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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS
VEGETAIS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE VARIEDADES DE
VIDEIRA (Vitis spp.) DE SANTA CATARINA POR
MARCADORES MICROSSATÉLITES (SSRs)
Mariane Ruzza Schuck
Florianópolis – SC
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS
VEGETAIS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE VARIEDADES DE
VIDEIRA (Vitis spp.) DE SANTA CATARINA POR
MARCADORES MICROSSATÉLITES (SSRs)
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Recursos
Genéticos Vegetais, Departamento de
Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal de Santa Catarina,
como requisito para a obtenção do título de
Mestre em Recursos Genéticos Vegetais.
Orientador: Prof. Dr. Aparecido Lima da Silva
Mariane Ruzza Schuck
Florianópolis – SC
2007
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE VARIEDADES DE
VIDEIRA (Vitis spp.) DE SANTA CATARINA POR
MARCADORES MICROSSATÉLITES (SSRs)
MARIANE RUZZA SCHUCK
Dissertação julgada e aprovada em sua
forma final pelo Orientador e membros
da Comissão Examinadora.
Comissão Examinadora:
............................................................
Dr. Marco Antônio Dalbó
EPAGRI
...................................................................
Dr. José Afonso Voltolini
FIT/CCA/UFSC
..................................................................
Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra
FIT/CCA/UFSC
.........................................................................
Prof. Dr. Rubens Onofre Nodari
FIT/CCA/UFSC
4
Dedico
A meus pais por tudo e sempre.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, proteção e por ter permitido mais esta vitória.
A toda minha família, meus irmãos Christian e Guilherme, aos meus pais,
Enio e Jane, pelo amor, apoio e tanto incentivo.
À Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) e ao Programa de Pós-
Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, pela oportunidade de realização
deste curso.
Ao professor Aparecido Lima da Silva, pela orientação, incentivo, apoio,
paciência e pelos grandes ensinamentos transmitidos, e, sobretudo pela
oportunidade de realizar um trabalho gratificante e enriquecedor à minha formação
profissional.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos
Vegetais, pelos ensinamentos transmitidos e convivência amigável.
As amigas Fernanda, Natasha, Sandra e Samanta, pela grande amizade.
Aos colegas do curso de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais,
pelo excelente convívio e troca de experiências.
Aos produtores e funcionários da EPAGRI por me auxiliarem na coleta das
amostras de videira.
À equipe do Laboratório de Morfogênese, em especial aos colegas Marcelo,
Shana, Fábio e Carol pela amizade, e à equipe do Laboratório de Fisiologia do
Desenvolvimento e Genética Vegetal, em especial a Josiane, Gustavo, Luisa,
Maguida e Sara, pela amizade, convívio e idéias em que compartilhamos.
A Stella Grando, por disponibilizar o Laboratório de Genética Molecular, do
Instituto Agrário di San Michelli all’ Adige (IASMA) para o seqüenciamento das
amostras de videira.
A Flávia pela disponibilidade em me ajudar com as amplificações e
seqüenciamento das amostras de videira, e pela competência e dedicação
demonstrada em todo o período que estive em Trento. Muito obrigado mesmo,
você foi uma professora e amiga fundamental para a realização deste trabalho.
6
Ao pessoal do Laboratório de Genética Molecular do Instituto Agrário di San
Michelli all’ Adige (IASMA), pela compreensão, ensinamentos, paciência e
amizade.
Ao José Afonso Voltolini pela disponibilidade e auxílio na indicação de onde
residir em Trento e a sua prima Carla pela acolhida carinhosa com que me
recebeu em sua casa.
A minha querida amiga Kelly e Mário, mestrandos do Curso de Informática
(UFRGS), que me auxiliaram a criar o Banco de Dados informatizado das
variedades de videira do Estado de Santa Catarina.
A CAPES pela concessão da bolsa de mestrado e ao Projeto Pro-Goethe
pelo apoio financeiro à execução do projeto.
A todos que não foram citados, mas nem por isso esquecidos, e que
contribuíram de alguma maneira para o êxito desse trabalho.
7
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................
ix
LISTA DE TABELAS................................................................................
x
LISTA DE FIGURAS................................................................................
xii
RESUMO...................................................................................................
xiv
ABSTRACT...............................................................................................
xvi
1. INTRODUÇÃO......................................................................................
1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................
6
2.1- Distribuição e Importância Econômica da Viticultura..............
7
2.2- Origem..........................................................................................
9
2.3- Classificação Botânica................................................................
9
2.4- Marcadores Moleculares.............................................................
10
2.5- Marcadores Moleculares baseados em PCR.............................
15
2.5.1- Marcadores Microssatélites (SSRs)............................................
18
2.5.2- Reações Múltiplas de Microssatélites (Multiplex).......................
23
2.5.3- Marcadores Microssatélites em Videira (Vitis spp.)...................
25
3. JUSTIFICATIVA....................................................................................
28
4. OBJETIVOS........................................................................................
30
4.1- Objetivo Geral..............................................................................
31
4.2- Objetivos Específicos..................................................................
31
5. METODOLOGIA...................................................................................
32
5.1- Material Vegetal............................................................................
33
5.2- Extração e Quantificação do DNA..............................................
34
5.3- Quantificação do DNA em Gel de Agarose.................................
35
5.4- Escolha dos Primers Microssatélites........................................
36
5.5- Amplificação dos marcadores microssatélites fluorescentes...
37
5.6- Análise dos dados.......................................................................
38
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................
40
6.1- Extração e Quantificação do DNA................................................
41
6.2- Genotipagem com multiplex de microssatélites.........................
43
6.3- Perfil Genético e Identificação das Variedades..........................
47
8
6.3.1- Comparação do perfil genético das variedades
coletadas em Santa Catarina entre si...............................................
6.3.2- Agrupamento das amostras por perfil genético......................
6.3.3- Comparação com os perfis genéticos de bancos de dados
online e dados da literatura internacional.........................................
6.3.4- Identificação de variabilidade intravarietal..............................
6.3.5- Genótipos Idênticos................................................................
6.3.6- Sinonímias, erros de identificação e identificação de
amostras de origem desconhecida...................................................
49
52
63
69
71
74
7. CONCLUSÕES.......................................................................................
77
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................
ANEXOS......................................................................................................
Anexo1..............................................................................................
Anexo 2.............................................................................................
Anexo 3.............................................................................................
80
108
109
110
120
9
LISTA DE ABREVIATURAS
% Porcentagem Nm Nanômetro
°C
Graus Celsius OD Densidade Optica
μg
Microgramo pB Pares de Base
μl
Microlitro PCR Polymerase Chain Reaction
μM
Micromolar PE Porta-enxerto
λ
Lambda pH Potencial Hidrogenionico
AFLP
Amplified Fragment Length Poymorphism
P2 [R] Primer reverse
bp Pares de bases QTLs Quantitative Trait Loci
CCA Centro de Ciências Agrárias
CIA Clofórmio Álcool-Isoamílico RAPD Random Amplified Polymorphic
CTAB Cetytrimenthylammonium Bromide RFLP Restriction Fragment Length
Polymorphism
DNA Ácido Desoxirribonucleico RNAse Ribonuclease
dNTPs Deoxyribonucleoside Triphosphates Rpm Rotaçoes por minuto
EDTA Acido Etileno Diamono Tetrecetico SC Santa Catarina
EPAGRI Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão
Rural de Santa Catarina S.A
SCAR Sequence Characterized
Amplified Regions
ha Hectare SSR Simple Sequence Repeats
g Grama Taq Thermus Aquticus
GENRES European Network for Grapevine Genetic
Resources Conservation and Characterization
TBE Tris Base
IASMA Instituto Agrario di San Michelli all’ Adige TE Tris – EDTA
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano
kV KiloVolts Tris-Cl Tris HCl
L Litro U Unidade
LFDGV Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e
Genética Vegetal
UFSC Universidade Federal de Santa
Catarina
M Molar UV Radiaçao Ultravioleta
mg Miligramo VNTR Variable Number of Tandem
Repeats
mM Milimolar
MgCl
2
Cloreto de magnésio
N Normal
Na Cl Cloreto de sódio
ng nanogramas
10
LISTA DE TABELAS
1. Área plantada de videiras no Brasil, em hectares, 2005 e 2006..........
2. Produção de uvas no Brasil, em toneladas, 2005 e 2006....................
3. Análise comparativa entre os marcadores...........................................
4. Descrição sucinta dos demais marcadores existentes na
literatura...................................................................................................
5. Relação dos primers apresentando a seqüência, temperatura de
anelamento e tamanho do alelo. Laboratório de Genética Molecular,
IASMA, Trento. ........................................................................................
6. Tamanho dos alelos (bp) em 10 locos das 181 variedades de Vitis sp.
Identificadas neste estudo, agrupadas por perfil genético. CCA/UFSC,
Florianópolis-SC, 2007........................................................
7. Comparação dos perfis genéticos encontrados das variedades mais
conhecidas de vitis sp. de Santa Catarina com aqueles das variedades
encontradas em bancos de dados online e dados da literatura.
CCA/UFSC, Florianópolis-SC, 2007........................................................
8. Perfil genético de outras variedades encontradas no GENRES 081
(European Vitis Database) e dados da literatura. CCA/UFSC,
Florianópolis-SC, 2007.............................................................................
9. Variedades com variabilidade intravarietal e tamanho dos alelos (bp)
microssatélites. CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2007............................
10. Variedades clonais de videira com genótipos idênticos
caracterizados pela análise molecular através de 10 marcadores
microssatélites. CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2007............................
11. Casos de sinonímias encontradas durante a análise molecular
através de 10 marcadores microssatélites das variedades de videira de
Santa Catarina. CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2007...........................
12. Variedades de videira de origens genéticas desconhecidas
identificadas pela análise molecular através de 10 marcadores
microssatélites. CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2007............................
7
8
21
22
36
53
65
66
69
72
75
76
11
13. Composição do gel de agarose para eletroforese horizontal.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006........................................
14. Reagentes utilizados na reação de polimerase em cadeia (PCR-
MIX). Laboratório de Genética Molecular, IASMA, Trento.......................
15. Marcadores microssatélites marcados com florescência utilizados
nos cinco painéis múltiplos (multiplex-sequenciador). Laboratório de
Genética Molecular, IASMA, Trento.........................................................
16. Variedades de Nova Trento, incluindo código de quantificação,
código de genotipagem, nome do acesso, localidade e a concentração
do DNA. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.. .......................
17. Variedades de Urussanga, incluindo código de quantificação, código
de genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a
concentração do DNA. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.....
18. Variedades de Rodeio, incluindo código de quantificação, código de
genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a concentração
do DNA. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006............................
19. Variedades de Tangará e Videira, incluindo código de quantificação,
código de genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a
concentração do DNA. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.....
20. Variedades de Campos Novos, incluindo código de quantificação,
código de genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a
concentração do DNA. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.....
21. Variedades de Água Doce, incluindo código de quantificação,
código de genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a
concentração do DNA. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.....
22. Variedades de São Joaquim, incluindo código de quantificação,
código de genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a
concentração do DNA. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.....
23. Variedades de porta-enxertos de Florianópolis, incluindo código de
quantificação, código de genotipagem, nome do acesso,
localidade/proprietário e a concentração do DNA. LFDGV/CCA/UFSC,
109
109
109
110
111
112
113
114
116
117
12
Florianópolis – SC, 2006............................................................................
24. Tamanho dos alelos (bp) em 10 locos das 246 amostras de videira
coletadas em Santa Catarina. CCA/UFSC, Florianópolis-SC, 2007..........
119
120
13
LISTA DE FIGURAS
1. Microssatélites com repetições em tandem de dinucleotídeos
CT/GA.......................................................................................................
2. Mapa das principais regiões onde foram coletadas as variedades
para análises e caracterização molecular através de microssatélites
(SSRs) no Estado de Santa Catarina, 2006.............................................
3. Eletroferograma mostrando o genótipo da variedade Standard com
10 marcadores microssatélites analisados com 5 painéis múltiplos.
Laboratório de Genética Molecular, IASMA, Trento.................................
4. Exemplo de eletroferograma - perfil genético do loco VVMD5. O
primeiro perfil genético corresponde ao tamanho dos fragmentos da
variedade Standard (Chardonnay). O eixo horizontal representa as
estimativas do tamanho em pares de bases e o eixo vertical indica a
intensidade de fluorescência medida pelo seqüenciador de DNA ABI
Prism. Laboratório de Genética Molecular, IASMA, Trento......................
5. Eletroforese capilar (ABI 3100) dos fragmentos de DNA amplificados
com os primers VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD25, VVMD27, VVMD28,
VVMD31, VVMD32, VRZAG62 e VRZAG79 das variedades estudadas.
O eixo horizontal representa as estimativas do tamanho em pares de
bases e o eixo vertical indica a intensidade de fluorescência medida
pelo seqüenciador de DNA ABI Prism. Laboratório de Genética
Molecular, IASMA, Trento.........................................................................
6. Quantificação de DNA das variedades de Nova Trento.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.........................................
7. Quantificação de DNA das variedades de Urussanga.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.........................................
8. Quantificação das variedades de Rodeio. LFDGV/CCA/UFSC,
Florianópolis – SC, 2006...........................................................................
9. Quantificação de DNA das variedades de Tangará e Videira.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.........................................
18
33
45
46
47
110
110
112
113
14
10. Quantificação de DNA das variedades de Campos Novos.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.........................................
11. Quantificação de DNA das variedades de Água Doce.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.........................................
12. Quantificação de DNA das variedades de São Joaquim.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.........................................
13. Quantificação de DNA das variedades de porta-enxertos de
Florianópolis. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006...................
114
115
117
119
15
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE VARIEDADES DE VIDEIRA (Vitis spp.)
DE SANTA CATARINA POR MARCADORES MICROSSATÉLITES (SSRs)
Autor: Eng. Agr. Mariane Ruzza Schuck
Orientador: Prof. Aparecido Lima da Silva
RESUMO
A videira é a frutífera economicamente mais importante no mundo e é cultivada
para que seus frutos produzam uvas de mesa, suco, uvas passas e vinhos. A
espécie Vitis vinifera L. é cultivada pelo mundo todo e muitas variedades
importantes têm sido selecionadas durante os séculos. O inventário das
variedades de videira descritas na literatura revela a existência de mais de 14000
variedades. Esta grande diversidade genética foi originada pela antiga prática da
propagação vegetativa. A dispersão das variedades de videira ou populações de
diferentes origens por meio da migração e do comércio conduziu a um grande
número de sinônimos, homônimos e ambigüidades na identificação das
variedades. Deste modo, a análise genética molecular, baseada no polimorfismo
de DNA detectado em locos marcadores tem sido útil no estudo de diversidade
genética das coleções de germoplasma facilitando a classificação correta de
amostras, bem como a identificação de sinônimos e homônimos. A coleção de
germoplasma de videira do Estado de Santa Catarina mantém plantas de videiras
que necessitam ser identificadas e caracterizadas corretamente a fim de evitar
duplicatas ou sinonímias. Este trabalho objetivou caracterizar e identificar as
variedades de videira, das coleções públicas e privadas de Santa Catarina, por
marcadores microssatélites. Foram utilizados cinco painéis de marcadores
microssatélites (multiplex-seqüenciador) constituídos por primers marcados com
fluorocromos para a genotipagem semi-automática
em seqüenciador de DNA de
246 amostras de videira, coletados em 7 regiões do Estado de Santa Catarina.
Dez locos marcadores distribuídos no genoma da videira foram genotipados
utilizando os painéis multiplex e os dados utilizados para identificar variedades
16
sinônimas, de origem desconhecida e erros de identificação, e criar um banco de
dados referencial informatizado das variedades de videira (Vitis spp.) de Santa
Catarina. Das 246 amostras genotipadas, 181 foram identificadas com segurança
e o restante (n=65) por terem amplificado em menos de 6 locos SSRs, não foram
identificadas, pois pouco ou nenhum dado referente ao tamanho dos alelos foi
suficiente para identifica-lás com segurança. A análise com microssatélites das
181 amostras identificadas resultou em 68 perfis moleculares únicos (68
variedades diferentes), 10 casos de variedades sinônimas (entre as variedades
coletadas em Santa Catarina quando comparadas com aquelas encontradas nos
‘database’ e literatura internacional), identificação de 10 amostras de origem
genética desconhecida, 7 casos de erro de identificação e 7 casos de variabilidade
intravarietal. Um grande número de alelos pôde ser detectado, o que comprovou a
natureza multialélica deste tipo de marcador e a alta eficiência na caracterização e
discriminação do germoplasma de Vitis sp. a nível de variedade, gerando
fingerprintings únicos para um grande número de genótipos. A metodologia de
genotipagem utilizando painéis de microssatélites marcados com fluorescência e
genotipados em seqüenciador automático de DNA apresentada mostrou ser um
procedimento eficiente, rápido e simples na detecção de polimorfismo SSRs.
Palavras-chaves: Vitis, Santa Catarina, microssatélites, SSR, genotipagem,
identificação.
17
“MOLECULAR CHARACTERIZATION OF GRAPEVINE (Vitis spp.) VARIETIES
OF SANTA CATARINA ANALYSED BY MICROSATELLITE MARKERS (SSRS)”
Author: Eng. Agr. Mariane Ruzza Schuck
Major Professor: Dr. Aparecido Lima da Silva
ABSTRACT
Grape is the most important perennial crop of the world and is cultivated to
produce table grapes, juice, grapes raisins and wines. Vitis vinifera L. is cultivated
world wide and many important varieties have been selected during the centuries.
The inventory of the described grape varieties in literature reveals the existence of
more than 14000 varieties. This great genetic diversity was originated by the old
practical of vegetative propagation. The dispersion of grapevine varieties or
populations of different origins by migration and commerce leads to a great number
of synonymous, homonyms and ambiguities in varieties identification. Thus, the
molecular genetic analysis, based in DNA polymorphism detected in marking
locus, has been useful in the study of genetic diversity of germplasm collections
facilitating the correct classification of samples as well as the identification of
synonymous and homonyms. The grapevine collections of Santa Catarina State
keeps grapevines plants that need to be identified and characterized correctly in
order to prevent duplicates or synonyms. In the study presented here our purpose
was to characterize and to identify grape varieties, of the public and private
collections of Santa Catarina, by using microsatellites markers. Five panels of
microsatellites markers (multiplex-sequencer) composed by primers labeled with
fluorochromes were used in a semi automated DNA sequencer for genotyping of
246 grapevine samples collected in 7 regions of Santa Catarina State. Ten marked
locus distributed in the grapevine genome had been genotyped using the multiplex
panels and the data utilizated to identify varieties of unknown origin, errors of
identification and synonyms, and to create an informatizated referencial data base
of grapevine (Vitis spp.) varieties of Santa Catarina State. Of the 246 samples
18
genotyped, 181 had been identified with security. The remaining (n=65) for having
amplified less than 6 locos SSRs had not been identified, because little or no
referring data of the allele sizes were not enough to identify them with security. The
analysis of the 181 samples identified with the microsatellites, resulted in 68 unique
molecular profiles (68 different varieties), 10 cases of varieties synonyms (between
the varieties collected in Santa Catarina when compared with that found in
`database' and international literature), identification of 10 samples of unknown
genetic origin, 7 cases of miss-identification and 7 cases of intravarietal variability.
A great number of allells could be detected, which proved the multialelic nature of
this type of marker and the high efficiency in the characterization and
discrimination of Vitis sp. germplasm at the variety level, generating unique
fingerprintings for a great number of genotypes. The genotyping methodology
using panels of microsatellites labelled with fluorescence and genotyped using an
automated DNA sequencer showed to be an efficient, fast and simple procedure in
the detention of SSRs polymorphism.
Key words: Vitis, Santa Catarina, Microsatellites, SSR, genotiping, identification.
19
INTRODUÇÃO
20
1- INTRODUÇÃO
A videira foi introduzida no Brasil, em 1532, pelos colonizadores
portugueses da expedição de Martim Afonso de Sousa, na Capitania de São
Vicente, e por um longo período de tempo permaneceu sem grande importância
devido à falta de adaptação das variedades européias às condições ambientais
brasileiras. A partir da segunda metade do século XIX foram trazidas para o Brasil
as primeiras variedades americanas, de maior resistência a doenças fúngicas e
com acentuadas características de adaptação ao ambiente brasileiro, e com o
advento da imigração italiana no final do século XIX a viticultura brasileira adquiriu
importância comercial, principalmente nos Estados do Rio Grande do Sul e de São
Paulo (Sousa e Martins, 2002).
Em Santa Catarina, a videira foi introduzida no sul do Estado por volta de
1878, e na região norte em 1893. No Alto Vale do Rio do Peixe somente começou
a ser cultivada em 1913 com a vinda ao Sul, dos imigrantes italianos (Sousa e
Martins, 2002). As regiões do Vale do Rio do Peixe e a Carbonífera são
responsáveis por 90% da produção de uva e vinho do Estado de Santa Catarina
(Rosier e Losso, 1997). Em 2006, a área cultivada de uvas em Santa Catarina foi
de 4.986 ha com uma produção de 47.971 toneladas de uva (IBGE, 2006).
O gênero Vitis L. é diverso, compreendendo 29 espécies na Ásia, cerca de
34 na América do Norte e uma única espécie na Europa – Vitis vinifera L. Esta
última é a espécie mais cultivada atualmente. As outras espécies de Vitis são
geralmente utilizadas como porta-enxertos e cultivares resistentes a fungos.
Estima-se existirem cerca de 6000 variedades de V. Vinifera L. (Alleweldt and
Dettweiler, 1994), das quais menos de 400 são de importância comercial.
Atualmente, a maioria dos recursos genéticos de Vitis vinifera L. são mantidos em
colecões de germoplasma (Galet, 2000).
A videira tem sido cultivada a cerca de 5000 anos (Zohary and Hopf 2000) e
a prática da propagação vegetativa favoreceu a dispersão de muitas variedades
para as diversas regiões do mundo (Dion 1977; Fregoni 1991). Como
conseqüência, algumas variedades têm hoje mais de 100 sinônimos (diferentes
nomes para a mesma variedade), e vários homônimos (diferentes variedades com
21
o mesmo nome) (Borrego et al., 2002; http://www.genres.de/idb/vitis/). A presença
de sinônimos, homônimos, e variedades sem nomes são problemas significativos
nas 130 coleções de videira existentes no mundo (Dettweiler et al., 2000a). Deste
modo, a identificação dos acessos é um requisito básico para o correto manejo e
uso do gemoplasma da videira.
A identificação e caracterização das variedades de videira são também de
considerável interesse para os viveiristas, agricultores, empresas vinícolas e
gestores dos bancos de germoplasma, pois a qualidade e a quantidade da
produção são determinadas pela variedade cultivada (Asensio et al., 2002). Além
disso, a caracterização de variedades, linhagens ou híbridos tem sido de grande
importância na proteção do direito intelectual do melhorista, sendo utilizada como
prova legal em processos jurídicos nos países em que já vigoram as leis de
proteção de cultivares. No caso específico do germoplasma brasileiro de videira, a
falta de conhecimento sobre a diversidade genética mantida tem constituído um
entrave à utilização e integração de outras formas de conservação de
germoplasma (por exemplo, in vitro), além de dificultar a produção e o
gerenciamento das informações demandadas pelos usuários.
O estudo da diversidade genética das coleções de germoplasma de videira
pode facilitar a classificação correta dos acessos, a seleção de amostras
representativas que capturem a diversidade genética da coleção e a detecção de
padrões de diferenciação em toda a coleção.
O desenvolvimento e aplicação de tecnologias baseadas em marcadores
moleculares fornecem ferramentas únicas capazes de identificar a variação
genética existente entre e dentro de populações, em função do alto grau de
precisão e informação que pode ser obtido pelo “fingerprinting” molecular. O
“fingerprinting” ou genotipagem molecular é a impressão digital de um
determinado genótipo, que permite a obtenção de seu perfil genético e sua
diferenciação inequívoca de outro genótipo (Ferreira e Grattapaglia, 1998;
Bredemeijer et al., 2002; Magalhaes et al., 2003; Vijayan et al., 2004). Os métodos
que utilizam diretamente o DNA apresentam grandes vantagens, por não serem
afetados pelo ambiente e por apresentarem um elevado poder de discriminação.
22
Além disso, o polimorfismo de DNA pode ser muito útil na definição de um grupo
de acessos (coleção nuclear) que pode geneticamente representar a grande
coleção de germoplasma do qual ela é originada. Uma coleção nuclear representa
um subgrupo derivado de uma coleção inteira que é composta de um pequeno
número de acessos que juntos devem representar o máximo possível da
diversidade genética existente em toda a coleção (Frankel & Brown, 1984).
Dentre os marcadores moleculares, os microssatélites ou SSR (Simple
Sequence Repeats) tem sido a ferramenta molecular mais utilizada em Vitis sp
para a identificação e caracterização de variedades copa e porta-enxerto,
avaliação da variabilidade genética, estudos de pedigree, mapeamento genético e
confirmação de sinônimos e homônimos (Thomas & Scott 1993;Thomas et al.
1994; Bowers et al. 1996, 1999; Bowers and Meredith 1997; Sefc et al. 1997;
1998a, 1998b, 1998c, 1999; Ulanovsky et al., 2002; Cipriani et al., 1994; Botta et
al., 1995; Sanchez-Escribano et al., 1999; Dalbo et al., 2000; Sefc et al., 2000;
Grando et al., 2003; Riaz et al., 2004; Boccacci
et al., 2005; Martin et al., 2006). Os
marcadores microssatélites são multialélicos, altamente polimórficos, de natureza
co-dominante, o que os torna marcadores ideais para análise genética de
populações, estruturas genéticas e diferenciações em coleções de germoplasmas
e populações naturais (Thomas & Scott, 1993; Bowers et al., 1996; Sefc et al.,
1999; Zulini et al., 2002; Magalhaes et al., 2003).
Com os dados obtidos na identificação molecular de genótipos de plantas
de Vitis com marcadores moleculares, vários bancos de referências foram
desenvolvidos para as variedades de Vitis de todo mundo (Dettweiller et al.,
1998a, 1998b; Lefort et al., 2000; Grape Microsatellite Collection,
http://www.ismaa.it/areabioav/gmc.html; Greek Vitis Database,
http://www.biology.uch.gr/gvd e Swiss Vitis Microsatellite Database – SVMD,
www.unine.ch/nccr/svmd/; e GENRES: http://www.genres.de/eccdb/vitis/). O
acesso aos bancos de referência permite que as informações sejam
compartilhadas aumentando significativamente os esforços internacionais para a
correta identificação do germoplasma das variedades (Lefort et al., 2000).
23
O presente trabalho teve por finalidade utilizar marcadores obtidos por
amplificação do DNA via PCR com primers de seqüências repetidas (SSR)
desenvolvidos para Vitis sp., para caracterizar geneticamente as variedades de
videira existentes nas coleções públicas e privadas do Estado de Santa Catarina e
construir um banco de dados referência das variedades analisadas.
24
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
25
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- Distribuição e Importância Econômica da Viticultura
A videira é a frutífera economicamente mais importante no mundo e é
cultivada para que seus frutos produzam uvas de mesa, suco, e uvas passas. As
bagas da videira são também a base para o alto valor agregado dos vinhos e
outras bebidas alcoólicas (Lund & Zapater, 2005).
A viticultura mundial ocupa uma área de aproximadamente, 8,7 milhões de
hectares, sendo a Europa responsável por mais de 4,8 milhões de hectares. Os
principais países que se destacam em áreas plantadas são: Espanha, França e
Itália, com respectivamente, 1.100, 858 e 836 mil ha (FAO, 2005).
A viticultura no Brasil ocupa uma área de 87.792 hectares e está situada,
principalmente, nos estados do: Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São
Paulo, Minas Gerais, Pernambuco e Bahia (Tabela 1) (IBGE, 2006).
Tabela 1. Área plantada de videiras no Brasil, em hectares, 2005 e 2006.
O Brasil, apesar de apresentar uma grande diferença, em termos de área
destinada à viticultura, quando comparado com os países da Europa, apresenta
produtividade superior a muitos países com mais tradição na cultura da uva,
ocupando o quarto lugar mundial de produtividade, 15,3 mil kg. ha
-1
; sendo que a
produção média do mundo é de 8,1 mil kg.ha
-1
(FAO, 2005).
Em 2006, a produção brasileira de uvas foi de aproximadamente 1,3
milhões de toneladas. O Rio Grande do Sul, maior produtor nacional, produziu
26
623.847 toneladas. Santa Catarina produziu 47.787 toneladas de uva, sendo o
segundo maior produtor nacional de vinhos (Tabela 2) (IBGE, 2006).
Tabela 2. Produção de uvas no Brasil, em toneladas, 2005 e 2006.
Em Santa Catarina, os principais municípios produtores de uva estão
localizados no Alto Vale do Rio do Peixe com uma área de 1.677,7 ha segundo
ICEPA (2005), onde a produção de uvas representa em torno de 60% da produção
estadual e concentra as principais indústrias vinícolas do Estado. A produção
catarinense corresponde a cerca de 4% da produção nacional, ocupando o
segundo lugar na produção de vinhos e mosto (Epagri, 2005).
Contudo, nos últimos anos, em função dos bons preços praticados para uva
e seus derivados, principalmente para as cultivares viníferas, está ocorrendo uma
reversão das expectativas. Novos pólos vitivinícolas estão surgindo em todas as
regiões de Santa Catarina, inclusive em áreas não tradicionais para o cultivo da
videira, como as regiões de elevada altitude (acima de 950 m) no Planalto
Serrano, Campos de Água Doce e Campos Novos. Na Serra Catarinense, a
cidade de São Joaquim, já concentra mais de 180 ha de uvas viníferas, para
produçao de vinhos finos (Epagri, 2006).
A vitivinicultura no Sul do Brasil vem apresentando um crescimento em área
cultivada, investimentos por parte das indústrias vinícolas e introdução de novas
variedades de Vitis vinifera. Novos pólos estão surgindo no Rio Grande do Sul e
Santa Catarina, onde variedades européias estão sendo plantadas para a
produção de vinhos finos, o que vem a melhorar a qualidade do produto. As
27
perspectivas para a viticultura no Sul do Brasil são muito boas, com um
crescimento sólido e tecnificado (Protas, 2000).
2.2 - Origem
Estudos arqueológicos revelaram fósseis de folhas de videira anteriores à
última era glacial. Registros históricos sobre a uva e o vinho desde tempos
remotos são retratados na Bíblia e em outras formas de comunicação. A videira
difundiu-se e adaptou-se paulatinamente a diversas regiões do globo terrestre.
Sua difusão ocorreu em duas principais direções, uma Américo-asiática e outra
Euro-asiática, originando respectivamente as cultivares de uvas chamadas
americanas e outra chamada européia ou Vitis vinifera (Pommer, 2003).
A partir da segunda metade do século XIX foram trazidas para o Brasil as
primeiras variedades americanas, que possuíam características de adaptação ao
ambiente brasileiro. A viticultura brasileira somente adquiriu importância comercial
com a imigração italiana, que se estabeleceu nos Estados de São Paulo e Rio
Grande do Sul (Souza e Martins, 2002).
Em Santa Catarina, crê-se, que a viticultura tenha mais de 200 anos. No
entanto o primeiro registro data de 1807, descrevendo a existência de videiras na
região do porto de São Francisco. De modo geral, a viticultura de Santa Catarina
teve a mesma evolução da viticultura de todo o Brasil, firmando-se como atividade
econômica a partir da segunda metade do século XIX, com o aparecimento da
variedade Isabel e com o incremento da colonização européia (Pommer, 2003).
2.3- Classificação Botânica
A videira é uma planta pertencente à família Vitaceae, a qual abrange mais
de mil espécies, incluídas em dezenove gêneros. O gênero Vitis é o único da
família com importância econômica, e conta com 107 espécies, sendo 29 de
28
origem asiática, 34 norte-americanas, 1 européia, 28 fósseis e 15 espécies cuja
origem é ainda indefinida (Souza e Martins, 2002).
Foex (1895 apud Pommer, 2003) dividiu o gênero Vitis em dois subgêneros,
Euvitis e Muscadinia, devido às diferenças anatômicas e morfológicas que suas
espécies apresentam. A seção Muscadinia agrupa plantas com 40 cromossomos e
engloba as espécies V. rotundifolia, V. munsoniana e V. popenoei, destacando-se
a primeira como mais importante do ponto de vista de resistência a stress biótico e
abiótico (Pommer, 2003). A seção Euvitis agrupa plantas com 38 cromossomos,
onde se encontram duas espécies de importância econômica para a agricultura (V.
labrusca e V. vinifera), seja para a produção de vinho, seja para o consumo in
natura das frutas. A primeira é uma espécie de origem americana e apresenta
características mais rústicas quanto à suscetibilidade a doenças; a segunda é uma
espécie de origem européia, responsável por mais de 90% dos vinhos fabricados
no mundo (Pommer, 2003).
Em Santa Catarina aproximadamente 100 variedades são cultivadas, com
predomínio das videiras americanas (Isabel, Niágara, Bordô e Goethe), híbridas
(Couderc 13 e Moscato Bailey-A) e européias (Cabernet Sauvignon, Merlot,
Chardonnay, Malbec, Pinot Noir e Cabernet Franc) (Souza e Martins, 2002).
2.4- Marcadores Moleculares
Os marcadores são definidos como elementos capazes de prever, mapear
e caracterizar um fenótipo. Inicialmente até meados da década de 60, os estudos
genéticos eram realizados utilizando-se marcadores morfológicos de fácil
identificação no organismo e geralmente regidos por um único gene. Apesar dos
marcadores morfológicos terem contribuído significativamente para o
estabelecimento dos princípios teóricos do mapeamento genético e das análises
de ligação gênica (Knapp, 1991), o pequeno número de marcadores morfológicos
diferentes em uma mesma linhagem diminui a probabilidade de se encontrar
associações significativas entre esses marcadores e caracteres de importância
29
para programas econômicos ou para estudos teóricos (Borém, 1998). Além disso,
esses marcadores freqüentemente são afetados pela ação gênica de dominância,
efeito ambiental, pleiotropia e epistasia (Paterson et al., 1991).
A identificação de variedades de videira tem sido tradicionalmente baseada
na ampelografia que é a analise e comparação de características morfológicas das
folhas, ramos, cachos e bagas (Galet, 1991; Boursiquot and This, 1996; IPGRI
UPOV OIV, 1997; Galet, 2000). Entretanto, o número de especialistas em
ampelografia é restrito e o tempo de formação nesta área é enorme.
Adicionalmente, a expressão das características morfológicas é influenciada por
fatores ambientais e pela biologia individual da planta. Além disso, plantas jovens
com 4 a 5 anos de vida são impossíveis de identificar, pois elas não apresentam
as típicas características de plantas adultas. Algumas variedades geneticamente
relatadas são morfologicamente similares e difíceis de diferenciar por comparação
visual (Aradhya et al., 2003). Por outro lado, clones intravarietais podem diferir
consideravelmente no fenótipo apesar de terem o mesmo perfil genético (Vignani
et al., 1996; Franks et al., 2002; Riaz et al., 2002).
O primeiro grande passo para resolver estes problemas foi o
desenvolvimento de marcadores isoenzimáticos, que são baseados na análise do
produto da expressão de genes (Moss, 1982). Isoenzimas foram definidas como
diferentes formas moleculares de uma mesma enzima (variantes), apresentando
função idêntica ou similar presente num mesmo indivíduo. Eles revelaram-se
como uma nova fonte de marcadores genéticos com inúmeras vantagens sobre os
marcadores morfológicos como co-dominância e insensibilidade a pleiotropia e
epistasia (Paterson et al., 1991). Desde a sua resolução pelos métodos
histoquímicos, as isoenzimas têm sido extremamente importantes para as
investigações sobre variação intra-específica, genética de populações, evolução e
mapeamento genético. Em plantas, as isoenzimas têm sido utilizadas
principalmente em genética de populações, evolução, e caracterização de
germoplasma (Gottlieb, 1981; Tanksley & Orton, 1983; Soltis & Soltis, 1989;
Pasteur et al., 1991; Hill et al., 1996).
30
Os marcadores isoenzimáticos foram testados para identificar e classificar
variedades de videira, porém o grau de polimorfismo obtido limitou sua utilização
na identificação de clones e na estimativa da diversidade genética. Outro fator
limitante na utilização das isoenzimas para identificação de variedades é que a
expressão das enzimas depende do estágio de desenvolvimento da planta (Sefc
et al., 2001; Asensio et al., 2002). Por essa razão, somente sistemas enzimáticos
que não apresentam variações sob diferentes condições podem ser considerados
marcadores enzimáticos. Isto limita o número de marcadores disponíveis, e
conseqüentemente restringe o grau de polimorfismo, afetando diretamente a
diferenciação conseguida com análise isoenzimática (Sefc et al., 2001; Ortiz et al.,
2004).
As técnicas de biologia molecular foram aprimorando-se e o DNA
passou a ser o ponto focal no desenvolvimento de novos marcadores (Borém,
1998). As tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitem
determinar pontos de referência nos cromossomos, tecnicamente denominados
“marcadores moleculares” (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Marcador Molecular é
todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um segmento específico de
DNA correspondente a regiões expressas ou não do genoma. O desenvolvimento
de marcadores moleculares veio dar um impulso maior à pesquisa genética,
propiciando a detecção de polimorfismo de DNA com comportamento Mendeliano,
passível de ser utilizado em diferentes áreas da genética e do melhoramento de
plantas (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Os distintos tipos de marcadores moleculares hoje disponíveis diferenciam-
se pela tecnologia utilizada para revelar variabilidade no DNA, polimorfismo
molecular, expressão gênica, distribuição no genoma, custo de implementação e
operação (Griffith et al., 2000). O uso desses marcadores é uma metodologia
muito utilizada para complementar a ampelografia, identificar sinônimos e
estabelecer relações genéticas entre as variedades de videira (Bowers et al. 1993;
Sefc et al., 1999).
Para Ferreira & Grattapaglia (1998), os marcadores moleculares se
caracterizam pela:
31
a) Unicidade: cada indivíduo tem um perfil de DNA único com exceção de
clones de uma planta ou gêmeos univitelinos no caso de animais;
b) Imutabilidade: ou melhor, mutabilidade extremamente baixa (da ordem
de 10
-4
a 10
-6
/geração); o DNA de um indivíduo é o mesmo em todas as células e
este é estável ao longo de sua vida;
c) Estabilidade física: moléculas de DNA podem ser recuperadas,
purificadas e analisadas com sucesso a partir de praticamente todo e qualquer
material biológico da planta, independentemente do tecido, idade, condição
fisiológica;
d) Variabilidade: apesar do fato de que a maior parte do genoma é muito
conservada entre indivíduos, algumas regiões genômicas específicas são
altamente variáveis permitindo uma discriminação altamente precisa, quantificável
e reproduzível com alta precisão entre laboratórios distintos.
Inicialmente, a utilização de enzimas de restrição no estudo direto do DNA
permitiu a análise e a comparação do comprimento de fragmentos gerados pela
clivagem do material genético através da detecção por hibridização da seqüência
clonada (Griffith et al., 2000). As variações nos nucleotídeos do DNA devido à
mutação, deleção, inserção e inversão, podem ser detectadas se ocorrerem num
sítio de corte das enzimas de restrição, gerando fragmentos de diferentes
tamanhos, portanto polimórficos (Lander et al., 1989). A técnica que se baseia
nestes fragmentos é denominada de RFLP (Restriction Fragment Lenght
Polimorphism – polimorfismo de restrição de DNA) e foi desenvolvido por Botstein
e colaboradores (1980). A grande vantagem dos marcadores RFLPs é a sua
ampla distribuição no genoma, permitindo uma cobertura adequada e
proporcionando a construção de densos mapas genéticos de ligação, que
possibilitam a realização de análises genéticas e moleculares e várias aplicações
no melhoramento de plantas, como clonagem de genes e mapeamento de QTLs
(Quantitative trait loci – locos controladores de características quantitativas), além
de ter expressão co-dominante (Nodari et al., 1993). Os marcadores RFLPs foram
utilizados para diferenciar, caracterizar e identificar os acessos de videira (Striem
et al., 1990; Bourquin et al., 1993; Bowers and Meredith, 1996). Entretanto o
32
elevado custo, instalações apropriadas ao manuseio e descarte de material
radioativo e o tempo necessário na geração destes marcadores restringe
drasticamente seu uso de forma freqüente (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Com os avanços nos estudos sobre o genoma dos organismos, surgiram
marcadores moleculares baseados nas seqüências repetitivas do DNA. Jeffreys e
colaboradores (1985) mostraram que muitos RFLPs eram causados por minis
satélites ou VNTR (Variable Number of Tandem Repeats, Wyman & White, 1980
apud Leoi, 2003), que são regiões dispersas no genoma que contém um número
variável de seqüências repetidas com tamanhos intermediários entre 0,5 a 30 Kb e
enfileiradas em tandem de DNA com comprimento variável entre 10 a 100 pb,
altamente variáveis (Armour et al., 1999). Os VNTRs podem ser analisados tanto
através de RFLPs ou PCR. O processo de detecção de VNTR é bastante
semelhante ao RFLP, contudo o polimorfismo depende da freqüência de
pequenas regiões repetitivas entre os sítios de restrição no genoma (Ferreira &
Grattapaglia, 1998). A vantagem deste tipo de marcador é a grande quantidade de
informação que pode ser obtida em um único teste, devido o cruzamento de
informações produzidas simultaneamente pelo RFLP com as sondas VNTR,
gerando um complexo padrão de bandas abrangendo todos os locos
hipervariáveis do genoma concomitantemente (Armour et al., 1999). Outra
vantagem desta técnica é a possibilidade de utilização de uma mesma sonda para
a detecção de locos hipervariáveis em uma larga variedade de espécies (Ferreira
& Grattapaglia, 1998). Em contrapartida, devido à complexidade do perfil gerado
de bandas, nem todos os alelos correspondentes a cada loco podem ser
identificados. Adicionalmente, por ser uma técnica baseada em RFLP,
compartilham as mesmas limitações (Ferreira & Grattapaglia, 1998). O uso destes
marcadores está concentrado no melhoramento de plantas para identificação de
variedades e clones, na análise de diversidade genética e determinação de
paternidade (Dallas, 1988; Nybom & Hall, 1991; Rogstad et al., 1988; Broun et al.,
1992).
33
2.5- Marcadores Moleculares baseados em PCR
Mais recentemente, o advento de técnicas baseadas em PCR (Polymerase
Chain Reaction – Reação de Polimerase em Cadeia) apresentou uma nova opção
ao uso de marcadores moleculares. Esta técnica (PCR) foi concebida em 1983 por
Kary Mullis (Prêmio Nobel em 1993), publicada em 1987, sendo utilizada de forma
rotineira em diversas áreas da biologia, tanto em pesquisa básica como na
aplicada a partir de 1988 (Saiki et al., 1988).
A reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) foi
um dos passos revolucionários na genética molecular, pois possibilitou a produção
de múltiplas cópias de seqüências específicas de DNA sem a necessidade de
clonar esses segmentos (Alberts et al., 1994). A PCR explora as características da
duplicação do DNA e consiste em desnaturar o DNA genômico, submetendo-o a
uma alta temperatura e, desse modo, permitindo que as duas fitas simples
originárias sejam duplicadas. Nesse ponto reside um dos trunfos dessa técnica,
que é a utilização de uma enzima extraída da bactéria Thermus aquaticus, a Taq
polimerase. Essa bactéria habita em locais quentes e sua enzima suporta
temperaturas de até 94 ºC, sendo que sua temperatura ótima é de 72 ºC. Essa
peculiaridade permite que o processo seja realizado em aparelho termociclador
com programas pré-estabelecidos que alterem a temperatura. Além da Taq
polimerase, são necessários dois iniciadores de seqüência conhecida conhecidos
como primers, que irão anelar-se às fitas simples do DNA com seqüências
complementares em suas extremidades 3’ e 5’, e direcionar a polimerase na
síntese da seqüência desejada. Ambas as fitas servem como moldes e o resultado
de “n” ciclos de PCR é a formação de 2
n duplas fitas de DNA, que são cópias da
seqüência flanqueada pelos iniciadores (Alberts et al., 1994).
As vantagens dessa técnica são muitas, entre elas a quantidade de DNA
necessária para a reação, na ordem de dezenas de nanogramas. Entre as
principais utilidades da reação em cadeia da polimerase estão os estudos de
evolução molecular, diferenciação de grupos taxonômicos, identificação de genes
específicos, entre outras (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
34
Com a PCR e as novas técnicas de genética molecular, os marcadores
moleculares de DNA (marcadores genéticos baseados na variabilidade de DNA)
têm contribuído como ferramenta para incrementar a eficiência do melhoramento
de plantas, seleção assistida e mapeamento genético (Ferreira & Grattapaglia,
1998).
Na década de 80, surgiu um novo tipo de marcador molecular denominado
de RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA Polimórfico Amplificado
ao Acaso, Williams et al., 1990). O RAPD foi praticamente o primeiro marcador
criado a ser baseado em PCR e utiliza como iniciadores oligonucleotídeos curtos,
comumente com 10 nucleotídeos, com seqüência nucleotídica arbitrária. A reação
de amplificação procede em condições de baixa estringência, permitindo que
ocorra o pareamento entre os iniciadores e o DNA – alvo, mesmo que não haja
complementaridade total entre as duas seqüências. Os produtos resultantes da
amplificação podem ser visualizados como bandas em géis de agarose ou
poliacrilamida. Diferenças ao nível de DNA são inferidas pela presença ou
ausência de um determinado fragmento amplificado que produzem um padrão de
bandas específico conhecido como impressão digital genômica (DNA fingerprint).
Os fingerprints permitem distinguir diferentes espécies e até mesmo populações
distintas da mesma espécie. As principais vantagens deste marcador estão na
simplicidade e rapidez na obtenção dos resultados, além da mínima quantidade de
DNA necessária para análise genotípica de um indivíduo. Sendo o RAPD um
marcador com característica dominante, sua principal limitação está justamente no
baixo conteúdo informativo por loco (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Em videira, os
marcadores RAPDs têm sido utilizados principalmente na caracterização e
identificação de variedades (Defontaine, 1992; Gogorcena et al., 1993; Büscher et
al., 1994; Botta et al., 1995a; Grando et al., 1995, 1996; Loureiro et al., 1998; Ye et
al., 1998; Fanizza et al., 1999; Tessier et al., 1999; Pinto-Carnide et al., 2003). O
primeiro mapa genético de videira foi desenvolvido por Lodhi et al. (1995)
utilizando marcadores RAPDs.
Em 1993, os dois pesquisadores Zabeau e Vos, desenvolveram e
divulgaram outro marcador molecular denominado AFLP (Amplified Fragment
35
Length Polymorphism – Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos
Amplificados). Esta técnica combina os alvos para estudo do polimorfismo pelos
marcadores RFLP e RAPD: a distribuição aleatória de sítios de restrição entre
genomas e a amplificação aleatória de fragmentos empregando-se primers de
seqüências arbitrárias. A característica fundamental desta técnica é a capacidade
de revelar simultaneamente muitas regiões diferentes distribuídas aleatoriamente
ao longo do genoma (Mueller & Wolfenbarger, 1999). A análise de AFLP é
baseada na amplificação seletiva via PCR de um subconjunto de fragmentos
genômicos gerados após digestão com uma enzima de corte raro combinada com
uma enzima de corte freqüente. A principal vantagem desta tecnologia é o grande
número de fragmentos que são gerados simultaneamente, aumentando o poder
de detecção de variabilidade genética. Por esta razão, ela tem sido utilizada
principalmente no estudo da diversidade genética entre indivíduos (Muluvi et al.,
1999; Loh et al., 2000) e na construção de mapas genéticos e mapeamento de
genes de interesse em diferentes espécies (Hart et al., 1999). A desvantagem é
que estes marcadores por não serem dirigidos a uma região particular do genoma
são inespecíficos, revelando o polimorfismo presente em dezenas de locos
concomitantemente. Os dados revelados têm natureza binária (ausência ou
presença), portanto, marcadores AFLP são marcadores dominantes e com baixo
conteúdo de informação genética por loco.
Em videira, no caso específico da identificação clonal e seleção assistida
das variedades, faz-se necessário à construção de mapas altamente saturados.
Nestes casos, os AFLPs são ferramentas poderosas devido ao grande número de
marcadores que podem ser gerados por indivíduo (Cervera et al., 1998; Dalbo et
al., 2000, 2001). Além disso, marcadores AFLPs têm sido utilizados para
diferenciar, caracterizar e identificar acessos de Vitis (Sensi et al., 1996; Cervera
et al., 1998).
Outra técnica também muito utilizada como marcador molecular baseia-se
nas seqüências repetidas em tandem presentes no genoma dos seres vivos,
sendo denominada de marcadores microssatélites (SSRs).
36
2.5.1- Marcadores Microssatélites (SSRs)
Os cientistas descobriram o DNA satélite em 1960, quando centrifugavam o
DNA em um gradiente de densidade, verificando que ele apresentava-se em duas
ou mais camadas: uma banda principal contendo genes e bandas secundárias,
que foram chamadas de bandas satélites. As bandas satélites mostraram-se como
sendo constituídas de seqüências de DNA repetidas e muito longas (Griffith et al.,
2000).
No fim dos anos 80, os microssatélites, também denominados SSR (Simple
Sequence Repeats – Repetições de Seqüências Simples), foram isolados e
descritos simultaneamente por três grupos de cientistas, como pequenas
seqüências com 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem (Litt & Luty, 1989; Weber
e May, 1989; Tautz, 1989) (Figura 1).
Figura 1. Microssatélites com repetições em tandem de dinucleotídeos CT/GA.
Os microssatélites têm sido detectados dentro dos genomas de todos os
organismos até agora analisados (Hancock, 1999). Nos eucariotos, estas
seqüências são freqüentes e distribuídas ao acaso no genoma. Apresentam
tamanhos variantes, formando locos genéticos muito polimórficos (Hamada et al.,
1992).
A maioria dos microssatélites (48-67%) estudados são dinucleotídeos
(Wang et al., 1994; Schug et al., 1998). Das repetições dinucleotídeos, a mais
freqüente é AC/TG, que ocorre duas vezes mais que repetições do tipo AT/TA e
três vezes mais que repetições AG/TC (Beckmann & Weber, 1992). Em plantas,
repetições dinucleotídeas de microssatélites AT ocorrem com maior freqüência
(Lagercrantz et al., 1993; Wang et al., 1994; Powell et al., 1996a; Toth et al.,
37
2000). Por outro lado às repetições do tipo CA/GT são as mais comuns em
Drosophila melanogaster (Schug et al., 1998). Os procariotos têm poucos
microssatélites quando comparados com o genoma de eucariotos (Hancock, 1995;
Field & Wills, 1998) e possuem repetições do tipo poly A/T em sua maioria,
seguidas das repetições AT/TA (Belkun et al., 1998; Gur – Arie et al., 2000).
Os marcadores microssatélites são marcadores co-dominantes, são
amplificados via PCR (o que facilita a sua obtenção mesmo com pouca quantidade
de DNA), estão amplamente distribuídos pelo genoma de eucariotos, são
multialélicos, de menor custo, não demandam de radioatividade, além de serem
geralmente muito polimórficos. Possuem ainda a vantagem de serem facilmente
compartilhados entre pesquisadores ou centros de pesquisa (pois cada loco é
definido por um par de seqüências de primer, mantendo o mesmo resultado
independente de onde o pesquisador esteja trabalhando). Os ensaios com
microssatélites são mais robustos do que com RAPDs e mais versáteis do que
com AFLPs. A natureza co-dominante dos microssatélites é uma vantagem sobre
os marcadores RAPD e AFLP (dominantes), principalmente para mapeamento
genético (Toth et al., 2000). Além disso, primers marcados com fluorescência
possibilitam sistemas múltiplos de detecção (multiplex), e conseqüentemente,
permitem a avaliação de um grande número de locos por indivíduo (Ferreira &
Grattapaglia, 1998; Akagi et al., 1996; McCouch et al., 1997).
A detecção dos marcadores microssatélites, a determinação do tamanho
dos seus fragmentos e conseqüentemente do polimorfismo pode ser feita por
eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida ou ainda por sistema de
capilares em seqüenciadores automáticos. A coloração com brometo de etídio é
comumente utilizada para detectar produtos de PCR em géis não desnaturantes,
i.e., géis de agarose. A resolução em agarose é, no entanto, limitada em
comparação com poliacrilamida. Vale comentar que géis de agarose MetaPhor 2%
e UltraPura 1% possibilitam maior distinção de diferenças alélicas (Becker & Heun,
1995). A resolução de nucleotídeos simples requer o uso de géis de poliacrilamida
desnaturante ou por capilaridade utilizando coloração de prata, marcação
radioativa ou fluorescência.
38
Tipicamente locos microssatélites são altamente polimórficos, fazendo
deles marcadores genéticos muito potentes (Schlötterer, 2000; Balloux and Lugon-
Moulin, 2002) e com uma grande habilidade para resolver diferenças genéticas
quando comparados a outras classes de marcadores genéticos (Mueller and
Wolfenbarger, 1999; Sunnucks, 2000). Por estas razões, eles são rotineiramente
usados para identificação forensis (Olaisen et al., 1997; Mukaida et al., 2000),
análises de pedigree (McCouch et al., 1997; Itokawa et al., 2003), e determinação
da estrutura da população (Goldstein and Schlötterer, 1999; Schlötterer, 2000).
Devido à natureza co-dominante estes marcadores podem ser usados em estudos
de parentesco e de proteção e identificação de variedades de plantas em bancos
de germoplasma (Lopes et al., 1999; Diwan & Cregan, 1997; Marklund et al.,
1994). Esses marcadores podem contribuir também para conservação, já que
permitem a obtenção de informações cruciais sobre a biologia de populações
naturais, tais como: fluxo gênico, migração, tamanho efetivo, sistema de
cruzamento, etc.
O grande poder de discriminação dos microssatélites justifica seu uso
quando se pretende obter uma boa representação da diversidade genética
existente, conduzindo a estudos de diversidade inter e intra-específicos e
promovendo a compreensão do genoma. Além disso, o conhecimento da
quantidade e da distribuição da variabilidade genética é um ponto central para o
desenvolvimento de estratégias de conservação e para o uso efetivo do
germoplasma de videira (Aradhya et al., 2003).
Recentemente, vários microssatélites foram isolados e caracterizados em
diversas espécies de plantas frutíferas, incluindo a pêra (Testolin et al., 2000),
maçã (Liebhard et al., 2002) e videira (Bowers e Meredith, 1997; Sefc et al., 1999;
Ulanovsky et al., 2002; Ortiz et al., 2004).
Os cinco tipos de marcadores citados anteriormente (Isoenzimas, RFLP,
RAPD, AFLP e SSR) são os mais utilizados atualmente no estudo do genoma de
plantas, animais e humanos. Para facilitar a diferenciação destes marcadores, a
Tabela 3 traz uma breve análise comparativa entre eles. Entretanto, na literatura
39
existem outros marcadores, que muitas vezes apresentam apenas uma pequena
modificação em relação a alguns desses já comentados (Tabela 4).
Tabela 3. Análise comparativa entre os marcadores.
Atributos Isoenzimas RFLPs RAPDs AFLPs Microssatélites
Nível de Polimorfismo baixo baixo-alto baixo-alto muito-alto muito-alto
Estabilidade Ambiental moderada Alta alta Alta Alta
Número de locos moderada<50 Alto alto Alto Alto
Expressão Gênica co-dominante co-dominante dominante dominante co-dominante
Números de alelos por
loco
2-5 multialélico 2 2 Multialélico
Distribuição no genoma regiôes de
cópia única
Várias ao acaso ao acaso ao acaso
Acessibilidade
tecnológica
muito alta Média muito alta Média muito baixa
Aplicabilidade
melhoramento
rápido, custo
baixo
lento, custo
médio
rápido, custo
baixo
rápido, custo
baixo
lento, custo alto
Identificação de
genótipos
baixa Alta muito alta muito alta muito alta
Avaliação de
germoplasma
média Alta alta muito alta Alta
Mapeamento genético baixa Alta alta Alta muito alta
Mapeamento de regiões
especificas
baixa Média muito alta muito alta Média
Mapeamento
comparativo
baixa muito alta baixa baixa Alta
Genética de autógamas baixa Média alta muito alta muito alta
Genética de alógamas média Média alta muito alta muito alta
Análise filogenética média muito alta média alta Média
Adaptado de Gepts, 1993; Ferreira & Grattapaglia, 1995.
40
Tabela 4. Descrição sucinta dos demais marcadores existentes na literatura
Tipo Descrição
AP-PCR
Arbitrary Primer PCR
Semelhante ao RAPD, constitui-se por amplificações ao acaso utilizando primer
com 20 bases, empregando-se temperaturas de anelamento inferiores à TM
exigida pelo primer. Característica dominante, detecção em gel de agarose
(Welsh & McClelland, 1990)
CAPS
Cleaved Amplified
Polymorphic Sequence
Constitui-se da digestão com enzimas de restrição de fragmentos polimórficos
amplificados com um primer específico. Função: revelar o polimorfismo
presente nos sítios de restrição do fragmento. Co-dominante e detecção em gel
de agarose ou prata (Konieczny & Azubel, 1993).
DAF
DNA Amplified
Fingerprinting
Mesmo princípio que o RAPD, utilizando primers mais curtos (entre 5 a 10
bases). Os perfis eletroforéticos dos produtos amplificados são extremamente
complexos, apresentando um grande número de bandas (Caetano-Anólles et al.,
1991).
DGGE
Differential Gradiente
Gel Electrophoresis
Visa à detecção de fragmentos com polimorfismo na seqüência de bases, após
eletroforese em gel de acrilamida contendo um gradiente do produto
desnaturante (Myers et al., 1987).
IMA
Inter Microsatellite
Amplification
Amplificação do DNA genômico com primers cuja seqüências de bases é
constituída de um motivo repetitivo (geralmente dinucleotídeos) seguido de 2 a
6 bases definidas ao acaso (Zietkiewicz et al., 1994). Este marcador também é
conhecido por Inter-SSR PCR; ISA ou IRA.
SCAR
Sequence
Characterized
Amplified Region
Fragmento de DNA genômico amplificado por PCR por primers específicos (14
a 20 bases). Estes primers são definidos após o conhecimento da seqüência de
bases do fragmento. Esta técnica originou-se a partir do isolamento seguido de
seqüenciamento de fragmentos amplificados por RAPD (Paran & Michelmore,
1993). Na literatura científica existe uma plenitude de marcadores SCARs
desenvolvidos principalmente para características de resistência a doenças (Julio
et al. 2006).
SSCP
Single Strand
Conformation Profile
Análise da conformação de fragmentos especificamente amplificados,
desnaturados e migrados em gel de acrilamida. As fitas simples assumirão uma
conformação estrutural diferente conforme a seqüência de bases que elas
apresentam, a qual modificará a mobilidade eletroforética da mesma. Através da
comparação de migração das fitas simples de um mesmo fragmento amplificado
em diferentes indivíduos, é possível determinar aqueles que apresentam
polimorfismo na seqüência de bases (Orita et al., 1989).
STS
Site Tagged Sequence
Corresponde a qualquer seqüência genômica amplificada com primers
específicos (Olso et al., 1989).
Adaptado: Souza, 2001.
41
2.5.2- Reações Múltiplas de Microssatélites (Multiplex)
PCR múltiplo ou multiplex é uma variante da PCR na qual dois ou mais
locos são simultaneamente amplificados na mesma reação ou, ainda, amplificados
em reações distintas, mas genotipados simultaneamente. O desenvolvimento de
um sistema multiplex requer: 1) seleção de marcadores de acordo com a variação
de tamanho de alelos em cada loco, evitando sobreposição de faixas de alelos em
marcadores marcados com o mesmo fluorocromo; 2) PCR de cada marcador sob
as mesmas condições de amplificação; 3) PCR múltiplo numa mistura equimolar
dos primers; 4) ajuste do tempo e temperatura de extensão; 5) ajuste do tempo e
temperatura de anelamento; 6) ajuste da quantidade de marcadores em multiplex;
e 7) ajuste da concentração do tampão. Esta técnica tem permitido a ampliação
simultânea de vários locos na mesma reação e tornou-se um meio rápido e
conveniente para a pesquisa laboratorial (Henegariu et al., 1997). A técnica de
PCR múltiplo tem sido também aplicada com sucesso em análises de deleção
(Henegariu et al., 1994), mutações (Shuber et al., 1995) e polimorfismos ou em
ensaios quantitativos (Mansfield et al., 1994) e PCR-Transcrição Reversa (Crisan,
1994).
A capacidade de montar uma PCR com vários pares de primers em uma
única reação é necessária para reduzir o tempo, trabalho e custo da genotipagem
(Olivo, et al., 2000). A otimização das condições da PCR múltipla pode ser
entediante e demorada visto que os primers interagem e afetam a quantidade e
qualidade dos produtos, produzem bandas inespecíficas, e produzem dímeros de
primers (Jordan et al., 1999). Em compensação, a mistura de vários marcadores
pode melhorar o rendimento final permitindo a visualização em cada linha de um
gel de muitos fragmentos polimórficos de DNA, aumentando a informação
produzida pela eletroforese (Armour et al., 2002).
A montagem de painéis de reações múltiplas impõe que microssatélites
marcados com a mesma fluorescência possuam variação de tamanho de alelos
diferentes e aqueles com faixa de tamanho em sobreposição sejam marcadores
com fluorescência diferente (Ziegle et al., 1992). A mistura dos microssatélites
42
pode ser feita após amplificação ou locos microssatélites podem ser amplificados
juntos numa mesma reação de PCR (Mitchell et al., 1997).
Em videira, Pinto-Carnide et al. (2003) reportou o uso de 6 marcadores SSR
marcados com fluorescência organizados em 2 painéis para a caracterização de
12 variedades de videira (Vitis vinifera L.) do Norte de Portugal. A combinação dos
pares de primers foi feita de forma tal a acomodar a análise de variedades
geneticamente diferentes, permitindo um método robusto e flexível para a
identificação de variedades de videira.
O sistema automatizado de determinação do tamanho dos alelos SSR
marcados com fluorescência é um sistema em que um dos primers PCR para um
loco SSR (geralmente o primer forward) é marcado com um marcador fluorescente
colorido. Os produtos da PCR carregando diferentes marcadores fluorescentes
são separados em eletroforese capilar. O uso de microssatélites marcados com
fluorescência para a genotipagem automática em seqüenciadores de DNA oferece
muitas vantagens em relação à análise usando técnicas de detecção com prata.
Uma das vantagens é a possibilidade de analisar vários locos ao mesmo tempo
em uma única coluna de gel. Um segundo benefício é o significativo aumento na
acurácia na mensuração do tamanho do alelo, obtido pelo uso de um padrão
interno em cada coluna de gel e analisado com o uso de algoritmo automatizado
(“allele calling”). De um modo geral, a automatização aumenta a velocidade e a
acurácia da coleta de dados e o processamento da informação. A alta
sensibilidade da detecção também reduz o volume necessário (e, sobretudo, o
custo) da reação de PCR e permite a detecção dos locos que apresentam
amplificação mais difícil, além de eliminar o uso de radioatividade (Mitchell et al.,
1997; Coburn et al., 2002).
O uso da análise de fragmentos de restrição automática baseada na
fluorescência foi primeiro reportado por Carrano et al. (1989). Este método foi
adaptado e melhorado para a análise com microssatélites (Edwards et al., 1991;
Ziegel et al., 1992). Os métodos automáticos de genotipagem com SSR estão
gradualmente substituindo os sistemas manuais de genotipagem no
melhoramento de plantas e na pesquisa genética.
43
Marcadores SSR constituem uma ótima ferramenta para a identificação de
cultivares, combinando o alto conteúdo informativo com a precisão de definição
automática de tamanho de alelos. Esta combinação oferece um sistema eficiente e
econômico para a identificação de genótipos como alternativa à identificação
convencional de alelos microssatélites usando outros tipos de marcação (Diwan &
Cregan, 1997).
Em plantas, a técnica de detecção fluorescente de microssatélites tem sido
aplicada em arabidopsis (Bell & Ecker, 1994; Ponce et al., 1999), em soja (Akaya
et al., 1995; Diwan & Cregan, 1997; Morgante & Olivieri, 1993, Cregan et al., 1994,
Rongwen et al., 1995, Maughan et al., 1995), em milho (Senior et al., 1996; Smith
et al., 1997), Brassica sp. (Kresovich et al., 1995), em tomate (Bredemeijer et al.,
1998), em uva (Thomas & Scott, 1993; Pinto-Carnide et al. 2003; Constantini et al.,
2005) e em arroz (McCouch et al., 1997; Akagi et al., 1996; Brondani, 2001, 2002;
Beló, 2001; Pessoa Filho, 2004), mostrando que a genotipagem de homozigotos e
heterozigotos é rápida e que os SSR são herdados de forma Mendeliana.
2.5.3 - Marcadores Microssatélites em Videira (Vitis spp.)
Thomas & Scott (1993) foram os primeiros pesquisadores a usar os
microsatélites para identificar variedades de videira. Estes autores mostraram que
os microssatélites foram abundantes e continham polimorfismo genético capaz de
caracterizar e identificar as variedades de Vitis vinifera. Além disso, os
microssatélites se mantiveram conservados para outras espécies de Vitis e
Muscadinia (Thomas & Scott, 1993). Eles também demonstraram através de
análises filogenéticas que os microssatélites são co-dominantes e comportam-se
de acordo com a herança mendeliana simples, confirmando sua adequação para o
mapeamento genético (Thomas & Scott, 1993). A partir daí, outros grupos
relacionados à videira iniciaram pesquisas com microssatélites, resultando no
desenvolvimento de primers específicos para Vitis (Browers et al., 1996, 1999;
Sefc et al., 1999; Lefort et al., 2002). A identificação de variedades de videira e
44
sua origem (Sefc et al., 2000), seus parentais (Bowers e Meredith, 1997; Secf et
al., 1997; Bowers et al., 1999; Vouillamoz et al., 2006) e seus nomes regionais em
diferentes áreas de produção tem despertado grande interesse entre os
pesquisadores e produtores, pois em muitos países as normas de regulamentação
para comercialização ou proteção de cultivares requerem acurada identificação.
Por exemplo, nos países europeus com viticultura tradicional, o uso da
terminologia vinhos regionais é estritamente regulamentada: somente variedades
específicas e registradas podem ser cultivadas em determinada região geográfica.
Nos últimos 15 anos, os microssatélites têm sido aplicados à videira para
genotipagem (Botta et al., 1995; Secf et al., 1998), estudos de pedigree (Cipriani et
al., 1994; Vignani et al., 1996; Bowers e Meredith, 1997; Sefc et al., 1997, 2000;
Crespan et al., 2001; Imazio et al., 2002; Lefort et al., 2002; Siret et al., 2002;
Ulanovsky et al., 2002; Ortiz et al., 2004), identificação de QTLs e seleção
assistida e mapeamento genético (Dalbo et al., 2000; Doligez et al., 2002; Riaz et
al., 2002, 2004; Grando et al., 2003; Adam - Blondon et al., 2004; Moreira, 2006) e,
definição de sinônimos e homônimos (Boccaci et al., 2005; Constantini et al.,
2005; Vouillamoz et al., 2006).
A análise de microssatélites pode favorecer a confirmação e definição de
sinônimos, ou seja, podem identificar genótipos iguais conhecidos por diferentes
nomes. Por exemplo, no perfil dos microssatélites de uvas viníferas italianas foram
encontrados sinônimos entre as variedades Refosco di faedis e Refoscone
(Cipriani et al., 1994), assim como entre as variedades Favorita, Pigato e
Vermentino (Botta et al., 1995). Na parte Oriental-Sul da Áustria, uma variedade
denominada de Morillon foi considerada um sinônimo da Chardonnay, pois o perfil
dos microssatélites das duas variedades mostrou-se idêntico (Sefc et al., 1998a).
Thomas et al. (1994), estudando os porta-enxertos 5A Teleki e 5BB Kober
demonstraram que eles possuem o mesmo perfil de DNA, indicando que os dois
diferentes nomes foram equivocadamente dados ao mesmo porta-enxerto no
passado. Martin et al. (2006) analisando 56 tradicionais variedades da Espanha e
Portugal, detectou que a variedade Tinta Roriz de Portugal é um sinônimo da
Tempranillo da Espanha.
45
No caso de estudos de pedigree de variedades viníferas, o primeiro e o
mais surpreendente dos resultados foi a descoberta da origem da variedade
Cabernet Sauvignon através dos marcadores microssatélites (Bowers e Meredith,
1997; Sefc et al., 1997). No exame da variedade conhecida como Petit Syrah na
Califórnia, foi demonstrado que a maioria dos acessos com este nome é idêntico
ao da variedade Durif (Meredith et al., 1999). Estudos com microssatélites em 25
locos confirmaram e identificaram a variedade Syrah como uma provável parente
da variedade Durif. Boccaci et al. (2005) analizando 8 locos microssatélites
identificou graus de parentesco entre as variedades Fortana
e Lambrusco Maestri
e entre Uva Tosca e Lambrusco Montericco.
Com os dados obtidos na identificação molecular de genótipos de plantas
de Vitis com marcadores moleculares, vários bancos de referências foram
desenvolvidos em todo mundo (Dettweiller et al., 1998a, 1998b; Lefort et al., 2000;
Grape Microsatellite Collection,
http://www.ismaa.it/areabioav/gmc.html; Greek
Vitis Database, http://www.biology.uch.gr/gvd e Swiss Vitis Microsatellite Database
– SVMD, www.unine.ch/nccr/svmd/; e GENRES:
http://www.genres.de/eccdb/vitis/).
46
JUSTIFICATIVA
47
3- JUSTIFICATIVA
Este trabalho é parte de um projeto geral que busca tecnologias para o
desenvolvimento da vitivinicultura catarinense, que envolve a Universidade
Federal de Santa Catarina (UFSC), Empresa de Pesquisa Agropecuária e
Extensão Rural de Santa Catarina (Epagri), a Companhia Integrada de
Desenvolvimento Agrícola de Santa Catarina (CIDASC), Istituto Agrário di San
Michele All’ Adige (ISMAA) e que tem o apoio da Província Autônoma de Trento e
do Governo do Estado de Santa Catarina. Para este trabalho foi proposto à
caracterização e a identificação dos acessos de videira por marcadores
microssatélites (SSRs) e a criação de um banco de dados referencial
informatizado das variedades de videira (Vitis spp.) das coleções públicas e
privadas do Estado de Santa Catarina. Os benefícios das informações geradas do
trabalho com marcadores microssatélites (SSRs) para a cultura da videira poderão
ser o aumento da precisão da identificação varietal, proteção de cultivar,
certificação de mudas e do melhoramento da viticultura via estabelecimento de
correlações entre características moleculares e características de interesse
agronômico. Espera-se que a caracterização e identificação dos acessos de
videira das coleções existentes permitam o credenciamento e reconhecimento
como Banco de Germoplasma Ativo para o Estado de Santa Catarina.
Além disso, a caracterização molecular em grande escala possibilita a
análise rápida e eficiente de coleções inteiras de germoplasma, proporcionando a
definição de coleções nucleares. Neste sentido, os resultados obtidos neste
trabalho contribuirão para a criação de uma coleção nuclear baseada em
características moleculares, morfológicas e de interesse agronômico, e que
representem toda coleção de germoplasma de videira do Estado de Santa
Catarina.
O trabalho Caracterização Molecular das Variedades de Videira (Vitis spp.)
de Santa Catarina por Marcadores Microssatélites (SSRs) foi financiado pelo
Projeto Pro-Goethe.
48
OBJETIVOS
49
4- OBJETIVOS
4.1- Objetivo Geral
Caracterizar geneticamente os acessos públicos e privados de videira (Vitis
spp.) existentes nas coleções do Estado de Santa Catarina por marcadores
microssatélites (SSRs).
4.2- Objetivos Específicos
Selecionar e estabelecer uma série de marcadores microssatélites com
capacidade de caracterização de variedades de videira viníferas, americanas e
híbridas;
Proceder a genotipagem automática de uma coleção de germoplasma de
videira utilizando painéis múltiplos de marcadores microssatélites;
Criar o banco de dados referência informatizado com informações geradas
no trabalho, com intuito de implementar projetos de proteção de cultivares,
certificação de mudas e manter intercâmbios com outras instituições ligadas à
viticultura.
50
METODOLOGIA
51
5- METODOLOGIA
5.1- Material Vegetal
Foram coletados folhas jovens e ramos de plantas de Videira (Vitis spp.) de
246 variedades produtoras e as principais variedades de porta-enxertos, mantidas
nas coleções de germoplasma, de coleções públicas e privadas, do Estado de
Santa Catarina, nas regiões de: Urussanga (Sul do Estado), Nova Trento (Vale do
Rio Tijucas), Rodeio (Médio Vale do Itajaí), São Joaquim (Planalto Serrano),
Campos Novos, Videira, Tangará e Água Doce (Meio-oeste) e Florianópolis
(Litoral) (Figura 2).
Figura 2. Mapa das principais regiões onde foram coletadas as variedades para análises e
caracterização molecular através de microssatélites (SSRs) no Estado de Santa Catarina,
2006.
Legenda:
■ Água Doce
■ Videira
■ Tangará
■ Campos Novos
■ Nova Trento
■ Rodeio
■ São Joaquim
■ Urussanga
■ Florianópolis
52
5.2- Extração e Quantificação do DNA
A extração do DNA das folhas e ramos de videira foi realizada, com
algumas modificaçoes, de acordo com o protocolo Doyle & Doyle (1990),
utilizando cerca de 150 mg de material vegetal (folhas e ramos) por tubo (2,0 ml)
para extração do DNA genômico total. Para o rompimento das paredes e
membranas celulares do tecido foi realizada maceração em cadinho de porcelana
após o congelamento do tecido em nitrogênio líquido. Ao tecido macerado foram
adicionados 1000 µl de tampão de extração de DNA (3% acetyldimethyl
tiethylammonium bromide – CTAB, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA pH 8,0, 100 mM
Tris-HCL pH 8.0, 1% polyvinylpyrrolidone - PVP, 0.2% ß-mercaptoetanol)
previamente aquecido a 65°C. Após a completa ressuspensão das amostras na
solução, iniciou-se a etapa de incubação por 45 min a 60 - 65°C em banho-maria,
com leve agitação a cada 10 minutos.
Os tubos foram retirados do banho-maria e, após atingirem temperatura
ambiente, foi realizada a primeira extração (em uma capela de exaustão) pela
adição de 1000 µl de CIA (clorofórmio - álcool isoamílico 24:1), para formar uma
emulsão. Em seguida, os tubos foram homogeneizados e centrifugados a 10.000 g
por 15 minutos. O sobrenadante foi retirado e transferido para novos tubos de 2,0
ml, aos quais foram adicionados 1000 µl de CIA e uma gota de 10% CTAB, 1,4 M
NaCl e, em seguida foram agitados manualmente por 5 minutos e centrifugados a
10.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado e transferido novamente
para novos tubos de 1,5 ml, aos quais foram adicionados 1500 µl de etanol
absoluto resfriado (-20°C). Esses tubos foram homogeneizados e colocados para
descansar por uma noite a temperatura de -20°C para precipitação dos ácidos
nucléicos.
Os tubos foram então centrifugados a 10.000 g por 15 minutos a 4°C (para
formação do pellet). Após a formação do pellet, o sobrenadante foi descartado e o
pellet foi lavado com 1 ml de etanol 76% e 10 mM de acetato de amônio e
gentilmente agitados, e colocados no freezer a -20°C por 20 minutos. Após, os
pellets foram centifugados a 10.000g por 10 minutos e então, o sobrenadante foi
descartado novamente e os tubos deixados secar ao ar ambiente por 30 minutos.
53
Após, foi adicionado ao precipitado 200 µl TE (Tris-HCL 10 mM + EDTA 1mM pH
8,0) + RNAse. Nesta etapa, os tubos ficaram overnight a temperatura ambiente
para ocorrer a diluição do DNA.
Esta etapa do projeto foi realizada no Laboratório de Fisiologia do
Desenvolvimento e Genética Vegetal (UFSC).
5.3- Quantificação do DNA em Gel de Agarose
A visualização do DNA extraído foi feita em eletroforese com gel de agarose
(0,8%) (ANEXO 1).
O gel foi preparado com agarose (0,8%) em 1X TBE e fundidos em
microondas. Deixou-se esfriar até aproximadamente 60°C, adicionando-se em
seguida o brometo de etídio. Foi vertido ainda quente em uma cuba de mini-gel
com o pente posicionado e deixado solidificar por aproximadamnete 20 minutos, à
temperatura ambiente. Após este período, as amostras de DNA foram carregadas
com 3 µl de tampão de carregamento (20 ml de TE, pH 8,0; 8 g de sacarose; 50
mg de azul de bromofenol; 400 µl de brometo de etídio e 1 µl de água mili-Q
autoclavada) e aplicadas no gel. Foi aplicado no mesmo gel um marcador de peso
molecular padrão (20, 50, 100 e 200 ng fago λ), e em seguida se prosseguiu com
a migração do DNA por eletroforese. O DNA foi visualizado com trans-iluminador
com luz ultravioleta/365 nm. A determinação da concentração do DNA extraído se
deu por comparação visual com os padrões utilizados. Após, o DNA foi diluído em
água mili-Q e PVP (2%) para a concentração final de 20 ng/µl, para serem
utilizadas nas reações de amplificação.
As diluições de DNA foram calculadas através da fórmula: C1.V1=C2.V2,
onde C1 corresponde a leitura no gel da concentração do DNA; V1 a incógnita; C2
a concentração desejada (20 ng) e V2 o volume desejado (100 µl).
Esta etapa do projeto foi realizada no Laboratório de Fisiologia do
Desenvolvimento e Genética Vegetal (UFSC).
54
5.4- Escolha dos Primers microssatélites
Foram genotipadas 246 variedades em 10 locos microssatélites: VVS2
(Thomas & Scott 1993), VVMD5, VVMD7 (Bowers et al., 1996), VVMD25,
VVMD27, VVMD28, VVMD31 e VVMD32 (Bowers et al., 1999b), VrZAG62 e
VrZAG79 (Sefc et al., 1999) (Tabela 5). No sentido de facilitar a comparação com
os dados da literatura e com outros bancos de dados, neste estudo foi utilizado o
‘core set ‘ de microssatélites do projeto GENRES 081 (Dettweiler et al. 2000b;
This et al. 2003; http://www.genres.de/vitis/), além de outros amplamente utilizados
na genotipagem da videira. O ‘core set ’ de microssatélites são marcadores
(VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 e VrZAG79) utilizados para o
screening das coleções de videira da Europa.
Tabela 5. Relação dos primers apresentando a seqüência, temperatura de anelamento e tamanho do alelo.
Laboratório de Genética Molecular, IASMA, Trento.
Primers
Seqüência
Referência
Temperatura de
Anelamento
(°C)
Tamanho do
alelo (bp)
VVS2
[F]cagccgtaaatgtatccatc
[R]aaattcaaaattctaattcaactgg
Thomas & Scott
(1993)
50 129-155
VVMD5
[F]ctagagctacgccaatccaa
[R] tataccaaaaatcatattcctaaa
Bowers et al.
(1996)
56 226-246
VVMD7
[F]agagttgcggagaacaggat
[R] cgaaccttcacacgcttgat
Bowers et al.
(1996)
50 232-263
VVMD25
[F]ttccgttaaagcaaaagaaaaagg
[R]ttggatttgaaatttattgagggg
Bowers et al.
(1999b)
56 243-275
VVMD27
[F]gtaccagatctgaatacatccgtaagt
[R] acgggtatagagcaaacggtgt
Bowers et al.
(1999b)
50 173-194
VVMD28
[F]aacaattcaatgaaaagagagagagaga
[R] tcatcaatttcgtatctctatttgctg
Bowers et al.
(1999b)
56 221-279
VVMD 31
[F]cagtgtttttcttaaagtttcaagg
[R]ctctgtgaaagaggaagagacgc
Bowers et al.
(1999b)
56 196-224
VVMD32
[F]tatgattttttaggggggtgagg
[R]ggaaagatgggatgactcgc
Bowers et al.
(1999b)
56 239-273
VRZag62
[F]ggtgaaatgggcaccgaacacacgc
[R] ccatgtctctcctcagcttctcagc
Sefc et al.
(1999)
50 185-203
VRZag79
[F]agattgtggaggaggaacaaaccg
[R] tgcccccattttcaaactcccttcc
Sefc et al.
(1999)
50 236-260
55
5.5- Amplificação dos marcadores microssatélites fluorescentes
A reação de amplificação das seqüências correspondentes aos
microssatélites constou de um voume final de 12.5 μl (ANEXO 1) contendo 20 ng
de DNA genômico. Em cada par de primer microssatélite um deles (Primer foward
[F]) foi marcado com as seguintes flourescências: FAM ou HEX (ANEXO 1).
As reações de amplificação foram conduzidas em um Termociclador 9600
(Applied Biosystems), e com duas diferentes temperaturas de anelamento:
• 50ºC (Programa Gold 50 - 35): (i) um “hot start” de 95°C durante 7 minutos; (ii)
35 ciclos de amplificação distribuídos em 45 segundos a 94°C, 45 segundos a
50°C, 1 minuto e 30 segundos a 72°C; e (iii) uma etapa de extensão final de 7
minutos a 72°C. Este programa foi utilizado para os primers VVS2, VVMD7,
VVMD27, VRZag62 e VRZag79.
• 56ºC (Programa Bio 56 - 35): (i) um “hot start” de 95°C durante 3 minutos; (ii) 35
ciclos de amplificação distribuidos em 45 segundos a 94°C, 45 segundos a 56°C, 1
minuto e 30 segundos a 72°C; e (iii) uma etapa de extensão final de 7 minutos a
72°C. Este programa foi utilizado para os primers VVMD5, VVMD25, VVMD28,
VVMD31 e VVMD32.
Foram utilizadas duas diferentes temperaturas de anelamento, de acordo
com as características dos primers. Além disso, os programas de amplificaçao se
distiguiram em funçao do tipo de enzima Taq polimerase utilizada. No Mix-PCR
dos primers VVS2, VVMD7, VVMD27, VRZag62 e VRZag79 foi adicionada a
enzima GOLD Taq polimerase que requer um tempo de ativaçao maior (5’),
enquanto no Mix – PCR dos primers VVMD5, VVMD25, VVMD28, VVMD31 e
VVMD32 foi usada a BIO Taq polimerase, que requer um periodo de ativaçao
menor (3’).
Neste estudo, cinco painéis de marcadores microssatélites (painel
multiplex-seqüenciador) constituídos por 10 marcadores marcados com
fluorescência foram utilizados para a genotipagem semi-automática em
seqüenciador de DNA. Os painéis multiplex-seqüenciador foram montados de
acordo com a cor do marcador e do tamanho dos alelos (ANEXO 1).
56
Uma alíquota de 0.5 ul do produto amplificado foi misturada a 9.5 ul de
tampão de carregamento (98% formamida, 10 mM EDTA-blue dextran) e 0.3 ul de
um padrão de tamanho conhecido (Genescan-500 ROX, Applied Biosystems),
seguido de desnaturação a 94°C por 3 minutos para separação por eletroforese
capilar a 15 kV por 45 minutos em um seqüenciador de DNA ABI 3100 (Applied
Biosystems).
Esta etapa do projeto foi realizada no Instituto Agrário di San Michelli all’
Adige – IASMA (Trento/Itália), no Laboratório de Genética Molecular.
5.6- Análise dos dados
A separação dos fragmentos microssatélites foi realizada utilizando o
programa GeneScan versão 3.7 (Applied Biosystems). Os tamanhos dos alelos
amplificados foram determinados utilizando o programa Genotyper versão 3.7
(Applied Biosystems). Todas as análises foram realizadas utilizando uma
variedade “standart” (Chardonnay). A variedade Chardonnay serve como
referência tanto da qualidade da amplificação como do tamanho dos alelos, já que
o seu perfil alélico é conhecido, permitindo a comparação do tamanho dos alelos
com outros germoplasmas. Esta etapa do projeto também foi realizada no Instituto
Agrário di San Michelli all’ Adige – IASMA (Trento/Itália), no Laboratório de
Genética Molecular.
A chamada dos alelos foi realizada por arredondamento dos valores
atribuídos aos genótipos para valores próximos do número de pares de bases
inteiro para resultar numa estimativa de par de bases para cada alelo. Como a
maioria dos locos utilizados neste estudo possui repetições dinucleotídicas, o
processo de chamada resultou algumas vezes em valores intermediários para os
alelos indicados. Uma correção foi efetuada de tal forma que todos os valores
seguem o tamanho esperado para locos com motivo dinucleotídeo. Para esse fim,
o fragmento alélico mais freqüente de cada loco foi considerado como referência
para os valores esperados dos outros alelos no loco marcador.
57
Os genótipos de todos os acessos estudados foram comparados/analisados
juntamente com (a) banco de dados online (Grape Microsatellite Collection:
http://www.ismaa.it/areabioav/gmc.html; Greek Vitis Database:
http://www.biology.uch.gr/gvd; Swiss Vitis Microsatellite Database – SVMD:
http://www.unine.ch/nccr/svmd/; e GENRES: http://www.genres.de/eccdb/vitis/) e
(b) com dados da literatura.
58
RESULTADOS E DISCUSSÃO
59
6- RESULTADOS
6.1- Extração e quantificação do DNA
Foram quantificados os DNAs de 246 amostras de diferentes variedades de
videira, sendo 9 amostras de Nova Trento, 37 de Urussanga, 22 de Rodeio, 7 de
Tangará, 14 de Videira, 43 de Campos Novos, 34 de Água Doce, 68 de São
Joaquim e 12 de Florianópolis. Verificou-se, através da literatura, que a
quantidade suficiente para uma reação adequada é de 20 ng/µl de DNA. Volume
este recomendado por Crespan et al. (1999), Crespan (2004) e Walker et al.
(2006).
Para as 9 amostras de Nova Trento a quantidade de DNA extraída foi
suficiente. Das amostras de Urussanga 36 apresentaram quantidade de DNA
suficiente para a reação, apenas para a amostra U11 (Benifugi – EPAGRI) foi
insuficiente. Das 22 amostras de Rodeio, 3 não apresentaram quantidade
suficiente de DNA (R14, R15 e R18) e 1 apresentou DNA de baixa qualidade
(R19). Para as amostras da Região de Tangará e Videira 9 apresentaram
quantidades insuficientes de DNA, 3 amostras (Dona Zilá, Riesling Renano e
Vênus) apresentaram DNA de baixa qualidade e 9 obtiveram quantidades
suficientes de DNA. Já das 43 amostras de Campos Novos um grupo de 9
amostras não apresentou uma quantidade de 20 ng de DNA. Das amostras de
Água Doce 15 apresentaram uma quantidade de 20 ng de DNA, 12 de 50 ng e do
restante (7) a quantidade foi insuficiente para uma reação. Das 68 amostras da
Região de São Joaquim um grupo de 7 amostras não apresentou uma quantidade
de 20 ng, sendo que destas 5 foram insuficiente e 2 apresentaram DNA de baixa
qualidade. Nas amostras de Florianópolis (12) apenas os porta-enxertos Paulsen
1103 e Gravesac apresentaram quantidades insuficientes de DNA, sendo
impossível à leitura.
A quantificação e a concentração do DNA extraído das amostras de videira
encontram-se no ANEXO 2.
60
No geral, os produtos obtidos da extração do DNA das amostras de videira
apresentaram-se de boa qualidade e quantidade (ANEXO 2), livres de
polissacarídeos e proteínas, dessa forma prontos para as reações de PCR.
De acordo com os dados de quantificação e qualidade do produto de
extração, foi observada uma variação entre 20 a 200 ng/µl de DNA. Esta
quantidade de DNA extraída está dentro da faixa esperada quando se utiliza este
protocolo para a videira (Doyle & Doyle, 1990; Constantini et al., 2005). Além
disso, a concentração de DNA das amostras analisadas é alta quando comparada
a outros procedimentos utilizados para extração de DNA de videira como os
apresentados por Bourquin et al. (1991), de 5 a 20 ng DNA/µl; Collins & Symons
(1992), de 10 a 30 ng DNA/µl; Thomas et al. (1993), de 25 a 150 ng DNA/µl. A
extração pelo método de Doyle e Doyle (1990) está sendo bastante utilizada em
frutíferas, como maracujazeiro (Aukar et al., 2001), cajueiro e mamoeiro (no prelo
– experimentos em andamento no LBPM).
Para algumas amostras (42) o método de extração não foi eficiente. Tal fato
pode ser devido tanto a problemas relacionados a manualidade no processo de
extração em si (dificuldades na recuperação do sobrenadante, perda de pellet, etc)
ou ao material vegetal utilizado. A extração de DNA de videira é bastante delicada,
devido à presença de contaminantes, tais como: polifenóis e polissacarídeos,
encontrados principalmente no tecido foliar maduro, apresentando dificuldade de
extração destes de um DNA de boa qualidade (Sefc et al., 2001; Silva, 2005).
Estes compostos também foram relatados como causadores de dificuldade na
purificação do DNA em outras espécies de plantas, os polissacarídeos (Murray &
Thompson, 1980; Fang et al., 1992) e os compostos polifenólicos (Couch & Fritz,
1990; Collins & Symons, 1992). Estes compostos, freqüentemente, estão ausentes
ou encontram-se em baixas concentrações, em folhas jovens e em sementes ou
pólen (Mitton et al., 1979, citado por Mazza et al., 2000).
Para Mauro et al. (1992) e Lodhi et al. (1994) os tecidos foliares em
desenvolvimento são os melhores materiais para se obter um DNA de boa
qualidade.
61
Cabe salientar que o material vegetal utilizado para extrair o DNA das
amostras de São Joaquim foram ramos. Das 68 amostras desta região 5
obtiveram quantidades de DNA insuficiente e 2 apresentaram o DNA de baixa
qualidade. Estas amostras de tecido lenhoso apresentaram menor viscosidade do
que as demais amostras de tecido foliar. Conforme Thomas et al. (1993) o tecido
lenhoso de videira apresenta menos polifenóis. Estes autores obtiveram
quantidades de 50 a 100 ng de DNA utilizando como material vegetal o tecido
lenhoso. Outros autores tais como: Vignani et al. (1996), Bowers et al. (1999),
Zulini et al. (2005) também obtiveram um DNA de boa qualidade e quantidade
utilizando tecido lenhoso para extração.
6.2- Genotipagem com multiplex de microssatélites
Neste trabalho, cinco painéis de marcadores microssatélites (painel
multiplex-seqüenciador) constituídos por 10 marcadores marcados com
fluorescência foram utilizados para a genotipagem semi-automática de 246
amostras de videira em seqüenciador de DNA ABI 3100 (Applied Biosystems). A
genotipagem semi-automática destes cinco painéis múltiplos de marcadores
microssatélites fluorescentes está representada na Figura 3. A separação dos
fragmentos microssatélites foi realizada utilizando o programa GeneScan versão
3.7 (Applied Biosystems). O arquivo gerado pelo programa Genescan permitiu a
análise no programa Genotyper 3.0 dos eletroferogramas (Figuras 4 e 5) de cada
loco com a determinação dos tamanhos dos alelos em pares de base (bp). Os
dados gerados pelos eletroferogramas foram então transferidos para uma Tabela
excel, e a partir daí se deu início a construção do banco de dados.
Para os autores Sefc et al. (2001); This et al. (2004) e Constantini et al.
(2005) está técnica que utiliza painéis de microssatélites marcados com
fluorescência e genotipados em seqüenciador de DNA é a mais eficaz em relação
àquelas baseadas em PAGE/coloração com prata ou resolução em agarose
corada com brometo de etídio. A grande vantagem é a maior quantidade de
informação genotípica em cada gel analisado pela a possibilidade de analisar o
62
produto de várias PCRs ou o produto da PCR de vários primers simultaneamente.
Outra vantagem desse sistema de genotipagem é a significante melhoria da
determinação do tamanho dos alelos, pois uma variedade “standart” é genotipada
junto com as amostras a serem analisadas como referência/padrão. Neste
trabalho utilizamos como “standard” a variedade Chardonnay por ela ter o seu
perfil alélico conhecido, permitindo assim a comparação do tamanho dos alelos
com outros germoplasmas (Grape Microsatellite Collection:
http://www.ismaa.it/areabioav/gmc.html; Greek Vitis Database:
http://www.biology.uch.gr/gvd; Swiss Vitis Microsatellite Database – SVMD:
http://www.unine.ch/nccr/svmd/; e GENRES: http://www.genres.de/eccdb/vitis/).
Vários estudos de caracterização e identificação de variedades de videira
foram realizados utilizando-se esta técnica por Grando et al. (1998, 1999, 2000ª,
2000b, 2000c). Constantini et al. (2005) caracterizaram 114 amostras de videira da
Campania-Itália, em uma semana, utilizando 8 marcadores SSRs marcados com
fluorescência organizados em 4 painéis. Pinto-Carnide et al. (2003) reportaram o
uso de 6 marcadores SSR marcados com fluorescência organizados em 2 painéis
para a caracterização de 12 variedades de videira (Vitis vinifera L.) do Norte de
Portugal. Neste trabalho, a combinação dos pares de primers foi feita de forma tal
a acomodar a análise de variedades geneticamente diferentes, permitindo um
método robusto e flexível para a identificação de variedades de videira.
Neste trabalho, como se utilizou um grande número de amostras (n=246),
esta técnica nos permitiu a ampliação simultânea de vários locos na mesma
reação, reduzindo o tempo, trabalho e custo da genotipagem. Além disso, a
utilização de seqüenciador automático combinado com os primers marcados com
fluorescência permitiu uma genotipagem rápida e precisa das variedades
coletadas em Santa Catarina.
63
Figura 3. Eletroferograma mostrando o genótipo da variedade Standard com 10 marcadores
microssatélites analisados com 5 painéis múltiplos. Laboratório de Genética Molecular, IASMA,
Trento.
64
Tamanho do alelo
(bp)
Variedade
224 : 234Merlot (SJ16)
224 : 230Syrah (SJ15)
230 : 238C.Sauvignon
(SJ14)
230 : 238C.Sauvignon
(SJ13)
226 : 236Pinot Noir
(SJ12)
224 : 234Merlot CL 843
(SJ11)
230 : 238C.Sauvignon
CL 338 (SJ10)
234 : -Bordô (NT9)
232 : 236Chardonnay
Figura 4. Exemplo de eletroferograma - perfil genético do loco VVMD5. O primeiro perfil genético
corresponde ao tamanho dos fragmentos da variedade Standard (Chardonnay). O eixo horizontal
representa as estimativas do tamanho em pares de bases e o eixo vertical indica a intensidade de
fluorescência medida pelo seqüenciador de DNA ABI Prism. Laboratório de Genética Molecular,
IASMA, Trento.
65
Fig 5. Eletroforese capilar (ABI 3100) dos fragmentos de DNA amplificados com os primers VVS2, VVMD5,
VVMD7, VVMD25, VVMD27, VVMD28, VVMD31, VVMD32, VRZAG62 e VRZAG79 das variedades
estudadas. O eixo horizontal representa as estimativas do tamanho em pares de bases e o eixo vertical indica
a intensidade de fluorescência medida pelo seqüenciador de DNA ABI Prism. Laboratório de Genética
Molecular, IASMA, Trento.
6.3- Perfil Genético e Identificação das Variedades
Das 246 amostras de videira genotipadas nos 10 locos microssatélites, 176
amplificaram com sucesso em todos os locos utilizados, 3 amplificaram com 9, 1
com 8 e 1 com 7 e o restante (n=65) amplificou menos de 6 locos ou não
amplificou (ANEXO 3).
No caso de ausência de amplificação, tentou-se otimizar as condições da
PCR, incluindo aumento ou redução da temperatura de anelamento, ajuste da
66
concentração de MgCl
2
, dos primers ([F] e [R]) e da água mili-Q. Apesar dos
ajustes, em alguns casos não foi observada amplificação. Esta ausência de
amplificação pode ser explicada pela qualidade do DNA extraído, uma vez que
nem sempre se consegue extrair a molécula de DNA íntegra. Como já relatado
anteriormente a extração do DNA da videira é bastante delicada, devido à
presença de contaminantes, como polifenóis e polissacarídeos, encontrados
principalmente no tecido foliar maduro, sendo difícil a extração de um DNA de boa
qualidade (Sefc et al., 2001; Silva et al., 2005).
As amostras que amplificaram em menos de 6 locos SSRs (n=65) ou não
amplificaram foram desconsideradas para as demais etapas deste trabalho, pois
pouco ou nenhum dado referente ao tamanho dos alelos foi suficiente para
identifica-lás com segurança. As demais amostras que amplificaram com 10
(n=176), 9 (n=3), 8 (n=1) e 7 (n=1) locos foram identificadas, totalizando assim 181
amostras identificadas a partir do tamanho dos alelos.
Na caracterização genética de videira diversos autores e banco de dados
on line (Dettweiler et al., 2000b; This et al., 2003, 2004; Swiss Vitis Microsatellite
Database – SVMD: http://www.unine.ch/nccr/svmd/; e GENRES:
http://www.genres.de/eccdb/vitis/) recomendam o uso de 6 locos microssatélites
(VVS2, VVMD5, VVMD2, VVMD27, VrZAG62 e VrZAG79) com 97,5% de
probabilidade de segurança na identificação varietal.
Neste trabalho utilizou-se 10 marcadores microssatélites, incluindo os 6
locos citados acima mais 4 outros amplamente utilizados na genotipagem da
videira, no sentido de aumentar o polimorfismo, reduzir a probabilidade de falsa
identificação e elevar o grau de confiabilidade do teste. Para Thomas et al. (1993);
Bowers et al. (1996, 1999b) e Sefc et al. (1999) estes 10 locos microssatélites
possuem elevado grau de polimorfismo e poder de discriminação genética, sendo
capazes de caracterizar e identificar variedades de videira.
A maioria das amostras analisadas (n=181) pôde ser caracterizada e
identificada geneticamente (70%), com exceção daquelas amostras em que
menos de 6 locos amplificaram (27,5%).
67
A análise e a comparação dos alelos revelados nos 10 locos microssatélites
nas 181 variedades de videira identificadas permitiram: 1) verificar se o material
identificado com o mesmo nome em regiões diferentes correspondia realmente ao
mesmo material genético; 2) verificar casos de sinônimos; 3) verificar a presença
de variabilidade intravarietal; e 4) identificar algumas amostras onde não era claro
a origem genética.
6.3.1- Comparação do perfil genético das variedades coletadas em Santa
Catarina entre si
Num primeiro momento comparou-se o perfil genético das 181 amostras
entre si para verificar se as amostras identificadas com o mesmo nome
correspondiam realmente à mesma variedade. Isto foi possível, pois algumas
amostras identificadas como o mesmo nome foram coletadas mais de uma vez na
mesma região ou em regiões diferentes. A seguir são relatadas por região o
número de amostras que foram coletas e identificadas, os erros de identificação,
as variedades identificadas com nomes diferentes e que após a caracterização
revelaram o mesmo perfil genético, a identificação de amostras de origem
genética desconhecida e a variabilidade intravarietal. Nos itens 6.3.2, 6.3.3, 6.3.4,
6.3.5 e 6.3.6 estes casos estão relatados mais detalhadamente. As demais
amostras identificadas que não estão citadas abaixo apresentaram o mesmo perfil
genético das variedades de origem (Tabela 6).
Na região de Nova Trento foram coletadas 9 amostras, deste total (n=9) 6
variedades foram identificadas e 3 ficaram sem identificação, pois não
amplificaram em nenhum loco microssatélite. Das variedades identificadas
verificou-se que a Bordô e a Gran D’Oro apresentaram o mesmo perfil genético. A
amostra (NT4) de origem genética desconhecida também foi caracterizada e
identificada como sendo a variedade Tinturina, apresentando o mesmo perfil
genético qua a variedade Tinturina de Urussanga.
Para a Região de Urussanga 37 amostras foram coletadas, sendo a maioria
dos acessos da variedade Goethe. Verificou-se que o número de variedades com
68
perfil genético definido foram 34 e que todas as variedades de Goethe (Clássica e
Primo) possuem o mesmo genótipo, assim como a amostra Clone GP (U52) de
origem não conhecida até aquele momento. Outra amostra de origem
desconhecida, denominada de São João, apresentou perfil genético idêntico as
amostras (U45, U49 e U54), todas as três amostras de variedade Bordô. A
amostra (U26) denominada de Família Moscatel também foi caracterizada e
identificada como pertencente ao grupo da variedade Itália, pois seu genótipo
mostrou-se igual ao das variedades da uva Itália de São Joquim, Campos Novos e
Videira. As amostras (U49 e U54), ambas Gran D’Oro apresentaram o mesmo
perfil genético da Bordô (U45).
Na Região de Rodeio foram coletadas 22 amostras, sendo que apenas 10
foram identificadas. Destas, 2 amostras de origem genética não conhecida (R16 e
R18) foram caracterizadas e posteriormente identificadas. A amostra (R16)
denominada de Bizaraqui revelou perfil genético idêntico ao das variedades Isabel
de Campos Novos e Nova Trento, e a amostra R18 (Uva pêra ou Moscatel) foi
identificada como sendo a variedade Goethe. A amostra R12 denominada como
Trincadeira apresentou o mesmo perfil genético que a variedade Pinot Noir de
Campos Novos (CN26), demonstrando ser um característico erro de introdução. A
amostra R21 (Bordô) diferiu apenas no loco VVMD31 das demais variedades de
Bordô analisadas neste trabalho, demonstrando ser, possivelmente, uma nova
mutação da Bordô. A amostra Isabel (R10), não apresentou nenhum alelo em
comum nos 10 locos microssatélites com as variedades Isabel de Campos Novos,
Nova Trento e Rodeio, demonstrando ser outra variedade e, portanto, identificada
de forma incorreta. Já a amostra (R13), Merlot CL R3, apresentou o mesmo
genótipo da variedade Merlot de origem.
No Meio-Oeste Catarinense (Água Doce, Campos Novos, Tangará e
Videira) foram coletadas 98 amostras de videira, destas 75,5% amplificaram com
os 10 marcadores microssatélites.
Em Água Doce foram identificadas 24 amostras (67,7%) das 34 coletadas.
A amostra (G6) de origem genética desconhecida foi identificada como a
variedade Malbec, pois o seu genótipo foi idêntico ao da Malbec coletada em São
69
Joaquim e Videira. As amostras (AD23 e AD2) clones da variedade Chardonnay
apresentaram o mesmo genótipo da variedade de origem. A amostra (AD12)
Cabernet Franc VCR 80, também apresentou o mesmo genótipo da variedade de
origem. A Pinot Noir (AD25) apresentou genótipo similar às demais Pinot diferindo
apenas no loco VVS2. A variedade denominada até então de Trincadeira (AD36)
apresentou perfil genético igual ao da amostra Viognier de Videira. O clone
Nebiollo 111 (AD16) apresentou o mesmo genótipo da variedade Nebiollo de São
Joaquim (SJ32).
Em Campos Novos foram coletadas 43 amostras e 93% delas foram
identificadas. As amostras CN32 (clone de Cabernet Sauvignon), CN33 e CN36
(clones de Merlot) todas diferiram das suas respectivas variedades apenas no loco
VVMD28. Os demais clones de Cabernet Sauvignon (CN42, CN8, CN23, CN27 e
CN29) e de Merlot (CN43) apresentaram o mesmo perfil das suas respectivas
variedades. As amostras CN4 (Itália Export), CN13 (Itália Koga), CN9 (Rubi Itália),
CN22 (Red Meire) e CN18 (Benitaka) apresentam o mesmo perfil genético da
variedade Itália (CN3, V25, SJ35). Como já relatado anteriormente, a Gran D’Oro
(CN16) também apresentou o seu genótipo igual ao da variedade Bordô. As 2
amostras de Niágara (Branca-CN19 e Rosada-CN7) também apresentaram os
mesmo tamanhos de alelos nos 10 locos. As amostras Moscato Giallo (CN17),
Moscato Embrapa (CN30) e Lorena (CN5) apresentaram o mesmo perfil genético,
caracterizando um erro de introdução.
Da Região de Tangará e Videira foram coletadas 21 amostras, sendo que
52,4% delas foram identificadas. De Videira, as amostras Brasil (V14) e Red Meire
(V20) apresentaram o mesmo perfil genético que a variedade Itália.
Na Região de São Joaquim foram coletadas 68 amostras, sendo que 48
(70,6%) foram identificadas e 20 (20,4%) não foram possíveis de identificar, pois
pouco ou nenhum loco amplificou. A maioria das amostras coletada nesta região
foi de variedades pertencentes à espécie Vitis vinifera, principalmente a variedade
Cabernet Sauvignon. Esta variedade, seus clones e as amostras SJ13 e SJ14
(ambas de origem genética desconhecida até o momento) todas apresentaram o
mesmo perfil genético, com exceção da amostra SJ45 que diferiu apenas no loco
70
VVS2 das demais. A amostra SJ1 (Pinot Noir) apresentou o mesmo perfil genético
da variedade Cabernet Sauvignon caracterizando um erro de introdução. A
amostra SJ12 de origem genética desconhecida foi identificada como sendo a
variedade Pinot Noir e as amostras SJ15 e SJ17 também de origens
desconhecidas como sendo a variedade Syrah. Esta amostra SJ17 diferiu apenas
no loco VVMD31 das demais amostras de Syrah. A amostra SJ51 (Trincadeira)
apresentou o mesmo genótipo da variedade Pinot Noir de Campos Novos, erro de
introdução também verificado na Região de Rodeio com amostra (R12). A amostra
SJ50 (Tinta Roriz) apresentou o genótipo igual ao das variedades Tempranillo
(CN37, AD29 e SJ5) coletadas neste trabalho. Todos os clones de Merlot (SJ11,
SJ22 e SJ28) apresentaram o mesmo genótipo da variedade Merlot.
6.3.2- Agrupamento das amostras por perfil genético
Após, está primeira etapa as amostras que amplificaram nos 10, 9, 8 e 7
locos microssatélites (181) foram agrupadas por perfil genético, ou seja, as
amostras que apresentavam perfil genético similar foram agrupadas e separadas
das demais. Destas 181 amostras identificadas, 68 genótipos foram distintos,
gerando perfis genéticos únicos nesses 10 locos microssatélites, ou seja, 68
variedades diferentes foram identificadas. A Tabela 6 mostra o tamanho dos
alelos das 181 amostras identificadas neste trabalho, agrupadas pelo perfil
genético.
71
Tabela 6. Tamanho dos alelos (bp) em 10 locos das 181 variedades de Vitis sp. identificadas neste estudo, agrupadas por perfil genético.
CCA/UFSC, Florianópolis-SC, 2007.
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Chardonnay CL R8
AD2 132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211
---
a
240 272
Chardonnay CL 95
AD23 132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211
---
a
240 272
Chardonnay
SJ3 132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211
---
a
240 272
Chardonnay
SJ43 132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211
---
a
240 272
Cabernet Franc VCR 80 AD12 134 142 224 238 239 263 177 185 192 202 247 259 240 256 227 235 203 213 240 258
Cabernet Franc
AD15 134 142 224 238 239 263 177 185 192 202 247 259 240 256 227 235 203 213 240 258
Cabernet Franc
SJ24 134 142 224 238 239 263 177 185 192 202 247 259 240 256 227 235 203 213 240 258
Sangiovese
AD20 128 128 224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242 242 233 243 209 209 252 256
Sangiovese CN28 128 128 224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242 242 233 243 209 209 252 256
Sangiovese
SJ20 128 128 224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242 242 233 243 209 209 252 256
Sangiovese
SJ44 128 128 224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242 242 233 243 209 209 252 256
Sangiovese
R6 128 128 224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242 242 233 243 209 209 252 256
Teroldego
SJ21 132 152 224 226 239 247 181
---
a
192
---
a
243 255 240 242 227 235 209 213 240 262
Teroldego
R14 132 152 224 226 239 247 181
---
a
192
---
a
243 255 240 242 227 235 209 213 240 262
Catawba
U7 118 130 238 238 235 247 165 181 192 200 239 247 242 256 229
---
a
201 209 246 272
Catawba
U14 118 130 238 238 235 247 165 183 192 200 239 247 250 256 229
---
a
201 209 246 272
72
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Cabernet Sauvignon CL 341 CN42 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 337 CN8 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL R5 CN23 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 685 CN27 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 170 CN29 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
* Cabernet Sauvignon CL 169 CN32 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 235 237* 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 339 CN40 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CS 18A
SJ4 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 015
SJ9 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 338
SJ10 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 685
SJ23 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 339
SJ25 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 169
SJ26 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 343
SJ29 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL R5
SJ30 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 107
SJ31 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 239 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon CL 337
SJ33 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
* Cabernet Sauvignon
SJ45 136* 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon
SJ47 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Cabernet Sauvignon
SJ38 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Quadra 6 Clone A
SJ13 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Quadra 5 Clone B SJ14 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
Pinot Noir SJ1 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
---
a
73
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
G6
AD14 128 146 226 238 239 263 185 187 186 200 245 259 240 250 233
---
a
207 209 240 252
Malbec CN39 128 146 226 238 239 263 185 187 186 200 245 259 240 250 233
---
a
207 209 240 252
Malbec
SJ27 128 146 226 236 239 263 185 187 186 200 245 259 240 250 233
---
a
207 209 240 252
Malbec V7 128 146 226 238 239 263 185 187 186 200 245 259 240 250 233
---
a
207 209 240 252
* Merlot CL5 CN33 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 233 235* 209 213 240 240
* Merlot CL343 CN36 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 233 235* 209 213 240 240
Merlot CL181 CN38 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
Merlot
SJ7 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
Merlot CL 843
SJ11 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
Merlot SJ16 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
Merlot CL 343
SJ22 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
Merlot CL181
SJ28 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
Merlot
SJ41 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
Merlot CL R3
R13 134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
Sauvignon Blanc
AD30 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
Sauvignon Blanc
AD32 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
Sauvignon Blanc CN25 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
Sauvignon Blanc
SJ2 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
Sauvignon Blanc
SJ36 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
74
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Montepulciano
R22 128 140 224 226 249
---
a
185 191 188 198 251
---
a
240
---
a
233 243 207 209 258 272
Montepulciano CN24 128 140 224 226 249
---
a
185 191 188 198 251
---
a
240
---
a
233 243 207 209 258 272
Montepulciano
AD28 128 140 224 226 249
---
a
185 191 188 198 251
---
a
240
---
a
233 243 207 209 258 272
Syrah CN43 128 128 224 230 239 239 185 187 186 192 245 251 242 242 217 227 209 213 240 272
Syrah
SJ6 128 128 224 230 239 239 185 187 186 192 245 251 242 242 217 227 209 213 240 272
Syrah
SJ48 128 128 224 230 239 239 185 187 186 192 245 251 242 242 217 227 209 213 240 272
Quadra 5 fila 28 SJ15 128 128 224 230 239 239 185 187 186 192 245 251 242 242 217 227 209 213 240 272
* Quadra 7 fila 23
SJ17 128 128 224 230 239 239 185 187 186 192 245 251 242 242 217 227 213 217* 240 272
* Pinot Noir
AD25 132 150* 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213 213 240 272
Pinot Noir CN26 132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213 213 240 272
Quadra 7 fila 14 SJ12 132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213 213 240 272
Trincadeira
SJ51 132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213 213 240 272
Trincadeira
R12 132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213 213 240 272
Tempranillo CN37 138 140 234
---
a
239 253 179
---
a
194 198 247 251 242 254 227 233 207 209 250
---
a
Tempranillo
SJ5 138 140 234
---
a
239 253 179
---
a
194 198 247 251 242 256 227 233 207 209 250
---
a
Tempranillo
AD29 138 140 234
---
a
239 253 179
---
a
194 198 247 251 242 256 227 233 207 209 250
---
a
Tinta Roriz
SJ50 138 140 234
---
a
239 253 179
---
a
194 198 247 251 242 256 227 233 207 209 250
---
a
Concord Precoce CN20 120 128 234
---
a
235 241 181
---
a
200 204 247 259 240
---
a
229 243 185 199 250 272
Concord CN21 120 128 234
---
a
235 241 181
---
a
200 204 247 259 240
---
a
229 243 185 199 250 272
75
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Itália CN3 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Itália Export CN4 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Itália Koga CN13 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Itália
V25 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Itália
SJ35 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Rubi Itália CN9 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Brasil
V14 128 144 230 238 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Red Meire CN22 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Red Meire
V20 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Benitaka CN18 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 254 233 243 209 211 252 272
Familia Moscatel
U26 128 144 230 236 239 263 175 181 192 194 255 257 240 254 233 243 209 211 252 272
* Bordô
R21 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
240
---
a
225 229 209* 213 248
---
a
Bordô
NT9 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
240
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Gran D’ Oro
U54 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
242
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Gran D’ Oro
U49 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
242
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Bordô
U45 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
240
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Gran D’ Oro
CN16 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
242
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Bordô
CN6 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
240
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Gran D’ Oro
NT6 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
240
---
a
225 229 201 213 248
---
a
São João
U51 118 130 234
---
a
235 249 179 181 200 202 247
---
a
242
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Moscato Giallo CN17 128 138 226 238 239 249 175
---
a
184 186 249 255 240 256 235 245 207
---
a
258 272
Moscato Embrapa CN30 128 138 226 238 239 249 175
---
a
184 186 249 255 240 256 235 245 207
---
a
258 272
Lorena CN15 128 138 226 238 239 249 175
---
a
184 186 249 255 240 256 235 246 207
---
a
258 272
76
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Goethe Clássica
U1 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Primo
U3 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U6 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U9 120 130 230 236 235 247 181 183 186 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U11 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U17 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Primo
U21 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U22 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U28 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Primo
U47 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Primo
U48 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U50 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Clone GP
U52 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U53 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Uva pêra ou Moscatel
R18 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Niágara Rosada CN7 118 128 234
---
a
235 241 175 181 200 202 237 259 240
---
a
229 235 201
---
a
248 272
Niágara Branca CN19 118 128 234
---
a
235 241 175 181 200 202 237 259 240
---
a
229 235 201
---
a
248 272
Niágara Branca
NT2 118 128 234
---
a
235 241 175 181 200 202 237 259 240
---
a
229 235 201
---
a
248 272
Isabel
CN10 118 146 236
---
a
235 249 175 179 200 202 237 247 240 250 225 235 201 213 248 272
Isabel Precoce
CN14 118 146 236
---
a
235 249 175 179 200 202 237 247 240 250 225 235 201 213 248 272
Isabel
NT5 118 146 236
---
a
235 249 175 179 200 202 237 247 240 250 225 235 201 213 248 272
Bizaraqui
R16 118 146 236
---
a
235 249 175 179 200 202 237 247 240 250 225 235 201 213 248 272
77
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Marta
R15 120 146 234 236 235 249 179 181 200 202 247 264 250
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Marta
NT3 120 146 234 236 235 249 179 181 200 202 247 264 250
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Marta
U19 120 146 234 236 235 249 179 181 200 202 247 264 250
---
a
225 229 201 213 248
---
a
Viognier
V1 128 134 224 230 239 249 181 187 186 198 251
---
a
240 242 215 243 209
---
a
262 272
Trincadeira
AD36 128 134 224 230 239 249 181 187 186 198 251
---
a
240 242 215 243 209
---
a
262 272
BRS Morena CN2 130
---
a
234 236 239 249 175
---
a
186 194 255 257 240 256 217 233 209 213 264 272
BRS Morena
V21 130
---
a
234 236 239 249 175
---
a
186 194 255 257 240 256 217 233 209 213 264 272
Alphonse Lavallée CN5 128 130 224 236 249 255 181
---
a
184 202 239 251 240 256 243
---
a
207 213 252 272
Alphonse Lavallée
V18 128 130 224 236 249 255 181
---
a
184 202 239 251 240 256 243
---
a
207 213 252 272
Alphonse Lavallée
SJ39 128 130 224 236 249 255 181
---
a
184 202 239 251 240 256 243
---
a
207 213 252 272
Primitivo
SJ62 128 138 224 234 247 249 177
---
a
198 202 237 259 240
---
a
247 257 209 211 256 264
Primitivo
SJ46 128 138 224 234 247 249 177
---
a
198 202 237 259 240
---
a
247 257 209 211 256 264
Gewstraminer
AD9 146
---
a
230 238 243 257 185
---
a
186 192 245 251 250
---
a
233 235 201 213 240 272
Gewstraminer
SJ42 146
---
a
230 238 243 257 185
---
a
186 192 245 251 250
---
a
233 235 201 213 240 272
Nebiollo Cl 111
AD16 152
---
a
230 234 247 249 181 185 192 198 243 251 240 242 235
---
a
209
---
a
240 262
Nebiollo
SJ32 152
---
a
230 234 247 249 181 185 192 198 243 251 240 242 235
---
a
209
---
a
240 262
Tinturina
U23 128 156 232 264 239 253 185
---
a
186 192 245 257 240 266 217 235 203 211 240
---
a
1 planta só ( sem identificação)
NT4 128 156 232 264 239 253 185
---
a
186 192 245 257 240 266 217 235 203 211 240
---
a
78
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Fantasya
U12 130 148 232 236 239 249 189 ---
a
184 190 257 259 224 254 243 ---
a
209 213 252 272
Isabel
R10 120 136 234 ---
a
235 241 179 181 200 ---
a
247 259 242 ---
a
225 229 201 ---
a
252 ---
a
Ancellota R2
AD7 128 152 230 ---
a
239 263 181 185 192 ---
a
245 247 242 ---
a
235 245 209 213 240 272
Gros Manseng
AD8 134 ---
a
232 238 237 239 185 ---
a
192 ---
a
251 ---
a
240 250 227 233 213 ---
a
240 ---
a
Villenave AD11 122 128 230 232 237 249 177 185 182 ---
a
X
X X
X X X X X X X
Castelão
AD21 138 140 234 236 243 257 177 ---
a
186 ---
a
247 251 242 256 235 ---
a
201 207 252 ---
a
Refosco
AD22 128 ---
a
224 230 239 247 177 185 192 ---
a
251 259 242 256 233 ---
a
209 213 250 262
Tannat
AD24 138 152 236 238 249 --
a
181 185 192 198 239 251 256 ---
a
233 ---
a
209 ---
a
240 256
Marzemino
AD26 128 ---
a
224 230 239 263 181 185 186 202 243 251 240 256 233 235 209 213 240 262
Mourvedre
AD33 128 146 224 238 249 ---
a
185 ---
a
186 202 251 261 240 262 241 257 203 209 240 256
Carmenere
AD17 134 142 224 238 239 263 171 185 186 202 247 ---
a
240 256 235 249 203 207 240 ---
a
Touriga Nacional
AD18 138 146 224 234 239 ---
a
177 185 186 192 245 ---
a
246 252 233 267 201 213 240 272
Touriga Francesa
AD4 138 146
X X
239 243 177 ---
a
190 ---
a
X
X
240 ---
a
241 ---
a
213 ---
a
240 272
79
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Gamay
AD34 128 132 232 238 239 249 177 185 192 202 243 245 240 --
a
241 ---
a
211 ---
a
240 272
BRS Clara CN1 128 130 224 236 239 253 175 191 186 ---
a
247 255 240 ---
a
217 225 209 213 252 272
BRS Linda CN12 130 146 234 236 239 249 191 ---
a
186 202 247 257 254 ---
a
217 233 213 217 248 252
Poloeske Muskataly CN11 138 ---
a
230 234 237 243 177 ---
a
178 186 255 ---
a
240 250 233 243 207 211 257
---
a
BRS Rubea CN31 118 ---
a
234 ---
a
241 249 181 ---
a
200 202 247 259 240 254 229 ---
a
201 213 248 272
Marselan
V5 134 140 224 230 243 247 175 191 190 202 255 257 240 242 233 243 203 207 240 ---
a
Alicante Bouschet V6 128 140 224 ---
a
X X 179 191 186 ---
a
243 257 X X X X 209 ---
a
250 272
Petit Verdot
V2 138 152 224 230 239 263 175 185 192 202 239 247 250 256 217 235 209 213 240 ---
a
Barbera
SJ34 128 130 224 ---
a
249 253 181 185 190 198 243 259 240 ---
a
233 239 209 ---
a
252 272
Riesling Renano
SJ37 138 146 224 232 249 257 177 185 192 202 243 245 250 256 227 233 201 211 252 272
Magic Black
SJ40 130 ---
a
224 234 249 ---
a
181 ---
a
184 ---
a
251 255 256 ---
a
243 253 209 213 252 272
Vidal Blank
U2 128 146 226 230 237 247 177 185 184 186 251 259 238 --
a
233 243 201 211 256 272
Centenial Seedless
U5 130 ---
a
236 238 239 ---
a
175 --
a
178 192 245 261 240 --
a
217 235 209 213 264 272
Muscat de Alexandria
V22 133 149 228 232 249 251 ---
a
---
a
185 203 246 254 253 253 247 271 216 244 265 273
80
Tabela 6. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
Prima
U15 128 130 224 234 243 249 177 181 184 187 251 259 224 243 217 244 201 213 263 272
Ora
U18 128 130 224 234 239 249 181 187 186 198 251 259 242 255 217 244 201 213 263 272
Vilamar
U20 128 140 236 242 239 249 175 191 186 194 259 261 242 256 229 243 201 ---
a
252 272
Regente
U24 128 150 224 236 243 247 175 191 190 202 251 259 238 266 233 257 199 209 240 272
Cristal
U27 138 148 238 ---
a
235 257 179 191 186 200 237 247 238 248 225 233 201 209 248 252
VR 043-43
U33 138 142 226 248 235 249 181 191 200 202 247 264 248 266 243 ---
a
203 209 244 272
101-14
U35 132 140 250 264 239 251 181 185 186 192 259 261 238 252 213 243 197 209 236 238
Paulsen 1103
U37 132 144 234 264 257 265 181 183 190 204 239 247 236 246 X X 201 209 260 ---
a
SO4
U38 140 144 234 ---
a
239 253 185 ---
a
186 192 245 257 238 246 251 ---
a
X X 260 ---
a
Pesc 2
U40 134 136 262 ---
a
251 --
a
185 207 190 202 255 257 238 --
a
235 241 197 203 238 246
Gravesac
U29 136 158 262 264 245 251 183 207
188
190
257
---
a
238 --
a
239 ---
a
197 ---
a
266 ---
a
IAC 313 ‘ Tropical’ U4 132 138 238 ---
a
245 251 183 207 188 190 257 ---
a
240 ---
a
219 253 203 209 240 ---
a
IAC 766 ‘Campinas’ U8 128 132 230 236 235 ---
a
195 203 198 ---
a
243 255 240 ---
a
213 251 197 ---
a
238
---
a
Red Globe
U13 130 146 234 236 239 249 177 --- a
184 186 247
259
250 256 257
---
a 207
---
a 252 272
* em negrito (variabilidade Intravarietal); X: não amplificou;
a
: O “---“ símbolo indica que a variedade pode ser ou homozigota ou heterozigota com alelo nulo
63
6.3.3- Comparação com os perfis genéticos de bancos de dados online e dados
da literatura internacional
A etapa sucessiva consistiu em comparar os perfis genéticos encontrados com
aqueles das variedades disponibilizadas em bancos de dados online (Grape
Microsatellite Collection: http://www.ismaa.it/areabioav/gmc.html; Greek Vitis Database:
http://www.biology.uch.gr/gvd; Swiss Vitis Microsatellite Database – SVMD:
http://www.unine.ch/nccr/svmd/; e GENRES: http://www.genres.de/eccdb/vitis/) e com
dados da literatura internacional. Os perfis genéticos encontrados em ‘database’ ou na
literatura internacional nem sempre se mostraram idênticos aos das varieadades deste
trabalho. Foram observadas em alguns casos diferenças de um a seis pares de bases e
que se um alelo era maior, por exemplo, em 2 pares de bases o outro também era
existindo uma coerência dentro do mesmo loco. Segundo This et al. (2004), estas
diferenças no tamanho dos alelos são normais, pois nos laboratórios são utilizados
diferentes métodos e equipamentos. Na maioria dos casos, o incremento foi de 2 pares
de bases, estando de acordo com a natureza dinucleotídea destes marcadores
(Thomas et al., 1993; Bowers et al., 1996, 1999b; Sefc et al., 1999). A magnitude da
diferença variou conforme o loco microssatélite.
Em alguns casos não foi possível fazer a comparação dos 10 locos
microssatélites, visto que a maioria dos ‘database’ online e dados da literatura utilizam
de 6 a 8 locos para a caracterização e identificação genética das variedades de videira
(Dettweiler et al., 2000b; This et al., 2003, 2004; Swiss Vitis Microsatellite Database –
SVMD: http://www.unine.ch/nccr/svmd/; e GENRES: http://www.genres.de/eccdb/vitis/).
No nosso trabalho utilizou-se 10 marcadores microssatélites, incluindo os 6 locos mais
recomendados para a caracterização e identificação das variedades de videira (VVS2,
VVMD5, VVMD2, VVMD27, VrZAG62 e VrZAG79) e mais 4 outros amplamente
utilizados na genotipagem da videira (VVMD25, VVMD28, VVMD31 e VVMD32) no
sentido de aumentar o polimorfismo, reduzir a probabilidade de falsa identificação e
elevar o grau de confiabilidade do teste.
Algumas das variedades identificadas não foram encontradas nos ‘database’ e
literatura internacional, são elas: as variedades-copa Marta, Ora, Prima, BRS Morena,
Catawba, Rubia, Isabel (amostra R10, visto que seu perfil genético não foi o mesmo das
demais variedades Isabel coletadas neste trabalho), Villenave, BRS Clara, BRS Linda,
Poloeske Muskataly, Marselan, Fantasya, Regente, Vilamar, Cristal, Gros Manseng e os
porta-enxertos Pesc 2, ‘IAC 313 Tropical’ e ‘IAC 766 Campinas’. Os porta-enxertos VR
64
043-43, 101-14, Paulsen 1103 e SO4 analisados neste trabalho foram encontrados nos
‘database’ online, mas o perfil genético dos mesmos não correspondeu aos da literatura
internacional. Com relação a estes porta-enxertos, deve-se fazer um estudo mais
aprofundado, pois certamente ocorreu erro de coleta ou introdução incorreta ou troca de
material.
As variedades-copa Marta (EUA) e Catabwa (EUA) são variedades americanas
(Vitis labrusca) e não foram encontradas nos bancos de dados que apresentam
somente variedades de Vitis vinifera. No caso da variedade Isabel (R10), identificada
erroneamente como Isabel não foi encontrada nenhuma variedade com o mesmo perfil
genético.
As variedades Ora (INRA, Bordeaux, França), Prima (INRA, Bordeaux, França),
Villenave (INRA, Bordeaux, França) e Marselan (INRA, Montpellier, França) são
variedades criadas recentemente pelo Institut Nationale de Recherches Agronoimiques
(INRA, França), apresentando pouca expressão econômica e, possivelmente, não
foram ainda disponibilizadas on line.
As variedades-copa BRS Morena, BRS Clara, BRS Linda, BRS Rubea são
genótipos brasileiros desenvolvidos pela equipe de pesquisadores da Embrapa Uva e
Vinho, os porta-enxertos ‘IAC 313 Tropical’ e ‘IAC 766 Campinas’ pelo Instituto
Agronômico de Campinas (IAC) e conseqüentemente dificilmente encontraríamos o
perfil genético destas variedades em bancos de dados internacionais e na literatura
internacional. De qualquer maneira este é um aspecto muito positivo, já que estas
variedades serão pela primeira vez descritas e colocadas a disposição da comunidade
científica. O mesmo ocorre com o porta-enxerto PESC 2 que é um genótipo antigo de
uso restrito a Região de Rodeio. Este porta-enxerto é de origem desconhecida,
possivelmente, uma introdução dos Trentinos no ínicio do século XX.
Nas Tabelas 7 e 8 encontram-se as variedades e o tamanho dos alelos (bp)
encontrados em bancos de dados online e na literatura internacional. Conforme estas
tabelas verifica-se que existe diferença no tamanho dos alelos (pb) entre as variedades
identificadas com o mesmo nome. Esta diferença no tamanho dos alelos provavelmente
se deve pelo fato dos diversos laboratórios utilizarem diferentes métodos e
equipamentos para identificar e caracterizar geneticamente as amostras de DNA.
65
Tabela 7. Comparação dos perfis genéticos encontrados das variedades mais conhecidas de vitis sp. de Santa Catarina com aqueles das
variedades encontradas em bancos de dados online e dados da literatura. CCA/UFSC, Florianópolis-SC, 2007.
VARIEDADE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
a
Chardonnay
132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211 240 272
b
Chardonnay
134 140 231 235 238 241 179 186 188 195 241 243 243 259 221 231 214 216 241 273
b
Chardonnay
136 142 232 236 236 240 218 228 239 271
a
Cabernet Franc
134 142 224 238 239 263 177 185 192 202 247 259 240 256 227 235 203 213 240 258
b
Cabernet Franc
138 146 224 238 236 260 193 203 246 258 228 236 239 257
b
Cabernet Franc
136 144 222 237 238 261 176 184 194 203 245 257
b
Cabernet Franc
138 146 224 238 236 260 193 203 246 258
a
Cabernet Sauvignon
134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
b
Cabernet Sauvignon
138 150 230 238 236 236 187 193 246 246 234 236 239 239
b
Cabernet Sauvignon
175 189 237 239 206 210 241 241
a
Merlot
134 146 224 234 239 247 185 187 192 192 259 259 240 250 227 233 209 213 240 240
b
Merlot
136 149 222 233 238 245 186 191 194 194 257 257 243 253 228 234 212 216 239 239
b
Merlot
138 150 224 234 236 244 193 193 258 258
b
Merlot
151 139 236 226 247 239 191 189 195 195 259 259
a
Syrah
128 128 224 230 239 239 185 187 186 192 245 251 242 242 217 227 209 213 240 272
b
Syrah
133 133 226 232 239 239 189 191 189 195 245 251 245 245 221 231 212 216 241 273
66
Tabela 7. Continuação
VARIEDADE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
a Pinot Noir
132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213 213 240 272
b Pinot Noir
136 150 226 236 236 240 187 193 238 244 218 236 239 271
b
Pinot Noir
137 151 228 238 239 243 185 189 243 253 221 239 216 216 241 273
a
Sangiovese
128 128 224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242 242 233 243 209 209 252 256
b
Sangiovese
179 185 245 245 237 247 212 212 253 257
b
Sangiovese
133 133 226 236 239 263 193 195 242 258 259 253 237 247 212 212 253 257
b
Sangiovese
133 133 226 236 239 263 179 185 197 199 243 259 245 245 237 247 212 212 253 257
a
: Variedades de vitis sp. de Santa Catarina.
b
: Variedades de vitis sp. de Banco de dados e da literatura.
Tabela 8. Perfil genético de outras variedades encontradas no GENRES 081 (European Vitis Database) e dados da literatura. CCA/UFSC,
Florianópolis-SC, 2007.
GENRES 081 VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79
Barbera 133 135 226 250 254 185 189 192 200 244 260
Goethe 137 161 262 264 252 266 186 219 202 202 262
Muscat blanc 133 228 236 234 250 179 194 186 196 252 256
Muscat of Alexandria 133 149 228 232 250 252 179 194 186 204 248 256
Pinot Noir 137 151 228 238 240 244 185 189 188 194 240 246
Toriga Nacional 143 151 226 236 240 181 189 188 194 246
Gewstraminer 151 232 238 244 258 189 188 194 246 252
LITERATURA VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79
Barbera 128 130 224 249 253 181 185 190 198 243 259
Barbera 128 130 224 249 253 181 185 190 198 243 259
67
Tabela 8. Continuação
LITERATURA VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79
Muscat Blanc 128 226 234 233 249 175 190 184 194 251 255
Muscat of Alexandria 128 144 226 230 249 251 175 190 184 202 247 255
Toriga national 138 146 224 234 239 177 185 186 192 245
Gewstraminer 146 230 236 243 257 185 186 192 245 251
Bordo 118 130 233 234 248 180 182 200 202 246
Goethe 120 130 229 235 234 246 182 184 190 204 238 246
Tempranillo 139 141 240 254 196 200 247
Marzemino 130 222 228 237 261 183 187 194 241 249
Carmenere 135 144 222 234 237 261 173 187 188 203 245
Malbec 228 238 239 263
Sauvignon blanc 132 150 226 230 236 254 187 193 244 246
Teroldego 134 154 223 225 237 245 177 183 194 241 253
Montepulciano 130 143 223 225 247 187 191 249
Italia 132 148 230 236 240 244 254 256
Trincadeira preta 132 150 232 236 236 246 187 203 246 250
Nebiollo Lampia 154 230 234 244 246 193 199 242 250
Goethe
132 156 260 262 251 265 182 215 200 200 261
Tannat 140 154 235 237 237 247 183 187 193 199 238 249
Gamay 132 136 232 236 236 246 193 203 242 244
Vidal 142 151 227 251 259
Gravesac - Ismaa 136 158 x x 246 252 183 207 188 190 257
Gravesac - France 136 158 x x 246 252 183 207 188 190 256
101-14 - Ismaa 133 137 x x 231 257 199 213 193 209 253
101-14 - France 128 139 x x 244 252 192 202 172 188 255
Kobber 141 149 236 266 234 266 191 211 200 214 252 260
SO4 146 234 264 230 262
68
Tabela 8. Continuação
LITERATURA VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79
3309
118 250 262 245 259 181 207 179 188 254 256
Kobber
136 145 223 264 232 251 199 207 190 213 251 258
101-14
132 136 259 264 230 257 199 213 193 209 251 253
SO4
143 234 264 232 264 199 207 198 213 251 254
P1103
132 138 242 264 230 256 185 200 194 212 242 258
039-16 EUA 142 144 229 239 194 252 256
043-43 EUA 138 142 225 247 190 212 186 202 254 258
69
6.3.4- Identificação de variabilidade intravarietal
A variabilidade genética intravarietal tem sido atribuída a duas razões: (i) uma
provável origem policlonal natural (origem de seedlings distintos); (ii) um acúmulo de
mutações somáticas. Uma variedade policlonal é formada por clones relacionados, mas
diferentes, que procedem do mesmo ou de cruzamentos próximos, e o acúmulo de
mutações durante os séculos aumenta a variabilidade (Ulanovsky et al., 2002).
Neste trabaho, verificou-se a presença de variabilidade intravarietal nas amostras
que apresentaram perfil genético similar diferindo apenas em um dos 10 locos
microssatélites. Neste único loco foi observada uma mudança no tamanho dos alelos.
Esta mudança ocorreu apenas em um dos dois alelos do par de base. Estas variações
observadas no tamanho dos alelos ocorreram por meio de mutações (Crespan et al.,
2004 e Zulini et al., 2005).
Na Tabela 9 estão relacionadas estas amostras, o loco microssatélite e o
tamanho dos alelos que sofreram esta mudança.
Tabela 9. Variedades com variabilidade intravarietal e tamanho dos alelos (bp) microssatélites.
CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2007.
Variedades VVS2 VVMD28 VVMD31
Bordô* 201 213
Bordô (R21) 213
209
Pinot Noir* 132 148
Pinot Noir (AD25) 132
150
Cabernet Sauvignon* 134 146
Cabernet Sauvignon (SJ45)
136
146 233 235
Cabernet Sauvignon CL 169 (CN32) 235
237
Merlot* 227 233
Merlot CL5 (CN33) 233
235
Merlot CL 343 (CN36) 233
235
Syrah* 209 213
Syrah (SJ17) 213
217
* Variedade original.
Número em negrito: alelo mutante.
Foram encontrados sete casos de mutações: duas aumentaram o tamanho do
alelo em 2 bp, uma em 4 bp e quatro em 8 bp.
70
As amostras da variedade Bordô analisadas neste estudo apresentaram o
tamanho dos alelos no loco VVMD31 de 201:213 bp, enquanto que na amostra R21 foi
de 209:213 bp, havendo um aumento de 8 bp em um dos alelos.
O acesso AD25 (Pinot Noir) apresentou uma mutação no loco VVS2 de 132:148
para 132:150 bp (+2 bp).
Nas 17 amostras de Cabernet Sauvignon analisadas foi encontrada uma com
uma mutação no loco VVMD28 (CL 169-CN32) e 1 no loco VVS2 (SJ45). No clone 169
foi observada uma mudança de 233:235 para 235:237 bp (+4 bp). Na amostra SJ45 foi
observada uma mudança de 134:146 para 136:146 bp (+2 bp).
Nas 15 amostras de Merlot identificadas, duas (CN33 e CN36) apresentaram
mutação no loco VVMD28. Nas variedades originais de Merlot o genótipo no loco
VVMD28 foi de 227:233, enquanto nas amostras CN33 e CN36 foi de 233:235 bp (+8
bp).
A amostra SJ17, identificada neste estudo como a variedade Syrah, apresentou
uma mutação no loco VVMD31 de 209:213 para 213:217 bp (+ 8 bp).
Os dados obtidos por Frank et al. (2002) podem ser adicionados e comparados
ao nosso caso. Estes autores verificaram que dois dos alelos que sofreram mutação
exibiram um aumento no tamanho, sendo de 186 bp para 188 bp no loco VVS19 na
variedade Primitivo di Gioia; e de 121 para 123 no loco VVS5 na Pinot Meunier). Os
resultados através do seqüenciamento confirmaram a adição de 2 bp. Riaz et al. (2002)
obtiveram resultados similares analisando os clones de Pinot Nero e Chardonnay.
Modificações no tamanho dos alelos são, portanto processos freqüentes e
contínuos e, quando as variações são na ordem de 2 a 6 bp, como nos casos descritos
acima, eles tendem a ser sem direção e o tamanho do alelo original aumenta pela
adição de um ou mais pares de bases. Ibãnez et al. (2000) trabalhando com dois
acessos de videira conhecidas por serem sinônimas, Black Currant e Mavri Corinthianki,
verificou uma diferença de 2 bp no tamanho de um dos alelos do loco VVMD7.
Infelizmente, apenas dois acessos foram comparados, de maneira que foi impossível
saber se o alelo mutante foi o menor ou o maior.
Mutações similares a estas descritas, foram observadas em diferentes espécies
de animais e vegetais (Ramakrishna et al., 1998; Karhu et al., 2000; Zhu et al., 2000;
Neff et al., 2001). Entretanto, os estudos com animais relatam que as mutações se
originam de gametas, em videira elas se originam de células somáticas e são
eventualmente fixadas e transmitidas para novos indivíduos através da propagação
71
vegetativa. Assim, elas são dependentes da condição e posição da célula mutante: se a
mutação ocorre em uma célula meristemática, ela tem o potencial de prolongar-se aos
tecidos derivados daquela célula, e permanecer estável através dos anos em pelo
menos uma camada da mesma planta e nos seus clones após a propagação vegetativa
(Crespan, 2004).
Mutações do tipo “mais 2 pares de bases” (+ 2bp) no tamanho do alelo parecem
ser mais freqüente em variedades de Vitis vinifera. O aumento de mais de 2 bp, mesmo
sendo menos comum, podem também ocorrer como resultado de um evento individual
(Primmer et al., 1996; Di Rienzo et al., 1994; Crespan et al., 2003).
A comparação do tamanho dos alelos microssatélites que sofreram mutação com
os das variedades originais mostrou em todos os casos um aumento de 2 bp ou mais.
Os resultados obtidos neste trabalho mostram que mutações em locos
microssatélites ocorrem em diferentes variedades viníferas. Portanto, isto deve ser
considerado um fenômeno geral que ocorre por acaso e é relativamente freqüente no
genoma de plantas. Isto significa que para ser mais confiável a genotipagem molecular
baseada em marcadores microssatélites requer a análise de diferentes acessos da
mesma variedade, especialmente no caso de variedades antigas em que a
probabilidade de mutações acumuladas e fixadas é completamente elevada (Crespan et
al., 2004). Uma sugestão é aproximar o uso de marcadores moleculares no
‘fingerprinting’ varietal escolhendo o loco polimórfico menos propenso a mutação, como
é o caso de SNPs e AFLPs que são baseados na variabilidade molecular presente em
uma única ou em poucas posições nucleotídeas (Franks et al., 2002).
6.3.5- Genótipos idênticos
Das 181 amostras identificadas foram encontrados 68 genótipos distintos e
destes (n=68) foram observados 36 casos de genótipos idênticos entre as variedades
de videira coletadas em Santa Catarina. No caso destes 36 genótipos idênticos, 19
foram encontrados em clones varietais, 11 em amostras identificadas com nomes
semelhantes ou diferentes e 7 são prováveis casos de erro de identificação. Os casos
de erro de identificação estão relatados no item 6.4.6.
No caso das 11 amostras identificadas com nomes semelhantes ou diferentes
pode-se afirmar através dos 10 marcadores moleculares, que elas também são clones,
e que são a progênie vegetativa das suas variedades originais. Então, somando-se as
72
19 variedades clonais mencionadas anteriormente com as 11 novas, temos 30
genótipos clones de variedades de videira neste trabalho (Tabela 10).
Os clones intravarietais podem diferir fenotipicamente entre si em alguma
característica quantitativa e/ou qualitativa, mesmo que tenham perfis de DNA
praticamente idênticos (Vignani et al., 1996; Franks et al., 2002; Riaz et al., 2002;
Walker et al., 2006). Estas características fenotípicas que as diferenciam das suas
variedades de origem podem ser explicadas pela ocorrência de variações somáticas da
mesma variedade, ou seja, por tipos “sports” de mutações (Bowers et al., 1996; Sefc et
al., 1998; Crespan et al., 1999; Ibáñez et al., 2003). Estas mutações genéticas
controlam diversas características quantitativas e/ou qualitativas, como cor e forma da
baga, aspectos fenológicos, vigor, rendimento, teor de açúcares, acidez, antocianinas,
etc.
Tabela 10. Variedades clonais de videira com genótipos idênticos caracterizados pela análise molecular
através de 10 marcadores microssatélites. CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2007.
Genótipos Idênticos
Bordô (SC)/Gran D’Oro (SC)
Cabernet Franc (SC)/Cabernet Franc VCR 80 (SC)
Cabernet Sauvignon (SC)/C. Sauvignon Clones 341, 337, R5, 685, 170, 169, 339, 015, 338, 343 e 107 (SC)
Chardonnay (SC)/Chardonnay Clones R8 e 95 (SC)
Concord (SC)/Concord Precoce (SC)
Goethe Primo (SC)/Goethe Clássica (SC)
Isabel (SC)/Isabel Precoce (SC)
Itália (SC)/Itália Export (SC)/Itália Koga (SC)/Rubi (SC)/Benitaka (SC)/Brasil (SC)/Redmeire (SC)
Merlot (SC) /Merlot Clones 5, 343, 181 e R3 (SC)
Nebiollo (SC)/Nebiollo CL 111 (SC)
Niágara Branca (SC)/Niágara Rosada (SC)
(SC): Variedade coletada em Santa Catarina
Segundo Pommer et. al (2003), mutações na cor da baga ou na forma das bagas
são de ocorrência muito freqüente e seus produtos tem sido usados com sucesso na
viticultura brasileira. Como exemplos podemos citar algumas amostras analisadas neste
trabalho. As variedades Niágaras (branca e rosada) apresentaram o mesmo perfil
73
genético, visto que a Niágara Rosada surgiu de uma mutação somática natural da
Niágara Branca. Da variedade Itália de bagas brancas surgiram as mutações:
• Rubi, sendo a coloração rosada da baga a única diferença da cultivar que lhe
deu origem.
• Benitaka, apresenta como diferença fenotípica a coloração das bagas rosadas-
escuras.
• Brasil que difere da uva Itália por ser de cor roxa escura, quase preta e
principalmente pela polpa, que também é colorida de vermelho intenso.
• Redimeire que surgiu a partir de uma mutação somática da Itália.
A Niágara e a Itália, ambas variedades de bagas brancas, deram origem a clones
com bagas vermelhas. Caso parecido foi relatado por Boss et al. (1996) em que as
variedades Chardonnay e Sultana (ambas de bagas brancas) produziram clones de
bagas vermelhas denominados respectivamente de Red Chardonnay e Pink Sultana.
Segundo Walker et al. (2006) mutações do tipo “sports” cor da baga são controladas por
dois genes reguladores similares MYB, sendo que qualquer um dos dois é suficiente
para produzir a cor na fruta.
Os resultados também mostraram que as duas variedades analisadas (Bordô e
Gran D’Oro) são geneticamente idênticas, indicando ser a variedade Grano D’Oro uma
mutação da Bordô. Esta variedade, Gran D’Oro difere fenotipicamente da Bordô no
aspecto vigor, produtividade e rusticidade, demonstrando boas perspectivas para
produção ecológica (Schuck et al., 2005; Schuck et al., 2007 no prelo). Além disso,
técnicos da EPAGRI de Nova Trento constataram que a uva em questão possui um
maior teor de açúcar e um nível de acidez satisfatório (Ruberti, 2004).
As análises moleculares realizadas com as variedades Goethe Clássica e
Goethe Primo, uvas típicas da Região de Urussanga, produtoras de vinhos brancos e
espumantes, mostraram que as duas variedades são geneticamente idênticas, e que a
Goethe Clássica sofreu uma mutação dando origem ao clone Goethe Primo (Schuck et
al., 2007 no prelo). Esta afirmação pode ser comprovada quando se compara a Goethe
Clássica com a Goethe encontrada nos bancos de dados ampelográficos, ambas
possuem a coloração das bagas rosáceas, enquanto a Goethe Primo possui a baga de
cor verde/branca. Além disso, em estudos realizados por Aparecido Lima da Silva e
Jean Pierre Rosier (Comunicação Oral, Seminário Vales da Uva Goethe, maio de 2007)
demonstraram diferenças marcantes na acidez total, com superioridade para a Goethe
Clássica, tanto no mosto como do vinho.
74
Os clones das variedades Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Chardonnay e
Malbec também apresentaram o mesmo perfil genético das suas variedades originais.
Os pesquisadores Cipriani et al. (1994), Botta et al. (1995) e Ye et al. (1998) também
examinaram a variedade Chardonnay e seus clones devido a sua ampla importância
mundial na produção de vinhos varietais e nenhum polimorfismo foi detectado entre os
clones e a variedade original. Botta et al. (1995) analisando clones da variedade
Cabernet Sauvignon da Itália e Austrália concluiram que clones crescidos em diferentes
ambientes apresentaram o mesmo perfil de DNA.
Apesar das diferenças observadas na planta e frutos serem marcantes, os
marcadores microssatélites, por serem normalmente localizados em regiões anônimas
do genoma (não codificantes) não possuem o poder de distingüir variantes de uma
variedade de videira (clones). Variantes referidas comumente como mutações
somáticas, que geralmente ocorrem em regiões funcionais do genoma (codificantes,
genes), propagadas de forma clonal, serão idênticos quanto ao perfil genético produzido
pelos microssatélites (Sefc et al., 1998; Lopes et al., 1999; Crespan et al., 2001; Martín
et al., 2003; Ibãnéz et al., 2003; Zulini et al., 2005).
Além disso, variações clonais são difíceis de serem caracterizadas pela análise
de alguns locos microssatélites, mas a extensão no número de marcadores utilizados
na genotipagem aumenta a chance de se encontrar clones mutantes. Isto foi
demonstrado por Riaz et al. (2002), que encontrou diferenças dentro de clones de Pinot
Noir e Chardonnay genotipando 100 locos SSRs. No nosso trabalho utilizamos apenas
10 locos microssatélites, que demonstrou ser um número insuficiente, para caracterizar
variações clonais. Os marcadores moleculares AFLPs, embora menos confiáveis devido
a inconstância de algumas bandas ‘fantasmas’, podem também ajudar a identificar
variações clonais, como foi demonstrado recentemente (Cervera et al., 2000; Scott et
al., 2000; Bellini et al., 2001; Zulini et al., 2005).
6.3.6- Sinonímias, erros de identificação e identificação de amostras de origem
desconhecida
Foram observados entre as variedades coletadas em Santa Catarina, seis casos
de variedades identificadas com nomes diferentes, mas que apresentaram o mesmo
perfil genético e uma variedade em que o perfil genético não foi o mesmo da sua
75
variedade original. Estes sete casos são prováveis erros de identificação. Além disso,
quando o perfil genético das variedades de Santa Catarina foi comparado aos das
variedades encontradas nos ‘database’ e literatura internacional, foi observado que 10
variedades apresentavam o mesmo perfil genético das variedades internacionais, mas
diferiam no nome (Tabela 11).
Tabela 11. Casos de sinonímias encontradas durante a análise molecular através de 10 marcadores
microssatélites das variedades de videira de Santa Catarina. CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2007.
Sinonímias
Castelão (SC)/Periquita (UC Davis e Sefc et al., 2000)
Isabel (SC)/Isabel Precoce (SC)/ Isabella (Suíça)/Fragolla (Itália e Austrália)
Magic Black (SC)/Exotic(Sanchez et al., 1999)/ Cardinal (Suíça)
Mouvédre (SC)/Monastrell (Sefc et al., 2000)
Muscat of Alexandria (SC)/ Chasselas Musque (França)/Muscat Gordo Blanco ou Lexia (Austrália)/Hanepoot (África
do Sul)
Refosco (SC)/
Refosco dal pedunculo rosso (IASMA, Sefc et al, 2000)
Pinot Noir (SC)/Pinot Gris (Suíça)/Pinot Blanc (Suíça)/ Blauburgunder (Suíça)
Tinta Roriz (SC)/Tempranillo (Espanha)
Tinturina (SC)/Usellina (Berna/Suíça)
Toriga Francesa (SC)/Touriga Franca (Pinto-Carinde et al., 2003)
(SC): Variedade coletada em Santa Catarina
No caso de erro de identificação, foram observados seis casos que não se
apresentam adequados com os resultados obtidos. A variedade Pinot Noir (SJ1)
apresentou o mesmo genótipo que a variedade Cabernet Sauvignon. As amostras da
variedade Trincadeira (SJ51 e R12) apresentaram o mesmo genótipo da variedade
Pinot Noir. As variedades Moscato Embrapa (CN30) e Lorena (CN15) apresentaram o
mesmo perfil genético da variedade Moscato Giallo. A variedade Trincadeira (AD39)
apresentou o mesmo perfil genético que a variedade Viognier (V1). Certamente estes
casos são equívocos de identificação ou erro de introdução ou mistura varietal, visto
que todas são variedades conhecidas e seguramente de origens genéticas diferentes
(Tabela 6). No caso da variedade identificada erroneamente como Isabel (R10),
nenhuma referência quanto ao seu perfil genético foi encontrado nos ‘database’ e
literatura internacional, demonstrando ser outra variedade.
76
Das amostras de origem genética desconhecida 10 foram identificadas, conforme
a Tabela 12.
Tabela 12. Variedades de videira de origens genéticas desconhecidas identificadas pela análise
molecular através de 10 marcadores microssatélites. CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2007.
Região Localidade/Proprietário Variedade de origem
genética desconhecida
Variedade
identificada
Água Doce Fazenda Villagio Grando G6 (AD14) Malbec
São Joaquim Sanjo - Sanvitis Quadra 6 Clone A (SJ13) Cabernet Sauvignon
Sanjo - Sanvitis Quadra 5 Clone B (SJ14) Cabernet Sauvignon
Sanjo - Sanvitis Quadra 5 fila 28 (SJ15) Syrah
Sanjo - Sanvitis Quadra 7 fila 23 (SJ17) Syrah
Sanjo - Sanvitis Quadra 7 fila 14 (SJ12) Pinot Noir
Rodeio San Micheli Bizaraqui (R16) Isabel
Solare Uva pêra ou Moscatel (R18) Goethe
Nova Trento Nova Trento 1 planta só
(sem identificação) (NT4)
Tinturina
Urussanga EPAGRI São João (U51) Bordô
Os resultados demonstram que as análises com marcadores microssatélites
podem favorecer a confirmação e definição de sinônimos, erros de identificação e
identificação de variedades de origem genética não clara (Lopes et al., 1999; Martín et
al., 2003; Constantini et al., 2005; Vouillmoz et al., 2006).
77
CONCLUSÕES
78
7. CONCLUSÕES
O material vegetal utilizado neste estudo constituiu-se de variedades de videira das
coleções públicas e privadas do Estado de Santa coletadas em 7 Regiões do Estado. O
recurso à caracterização molecular, envolvendo marcadores moleculares
microssatélites, permitiu estabelecer com maior clareza os vínculos genéticos entre os
diferentes acessos ou variedades e, conseqüentemente, uma melhor organização da
Coleção de Germoplasma. Permitiu ainda enriquecer o conhecimento para melhorar a
estratégia de coleção futura de germoplasma, e possibilitar mais eficazmente a
utilização desse material em programas de criação de variedades, proteção de
cultivares, produção e certificação de mudas.
Os painéis múltiplos de marcadores microssatélites mostraram-se úteis para a
genotipagem em escala de amostras/variedades de videira conservadas nas Coleções
de Germoplasma de Santa Catarina. Um total de 246 amostras foram utilizadas para as
análises genéticas, e destas 181 foram identificadas com um número de 10 marcadores
genotipados. A obtenção dos genótipos foi realizada eficientemente em seqüenciador
automático de DNA.
A análise com microssatélites das 181 amostras identificadas resultou em 68 perfis
moleculares únicos (68 variedades diferentes), 10 casos de variedades sinônimas
(entre as variedades coletadas em Santa Catarina quando comparadas com aquelas
encontradas nos ‘database’ e literatura internacional), identificação de 10 amostras de
origem genética desconhecida, 7 casos de erro de identificação e 7 casos de
variabilidade intravarietal.
A genotipagem, utilizando dez marcadores microssatélites, é adequado para
identificação de variedades, mas não é efetivo para distingüir variações clonais.
A utilização de marcadores microssatélites para a construção de um banco de dados
molecular pode simplificar a identificação de equívocos e sinônimos nas coleções de
germoplasma de videira. A associação deste tipo de marcador, altamente confiável e
informativo, com um sistema automático de análise das amostras, pode ser uma
ferramenta para o desenvolvimento de eficientes protocolos para proteção e certificação
de variedades de videira.
Os dados gerados neste trabalho pretendem contribuir para a discussão sobre a
caracterização e intensificação do uso de recursos genéticos depositados em bancos
de germoplasma, em especial a métodos de amostragem de coleções para definição de
79
acessos apropriados a uso específico em estudos genéticos e programas de
melhoramento.
80
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8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2005.
108
ANEXOS
109
Anexo 1
Tabela 13.
Composição do gel de agarose para eletroforese horizontal. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis –
SC, 2006.
Componentes Concentrações
Agarose 0,8%
TBE 1X
Brometo de Etídio
1,5 μg.ml
-1
Tabela 14. Reagentes utilizados na reação de polimerase em cadeia (PCR-MIX). Laboratório de Genética
Molecular, IASMA, Trento.
Componentes
Volume 1X (1 µl) Concentração Final
Água mili-Q
10X Buffer
5.05
1.25
1X
MgCl
2
0.75 1.5 mM
dNTP
2.5 25 µM
P1 (F)
0.2 0.5 µM
P2 (R)
0.2 0.5 µM
Taq DNA polimerase
0.05 0.5 U
DNA
2.5 25-50 ng
Total
12.5 µl
Tabela 15. Marcadores microssatélites marcados com florescência utilizados nos cinco painéis múltiplos
(multiplex-sequenciador). Laboratório de Genética Molecular, IASMA, Trento.
Painel Locus Fluorocromo Cor Variação de tamanho esperada
(pb)
A VVS2 FAM Blue 129-155
A VVMD5 HEX Green 226-246
B VVMD7 FAM Blue 232-263
B VVMD27 HEX Green 173-194
C Zag62 HEX Green 185-203
C Zag79 FAM Blue 236-260
D VVMD25 HEX Green 236-260
D VVMD31 FAM Blue 196-224
E VVMD28 HEX Green 221-279
E VVMD32 FAM Blue 239-273
110
110
ANEXO 2
1- Variedades: Nova Trento
Figura 6. Quantificação de DNA das variedades de Nova Trento. LFDGV/CCA/UFSC,
Florianópolis – SC, 2006.
Tabela 16. Variedades de Nova Trento, incluindo código de quantificação, código de genotipagem,
nome do acesso, localidade e a concentração do DNA. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE
CONCENTRAÇÃO DO DNA
(ng)
A NT1 Goethe Nova Trento 50
B NT2 Niágara Branca Nova Trento 100
C NT3 Marta Nova Trento 50
D NT4 1 planta só (sem identificação) Nova Trento 200
E NT5 Isabel Nova Trento 200
F NT6 Gran D’Oro Nova Trento 100
G NT7 Niágara Rosada Nova Trento 20
H NT8 Concord Nova Trento 20
I NT9 Bordô Nova Trento 100
A
*
: Código quantificação, B
**
: Código genotipagem
NOME DO ACESSO
: O nome das variedades está descrito conforme a identificação dada pelo
proprietário.
2 – Variedades: Urussanga
Figura 7. Quantificação de DNA das variedades de Urussanga. LFDGV/CCA/UFSC,
Florianópolis – SC, 2006.
111
111
U54 U45 U49 U51 U47 U48 U50 U52 U53
112
112
Tabela 17. Variedades de Urussanga, incluindo código de quantificação, código de
genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a concentração do DNA.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO DNA
(ng)
U54 U54 Gran D’Oro EPAGRI 50
U45 U45 Bordô Felippe 200
U49 U49 Gran D’Oro EPAGRI 100
U51 U51 São João EPAGRI 200
U47 U47 Goethe Primo Damiani 20
U48 U48 Goethe Primo Damiani 100
U50 U50 Goethe Clássica Damiani 200
U52 U52 Clone GP EPAGRI 100
U53 U53 Goethe Clássica EPAGRI 20
U1 U1 Goethe Clássica Quarezemin 200
U2 U2 Vidal Blank Possamai 200
U3 U3 Goethe Primo Quarezemin 20
U4 U4 IAC 313 ‘Tropical’ EPAGRI 200
U5 U5 Centenial Seedless EPAGRI 200
U6 U6 Goethe Clássica Felippe 200
U7 U7 Catawba Trevisol 200
U8 U8 IAC 766 ‘Campinas’ EPAGRI 200
U9 U9 Goethe Clássica Felippe 200
U10 U10 Benifugi EPAGRI -
U11 U11 Goethe Clássica Trevisol 200
U12 U12 Fantasia EPAGRI 200
U13 U13 Red Globe EPAGRI 200
U14 U14 Catawba Soreto 200
U15 U15 Prima EPAGRI 200
U16 U16 IAC Jales EPAGRI 100
U17 U17 Goethe Clássica Mazon 200
U18 U18 Ora EPAGRI 200
U19 U19 Marta Trevisol 100
U20 U20 Vilamar Possamai 200
U21 U21 Goethe Primo Felippe 100
U22 U22 Goethe Clássica Possamai 100
U23 U23 Tinturina EPAGRI 200
U24 U24 Regente EPAGRI 200
U25 U25 Bordô João Pignatel 200
U26 U26 Família Moscatel Possamai 200
U27 U27 Cristal Felippe 200
U28 U28 Goethe Cristal EPAGRI 200
A
*
: Código quantificação, B
**
: Código genotipagem
NOME DO ACESSO
: O nome das variedades está descrito conforme a identificação dada pelo
proprietário.
113
113
3 – Variedades: Rodeio
Figura 8. Quantificação de DNA das variedades de Rodeio. LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis
– SC, 2006.
Tabela 18. Variedades de Rodeio, incluindo código de quantificação, código de genotipagem,
nome do acesso, localidade/proprietário e a concentração do DNA. LFDGV/CCA/UFSC,
Florianópolis – SC, 2006.
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
A5 R1 Seibel San Micheli 20
A6 R2 Chardonnay San Micheli 30
A7 R3
Vênus San Micheli 30
A8 R4
Tinta Roriz Rodeio 20
A9 R5
Sauvignon Blanc Rodeio 30
A10 R6
Sangiovese Rodeio 20
A11 R7
Cabernet Sauvignon CL R5
San Micheli 50
A12 R8
Porta – enxerto
(sem identificação)
Ascurra – Mondini 30
A13 R9
Pinot Noir Rodeio 20
A14 R10
Isabel San Micheli 50
A15 R11
Touriga Nacional Rodeio 30
A16 R12
Trincadeira Rodeio 20
A17 R13
Merlot CL R3 San Micheli 20
A18 R14
Teroldego San Micheli -
A19 R15
Marta San Micheli 10
A20 R16
Bizaraqui San Micheli 20
A21 R17
Niágara Rosada San Micheli 20
A22 R18
Uva pêra ou Moscatel Solare 10
A23 R19
Niágara Branca San Micheli sujo
A24 R20
Couderc San Micheli 20
A25 R21
Bordô Rodeio 20
A26 R22
Montepulciano Rodeio 20
A
*
: Código quantificação, B
**
: Código genotipagem
NOME DO ACESSO
: O nome das variedades está descrito conforme a identificação dada pelo
proprietário.
114
114
4 – Variedades: Tangará e Videira
Figura 9. Quantificação de DNA das variedades de Tangará e Videira. LFDGV/CCA/UFSC,
Florianópolis – SC, 2006.
Tabela 19. Variedades de Tangará e Videira, incluindo código de quantificação, código de
genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a concentração do DNA.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
62 V1 Viognier Tangará-Pancieri -
63 V2 Petit Verdot Tangará-Pancieri -
64 V22
Muscat de Alexandria Tangará-Pancieri 50
65 V4
Arimonoa Tangará-Pancieri -
66 V5
Marselan Tangará-Pancieri -
67 V6
Alicante Bouschet Tangará-Pancieri 20
68 V7
Malbec Tangará-Pancieri 50
1 V8
Bailey Videira-EPAGRI 20
2 V9
Dona Zilá Videira-EPAGRI sujo
3 V10
Patrícia Videira-EPAGRI -
4 V11
Teroldego Videira-EPAGRI -
5 V12
Riesling Renano Videira-EPAGRI sujo
6 V13
Tardia de Caxias Videira-EPAGRI 20
7 V14
Brasil Videira-EPAGRI -
8 V15
Vênus Videira-EPAGRI sujo
9 V16
Seibel 9 Videira-EPAGRI -
10 V17
Couderc Videira-EPAGRI -
11 V18
Alphonse Lavallée Videira-EPAGRI 50
12 V25 Itália Videira-EPAGRI 200
13 V20 Red Meire Videira-EPAGRI 100
14 V21 BRS Morena Videira-EPAGRI 100
A *
: Código quantificação, B
**
: Código genotipagem
Sq: amostras sem quantificação
NOME DO ACESSO
: O nome das variedades está descrito conforme a identificação dada pelo
proprietário.
12
13 14
115
115
5 – Variedades: Campos Novos
Figura 10. Quantificação de DNA das variedades de Campos Novos. LFDGV/CCA/UFSC,
Florianópolis – SC, 2006.
Tabela 20. Variedades de Campos Novos, incluindo código de quantificação, código de
genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a concentração do DNA.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
CN1 CN1
BRS Clara
EPAGRI 200
CN2 CN2
BRS Morena
EPAGRI -
CN3 CN3
Itália
EPAGRI
100
CN4 CN4
Itália Export
EPAGRI
100
CN5 CN5
Alphonse Lavallée
EPAGRI
100
CN6 CN6
Bordô
EPAGRI
200
CN7 CN7
Niágara Rosada
EPAGRI
100
CN8 CN8
Cabernet Sauvignon CL337
EPAGRI
-
CN9 CN9
Rubi Itália
EPAGRI
100
CN10 CN10
Isabel
EPAGRI
100
CN11 CN11
Poloeske Muskataly
EPAGRI
100
CN12 CN12
BRS Linda
EPAGRI
100
CN13 CN13
Itália Koga
EPAGRI
100
CN14 CN14
Isabel Precoce
EPAGRI
100
CN15 CN15
Lorena
EPAGRI
100
CN16 CN16
Gran D’Oro
EPAGRI
-
CN17 CN17
Moscato Giallo
EPAGRI
100
CN18 CN18
Benitaka
EPAGRI
200
CN19 CN19
Niágara Branca
EPAGRI
100
CN20 CN20
Concord Precoce
EPAGRI
100
CN21 CN21
Concord
EPAGRI
200
CN22 CN22
Red Meire
EPAGRI
100
CN23 CN23
Cabernet Sauvignon CL R5
EPAGRI
-
CN24 CN24
Montepulciano
EPAGRI
100
CN25 CN25
Sauvignon Blanc
EPAGRI
100
CN26 CN26
Pinot Noir
EPAGRI
100
CN27 CN27
Cabernet Sauvignon CL685
EPAGRI
100
CN28 CN28
Sangiovese
EPAGRI
100
CN29 CN29
Cabernet Sauvignon CL170
EPAGRI
-
CN30 CN30
Moscato Embrapa
EPAGRI
100
CN31 CN31
BRS Rubea
EPAGRI
200
CN32 CN32
Cabernet Sauvignon CL169
EPAGRI
100
CN1 CN2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 171819 20 212 23 24 2526 27 2829 30 31 32 3334 3536 37 38 3940 41 42 43
50 100 200
116
116
Tabela 20. Continuação
A
*
B ** NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
CN33 CN33
Merlot CL5
EPAGRI 200
CN34 CN34
Chardonnay
EPAGRI -
CN35 CN35
Cabernet Franc
EPAGRI
-
CN36 CN36
Merlot CL 343
EPAGRI
200
CN37 CN37
Tempranillo
EPAGRI 200
CN38 CN38
Merlot 181
EPAGRI 100
CN39 CN39
Malbec
EPAGRI
-
CN40 CN40
Cabenet Sauvignon CL 339
EPAGRI
-
CN41 CN41
Cabenet Sauvignon CL 341
EPAGRI
200
CN42 CN42
Carmenere
EPAGRI
200
CN43 CN43
Syrah
EPAGRI
200
A
*
: Código quantificação, B
**
: Código genotipagem
NOME DO ACESSO
: O nome das variedades está descrito conforme a identificação dada pelo
proprietário.
6 – Variedades: Água Doce
Figura 11. Quantificação de DNA das variedades de Água Doce. LFDGV/CCA/UFSC,
Florianópolis – SC, 2006.
117
117
Tabela 21. Variedades de Água Doce, incluindo código de quantificação, código de
genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a concentração do DNA.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
33 AD1 Riesling Renano Fazenda Villagio Grando 20
34 AD2 Chardonnay CL R8 Fazenda Villagio Grando 20
28 AD3 Jaen Fazenda Villagio Grando 20
16 AD4 Touriga Francesa Fazenda Villagio Grando 10
42 AD5 Nebiollo R6 Fazenda Villagio Grando 10
22 AD6 Marselan Fazenda Villagio Grando 20
25 AD7 Ancellota R2 Fazenda Villagio Grando 50
24 AD8 Gros Manseng Fazenda Villagio Grando 50
36 AD9 Gewstraminer Fazenda Villagio Grando 30
31 AD10 Villenave Fazenda Villagio Grando -
32 AD12
Cabernet Franc VCR 80
Fazenda Villagio Grando 10
45 AD13 Trebbiano Fazenda Villagio Grando 20
18 AD14 G6 Fazenda Villagio Grando 50
37 AD15 Cabernet Franc Fazenda Villagio Grando 20
42 AD16 Nebiollo CL 111 Fazenda Villagio Grando 20
19 AD17 Carmenere Fazenda Villagio Grando 10
16 AD18 Touriga Nacional Fazenda Villagio Grando 50
27 AD19 Pinot Gris Fazenda Villagio Grando 50
13 AD20 Sangiovese Fazenda Villagio Grando 50
17 AD21 Castelão Fazenda Villagio Grando 50
12 AD22 Refosco Fazenda Villagio Grando 50
20 AD23 Chardonnay CL 95 Fazenda Villagio Grando 50
29 AD24 Tannat Fazenda Villagio Grando 50
14 AD25 Pinot Noir Fazenda Villagio Grando -
46 AD26 Marzemino Fazenda Villagio Grando 50
50 AD27 Trebbiano Fazenda Villagio Grando -
51 AD28 Montepulciano Fazenda Villagio Grando 20
52 AD29 Tempranillo Fazenda Villagio Grando 20
53 AD30 Sauvignon Blanc Fazenda Villagio Grando -
54 AD31 Nebiollo Fazenda Villagio Grando -
57 AD33 Mourvèdre Fazenda Villagio Grando 30
59 AD34 Gamay Fazenda Villagio Grando 50
61 AD35 Viognier Fazenda Villagio Grando 20
30 AD36 Trincadeira Fazenda Villagio Grando -
A
*
: Código quantificação, B
**
: Código genotipagem
NOME DO ACESSO
: O nome das variedades está descrito conforme a identificação dada pelo
proprietário.
118
118
7 – Variedades: São Joaquim
Figura 12. Quantificação de DNA das variedades de São Joaquim. LFDGV/CCA/UFSC,
Florianópolis – SC, 2006.
Tabela 22. Variedades de São Joaquim, incluindo código de quantificação, código de
genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a concentração do DNA.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
T1 SJ1 Pinot Noir Terras Altas 100
T2 SJ2 Sauvignon Blanc Terras Altas 200
T3 SJ3 Chardonnay Terras Altas 100
T4 SJ4 Cabernet Sauvignon Terras Altas 50
T5 SJ5 Tempranillo Terras Altas 100
T6 SJ6 Syrah Terras Altas 100
T7 SJ7 Merlot Terras Altas 50
T8 SJ8 Branca Terras Altas 20
T9 SJ9
Cabernet Sauvignon CL 015
Terras Altas 100
T10 SJ10
Cabernet Sauvignon CL 338
Terras Altas 50
T11 SJ11 Merlot CL 843 Terras Altas 50
T12 SJ12 Quadra 7 fila 14 Sanjo – Sanvitis 20
T13 SJ13 Quadra 6 Clone A Sanjo – Sanvitis -
T14 SJ14 Quadra 5 Clone B Sanjo – Sanvitis 20
119
119
Tabela 22. Continuação
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
T15 SJ15 Quadra 5 fila 28 Sanjo – Sanvitis 20
T16 SJ16 Merlot Sanjo – Sanvitis 100
T17 SJ17 Quadra 7 fila23 Sanjo – Sanvitis 20
T18 SJ18 Cabernet Sauvignon Sanjo - Furihata
20
T19 SJ19 Quadra 6 fila 34 Sanjo – Sanvitis
-
T20 SJ20 Sangiovese Villa Francioni 50
T21 SJ21 Teroldego Villa Francioni 50
T22 SJ22 Merlot CL 343 Villa Francioni 20
T23 SJ23
Cabernet Sauvignon CL 685
Villa Francioni 50
T24 SJ24
Cabernet Franc
Villa Francioni 50
T25 SJ25
Cabernet Sauvignon CL 339
Villa Francioni 20
T26 SJ26
Cabernet Sauvignon CL 169
Villa Francioni 50
T27 SJ27
Malbec
Villa Francioni 50
T28 SJ28
Merlot181
Villa Francioni 20
T29 SJ29
Cabernet Sauvignon CL 343
Villa Francioni 20
T30 SJ30
Cabernet Sauvignon CL R5
Villa Francioni -
T31 SJ31
Cabernet Sauvignon CL 107
Villa Francioni -
T32 SJ32
Nebiollo
Villa Francioni 50
T33 SJ33
Cabernet Sauvignon CL 337
Villa Francioni 50
T34 SJ34 Barbera Suzin 50
T35 SJ35 Itália Suzin 50
T36 SJ36 Sauvignon Blanc Suzin 50
T37 SJ37 Riesling Renano Suzin 20
T38 SJ38 Cabernet Sauvignon Suzin 20
T39 SJ39 Alphonse Lavallée Suzin 20
T40 SJ40 Magic Black Suzin 20
T41 SJ41 Merlot Suzin 50
T42 SJ42 Gewstraminer Suzin 20
T43 SJ43 Chardonnay Quinta da Neve 20
T44 SJ44 Sangiovese Quinta da Neve -
T45 SJ45 Cabernet Sauvignon Quinta da Neve 20
T46 SJ46 Primitivo Quinta da Neve 20
T47 SJ47 Cabernet Sauvignon Quinta da Neve 20
T48 SJ48 Syrah Quinta da Neve -
T49 SJ49 Pinot Blanc Quinta da Neve -
T50 SJ50 Tinta Roriz Quinta da Neve 20
T51 SJ51 Trincadeira Quinta da Neve -
F8 SJ52 Pinot Griggio Quinta da Neve 20
F9 SJ53 Touriga Francesa Quinta da Neve Sujo
F10 SJ54 Touriga Nacional Quinta da Neve 20
F11 SJ55 Montepulciano Quinta da Neve Sujo
F12 SJ56 Sangiovese Quinta da Neve Sujo
F13 SJ57 Tinta Roriz Quinta da Neve 20
F14 SJ58 Pinot Blanc Quinta da Neve 10
F15 SJ59 Trincadeira Quinta da Neve 50
F16 SJ60 Cabernet Sauvignon Quinta da Neve 50
F17 SJ61 Syrah Quinta da Neve 50
F18 SJ62 Primitivo Quinta da Neve 50
F19 SJ63 Merlot Quinta da Neve 50
F20 SJ64 Nebiollo Quinta da Neve 20
120
120
Tabela 22. Continuação
A
*
B
**
NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
F22 SJ65 Tempranillo Quinta da Neve 20
F23 SJ66 Nebiollo Quinta da Neve 20
F24 SJ67 Chardonnay Quinta da Neve 20
F25 SJ68 Pinot Noir Quinta da Neve -
A
*
: Código quantificação, B
**
: Código genotipagem
NOME DO ACESSO
: O nome das variedades está descrito conforme a identificação dada pelo
proprietário.
8 – Variedades: Florianópolis
Figura 13. Quantificação de DNA das variedades de porta-enxertos de Florianópolis.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.
Tabela 23. Variedades de porta-enxertos de Florianópolis, incluindo código de quantificação,
código de genotipagem, nome do acesso, localidade/proprietário e a concentração do DNA.
LFDGV/CCA/UFSC, Florianópolis – SC, 2006.
A
*
B ** NOME DO ACESSO LOCALIDADE/
PROPRIETÁRIO
CONCENTRAÇÃO DO
DNA (ng)
P1 U33 VR 043-43 UFSC - CCA 100
P2 U35 101-14 UFSC – CCA 100
P3 U37 Paulsen 1103 UFSC – CCA -
P4 U38 SO4 UFSC – CCA 20
P5 U40 Pesc 2*** UFSC – CCA 200
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
U29
U30
U31
U32
U34
U36
U39
Gravesac
Kobber
3309
Pesc 2***
VR 039-16
110-R
Branco Rasteiro
UFSC – CCA
UFSC – CCA
UFSC – CCA
UFSC – CCA
UFSC – CCA
UFSC – CCA
UFSC - CCA
-
20
100
50
100
100
100
A
*
: Código quantificação, B
**
: Código genotipagem
NOME DO ACESSO
: O nome das variedades está descrito conforme a identificação dada pelo
proprietário.
***Pesc: Porta-enxertos de Santa Catarina; PE = Porta-enxerto, UFSC = Universidade Federal
de Santa Catarina, CCA = Centro de Ciências Agrárias.
120
120
Anexo 3
Tabela 24. Tamanho dos alelos (bp) em 10 locos das 246 amostras de videira coletadas em Santa Catarina. CCA/UFSC, Florianópolis-SC, 2007.
VARIEDADE/REGIÃO CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
ÁGUA DOCE
Chardonnay CL R8
AD2 132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211
--
a
240
--
a
Chardonnay CL 95
AD23 132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211
--
a
240 272
Toriga Francesa
AD4 138 146 X X 239 243 177
--
a
190
--
a
X X 240
--
a
241
--
a
213
--
a
240 272
Touriga Nacional
AD18 138 146 224 234 239 177 185 186 192 245
--
a
246 252 233 267 201 213 240 272
Cabernet Franc VCR 80
AD12 134 142 224 238 239 263 177 185 192 202 247 259 240 256 227 235 203 213 240 258
Cabernet Franc
AD15 134 142 224 238 239 263 177 185 192 202 247 259 240 256 227 235 203 213 240 258
Sangiovese
AD20 128
--
a
224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242
--
a
233 243 209
--
a
252 256
G6
AD14 128 146 226 238 239 263 185 187 186 200 245 259 240 250 233
--
a
207 209 240 252
Sauvignon Blanc
AD30 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
Tempranillo
AD29 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
Montepulciano
AD28 128 140 224 226 249
--
a
185 191 188 198 251
--
a
240
--
a
233 243 207 209 258
--
a
* Pinot Noir
AD25 132 150* 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213
--
a
240 272
Trincadeira
AD36 128 134 224 230 239 249 181 187 186 198 251
--
a
240 242 215 243 209
--
a
262 272
Carmener
AD17 134 142 224 238 239 263 171 185 186 202 247
--
a
240 256 235 249 207
--
a
240
--
a
Gewstraminer
AD9 146
--
a
230 238 243 257 185
--
a
186 192 245 251 250
--
a
233 235 201 213 240 272
Nebiollo Cl 111
AD16 152
--
a
230 234 247 249 181 185 192 198 243 251 240 242 235
--
a
209
--
a
240 262
Ancellota R2
AD7 128 152 230
--
a
239 263 181 185 192
--
a
245 247 242
--
a
235 245 209 213 240 272
Gros Manseng
AD8 134
--
a
232 238 237 239 185
--
a
192
--
a
251
--
a
240 250 227 233 213
--
a
240
--
a
Villenave
AD10 X X 231 237
X X X X X X X X X X X X X X X X
Pinot Gris
AD19 X X 227 238
X X X X X X X X X X X X X X X X
Riesling Renano
AD1 X X 224 237
X X
190 204
X
X X X X X X X X X X X
121
121
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
ÁGUA DOCE
Villenave AD11 122 128 230 232 237 249 177 185 182
--
a
X X X X X X X X X X
Castelão
AD21 138 140 234 236 243 257 177
--
a
186
--
a
247 251 242 256 235
--
a
201 207 252
--
a
Refosco
AD22 128
--
a
224 230 239 247 177 185 192
--
a
251 259 242 256 233
--
a
209 213 250 262
Tannat
AD24 138 152 236 238 249
--
a
181 185 192 198 239 251 256
--
a
233
--
a
209
--
a
240 256
Marzemino
AD26 128
--
a
224 230 239 263 181 185 186 202 243 251 240 256 233 235 209 213 240 262
Mourvede
AD33 128 146 224 238 249
--
a
185
--
a
186 202 251 261 240 262 241 257 203 209 240 256
Gamay
AD34 128 132 232 238 239 249 177 185 192 202 243 245 240
--
a
241
--
a
211
--
a
240 272
Trebbiano
AD27 X X 231 237 X X X X 186 192 X X X X X X X X X X
Nebiollo
AD31 X X 230 237 X X 172 185 X X X X X X X X X X X X
Viognier
AD35 X X 236
--
a
X X 200 202 X X X X X X X X X X X X
Jaen
AD3 X X 224 235 X X X X X X X X X X X X X X X X
Nebiollo CL R6
AD5 X X 231 235 X X X X X X X X X X X X X X X X
Marselan
AD6 X X 234
--
a
X X X X X X X X X X X X X X X X
122
122
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
SÃO JOAQUIM
Cabernet Sauvignon CL 015
SJ9 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 338
SJ10 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 685
SJ23 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 339
SJ25 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 169
SJ26 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 343
SJ29 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL R5
SJ30 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 107
SJ31 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
239 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 337
SJ33 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
* Cabernet Sauvignon
SJ45 136* 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon
SJ47 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 230 238 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon
SJ38 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240
--
a
230 238 203 207 240
--
a
Quadra 6 Clone A
SJ13 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Quadra 5 Clone B
SJ14 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Pinot Noir
SJ1 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Malbec
SJ27 128 146 226 236 239 263 185 187 186 200 245 259 240 250 233
--
a
207 209 240 252
Merlot
SJ7 134 146 224 234 239 247 185 187 192
--
a
259
--
a
240 250 227 233 209 213 240
--
a
Merlot CL 843
SJ11 134 146 224 234 239 247 185 187 192
--
a
259
--
a
240 250 227 233 209 213 240
--
a
Merlot
SJ16 134 146 224 234 239 247 183 187 192
--
a
259
--
a
240 250 227 233 209 213 240
--
a
Merlot CL 343
SJ22 134 146 224 234 239 247 183 187 192
--
a
259
--
a
240 250 227 233 209
--
a
240
--
a
Merlot181
SJ28 134 146 224 234 239 247 185 187 192
--
a
259
--
a
240 250 227 233 209 213 240
--
a
Merlot
SJ41 134 146 224 234 239 247 185 187 192
--
a
259
-
a
240 250 227 233 209 213 240
--
a
Sauvignon Blanc
SJ2 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
Chardonnay
SJ3 132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211
--
a
240 272
Chardonnay
SJ43 132 138 232 236 239 243 177 185 186 194 243 245 240 256 217 227 211
--
a
240 272
Cabernet Franc
SJ24 134 142 224 238 239 263 177 185 192 202 247 259 240 256 227 235 203 213 240 258
Sangiovese
SJ20 128
--
a
224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242
--
a
233 243 209
--
a
252 256
Sangiovese
SJ44 128
--
a
224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242
--
a
233 243 209
--
a
252 256
Cabernet Sauvignon CS 18A
SJ4 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
123
123
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
SÃO JOAQUIM
Sauvignon Blanc
SJ36 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240 256
Teroldego
SJ21 132 152 224 226 239 247 181
--
a
192
--
a
243 255 240 242 227 235 209 213 240 262
Syrah
SJ6 128
--
a
224 230 239
--
a
185 187 186 192 245 251 242
--
a
217 227 209 213 240 272
Syrah
SJ48 128
--
a
224 230 239
--
a
185 187 186 192 245 251 242
--
a
217 227 209 213 240 272
Quadra 5 fila 28
SJ15 128
--
a
224 230 239
--
a
185 187 186 192 245 251 242
--
a
217 227 209 213 240 272
* Quadra 7 fila 23
SJ17 128
--
a
224 230 239
--
a
185 187 186 192 245 251 242
--
a
217 227 213 217* 240 272
Quadra 7 fila 14
SJ12 132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213
--
a
240 272
Trincadeira
SJ51 132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213
--
a
240 272
Tempranillo
SJ5 138 140 234
--
a
239 253 179
--
a
194 198 247 251 242 256 227 233 207 209 250
--
a
Tinta Roriz
SJ50 138 140 234
--
a
239 253 179
--
a
194 198 247 251 242 256 227 233 207 209 250
--
a
Itália
SJ35 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Alphonse Lavallée
SJ39 128 130 224 236 249 255 181
--
a
184 202 239 251 240 256 243
--
a
207 213 252 272
Primitivo
SJ62 128 138 224 234 247 249 177
--
a
198 202 237 259 240
--
a
247 257 209 211 256 264
Primitivo
SJ46 128 138 224 234 247 249 177
--
a
198 202 237 259 240
--
a
247 257 209 211 256 264
Gewstraminer
SJ42 146
--
a
230 238 243 257 185
--
a
186 192 245 251 250
--
a
233 235 201 213 240 272
Nebiollo
SJ32 152
--
a
230 234 247 249 181 185 192 198 243 251 240 242 235
--
a
209
--
a
240 262
Barbera
SJ34 128 130 224
--
a
249 253 181 185 190 198 243 259 240
--
a
233 239 209
--
a
252 272
Riesling Renano
SJ37 138 146 224 232 249 257 177 185 192 202 243 245 250 256 227 233 201 211 252 272
Magic Black
SJ40 130
--
a
224 234 249
--
a
181
--
a
184
--
a
251 255 256
--
a
243 253 209 213 252 272
124
124
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
SÃO JOAQUIM
Cabernet Sauvignon
SJ18 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Quadra 6 fila 34
SJ19 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Pinot Blanc
SJ49 135 148 226 237 X X X X X X X X X X X X X X X X
Pinot Griggio
SJ52 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Touriga Francesa
SJ53 X X 231 236 X X X X X X X X X X X X X X X X
Touriga Nacional
SJ54 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Montepulciano
SJ55 X X 231 238 X X X X X X X X X X X X X X X X
Sangiovese
SJ56 X X 230 237 X X X X X X X X X X X X X X X X
Tinta Roriz
SJ57 X X 226 239 X X X X X X X X X X 184 186 X X X X
Pinot Blanc
SJ58 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Trincadeira
SJ59 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Cabernet Sauvignon
SJ60 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Syrah
SJ61 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Merlot
SJ63 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Nebiollo
SJ64 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Tempranillo
SJ65 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Nebiollo
SJ66 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Chardonnay
SJ67 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Pinot Noir
SJ68 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Branca
SJ8 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
125
125
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
CAMPOS NOVOS
Sangiovese CN28 128
--
a
224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242
--
a
233 243 209
--
a
252 256
Cabernet Sauvignon CL 337 CN8 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL R5 CN23 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 685 CN27 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 170 CN29 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
* Cabernet Sauvignon CL 169 CN32 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 235 237* 203 207 240
--
a
Cabernet Sauvignon CL 339 CN40 134 146 230 238 239
--
a
171 185 186 192 247
--
a
240 250 233 235 203 207 240
--
a
Malbec CN39 128 146 226 238 239 263 185 187 186 200 245 259 240 250 227 233 207 209 240 252
* Merlot 3 CN33 134 146 224 234 239 247 185 187 192
--
a
259
--
a
240 250 233 235* 209 213 240
--
a
* Merlot 343 CN36 134 146 224 234 239 247 183 187 192
--
a
259
--
a
240 250 233 235* 209 213 240
--
a
Merlot 181 CN38 134 146 224 234 239 247 185 187 192
--
a
259
--
a
240 250 227 233 209 213 240
--
a
BRS Clara CN1 128 130 224 236 239 253 175 191 186
--
a
247 255 240
--
a
217 225 209 213 252 272
BRS Linda CN12 130 146 234 236 239 249 191
--
a
186 202 247 257 254
--
a
217 233 213 217 248 252
Poloeske Muskataly CN11 138 230 234 237 243 177
--
a
178 186 255 240 250 233 243 207 211 257
--
a
Chardonnay
CN34 X X X X 238
--
a
X X X X X X X X X X X X X X
Cabernet Franc
CN35 X X X X 239 262 177 185 X X X X X X X X X X X X
Cabernet Sauvignon CL 341
CN41 X X 227 238 X X X X 186 192 247 X X X X X X X X
Sauvignon Blanc CN25 128 146 226 230 239 257 171 185 186 192 245 247 240 250 233 235 207 213 240
--
a
Montepulciano CN24 128 140 224 226 249
--
a
185 191 188 198 251
--
a
240
--
a
233 243 207 209 258 272
Syrah CN43 128
--
a
224 230 239
--
a
185 187 186 192 245 251 242
--
a
217 227 209 213 240 272
Pinot Noir CN26 132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213
--
a
240 272
Tempranillo CN37 138 140 234
--
a
239 253 179
--
a
194 198 247 251 242 254 227 233 207 209 250
--
a
Itália CN3 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
126
126
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
CAMPOS NOVOS
Itália Export CN4 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Itália Koga CN13 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Rubi Itália CN9 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Red Meire CN22 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Benitaka CN18 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 254 233 243 209
--
a
252 272
Gran D’ Oro CN16 118 130 234
--
a
235 249 179 181 200 202 247
--
a
242
--
a
225 229 201 213 248
--
a
Bordô CN6 118 130 234
--
a
235 249 179 181 200 202 247
--
a
240
--
a
225 229 201 213 248
--
a
Isabel CN10 118 146 236
--
a
235 249 175 179 200 202 237 247 240 250 225 235 201 213 248 272
Isabel Precoce CN14 118 146 236
--
a
235 249 175 179 200 202 237 247 240 250 225 235 201 213 248 272
Niágara Rosada CN7 118 128 234
--
a
235 241 175 181 200 202 237 259 240
--
a
229 235 201
--
a
248 272
Niágara Branca CN19 118 128 234
--
a
235 241 175 181 200 202 237 259 240
--
a
229 235 201
--
a
248 272
Moscato Giallo CN17 128 138 226 238 239 249 175
--
a
184 186 249 255 240 256 235 245 207
--
a
258 272
Moscato Embrapa CN30 128 138 226 238 239 249 175
--
a
184 186 249 255 240 256 235 245 207
--
a
258 272
BRS Lorena CN15 128 138 226 238 239 249 175
--
a
184 186 249 255 240 256 235 246 207
--
a
258 272
BRS Morena CN2 130
--
a
234 236 239 249 175
--
a
186 194 255 257 240 256 217 233 209 213 264 272
Alphonse Lavallée CN5 128 130 224 236 249 255 181
--
a
184 202 239 251 240 256 243
--
a
207 213 252 272
Cabernet Sauvignon CL 341 CN42 134 146 230 238 239 239 171 185 186 192 247 247 240 250 233 235 203 207 240
--
a
BRS Rubea CN31 118
--
a
234
--
a
241 249 181
--
a
200 202 247 259 240 254 229
--
a
201 213 248 272
Concord Precoce CN20 120 128 234
--
a
235 241 181
--
a
200 204 247 259 240
--
a
229 243 185 199 250 272
Concord CN21 120 128 234
--
a
235 241 181
--
a
200 204 247 259 240
--
a
229 243 185 199 250 272
127
127
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
VIDEIRA E TANGARÁ
Malbec V7 128 146 226 238 239 263 185 187 186 200 245 259 240 250 233
--
a
207 209 240 252
Itália V25 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Brasil V14 128 144 230 238 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Red Meire V20 128 144 230 236 243 247 175 191 190 202 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Viognier V1 128 134 224 230 239 249 181 187 186 198
--
a
--
a
240 242 215 243 209
--
a
262 272
BRS Morena V21 130
--
a
234 236 239 249 175
--
a
186 194
--
a
--
a
240 256 217 233 209 213 264 272
Alphonse Lavallée V18 128 130 224 236 249 255 181
--
a
184 202 239 251 240 256 243
--
a
207 213 252 272
Muscat de Alexandria
V22 133 149 228 232 249 251
--
a
--
a
185 203 246 254 253 253 247 271 216 244 265 273
Marselan
V5 134 140 224 230 243 247 175 191 190 202 255 257 240 242 233 243 203 207 240
--
a
Alicoute Bouchet
V6 128 140 224
--
a
X X 179 191 186
--
a
243 257 X X X X 209
--
a
250 272
Petit Verdot
V2 138 152 224 230 239 263 175 185 192 202 239 247 250 256 217 235 209 213 240
--
a
Patrícia
V10 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Riesling Renano
V12 X X 239
--
a
X X 186 200 X X X X X X X X X X X X
Tardia de Caxias
V13 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Vênus
V15 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Couderc
V17 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Petit Verdot
V2 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Arimonoa
V4 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Bailey
V8 X X 231 238 X X X X X X X X X X X X X X X X
Dona Zilá
V9 X X X X X X X X X X X X X 181
--
a
184 202 181 X X
128
128
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
RODEIO
Sangiovese
R6 128
--
a
224 234 239 263 175 181 192 194 243 259 242
--
a
233 243 209
--
a
252 256
Merlot CL R3
R13 134 146 224 234 239 247 185 187 192
--
a
259
--
a
240 250 227 233 209 213 240
--
a
Teroldego
R14 132 152 224 226 239 247 181
--
a
192
--
a
243 255 240 242 227 235 209 213 240 262
Montepulciano
R22 128 140 224 226 249
--
a
185 191 188 198 251
--
a
240
--
a
233 243 207 209 258 272
Trincadeira
R12 132 148 226 236 239 243 181 185 186 192 239 245 240 250 217 235 213
--
a
240 272
* Bordô
R21 118 130 234
--
a
235 249 179 181 200 202 247
--
a
240
--
a
225 229 209* 213 248
--
a
Bizaraqui
R16 118 146 236
--
a
235 249 175 179 200 202 237 247 240 250 225 235 201 213 248
--
a
Uva pêra ou Moscatel
R18 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Marta
R15 120 146 234
--
a
235 249 179 181 200 202 247 264 250
--
a
225 229 201 213 248
--
a
Isabel
R10 120 136 234
--
a
235 241 179 181 200
--
a
247 259 242
--
a
225 229 201
--
a
252
--
a
Touriga Nacional
R11 X X 237
--
a
X X X X X X X X X X X X X X X X
Niágara Rosada
R17 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Niágara Branca
R19 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Seibel
R1 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Couderc
R20 X X X X 235 257 183
--
a
X X X X X X X X X X X X
Chardonnay
R2 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Vênus
R3 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Tinta Roriz
R4 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Sauvignon Blanc
R5 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Cabernet Sauvignon CL RS
R7 X X 230 237 X X X X X X X X X X X X X X X X
Porta – enxerto (sem
identificação)
R8 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Pinot Noir
R9 160
--
a
230
--
a
239 254
--
a
X X X X X X X X X X X X X
129
129
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
NOVA TRENTO
Bordô
NT9 118 130 234
--
a
235 249 179 181 200 202 247
--
a
240
--
a
225 229 201 213 248
--
a
Gran D’ Oro
NT6 118 130 234
--
a
235 249 179 181 200 202 247
--
a
240
--
a
225 229 201 213 248
--
a
Isabel
NT5 118 146 236
--
a
235 249 175 179 200 202 237 247 240 250 225 235 201 213 248 272
Niágara Branca
NT2 118 128 234
--
a
235 241 175 181 200 202 237 259 240
--
a
229 235 201
--
a
248 272
Marta
NT3 120 146 234 236 235 249 179 181 200 202 247 264 250
--
a
225 229 201 213 248
--
a
1 planta só ( sem identificação)
NT4 128 156 232 264 239 253 185
--
a
185 192 245 257 250
--
a
217 235 203 211 240
--
a
Goethe
NT1 X X 224 237 X X 181 183 X X X X X X X X X X X X
Niágara Rosada
NT7 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Concord
NT8 X X 226 230 X X X X X X X X X X X X X X X X
URUSSANGA
Bordô
U45 118 130 234
--
a
235 249 179 181 200 202 247
--
a
240
--
a
225 229 201 213 248
--
a
São João
U51 118 130 234
--
a
235 249 179 181 200 202 247
--
a
242
--
a
225 229 201 213 248
--
a
Goethe Clássica
U1 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Primo
U3 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U6 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U9 120 130 230 236 235 247 181 183 186 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U11 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U17 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
130
130
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
URUSSANGA
Goethe Primo
U21 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Clássica
U22 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 253
Goethe Clássica
U28 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 253
Goethe Primo
U47 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Goethe Primo
U48 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 253
Goethe Clássica
U50 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 253
Clone GP
U52 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 253
Goethe Clássica
U53 120 130 230 236 235 247 181 183 190 204 239 247 242 254 229 235 203 209 246 252
Marta
U19 120 146 234 236 235 249
--
a
--
a
200 202 247 264 250
--
a
225 229 201 213 248
--
a
Familia Moscatel
U26 128 144 230 236 239 263 175 181 192 194 255 257 240 250 233 243 209 211 252 272
Prima
U15 128 130 224 234 243 249 177 181 184 187 251 259 224 242 217 243 201 213 262 272
Ora
U18 128 130 224 234 239 249 181 187 186 198 251 259 242 256 217 243 201 213 262 272
Tinturina
U23 128 156 232 264 239 253 185
--
a
192 202 251 255 242 256 217 235 211
--
a
240
--
a
Vidal Blank
U2 128 146 226 230 237 247 177 185 184 186 251 259 238
--
a
233 243 201 211 256 272
Centenial Seedless
U5 130
--
a
236 238 239
--
a
175
--
a
178 192 245 261 240
--
a
217 235 209 213 264 272
Catawba
U7 118 130 238
--
a
235 247 165 181 192 200 239 247 242 256 229
--
a
201 209 246 272
Fantasia
U12 130 148 232 236 239 249 189
--
a
184 190 257 259 224 254 243
--
a
209 213 252 272
Red Globe
U13 130 146 234 236 239 249 177
--
a
184 186 247 259 250 256 257
--
a
207
--
a
252 272
Catawba
U14 120 152 236 238 235 247 181 183 192 200 239 247 250 256 229
--
a
201 209 246 272
Vilamar
U20 128 140 236 242 239 249 175 191 186 194 259 261 242 256 229 243 201
--
a
252 272
Regente
U24 128 150 224 236 243 247 175 191 190 202 251 259 238 266 233 257 199 209 240 272
Cristal
U27 138 148 238
--
a
235 257 179 191 186 200 237 247 238 248 225 233 201 209 248 252
IAC 313 ‘Tropical’
U4 132 138 238
--
a
245 251 183 207 188 190 257
--
a
240
--
a
219 253 203 209 240
--
a
IAC 766 ‘Campinas’
U8 128 132 230 236 235
--
a
195 203 198
--
a
243 255 240
--
a
213 251 197
--
a
238
--
a
131
131
Tabela 24. Continuação
VARIEDADE
CODE VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD31 VVMD32
URUSSANGA
Gran D’ Oro
U54 118 130 234 --- a 235 249 179 181 200 202 247 --- a 242 --- a 225 229 201 213 248 --- a
Gran D’ Oro
U49 118 130 234 --- a 235 249 179 181 200 202 247 --- a 242 --- a 225 229 201 213 248 --- a
Benifugi
U10 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
IAC Jales
U16 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Bordô Híbrido
U25 128 145 230 237 244 248 X X X X X X X X X X X X X X
FLORIANÓPOLIS
VR 043-43
U33 138 142 226 248 235 249 181 191 200 202 247 264 248 266 243
--
a
203 209 244 272
101-14
U35 132 140 250 264 239 251 181 185 186 192 259 261 238 252 213 243 197 209 236 238
Paulsen 1103
U37 132 144 234 264 257 265 181 183 190 204 239 247 236 246 X X 201 209 260
--
a
SO4
U38 140 144 234
--
a
239 253 185
--
a
186 192 245 257 238 246 251
--
a
X X 260
--
a
Pesc 2
U40 134 136 262
--
a
251
--
a
185 207 190 202 255 257 238
--
a
235 241 197 203 238 246
Gravesac
U29 136 158 262 264 245 251 183 207 X X X X 238
--
a
239
--
a
197
--
a
266
--
a
3309
U31 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Pesc 2
U32 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
VR 039-16
U34 X X X X X X X X X X X X X X X X 190 205 240 248
110-R
U36 X X X X 235 247 181 183 X X X X X X X X X X X X
Branco rasteiro
U39 X X X X X X X X X X X X X X X X 192 202 251 259
Kobber
U30 X X X X 243 247 X X X X X X X X 185 187 186 200 X X
* variedade e alelo em negrito: variabilidade intravarietal
a
: O “---“ símbolo indica que a variedade pode ser ou homozigota ou heterozigota com alelo nulo
X: não amplificou
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