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ANATOMIA E MORFOGÊNESE
ANATOMIA E MORFOGÊNESE ANATOMIA E MORFOGÊNESE
ANATOMIA E MORFOGÊNESE
IN VITRO
IN VITROIN VITRO
IN VITRO
DE
DE DE
DE
Cymbidium
Cymbidium Cymbidium
Cymbidium
‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ ‘Joy Polis’
‘Joy Polis’
(Orchidaceae)
(Orchidaceae)(Orchidaceae)
(Orchidaceae)
CURITIBA
CURITIBACURITIBA
CURITIBA
2006
20062006
2006
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ANATOMIA E MORFOGÊNESE
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ANATOMIA E MORFOGÊNESE
IN VITRO
IN VITROIN VITRO
IN VITRO
DE
DE DE
DE
Cy
CyCy
Cymbidium
mbidium mbidium
mbidium
‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ ‘Joy Polis’
‘Joy Polis’
(Orchidaceae)
(Orchidaceae)(Orchidaceae)
(Orchidaceae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Agronomia - Produção Vegetal,
Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo,
Setor de Ciências Agrárias, Universidade Federal
do Paraná, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Marguerite G. G. Quoirin
Co-orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Luciana L. F. Ribas
Co-orientador: Prof. Dr. Henrique S. Koehler
Co-orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Cleusa Bona
CURITIBA
CURITIBACURITIBA
CURITIBA
2006
20062006
2006
DEDICO ESTE TRABALHO AOS MEUS
DEDICO ESTE TRABALHO AOS MEUS DEDICO ESTE TRABALHO AOS MEUS
DEDICO ESTE TRABALHO AOS MEUS
DOIS GRANDES AMORES MARCELO E
DOIS GRANDES AMORES MARCELO E DOIS GRANDES AMORES MARCELO E
DOIS GRANDES AMORES MARCELO E
ISABELA
ISABELAISABELA
ISABELA
i
"Grandes realizações são possíveis
"Grandes realizações são possíveis "Grandes realizações são possíveis
"Grandes realizações são possíveis
quando se dá atenção aos pequenos
quando se dá atenção aos pequenos quando se dá atenção aos pequenos
quando se dá atenção aos pequenos
começos."
começos."começos."
começos."
(Lao Tse)
ii
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia – Produção Vegetal,
Universidade Federal do Paraná, pela oportunidade.
A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos durante o período do curso.
À Profa. Dra. Marguerite Quoirin, por ter me aceitado como orientada, e que
mesmo em viagem de estudos, manteve o incentivo e principalmente a confiança.
À Profa. Dra. Luciana Lopes Fortes Ribas, pela co-orientação no decorrer dos
experimentos desta dissertação, além da amizade e incentivo.
À Profa. Dra. Cleusa Bona, pela orientação nas análises anatômicas, por
possibilitar a realização de trabalhos à parte da dissertação e por todos os anos,
desde o início da graduação, de amizade e incentivo.
Ao Prof. Dr. Henrique Koehler, pela orientação estatística.
Ao Laboratório de Micropropagação do Departamento de Botânica,
Universidade Federal do Paraná, por possibilitar esse estudo.
Ao Laboratório de Botânica Estrutural do Departamento de Botânica,
Universidade Federal do Paraná, em especial ao Biólogo Nilson Belém Filho, técnico
do laboratório, pela amizade e pelos inúmeros auxílios na realização deste e de
outros trabalhos.
Ao Biólogo Rogério Duílio Genari, por gentilmente ceder o material vegetal
indispensável para a realização deste trabalho.
Às colegas de mestrado Marília P. Machado, Ana Cristina Atala Alves, Áurea
P. Ferriani, Michele F. Bortolini e Juliany de Bitencourt, pela amizade, pelas longas
conversas e pelos trabalhos realizados em conjunto.
À Engenheira Agrônoma Ana Carolina Theodoro de Carvalho Leitão, pelo
importante auxilio durante a realização desse trabalho.
À minha família pelo incentivo e carinho.
E agradeço principalmente às duas pessoas que são o motivo e a inspiração
para a realização desse trabalho, pois sem eles não haveria razão de ser. Ao meu
marido, Marcelo Alexandre Mayer, por toda a ajuda e por sempre me incentivar a ir
mais longe. E à minha filha Isabela Sampaio Mayer, sempre tão paciente e
compreensiva apesar de tão novinha...
iii
SUMÁRIO
SUMÁRIOSUMÁRIO
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS ..........................................................................................
vi
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS .........................................................................................
x
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURASLISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURAS ..............................................................................
xi
RE
RERE
RESUMO
SUMO SUMO
SUMO ...........................................................................................................
xii
ABSTRACT
ABSTRACT ABSTRACT
ABSTRACT
.......................................................................................................
xiii
1 INTRODUÇÃO GERAL
1 INTRODUÇÃO GERAL1 INTRODUÇÃO GERAL
1 INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................
1
1.1 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................
5
2 CAPÍTULO I
2 CAPÍTULO I 2 CAPÍTULO I
2 CAPÍTULO I -
--
- Efeito da BAP na formação e na morfo
Efeito da BAP na formação e na morfo Efeito da BAP na formação e na morfo
Efeito da BAP na formação e na morfo-
--
-
anatomia de
anatomia de anatomia de
anatomia de
protocormóides (PLBs) de
protocormóides (PLBs) de protocormóides (PLBs) de
protocormóides (PLBs) de
Cymbidium
Cymbidium Cymbidium
Cymbidium
‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ ‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ .............................................
8
RESUMO
RESUMO RESUMO
RESUMO ...........................................................................................................
9
ABSTRACT
ABSTRACT ABSTRACT
ABSTRACT .......................................................................................................
10
2.1 INTRODUÇÃO.............................................................................................
11
2.2 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................
13
2.2.1 Condições de cultura
in vitro
.....................................................................
13
2.2.2 Origem do material vegetal.......................................................................
13
2.2.3 Regeneração de PLBs..............................................................................
14
2.2.4 Análise anatômica.....................................................................................
16
2.2.5 Análise estatística......................................................................................
17
2.3 RESULTADOS.............................................................................................
18
2.4 DISCUSSÃO................................................................................................
25
2.5 CONCLUSÃO...............................................................................................
28
2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................
29
3 CAPÍTULO II
3 CAPÍTULO II 3 CAPÍTULO II
3 CAPÍTULO II -
--
-
Efeito de ANA e BAP na regeneração e na morfo
Efeito de ANA e BAP na regeneração e na morfoEfeito de ANA e BAP na regeneração e na morfo
Efeito de ANA e BAP na regeneração e na morfo-
--
-
anatomia
anatomia anatomia
anatomia
de
de de
de
Cymbidium
CymbidiumCymbidium
Cymbidium
‘Joy Polis’
‘Joy Polis’‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ a partir de discos de PLBs
a partir de discos de PLBs a partir de discos de PLBs
a partir de discos de PLBs ........................................
32
RESUMO ..
RESUMO ..RESUMO ..
RESUMO ...........................................................................................................
33
ABSTRACT ..
ABSTRACT ..ABSTRACT ..
ABSTRACT .......................................................................................................
34
3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................
35
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................
37
3.2.1 Condições de cultura
in vitro
....................................................................
37
3.2.2 Origem do material vegetal ......................................................................
37
3.2.3 Regeneração de PLBs .............................................................................
38
3.2.4 Análise anatômica ....................................................................................
38
3.2.5 Análise estatística......................................................................................
39
3.3 RESULTADOS ............................................................................................
40
3.4 DISCUSSÃO ...............................................................................................
51
3.5 CONCLUSÃO ..............................................................................................
54
3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................
55
iv
4 CAPÍTULO III
4 CAPÍTULO III 4 CAPÍTULO III
4 CAPÍTULO III -
--
-
Multiplicação
Multiplicação Multiplicação
Multiplicação
in vitro
in vitroin vitro
in vitro
de brotações de
de brotações de de brotações de
de brotações de
Cymbidium
CymbidiumCymbidium
Cymbidium
‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ ‘Joy Polis’
‘Joy Polis’
(Orchidaceae)
(Orchidaceae) (Orchidaceae)
(Orchidaceae) ....................................................................................................
57
RESUMO
RESUMO RESUMO
RESUMO ...........................................................................................................
58
ABSTRACT .
ABSTRACT .ABSTRACT .
ABSTRACT .......................................................................................................
59
4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................
60
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................
61
4.3 RESULTADOS e DISCUSSÃO ...................................................................
62
4.4 CONCLUSÃO ..............................................................................................
65
4.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................
66
5 CAPÍTULO IV
5 CAPÍTULO IV 5 CAPÍTULO IV
5 CAPÍTULO IV -
--
-
Aclimatização em diferentes substratos e morfo
Aclimatização em diferentes substratos e morfoAclimatização em diferentes substratos e morfo
Aclimatização em diferentes substratos e morfo-
--
-
anatomia
anatomia anatomia
anatomia
de mudas micropropagadas de
de mudas micropropagadas de de mudas micropropagadas de
de mudas micropropagadas de
Cymbidium
Cymbidium Cymbidium
Cymbidium
‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ ‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ .....................................
68
RESUMO
RESUMO RESUMO
RESUMO ...........................................................................................................
69
ABSTRACT
ABSTRACT ABSTRACT
ABSTRACT .......................................................................................................
70
5.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................
71
5.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................
73
5.2.1 Material .....................................................................................................
73
5.2.2 Substratos ................................................................................................
73
5.2.3 Análise anatômica ....................................................................................
75
5.3 RESULTADOS ............................................................................................
77
5.3.1 Análise quantitativa das mudas ................................................................
77
5.3.2 Resultados da análise anatômica .............................................................
82
5.4 DISCUSSÃO ...............................................................................................
90
5.5 CONCLUSÃO ..............................................................................................
94
5.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................
95
CONSIDERAÇÕES FINAIS
CONSIDERAÇÕES FINAIS CONSIDERAÇÕES FINAIS
CONSIDERAÇÕES FINAIS ..............................................................................
99
ANEXO
ANEXOANEXO
ANEXO............................................................................................................... 101
v
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURASLISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
CAPÍTULO ICAPÍTULO I
CAPÍTULO I
FIGURA
1.1
-
Cymbidium ‘
Joy Polis’. A. Planta matriz com flores; B. Planta matriz com
brotação lateral; C. Brotação lateral; D. Brotação lateral com a gema
exposta (seta). A. Barra = 3 cm; B. Barra = 1 cm; C. Barra = 2 cm; D.
Barra = 0,5 cm...........................................................................................15
FIGURA
1.2
-
Cymbidium
‘Joy Polis’. A. PLBs originados da região meristemática da
gema após 60 dias no meio de cultura MS; B. Brotação com uma escala
(vertical) indicando como foi realizada a medição da altura.
Barra = 1 cm..............................................................................................16
FIGURA
1.3
-
Número de PLBs regenerados por disco de PLB de
Cymbidium
‘Joy Polis’
em meio de cultura MS em função da concentração de BAP após 90
dias............................................................................................................19
FIGURA
1.4
-
Brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’, obtidas a partir de discos de PLBs
cultivados em meio de cultura MS acrescido ou não de BAP, após 90
dias. T1. sem BAP; T2. 5 µM de BAP; T3. 10 µM de BAP.; T4. 20 µM de
BAP; T5. 40 µM de BAP. Barra = 1 cm.....................................................20
FIGURA
1.5
-
Discos de PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A-D. Em meio de cultura sem
fitorregulador; E-H. Em meio de cultura adicionado de 10 µM de BAP; I-M.
Em meio de cultura adicionado de 20 µM de BAP. A, E e I. 21 dias de
cultura; B, F e J. 30 dias de cultura; C, G e L. 45 dias de cultura; D, H e M.
60 dias de cultura; seta = PLBs laterais. Barra = 0,5 cm..........................21
FIGURA
1.6
-
FIGURA 1.6 - PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A. PLBs em vista geral
(MEV); B. detalhe de um estômato na superfície do PLB (MEV); C.
Secção transversal do PLB no dia zero; D. Secção longitudinal do PLB no
dia zero, observar o meristema apical envolvido pelo coleóptile; E-H.
PLBs cultivados em meio de cultura sem a adição de BAP; E. Secção do
PLB aos nove dias de cultura; F. Secção do PLB aos 12 dias de cultura,
observar a origem de ápices meristemáticos; G. Secção do PLB aos 21
dias de cultura, observar dois ápices meristemáticos (setas); H. Secção
do PLB aos 30 dias de cultura, verificar o inicio do estrangulamento na
base do novo PLB formado (seta). co = coleóptile. cp = cordão
procambial. cv = conexão vascular. mac = meristema apical caulinar.
Barra A= 500 µm. Barra B= 10 µm. Barra C-H= 400 µm..........................22
FIGURA
1.7
-
Secções de PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A-D. cultivados em meio de
cultura adicionado de 10 µM de BAP. E-I cultivados em meio de cultura
adicionado de 20 µM de BAP. A,E Secção do PLB aos nove dias de
cultura; B,F. Secção do PLB aos 12 dias de cultura; C,G. Secção do PLB
aos 21 dias de cultura; D,H-I. Secção do PLB aos 30 dias de cultura,
observar um PLB lateral (seta). I. Detalhe da camada de abscisão
(seta).co = coleóptile. cp = cordão procambial Barra A, E, F e I= 200 µm.
Barra B-D, G e H = 400 µm.......................................................................24
CAPÍTULO II
CAPÍTULO IICAPÍTULO II
CAPÍTULO II
FIGURA
2.1
-
Número de PLBs regenerados por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após
90 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de
40µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem
estatisticamente para as concentrações de ANA e as letras maiúsculas
para as concentrações de BAP ao nível de 95%......................................40
vi
FIGURA
2.2
-
Altura das plantas regeneradas por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após
90 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de
40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra minúscula não
diferem estatisticamente para as concentrações de ANA e as letras
maiúsculas para as concentrações de BAP ao nível de 95%...................41
FIGURA
2.3
-
Porcentagem de explantes necróticos de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em meio
de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após 90
dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de
40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade...................42
FIGURA
2.4
-
Plantas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ obtidas a partir de discos de PLBs
cultivados em meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou
combinado ao BAP sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de
40 µmol.m
-2
.s
-1
) após 90 dias. Seta = raiz.
Barra = 1 cm..........................43
FIGURA
2.5
-
Número de PLBs regenerados por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após
30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e
irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra
minúscula não diferem estatisticamente para as concentrações de ANA e
as letras maiúsculas para as concentrações de BAP ao nível de 95%....44
FIGURA
2.6
-
Número de plantas regeneradas por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após
30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e
irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra
minúscula não diferem estatisticamente para as concentrações de ANA e
as letras maiúsculas para as concentrações de BAP ao nível de 95%....44
FIGURA
2.7
-
Altura das plantas regenerados por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após
30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e
irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra
minúscula não diferem estatisticamente para as concentrações de ANA e
as letras maiúsculas para as concentrações de BAP ao nível de 95%....45
FIGURA
2.8
-
Porcentagem de explantes necróticos de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em meio
de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após 30
dias no escuro e 60 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e
irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra não
diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade......46
FIGURA
2.9
-
Plantas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ obtidas a partir de discos de PLBs
cultivados em meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou
combinado ao BAP 30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação
(fotoperiodo 16 horas e irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Seta = raiz.
Barra = 1 cm..............................................................................................47
FIGURA
2.10
-
Discos de PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A-H. Discos de PLBs
cultivados em meio de cultura adicionado de 0,5 µM de ANA combinado a
0,5 µM de BAP; A-D cultivados sob iluminação; E-F. cultivados no escuro;
G. sob iluminação a 15 dias; H. sob iluminação a 30 dias A. e E. 21 dias
de cultura; B. e F. 30 dias de cultura; C. e G. 45 dias de cultura; D. e H. 60
dias de cultura. r = raiz. Seta = coleóptile. Barra = 0,5 cm........................48
vii
FIGURA
2.11
-
Secções de PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’ cultivados em meio de cultura
adicionado de 0,5 µM de ANA combinado a 0,5 µM de BAP. A-E.
mantidas sob iluminação. F-I. mantidas no escuro. A-B,F. aos nove dias
de cultura; C,G. aos 12 dias de cultura; D,H. aos 21 dias de cultura,
observar o inicio do estrangulamento na base do novo PLB formado
(seta); E-I. aos 30 dias de cultura. co = coleóptile. cp = cordão procambial.
Barra A, C, F e G= 200 µm. Barra B, D-E, I e H= 400 µm...
....................
50
CAPÍTULO III
CAPÍTULO IIICAPÍTULO III
CAPÍTULO III
FIGURA
3.1
-
A-B. Brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em meio de cultura MS sob
diferentes concentrações de BAP combinado com AIB. T1. sem BAP; T2.
2,5 µM de BAP; T3. 5 µM de BAP; T4. 10 µM de BAP; T5. 2,5 µM de BAP
e 0,5 µM de AIB; T6. 5 µM de BAP e 0,5 µM de AIB; T7. 10 µM de BAP e
0,5 µM de AIB. Barra = 2,0 cm..................................................................64
FIGURA
3.2
-
A-B. Enraizamento de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em meio de cultura MS
acrescido de carvão ativado, após 30 dias. Barra =
2,0 cm........................................................................................................65
CAPÍTULO IV
CAPÍTULO IVCAPÍTULO IV
CAPÍTULO IV
FIGURA
4.1
-
Diferentes substratos utilizados para a aclimatização de mudas
micropropagadas de
Cymbidium
‘Joy Polis’. Barra: 4 cm.........................74
FIGURA
4.2
-
Porcentagem de ganho na massa fresca de mudas de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ em diferentes substratos após 45 dias. Médias seguidas pela
mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.............................................................................................78
FIGURA
4.3
-
Número médio de raízes de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
diferentes substratos após 45 dias. Médias seguidas pela mesma letra
não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.............................................................................................79
FIGURA
4.4
-
Comprimento das 3 maiores raízes de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’
em diferentes substratos após 45 dias. Médias seguidas pela mesma letra
não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.............................................................................................80
FIGURA
4.5
-
Detalhe das mudas micropropagadas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ após 45
dias da aclimatização nos diferentes substratos. Barra = 3 cm................81
FIGURA
4.6
-
Vista geral de um segmento da raiz de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
diferentes ambientes de cultivo. A. Planta cultivada no ambiente
ex vitro,
B.
Planta cultivada no ambiente
in vitro
, C. Planta aclimatizada. Barra A-
C: 500 µm..................................................................................................83
FIGURA
4.7
-
Secções longitudinais do ápice de raiz de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A. Planta
cultivada no ambiente
ex vitro,
B.
Planta cultivada no ambiente
in vitro
, C.
Planta aclimatizada. co = coifa. mf = meristema fundamental. pc =
procâmbio. pm = promeristema. pt = protoderme. seta = idioblastos com
ráfides. Barra: 100 µm. .............................................................................84
FIGURA
4.8
-
Secções transversais da raiz de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A e B. Planta
cultivada no ambiente
ex vitro,
C e D.
Planta cultivada no ambiente
in
vitro
, E e F. Planta aclimatizada. c = córtex. cv = cilindro vascular. ex =
exoderme. en = endoderme. fl = floema. m = medula. x = xilema. v =
velame. Barra A, C e E: 300 µm. Barra B, D e F: 200 µm.........................85
FIGURA
4.9
-
Vista frontal da epiderme abaxial de folhas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
diferentes ambientes de cultivo. A. e B. planta cultivada no ambiente
ex
vitro,
C.e D.
planta cultivada no ambiente
in vitro
, E. e F. planta
aclimatizada. Barra A, C e E: 2500 µm. Barra B, D e F: 50 µm................88
viii
FIGURA
4.10
-
Secções transversais da nervura e do limbo de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A e
B. Planta cultivada no ambiente
ex vitro,
C e D.
Planta cultivada no
ambiente
in vitro
, E e F. Planta aclimatizada. B, D e F. Observar detalhe
da epiderme de ambas as faces. fi = fibras. ra = idioblatos com ráfides
Barra: 200 µm. Barra detalhe da epiderme: 25 µm...................................89
ix
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELASLISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
CAPÍTULO ICAPÍTULO I
CAPÍTULO I
TABELA
1.1
-
Regeneração de PLBs a partir de discos de PLB de
Cymbidium
‘Joy Polis’
cultivados em meio de cultura MS acrescido ou não de BAP após
90 dias........................................................................................................19
CAPÍTULO III
CAPÍTULO IIICAPÍTULO III
CAPÍTULO III
TABELA
3.1
-
Resultados de multiplicação de brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’
cultivadas em meio de cultura MS sob diferentes concentrações de BAP
combinado com AIB, após 90 dias.............................................................62
CAPÍTULO IV
CAPÍTULO IVCAPÍTULO IV
CAPÍTULO IV
TABELA
4.1
-
Caracterização dos diferentes substratos e misturas pela análise de
rotina...........................................................................................................76
x
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURASLISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURAS
AIB - Ácido indolbutírico
ANA - Ácido naftaleno acético
BAP - 6-benzilaminopurina
FAA - Solução de formol + ácido acético + etanol
KC - Knudson (1946)
MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura
MS - Murashige e Skoog (1962)
PLBs - Protocormóides (“protocorm like body”)
2,4 D - ácido 2,4 diclorofenoxiacético
xi
RESUMO
RESUMORESUMO
RESUMO
Orchidaceae é considerada a maior família de plantas com flores, englobando cerca
de 35 mil espécies, o que corresponde a um sétimo de todas as plantas com flores.
O gênero
Cymbidium
é constituído por um grupo numeroso de espécies e de plantas
híbridas, estas últimas originadas a partir de trabalhos hortícolas de melhoramento
genético. A multiplicação deste gênero possui limitações como baixas taxas de
germinação e alta especificidade nos processos de desenvolvimento. Além disso,
plantas híbridas dificilmente produzem sementes e quando as produzem, estas são
na maioria inférteis. Desse modo, técnicas de propagação
in vitro
que possibilitem e
acelerem a produção de mudas são essenciais para a horticultura. Outra vantagem
da micropropagação é a obtenção de populações homogêneas oriundas de matrizes
melhoradas geneticamente. A micropropagação vem sendo utilizada como método
de propagação clonal em larga escala de plantas comercialmente importantes, como
por exemplo, espécies da família Orchidaceae. O material de estudo foi o híbrido de
Cymbidium
‘Joy Polis’. Este híbrido possui uma inflorescência ereta com flores
numerosas de coloração avermelhada, a qual é muito apreciada comercialmente, e
para tanto, se necessita de mudas de boa qualidade fitossanitária em grande
quantidade. Sendo assim, a multiplicação desse híbrido por meio da
micropropagação possibilitará a produção massal de mudas. O objetivo do presente
trabalho foi estabelecer um protocolo de micropropagação a partir de meristemas
obtidos de gemas axilares, acompanhado de análises morfo-anatômicas. Foram
testadas diferentes concentrações e diferentes fitorreguladores, isolados ou
combinados para aumentar a taxa de multiplicação
in vitro
deste híbrido. Além disso,
foi descrita a morfo-anatomia do desenvolvimento do disco de protocormóide (PLB)
até a formação de novos PLBs e foram estabelecidas as condições adequadas para
a aclimatização de mudas em casa-de-vegetação.
Palavra
PalavraPalavra
Palavra-
--
-chave:
chave: chave:
chave: Orquídea, micropropagação
,
fitorreguladores, morfologia
xii
ABSTRACT
ABSTRACTABSTRACT
ABSTRACT
The Orchidaceae are considered the biggest family of flowering plants, with about
35.000 species, which represent the seventh part of all flowering plants.
Cymbidium
genus is formed by a numerous group of species and hybrids, the last one originated
through genetic improvement. Hybrid plants rarely produce seeds and even when
they produce, they are almost infertile. Thus
in vitro
techniques that accelerate the
plant multiplication are essential for horticulture. Another advantage of
micropropagation is the possibility to obtain homogeneous populations originated
from genetically improved plants. Micropropagation has been used to clone
commercially important species in large scale, for example Orchidaceae species. The
choosen species was
Cymbidium
‘Joy Polis’. This hybrid has an erect inflorescence
with numerous red flowers, that is commercially appreciated, and so, needs a large
number of plants with good sanitary conditions. The multiplication of this hybrid
through micropropagation will thus enable plant mass production. The objective of
this work was to establish a micropropagation protocol using axillary buds. Different
concentrations of two growth regulators (BA and NAA), alone or combined, were
tested in order to improve the
in vitro
multiplication rate of this hybrid. Morphology
and anatomy of transverse sections of protocorm-like body (PLB) forming new PLBs
were described and the adequate conditions of plant acclimatization in green house
were established.
Key words
Key wordsKey words
Key words: Orchid, micropropagation, growth regulator, morphology
xiii
1 INTRODUÇÃO GERAL
1 INTRODUÇÃO GERAL1 INTRODUÇÃO GERAL
1 INTRODUÇÃO GERAL
Orchidaceae é provavelmente a maior família de plantas com flores, sendo
estimadas em cerca de 35 mil espécies distribuídas em aproximadamente 1800
gêneros, correspondendo a um sétimo de todas as plantas com flores. Estão
amplamente distribuídas, porém com maior diversidade nas montanhas tropicais
(DRESSLER, 1993; WATANABE, 2002). Orquídeas são monocotiledôneas,
herbáceas e perenes, podendo ser epífitas, terrestres e rupícolas (BLACK, 1984). O
gênero
Cymbidium
é constituído por um grupo numeroso de espécies e plantas
híbridas originadas a partir de trabalhos de melhoramento genético (LORENZI e
SOUZA, 2001).
As orquídeas produzem um grande número de sementes, cada cápsula pode
conter até 500 mil sementes (WATANABE, 2002). Porém, em condições naturais,
estima-se que somente 5% delas germinam. Isto ocorre em virtude destas sementes
não possuírem endosperma com reservas nutritivas e não possuírem a capacidade
de utilizar diretamente o substrato na natureza, necessitando de associação com
micorrizas (RAO, 1977; BAJAJ, 1992). Além disso, mudas obtidas por fecundação
cruzada possuem alta taxa de heterogeneidade, não sendo portanto esta técnica a
mais indicada para produção em larga escala (PIERIK, 1990). Os métodos
convencionais de propagação vegetativa pela separação, divisão de touceiras ou de
pequenas mudas que se formam nos rizomas e em hastes florais são extremamente
lentos, apesar de proporcionarem uma descendência geneticamente idêntica à
planta matriz (SAGAWA e KUNISAKI, 1984). Portanto, esse método também não é
viável em escala comercial (REINERT e MOHR, 1967).
A multiplicação de
Cymbidium
possui limitações como uma baixa taxa de
germinação. Além disso, plantas híbridas dificilmente produzem sementes ou
quando as produzem são na maioria estéreis. Portanto, técnicas de propagação
in
vitro
que possibilitem e acelerem a produção de mudas são essenciais para a
horticultura. Outra vantagem da micropropagação é a obtenção de populações
homogêneas oriundas de matrizes melhoradas geneticamente (HASEGAWA e GOI,
1987).
1
Técnicas de propagação
in vitro
aceleram a produção de mudas e são
essenciais para a horticultura (MUKHOPADHYAY e ROY, 1994). Segundo dados do
Instituto Brasileiro de Floricultura, o mercado internacional de flores e plantas
ornamentais movimenta anualmente em torno de 100 bilhões de dólares
(IBRAFLOR, 2003). O principal importador e exportador desses produtos é a
Holanda, que, em 1995, comercializou 67 milhões de dólares somente em orquídeas
do gênero
Cymbidium
(CASTRO, 1998). O desenvolvimento do método de
germinação de sementes
in vitro
por Knudson, em 1922, abriu caminho para outros
estudos visando à propagação vegetativa
in vitro
(READ e SZENDRÁK, 1998).
Técnicas de propagação
in vitro
de orquídeas também são citadas por vários
autores como meio de conservação de espécies raras ou ameaçadas de extinção
(AGRAWAL et al., 1991; SEENI e LATHA, 1992; De PAUW et al., 1995; RAMSAY e
STEWART, 1998).
A micropropagação é utilizada para a propagação clonal em grande escala de
plantas comercialmente importantes, como, por exemplo, espécies da família
Orchidaceae. As maiores vantagens do cultivo
in vitro
são a multiplicação rápida e a
obtenção de populações homogêneas oriundas de matrizes melhoradas
geneticamente (GOVIL e GUPTA, 1997). Nessa técnica podem ser utilizados tecidos
meristemáticos, constituídos por grupos de células indiferenciadas, que estão
localizados nos ápices de caule e raiz e nas axilas das folhas. As células desse
tecido são totipotentes, isto é, possuem a capacidade de se regenerar e se
diferenciar em diferentes órgãos e tecidos (KYTE e KLEYN, 1996). Os tecidos
meristemáticos possuem maior estabilidade na regeneração de plantas do que
tecidos diferenciados, pois nesses tecidos não há a necessidade de formação de
calos (LAMEIRA et al., 2000).
A cultura
in vitro
de tecidos meristemáticos permite produzir centenas de
clones de plantas previamente selecionadas, muitas delas híbridas, mantendo assim
o genótipo e fenótipo, e ainda eliminar vírus de plantas matrizes infectadas
(CASTRO et al., 2002). A eliminação de vírus é baseada no fato de que a região
meristemática é a única não infectada devido à alta taxa de divisão celular e a
ausência do sistema vascular (NORTHEN, 1990; CARVALHO, 1999). Essa limpeza
viral é muito importante em razão de não existirem espécies de orquídeas totalmente
resistentes (WISLER et al., 1986). Mudas destacadas de plantas contaminadas
2
carregam consigo a infecção viral. A transmissão viral também se dá pelo método de
colheita de flores, com o uso de instrumental contaminado, ampliando a
disseminação nos orquidários (ZETTLER et al., 1978). Os vírus mais freqüentes são
o do mosaico do
Cymbidium
e da mancha-anelar do
Odontoglossum.
Plantas
infectadas são geralmente incineradas (ISHII, 1974).
A micropropagação pela proliferação de gemas axilares é a técnica mais
utilizada. Essas gemas são estimuladas a crescer formando protocormóides
(“protocorm like body” ou PLBs) que, cultivados, originam novos explantes
(CARVALHO, 1999). Protocormóides são caracterizados como estruturas
semelhantes aos protocormos que são gerados a partir da germinação de sementes
de orquídeas, os quais são descritos como uma pequena estrutura esférica e
esverdeada. Na maioria das orquídeas as gemas laterais são claramente visíveis
nas axilas das folhas, parecendo como uma pequena saliência (ARDITTI e ERNST,
1993).
Para a cultura de células, tecidos ou órgãos de plantas são utilizados meios
nutritivos para fornecer as substâncias essenciais para o crescimento e
desenvolvimento
in vitro
. Além disso, a composição e a concentração dos
reguladores de crescimento no meio determinam o padrão de desenvolvimento
(CASTRO et al., 2002). Para o cultivo
in vitro
de tecidos vegetais de orquídeas
utiliza-se o meio de cultura inicial líquido para a formação de PLBs. Já para evolução
destes em plântulas utiliza-se o meio sólido (PIERIK, 1990). Meio de cultura líquido,
quando agitado, aumenta o contato entre os tecidos e o meio melhorando o
crescimento e desenvolvimento (ARDITTI e ERNST, 1993). No entanto, estudos
indicam que meristemas de
Cymbidium
quando cultivados em meio de cultivo líquido
ou sólido não apresentam diferenças no desenvolvimento tanto para meristema
apical como para meristema de gemas laterais (DALLA ROSA e LANERI, 1977).
Os meios de cultivo mais empregados para este gênero são o de
MURASHIGE e SKOOG (1962) (MS) e o de KNUDSON (1946) (KC). A adição de
fitorreguladores melhora o desenvolvimento e crescimento dos PLBs. A adição de
ácido naftaleno acético (ANA), de 5,37 a 53,71 µM, parece aumentar
consideravelmente a produção de brotações durante os primeiros noventa dias de
cultivo, principalmente quando combinada à 44,38 µM de BAP (6-benzilaminopurina)
(ARDITTI e ERNST, 1993).
3
Um dos maiores problemas encontrados no cultivo
in vitro
de explantes de
orquídeas é a exsudação fenólica. Portanto, são necessários estudos para
desenvolver um protocolo que aumente o rendimento e eficiência desta técnica
(GEORGE, 1993). Segundo ARDITTI e ERNST (1993) as publicações sobre a
cultura de células e tecidos vegetais a partir de orquídeas adultas são escassas e os
protocolos necessitam de maior detalhamento, constatando-se isso até os dias
atuais. Nas publicações mais antigas, muitas vezes não são explicitados dados
numéricos como o número de repetições, número de explantes que produziram
PLBs ou que morreram, ou ainda partem de um número muito reduzido de
explantes, não possibilitando uma análise estatística satisfatória (WIMBER, 1963).
Dessa forma foi desenvolvido um protocolo de micropropagação, a partir de
meristemas obtidos de gemas axilares, utilizando discos de PLBs de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ (Anexo 1),
acompanhado de estudos morfo-anatômicos.
4
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7
CAPÍTULO I
CAPÍTULO ICAPÍTULO I
CAPÍTULO I
Efeito da BAP na formação e na morfo-anatomia de protocormóides
(PLBs) de
Cymbidium
‘Joy Polis’
8
RESUMO
RESUMORESUMO
RESUMO
O gênero
Cymbidium
Hort.
,
pertencente à família
Orchidaceae, é constituído por um
grupo numeroso de espécies e plantas híbridas importantes economicamente como
plantas ornamentais. Protocormóides (“protocorm like body” ou PLBs) são estruturas
muito semelhantes ao protocormo, o qual é a extensão do estádio embrionário que
ocorre durante a germinação das sementes de orquídeas. PLBs apresentam alto
potencial morfogênico, demonstrando alta capacidade de regeneração. Dessa
forma, têm sido utilizados como explantes. Essa técnica tem como vantagens a
economia de tempo e de material, além de ser mais eficiente que outras técnicas
convencionais que utilizam outras partes da planta como explantes. O objetivo deste
trabalho foi desenvolver um protocolo eficiente de regeneração de PLBs com a
utilização de diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina
(BAP). PLBs oriundos
de meristemas, de
Cymbidium
‘Joy Polis’, foram seccionados transversalmente,
dando origem a dois discos de 0,7 a 1,0 mm de espessura e
0,3 a 0,4 cm de
diâmetro. O meio de cultura utilizado foi o MS com a adição de BAP nas seguintes
concentrações: 0, 5, 10, 20 e 40 µM. Após 90 dias foram avaliados o número médio
de PLBs, brotações e plantas formados por disco, a altura das brotações acima de
0,5 cm e a porcentagem de explantes necróticos. A origem dos PLBs foi direta pela
proliferação das células das camadas epidérmicas e subepidérmicas. O tratamento
com 20 µM de BAP foi melhor para a variável número médio de PLBs por disco
(9,95). Porém, somente os tratamentos com 5 e 10 µM de BAP apresentaram
brotações (3,29 e 1,61 por disco), além de PLBs (2,71 e 6,72 PLBs por disco,
respectivamente). Explantes necróticos foram encontrados em todos os tratamentos,
porém em maior porcentagem no tratamento com 40 µM de BAP (26%). A
concentração de 20 µM de BAP foi a mais indicada para a regeneração dos discos
de PLBs.
Palavras chave
Palavras chavePalavras chave
Palavras chave: Orchidaceae, micropropagação, propagação
in vitro,
fitorregulador.
9
ABSTRACT
ABSTRACTABSTRACT
ABSTRACT
The
Cymbidium
Hort. genus, Orchidaceae family, has numerous species and
hybrids, which are economically important as ornamental plants. Protocorm-like
bodies (PLBs) are structures very similar to the protocorm, which is the extension of
the embryonic state after orchid seed germination. PLBs have high morphogenetic
potential, showing high regeneration capacity. So, they have been used as explants
for multiplication. The advantages of this technique are the shorter time, use of few
material and the fact that it is more efficient than other techniques that uses explants
from other plant parts. The objective of this study was to develop an efficient protocol
for regeneration from PLBs, by the addition of N
6
– benzyladenine (BA) at different
concentrations, into culture medium. PLBs obtained from meristems of
Cymbidium
‘Joy Polis’, were cut transversally, forming two thin sections 0.7 to 1 mm thick and
with 0.3 to 0.4 cm of diameter. The culture medium was MS, supplemented with the
following BA concentrations: 0; 5; 10; 20 and 40 µM. After 90 days, the number of
PLBs, shoots and plants formed per section, the shoot height up to 0.5 cm and the
percentage of necrotic explants were evaluated. The PLBs were originated directly by
proliferation of cells from the epidermal and subepidermal layers. The concentration
of 20 µM BA gave the best number of PLBs per section (9.95). Shoots were
observed only in the treatments with 5 and 10 µM BA (3.29 and 1.61 per section,
respectively), as well as PLBs (2.71 and 6.71 per section, respectively). Necrotic
explants appeared in all treatments, but in higher rates in the presence of 40 µM BA
(26%). The concentration of 20 µM BA was the most indicated for regeneration from
PLBs sections.
Key words:
Key words: Key words:
Key words: Orchidaceae, micropropagation,
in vitro
propagation, growth regulator
1
0
2.1 INTRODUÇÃO
A maioria das espécies de orquídeas são acotiledonares e seu embrião pode
ser comparado à fase globular dos embriões das dicotiledôneas por se apresentar
como uma massa de células indiferenciadas (HARRISON e ARDITTI, 1978). Esses
autores também observaram nos protocormos dois tipos celulares: células pequenas
e com conteúdo denso no pólo meristemático e, no pólo oposto, células com núcleos
evidentes e vacúolos. Segundo LEROUX et al. (1997), a região apical do protocormo
constitui um promeristema e logo abaixo dessa região observam-se cordões de
células procambiais e a porção basal formada por tecido parenquimático.
A presença de protocormos é única dentre as fanerógamas e pode ser
considerada como uma extensão do estádio embrionário que ocorre fora das
sementes (DRESSLER, 1993; LEROUX et al., 1997). O desenvolvimento do
protocormo após a germinação da semente é lento e ocorre com o aumento de
volume e diferenciação dos tecidos, originando a plântula (BARABÉ et al., 1993).
De acordo com ARDITTI e ERNST (1993), explantes como tecidos ou calos
de orquídeas
in vitro
formam PLBs, os quais são caracterizados como estruturas
semelhantes aos protocormos. Porém, na literatura são escassos os trabalhos que
demonstrem a real semelhança entre esses dois tipos de estruturas. Nos últimos
anos, o PLB tem sido utilizado como explante, pelo uso de discos transversais, para
acelerar a multiplicação
in vitro
de algumas espécies de orquídeas. Esse uso se
deve ao alto potencial morfogênico dos PLBs. Como os PLBs demonstram alta
capacidade de regeneração, essa técnica tem como vantagens a economia de
tempo e de material, além de ser mais eficiente que outras técnicas convencionais
que utilizam outras partes da planta como explantes. No entanto, esse sistema de
cultura tem sido pouco explorado para espécies de orquídeas comercialmente
importantes (NAYAK et al., 2002).
BEGUM et al. (1994) utilizaram discos longitudinais de PLBs oriundos da
cultura
in vitro
de região apical de brotações de
Cymbidium
. Esses discos possuiam
a capacidade de produzir novos PLBs quando cultivados na presença de 4,4 µM de
BAP e 0,54 µM de ANA, sendo que todos os explantes formaram novos PLBs em
oito semanas.
11
Utilizando a região apical de plântulas derivadas de germinação
in vitro
da
espécie
Cymbidium aloifolium
(Orchidaceae)
,
desenvolveram-se PLBs, após 50 - 60
dias, nos quais foram feitas secções transversais de aproximadamente 0,5 mm de
espessura. A regeneração dos discos com a formação de novos PLBs foi melhor em
meio de cultivo MS com a adição de 14 µM de zeatina ribosideo (ZR) e 22 µM de
BAP, apresentando, respectivamente, 89,03% e 68,03% de explantes que formaram
PLBs em 10 semanas (NAYAK et al., 2002).
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo eficiente de
regeneração de PLBs, comparando diferentes concentrações da citocinina BAP e
acompanhar as alterações morfológicas e histológicas durante a regeneração dos
PLBs.
12
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Micropropagação
Vegetal e a análise anatômica no Laboratório de Botânica Estrutural do
Departamento de Botânica, do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Paraná (UFPR).
2.2.1 Condições de cultivo
in vitro
As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ±
2°C, sob fotoperiodo de 16 horas e irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
. As lâmpadas
utilizadas foram do tipo luz branca da marca Philips® 32W/64RS, as quais ficavam a
uma distância de 40 cm dos frascos. Os frascos utilizados nos experimentos
possuíam três centímetros de diâmetro e sete centímetros de altura, capacidade de
55 ml, e continham 10 ml de meio de cultura e foram tampados com alumínio e
vedados com filme de PVC.
2.2.2 Origem do material vegetal
Foram coletadas brotações laterais de 5 a 7 cm de comprimento de híbridos
de
Cymbidium
‘Joy Polis’ (Figura 1.1A). Estas foram fornecidas pela RF Orquídeas
situada em Campo Largo, Paraná.
As brotações laterais do gênero
Cymbidium
(Figuras 1.1B-C)
,
descritas acima,
foram desinfestadas com etanol 70% por 5 minutos, e em seguida em hipoclorito de
sódio a 2% com Tween 20 a 0,1% por 15 minutos. Posteriormente, foram feitas
lavagens em água destilada autoclavada. Com o auxílio de microscópio
estereoscópico e com pinças e bisturis foram expostas as gemas (Figura 1.1D) e
isolada a região meristemática com dois primórdios foliares adjacentes. Os
meristemas foram cultivados em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) sem a
13
adição de fitorreguladores, inicialmente ficaram 15 dias no escuro e posteriormente
sob fotoperiodo de 16 horas.
Foram utilizados como fonte de explantes os PLBs formados a partir dos
meristemas após 60 dias. Durante quatro semanas foram avaliadas a porcentagem
de contaminação microbiana, de oxidação fenólica e de sobrevivência dos
explantes.
2.2.3 Regeneração de PLBs
Os PLBs oriundos dos meristemas (Figura 1.2A) foram seccionados
transversalmente, com o auxílio de microscópio estereoscópico, dando origem a dois
discos de 0,7 a 1,0 mm de espessura e 0,3 a 0,4 cm de diâmetro, eliminando o ápice
e a base.
Todos os experimentos
in vitro
foram realizados em meio MS (MURASHIGE e
SKOOG, 1962) suplementado com 30 g L
-1
de sacarose e 6 g L
-1
de ágar (Vetec®),
com pH ajustado para 5,8 com NaOH ou HCl 0,1 N, e esterilizado em autoclave a
121°C por 20 minutos. O fitorregulador testado foi BAP nas seguintes
concentrações: 0; 5; 10; 20 e 40 µM. Após 90 dias da instalação do experimento,
foram avaliados: o número médio de PLBs formados por disco de PLB, o número
médio de brotações, o número médio de plantas (os explantes que apresentavam
parte aérea e raiz desenvolvidas), a altura das brotações e plantas acima de 0,5 cm
e a porcentagem de explantes necróticos. A medida da altura foi realizada da base
do explante até a região de abertura das folhas (Figura 1.2B). O delineamento
experimental foi inteiramente casualizado, sendo testados cinco tratamentos com
cinco repetições. A unidade experimental foi dez frascos com um explante cada,
totalizando 250 explantes para o experimento.
14
FIGURA 1.1 -
Cymbidium ‘
Joy Polis’. A. Planta matriz com flores; B. Planta matriz
com brotação lateral; C. Brotação lateral; D. Brotação lateral com a gema exposta
(seta). A. Barra = 3 cm; B. Barra = 1 cm; C. Barra = 2 cm; D. Barra = 0,5 cm.
15
FIGURA 1.2 -
Cymbidium
‘Joy Polis’. A. PLBs originados da região meristemática da
gema após 60 dias no meio de cultura MS; B. Brotação com uma escala (vertical)
indicando como foi realizada a medição da altura. Barra = 1 cm.
2.2.4 Análise anatômica
Para a análise anatômica qualitativa, foram coletadas amostras de discos de
PLBs cultivados
in vitro
sem BAP, com 10 e 20 µM de BAP, a cada três dias, as
quais foram fixadas em FAA 70 (JOHANSEN, 1940). Esses materiais foram
destinados à preparação de lâminas permanentes, sendo incluídos em meta-
acrilatoglicol (historresina-Leica), segundo a técnica de FEDER e O’BRIEN (1968) e
as indicações do fabricante. Os blocos foram seccionados em micrótomo de rotação,
e os cortes de 7 µm de espessura foram corados com azul de toluidina (FEDER e
O’BRIEN, 1968). As lâminas foram montadas com resina sintética (Permalte). As
fotomicrografias foram realizadas em microscópio Zeiss com câmera digital Sony
Cyber-shot P200 acoplada.
Para a análise da superfície dos PLBs em microscopia eletrônica de
varredura (MEV), o material botânico foi fixado em FAA 70, desidratado em série
alcoólico etílica, e posteriormente pelo método do ponto crítico com CO
2
no
aparelho Bal-Tec CPD 030. Após o ponto crítico, o material foi colado em suportes
metálicos e metalizado com ouro, a vácuo, no equipamento Balzers Union FL 9496
16
SCD 030. A análise e o registro eletromicrográfico foram realizados com
Microscópio Eletrônico de Varredura Jeol (JSM 6360 LV), no Centro de
Microscopia Eletrônica da UFPR.
2.2.5 Análise estatística
Os resultados obtidos foram submetidos a analise de variância. Inicialmente,
as variâncias dos tratamentos foram avaliadas quanto a sua homogeneidade pelo
teste de Bartlett. As variáveis cujas variâncias mostraram-se homogêneas tiveram as
médias dos tratamentos testadas por meio do teste de F, enquanto que as que
apresentaram heterogeneidade tiveram seus valores transformados para posterior
análise. Quando as médias dos tratamentos foram diferentes estatisticamente, essas
foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
17
2.3 RESULTADOS
Os meristemas utilizados para a produção de explantes apresentaram 36% de
contaminação bacteriana e 10% de oxidação fenólica. A alta porcentagem de
contaminação provavelmente deve-se ao fato de as brotações laterais se
desenvolverem próximas ao solo, dificultando uma eficiente desinfestação do
material. Dos meristemas inoculados, 54% sobreviveram e destes, 76,67%
produziram PLBs, possibilitando o desenvolvimento do experimento.
Os resultados das análises de variância para as variáveis analisadas são
apresentados nos Anexos 2 a 6 e o teste de Tukey para as médias de número de
PLBs formados e altura das brotações na Tabela 1.1.
A equação de regressão, ajustada para número médio de PLBs formados por
disco de PLB em função das concentrações de BAP testadas, revelou que o número
de PLBs tende a crescer com a elevação da concentração de BAP, até alcançar uma
concentração estimada de BAP de 25,23 µM, iniciando uma queda no número de
PLBs com o aumento da concentração até 40 µM de BAP (Figura 1.3).
Nos tratamentos com 20 e 40 µM de BAP, os explantes formaram uma massa
verde escura com pequenos PLBs (Figuras 1.4 T
4
e T
5
) e não apresentaram
brotações ou plantas (Tabela 1.1). O tratamento com melhores resultados foi 10 µM
de BAP, pois formou PLBs e brotações, os quais somados resultaram num total de
8,33 (6,72 + 1,61) e somente 4% de explantes necróticos. No entanto, o tratamento
com 20 µM de BAP resultou em 9,95 PLBs formados por disco e 14% de explantes
necróticos. Dessa forma, os melhores resultados foram obtidos com a utilização de
10 e 20 µM de BAP. As plantas do tratamento sem fitorregulador desenvolveram
raízes e folhas alongadas (Figura 1.4 T
1
). Explantes necróticos foram encontrados
em todos os tratamentos, porém em maior porcentagem no tratamento com 40 µM
de BAP, sendo que esses explantes morreram e não desenvolveram PLBs.
Os PLBs em na presença de BAP, quando tranferidos para o meio de cultura
sem fitorregulador, desenvolveram-se com a emissão da parte aérea e raiz.
18
TABELA 1.1 - Regeneração de PLBs a partir de discos de PLB de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ cultivados em meio de cultura MS acrescido ou não de BAP
após 90 dias.
Concentração
de BAP (µM)
Número médio
de brotações por
disco de PLB*
Número médio de
plantas por disco
de PLB
Altura das
brotações (cm)
Explantes
necróticos (%)
0 0 c 1,54 a 1,14 a 12 b
5 3,29 a 0,19 b 0,71 b 4 b
10 1,61 b 0 b 0,67 b 4 b
20 0 c 0 b --- 14 b
40 0 c 0 b --- 26 a
Coeficiente de
variação (%)
3,09 28,94 14,92 44,10
Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
*variável transformada por raiz quadrada
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Concentrações de BAP (
Concentrações de BAP (Concentrações de BAP (
Concentrações de BAP (µM)
µM)µM)
µM)
Número de PLBs/disco de PLB
Número de PLBs/disco de PLB
Número de PLBs/disco de PLB
Número de PLBs/disco de PLB
FIGURA 1.3 - Número de PLBs regenerados por disco de PLB de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ em meio de cultura MS em função da concentração de BAP após 90 dias.
R
2
= 0,975
y = -0,0158x
2
+0,797x
1
+0,0868
19
FIGURA 1.4 - Brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’, obtidas a partir de discos de
PLBs cultivados em meio de cultura MS acrescido ou não de BAP, após 90 dias.
T1. sem BAP; T2. 5 µM de BAP; T3. 10 µM de BAP.; T4. 20 µM de BAP; T5. 40 µM
de BAP.Barra = 1 cm.
Os discos de PLBs, no meio de cultura sem fitorregulador, formam uma
protuberância aos 21 dias, a qual, aos 30 dias, está diferenciada em um PLB com
região apical e pêlos na base. Esse novo PLB formado, aos 45 dias, apresenta
região apical desenvolvida com a emergência de primórdios foliares e aos 60 dias é
possível observar a emissão da raiz (Figura 1.5A-D). Nos meios de cultura com 10 e
20 µM de BAP formaram-se vários PLBs na periferia dos discos (Figura 1.5E-M).
Também foi possível observar novos PLBs laterais desenvolvendo-se nesses PLBs
(Figura 1.5L). O PLB apresenta formato esférico com uma região apical contendo
primórdios foliares e uma região oposta com pelos absorventes (Figura 1.6A).
Poucos estômatos foram visualizados na superfície do PLB (Figura 1.6B).
O PLB em secção transversal, no momento da instalação do experimento,
apresenta formato arredondado. A epiderme é unisseriada, com células alongadas
no sentido transversal, e com poucos estômatos e tricomas dispersos. Nas camadas
subepidérmicas ocorrem idioblastos com ráfides. O tecido de preenchimento é
parenquimático com células de diferentes tamanhos e formatos, e na região central
ocorre um cilindro vascular envolvido pela endoderme (Figura 1.6C). O xilema e o
floema possuem organização de região de transição entre o caule a raiz. Em secção
longitudinal, observa-se na região apical um meristema caulinar com primórdios
foliares envolvidos por uma estrutura inicialmente contínua com epiderme interna e
externa, mesofilo parenquimático e feixes vasculares, similar ao coleóptile de
embriões zigóticos (Figura 1.6D). Pela similaridade desta com o coleóptile de
embriões zigóticos será definida como tal no presente trabalho.
Os discos de PLBs aos nove dias em meio de cultura sem a adição de
fitorregulador não apresentam alterações visíveis (Figura 1.6E). Já aos 12 dias,
20
FIGURA 1.5 – Discos de PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A-D. Em meio de cultura
sem fitorregulador; E-H. Em meio de cultura adicionado de 10 µM de BAP; I-M. Em
meio de cultura adicionado de 20 µM de BAP. A, E e I. 21 dias de cultura; B, F e J.
30 dias de cultura; C, G e L. 45 dias de cultura; D, H e M. 60 dias de cultura; seta =
PLBs laterais. Barra = 0,5 cm
.
21
FIGURA 1.6 - PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A. PLBs em vista geral (MEV); B. detalhe de
um estômato na superfície do PLB (MEV); C. Secção transversal do PLB no dia zero; D.
Secção longitudinal do PLB no dia zero, observar o meristema apical envolvido pelo
coleóptile; E-H. PLBs cultivados em meio de cultura sem a adição de BAP; E. Secção do
PLB aos nove dias de cultura; F. Secção do PLB aos 12 dias de cultura, observar a origem
de ápices meristemáticos; G. Secção do PLB aos 21 dias de cultura, observar dois ápices
meristemáticos (setas); H. Secção do PLB aos 30 dias de cultura, verificar o inicio do
estrangulamento na base do novo PLB formado (seta). co = coleóptile. cp = cordão
procambial. cv = conexão vascular. mac = meristema apical caulinar. Barra A= 500 µm.
Barra B= 10 µm. Barra C-H= 400 µm.
22
pode-se observar a formação de meristemas apicais caulinares, protegido pelo
coleóptile, e conectado vascularmente ao tecido de origem (Figura 1.6F). Aos 21
dias de cultura, esses meristemas se desenvolvem dando origem a primórdios
foliares e tecido parenquimático, aumentando de volume (Figura 1.6G). Esses
meristemas apicais originam novos PLBs que são observados aos 30 dias de
cultura. Os novos PLBs apresentam região apical desenvolvida e conexão vascular
com o disco. Neste estádio de desenvolvimento, é possível observar o
estrangulamento na base desses PLBs, devido ao surgimento de uma zona de
abscisão (Figura 1.6H). Após ocorrer o total desligamento dos PLBs com o tecido de
origem, eles se desprendem facilmente.
Os discos de PLBs, aos nove dias em meio de cultura com 10 µM de BAP,
apresentam protuberâncias formadas pela divisão celular da epiderme e camadas
subepidérmicas (Figura 1.7A). As células dessas protuberâncias assumem
características de células meristemáticas, como núcleo evidente, conteúdo denso e
pouco vacuoladas. Aos 12 dias, já é possível observar a individualização do
coleóptile, ainda contínuo, protegendo o meristema caulinar apical e a conexão
vascular com o disco de PLB (Figura 1.7B). O novo PLB está desenvolvido aos 21
dias e iniciando o desligamento com o tecido de origem (Figura 1.7C). Nesse estádio
de desenvolvimento, é possível observar o rompimento do coleóptile devido ao
desenvolvimento do meristema apical do PLB. Com 30 dias de cultura, os novos
PLBs formados apresentam região apical com folhas bem desenvolvidas. Além
disso, também é observado o surgimento de PLBs laterais (Figura 1.7D).
No tratamento com 20 µM de BAP, a epiderme, aos nove dias de cultura,
torna-se meristemática em quase todo o contorno do explante (Figura 1.7E). Aos 12
dias, a camada meristemática torna-se mais espessa e inicia-se a formação de
protuberâncias (Figura 1.7F). Essas protuberâncias iniciam o desenvolvimento do
meristema apical caulinar aos 21 dias (Figura 1.7G). Com 30 dias de cultura, os
PLBs têm região apical diferenciada com várias folhas (Figura 1.7H). Da mesma
forma que os discos de PLBs cultivados em meio de cultura sem fitorregulador,
forma-se uma zona de abscisão na base dos novos PLBs, isolando-os do disco
central (Figura 1.7I). Nessa região foi possível distinguir duas camadas distintas,
uma com células pequenas de parede delgada e com poucos espaços
intercelulares, e outra com a presença de suberina.
23
FIGURA 1.7 - Secções de PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A-D. cultivados em meio
de cultura adicionado de 10 µM de BAP. E-I cultivados em meio de cultura
adicionado de 20 µM de BAP. A,E Secção do PLB aos nove dias de cultura; B,F.
Secção do PLB aos 12 dias de cultura; C,G. Secção do PLB aos 21 dias de cultura;
D,H-I. Secção do PLB aos 30 dias de cultura, observar um PLB lateral (seta). I.
Detalhe da zona de abscisão (seta). co = coleóptile. cp = cordão procambial. Barra
A, E, F e I= 200 µm. Barra B-D, G e H= 400 µm.
24
2.4 DISCUSSÃO
A micropropagação de orquídeas utilizando discos de PLBs, tanto com cortes
transversais (TENG et al., 1997; ISHII et al., 1998; YOUNG et al., 2000; NAYAK et
al., 2002) como foi testada para
Cymbidium
no presente trabalho, como com cortes
longitudinais (BEGUM et al., 1994; HUAN et al, 2004; HUAN e TANAKA, 2004),
obteve resultados satisfatórios nos últimos anos. NAYAK et al. (2002) indicam que
esses resultados positivos estão relacionados com a alta capacidade de
regeneração desse tecido, e ainda que essa técnica tem a vantagem de economia
de tempo e de material. Os mesmos autores observaram que a adição de citocinina
no meio de cultura é essencial para elevar a porcentagem de explantes regenerando
PLBs, bem como aumentar o número de PLBs por disco. E ainda, utilizando secções
transversais de PLBs de
Cymbidium aloifolium
(Orchidaceae), obtiveram as maiores
porcentagens de explantes regenerando novos PLBs (68,03%) e número de PLBs
por disco (28,1) utilizando 22 µM de BAP. Resultado semelhante ao obtido no
presente trabalho, no qual a melhor concentração para a formação de PLBs foi de
20 µM.
No entanto, BEGUM et al. (1994) obtiveram um número maior de PLBs por
explante (8,3) utilizando 4,4 µM de BAP para discos de PLBs de
Cymbidium
x
Thanksgiving ‘Nativity’ (Orchidaceae). Ainda segundo esses autores, as respostas
dos explantes ao tipo e concentrações de fitorreguladores podem variar de acordo
com o cultivar. O tratamento sem a adição de BAP regenerou novos PLBs, segundo
BEGUM et al. (1994), sugerindo que a adição de fitorreguladores não é essencial
para a formação direta de PLBs no explante.
A elevação da concentração de BAP inibiu a formação de raízes nos PLBs, os
quais desenvolveram somente a parte aérea. SEENI e LATHA (1992) também
observaram que a presença de altas concentrações de BAP no meio de cultura
inibiam o enraizamento de
Renanthera imschootiana
(Orchidaceae). Além disso, o
aumento na concentração de BAP acima do nível ideal, ocasionou à inibição do
desenvolvimento de novos PLBs, confirmando o observado por NAYAK et al. (2002).
ROY e BANERJEE (2003), estudando
Dendrobium fimbriatum
(Orchidaceae),
da mesma forma que nesse trabalho, observaram a necessidade de transferir os
25
PLBs para o meio de cultura sem fitorregulador para que estes se desenvolvessem
em plantas.
Em monocotiledôneas, o embrião zigótico passa pelos estádios globular e
coleoptilar (GRAY e PUROHIT, 1991). No entanto, em orquídeas, após a
germinação da semente, o embrião desenvolve-se formando uma estrutura
denominada protocormo, o qual apresenta uma natureza hipocotílica (FONT QUER,
1989). Os embriões zigóticos de orquídeas, protocormo, apresentam características
que contrariam o descrito para a maioria das angiospermas, pois não são estruturas
bipolares. De acordo com BELTRATI e PAOLI (2003), nas monocotiledôneas mais
avançadas como as orquídeas, a raiz primária é pouco desenvolvida ou ausente.
JIMÉNEZ (2001) descreve a embriogênese somática como um processo no qual
células haplóides ou diplóides se desenvolvem em estruturas semelhantes aos
embriões zigóticos, os quais são estruturas bipolares sem conexão vascular com o
tecido de origem (ARNOLD et al., 2002). O processo de embriogênese somática
direta ou indireta em orquídeas está baseado na formação de PLBs (ARDITTI e
ERNST, 1993; BEGUM et al., 1994). A embriogênese direta seria a diferenciação
direta do explante em PLBs, que por sua vez formarão novas plantas.
No presente trabalho, os discos de PLBs desenvolveram diretamente novos
PLBs, pela proliferação das células epidérmicas e subepidérmicas, tanto nos meios
de cultura sem fitorregulador como nos adicionados de BAP. Esses PLBs, da mesma
forma que no descrito para os protocormos, não são estruturas bipolares. A
presença de uma folha contínua protegendo o meristema apical caulinar também foi
observada nos diferentes tratamentos, sendo denominada, no presente trabalho, de
coleóptile devido à semelhança com o coleóptile presente em embriões de
gramínea.
No presente estudo foi observado que, primeiramente, durante o
desenvolvimento dos novos PLBs, há conexão com o tecido de origem, e que essa
conexão é posteriormente rompida pela formação de uma zona de abscisão. Esse
resultado difere do normalmente observado na embriogênese somática, a qual é
caracterizada por não apresentar conexão vascular do embrião com o tecido de
origem (ARNOLD et al., 2002). As características da zona de abscisão observada
nos PLBs conferem com o descrito para a zona de abscisão de folhas em
Gimnospermas e Dicotiledôneas, por vários autores (WEIER et al, 1982; CUTTER,
26
1987; MAUSETH, 1988). Ainda segundo esses autores, a primeira camada com
células pequenas é denominada de camada de separação e a que contém suberina
de camada protetora.
BEGUM et al. (1994), utilizando como explante secções longitudinais de PLBs
de
Cymbidium
, observaram que a regeneração dos novos PLBs foi a partir da
proliferação de pequenos grupos de células epidérmicas, as quais apresentavam, da
mesma forma que nesse estudo, citoplasma denso, pouco vacuolado e com núcleo
evidente. Esses autores observaram que, aos 28 dias de cultivo, os novos PLBs
formados apresentavam primórdios foliares e cordão procambial. Porém, não
verificaram a presença de uma folha contínua protegendo o meristema apical
caulinar e nem a presença da conexão vascular com o tecido de origem, como foi
observado nesse trabalho.
A embriogênese somática direta foi observada em folhas de
Oncidium
Gower
Ramsey (Orchidaceae), nas quais os embriões foram geralmente formados das
células das camadas epidérmica e subepidérmicas (CHEN et al., 1999). No entanto,
diferentemente do observado em
Cymbidium
, os autores afirmam que a origem dos
embriões é a partir de uma única célula. A origem direta dos PLBs em ápice de raiz
de
Clowesia warscewiczii
(Orchidaceae) foi a partir da proliferação das células do
meristema apical (KERBAUY e ESTELITA, 1996). No entanto, em ápice de raiz de
Doritaenopsis
‘New Candy’ (Orchidaceae), foi observada a embriogênese direta e
indireta. A origem direta dos PLBs ocorreu pela proliferação das células do
meristema apical; já a origem indireta ocorreu pela proliferação das células do
córtex, as quais formaram uma massa de células semelhante a um calo (PARK et
al., 2003).
Os discos de PLBs cultivados em meio de cultura adicionado de 10 e 20 µM
de BAP, apresentaram diferenças no início do desenvolvimento dos novos PLBs. No
meio de cultura contendo 10 µM de BAP, formaram-se protuberâncias localizadas na
epiderme, já no meio de cultura contendo 20 µM de BAP, a epiderme e as camadas
subepidérmicas, em quase todo o contorno do explante, tornaram-se
meristemáticas. Essa diferença anatômica reflete no maior número médio de novos
PLBs (9,95) no meio de cultura contendo 20 µM de BAP.
27
2.5 CONCLUSÃO
A técnica utilizada mostrou-se eficiente devido à capacidade dos discos de
PLBs regenerarem diretamente novos PLBs e subsequentemente formarem plantas.
Portanto, essa técnica pode ser utilizada para a multiplicação de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ em larga escala, sendo a concentração de 20 µM de BAP a mais indicada para
a regeneração dos discos de PLBs. Cada PLB pode dar origem a 20 plantas em
quatro meses. Pelas análises anatômicas os PLBs são originados diretamente das
células das camadas epidérmica e subepidérmicas, possuem uma folha (coleóptile)
protegendo o meristema apical caulinar e conexão vascular com o tecido de origem.
A separação do PLB do disco de origem ocorre a partir da instalação de uma zona
de abscisão.
28
2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Micropropagation of orchids
on of orchidson of orchids
on of orchids. New York: John Wiley & Sons,
1993. 682 p.
ARNOLD, S. von; SABALA, I.; BOZHKOV, P.; DYACHOK, J.; FILOLOVA, L.
Developmental pathways of somatic embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ
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Culture v. 69, p. 233-249, 2002.
BARABÉ, D.; SAINT-ARNAUD, M.; LAUZER, D.; Sur la nature des protocormes d’
Orchidées (Orchidaceae). Comptes Rendus de l’ Académie des Sciences,
Comptes Rendus de l’ Académie des Sciences, Comptes Rendus de l’ Académie des Sciences,
Comptes Rendus de l’ Académie des Sciences, Paris, t.
316, Série III, p. 139-144, 1993.
BEGUM, A. A.;TAMAKI, M.; KAKO, S. Formation of protocorm-like bodies (PLB) and
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culture of outer tissue of
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PLB. Journal
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of the Japanese Society of Horticultural Scienceof the Japanese Society of Horticultural Science
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31
CAPÍTULO II
CAPÍTULO IICAPÍTULO II
CAPÍTULO II
Efeito de ANA e BAP na regeneração e na morfo
Efeito de ANA e BAP na regeneração e na morfoEfeito de ANA e BAP na regeneração e na morfo
Efeito de ANA e BAP na regeneração e na morfo-
--
-anatomia de
anatomia de anatomia de
anatomia de
Cymbidium
CymbidiumCymbidium
Cymbidium
‘Joy Po
‘Joy Po‘Joy Po
‘Joy Polis’
lis’lis’
lis’ a partir de discos de PLBs
a partir de discos de PLBsa partir de discos de PLBs
a partir de discos de PLBs
32
RESUMO
RESUMORESUMO
RESUMO
O gênero
Cymbidium
Hort.
,
pertencente à família
Orchidaceae, é constituído por um
grupo numeroso de espécies e plantas híbridas importantes economicamente como
plantas ornamentais. Os métodos convencionais de propagação vegetativa pela
divisão de touceiras são extremamente lentos. Portanto, técnicas de propagação
in
vitro
que possibilitem e acelerem a produção de mudas, são essenciais para a
horticultura. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo eficiente de
regeneração de discos de PLBs utilizando diferentes concentrações de ácido
naftaleno acético (ANA) isolado ou combinado ao 6-benzilaminopurina (BAP). PLBs,
oriundos dos meristemas de gemas axilares de
Cymbidium
‘Joy Polis’, foram
seccionados transversalmente, dando origem a dois discos de 0,7 a 1,0 mm de
espessura e 0,3 a 0,4 cm de diâmetro. Em seguida foram inoculados em meio de
cultura MS (Murashige e Skoog, 1962) com ANA isolado ou combinado a 0,5 µM de
BAP nas seguintes concentrações: 0,5; 1; 2 e 4 µM. Esse experimento foi realizado
duas vezes, sendo uma cultura mantida sob iluminação (fotoperiodo de 16 horas e
irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
) e a outra mantida 30 dias no escuro e 60 dias sob
iluminação. As avaliações foram realizadas após 90 dias, sendo consideradas as
seguintes variáveis: número médio de PLBs e plantas formadas por disco, altura das
plantas e porcentagem de explantes necróticos. A origem dos PLBs foi direta pela
proliferação das células das camadas epidérmica e subepidérmicas. Nos explantes
que foram cultivados no escuro, em quase todo o contorno do disco de PLB foram
observadas células assumindo atividade meristemática resultando num número
maior de PLBs formados. Os tratamentos com ANA combinado ao BAP deram
resultados estatisticamente superiores aos tratamentos com ANA isolado. O
tratamento com 0,5 µM de ANA combinado a 0,5 µM de BAP forneceu o maior
número médio de PLBs por disco tanto no tratamento sob iluminação (3,25) quanto
no escuro (7,03). Em ambos os experimentos houve um aumento na porcentagem
de explantes necróticos com o aumento na concentração de ANA, tanto nos
tratamentos sem BAP como na presença de BAP. Portanto, o tratamento mais
indicado é o de 0,5 µM de ANA combinado a 0,5 µM de BAP mantido 30 dias no
escuro e 60 dias sob iluminação.
Palavras chave
Palavras chavePalavras chave
Palavras chave: Orchidaceae, micropropagação, fitorregulador
33
ABSTRACT
ABSTRACTABSTRACT
ABSTRACT
The
Cymbidium
Hort. genus, Orchidaceae family, has numerous species and
hybrids, which are economically important as ornamental plants. The traditional
vegetative propagation method by plant shoot separation is slow. In vitro propagation
techniques that make possible and speed up the plant production are thus essential
for horticulture. The objective of this study was to develop an efficient protocol for
PLBs sections using naphthaleneacetic acid (NAA) alone or combined with N
6
–
benzyladenine (BA). PLBs originated from meristems of axillary buds of
Cymbidium
‘Joy Polis’, were cut transversaly, forming two thin sections, 0.7 to 1 mm thick and
with 0.3 to 0.4 cm of diameter, that were inoculated in MS culture medium
supplemented with NAA (0,5; 1; 2 e 4 µM), alone or combined with 0.5 µM BA. This
experiment was made twice: one of them was developed under 16 h photoperiod
(irradiance de 40 µmol.m
-2
.s
-1
) and the other was kept for 30 days in dark and 60
days under illumination. After 90 days, the following variables were analyzed: the
number of PLBs and plants formed per section, the plant height up to 0.5 cm and the
necrotic explants percentage. The PLBs were originated directly by proliferation of
cells of the epidermal and subepidermal layers. In the explants cultivated in dark
conditions, almost in all the periphery of the PLBs, cells with meristematic activity
were observed, resulting in a higher number of PLBs formed. The treatment with
NAA combined with BA showed statistically superior results than treatment with NAA
only. The treatment with 0.5 µM NAA plus 0.5 µM BA showed the biggest PLBs mean
number both under light condition (3.25) and darkness (7.03). In both experiments,
the percentage of necrotic explants increased with the increase of NAA
concentration, with or without BA. The most efficient treatment was the combination
of 0.5 µM NAA and 0.5 µM BA kept 30 days in darkness and 60 days under
illumination.
Key words
Key wordsKey words
Key words: Orchidaceae, micropropagation, growth regulator
34
3.1 INTRODUÇÃO
Atualmente, a produção de mudas de orquídeas é feita principalmente pela
germinação de sementes
in vitro
. Porém, uma grande desvantagem dessa técnica é
a variabilidade genética, devido à alta heterogeneidade das mudas produzidas. Essa
desvantagem é agravada pela demora na floração das mudas produzidas, em torno
de 5 a 7 anos. Portanto, somente após esse período o produtor poderá selecionar as
melhores flores. Uma solução para esse problema é a cultura de tecidos
in vitro
, a
qual possibilita a obtenção de populações homogêneas oriundas de matrizes
melhoradas geneticamente. Para essa técnica podem ser utilizados diferentes
explantes, como meristemas, gemas dormentes, pedaços de folhas e raízes e mais
recentemente discos de PLBs.
O processo de embriogênese somática direta ou indireta em orquídeas está
baseado na formação de PLBs (STEWARD e MAPES, 1971; ARDITTI e ERNST,
1993; BEGUM et al., 1994). A embriogênese direta seria a diferenciação direta do
explante em PLBs, que por sua vez formarão novas plantas. Já na embriogênese
indireta ocorre uma fase intermediária de calo, antes da formação dos PLBs
(STEWARD e MAPES, 1971; BEGUM et al., 1994; LAKSHMANAN et al., 1996; ISHII
et al, 1998; HUAN e TANAKA, 2004).
A formação de embriões globulares bem definidos não tem sido descrita na
embriogênese somática para a família Orchidaceae (CHANG e CHANG, 1998). A
embriogênese somática direta foi observada em folhas de
Oncidium
‘Gower Ramsey’
(Orchidaceae), nas quais os embriões formavam-se a partir da epiderme e da
camada subepidérmica (CHEN et al. 1999). Em ápices de raiz de
Doritaenopsis
(Orchidaceae), PLBs originam-se diretamente da região meristemática e
indiretamente da região do córtex (PARK et al., 2003). Já KERBAUY e ESTELITA
(1996) observaram somente a formação direta de PLBs no ápice meristemático de
Clowesia warscewiczii
(Orchidaceae).
Pesquisas de embriogênese indireta em orquídeas são escassas,
principalmente as que utilizam PLBs como explantes (HUAN et al., 2004). Esse fato
pode ser devido ao crescimento lento e tendência necrótica dos calos de orquídeas
(KERBAUY, 1984). BEGUM et al. (1994) observaram que calos de
Cymbidium
35
sofriam necrose após dois meses de cultura. A formação de calos em orquídeas
depende fundamentalmente da concentração dos fitorreguladores utilizada (CHEN e
CHANG, 2000; ROY e BANERJEE, 2003; HUAN et al., 2004). As maiores
porcentagens de formação de calos foram obtidas, em diferentes explantes, com a
combinação de auxinas, ANA e ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4 D), com a
citocinina BAP (CHANG e CHANG, 1998; ISHII et al., 1998; CHEN e CHANG, 2000;
ROY e BANERJEE, 2003; HUAN et al., 2004). O tempo de indução para a formação
dos calos pode variar de um mês a 18 meses, dependendo da espécie, do tipo de
explante, do meio de cultura e das condições de cultivo (HUAN et al., 2004).
Segundo ROY e BANERJEE (2003), as plantas regeneradas dos calos podem ser
tratadas como microestacas para o enraizamento ou como explantes para
experimento de multiplicação.
A embriogênese somática apresenta vantagens especialmente para estudos
de mutação espontânea ou induzida, bem como para transformação genética. A
inserção de genes de resistência a doenças e estresse, de precocidade de
florescimento e de melhoramento da morfologia e coloração é de grande importância
comercial. A técnica de embriogênese somática tem sido pouco explorada para
orquídeas (CHEN et al., 1999). Existem trabalhos com
Oncidium
(CHEN et al., 1999;
CHEN e CHANG, 2000; CHEN e CHANG, 2002),
Cymbidium
(CHANG e CHANG,
1998, HUAN et al., 2004; HUAN e TANAKA, 2004) e
Phalaenopsis
(ISHII et al,
1998).
Apesar de existirem várias pesquisas com a indução de PLBs em culturas
in
vitro
de orquídeas, sabe-se pouco sobre desenvolvimento estrutural desses PLBs e
da sua origem nos diferentes explantes (PARK et al., 2003).
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo eficiente de
regeneração de plantas utilizando discos de PLBs em diferentes concentrações de
ANA isolado ou combinado com BAP, acompanhando as alterações morfológicas e
histológicas durante a regeneração dos PLBs.
36
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Micropropagação
Vegetal e a análise anatômica no Laboratório de Botânica Estrutural do
Departamento de Botânica, do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Paraná (UFPR).
3.2.1 Condições de cultivo
in vitro
As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ±
2°C, sob fotoperiodo de 16 horas e irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
. As lâmpadas
utilizadas foram do tipo luz branca da marca Philips® 32W/64RS, as quais ficavam a
uma distância de 40 cm dos frascos. Os frascos utilizados para o experimentos
possuíam três centímetros de diâmetro e sete centímetros de altura, capacidade de
55 ml, e continham 10ml de meio de cultura. Todos os experimentos
in vitro
foram
realizados em meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), suplementado
com 30 g L
-1
de sacarose e 6 g L
-1
de ágar (Vetec®), com pH ajustado para 5,8 com
NaOH ou HCl a 0,1 N, e esterilizado em autoclave a 121°C por 20 minutos.
3.2.2 Origem do material vegetal
Foram coletadas brotações laterais de 5 a 7 cm de comprimento de híbridos
de
Cymbidium
‘Joy Polis’. Estas foram fornecidas pela RF Orquídeas situada em
Campo Largo, Paraná.
As brotações laterais do gênero
Cymbidium
foram desinfestadas em etanol
70% por 5 minutos, e em seguida em hipoclorito de sódio a 2% com Tween 20 a
0,1% por 15 minutos. Posteriormente, foram feitas lavagens em água destilada
autoclavada. Com o auxílio de microscópio estereoscópico e com pinças e bisturis
foram expostas as gemas e isolada a região meristemática com dois primórdios
foliares adjacentes. Os meristemas foram cultivados em meio MS sem a adição de
37
fitorreguladores. Inicialmente ficaram 15 dias no escuro e posteriormente sob
fotoperiodo de 16 horas. Foram utilizados como fonte de explantes os PLBs
formados a partir dos meristemas após 60 dias.
3.2.3 Regeneração de PLBs
Os PLBs oriundos dos meristemas foram seccionados transversalmente com
o auxílio de microscópio estereoscópico, dando origem a dois discos de 0,7 a 1,0
mm de espessura e 0,3 a 0,4 cm de diâmetro. Em seguida, foram inoculados em
meio de cultura MS com ANA (0,5; 1; 2 e 4 µM) isolado ou combinado com BAP (0,5
µM). Esse experimento foi realizado duas vezes, sendo uma cultura mantida sob
iluminação e a outra mantida 30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação.
As avaliações foram realizadas após 90 dias, sendo consideradas as
seguintes variáveis: número médio de PLBs formados por disco, número médio de
plantas, altura das plantas acima de 0,5 cm e porcentagem de explantes necróticos.
Para cada experimento, escuro e claro, o delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, sendo testados oito tratamentos, com um arranjo fatorial de duas
concentrações de BAP (0 e 0,5 µM) em quatro concentrações de ANA (0,5; 1; 2 e 4
µM).
3.2.4 Análise anatômica
Para a análise anatômica qualitativa foram coletadas amostras de PLBs
cultivados
in vitro,
com 0,5 µM de ANA combinado com 0,5 µM de BAP em
condições de iluminação e no escuro, a cada três dias, as quais foram fixadas em
FAA 70 (JOHANSEN, 1940). Essas amostras foram destinados à preparação de
lâminas permanentes, sendo incluídos em meta-acrilatoglicol (historresina-Leica),
segundo a técnica de FEDER e O’BRIEN (1968) e as indicações do fabricante. Os
blocos foram seccionados em micrótomo de rotação, e os cortes foram obtidos com
7 µm de espessura e corados com azul de toluidina (FEDER e O’BRIEN, 1968). As
lâminas foram montadas com resina sintética (Permalte). As fotomicrografias foram
38
realizadas em microscópio Zeiss com câmera digital Sony Cyber-shot P200
acoplada.
3.2.5 Análise estatística
Os resultados obtidos foram submetidos a analise de variância. Inicialmente,
as variâncias dos tratamentos foram avaliadas quanto a sua homogeneidade pelo
teste de Bartlett. As variáveis cujas variâncias mostraram-se homogêneas tiveram as
médias dos tratamentos testadas por meio do teste de F, enquanto que as que
apresentaram heterogeneidade tiveram seus valores transformados para posterior
análise. Quando os resultados das médias dos tratamentos foram diferentes
estatisticamente, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey no nível de 5%
de probabilidade.
39
3.3 RESULTADOS
Analisando-se a variância dos dados do experimento mantido 90 dias sob
iluminação verificou-se que a interação entre as concentrações de BAP e ANA foi
estatisticamente significativa para as variáveis número médio de PLBs formados por
disco e altura das plantas, indicando que os fatores não são independentes
(Anexo 7).
Os tratamentos com 0,5 µM ANA combinado ou não com 0,5 µM BAP e 4 µM
de ANA proporcionaram os melhores resultados para o número médio de PLBs
formados por disco (Figura 2.1). Já para a variável altura das plantas, os resultados
foram semelhantes para todos os tratamentos (Figura 2.2).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0,5 1 2 4
Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (µM)
µM)µM)
µM)
Número de PLBs/explante
Número de PLBs/explante
Número de PLBs/explante
Número de PLBs/explante
0 BAP
0,5 BAP
FIGURA 2.1 - Número de PLBs regenerados por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após 90 dias
sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias
seguidas pela mesma letra minúscula não diferem estatisticamente para as
concentrações de ANA e as letras maiúsculas para as concentrações de BAP ao
nível de 95%.
aA
aA
bB
bA
bB
bA
aA
bB
40
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0,5 1 2 4
Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (µM)
µM)µM)
µM)
Altura das plantas (cm)
Altura das plantas (cm)
Altura das plantas (cm)
Altura das plantas (cm)
0 BAP
0,5 BAP
FIGURA 2.2 - Altura das plantas regeneradas por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após 90 dias
sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias
seguidas pela mesma letra minúscula não diferem estatisticamente para as
concentrações de ANA e as letras maiúsculas para as concentrações de BAP ao
nível de 95%.
Para as variáveis número médio de plantas por disco de PLB e porcentagem
de explantes necróticos, foi evidenciado pela análise de variância que a interação
entre as concentrações de BAP e ANA não foi significativa, indicando que os fatores
são independentes (Anexo 7). Para a variável número médio de plantas por disco de
PLB, somente o fator BAP foi significativo, essa não apresentando diferença
estatística significativa entre as médias e resultando num valor médio de 1,65 para
ambas as concentrações. Para a variável porcentagem de explantes necróticos,
somente o fator ANA foi significativo, sendo o tratamento com 4 µM de ANA o que
apresentou o pior resultado. A porcentagem de explantes necróticos apresentou
uma tendência a crescer com o aumento na concentração de ANA (Figura 2.3).
aA
bA
abA
aA
abA
aB
aA
aA
41
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0,5 1 2 4
Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (µM)
µM)µM)
µM)
% de explantes necróticos
% de explantes necróticos
% de explantes necróticos
% de explantes necróticos
FIGURA 2.3 - Porcentagem de explantes necróticos de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA após 90 dias sob iluminação (fotoperiodo 16
horas e irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra não
diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Os melhores resultados foram obtidos nos tratamentos com 0,5 µM de ANA
combinado ou não com BAP, pois esses tratamentos apresentaram os maiores
valores de PLBs regenerados por disco e baixa porcentagem de explantes
necróticos. A melhor multiplicação foi alcançada pelo tratamento com 0,5 µM ANA
combinado a 0,5 µM BAP, principalmente quando considerada a soma dos números
médios de PLBs e de plantas 5,35 (3,25 + 2,1). Nesse experimento, não foram
observadas brotações sem raízes, somente PLBs ou a planta completa com parte
aérea e raízes (Figura 2.4).
A
A
A
B
42
FIGURA 2.4 - Plantas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ obtidas a partir de discos de PLBs
cultivados em meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP
sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
) após 90 dias.
Seta = raiz. Barra = 1 cm.
A análise de variância dos dados do experimento mantido 30 dias no escuro e
60 dias sob iluminação revelou que a interação entre as concentrações de BAP e
ANA foi significativa para as variáveis número médio de PLBs formados por disco,
número médio de plantas e altura das plantas, indicando que os fatores não são
independentes (Anexo 8).
Os explantes submetidos aos tratamentos com ANA combinado ou não com
BAP apresentaram comportamentos diferentes com o aumento na concentração de
ANA, os melhores resultados sendo obtidos com 0,5 µM de ANA combinado com
0,5 µM de BAP e 2 µM de ANA sem BAP (Figura 2.5). Já para a variável número
médio de plantas por disco, os melhores resultados foram encontrados no
tratamento com 2 µM de ANA combinada ou não com BAP (Figura 2.6).
43
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,5 1 2 4
Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (µM)
µM)µM)
µM)
Número de PLBs/explante
Número de PLBs/explante
Número de PLBs/explante
Número de PLBs/explante
0 BAP
0,5 BAP
FIGURA 2.5 - Número de PLBs regenerados por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após 30 dias
no escuro e 60 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de
40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem
estatisticamente para as concentrações de ANA e as letras maiúsculas para as
concentrações de BAP ao nível de 95%.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0,5 1 2 4
Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (µM)
µM)µM)
µM)
Número de plantas/explante
Número de plantas/explante
Número de plantas/explante
Número de plantas/explante
0 BAP
0,5 BAP
FIGURA 2.6 - Número de plantas regeneradas por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’
em meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após 30
dias no escuro e 60 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de
40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem
estatisticamente para as concentrações de ANA e as letras maiúsculas para as
concentrações de BAP ao nível de 95%.
cB
aA
cB
bA
aA
cB
bA
bcA
cA
abA
aB
bA
aA
bB
bA
abB
44
Para a variável altura das plantas, os melhores resultados para os
tratamentos combinados a 0,5 µM de BAP, foram os com 0,5; 1 e 2 µM de ANA e
para os tratamentos sem BAP foram os com 0,5 e 2 µM de ANA (Figura 2.7).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0,5 1 2 4
Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (µM)
µM)µM)
µM)
Altura das plantas (cm)
Altura das plantas (cm)
Altura das plantas (cm)
Altura das plantas (cm)
0 BAP
0,5 BAP
FIGURA 2.7 - Altura das plantas regenerados por disco de
Cymbidium
‘Joy Polis’
em meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP após 30
dias no escuro e 60 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de
40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem
estatisticamente para as concentrações de ANA e as letras maiúsculas para as
concentrações de BAP ao nível de 95%.
Para a variável porcentagem de explantes necróticos, somente o fator ANA foi
significativo (Anexo 8), sendo os tratamentos com 2 e 4 µM de ANA os que
apresentaram os piores resultados. A porcentagem de explantes necróticos
apresentou uma tendência a crescer com o aumento na concentração de ANA
(Figura 2.8).
bB
abA
aB
aA
abA
aA
cB
bA
45
0
5
10
15
20
25
30
35
0,5 1 2 4
Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (Concentrações de ANA (
Concentrações de ANA (µM)
µM)µM)
µM)
% de explantes necróticos
% de explantes necróticos
% de explantes necróticos
% de explantes necróticos
FIGURA 2.8 - Porcentagem de explantes necróticos de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
meio de cultura MS acrescido de ANA após 30 dias no escuro e 60 dias sob
iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de 40 µmol.m
-2
.s
-1
). Médias seguidas
pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
Os melhores resultados foram obtidos nos tratamentos com 0,5 µM de ANA
combinado com 0,5 µM de BAP, pois esse tratamento apresentou os maiores
valores de PLBs regenerados por disco e baixa porcentagem de explantes
necróticos (Figura 2.9). Além disso, nesse tratamento, a soma dos números médios
de PLBs e de plantas chega a 8,14 (7,03 + 1,11).
Tanto na cultura mantida sob iluminação como na mantida 30 dias no escuro
e 60 dias sob iluminação, os maiores números de PLBs regenerados por disco de
PLB foram obtidos nos meios contendo 0,5 µM de ANA combinado a 0,5 µM de
BAP. Porém, a cultura mantida 30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação resultou
num maior valor do número de PLBs regenerados por disco que a cultura mantida 90
dias sob iluminação (7,03 e 3,25 respectivamente). Em ambos os experimentos
houve um aumento na porcentagem de explantes necróticos com o aumento na
concentração de ANA.
A
A
B
B
46
FIGURA 2.9 - Plantas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ obtidas a partir de discos de PLBs
cultivados em meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou combinado ao BAP
30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação (fotoperiodo 16 horas e irradiância de 40
µmol.m
-2
.s
-1
) após 90 dias. Seta = raiz. Barra = 1 cm
Os discos de PLBs cultivados sob iluminação apresentaram novos PLBs
formados aos 21 dias, e, aos 30 dias, esses PLBs possuíam região apical
desenvolvida (Figura 2.10A-B). As primeiras raízes são observadas aos 45 dias de
cultura (Figura 2.10C), e aos 60 dias, uma planta com folhas e raiz, além de novos
PLBs, são visualizados (Figura 2.10D). Nos discos de PLBs cultivados no escuro,
após 21 e 30 dias de cultura, formam-se PLBs aclorofilados e massas de células na
periferia do disco (Figura 2.10E-F). Nos discos de PLBs, aos 45 e 60 dias, portanto a
15 e 30 dias sob iluminação, os PLBs tornam-se verdes e a massa de células dá
origem a vários PLBs (Figura 2.10G-H).
47
FIGURA 2.10 – Discos de PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A-H. Discos de PLBs cultivados
em meio de cultura adicionado de 0,5 µM de ANA combinado a 0,5 µM de BAP; A-D
cultivados sob iluminação; E-F. cultivados no escuro; G. sob iluminação a 15 dias; H. sob
iluminação a 30 dias A. e E. 21 dias de cultura; B. e F. 30 dias de cultura; C. e G. 45 dias de
cultura; D. e H. 60 dias de cultura. r = raiz. Seta = coleóptile. Barra = 0,5 cm.
48
Os discos de PLBs mantidos em meio de cultura com 0,5 µM de ANA
combinado a 0,5 µM de BAP sob iluminação, aos nove dias de cultura apresentaram
porções da epiderme e camadas subepidérmicas assumindo características
meristemáticas (Figura 2.11A e B). Aos 12 dias já foi possível observar a formação
de meristema apical caulinar protegido por uma folha com epiderme interna e
externa, mesofilo parenquimático e feixes vasculares, similar ao coleóptile de
embriões zigóticos (Figura 2.11C). Pela similaridade desta com o coleóptile de
embriões zigóticos será definida como tal no presente trabalho. Com 21 dias,
observou-se protuberância desenvolvida ao redor do disco de PLB (Figura 2.11D) e
aos 30 dias essas protuberâncias já estão diferenciadas em novos PLBs que estão
praticamente desconectados do tecido de origem (Figura 2.11E).
Os discos de PLB cultivados no mesmo meio de cultura citado anteriormente,
porém no escuro, aos nove dias, apresentaram várias projeções de células
meristemáticas próximas à epiderme (Figura 2.11F). Essas projeções aumentaram
de volume aos 12 dias de cultura (Figura 2.11G). Aos 21 dias observou-se PLBs
desenvolvidos com meristema apical caulinar protegido pelo coleóptile, e com um
cordão procambial conectado ao disco central. Nesse estádio, o novo PLB inicia sua
separação do disco original através de um estrangulamento na base (Figura 2.11H).
Com 30 dias de cultura, os PLBs formados iniciaram um processo de estiolamento,
tornando-se alongados (Figura 2.11I).
49
FIGURA 2.11 - Secções de PLBs de
Cymbidium
‘Joy Polis’ cultivados em meio de cultura
adicionado de 0,5 µM de ANA combinado a 0,5 µM de BAP. A-E. mantidas sob iluminação.
F-I. mantidas no escuro. A-B,F. aos nove dias de cultura; C,G. aos 12 dias de cultura; D,H.
aos 21 dias de cultura, observar o inicio do estrangulamento na base do novo PLB formado
(seta); E-I. aos 30 dias de cultura. co = coleóptile. cp = cordão procambial. Barra A, C, F e
G= 200 µm. Barra B, D-E, I e H= 400 µm.
50
3.4 DISCUSSÃO
No presente trabalho, a adição de ANA no meio de cultura nas concentrações
de 0,5 a 4 µM induziu a formação direta de PLBs sem a formação de calo. No
entanto, BEGUM et al. (1994), HUAN et al. (2004) e HUAN e TANAKA (2004)
trabalhando com
Cymbidium
, e ISHII et al. (1998) com
Phalaenopsis
, induziram
calos embriogênicos de discos de PLBs com a utilização de ANA e 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4D). ROY e BANERJEE (2003) obtiveram a formação de
calos em meristemas apicais de
Dendrobium fibriatum
Lindl. (Orchidaceae) com a
combinação de ANA e BAP. Para esses autores é evidente que a auxina exógena
combinada a citocinina é o mais importante fitorregulador para a indução de calos
embriogênicos.
NAYAK et al. (2002), utilizando secções transversais de PLBs de
Cymbidium
aloifolium
, obtiveram os melhores resultados de porcentagem de explantes
regenerando novos PLBs (53,71%) e número de PLBs por disco (7,7) em meio de
cultura adicionado de 13,5 µM de ANA. Sendo diferente do obtido no presente
trabalho, no qual a melhor concentração para a formação de PLBs foi de 0,5 µM de
ANA combinado com 0,5 µM de BAP, o que resultou em 92,5% de explantes
regenerando novos PLBs e 7,03 PLBs por disco.
A elevação da concentração de ANA levou a um aumento na porcentagem de
explantes necróticos, chegando a 40% com a adição de 4 µM de ANA (Figura 2.3 e
2.8). Portanto, concentrações mais elevadas (13,5 µM), como a utilizada por NAYAK
et al. (2002), provavelmente elevaria ainda mais a porcentagem de explantes
necróticos de
Cymbidium
‘Joy Polis’.
Os melhores resultados para
Cymbidium
‘Joy Polis’ foram obtidos com ANA
combinado com BAP. O mesmo foi observado por BEGUM et al. (1994), em discos
de PLBs de
Cymbidium
x Thanksgiving ‘Nativity’, em meio de cultura MS adicionado
de 2,7 µM de ANA e 2,2 µM de BAP. Esses autores afirmaram que, nos tratamentos
com ANA isolado (0,54; 2,7 e 5,4 µM), houve um atraso no desenvolvimento dos
PLBs em plantas aos noventa dias de cultura, quando comparados aos outros
tratamentos com ou sem fitorreguladores. No caso de
Spathoglottis plicata
(Orchidaceae), TENG et al. (1997) também observaram que a combinação de ANA e
5
1
BAP, 5,37 e 0,44 µM respectivamente, induziu a formação de novos PLBs em discos
de PLB. No entanto, atrasou o desenvolvimento desses PLBs em plantas
,
fato que
não foi observado no cultivar desse estudo.
Orquídeas necessitam de um balanço de auxinas e/ou citocininas para a
formação de PLBs
in vitro
e posterior desenvolvimento de plantas (ARDITTI e
ERNST, 1993). A combinação, concentração e a relação entre esses hormônios são
muito importantes e variam conforme as espécies (TENG et al., 1997). Em
Spathoglottis plicata,
a razão ANA:BAP mais eficiente foi de 12,2 para a indução de
PLBs (TENG et al., 1997); em
Dendrobium antennatum
(Orchidaceae), a razão foi de
0,42 (KUKULCZANKA e WOJCIECHOWSKA, 1983).
A cultura mantida 30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação resultou num
maior número de PLBs regenerados por disco que a cultura mantida 90 dias sob
iluminação (7,03 e 3,25 respectivamente). A cultura de ápices radiculares de
Clowesia warscewiczii
mantida no escuro foi mais efetiva na formação de PLBs do
que aquela mantida sob iluminação (KERBAUY e ESTELITA, 1996). No entanto,
para a cultura
in vitro
de rizomas de
Cymbidium forrestii
, as culturas mantidas no
escuro apresentaram massa fresca inferior a das culturas mantidas sob iluminação
(PAEK e YEUNG, 1991). Segundo PERES (2002), a manutenção de uma cultura no
escuro, evita a oxidação do explante na fase de estabelecimento, devido à inibição
da ação de uma enzima dependente da luz, envolvida na produção de compostos
fenólicos. Ainda, segundo o autor, a luz afeta a morfogênese de modo mediado por
fotorreceptores como o fitocromo.
O processo de embriogênese somática direta ou indireta em orquídeas está
baseado na formação de PLBs (ARDITTI e ERNST, 1993; BEGUM et al., 1994).
Nesse trabalho foi observada a embriogênese somática direta, sendo os PLBs
desenvolvidos pela proliferação das células das camadas epidérmicas e
subepidérmicas. No início do desenvolvimento dos PLBs forma-se uma conexão
vascular com o tecido de origem por meio de um cordão procambial. Mas com o
crescimento desses PLBs inicia-se o estrangulamento na base, separando-os do
tecido de origem, e culminando em novos PLBs.
ISHII et al. (1998) e HUAN et al. (2004) obtiveram PLBs via embriogênese
indireta em
Phalaenopsis
e
Cymbidium
, respectivamente, e ambos os autores
observaram que os PLBs emergiam do calo sem estabelecer conexão vascular.
52
BEGUM et al. (1994), analisando secções longitudinais de PLBs de
Cymbidium
em meio de cultura MS, adicionado de 2,2 µM de BAP e 0,54 µM de
ANA, observaram que, após sete dias de cultura, ocorria a ruptura da epiderme, mas
que esse fato não estava envolvido na formação dos PLBs. Nesse trabalho, não foi
observada essa ruptura da epiderme no início do desenvolvimento dos PLBs,
somente na base desses quando eles já estavam totalmente desenvolvidos.
O surgimento de raízes nos PLBs é tardia e ocorre no mesmo meio de cultura
inicial, não havendo a necessidade de transferência para meio de cultura livre de
fitorreguladores. Esse surgimento tardio das raízes, após 60 dias de cultura, também
foi observado por PARK et al. (2003) em PLBs regenerados de folhas de
Doritaenopsis
(Orchidaceae).
53
3.5 CONCLUSÃO
O protocolo de regeneração de plantas a partir de discos de PLBs é um
eficiente método para a multiplicação de
Cymbidium
‘Joy Polis’, pois além de formar
novos PLBs, esses produzem plantas com parte aérea e raízes bem desenvolvidas
no mesmo meio de cultura. O tratamento mais indicado é o de 0,5 µM de ANA
combinado a 0,5 µM de BAP mantido 30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação.
Pelas análises anatômicas pode-se observar que os PLBs, originados diretamente
das células das camadas epidérmica e subepidérmicas, apresentam uma folha
(coleóptile) que protege o meristema apical caulinar e conexão vascular com o tecido
de origem. A separação do PLB do disco de origem ocorre a partir da instalação de
uma zona de abscisão. Cada PLB pode dar origem a 16,3 plantas em quatro meses.
54
3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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56
CAPÍTULO III
CAPÍTULO IIICAPÍTULO III
CAPÍTULO III
Multiplicação
Multiplicação Multiplicação
Multiplicação
in vitro
in vitroin vitro
in vitro
de brotações de
de brotações de de brotações de
de brotações de
Cymbidium
CymbidiumCymbidium
Cymbidium
‘Joy Polis’
‘Joy Polis’ ‘Joy Polis’
‘Joy Polis’
(Orchidaceae)
(Orchidaceae)(Orchidaceae)
(Orchidaceae)
57
RESUMO
RESUMORESUMO
RESUMO
O método convencional de propagação vegetativa de orquídeas pela separação de
touceiras é extremamente lento, o que o torna inviável em escala comercial, apesar
de proporcionar uma descendência geneticamente idêntica à planta matriz. A
micropropagação é utilizada para a propagação clonal em grande escala de plantas
comercialmente importantes. As maiores vantagens desta técnica são a
multiplicação rápida e a obtenção de populações homogêneas oriundas de matrizes
melhoradas geneticamente. A multiplicação de orquídeas do gênero
Cymbidium
por
semeadura possui limitações como uma baixa taxa de germinação. Além disso,
plantas híbridas dificilmente produzem sementes ou quando as produzem essas são
na maioria inférteis. O objetivo desse trabalho foi a multiplicação
in vitro
de
brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’. Foram utilizadas brotações apresentando de 3 a
4 folhas e com 0,5 a 1,5 cm de comprimento. O meio de cultura foi o MS adicionado
de 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido indolbutírico (AIB) nas seguintes
concentrações: 0; 2,5; 5; e 10 µM de BAP e as mesmas concentrações de BAP
combinadas com 0,5 µM de AIB. As avaliações foram realizadas após 90 dias,
sendo consideradas as variáveis número de brotações por explante, porcentagem
de crescimento da brotação inicial e comprimento médio das brotações laterais
formadas. Foi possível observar que os tratamentos com 2,5 e 5 µM de BAP
proporcionaram o maior número de brotações por explante, apesar de não diferirem
estatisticamente das outras concentrações, somente do controle. Nos tratamentos
com a adição de fitorreguladores, os explantes liberaram compostos fenólicos no
meio de cultura. Com a elevação da concentração de BAP houve uma redução na
porcentagem de crescimento da brotação inicial e no comprimento médio das
brotações laterais formadas. A concentração mais indicada de BAP para a
multiplicação de brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’ foi a de 2,5 µM, por
proporcionar o maior número de brotações por explante (2,38) e pelo menor custo,
em relação à concentração de 5 µM.
Palavras chave:
Palavras chave: Palavras chave:
Palavras chave: micropropagação, plantas ornamentais, fitorregulador, BAP, AIB
58
ABSTRACT
ABSTRACTABSTRACT
ABSTRACT
The traditional method of vegetative propagation used for orchid by separation of
shoots is slow, and is not recommended at commercial scale, though it furnishes new
plants genetically identical to matrix plant. Micropropagation is used for clonal
propagation of commercially important plants in large scale. The main advantages of
this technique are the fast multiplication and the obtention of homogeneous
population of genetically improved plants. The multiplication of orchid of genus
Cymbidium
by seedling has limitations like low germination rate. Hybrid plants rarely
produce seeds, and if it produces, they are almost all unviable. The objective of this
study was the in vitro multiplication of
Cymbidium
‘Joy Polis’. Shoots with 3 to 4
leaves and 0.5 to 1.5 cm high were used. The culture medium was MS supplemented
with N
6
– benzyladenine (BA) and indole-3-butiric acid (IBA) in the following
concentrations: 0; 2.5, 5 and 10 µM BA and the same BA concentrations with 0.5 µM
IBA. After 90 days, the number of shoots per explant, initial shoot growth percentage
and height of the lateral shoots were evaluated. The treatment with 2.5 and 5 µM of
BA showed the biggest number of shoots per explant, although there was no
significant differences between the treatments, with exception of control. In the
treatments with growth regulators, the explants produced phenolic substances in the
culture medium. With the elevation of BA concentrations the growth percentage of
the initial shoots and the height of the new lateral shoots were reduced, in
comparation with control medium. The best concentration of BA for
Cymbidium
‘Joy
Polis’ shoot multiplication was 2.5 µM, as it showed the highest number of explant
per shoot (2.38) and the lowest cost when compared to 5 µM BA.
Key words:
Key words:Key words:
Key words: micropropagation, ornamental plants, growth regulators, BA, IBA
59
4.1 INTRODUÇÃO
Cymbidium
é um gênero com aproximadamente 50 espécies originárias da
Ásia, mas a maioria das
Cymbidium
cultivadas são híbridos. Muitos desses híbridos
são comercialmente importantes como flor de corte e de vaso (HUAN et al. 2004).
Desde o desenvolvimento do método de germinação assimbiótica de sementes de
orquídeas por KNUDSON (1946), a cultura de tecidos tem sido utilizada para a
propagação em larga escala de um grande número de espécies e de híbridos de
orquídeas (ARDITTI e ERNST, 1993).
Cymbidium
foi o primeiro gênero de orquídea
a ser propagado
in vitro
usando o meristema apical como explante (MOREL, 1960),
e mais recentemente, outros explantes tem sido utilizados, como rizoma (PAEK e
YEUNG, 1991), raiz, folha e pseudobulbo (CHANG e CHANG, 1998), botão floral
(SHIMASAKI e UEMOTO, 1991) e PLBs (BEGUM et al., 1994; NAYAK et al., 2002;
HUAN et al., 2004; HUAN e TANAKA, 2004).
Explantes de
Cymbidium
aloifolium,
quando cultivados em meio MS
suplementado com 9,8 µM de ácido indolbutírico (AIB) apresentaram 85% de
enraizamento em 30 dias (NAYAK et al., 2002). No entanto, para
Cymbidium
kanran,
obteve-se maior porcentagem de enraizamento, em torno de 60%, utilizando 10% de
água de coco (HASEGAWA e GOI, 1987).
A taxa de multiplicação de espécies de
Cymbidium
orientais em condições
naturais é reduzida quando comparada à das orquídeas tropicais e subtropicais;
além disso, a propagação clonal de espécies e híbridos de orquídeas de regiões
temperadas geralmente é mais exigente que a de espécies tropicais (PAEK e
YEUNG, 1991). Desse modo, o objetivo desse trabalho foi desenvolver um método
para a multiplicação
in vitro
de brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’, com o uso de
BAP e AIB.
60
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Laboratório de Micropropagação Vegetal do
Departamento de Botânica, do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Paraná (UFPR).
Brotações apresentando de 3 a 4 folhas e medindo de 0,5 a 1,5 cm de
comprimento, oriundas de PLBs regenerados de meristemas de brotações laterais,
foram isoladas e repicadas para o meio de cultura MS, suplementado com 30 g L
-1
de sacarose e 6 g L
-1
de ágar (Vetec®), com pH ajustado para 5,8 com NaOH ou HCl
a 0,1 N, e esterilizado em autoclave a 121°C por 20 minutos. Os tratamentos
testados foram testemunha (sem fitorregulador) e BAP (2,5; 5 e 10 µM) isolado ou
combinado com AIB (0,5 µM).
As avaliações foram realizadas após 90 dias, sendo consideradas as
seguintes variáveis: número de brotações por explante, porcentagem de crescimento
da brotação inicial e comprimento médio das brotações laterais formadas. O
delineamento experimental foi inteiramente casualizado com sete tratamentos e
quatro repetições de dez explantes cada, totalizando 280 explantes.
Após a avaliação desse experimento, as brotações resultantes foram
transferidas para o meio de cultura MS adicionado de 1 g.L
-1
de carvão ativado.
Foram utilizados frascos com volume de 350 ml, 13 cm de altura e 6 cm de diâmetro
contendo 25 ml de meio de cultura. Em cada frasco foram colocadas cinco plantas.
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância. Inicialmente,
as variâncias dos tratamentos foram avaliadas quanto a sua homogeneidade pelo
teste de Bartlett. As variáveis cujas variâncias mostraram-se homogêneas tiveram as
médias dos tratamentos testadas por meio do teste de F, enquanto que as que
apresentaram heterogeneidade tiveram seus valores transformados para posterior
análise. Quando as médias dos tratamentos foram diferentes estatisticamente, essas
foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
6
1
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em todas as variáveis analisadas foram encontradas diferenças estatísticas
significativas entre as médias; os resultados estão apresentados na Tabela 3.1 e a
análise de variância para as variáveis analisadas nos Anexos 9 a 11. Na variável
número de brotações por explante é possível observar que os tratamentos com 2,5 e
5 µM de BAP proporcionaram os maiores valores e diferiram significativamente do
controle (Tabela 3.1). NAYAK et al. (1997) obtiveram os melhores resultados para a
formação de brotos laterais em brotações de
Cymbidium aloifolium
com a utilização
de 22 µM de BAP sozinho ou combinado a 5,4 µM de ANA. No entanto, para SILVA
(2003), o uso de BAP (0 - 18 µM) não promoveu nenhum efeito para a multiplicação
de
Brassiocattleya
Pastoral x
Laeliocattleya
Amber Glow.
TABELA 3.1 - Resultados de multiplicação de brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’
cultivadas em meio de cultura MS sob diferentes concentrações de
BAP combinado ou não com AIB, após 90 dias.
Concentrações
(µM)
i
BAP AIB
Número de
brotações por
explante
Porcentagem de
crescimento da
brotação inicial
Comprimento
médio das
brotações laterais
0 0 1,00 b 79,90 a ----
2,5 0 2,38 a 63,20 abc 1,42 ab
5 0 2,35 a 37,16 c 1,37 ab
10 0 1,85 ab 47,46 bc 0,75 bc
2,5 0,5 1,85 ab 68,25 ab 1,58 a
5 0,5 1,68 ab 48,19 bc 1,77 a
10 0,5 1,48 ab 46,29 bc 1,15 ab
Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
62
CARVALHO (2002), utilizando plântulas de
Cattleya walkeriana
, sem raízes e
com as folhas reduzidas a 1/3, obteve o melhor resultado de multiplicação sem a
adição de fitorreguladores (3,53 brotações por explante). Para este autor, com o
aumento na concentração de 2,4-D houve a redução na multiplicação e com a
utilização de BAP não houve influência na formação de novas brotações. Porém,
MAURO et al. (1994), utilizando o mesmo tipo de explante de
Cattleya aurantiaca
Rolf, obteve maior número de gemas adventícias utilizando 44,38 µM de BAP e 0,54
µM de ANA. VENTURA (2002), também utilizando o mesmo tipo de explante, definiu
como melhor concentração para a multiplicação de
Brassolaeliocattleya
Sun King
‘Orange’ x
Laelia purpurata
, 5,33 µM de BAP (4,8 brotações por explante).
O aumento na concentração de BAP (Tabela 3.1), quando combinado ou não
com AIB, reduziu a porcentagem de crescimento da brotação inicial e o comprimento
médio das brotações laterais formadas (Figura 3.1A-B). As brotações mais
alongadas são mais desejáveis, pois não será necessário utilizar um meio de cultura
para o alongamento dos explantes, podendo transferi-las diretamente para o meio
de cultura de enraizamento.
Nos tratamentos com fitorreguladores, os explantes liberaram compostos
fenólicos no meio de cultura, alterando a coloração (Figura 3.1A). Resultados
semelhantes foram obtidos com rizomas de
Cymbidium forrestii,
quando cultivados
in vitro
na presença de 22 e 44 µM de BAP, os quais liberaram compostos fenólicos
no meio de cultura, tornando a cor deste de amarelo a marrom (PAEK e YEUNG,
1991). Esses mesmos autores adicionaram carvão ativado no meio de cultura para
evitar a oxidação, porém observaram que houve uma inibição do desenvolvimento
do rizoma e massa fresca.
CHANG e CHANG (2000), utilizando rizomas de
Cymbidium sinense
Willd,
obtiveram maior indução de gemas adventícias (2,5 por explante) utilizando 4,54 µM
de tidiazuron (TDZ). LU et al. (2001), utilizando o mesmo tipo de explante de
Cymbidium ensifoilum
‘Yuh Hwa’, em meio de cultura com 20 µM de BAP, obtiveram
7,3 brotações por explante.
As brotações transferidas para o meio de cultura MS adicionado de 1 g L
-1
de
carvão ativado apresentaram 100% de enraizamento após 30 dias (Figura 3.2A-B),
sem necessidade de adição de auxina. A primeira descrição de utilização de carvão
ativado para o cultivo
in vitro
de orquídeas foi realizada por WERCKMEISTER
63
(1971), o qual observou que raízes de
Cymbidium
cultivadas em meio de cultura
acrescido de carvão ativado cresciam para dentro do meio de cultura,
diferentemente do que ocorria nas cultivadas na ausência do carvão ativado, cujas
raízes se desenvolviam para cima, em direção à luz. Tais características também
foram observadas neste trabalho. Segundo PAN e STADEN (1998), a adição de
carvão ativado no meio de cultura pode promover ou inibir o crescimento
in vitro
,
dependendo do tecido e da espécie utilizada. O carvão ativado promove a
estabilização, o escurecimento e a absorção de substâncias inibidoras, compostos
orgânicos e de fitorreguladores do meio de cultura.
FIGURA 3.1 – A-B. Brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em meio de cultura MS sob
diferentes concentrações de BAP combinado com AIB. T1. sem BAP; T2. 2,5 µM de
BAP; T3. 5 µM de BAP; T4. 10 µM de BAP; T5. 2,5 µM de BAP e 0,5 µM de AIB;
T6. 5 µM de BAP e 0,5 µM de AIB; T7. 10 µM de BAP e 0,5 µM de AIB.
Barra = 2,0 cm.
64
FIGURA 3.2 – A-B. Enraizamento de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em meio de cultura MS
acrescido de carvão ativado, após 30 dias. Barra = 2,0 cm.
4.4 CONCLUSÃO
A multiplicação de
Cymbidium
‘Joy Polis’ utilizando brotações foi possível,
porém, com baixa eficiência nas concentrações de BAP e AIB utilizadas. O melhor
resultado foi obtido com a utilização de 2,5 µM de BAP, o qual diferiu da testemunha.
A adição de carvão ativado foi eficiente para a indução e desenvolvimento de raízes.
65
4.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Growth RegulatGrowth Regulat
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Multiplicação e crescimento in vitro de orquídea Multiplicação e crescimento in vitro de orquídea
Multiplicação e crescimento in vitro de orquídea
Brassiocattleya
BrassiocattleyaBrassiocattleya
Brassiocattleya
Pastoral x
Pastoral x Pastoral x
Pastoral x
Laeliocattleya
LaeliocattleyaLaeliocattleya
Laeliocattleya
Amber Glow
Amber Glow Amber Glow
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Propagação Propagação
Propagação
in vitro
in vitroin vitro
in vitro
de orquíd
de orquíd de orquíd
de orquídeas do grupo
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eas do grupo
Cattleya
CattleyaCattleya
Cattleya.
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67
CAPÍTULO IV
CAPÍTULO IVCAPÍTULO IV
CAPÍTULO IV
Aclimatização em diferentes substratos e morfo
Aclimatização em diferentes substratos e morfoAclimatização em diferentes substratos e morfo
Aclimatização em diferentes substratos e morfo-
--
-anatomia de
anatomia de anatomia de
anatomia de
mudas micropropagadas de
mudas micropropagadas de mudas micropropagadas de
mudas micropropagadas de
Cymbidium
Cymbidium Cymbidium
Cymbidium
‘Joy Polis’
‘Joy Polis’‘Joy Polis’
‘Joy Polis’
68
RESUMO
RESUMORESUMO
RESUMO
As orquídeas do gênero
Cymbidium
estão entre as mais comercializadas em todo o
mundo. Na fase de cultivo
in vitro
as plantas são mantidas em um ambiente com
condições de alta umidade relativa do ar, baixa luminosidade e trocas gasosas
restritas, resultando em baixas taxas de transpiração. Assim, uma das fases mais
críticas da micropropagação é a aclimatização das mudas. Plantas
in vitro
normalmente apresentam baixa taxa de fotossíntese, não possuem estômatos nem
raízes funcionais e sua cutícula é delgada. Portanto, quando essas mudas são
expostas ao meio
ex vitro
, sofrem estresse que pode causar a morte. O objetivo
desse trabalho foi avaliar a capacidade de aclimatização e analisar a estrutura
anatômica de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em diferentes substratos. Plantas
com 4 a 6 folhas apresentando raízes foram removidas do meio de cultura MS e
transferidas para vasos individuais. Foram realizados dez tratamentos com
diferentes substratos e misturas. Para a análise anatômica qualitativa foram
coletadas amostras de folhas e raízes de plantas
in vitro
, aclimatizadas e
ex vitro
(planta matriz). Após 45 dias, não foi observado crescimento em altura nas mudas.
Os diferentes tratamentos propiciaram 100% de sobrevivência das mudas. Os
melhores resultados no ganho de massa fresca foram obtidos nos substratos que
continham fibra de coco em pó sozinha ou combinada a RendMax®, vermiculita e
fibra de coco. As alterações anatômicas nas plantas cultivadas
in vitro
, facilitaram a
aclimatização das mudas, visto que a sobrevivência dessas foi de 100% em todos os
substratos testados. O substrato mais indicado para a aclimatização das mudas foi a
fibra de coco em pó combinada com fibra de coco, devido a seu baixo custo e
eficiência.
Palavras chave: Orchidaceae, orquídea, micropropagação, morfologia, fibra de coco
69
ABSTRACT
ABSTRACTABSTRACT
ABSTRACT
Cymbidium
orchids are among the most commercialized plants in the world. During
in
vitro
culture the plants are kept under conditions of hight relative humidity, low
luminosity and reduced gas exchange, resulting in low rates of transpiration. One of
the most critical points of micropropagation is acclimatization.
In vitro
plants normally
have low photosynthesis rate, don’t have functional stomata and roots, and their
cuticle is reduced. So, when these plants are exposed to
ex vitro
conditions they
suffer stress, which can induce mortality. The purpose of this study was to investigate
the acclimatization capacity and the anatomical structure of
Cymbidium
‘Joy Polis’ in
different substrates. Plants with 4 to 6 leaves and roots were removed from MS
medium and transferred to individual pots. Ten treatments were tested with different
substrates and mixtures. For qualitative anatomical analyses root and leaf samples of
the
in vitro
, acclimatized and
ex vitro
plants (matrix) were collected. After 45 days, no
differences in the shoot size were observed. The different treatments gave 100% of
survival. The best results in mass profit were obtained in the treatment with coconut
powder or in a mixture with RendMax®, vermiculite and coconut fiber. The
anatomical changes in
in vitro
plants made easier plant acclimatization. The most
indicated substrate for plant acclimatization is coconut powder in a mixture with
coconut fiber, given its low cost and efficiency.
Key words:
Key words: Key words:
Key words: Orchidaceae, orchid, micropropagation, morphology, coconut fiber
70
5.1 INTRODUÇÃO
As orquídeas do gênero
Cymbidium
Hort. estão entre as orquídeas
comercialmente mais importantes no mundo, sendo esse gênero muito popular no
Japão (BEGUM et al., 1994). Esse gênero é constituído de numerosas espécies e
plantas híbridas originadas a partir de trabalhos de melhoramento genético
(LORENZI e SOUZA, 2001).
Plantas micropropagadas, quando em ambiente
in vitro
, crescem em
condições de alta umidade relativa do ar, baixa luminosidade e trocas gasosas
restritas, resultando em baixas taxas de transpiração e fotossíntese (SHACKEL et
al., 1990). Aclimatização é a adaptação de um organismo a um novo ambiente
(COSTA, 1998). Durante o processo de aclimatização das plantas crescidas
in vitro
em casa-de-vegetação, ocorrem mudanças morfológicas, anatômicas e fisiológicas,
tornando-as capazes de crescer nesse novo ambiente (SUTTER et al., 1992). Esse
processo pode causar estresse para as plantas, sendo um fator limitante no
processo da micropropagação (SUTTER, 1988). Em angiospermas, a cutícula
delgada, os estômatos não funcionais e o parênquima paliçádico pouco
desenvolvido são citados como a principal causa da mortalidade de plantas
transferidas de um ambiente
in vitro
para um
ex vitro
(BRAINERD e FUCHIGAMI,
1982; DHAWAN e BHOJWANI, 1987; REUTHER, 1988; DÍAZ-PÉREZ et al., 1995).
Os estômatos das plantas
in vitro
podem se apresentar levemente projetados
e abertos, com diferentes tamanhos e formatos e não uniformemente distribuídos
(DONNELY e VIDAVER, 1984; JOHANSSON et al., 1992). Também pode haver
redução no número de elementos condutores, como registrado por ALBARELLO et
al. (2001) em
Rollinea mucosa
. Essas alterações anatômicas nas plantas cultivadas
in vitro
podem inviabilizar a aclimatização das mesmas (ALBARELLO et al., 2001).
De acordo com RODRIGUES et al. (2005), o sucesso na aclimatização de
plantas micropropagadas depende da seleção de um substrato adequado, pois ele
tem efeito direto na sobrevivência das plantas. Diferentes autores citam a vermiculita
como um substrato não eficiente para aclimatização (HOFFMANN et al., 2001;
SILVA et al., 2003; RODRIGUES et al., 2005). No entanto, para outros autores a
vermiculita pura ou em mistura foi o melhor substrato durante o cultivo (FARIA et al.,
2001).
71
Segundo DEMATTÊ e DEMATTÊ (1996), o cultivo de orquídeas pode ser
realizado em diferentes substratos, geralmente de origem vegetal ou mineral e até
mesmo sintéticos. O substrato adequado para o cultivo de orquídeas deve ter
consistência para o suporte da planta, boa aeração para as raízes e capacidade de
retenção de água (SILVA e SILVA, 1997). A maioria das orquídeas sobrevive a
longos períodos de estiagem, mas não suporta substrato com drenagem deficiente
(BATCHELOR, 1981).
O xaxim, formado pelas raízes adventícias de algumas samambaias das
famílias Dicksoniaceae e Cyatheaceae, era o substrato mais apreciado pelos
orquidófilos e colecionadores de todo o mundo. Porém, no Brasil, o xaxim encontra-
se em processo de extinção devido ao extrativismo, apesar das leis que o protegem.
Desse modo, torna-se importante à busca por substratos equivalentes que possam
substituir o xaxim (DEMATTÊ e DEMATTÊ, 1996).
A escolha adequada de um substrato deve levar em conta fatores de ordem
econômica, química e física do material. Entre os fatores de ordem econômica está o
custo, a disponibilidade, a qualidade e a facilidade de manuseio (WENDLING e
GATTO, 2002). Por exemplo, a fibra da casca de coco é adequada para o uso como
substrato por sua facilidade de produção, baixo custo e alta disponibilidade
(CARRIJO et al., 2002). Além disso, a fibra de coco verde apresenta propriedades
físico-químicas desejáveis, como por exemplo: porosidade total de 95,6%;
capacidade de aeração de 45,5% e água facilmente assimilável (19,8%). Um
substrato ideal deve possuir porosidade acima de 85%, capacidade de aeração
entre 10 e 30% e água facilmente assimilável de 20
a 30%. Portanto, as
propriedades da fibra de coco conferem ao seu substrato características de boa
qualidade, além de possuir grande durabilidade.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar diferentes substratos na
aclimatização de mudas micropropagadas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ e analisar a
estrutura anatômica destas.
72
5.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado em casa-de-vegetação do Departamento de
Fitotecnia e Fitossanitarismo, Setor de Ciências Agrárias, (25º25’40S, 49º16’23W)
da Universidade Federal do Paraná (UFPR). E a análise anatômica no Laboratório
de Botânica Estrutural do Departamento de Botânica, do Setor de Ciências
Biológicas da UFPR.
5.2.1 Material
O material vegetal utilizado foi híbridos de
Cymbidium
‘Joy Polis’, obtidos de
brotações laterais de 5 a 7 cm de comprimento da planta adulta, dos quais foram
retirados meristemas das gemas laterais. Os meristemas foram cultivados em meio
MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), suplementado com 30 g L
-1
de sacarose e 6 g
L
-1
de ágar (Vetec®), com pH ajustado para 5,8, com NaOH ou HCl a 0,1 N, e
esterilizado em autoclave a 121°C por 20 minutos. As plantas regeneradas foram
multiplicadas em meio MS a fim de se obter um número suficiente de plantas para o
experimento.
Mudas com 4 a 6 folhas, de 2 a 3 cm de comprimento, apresentando raízes,
foram removidas do meio de cultura, lavadas com água para retirar o restante do
meio de cultura e transferidas para vasos individuais com 5,5 cm de diâmetro e 4 cm
de altura (Figura 4.1).
5.2.2 Substratos
Foram realizados dez tratamentos com os seguintes substratos:
1- Fibra de coco em pó
2- Fibra de coco em pó + RendMax® (para orquídeas e bromélias) (proporção 1:1)
3- Fibra de coco em pó + vermiculita (proporção 1:1)
4- Fibra de coco em pó+ fibra de coco (proporção 1:1)
73
5- Fibra de coco
6- Vermiculita
7- Vermiculita + RendMax® (para orquídeas e bromélias) (proporção 1:1)
8- RendMax® (para orquídeas e bromélias)
9- PlantMax® (para hortaliças)
10- Casca de pinus (fina)
FIGURA 4.1: Diferentes substratos utilizados para a aclimatização de mudas
micropropagadas de
Cymbidium
‘Joy Polis’. Barra: 4 cm.
74
As mudas ficaram em casa-de-vegetação com nebulização intermitente por
cinco dias e, após esse período, com regas manuais conforme a necessidade,
durante os meses de julho a setembro de 2004. Após 45 dias foram avaliadas a
porcentagem de sobrevivência das mudas, de crescimento em altura e de ganho na
massa fresca, o número de raízes novas formadas e o comprimento das três
maiores raízes novas formadas.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado sendo testados dez
tratamentos com quatro repetições de dez explantes cada, totalizando 400 plantas.
As condições mínima e máxima de temperatura e umidade da casa-de-vegetação
foram 11,16 e 25,17 °C e 53,97 e 99%, respectivamente (Anexo 12).
A composição e o pH dos substratos analisados no Laboratório de Análise de
Solos do Departamento de Solos e Engenharia Agrícola do Setor de Ciências
Agrárias, UFPR, estão indicadas na Tabela 4.1.
5.2.3 Análise anatômica
Para a análise anatômica qualitativa, foram coletadas amostras de folhas e
raízes de plantas
in vitro
, aclimatizadas e
ex vitro
(planta matriz), as quais foram
fixadas em FAA 70 (JOHANSEN, 1940). Esses materiais foram destinados à
preparação de lâminas permanentes, sendo incluídos em meta-acrilatoglicol
(historresina-Leica), segundo a técnica de FEDER e O’BRIEN (1968) e as indicações
do fabricante. Os blocos foram seccionados em micrótomo de rotação, e os cortes
foram obtidos com 7 µm de espessura e corados com azul de toluidina (FEDER e
O’BRIEN, 1968). As lâminas foram montadas com resina sintética (Permalte). As
fotomicrografias foram realizadas em microscópio Zeiss com câmera digital Sony
Cyber-shot P200 acoplada. Foi realizado teste microquímico com o reagente lugol,
para a detecção de amido nos ápices de raiz.
Para a análise da superfície epidérmica das folhas e raiz em microscopia
eletrônica de varredura (MEV), o material botânico foi fixado em FAA 70
(JOHANSEN, 1940), desidratado em série alcoólico etílica, e posteriormente pelo
método do ponto crítico com CO
2
no aparelho Bal-Tec CPD 030. Após o ponto
crítico, o material foi colado em suportes metálicos e metalizado com ouro, a
75
vácuo, no equipamento Balzers union FL 9496 SCD 030. A análise e o registro
eletromicrográfico foram realizados com Microscópio Eletrônico de Varredura Jeol
(JSM 6360 LV), no Centro de Microscopia eletrônica da UFPR.
TABELA 4.1 - Caracterização dos diferentes substratos e misturas pela análise
química.
Substratos
pH
Al
+3
H
+
+Al
+3
Ca
+2
Mg
+2
K
+
CTC*
P C V*
CaCl
2
SMP*
......................Cmol
c
/dm
3
...........................
..Mg/dm
3
..
%
Fibra de coco em
pó
4,9 6,4 0,5 3,5 4,2 0,8 1,84
10,3
289 86 66
Fibra de coco em
pó + RendMax®
4,6 5,8 0,23
6,0 4,8 2,3 1,3 14,4
133 108
58
Fibra de coco em
pó + vermiculita
5,7 6,9 0,0 2,5 3,8 4,8 0,98
12,1
149 49 79
Fibra de coco em
pó + fibra de coco
4,9 6,5 0,2 3,2 3,4 0,7 0,94
8,24
90,9
59 61
Fibra de coco 3,9 6,5 0,4 3,2 0,9 0,7 3,45
8,25
7,9 76 61
Vermiculita 6,2 7,2 0,0 2,0 0,9 8,1 0,13
11,1
1,6 0,9
82
Vermiculita +
RendMax®
4,3 5,4 0,4 8,5 4,2 4,4 0,51
17,6
19,6
77 52
RendMax® 4,0 4,8 0,7 14,4 5,4 3,0 0,81
23,6
52,5
185
39
PlantMax® 4,2 5,0 0,4 24,5 17,4 7,2 1,06
50,2
458 158
51
Casca de pinus 3,7 4,9 1,0 13,2 2,6 1,6 0,69
18,1
45,5
123
27
*CTC = Capacidade de troca de cátions. V = Saturação por bases. SMP = Shoemaker, Maclean e Pratt (solução tampão)
76
5.3 RESULTADOS
5.3.1 Análise quantitativa das mudas
A sobrevivência das mudas foi de 100% para todos os tratamentos durante os
45 dias do experimento. No entanto, não foi observado incremento em altura das
mudas em nenhum dos tratamentos durante esse mesmo período.
Os resultados de porcentagem de ganho na massa fresca, número de raízes
novas formadas e comprimento das três maiores raízes novas formadas estão
apresentados nas Figuras 4.2 a 4.4 e as análises de variância para as variáveis
analisadas nos Anexos 13 a 15.
As maiores porcentagens de ganho de massa fresca foram obtidas nos
substratos que possuíam fibra de coco em pó isolado ou combinado a outros
substratos (Figura 4.2). Para a variável número de raízes novas formadas, o melhor
resultado foi obtido no tratamento com os substratos fibra de coco em pó + fibra de
coco, seguido pelos substratos fibra de coco, Rendmax® e casca de pinus (Figura
4.3).
77
0
20
40
60
80
100
120
140
fibra de coco em pó
fibra de coco em
pó+Rendmax®
fibra de coco em
pó+vermiculita
fibra de coco em
pó+fibra de coco
fibra de coco
vermiculita
vermiculita+Rendmax®
Rendmax®
Plantmax®
casca de pinus
Tratamentos
TratamentosTratamentos
Tratamentos
% de ganho na massa fresca
% de ganho na massa fresca
% de ganho na massa fresca
% de ganho na massa fresca
FIGURA 4.2 - Porcentagem de ganho na massa fresca de mudas de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ em diferentes substratos após 45 dias. Médias seguidas pela mesma letra não
diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
a
bc
a
a
a
b
b
c
c
b
78
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
fibra de coco em pó
fibra de coco em
pó+Rendmax®
fibra de coco em
pó+vermiculita
fibra de coco em
pó+fibra de coco
fibra de coco
vermiculita
vermiculita+Rendmax®
Rendmax®
Plantmax®
casca de pinus
Tratamentos
TratamentosTratamentos
Tratamentos
Número de raízes
Número de raízes
Número de raízes
Número de raízes
FIGURA 4.3 - Número médio de raízes de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
diferentes substratos após 45 dias. Médias seguidas pela mesma letra não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
O melhor resultado para o comprimento das três maiores raízes novas
formadas foi obtido com o substrato fibra de coco em pó + fibra de coco (Figura 4.4).
Dessa forma, os substratos mais indicados para a aclimatização de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’, nessas condições experimentais, foram os com fibra de coco
em pó isolado ou combinado a Rendmax®, vermiculita ou fibra de coco, sendo o
substrato fibra de coco em pó + fibra de coco o mais indicado por ser
significativamente superior aos demais substratos nas variáveis analisadas (Figura
4.5).
bc
ab
c
c
ab
abc
ab
bc
c
a
79
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
fibra de coco em pó
fibra de coco em
pó+Rendmax®
fibra de coco em
pó+vermiculita
fibra de coco em
pó+fibra de coco
fibra de coco
vermiculita
vermiculita+Rendmax®
Rendmax®
Plantmax®
casca de pinus
Tratamentos
TratamentosTratamentos
Tratamentos
Comprimento das 3 maiores raízes
Comprimento das 3 maiores raízes
Comprimento das 3 maiores raízes
Comprimento das 3 maiores raízes
FIGURA 4.4 - Comprimento das 3 maiores raízes de mudas de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ em diferentes substratos após 45 dias. Médias seguidas pela mesma letra não
diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
b
b
a
d
cd
bc
d
b
bc
cd
80
FIGURA 4.5 - Detalhe das mudas micropropagadas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ após
45 dias da aclimatização nos diferentes substratos. Barra = 3 cm.
81
5.3.2 Resultados da análise anatômica
Na raiz da planta cultivada
ex vitro
, é possível observar a ausência de pêlos
absorventes (Figura 4.6A). Ao contrário, a planta cultivada
in vitro
apresenta grande
quantidade de pêlos absorventes (Figura 4.6B). Nas plantas aclimatizadas, os pêlos
absorventes ocorrem em grupos dispersos (Figura 4.6C).
As raízes das plantas cultivadas
in vitro
apresentam geotropismo negativo,
mas durante a aclimatização essas tornam a crescer normalmente. Testes com lugol
foram realizados para tentar evidenciar a presença de amido nas raízes das plantas
ex vitro
e aclimatizadas. Porém, não foi identificada a presença de amido em
nenhuma das plantas.
O ápice da raiz da planta
ex vitro
, em secção longitudinal, apresenta na região
do promeristema células iniciais comuns, não sendo distinguíveis camadas distintas
(Figura 4.7A). O formato do ápice de raiz da planta
ex vitro
é obtuso enquanto o
in
vitro
é mais agudo (Figura 4.7A-B). Na planta
in vitro
as camadas meristemáticas
apresentam células menos densas (Figura 4.7B). Já nas plantas aclimatizadas
(Figura 4.7C), o meristema apical e a coifa se assemelham a raízes da planta
ex
vitro
. No meristema fundamental das plantas cultivadas nos três ambientes ocorrem
idioblastos contendo ráfides, estando em maior concentração na planta
in vitro
(Figura 4.7A-C).
A raiz da planta matriz em corte transversal tem características típicas da
família Orchidaceae, como velame, córtex com exoderme e endoderme bem
definidas e cilindro vascular poliarco. O velame das raízes das plantas
ex vitro
, é
constituído por nove camadas de células. A exoderme possui células com parede
periclinal externa e anticlinais espessadas, alternadas com células de passagem. O
parênquima cortical é constituído de 14 a 16 camadas de células alongadas (Figura
4.8A), e a endoderme é unisseriada com células com espessamento em O nas
regiões próximas ao floema alternadas com células de passagem de paredes
delgadas próximos ao xilema. O periciclo também apresenta porções com células de
parede espessada próxima ao floema e de parede delgada próxima ao xilema. O
cilindro vascular é composto de 15 pólos floemáticos e xilemáticos, e medula
parenquimática com células de paredes delgadas. O floema é totalmente envolvido
por células de paredes espessadas (Figura 4.8B).
82
FIGURA 4.6 - Vista geral de um segmento da raiz de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
diferentes ambientes de cultivo. A. Planta cultivada no ambiente
ex vitro,
B.
Planta
cultivada no ambiente
in vitro
, C. Planta aclimatizada. Barra A-C: 500 µm.
83
FIGURA 4.7 - Secções longitudinais do ápice de raiz de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A.
Planta cultivada no ambiente
ex vitro,
B.
Planta cultivada no ambiente
in vitro
, C.
Planta aclimatizada. co = coifa. mf = meristema fundamental. pc = procâmbio.
pm = promeristema. pt = protoderme. seta = idioblastos com ráfides. Barra: 100 µm.
84
FIGURA 4.8 - Secções transversais da raiz de
Cymbidium
‘Joy Polis’. A e B. Planta
cultivada no ambiente
ex vitro,
C e D.
Planta cultivada no ambiente
in vitro
, E e F.
Planta aclimatizada. c = córtex. cv = cilindro vascular. ex = exoderme. en =
endoderme. fl = floema. m = medula. x = xilema. v = velame. Barra A, C e E: 300 µm.
Barra B, D e F: 200 µm.
85
Nas plantas cultivadas
in vitro
, a raiz em secção transversal, possui diâmetro
reduzido. O velame passa a apresentar somente duas a três camadas e a exoderme
e endoderme apresentam células com paredes pouco espessadas (Figura 4.8C-D).
O cilindro vascular é muito reduzido com cinco pólos de floema e xilema envolvidos
por células de paredes finas (Figura 4.8D).
As raízes das plantas aclimatizadas ainda apresentam velame com três a
quatro camadas de células, mas as células da exoderme voltam a ter formato
semelhante às plantas
ex vitro
e há espessamento na parede periclinal externa
(Figura 4.8E). A endoderme não apresenta células de parede espessada como nas
plantas
ex vitro
, somente células com leve espessamento de parede nas células
próximas ao floema O cilindro vascular é ainda reduzido com sete pólos de floema e
xilema, e o floema é envolvido por células de paredes delgadas (Figura 4.8F).
As folhas da planta
ex vitro
apresentam, na epiderme da face abaxial,
estômatos levemente abaixo da linha das outras células epidérmicas e com os poros
alinhados paralelamente com o maior eixo da folha (Figuras 4.9A-B). No entanto, os
estômatos das plantas
in vitro
são levemente projetados acima da epiderme, e o
poro, aparentemente, possui maior abertura (Figuras 4.9C-D). Nas plantas
aclimatizadas, a abertura do poro é relativamente grande, mas os estômatos já
retornam a posição levemente abaixo da linha das outras células epidérmicas
(Figuras 4.9E-F).
Em secção transversal, as folhas das plantas nos três ambientes, apresentam
células epidérmicas da face adaxial maiores que as da face abaxial. Como o
observado em vista frontal, os estômatos ocorrem em posição ligeiramente
aprofundada nas folhas das plantas
ex vitro
(Figura 4.10A-B) e abertos e projetados
acima das células epidérmicas nas folhas das plantas
in vitro
(Figura 4.10C-D). A
cutícula é mais espessa nas plantas
ex vitro
, muito delgada nas plantas
in vitro
e de
espessura média nas plantas aclimatizadas (Figura 4.10B, D e F). O mesofilo é
homogêneo com células arredondadas e de maior tamanho na região central em
todos os ambientes. Feixes de fibras estão dispostos próximos às faces adaxial e
abaxial ao longo de toda a folha das plantas
ex vitro
(Figura 4.10A-B). Nas plantas
in
vitro
e aclimatizadas
,
as folhas são mais delgadas e possuem feixes de fibras menos
evidentes e com paredes mais delgadas. O mesofilo das plantas
ex vitro
possuem
86
células com conteúdo celular mais denso, provavelmente pela maior quantidade de
cloroplastos e compostos fenólicos (Figura 4.10E-F).
Na região da nervura central das folhas das plantas
ex vitro
ocorre uma
proeminência na face abaxial com feixe vascular de grande porte do tipo colateral,
sendo o floema totalmente envolvido por fibras (Figura 4.10A). Já nas folhas das
plantas
in vitro,
o feixe vascular da nervura central é pouco desenvolvido, com uma
menor proporção de fibras ao redor do floema (Figura 4.10C), quando comparado a
folhas
ex vitro
. Nas folhas das plantas aclimatizadas, a nervura central é mais
proeminente que nas plantas
ex vitro
e
in vitro
. O feixe vascular nessa região ainda é
menos desenvolvido que nas folhas das plantas
ex vitro
, mas apresenta mais feixes
de fibras dispersos que nas plantas
in vitro
. No mesofilo de todas as plantas são
observados idioblastos contendo ráfides (Figura 4.10E-F).
87
FIGURA 4.9 - Vista frontal da epiderme abaxial de folhas de
Cymbidium
‘Joy Polis’
em diferentes ambientes de cultivo. A e B. Planta cultivada no ambiente
ex vitro,
C e
D.
Planta cultivada no ambiente
in vitro
, E e F. Planta aclimatizada. Barra A, C e E:
2500 µm. Barra B, D e F: 50 µm.
88
FIGURA 4.10 - Secções transversais da nervura e do limbo de
Cymbidium
‘Joy
Polis’. A e B. Planta cultivada no ambiente
ex vitro,
C e D.
Planta cultivada no
ambiente
in vitro
, E e F. Planta aclimatizada. B, D e F. Observar detalhe da epiderme
de ambas as faces. fi = fibras. ra = idioblatos com ráfides Barra: 200 µm. Barra
detalhe da epiderme: 25 µm.
89
5.4 DISCUSSÃO
Os melhores resultados obtidos no substrato fibra de coco em pó puro ou em
mistura pode estar relacionado ao pH e ao teor de potássio (Tabela 4.1). Segundo
KÄMPF (2000), o pH (CaCl
2
) ideal para o gênero
Cymbidium
é de 5,0 a 6,0. PAN et
al. (1997) citam a alta demanda de
Cymbidium
por potássio, o qual é encontrado,
dentre os substratos utilizados, em maior concentração na fibra de coco em pó e na
fibra de coco (Tabela 4.1).
Outro fator que pode ter contribuído para os resultados, foi os valores mais
elevados da saturação por bases dos substratos vermiculita (82%), fibra de coco em
pó + vermiculita (79%) e fibra de coco em pó (66%) (Tabela 4.1). De acordo com
MALAVOLTA (1992), a saturação por bases é a proporção de capacidade de troca
de cátions CTC ocupada por bases trocáveis, que são potássio, cálcio, magnésio e
sódio. Baixa porcentagem de saturação por bases significa predominância de
hidrogênio e alumínio no complexo de troca. Segundo SERRAT et al. (2002), para
que o substrato seja considerado fértil, deve apresentar valores acima de 50% na
saturação por bases, como foi observado nos substratos que continham fibra de
coco em pó puro ou em mistura. Segundo COLOMBO (2004), a fibra de coco em pó
também foi indicada para a aclimatização de mudas de
Cattleya chocolate drop
x (
C.
guttata
x
L. tenebrosa
).
Apesar de o substrato Plantmax® ter apresentado um dos maiores valores de
CTC e elevados teores de fósforo, cálcio, magnésio e carbono (Tabela 4.1), ele não
foi adequado para aclimatização de mudas dessa cultivar (Figuras 4.2 e 4.3).
KÄMPF (2000), afirma, que quanto menor o tamanho das partículas, maior será o
valor da CTC. O autor ainda indica que substratos com alta CTC, porém com alta
retenção de água e baixo espaço de aeração, devem ter participação limitada como
substrato, principalmente para orquídeas que necessitam de 20 a 30% de espaço de
aeração no substrato.
Os teores mais elevados de fósforo foram observados nos substratos que
continham fibra de coco em pó puro ou em mistura e Plantmax®. De acordo com
MALAVOLTA et al. (1974), o fósforo desempenha papel fundamental na respiração,
90
seja no deslocamento inicial da glicose, seja no armazenamento, na transferência e
na utilização da energia gerada no processo.
DEMATTÊ e DEMATTÊ (1996) afirmam que o substrato recomendado para
substituir o xaxim, no cultivo de orquídeas epífitas, é a fibra de coco pura ou em
mistura com carvão vegetal. Já, para ASSIS (2004), o substrato adequado para o
cultivo de
Dendrobium nobile
Lindl. foi a mistura de fibra de coco em pó com coco
em cubos. SOUZA e JASMIM (2004) e SILVEIRA et al. (2002), concluiram que a
utilização da fibra de coco pura ou em misturas pode reduzir os custos de produção,
quando comparada com a utilização de substratos comerciais, sem prejudicar o
crescimento das plantas.
Na literatura também são citados outros substratos e misturas para o cultivo
de orquídeas, como vermiculita associada ao carvão para espécies nativas do Brasil,
Oncidium sarcodes e Shomburgkia crispa
(MORAES et al., 2002), vermiculita mais
carvão e vermiculita mais casca de arroz carbonizada para
Maxillaria pictea
e
vermiculita para
Oncidium baueri
(FARIA et al., 2001).
O velame presente nas raízes das orquídeas é capaz de absorver água e sais
minerais, reduzir a transpiração e oferecer proteção mecânica (PRIDGEON, 1982).
O número de camadas de células no velame e no córtex varia conforme a espécie
(SILVA e MILANEZE-GUTIERRE, 2004). No presente trabalho, o número de
camadas do velame variou conforme o ambiente de cultivo. Plantas
in vitro
apresentaram drástica redução no número de camadas de células do velame,
provavelmente devido à alta umidade relativa dentro do frasco.
Provavelmente devido a essa estrutura anatômica das raízes
in vitro
, nas
plantas aclimatizadas novas raízes se formam e as raízes formadas
in vitro
cessam
o crescimento, sendo provavelmente pouco eficientes. Concordando com o
observado por PIERIK (1990), que afirmou que as raízes produzidas
in vitro
são
fracas e pouco funcionais.
A disposição alinhada dos estômatos também foi registrada por SILVA e
MILANEZE-GUTIERRE (2004) em
Cattleya walkeriana
. A presença de estômatos
apenas na face da epiderme abaxial é muito comum para a família Orchidaceae
(PRIDGEON, 1982; OLIVEIRA e SAJO, 1999; SILVA e MILANEZE-GUTIERRE,
2004).
91
De acordo com ESAU (1977), o crescimento e a organização da lâmina foliar
sofrem grande influência de fatores ambientais como a temperatura, a intensidade
luminosa e a disponibilidade de água. A plasticidade fenotípica, que é uma
propriedade do genótipo, é a capacidade da planta de alterar seu desenvolvimento
em resposta à mudança ambiental. Alterações fenotípicas relacionadas à limitação
de recurso representam uma resposta às condições adversas e podem ser uma
vantagem para o organismo (WELLS e PIGLIUCCI, 2000). Plantas anfíbias
apresentam plasticidade fenotípica que permite a sobrevivência destas tanto
estando submersas como emersas (SCULTHORPE, 1967). Segundo WELLS e
PIGLIUCCI (2000), as folhas destas plantas, quando submersas, apresentam
redução do sistema vascular e da espessura do mesofilo e da cutícula se
comparadas às folhas das plantas emersas.
Na cultura
in vitro,
as plantas estão submetidas a um ambiente com elevada
umidade relativa e baixa intensidade luminosa. Estas condições ambientais levaram
a alterações morfo-anatômicas nas plantas de
Cymbidium
‘Joy Polis’. Houve
diferença na deposição de cutícula em ambas as faces da epiderme das folhas nas
plantas
ex vitro, in vitro
e aclimatizadas. Similarmente, em
Liquidambar styraciflua
L.,
a cutícula foi reduzida nas plantas
in vitro
, quando comparada às plantas
ex vitro
(WETZSTEIN e SOMMER, 1982). Para POSPÍŠILOVÁ et al. (1999), as alterações
mais importantes nas plantas durante a aclimatização são o desenvolvimento da
cutícula e de estômatos funcionais.
Estômatos levemente projetados e abertos como os observados nas folhas
das plantas cultivadas
in vitro
, também ocorreram em cultura de
Rubus idaeus
(DONNELY e VIDAVER, 1984). Durante a aclimatização, os estômatos das folhas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ retornaram à posição levemente abaixo das células
epidérmicas, o que é característico em ambientes com menor grau de umidade.
JOHANSSON et al. (1992) verificaram a mesma alteração em plantas de Rosa
cultivadas
in vitro
. Essa característica provavelmente se deve à maior umidade do
ambiente
in vitro
, o que também é registrado em plantas aquáticas (SCULTHORPE,
1967; BONA, 1999).
Os feixes vasculares observados nas folhas são colaterais com fibras
envolvendo o floema. O mesmo foi observado em várias espécies por PRIDGEON
(1982), OLIVEIRA e SAJO (1999) e SILVA e MILANEZE-GUTIERRE (2004). Feixes
92
de fibras dispersos no mesofilo também foram encontrados em espécies com folhas
coriáceas, porém não observadas em orquídeas de folhas membranáceas, o que
difere do observado nesse trabalho para
Cymbidium
, no qual as folhas são
membranáceas com a presença de feixes de fibras no mesofilo.
Os feixes vasculares das plantas cultivadas
in vitro
e aclimatizadas
apresentaram-se mais reduzidos que os das plantas
ex vitro
. Essa característica
também foi registrada em folhas de
Rollinea mucosa
, nas quais o sistema vascular
apresentou um reduzido número de elementos condutores (ALBARELLO et al.,
2001). Segundo esses autores, apesar dessa alteração nas plantas
in vitro
, elas são
aptas a passar pelo processo de aclimatização. A redução do tecido vascular,
especialmente o xilema, é uma característica típica de plantas de ambientes úmidos
(SCULTHORPE, 1967).
Algumas dicotiledôneas, como o
Liquidambar styraciflua
L., quando cultivadas
in vitro,
deixam de apresentar diferenciação entre os parênquimas paliçádico e
lacunoso (WETZSTEIN e SOMMER, 1982). Em
Rollinea mucosa,
essa organização
é mantida, fato que, segundo os autores, favorece a fase de aclimatização
(ALBARELLO et al., 2001), já que essa etapa não foi alcançada no caso de
Liquidambar styraciflua
. Em
Cymbidium
‘Joy Polis’ o parênquima é homogêneo, mas
foi possível observar uma redução na espessura do limbo.
A estrutura anatômica das plantas aclimatizadas de
Cymbidium
‘Joy Polis’
possui mais características semelhantes a da planta
ex vitro
(matriz), demonstrando
a capacidade de adaptação desta planta ao novo ambiente. Segundo POSPÍŠILOVÁ
et al. (1999), as alterações morfo-anatômicas e fisiológicas das plantas cultivadas
in
vitro
podem ser revertidas durante a aclimatização, sendo que algumas espécies
necessitam de uma mudança gradual das condições ambientais.
93
5.5 CONCLUSÃO
O substrato mais indicado para a aclimatização de mudas de
Cymbidium
‘Joy
Polis’, nessas condições experimentais, foi a fibra de coco em pó + fibra de coco, por
apresentar bons resultados de ganho de massa fresca e pelo seu baixo custo. Pelas
alterações anatômicas observadas, as plantas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ possuem
grande capacidade de adaptação ao ambiente, sendo provavelmente este um dos
fatores responsáveis pela sobrevivência das mudas durante a aclimatização.
94
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morfomorfo
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anatômicas dos órgãos vegetativos de
Bacopa
Bacopa Bacopa
Bacopa
salzmanii
salzmaniisalzmanii
salzmanii
(Benth.)
(Benth.) (Benth.)
(Benth.) Wettst. ex Edwall e
Wettst. ex Edwall e Wettst. ex Edwall e
Wettst. ex Edwall e
Bacopa monnierioides
Bacopa monnierioidesBacopa monnierioides
Bacopa monnierioides
(Chom.)
(Chom.) (Chom.)
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98
CONSIDERAÇÕES FINAIS
CONSIDERAÇÕES FINAISCONSIDERAÇÕES FINAIS
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A técnica utilizada de cultivo de discos de PLBs mostrou-se eficiente, tanto
com a utilização de BAP como de ANA combinado ao BAP, podendo ser utilizada
para a multiplicação de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em larga escala. A escolha do
fitorregulador deve levar em conta as diferenças encontradas nesse trabalho, como
uma maior regeneração de novos PLBs (9,95) com a utilização de BAP ao invés de
ANA combinado ao BAP (7,03). Porém, os PLBs cultivados em meio de cultura com
BAP, requerem a transferência para meio de cultura sem fitorregulador para
desenvolver plantas, ao contrário do observado nos meios de cultura com ANA mais
BAP. Nestes últimos meios, os PLBs formados desenvolvem-se e enraízam no
mesmo meio de cultura, reduzindo o custo do processo.
A utilização dos diferentes fitorreguladores em diferentes concentrações, não
alterou a origem anatômica dos PLBs, nem o tempo necessário para sua formação.
Contrariamente ao descrito na literatura consultada para a embriogênese somática,
os PLBs apresentaram conexão vascular com o explante, a qual posteriormente é
desfeita pela formação de uma zona de abscisão.
A multiplicação de
Cymbidium
‘Joy Polis’ a partir de brotações não foi eficaz
do modo como foi testada neste trabalho. Portanto, seria interessante testar outras
citocininas e outras concentrações. Além de outros tipos de tecidos para iniciar a
cultura.
A aclimatização de mudas micropropagadas de
Cymbidium
‘Joy Polis’, não
apresentou dificuldades, provavelmente devido à capacidade de adaptação
morfológica e anatômica.
O estudo anatômico do desenvolvimento do PLB, a partir de diferentes
explantes e em diferentes espécies de orquídeas, seria interessante para verificar a
ocorrência ou não da conexão vascular do PLB com o tecido de origem e a
instalação da camada de abscisão, além da presença do coleóptile.
99
Os três métodos de multiplicação de
Cymbidium
‘Joy Polis’ estão ilustrados
no esquema abaixo, no qual pode-se observar sua eficiência pelo número de plantas
que podem ser produzidas num mesmo período de tempo:
1 meristema 5 PLBs 10 discos de PLBs
10 brotações 24 plantas
20 µM BAP
100 plantas
0,5 µM ANA + 0,5 µM BAP
82 plantas
2,5 µM BAP
4 meses
4 meses
4 meses
100
ANEXO
ANEXOANEXO
ANEXO
ANEXO 1. Síntese da metodologia do presente trabalho de anatomia e morfogênese
in vitro
de
Cymbidium
‘Joy Polis’ (Orchidaceae).
Planta matriz
Desinfestação com
etanol 70% e
hipoclorito de sódio
2%
Meristemas de
gemas laterais
Coleta de brotações
laterais
Protocormóides (PLBs)
CAPÍTULO I - Efeito da 6
-
benzilaminopurina na formação e na
morfo-
anatomia de protocormóides (PLBs)
de
Cymbidium
‘Joy Polis’
CAPÍTULO II -
Efeito de ANA e BAP
na regeneração e na morfo-
anatomia
de
Cymbidium
‘Joy Polis’ a partir de
discos de PLBs
Brotações
CAPÍTULO III - Multiplicação
in vitro
de
brotações de
Cymbidium
‘Joy Polis’
(Orchidaceae)
Plantas
Plantas
CAPÍTULO IV -
Aclimatização em diferentes
substratos e morfo-
anatomia de mudas
micropropagadas de
Cymbidium
‘Joy Polis’
101
ANEXO 2. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável número de PLBs
por explante sob diferentes concentrações de BAP.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 4 67,40**
Erro Experimental 20 0,33
Total 24
Qui-quadrado (χ2) 9,262
ns
Coeficiente de Variação (%) 10,73
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
ANEXO 3. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável número de
brotações por explante sob diferentes concentrações de BAP.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 4 0,24**
Erro Experimental 20 0,01
Total 24
Qui-quadrado (χ2) 1,07
ns
Coeficiente de Variação (%) 3,09
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
ANEXO 4. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável número de plantas
por explante sob diferentes concentrações de BAP.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 4 2,27**
Erro Experimental 20 0,01
Total 24
Qui-quadrado (χ2) 4,48
ns
Coeficiente de Variação (%) 28,34
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
102
ANEXO 5. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável altura média das
brotações por explante sob diferentes concentrações de BAP.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 4 1,23**
Erro Experimental 20 0,006
Total 24
Qui-quadrado (χ2) 3,07
ns
Coeficiente de Variação (%) 14,92
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
ANEXO 6. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável porcentagem de
explantes necróticos sob diferentes concentrações de BAP.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 4 410**
Erro Experimental 20 28
Total 24
Qui-quadrado (χ2) 0,22
ns
Coeficiente de Variação (%) 44,10
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
103
ANEXO 7. Análise de variância e Teste de Bartlett para o número médio de PLBs
formados por explante, número médio de plantas, altura média das
plantas e a porcentagem de explantes necróticos de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ cultivados em meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou
combinado ao BAP após 90 dias sob iluminação.
FV
Graus de
Liberdade
Quadrado Médio
PLBs/explante
Plantas/
explante
Altura das
plantas
Explantes
necróticos
(%)
BAP 1 1,11* 0,72*
0,00
ns
12,50
ns
ANA 3 4,75**
0,23
ns
0,042
ns
1070,83**
BAPxANA 3 3,20**
0,05
ns
0,25**
20,83
ns
ERRO 24 0,17 0,14 0,07 72,92
CV (%) 18,16 22,30 22,10 41,40
Qui-quadrado
(χ2)
3,36
ns
7,43
ns
8,31
ns
4,99
ns
n.s. não significativo
* significativo a 5% de probabilidade
** significativo a 1% de probabilidade
FV Fator de variação
CV Coeficiente de variação
104
ANEXO 8. Análise de variância e Teste de Bartlett para o número médio de PLBs
formados por explante, número médio de plantas, altura média das
plantas e a porcentagem de explantes necróticos de
Cymbidium
‘Joy
Polis’ cultivados em meio de cultura MS acrescido de ANA isolado ou
combinado ao BAP após 30 dias no escuro e 60 dias sob iluminação.
FV
Graus de
Liberdade
Quadrado Médio
PLBs/explante
Plantas/
explante
Altura das
plantas
Explantes
necróticos
(%)
BAP 1 11,15** 0,34** 0,35**
12,50
ns
ANA 3 3,67** 0,38** 0,08** 737,50**
BAPxANA 3 23,91** 0,22** 0,04**
4,17
ns
ERRO 24 0,17 0,01 0,01 31,25
CV (%) 11,84 7,74 6,56 35,78
Qui-quadrado
(χ2)
11,37
ns
7,91
ns
3,33
ns
1,38
ns
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
FV Fator de variação
CV Coeficiente de variação
ANEXO 9. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável número de
brotações por explante sob diferentes concentrações de BAP isolado ou
combinado ao AIB.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 6 0,93**
Erro Experimental 21 0,22
Total 27
Qui-quadrado (χ2) 7,46
ns
Coeficiente de Variação (%) 25,92
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
105
ANEXO 10. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável porcentagem de
crescimento da brotação inicial sob diferentes concentrações de BAP
isolado ou combinado ao AIB.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 6 906,9**
Erro Experimental 21 143,14
Total 27
Qui-quadrado (χ2) 5,554
ns
Coeficiente de Variação (%) 21,44
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
ANEXO 11. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável comprimento
médio das brotações laterais sob diferentes concentrações de BAP
isolado ou combinado ao AIB.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 6 1,15**
Erro Experimental 21 0,13
Total 27
Qui-quadrado (χ2) 16,47
ns
Coeficiente de Variação (%) 31,13
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
106
0
5
10
15
20
25
30
10 20 30 40 50
Dias
DiasDias
Dias
Temperatura (°C)
Temperatura (°C)
Temperatura (°C)
Temperatura (°C)
0
20
40
60
80
100
120
% de umidade relativa
% de umidade relativa
% de umidade relativa
% de umidade relativa
Temperatura máxima Temperatura mínima
Umidade relativa máxima Umidade relativa mínima
ANEXO 12. Médias de temperatura e umidade mínimas e máximas durante o
experimento de aclimatização de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’.
ANEXO 13. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável ganho na massa
fresca na aclimatização de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
diferentes substratos após 45 dias.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 9 5549,66**
Erro Experimental 30 81,92
Total 39
Qui-quadrado (χ2) 11,36
ns
Coeficiente de Variação (%) 14,08
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
107
ANEXO 14. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável número médio de
raízes na aclimatização de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em
diferentes substratos após 45 dias.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 9 0,96**
Erro Experimental 30 0,09
Total 39
Qui-quadrado (χ2) 11,16
ns
Coeficiente de Variação (%) 11,23
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
ANEXO 15. Análise de variância e Teste de Bartlett para a variável comprimento
médio das 3 maiores raízes na aclimatização de mudas de
Cymbidium
‘Joy Polis’ em diferentes substratos após 45 dias.
Fontes de Variação Graus de Liberdade Quadrado Médio
Tratamentos 9 2,10**
Erro Experimental 30 0,08
Total 39
Qui-quadrado (χ2) 9,03
ns
Coeficiente de Variação (%) 12,20
n.s. não significativo
** significativo a 1% de probabilidade
108
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