermelha). Aumento: 100 vezes. Em B -
xiv
mesmo caso descrito em A, no entanto, com aumento de
400 vezes Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer.
UNESP – Jaboticabal, SP, 2006..............................................
46
FIGURA 14-
Em A -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica
onde se visibiliza células neoplásicas marcadas p
ara
atividade da P53 (seta vermelha) em um caso de carcinoma
inflamatório em cadela. Aumento: 100 vezes. Em B -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde não
se observa a presença de células marcadas para a proteína
P53 em um caso de adenoma mamá
rio em cadela.
Aumento: 400 vezes. Contra-
coloração: Hematoxilina de
Mayer. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006..................................
47
FIGURA 15-
Expressão da Caspase-
3 nas neoplasias mamárias de
cadelas. (*) Grupo onde houve correlaçã
o com a
ciclooxigenase-2. UFPR – Curitiba, PR, 2006
.........................
48
FIGURA 16-
Em A -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica
onde se observa marcação das células neoplásicas para
atividade da Caspase-3 em um carcinoma primário
metastático de cadela. Contra-
coloração: Hematoxilina de
Mayer. Aumento: 400 vezes. Em B –
Fotomicrografia de
preparação imunoistoquímica onde se visibiliza expressão
para a Caspase-
3 (seta vermelha) em um carcinoma
primário metastático de cadela. Aumento
: 400 vezes.
Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer. UNESP –
Jaboticabal, SP, 2006..............................................................
49
FIGURA 17-
Em A -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica
onde se verifica a presença
de células imunorreativas para a
atividade da Caspase-
3 em um caso de metástase pulmonar
de carcinoma mamário em cadela. Aumento: 400 vezes. Em
B –
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde
se visibiliza marcação das células neoplásicas no interi
or do
vaso linfático (seta vermelha) para atividade da Caspase-
3
em um carcinoma inflamatório de cadela. Aumento: 400
vezes. Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer. UNESP –
Jaboticabal, SP, 2006..............................................................
50
xv
CORRELAÇÃO DA CICLOOXIGENASE-2 COM Ki-67, P53 e CASPASE-3 NAS
NEOPLASIAS DE MAMA EM CADELAS
RESUMO - Tendo em vista a relação da ciclooxigenase-2 (COX-2) com a progressão
do câncer, este trabalho teve como objetivo investigar a expressão da atividade
desta enzima com a imunorreativadade do Ki-67, P53 e Caspase-3 no diagnóstico e
prognóstico de neoplasias mamárias em cadelas. Para a realização deste estudo
foram selecionadas 60 amostras de tumores mamários de cadelas. As amostras
foram divididas em seis grupos, com 10 tumores em cada grupo, de acordo com a
classificação histopatológica. Nos grupos adenoma, carcinoma com prognóstico bom
e carcinoma com prognóstico ruim a seleção dos casos se deu pela classificação
histológica e evolução clínica do tumor. Os outros 30 tumores foram representados
por 10 amostras de carcinoma primário metastático, 10 de metástase pulmonar e 10
de carcinoma inflamatório. A avaliação da expressão da COX-2 (Dako, CX-294), Ki-
67 (Dako, M7240), P53 (Novocastra, CM1), Caspase-3 (Neomarkers, Asp175) foi
conduzida por imunoistoquímica, utilizando-se a técnica de estreptoavidina-biotina-
peroxidase. Em relação aos resultados houve correlação da expressão da COX-2
com o índice de proliferação celular Ki-67 no grupo dos adenomas, metástases
pulmonares e carcinomas inflamatórios (P<0,05). Em todos os grupos estudados a
COX-2 apresentou correlação com a proteína P53 (P<0,01). Observou-se correlação
da expressão da ciclooxigenase-2 com a Caspase-3 no grupo dos carcinomas
primários metastáticos e nas metástases pulmonares (P<0,05). A expressão da
ciclooxigenase-2 variou de acordo com a agressividade das neoplasias mamárias
nos casos de adenoma, carcinoma metastático e carcinoma não metastáticos
(P<0,05). A sobrevida das pacientes com neoplasias mamária no pós-operatório está
ligada à expressão da COX-2, no grupo dos adenomas, carcinoma com prognóstico
bom e carcinoma com prognóstico ruim (P<0,01).
Palavras-chave: câncer, neoplasia mamária, ciclooxigenase-2, oncoproteina,
proliferação celular, cadela.
xvi
CORRELATION OF CYCLOOXYGENASE-2 WITH Ki-67, P53 AND CASPASE-3 IN
BREAST CANCER OF BITCHES
ABSTRACT – Considering the relationship between cyclooxygenase-2 (COX-2) with
the cancer evolution, this study aimed to detect the expression of this enzyme with
the immunoreactive of Ki-67, P53 and Caspase-3 in the diagnosis and prognostic of
mammary neoplasms in bitches. Sixty mammary tumors samples were selected for
the accomplishment of this study. The samples were divided into six groups,
contenting 10 tumors in each group, in accordance to histopathology classification. In
adenoma, good prognosis carcinoma and poor prognosis carcinoma groups the
criteria for selection was made by histology classification and clinical tumor evolution.
The others 30 tumors samples were represented by 10 samples of metastatic primary
carcinoma, 10 of pulmonary metastases, and 10 of inflammatory carcinoma. The
evaluation of the COX-2 (Dako, CX-294), Ki-67 (Dako, M7240), P53 (Novocastra,
CM1), Caspase-3 (Neomarkers, Asp175) expression was achieved by
immunohistochemistry, by means of streptavidine-biotine-peroxidase. About the
results a positive correlation between COX-2 and the cellular proliferation index Ki-67
was found in the adenomas, pulmonary metastases, and inflammatory carcinomas
groups (P<0,05). In all studied groups the COX-2 presented correlation with P53
protein (P<0,01). There was correlation of cyclooxygenase-2 with caspase-3 in the
primary metastatic carcinoma and in the pulmonary metastases group (P<0,05). The
cyclooxygenase-2 expression varied in accordance with aggressiveness of mammary
neoplasms in cases such adenoma, metastatic carcinoma, and non metastatic
carcinoma (P<0,05). The post operative survival rate of patients with mammary
neoplasms was linked to COX-2 expression in the adenomas, good prognosis
carcinoma and poor prognosis carcinoma groups (P<0,01).
Key words: Cancer, mammary neoplasm, ciclooxygenase-2, oncoprotein, cell
proliferation, bitch.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................................IX
LISTA DE TABELAS...........................................................................................................X
LISTA DE QUADROS.........................................................................................................XI
LISTA DE FIGURAS
..........................................................................................................XII
RESUMO..............................................................…..........................................................XV
ABSTRACT.......................................................................................................................XVI
I. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1
II. REVISÃO DA LITERATURA......................................................................................... 3
II.1- NEOPLASIA MAMÁRIA.............................................................................................. 3
II.2- ENZIMA CICLOOXIGENASE-2 .................................................................................. 6
II.3- ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO TECIDUAL Ki-67 ....................................................... 16
II.4- GENE p53 ................................................................................................................ 18
II.5- CASPASE-3 ............................................................................................................. 20
II.6- TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA........................................................................ 23
III. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 25
III.1- ESCOLHA DOS TUMORES .................................................................................... 25
III.1.1-ADENOMA, CARCINOMA COM PROGNÓSTICO BOM E CARCINOMA COM
PROGNÓSTICO RUIM.................................................................................................... 25
III.1.2- CARCINOMA PRIMÁRIO METASTÁTICO, METÁSTASE PULMONAR E
CARCINOMA INFLAMATÓRIO ....................................................................................... 28
III.2- ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO............................................................................. 29
III.3- ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................................... 31
IV. RESULTADOS........................................................................................................... 33
IV.1- IDADE..................................................................................................................... 33
IV.2- ESTADIAMENTO CLÍNICO..................................................................................... 34
IV.3- SOBREVIDA APÓS A CIRURGIA........................................................................... 37
IV.4- IMUNOISTOQUÍMICA............................................................................................. 38
IV.4.1- IMUNORREATIVIDADE PARA A COX-2 ............................................................. 38
IV.4.2- IMUNORREATIVIDADE PARA O Ki-67................................................................ 42
IV.4.3- IMUNORREATIVIDADE PARA A PROTEÍNA P53............................................... 45
IV.4.4- IMUNORREATIVIDADE PARA A CASPASE-3 .................................................... 48
V. DISCUSSÃO............................................................................................................... 51
VI. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 60
VII. REFERÊNCIAS......................................................................................................... 62
VIII. ANEXOS.................................................................................................................. 87
1
I. INTRODUÇÃO
O câncer de mama é a neoplasia mais comum em cadelas (GORMAN &
DOBSON, 1995; ZUCCARI, 2001). Aproximadamente 50% destes tumores são
malignos, em 25% dos casos, os animais já apresentam metástases no momento
do diagnóstico (KITCHELL, 1995; OGILVIE & MOORE, 1995; MORRISON, 1998).
As raças nas quais se observa maior incidência de tumores de mama são os
Poodles, os Pastores Alemães e os Cockers Spaniel, além dos animais sem raça
definida (ZUCCARI, 1999; RUTTEMAN et al., 2001).
A remoção cirúrgica completa destas neoplasias, com amplas margens de
segurança, quando não existe envolvimento metastático, ainda é o procedimento
terapêutico com maior probabilidade de cura. Os protocolos de quimioterapia
antineoplásica e radioterapia apresentam baixa atividade antitumoral para as
neoplasias mamárias (RUTTEMAN et al., 2001).
Sabe-se que há pelo menos dois tipos de ciclooxigenases que exercem no
organismo diferentes funções fisiológicas: ciclooxigenase-1 (COX-1) e
ciclooxigenase-2 (COX-2) (SOUZA et al., 2001; WANG et al., 2006). A COX-1 é
expressa de forma constitutiva em muitos tecidos. Ela age sintetizando as
prostaglandinas que regulam a função celular normal. A inibição da COX-1 conduz
a efeitos colaterais bem conhecidos, como as úlceras gástricas e a toxicidade
renal (MURRAY & BRATER, 1993; DAVIES, 1995). A COX-2 não é encontrada
nas células em repouso em quantidade significativa, mas sua expressão é
aumentada significativamente nos estados inflamatórios (DAVIES, 1995).
2
Pesquisas realizadas por EBERHAT et al. (1994), SUBBARAMAIAH et al.
(1996) e HIDA et al. (1998) sugerem que a COX-2 é importante no processo da
carcinogênese. OSHIMA et al. (1996) e KAWAMORI et al. (1998), em estudos
experimentais com ratos, comprovaram que o uso de fármacos inibidores seletivos
para a COX-2 protege contra a formação de tumores gastrintestinais.
O estudo da imunorreatividade de marcadores prognósticos do câncer de
mama em cadelas, através da imunoistoquímica, tem se revelado uma importante
ferramenta de trabalho na rotina diagnóstica e de pesquisa (
KANDIOLER-
ECKERSBERGER et al., 2000)
.
A disponibilidade de anticorpos monoclonais que reagem com antígenos
associados aos tumores de mama está se expandindo progressivamente,
permitindo que se conheça melhor a biologia destas neoplasias (MOTTOLLESE et
al., 1994). Segundo Allred et al. (1998), Crosier et al. (1999) e Ohashi et al. (2006)
a imunorreatividade de alguns marcadores como Ki-67, P53 e Caspase-3 são
importantes para determinar o prognóstico das neoplasias mamárias.
Tendo em vista a relação da ciclooxigenase-2 com o desenvolvimento do
câncer, objetivou-se correlacionar a imunorreatividade do Ki-67, P53 e Caspase-3
com a COX-2 em relação ao prognóstico dos adenomas e carcinomas mamários
de cadelas. Além disto, avaliou-se a expressão destes anticorpos em casos de
carcinoma primário metastático, metástase pulmonar e carcinoma inflamatório
desta mesma espécie.
3
II. REVISÃO DA LITERATURA
II.1- NEOPLASIA MAMÁRIA
Devido à elevada incidência de tumores de mama em fêmeas da espécie
canina, seu estudo vem crescendo em relação a outras afecções. As neoplasias
que acometem cães e gatos são modelos apropriados e válidos ao estudo da
biologia do câncer (MOTTOLLESE et al., 1994; ZUCCARI et al., 2001), assim
como, para testar novos agentes terapêuticos, já que os animais de estimação têm
tumores com apresentação histopatológica e comportamento biológico similares
aos tumores que acometem o homem (MacEWEN, 1990; PELETEIRO, 1994;
ZUCCARI et al., 2001).
Os tumores de glândula mamária representam aproximadamente 52% de
todas as neoplasias observadas em cadelas (GORMAN & DOBSON, 1995;
PEREZ-ALENZA, 1998; ZUCCARI, 2001), somente 40 a 50% dos casos são
benignos (KITCHELL, 1995; OGILVIE & MOORE, 1995; MORRISON, 1998). Estas
neoplasias acometem com maior freqüência fêmeas com nove a 12 anos de idade
(SONNENSCHEIN et al., 1991; RUTTEMAN et al., 2001).
Geralmente os tumores mamários apresentam-se como nódulos
circunscritos, de dimensões variáveis. Em relação à mobilidade, podem ser
móveis ou aderidos, com extenso envolvimento cutâneo e muscular. Ao corte,
podem ter aspecto sólido, cístico ou misto, em cuja superfície são observados
freqüentemente focos de necrose (BRODEY et al., 1983; RUTTEMAN et al.,
2001).
4
O exame histopatológico é o método de eleição para identificar as
características de uma neoplasia (LIMA & MARTINS, 1992; MOTA & OLIVEIRA,
1999). A classificação dos tumores mamários em cadelas segundo a Organização
Mundial da Saúde (OMS) está disposta no Quadro 1.
QUADRO 1-
Classificação dos tumores mamários em cadelas segundo a
Organização Mundial da Saúde, citada por MISDORP et al.
(1999).
1- Neoplasias malignas 2- Neoplasias benignas
1.1- Carcinoma in situ
1.2- Carcinoma complexo
1.3- Carcinoma simples
1.3.1- Carcinoma túbulo-papilífero
1.3.2- Carcinoma sólido
1.3.3- Carcinoma anaplásico
1.4- Tipos especiais de carcinoma
1.4.1- Carcinoma de células fusiformes
1.4.2- Carcinoma de células escamosas
1.4.3- Carcinoma mucinoso
1.4.4- Carcinoma rico em lipídeos
1.5- Sarcoma
1.5.1- Fibrossarcoma
1.5.2- Osteossarcoma
1.5.3- Outros sarcomas
1.6- Carcinossarcoma
1.7- Carcinoma ou sarcoma em tumores
benignos
2.1- Adenoma
2.1.1- Adenoma simples
2.1.2- Adenoma complexo
2.1.3- Adenoma basalóide
2.2- Fibroadenoma
2.2.1- Fibroadenoma com
baixa celularidade
2.2.2- Fibroadenoma com
alta celularidade
2.3- Tumor misto benigno
2.4- Papiloma ductal
3- Tumores sem classificação
4- Hiperplasias mamárias e displasias
4.1- Hiperplasia ductal
4.2- Hiperplasia lobular
4.2.1- Hiperplasia epitelial
4.2.2- Adenose
4.3- Cistos
4.4- Ectasia ductal
4.5- Fibrose focal
4.6- Ginecomastia
Outra forma de apresentação histológica dos tumores mamários malignos é
aquela em que o neoplasma é denominado de carcinoma inflamatório, que tem
5
como característica, extrema rapidez de crescimento e invasão da musculatura
adjacente, resultando em edema e inflamação intensa das mamas (BRODEY et
al., 1983; RUTTEMAN et al., 2001).
As características histopatológicas dos tumores mamários indicativas de um
prognóstico reservado são: pouca diferenciação nuclear, necrose tumoral, invasão
de vasos linfáticos e/ou sangüíneos e metástases em linfonodos satélites
(BOSTOCK, 1992; HELLMEN, 1993; FRANCO, 1997; PHILIBERT et al., 2003).
Estas neoplasias, geralmente, se metastizam para os linfonodos e pulmão. No
entanto, podem ocorrer em outros órgãos ou tecidos tais como fígado, coração,
rins, pele, cérebro e ossos (KITCHELL, 1995).
O estadiamento das neoplasias mamárias em cadelas deve ser voltado
para avaliar a fase de evolução tumoral, bem como as possibilidades de
progressão do tumor, no seu sítio de origem e em outros territórios (metástases).
Este estadiamento pode ser feito segundo o sistema TNM (Tumor/ Nódulo
(Linfonodo)/ Metástase) proposto pela OMS (OWEN, 1980).
Hormônios como o estrógeno, progesterona e o hormônio do crescimento
influenciam a carcinogênese (MORRISON, 1998; FONSECA, 1999; ZUCCARI,
1999). MacEWEN et al. (1982) e SARTIN (1992) identificaram receptores de
estrógenos em 40 a 60% dos casos de câncer de mama em cães. A
ovariossalpingohisterectomia precoce reduz a incidência desta neoplasia, pois
inibe a carcinogênese pela influência dos hormônios produzidos no ovário. Em
animais submetidos a ovariossalpingohisterectomia antes do primeiro estro, o
risco de desenvolvimento dos tumores mamários é de 0,05%; de 8% após o
primeiro estro, e após o segundo ciclo estral o risco aumenta para 26%
6
(MORRISON, 1998). Cadelas submetidas à ovariossalpingohisterectomia após os
dois anos e meio de idade, ou concomitantemente à mastectomia, não são
beneficiadas pelos efeitos profiláticos deste procedimento (PELETEIRO, 1994;
FONSECA, 1999; RUTTEMAN et al., 2001).
Até o momento, somente a terapia cirúrgica realizada com ampla margem
de segurança é a forma de tratamento que confere maior sobrevida para cadelas
com câncer de mama (BIRCHARD, 1995). Os protocolos com fármacos
antineoplásicos e/ou radioterapia, geralmente são pouco efetivos (RUTTEMAN et
al., 2001). Experimentos desenvolvidos por PIAZZA et al. (1995) e THOMPSON et
al. (1997) com ratos demonstraram a ação do “sulindac sulfone” na proteção
contra os tumores de mama. O “sulindac sulfone” é um metabólico do
antiinflamatório não esteróide “exisunlind” e age diretamente na inibição da enzima
ciclooxigenase-2.
II.2- ENZIMA CICLOOXIGENASE-2
Os produtos do metabolismo do ácido araquidônico compõem um conjunto
de mediadores que modulam a resposta inflamatória e imunológica, são
decorrentes da oxidação do ácido araquidônico, o qual é gerado pela ação da
enzima fosfolipase A
2
sobre fosfolipídios da membrana celular. A oxidação do
ácido araquidônico pode ser realizada por duas vias enzimáticas: ciclooxigenase
(também conhecida como PGH sintetase) e a lipooxigenase. A ação do sistema
enzimático da ciclooxigenase sobre os fosfolipídios de membrana converte o ácido
araquidônico em uma prostaglandina endoperóxida estável (PGG
2
), que é
7
subseqüentemente reduzida para PGH
2
. Esta então pode ser usada como um
substrato para sintetizar várias prostaglandinas, como a PGE
2
, PGD
2
e PGF
2
. A
PGH
2
pode ainda ser convertida em prostaciclina (PGI
2
) ou tromboxano (TXA
2
)
(MONTENEGRO & FRANCO, 1999; SLAUSON & COOPER, 2002; CALDERÓN,
2005; QUEIROGA et al., 2005; WANG et al. 2006) (Figura 1).
Figura 1 - Esquema do metabolismo do ácido araquidônico pela via da
ciclooxigenase. Adaptado de CALDERON (2005).
Sabe-se que há pelo menos dois tipos de ciclooxigenases que exercem no
organismo diferentes funções fisiológicas: ciclooxigenase-1 (COX-1) e
Ciclooxigenase
Lipooxigenase
Prostaglandina G
2
Lipooxigenase A
2
ativada
Prostaglandina H
2
Tromboxano A
2
Prostaciclina (PGI
2
)
Prostaglandina E
2
Prostaglandina F
2
Prostaglandina D
2
8
ciclooxigenase-2 (COX-2) (SOUZA et al., 2001; WANG et al., 2006). As
ciclooxigenases têm estruturas e pesos moleculares similares. Ambas as enzimas
são constituídas por, aproximadamente, 600 aminoácidos e suas estruturas se
assemelham em cerca de 60%. O peso molecular da COX-1 é 68000 daltons,
enquanto o da COX-2 é 70000 daltons (JONES & BUDSBERG, 2000).
A COX-1 (constituinte) é uma enzima que precisa estar disponível e
funcional no organismo, sendo expressa em vários tecidos. Considera-se que está
envolvida na produção de prostaglandinas que modulam as funções fisiológicas
em diversos órgãos, incluindo rins (mantém o aporte sangüíneo no tecido renal,
evitando quadros de isquemia), trato gastrintestinal (preserva a integridade do
estômago pela produção de PGs gastroprotetoras que impedem a isquemia dos
vasos gástricos) e células como as plaquetas (geração de TxA2 pró agregatórios)
(ZHA et al., 2001; BREYER & HARYS, 2001; CHEN et al., 2002; WANG et al.,
2006).
A COX-3, possivelmente uma variante da COX-1 (pois é derivada do
mesmo gene dessa isorforma), encontra-se distribuída principalmente no córtex
cerebral, sendo mais sensível ao acetaminofeno do que a COX-1 e COX-2.
Postulou-se que a inibição da COX-3 poderia representar o mecanismo central
primário pelo qual as drogas analgésicas e antipiréticas do tipo AINE
desenvolveriam suas atividades de redução da dor e da febre
(CHANDRASEKHARAN et al., 2002; KIS et al., 2005).
Em contraste, a COX-2 é indetectável na maioria dos tecidos, mas pode ser
expressa em resposta a certos estímulos tais como presença de citocinas
(interleucina-1 e fator de necrose tumoral), fatores de crescimento (fator de
9
crescimento epidermal – EGF e fator de crescimento de fibroblastos - FGF),
lipopolissacarídeo bacteriano e oncogenes (BREYER & HARYS, 2001; ZHA et al.,
2001; DONG et al., 2003; KRAUS, 2003; BRUNELLE et al., 2006).
Recentemente, relatou-se a presença de baixos níveis de COX-2 na mácula
densa e no ramo ascendente da alça de Henle em rins de cães adultos normais e
em néfrons imaturos de rins fetais, que declinam progressivamente para
quantidades muito baixas até o momento do parto, evidenciando seu papel na
nefrogênese (KHAN et al., 2001). A COX-2 está presente fisiologicamente de
forma limitada no cérebro, medula espinhal e pode estar envolvida na transmissão
nervosa, particularmente na dor e febre (DUBOIS et al., 1996; KNOTTENBELT et
al., 2006).
A maioria dos antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) inibe as COX-1 e
COX-2, enquanto que os coxibes, que constituem uma nova geração de AINEs,
são inibidores seletivos da COX-2. Os AINEs seletivos para COX-2 têm sido mais
utilizados no controle da inflamação, evitando os efeitos adversos sobre o trato
gastrintestinal causado pela inibição da COX-1 (JONES & BUDSBERG, 2000;
BURLEIGH, 2002; WOLFESBERGER et al., 2006).
No presente contexto, é importante citar que a COX-2 foi primeiramente
descrita como sendo induzida por um oncogene viral (XIE et al., 1992). BAKHLE &
BOTTING (1996) e SMITH et al. (1998) demonstraram que a formação da COX-2
pode ser induzida por uma variedade de fatores de crescimento, relevando a ação
desta enzima no processo de crescimento celular e carcinogênese. Desde então,
progressos foram feitos na tentativa de compreender a biologia das
ciclooxigenases, seu papel nas doenças inflamatórias e no crescimento celular
10
(DUBOIS et al., 1996; BAKHLE, 2001; CAO & PRESCOTT, 2002; MILLANTA et
al., 2006).
Nas últimas duas décadas, numerosos estudos clínicos, experimentais e
epidemiológicos têm ligado o desenvolvimento e progressão das neoplasias com a
presença da COX-2 nas células tumorais humanas (BEAM et al., 2003). A
proposta que a COX-2 está ligada ao desenvolvimento do câncer oferece uma
nova abordagem para aumentar os conhecimentos sobre as neoplasias. A
correlação entre COX-2 e o câncer emergiu a partir de diversos estudos (BAKHLE,
2001) que estabeleceram o uso crônico de antiiflamatórios não esteroidais e a
diminuição da incidência do carcinoma de cólon, em meados dos anos noventa.
Mecanismos associados à promoção tumoral, como aumento da
angiogênese, inibição da apoptose, modulação da resposta imune, maior
capacidade de invasão e metástase, têm sido propostos, baseados em estudos
experimentais, para explicar as conseqüências da super expressão de COX-2
(BOL et al., 2002; CAO & PRESCOTT, 2002; WANG & DUBOIS, 2004; MILLANTA
et al., 2006).
A COX-2 está envolvida com a transformação celular (DAVIES, 1995),
sendo que sua expressão encontra-se aumentada em vários tipos de câncer
(EBERHAT et al., 1994; RISTIMAKI et al., 1997; HIDA et al., 1998; WILSON et al.,
1998; HELLER et al., 2005; BRUNELLE et al., 2006).
THUN et al. (1993) e GIOVANNUCCI et al. (1994) demonstraram
diminuição em 40 a 50% do risco de desenvolvimento de câncer de cólon e reto
em pessoas que usavam regularmente aspirina ou outro antiinflamatório não
esteróide. Os ensaios clínicos de GIARDIELLO et al. (1995) com antiinflamatórios
11
não esteróides em pacientes com pólipos adenomatosos evidenciaram claramente
que o tratamento com estes medicamentos promove a regressão dos adenomas
pré-existentes.
Em uma grande variedade de modelos animais com câncer de cólon
observou-se significativa redução tumoral após o emprego de antiinflamatórios
(WILLIAMS et al., 1997; KAWAMORI et al., 1998; KNOTTENBELT et al., 2006).
Os experimentos de EBERHAT et al. (1994), SANO et al. (1995), KUTCHERA et
al. (1996) e DUBOIS et al. (1996) para determinar o mecanismo envolvido a partir
destas observações, encontraram em pessoas e animais elevada expressão para
a COX-2 nos tumores de cólon e reto, enquanto que áreas normais de mucosa
intestinal possuíam baixas ou nenhuma expressão para a COX-2. Estas
descobertas lideram a hipótese que a COX-2 pode estar envolvida na
determinação do crescimento e progressão do câncer de cólon. Por exemplo, os
efeitos de um inibidor altamente seletivo para a COX-2 (SC-58125) foram testados
em duas linhagens celulares diferentes, sendo que apenas uma delas possuía alta
atividade e expressão para a COX-2. Durante este experimento foi observado
diminuição no crescimento celular nas duas linhagens in vitro, no entanto, in vivo
constatou-se o mesmo efeito apenas nas células com expressão para a COX-2
(SHENG et al., 1997; SHENG et al., 1998).
Evidências genéticas comprovaram o papel da COX-2 no desenvolvimento
das neoplasias intestinais. OSHIMA et al. (1996) avaliaram, em ratos, a ausência
da expressão para a COX-2 determinando o quanto esta enzima contribui para a
formação dos adenomas intestinais. Estes pesquisadores descobriram que
quando o gene da COX-2 é deletado do cromossomo, estes animais não
12
apresentam predisposição genética para a formação de pólipos. O
desenvolvimento tumoral foi significativamente reduzido quando comparado com
ratos do grupo controle; comprovando desta forma o papel da COX-2 na iniciação
da neoplasia.
BEAM et al. (2003) relataram atividade antitumoral em cães com carcinoma
oral de células escamosas tratados com antiinflamatório não esteroidal
(piroxicam). Os cães com carcinoma de células transicionais de bexiga urinária
quando tratados com piroxicam obtiveram remissão parcial ou completa dos
tumores e aumento da sobrevida (BEAM et al, 2003).
Nas neoplasias mamárias em cadelas o número de células marcadas pela
COX-2 variou de acordo com a classificação histopatológica (P<0,001). Observou-
se baixa expressão para a COX-2 nas células dos adenomas (32,1%). No entanto,
verificou-se elevada imunorreatividade nos casos de carcinomas (60,3%) e nas
metástases pulmonares (DE NARDI, 2004).
BAKHLE (2001) sugeriu um possível papel da ciclooxigenase-2 no processo
de progressão de uma lesão pré-neoplásica para uma neoplasia. A COX-2 é
encontrada em lesões de pele pré-cancerosas como na ceratose actínica. A
irradiação de raios ultravioleta – tipo B (UVB) em ceratinócitos humanos induz a
super expressão de COX-2, sugerindo o envolvimento desta enzima no
desenvolvimento do tumor de pele depois de prolongada exposição solar.
Experimentalmente o uso de inibidores específicos para COX-2 (celecoxib SC
5835) tem se mostrado quimiopreventivo no desenvolvimento de tumores de pele
(carcinoma de células escamosas) em camundongos irradiados com raios
ultravioletas (ALMEIDA et al., 2001).
13
TSUJII & DUBOIS (1995), BRUNELLE et al. (2006), WOLFESBERGER et
al. (2006) demonstraram, em trabalhos com culturas celulares, que a expressão
para a COX-2 contribui significativamente no potencial carcinogênico das células
epiteliais pela elevação da resistência aos sinais de apoptose. Estudos sugerem
que a ciclooxigenase-2 inibe a apoptose por indução da expressão do Bcl proto-
oncogene. Esta ação anti-apoptótica pode prolongar a sobrevivência de células
anormais, permitindo assim maior tempo para o acúmulo de mutações genéticas,
resultando em transformações neoplásicas (SURH et al., 2001; BOL et al., 2002;
CAO & PRESCOTT, 2002). Estudos com inibidores de COX levam a redução da
expressão de Bcl-2 e indução a apoptose (CAO & PRESCOTT, 2002; WANG &
DUBOIS, 2004).
A atividade catalítica da COX-2 resulta em produção e potencialização de
danos do DNA por radicais livres. A combinação desses efeitos contribui para que
ocorra lesões permanentes no DNA genômico, justificando a hipótese dos
processos inflamatórios levarem ao aparecimento do câncer (KULKARNI et al.,
2001; ZHA et al., 2001; DONG et al., 2003).
Muitas neoplasias são associadas com a supressão da resposta do sistema
imune por elevados níveis de PGE
2
, formada pela atividade da COX-2. Ocorre
supressão na proliferação de linfócitos B e T, na produção de linfocinas e
formação de células Natural Killer (NK). Além disto, a inibição na liberação de
interleucina-1 pode resultar na produção de células T não responsivas,
contribuindo para promoção do tumor (SOUZA et al., 2000; SURH et al., 2001;
BOL et al., 2002; WANG & DUBOIS, 2004; WANG et al., 2006).
14
A ciclooxigenase-2 possui papel vital na regulação da angiogênese
associada com a proliferação das células neoplásicas (TSUJII et al., 1998;
QUEIROGA et al., 2005). O aumento na expressão de COX-2 está relacionado à
produção do fator de crescimento endotelial, determinando a habilidade para
estimular o desenvolvimento de células endoteliais e promover a angiogênese. A
maioria dos tumores sólidos necessita de novos vasos sangüíneos para prover os
nutrientes necessários para garantir seu crescimento e sobrevivência. A provisão
deste novo aporte sangüíneo – a angiogênese – é também crucial para determinar
a ocorrência de metástases (MEYERS & WATSON, 2003; NIJSTEN et al., 2004;
WANG & DUBOIS, 2004; KNOTTENBELT et al., 2006). A partir disto, os inibidores
para a COX-2 podem bloquear o crescimento dos vasos sangüíneos relacionados
com o desenvolvimento tumoral (TSUJII et al., 1998; WOLFESBERGER et al.,
2006).
O uso de antiinflamatórios inibidores específicos da COX-2, em
camundongos com células tumorais positivas para COX-2, diminuiu a
angiogênese e o crescimento do tumor. No entanto, quando células negativas
para COX-2 foram tratadas com esses mesmos inibidores, não houve nenhum
efeito no volume ou no índice de angiogênese (PRESCOTT, 2000; WILLIAMS et
al., 2000).
Foi demonstrado que o desenvolvimento tumoral é marcadamente
atenuado em células de carcinoma pulmonar de Lewis implantado em
camundongos geneticamente deficientes em COX-2. A diminuição na densidade
vascular tem sido observada no crescimento deste tumor, sugerindo que COX-2
deve regular a densidade vascular intratumoral (WILLIAMS et al., 2000).
15
Existe uma correlação positiva entre a expressão da COX-2 e capacidade
de invasão tecidual pelas células tumorais (SOUZA et al., 2000). A super
expressão de COX-2 nas células de câncer de cólon e mama em humanos está
associada com o aumento da expressão de metaloproteinases que possibilita o
rompimento das barreiras teciduais por sua capacidade de lisar colágeno tipo IV
(presente na membrana basal) e colágenos tipos I, II e III, além de gelatinases,
resultando em células com maior potencial metastático e capacidade de invasão
(BOL et al., 2002; CAO & PRESCOTT, 2002; SLAUSON & COOPER, 2002;
KNOTTENBELT et al., 2006).
A elevada expressão de COX-2 foi acompanhada com a diminuição da
adesão as proteínas da matriz extracelular no epitélio intestinal de ratos, onde se
observou a diminuição da expressão de E-caderina, proteína que está envolvida
com a adesão celular (TSUJII & DUBOIS, 1995).
Relatos na literatura oncológica humana têm documentado a ação
quimiopreventiva e antitumoral dos inibidores de COX-2 contra o câncer de
bexiga, câncer cólon retal e outros carcinomas (KAWAMORI et al., 1998; KHAN et
al., 2001; HENRY, 2003).
Essas pesquisas comprovam o papel da COX-2 na patogênese do câncer e
assim sugerem que sua inibição programada, com o uso de antiinflamatórios
inibidores seletivos de COX-2, pode ser efetiva na quimioprevenção e tratamento
do câncer.
16
II.3- ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO TECIDUAL Ki-67
Independente de suas causas primárias, as neoplasias apresentam
distúrbios no controle do ciclo celular, que levam ao aumento da proliferação
celular, perda da diferenciação e a formação de massas tumorais
(RABENHORST, 1994; FRAILE et al., 2003).
A detecção e quantificação das células em proliferação constituem
parâmetros importantes no prognóstico de diferentes tumores, uma vez que a
capacidade proliferativa tem sido considerada como um grande parâmetro de
identificação de neoplasias, associada ao grau de malignidade (RABENHORST,
1994; SAKAI et al., 2002) .
Atividade proliferativa determinada por meio de marcação imunoistoquímica
pode também ser associada à susceptibilidade do tumor à quimioterapia, uma vez
que a maioria dos fármacos antineoplásicos atua em células que estão em divisão
celular. Tumores com alto índice de crescimento são mais susceptíveis a estes
fármacos. A atividade proliferativa tem sido usada em humanos para selecionar
pacientes que precisam de tratamento adjuvante, obtendo melhores resultados do
que exclusivamente com cirurgia (ABADIE et al., 1999) .
Na neoplasia mamária canina, a avaliação de marcadores de proliferação
celular tem sido sugerida como indicador de prognóstico, adicionados à
classificação por critérios histopatológicos tradicionais (ZUCARI et al., 2001).
Segundo WEIDNER et al. (1994) a proliferação de células tumorais está
relacionada com o prognóstico em muitos tumores, considera-se que a
proliferação tumoral é inversamente proporcional à sobrevida de pacientes com
17
carcinoma mamário. O método que vem sendo mais utilizado é a avaliação
imunoistoquímica do potencial proliferativo para detecção de proteína nucleares
relacionadas com a replicação do DNA. Um dos marcadores mais estudados é o
Ki-67 (VERONESE & GAMBACORTA, 1992). O Ki-67 é um antígeno nuclear que
está presente nas fases ativas do ciclo celular (WEIDNER et al., 1994).
O Ki-67 é uma proteína não histônica, com peso molecular aparente de 345
a 349 Kd presente em todas as fases do ciclo de divisão celular (exceto no início
da fase G
1
e na fase G
0
), sua expressão aumenta na segunda metade da fase S,
alcançando sua maior expressão em G
2
e M. (RABENHORST, 1994; ABADIE et
al., 1999; BARBOSA et al., 2003).
A avaliação da fração do crescimento pelo índice proliferativo de Ki-67 é
altamente preditivo no comportamento de várias neoplasias caninas e tem sido
aplicado como um marcador de proliferação celular útil em muitas neoplasias
humanas (MILLANTA et al., 2002; SAKAI et al., 2002).
A expressão do Ki-67 tem sido estudada em tecidos normais e tumorais em
humanos. A porcentagem de células imunorreativas para esse anticorpo
correlaciona bem com as características morfológicas de proliferação celular,
particularmente índice mitótico e grau de diferenciação do tumor. Diante da
presença de neoplasias indiferenciadas, o Ki-67 é o melhor marcador de
proliferação celular atualmente disponível, permite estabelecer uma relação direta
com o prognóstico (ABADIE et al., 1999; BARBOSA et al., 2003).
De acordo com PEÑA et al. (1998), valores aumentados de Ki-67 têm
correlação positiva com metástase, morte pela neoplasia e menor tempo de
sobrevida. Estudos correlacionam sua imunorreatividade com o tamanho tumoral e
18
envolvimento de linfonodos (VERONESE & GAMBACORTA, 1992). Assim,
anticorpos específicos para a proteína Ki-67 abrem caminho para a pesquisa por
imunoistoquímica da proliferação celular, particularmente útil em numerosos
estudos de valor prognóstico do crescimento celular em neoplasias humanas e de
cães (BOUZUBAR et al., 1989).
II.4- GENE p53
De acordo com KANDIOLER-ECKERSBERGER et al. (2000) e
KUMARAGURUPARAN et al. (2006)
as mutações dos oncogenes fazem com que
as células passem a se dividir sem restrições, enquanto que as mutações dos
genes supressores de tumor fazem com que haja a produção de proteínas
defeituosas que não conseguem prevenir a replicação irregular das células,
principalmente quando ocorre agressão ao DNA. Portanto, tanto os oncogenes,
como os genes supressores de tumor, podem levar a formação de tumores
malignos como resultado final de uma mutação, os oncogenes por serem ativados
e os genes supressores de tumor por serem desativados.
Quando a proteína P53 foi descoberta em 1979, verificou-se sua super
expressão em muitos tipos de tumores malignos, portanto, chegando a conclusões
precipitadas que se tratava de um oncogene. Mais tarde chegou-se a conclusão
que a super expressão era de sua forma mutante (KO & PRIVES, 1996; LEVINE,
1997). Porém, atualmente sabe-se que o p53 é um gene supressor de tumor. O
gene p53 codifica uma fosfoproteína nuclear de 53 kD com atividade supressora
de tumor (SCHMITT et al., 1998).
19
As funções do p53 estão relacionadas às respostas aos constantes
bombardeamentos genotóxicos que as células sofrem ao longo de suas vidas. A
proteína P53 está diretamente relacionada ao bloqueio do ciclo celular, no caso de
dano no DNA, apoptose, ou diferenciação (BROOKS & GU, 2003; WU et al.,
2006).
A regulação da estabilidade protéica é extremamente crítica quando se
detecta o primeiro sinal de um estresse genotóxico (KO & PRIVES, 1996). O DNA
danificado, leva a um rápido aumento nos níveis de P53. Esta proteína sinaliza o
bloqueio do ciclo celular no ponto de verificação em G
1
(ZÖRNIG et al., 2001). O
p53 possui vários mecanismos para efetuar o reparo ou induzir a apoptose, e
diferentes fatores induzem o p53 a escolher a resposta celular mais adequada.
Sob condições de estresse, como irradiações gama e UV, calor e baixos
níveis de oxigênio, o p53 se torna ativo, alterando sua conformação e se ligando a
várias proteínas quinases, resultando na sua estabilização e aumento do potencial
do DNA-ligante (GIACCIA & KASTAN, 1998). Segundo BROOKS & GU (2003) e
SOKOLOWSKA et al. (2005) a estabilização do p53 nas células que apresentam
estresse é crucial para a homeostase celular. A P53 é expressa em níveis muito
baixos em células normais porque é extremamente instável e degrada
rapidamente.
Por agir de tal forma o p53 é chamada de “Guardiã do Genoma”. Uma
mutação do gene p53 causa perda dessa proteção celular, desestabiliza o
genoma e permite a produção de uma proteína defeituosa, não funcionante, que
se acumula na célula e é eliminada mais vagarosamente, o que permite a sua
detecção pela técnica da imunoistoquímica (
KANDIOLER-ECKERSBERGER et al.,
20
2000; NAKANO et al., 2005; WU et al., 2006)
. Já em células normais a concentração
da proteína está abaixo do limiar de detecção por métodos de imunoistoquímica. A
imunorreatividade exacerbada desta proteína têm sido observada em um grande
número de tumores, incluindo carcinomas mamários e está associada com a
agressividade tumoral (SCHMITT et al., 1998; KUMARAGURUPARAN et al.,
2006).
Segundo ZÖRNIG et al. (2001), sabe-se que o gene supressor de tumor
p53 está inativado em aproximadamente 70% dos tumores humanos. A ocorrência
de mutações específicas no gene p53 está associadas com resistência primária à
quimioterapia e recidiva precoce em pacientes humanos com câncer de mama. A
expressão da proteína P53 defeituosa está relacionada com alta taxa de
proliferação tumoral e recorrência precoce da doença (ALLRED et al., 1998;
SOKOLOWSKA et al., 2005).
Segundo SCHMITT et al. (1998) e
WU et al. (2006)
as mutações no p53
estão associadas a menor sobrevida de pacientes portadores de câncer e o seu
estudo como marcador prognóstico, pode prever o comportamento clínico e a
resposta à terapia no câncer de mama.
II.5- CASPASE-3
A morte celular programada vem sendo descrita desde 1828, quando os
pesquisadores observaram a regressão de estruturas durante o desenvolvimento
de fetos e larvas. No entanto, apenas em 1972 o termo apoptose foi introduzido
para caracterizar a morte celular programada, quando o patologista australiano
21
JOHN KERR e colaboradores observando células morrendo em diversas
condições, patológicas ou não, verificaram que elas partilhavam de uma
morfologia estereotipada, aplicando a este fenômeno o termo aptoptose (em grego
apó- para longe; ptósis – queda), palavra usada por poetas gregos para descrever
flores ou folhas cadentes. Durante esse estudo, além da correlação da aptotose
com eventos fisiológicos como a renovação celular, regressão de estruturas no
desenvolvimento embrionário, os autores também a relacionaram com situações
patológicas, que incluíam neoplasias malignas e a involução de tumores após a
administração de quimioterápicos antineoplásicos (KERR et al., 1972; CARSON &
RIBEIRO, 1993; SCHWERDT et al., 2005; LUZ et al., 2006).
A adequada regulação da aptoptose mostra-se importante para o
desenvolvimento e manutenção dos tecidos normais (DEVERAUX et al., 2001;
FISCHER, 2001; LUZ et al., 2006). Os distúrbios apoptóticos, considerados o
primeiro evento em alguns tipos de câncer e leucemia, permitem que células
malignas tenham maior sobrevida, contribuindo para que ocorra a expansão
neoplásica (DEVERAUX et al., 2001; OHASHI et al., 2006).
A morte celular programada pode ocorrer através de duas vias principais, a
via extrínseca e a intrínseca (FISCHER, 2001). Pela via extrínseca, ocorrerá a
ativação de receptores de membrana transmitindo sinais para o interior da célula e
ativando, inicialmente a caspase-8 ou caspase-10. A via intrínseca, ativada por
estresse celular, é mediada pela liberação do citocromo c pela mitocôndria,
levando a ativação da caspase-9. Essas duas vias levam a ativação das caspases
efetoras, as caspases-3, -6 e -7 (LORO et al., 2003).
22
A família das caspases caracteriza-se como a principal via de regulação da
morte celular programada. Diferentes tipos de caspases são expressos na maioria
das células vivas, localizados no citosol, na sua forma inativa. Acredita-se que as
caspases causem a apoptose quebrando ou degradando diversos substratos
celulares considerados importantes na homeostasia da célula (ZIMMERMANN &
GREEN, 2001; SCHWERDT et al., 2005).
Segundo LORO et al. (2003) quatorze tipos distintos de caspases já foram
identificados e associados a diferentes aspectos da morte celular. Elas são
sintetizadas como pró-enzimas de 30 a 50 kDa que necessitam de um processo
proteolítico para serem ativadas.
As caspases podem ser caracterizadas em iniciadoras e efetoras. As
iniciadoras, representadas pelas caspases 8 e 9, caracterizam a primeira caspase
a ser ativada durante a sinalização para a execução da apoptose. A ativação
proteolítica das iniciadoras, geralmente, envolve a autoclivagem e autoativação,
seguida da clivagem e ativação das caspases efetoras (FISCHER, 2001; LUZ et
al., 2006).
A liberação do citocromo c pela mitocôndria caracteriza uma importante via
para ativação das caspases. O citocromo c liga-se ao Apaf-1, formando complexo
citosólico que recruta a pró-caspase 9, clivando-a em caspase 9. Essa, então,
quando liberada do complexo apresenta capacidade de clivar e ativar as caspases
efetoras, como a 3 e a 7 (FISCHER, 2001, SCHWERDT et al., 2005).
A caspase-3, considerada a mais prevalente nas células, caracteriza-se
como responsável pela maioria dos efeitos apoptóticos, como a quebra de muitas
proteínas importantes tais como as enzimas nucleares poli (ADP-ribose)
23
polimerase (PARP). No entanto, recebe suporte de outras, como a caspase-6 e
caspase-7. Juntas, referidas como as caspases de execução ou efetoras,
possuem importante função na controle da morte celular programada
(ZIMMERMANN & GREEN, 2001; OHASHI et al., 2006). A marcação da caspase-
3, em imunoistoquímica, tem sido utilizada para identificar células em apoptose,
revelando fácil aplicabilidade e alta sensibilidade (LORO et al., 2003).
II.6- TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA
O estudo da imunorreatividade de marcadores prognósticos do câncer de
mama na mulher, através da imunoistoquímica, tem se revelado importante
ferramenta de trabalho na rotina diagnóstica e de pesquisa. ALLRED et al. (1998)
denominaram esse estudo de predição da resposta ao tratamento (estudo de
fatores preditivos). As informações como imunorreatividade de receptores de
membrana ou mesmo características proliferativas do tumor são, sem dúvida,
definitivas na escolha de um esquema terapêutico correto (ALLRED et al., 1998).
A técnica de imunoistoquímica foi iniciada com a complexação dos
anticorpos com enzimas, que se mostraram instrumentos simples, versáteis e
práticos para o diagnóstico histopatológico. Assim, a técnica de imunoistoquímica
se baseia na capacidade que têm os anticorpos específicos de se ligarem aos
antígenos correspondentes. A reação de ligação não é visível a menos que o
anticorpo esteja marcado com uma substância que absorva ou emita luz e que,
assim produza um contrate ou cor. O complexo enzima-anticorpo é capaz de se
ligar ao antígeno específico no tecido e alterar a cor do cromógeno apropriado. A
24
peroxidase e a fosfatase alcalina são as enzimas mais utilizadas, sendo a
peroxidase o marcador de preferência na maior parte das técnicas de diagnóstico
imunoistoquímico. O método da imunoistoquímica tem revolucionado a pesquisa
diagnóstica das neoplasias, pois os anticorpos reconhecem antígenos que são
expressos por células neoplásicas específicas, desta forma permite que se
conheça melhor a biologia do câncer (ZUCCARI, 2001).
25
III. MATERIAL E MÉTODOS
III.1- ESCOLHA DOS TUMORES
Para a realização deste estudo foram selecionados 60 amostras de tumores
mamários de cadelas. Estas amostras foram divididas em seis grupos, composto
por 10 tumores em cada grupo, de acordo com a classificação histopatológica.
Para a escolha dos adenomas (Grupo 1), carcinomas com prognóstico bom
(Grupo 2) e carcinomas com prognóstico ruim (Grupo 3) além da classificação
histológica foi considerada a evolução clínica do tumor na seleção dos casos. As
outras 30 amostras foram compostas por 10 casos de carcinoma primário
metastático (Grupo 4), 10 de metástase pulmonar (Grupo 5) e 10 de carcinoma
inflamatório (Grupo 6).
III.1.1-ADENOMA, CARCINOMA COM PROGNÓSTICO BOM E CARCINOMA
COM PROGNÓSTICO RUIM
Os casos de adenoma (Grupo 1), carcinoma com prognóstico bom (Grupo
2) e carcinoma com prognóstico ruim (Grupo 3) foram selecionados a partir de
pacientes atendidas pelo Serviço de Oncologia do Hospital Veterinário da
Universidade Federal do Paraná, no período de janeiro de 2002 a dezembro de
2004.
Procurou-se estabelecer o estadiamento clínico das neoplasias por meio da
mensuração do tamanho do(s) tumor(es) com auxílio de um paquímetro,
procedeu-se também à avaliação dos linfonodos quanto ao tamanho, mobilidade e
26
envolvimento por células neoplásicas, por meio do exame citológico. A avaliação
radiográfica do tórax e a ultra-sonografica do abdome objetivaram pesquisar a
presença ou não de metástases nestas cavidades. O estadiamento clínico das
neoplasias mamárias foi realizado segundo o sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/
Metástase) proposto pela OMS (OWEN, 1980).
Após a realização do estadiamento da doença planejou-se a execução do
procedimento cirúrgico. A mastectomia foi realizada com amplas margens de
segurança, ressecando-se sempre 2 a 3 cm de tecido normal perineoplásico.
Outros princípios da cirurgia oncológica foram seguidos, como por exemplo, a
remoção dos linfonodos satélites.
Após a cirurgia adequada para cada caso específico efetuou-se a colheita
das amostras contendo tecido neoplásico para a classificação da histogênese
tumoral. Os fragmentos dos tumores foram fixados em solução de formol a 10%,
tamponada com fosfato, pH 7,2. Após um período de fixação de aproximadamente
oito horas, o material foi colocado em álcool 80, seguindo os procedimentos
usuais para inclusão em parafina. Nos blocos obtidos realizaram-se cortes de
cinco micrômetros de espessura, os quais foram corados pela Hematoxilina-
eosina e utilizados para observação histológica, permitindo a confirmação do
diagnóstico e classificação dos tumores, mediante os critérios estabelecidos por
MISDORP et al. (1999). As 30 amostras foram então divididas em três grupos, de
acordo com a classificação histopatológica e evolução clínica do tumor (Tabela 1).
No período pós-operatório as pacientes foram avaliadas trimestralmente por
exames físico e complementares, com o propósito de monitorar a evolução da
afecção neoplásica (presença ou ausência de recidiva e/ou metástase; paciente
27
vivo ou morto), procedimento este que teve continuidade até o mês de dezembro
de 2006.
Tabela 1 –
Relação dos casos de acordo com a classificação histopatológica e
evolução clínica das neoplasias mamárias de cadelas atendidas no
Hospital Veterinário da UFPR, câmpus de Curitiba, no período de
janeiro de 2002 a dezembro de 2004. UFPR – Curitiba, PR, 2006.
Paciente Classificação
histopatológica
Evolução clínica Denominação
do grupo
1 Adenoma simples
2 Adenoma simples
3 Adenoma complexo
4 Adenoma simples
5 Adenoma simples
6 Adenoma simples
7 Adenoma complexo
8 Adenoma complexo
9 Adenoma simples
10 Adenoma simples
Favorável
Adenoma
11 Carcinoma complexo
12 Carcinoma túbulo-papilífero
13 Carcinoma túbulo-papilífero
14 Carcinoma complexo
15 Carcinoma complexo
16 Carcinoma sólido
17 Carcinoma complexo
18 Carcinoma sólido
19 Carcinoma túbulo-papilífero
20 Carcinoma túbulo-papilífero
Durante o período de
acompanhamento
pós-operatório
1
os
animais
não
apresentaram
recidiva ou
metástases
Carcinoma com
prognóstico bom
21 Carcinoma sólido
22 Carcinoma complexo
23 Carcinoma túbulo-papilífero
24 Carcinoma túbulo-papilífero
25 Carcinoma sólido
26 Carcinoma complexo
27 Carcinoma complexo
28 Carcinoma sólido
29 Carcinoma túbulo-papilífero
30 Carcinoma complexo
Durante o perí
odo de
acompanhamento
pós-operatório
1
os
animais
apresentaram
recidiva ou
metástases.
Carcinoma com
prognóstico ruim
1
Acompanhamento pós-operatório: período compreendido entre a data da cirurgia
2
e os
retornos (ou a morte do paciente). Os pacientes que não morreram foram monitorados até
dezembro de 2006.
2
Os procedimentos cirúrgicos foram realizados entre janeiro de 2002 e dezembro de 2004.
28
III.1.2- CARCINOMA PRIMÁRIO METASTÁTICO, METÁSTASE PULMONAR E
CARCINOMA INFLAMATÓRIO
Dez animais submetidos à necropsia pelo Serviço de Patologia Veterinária
da Universidade Federal do Paraná foram contabilizados a este estudo. Em todos
os casos os pacientes apresentavam metástases pulmonares de carcinoma
mamário.
Durante a necropsia teve-se o cuidado de colher fragmentos da neoplasia
mamária (carcinoma primário metastático – Grupo 4) e das metástases
pulmonares (metástase pulmonar – Grupo 5). Para estes pacientes, não existem
informações em relação à evolução clínica do tumor, pois inúmeros animais
chegaram mortos ao Hospital Veterinário em virtude da progressão do processo
neoplásico.
Além disto, utilizaram-se 10 casos de carcinoma inflamatório (Grupo 6)
provenientes do arquivo do Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Botucatu. Neste grupo, a única
informação é o resultado histopatológico.
Os fragmentos de cada um dos tumores foram fixados com formol 10%,
recortados com o auxílio de micrótomo (5
µ
m de espessura) e submetidos à
coloração de Hematoxilina e Eosina. Após a confecção da lâmina, procedeu-se à
avaliação através da microscopia de luz, definindo-se assim o diagnóstico do
tumor mamário, de acordo com a classificação proposta por MISDORP et al.
(1999).
29
III.2- ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
Para a realização da técnica de imunoistoquímica, os blocos de parafina
foram cortados em micrótomo, com espessura de 3
µ
m e distendidos em lâminas
histológicas devidamente preparadas com Poly-L-Lysina (Sigma P8920) com o
objetivo de promover maior aderência dos cortes às lâminas de vidro, evitando
assim a perda do material durante o processamento.
A técnica de imunoistoquímica seguiu o protocolo do Laboratório de
Imunoistoquímica do Serviço de Patologia da FMVZ – UNESP – Botucatu,
utilizando-se a técnica de estreptoavidina-biotina-peroxidase (Anexos 1 e 2). Os
anticorpos utilizados estão descritos na Tabela 2.
Tabela 2 -
Relação dos anticorpos primários, clone e código, marca do anticorpo,
recuperação antigênica e diluição utilizada nos cortes de neoplasias
mamárias de cadelas atendidas no Hospital Veterinário da UFPR,
câmpus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
UNESP – Botucatu, SP, 2006.
Anticorpo 1°
Clone e
código
Marca do
anticorpo
Recuperação antigênica
Diluição
COX-2
CX-294
M3617
Dako Citrato* em banho-maria** 1:50
P53 Policlonal
(CM1)
Novocastra Citrato* em banho-maria** 1:1000
Ki-67 MIB-1
M7240
Dako
Citrato* em banho-maria** 1:50
Caspase-3
clivada
Policlonal
(Asp175)
Neomarkers Citrato* em banho-maria** 1:100
* Citrato: 10 milimolar, pH 6,0.
** Banho-maria: solução pré-aquecida 96,5ºC. As lâminas foram incubadas
durante 25 minutos em banho-maria.
30
O percentual de positividade para COX-2, P53, Ki-67 e Caspase-3 foi obtido
pela contagem de células imunorreativas com o auxílio de um equipamento
analisador de imagens (KS 300, versão 3.0 – Zeiss) que consta de um
microscópio (Leica DMLD) acoplado a uma câmara digital (Sony – DXV15A) que
emite imagens para o programa computacional de análise morfométrica.
Na avaliação imunoistoquímica das expressões de ciclooxigenase-2 e
caspase-3 foram contados cinco campos para cada caso analisado, avaliando-se
o número de células marcadas (Tabela 3) e a intensidade de coloração de cada
campo (Tabela 4), conforme preconizado por DORÉ et al. (2003) e HELLER et al.
(2005).
Tabela 3 –
Pontuação atribuída de acordo com o número de células marcadas
(imunorreativas) por campo, nas neoplasias mamárias de cadelas.
UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
Número de células
marcadas por campo (%)
Pontuação
< 5% 0
5 – 25 % 1
26 – 50% 2
51 – 75% 3
> 75% 4
31
Tabela 4 –
Pontuação atribuída à intensidade de coloração das células marcadas
por campo, nas neoplasias mamárias de cadelas. UNESP – Jaboticabal,
SP, 2006.
Intensidade de coloração Pontuação
Fraca 1
Moderada 2
Intensa 3
Ao final, estabeleceu-se um escore que variou entre 0 e 12 pontos que foi
obtido a partir do produto da pontuação do número de células marcadas pela
pontuação da intensidade de coloração.
A avaliação da expressão dos anticorpos Ki-67 e P53 foi determinada pela
forte coloração acastanhada nos núcleos. Foram contados oito campos para cada
caso analisado, obtendo-se assim a contagem mínima de 1000 células, entre
positivas e negativas.
III.3- ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram submetidos ao programa Statistical Analysis
System (SAS). A independência dos resultados (expressão para os anticorpos
COX-2, Ki-67, P53 e Caspase-3) com a classificação histopatológica e
comportamento clínico das neoplasias mamárias foi testada por meio de uma
tabela de contingência 2X6 (Teste Qui-Quadrado). Posteriormente, para cada um
dos quatro anticorpos, houve uma subdivisão desta tabela em tabelas de
32
contingência 2X2 para testes de independência específicos entre os grupos
(adenoma e carcinoma com prognóstico bom; adenoma e carcinoma com
prognóstico ruim; carcinoma com prognóstico bom e carcinoma com prognóstico
ruim; carcinoma inflamatório e carcinoma com prognóstico bom; carcinoma
inflamatório e carcinoma com prognóstico ruim; carcinoma primário metastático e
metástase pulmonar). Além disto, para cada grupo de tumor foi avaliado a
correlação da expressão da ciclooxigenase-2 com os anticorpos usados neste
estudo (Ki-67, P53 e Caspase-3), utilizando-se o teste de Análise de Variância.
33
IV. RESULTADOS
IV.1- IDADE
A incidência das neoplasias mamárias nas cadelas relacionada com a idade
está representada na Figura 2, neste ensaio, observou-se maior prevalência no
desenvolvimento de tumores mamários em pacientes com idade entre sete e 12
anos.
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Idade
Número de casos
FIGURA 2 –
Distribuição da incidência das neoplasias mamárias em cadelas
de acordo com a idade. UFPR – Curitiba, PR, 2006.
34
IV.2- ESTADIAMENTO CLÍNICO
Os dados de estadiamento clínico estão apresentados de acordo com a
classificação histopatológica e comportamento clínico das neoplasias. Seis
tumores (60%) do grupo adenoma foram classificados em estágio I, três (30%) em
estágio II e um (10%) em estágio III (Quadro 2). No grupo de carcinoma mamário
com prognóstico bom (Quadro 3), quatro tumores (40%) foram estadiados em
estágio I, dois (20%) em estágio II e quatro (40%) em estágio III. Nas neoplasias
do grupo carcinoma mamário com prognóstico ruim (Quadro 4), dois tumores
(20%) foram classificados em estágio I, dois (20%) em estágio II, cinco (50%) em
estágio III e um (10%) em estágio IV.
LEGENDA: Tamanho do tumor: T1 = Tumor <3cm de diâmetro. T2 = Tumor entre 3-5cm de diâmetro.
T3 = Tumor >5cm de diâmetro.
Linfonodo: N0 = Sem evidência de metástase em linfonodo regional.
Metástase: M0 = Sem evidência de metástases à distância.
QUADRO 2 -
Estágio clínico dos adenomas mamários em cadelas
seguindo
o Sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/
Metástase) proposto pela OMS
(OWEN, 1980).
UFPR – Curitiba, PR, 2006.
Paciente Tamanho
do tumor
Linfonodo Metástase Estágio
clínico
1 T1 N0 M0 I
2 T1 N0 M0 I
3 T2 N0 M0 II
4 T1 N0 M0 I
5 T1 N0 M0 I
6 T2 N0 M0 II
7 T3 N0 M0 III
8 T1 N0 M0 I
9 T1 N0 M0 I
10 T2 N0 M0 II
35
QUADRO 3 -
Estágio clínico dos carcinomas mamários
com
prognóstico bom, em cadelas,
seguindo o Sistema
TNM (Tumor/ Linfonodo/ Metástase) proposto pela
OMS (OWEN, 1980). UFPR – Curitiba, PR, 2006.
Paciente Tamanho do
tumor
Linfonodo Metástase Estágio
clínico
11 T3 N0 M0 III
12 T3 N0 M0 III
13 T1 N0 M0 I
14 T1 N0 M0 I
15 T2 N0 M0 II
16 T2 N0 M0 II
17 T1 N0 M0 I
18 T3 N0 M0 III
19 T3 N0 M0 III
20 T1 N0 M0 I
LEGENDA: Tamanho do tumor: T1 = Tumor <3cm de diâmetro. T2 = Tumor entre 3-5cm de diâmetro.
T3 = Tumor >5cm de diâmetro.
Linfonodo: N0 = Sem evidência de metástase em linfonodo regional.
Metástase: M0 = Sem evidência de metástases à distância.
QUADRO 4 -
Estágio clínico dos carcinomas mamários
com
prognóstico ruim, em cadelas,
seguindo o Sistema
TNM (Tumor/ Linfonodo/ Metástase) propost
o pela
OMS (OWEN, 1980). UFPR – Curitiba, PR, 2006.
Paciente Tamanho
do tumor
Linfonodo Metástases Estágio
clínico
21 T2 N1 M0 II
22 T3 N0 M0 III
23 T3 N1 M0 III
24 T3 N1 M0 III
25 T3 N0 M0 III
26 T3 N1 M0 III
27 T1 N0 M0 I
28 T1 N0 M0 I
29 T2 N1 M1 IV
30 T2 N0 M0 II
LEGENDA: Tamanho do tumor: T1 = Tumor <3cm de diâmetro. T2 = Tumor entre 3-5cm de diâmetro.
T3 = Tumor >5cm de diâmetro.
Linfonodo: N0 = Sem evidência de metástase em linfonodo regional. N1 = Presença de
metástase em linfonodo regional.
Metástase: M0 = Sem evidência de metástases à distância. M1= Presença de metástase à
distância.
36
Na Figura 3 está representada a divisão dos tumores por tamanho (< 3cm;
entre 3 e 5cm; > 5cm) deste estudo. No grupo dos adenomas, 60% dos tumores
eram menores que 3cm de diâmetro, enquanto que 50% dos casos de carcinoma
com prognóstico ruim os tumores apresentavam mais que 5cm de diâmetro.
FIGURA 3 –
Prevalência de neoplasias mamárias, distribuídas conforme o
tamanho do tumor, em cadelas atendidas no Hospital
Veterinário da UFPR, câmpus de Curitiba, no período de janeiro
de 2002 a dezembro de 2004. UFPR – Curitiba, PR, 2006.
Número de tumores
0
1
2
3
4
5
6
Número de animais
< 3cm 3-5 cm > 5cm
Tamanho do tumor
Adenoma
Carcinoma com
prognóstico bom
Carcinoma com
prognóstico ruim
37
IV.3- SOBREVIDA APÓS A CIRURGIA
Três cadelas (30%) com adenomas apresentaram sobrevida no pós-
operatório maior que 36 meses. No grupo de carcinomas com prognóstico bom,
20% das pacientes viveram mais que 36 meses. No entanto, no grupo dos
carcinomas com prognóstico ruim nenhum paciente apresentou sobrevida maior que
36 meses (Figura 4).
FIGURA 4 –
Distribuição das neoplasias mamárias de acordo com a
sobrevida observada no pós-operatório, em cadelas atendidas
no Hospital Veterinário da UFPR, câmpus de Curitiba, no
período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004. UFPR –
Curitiba, PR, 2006.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Número de animais
Adenoma Adenocarcinoma sem
recidiva/metástase
Adenocarcinoma com
recidiva/metástase
< 12 meses 13-24 meses 25-36 meses 37-48 meses > 49 meses
Carcinoma com
prognóstico bom
Carcinoma com
prognóstico ruim
38
IV.4- IMUNOISTOQUÍMICA
IV.4.1- IMUNORREATIVIDADE PARA A COX-2
Na avaliação imunoistoquímica, o número de células marcadas para
atividade da COX-2, variou de acordo com a classificação histopatológica,
havendo uma correlação significativa (P<0,05) entre o número de células
marcadas e a classificação histopatológica.
Observou-se baixa imunorreatividade para a COX-2 nas células dos
adenomas (25%). A expressão nos carcinomas inflamatórios foi de 35%, nos
casos de carcinoma com prognóstico bom foi de 41,6%. No entanto, elevada
imunomarcação para a ciclooxigenase-2 foi observada nos carcinomas com
prognóstico ruim (60,8%), carcinomas primários metastáticos (70%) e nas
metástases pulmonares (68%) (Figura 5).
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
Adenoma
Carcinoma
com
prognóstico
bom
Carcinoma
com
prognóstico
ruim
Carcinoma
primário
metastático
Metástase
pulmonar
Carcinoma
inflamatório
Expressão da ciclooxigenase-2
FIGURA 5 –
Expressão da ciclooxigenase-2 nas neoplasias mamárias de
cadelas. UFPR – Curitiba, PR, 2006.
39
O resultado foi significativo (P<0,05) na independência dos grupos:
adenoma e carcinoma com prognóstico bom; adenoma e carcinoma com
prognóstico ruim; carcinoma com prognóstico bom e carcinoma com prognóstico
ruim; carcinoma inflamatório e carcinoma com prognóstico ruim.
A imunorreatividade para a COX-2 foi inteiramente confinada ao citoplasma
das células neoplásicas. Poucas células foram marcadas nos casos de adenoma
(Figura 6 - A). No entanto, um grande número de células imunorreativas, bem
como forte expressão para a COX-2 foi observada na maior parte dos casos de
carcinoma com prognóstico ruim (Figura 6 – B), carcinoma primário metastático
(Figura 7 - A) e nas metástases pulmonares (Figura 7 - B). Nas preparações
imunoistoquímicas verificou-se forte marcação das células neoplásicas no interior
dos vasos linfáticos (êmbolo neoplásico) nos casos de carcinoma primário
metastático.
Observou-se imunomarcação apenas para o componente epitelial das
neoplasias mamárias, nenhuma expressão foi constatada nas células
mesenquimais adjacente ao tumor (Figura 6 - B).
Nas preparações imunoistoquímicas dos casos de carcinoma inflamatório
verificou-se moderada marcação das células neoplásicas no interior dos vasos
linfáticos (Figura 8 – A e B).
40
FIGURA 6-
Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um adenoma
mamário em cadela. Observar que não houve marcação das células para a
atividade da ciclooxigenase-2. Aumento: 400 vezes. Em B - Fotomicrografia de
preparação imunoistoquímica de um carcinoma mamário com prognóstico ruim
em cadela. Observar as células neoplásicas marcadas para atividade da
ciclooxigenase-2 (seta vermelha). Atentar para a presença de imunorreatividade
para atividade da ciclooxigenase-2 na parte epitelial (seta vermelha) e ausência
na área mesenquimal (seta azul) desta neoplasia. Contra-coloração: Hematoxilina
de Mayer. Aumento: 200 vezes. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
FIGURA 7-
Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde se visibiliza
grande número de células neoplásicas marcadas para atividade da
ciclooxigenase-2 (seta vermelha) em um caso de carcinoma primário
metastático em cadela. Aumento: 100 vezes. Em B - Fotomicrografia de
preparação imunoistoquímica na qual se observa inúmeras células neoplásicas
marcadas para atividade da ciclooxigenase-2 em um caso de metástase
pulmonar em cadela. Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer. Aumento: 400
vezes. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
A
B
A
B
41
FIGURA 8 - Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica na qual se
observa moderada marcação das células neoplásicas no interior do vaso
linfático (seta vermelha), para atividade da ciclooxigenase-2 em um
carcinoma inflamatório de cadela. Contra-coloração: Hematoxilina de
Mayer. Aumento: 200 vezes. Em B – Mesmo caso descrito em A, no
entanto, com aumento de 400 vezes. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
A
B
42
IV.4.2- IMUNORREATIVIDADE PARA O Ki-67
Em relação a imunorreatividade do índice de proliferação celular Ki-67, o
número de células marcadas variou de acordo com a classificação histopatológica
no grupo dos adenomas, carcinomas inflamatórios e metástases pulmonares
(P<0,05). Não houve diferença estatística (P>0,05) entre os grupos de carcinomas
(carcinoma com prognóstico bom, carcinoma com prognóstico ruim e carcinoma
primário metastático).
Ocorreu baixa expressão do Ki-67 nos casos de adenoma (10%),
carcinoma com prognóstico bom (12,5%), carcinoma com prognóstico ruim (14%),
carcinoma primário metastático (17,5%) e nas metástases pulmonares (5%).
Todavia, 45% das células expressaram este antígeno nos carcinomas
inflamatórios (Figura 9). O resultado foi significativo (P<0,05) na independência
dos grupos: carcinoma inflamatório e carcinoma com prognóstico bom; carcinoma
inflamatório e carcinoma com prognóstico ruim; carcinoma primário metastático e
metástase pulmonar.
Houve correlação da expressão da COX-2 com o índice de proliferação
celular Ki-67 (P<0,05) nos grupos de adenoma, metástase pulmonar e carcinoma
inflamatório (Figura 9).
43
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
Adenoma Carcinoma
com
prognóstico
bom
Carcinoma
com
prognóstico
ruim
Carcinoma
primário
metastático
Metástase
pulmonar
Carcinoma
inflamatório
Expressão do Ki-67
FIGURA 9
–
Expressão do índice de proliferação celular Ki-67 nas neoplasias
mamárias de cadelas. (*) Grupo onde houve correlação com a
ciclooxigenase-2. UFPR – Curitiba, PR, 2006.
A imunorreatividade para o Ki-67 foi inteiramente confinada ao núcleo das
células. Ocorreu intensa marcação das células neoplásicas no interior dos vasos
linfáticos, nos casos de carcinoma inflamatório (Figura 10 – A e B).
Em um único caso de carcinoma primário metastático, de uma paciente
com dois anos, evidenciou-se intensa expressão para o Ki-67 (Figura 11 – A e B).
No entanto, pouquíssimas células apresentaram expressão para o Ki-67 na
avaliação das amostras de metástase pulmonar deste mesmo animal.
*
*
*
44
FIGURA 10 -
Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica na qual está
demonstrada intensa marcação das células neoplásicas no interior do vaso
linfático (seta vermelha), para atividade do Ki-67 em um carcinoma
inflamatório de cadela. Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer.
Aumento: 200 vezes. Em B – Mesmo caso descrito em A, no entanto, com
aumento de 400 vezes. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
FIGURA 11 -
Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde se visibiliza a
presença de inúmeros núcleos marcados para atividade do Ki-67 (seta vermelha)
em um caso de carcinoma primário metastático em cadela. Contra-coloração:
Hematoxilina de Mayer. Aumento: 40 vezes. Em B – Mesmo caso descrito em A,
no entanto, com aumento de 200 vezes. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
A
B
A
B
45
IV.4.3- IMUNORREATIVIDADE PARA A PROTEÍNA P53
Na avaliação imunoistoquímica, o número de células marcadas com a
proteína P53, variou de acordo com a classificação histopatológica, havendo uma
correlação significativa (P<0,05) entre o número de células marcadas e a
classificação histopatológica.
Observou-se baixa expressão da proteína P53 nas células dos adenomas
(8,4%) e média expressão nos carcinomas com prognóstico bom (21,25%). No
entanto, expressão para a P53 foi bastante evidenciada nos carcinomas com
prognóstico ruim (36,57%), carcinomas primários metastáticos (41%), metástases
pulmonares (38.5%) e carcinomas inflamatórios (45,83%) (Figura 12). Em todos os
grupos de neoplasias mamárias estudados a COX-2 apresentou correlação com a
proteína P53 (P<0,01) (Figura 12).
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
40,00%
45,00%
50,00%
Adenoma Carcinoma
com
prognóstico
bom
Carcinoma
com
prognóstico
ruim
Carcinoma
primário
metastático
Metástase
pulmonar
Carcinoma
inflamatório
Expressão da proteína P53
FIGURA 12
–
Expressão da proteína P53 nas neoplasias mamárias de
cadelas. (*) Grupo onde houve correlação com a
ciclooxigenase-2. UFPR – Curitiba, PR, 2006.
*
*
*
*
*
*
46
O resultado foi significativo (P<0,05) na independência dos grupos:
adenoma e carcinoma com prognóstico bom; adenoma e carcinoma com
prognóstico ruim; carcinoma inflamatório e carcinoma com prognóstico bom;
carcinoma inflamatório e carcinoma com prognóstico ruim.
A imunorreatividade para a proteína P53 foi evidenciada no núcleo das
células neoplásicas e em alguns casos ocorreu a marcação do citoplasma. Várias
células marcadas, bem como forte expressão para a P53 foi visibilizada nos casos
de carcinoma com prognóstico ruim (Figura 13 – A e B).
Nas preparações imunoistoquímicas dos casos de carcinoma inflamatório
verificou-se moderada marcação das células neoplásicas (Figura 14 – A). Poucas
células foram marcadas nos casos de adenoma e em alguns campos não foi
observado nenhuma imunorreatividade para a proteína P-53 (Figura 14 - B).
FIGURA 13-
Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
mamário com prognóstico ruim em cadela. Observar presença de células
imunorreativas para a proteína P53 (seta vermelha). Aumento: 100 vezes. Em
B -
mesmo caso descrito em A, no entanto, com aumento de 400 vezes
Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
A
B
47
FIGURA 14-
Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde se visibiliza
células neoplásicas marcadas para atividade da P53 (seta vermelha) em um
caso de carcinoma inflamatório em cadela. Aumento: 100 vezes. Em B -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde não se observa a
presença de células marcadas para a proteína P53 em um caso de adenoma
mamário em cadela. Aumento: 400 vezes. Contra-coloração: Hematoxilina de
Mayer. UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
A
B
48
IV.4.4- IMUNORREATIVIDADE PARA A CASPASE-3
Em relação a imunorreatividade da Caspase-3, o número de células
marcadas variou de acordo com a classificação histopatológica somente no grupo
dos carcinomas primários metastáticos e nas metástases pulmonares (P<0,05).
Ocorreu baixa imunomarcação para a Caspase-3 nos casos de adenoma
(0,33%), carcinoma com prognóstico bom (1,33%), carcinoma com prognóstico
ruim (0,25%) e carcinoma inflamatório (2,37%). Maior expressão para a Caspase-
3 foi observada nos carcinomas primários metastáticos (16,88%) e nas
metástases pulmonares (12,22%) (Figura 15). O resultado foi significativo (P<0,05)
somente na independência dos grupos: carcinoma primário metastático e
metástase pulmonar. Observou-se correlação da expressão da ciclooxigenase-2
com a Caspase-3 nos grupos de carcinoma primário metastático e nas metástases
pulmonares (P<0,05) (Figura 15).
0,00%
2,00%
4,00%
6,00%
8,00%
10,00%
12,00%
14,00%
16,00%
18,00%
Adenoma Carcinoma
com
prognóstico
bom
Carcinoma
com
prognóstico
ruim
Carcinoma
primário
metastático
Metástase
pulmonar
Carcinoma
inflamatório
Expressão da Caspase-3
FIGURA 15–
Expressão da Caspase-3 nas neoplasias mamárias de cadelas. (*)
Grupo onde houve correlação com a ciclooxigenase-2. UFPR –
Curitiba, PR, 2006.
*
*
49
A imunorreatividade para a Caspase-3 foi confinada, na maior parte das
lâminas, ao citoplasma das células neoplásicas. Ocorreu marcação principalmente
nos casos de carcinoma primário metastático (Figura 16 – A e B) e nas
metástases pulmonares (Figura 17 – A).
Nas preparações imunoistoquímicas dos casos de carcinoma inflamatório
verificou-se expressão para Caspase-3 em algumas células desta neoplasia
(Figura 17 – B).
FIGURA 16 - Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde se observa
marcação das células neoplásicas para atividade da Caspase-3 em um
carcinoma primário metastático de cadela. Contra-coloração:
Hematoxilina de Mayer. Aumento: 400 vezes. Em B – Fotomicrografia de
preparação imunoistoquímica onde se visibiliza expressão para a
Caspase-3 (seta vermelha) em um carcinoma primário metastático de
cadela. Aumento: 400 vezes. Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer.
UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
A
B
50
FIGURA 17-
Em A - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde se verifica a
presença de células imunorreativas para a atividade da Caspase-3 em um
caso de metástase pulmonar de carcinoma mamário em cadela. Aumento:
400 vezes. Em B – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica onde se
visibiliza marcação das células neoplásicas no interior do vaso linfático (seta
vermelha) para atividade da Caspase-3 em um carcinoma inflamatório de
cadela. Aumento: 400 vezes. Contra-coloração: Hematoxilina de Mayer.
UNESP – Jaboticabal, SP, 2006.
B
A
51
V. DISCUSSÃO
A condução de pesquisas dentro dessa linha e concepção justifica-se
devido à elevada incidência de neoplasias mamárias malignas em cadelas
(GORMAN & DOBSON, 1995; KITCHELL, 1995; OGILVIE & MOORE, 1995;
MORRISON, 1998; PEREZ-ALENZA, 1998; ZUCCARI, 2001). Além disto, os
tumores que acometem os cães são modelos apropriados para o estudo da
biologia do câncer, assim como para testar novos agentes terapêuticos no
tratamento das neoplasias, pois os animais de estimação têm tumores com
comportamento semelhante aos tumores que acometem o homem (MacEWEN,
1990; MOTTOLLESSE et al., 1994; PELETEIRO, 1994; ZUCCARI, 2001).
De maneira semelhante ao constatado por SONNENSCHEIN et al. (1991) e
RUTTEMAN et al. (2001), as neoplasias mamárias, neste estudo, prevaleceram
em pacientes com sete a 12 anos de idade. O estadiamento dos tumores
mamários realizado de acordo com o sistema TNM (Tumor/ Nódulo ou Linfonodo/
Metástase) proposto pela Organização Mundial da Saúde (MOULTON, 1990) foi
fundamental para avaliar, neste ensaio, a possibilidade de progressão do tumor
para os principais locais de ocorrência de metástases, como os linfonodos e os
pulmões (KITCHELL, 1995).
Dados em relação ao histórico das pacientes, como tipo de alimentação,
número de gestações, freqüência da administração de anticoncepcionais,
ocorrência de pseudogestações e realização da ovariossalpingohisterectomia,
foram levantados nos grupos dos adenomas, carcinomas com prognóstico bom e
carcinomas com prognóstico ruim. Futuramente, com o aumento do número de
52
casos, estes dados serão analisados e correlacionados com a expressão da
ciclooxigenase-2 nas neoplasias mamárias de cadelas.
Os resultados encontrados, no presente experimento, evidenciam a
importância do estudo de marcadores celulares nas neoplasias mamárias pela
técnica de imunoistoquímica, semelhante ao relatado por ZUCCARI (2001), pois
foi possível determinar a presença, bem como quantificar a expressão da enzima
COX-2; que normalmente só é encontrada em resposta a estímulos inflamatórios
(SOUZA et al., 2000). A utilização da técnica da estreptoavidina-biotina-
peroxidase, bem como a recuperação antigênica em banho-maria, juntamente
com a diluição do anticorpo monoclonal (clone CX-294, M3617, Dako) na
proporção de 1:50 foi adequada para realizar a imunomarcação das células
neoplásicas. A marcação positiva foi identificada pela coloração marrom -
acastanhada granular citoplasmática das células neoplásicas. Além disto, foi
observado variação na intensidade de coloração, como reportado por DORÉ et al.
(2003) e HELLER et al. (2005).
A técnica de imunoistoquímica tem grande importância na pesquisa
diagnóstica das neoplasias, em virtude da especificidade deste exame (ZUCCARI,
1999). Esta técnica proporciona dados menos subjetivos na graduação
histopatológica das neoplasias mamárias, e, com estudos prospectivos é possível
correlacioná-las como prognóstico e sobrevida dos animais.
O exame histopatológico é o método de eleição para identificar as
características de uma neoplasia (LIMA & MARTINS, 1992; MISDORP et al., 1999;
MOTA & OLIVEIRA, 1999). Com relação à classificação histopatológica das
neoplasias mamárias adotou-se a descrita por MISDORP et al. (1999). Houve
53
correlação significativa (P<0,05) da imunorreatividade para a COX-2 em relação
ao prognóstico das neoplasias mamárias, levando-se em consideração a
classificação e as características histopatológicas desta afecção.
A expressão de COX-2 foi superior nas neoplasias malignas em relação às
benignas; além disto, a intensidade de imunorreatividade também foi maior nas
lesões neoplásicas malignas, semelhante ao encontrado por DORÉ et al. (2003).
A expressão da COX-2 tem relação com o prognóstico nos carcinomas
mamários de mulheres (COSTA et al., 2002), provavelmente o mesmo acontece
em cadelas, haja vista a diferença significativa (P<0,05) que foi observada entre o
grupo de pacientes com carcinoma de prognóstico bom e o grupo com carcinoma
de prognóstico ruim. Em humanos, a expressão da ciclooxigenase-2 nos
carcinomas gástricos (SHI et al., 2003) e carcinomas pulmonares (KHURI et al.,
2001) é conhecida como marcador prognóstico destas afecções.
A expressão para a ciclooxigenase-2 se restringiu ao componente epitelial
da glândula mamária. Nenhuma imunomarcação foi observada no componente
mesenquimal, representado pelas células contráteis de natureza mioepitelial.
Semelhante ao constatado por DORÉ et al. (2003), não foi observado
diferença estatística, em relação a imunoexpressão da COX-2, entre os três sub-
tipos de carcinoma (sólido, complexo e túbulo-papilífero). Este resultado ressalta a
importância de realizar pesquisas avaliando principalmente o prognóstico dos
animais. Em relação ao estadiamento das neoplasias verificou-se maior
imunorreatividade para a ciclooxigenase-2 nos tumores em estágio III (P<0,05),
relacionando a expressão desta enzima com a progressão do tumor, corroborando
com os resultados encontrados por HELLER et al. (2005).
54
Diferentemente do esperado, evidenciou-se 35% de imunomarcação para a
COX-2 nos carcinomas inflamatórios. A expectativa era encontrar um elevado
número de células marcadas para a ciclooxigenase-2 neste tipo de carcinoma,
devido ao comportamento extremamente agressivo que este tumor apresenta
(BRODEY et al., 1983; RUTTEMAN et al., 2001). Este resultado pode ser
conseqüência da intensa anaplasia que as células desta neoplasia apresentam.
No processo de progressão tumoral é possível que as células percam a
capacidade de sintetizar a ciclooxigenase-2, assim como acontece, com a perda
dos receptores de estrógeno e progesterona nos carcinoma mamários de
prognóstico ruim (PELETEIRO, 1994). Na mesma linha de raciocínio, constatação
semelhante foi feita por GERARDI (2005), este pesquisador observou redução na
expressão da glicoproteína-P nos mastocitomas grau III em cães, quando
comparado ao grau I.
A atividade catalítica da COX-2 resulta em produção e potencialização de
danos do DNA por radicais livres. A combinação desses efeitos contribui para
permanente dano ao DNA genômico e a transformação celular (KUKARNI et al.,
2001; ZHA et al., 2001; DONG et al., 2003). A iniciação ocorre geralmente a partir
de uma única célula progenitora que sofre a ação de diversas mutações (RAW &
MORO, 1999; COTRAN et al., 2000; RUTTEMAN et al., 2001), sendo que os
genes supressores de tumor, como o p53, constituem os principais alvos destas
mutações (COTRAN et al., 2000; RUTTEMAN et al., 2001; ZUCCARI, 2001).
Presente nas células normais na forma “wild” ou não-mutante, o gene p53
tem a função de bloquear a divisão celular através de uma proteína por ele
produzida, atuando como mediador da apoptose quando da ocorrência de
55
alterações no genoma (LOWE et al., 1994). Quando este gene torna-se mutante,
ocorre perda do controle do ciclo celular e, como conseqüência, pode ser
observado distúrbios na indução da apoptose (MAY e MAY, 1999).
Associou-se a mutação do gene p53 com a malignidade das neoplasias
mamárias, pois a expressão para a proteína P53 em todos os casos de carcinoma
(carcinoma com prognóstico bom, carcinoma com prognóstico ruim, carcinoma
primário metastático, metástase pulmonar e carcinoma inflamatório) foi maior
(P<0,01) que o grupo dos adenomas. Além disto, semelhante ao encontrado por
LEE et al. (2004), houve diferença significativa (P<0,05) entre o grupo de
carcinomas com prognóstico bom e o grupo de carcinomas com prognóstico ruim,
sugerindo um possível envolvimento da mutação do p53 com a agressividade das
neoplasias mamárias.
A imunomarcação da P53 foi predominantemente nuclear, no entanto, em
algumas lâminas visibilizou-se imunorreatividade citoplasmática. Observou-se
expressão da proteína P53 em todos os casos estudados. Provavelmente a
utilização do anticorpo policlonal P53 conferiu maior expressão e menor
especificidade, justificando a marcação de todos os tumores analisados,
corroborando com os achados de ZUCCARI et al. (2005).
Nos casos de carcinoma com prognóstico ruim, em 70% dos pacientes a
sobrevida após a mastectomia foi menor que 24 meses, confirmando os achados
feitos por SCHMITT et al. (1998), segundo os quais as mutações no p53 estão
associadas à baixa sobrevida de pacientes portadores de câncer e seu estudo
como marcador prognóstico pode prever o comportamento clínico e a resposta à
terapia no câncer de mama.
56
A atividade da COX-2 no câncer de mama pode estar envolvida com a
transformação do Bcl proto-oncogene em Bcl oncogene, inibindo assim, os sinais
de apoptose, permitindo desta forma maior tempo para o acúmulo de lesões
genéticas múltiplas, resultando em transformação neoplásica (TSUJII et al., 1995;
SURH et al., 2001; BOL et al., 2002).
A mutação do proto-oncogene Bcl2 pode ter contribuído para a redução da
taxa de apoptose, avaliada pela expressão da Caspase-3, no grupo dos adenoma,
carcinoma com prognóstico bom, carcinoma com prognóstico ruim e carcinoma
inflamatório. Os distúrbios apoptóticos, permitem que células malignas tenham
maior sobrevida, contribuindo para que ocorra a expansão neoplásica
(DEVERAUX et al., 2001; OHASHI et al., 2006). O aumento da ocorrência de
apoptose nos carcinomas primários metastáticos e nas metástases pulmonares
pode ser resultado da evolução clínica do tumor, desencadeando mecanismos que
ainda não são bem conhecidos.
Futuras investigações devem ser realizadas para determinar a ação do
oncogene Bcl-2 na indução da resistência aos sinais de apoptose, correlacionado
estes resultados com a expressão da COX-2 nos tumores mamários de cadelas.
O aumento da população celular é dependente da fração de células que
estão se dividindo. A detecção e quantificação das células em proliferação
constituem parâmetros importantes no prognóstico de diferentes tumores
(ZUCOLOTO, 1992; BACCHI & GOWN, 1993; RABENHORST et al., 1994).
Houve correlação da COX-2 com o índice de proliferação celular avaliado
pela expressão do Ki-67 (clone MIB-1) no grupo dos adenomas, metástases
pulmonares e carcinomas inflamatórios. Estes resultados são semelhantes aos
57
descritos na literatura onde a expressão de COX-2 está relacionada a fatores
fisiológicos do crescimento celular, desenvolvimento das neoplasias e progressão
neoplásica (DUBOIS et al., 1996; KHAN et al., 2000; KUKARNI et al., 2001; ZHA
et al., 2001; BREYER & HARYS, 2001; DONG et al., 2003; KRAUS, 2003). Esta
correlação não foi evidenciada para os grupos de carcinomas (carcinoma com
prognóstico bom, carcinoma com prognóstico ruim e carcinoma primário
metastático). Dentro desta linha de pesquisa é importante que outros marcadores
de proliferação celular como o PCNA (antígeno nuclear de células proliferativa) e o
AgNOR (regiões organizadoras nucleolares) sejam avaliados, para tentar
estabelecer a verdadeira relação da ciclooxigenase-2 com a divisão das células
neoplásicas.
O alto índice de proliferação celular (45%) detectado nos carcinoma
inflamatórios corrobora com as constatações feitas BRODEY et al. (1983) e
RUTTEMAN et al. (2001), os quais apontam o carcinoma inflamatório, como um
tumor que apresenta alta velocidade de crescimento.
Em contrapartida, as metástases pulmonares apresentaram baixo índice de
proliferação celular (5%). Provavelmente este resultado seja decorrente da
localização anatômica deste tumor, ou seja, na ocorrência de metástases o
organismo emite sinais para frear o seu desenvolvimento.
SIMOES et al. (1994) observaram que o índice mitótico mostra diferença
significativa entre os mastocitomas recorrentes e não recorrentes; apesar de
serem outras neoplasias, esta constatação não foi observada neste experimento,
quando foi realizada a comparação entre os carcinomas com prognóstico bom e
os carcinomas com prognóstico ruim (P>0,05).
58
Outro achado importante foi à identificação de forte marcação de COX-2 em
células neoplásicas presentes em vasos linfáticos (êmbolo neoplásico), nos casos
de carcinoma primário metastático. Assim como existe uma relação positiva entre
a expressão da COX-2 e a capacidade de invasão tecidual pelas células tumorais,
principalmente nos tumores de cólon e mama em humanos (SURH et al., 2001;
BOL et al., 2002; CAO & PRESCOTT, 2002; DONG et al., 2003; WANG &
DUBOIS, 2004), sugere-se que ação semelhante possa acontecer com os
carcinomas primários metastáticos em cadelas, haja vista, o grande potencial de
infiltração e metástases que estes tumores apresentam.
As metástases pulmonares podem ter sido facilitadas pela habilidade da
COX-2 em regular a angiogênese, favorecendo o aporte sangüíneo necessário
para a da disseminação das células neoplásicas (TSUJII et al., 1998; BAKHLE,
2001). Estudos futuros poderão correlacionar a expressão do fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF) com a ciclooxigenase-2 nos tumores mamários de
cadelas.
A atividade da COX-2 nos tumores de mama sugere que possa estar
acontecendo alta produção de PGE
2
e conseqüentemente a supressão do sistema
imune, contribuindo desta forma para a progressão do processo neoplásico, pois,
como já foi constado por WANG & DUBOIS (2004) esta prostaglandina está
envolvida com o desenvolvimento do câncer.
Futuras investigações devem ser realizadas para avaliar a existência de
associação da expressão da COX-2 e a presença dos receptores de estrógeno e
progesterona no tecido mamário em relação ao prognóstico do câncer de mama
em cadelas, pois estes hormônios influenciam a carcinogênese mamária, segundo
59
MacEWEN et al. (1992); SARTIN (1992); MORRISON (1998); FONSECA (1999) e
ZUCCARI (1999).
De acordo com trabalhos propostos por BAKHLE (2001), BEAM et al.
(2003) e WANG & DUBOIS (2004), pode-se especular que o desenvolvimento da
carcinogênese mamária está ligado à atividade da ciclooxigenase-2, porém a
exata implicação desta enzima nas neoplasias mamárias permanece
desconhecida. Alguns estudos epidemiológicos em cães revelaram que o uso
prolongado de antiinflamatórios não esteróides, responsáveis por inibir a COX-2,
pode diminuir a incidência de carcinoma de células escamosas oral e carcinoma
de células transicionais da bexiga (BEAM et al., 2003), no entanto, esta ação
ainda não foi avaliada em cadelas com neoplasias mamárias.
Como os protocolos com fármacos antineoplásicos e/ou radioterapia,
geralmente, são pouco efetivos (RUTTEMAN et al., 2001) os inibidores seletivos
COX-2 podem ser mais uma alternativa no tratamento de neoplasias mamárias em
cadelas.
Os coxibes, inibidores seletivos da COX-2 (JONES & BUDSBERG, 2000;
BURLEIGH, 2002), devem ser investigados quanto ao uso na quimioprevenção e
tratamento dos tumores de mama, pois resultados positivos já foram descritos por
GIARDIELLO et al. (1995), SHENG et al. (1997), WILLIAMS et al. (1997), SHENG
et al. (1998), KAWAMORI et al. (1998), ALMEIDA et al. (2001), SURH et al. (2001)
no tratamento de outras neoplasias utilizando antiinflamatórios não esteróides.
60
VI. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que:
Houve correlação da expressão da COX-2 com o índice de
proliferação celular Ki-67 nos grupos de adenoma, metástase pulmonar e
carcinoma inflamatório (P<0,05).
Em todos os grupos de neoplasias mamárias estudados a COX-2
apresentou correlação com a proteína P53 (P<0,01).
Observou-se correlação da expressão da ciclooxigenase-2 com a
Caspase-3 nos grupos de carcinoma primário metastático e nas metástases
pulmonares (P<0,05).
Houve correlação significativa (P<0,05) da imunorreatividade para a
COX-2 em relação ao prognóstico das neoplasias mamárias, levando-se em
consideração a classificação e as características histopatológicas desta afecção.
A expressão de COX-2 foi superior nas neoplasias malignas em
relação às benignas; além disto, a intensidade de imunorreatividade também foi
maior nas lesões neoplásicas malignas.
61
A expressão para a ciclooxigenase-2 se restringiu ao componente
epitelial da glândula mamária. Nenhuma imunomarcação foi observada no
componente mesenquimal.
Não foi observado diferença estatística, em relação a
imunoexpressão da COX-2, entre os três sub-tipos de carcinoma (sólido,
complexo e túbulo-papilífero).
Em relação ao estadiamento das neoplasias verificou-se maior
imunorreatividade para a ciclooxigenase-2 nos tumores em estágio III (P<0,05).
A sobrevida das pacientes com neoplasias mamária, no pós-
operatório, está ligada a expressão da COX-2, no grupo dos adenomas,
carcinomas com prognóstico bom e carcinomas com prognóstico ruim (P<0,01).
62
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87
VIII. ANEXOS
VIII.1- ANEXO 1
TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA:
Para a realização da técnica de imunoistoquímica, os blocos de parafina
foram cortados em micrótomo com espessura de três
µ
m e distendidos em
lâminas histológicas devidamente preparadas com Poly-L-Lysina (Sigma P8920)
com o objetivo de promover maior aderência dos cortes às lâminas de vidro,
evitando assim a perda do material durante o processamento imunoistoquímico.
As lâminas foram estocadas em estufa com temperatura de 60°C por 24 horas, e a
seguir transferidas para cubas de vidro vertical a fim de realizar-se a técnica de
imunoistoquímica.
A técnica de imunoistoquímica (conforme descrita na seqüência) foi
realizada de acordo com o protocolo do Laboratório de Imunoistoquímica do
Serviço de Patologia da FMVZ – UNESP – Botucatu, as soluções e reagentes
utilizados estão descritos no anexo 2.
1- Desparafinização:
- 30 minutos no xilol, em temperatura ambiente;
- 20 minutos no xilol, em temperatura ambiente.
88
2- Hidratação dos cortes:
- álcool absoluto I / II / III – 3 minutos em cada etapa;
- álcool 95 – 3 minutos;
- álcool 85 – 3 minutos;
- Lavar em água destilada (10 vezes).
3- Recuperação Antigênica:
- Conforme tabela 2 (página 29);
- Deixar esfriar 20 minutos em temperatura ambiente;
- Lavar em água destilada (10 vezes).
4- Bloqueio da peroxidase endógena:
- Deixar durante 20 minutos em água oxigenada 10 volumes;
- Lavar em água destilada (10 vezes)
5- Lavar duas vezes, durante 5 minutos, em solução tampão de TRIS (Trizma
base – Sigma – código T1503 - pH 7,4).
6- Incubação com BSA 5% (Albumina Sérica Bovina – Sigma – código A7906,
diluída em solução de TRIS), durante uma hora, em temperatura ambiente.
Contribuindo assim para diminuição das marcações inespecíficas (“fundo”).
7- Incubação com o Anticorpo primário
- Diluir o anticorpo primário em solução BSA 5% (Tabela 2 – página 29);
89
- Cobrir os cortes com o anticorpo, deixar as lâminas sempre em câmara
úmida. Tempo: “overnight” (18hs a 4
°
C - geladeira);
- Posteriormente, lavar com TRIS;
- Remover o excesso de TRIS.
8- Incubação com anticorpo secundário e peroxidase (Kit ABC – Avidina Biotina
Peroxidase - Dako - código K0492)
- Anticorpo secundário biotinilado (anti-camundongo e anti-coelho), diluído
conforme informações do fabricante. Incubado por 30 minutos, a
temperatura ambiente.
- Lavar com solução TRIS. Tempo: 10 minutos;
- Complexo avidina, biotina, peroxidase: preparada meia hora antes do
uso, de acordo com informações do fabricante. Incubado por 30 minutos
a temperatura ambiente.
- Lavar em solução TRIS. Tempo: 10 minutos.
9- Revelação com o substrato cromogênico (Diaminobenzidina – DAB, pronto para
uso – Dako - código K34466)
- Tempo de DAB: 5 minutos;
- Passar em solução TRIS;
- Lavar em água destilada (10 vezes).
90
10- Contra-coloração com Hematoxilina de Mayer
- Tempo: 3 minutos;
- Lavar em água corrente durante 10 minutos;
- Lavar em água destilada (uma vez).
11- Desidratação dos cortes e montagem das lâminas:
- Passagem em álcool 85
°
e 95
°
;
- Passagem em álcool absoluto I / II / III – 3 minutos em cada etapa;
- Passagem em xilol I e II – 3 minutos em cada etapa;
- Montar as lâminas com resina sintética (Permount – Fisher Scientific –
SP 15-500) e lamínulas.
91
VIII.2- ANEXO 2
SOLUÇÕES UTILIZADAS NA TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA:
Solução tampão utilizadas na recuperação antigênica
Citrato 10 mM:
- 1000 ml de água destilada
- 1,921g de ácido cítrico monohidratado de peso molecular 192.13
- pH 6,0 (ajustar em medidor com hidróxido de sódio hipersaturado)
TRIS solução tampão:
- 1000ml de água destilada
- 6,0g Trizma base
- 8,5g cloreto de sódio
- pH em 7,4 (pode variar entre 7,4 a 7, 6),o pH é acertado com ácido clorídrico
diluído em água destilada na proporção de 1:1.
Solução de BSA a 5%
Solução A
- 10 ml de água deionizada
- 500 mg de albumina bovina – Sigma – A – 7906
Solução B
- 10 ml de água deionizada
- 500 mg de ázida sódica (NaN3) – Merck – 1.06688.0100
92
Solução de BSA para uso (5%)
- 59 ml de TRIS pH 7,4
- 1,25ml solução A
- 2,5ml solução B
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