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UNIVERSIDADE POTIGUAR
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
CURSO DE MESTRADO EM ODONTOLOGIA
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO FATOR VIII E
CD31 EM CARCINOMA ESPINOCELULAR DE LÍNGUA,
LÁBIO INFERIOR E ASSOALHO DE BOCA.
JOÃO BATISTA OLIVEIRA MAIA
NATAL
2007
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2
JOÃO BATISTA OLIVEIRA MAIA
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO FATOR VIII E DO CD31 EM
CARCINOMA ESPINOCELULAR DE LÍNGUA, LÁBIO INFERIOR E
ASSOALHO DE BOCA.
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em
Odontologia da Universidade potiguar, como parte dos
requisitos para a obtenção do Grau de Mestre em
Odontologia – Área de Concentração Clínica
Odontológica.
Orientadora: Profa. Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira
Co-orientadora:Dra. Maria Goretti Freire de Carvalho
NATAL
2007
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3
JOÃO BATISTA OLIVEIRA MAIA
EXPRESSÃO IMUNO - HISTOQUÍMICA DO FATOR VIII E DO CD31
EM CARCINOMA ESPINOCELULAR DE LÍNGUA, LÁBIO INFERIOR E
ASSOALHO DE BOCA.
Dissertação apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e
Pós-Graduação da Universidade de Potiguar, como
parte integrante dos requisitos para a obtenção do título
de Mestre (Mestrado em Odontologia).
Área de Concentração: Clínica Odontológica
Orientadora: Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira
Co-orientadora: Dra. Maria Goretti Freire de Carvalho
Banca Examinadora:
_________________________________________________
Profa. Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira (Orientadora)
________________________________________________
Profa. Dra. Maria Goretti Freire de Carvalho (UnP)
_________________________________________________________
Profa. Dra. Ruthinéa Diógenes Alves Uchoa Lins (UEPB)
NATAL
2007
4
DEDICATÓRIA
Dedico todo o meu trabalho e esforços à
Deus por ter dado oportunidade tão ímpar
em minha vida e por iluminar todos os meus
dias.
5
AGRADECIMENTOS
Ao Chanceler Prof.. Paulo Vasconcelos de Paula, ao Reitor Prof. Manoel Pereira
dos Santos, ao Vice-Reitor Prof. Mizael Araújo Barreto, à Pró-Reitora de Pesquisa
e Pós-Graduação Profa. Dra. Lecy Maria de Araújo Gadelha Fernandes, ao
Diretor do Curso de Odontologia Prof. Dr. Tasso Gadelha Fernandes.
À Deus
Por me iluminar e dar discernimento nos momentos difíceis dessa jornada.
À minha querida e tão amada família, pela enorme compreensão e total apoio em
todos os momentos.
À Profª. Drª. Rejane Andrade de Carvalho pela maneira materna de conduzir a
pós-graduação da Universidade Potiguar, sempre alegrando e encorajando a todos.
À Prof
ª
. Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira pela orientação prestada durante esta
etapa da minha vida.
À Profª. Dra. Maria Goretti Freire de Carvalho pela sua paciência e dedicação, o
que a faz uma grande e querida mestre.
Ao Prof. Dr. Flávio Roberto Guerra Seabra por ter contribuído de forma especial.
A todos os professores que compõem a pós-graduação da Universidade Potiguar:
Alex José Santos, Alexandre Dias , Cláudia Tavares Machado, Carlos Frederico
6
de Moraes Sarmento, Cícero Gadê Neto, Edja Maria de Melo Brito, Rosângela
Vitória Daniel, Samira Albuquerque de Souza.
Aos colegas de turma pelo convívio e aprendizado: Ana, Eva, Lílian, Luciana,
Eliziane, Rachel, Rafael, Rômulo e Vilmar.
Às amigas Daniella, Lucy e Patrícia e aos amigos Lacet e Vânio pelo
companheirismo nas horas de dificuldade e pelas risadas nos momentos de
descontração.
A todos do Centro de Saúde Miriam Mota, em especial a Flávia D’alva e Aldenice.
A Dra. Isabel Cristina Carlos por ter incentivado continuamente e apoiado nos
momentos de ausência.
A Fundação Cearense de Apoio à Pesquisa (FUNCAP) por ter me apoiado
financeiramente.
A todos que direta ou indiretamente participaram da elaboração desse trabalho, o
meu muito obrigado.
7
________________________________________________
8
RESUMO
Considerando a imprevisibilidade de comportamento biológico do carcinoma
espinocelular de boca (CEC), a angiogênese tumoral vem sendo estudada para
correlacionar à agressividade destas neoplasias com seu prognóstico. Este
trabalho teve como objetivo avaliar a expressão imuno-histoquímica do Fator
VIII e CD31 em CEC de boca. Para o estudo foram selecionados 15 casos de
CEC, localizados em lábio inferior (cinco casos), assoalho bucal (cinco casos) e
língua (cinco casos). Inicialmente foi realizada uma análise morfológica em
todos os casos, seguindo os critérios recomendados por Bryne (1989), e
classificados em alto e baixo escore de malignidade, conforme preconizado por
Anneroth, Batsakis e Luna (1986). A angiogênese foi medida através da
contagem de células marcadas pelo Fator VIII e CD31. Os resultados
demonstraram que houve diferença estatisticamente significante na marcação
do Fator VIII entre os casos de CEC de baixo e de alto grau de malignidade
(p=0,0484; Teste de Mann-Whitney). Quando se comparou a expressão destes
marcadores entre os sítios da lesão, observou-se uma marcação
estatisticamente maior no assoalho bucal, tanto para o CD31 (p=0,01 ANOVA a
Um critério) quanto para o Fator VIII (p=0.006 ANOVA a Um critério). Conclui-
se que a angiogênese , expressa pelo Fator VIII em CEC de boca pode está
relacionada ao comportamento biológico do tumor.
Palavras-chave: carcinoma espinocelular, angiogênese, Fator VIII, CD31
.
9
__________________________________________
10
ABSTRACT
Considering the unpredictability of the biology of oral squamous cell
carcinomas, tumoral angiogenesis has been evaluated as a means of
correlating the level of tumor severity and its prognosis. The aim of this study
was to evaluate the immunohistochemical expression of both factor VIII and
CD31 in oral squamous cell carcinomac (SCCs). Based on the study of 15 oral
SCCs (5 lower lip, 5 floor of the mouth, 5 tongue) a morphologic analysis was
initially performed as recommended by Bryne(1989), and the tumors
subsequently classified into either high or low grades of malignancy, as defined
by Anneroth, Batsakis and Luna (1986). Angiogenesis was assessed by cell
counting of factor VIII and CD31 stained cells. There were statistically
significant differences (Mann-Whitney, p=0,0484) in factor VIII expression in
high and low grade tumors. Moreover, both VII and CD31 expression was
greater in the floor of the mouth (One-way-ANOVA, p=0.006 and p=0.01
respectively). The results above suggest that the angiogenesis conting of fator
VII index of the SCC, of the mouth this neoplasm correlated with the biological
behavior of oral squamous cell carcinomas.
Keyword: squamous cell carcinomas, angiogenesis, factor VIII, CD31
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
CEC de lábio inferior exibindo área de front de invasão
tumoral (HE 40X).
48
Figura 2 Cortes histológicos de CEC de lábio inferior marcado com
anticorpo anti-CD31 evidenciando a seleção dos campos
para contagem.
51
Figura 3
Aspecto microscópico de CEC de baixo escore de
malignidade em lábio inferior, exibindo área de invasão
tumoral na forma de ninhos celulares (H&E, 40x).
58
Figura 4 Detalhe da figura anterior mostrando área de invasão tumoral
e infiltrado inflamatório (H&E, 100x).
58
Figura 5 Detalhe da figura 3 mostrando presença de ceratinização em
CEC de língua (H&E, 400x).
59
Figura 6 Aspecto microscópico de CEC de alto escore de malignidade
em assoalho (H&E, 40x).
59
Figura 7 Detalhe da figura anterior mostrando invasão tumoral na
forma de ninhos (H&E, 100x).
60
Figura 8 Detalhe da figura anterior exibindo área de invasão tumoral
com intenso pleomorfismo nuclear e escasso infiltrado
inflamatório (H&E, 400x).
60
12
Figura 9 Aspecto microscópico de CEC de língua de baixo
escore de malignidade (H&E, 40x).
61
Figura 10 Detalhe da figura anterior exibindo ceratinização (H&E,
400x)
61
Figura 11 CEC de lábio de baixo escore de malignidade exibindo
marcação positiva para o CD31 (40X).
64
Figura 12 Detalhe da figura anterior mostrando marcação positiva em
área de invasão tumoral (100X)
64
Figura 13 Detalhes dos campos selecionados para contagem das
células CD31 positivas (setas) em CEC de lábio (400x).
65
Figura 14 CEC de lábio de baixo escore de malignidade exibindo
marcação positiva para o Fator VIII. No detalhe a marcação
positiva de vaso.
65
Figura 15 CEC de assoalho de alto escore de malignidade exibindo
marcação positiva para o CD31. Observar detalhe da
marcação (seta).
66
Figura 16 Marcação do Fator VIII CEC de assoalho de alto escore de
malignidade exibindo marcação positiva para o CD31.
Observar detalhe da marcação (seta).
67
Figura 17 CEC de língua de baixo escore de malignidade
exibindo marcação positiva para o CD 31.
67
Figura 18 CEC de língua de baixo escore de malignidade
exibindo marcação positiva para o Fator VIII.
68
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Casos de CEC no sítio anatômico língua e médias dos
escores obtidos para cada caso avaliado e classificação em
baixo ou alto grau de malignidade. Natal/RN- 2007
55
Tabela 2 Casos de CEC no sítio anatômico lábio inferior e escores
obtidos para cada caso avaliado e classificação em baixo
ou alto grau de malignidade..Natal/RN- 2007
55
Tabela 3 Casos de CEC no sítio anatômico assoalhol e escores
obtidos para cada caso avaliado e classificação em baixo
ou alto grau de malignidade. Natal/RN- 2007
55
Tabela 4 Valores observados para cada um dos parâmetros
avaliados no sítio anatômico língua. Natal/RN- 2007
56
Tabela 5 Valores observados para cada um dos parâmetros
avaliados no sítio anatômico lábio. Natal/RN- 2007
56
Tabela 6 Valores observados para cada um dos parâmetros
avaliados no sítio anatômico assoalho. Natal/RN- 2007
57
Tabela 7 Casos de CEC e média de células positivas para os
marcadores CD31 e Fator VIII de acordo com os sítios
anatômicos estudados. Natal/RN – 2007
62
Tabela 8 Comparação de médias de contagem das células positivas
entre os sítios anatômicos avaliados para os marcadores
Fator VIII e CD31. Natal/RN – 2007
63
14
Tabela 9 Resultados do CD31, segundo a classificação de
malignidade de Aneroth, Batasakis e Luna (1986). Natal/RN
– 2007
69
Tabela 10 Resultado para o Fator VIII, segundo a classificação de
malignidade de Aneroth, Batasakis e Luna (1986). Natal/RN
– 2007
69
Tabela 11 Resultados do teste de Tukey para o marcador CD31
aplicado entre os sítios anatômicos língua , assoalho e
lábio inferior. Natal/RN – 2007
70
Tabela 12 Resultados do teste de Tukey para o marcador Fator VIII
aplicado entre os sítios anatômicos língua , assoalho e
lábio inferior. Natal/RN – 2007
71
15
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Gráfico com os valores percentuais de casos de CEC
classificados em alto escore e baixo escore de malignidade
de acordo com Bryne (1998).
54
Gráfico 2
Gráfico representando as médias obtidas conforme sítio
anatômico estudado e marcador CD31 e Fator VIII.
62
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Distribuição dos casos de CEC de acordo com o sítio e
grupos .
46
Quadro 2 Especificação dos anticorpos utilizados com suas
respectivas especificidades e diluições utilizadas.
47
Quadro 3 Sistema de gradação histológica de malignidade proposto
por Bryne et al. (1998).
49
Quadro 4 Classificação de malignidade conforme Anneroth, Batsakis
e Luna (1986).
49
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 16
2. REVISÃO DALITERATURA......................................................................... 19
2.1 Carcinoma espinocelular (CEC) - considerações gerais.........................
20
2.2 Carcinoma espinocelular oral x sistema de gradação de malignidade
(SGHM).........................................................................................................
25
2.3 Angiogênese tumoral................................................................................
29
2.4 Marcadores tumorais – Fator VIII e CD31................................................ 35
3. PROPOSIÇÃO ............................................................................................... 42
4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 44
4.1 Característica do estudo.......................................................................... 45
4.2 Amostra.................................................................................................... 45
4.3 Metodologia............................................................................................. 46
4.4 Análise morfológica.................................................................................. 47
4.5 Estudo imuno-histoquímico...................................................................... 50
4.6 Análise estatística.....................................................................................
52
5. RESULTADOS ............................................................................................... 53
5.1 Análise Morfológica.................................................................................. 54
5.2 Estudo imuno-histoquímico...................................................................... 62
5.3 Análise estatística.....................................................................................
69
6. DISCUSSÃO................................................................................................... 72
7. CONCLUSÕES............................................................................................... 83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 85
ANEXO.............................................................................................................. 95
17
___________________________________________
1 INTRODUÇÃO
18
O carcinoma espinocelular (CEC) é a neoplasia maligna mais comum na
boca, sendo considerado um problema de saúde pública no Brasil. Esta neoplasia
está entre as mais comuns na população adulta, ocupando o sexto lugar entre os
cânceres mais incidentes nos homens e o oitavo nas mulheres (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, INCA, 2003). Observa-se que a sobrevida dos indivíduos acometidos pelo
CEC continua baixa, apesar dos recentes avanços científicos desenvolvidos na
terapêutica desta condição (MOORE et al., 2000; RAMALHO et al., 2002).
A agressividade das lesões do CEC é bastante heterogênea e pode estar
relacionada a diversos fatores, como gradação histológica, tamanho da lesão, grau
de comprometimento dos tecidos vizinhos, presença de metástase e localização
anatômica do tumor (BRYNE, 1991; TODO; DONOFF; WONG, 1997; BRYNE,
1998). Baseados nesta heterogeneidade alguns estudos têm sido realizados no
sentido de estabelecer uma correlação entre as características clínicas e
histopatológicas desta lesão com o seu prognóstico. Estes estudos buscam
informações que possam indicar o comportamento biológico e a agressividade do
tumor no sentido de fornecer dados para uma melhor ação terapêutica nesta
neoplasia.
A tumorigênese é um processo desenvolvido em várias etapas, sendo que a
formação de novos vasos sanguíneos representa um passo essencial para o seu
desenvolvimento e, também, para a formação de metástases. Através da
neoformação de vasos, a neoplasia obtém o suprimento sanguíneo que fornece
oxigênio, nutrientes e rotas para a colonização de células malignas em sítios
distantes (FOX, 1997).
Partindo deste raciocínio FOLKMAN; LONG; BEEKER (1963)
desenvolveram os primeiros trabalhos relacionando crescimento tumoral e a
neoformação vascular. A partir de então a maioria das pesquisas foi desenvolvida
buscando elucidar a relevância clínica da angiogênese na biologia tumoral.
Atualmente estudos têm sido realizados em várias áreas da oncologia pesquisando
o papel da angiogênese como um biomarcador tumoral (SOUZA, 2002; PINSKY et
al., 2006; LEE et al., 2007; HARDEE et al., 2007; REANG; GUPTA; KOHLI, 2007).
19
Apesar de existirem pesquisas utilizando marcadores imunohistoquímicos
para relacionar a angiogênese com o prognóstico do CEC de boca, os resultados
encontrados até o momento são contraditórios e não conclusivos. Enquanto algumas
pesquisas afirmam que uma maior da expressão da angiogênese pode estar
relacionada a um prognóstico menos favorável e uma maior possibilidade de
desenvolvimento de metástases, outras não foram capazes de comprovar esta
associação.
Baseados nos estudos anteriores e buscando um melhor entendimento
sobre o papel da angiogênese como fator de prognóstico do CEC, é objetivo desta
pesquisa avaliar a expressão dos marcadores angiogênicos anti-Fator VIII e anti-
CD31 em CEC de lábio inferior, língua e assoalho de boca.
20
___________________
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CARCINOMA ESPINOCELULAR (CEC) - CONSIDERAÇÕES GERAIS
21
O carcinoma epidermóide oral, também denominado de carcinoma de
células escamosas ou carcinoma espinocelular (CEC), representa a neoplasia
maligna mais freqüente na boca e é uma doença multifatorial com diversos
elementos envolvidos na sua ocorrência (NEVILLE et al. ,1998; ABDO, 2001).
O CEC acomete aproximadamente 7% da população mundial, onde o Brasil
ocupa o 4º lugar em incidência no mundo, estimando-se que cerca de 10% dos
tumores malignos brasileiros localizam-se na boca (INCA, 2002). Atinge mais
homens do que mulheres, ambos com idade acima de 60 anos. Entretanto, de
acordo com Moore et al. (2000) esse perfil epidemiológico alterou em função da
mudança de hábitos, observando-se aumento na incidência em pessoas jovens,
abaixo dos 45 anos de idade.
Clinicamente o CEC oral exibe várias apresentações, incluindo formas
leucoplásicas, eritroleucoplásicas ou ulceradas, podendo ter crescimento exofítico
e/ou endofítico, podendo ou não desenvolver metástases para linfonodos regionais
ou à distância (JORDAN; 1997; NEVILLE et al,1998).
O carcinoma epidermóide ocorre principalmente na língua e lábios, podendo
acometer outros sítios como assoalho, mucosa jugal, gengiva e palato (REGEZI,
2000). Dentre os sítios anatômicos, o carcinoma de língua geralmente apresenta
pobre diferenciação histológica, avançado estágio clínico, evolução rápida e maior
probabilidade de desenvolvimento de metástases à distância, sendo assim uma
lesão de prognóstico reservado, quando comparado ao CEC de outros sítios
anatômicos orais (SCHARTZ et al., 2000).
Fatores intrínsecos tais como alterações genéticas, deficiências nutricionais
e imunossupressão; e fatores extrínsecos como radiação solar, tabaco, álcool, e
alguns vírus, têm sido apontados dentre os agentes relacionados a sua
etiopatogenia (ABDO, 2001; UOBE et al., 2001).A influência genética familiar é
também um importante agente contribuinte para o desenvolvimento de carcinomas
de cabeça e pescoço (YU et al., 1999).
22
O fumo e o álcool representam os fatores mais significativos na etiologia do
câncer oral. O tabaco, fumado ou mascado, pode atuar isoladamente ou em
sinergismo com o álcool, estando correlacionado que o risco para o desenvolvimento
da carcinogênese aumenta proporcionalmente com a quantidade de fumo
consumido, havendo um efeito multiplicativo quando associado ao álcool (ALLISON,
2002).
No tocante a etiologia viral, Summersgill et al. (2001) sugeriram que a
infecção oral por HPV pode ter um papel significativo na carcinogênese e
progressão do câncer oral. Em estudo desenvolvido por Kojhima et al. (2002) para
verificar a correlação entre o HPV-38 em 53 casos de CEC de boca, verificaram que
a positividade para este vírus estava associada a super- expressão do p53 e PCNA,
concluindo que a infecção por este vírus, concomitante a outros fatores pode ter um
papel importante na carcinogênese oral, podendo atuar como co-fator no referido
processo.
Em relação aos fatores intrínsecos, a literatura aponta os hormônios,
imunosupressão, deficiências nutricionais e mutações genéticas (INCA, 2002).De
acordo com Ramalho et al. (2002) o desenvolvimento do CEC oral relaciona-se
diretamente com alterações na estrutura e regulação genética, principalmente
naqueles genes reguladores do processo de divisão celular. Dentre as alterações
genéticas, as mutações no gene p53 são as mais comuns, podendo essa ser
utilizada como indicador de prognóstico nos carcinomas epidermóides orais
(YAMAZAKI et al., 2003).
Alguns estudos apontaram fatores que influenciam no prognóstico e
sobrevida dos pacientes portadores desta neoplasia, destacando-se gradação
histológica de malignidade, tamanho e localização do tumor primário,
comprometimento de linfonodos regionais e presença de metástases à distância
(BRYNE,1998). Moles et al., (2002) destacam que a espessura do tumor é o
principal parâmetro que influencia na sobrevida de pacientes portadores de câncer
de língua.
23
De acordo com Hiratsuka et al. (1999) o sistema TNM representou o
parâmetro prognóstico mais exato. Conforme Pugliano et al. (1999) os principais
objetivos deste sistema são: auxiliar no planejamento, dar alguma indicação do
prognóstico, ajudar na avaliação dos resultados do tratamento, facilitar informações
entre centros de tratamento e contribuir na investigação contínua do câncer. Este
sistema é baseado no aspecto de que pequenos tumores sem metástases têm
melhor prognóstico que tumores maiores com metástases, apesar de que alguns
tumores com o mesmo estadiamento clínico mostram diferentes padrões de
crescimento e prognóstico, reforçando a tese de que há necessidade de outros
meios para avaliação prognostica.
Dib et al. (1994) observaram que o sistema de estadiamento clínico TNM
apresenta muitas qualidades, principalmente por avaliar as características
fundamentais de um câncer que são: extensão local, disseminação regional e
metástases à distância. Os sistemas de gradação histológica de malignidade são
importantes, tendo em vista que enfatizam as características histopatológicas e a
relação imunológica entre tumor e hospedeiro.
Estudo realizado por Costa et al. (2002) em 120 casos de CEC oral para
investigar a existência de correlação da classificação clínica TNM com gradação
histológica de malignidade e localização anatômica, concluíram que houve
correlação estatisticamente significante de ambos e a classificação TNM.
O sistema tumor, linfonodo, metástase (TNM) de classificação do câncer
bucal é o de uso mais difundido entre os clínicos e ainda tem como objetivo predizer
o prognóstico dos pacientes portadores do CECB. Apesar de grande aceitação
clínica, esse sistema de estadiamento apresenta óbvias limitações
.
A implementação
de sistemas de gradações morfológicas, associados ao sistema de estadiamento
clínico TNM, pode propiciar informações prognósticas mais confiáveis para os
pacientes e suas famílias (ALBELDA, S.M.,1993).
A correlação clínica, histológica e imunohistoquímica foi avaliada por
Silveira (2004), estudando 30 casos de CEC de língua através da expressão das
citoqueratinas 7,10,13,14,16 e 19 para verificar a correlação da gradação histológica
de malignidade proposta por Bryne (1998) e o comportamento biológico do CEC de
24
língua. A autora concluiu que a utilização da citoqueratinas parece refletir o
corportamento biológico e a agressividade de CEC de língua, no entanto o mesmo
não aconteceu com o sistema de gradação histológica de Bryne (1998) nos casos
estudados.
Schnetler (1992) observou que cerca de 50% dos cânceres orais são
diagnosticados em fases avançadas, principalmente, por serem submetidos à
biópsia apenas quando apresentam sintomas ou características sugestivas de
malignidade. Muitas vezes, neoplasias malignas orais de aparência inócua em
estágio inicial são simplesmente observadas, mas não diagnosticadas
adequadamente. Portanto, o maior determinante do pobre prognóstico é o estágio
avançado da doença no momento do diagnóstico, quando, então, na maioria dos
casos, o tratamento a ser adotado é tardio e, geralmente, mais mutilante e
traumático, nem sempre refletindo numa cura total, com boas taxas de sobrevida
para o paciente.
De acordo com Abreu et al. (2004) lesões menores de 2 centímetros têm
melhor prognóstico, evolução lenta, alto grau de diferenciação e menor potencial
metastático e determinados fatores como tamanho e localização do tumor primário,
comprometimento de linfonodos regionais e presença de metástases podem
influenciar o prognóstico e a sobrevida dos pacientes portadores de CEC.
Histologicamente, o CEC apresenta-se como uma proliferação de células da
camada espinhosa, que se dispõem em grupos celulares, formando cordões e
ninhos, ou de forma individual, envolvendo o conjuntivo, podendo ser classificados
como bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco diferenciado. As
células neoplásicas observadas individualmente exibem hipercromatismo,
pleomorfismo, aumento do número de figuras de mitose e, eventualmente, mitoses
atípicas (NEVILLE et al., 2004).
É grande o interesse na análise das diferentes populações celulares
tumorais em virtude das células mais invasivas do tumor, supostamente,
apresentaram propriedades denotativas de maior agressividade. De acordo com
Barros (2006), anormalidades em genes que regulam a proliferação e morte celular
25
podem provocar inúmeras doenças entre elas o carcinoma epidermóide de boca.
Tem sido relatado que alterações genéticas nas células tumorais predizem a
agressividade biológica dos tumores. Marcadores genéticos como c-erbB-2, Bcl-2 e
EGFR são considerados indicadores promissores de prognósticos de lesões
cancerizáveis e as neoplasias. Segundo Gasco et al. (2003) um fator comumente
associado à etiologia do carcinoma epidermóide oral são a mutações do gene p53,
capazes de impossibilitar a função do guardião do genoma exercida por esse gene,
permitindo assim, a sobrevida de células com danos em seu DNA.
Estudo realizado por Cruz (2006), avaliando a expressão imuno-
histoquímica da e-caderina e do CD 44v6 em CEC de lábio inferior e língua
concluiu-se que esses marcadores não constituiem fator de prognóstico para
pacientes portadores de CEC. Em outro estudo realizado por Pereira (2006),
avaliando a expressão imunohistoquímica das integrinas 21, 31, e 51, em
CEC de lábio inferior e língua sugeriu que haja uma ampla participação dessas
proteínas na carccinogênese oral;no entanto não permitiu correlacionar esses
marcadores como indicador de variações no comportamento biológico dessa
neoplasia.
Em outro estudo realizado por Amar et al. (2002) onde avaliaram a
densidade microvascular no CEC de língua, no sítio primário e em metástases
linfáticas concluiu-se que há uma relação inversa entre a densidade microvascular
no sítio primário e na metástase linfonodal, sugerindo um controle regional ou
sistêmico da angiogênese. De acordo com Speck et al. (2003), a angiogênese, por
ser fator independente e aplicável na prática para todos os tumores sólidos, é
considerada como bom indicador de prognóstico. Assim em carcinoma prostático
apresenta-se aumentada nos tumores de alto grau e nos casos metastáticos.
De acordo com Lathers (1999) as células CD 34 positivas, podem
representar células dendríticas imaturas ou precursores endoteliais e têm sido
encontradas em maior número no sangue periférico e no infiltrado inflamatório
tumoral em pacientes portadores de câncer de cabeça e pescoço. Estas células
causam imunosupressão local, podem estimular a angiogênese e têm sido
associadas com pior prognóstico. Com relação ao Fator VIII, Bremer (1996)
26
observou a sua presença em células endoteliais de carcinoma de mama e considera
um marcador de importância a ser utilizado como fator prognóstico no carcinoma de
colo uterino.
Calux et al. (2001) em estudo acerca da angiogênese na neoplasia
escamosa do colo uterino, comparou dois marcadores de células endoteliais anti-
CD34 e anti- fator VIII e concluiu que o emprego do anti-CD 34 permite deteccção de
maior número de vasos do que o uso do anti-fator VIII. Confirmou-se a utilidade de
ambos os marcadores na avaliação da angiogênese, concluindo que a angiogênese
diferencia lesões de baixo e alto grau, utilizando-se anti-fator VIII, o que não ocorre
com o anti CD34.
Segundo Van Heerden et al. (1995) a avaliação do prognóstico tumoral tem
importância ímpar, pois mesmo os tumores de igual estadiamento clínico
apresentam, na maioria dos casos, comportamentos diferentes. Torna-se
fundamental, portanto, a aplicação de métodos complementares de diagnóstico e
classificação, como uma gradação histológica, por exemplo, para a determinação da
tendência quanto ao curso evolutivo da lesão (SPIRO et al., 1986).
2.2 CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL X SISTEMA DE GRADAÇÃO DE
MALIGNIDADE (SGHM)
O CEC oral apresenta diversos aspectos microscópicos que asssociados a
achados clínicos permite traçar o comportamento tumoral frente o potencial de
malignidade e mesmo graduá-lo numa classificação variando de bem diferenciado a
indiferenciado (MIRANDA, 2002).
A criação de SGHM foi introduzida por estudos desenvolvidos por Broders
(1920) acerca das características morfológicas das células que compunham o
tumor.Em 1941, o mesmo autor analisou o grau de anaplasia com o grau de
malignidade do tumor, ressaltando a associação entre a diferenciação dos tumores
com o tratamento e prognóstico.
27
Wahi (1971), propôs um novo método de gradação para CEC oral,
baseando-se na presença de pérolas córneas, ceratinização celular individual,
evidência de pontes intercelulares, figuras de mitoses, mitoses atípicas, células
neoplásicas gigantes multinucleadas, pleomorfismo celular e nuclear.
Baseados nas características morfológicas das células neoplásicas e na
relação tumor-hospedeiro de CEC oral, Jakobsson et al.(1973) estudando CEC da
glote idealizaram um sistema de gradação aplicando-se escores numéricos variando
de 1 a 4 pontos, destacando a importância do pleomorfismo nuclear e o padrão de
invasão tumoral na influência na taxa de sobrevida de 5 anos. O autor concluiu que
o sistema de gradação histológica de malignidade exerce uma maior influência na
determinação do prognóstico do paciente em relação ao estadiamento clínico TNM.
A aplicação de métodos complementares de diagnóstico e classificação,
como uma gradação histológica, por exemplo, comprovadamente tem contribuído
para a determinação da tendência quanto ao curso evolutivo das lesões de CEC oral
(SPIRO et al., 1986). De acordo com Van Heerden et al. (1995) a avaliação do
prognóstico tumoral tem importância ímpar, pois mesmo os tumores de igual
estadiamento clínico apresentam, na maioria dos casos, comportamentos diferentes.
O SGHM é de grande importância por se constituir numa linguagem comum
entre estomatologistas, patologistas, oncologistas e cirurgiões, pois influenciam
diretamente no planejamento da terapêutica a ser estabelecida e no prognóstico do
caso (MARTINS NETO, 1999).
A gradação histopatológica de malignidade do CEC de boca é um recurso
microscópico que objetiva classificar a lesão de acordo com o grau de diferenciação
celular, no intuito de fornecer subsídios que possibilitem a interpretação da
agressividade do tumor. Existem diversas gradações escritas na literatura,
denominadas de sistemas de gradação histológica de malignidade (SGHM), com o
propósito comum de fornecer subsídios para possibilitar a interpretação da
agressividade da neoplasia (MARTINS NETO, 1999).
28
Em 1987, Anneroth, Batsakis e Luna fizeram uma ampla análise dos
sistemas de gradaçõeshistológicas existentes e observaram uma grande
controvérsia entre os dados oferecidos quanto à correlação destes sistemas com o
TNM e o prognóstico tumoral. Assim os autores criaram um SGHM considerando
três aspectos em relação à população tumoral, ou seja, grau de ceratinização,
pleomorfismo celular e número de mitoses e três aspectos referentes à resposta do
hospedeiro frente ao tumor: padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado
inflamatório. Este sistema estabelecia uma escala que variava dos níveis I ao IV,
caracterizando um método quantitativo e objetivo e mostrar correspondência entre
os aspectos clínicos com o histológico, refletindo maior fidedignidade com o
prognóstico tumoral.
Dantas et al. (2003) estudando 18 casos de CEC de língua visando
correlacionar os escores de malignidade pelo sistema proposto por Anneroth,
Batsakis e Luna (1987) e a classificação de estadiamento clínico (TNM), chegaram a
conclusão que não existe correlação estatisticamente significativa entre o
estadiamento clínico e a gradação histológica estudada, no entanto o estadiamento
clínico mostrou ser efetivo como indicador de prognóstico.
Estudando 14 casos de CEC oral para analisar a imunoexpressão das
proteínas p53 e PCNA correlacionando com os escores de malignidade proposto por
Anneroth, Batsakis e Luna (1987), Novellino et al.(2003) chegaram a conclusão que
o maior número de PCNA positivas coreelacionava-se com elevado escore de
malignidade , o que não foi verificada quando da análise da p53.
Considerando que as células da frente de invasão tumoral teriam maiores
chances de representar clones neoplásicos potencialmente capazes de produzir
metástase, um novo estudo aplicado a biopsias incisionais foi proposto por Bryne et
al (1989),com base naquele preconizado por Anneroth, Batsakis e Luna (1987),
sendo excluído o estágio de invasão e priorizando a frente de invasão tumoral.
Foram considerados morfologicamente o grau de ceratinização celular,
pleomorfismo celular, número de mitoses, padrão de invasão tumoral e reação
inflamatória, estabelecendo valores numéricos de 1 a 4 para este cinco critérios ,
sendo que o escore total foi dado pela soma dos escores. Dessa forma classificaram
29
como grau I ou de baixo escore de malignidade, quando a soma dos escores
pontuava de 5 a 10 e grau II ou alto escore quando o somatório dos escores
ultrapassava 10 pontos.
Em 1998, Bryne, revisando seus estudos sobre o sistema de gradação
histológica de malignidade, desenvolveu um sistema retirando o parâmetro figuras
de mitose, baseando-se, principalmente, na análise do grau de ceratinização,
pleomeorfismo nuclear, padrão de invasão tumoral e infiltrado inflamatório,
considerando a frente de invasão tumoral como alvo da análise. Também foram
atribuídos valores numéricos de 1 a 4 para cada um desses parâmetros. Esse
sistema mostrou ser uma importante ferramenta no diagnóstico bem como para a
terapêutica dos tumores, sugerindo que a gradação do “front” invasivo é um dado
valioso para análise histológica, uma vez que vários eventos moleculares
importantes ocorrem na interface tumor-hospedeiro, como secreção de enzimas
proteolíticas, alterações em moléculas de adesão, aumento da proliferação celular e
angiogênese.
O sistema de gradação morfológico do front invasivo representa um
conjunto de alterações estruturais e funcionais das regiões mais avançadas do CEC
(NOGUCHI et al, 2002).
A gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998) foi
sugerida por Costa et al. (2005) como sendo a que melhor representa informação
prognóstica da neoplasia, uma vez que não observavam apenas a porção superficial
do tumor.
No entanto os CEC orais apresentam marcada heterogeneidade em seu
comportamento biológico, sendo observado que pacientes com o mesmo estágio
clínico da doença poderão responder diferentemente ao mesmo tratamento (WANG
et al., 2006).
2.3 ANGIOGÊNESE TUMORAL
30
Para que uma célula evolua de seu estado normal até assumir as
características de uma célula neoplásica, é necessária a ocorrência de uma série de
mutações, envolvendo genes que expressem proteínas cuja ação esteja relacionada
ao controle do ciclo celular. Caso esta ação seja no sentido de estimular a divisão
celular, estes genes são genericamente denominados como oncogenes e caso
tenham por função inibi-la serão considerados como genes supressores de tumor.
Seja por função anormalmente exacerbada dos oncogenes ou por inibição dos
supressores, o resultado será a obtenção de uma célula que apresentará um ganho
proliferativo em relação às demais, tornando-se insensível aos estímulos apoptóticos
(ALBERTS, 1999).
Entretanto, aparentemente isto não é suficiente para que esta célula dê
origem a um tumor com volume detectável e capaz de ameaçar a vida do indivíduo.
Para que um determinado grupo de células consiga manter um crescimento
sustentado é necessário que exista uma fonte de suprimento sanguíneo específico e
constante, fato constatado em neoplasias diversas e achado em diversos estudos
(PINHO, 2005).
Há muitas décadas foi percebido que os tumores apresentam uma
vascularização bastante proeminente em relação aos tecidos normais. Estes
achados foram sempre considerados como uma conseqüência do processo
inflamatório decorrente das áreas focais de necrose existentes na massa tumoral
(FOX, 1997).
Existem suficientes evidências hoje de que na verdade a presença desta
vascularização exacerbada é uma condição essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplásico. Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de células endoteliais pertencentes a capilares situados próximos às células
neoplásicas.
Embora os capilares sejam um tipo de tecido universalmente presente em
nosso corpo, são estes formados por células endoteliais que podem ser
consideradas entre aquelas que apresentam um baixo ritmo de divisões celulares
31
entre as demais células do corpo, com um ciclo proliferativo que compreende
centenas de dias, enquanto as células epiteliais, por exemplo, podem se dividir até
duas vezes ao dia (PINHO, 2005).
Assim sendo, a presença de um crescimento vascular acentuado em um
tecido tumoral demonstra dois aspectos bastante relevantes. O primeiro deles é a
existência de um forte estímulo para estas células endoteliais, capaz de alterar seu
estado proliferativo normal. O segundo é a natureza local deste estímulo, uma vez
que tal proliferação irá ocorrer apenas no segmento adjacente ao surgimento de um
diminuto clone de células neoplásicas, crescimento denominado de angiogênese
tumoral e de grande relevância para o desenvolvimento de neoplasias (STRAUME et
al., 2002).
Grande parte do mérito referente ao atual estado de conhecimentos sobre a
angiogênese deve ser atribuída a Folkman, o qual propôs no princípio da década de
setenta a importante participação do desenvolvimento de microcirculação no
processo de crescimento tumoral. Já naquela época, este autou antecipava o futuro
ao sugerir que uma importante linha de estudos na terapêutica antineoplásica estaria
relacionada ao desenvolvimento de técnicas capazes de bloquear o surgimento
desta neovascularização, a fim de impedir o crescimento tumoral (FOLKMAN,
1997).
Cerca de 95% dos tumores malignos humanos são carcinomas que se
originam como diminutas lesões in situ que podem ser encontradas em epitélios
como pele, mucosa gastrointestinal, bexiga, próstata, mama ou colo uterino,
podendo permanecer sem sinais evidentes de crescimento durante anos. Estudos
demonstram que durante esta fase as células neoplásicas poderão já apresentar
uma atividade proliferativa aumentada, não ocorrendo, no entanto, um aumento do
volume tumoral devido ao mecanismo compensatório representado pela apoptose
celular (WANG, 2005).
Nmerosos estudos realizados ao longo das últimas duas décadas
demonstraram fortes evidências de que esta modificação do padrão de crescimento
tumoral é dependente do desenvolvimento de uma neovascularização específica, a
32
qual ocorre em decorrência de diversos fatores locais estimulantes da angiogênese
como a hipóxia e a elevação de CO2 ou óxido nítrico (GORDON et al.,2005).
A presença dos fatores locais como a hipóxia e a elevação de CO2 ou óxido
nítrico, irá desencadear um processo de liberação de diversas proteínas, as quais
atuam no processo de angiogênese e de sua ação estimulante sobre o tecido
neoplásico . Estudos realizados utilizando o fator de crescimento fibroblástico básico
(bFGF) demonstraram que, além de uma elevada ação oncogênica, contribuindo
para a transformação de fibroblastos normais em neoplásicos, esta proteína
apresentava ainda uma grande capacidade de estimular o processo de
angiogênese, sendo ambos revertidos após sua inativação pela adição de um
anticorpo (STRAUME et al.,2002). Estudos semelhantes identificaram outra proteína
com potente ação angiogênica denominada como fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF), considerada de importante ação mitogênica sobre células
endoteliais a qual é hoje relacionada a uma importante linha de terapêutica
antineoplásica (BROLL et al.,2001).
Ao contrário da ciclo-oxigenase-1 (COX-1), a qual é uma enzima
usualmente expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funções
celulares, a ciclo-oxigenase-2 (COX-2) é uma proteína expressa como resposta à
presença de mediadores locais liberados em conseqüência de vários estímulos,
fazendo parte de uma resposta inflamatória a estes. Além disto, diversos estudos
demonstram que sua expressão nos tecidos colorretais está associada a fatores
angiogênicos e formação de novos vasos,ou seja neoformação vascular no processo
de carcinogênese (WU et al.,2004).
Posteriormente a estes agentes considerados como angiogênicos, foram
identificadas algumas proteínas capazes de exercer ação oposta, como a
angiostatina e a endostatina, as quais inibiriam a angiogênese ocorrida nos modelos
experimentais. É interessante notar que a ação inibidora destas proteínas restringe-
se apenas à atividade angiogênica conseqüente à presença de tecido neoplásico,
não exercendo qualquer influência negativa sobre a atividade proliferativa de células
endoteliais normais (ZONDOR et al.,2004).
33
Existem fortes evidências de que a angiogênese esteja relacionada não
apenas ao crescimento tumoral, desempenhando ainda uma importante ação no
processo de formação e desenvolvimento de metástases. Estudos experimentais
demonstram ser bastante infrequente a formação de metástases a partir de tumores
primários antes do desenvolvimento de neovascularização, ocorrendo após esta,
uma facilitação da migração de células neoplásicas através da circulação sanguínea.
Suportando estes achados, diversos autores referem uma correlação positiva entre a
microdensidade vascular e o risco de desenvolvimento de metástases em diversos
tumores, inclusive os de origem na cavidade oral (FOX, 1997).
A proliferação vascular gerando uma rede de capilares com paredes
endoteliais fragmentadas em meio a um tecido formado por células neoplásicas com
baixa adesividade entre si representa um fator favorecedor à penetração e migração
celular através da corrente sanguínea. Além disto, existem evidências de que a
capacidade destas células neoplásicas de liberar fatores angiogênicos contribui para
a formação de metástases através da ativação de plasminogênio e colagenases
contribuindo para a degradação da membrana basal endotelial (PINHO, 2005).
A angiogênese, por ser um fator independente e aplicável na prática para
todos os tumores sólidos, é considerada como um bom indicador prognóstico
(SPECK et al., 2003).
A neo-angiogênese ocorre na transição do processo hiperplásico para
neoplasia, portanto antes da formação tumoral propriamente dita. Este fato sugere
que a indução da angiogênese constitui etapa importante da carcinogênese (SMITH
et al.,1994).
A neoformação vascular, além de ocorrer em neoplasias malignas, também
o faz nos processos fisiológicos como, por exemplo, na maturação dos folículos
ovarianos, na formação do corpo lúteo e no reparo do endométrio funcional. Em
processos patológicos benignos como reparo de feridas, osteoartrite, doenças
oftálmicas e na reação imunológica também ocorre (KNIGHTON et al.,1991).
34
A primeira evidência de que o número de vasos neoformados pode ser
empregado como fator prognóstico foi observado no melanoma cutâneo humano.
Descreve-se uma fase inicial, sem neovascularização associada à ausência de
metástases, seguindo-se um estágio com neovascularização crescente, que se
correlaciona com o aumento do número de metástases (SRIVASTAVA et al.,1986).
Estudo para correlacionar a angiogênese em doenças inflamatórias crônicas
como asma e bronquite crônica, concluiu que há significativo aumento de novos
vasos em asma e, após terapia, ocorre o decréscimo da atividade angiogênica
demonstrada pelo fator de crescimento tumoral (VEFG) e angiogenina. O aumento
no número e tamanho dos vasos pode contribuir para o aumento do espessamento
das vias aéreas levando a um estreitamento crítico. A angiogenina desempenha um
papel central no processo de neoformação vascular aumentando a permeabilidade
vascular de tal forma que o plasma e proteínas podem invadir o espasso
extravascular levando edema e alterações profundas na matriz extracelular (AZZA et
al, 2003).
Vários marcadores biológicos têm sido identificados como passíveis de
utilização para informação prognóstica em muitos tipos de carcinomas de cabeça e
pescoço, sendo os relacionados com a angiogênese, atualmente, bastante
estudados. Dentre estes marcadores, o fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) está associado com a estimulação da proliferação celular endotelial e
promoção da permeabilidade vascular e o fator de crescimento fibroblástico (FGF)
na variedade ácida e básica, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o
fator de crescimento da célula endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF),
liberadas pelas células tumorais e tidos como estimuladores da proliferação, invasão
e atividade quimiotática das células endoteliais em carcinomas de células
escamosas, inclusive da cavidade oral (LINGEN, 1999).
Outros fatores angiogênicos, já identificados são o fator de crescimento
transformante , o fator de crescimento transformante e o fator de necrose
tumoral. Já o interferon, trombospondina 1, a angiostatina e o fator 4 plaquetário
são elementos que podem coibir a angiogênese (HANAHAN et al.,1996).
35
Ascani et al.(2005) baseado em estudos anteriores que indicam que a
densidade microvascular- DMV tem se mostrado um marcador de prognóstico em
tumores primários, sugerindo que a atividade angiogênica aumentada tem sido
correlacionada com prognóstico negativo e tendência à metástase, estudou 64
casos de CEC oral utilizando-se o fator CD34 comparando o estado TNM com as
variáveis clínicas idade, sexo concluíram que não houve correlação estatística entre
a DMV e as variáveis clínicas, bem como com a atividade tumoral.
Shieh et al.,(2004) estudando o papel da angiogênese e os mecanismos da
não- angiogênese em CEC oral e sua correlação com a diferenciação histológica e
progressão do tumor, utilizou mucosa normal, mucosa em displasia e casos de
CEC, com os marcadores CD31,CD34 e fator VIII.
Baseados em estudos anteriores controvérsios, mas partindo do
pressuposto que a angiogênese tumoral está associada com sua agressividade e
conforme estudos recentes indicando que a não angiogênese pode existir em certos
tumores, concluíram que a densidade microvascular aumentada e os parâmetros
clínicos-patológicos estão correlacionados, sendo o fator VIII mais fortemente
marcado.Verificaram que na iniciação do CEC a vascularização se dá na periferia do
tumor e no decorrer do crescimento da lesão há aumentos adicionais de
vascularização intratumoral.Segundo os autores a não-angiogênese se fez presente
no decorrer da progressão do tumor, sendo um fator de prognóstico de CEC oral.
Estudos com imunofluorescência e cultura de tecidos demonstram que
células endoteliais sintetizam o antígeno relacionado ao Fator VIII. A microscopia
eletrônica evidencia o Fator VIII também em plaquetas e em megacariócitos
(PIOVELLA et al.,1978).
Fina et al.,(1990) mostraram a presença do antígeno CD31 em células
endoteliais e sugerem que o CD31 poderia participar da adesão celular tanto nas
células endoteliais como nas progenitoras hematopoiéticas.
Estudo desenvolvido sobre angiogênese em 18 casos de CEC de lábio
inferior e língua de alto e baixo escore de malignidade, objetivando avaliar a
36
correlação existente entre o índice angiogênico e o grau histológico de malignidade
utilizou o CD31 e fator VIII em campos de maior densidade microvascular. De acordo
com os resultados a marcação do fator VIII foi mais eficiente e homogenia que o
CD31, sugerindo que a avaliação da angiogênese tumoral, não tem importante valor
prognóstico em CEC de lábio inferior e língua (SOUZA, 2002).
A grande maioria dos estudos aponta o CD31 e o Fator VIII como
marcadores eficientes para avaliar angiogênese tumoral.
2.4 MARCADORES TUMORAIS: FATOR VIII E CD31
Em razão do avanço da pesquisa nesta área, atualmente dispõe-se de uma
grande variedade de anticorpos e de uma crescente sensibilidade e especialidade
desta técnica. Os anticorpos mais utilizados são para a detecção de marcadores
epiteliais, linfohematopoiéticos, mesenquimais e tecido nervoso. Utilizando-se tais
painéis é possível resolver problemas diagnósticos com a diferenciação de linhagem
celulares, local de origem de uma metástase ou mesmo determinação de
microinvasão ou microdepósitos de células malignas.De acordo com Ramalho
(2000) os critérios de graduação de malignidade existente para os carcinomas
espinocelulares de boca não possibilitam a predição fidedigna do seu curso clínico,
pois, muitas vezes, lesões histologicamente bem diferenciadas revelam
comportamento mais agressivo. Estes dados reforçam a necessidade premente de
novos critérios avaliativos do comportamento biológico tumoral.
O Fator VIII, conhecido como fator Von Willebrand ou FvW, também se
configura como um anticorpo monoclonal, o qual reage com uma glicoproteína de
270KDa do plasma humano, capaz de reagir com células endoteliais exibindo
reatividade num padrão granular ao nível do citoplasma das células marcadas
positivamente (DAKO A/S, 2001). É relatado para expressar nas plaquetas,
megacariócitos e em tumores, incluindo hemangiomas, hemagiosarcomas e
sarcomas de Kaposi (NOVOCASTRA, 2007).
37
Em relação ao CD31, este se caracteriza como um anticorpo monoclonal, o
qual reage com uma glicoproteína de 130 KDa presente nas células endoteliais e
plaquetas, sendo utilizado na avaliação da vascularização tanto em tecidos normais
como neoplásicos (DAKO A/S, 2001). A molécula do CD31 é expressada na
superfície de plaquetas, monócitos, granulócitos e na junção endotelial intracelular e
tem marcação em citoplasma de células em potencial proliferação após a ativação
celular. As propriedades do antígeno CD31, sugerem que ele está envolvido durante
a angiogênese, sendo esta, essencial para crescimento e metástase do tumor
(NOVOCASTRA, 2007).
Os marcadores Fator VIII e CD31 são comumente utilizados para mensurar
a angiogênese. Esta vem sendo considerada como um processo fundamental para o
desenvolvimento tumoral. Alguns estudos demonstram que as células tumorais em
processos neoplásicos, podem replicar rapidamente, levando a um aumento da
necessidade de aporte nutricional, ocasionando, consequentemente, uma expansão
da vascularização, que permite o crescimento e manutenção do tumor. Por outro
lado, a inibição da angiogênese limita o crescimento tumoral (RAVI, 2000).
A angiogênese pode ser identificada através da expressão de vários
marcadores vasculares, utilizando-se para tal, a técnica da imuno-histoquímica. A
sua evidenciação é feita aplicando-se anticorpos com afinidade por epítopos
específicos da célula endotelial, como o fator VIII, CD31, CD34, entre outros
(WEIDNER et al.,1991).Esse mesmo autor em 1993, comparando a densidade
microvascular em carcinoma prostático demonstrou correlação entre a neoformação
celular e a metástase, utilizando-se o Fator VIII.
A controvérsia em estudos anteriores acerca da neoformação vascular
motivou um estudo utilizando CD31, CD34 e fator de crescimento endotelial para
relacioná-los com a metástase em linfonodos em CEC oral.Os resultados mostraram
padrões de distribuições diferentes usando os marcadores em tecidos normais e em
tumorais, concluindo que a distribuição e as propriedades das células endoteliais
parecem estar associadas com a metástase em linfonodos (NAGATSUKA et
al.,2004).
38
Podemos verificar dentre os mais citados na literatura que o CD31 e Fator
VIII, são os mais empregados na identificação de microvasos a serem quantificados,
mas os autores são conflitantes na indicação do marcador imuno-histoquímico que
oferece melhores resultados (ALVES, BACCHI, VASSALLO, 1999). No entanto, o
Fator VIII é o anticorpo de eleição na avaliação da angiogênese. de acordo com
Beatrice et al. (1996); Marinho et al. (1997) e Tomoda et al. (1999), divergindo de
Petruzzelli (1996) que recomenda o anticorpo CD31.
Estudo desenvolvido sobre angiogênese em 18 casos de CEC de lábio
inferior e língua de alto e baixo escore de malignidade, objetivando avaliar a
correlação existente entre o índice angiogênico e o grau histológico de malignidade
utilizou o CD31 e fator VIII em campos de maior densidade microvascular.. De
acordo com os resultados a marcação do fator VIII foi mais eficiente e homogenia
que o CD31, sugerindo que a avaliação da angiogênese tumoral não tem importante
valor prognóstico em CEC de lábio inferior e língua (SOUZA,2002).
A correlação entre a angiogênese e a possibilidade de desenvolvimento de
metástase regional, foi avaliada em pacientes portadores de carcinoma de CEC oral,
utilizando-se o Fator VIII. Concluiu-se que embora a espessura do tumor fosse
sugestiva de premeditabilidade para metástase, a angiogênese foi um significativo
preditor de recorrência regional, podendo ser utilizado como indicador de
prognóstico (WILLIAMS et al.,1994).
Penfold et al.(2005), utilizaram o marcador CD31 objetivando estudar 41
casos de CEC oral para comparar indicadores clínicos e patológicos do
comportamento do tumor incluindo diferenciação histológica, tamanho e velocidade
do crescimento do tumor. Os autores mostraram que houve correlação entre a DMV
com a metástase em linfonodos regionais, no entanto esta correlação era
independente da velocidade de crescimento, tamanho e diferenciação histológica do
tumor.
A angiogênese e a progressão tumoral estão fortemente correlacionadas.
Em estudo comparativo de amostras de tecidos orais normais, displasia epitelial e
carcinoma epidermóide, verificaram a determinação da vascularização através do
39
volume microvascular (MW) utilizando-se o Fator VIII e CD31, concluíram que é um
método sensível, e indica a transição de displasia para neoplasia, podendo ser
utilizada como indicador prognóstico para cânceres orais iniciais e, recomendaram o
Fator VIII e CD31 como marcadores (PAZOUKI et al., 1997).
Gleich et al.(1997) utilizaram o Fator VIII e CD31 em 31 casos de CEC oral
objetivando comparar a DMV e as fases T e N da classificação TNM em relação a
outros estudos com outros tipos de câncer. O Fator VIII mostrou-se mais uniforme e
mais fácil de interpretar que o CD31 e os autores sugeriram que o CEC oral são
menos angiogênese dependentes que tumores em outras localizações.Concluíram
que a angiogênese tumoral não tem resultados significativos que possam predizer a
agressividade do tumor.
Utilizando-se o FVIII para estudar a correlação da angiogênese e o PCNA
verificando a proliferação celular em 108 amostras de carcinoma gástrico,
observaram que os pacientes que apresentaram um pior prognóstico tinham alta
MVC e elevado índice de PCNA, ao contrário dos de melhor prognóstico com MVC e
índice PCNA baixos. Sugerem os autores, que ambos os índices são bons
indicadores de gravidade em pacientes portadores desta patologia (MAEDA et al.,
1995).
O Fator VIII tem sido recomendado para a demonstração do endotélio
linfático (HORAK et al.1992). No entanto Lee, De Lillis e Wolf (1986) e Ordonez et al.
(1987) recomendam a sua aplicação na marcação das células e vasos endoteliais,
mas advertendo que, a imunorreatividade em vasos linfáticos ser de qualidade
relativamente fraca ou, na maioria das vezes, ausente.
Smith et al. (1994) utilizando o Fator VIII para a quantificação dos vasos em
carcinoma espino celular em colo uterino sugeriram que a angiogênese começa na
fase pré-invasiva e pode ser um importante evento na conversão do epitélio normal
a neoplásico.
Através dos anticorpos CD31 e Fator VIII, foi realizado estudo em
carcinomas primários de laringe para correlacionar parâmetros clínico-patológicos
40
com a quantificação micro vascular. Concluíram que os tumores mais invasivos, ou
seja, com profundidade maior que 5 mm, exibiram uma expressiva contagem
vascular e que a contagem de vasos foi a única que mostrou resultados
significativos (SION-VARDY et al., 2001) .
Para verificar o índice angiogênico através de variadas metodologias
usadas na quantificação dos vasos sanguíneos em tecidos normais e tumorais de
mama, cavidade oral e pulmão, utilizou-se os anticorpos CD31 e Fator VIII.
Constatou-se que a técnica do volume microvascular (MW) em tumores orais foi a
mais indicada, utilizando-se o Fator VIII (SCHOR et al.,1998).
O marcador vascular Fator VIII foi utilizado para estudar a angiogênese
através do fator de crescimento endotelial (VEGF) e a da densidade microvascular
(MVD) em 52 casos de carcinomas de células escamosas da cavidade oral. Foi
realizada a análise da vascularização em tumores com gradação G1, G2 e G3 e sua
correlação com os casos apresentando linfonodos positivo e negativo. Os autores
concluíram que há correlação positiva entre a MVD com a gradação histológica e o
estado nodal (ARTESE et al., 2001).
Shang et al.(2005) estudando 40 casos de CEC oral para avaliar a DMV e
metástase em linfonodos regionais , utilizaram o fator VIII através do VEGF e óxido
nítrico endotelial(e-NOS). Os autores concluíram que a investigação adicional
utilizando os fatores e-NOS e VEGF são relevantes para analisar a angiogênese
tumoral , pois a DMV era significamente mais alta em e-NOS e VEGF positivos. O
mesmo estudo mostrou associação entre metástase de linfonodo regional e
angiogênese tumoral.
Estudos realizados com o Fator VIII para analisar a neovascularização em
48 pacientes com carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço,
relacionando com a idade, estágio tumoral, estadiamento pelo sistema TNM,
gradação histológica e tratamento, mostraram que o grau de vascularização neste
tipo de neoplasia pode ser utilizado como preditor de resposta à radioterapia.
Recomendaram que a angiogênese tumoral em CEC poderia determinar
41
previamente a susceptibilidade dos pacientes à radioterapia (ZATTERSTROM et
al.,1995).
A neoproliferação vascular foi estudada em 16 casos de carcinoma de
células escamosas orais e de laringe, com metástase nodal. Verificou-se a
importância da angiogênese no suporte e promoção do crescimento tumoral pela co-
expressão do antifator VIII, analisando a marcação de vasos e do MIB-1, analisando
a marcação de núcleos na célula endotelial. Os autores verificaram que angiogênese
é irrelevante para a metástase tumoral, em virtude da rica vascularização dos
linfonodos (NARESH, NERURKAR e BORGES, 2001).
A metástase nodal em carcinoma epidermóide de língua em sua fase inicial,
pode ser previamente determinada pela neovascularização. Esta pode ser analisada
utilizando-se a evidenciação dos vasos com o Fator VIII, através da densidade
microvascular (MVD). Dessa forma, há possibilidade de predizer quais serão os
pacientes com possibilidade da lesão evoluir mais agressivamente e iniciar terapias
mais intensas o mais precoce possível (SHPITZER et al.,1996).
Avaliando-se a proliferação celular e a vascularização em CEC oral, Alcade
et al. (1995) utilizaram o antígeno nuclear de células em proliferação (PCNA), para
analisar a proliferação celular e o CD31 e PD-ECGF para densidade microvascular
(MVD). Conforme estes autores, a avaliação destes parâmetros é relevante para a
identificação da determinação do potencial de malignidade.
Hagedorn e Nerlich (2000) realizaram estudo em carcinomas de células
escamosas de laringe, através da determinação da MVD empregando o marcador
CD31, em mucosa normal, displasia e carcinoma invasivo de laringe, bem como com
os parâmetros idade, gênero, localização anatômica, estadiamento tumoral e grau
de diferenciação. Concluíram que não houve correlação significativa entre a MVD e
os dados clínico-patológicos e que a determinação deste índice não se configura
como marcador prognóstico individual neste tipo de carcinoma, concordando com os
estudos desenvolvidos por Leedy et al. (1994).
42
De acordo com Jacquemier et al. (1998) a determinação da contagem
microvascular (MVC) em câncer de mama, pode prever o grau de resistência dos
portadores deste tipo de neoplasia à quimioterapia, pois os estudos utilizando o
anticorpo CD31 para evidenciação dos vasos, e outros fatores prognósticos como a
expressão do p53, ERBB2, Bcl2 e Ki 67, mostraram que a que o emprego da MVC é
importante como indicador prognóstico.
Moriyama et al. (1997) estudaram 44 casos de carcinomas de células
escamosas orais, utilizando o marcador pan-endotelial CD-31. Os resultados
demonstraram uma correlação positiva entre a expressão do fator de crescimento
vascular endotelial (VEGF) e metástase línfonodal nas lesões estudadas. Os autores
concluíram que a utilização do VEGF em conjunto com densidade vascular, através
da marcação do CD31, podem ser preditores de metástase linfonodal em CEC oral.
No entanto, utilizando-se apenas a densidade vascular não é suficiente para
predizer o prognóstico nestas lesões.
O marcador CD-31 foi utilizado para determinação do índice angiogênico em
51 casos de carcinomas de células escamosas de laringe, para verificar a relação
entre o grau de angiogênese, o estado nodal e a recorrência. Os autores concluíram
que existe uma forte correlação entre a angiogênese e a recorrência nodal e que
apenas a determinação da angiogênese pode ser utilizada como indicador
prognóstico em pacientes com risco de metástase (MURRAY et al., 1997).
43
3 PROPOSIÇÃO
44
Este trabalho tem como proposição analisar o padrão da expressão dos
marcadores CD31 e Fator VIII em CEC de boca, comparando a expressão destes
marcadores com o sítio anatômico da lesão e o escore de malignidade.
45
________________________
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
46
O estudo desenvolvido foi do tipo descritivo, composto por uma avaliação
morfológica das células neoplásicas das áreas de CEC de boca e análise da
expressão imuno-histoquímica do fator VIII e CD31 nestas lesões.
4.2 AMOSTRA
Foram selecionados para este estudo 15 (quinze) casos de CEC localizados
em língua, lábio inferior e assoalho de boca, divididos em três grupos conforme
mostra o Quadro 1.
O método de coleta de material baseou-se em técnica de amostragem
sistemática, na qual foram escolhidos de forma não ocasional, dentre todos os casos
de CEC, aqueles localizados nos sítios anatômicos supracitados e cujo material
emblocado em parafina estivesse em bom estado de conservação e contivesse
quantidade suficiente de tecido para realização das técnicas de coloração propostas.
Foram excluídos os casos que apresentavam material insuficiente, em mau estado
de conservação e que não pertencessem aos sítios anatômicos estudados.
Dos 15 espécimes teciduais selecionados para o presente estudo, 10
pertenciam aos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Universidade
Potiguar – UnP e 5 aos arquivos do Laboratório de CitoPatologia de Natal-RN.
Para o desenvolvimento do estudo o projeto de pesquisa foi submetido ao
Comitê de Ética em Pesquisa da UnP.
Quadro 1. Distribuição dos casos de CEC de acordo com o sítio e grupos estudados.
Grupo Sítio anatômico N° de Casos
Grupo 1 Lábio inferior 05
47
Grupo 2 Assoalho 05
Grupo 3 Língua 05
4.3 METODOLOGIA
Todos os espécimes utilizados estavam emblocados em parafina e haviam
sido fixados previamente em formalina 10%. Os espécimes foram submetidos a
cortes histológicos de 4µm de espessura, desparafinizadas e corados pela técnica
de rotina da hematoxilina-eosina (HE) para avaliação morfológica.
Para o estudo imuno-histoquíco foram realizados cortes histológicos de 3µm
de espessura, os quais foram estendidos em lâminas de vidro organosilanizadas, e
marcados com anticorpos monoclonais CD31 e anti-fator VIII .
Todo o estudo imuno-histoquímico foi realizado no Instituto de Patologia da
Universidade do Porto – IPATIMUPI, em Portugal. A descrição da técnica de
preparação do material encontra-se em anexo.
No Quadro 2, está explicitado o anticorpo utilizado, sua especificidade e a
diluição utilizada.
Quadro 2. Especificação dos anticorpos utilizados com suas respectivas
especificidades e diluições utilizadas.
ANTICORPO
CLONE
ESPECIFICIDADE DILUIÇÃO
48
Fator VIII (F8/86)*
Células endoteliais 1:50
CD-31 (1A 10-CE)*
Células endoteliais e plaquetas
1:50
DAKO Corp., Denmark*/ SCHOR, 1998*
4.4 ANÁLISE MORFOLOGICA
Para análise morfológica foram selecionadas áreas consideradas front de
invasão do CEC, localizado nas regiões mais agressivas da lesão, que revelam
freqüentemente a presença de células com menor grau de diferenciação e maior
grau de dissociações celulares, comparado às demais localizações do tumor (figura
1).
49
Figura 1: CEC de lábio inferior exibindo área de front de invasão tumoral (HE 40X).
Na análise morfológica foi seguida a metodologia descrita por SOUZA
(2002) que utilizou o sistema de gradação de malignidade proposto por Bryne et al.
(1998). Este sistema baseia-se em quatro parâmetros morfológicos identificados no
parênquima maligno e na sua relação com o estroma circunvizinho à lesão,
representados por: 1) grau de ceratinização; 2) pleomorfismo nuclear; 3) padrão de
invasão; e 4) infiltrado celular inflamatório (Quadro 3).
Todos os casos estudados foram examinados em um aumento de 100X e
cada um dos parâmetros avaliados recebeu um escore variando de 1 a 4 conforme
recomenda Bryne et al. (1998).
Quadro 3. Sistema de gradação histológica de malignidade proposto por Bryne et al.
(1998).
ASPECTO
MORFOLÓGICO
ESCORE
1
2
3
4
Grau de
ceratinização
Altamente
Ceratinizado
(> 50% das células)
Moderadamente
Ceratinizado
(20-50% das células)
Minimamente
ceratinizado
(5-20% das células)
Não ceratinizado
(0-5% das células)
Pleomorfismo
nuclear
Pouco pleomorfismo
nuclear
(>75% células
maduras)
Moderado
pleomorfismo nuclear
(50-75% células
maduras)
Abundante
pleomorfismo nuclear
(25 -50% células
maduras)
Excessivo
pleomorfismo nuclear
(0-25%células
maduras)
Padrão de
invasão
Massa tumoral
infiltrante com bordos
bem delimitados
Estruturas cordonais
sólidas infiltrantes
Pequenos grupos ou
cordões celulares
infiltrantes
(n<15)
Dissociação celular
marcante e
disseminada em
pequenos grupos
e/ou células isoladas
(n<15)
Infiltrado de
células
inflamatórias
Marcante Moderado Escasso Ausente
50
Fonte: BRYNE et al.(1998)
Para cada aspecto analisado foi feito um somatório e, posteriormente
realizado divisão por 4, obtendo-se assim uma média para cada caso avaliado. Após
obtenção desta média, cada caso foi classificado em baixo ou alto escore de
malignidade, seguindo critérios descritos por Anneroth, Batsakis e Luna (1986),
conforme mostra o Quadro 4.
Quadro 4. Classificação de malignidade conforme Anneroth, Batsakis e Luna (1986).
Fonte: ANNEROTH, BATSAKIS E LUNA (1986).
Tanto para a análise morfológica, como para o estudo imuno-histoquímico, a
avaliação foi feita em microscópico Olympus CXD31, simultaneamente, por dois
examinadores previamente calibrados.
4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
A avaliação imuno-histoquímica foi realizada em microscopia de luz no front
de invasão tumoral fazendo a contagem do microvascular. Foram consideradas
marcações positivas vasos contendo lúmem e qualquer célula ou grupo endotelial
corado positivamente com coloração acastanhada (SOUZA, 2002).
A contagem foi realizada em 4 campos em aumento de 400x, identificados
no front de invasão tumoral (figura 2). Os campos foram inicialmente selecionados
em aumento de 40X, e depois em aumento de 400X, os quatro campos foram
fotografados com máquina Olympus C5060, acoplada ao microscópio, e
armazenados em um arquivo no computador.
Malignidade
Escore
Baixo grau 1,0 a 2,5
Alto grau 2,6 a 4,0
51
Figura 2: Cortes histológicos de CEC de lábio inferior marcado com anticorpo anti-
CD31 evidenciando a seleção dos campos para contagem.
Em seguida as microfotografias foram transferidas para o computador onde
foi realizada a contagem microvascular. Os valores obtidos para cada campo foram
somados de modo que cada caso de CEC obteve um valor de células positivas para
cada um dos marcadores.
52
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores obtidos nas contagens microvascular foram submetidos à análise
estatística para comparação com a gradação histológica (escores de alto e baixo
grau de malignidade) e com o sítio anatômico do CEC. Utilizou-se para este estudo
o teste não-paramétrico de Mann-Whitney e ANOVA a um critério, com nível de
significância de 5%. Posteriormente foi aplicado o pós-teste de Tukey para averiguar
a diferença entre os grupos.
53
_________________________________________
54
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA
A análise morfológica dos cortes histológicos avaliados pela técnica da H&E
(figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10) classificou os casos de CEC em alto ou baixo escore
de malignidade, segundo os critérios de estabelecidos por Bryne (1998). Observou-
se que, para o lábio inferior 100% dos casos exibiram baixo escore de malignidade.
Para os cortes de língua 80% considerado de baixo grau e 20% de alto escore de
malignidade. No assoalho 60% foi classificado como baixo escore de malignidade e
40% de alto (gráfico 1).
0
1
2
3
4
5
LÍNGUA LÁBIO INFERIOR ASSOALHO
ALTO ESCORE BAIXO ESCORE
Gráfico 1 - Gráfico com os valores percentuais de casos de CEC classificados em
alto escore e baixo escore de malignidade de acordo com Bryne (1998).
Nas tabelas 1, 2 e 3 estão demonstrados as médias dos escores obtidos
para cada caso avaliado, de acordo com o sítio de localização da lesão e suas
respectivas classificações de acordo com a proposta de Bryne (1998) e Anneroth,
Batsakis e Luna (1986).
100%
80
%
60
%
20
%
40%
55
Tabela 1 – Casos de CEC no sítio anatômico língua e médias dos escores obtidos para
cada caso avaliado e classificação em baixo ou alto grau de malignidade. Natal/RN- 2007
Caso Escore Classificação
Caso 1
2,75 Alto grau
Caso 2
2,0 Baixo grau
Caso 3
2,5 Baixo grau
Caso 4
2,0 Baixo grau
Caso 5
2,25 Baixo grau
Tabela 2 – Casos de CEC no sítio anatômico lábio inferior e escores obtidos para cada caso
avaliado e classificação em baixo ou alto grau de malignidade..Natal/RN- 2007
Caso Escore Classificação
Caso 1
1,25 Baixo grau
Caso 2
1,5 Baixo grau
Caso 3
2,0 Baixo grau
Caso 4
2,0 Baixo grau
Caso 5
1,25 Baixo grau
Tabela 3 – Casos de CEC no sítio anatômico assoalhol e escores obtidos para cada caso
avaliado e classificação em baixo ou alto grau de malignidade. Natal/RN- 2007
Caso Escore Classificação
Caso 1
2,5 Baixo grau
Caso 2
3,0 Alto grau
Caso 3
2,25 Baixo grau
Caso 4
3,25 Alto grau
Caso 5
2,25 Baixo grau
56
Os valores observados para cada um dos parâmetros avaliados (padrão de
invasão, grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear e infiltrado inflamatório), em
cada um dos sítios anatômico estudados, encontram-se expressos nas tabelas 4, 5
e 6.
Tabela 4 - Valores observados para cada um dos parâmetros avaliados no sítio anatômico
língua. Natal/RN- 2007
LÍNGUA
Padrão de
invasão
Grau de
ceratinização
Pleomorfismo
nuclear
Infiltrado
inflamatório
Caso 1 3 4 2 2
Caso 2 2 1 2 3
Caso 3 3 1 3 3
Caso 4 2 1 2 3
Caso 5 3 2 2 2
Tabela 5 - Valores observados para cada um dos parâmetros avaliados no sítio anatômico
lábio. Natal/RN- 2007
LÁBIO
Padrão de
invasão
Grau de
ceratinização
Pleomorfismo
nuclear
Infiltrado
inflamatório
Caso 1 1 2 1 1
Caso 2 2 1 2 1
Caso 3 2 2 2 2
Caso 4 2 3 2 1
Caso 5 1 2 1 1
57
Tabela 6 - Valores observados para cada um dos parâmetros avaliados no sítio anatômico
assoalho. Natal/RN- 2007
LÁBIO
Padrão de
invasão
Grau de
ceratinização
Pleomorfismo
nuclear
Infiltrado
inflamatório
Caso 1 2 4 2 2
Caso 2 3 4 2 3
Caso 3 2 4 2 2
Caso 4 3 4 3 3
Caso 5 2 3 2 2
58
Figura 3- Aspecto microscópico de CEC de baixo escore de malignidade em lábio
inferior, exibindo área de invasão tumoral na forma de ninhos celulares (H&E, 40x).
Figura 4 - Detalhe da figura anterior mostrando área de invasão tumoral e infiltrado
inflamatório (H&E, 100x).
59
Figura 5- Detalhe da figura 3 mostrando presença de ceratinização em CEC de língua
(H&E, 400x).
Figura 6- Aspecto microscópico de CEC de alto escore de malignidade em assoalho
(H&E, 40x).
60
Figura 7- Detalhe da figura anterior mostrando invasão tumoral na forma de ninhos (H&E,
100x).
Figura 8- Detalhe da figura anterior exibindo área de invasão tumoral com intenso
pleomorfismo nuclear e escasso infiltrado inflamatório (H&E, 400x).
61
Figura 9- Aspecto microscópico de CEC de língua de baixo escore de malignidade (H&E,
40x).
Figura 10 - Detalhe da figura anterior exibindo ceratinização (H&E, 400x)
62
5.2 ESTUDO IMUNO- HISTOQUÍMICO
No estudo imuno-histoquímico, observou - se marcação positiva para o
marcador CD31 e Fator VIII em 100% dos casos de CEC avaliados nos três sítios
estudados (figuras 11, 12, 13, 14, 15,16, 17 e 18). Foram consideradas marcações
positivas a presença de coloração acastanhada no citoplasma das células
endoteliais. Os resultados encontrados estão apresentados na Tabela 7 e Gráfico 2.
Tabela 7 - Casos de CEC e média de células positivas para os marcadores CD31 e Fator
VIII de acordo com os sítios anatômicos estudados. Natal/RN – 2007
MARCADOR LÁBIO LÍNGUA ASSOALHO
CD31+ 224,4 157,4 299,6
F VIII 39,2 47,2 110,4
0
50
100
150
200
250
300
350
L
Á
B
I
O
L
Í
N
G
U
A
A
S
S
O
A
L
H
O
CD31 +
F. VIII +
Gráfico 2 – Gráfico representando as médias obtidas conforme sítio anatômico
estudado e marcador CD31 e Fator VIII.
Na Tabela 8, são comparadas as médias de imuno-localização dos
marcadores CD31 e Fator VIII nos sítios anatômicos estudados e analisados
conforme a média obtida pela contagem de células positivas.
224,4
299,9
157,4
56
110,4
39
63
Tabela 8 – Comparação de médias de contagem das células positivas entre os sítios
anatômicos avaliados para os marcadores Fator VIII e CD31. Natal/RN - 2007
Sítio Fator VIII + CD31+
Assoalho 110,4 a 229,6 a
Língua 47,2 b 157,4 b
Lábio Inferior 39,2 b 224,4 a b
Letras distintas denotam diferenças estatisticamente significantes ao nível de 5% de significância nas
comparações entre os sítios de localização para cada marcador.
64
Figura 11 - CEC de lábio de baixo escore de malignidade exibindo marcação positiva para o
CD31 (40X).
Figura 12- Detalhe da figura anterior mostrando marcação positiva em área de invasão tumoral
(100X)
65
Figura 13 - Detalhes dos campos selecionados para contagem das células CD31 positivas (setas)
em CEC de lábio (400x).
Figura 14 - CEC de lábio de baixo escore de malignidade exibindo marcação positiva para o Fator
VIII. No detalhe a marcação positiva de vaso.
66
Figura 15 - CEC de assoalho de alto escore de malignidade exibindo marcação positiva
para o CD31. Observar detalhe da marcação (seta).
40x
400x 400x
100x
67
Figura 16 - Marcação do Fator VIII CEC de assoalho de alto escore de malignidade
exibindo marcação positiva para o CD31. Observar detalhe da marcação (seta).
Figura 17 - CEC de língua de baixo escore de malignidade exibindo marcação positiva
para o CD 31.
68
Figura 18 - CEC de língua de baixo escore de malignidade exibindo marcação positiva
para Marcação F VIII.
69
5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Na comparação da expressão do marcador CD31 com o escore de
malignidade (Tabela 9), observou-se que as lesões de alto grau de malignidade
registraram uma média de 213,67 células CD31 positivas e as de baixo grau de
malignidade uma média de 217,42 células CD31 positivas. Aplicando-se o teste
estatístico de Mann-Whitney, obteve-se um valor de p= 0,73, mostrando não haver
diferença estatística significante para este marcador no que se refere ao escore de
malignidade.
Tabela 9 - Resultados do CD31, segundo a classificação de malignidade de Aneroth,
Batasakis e Luna (1986). Natal/RN – 2007
Grupo N
Média Desvio Padrão Mediana
Alto escore 3 213.67 57.709 186.00
Baixo escore 12 217,42 112.54 200.50
Diferença estatisticamente não significante (p=0,7341) Teste de Mann- Whitney
Em relação ao marcador Fator VIII (Tabela 10), as lesões de alto grau de
malignidade registraram uma média de 105.00 células Fator VIII positivas e as de
baixo grau de malignidade uma média de 55,75 células Fator VIII positivas.
Aplicando-se o mesmo teste estatístico de Mann-Whitney, obteve-se um valor de
p=0,04, mostrando haver diferença estatística significativa para este marcador no
que se refere ao escore de malignidade..
Tabela 10 - Resultado para o Fator VIII, segundo a classificação de malignidade de Aneroth,
Batasakis e Luna (1986). Natal/RN – 2007
Diferença estatisticamente significante (p=0,0484) Teste de Mann- Whitney
Grupo N
Média Desvio Padrão Mediana
Alto escore 3 105.00 58.284 77.00
Baixo escore 12 55.75 36.071 48.00
70
Ao avaliar a imuno-localização do CD31 em relação aos sítios anatômicos
estudados, aplicou-se o teste ANOVA a Um critério obtendo-se um valor de p= 0,01,
mostrando que houve diferença estatística entre os grupos 1 (lábio), 2 (assoalho de
boca) e 3 (lábio inferior). Para identificação dos grupos que apresentaram diferenças
na marcação da expressão do CD31, utilizou-se o teste de Tukey a 5 % com o sítio
de ocorrência da lesão e observou-se que houve diferença estatisticamente
significante entre os casos de CEC de assoalho e lábio inferior (p<0,01). Entre os
sítios anatômicos língua e assoalho e lábio inferior e língua, obteve-se valor de
p>0,05, significando não haver diferença estatística entre estes sítios (Tabela 11).
Tabela 11 – Resultados do teste de Tukey para o marcador CD31 aplicado entre os sítios
anatômicos língua , assoalho e lábio inferior. Natal/RN - 2007
Nível de significância = 5.00 %
Comparação Diferença q p Interpretação
LI X AS - 75.200 2.198 p>0.05 Não significante
LI X LA 98.400 2.876 p>0.05 Não significante
AS X LA 1 73.60 5.074 p<0.01 SIGNIFICANTE
AS= assoalho de boca; LA= lábio inferior; LI= língua
Ao avaliar a imuno-localização do Fator VIII em relação aos sítios
anatômicos estudados, aplicou-se o teste ANOVA a Um critério obtendo-se um valor
de p=0,006, mostrando que houve diferença estatística muito significante entre os
grupos 1 (lábio), 2 (assoalho de boca) e 3 (lábio inferior). Para identificação dos
grupos que apresentaram diferenças na marcação da expressão do Fator VIII,
utilizou-se o teste de Tukey a 5 % com o sítio de ocorrência da lesão e observou-se
que houve diferença estatisticamente significante entre os casos de CEC de
assoalho e lábio inferior (p<0,05) e entre os casos de CEC de assoalho e língua
(p<0,01). Entre os sítios anatômicos língua e lábio inferior, obteve-se valor de
p>0,05, significando não haver diferença estatística entre estes sítios (Tabela 12).
71
Tabela 12 - Resultados do teste de Tukey para o marcador Fator VIII aplicado entre os
sítios anatômicos língua , assoalho e lábio inferior. Natal/RN – 2007.
Nível de significância = 5.00 %
Comparação Diferença q p Interpretação
LI X AS - 71.200 5.096 p<0.01 SIGNIFICANTE
LI X LA - 8.000 0.5725 p>0.05 Não significante
AS X LA 63.200 4.523 p<0.05 SIGNIFICANTE
AS= assoalho de boca; LA= lábio inferior; LI= língua
72
___________________________________
!"
!"!"
!"
73
6. DISCUSSÃO
Apesar de todo o desenvolvimento científico, os clínicos ainda não dispõem
de ferramentas precisas e seguras que os permitam identificar pacientes com câncer
que irão ou não responder adequadamente ao tratamento adotado. Portanto, é
fundamental que estudos sejam realizados objetivando desenvolver novas
metodologias que possibilitem pré-estabelecer o comportamento clínico da lesão, ou
seja, a determinação do prognóstico, permitindo assim, auxiliar nas tomadas de
decisão quanto à terapêutica, bem como, no melhor entendimento da biologia destas
neoplasias.
O CEC oral assume grande importância em relação às neoplasias
originadas nos tecidos da boca, devido sua significativa prevalência. Sabe-se que
cerca de 95% de todos os casos de câncer de boca são de CEC. O tabagismo
associado ao álcool ou não, é considerado como fator importante relacionado ao
aparecimento da neoplasia. Fatores como radiação ultravioleta e agentes biológicos,
também estão correlacionados com o CEC de boca. Dentre estes, destaca-se o
papel do HPV, identificados por Kojhima et al. (2002) e Summersgill et al.l (2001). A
disfunção hormonal, imunosupressão, deficiências nutricionais e mutações genéticas
também podem contribuir para o aparecimento de CEC (RAMALHO et al., 2002).
Esta neoplasia, pode surgir em qualquer sítio anatômico da cavidade bucal,
incluindo rebordo alveolar, mucosa, palato, área retromolar, lábio inferior, lábio
superior, assoalho, língua. No entanto, verifica-se maior freqüência nos sítios lábio
inferior, língua e assoalho (REGEZI, 2000). Nesta trabalho optamos por avaliar CEC
localizados nos sítios de maior ocorrência que apresentam comportamentos
distintos, uma vez que as lesões de lábio quase sempre estão associadas a um
melhor prognóstico.
De acordo com estudos realizados por Schawartz et al (2000) os casos de
CEC localizados em lábio são bem diferenciados e menos agressivos.
Diferentemente das lesões localizadas em língua e assoalho que podem apresentar
74
lesões menos diferenciadas, ou seja, geralmente apresentam pobre diferenciação
histológica, avançado estágio clínico, evolução rápida e maior probabilidade de
desenvolvimento de metástases à distância, sendo assim uma lesão de prognóstico
reservado, quando comparado ao CEC de outros sítios anatômicos orais.
O prognóstico dos casos de CEC de boca está associado a diversos fatores
que influenciam na sobrevida dos pacientes portadores desta neoplasia,
destacando-se gradação histológica de malignidade, tamanho e localização do
tumor primário, comprometimento de linfonodos regionais e presença de metástases
à distância (BRYNE, 1998).
Em relação às características histológicas, Neville et al. (2004), caracteriza
o CEC como uma proliferação de células da camada espinhosa, que se dispõe em
grupos celulares, formando cordões e ninhos, ou de forma individual, envolvendo o
conjuntivo, podendo ser classificados como bem diferenciado, moderadamente
diferenciado e pouco diferenciado. As células neoplásicas observadas
individualmente exibem hipercromatismo, pleomorfismo, aumento do número de
figuras de mitose e, eventualmente, mitoses atípicas.
A gradação histológica de malignidade em CEC oral, pode ser avaliada por
diversos sistemas que associados aos achados clínicos contribui para fornecer
subsídios no prognóstico e tratamento das lesões. Conforme revisão da literatura
destacamos os sistemas de Broders (1920), Wahi (1971), Jakobsson (1973), Bryne
(1989) e Bryne et al. (1998), Anneroth, Batsakis e Luna (1986) e Anneroth, Batsakis
e Luna (1987).
Têm sido verificados na literatura, trabalhos baseados nos mais diversos
parâmetros, como moleculares, morfológicos e clínicos. Todos com o intuito de
estabelecer critérios prognósticos para os cânceres de cabeça e pescoço, inclusive
os da cavidade oral. Apesar disto, a maioria não tem aceitação generalizada, com
exceção, do sistema TNM. Contudo, suas limitações, quanto à subjetividade de seus
parâmetros, têm sido citadas na literatura (BRYNE, 1991; ROLAND et al., 1992).
75
O sistema tumor, linfonodo, metástase (TNM) de classificação do câncer
bucal é o de uso mais difundido entre os clínicos e ainda tem como objetivo predizer
o prognóstico dos pacientes portadores do CEC. Apesar de grande aceitação clínica,
esse sistema de estadiamento apresenta óbvias limitações (MARTINS NETO, 1999).
A implementação dos sistemas de gradações morfológicas, associados ao sistema
de estadiamento clínico TNM, pode propiciar informações prognósticas mais
confiáveis para os pacientes e suas famílias.
Estudo realizado por Costa et al. (2002), procurou estabelecer a correlação
da classificação TNM, com a gradação histológica de malignidade e a localização
anatômica dos pacientes acometidos pelo CEC oral. Concluíram que existe
correlação estatiscamente significante entre o estadiamento clínico TNM e
localização anatômica. Esses resultados são conflitantes com os achados de Silveira
(2004) estudando casos de CEC em língua, pois observou que não houve
correlação entre o comportamento biológico e a gradação histológica.
Dentre os sistemas para avaliar a gradação histológica de malignidade
optamos em nosso estudo pelo modelo desenvolvido pelos estudos de Bryne (1998)
e utilizado por Dantas (2000), Novellino (2003) e Cruz (2006), modificado por
Anneroth, Batsakis e Luna (1986) e adotado nos estudos de realizados por Souza
(2002), Miranda (2002). O sistema analisa a lesão de forma simples às áreas de
invasão tumoral mais profundas a partir dos seguintes parâmetros: grau de
ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltrado inflamatório.
O sistema de Bryne (1998), mostrou ser uma importante ferramenta no
diagnóstico bem como para a terapêutica dos tumores, sugerindo que a gradação do
“front” invasivo é um dado valioso para análise histológica, uma vez que vários
eventos moleculares importantes ocorrem na interface tumor-hospedeiro, como
secreção de enzimas proteolíticas, alterações em moléculas de adesão, aumento da
proliferação celular e angiogênese. Esse sistema foi sugerido por Costa et al. (2005)
como sendo a que melhor representa informação prognóstica da neoplasia, uma vez
que não observavam apenas a porção superficial do tumor.
76
Aspectos morfológicos encontrados no front de invasão resultam de uma
série de anormalidades gênicas responsáveis por alterações moleculares que
culminam com a progressão e a disseminação das células neoplásicas malignas.
Interações moleculares entre as áreas do front CEC e os tecidos normais do
hospedeiro são consideradas determinantes para a predição do comportamento
biológico da lesão (BRYNE,1989).O sistema de gradação morfológico do front
invasivo representa um conjunto de alterações estruturais e funcionais das regiões
mais avançadas do CEC (NOGUCHI et al, 2002).
Conforme os nossos achados, 100% dos casos de CEC de lábio inferior
exibiram baixo escore de malignidade, não ocorrendo o mesmo na língua e assoalho
onde 20% e 40% dos casos respectivamente, foram classificados de alto grau,
conforme o sistema de gradação de Bryne (1998) e classificados de acordo com
Anneroth, Batsakis e Luna (1986). Nossos resultados morfológicos, para o sítio
anatômico lábio inferior, concordam com os achados de Pereira (2006), Cruz (2006)
e Silveira (2004). No entanto, em relação aos outros sítios anatômicos, os dados são
conflitantes.
O fato de todos os casos estudados de lábio inferior ter obtido classificação
como de baixo escore de malignidade, sugere um comportamento biológico menos
agressivo conforme observados nos estudos de Costa (2002), Cruz (2002), Pereira
(2006).
No sítio anatômico língua encontramos 20% dos casos classificados como
de alto escore de malignidade, conforme o sisema de gradação de Bryne (1998) e
classificados de acordo com Anneroth, Batsakis e Luna (1986). Estes resultados
discordam dos achados de Souza (2002), Cruz (2006), Pereira (2006), pois os
mesmos observaram maiores porcentagens classificadas como de alto escore.
Acreditamos que estas diferenças são justificadas, pelo fato de que os
variados estudos, mesmo utilizando a contagem matemática de escores
fundamentada pela análise morfológica idealizada por Bryne (1998), há
subjetividade na análise dos parâmetros padronizados.
77
Schnetler (1992) também observa que cerca de 50% dos cânceres orais são
diagnosticados em fases avançadas, principalmente, por serem submetidos à
biópsia apenas quando apresentam sintomas ou características sugestivas de
malignidade, fato este preocupante e condizente com o propósito de vários estudos
acerca do prognóstico de CEC oral, inclusive com o nosso propósito.
Segundo Solomon et al.(1991), o câncer resulta de uma série progressiva
de alterações genéticas que ocorrem em um único clone de células como
conseqüência de alterações em um número limitado de genes: os oncogenes, genes
sob ação de fatores de crescimento, e os genes supressores tumorais.
Uma célula individual transformada tem o potencial, através de sucessivas
divisões celulares e posteriores mutações, de se desenvolver num cluster, ou
nódulo, de células tumorais. Neste estágio, o tumor sólido consiste de
aproximadamente 106 células e apresenta um diâmetro em torno de 3 mm. A partir
de então, seu crescimento torna-se limitado pois é dependente, unicamente, de
difusão para receber oxigênio e nutrientes e eliminar seus produtos de excreção.
Como conseqüência, as células, no centro da massa tumoral tendem a morrer,
devido a necrose ou a apoptose. Acredita-se que microtumores, neste estágio,
possam sobreviver, num estado dormente, no qual o número de células que
proliferam se equivaleria ao das que morrem (FOLKMAN, 1985; GASTL et al, 1997).
Para um desenvolvimento posterior ocorrer, o tumor precisa induzir um
processo angiogênico, iniciado pela secreção de fatores pró-angiogênicos. Esses
fatores são capazes de induzir as células endoteliais, nas vizinhanças dos vasos
sangüíneos, a degradar sua lâmina basal e migrar em direção ao tumor.Uma vez
que o tumor passe a ter um suprimento sangüíneo, se tornará muito mais invasivo e
irá adquirir um potencial para metástase, podendo levar à formação de tumores
secundários.Metástase é o mais temido e o menos entendido aspecto do câncer.
(FOLKMAN, 1997).
Williams et al. (1994), em estudos com pacientes acometidos por CEC oral
sem metástases linfonodais clinicamente identificáveis, relataram maior índice de
recidivas regionais entre os pacientes com tumores primários mais angiogênicos, A
78
mesma conclusão chegou Amar et al.(2002), observando ainda que a avaliação da
angiogênese pode auxiliar a elucidar o significado clínico das micrometástases,
fazendo a diferenciação entre focos neoplásicos com crescimento suprimido e
células “em trânsito”. Outro estudo realizado por Srivastava et al.(1986), concluiu
que há forte correlação entre o aparecimento da angiogênese com metástases e
recorrência regional.
Muito se tem pesquisado no sentido de melhor compreensão do
comportamento biológico do CEC com a finalidade de obtenção de melhores
resultados terapêuticos, e dessa forma aumentar a sobrevida e levar a um melhor
prognóstico para os pacientes com câncer. Diversas evidências apontam para o fato
de que a neoformação vascular está relacionada ao desenvolvimento das neoplasias
através de substâncias estimuladoras e inibidoras que poderão está em equilíbrio ou
desequilíbrio, desenvolvendo assim um papel relevante na progressão tumoral
( FOLKMAN, 1989; WEIDNER, 1993; KHON, 1997).
A avaliação do índice angiogênico tem sido relatada como um bom
indicador prognóstico em casos de CEC por fornecer informações acerca de sua
biologia e estando correlacionado com o desenvolvimento de metástase regional e
preditor de recorrência regional (ARTESE et al., 2001; MAEDA et al., 1995;
NARESH, 2001; WILLIAMS et al., 1994). No entanto, estudos realizados por Leedy
et al. (1994); Gleich et al. (1997); Fridman et al. (2000) e Souza (2002) observaram
que o índice angiogênico não se configura como um bom indicador de prognóstico
tumoral.
A angiogênese pode ser quantificada através da avaliação microscópica da
vascularização tumoral, utilizando-se anticorpos específicos para as células
endoteliais como o VEGF C1, VEGF A-20, CD31, CD 34 e Fator VIII (WEIDNER et
al, 1991; MAEDA et al.,1995; PAZOUKI et al., 1997).
Nagatsuka et al.( 1994) e Weidner et al.(1991) recomendam o CD34 como
bom marcador para angiogênese tumoral, Da mesma forma Calux et al. (2001) em
estudo acerca da angiogênese na neoplasia escamosa do colo uterino, concluiu que
o emprego do anti-CD 34 permite deteccção de maior número de vasos do que o
79
uso do anti-fator VIII. De acordo com Lathers (1999) as células CD 34 positivas,
podem representar células dendríticas imaturas ou precursores endoteliais e podem
estimular a angiogênese.
No entanto, baseados nos relatos de Artese et al. (2001), Hagedorn e
Nerlich (2000), Fina et al.(1990), Leedy et al. (1994) Moriyama et al. (1997), Murray
et al., 1997), Sion-Vardy et al. (2001) e Penfold et al.(2005), que utilizaram o CD31
e comprovaram eficácia na marcação de lúmen de vasos e células isoladamente,
optamos em utilizá-lo em nosso estudo.
Fina et al.(1990) verificou que o CD31 poderia participar da adesão celular
nas células endoteliais e hematopoiéticas, sugerindo assim que o anticorpo é
eficiente na marcação para avaliar a angiogênese.
Da mesma forma optamos pelo Fator VIII embasados em estudos
desenvolvidos por Schor et al.(1998), Piovella et al.(1978), Pazouki et al.(1997),
Gleich et al (1997), Maeda et al.(1995), Smith et al. (1994), Artese et al.2001),
Shang et al.(2005), Zätterstrom et al. (1995), Naresh, Nerurkar e Borges (2001),
Souza (2002). Estes autores concluíram que o Fator VIII obteve marcação
satisfatória para avaliar novos vasos formados em lesões neoplásicas.
Estudo realizado por Piovella et al.(1978) concluiu que células endoteliais
sintetizam o antígeno relacionado ao Fator VIII, possibilitando dessa forma verificar a
reação antígeno- anticorpo e apurar a neoformação celular.
De acordo com as recomendações de Alves, Bacchi e Vassalo (1999),
Marinho et al. (1997) e Souza (2002) os melhores marcadores na identificação dos
vasos são o CD31 e Fator VIII, motivo pelo qual selecionamos estes marcadores o
experimento em questão. Do mesmo modo, estudo de Ravi (2000) concluiu que
células tumorais em processos neoplásicos replicam rapidamente e necessitam de
aporte nutricional formando novos vasos e que estes marcadores são importantes
para mensurar a angiogênese.
80
Utilizamos neste experimento os dois marcadores, porque além de
comprovação em estudos anteriores de Alves, Bacchi e Vassalo (1999), Marinho et
al. (1997) e Souza (2002) sobre sua eficácia na marcação de novos vasos,
pudemos fazer uma comparação entre a expressão dos mesmos no CEC de boca.
Observamos que tanto o CD31 como o Fator VIII marcaram 100% dos
casos aqui avaliados, sendo que para o CD31 constatou-se uma marcação mais
expressiva do que o Fator VIII. Nossos achados divergem dos resultados de Souza
(2002), uma vez que este autor não obteve marcação positiva em todos os casos de
CEC avaliados. Acreditamos que este fato pode refletir diferenças na metodologia
empregada nos dois estudos.
Ao realizarmos a contagem de células CD31 positivas em relação ao escore
de malignidade, observamos que não houve diferença estatística significante entre
os casos de CEC analisados neste experimento. Resultados semelhantes foram
encontrados por Leedy et al. (1994), Hagedorn e Nerlich (2000), sugerindo que este
marcador não configura um método para avaliar a agressividade do CEC de boca.
Os dados observados nesta pesquisa indicam que em relação aos casos de
alto grau de malignidade, o Fator VIII mostrou-se mais fortemente marcado, uma vez
que houve diferença estatística para os casos de CEC de alto grau e baixo grau de
malignidade. Esses achados sugerem uma possível associação entre a expressão
do Fator VIII e a agressividade do CEC. Dados semelhantes foram encontrados por
Horak et al. (1992), Zatterstrom et al.(1995), Shpitzer et al.(1996) e Shieh et al
(2004). Entretanto, nos estudos desenvolvidos por Naresh, Nerurkar e Borges
(2001) e Gleich et al.(1997) comparando a expressão do Fator VIII, não encontraram
associação da angiogênese com este marcador.
Em relação ao sítio anatômico, no estudo imuno-histoquímico podemos
observar que o CD31 apresentou células em 100% dos casos de CEC estudados,
no entanto apresentou marcação mais efetiva no sítio anatômico assoalho, seguido
de lábio e por último língua. Resultados conflitantes identificados no estudo realizado
por Souza (2002) ao avaliar a angiogênese tumoral utilizando o mesmo marcador,
pois houve reação em apenas 50% dos casos de lábio inferior e 60% de língua.
81
O estudo estatístico com o CD31, revelou que em relação aos sítios
anatômicos houve significante diferença de células positivas entre os sítios assoalho
e lábio e assoalho e língua, demonstrando que o mesmo pode ser utilizado para
avaliar a neoformação vascular de acordo com os achados de Petruzzelli (1996),
Murray et al. (1997), Penfold et al. (2005) e Nagatsuka et al.(2004), Schor et al.
(1998). Esses dados são diferentes dos achados por Souza (2002), que não indica o
CD31 para quantificação da vascularização e conseqüentemente como possível
indicador prognóstico para casos de CEC oral.
Observa-se que em relação ao Fator VIII também houve 100% de marcação
nos casos de CEC estudados, concordando com os achados de Souza (2002).
Houve diferença estatística significante entre os sítios anatômicos assoalho e língua
e assoalho e lábio, indicando que o Fator VIII pode ser utilizado para quantificação
de vasos e possível indicador de prognóstico, concordando com os estudos
realizados por Pazouki et al. (1997), Lee, DeLillis e Wolfe (1996), Ordonez et al.
(1987), Gleich et al. (1997), Artese et al. (2001).
A avaliação do estudo realizado nesta pesquisa o Fator VIII mostrou-se
mais efetivo para o assoalho de boca e em casos de alto escore de malignidade,
possibilitando assim, indicá-lo como possível marcador angiogênico em CEC oral,
especialmente no sítio anatômico supracitado. Nossos dados corroboram com os
estudos realizados por Williams (1994), Gleich et al. (1996), Beatrice et al. (1996),
Tomoda et al. (1999), Schor et al. (1998), e Artese et al.(2001) que recomendam o
Fator VIII na análise da neovascularização em CEC decorrente da facilidade de sua
interpretação e pode ser utilizado como indicador de neoangiogênese.
O comportamento biológico do CEC de assoalho bucal pode estar
relacionado com a angiogênese. Sugere-se que o Fator VIII poderá ser utilizado
para predizer se os CEC de boca poderão se transformar em lesões de alto grau de
malignidade, favorecendo assim o planejamento do tratamento; O Fator VIII também
poderá ser indicativo se uma lesão terá prognóstico favorável ou não, corroborando
com os achados verificados por Maeda et al. (1995), Weidner et al.(1991) e Smith et
al. (1994).
82
Pelas informações obtidas em nosso experimento e analisando estudos
anteriores sobre a angiogênese tumoral verificamos que mesmo havendo muitas
diferenças na literatura sobre o tema, quando alguns autores sugerem que há
correlação entre angiogênese e prognóstico tumoral e outros autores discordam,
acreditamos que a neoformação vascular averiguada com marcadores específicos,
poderá ser utilizada como sugestivo preditor para casos de CEC oral. Sugerimos
que novos estudos poderão ser desenvolvidos, objetivando garantir maior exatidão e
precisão na indicação em planos de tratamento para câncer oral e, dessa forma ser
aplicado de forma rotineira em patologia.
83
_________________________________________
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#$%#$%
#$%
84
7 CONCLUSÕES
1. Observou-se marcação positiva para os marcadores CD31 e Fator VIII em
todos os casos de CEC de boca avaliados.
2. Observou-se uma marcação estatisticamente significante do Fator VIII nos
casos de CEC de alto escore de malignidade.
3. O marcador CD31 em relação ao escore de malignidade não apresentou
diferença estatística significante.
4. Em relação aos sítios anatômicos, observou-se que tanto o Fator VIII como o
CD31, foram consideravelmente mais expressivos no assoalho de boca que
nos sítios anatômicos lábio e língua.
85
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_________________________________________________________ _
+
++
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96
PROTOCOLO DA TÉCNICA IMUNO-HISTOQUÍMICA DO IPATIMUPI (Instituto de
Patolologia da Universidade do Porto)
Este procedimento aplica-se à descrição de todos os procedimentos necessários a
realização da técnica de imunohistoquimica em sistema automático (Lab Vision
Autostainer® – LV-1)
A – Desparafinação e Hidratação
Utilizam-se cortes de 3 µm em lâminas adesivadas (polysina), após secagem
durante a noite na estufa a 37ºC. Antes de se proceder à recuperação antigénica, os
cortes são desparafinados e hidratados em sistema automático (MT.TEC.05) ou
manualmente, procedendo da seguinte forma: Clear Rite (1) 15 min; Clear Rite(2)
15 min; álcool absoluto 5 min; álcool 70% 3 min; álcool 50% 3 min; e água corrente
3 min.
B – Recuperação Antigénica
Após a hidratação das lâminas com os cortes histológicos, consoante o anticorpo
em questão, estas podem ser ou não submetidas a uma das diferentes
recuperações antigénicas (em anexo está a tabela de recuperações antigénicas e
diluições dos anticorpos utilizados no Laboratório da Unidade de Prestação de
Serviços).
a) Banho-Maria
Solução Retrieval: Diluir a solução retrieval (comercial) em água desionizada.
Acertar o pH da solução a 6.00 (6.00-6.10). Pré-aquecer a solução em banho-maria
a 98ºC durante 5 minutos. Colocar as lâminas na solução dentro do banho-maria
(durante 20 ou 30 minutos, conforme o padronizado para o anticorpo em questão) e
deixar arrefecer a solução à temperatura ambiente durante 5 minutos. Colocar as
lâminas em PBS (phosphate buffered saline).
Tampão TRIS-EDTA: Diluir a solução de TRIS-EDTA (DAKO Cytomation®),
pH=9,0, 1/10 em água desionizada. Acertar o pH da solução a 9.00 (8.00-8.10). Pré-
aquecer a solução em banho-maria a 98ºC durante 5 minutos. Colocar as lâminas
durante 20 minutos na solução dentro do banho-maria e deixar arrefecer a solução
à temperatura ambiente durante 5 minutos. Colocar as lâminas em PBS.
97
b) Estufa 37ºC
Solução Pepsina: Diluir 400 mg de pepsina (Sigma – Pepsin A 1:10,000) em 100
ml de água desionizada e adicionar 0.1 ml de HCL 1M. Colocar as lâminas dentro
desta solução durante 30 minutos na estufa a 37ºC. Após incubação inactivar a
acção da enzima colocando as lâminas em PBS durante 3 minutos a -20ºC.
c) PT Module
Preparar 1,5 L da solução PTModule pH 6,0 a partir de uma solução concentrada
100x. Colocar as lâminas na rack do aparelho automático de imunohistoquímica e
encaixa-la no recipiente do PTmodule previamente aquecido a 65ºC. Fechar o
tanque com as lâminas e a solução de recuperação antigénica e iniciar o
aquecimento até 98ºC e manter a temperatura durante 40 minutos, ao fim dos quais
a temperatura do tamque começa a arrefecer até chegar a 65ºC (momento que o
tanque desbloqueia a tampa e se podem retirar as lâminas). Depois colocar as
lâminas em solução tampão PBS Tween aquecido a 65ºC durante 10 minutos. Este
tipo de recuperação antigénica dispensa desparafinação e hidratação das
lâminas(5.1-A).
Depois de feita a recuperação antigénica, as lâminas são colocadas no Lab Vision
Autostainer, pela ordem especificada no programa. A partir daqui, o aparelho realiza
automaticamente os seguintes passos:
A partir deste passo procede habitualmente ao sistema automático de imunohistoquímica.
Sempre que necessário pode realizar-se o mesmo protocolo em sistema manual, efectuando
os mesmos passos e os mesmos tempos de incubação.
O sistema automático de imunohistoquímica é constituído por um computador, impressora e
Autostainer. (Lab Vision Autostainer). Este sistema funciona automaticamente depois de
serem introduzidos no programa informático todos os dados específicos da técnica
imunohistoquímica.
A utilização deste sistema automático de imunohistoquímica requer uma formação teórica (ver
manual de instruções do aparelho localizado no terceiro armário no laboratório) e prática
(técnico responsável pela imunohistoquímica).
98
• Bloqueio da Peroxidase Endógena
Bloqueio da peroxidase endógena com solução de peróxido de hidrogénio a 3%
diluído em metanol durante 10 minutos.Lavagem em PBS.
• Bloqueio de Reacções Inespecíficas
Incubação das lâminas com UltraVisonBlock durante 10 minutos. Após esta
incubação retirar o excesso de reagente das lâminas e não lavar.
• Anticorpo Primário
Incubação do Anticorpo primário durante 30 e/ou 60 minutos (dependendo do
anticorpo utilizado). Lavagem em PBS.
• Anticorpo Secundário conjugado com polímero com peroxidase
Incubação das lâminas com anticorpo secundário conjugado com polímero durante
30 minutos. Lavagem em PBS.
• Cromogénio: Diaminobenzidina (DAB)
Preparar uma solução de diaminobenzidina: 20 l de comogénio DAB por cada ml
de substrato. Incubar durante 10 minutos. Lavagem em água corrente durante 5
minutos.
C – Contraste Nuclear
Este passo é efetuado em sistema automático (MT.TEC.01) ou manualmente
procedendo da seguinte forma: Contrastar os núcleos com Hematoxilina de Mayer,
mergulhando as lâminas neste corante durante 20 segundos. Lavagem em água
corrente durante 2 minutos. Diferenciar em água amoniacal 1% durante 15
segundos e lavar em água corrente 3 minutos. Desidratar as lâminas mergulhando-
as em álcoois de concentrações crescentes.
D – Montagem
Procede-se à montagem das lâminas em sistema automático (MT.TEC.03) ou
manualmente colocando meio de montagem e lamela por cima do corte.
99
E – Autoclavagem de Material
As pontas utilizadas nas micropipetas e os tubos utilizados para diluição de
anticorpos e reagentes do Kit de detecção são autoclavados. As pontas são
colocadas em caixas próprias e em sacos específicos para autoclavagem. Os tubos
e as respectivas tampas, depois de lavados, são também colocados em sacos
específicos para autoclavagem. Estes sacos seguem para a sala de lavagem de
material e são lacrados com uma fita. Esta fita indica se a autoclavagem foi efetiva
através da alteração da cor.
Controle de qualidade
Controle dos Anticorpos Utilizados
Todos os anticorpos utilizados na técnica de imunohistoquimica da rotina do
Laboratório de Patologia da UPS são validados pela MED através de testes em
controles positivos realizados pela TEC. Estes testes são registados no IM.TEC.16
“Teste de validação de anticorpos”.
Controle Positivo
Deve ser incluído na série de lâminas para a técnica de imunohistoquimica um corte
correspondente a um tecido que se saiba à partida que é positivo para o anticorpo
em questão. Para cada anticorpo deve existir um controle positivo.
Para anticorpos com prazo de validade expirado, é necessária a validação da
reação através de comparação da qualidade da coloração entre os controles
positivos após expiração do prazo de validade e o controle positivo anterior à
expiração da validade.
Controle Negativo
Quando se utilizam anticorpos policlonais deve incluir-se um corte histológico do
mesmo caso para controle negativo da reação de imunohistoquimica. Este corte vai
ser submetido a todos os passos do protocolo de imunohistoquímica exceto um: O
anticorpo primário é substituído por um soro normal constituído por imunoglobulinas
que não têm afinidade com os tecidos humanos. Se este soro não se liga, os
100
restantes complexos também não se irão conjugar-se constituindo um controle
negativo da reação.
Controle Interno
Alguns cortes histológicos têm áreas de tecido normal que podem servir de controle
positivo ou negativo da reação de imunohistoquímica para determinados anticorpos
primários.
Controle da Temperatura e Umidade
Ambiente: A temperatura e umidade do ambiente são controladas por higrômetros
que se encontram no Laboratório (Piso 1) e na Sala de Macroscopia (Piso 0). A
temperatura ambiental deve permanecer entre 18 e 22ºC, podendo atingir o máximo
de 25ºC, em situações especiais. A umidade do ambiente deve permanecer entre os
50 e 70%.
Normas de funcionamento e manutenção do higrômetro:
- O higrômetro mostra o grau de umidade do ar em %.
- Para um bom funcionamento e maior duração do aparelho, este deve ser
testado semestralmente, sendo os valores registrados no IM.TEC.03 “Controle de
Temperatura e Umidade do Ambiente”. Durante o teste, o aparelho deve
permanecer envolvido num pano úmido durante 30 minutos, após os quais o
ponteiro deverá indicar 95%. Se o aparelho não atingir está percentagem de
umidade, deve ser feito um ajuste na parte traseira do mesmo, com a ajuda de uma
chave de parafusos.
Frigoríficos: A temperatura dos frigoríficos é controlada através de termômetros
digitais colocados na porta dos dois frigoríficos existentes no Laboratório (Piso 1),
com sensores localizados no interior dos frigoríficos (Sanyo e Siemens). Os
termômetros mostram a temperatura interna e a temperatura externa ao frigorífico.
Estas temperaturas devem ser registradas diariamente no IM.TEC.02 “Controle de
temperatura dos frigoríficos”.
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