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Arethuza Dornelles
Papel do Sistema Adrenérgico na Formação
da Memória de Reconhecimento em Ratos
Dissertação apresentada como requisito
para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Celular e Molecular, a ser
apreciada pela Banca Examinadora do
Programa de Pós Graduação em Biologia
Celular e Molecular, da Faculdade de
Biociências, da Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul.
Orientadora: Prof.a Dr.a Nadja Schröder
Porto Alegre
2007
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2
AGRADECIMENTOS
À Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, especialmente à Faculdade
de Biociências por me acolher, tanto ao longo da graduação, quanto ao da pós-graduação.
Às meninas da secretaria do Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e
Molecular; Maria Luiza Moreira, Cátia Bonacina e Josilene Martins Rocha que, devido a sua
competência, me mantiveram sempre bem informada a respeito de tudo sobre o programa
nunca perdendo a paciência e oferecendo toda a atenção possível.
À professora Dr.a Clarice Alho que demonstrou-se sempre presente e disponível para
resolver todos os problemas que apareciam ao longo desses anos.
Aos meus colegas e amigos do laboratório Marcelo Guimarães, Caroline Dias e
Roberta Petry pela ajuda prestada em todas as horas, aos amigos Felipe Scalco, Vanessa
Athaíde Garcia e Juliana Presti Torres que foram incansáveis em sua ajuda, sempre presentes
em qualquer hora e principalmente à Maria Noêmia Martins de Lima que foi excepcional,
pela paciência dissipada comigo no decorrer de todo este trabalho não medindo esforços para
me auxiliar; muito obrigada.
À Glauramar Barbosa Martins e à Betânia Souza de Freitas, pessoas que conheci
graças ao desenvolvimento deste trabalho e que, desde o início, estiveram dispostas a ajudar,
não só na rotina laboratorial, mas sim, em todos os momentos nos quais precisei de amigas
para desabafar. Estou certa de que este vínculo não acabará com a conclusão deste trabalho.
À Prof.a Dr.a Elke Bromberg por emprestar o computador, por ter colaborado com a
realização do meu estágio docente e por descontrair o ambiente nos momentos de tensão
mostrando que, por mais difícil que possa parecer a situação na qual nos encontremos,
devemos agir de maneira calma e despreocupada.
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3
À Prof.a Dr.a Nadja Schröder, que mesmo sem me conhecer, me recebeu de braços
abertos no momento em que mais precisava de apoio; no momento em que parecia que o
mundo tinha desabado e que não sabia mais o rumo que as coisas tomariam. Agradeço, por
desde o início, ter acreditado e investido em mim apesar de tudo que estava acontecendo. No
decorrer de todo este trabalho, conseguistes mudar o conceito que eu tinha de orientador, pois
me mostrastes que é possível orientar com paciência e carinho. Vi que, apesar da quantidade
de trabalho que tenha, um orientador pode e deve ser, não só um orientador, mas um amigo.
Obrigada por me ensinar muito além da tarefa de reconhecimento do objeto novo, dos efeitos
das drogas ou de como escrever um artigo; me ensinastes como devo ser e agir na profissão
que escolhi, não só uma orientadora, mas principalmente uma amiga. Bom, poderia escrever
páginas e mais páginas e não seria suficiente para agradecer, por que tu sabes que se não fosse
por ti, talvez tivesse desistido do meu sonho.
Às minhas maravilhosas irmãs, Arielle e Ariany, que sempre me apoiaram desde o
momento que escolhi a carreira que gostaria de seguir. Mesmo sem saberem, me ajudaram
muito no decorrer desta caminhada pelo simples fato de estarem do meu lado me fazendo rir e
esquecer das coisas ruins que aconteciam e das dificuldades que ainda teria de enfrentar.
Tenho certeza de que sempre poderei contar com o apoio de vocês, não importando o quanto
falte para atingir meus objetivos. Amo vocês!
Aos meus pais, Carlos e Virginia. Difícil encontrar palavras para agradecer tudo que
fizeram por mim até hoje. Desde o apoio financeiro, sem o qual realmente não teria chegado
até aqui, até o apoio emocional e incentivo que me deram, mesmo sem saber direito do que se
tratava o meu trabalho. Estiveram do meu lado no decorrer da graduação, no ingresso e no
decorrer do programa de pós-graduação, sempre me apoiando e incentivando nos momentos
mais difíceis, não me deixando desistir nunca de atingir meus objetivos não importando o
4
quão difíceis fossem. Muito obrigada por serem esses pais maravilhosos que são; sei que
poderei contar com a ajuda e com o apoio de vocês sempre. Amo vocês!
5
INDICE
1
RESUMO / ABSTRACT .................................................................................... 07
2
APRESENTAÇÃO DO TEMA.......................................................................... 09
3
OBJETIVOS.........................................................................................................
12
3.1
OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................ 12
4
ARTIGO (submetido ao periódico Neurobiology of Learning and Memory)..
13
5
CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................. 35
6
REFERÊNCIAS................................................................................................... 40
7
ANEXOS............................................................................................................... 43
6
1. RESUMO/ABSTRACT
Resumo
Evidências indicam que a adrenalina modula a consolidação da memória em testes
de caráter aversivo/emocional tanto em animais quanto em humanos. Entretanto, pouco se
sabe a respeito dos efeitos da adrenalina sobre a consolidação da memória de reconhecimento.
Neste trabalho, constatamos que a administração sistêmica de adrenalina melhora a
consolidação da memória na tarefa de reconhecimento do objeto novo sob diferentes
condições de treino. Ratos machos controles que receberam injeção sistêmica de salina (NaCl
0,9%) imediatamente após treino mostraram retenção significativa de memória quando
testados 1,5 ou 24 horas, mas não 96 horas após o treino. Em contraste, ratos tratados com
injeção pós-treino de adrenalina mostraram retenção significativa de memória de
reconhecimento do objeto novo em todos os intervalos de tempo testados. Em um segundo
experimento utilizando uma condição de treino com maior grau de dificuldade, os ratos
tratados com adrenalina, mas não os animais tratados com salina, mostraram retenção
significativa na memória de reconhecimento do objeto novo quando testados 1,5 e 24 horas
depois do treino. Depois, mostramos que a melhora de retenção na memória testada 96 horas
depois do treino induzida por adrenalina foi prevenida pela administração sistêmica pré-treino
do antagonista de β-adrenoreceptores, propranolol. Estes resultados sugerem que, como
observado anteriormente em experimentos usando tarefas com caráter aversivo/emocional, a
adrenalina modula a consolidação da memória de reconhecimento e que seus efeitos
necessitam da ativação de receptores β-adrenérgicos.
Palavras-chave: Adrenalina; Adrenoreceptores; Memória de Reconhecimento;
Consolidação da Memória.
7
Abstract
Extensive evidence indicates that epinephrine (EPI) modulates memory
consolidation for emotionally arousing tasks in animals and human subjects. However,
previous studies have not examined the effects of EPI on consolidation of recognition
memory. Here we report that systemic administration of EPI enhances consolidation of
memory for a novel object recognition (NOR) task under different training conditions.
Control male rats given a systemic injection of saline (0.9% NaCl) immediately after NOR
training showed significant memory retention when tested at 1.5 or 24, but not 96 h after
training. In contrast, rats given a posttraining injection of EPI showed significant retention of
NOR at all delays. In a second experiment using a different training condition, with a higher
degree of difficulty, rats treated with EPI, but not SAL-treated animals, showed significant
NOR retention at both 1.5 and 24-h delays. We next showed that the EPI-induced
enhancement of retention tested at 96 h after training was prevented by pretraining systemic
administration of the β-adrenoceptor antagonist propranolol. The findings suggest that, as
previously observed in experiments using aversively-motivated tasks, epinephrine modulates
consolidation of recognition memory and that the effects require activation of β-
adrenoceptors.
Keywords: Epinephrine; Adrenoceptors; Recognition memory; Memory consolidation
8
2. APRESENTAÇÃO DO TEMA
Nas últimas décadas o interesse pelo estudo dos efeitos do estresse sobre órgãos e
sistemas tem crescido de maneira significativa dentro da comunidade científica. Investigações
a respeito de que maneira os eventos de conteúdo emocional podem influenciar a memória
têm se destacado dentre as pesquisas sobre esse tema.
A idéia de que a ativação emocional pode melhorar a consolidação da memória tem
sido muito discutida nos últimos anos. Eventos com conteúdo emocional causam liberação de
adrenalina e aumento nos níveis de glicocorticóides circulantes, os quais são conhecidos por
modular a memória.
Testes de memória com caráter aversivo/emocional já foram demonstrados sensíveis a
neuromoduladores e hormônios relacionados ao aspecto emocional que governa a fase de
treino desses testes. Contudo, pouco se sabe a respeito da influência da adrenalina sobre tipos
de memória que não são diretamente moduladas pelos hormônios liberados em situações de
estresse, nem que regiões cerebrais estão classicamente envolvidas na modulação da memória
de conteúdo emocional.
A memória, uma das mais importantes funções cognitivas do ser humano, pode ser
entendida como a incrível habilidade que possuímos de armazenar informações e
conhecimentos sobre nós mesmos e o mundo que nos cerca. Ela é a base para o
desenvolvimento da linguagem, do reconhecimento das pessoas e dos objetos que
encontramos todos os dias, para sabermos quem somos e para termos a consciência da
continuidade de nossas vidas. Sem a memória, a cada dia, ou a cada momento, estaríamos
começando uma nova vida, sem podermos nos valer do que aprendemos anteriormente
(Yassuda, 2002).
9
Em relação ao conteúdo, as memórias podem ser declarativas ou procedurais. As
memórias procedurais são aquelas relacionadas às capacidades/habilidades motoras, ou
sensoriais (Izquierdo, 2002).
As memórias que registram fatos, eventos, ou conhecimento são chamadas
declarativas, porque nós, seres humanos, podemos declarar que existimos e podemos relatar
como as adquirimos. Entre elas, as referentes a eventos aos quais presenciamos ou dos quais
participamos são denominadas episódicas e, ainda, as de conhecimentos gerais são conhecidas
como semânticas (Izquierdo, 2002), sendo que esta última abrange a memória do significado
das palavras e é utilizada quando envolve conceitos, ou seja, quando aprendemos que a capital
do Brasil é Brasília, por exemplo.
A formação da memória declarativa depende de um sistema de estruturas
anatomicamente relacionadas no lobo medial temporal. Em humanos a memória declarativa
dá suporte à capacidade de relembrar fatos e eventos e pode ser contrastada com o acúmulo
das habilidades não declarativas de memória: hábitos e habilidades, formas simples de
condicionamento, entre outros (Manns et al., 2003).
Um dos exemplos mais profundamente estudados da memória declarativa é a memória
de reconhecimento (neutra, ou seja, não causadora de estresse nos animais), que é a
capacidade de julgar um item recentemente encontrado como familiar. A capacidade da
memória de reconhecimento tem sido também muito bem documentada em camundongos,
ratos e macacos, assim como em humanos (Manns et al., 2003).
A memória de reconhecimento em seres humanos consiste de dois componentes: um
episódico, que diz respeito à habilidade de lembrar do episódio (situação) no qual um objeto
foi introduzido (objeto novo), e um componente familiar, que se relaciona com a habilidade
de reconhecer um objeto como já conhecido (ou familiar), mas sem a necessidade da
lembrança do próprio episódio (Manns et al., 2003).
10
Experimentalmente, podemos estudar a memória de reconhecimento em roedores
através da tarefa de reconhecimento do objeto novo, a qual se baseia na tendência espontânea
dos roedores de explorar um objeto novo. Tem sido proposto que essa tarefa apresenta
analogia com testes de memória de reconhecimento que são amplamente utilizados em seres
humanos para caracterizar síndromes amnésicas, pois fornecem um índice acurado do grau de
severidade geral de prejuízos da memória declarativa (Dix & Aggleton, 1999; Reed & Squire,
1997).
Durante e imediatamente após situações emocionalmente intensas ou estressantes,
vários sistemas neuro-humorais são ativados, incluindo a liberação de inúmeros hormônios
(Quevedo et al., 2003), como é o caso da adrenalina, citada anteriormente. Foi observado que
pacientes que sofrem da Síndrome do Estresse Pós-Traumático apresentam níveis circulantes
aumentados de adrenalina (Yehuda, 2002). Interessantemente, estes pacientes apresentam
uma inabilidade de apagar memórias de certos eventos traumáticos (van Praag, 2004).
A premissa de que eventos com caráter emocional são lembrados de forma mais
marcante tem sido especialmente discutida. Portanto, é de extrema importância o
aprofundamento dos estudos sobre quais são os tipos de memória que podem ser
influenciados pela ação dos hormônios do estresse; em que fase da formação da memória
esses hormônios atuam e de que forma (positiva ou negativa) se dá essa modulação.
Nesse contexto, analisamos os efeitos da adrenalina sobre a consolidação da memória
de reconhecimento através da tarefa de reconhecimento do objeto novo em ratos.
11
3. OBJETIVOS
Avaliar os efeitos de manipulações farmacológicas do sistema adrenérgico sobre a
consolidação da memória de reconhecimento em ratos.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito do tratamento agudo com salina (grupo controle) ou adrenalina (i.p.)
sobre a memória de curta e de longa duração na tarefa de reconhecimento do objeto novo.
Avaliar o efeito do tratamento agudo com salina (grupo controle) ou propranolol (i.p.)
a memória de curta e de longa duração na tarefa de reconhecimento do objeto novo;
Verificar se a administração prévia de propranolol bloquearia os efeitos da adrenalina.
12
4. ARTIGO
Neurobiology of Learning and Memory
Research article
Adrenergic enhancement of consolidation of object recognition memory
Arethuza Dornelles
a
, Maria Noemia Martins de Lima
a
, Manoela Grazziotin
a
, Juliana Presti-
Torres
a
, Vanessa Athaide Garcia
a
, Felipe Siciliani Scalco
a
,
Rafael Roesler
b
, Nadja Schröder
a, *
a
Neurobiology and Developmental Biology Laboratory and Graduate Program in Cellular
and Molecular Biology, Faculty of Biosciences, Pontifical Catholic University, 90619-900
Porto Alegre, RS, Brazil
b
Cellular and Molecular Neuropharmacology Research Group, Department of
Pharmacology, Institute for Basic Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Sul,
90046-900 Porto Alegre, RS, Brazil
* Corresponding author. Department of Physiological Sciences, Faculty of Biosciences,
Pontifical Catholic University, Av. Ipiranga, 6681 Prédio 12C, Sala 266, 90619-900 Porto
Alegre, RS, Brazil. Telephone: +55 51 33203545. Fax: +55 51 33203612.
E-mail address: [email protected]
.
13
Abstract
Extensive evidence indicates that epinephrine (EPI) modulates memory consolidation
for emotionally arousing tasks in animals and human subjects. However, previous studies
have not examined the effects of EPI on consolidation of recognition memory. Here we report
that systemic administration of EPI enhances consolidation of memory for a novel object
recognition (NOR) task under different training conditions. Control male rats given a
systemic injection of saline (0.9% NaCl) immediately after NOR training showed significant
memory retention when tested at 1.5 or 24, but not 96 h after training. In contrast, rats given a
posttraining injection of EPI showed significant retention of NOR at all delays. In a second
experiment using a different training condition, rats treated with EPI, but not SAL-treated
animals, showed significant NOR retention at both 1.5 and 24-h delays. We next showed that
the EPI-induced enhancement of retention tested at 96 h after training was prevented by
pretraining systemic administration of the β-adrenoceptor antagonist propranolol. The
findings suggest that, as previously observed in experiments using aversively-motivated tasks,
epinephrine modulates consolidation of recognition memory and that the effects require
activation of β-adrenoceptors.
Keywords: Epinephrine; Adrenoceptors; Recognition memory; Memory consolidation
14
1. Introduction
Extensive evidence indicates that adrenal stress hormones, namely epinephrine (EPI)
and glucocorticoids, modulate consolidation of emotionally-motivated memory in animals
and human subjects (for reviews, see Cahill & McGaugh, 1998; McGaugh, 1983; 2004;
McGaugh, Cahill, & Roozendaal, 1996; McGaugh & Roozendaal, 2002). In rodent models,
the kind of stimulation typically used in learning experiments induces release of endogenous
EPI (McCarty & Gold, 1981; McGaugh et al., 1996), and systemic administration of EPI
shortly after training enhances consolidation of memory for arousing tasks (McGaugh, 1983;
McGaugh et al., 1996; Nordby, Torras-Garcia, Portell-Cortes, & Costa-Miserachs, 2006). The
memory-enhancing effects of peripheral administration of EPI require release of
norepinephrine and activation of β-adrenoceptors in brain areas including the basolateral
amygdala (BLA) (Liang, Juler, & McGaugh, 1986; McGaugh et al., 1996; McGaugh &
Roozendaal, 2002). Together, these findings strongly indicate that endogenous EPI released
during learning modulate the formation of long-lasting memories for arousing events
(McGaugh, 1983; 2004; McGaugh et al., 1996; McGaugh & Roozendaal, 2002).
In contrast to the extensive evidence available from studies in emotionally motivated
tasks, the role of the adrenergic system in modulating memory for tasks in which learning
occurs under conditions of low arousal remains poorly understood. In the present study we
investigated the effects of EPI on consolidation of memory for a novel object recognition
(NOR) task. NOR training relies on a rodent’s spontaneous tendency to explore a novel object
more than a familiar one. During training for this task, rats or mice are presented with two
identical or different novel objects, which they explore for some time. When animals are
presented at a retention test trial carried out after training with two different objects, one of
which was presented previously during training (“familiar”), and the other of which is novel,
15
animals that remember the familiar object will spend more time exploring the novel one
(Ennaceur & Delacour, 1988; Steckler, Drinkenburg, Sahgal, & Aggleton, 1998). Since no
explicit rewarding or aversive stimulation is used during training, NOR is considered to be a
poorly motivated task involving low levels of arousal when compared to aversively-motivated
tasks. Two recent studies evaluating the role of adrenal stress hormones on consolidation of
NOR have indicated that corticosterone influences memory for NOR only when an
experimental condition in which the level of experimental arousal associated with training
was higher (Okuda, Roozendaal, & McGaugh, 2004; Rozendaal, Okuda, Van der Zee, &
McGaugh, 2006). However, previous studies have not evaluated whether consolidation of
memory for NOR can be affected by peripheral EPI. To address this issue, EPI was
administered systemically immediately after NOR training to rats that were exposed to two
identical objects during training and given retention test trials at different posttraining delays.
A second experiment examined the effects of posttraining administration of EPI on memory
for NOR training in rats exposed to two different objects during training (an experimental
condition in which control rats showed no significant retention 1 day after training). To
examine whether the effects of EPI depend upon β-adrenoceptors, a third experiment
evaluated the effect of pretraining administration of propranolol on EPI-induced enhancement
of consolidation.
2. Materials and methods
2.1 Subjects
Adult male Wistar rats (age: 60 days at the time of arrival) were used as experimental
subjects. Animals were housed five to a cage with food and water available ad libitum, and
were maintained on a 12-h light/dark cycle (lights on at 7:00 h). All behavioral procedures
16
were conducted between 9:00 and 16:00 h. All experimental procedures were performed in
accordance with the NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication
No. 80-23 revised 1996), and were approved by the Ethics Committee of the Pontifical
Catholic University.
2.2 Drug administration
In Experiments I and II, animals received an intraperitoneal (i.p.) injection of either
saline solution (SAL, NaCl 0,9%) or epinephrine (EPI, 2.5; 25 or 250 µg/kg) immediately
after NOR training. In Experiment III, an i.p. injection of propranolol (2 mg/kg, PROP) was
given 15 minutes prior NOR training, followed by an i.p. injection of SAL or EPI (25 µg/kg)
immediately after training. Drugs were purchased from Sigma-Aldrich, São Paulo, Brazil, and
were dissolved in SAL in a 1.0 ml/kg injection volume. Drug doses were chosen on the basis
of previous studies (Nordby et al., 2006; Roozendaal, de Quervain, Schelling, & McGaugh,
2004; Sternberg, Isaacs, Gold, & McGaugh, 1985).
2.3 Behavioral apparatus and procedures
For NOR training, rats were left to explore two objects in a training box to which they
had been previously familiarized. The apparatus and procedures for the object recognition
task have been described elsewhere (de Lima, Luft, Roesler, & Schröder, 2006; de Lima, et
al., 2005a; de Lima, Polydoro, Laranja, Bonatto, Bromberg, Moreira, Dal-Pizzol, & Schröder,
2005b; Schröder, O'Dell, & Marshall, 2003). Briefly, the task took place in a 40 cm x 50 cm
open field surrounded by 50 cm high walls, made of plywood with a frontal glass wall, with a
floor covered with sawdust. All animals were given a habituation session where they were left
17
to freely explore the open field for 2 minutes. No objects were placed in the box during the
habituation trial. All objects used in training and testing trials presented similar textures,
colors, and sizes, but distinctive shapes. Between trials the objects were washed with 10%
ethanol solution. Exploration was defined as sniffing or touching the object with the nose
and/or forepaws. NOR procedures were conducted in a dimly lit room in order to minimize
the influence of contextual information.
2.3.1. Experiment I
Twenty-four hours after habituation, training was conducted by placing individual rats
for 2 minutes into the field, in which two identical objects (objects A1 and A2; Duplo Lego
toys) were positioned in two adjacent corners, 10 cm from the walls. In a short-term retention
test given 1.5 hours after training, the rats explored the open field for 2
minutes in the
presence of one familiar (A) and one novel (B) object. In a long-term retention test given 24
hours after training, rats explored the field for 2 minutes in the presence of familiar (A) and a
novel (C) object. An additional retention test was performed 96 hours after training, where
rats again explored the field for 2 min in the presence of the familiar (A) and a novel (D)
object. The same groups of animals were submitted to NOR testing trials at 1.5, 24, and 96
hours after training.
2.3.2. Experiment II
In Experiment II, we assessed the effects of posttraining administration of EPI in rats
exposed to two different objects during training. In this and the following experiment, training
duration was increased. Twenty-four hours after habituation, training was conducted by
placing individual rats for 5 minutes into the field, in which two distinct
objects (A and B)
were positioned in two adjacent corners, 10 cm from the walls. In a short-term retention test
18
given 1.5 hours after training, the rats explored the open field for 5 minutes in the presence of
one familiar (either A or B) and one novel object. In a long-term retention test given 24 hours
after training, the rats explored the open field for 5 minutes in the presence of one familiar
(either A or B) and one novel object. Short- (1.5 h) and long- (24 h) retention tests were
conducted in two separate groups of rats.
2.3.2. Experiment III
In Experiment III, training and testing trials were conducted as described for Experiment
I except that trial duration was 5 min.
Data for all three experiments were analysed by calculating a recognition index for each
animal, expressed as the ratio T
B
/(T
A
+ T
B
) [T
A
= time spent exploring the familiar object A;
T
B
= time spent exploring the novel object B] (de Lima et al., 2005a; b; 2006; Schröder et al.,
2003).
2.4 Statistical analysis
Data for recognition indexes were expressed as median (interquartile ranges).
Comparisons among groups were performed using a Kruskal-Wallis analysis of variance
followed by Mann-Whitney U-tests when necessary. Total exploration time during object
recognition training is expressed as mean +
SEM, and comparison among groups was done
using an analysis of variance (ANOVA) (de Lima et al., 2005a; b; 2006). In all comparisons,
P < 0.05 was considered to indicate statistical significance.
19
3. Results
3.1. Experiment I
We first examined the effects of posttraining administration of EPI on NOR
consolidation using a training condition in which rats were exposed to two identical objects
for a brief period and tested for retention at several posttraining delays. SAL or EPI was given
immediately after training. There was no significant difference among groups in the total time
spent exploring both objects during training (F(3,31) = 0.54, P = 0.66; overall mean + SEM
time spent exploring both objects (s) was 8.16 + 0.84). Results for exploratory preferences are
shown in Fig. 1. Kruskall-Wallis analysis of variance revealed a significant difference in
exploratory preference among groups in the 96-h retention test trial (df = 3, H = 16.73, P <
0.001), but not in the training (df = 3, H = 4.77, P = 0.19), 1.5-h retention (df = 3, H = 5.83, P
= 0.12), or 24-h retention (df = 3, H = 1.07, P = 0.78) trials. Further analysis using Mann-
Whitney tests showed that rats given EPI at either 25 or 250 µg/kg showed enhanced NOR
retention when tested 96 h posttraining when compared to SAL-treated rats (both Ps < 0.01),
whereas retention of animals given EPI at 2.5 µg/kg was similar to that in the SAL group (P =
0.14). The results indicate that posttraining administration of EPI induced a facilitation of
long-term NOR retention tested at 96 h after training.
3.2. Experiment II
Using two different objects during NOR training might increase the difficulty of the
task, thus preventing control animals from showing significant retention at a 24-h posttraining
delay (Tang, Shimizu, Dube, Rampon, Kerchner, Zhuo, Liu, & Tsien, 1999). We thus
20
assessed the effects of posttraining administration of EPI on 1.5 and 24-h retention of NOR in
rats exposed to two different objects during training. There were no significant differences
among groups in the total time spent exploring both objects during training in animals tested
at 1.5 (F(3,34) = 1.82, P = 0.16; overall mean + SEM time spent exploring both objects (s)
was 15.71 ± 0.75) or 24 h (F(3,36) = 1.12, P = 0.35; overall mean +
SEM time spent
exploring both objects (s) was 14.36 ± 0.83) after training. In rats tested for retention at 1.5 h
posttraining, there was a significant difference among groups in the retention test trial (df = 3,
H = 8.40, P < 0.0001), but not in the training trial (df = 3, H = 5.34, P = 0.15). Mann-Whitney
tests revealed that rats treated with any dose of EPI showed enhanced retention when
compared to the SAL-treated group (all Ps < 0.0001) (Fig. 2A). In rats tested at 24 h after
training, there was a significant difference among groups in the retention test trial (df = 3, H =
7.72, P < 0.0001), but not in the training trial (df = 3, H = 7.07, P = 0.07). Rats treated with
any dose of EPI showed enhanced retention when compared to the SAL-treated group (all Ps
< 0.0001) (Fig. 2B). The results show that, using a training condition in which rats were
exposed to two different objects, animals treated with EPI, but not SAL-treated rats, showed
significant NOR retention tested at 1.5 or 24 h after training, thus indicating that posttraining
administration of EPI facilitated both formation of short-term memory and consolidation of
long-term memory for NOR.
3.3. Experiment III
We next verified whether pretraining administration of the β-adrenoceptor antagonist
propranolol would prevent the enhancing effect of posttraining EPI on NOR consolidation.
Results are shown in Fig. 3. There was no significant difference among groups in the total
time spent exploring both objects during training (F(3,42) = 0.87, P = 0.47; overall mean +
21
SEM time spent exploring both objects (s) was 27.5 ± 2.1). Kruskal-Wallis analysis of
variance revealed significant differences in exploratory preferences among groups in retention
test trials carried out at 1.5 (df = 3, H = 8.41, P < 0.05), 24 (df = 3, H = 27.23, P < 0.0001),
and 96 h (df = 3, H = 21.31, P < 0.0001) after training, but not in the training trial (df = 3, H =
2.57, P = 0.46). Further analysis revealed that the group given pretraining SAL and
posttraining EPI showed a significant enhancement of 96-h retention when compared to the
control group given pretraining SAL and posttraining SAL (P < 0.0001). Pretraining
administration of PROP induced a significant impairment of retention at 24 h after training (P
< 0.0001) but did not affect retention at the 1.5 and 96 h posttraining delays (Ps = 0.31 and
0.81 respectively). Importantly, pretraining administration of PROP prevented the EPI-
induced enhancement of 96-h retention. There was no significant difference in the 96-h
retention test performance between the control group given SAL both before and after
training and the group treated with pretraining PROP and posttraining EPI (P = 0.39). The
group given pretraining PROP and posttraining EPI showed a significantly impaired retention
at both 1.5 (P < 0.05) and 24 h (P < 0.01) after training. The main finding of this experiment
was that pretraining administration of PROP prevented the enhancing effect of EPI on NOR
memory tested 96 h posttraining.
4. Discussion
The main findings of the present study can be summarized as follows: (1) rats treated
with a posttraining systemic injection of EPI showed enhanced retention of memory of a NOR
task 96 h after training when compared to control animals; (2) when rats were trained under a
condition in which the difficulty of the task was increased (i.e., using two different objects
during training), rats treated with a posttraining injection of EPI showed enhanced retention at
22
1.5 and 24 h after training in comparison to the control group; and (3) pretraining systemic
administration of the β-adrenoceptor antagonist PROP prevented the EPI-induced
enhancement of NOR retention. Together, these findings suggest that the adrenergic system
modulates consolidation of recognition memory through a mechanism dependent on β-
adrenoceptors. In addition, pretraining administration of PROP produced an impairment of
retention tested 24 h posttraining, and rats given pretraining PROP followed by posttraining
EPI showed a mild, yet significant, impairment of 1.5- 24-h retention. The impairing effect
observed 1.5 h after training in rats treated with both PROP and EPI might be related to an
effect of PROP and/or EPI on performance or retrieval since animals were tested around 1.5 h
after drug injections.
Since Gold & van Buskirk (1975) provided the first finding that posttraining
administration of EPI enhanced memory retention, extensive evidence has supported the view
that peripheral release of EPI regulates consolidation of memory for emotionally-motivated
tasks. Thus, it has long been known that systemic administration of EPI to rats modulates
consolidation of memory for arousing tasks, and the modulatory effects of EPI are blocked by
propranolol (Gold & van Buskirk, 1975; Izquierdo & Dias, 1983; Sternberg et al., 1985).
Proposed mechanisms mediating the enhancing effects of EPI on consolidation include
release of hepatic glucose and activation of β-adrenoceptors on vagal afferents, which
ultimately would lead to noradrenergic activation in brain areas including the basolateral
amygdala (for reviews, see McGaugh & Roozendaal, 2002; McGaugh et al., 1996).
The role of the adrenergic system in modulating tasks involving lower levels of
emotional arousal is less clear. In the NOR task, two recent studies indicated that memory
consolidation is regulated by corticosterone (which, like EPI, is an adrenal stress hormone
regulating memory consolidation in rats) through a mechanism dependent on noradrenergic
activation only under a condition (i.e., when rats were not habituated to the experimental
23
context) in which training stimulated novelty-induced emotional arousal (Okuda et al., 2004;
Roozendaal et al., 2006). The present findings indicate that, in animals given a single session
of habituation to the training context, after training EPI facilitated memory consolidation for
the NOR task so that memory retention measured either at 24 (Experiment II) or 96 h
(Experiment I) after training was increased in comparison to control animals. The use of a
longer posttraining delay (i.e., 96 h) to measure retention in Experiment I, as well as the use
of two different objects during training in Experiment II, enabled us to reveal the memory-
enhancing effect of EPI under conditions in which control animals did not show high
retention scores. These findings indicate that, as with tasks involving strong aversive
stimulation (such as a footshock), peripheral release of EPI might modulate consolidation of
memory for the NOR task through a mechanism dependent on β-adrenoceptors.
Further studies are required to investigate the brain systems and neurochemical
mechanisms mediating the adrenergic modulation of NOR consolidation. NOR is a nonspatial
memory task based on the ability to recognize a familiar object and the natural tendency to
explore a novel one (Ennaceur & Delacour, 1988). Evidence indicates that brain areas
involved in mediating or modulating NOR might include the dorsal hippocampus (Broadbent,
Squire, & Clark, 2004; Clark, Zola, & Squire, 2000; de Lima et al., 2006;) and, at least under
some experimental conditions, the basolateral amygdala (Roozendaal et al., 2006). We and
others have proposed that molecular mechanisms involved in formation of NOR memory
might include N-methyl-
D-aspartate (NMDA) glutamate receptors (Baker & Kim, 2002; de
Lima et al., 2005a; Puma & Bizot, 1998; Rampon, Tang, Goodhouse, Shimizu, Kyin, &
Tsien, 2000; Sargolini, Roullet, Oliverio, & Mele, 2003; Tang et al., 1999). A number of
studies suggest that the noradrenergic system modulation of memory consolidation depends
on NMDA receptors (for a review, see McGaugh & Roozendaal, 2002). Thus, noradrenergic
activation leads to facilitation of NMDA receptor-mediated synaptic plasticity in the
24
amygdala (Huang, Tsai, & Gean, 1994; Wang, Huang, Hsu, Tsai, Huang, & Gean, 1996), the
memory-impairing effects of propranolol can be reversed by glutamate (Lennartz, Helems,
Mook, & Gold, 1996), and NMDA receptor blockade prevents the enhancing effect of
posttraining administration of EPI on memory consolidation (Roesler, Vianna, de Paris, &
Quevedo, 1999). These findings suggest that an interesting possibility worth examining is
whether the adrenergic modulation of NOR consolidation requires NMDA receptors.
In summary, the present study shows that posttraining systemic administration of EPI
in rats can facilitate consolidation of memory for the NOR task through a mechanism
dependent on activation of β-adrenoceptors. To our knowledge, this is the first evidence
suggesting that the adrenergic system, and possibly peripheral release of EPI, modulate
consolidation of object recognition memory.
Acknowledgements
This research was supported by FAPERGS grant 05/2179.8 to N.S.
25
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29
Legends for figures
Fig. 1. Posttraining systemic administration of epinephrine (EPI) enhanced 96-h retention of
memory for novel object recognition (NOR) in rats exposed to two identical objects during
training. Rats received a single intraperitoneal (i.p.) injection of saline (SAL) or EPI (2.5; 25
or 250 µg/kg) immediately after training and were tested for retention at 1.5, 24, and 96 h
after training. EPI administered in doses of 25 or 250 µg/kg significantly enhanced 96-h NOR
memory. **P < 0.01 compared with the SAL control group (N = 8-9 animals per group).
Fig. 2. Posttraining systemic administration of epinephrine (EPI) enhanced short- (1.5 h) and
long-term (24 h) retention of memory for novel object recognition (NOR) in rats exposed to
two different objects during training. Rats received a single intraperitoneal (i.p.) injection of
saline (SAL) or EPI (2.5; 25 or 250 µg/kg) immediately after training and were tested for
retention at 1.5 (A) or 24 h (B) after training. EPI administered at any of the three doses
significantly enhanced 1.5- and 24-h retention of NOR memory. #P < 0.0001 compared with
the SAL control group (N = 9-10 animals per group).
Fig. 3. Pretraining administration of propranolol (PROP) prevents the enhancement of 96-h
retention of novel object recognition (NOR) memory induced by posttraining administration
of epinephrine (EPI). Rats received an intraperitoneal (i.p.) injection of saline (SAL) or PROP
(2 mg/kg) 15 minutes before training and an i.p. injection of SAL or EPI (25 µg/kg)
immediately after training. Two identical objects were used during training. Animals were
tested for retention at 1.5, 24, and 96 h after training. EPI administration significantly
enhanced 96-h retention of NOR memory. Pretraining administration of PROP prevented the
EPI-induced memory enhancement. In addition, pretraining administration of PROP produced
30
a significant impairment of 24-h retention, and rats treated with pretraining PROP and
posttraining EPI showed a significant impairment of both 1,5- and 24-h retention. *P < 0.05,
**P < 0.01, and #P < 0.0001 compared with the control group treated with pretraining and
posttraining injections of SAL (N = 10-11 animals per group).
31
Figure 1
**
**
0
0,25
0,5
0,75
1
SAL 2.5 25 250
EPI (µg/kg)
Recognition index
Training
1.5 h
24 h
96 h
32
Figure 2
#
#
#
B
0
0,25
0,5
0,75
1
SAL 2.5 25 250
EPI (µg/kg)
Recognition index
A
#
#
#
0
0,25
0,5
0,75
1
SAL 2.5 25 250
EPI (µg/kg)
Recognition index
33
Figure 3
*
**
#
#
0
0,25
0,5
0,75
1
SAL-SAL SAL-EPI PROP-SAL PROP-EPI
Recognition index
Training
1.5 h
24 h
96 h
34
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com a realização deste trabalho foi possível constatar que os ratos tratados com
injeção sistêmica pós-treino de adrenalina apresentaram melhora na retenção de memória na
tarefa de reconhecimento do objeto novo 96 horas depois do treino quando comparados com
os animais controles. Além disso, vimos que quando os ratos foram treinados em uma
condição com um maior grau de dificuldade, na qual foram utilizados dois objetos diferentes
durante o treino, os animais tratados com injeção pós-treino de adrenalina apresentaram maior
retenção nos testes realizados 1,5 e 24 horas depois do treino em comparação ao grupo
controle. Constatamos também que a administração sistêmica pré-treino de propranolol, um
antagonista dos receptores β-adrenérgicos, inibiu a melhora na retenção da memória de
reconhecimento do objeto novo induzida por adrenalina. Todas essas informações sugerem
que o sistema adrenérgico modula a consolidação da memória de reconhecimento através de
um mecanismo dependente dos receptores β-adrenérgicos. Ainda, a administração de
propranolol pré-treino provocou um prejuízo no teste de retenção realizado 24 horas depois do
treino e os ratos que receberam injeção pré-treino de propranolol seguida de uma injeção pós-
treino de adrenalina também mostraram um leve, mas significativo, prejuízo na taxa de
retenção quando testados 1,5 e 24 horas depois do treino. Esse efeito observado 1,5 horas
depois do treino nos ratos tratados com propranolol e com adrenalina pode estar relacionado
com o efeito do propranolol e/ou da adrenalina na performance ou evocação, já que os
animais foram testados aproximadamente 1,5 horas depois das injeções.
Desde que Gold & van Buskirk (1975) forneceram o primeiro indício de que a
administração pós-treino de adrenalina melhora a retenção da memória, muitas evidências têm
dado suporte à idéia de que a liberação periférica de adrenalina regula a consolidação da
memória para tarefas motivadas emocionalmente. Assim, é bem estabelecido que a
35
administração sistêmica de adrenalina em ratos modula a consolidação da memória para
tarefas com caráter emocional e que os efeitos modulatórios da adrenalina são bloqueados
pelo propranolol (Gold & van Buskirk, 1975; Izquierdo & Dias, 1983; Sternberg et al., 1985).
Dentre os mecanismos propostos envolvidos na melhora da consolidação induzida pela
adrenalina, se encontram a liberação de glicose hepática e a ativação dos receptores β-
adrenérgicos nas aferências vagais, as quais podem levar a uma ativação noradrenérgica em
áreas do cérebro incluindo a amígdala basolateral (McGaugh & Roozendaal, 2002; McGaugh
et al., 1996). A amígdala, por sua vez, modula a consolidação da memória em outras regiões
cerebrais, como o hipocampo, por exemplo. Portanto, se sugere que a amígdala seja sensível
às mudanças nos níveis periféricos de adrenalina, ou seja, a amígdala pode estar relacionada
com o efeito modulador da adrenalina sobre a memória, de acordo com modelo proposto por
McGaugh, J. L. (2004), o qual pode ser observado na figura 4.
O papel do sistema adrenérgico na modulação de tarefas com baixo nível de
envolvimento emocional ainda não é clara. Na tarefa de memória de reconhecimento do
objeto novo, dois estudos recentes indicaram que a consolidação da memória é regulada por
corticosterona (o qual, assim como a adrenalina é um hormônio adrenal do estresse que regula
a consolidação da memória em ratos) através de um mecanismo dependente da ativação
noradrenérgica somente sob uma condição na qual os ratos não estão habituados ao contexto
experimental, sugerindo que o treino estimulado pela novidade induz uma situação com
caráter emocional (Okuda et al., 2004; Roozendaal et al., 2006). Nossos dados indicam que,
em animais que foram submetidos a uma única sessão de habituação ao contexto do treino,
adrenalina administrada após o treino, facilitou a consolidação da memória para tarefa de
reconhecimento do objeto novo de modo que a retenção da memória medida tanto 24 horas
(Experimento II) quanto 96 horas (Experimento I) após o treino estava aumentada em
comparação aos animais controles.
O uso de um intervalo pós-treino mais longo (por
36
exemplo, 96 horas) para medir a retenção no Experimento I, assim como o uso de dois objetos
diferentes durante a sessão de treino no Experimento II, nos permitiu revelar o aumento da
memória causado pela adrenalina sob condições nas quais os animais controles não
mostraram altas taxas de retenção. Esses achados indicam que, assim como nas tarefas
envolvendo estimulação aversiva, como a esquiva inibitória, por exemplo, a liberação
periférica de adrenalina pode modular a consolidação da memória para tarefa de
reconhecimento do objeto novo através de um mecanismo dependente de receptores β-
adrenérgicos.
Figura 4. Esquema representativo da modulação da memória através do complexo basolateral
da amígdala. Através da ilustração podemos ver a liberação de noradrenalina (NA) dentro da
amídala é crítica para as influências da modulação da memória. A adrenalina liberada pela
medula adrenal ativa receptores no nervo vago ascendente que projeta ao núcleo do trato
solitário (NTS), o qual envia projeções noradrenérgicas à amídala assim como o locus
coeruleus (LC). Peptídeos opióides (OP) e o ácido gama-amino-butírico (GABA) inibem a
liberação de NA. Corticosterona liberada no córtex adrenal ativa receptores de
glicocorticóides no NTS, no complexo basolateral da amídala (BLA) e em outros lugares no
cérebro. No BLA, a corticosterona interage com a ativação β-adrenérgica. A ativação
glutamatérgica e colinérgica no núcleo basal (NB) ocorre na etapa posterior da ativação
noradrenérgica. Ativação de receptores de histamina regula liberação de acetilcolina (ACh).
Estas influências modulatórias convergem em projeções da amídala e na ativação de outras
regiões do cérebro envolvidas na consolidação de memória. McGaugh, J. L. (2004). The
amygdala modulates the consolidation of memories of emotionally arousing experiences.
Annual Review of Neuroscience, 27, 1-28.
Modulação da
consolidação
da memória em
outras regiões
do cére
bro
.
Glicocorticóides
Adrenalina
Glutamato
Histamina
37
Estudos posteriores são necessários para investigar os sistemas cerebrais e os
mecanismos neuroquímicos envolvidos na modulação adrenérgica da consolidação da tarefa
de reconhecimento do objeto novo. Esta é uma tarefa de memória não espacial baseada na
habilidade de reconhecer um objeto familiar e na tendência natural de explorar um objeto
novo (Ennaceur & Delacour, 1988). Evidências indicam que áreas do cérebro envolvidas na
modulação da memória de reconhecimento do objeto novo podem incluir o hipocampo dorsal
(Broadbent, Squire, & Clark, 2004; Clark, Zola, & Squire, 2000; de Lima et al., 2006;) e, pelo
menos sob algumas condições experimentais, a amígdala basolateral (Roozendaal et al.,
2006). Tem sido proposto que mecanismos moleculares envolvidos na formação da memória
de reconhecimento do objeto novo podem incluir receptores de glutamato N-metil-D-
aspartato (NMDA) (Baker & Kim, 2002; de Lima et al., 2005a; Puma & Bizot, 1998;
Rampon, Tang, Goodhouse, Shimizu, Kyin, & Tsien, 2000; Sargolini, Roullet, Oliverio, &
Mele, 2003; Tang et al., 1999). Alguns estudos sugerem que a modulação da consolidação da
memória pelo sistema noradrenérgico depende dos receptores NMDA (McGaugh &
Roozendaal, 2002). Assim, a ativação noradrenérgica causa uma facilitação da plasticidade
sináptica mediada pelos receptors NMDA na amígdala (Huang, Tsai, & Gean, 1994; Wang,
Huang, Hsu, Tsai, Huang, & Gean, 1996), os efeitos prejudiciais do propranolol na memória
podem ser revertidos por glutamato (Lennartz, Helems, Mook, & Gold, 1996), e o bloqueio
dos receptores NMDA impede a melhora na consolidação da memória causada pela
administração de adrenalina pós-treino (Roesler, Vianna, de Paris & Quevedo, 1999). Todas
essas informações sugerem a importância de se examinar se a modulação adrenérgica da
consolidação da memória de reconhecimento necessita de receptores NMDA.
Em suma, este estudo mostra que a administração sistêmica de adrenalina pós-treino
em ratos pode facilitar a consolidação da memória para a tarefa de reconhecimento do objeto
novo através de um mecanismo dependente da ativação de receptores β-adrenérgicos. Essa é a
38
primeira evidência sugerindo que o sistema adrenérgico, e possivelmente a liberação
periférica de adrenalina, modula a consolidação da memória de reconhecimento do objeto.
A conclusão deste trabalho nos permite sugerir outros estudos como, por exemplo, a
análise dos efeitos da adrenalina sobre a memória de reconhecimento do objeto novo, quando
administrada após outros intervalos de tempo, e não imediatamente após a sessão de treino,
como realizado no presente trabalho. Podem ainda ser analisados os efeitos de injeções intra-
cerebrais tanto de adrenalina quanto de propranolol em regiões comprovadamente envolvidas
com a consolidação deste tipo de memória, como o hipocampo a amígdala, utilizando nosso
protocolo da tarefa de reconhecimento do objeto novo no qual os ratos são habituados ao
contexto.
39
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42
7. ANEXOS
From: "NLM (ELS)" <nlm@elsevier.com>
To: <
nadja_s@terra.com.br>
Sent: Monday, December 18, 2006 2:45 PM
Subject: Neurobiology of Learning and Memory Submission: Manuscript Number
Assigned
> Ms. No.: NLM-06-176
> Title: Adrenergic enhancement of consolidation of object recognition
> memory
> Corresponding Author: Dr. Nadja Schroder
> Authors: Arethuza Dornelles; Maria Noemia M de Lima; Manoela Grazziotin;
> Juliana Presti-Torres; Vanessa A Garcia; Felipe S Scalco; Rafael Roesler;
>
> Dear Dr. Schroder,
>
> Your submission, referenced above, has been assigned the following
> manuscript number: NLM-06-176
>
> Thank you for submitting your work to Neurobiology of Learning and
Memory.
>
> Kind regards,
>
> Susan Ikeda
> Journal Manager, Neurobiology of Learning and Memory
> Email: nlm@elsevier.com
43
XXII CONGRESO LATINOAMERICANO Y 1RO IBEROAMERICANO DE
CIENCIAS FISIOLÓGICAS. BUENOS AIRES, 4 AL 7 DE NOVIEMBRE DE 2006
ENVIO DE RESUMENES
Utilizar el recuadro que se adjunta (11 x 17 cms), sin exceder los límites del mismo.
Emplear letra Time New Roman 12 para el título, autores y lugar de trabajo. Para el
cuerpo del resumen usar Time New Roman 11 siguiendo el modelo que se muestra
(borrar el texto e incluír el propio). Enviar por mail
antes del 30 de agosto de 2006 a
safisiol@safisiol.org.ar . Solo se acepta un resumen por participante inscripto (subrayar
su nombre). Utilizar castellano, portugués o inglés.
Adrenaline modulates object recognition memory
Nadja Schroder, Arethuza Dornelles, Manoela Grazziotin, Maria Noêmia Matins de Lima,
Rafael Roesler, Lab. Biologia e Desenvolvimento do Sistema Nervoso, Programa de Pós-
graduação em Biologia Celular e Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia
Universidade Católica do Rio Garnde do Sul, Brasil.
Extensive findings from animal experiments indicate that stress hormones modulate memory storage
of emotionally arousing information. Over the last decades a number of studies using aversively
motivated learning tasks indicated that posttraining administration of adrenaline modulates memory
consolidation. However, little is known about adrenaline influences on memory tasks that do not
involve aversive/emotional content. Thus, the aim of the present study was to evaluate the effects of
the acute adrenaline on a nonaversive memory test: the novel object recognition task (NOR). In order
to do that, adult male Wistar rats received intraperitoneal injections of saline (control group) or
epinephrine (2,5; 25,0 and 250,0 µg/kg) immediately after the NOR training session.
The behavioral
task consisted of a training session, where rats explored two identical copies of the same object for 2
minutes (Experiment I) or 2 distinct objects for 5 minutes (Experiments II) in an open field box. In
retention tests, one of the familiar objects was replaced by a novel object. A recognition index
calculated for each animal was expressed by the ratio T
N
/T
F
+T
N
(T
F
= time spent exploring the familiar
object; T
N
= time spent exploring the novel object). Results have indicated that adrenaline facilitated
recognition memory, as assessed by comparison of recognition indexes among groups. These findings
provide evidence that, as found with emotionally arousing tasks, recognition memory consolidation
requires posttraining adrenergic activity.
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