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HUGO BRUNO CORREA MOLINARI
EXPRESSÃO ESTRESSE-INDUZIDA DO GENE P5CS EM PLANTAS
TRANSGÊNICAS DE CANA-DE-AÇÚCAR SUBMETIDAS AO DÉFICIT
HÍDRICO
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Agronomia, área de concentração em
Produção Vegetal, Departamento de Fitotecnia e
Fitossanitarismo, Setor de Ciências Agrárias,
Universidade Federal do Paraná, como requisito
para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Edelclaiton Daros
Co-orientador: Dr. Luiz Gonzaga E. Vieira
CURITIBA
2006
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ii
À minha família, tão importante em todos
os momentos da minha vida. Meus
queridos pais Leny e Hugo e minhas
irmãs Mayla Daiane e Leny Meire.
Ofereço.
À minha noiva Fabiana Manzato por todo
amor, carinho, dedicação, compreensão,
amizade e incentivo.
Dedico.
iii
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Luiz Gonzaga Esteves Vieira (Santista), pela amizade, enorme
confiança e credibilidade depositada ao longo destes anos de trabalho (Orientador,
co-orientador...enfim sempre me apoiando para que as coisas realmente
acontecessem).
Ao orientador e Prof. Dr. Edelclaiton Daros, pela amizade, apoio e acima de
tudo confiança no trabalho realizado.
Ao Dr. João Carlos Bespalhok Filho, pela amizade, apoio e sugestões dadas
desde o início dos trabalhos.
Ao Dr. Luiz Filipe P. Pereira, pela amizade, sugestões e apoio durante toda
execução deste trabalho.
Ao Dr. Celso Jamil Marur grande incentivador durante o trabalho, pelo apoio,
amizade e sugestões durante todo trabalho.
As amigas Jane e Cherrimar, quase criamos uma Empresa (CJH)!!!! Foi uma
experiência muito agradável ter vocês trabalhando e me ajudando. Meu muito
Obrigado!!!!!
A grande e verdadeira amiga Liliane, sempre presente!!!
As grandes amigas do Lab.2, Luciana, Michele, Eliana e Débora aos bons
momentos de descontração.
As amigas do Lab.1, Lúcia, Sandra e Marília pela amizade e convívio
agradável.
A todos amigos do curso, especialmente Michele e Áurea pela amizade e
convívio agradável.
À Sueli Kudo, pelo excelente trabalho e seriedade na condução dos trabalhos
de laboratório, sempre disposta a aprender.
A todos que direta e indiretamente contribuíram para realização deste
trabalho de pesquisa.
Ao corpo docente da Universidade Federal do Paraná – UFPR.
Ao programa de Doutorado em Agronomia (Produção Vegetal).
Ao Instituto Agronômico do Paraná – IAPAR.
Ao Laboratório de Biotecnologia Vegetal.
iv
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq
pela concessão de bolsa-auxílio;
v
BIOGRAFIA DO AUTOR
HUGO BRUNO CORREA MOLINARI, nascido no dia 30 de junho de 1978,
em Londrina – PR, filho de Hugo Molinari e Leny Maria Correa Molinari.
Engenheiro Agrônomo, formado na Universidade Estadual de Londrina – UEL
em 2002, Londrina – PR.
Em Agosto de 2003, defendeu a dissertação de Mestrado em Genética e
Biologia Molecular, na Universidade Estadual de Londrina, com o trabalho intitulado
“Transformação genética de porta-enxertos para Citrus spp. visando obter maior
tolerância ao estresse hídrico”.
Iniciou em março de 2004 o curso de Doutorado em Agronomia, área de
concentração Produção Vegetal, na Universidade Federal do Paraná – UFPR,
concluindo em maio de 2006, com apresentação da tese “Expressão estresse-
induzida do gene P5CS em plantas transgênicas de cana-de-açúcar submetidas ao
déficit hídrico”.
vi
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS........................................................................................................iii
BIOGRAFIA DO AUTOR ...................................................................................................v
SUMÁRIO ............................................................................................................................vi
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................viii
LISTA DE TABELAS........................................................................................................xii
RESUMO............................................................................................................................xiii
ABSTRACT.......................................................................................................................xiv
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA.........................................................1
1.1 Estresses abióticos que comprometem a cultura da cana-de-açúcar.................2
1.2 Resposta ao déficit hídrico..........................................................................................3
1.3 Estresse oxidativo ........................................................................................................9
1.3.1 Estresse oxidativo relacionado à seca................................................................11
1.4 Osmoprotetores..........................................................................................................13
1.4.1 Prolina.......................................................................................................................14
1.4.2 O papel da prolina como um antioxidante ..........................................................19
1.4.3 O papel da prolina como um osmoprotetor ..................................................19
1.4.4 Mecanismos de acumulação de prolina induzidos por estresse.....................21
1.4.5 Efeitos da prolina no metabolismo celular..........................................................22
1.5 Transformação genética em cana-de-açúcar........................................................24
1.5.1 Transformação para tolerância a estresses abióticos......................................26
2 REFERÊNCIAS .............................................................................................................31
3 ARTIGO........................................................................................................................62
3.1 Resumo ........................................................................................................................63
3.2 Abstract.........................................................................................................................64
3.3 Introdução ....................................................................................................................65
3.4 Material e Métodos .....................................................................................................68
3.4.1 Material Vegetal......................................................................................................68
3.4.2 Cultura de tecidos e transformação genética.....................................................68
3.4.3 Plasmídeo pJS107..................................................................................................69
3.4.4 Análises da integração do transgene ..................................................................70
3.4.5 Análise da expressão do transgene.....................................................................71
3.4.6 Análise da tolerância ao déficit hídrico................................................................71
3.4.7 Medidas da fluorescência da clorofila a ..............................................................73
3.4.8 Determinação da quantidade de prolina .............................................................73
3.4.9 Determinação do conteúdo de malondialdeído (MDA).....................................74
3.4.10 Determinação do conteúdo de clorofila total e testes de estresse
oxidativo .................................................................................................................74
3.4.11 Determinação da massa seca total de parte aérea e raiz.............................75
3.4.12 Análises estatísticas.............................................................................................75
3.5 Resultados ...................................................................................................................75
vii
3.5.1 Transformação genética......................................................................................75
3.5.2 Análises moleculares............................................................................................78
3.5.3 Caracterização do conteúdo de água no substrato.........................................80
3.5.4 Ensaios de tolerância ao déficit hídrico.............................................................82
3.5.5 Análise da expressão do transgene...................................................................85
3.5.6 Teores de MDA.....................................................................................................86
3.5.7 Tratamento com herbicida paraquat..................................................................87
3.5.8 Análises da fluorescência da clorofila a ............................................................90
3.5.9 Massa seca total de parte aérea e raízes.........................................................91
3.6 Discussão.....................................................................................................................92
3.7 Conclusões ..................................................................................................................97
3.8 Referências..................................................................................................................98
viii
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
FIGURA 1 - Genes induzidos durante o estresse hídrico e suas possíveis
funções na resposta e tolerância ao estresse (SHINOZAKI;
YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000).........................................................5
FIGURA 2 - Via de transdução de sinais ao estresse hídrico desde a
percepção até a expressão gênica. ABA, ácido abscísico;
ABRE, ABA-responsive element; AP, apetala; bZIP, basic-
region Figura 1: Via de transdução de sinais ao estresse
hídrico desde a percepção até a expressão gênica. ABA,
ácido abscísico; ABRE, ABA-responsive element; AP2,
apétala; bZIP, basic-region leucine zipper; CRT, C-repeat;
DRE, dehydration-responsive element; DREB, DRE-
binding protein; erd1, early responsive to dehydration;
ERF, ethylene-responsive factor; MYB e MYC,
transcriptions factor; CE, coupling element, NACR, NAC
recognition site, ZF-HD, zinc-finger homeodomain, rps1, 1-
like sequence (adaptado de YAMAGUCHI-SHINOZAKI;
SHINOZAKI, 2005)..................................................................................7
FIGURA 3 - Via metabólica de biossíntese de prolina em bactérias (A) e
plantas superiores (B) (Via Glutamato). GSA, Ácido
glutâmico γ-semialdeído; P5C, ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato;
P5CS, P5C sintetase; P5CR, P5C redutase; ProDH,
prolina desidrogenase; P5CDH, P5C desidrogenase......................15
FIGURA 4 - Compartimentos celulares envolvidos no metabolismo de
prolina em plantas (DÍAZ et al., 1999)................................................16
ARTIGO
FIGURA 1 - Diagrama do plasmídeo pJS107 utilizado nos experimentos
de transformação de cana-de-açúcar. Barra em negrito
corresponde à sonda usada para análises de DNA e RNA...............70
ix
FIGURA 2 - Esquema de regeneração e transformação de cana-de-
açúcar. A – Explantes de folhas imaturas com 2-3 mm; B –
Calos embriogênicos obtidos após 4 subcultivos em meio
MS acrescido de 13 µM de 2,4-D; C – Aparelho de
bombardeamento PDS-1000/He usado nos experimentos de
transformação genética da cana-de-açúcar; D – Etapa de
regeneração dos calos embriogênicos em meio de cultura
contendo 25 µM de glufosinato de amônio; E – Alongamento
e enraizamento das plantas putativas transgênicas de cana-
de-açúcar; F – Fase de aclimatização das plantas em casa-
de-vegetação; G – Fase de multiplicação dos eventos......................77
FIGURA 3 - Análises de PCR de cana-de-açúcar variedade RB 855156.
Linha M – Marcador de peso molecular (Ladder 100 pb);
linhas 1, 2,3, 6, 7, 8, 9,10, 12, 18 – plantas transgênicas;
linhas 3, 5, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 19 – escapes; linha C –
controle negativo de cana-de-açúcar variedade RB855156
(planta não transformada); P – controle positivo (plasmídeo
pJS107)......................................................................................................78
FIGURA 4 - Análise de Southern blot em cana-de-açúcar. A – Gel de
agarose com amostras digeridas com as enzimas NotI e
BamHI. B – Southern dos eventos selecionados. Linha ND –
DNA de plantas transgênicas não digerido; Linha C –
controle negativo de cana-de-açúcar variedade RB855156
(planta não transformada); Linhas 4, 6, 7 e 10 – plantas
transgênicas de cana-de-açúcar variedade RB855156; P1,
P3 e P5 – plasmídeo digerido correspondente a 1, 3 e 5
cópias do transgene.................................................................................79
FIGURA 5 - Consumo de água relativo ao tempo inicial (Zero)................................81
FIGURA 6 - A - Potencial total da água; B – Potencial osmótico; C –
Potencial de pressão nas folhas nos eventos transgênicos
de cana-de-açúcar submetidos a 12 dias de estresse hídrico.
Potenciais expressos em mega pascal (MPa). Valores são
apresentados como média ± erro padrão (n = 5) (Tukey; p<
0,05). Coeficientes de variação = 32,9, 27,3 e 25,2%, A, B e
C respectivamente ...................................................................................83
FIGURA 7 - Taxa de fotossíntese líquida expressa em µmol CO
2
.m
-2
.s
-1
nos eventos transgênicos de cana-de-açúcar após 12 dias
sem irrigação. Valores são apresentados como média ± erro
x
padrão (n = 5) (Tukey; p< 0,05). Coeficiente de variação =
20,09%........................................................................................................84
FIGURA 8 - Concentração de prolina em plantas controle e transgênicas
submetidas a 12 dias de estresse hídrico. Valores são
apresentados como média ± erro padrão (n = 5). Letras
maiúsculas comparam colunas de mesmo padrão; letras
minúsculas comparam colunas de padrões diferentes. Letras
iguais não apresentam diferença pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade. Coeficiente de variação =
10,7%..........................................................................................................85
FIGURA 9 - Análise da expressão de P5CS por Northern blot em cana-de-
açúcar. Linhas 1, 3, 5, 7 – plantas controle de cana-de-
açúcar variedade RB855156 submetidas a 0, 6, 9 e 12 dias
de déficit hídrico, respectivamente. Linhas 2, 4, 6, 8 –
plantas transgênicas (evento 10) de cana-de-açúcar
variedade RB855156, submetidas 0, 6, 9 e 12 dias sem
irrigação......................................................................................................86
FIGURA 10 - Nível de peroxidação de lipídeos (teor de MDA) em folhas de
plantas de cana-de-açúcar. Valores são apresentados como
média ± erro padrão (n = 5). Letras maiúsculas comparam
colunas de mesmo padrão; letras minúsculas comparam
colunas de padrões diferentes. Letras iguais não
apresentam diferença pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade. Coeficiente de variação = 5,09% .................................87
FIGURA 11 – Tolerância ao estresse oxidativo de plantas transgênicas de
cana-de-açúcar produzindo prolina. Segmentos foliares
incubados com 5 µM de paraquat por 24 h. A – Segmentos
foliares de plantas controle incubados com paraquat; B, D,
E – eventos 4, 7 e 10, respectivamente incubados com
paraquat. C e F – segmentos de planta controle e
transgênica em água destilada, respectivamente ...............................88
FIGURA 12 – Mudanças no conteúdo de clorofila total em segmentos
foliares de cana-de-açúcar. A - Segmentos foliares tratados
somente com água destilada; B – Segmentos foliares
tratados com 5 µM de paraquat. Segmentos foliares foram
incubados 24 h sob intensidade luminosa de 50 µmol m
-2
s
-1
.
O conteúdo de clorofila é expresso em mg g
-1
de massa
seca. Valores são apresentados como média ± erro padrão
(n = 5). Letras maiúsculas comparam colunas de mesmo
padrão; letras minúsculas comparam colunas de padrões
xi
diferentes. Letras iguais não apresentam diferença pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Coeficiente
de variação = 14,08 e 14,04%, A e B respectivamente......................89
FIGURA 13 - Rendimento quântico potencial do fotossistema II em cana-
de-açúcar. A – valores de rendimento fotoquímico (Fv/Fm);
B – valores de fluorescência inicial (F0); C – valores de
fluorescência variável (Fv) e D – valores de fluorescência
máxima. Valores são apresentados como média ± erro
padrão (n = 5). Letras maiúsculas comparam colunas de
mesmo padrão; letras minúsculas comparam colunas de
padrões diferentes. Letras iguais não apresentam diferença
pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Coeficiente de variação = 6,5, 12,8, 15,8, 11,4%, A, B, C e D
respectivamente........................................................................................90
FIGURA 14 - A - Massa seca de parte aérea de cana-de-açúcar; B -
Massa seca da raiz de cana-de-açúcar. Valores são
apresentados como média ± erro padrão (n = 5). Letras
iguais não apresentam diferença pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade. Coeficiente de variação = 13,6
e 14,09%, A e B respectivamente..........................................................91
xii
LISTA DE TABELAS
ARTIGO
TABELA 1 - Eficiência de transformação via biolística com a variedade de
cana-de-açúcar RB855156......................................................................76
TABELA 2 - Conteúdo de água (θ; m
3
m
-3
) para os quatro tratamentos no
período de 12 dias de déficit hídrico......................................................80
xiii
RESUMO
Períodos de distribuição irregular de chuvas podem causar perdas de até 20% no
setor sucroalcooleiro brasileiro. Plantas submetidas ao déficit hídrico acumulam
prolina nas células a qual pode atuar como osmoprotetor e removedor de espécies
reativas de oxigênio (ROS). A engenharia genética tem sido aplicada com sucesso
na identificação e utilização de genes envolvidos na resposta a estresses abióticos
em diferentes organismos. Altos níveis de prolina permitem que as plantas
mantenham crescimento em condições de deficiência hídrica e também na presença
de altas concentrações salinas. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta ao
estresse hídrico de plantas de cana-de-açúcar RB855156 transformadas com um
gene heterólogo P5CS, que codifica a enzima ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato sintetase
limitante na biossíntese de prolina em plantas, sob controle do promotor estresse
induzido AIPC. Para isto, foram analisados 3 eventos de transformação obtidos
através de bombardeamento de partículas utilizando o gene marcador de seleção
bar. As concentrações de prolina, conteúdo de malondialdeído (MDA), clorofila total
e o efeito do tratamento de estresse hídrico foram analisados. Em condições de
estresse hídrico, os eventos de transformação acumularam prolina até 28,8 µmol g
-1
de massa foliar seca em comparação com plantas não transformadas. Os níveis de
MDA nas plantas controle foram em média 27% maior do que nas plantas
transgênicas. Segmentos foliares de cana-de-açúcar transgênicas tratadas com 5
µM de paraquat, um herbicida indutor de estresse oxidativo celular, mostraram níveis
de clorofila total em média 80% maior a partir do sexto dia de déficit hídrico
comparado com as plantas não transformadas. Mesmo em condição de déficit
hídrico severo, o potencial osmótico na folha tanto de plantas transgênicas quanto
de plantas controle não se mostrou diferente. Até o sexto dia de estresse hídrico,
tanto plantas controle quanto plantas transgênicas não apresentaram alterações
significativas nos parâmetros F
0
e Fv/Fm. No nono e décimo segundo dia de
estresse hídrico, plantas transgênicas apresentaram rendimento fotoquímico (Fv/Fm)
em média 64% e 60% maior, respectivamente. Estes resultados sugerem a
participação da prolina na proteção do aparelho fotossintético através de sua
habilidade em atuar mais como um removedor de espécies reativas de oxigênio
(ROS) do que como um osmoprotetor.
Palavras-chave: Saccharum spp., prolina, tolerância à seca, espécies reativas de
oxigênio (ROS).
xiv
ABSTRACT
Periods of irregular rain distribution can cause losses of up to 20% in the Brazilian
sugarcane industry. Plants submitted to water deficit accumulate proline in the cells,
which can act as an osmoprotector and scavenger of reactive oxygen species (ROS).
Genetic engineering has been successfully used for identification and utilization of
genes involved in response to abiotic stress in several organisms. High levels of
proline allow plants to maintain growing in water stress deficiency and high saline
concentrations. The objective of this work was to evaluate the response of transgenic
sugarcane RB855156 to water deficit stress. These plants were transformed with a
P5CS gene, which codes for an enzyme ∆
1
-pyrroline-5-carboxylate synthetase, under
control of a stress-inducible promoter complex AIPC. Therefore, three transformation
events were obtained by biolistic technology using the bar gene. Free proline
contents, malondialdehyde contents (MDA), total chlorophyll contents and the effect
of water stress treatment were analyzed. In stressed conditions, the transformation
events accumulated proline up to 28,8 µmol g
-1
leaf dry weight compared with non-
transformed plants. The levels of MDA in control plants were 27% higher than in
transgenic plants. Leaf segments of transgenic sugarcane treated with 5 µM of
paraquat, an inducer of cellular oxidative stress, showed total chlorophyll contents
80% higher since the sixth day after water deficit compared with non-transformed
plants. Even in severe water deficit conditions, the leaf osmotic potential of
transgenic plants was not different from non-transformed plants. Under six days of
water deficit, no significant alteration in Fo and Fv/Fm was found in both transgenic
and control plants. On the ninth and twelfth day of water deficit, transgenic plants
presented quantum yield (Fv/Fm) 64% and 60% higher, respectively. These results
suggest the participation of proline in protection of photosynthetic apparatus more by
its ability to act as a free radical scavenger than osmoprotection.
Key words: Saccharum spp., proline, drought tolerance, reactive oxygen species
(ROS).
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância econômica
no mundo. É cultivada em regiões tropicais e subtropicais de mais de 70 países,
sendo o Brasil o maior produtor mundial de açúcar (OIA, 2006). O setor
sucroalcooleiro responde por um faturamento anual da ordem de US$ 7 bilhões
(UNICA, 2006). Atualmente, as variedades de cana cultivadas são o resultado do
cruzamento interespecífico entre Saccharum officinarum, S. barbieri, S. sinense e as
espécies selvagens S. spontaneum e S. robustum. A cana-de-açúcar apresenta um
dos genomas mais complexos do reino vegetal, com um número diplóide de
cromossomos que varia entre 70-120 (D’HONT et al., 1996). Esta complexidade
dificulta a aplicação de técnicas convencionais de melhoramento genético para a
cultura visando o desenvolvimento de novos cultivares com maior produtividade e
tolerância a estresses bióticos e abióticos (HOGARTH, 1987). Além disso, muitos
materiais altamente promissores são descartados por apresentarem defeitos, como
por exemplo, susceptibilidade a alguma doença. Desta forma, tal complexidade e
fatores somados tornam a cana-de-açúcar uma excelente candidata ao
melhoramento por meio da engenharia genética (ROACH, 1995).
Assim como toda cultura agrícola, a produção da cana-de-açúcar é
influenciada por um grande número de fatores ambientais. Alguns desses não são
passíveis de manejo, como clima, enquanto outros, como solo, podem ser
manejados para permitir o melhor desempenho da cultura. A busca por altos
rendimentos a baixos custos implica em conhecer mais detalhadamente a fisiologia e
a genética da cultura, com o objetivo de racionalizar as relações entre os diferentes
fatores de produção visando o máximo desempenho. O sucesso da indústria
canavieira, indubitavelmente estará baseado em cultivares que se adaptem bem ao
clima, ao solo e às características intrínsecas de uma dada região de interesse.
Atualmente, a tecnologia genômica disponível representa uma
ferramenta de grande importância para o entendimento e resolução destas
limitações ambientais. Tais aplicações incluem uma maior rapidez e eficiência na
produção de novos cultivares que possam atender às preferências do consumidor,
bem como, disponibilizá-los de maneira que possam utilizar quantidades menores de
2
defensivos e fertilizantes e tolerar condições ambientais adversas, podendo ocupar
áreas marginais antes não ocupadas pela cultura.
Devido à grande importância da cana-de-açúcar na economia
mundial, a FAPESP, pela rede ONSA (Organização para Seqüenciamento e Análise
de Nucleotídeos), financiou o programa SUCEST de seqüenciamento de genes
expressos da cultura.
O programa SUCEST-FAPESP gerou seqüências ESTs com alto
valor científico agregado, definindo o emprego de diversos tipos de bibliotecas,
originadas de estádios fisiológicos diversos, como meristemas apicais vegetativos e
florais e folhas em diversas fases de desenvolvimento, vários tipos radiculares,
sementes, caules, células de calos cultivados, além de tecidos infectados com
bactérias simbióticas (VETTORE et al., 2001).
O seqüenciamento dos cerca de 300.000 ESTs revelou mais de
50.000 seqüências diferentes (ARRUDA, 2003). Dados gerados no programa, como
análises da diferença na expressão gênica em diferentes situações fisiológicas,
permitirão desvendar os mecanismos moleculares do desenvolvimento e da
bioquímica da cana-de-açúcar, bem como, encontrar funções gênicas significativas
responsáveis pelas características de superioridade varietal desejadas pelos
melhoristas da cultura.
1.1 Estresses abióticos que comprometem a cultura da cana-de-açúcar
Plantas estão expostas a vários estresses ambientais que afetam de
maneira negativa seu crescimento, metabolismo e produtividade. Seca, salinidade,
baixas e altas temperaturas, inundação, poluentes e radiação são os fatores de
estresse mais importantes que limitam a produtividade das culturas (LAWLOR,
2002). No Brasil, dentre estes fatores, o estresse hídrico é o que freqüentemente
mais influencia de forma negativa a produtividade da cana-de-açúcar. Assim, seus
efeitos nas plantas incluem redução nas taxas de assimilação de CO
2
, tamanho das
células foliares, taxa de transpiração, potencial de água na planta, taxa de
crescimento e abertura estomática (HSIAO, 1973; TAIZ; ZEIGER, 2004). Além disso,
3
o déficit hídrico influencia de maneira direta o crescimento dos perfilhos e a altura
final dos colmos e, conseqüentemente, a produção de açúcar (GASCHO; SHIH,
1983, SUGIHARTO, 2004).
Plantas de cana-de-açúcar necessitam de umidade disponível no
solo durante todo o período de crescimento; durante a maturação, porém, o ideal é
que haja redução na disponibilidade de água, não drasticamente, mas o suficiente
para reduzir o crescimento e induzir a maior concentração de açúcar nos colmos
(BARBIERI; VILLA NOVA, 1977, BULL, 2000).
A maioria das regiões canavieiras do país apresenta um volume
adequado de chuvas para a cultura, estimado entre 1200 e 1500 mm anuais
(OMETO, 1980, BULL, 2000). Entretanto, o mais importante é a distribuição
pluviométrica, uma vez que esta é bastante irregular. De acordo com Doorenbos;
Kassan (1979), períodos com precipitação inferior a 50 e 60 mm são considerados
períodos de déficit hídrico. Em anos com distribuição irregular de chuvas, como na
safra 1999/2000, ocorreram perdas de até 20% (IEA, 2000). Em 2005 em
decorrência da estiagem, o Estado do Paraná apresentou quebra na safra de cana-
de-açúcar de 16%, ou uma perda de cerca de 4 milhões de toneladas para o setor
(ALCOPAR, 2005).
1.2 Resposta ao déficit hídrico
Embora sejam conhecidos razoavelmente bem os efeitos gerais da
seca no crescimento das plantas, os efeitos primários do déficit hídrico em níveis
bioquímicos e moleculares ainda não são bem entendidos (ZHU, 2002; CHAVES et
al., 2003; YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005). O déficit hídrico em
plantas inicia-se a partir de uma complexa via de respostas, começando com a
percepção do estresse, o qual desencadeia uma cascata de eventos moleculares,
sendo finalizada em vários níveis de respostas fisiológicas, metabólicas e de
desenvolvimento (BRAY, 1993). Uma mudança no potencial osmótico, através da
membrana plasmática, pode ser a maior causa de respostas ao estresse hídrico em
nível molecular (BRAY, 1993)., Também, alterações na conformação da membrana
4
celular provocam mudanças em canais de transporte ativados por pressão, modifica
a conformação ou a justaposição de proteínas sensoriais embebidas nas
membranas celulares, e altera a continuidade entre a parede e a membrana celular
(SHINOZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 1999, 2000). A percepção do déficit hídrico
celular precisa ser traduzida em compostos bioquímicos e metabólitos, gerando uma
conseqüente resposta fisiológica ao estresse (INGRAM; BARTELS, 1996).
Os produtos de genes induzidos pelo estresse podem ser
classificados em três grandes grupos (FIGURA 1): 1- aqueles que protegem a planta
contra os estresses ambientais; 2- aqueles que regulam a expressão gênica e a
transdução de sinais de resposta a estresses e 3- os de funções desconhecidas
(SEKI et al., 2003; YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).
O primeiro grupo inclui proteínas que funcionam protegendo as
células da desidratação, como as enzimas envolvidas na biossíntese de vários
osmoprotetores tais como prolina e betaínas, proteínas LEA (“late embryogenesis
abundant”), chaperonas e enzimas detoxificadoras. Os níveis de moléculas
osmoprotetoras geralmente aumentam durante o estresse. Vários genes codificando
enzimas envolvidas na biossíntese dessas moléculas já foram isolados, como colina
desidrogenase e colina oxidase (síntese de glicina betaína), manitol-1-fosfato
desidrogenase (síntese de manitol); trehalose-6-fosfato desidrogenase (síntese de
trehalose); e ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato sintetase (síntese de prolina). Genes
codificando enzimas que sintetizam moléculas osmoprotetoras podem ser utilizados
na obtenção de plantas transgênicas com maior tolerância a estresses abióticos
(HARE; CRESS, 1997, HARE et al., 1998 e 1999; SERRAJ; SINCLAIR, 2002;
MOLINARI et al., 2004).
No segundo grupo, envolvido na transdução de sinais, estão os fatores de
transcrição que desempenham papel fundamental na resposta da planta ao estresse
(SEKI et al., 2003). Até o momento foram descritas quatro vias de transdução de
sinais envolvidas na resposta da planta ao déficit hídrico (FIGURA 2): duas vias são
ABA dependentes (I e II) e as outras duas ABA não dependentes (III e IV)
(SHINOZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 1997, 1999, 2000; SEKI et al., 2003;
YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).
5
FIGURA 1: Genes induzidos durante o estresse hídrico e suas possíveis funções na
resposta e tolerância ao estresse (Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki, 2000).
Proteínas Funcionais
Estresse
Hídrico
Proteínas de membrana,
(aquaporinas, proteínas de
transporte)
Enzimas detoxificadoras
(superóxido dismutase,
ferritina)
Fatores de proteção de
macromoléculas (proteínas
LEA, chaperonas)
Enzimas chave para
biossíntese de osmólitos
(prolina, betaína, açúcares)
Proteinases (proteases
thiol, ubiquitinas)
Proteínas Regulatórias
Fatores de transcrição
(MYC, MYB, bZIP, DREB)
Proteínas Quinases
(MAPK, MPKKK)
Proteínas fosfatases (PTP)
PI turnover (Fosfolipase C,
PIP5K)
6
A via ABA dependente tipo I requer a síntese de certas proteínas
para ativar os fatores de transcrição MYC/MYB (ABE et al., 1997) e/ou bZIP, os
quais se ligam a regiões do DNA como os ABREs – ABA-Responsive Elements e
elementos tais como CE1 e CE3 – Coupling Elements (SHEN; HO, 1995; SHEN et
al., 1996). A via ABA dependente tipo II ativa o fator de transcrição bZIP
(NAKAGAWA et al., 1996; HOLLUNG et al., 1997) o qual aciona a expressão gênica
pela ligação com os elementos ABA responsivos ABREs. A via ABA não dependente
tipo IV induz a expressão gênica pela ativação de DREBP – Dehydration-Response-
Element-Binding Protein que se liga ao elemento de resposta à seca DRE/CRT –
Drought Response Element/C-repeat, conduzindo para a indução de genes
estimulados pela seca e frio. A via ABA não dependente tipo III compreende alguns
genes induzidos pela seca que não respondem ao ABA nem ao frio. Estes genes
incluem o ERD1 – Early Responsive to Dehydration 1, que codifica para uma
subunidade regulatória da protease Clp (ClpD) (NAKASHIMA et al., 1997).
Além destas vias, muitos outros sistemas de regulação transcricional
estão envolvidos na expressão de genes responsivos ao estresse. De maneira
paralela, estas quatro principais vias se relacionam e convergem para a ativação de
genes envolvidos na resposta ao estresse. A FIGURA 2 mostra a via completa de
transdução de sinais ao estresse hídrico desde a percepção até a expressão gênica.
Muitos genes são induzidos pela seca, salinidade e baixa
temperatura. Isto sugere que existe uma comunicação cruzada (“cross-talk”) entre
estas vias de sinalização, implicando na interação de diferentes elementos em cis
envolvidos na expressão de genes. Além disso, existe uma complexa e especifica
rede de genes para o “cross-talk” na resposta a estresses abióticos (YAMAGUCHI-
SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).
7
FIGURA 2: Via de transdução de sinais ao estresse hídrico desde a percepção até a
expressão gênica. ABA, ácido abscísico; ABRE, ABA-responsive element; AP2,
apétala; bZIP, basic-region leucine zipper; CRT, C-repeat; DRE, dehydration-
responsive element; DREB, DRE-binding protein; erd1, early responsive to
dehydration; ERF, ethylene-responsive factor; MYB e MYC, transcriptions factor; CE,
coupling element, NACR, NAC recognition site, ZF-HD, zinc-finger homeodomain,
rps1, 1-like sequence (adaptado de YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).
Como descrito anteriormente, o ABA desempenha um papel
importante na adaptação de plantas a estresses abióticos tais como seca,
salinidade, bem como na germinação e dormência de sementes. O ABA regula a
expressão de muitos genes que podem atuar na tolerância a desidratação de
plantas. A região promotora de vários genes ABA induzíveis foram comparadas e
uma seqüência conservada PyACGTGGC, foi encontrada em suas regiões
promotoras. Esta seqüência foi primeiramente identificada como um elemento em
cis, denominado ABRE, no gene Em de trigo, que se expressa principalmente em
sementes durante a fase tardia de embriogênese (GUILTINAN et al., 1990) e no
gene RAB16 de arroz, expresso em tecidos desidratados e em sementes em fase de
Percepção do sinal
Vias ABA dependente
I
II
Síntese de proteínas
(MYC, MYB)
bZIP
Vias ABA independente
DREBs
(ERF/AP2)
Resposta ao estresse hídrico e tolerância
III
IV
ABRE
MYC
MYB
TATA
box
Expressão gênica
rd29A
rd22
rd29B
DRE/CRT
Percepção do sinal
Vias ABA dependente
I
II
Síntese de proteínas
(MYC, MYB)
bZIP
Vias ABA independente
DREBs
(ERF/AP2)
Resposta ao estresse hídrico e tolerância
III
IV
ABRE
MYC
MYB
TATA
box
Expressão gênica
rd29A
rd22
erd1
rd29B
DRE/CRT
CE
NACR
NAC
C
lp
protease
Estresse hídrico
Rps 1
like
?
ZF-HD
ABRE
8
maturação (MUNDY et al., 1990). O elemento ABRE é o principal elemento em cis
na expressão gênica ABA-responsiva.
Vários outros genes induzíveis possuem além do ABRE um
elemento em cis similar chamado de G-box (CACGTGGC) (MENKES et al., 1995).
Todos estes promotores requerem pelo menos um elemento em cis em
complementação a um G-box para ativação transcricional adequada. Uma única
cópia do ABRE não é suficiente para transcrição de genes ABA induzíveis. O ABRE
em complementação a elementos como CE1 e CE3 constituem um complexo ABA
responsivo eficiente na regulação dos genes HVA1 e HVA22 de trigo (SHEN; HO,
1995; SHEN et al., 1996).
Estudos com o promotor ABA-responsivo HVA22 de cevada que
possui uma seqüência ABRC1 (ABA responsive complex) de aproximadamente 49
bp, ligados a um promotor truncado da α-amilase da cevada (AMY 64) e acoplados a
uma região intron de aproximadamente 233 pb do gene HVA22 (HVA22I) induziram
cerca de 30 vezes a expressão do gene uidA (GUS) em experimentos com células
em suspensão de cevada (SHEN et al., 1995). O uso de mais de uma cópia da
região ABRC1 gerou dois tipos de promotores (SU et al., 1998). Estes promotores
foram testados em arroz e aumentaram a expressão do gene GUS de 3 a 8 vezes
com a aplicação de ABA e submissão a déficit hídrico e salinidade. Plantas com 4
cópias do complexo ABA-responsivo mostraram níveis de expressão do gene GUS
50 a 200% maior.
Zhu et al., 1998 usaram o complexo ABA-responsivo ligado ao
promotor mínimo do gene da Actina (act-100) e ao íntron do gene HVA22,
denominado de complexo promotor estresse induzido (AIPC), para controlar a
expressão do gene P5CS de Vigna aconitifolia. Esta construção foi testada em arroz
e seu promotor usado para conduzir a expressão em muitos tecidos, como folhas,
raízes, tornando-se uma excelente ferramenta para o estudo de genes relacionados
com a tolerância aos estresses abióticos em monocotiledôneas (SU et al., 1998; SU;
WU, 2004).
9
1.3 Estresse oxidativo
A formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) tem sido
relatada por vários autores como produto do estresse biótico e abiótico (FOYER;
NOCTOR, 2000; REDDY et al., 2004).
O oxigênio atômico é o elemento mais abundante na superfície da
terra; o oxigênio molecular na atmosfera e na água é requerido para suportar todas
as formas de vida aeróbicas (GILBERT, 1981). A reserva presente de oxigênio na
terra foi sendo construída como resultado da fotossíntese, um processo que libera
oxigênio a partir da água (PRICE et al., 1989). Ele é mantido praticamente constante
pela respiração, no qual o oxigênio (O
2
) é usado como aceptor final de elétrons
(ELSTNER, 1987). Também, os átomos de oxigênio são “fixados” em várias
moléculas orgânicas através de uma variedade de enzimas (por exemplo,
oxigenases) e processos não enzimáticos (GILBERT, 1981). Organismos aeróbicos
devem, entretanto, adequar-se aos efeitos adversos do O
2.
Em altas concentrações
na atmosfera, o O
2
pode inibir ou inativar certas enzimas e também competir com a
fixação fotossintética do CO
2
pela ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase,
aumentando o custo energético da fotossíntese (MORAN et al., 1994). Ainda, o
efeito tóxico do oxigênio é principalmente atribuído aos seus derivados reativos
(MITTLER, 2002). Para o oxigênio se tornar quimicamente reativo, ele deve ser
ativado fisicamente ou quimicamente:
A ativação física ocorre principalmente pela transferência da energia
de excitação de um pigmento foto-ativado, tal como uma molécula de clorofila
excitada. Esta energia é altamente difusível e capaz de reagir com moléculas
orgânicas, causando danos nas membranas do aparelho fotossintético (NOCTOR;
FOYER, 1998).
A ativação química ocorre por meio de um processo onde são
formados os íons superóxidos (O
2
-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radicais hidroxil
(OH), os quais são altamente reativos e biologicamente tóxicos (MCKERSIE;
LESHEM, 1994). Suas toxicidades estão relacionadas as suas meia-vidas antes de
reagir com componentes celulares (BOWLER et al., 1992). As espécies reativas de
oxigênio (ROS) colidem com as moléculas orgânicas, extraindo um elétron desta.
10
Desta forma, faz com que este radical se propague numa reação em cadeia, por
exemplo, gerando radicais peroxil (ROO) e alkoxil (RO) (MCKERSIE et al., 2000).
O superóxido é o primeiro produto da redução do oxigênio molecular,
sendo capaz tanto de se reduzir como oxidar. Ele pode reagir para produzir várias
outras espécies reativas e pode formar H
2
O
2
tanto enzimática ou espontaneamente
(PITCHER; ZILINSKAS, 1996).
O peróxido de hidrogênio não é um radical livre, mas participa como
oxidante e redutor em muitas reações celulares (PRICE et al., 1989). Contrário ao
superóxido, o peróxido de hidrogênio é altamente difusível através das membranas e
compartimentos aquosos e pode inativar diretamente enzimas sensíveis em baixas
concentrações. Tal como o superóxido, o H
2
O
2
é pouco estável e, portanto menos
tóxico que outras espécies reativas de oxigênio; a principal ameaça imposta pelo
superóxido e peróxido de hidrogênio está na habilidade de ambos gerarem altas
quantidades de radicais hidroxil (SGHERRI; NAVARI-IZZO, 1995).
O radical hidroxil é a mais potente espécie oxidante encontrada em
sistemas biológicos. Ele reage de forma não específica com qualquer molécula
biológica. Até o momento, nenhum removedor específico de radicais hidroxil é
conhecido, embora alguns metabólitos, tais como a uréia ou glicose, foram
propostos como sendo removedores destes em sistemas animais (BARTELS, 2001).
As diferentes formas de espécies reativas descritas acima causam
uma variedade de danos nas células vegetais como: 1. inibição de enzimas
sensíveis; 2. degradação da clorofila ou “bleaching”; 3. peroxidação lipídica; radicais
livres, H
2
O
2
e oxigênio singleto atacam prontamente ácidos graxos insaturados,
produzindo hidroperóxidos de lipídeos, em presença de metal catalisador, e radicais
alkoxil e peroxil que desencadeiam uma série de reações nas membranas, mudando
e desfazendo estruturas lipídicas e alterando a integridade e organização das
membranas (YU, 1994); adicionalmente, alguns aldeídos e hidrocarbonetos
produzidos pela peroxidação lipídica exercem efeitos citotóxicos em sistemas
animais (ESTERBAUER et al., 1990). 4. ataque de radicais hidroxil à moléculas
orgânicas, incluindo o DNA.
Uma variedade de espécies alteradas oxidativamente podem ser
identificadas seguidas do ataque de hidroxil, incluindo alterações nas bases
11
nitrogenadas e quebras que podem dificultar seu reparo ou tolerância (KASAI et al.,
1986). Proteínas expostas a este radical passam por modificações típicas, incluindo
alterações na especificidade dos aminoácidos, fragmentação polipeptídica,
agregação, desnaturação e susceptibilidade à proteólise (WOLFF et al., 1986;
REDDY et al., 2004).
1.3.1 Estresse oxidativo relacionado à seca
As plantas estão expostas, durante o crescimento e
desenvolvimento, a grandes mudanças climáticas no ambiente em que vivem, tendo
que apresentar um amplo espectro de respostas no seu desenvolvimento, bem como
adaptações bioquímicas para a condição estressante. A grande quantidade de
informação gerada nesta área mostra uma intrincada via de transdução de sinais em
plantas e os múltiplos papéis que os radicais de oxigênio desempenham no
metabolismo da planta (SMIRNOFF, 1998).
Ao longo destes anos, vários estudos fisiológicos encontraram
correlação entre níveis de antioxidantes e o nível de tolerância ao estresse em
espécies, variedades e biótipos de plantas. Em muitos casos, o dano induzido pelos
ROS está relacionado com situações de estresse causadas por calor, frio, raios
ultravioleta (UV), poluentes no ar e seca. Outro importante aspecto dos ROS é seu
envolvimento na sinalização molecular, o que implica que a característica de
tolerância poderia ser selecionada ou geneticamente modificada contra um tipo de
estresse, resultando em uma co-tolerância a outros tipos (GRESSEL; GALUN,
1994).
Durante o déficit hídrico, as plantas apresentam alteração no
transporte de elétrons mediado pelos radicais superóxido formados (O
2
-
) que
competem com o NADP para redução no fotossistema I (REDDY et al., 2004). Como
conseqüência, pode ocorrer a perda e redução das proteínas D1 e D2 do
fotossistema II (REDDY et al., 2004). A diminuição da assimilação de CO
2
, redução
das atividades dos fotossistemas e alteração no sistema de transporte de elétrons,
aceleram a geração de ROS, via cloroplasto (ASADA, 1999).
12
Os ROS têm a capacidade de inativar enzimas e danificar estruturas
e componentes celulares importantes (ASADA,1999). As enzimas do ciclo de Calvin-
Benson, enzimas que contêm Fe
+2
, e as proteínas D1 e D2, são as mais afetadas
pelos ROS (REDDY et al., 2004).
Várias enzimas parecem estar envolvidas no mecanismo de
proteção aos ROS, como as catalases, superóxido dismutase, peroxidases,
glutationas. Além destas, outras moléculas podem participar do sistema antioxidante
das plantas como os flavonóides, alcalóides, ácido ascórbico e carotenóides
(REDDY et al., 2004).
Em tomate, a enzima Cu/Zn-SOD (superóxido dismutase) citosólica
apresentou forte indução pelo déficit hídrico, enquanto a Cu/Zn-SOD cloroplástica
não se alterou. Enzimas como a glutationa redutase mostraram-se altamente
induzidas em condições de déficit hídrico (EDREVA, 2005). REDDY et al., 2004
sugerem que as enzimas removedoras de ROS, além de remover o H
2
O
2
ajudam o
fotossitema I, tornando o NADP disponível para aceitar os elétrons provenientes da
ferredoxina, minimizando assim a formação dos íons superóxido.
Sairam et al., (1998) desmostraram que os sistemas de remoção de
ROS pelas enzimas ascorbato peroxidase, glutationa redutase e catalase são
importantes para a diminuição da peroxidação lipídica, mantendo a estabilidade de
membranas, bem como os conteúdos de clorofilas e carotenóides presentes.
Além das enzimas antioxidativas, as plantas podem tolerar o
estresse oxidativo pela síntese e acúmulo de osmólitos compatíveis ou
osmoprotetores. Dentre estes, aminoácidos como a prolina parecem estar
envolvidos na tolerância (LAWLOR; CORNIC, 2002). A prolina por possuir um anel
pirrolina, que confere uma baixa capacidade de ceder elétrons, forma um complexo
de transferência de carga e sequestra O
2
livre (REDDY et al., 2004). Assim, a prolina
pode reduzir o dano por fotoinibição nas membranas do tilacóide pelo seqüestro e
redução da produção de íons superóxido (REDDY et al., 2004).
13
1.4 Osmoprotetores
A classe de pequenas moléculas conhecidas como osmólitos
compatíveis inclui aminoácidos como a prolina, compostos quaternários de amônio
(glicina betaína, prolina betaína, B-alanina betaína, e cholina-0-sulfato) e o composto
terciário de sulfato, 3-dimetilsulfoniopropionato (DMSP). Os compostos quaternários
de amônio e DMSP são derivados de precursores de aminoácidos (YANCEY, 1994;
SAKAMOTO; MURATA, 2000).
Estes compostos compartilham a propriedade de permanecerem
invariáveis em pH neutro e serem altamente solúveis em água (BALLANTYNE;
CHAMBERLIN, 1994). Além disso, em altas concentrações, têm pequeno ou
nenhum efeito sobre a interação de macromoléculas solventes (YANCEY et al, 1982;
LOW, 1985; SOMERO, 1986; TIMASHEFF, 1993; YANCEY, 1994), diferentemente,
dos íons inorgânicos que entram prontamente na esfera de hidratação de proteínas,
favorecendo seu desdobramento. Os osmólitos compatíveis tendem a serem
excluídos da esfera de hidratação das proteínas e estabilizam a estrutura de
proteínas (LOW, 1985). Estes compostos têm um papel fundamental no ajustamento
osmótico do citoplasma da planta durante a resposta ao estresse osmótico (WYN
JONES et al., 1977).
O acúmulo de osmólitos em células de plantas resulta em um
decréscimo no potencial osmótico e também na manutenção da absorção de água e
pressão de turgor da célula, o que contribui para a manutenção dos processos
fisiológicos, como abertura estomática, fotossíntese e crescimento da planta (BLUM,
MAYER; GOZLAN, 1983; MORGAN, 1984; LUDLOW; MUCHOW 1990; BLUM,
1996). O acúmulo de osmólitos em plantas tem sido utilizado com ênfase em
critérios de seleção nos programas tradicionais de melhoramento de plantas para
aumento da produtividade em ambiente com deficiência hídrica (BLUM et al., 1983;
LUDLOW; MUCHOW 1990; TANGPRENSRI et al., 1991; BELHASSEM et al., 1995;
ZHANG, NGUYEN; BLUM, 1999; CLAUSSEN, 2005).
14
1.4.1 Prolina
L-prolina é um dos 20 aminoácidos presentes nas proteínas de todos
os organismos vivos. Aminoácidos são moléculas que contém ambas porções amino
(-NH
2
) e um grupo funcional carboxil (-COOH). Diferentemente, prolina contém uma
porção imino (C=NH), um grupo funcional carboxil e um grupo imine secundário,
tendo sido reportada como um importante osmoprotetor em muitas plantas.
Este aminoácido,
na sua forma pura, apresenta-se como uma
substância incolor, altamente solúvel em água, medianamente solúvel em álcoois,
razoavelmente em benzeno e acetona e insolúvel em outros compostos (MILNER-
WHITE et al., 1992).
Em plantas, o aminoácido prolina é sintetizado a partir de glutamato
via ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato (P5C) por duas sucessivas reduções, as quais são
catalisadas pelas enzimas P5C sintetase (P5CS) e P5C redutase (P5CR) (HARE et
al., 1999) (FIGURA 3) ou alternativamente a partir de ornitina pela enzima ornitina δ-
aminotransferase – OAT (ROOSENS et al., 1998; LUTTS et al., 1999).
A enzima ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato redutase (P5CR) foi a primeira a
ser identificada e caracterizada em muitas espécies de plantas (KREUGER et al.,
1986; TREICHEL, 1986; LAROSA et al., 1991). A localização no cloroplasto desta
enzima foi reportada em ervilha (RAYAPATI et al., 1989). Por outro lado, Szoke et al.
(1992) encontrou atividade da enzima P5CR na fração citosólica de raízes e nódulos
de soja, bem como em células de folha. As diferentes localizações da enzima P5CR
indicam que a prolina pode ser sintetizada em diferentes compartimentos celulares,
como no citosol e estroma de cloroplastos, via Fd-GOGAT (glutamato sintase
ferrodoxina dependente) (FIGURA 4).
15
FIGURA 3: Via metabólica de biossíntese de prolina em bactérias (A) e plantas
superiores (B) (Via Glutamato). GSA, Ácido glutâmico γ-semialdeído; P5C, ∆
1
-
pirrolina-5-carboxilato; P5CS, P5C sintetase; P5CR, P5C redutase; ProDH, prolina
desidrogenase; P5CDH, P5C desidrogenase.
CH
2
N
P5CR
ProDH
NH
Ácido L-Glutâmico GSA
P5C L-Prolina
CH
2
CH
COOH
NH
2
COOH
P5CS
P5CDH
CH
2
CH
2
CHCHO
espontâneo
CH
2
CH
2
CH
CH
CH
2
CH
2
CHCH
2
COOHNH
2
COOH
CH
2
N
P5CR
NH
Ácido L-Glutâmico
GSA P5C L-Prolina
CH
2
CHCOOH
NH
2
COOH
proB
CH
2
CH
2
CH
CHO
espontâneo
CH
2
CH
2
CHCH
CH
2
CH
2
CH
CH
2
COOHNH
2
COOH
γ-glutamil
quinase
CH
2
CH
2
CH
3
OPOC
NH
2
COOH
L-glutamil -γ - fosfato
proA
glutâmico -γ-
semialdeído
desidrogenase
proC
A
B
16
FIGURA 4. Compartimentos celulares envolvidos no metabolismo de prolina em
plantas (DÍAZ et al., 1999).
Cloroplasto
Prolina
Prolina
Mitocôndria
P5CR
P5C
Glutamato
P5CS
Fd-GOGAT
Citosol
Glutamato
P5C
Prolina
Vacúolo
Glutamato
P5C
PDH
P5CDH
P5CS
P5CR
Cloroplasto
Prolina
Prolina
Mitocôndria
P5CR
P5C
Glutamato
P5CS
Fd-GOGAT
Citosol
Glutamato
P5C
Prolina
Vacúolo
Glutamato
P5C
PDH
P5CDH
P5CS
P5CR
17
O gene codificando a enzima P5CR foi identificado por teste de
complementação direta de uma linhagem de E. coli proC auxotrófica com clones de
uma biblioteca de cDNA de nódulos de soja (DELAUNEY; VERMA, 1990), facilitando
o isolamento de P5CR homólogos de Pisum sativum (WILLIAMSON; SLOCUM,
1992) e Arabidopsis thaliana (VERBRUGGEN et al., 1993).
Transcritos de P5CR aumentam abundantemente em resposta ao
estresse osmótico, indicando que o gene P5CR transcrito é controlado sob estresse
osmótico (DELAUNEY; VERMA, 1990; WILLIAMSON; SLOCUM, 1992;
VERBRUGGEN et al., 1993). O promotor do gene P5CR proporciona forte
expressão de GUS em ápices radiculares, meristema, células guarda, grãos de
pólen, óvulos e sementes em desenvolvimento (HUA et al., 1997).
O cDNA de P5CR de soja, quando superexpresso em tabaco, não
resultou em um aumento significativo nos níveis de prolina em plantas transgênicas,
apesar de um aumento de 100 vezes na atividade da enzima comparado ao controle
(SZOKE et al., 1992). Assim, P5CR mostrou não ser o passo limitante no acúmulo
de prolina em plantas superiores (LAROSA et al., 1991; DELAUNEY; VERMA,
1993).
Em bactérias como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Salmonella typhimurium, a síntese de prolina a partir de glutamato é catalisada por
três enzimas: a gama glutamil quinase (GK), a glutamil fosfato redutase (GPR),
glutamato 5-semialdeído desidrogenase e a P5C redutase (P5CR), codificadas pelos
genes proB, proA e proC, respectivamente (DEUTCH et al, 1984; SMITH et al,
1984).
A partir de uma biblioteca de cDNA de Vigna aconitifolia, foi
encontrado e caracterizado o gene da enzima bifuncional, ∆
1
-pirrolina-5-caboxilato
sintetase (P5CS), que apresenta ambas atividades GK e GPR (HU et al., 1992).
Empregando-se mutantes auxotróficos de E. coli para prolina proA, proB e proBA foi
possível demonstrar o crescimento da bactéria na ausência de prolina. A única e
maior ORF (Open-Reading Frame) deste cDNA codifica um polipeptídeo de 73,2
kDa, o qual possui dois domínios distintos, exibindo 55,3% de similaridade global
para GK de E. coli e 57,9% de similaridade para GPR de E. coli (HU et al., 1992).
18
A atividade GK da enzima bifuncional P5CS de Vigna aconitifolia é
inibida por prolina (50% de inibição com 5 mM de prolina). Esta enzima parece ser
muito menos sensível por inibição por retroalimentação que o genótipo selvagem GK
de E. coli (HU et al., 1992). Análises de Northern blot indicaram que o gene P5CS é
induzido (particularmente em folhas) pelo tratamento de plantas de Vigna com 200
mM de NaCl (HU et al., 1992). Dessecação, estresse salino e ABA induzem
fortemente transcritos RNAm do gene P5CS em Arabidopsis (YOSHIBA et al., 1995).
Savoure et al. (1997) sugerem que a expressão de genes para a biossíntese de
prolina são dependentes em pelo menos duas vias de transdução de sinais; uma
ativada por aplicação exógena de ABA na ausência de estresse e outra ativada por
frio e estresse osmótico independentemente da aplicação exógena de ABA.
A enzima P5CS é limitante para a síntese de prolina, sendo sensível
à inibição por retroalimentação. Plantas transgênicas de tabaco superexpressando o
gene P5CS parecem ter aumentado a sua tolerância ao estresse hídrico e salino
(KISHOR et al., 1995). Entretanto, os dados disponíveis foram insuficientes para se
concluir com certeza que o acúmulo de prolina nestas plantas transgênicas contribui
para o aumento da tolerância via ajustamento osmótico ou por algum outro
mecanismo (SHARP et al., 1996). Como discutido por Hare; Cress (1997), os dados
obtidos pelos autores são contraditórios para relação hídrica destas plantas
transgênicas, sendo necessária uma maior investigação dos fenótipos observados.
O gene P5CS de Vigna aconitifolia foi introduzido em arroz sob o
controle de um promotor ABA-induzido. As plantas transgênicas de arroz
acumularam 2,5 vezes mais prolina que as plantas controle sob condição de
estresse. Resultados preliminares mostraram que a expressão induzida do gene
P5CS na segunda geração de plantas transgênicas de arroz proporcionou um
aumento da biomassa, refletindo no aumento do peso fresco de raiz e parte aérea
sob condições de estresse hídrico e salino (ZHU et al, 1998).
19
1.4.2 O papel da prolina como um antioxidante
O estresse hídrico desencadeia muitos processos bioquímicos e
fisiológicos importantes como, por exemplo, ajustamento osmótico e afeta o sistema
de defesa de enzimas antioxidantes e peroxidação lipídica. Este causa o acúmulo de
ROS, tais como radicais superóxido, H
2
O
2
e OH (PASTORI; FOYER, 2002). Em
baixas concentrações, estes radicais servem como moléculas sinais na resposta
adaptativa das plantas frente ao estresse, porém, em excesso podem causar danos
oxidativos nas células.
Os radicais hidroxil são gerados pelo ascorbato/H
2
O
2
ou pela xantina
oxidase/hipoxantina/H
2
O
2
e detectados pela hidroxilação do salicilato ou pela
desnaturação da enzima malato desidrogenase. O aminoácido prolina tem sido
reportado como um removedor de diferentes ROS em certos sistemas de detecção e
geração in vitro. Smirnoff; Cumbes (1989) demonstraram a propriedade da prolina na
remoção de radicais hidroxil (OH
.
). O OH pode reagir com a prolina causando uma
alteração dos prótons pela formação de um radical mais estável (FLOYD; NAGY,
1984). O radical prolina-nitroxil R
2
N-O é também formado da reação entre OH e
prolina (FLOYD; NAGI, 1984). Similarmente, Alia et al. (2001) reportaram a ação de
“quenching” da prolina nos oxigênios “singlet” (
1
O
2
). O “quenching” de oxigênio
singleto pela prolina parece estar baseado na sua capacidade de formar um
complexo de transferência que funciona devido a um baixo potencial de ionização.
Os mecanismos de “quenching” de ROS pela prolina foram revisados por Matysik et
al. (2002).
1.4.3 O papel da prolina como um osmoprotetor
O acúmulo de prolina representa uma resposta metabólica comum
de plantas superiores ao déficit hídrico e estresse salino, e tem sido tema de
numerosas revisões nos últimos 25 anos (DELAUNEY; VERMA, 1993; SAMARAS et
al., 1995; TAYLOR, 1996; HARE; CRESS, 1997; HARE et al., 1998 e 1999;
SERRAJ; SINCLAIR, 2002; KISHOR et al., 2005).
20
Este aminoácido é acumulado em folhas de muitas espécies de
plantas halofíticas superiores que crescem em ambientes salinos (BRIENS;
LARHER, 1982; TREICHEL, 1986), em tecidos de folha e meristemas apicais de
plantas submetidas a estresse hídrico (BOGGESS et al., 1976; JONES et al., 1980),
em pólen dessecado (HONG-QI et al., 1982; LANSAC et al., 1996), em regiões
apicais de raízes crescendo em baixos potenciais de água (VOETBERG; SHARP,
1991) e em células em suspensão submetidas ao estresse hídrico (TAL; KATZ,
1980; HANDA et al., 1986; RHODES et al., 1986) ou estresse salino (BINZEL et al.,
1987; RHODES; HANDA, 1989; THOMAS et al., 1992).
De acordo com Alia (2003) a prolina em plantas constitui menos que
5% dos aminoácidos totais livres em condições normais, mas sob várias formas de
estresse a concentração de prolina pode chegar a 80% do “pool” total de
aminoácidos. Plantas naturalmente adaptadas a ambientes salinos produzem altos
níveis de prolina (aproximadamente 100 µmol g
-1
de matéria fresca) como é o caso
das halófitas. Estes níveis podem aumentar até 10X (até 1500 µmol g
-1
de matéria
fresca) em resposta a altas concentrações salinas (THOMAS; BOHNERT, 1993).
A prolina protege a membrana celular e proteínas contra efeitos
adversos de altas concentrações de íons inorgânicos e temperaturas extremas
(RUDOLPH et al., 1986; SANTARIUS et al., 1992; SANTORO et al., 1992). A prolina
pode também funcionar como um osmólito compatível inibitório da agregação de
proteínas (SRINIVAS; BALASUBRAMANIAN, 1995).
O acúmulo de prolina em resposta ao estresse salino ou hídrico em
plantas é primariamente localizado no citosol (KETCHUM et al., 1991; PAHLICH et
al., 1993).
Em meristemas apicais de raízes de milho, a prolina representa o
soluto em maior quantidade, alcançando concentrações de 120 mM em raízes
crescendo em um potencial de água de -1.6 MPa e representa uma significante
fração (~50%) do ajustamento osmótico desta região (VOETBERG; SHARP, 1991).
O acúmulo de prolina em meristemas apicais de raízes de milho em resposta ao
estresse hídrico envolve aumento do seu depósito em regiões de crescimento e
parece requerer ABA (OBER; SHARP, 1994; SHARP et al., 1994).
21
O suplemento exógeno de prolina funciona como um osmoprotetor
para bactérias, facilitando seu crescimento em ambientes altamente salinos
(CSONKA; HANSON, 1991; YANCEY et al., 1994). Um aumento na osmoproteção
de bactérias causado pela superprodução de prolina deve-se a uma alteração na
inibição por retroalimentação na via biossintética de prolina (CSONKA, 1981; SMITH,
1985). O acúmulo de prolina no citoplasma é acompanhado por uma redução nas
concentrações de solutos pouco compatíveis e um aumento no volume de água no
citosol (CAYLEY et al., 1991). Em células de plantas superiores, o suplemento
exógeno de prolina pode ser osmoprotetor (HANDA et al., 1986; LONE et al., 1987)
e crioprotetor (SONGSTAD et al., 1990; SANTARIUS et al., 1992)
Em uma seleção de mutantes resistentes a hidroxiprolina em cevada
e trigo foram identificadas linhagens que acumulavam grandes quantidades de
prolina em comparação ao genótipo selvagem (KUEH; BRIGHT, 1981; DORFFLING
et al., 1993). Entretanto, parece que as concentrações de prolina acumuladas por
estes mutantes podem ser uma ordem de magnitude menor que as requeridas para
produzir efeitos fisiológicos significativos sob estresse osmótico (LONE et al., 1987).
A síntese de prolina pode estar envolvida na recuperação da acidose
citoplasmática, podendo manter a relação NADP+/NADPH em valores compatíveis
com o metabolismo normal (HARE; CRESS, 1997). O catabolismo rápido de prolina
pode promover reduções equivalentes que suportem a fosforilação oxidativa
mitocondrial e a geração de ATP para a recuperação e conseqüente reparo de
danos causado pelo estresse (HARE; CRESS, 1997).
1.4.4 Mecanismos de acumulação de prolina induzidos por estresse
O estresse osmótico resulta de um aumento na taxa biossintética de
prolina (RHODES et al., 1986; RHODES; HANDA, 1989). O acúmulo de prolina
envolve a indução (PENG et al., 1996) e/ou ativação de enzimas da biossíntese de
prolina, provavelmente junto com o controle da inibição por retroalimentação da via
de produção de prolina (STEWART, 1981; DELAUNEY; VERMA, 1993), o
decréscimo de oxidação de prolina para glutamato (SELLS; KOEPPE, 1981;
22
ELTHON; STEWART, 1982) mediado por uma baixa regulação de prolina
desidrogenase (KIYOSUE et al., 1996; PENG et al., 1996), o decréscimo na
utilização de prolina na síntese de proteínas (BOGGESS; STEWART, 1980;
STEWART, 1981) e o aumento no “turn over” protéico (FUKUTOKU; YAMADA,
1984).
O estresse hídrico induz grandes aumentos na concentração de
prolina no floema de alfafa (GIROUSSE et al., 1996), sugerindo que o aumento na
deposição de prolina no ápice radicular em plantas estressadas hidricamente pode,
em parte, ocorrer pelo transporte de prolina via floema (GIROUSSE et al., 1996). Um
gene de transporte de prolina, ProT2, se mostrou fortemente induzido por déficit
hídrico e estresse salino em Arabidopsis thaliana (RENTSCH et al., 1996). Também,
um gene homólogo transportador de prolina foi encontrado em tomate, LeProT1
(SCHWACKE et al., 1999). Este gene é fortemente expresso em pólen maduro e em
fase de germinação e está envolvido no transporte de outros solutos compatíveis,
como glicina betaína e GABA (Ácido γ-Amino-Butírico).
Altos níveis de prolina livre tem sido reportados pela modificação
genética de várias espécies de plantas. As modificações visadas foram tanto para
suprimir quanto para superexpressar as enzimas chave no metabolismo de prolina e
as plantas geneticamente modificadas resultantes tem exibido aumento de tolerância
a vários tipos de estresses abióticos (KISHOR et al., 1995; ZHU et al., 1998; NANJO
et al., 1999; HONG et al., 2000; ROOSENS et al., 2002; MOLINARI et al., 2004; DE
RONDE et al., 2004; HMIDA-SAYARI et al., 2005). Adicionalmente, o aumento dos
níveis de outros osmólitos tais como: modificações genéticas para aumento da
tolerância a estresses abióticos, podem ser encontradas em revisão recente
(BLUMWALD et al., 2004).
1.4.5 Efeitos da prolina no metabolismo celular
Plantas transgênicas transformadas com o objetivo de superproduzir
o osmólito prolina poderiam ter seu crescimento reduzido na ausência de estresse,
devido ao acúmulo de prolina. Para testar esta possibilidade, níveis intracelulares de
23
prolina foram manipulados pela expressão do gene tomPRO2 mutante (∆
1
-pirrolina-
5-carboxilato sintetase, P5CS, de tomate) em Saccharomyces cerevisae. Este
experimento foi conduzido na presença e na ausência da enzima prolina oxidase
(PDH), seguido da seleção de leveduras com aumento da concentração de prolina
na ausência de estresse. Foi observado que o nível de acúmulo deste aminoácido
mostrou-se inversamente correlacionado em células que cresciam em condições
normais osmóticas (MAGGIO et al., 2002). Também, a concentração intracelular de
prolina resultou em um aumento no número de ploidia, na vacuolação e no acúmulo
alterado de vários e diferentes transcritos relacionados à divisão celular e ao controle
da expressão gênica (MAGGIO et al., 2002).
Em A. thaliana, a expressão antisenso do gene P5CS inibiu a
produção de prolina fazendo com que as plantas se tornassem hipersensíveis ao
estresse osmótico (NANJO et al., 1999). Foi ainda provado que estas plantas
transgênicas antisenso tiveram um impacto negativo no desenvolvimento da
inflorescência e mostraram alterações na morfologia da diferenciação vascular
devido a uma mudança nas proteínas estruturais da parede celular (NANJO et al.,
1999).
Danos na ultraestrutura de cloroplastos e mitocôndrias foram
observados em plântulas de A. thaliana tratadas com concentrações milimolares de
prolina exógena. Essa descoberta aponta para possíveis danos que este aminoácido
pode causar quando as plantas superproduzem prolina (HARE et al., 2002). Assim,
se faz necessário maiores estudos em plantas onde naturalmente os “pools”
metabólicos de formação de prolina são menores.
Realizaram-se também estudos in vitro para verificar o papel
osmoprotetor da prolina sobre a atividade da enzima Rubisco (Ribulose 1,5-
bisfosfato carboxilase oxigenase) (SIVAKUMAR et al., 1998). Concentrações
crescentes desse aminoácido foram testadas com a principal enzima do cloroplasto
(Rubisco), purificada de plântulas de Brassica juncea, Sesbania sesban e Oryza
sativa. A prolina, na concentração de 1 M, mostrou uma redução de
aproximadamente 50% na atividade da Rubisco nestas espécies. Estes dados são
contrários aos publicados na literatura, onde a prolina tem mostrado desempenhar
24
um papel vital na manutenção da integridade e na estabilização de macromoléculas
(SCHWAB; GAFF, 1990; GERAND et al., 1991).
Outro efeito negativo diz respeito ao acúmulo de sacarose pelas
plantas de cana-de-açúcar transgênicas resultante da competição entre a síntese de
sacarose e aminoácidos. Quando ocorre a assimilação de uma fonte de nitrogênio
(amônia) pela planta, esta exige uma alta demanda por esqueletos de carbono
(CHAMPIGNY, 1995) que poderia ocasionar em um desvio de esqueletos de
carbono para produção deste aminoácido.
Entretanto, estudos indicam que a prolina desempenha um
importante papel durante o desenvolvimento das plantas servindo como uma fonte
rápida e acessível de energia (PHANG, 1985). Além disso, segundo Hu et al. (1996)
a oxidação de uma molécula de prolina fornece 30 ATPs para a célula. Neste
contexto, é importante saber como o acúmulo de prolina influencia outras vias de
energia relacionadas, bem como no metabolismo de carbono durante e após o
período de submissão a estresses abióticos.
1.5 Transformação genética em cana-de-açúcar
O melhoramento direcionado para obter tolerância ao estresse
hídrico em plantas de cana-de-açúcar tem mostrado consideráveis graus de sucesso
no desenvolvimento de variedades de melhor performance a campo sob condições
de estresse hídrico. Entretanto, o melhoramento clássico de cana-de-açúcar
demanda tempo e muito trabalho, além de oferecer um estoque genético limitado
relacionado à tolerância à seca nos bancos de germoplasma.
Uma alternativa para se criar novas plantas de cana-de-açúcar
tolerantes ao déficit hídrico seria a utilização da transformação genética. Além disso,
esta ferramenta viabilizaria o ganho de informações para o melhor entendimento dos
mecanismos que envolvem a tolerância ao estresse. O uso desta tecnologia abre
oportunidades para o aumento da tolerância pela incorporação de genes envolvidos
na proteção ao estresse de alguma fonte dentro de plantas importantes para a
agricultura.
25
O desenvolvimento de métodos de transformação para a introdução
de transgenes em plantas envolve dois objetivos principais: a) melhoria genética
racional de espécies agronomicamente importantes para o cultivo e b) melhor
entendimento da expressão e função do gene nela introduzido. Entretanto, em
certas espécies este procedimento representa um passo limitante, pois é necessário
estabelecer um sistema de transformação bastante eficiente para ser usado como
rotina no laboratório.
A transformação genética de cana-de-açúcar foi primeiramente
obtida em 1992 por Bower; Birch (1992), através da técnica de biobalística. As
plantas transformadas obtidas continham o gene nptII, que codifica para a enzima
neomicina fosfotransferase II, a qual confere resistência a antibióticos
aminoglicosídeos (canamicina e geneticina). No mesmo ano, Chowdhury; Vasil
bombardearam calos embriogênicos de cana-de-açúcar com o gene bar, porém, não
conseguiram regenerar nenhuma planta transgênica, provavelmente devido a idade
e tipo de calo utilizado nos experimentos de transformação.
A transformação genética de cana-de-açúcar está ganhando espaço
e sendo amplamente estudada. Atualmente, existem plantas transgênicas de cana-
de-açúcar com diversas caracteríticas de interesse comercial contendo o gene
marcador de seleção nptII (GAMBLEY et al., 1993; BOWER et al., 1996; ARENCIBIA
et al., 1998; ELLIOTT et al., 1998; CHENGALRAYAN et al., 2001); resistentes a
herbicidas (CHOWDHURY; VASIL, 1992; GALLO-MEAGHER; IRVINE, 1996;
ENRIQUEZ-OBREGON et al., 1998; LEIBBRANDT; SNYMAN, 2003), a insetos
(ARENCIBIA et al., 1997, 1999), ao vírus do mosaico (INGELBRECHT et al., 1999;
BUTTERFIELD et al., 2002), ao vírus Fiji (FDV) (McQUALTER et al., 2004), a
bactéria causadora da escaldadura das folhas (ZHANG et al., 1999).
Foram obtidas plantas transgênicas tolerantes ao déficit hídrico
(ZHANG et al., 2006), com alteração na atividade da enzima polifenol oxidase (PPO)
e sacarose fosfato sintase (SPS) (VICKERS et al., 2005) e produção de ácido p-
hidroxibenzóico (McQUALTER et al., 2005). A cana-de-açúcar transgênica também
foi usada como plataforma para produção de um fator de estimulação humano GM-
CSF empregado no tratamento da neutrofenia e anemia aplástica (WANG et al.,
2005).
26
O método biobalístico, mesmo sendo atrativo para cana-de-açúcar,
apresenta problemas quanto à complexidade de integração. Esse método pode
gerar inserções múltiplas do transgene resultando em silenciamento ou instabilidade
do transgene (LESSARD et al., 2002).
Arencibia et al (1998) e Elliot et al (1998) avaliaram o uso da bactéria
Agrobacterium tumefaciens como método alternativo na transformação genética de
cana-de-açúcar. Entretanto, o espectro natural de hospedeiro desta bactéria definido
como a habilidade de formar tumor, não inclui a maioria das monocotiledôneas,
como a cana-de-açúcar. Assim, são fundamentais a otimização e adequação de
protocolos visando o uso rotineiro desta técnica nos laboratórios.
1.5.1 Transformação para tolerância a estresses abióticos
Os estudos da expressão gênica induzida por estresses abióticos
têm sido realizados principalmente em plantas modelo como Arabidopsis thaliana e
Nicotiana tabacum. Há pouca informação sobre genes expressos em plantas de
cana-de-açúcar durante estresses abióticos, principalmente estresse hídrico. Essas
informações são muito importantes em programas de melhoramento para tolerância
ao estresse por déficit hídrico para serem usadas na obtenção de cultivares
transgênicas com maior tolerância à seca.
O aumento da tolerância ao estresse por déficit hídrico através da
transformação genética vem sendo obtido em várias espécies utilizando-se
principalmente duas estratégias: introdução de genes envolvidos na síntese de
moléculas osmoprotetoras ou através de genes codificando fatores de transcrição.
A estratégia de transferência de genes envolvidos na biossíntese de
osmoproterores, tais como manitol, prolina, trehalose e glicina betaína, tem mostrado
ser efetiva para aumentar a tolerância a temperaturas extremas, salinidade, déficit
hídrico e oxidação (BAJAJ et al., 1999; KISHOR et al., 2005).
Numerosos trabalhos têm sido feitos na tentativa de demostrar a
eficácia destes osmoprotetores na proteção da planta ou microrganismos
submetidos a condições estressantes.
27
Com o uso do gene ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS)
podem-se citar inúmeros trabalhos mostrando sua capacidade de aumentar a
tolerância de plantas a estresses abióticos como, por exemplo, a seca e o estresse
salino. Plantas transgênicas de tabaco superexpressando o gene mutante P5CS,
sob controle do promotor constitutivo CaMV 35S, produziram 5-6 vezes mais prolina
do que as plantas não transformadas em condições normais. Em condições de
estresse salino, plantas transformadas produziram três vezes mais prolina em
comparação às plantas não-transgênicas, mostrando-se tolerantes a altas
concentrações de NaCl (HONG et al., 2000).
O mesmo gene, porém, não mutante foi introduzido em arroz sob o
controle de um promotor ABA-induzido. As plantas transgênicas de arroz
acumularam 2,5 vezes mais prolina que as plantas controle sob condição de
estresse. Resultados preliminares mostraram que a expressão induzida do gene
P5CS, na segunda geração de plantas transgênicas de arroz, proporcionou um
aumento da biomassa refletindo no aumento do peso fresco de raiz e da parte aérea
sob condições de estresse hídrico e salino (ZHU et al, 1998).
Recentemente, foram obtidas plantas transgênicas de trigo
produzindo altos níveis de prolina (SAWAHEL & HASSAN, 2002). Esses autores
consideram que a partir da combinação do melhoramento convencional e de plantas
transgênicas é possível produzir culturas tolerantes ao NaCl. Também, plantas do
porta-enxerto citrange Carrizo, transformadas com o gene mutante P5CS,
acumularam altas concentrações de prolina nas folhas e, conseqüentemente,
apresentaram maior tolerância ao estresse hídrico (MOLINARI et al., 2004).
Plantas de tabaco transformadas com gene mtlD, que codifica a
enzima manitol-1-fosfato desidrogenase, mostraram maior acúmulo de manitol.
Estas plantas apresentaram também aumento na tolerância a altas concentrações
salinas comparado a plantas controle (TARCZYNSKY et al., 1993). Thomas et al.,
(1995) transformando plantas de A. thaliana com o mesmo gene verificaram que
sementes transgênicas acumulavam manitol quando germinadas em presença de
altas concentrações salinas, enquanto que sementes não transgênicas não
germinavam nestas condições. Entretanto, Karakas et al. (1997) observaram que
plantas transgênicas de tabaco transformadas com o gene mtlD mostraram um
28
aumento em peso seco sob estresse salino, porém nenhuma diferença no
crescimento pode ser verificada entre plantas transgênicas e o controle sob estresse
hídrico. Além disso, foi observado que o acúmulo de manitol contribuiu muito pouco
para o ajuste osmótico nas plantas de tabaco transgênicas.
Quanto à utilização do osmoprotetor glicina betaína, Lilius et al.
(1996) introduziram em tabaco o gene betA de E. coli que codifica a enzima colina
desidrogenase. Plantas transformadas com este gene mostraram-se mais tolerantes
ao estresse salino quando comparadas ao controle. Posteriormente, o gene da
enzima colina oxidase (codA) que converte colina a glicina betaína, isolado de
Arthrobacter globiformis, foi introduzido em A. thaliana. Plantas transgênicas com
este gene acumularam glicina betaína e mostraram aumento na tolerância aos
estresses salino e frio (HAYASHI et al., 1997; ALIA et al., 1998). Sakamoto et al.
(1998) mostraram também que plantas transgênicas de arroz superexpressando o
gene codA foram mais tolerantes aos estresses salino e frio.
Um outro importante osmoprotetor é a trealose, um dissacarídeo não
reduzido de glicose encontrado em bactérias, fungos, insetos. Somente no final da
década passada foi identificada em plantas superiores (GODDIJIN et al., 1997). A
dificuldade na identificação da trehalose, provavelmente, foi devido à alta atividade
da enzima trehalase em plantas superiores (NEPOMUCENO et al., 2001). Plantas
que produzem trealose são, na maioria das vezes, altamente tolerantes ao estresse
por dessecação. O gene trealose-6-fosfato sintetase (TPS1) de levedura foi
introduzido em tabaco. O acúmulo de trealose nas plantas mostrou múltiplas
alterações fenotípicas e aumento na tolerância ao estresse hídrico (ROMERO et al.,
1997). Pilon-Smits et al. (1998) introduziram o gene trealose-6-fosfato sintase (otsA)
e trealose-6-fosfato fosfatase (otsB) de bactéria em tabaco. As folhas das plantas
transgênicas se mostraram grandes, além de apresentarem melhor crescimento em
termos de peso seco sob estresse hídrico, acumulando trealose acima de 0,17 mg
por grama de peso fresco. Estas plantas também mostraram maior eficiência na
atividade fotossintética.
Outro osmoprotetor são as frutanas que são moléculas de polifrutose
produzidas por muitas plantas e bactérias. Devido à sua alta solubilidade, elas
podem ajudar as plantas sobreviverem em períodos de estresse osmótico. Pilon-
29
Smits et al. (1995) introduziram um gene de bactéria codificando para frutana sintase
(sacB) isolado de Bacillus subtilis em tabaco. Sob condições normais, a presença de
frutana não apresentou efeitos significativos na taxa de crescimento e rendimento.
Estas plantas transgênicas tiveram melhor performance sob estresse osmótico
mediado por PEG (Poli Etileno Glicol) comparado a plantas controle e resistência ao
estresse correlacionado com as quantidades de frutana acumulado.
A expressão de um cDNA codificando para outro osmoprotetor, o
mio-inositol O-metiltransferase (IMT1), em tabaco durante estresse hídrico e salino
resultou no acúmulo de inositol metilado (D-ononitol), o qual confere tolerância a
ambos estresses (SHEVELEVA et al., 1997). Desde que o nível de D-ononitol
alcance mais que 600 mM no citosol e ele não entre no vacúolo, seu acúmulo
promove um balanço osmótico de Na
+
.
Poliaminas compreendem outro grupo de osmoprotetores, sendo
pequenos e ubíquos componentes nitrogenados celulares que têm implicações em
uma variedade de respostas ao estresse em plantas. Poliaminas são acumuladas
sob algumas condições de estresse abiótico, incluindo estresse hídrico e salino.
Cultivares que continham altos níveis de poliaminas demonstraram um decréscimo
na tolerância ao estresse salino (GALSTON et al., 1997). A aplicação exógena de
poliaminas proporcionou a folhas de aveia proteção contra o estresse osmótico
(BESFORD et al., 1993). Minocha; Sun, (1997) mostraram que células transgênicas
de cenoura superexpressando ornitina decarboxilase de rato, converteram ornitina
para diamina putrescina, podendo assim resistir ao estresse osmótico e salino a um
curto período de 0 a 48 horas. Capell et al. (1998) superexpressou o gene da
arginina descaboxilase de aveia em arroz. Embora as plantas apresentassem
aumento na tolerância à seca em termos de clorofila perdida sob estresse hídrico, a
expressão constitutiva deste gene afetou severamente os padrões de
desenvolvimento in vitro.
A segunda estratégia foi usada para a transformação de Arabidopsis
thaliana com o fator de transcrição DREB1A, que se liga a uma região chamada de
DRE, essencial para a expressão de genes responsivos ao estresse hídrico,
aumentando a tolerância a vários estresses, entre os quais a seca (KASUGA et al.,
1999).
30
Para análise de genes envolvidos na resposta a estresses abióticos
são fundamentais a obtenção de plantas transformadas com construções quiméricas
constituídas de seqüências regulatórias e um gene indicador (XIONG et al., 1999).
Por sua excelente resposta a diversos sistemas de transformação, A. thaliana tem
sido usada como planta modelo para a maioria dos estudos de tolerância a
estresses abióticos (ZHU et al., 1997; HUANG et al., 2000; SCHOEREDER et al.,
2001). Apesar da importância dos estudos realizados com plantas modelos, a
utilização da espécie vegetal alvo evitaria diversos problemas resultantes da
extrapolação de dados e permitiria que os resultados obtidos se transformassem em
uma nova tecnologia mais rapidamente.
31
2 REFERÊNCIAS
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between the induction of a gene for delta
1
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62
3. ARTIGO
Expressão estresse induzida do gene P5CS em cana-de-açúcar (Saccharum
spp.) confere tolerância ao déficit hídrico
63
3.1 Resumo
Título: Expressão estresse induzida do gene P5CS em cana-de-açúcar
(Saccharum spp.) confere tolerância ao déficit hídrico
O objetivo deste estudo foi transformar a cana-de-açúcar RB855156 com o gene ∆
1
-
pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS) de Vigna aconitifolia. Calos embriogênicos
provenientes de folhas imaturas foram bombardeados com o plasmídeo pJS107, o
qual possui o gene P5CS que codifica a enzima ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato sintetase,
limitante na biossíntese de prolina em plantas, sob controle do promotor estresse
induzido AIPC. Para isto, foram analisados 3 eventos de transformação utilizando o
gene bar como marcador de seleção. As concentrações de prolina, conteúdo de
malondialdeído (MDA), clorofila total e o efeito do tratamento do déficit hídrico foram
analisados. Em condições de déficit hídrico, os eventos de transformação
acumularam prolina até 28,8 µmol g
-1
de massa foliar seca em comparação com
plantas não transformadas. Os níveis de MDA nas plantas controle foram em média
27% maior do que nas plantas transgênicas. Segmentos foliares de cana-de-açúcar
transgênicas tratadas com 5 µM de paraquat, um herbicida indutor de estresse
oxidativo celular, mostraram níveis de clorofila total em média 80% maior a partir do
sexto dia de déficit hídrico comparado com as plantas não transformadas. Mesmo
em condição de déficit hídrico severo, o potencial osmótico na folha tanto de plantas
transgênicas quanto de plantas controle não se mostrou diferente. Até o sexto dia de
estresse hídrico, tanto plantas controle quanto plantas transgênicas não
apresentaram alterações significativas nos parâmetros F
0
e Fv/Fm. No nono e
décimo segundo dia de estresse hídrico, plantas transgênicas apresentaram
rendimento fotoquímico (Fv/Fm) em média 64% e 60% maior, respectivamente.
Estes resultados sugerem a participação da prolina na proteção do aparelho
fotossintético através de sua habilidade em atuar mais como um removedor de
espécies reativas de oxigênio (ROS) do que como um osmoprotetor.
Palavras-chave: Saccharum spp., prolina, MDA, fluorescência da clorofila a,
paraquat, tolerância à seca
64
3.2 Abstract
Title: Stress induced expression of P5CS gene in sugarcane (Saccharum spp.)
confers tolerance to water deficit
The objective of this study was to transform sugarcane RB855156 with a ∆
1
-pirroline-
5-carboxylate sinthetase gene (P5CS) of Vigna aconitifolia. Embriogenic callus from
immature leaves were bombarded with pJS107 plasmid that contains the P5CS
gene, which codes for an enzyme ∆
1
-pyrroline-5-carboxylate synthetase, under
control of a stress-inducible promoter complex AIPC. Therefore, three transformation
events were analyzed using the bar gene. Free proline contents, malondialdehyde
contents (MDA), total chlorophyll contents and the effect of water stress treatment
were analyzed. In stressed conditions, the transformation events accumulated proline
up to 28.8 µmol g
-1
leaf dry weight compared with non-transformed plants. The levels
of MDA in control plants were 27% higher than in transgenic plants. Leaf segments of
transgenic sugarcane treated with 5 µM of paraquat, an inducer of cellular oxidative
stress, showed total chlorophyll contents 80% higher since the sixth day after water
deficit compared with non-transformed plants. Even in severe water deficit conditions,
the leaf osmotic potential of transgenic plants was not different from non-transformed
plants. Under six days of water deficit, no significant alteration in Fo and Fv/Fm was
found in both transgenic and control plants. On the ninth and twelfth day of water
deficit, transgenic plants presented quantum yield (Fv/Fm) 64% and 60% higher,
respectively. These results suggest the participation of proline in protection of
photosynthetic apparatus more by its ability to act as a free radical scavenger than
osmoprotection.
Key words: Saccharum spp., proline, MDA, chlorophyll fluorescence, paraquat,
drought tolerance
65
3.3 Introdução
A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância econômica
no mundo. É cultivada em regiões tropicais e subtropicais de mais de 70 países,
sendo o Brasil o maior produtor mundial de açúcar (OIA, 2006). O setor
sucroalcooleiro responde por um faturamento anual da ordem de US$ 7 bilhões
(UNICA, 2006). Atualmente, as variedades de cana cultivadas são o resultado do
cruzamento interespecífico entre Saccharum officinarum, S. barbieri, S. sinense e as
espécies selvagens S. spontaneum e S. robustum. A cana-de-açúcar apresenta um
dos genomas mais complexos do reino vegetal, com um número diplóide de
cromossomos que varia entre 70-120 (D’HONT et al., 1996). Esta complexidade
dificulta a aplicação de técnicas convencionais de melhoramento genético para a
cultura visando o desenvolvimento de novos cultivares com maior produtividade e
tolerância a estresses bióticos e abióticos (HOGARTH, 1987). Além disso, muitos
materiais altamente promissores são descartados por apresentarem defeitos, como
por exemplo, susceptibilidade a alguma doença. Desta forma, tal complexidade e
fatores somados tornam a cana-de-açúcar uma excelente candidata ao
melhoramento por meio da engenharia genética (ROACH, 1995).
Assim como toda cultura agrícola, a produção da cana-de-açúcar é
influenciada por um grande número de fatores ambientais que afetam de maneira
negativa seu crescimento, metabolismo e produtividade. Seca, salinidade, baixas e
altas temperaturas, inundação, poluentes e radiação são os fatores de estresse mais
importantes que limitam a produtividade das culturas (LAWLOR, 2002). No Brasil,
dentre estes fatores, o estresse hídrico é o que freqüentemente mais influencia de
forma negativa a produtividade da cana-de-açúcar. Assim, seus efeitos nas plantas
incluem redução nas taxas de assimilação de CO
2
, tamanho das células foliares,
taxa de transpiração, potencial de água na planta, taxa de crescimento e abertura
estomática (HSIAO, 1973; CHAVES et al., 2003). Além disso, o déficit hídrico
influencia de maneira direta o crescimento dos perfilhos e a altura final dos colmos e,
conseqüentemente, a produção de açúcar (GASCHO; SHIH, 1983, SUGIHARTO,
2004).
66
O déficit hídrico causa à planta uma série de mudanças fisiológicas,
iniciando pelo decréscimo de pressão de turgor da célula (BAJAJ et al., 1999; ZHU,
2002; CHAVES et al., 2003). Também, afeta muitos processos bioquímicos e
fisiológicos importantes como ajustamento osmótico, sistema de defesa de enzimas
antioxidantes e peroxidação lipídica.
Muitas plantas respondem ao déficit hídrico por acumular compostos
orgânicos não tóxicos de baixo peso molecular, coletivamente conhecidos como
solutos ou osmólitos compatíveis, tais como a prolina (RHODES; SÂMARAS, 1994;
KISHOR et al., 2005). Plantas submetidas ao déficit hídrico acumulam prolina nas
células, o que resulta em decréscimos no potencial osmótico (Ψ
s
). Esta redução no
Ψ
s
favorece a manutenção da absorção de água e da pressão de turgor da célula,
contribuindo assim para a manutenção de processos como abertura estomática,
fotossíntese e crescimento da planta (ZHANG et al., 1999). A prolina também, está
envolvida na proteção de estruturas celulares, e de vários processos metabólicos
(RATHINASABAPATHI et al.,2000; KISHOR et al., 2005). Além disso, a prolina pode
atuar como um removedor de espécies reativas de oxigênio (ROS) (BOWLER et al.,
1992; TSUGANE et al., 1999). Desta forma, o aumento da síntese de prolina em
plantas pode auxiliar na tolerância ao estresse oxidativo.
Em plantas, a prolina é sintetizada a partir de glutamato e ornitina
(HU et al., 1992; KISHOR et al., 2005). A via glutamato é predominante em plantas
em condições de estresse osmótico e falta de nitrogênio (DELAUNEY et al., 1993).
O glutamato é convertido para glutamato semi-aldeído por uma única enzima
bifuncional, ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS), o qual é ciclado
espontaneamente para pirrolina-5-carboxilato, que é então reduzido a prolina pela
enzima pirrolina-5-carboxilato redutase (P5CR).
O aumento da tolerância ao déficit hídrico pela transformação
genética já foi obtido em várias espécies utilizando-se duas estratégias: introdução
de genes envolvidos na síntese de moléculas osmoprotetoras ou através de genes
codificando fatores de transcrição (RIBAUT et al., 2002).
Dentro do grupo de moléculas osmoprotetoras, inúmeros trabalhos
mostram a capacidade da prolina em aumentar a tolerância de plantas a estresses
abióticos como, por exemplo, a seca e o estresse salino (KISHOR et al., 1995; ZHU
67
et al, 1997; HONG et al., 2000; NANJO et al., 1999; SAWAHEL & HASSAN, 2002;
MOLINARI et al., 2004; DE RONDE et al., 2004; HMIDA-SAYARI et al., 2005).
Assim, a obtenção de variedades de cana-de-açúcar com maior
acúmulo de prolina representa uma estratégia promissora para aumentar a
tolerância a estresses, principalmente o estresse hídrico, além de proporcionar
valioso material tanto para estudos sobre mecanismos de tolerância a estresses
abióticos como para utilização direta em sistemas produtivos.
68
3.4 Material e Métodos
3.4.1 Material Vegetal
Plantas de cana-de-açúcar, variedade RB855156, com 6 a 8 meses
de cultivo foram utilizadas para os estudos. Esta variedade é o resultado do
cruzamento RB72454 x TUC71-7. Trata-se de uma variedade precoce, rica e
altamente produtiva. Em ensaios preliminares apresentou grande produção de calos
embriogênicos in vitro.
3.4.2 Cultura de tecidos e transformação genética
Folhas imaturas (cilindro de aproximadamente 2 x 10 cm) foram
desinfestadas superficialmente por 1 min com EtOH 70% (v/v), seguido de
incubação por 20 min com uma solução de 2,5% (v/v) de hipoclorito de sódio e
enxaguadas cinco vezes com água destilada esterilizada. Segmentos transversais
da região meristemática foram então removidos e cortados transversalmente em
segmentos de 2-3 mm, os quais foram usados para os experimentos de
transformação (BOWER et al., 1996). Os explantes foram colocados em frascos
Magenta
TM
com meio de indução contendo micro e macronutrientes do meio MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 20 g l
-1
de sacarose, 280 mM
arginina, 13 µM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e solidificado com 8 g l
-1
de
Bacto Agar. As culturas foram mantidas no escuro a 27±1 ºC por 4 semanas. Os
calos embriogênicos que surgiram nos explantes foram individualizados e
transferidos para meio de indução, anteriormente citado. Foram realizados de 3 a 5
sub-cultivos em intervalos de 15 dias para promover o rápido crescimento dos calos
embriogênicos e, também, facilitar a eliminação dos calos não embriogênicos.
Para transformação, calos embriogênicos (4-8 mm) foram mantidos
em meio de cultura quatro horas antes e depois do bombardeamento de partículas
(VAIN et al., 1993).
A suspensão de micropartículas foi preparada de acordo com
metodologia de Sanford et al. (1993) usando 25 µl de suspensão de partículas (60
mg ml
-1
), 2,5 µl do plasmídeo pJS107 (0,5 mg µl
-1
), 25 µl CaCl
2
(2,5 M) e 10 µl de
69
espermidina (0,1 M). Cinco microlitros da suspensão de micropartículas foram
pipetadas em membrana carreadora e secas em suporte contendo sílica gel em
câmara de fluxo laminar. Partículas de tungstênio M-17 (Biorad, ~1.1 µM) foram
usadas para os experimentos. O equipamento de bombardeamento PDS-1000/He
(Biorad) foi usado com pressão de vácuo de 27’’ Hg, 10 mm de distância do disco de
ruptura e 10 mm da membrana carreadora. A pressão de ruptura de disco usada e
distância da prateleira (distância percorrida pela micropartícula até atingir o explante)
foram de 1200 psi e 90 mm, respectivamente.
Após o bombardeamento, os calos foram selecionados em meio de
cultura contendo 25 µM de glufosinato de amônio. As plantas transformadas foram
regeneradas e enraizadas pela transferência dos calos embriogênicos para meio
sem a adição de 2,4-D. As culturas foram mantidas a 27±1 ºC sob fotoperíodo de 16
horas luz e intensidade luminosa de 30 µmol m
-2
s
-1
. Plantas enraizadas in vitro
foram transplantadas para isopor em substrato comercial (Plantmax
TM
) acrescido de
matéria orgânica e vermiculita.
3.4.3 Plasmídeo pJS107
O plasmídeo vetor pJS107 (SU et al., 1998), usado para
transformação da cana-de-açúcar, contém o gene marcador de seleção bar que
codifica para a enzima fosfinotricina acetil transferase (confere resistência ao
herbicida glufosinato de amônio) sob o controle do promotor constitutivo CaMV 35S
e o gene P5CS de Vigna aconitifolia, sob controle do complexo promotor estresse
induzido designado como AIPC (ABA inducible promoter complex). O promotor AIPC
contém um elemento ABA responsivo (ABRC1) de 49 pb do gene HVA22 de cevada
(SHEN & HO, 1995), uma versão mínima de 180 pb da região promotora do gene
Actina 1 (pAct1-100) de arroz e a seqüência intron de 233 pb do gene HVA22
(FIGURA 1).
70
FIGURA 1. Diagrama do plasmídeo pJS107 utilizado nos experimentos de
transformação de cana-de-açúcar. Barra em negrito corresponde à sonda usada
para análises de DNA e RNA.
3.4.4 Análises da integração do transgene
A análise das plantas transformadas foi realizada por reação em
cadeia da polimerase (PCR) para detectar a presença do transgene bar em plântulas
“in vitro”. DNA genômico foi extraído através de protocolo baseado em Doyle &
Doyle (1987). Cada reação (20µl) continha 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 3
mM MgCl
2
, 100 µM de cada dNTP, 1,0 U de Taq polimerase, 50 ng de DNA e 5 µM
de cada oligonucleotídeo iniciador específico para o gene bar. Os oligonucleotídeos
iniciadores 5’-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’ e 5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-
3’ foram utilizados para a amplificação de um fragmento de 450 pb. As reações
foram submetidas ao seguinte programa de temperaturas: 5 min a 94 ºC, seguido de
40 ciclos de amplificação (1 min a 94 ºC; 1 min 59 ºC; 1 min a 72 ºC) e extensão final
de 5 min a 72 ºC, em termociclador PTC-100
TM
(MJ Research, Walthan, MA, U.S.A).
Os produtos das reações de PCR foram submetidos à eletroforese em tampão SB
1X (BRODY; KERN, 2004) em gel de agarose 1,5% (p/v) e visualizados após
coloração com brometo de etídeo (0,5 µg/ml) sob luz UV.
Análises de Southern blot foram feitas para confirmar a integração do
transgene P5CS nas plantas transgênicas de cana-de-açúcar. O DNA genômico foi
isolado de folhas inteiramente expandidas de acordo com metodologia de Doyle &
Doyle (1987). Vinte µg de DNA de cada amostra foram incubadas com as enzimas
NotI e BamHI a 37 ºC por 16 h e submetidas à eletroforese em tampão SB 1X em
gel de agarose 0,8% (p/v) a 2 V/cm por 16 h. Após a eletroforese, foi feita a
transferência do DNA à membrana de Nylon (Hybond-N
+
, Amershan Pharmacia
BamHI BamHI NotI
71
Biotech, PI, EUA) e fixado mediante incubação a 80 ºC por 2h, conforme descrito por
Sambrook et al. (1989). Seqüência de aproximadamente 2,4 Kb, correspondente ao
gene completo P5CS, foi utilizado como sonda para hibridização. Esta sonda foi
obtida através da digestão do plasmídeo pJS107 com BamHI, sendo a marcação
feita utilizando α
32
P d-CTP pela técnica de “random priming”. Após hibridização e
lavagens a 42 ºC, as membranas foram expostas a filme de Raio-X a -70 ºC.
Plantas que apresentaram amplificação para o gene bar, juntamente
com plantas controle (não transformadas) foram usadas para o ensaio de resistência
ao herbicida glufosinato de amônio. Plantas foram pulverizadas duas vezes com o
herbicida glufosinato de amônio a 2%. As plantas foram avaliadas 8 dias após a
pulverização.
3.4.5 Análise da expressão do transgene
Para as análises de Northern blot, RNA total foi extraído de folhas
inteiramente expandidas de cana-de-açúcar utilizando TRIzol (Invitrogen). Dez µg de
RNA total de plantas transgênicas e não transgênicas foram submetidas à
eletroforese em gel de agarose desnaturante (1,0% de formaldeído). Após a
eletroforese, o RNA foi transferido para uma membrana de Nylon (Hybond-N
+
,
Amershan Pharmacia Biotech, PI, EUA) e fixado mediante incubação a 80 ºC por 2h,
conforme descrito por Sambrook et al. (1989). Sequência de aproximadamente 2,4
Kb correspondente ao gene completo P5CS foi utilizado como sonda para
hibridização. A marcação da sonda foi feita utilizando α
32
P d-CTP pela técnica de
“random priming”. Após hibridização e lavagens a 42 ºC, as membranas foram
expostas a filme de Raio-X a -70 ºC.
3.4.6 Análise da tolerância ao déficit hídrico
Cinco plantas de cada um dos eventos 4, 7 e 10 de cana-de-açúcar
e do controle, clonadas por micropropagação, foram submetidas a um período de 12
dias sem adição de água em vasos com 17 Kg de substrato (3 terra: 1 areia). Para
72
minimizar a variabilidade, todas as plantas tinham idade e tamanho similar (2 meses
e cerca de 100 cm de altura).
Os vasos foram dispostos em posições semelhantes em relação à
incidência de radiação solar. As coletas de dados foram feitas a cada três dias, a
partir do início do déficit hídrico. O monitoramento da umidade no substrato dos
vasos foi feito durante os 12 dias de estresse hídrico com o auxílio de sondas TDR
(Time Domain Reflectometry) acopladas ao aparelho Tektronix 1502B Metallic TDR
Cable Tester (Tektronix). Os valores obtidos nas leituras foram multiplicados por um
fator para estimativa da umidade do solo. Para isso, utilizou-se a equação de
calibração para a constante dielétrica (Ka) proposta por Topp (1980):
q (m
3
m
-3
) = (-5,3 x 10
-2
) + (2,92 x 10
-2
Ka)- (5,5 x 10
-4
x Ka
2
) + (4,3 x 10
-6
x
Ka
3
)
A constante dielétrica (Ka) é obtida em função do comprimento da
haste (L; m), que é corrigida pela velocidade de propagação do pulso elétrico (VP =
0,66). É usado o fator 1000 para transformar os dados das leituras na unidade
métrica (m), considerando-se o comprimento das hastes metálicas das sondas de
220 mm, sendo L = leitura/0,66 e Ka = (L/1000/0,22)
2
.
O estado da água nas folhas foi monitorado através de psicrômetros
de termopar (modelo C-30, Wescor, Inc., Logan, Ut, U.S.A.) acoplados a um
datalogger (Campbell Scientific, Inc., Logan, Ut, U.S.A., modelo CR-7). A cada dia de
leitura, entre 9h30 e 10h, uma amostra de aproximadamente 2 cm
2
da folha + 1 de
cada planta foi coletada e colocada nos psicrômetros. O datalogger foi programado
para que as leituras fossem efetuadas a cada 10 min até que o equilíbrio da pressão
de vapor na câmara fosse verificado. A microvoltagem fornecida pelo sistema foi
convertida em potencial da água (MPa) em função de prévia calibração dos
sensores com soluções de cloreto de sódio. Após a obtenção do potencial total da
água (Ψ
t
), os sensores foram imersos durante 4 min em nitrogênio líquido e as
leituras foram retomadas para obtenção do potencial osmótico (Ψ
s
). O cálculo do
potencial de pressão foi realizado através de Ψ
t
- Ψ
s
.
73
Logo após a coleta do material, as taxas de fotossíntese líquida
(µmol CO
2
.m
-2
.s
-1
) em cada planta foram obtidas utilizando um sistema portátil de
fotossíntese, modelo LI-6200 (LI-COR), Lincoln, NE, EUA), com câmara de 1 litro. As
medidas foram feitas em condições naturais, em folhas +1 da planta. As plantas
estressadas, após terem atingido um valor de assimilação de CO
2
próximo de zero,
foram irrigadas novamente.
3.4.7 Medidas da fluorescência da clorofila a
A emissão de fluorescência inicial, máxima e variável, e a estimativa
da capacidade fotoquímica do fotossistema II (dado pela razão entre fluorescência
variável e fluorescência máxima) foram determinadas por um fluorômetro portátil
"Plant Efficiency Analyser", PEA (Hansatech Instruments). As medidas foram feitas
após pré-condicionamento no escuro, por uma hora, para garantir o estado oxidado
dos centros de reação fotossintéticos. Todas as medições foram feitas em folhas +1.
3.4.8 Determinação da quantidade de prolina
A determinação da concentração de prolina nas folhas foi feita
baseada em curva-padrão, conforme descrito por Bates (1973). Resumidamente, em
condições normais e de estresse hídrico, folhas de cada uma das cinco plantas
transgênicas de cada evento e das plantas controle foram utilizadas para a análise
de prolina. Como a concentração deste aminoácido varia conforme o estádio de
desenvolvimento das folhas, padronizou-se o uso de folhas de mesma idade e
tamanho. Foram coletados 100 mg de tecido, rapidamente congelado e macerado
em N
2
líquido. A extração foi feita com adição de ácido sulfosalicílico (10%) e, em
seguida, o extrato foi centrifugado (10.000 rpm) por 5 min. Foram coletados 2 ml do
centrifugado e acrescentados 2 ml da solução de ácido nihídrico (1,25 g de nihidrina;
30 ml de ácido acético glacial; 20 ml de ácido fosfórico 6M) e de 2 ml de ácido
acético glacial em tubos de microcentrífuga de 15 ml. As amostras foram então
incubadas a 100 ºC por 1 h e, em seguida, transferidas para gelo. Após incubação,
as amostras foram acrescidas de 4 ml de tolueno e homogeneizadas por 20 s para
74
completa extração da prolina. O sobrenadante foi utilizado para determinação da
concentração de prolina por espectrofotometria (520 nm).
3.4.9 Determinação do conteúdo de malondialdeído (MDA)
Em condições normais e de estresse hídrico, folhas de cada um dos
eventos transgênicos e de plantas controle foram utilizadas para a análise do
conteúdo de MDA segundo metodologia de Hodges et al. (1999). Tecidos foliares
(sem a nervura central) foram pulverizados em almofariz e homogeneizados em
solução 80:20 (v/v) etanol:água, seguido de centrifugação a 3000 g por 10 min. Um
mililitro do extrato foi colocado em um tubo de microcentrífuga de 15 ml e misturado
a mais um mililitro dos reagentes: a. solução –TBA (20% (p/v) de ácido
tricloroacético), b. solução +TBA (20% (p/v) de ácido tricloroacético e 0,65% (p/v) de
TBA (ácido tiobarbitúrico) ). As amostras foram então misturadas vigorosamente e
incubadas a 100 ºC por 25 min, em seguida, transferidas para gelo e centrifugadas a
3000 g por 10 min. As absorbâncias foram lidas nos comprimentos de onda 440 nm,
532 nm e 600 nm. Equivalentes de malondialdeído foram calculados da seguinte
maneira:
1) [(Abs 532
+TBA
)-(Abs 600
+TBA
) – (Abs 532
-TBA
-Abs600
-TBA
)] = A
2) [(Abs 440
+TBA
-Abs 600
+TBA
) 0.0571] = B
3) Equivalentes de MDA (nmol ml
-1
) = (A-B/157 000) 10
6
3.4.10 Determinação do conteúdo de clorofila total e testes de estresse
oxidativo
Os testes de estresse oxidativo em plantas de cana-de-açúcar foram
feitos de acordo com Moon et al. (2003). Folhas recém coletadas tanto de plantas
transgênicas quanto de não transgênicas, submetidas a déficit de água gradativo de
12 dias, foram coletadas e incubadas em placas de Petri (3 segmentos com ~1 cm
2
de área) em solução de água destilada contendo 5 µM de paraquat por 24h de luz e
intensidade luminosa de 50 µmol m
-2
s
-1
. Segmentos foliares de cana-de-açúcar não
tratados com paraquat foram usados como controle negativo.
75
O conteúdo de clorofila total foi determinado segundo metodologia
de Lichtenthaler (1987). A extração da clorofila foi feita em acetona 80% e a
quantificação por espectrofotometria em 663 e 645 nm. Os cálculos de mg de
clorofila por grama de peso fresco de tecido foliar basearam-se nas equações:
1) Clorofila a (µg ml
-1
) = 12,7 (Abs
663
) – 2,69 (Abs
645
)
2) Clorofila b (µg ml
-1
) = 22,9 (Abs
645
) – 4,68 (Abs
663
)
3) Clorofila total (µg ml
-1
) = 20,2 (Abs
645
) + 8,02 (Abs
663
)
3.4.11 Determinação da massa seca total de parte aérea e raiz
Para determinação da massa seca total tanto de parte aérea quanto
de raiz foram utilizadas cinco plantas de cada tratamento (controle, evento 4, evento
7 e evento 10 de cana-de-açúcar transgênica). O material foi seco em estufa com
circulação forçada de ar à temperatura de 80 ºC, até atingirem massa constante.
3.4.12 Análises estatísticas
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos inteiramente
casualizados com 5 repetições sendo que cada repetição consistiu de um clone de
cada evento e da planta controle. Os tratamentos utilizados foram dispostos em
esquema fatorial 4 x 4, para plantas e épocas de submissão ao déficit hídrico. Foram
considerados como tratamento testemunha as plantas não transformadas que
passaram por protocolo de cultura de tecidos. Foi realizada a análise de variância
dos dados pelo teste F. A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa
SAS, sendo a comparação entre médias efetuada pelo teste de Tukey (P = 0,05).
3.5 Resultados
3.5.1 Transformação genética
O esquema de obtenção de explantes, transformação e
regeneração, a partir de segmentos transversais (2-3 mm) de folhas imaturas de
cana-de-açúcar de material proveniente de campo, pode ser observado na FIGURA
76
2. Para este estudo foram obtidas eficiências de transformação de 1,7%, usando a
variedade de cana-de-açúcar RB855156 (TABELA 1). A eficiência de transformação
foi calculada pela fórmula: (nº de plantas bar positivas enraizadas / nº de placas
bombardeadas x quantidade de calos por placa) x 100. Nenhuma diferença
morfológica aparente foi observada nas plantas transgênicas quando comparadas a
plantas não transgênicas 2 meses após a transferência das plantas para a casa-de-
vegetação.
TABELA 1. Eficiência de transformação via biobalística com a variedade de cana-de-
açúcar RB855156
Variedade Nº de placas
bombardeadas
Quantidade
de calos por
placa
Nº de calos
bar positivos
regenerados
Nº de plantas
bar positivas
enraizadas
RB 855156
40 25 6 17
Os eventos com maiores concentrações de prolina nas folhas foram
selecionados após submissão das plantas transgênicas a 9 dias de estresse.
Enquanto plantas controle apresentavam concentrações que variaram de 3,42 a
4,87 µmoles de prolina g
-1
de peso fresco, as plantas transgênicas selecionadas de
cana-de-açúcar variedade RB855156 variaram de 15,82 a 28,8 µmoles de prolina g
-1
de peso fresco (Dados não apresentados). Os melhores eventos quanto ao acúmulo
estresse induzido de prolina foram os eventos 4, 7 e 10, todos com cerca de 2-2,5
vezes mais prolina em relação às plantas controle (não transformadas).
77
FIGURA 2. Esquema de regeneração e transformação de cana-de-açúcar. A –
Explantes de folhas imaturas com 2-3 mm; B – Calos embriogênicos obtidos após 4
subcultivos em meio MS acrescido de 13 µM de 2,4-D; C – Aparelho de
bombardeamento PDS-1000/He usado nos experimentos de transformação genética
da cana-de-açúcar; D – Etapa de regeneração dos calos embriogênicos em meio de
cultura contendo 25 µM de glufosinato de amônio; E – Alongamento e enraizamento
das plantas putativas transgênicas de cana-de-açúcar; F – Fase de aclimatização
das plantas em casa-de-vegetação; G – Fase de multiplicação dos eventos.
Explante
Embriões
somáticos
Acelerador de
partículas
Seleção dos
transformantes
Aclimatização
Multiplicação dos
eventos
Tratamento
osmótico
Micropropagação
in vitro
Incubação
escuro MS +
2,4D
D
R
e
g
e
n
e
r
a
ç
ã
o
A
B
C
A
E
F
A
G
A
78
3.5.2 Análises moleculares
A inserção do transgene bar no genoma da variedade de cana
RB855156 foi detectado por meio de PCR (reação em cadeia da polimerase). Das
26 plantas obtidas pelo processo de transformação biolística, 17 mostraram o
fragmento esperado de 450 pb (FIGURA 3). Como esperado, plantas não
transgênicas que passaram pelo mesmo protocolo de regeneração não
apresentaram o fragmento.
FIGURA 3. Análises de PCR de cana-de-açúcar variedade RB 855156. Linha M –
Marcador de peso molecular (Ladder 100 pb); linhas 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9,10, 12, 18 –
plantas transgênicas; linhas 3, 5, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 19 – escapes; linha C –
controle negativo de cana-de-açúcar variedade RB855156 (planta não
transformada); P – controle positivo (plasmídeo pJS107).
Para determinar o número de cópias que foram inseridos no genoma
da variedade de cana RB855156, foram feitos Southern blots de 4 plantas
selecionadas que se mostraram positivas para o PCR com o gene bar e que
apresentaram maior conteúdo de prolina nas folhas em testes preliminares. DNA
total obtido de folhas foram digeridos primeiramente com a enzima de restrição NotI
que possui um único sítio no T-DNA e posteriormente com a enzima de restrição
BamHI. Ambas digestões foram hibridizadas com sonda de ~2,4 kb referente ao
gene completo P5CS de Vigna aconitifolia. Todas as plantas analisadas mostraram a
integração do transgene em seu genoma (FIGURA 4). Somente o evento 10
apresentou uma única cópia do transgene. Os eventos independentes 4 e 7
apresentaram duas cópias do transgene, enquanto que o evento 6 apresentou
79
quatro cópias do transgene em seu genoma. Para verificar a possibilidade de
múltiplas cópias no mesmo sítio de inserção do transgene, procedeu-se à digestão
das amostras com a enzima de restrição BamHI, que libera o gene P5CS não
mutante de Vigna aconitifolia do vetor pJS107. Assim, foi possível correlacionar a
variação entre as bandas em relação à intensidade do sinal de hibridização e o
número de cópias (FIGURA 4).
FIGURA 4. Análise de Southern blot em cana-de-açúcar. A – Gel de agarose com
amostras digeridas com as enzimas NotI e BamHI. B – Southern dos eventos
selecionados. Linha ND – DNA de plantas transgênicas não digerido; Linha C –
controle negativo de cana-de-açúcar variedade RB855156 (planta não
transformada); Linhas 4, 6, 7 e 10 – plantas transgênicas de cana-de-açúcar
variedade RB855156; P1, P3 e P5 – plasmídeo digerido correspondente a 1, 3 e 5
cópias do transgene.
A
B
NotI BamHI
80
3.5.3 Caracterização do conteúdo de água no substrato
Na primeira avaliação o conteúdo de água (?) nos vasos variou de
0,26 a 0,30 m
3
m
-3
para os quatro tratamentos (TABELA 2). Esta avaliação foi
realizada após o início da drenagem do solo saturado. Os valores do conteúdo de
água aproximaram-se da capacidade de campo correspondente ao potencial mátrico
(? = -0,008 MPa), considerando-se a porosidade total de 0,36 m
3
m
-3
.
Do segundo ao quinto dia de avaliação houve progressiva redução
do conteúdo de água nos vasos sem que houvesse diferenciação estatística entre os
quatro tratamentos (TABELA 2). No quinto dia de avaliação, o conteúdo de água nos
vasos variaram de 0,09-0,11 m
3
m
-3
, valores que corresponderam ao ponto de
murcha permanente (? = -1,5 MPa).
Nas avaliações subseqüentes, sexto, oitavo, nono e décimo primeiro
dia de avaliação foram constatados os menores valores do conteúdo de água (0,06-
0,10 m
3
m
-3
), tendo sido constatada a diferenciação estatística (Tukey; p<0,05) entre
os tratamentos (TABELA 2). De um modo geral, os vasos dos tratamentos Controle
e T7 continham maiores conteúdo de água do que os tratamentos T4 e T10.
O monitoramento temporal do conteúdo de água nos vasos
apresentados na Tabela 2, permitiu a caracterização do consumo diferenciado de
água pelas plantas de cana-de-açúcar, entre os potenciais mátricos da capacidade
de campo e ponto de murcha permanente, descrevendo o consumo e a drenagem
da água do solo desde a saturação até a água residual retida pelos microporos
(TABELA 2).
TABELA 2. Conteúdo de água (θ; m
3
m
-3
) para os quatro tratamentos no período de
12 dias de déficit hídrico.
Tratamento 0 2 6 8 9 12
__________________________dia__________________________________
Controle 0,2998 a 0,2619 a 0,1038 a 0,0898 a 0,0838 a 0,0823 a
T4 0,2635 a 0,2094 a 0,0723 b 0,0635 b 0,0579 c 0,0579 b
T7 0,2983 a 0,2433 a 0,0886 ab 0,0780 ab 0,0764 ab 0,0764 a
T10 0,2869 a 0,2366 a 0,0793 ab 0,0706 b 0,0677 bc 0,0677 ab
CV(%) 8,2048 12,8958 18,0724 13,0387 11,8348 12,1281
Médias seguidas da mesma letra não diferem entre os tratamentos (coluna) (Tukey;
p<0,05)
81
Ao se proceder ao cálculo do consumo de água (%) pelas plantas de
cana-de-açúcar nos vasos verificou-se que até o quinto dia de avaliação este foi
maior nos tratamentos T4 e T10 do que nos tratamentos Controle e T7 (FIGURA 5).
No sexto e oitavo dia de avaliação, observou-se aumento e manutenção de maior
consumo de água (%), respectivamente, para os tratamentos Controle e T4 em
relação aos demais tratamentos (FIGURA 5). O tratamento T4, portanto, apresentou
o menor conteúdo de água e o maior consumo de água (%) pelas plantas de cana-
de-açúcar (TABELA 2 e FIGURA 5), caracterizando o tratamento de maior
ineficiência nas relações solo-planta e na utilização da água do solo.
Diferentemente, os tratamentos T7 e T10 consistiram de plantas de cana-de-açúcar
que minimizaram o consumo relativo de água do solo sob condição de estresse
hídrico.
Os valores de θ estão caracterizando que houve decréscimo
acentuado do conteúdo de água nos vasos durante os primeiros seis dias de déficit
hídrico, devido a saturação do solo acima da capacidade de campo (0,26-0,30 m
3
m
-
3
) imposta para iniciar as avaliações.
0
20
40
60
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tempo, dia
Consumo de água, %
Controle
T4
T7
T10
FIGURA 5. Consumo de água relativo ao tempo inicial (Zero).
82
3.5.4 Ensaios de tolerância ao déficit hídrico
Em condições normais de suprimento de água, o potencial total da
água e a fotossíntese líquida não foram diferentes entres as plantas controle e
transgênicas (FIGURAS 6A e 7, respectivamente).
Sob condições de estresse, o potencial da água e osmótico nas
plantas controle e transgênicas foram muito semelhantes até o fim do período
estudado (FIGURAS 6A e B). O potencial de pressão nas plantas transformadas
manteve-se ainda positivo até o nono dia de estresse para os eventos T4 e T10,
porém ao décimo segundo todas as plantas apresentavam potencial de pressão
negativo, indicando que as plantas estavam com seu metabolismo comprometido
(FIGURA 6C).
As taxas fotossintéticas das plantas transgênicas foram maiores,
porém não estatisticamente significativas durante o período de estresse hídrico
(FIGURA 7). No décimo segundo dia, apesar dos baixos valores de fotossíntese
apresentados pelas plantas transgênicas, estas ainda apresentavam-se verdes.
83
FIGURA 6. A - Potencial total da água; B – Potencial osmótico; C – Potencial de
pressão nas folhas nos eventos transgênicos de cana-de-açúcar submetidos a 12
dias de estresse hídrico. Potenciais expressos em mega pascal (MPa). Valores são
apresentados como média ± erro padrão (n = 5) (Tukey; p< 0,05). Coeficientes de
variação = 32,9, 27,3 e 25,2%, A, B e C respectivamente.
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
Potencial da água (MPa)
Controle
T4
T7
T10
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
Potencial osmótico (MPa)
Controle
T4
T7
T10
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
Potencial de Pressão (MPa)
Controle
T4
T7
T10
A
B
C
0 6 9 12
dias
84
FIGURA 7. Taxa de fotossíntese líquida expressa em mg CO
2
.dm
-2
.h
-1
nos eventos
transgênicos de cana-de-açúcar após 12 dias sem irrigação. Valores são
apresentados como média ± erro padrão (n = 5) (Tukey; p< 0,05). Coeficiente de
variação = 20,09%.
Para análise da tolerância de plantas transgênicas ao déficit hídrico
foram utilizados os eventos 4, 7 e 10. Estes eventos foram escolhidos com base na
concentração de prolina obtida em experimentos preliminares (Dados não
mostrados). Em condições normais de suprimento de água, não houve diferença na
concentração de prolina nas folhas destes eventos. Entretanto, no sexto dia de
déficit hídrico a concentração de prolina aumentou significamente tanto nas plantas
não transformadas quanto nas transgênicas. Neste dia, os eventos transgênicos
apresentaram cerca de duas vezes mais prolina quando comparadas com as plantas
controle (FIGURA 8). No nono dia de estresse, não houve alteração na concentração
de prolina nas plantas controle. Por outro lado, plantas transgênicas de todos os
eventos apresentaram em média cerca de 2,5 vezes mais prolina nas folhas
(FIGURA 8), sendo que a concentração se manteve praticamente constante até o
final do experimento.
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
fotossíntese (mg CO
2
.dm
-2
.h
-1
)
Controle
T4
T7
T10
Dia 0 Dia 6 Dia 9 Dia 12
Ba
Ba
Ba
Ba
Ba
Ba
Ba
Ba
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
85
FIGURA 8. Concentração de prolina em plantas controle e transgênicas submetidas
a 12 dias de estresse hídrico. Valores são apresentados como média ± erro padrão
(n = 5). Letras maiúsculas comparam colunas de mesmo padrão; letras minúsculas
comparam colunas de padrões diferentes. Letras iguais não apresentam diferença
pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Coeficiente de variação =
10,7%.
3.5.5 Análise da expressão do transgene
Como o conteúdo de prolina nos diferentes eventos se mostrou
similar ao longo do déficit hídrico, independente do número de cópias do gene
heterólogo P5CS inserido, procedeu-se análises do padrão de expressão do
transgene em plantas estressadas e não estressadas no evento 10 de cana-de-
açúcar. Plantas transgênicas submetidas a 0, 6, 9 e 12 dias de estresse hídrico
apresentaram aumento no número de transcritos a partir sexto dia de estresse,
acentuando a expressão no último dia (12 dias sem irrigação). Plantas não
transformadas tanto em condições normais de suprimento de água, quanto em
condições de estresse hídrico não mostraram expressão do transgene (FIGURA 9).
0
5
10
15
20
25
30
Dia 0 Dia 6 Dia 9 Dia 12
µmoles prolina g
-1
de massa seca
Controle
T4
T7
T10
Aa Aa
Aa
Aa
Ba
Bb
Bb
Bb
Ba
Cb
Cb
Cb
Ba
Cb
Cc
Cc
86
FIGURA 9. Análise da expressão de P5CS por Northern blot em cana-de-açúcar.
Linhas 1, 3, 5, 7 – plantas controle de cana-de-açúcar variedade RB855156
submetidas a 0, 6, 9 e 12 dias de déficit hídrico, respectivamente. Linhas 2, 4, 6, 8 –
plantas transgênicas (evento 10) de cana-de-açúcar variedade RB855156,
submetidas 0, 6, 9 e 12 dias sem irrigação; B – Controle de loading de RNA total das
amostras.
3.5.6 Teores de MDA
Os teores de MDA, um produto da peroxidação de lipídeos,
aumentaram significativamente durante a imposição do estresse (FIGURA 10).
Todos os eventos transgênicos apresentaram menores níveis de acúmulo de MDA,
quando comparadas com as plantas controle, à medida que o estresse aumentava.
A partir do nono dia de estresse hídrico os níveis de MDA nas plantas controle foram
em média 27% maior do que nas plantas transgênicas (FIGURA 10).
1 2 3 4 5 6 7 8
A
B
87
FIGURA 10. Nível de peroxidação de lipídeos (teor de MDA) em folhas de plantas de
cana-de-açúcar. Valores são apresentados como média ± erro padrão (n = 5). Letras
maiúsculas comparam colunas de mesmo padrão; letras minúsculas comparam
colunas de padrões diferentes. Letras iguais não apresentam diferença pelo teste de
Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Coeficiente de variação = 5,09%.
3.5.7 Tratamento com herbicida paraquat
Os resultados do tratamento com 5 µM de paraquat mostraram um
evidente branqueamento dos segmentos de plantas controle após 24h (FIGURA
11A), enquanto nas plantas transgênicas estes se apresentaram verdes (FIGURAS
11B, D e E). Os segmentos foliares de cana-de-açúcar não tratados com paraquat,
usados como controle negativo, mostram a perda de clorofila total que as plantas
controle e transgênicas tiveram após tratamento com o paraquat (FIGURAS 11C e
F).
0
100
200
300
400
500
600
700
Dia 0 Dia 6 Dia 9 Dia 12
nmol MDA g
-1
de massa seca
Controle
T4
T7
T10
Aa
Aa
Aa
Aa
Ba
Cb
Db
Ab
Bab
b
Bab
Ba
Ca
Ca
Ca
Da
Da
88
FIGURA 11. Tolerância ao estresse oxidativo de plantas transgênicas de cana-de-
açúcar produzindo prolina. A – Segmentos foliares de plantas controle incubados
com 5 µM paraquat por 24h; B, D, E – eventos 4, 7 e 10, respectivamente incubados
com paraquat. C e F – segmentos de planta controle e transgênica (evento 10) em
água destilada, respectivamente.
Medidas quantitativas do conteúdo de clorofila revelaram que
segmentos foliares de plantas transgênicas após o sexto dia de estresse
apresentaram maiores concentrações de clorofila total tanto na presença quanto na
ausência do herbicida paraquat (FIGURAS 12A e B). No nono dia, os segmentos
foliares de plantas controle apresentaram drástica diminuição das concentrações de
clorofila total, porém nas plantas transgênicas estas se mantiveram ainda similares
às plantas controle quando estas estavam no sexto dia de estresse hídrico. Somente
no décimo segundo dia de estresse, segmentos foliares das plantas transgênicas
apresentaram níveis menores de clorofila total (FIGURA 12A). Em média, plantas
transgênicas mostraram níveis de clorofila total 80% maior do que plantas não
transformadas a partir do sexto dia de déficit hídrico.
89
FIGURA 12. Mudanças no conteúdo de clorofila total em segmentos foliares de
cana-de-açúcar. A - Segmentos foliares tratados somente com água destilada; B –
Segmentos foliares tratados com 5 µM de paraquat. Segmentos foliares foram
incubados 24 h sob intensidade luminosa de 50 µmol m
-2
s
-1
. O conteúdo de clorofila
é expresso em mg g
-1
de massa seca. Valores são apresentados como média ± erro
padrão (n = 5). Letras maiúsculas comparam colunas de mesmo padrão; letras
minúsculas comparam colunas de padrões diferentes. Letras iguais não apresentam
diferença pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Coeficiente de
variação = 14,08 e 14,04%, A e B respectivamente.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Controle T4 T7 T10
mg clorofila g
-1
de massa seca
Dia 0
Dia 6
Dia 9
Dia 12
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Controle T4 T7 T10
mg clorofila g
-1
de massa seca
Dia 0
Dia 6
Dia 9
Dia 12
A
Ad
Ac
Ab
Aa
Ad
Bc
Bb
Ba
Ad
Bc
Bb
Ba
Ad
Bc
Bb
Ac
Ab
Aa
Aa
Ac
Bc
Bb
Ba
Ac
Bc
Bb
Ba
Ac
Bc
Bb
B
Ba
Ba
H
2
O
5 µM paraquat
90
3.5.8 Análises da fluorescência da clorofila a
Até o sexto dia de estresse hídrico, tanto plantas controle quanto
plantas transgênicas não apresentaram alterações significativas nos parâmetros
Fv/Fm e F
0
(FIGURAS 13A e B). À medida que o estresse aumentava as plantas
controle apresentaram decréscimo no rendimento fotoquímico (Fv/Fm) (FIGURA
13A). Ao contrário, plantas transgênicas mantiveram praticamente constantes seus
valores de rendimento fotoquímico. No nono dia de estresse, plantas controle
apresentaram um aumento em F
0
, acentuando-se no nono dia. Adicionalmente, as
plantas controle apresentaram um decréscimo acentuado de Fv que pode indicar um
incremento da supressão não-fotoquímica (FIGURA 13C). As plantas controle
apresentaram variações nestes dois parâmetros, porém sem afetar
significativamente o rendimento quântico potencial do fotossistema II (Fv/Fm).
FIGURA 13. Rendimento quântico potencial do fotossistema II emplantas
transgênicas e controle de cana-de-açúcar. A – valores de rendimento fotoquímico
(Fv/Fm); B – valores de fluorescência inicial (F0); C – valores de fluorescência
variável (Fv) e D – valores de fluorescência máxima. Valores são apresentados
como média ± erro padrão (n = 5). Letras maiúsculas comparam colunas de mesmo
padrão; letras minúsculas comparam colunas de padrões diferentes. Letras iguais
não apresentam diferença pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Coeficiente de variação = 6,5, 12,8, 15,8, 11,4%, A, B, C e D respectivamente.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Controle T4 T7 T10
Dia 0
Dia 6
Dia 9
Dia 12
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Controle T4 T7 T10
Dia 0
Dia 6
Dia 9
Dia 12
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Controle T4 T7 T10
Dia 0
Dia 6
Dia 9
Dia 12
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Controle T4 T7 T10
Dia 0
Dia 6
Dia 9
Dia 12
B
Aa
Aa
Ab
Ab
Aab Aa
Bbc
Bc
Aa Aa
Bb
Bc
Aa
Aa
Bb
Bb
Ab
Ab
Aa
Ab
Ab
Ab
Aa
Bab
Abc
Ac
b
Aa
Bab
Abc Ac
Aa
Bab
Aa
Aa
Ab
Ab
Aa
Aa
Bab
Bb
Aa
Aab
Bab
Bb
Aa
Aa
Bab
Bb
a
Aa
Aa
Ab
Ac
Aab
Aa Ba
Bb
Aa
Aab Bab
Bb
Aa
Aa
Ba
Ba
A
D
C
91
3.5.9 Massa seca total de parte aérea e raízes
As Figuras 14A e 14B apresentam os valores de massa seca de
parte aérea e raiz, respectivamente. Os resultados mostram diferenças significativas
de matéria seca acumulada pela parte aérea e raiz, para as plantas transgênicas e
as plantas controle. A massa seca acumulada das plantas transgênicas foi superior a
das plantas controle, em média 35% e 55% para parte aérea e raiz,
respectivamente.
FIGURA 14. A - Massa seca de parte aérea de cana-de-açúcar; B - Massa seca da
raiz de cana-de-açúcar. Valores são apresentados como média ± erro padrão (n =
5). Letras iguais não apresentam diferença pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade. Coeficiente de variação = 13,6 e 14,09%, A e B respectivamente.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Matéria seca parte aérea (g)
Controle
T4
T7
T10
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Matéria seca da raiz (g)
Controle
T4
T7
T10
A
b
a
ab
a
b
a
a
a
B
92
3.6 Discussão
A expressão do gene P5CS foi avaliada somente no evento 10 de
cana-de-açúcar, evento este que apresentava 1 cópia do transgene em seu genoma
(FIGURA 4). Entretanto, os outros dois eventos que apresentavam mais de uma
cópia (FIGURA 4B) mostraram padrões similares no acúmulo final de prolina
(FIGURA 8).
Alterações morfológicas e redução de crescimento foram observadas
em plantas transgênicas de A. thaliana e tabaco possuindo genes osmoprotetores
controlados por promotores constitutivos (PILON-SMITS et al., 1998; KASUGA et al.,
1999). Zhu et al. (1998) reportaram pela primeira vez, o uso do gene P5CS de Vigna
aconitifolia sob controle de um promotor estresse induzido (AIPC) em arroz. Estas
plantas acumularam altas concentrações de prolina e apresentaram um melhor
crescimento comparados às plantas controle. Entretanto, nenhum resultado
comparativo com promotores constitutivos havia sido reportado (ZHU et al., 1998).
SU & WU (2004) compararam o efeito dos estresses hídrico e salino em plantas
transgênicas de arroz possuindo o gene P5CS de Vigna aconitifolia controlado
separadamente por um promotor ABA estresse induzido (SU et al., 1998) e um
promotor constitutivo. É provável que a superprodução constitutiva da enzima P5CS
possa competir pela formação e síntese de proteínas necessárias para o
crescimento e desenvolvimento das plantas sob condições normais. Além disso,
altos níveis de síntese de prolina pela enzima P5CS podem gerar efeitos prejudiciais
em certos estádios de crescimento e desenvolvimento da planta. Neste estudo, ao
se comparar plantas transgênicas de cana-de-açúcar com as plantas controle de
mesma idade, nenhuma alteração no crescimento e morfologia foram observadas
após 3 meses em casa-de-vegetação.
No último dia de estresse (12 dias), os níveis de transcritos não
apresentaram correspondência com aumento na concentração de prolina. A falta de
correspondência entre o aumento da expressão de RNAm e a concentração de
prolina nas folhas observadas em plantas transgênicas pode estar relacionada a
diversos mecanismos de regulação da expressão gênica, tais como degradação do
RNAm no citoplasma (MITCHELL et al., 1997), oxidação da prolina pela enzima
93
ProDH (NANJO et al., 1999), turnover da enzima P5CS (FUKUTOKU & YAMADA,
1984) e incorporação da prolina em proteínas (HARE & CRESS, 1997). Além disso,
o gene usado neste estudo é o selvagem (WT), ou seja, apresenta inibição por
retroalimentação (feedback), de modo que a atividade GK da enzima bifuncional
P5CS de Vigna aconitifolia é inibida por prolina, conforme demonstrado por HU et al.
(1992). Estes dados indicam que a expressão do gene P5CS controlada pelo
promotor AIPC foi induzida por déficit hídrico e que essa indução aumentou de 2 a
2,5X os níveis de prolina nos diferentes eventos, estando de acordo com dados já
reportado para arroz usando promotor estresse induzido submetido a estresse
hídrico e salino (ZHU et al., 1998; SU; WU, 2004).
O estresse hídrico afeta muitos processos bioquímicos e fisiológicos
importantes como, por exemplo, ajustamento osmótico, sistema de defesa de
enzimas antioxidantes e peroxidação lipídica (WANG et al., 2003).
Muitas plantas tolerantes à seca podem regular seu potencial
osmótico para compensar pequenos ou grandes períodos de estresse hídrico
(SPERRY et al., 2002). Kavi-Kishor et al. (1995) trabalhando com plantas
transgênicas de tabaco transformadas com gene P5CS não conseguiram
demonstrar que o alto acúmulo de prolina resultou em ajustamento osmótico. Por
outro lado, Molinari et al. (2004) trabalhando com plantas transgênicas de Carrizo
citrange transformadas com o mesmo gene mostraram que a manutenção do turgor
nas plantas transgênicas pôde ser mantida pelo abaixamento do potencial osmótico
(ajustamento osmótico) até o décimo sétimo dia de estresse hídrico. Portanto, o
acúmulo de prolina sob condições de estresse hídrico contribuiu para diminuir o
potencial osmótico e, conseqüentemente, manter a pressão de turgor nas células.
No presente trabalho, os dados mostram que o maior acúmulo de prolina nas plantas
transgênicas de cana-de-açúcar não foi suficiente para diminuição do potencial
osmótico das plantas transgênicas em condição de estresse. Assim, a prolina
acumulada nas plantas transgênicas de cana-de-açúcar pode ter desempenhado um
outro papel.
Para testar a hipótese do papel da prolina na adaptação da planta ao
estresse hídrico, bem como testar seu papel como removedor de espécies reativas
de oxigênio (ROS), foi determinado o efeito da prolina nos níveis de MDA formado e
94
do herbicida paraquat no conteúdo de clorofila de plantas transgênicas de cana-de-
açúcar. O MDA é um indicador do processo de peroxidação lipídica, processo
mediado por espécies reativas de oxigênio (ROS). Aumentos na peroxidação lipídica
observados estão de acordo com resultados já reportados em outros estudos
(MORAN et al., 1994; FU & HUANG, 2001) e suportam a hipótese de que o déficit
hídrico pode induzir a peroxidação de membranas. Tal indução pode resultar num
aumento da permeabilidade da membrana, a qual pode levar a uma perda de
eletrólitos pela célula (QUEIROZ et al., 1998). Aumentos no dano celular parecem
resultar em um desequilíbrio no mecanismo de defesa e queda na atividade
fotossintética (SMIRNOFF, 1993). Entretanto, ao comparar as plantas transgênicas
de cana-de-açúcar com as controle observa-se a formação de níveis menores de
MDA sob condições de déficit hídrico, assim a expressão estresse induzida do gene
P5CS pode ter ativado ou mesmo melhorado a remoção de espécies reativas de
oxigênio (ROS).
Adicionalmente, foi determinado o efeito do herbicida paraquat no
conteúdo de clorofila de plantas de cana-de-açúcar. O herbicida paraquat em
contato com a planta, gera radicais superóxido e causa danos à membrana e
degradação da clorofila (SLADE, 1966). Plantas transgênicas de cana-de-açúcar
apresentaram uma diminuição na degradação de clorofila total comparadas com as
plantas controle. Smirnoff & Cumbes (1989) demonstraram a propriedade da prolina
na remoção de radicais hidroxil (OH), um dos mais potentes radicais livres
encontrados em sistemas biológicos. Assim, é provável que a prolina tenha
amenizado o dano causado pelo tratamento com o herbicida paraquat, reforçando a
hipótese de sua atuação na remoção de ROS.
Existem evidências de que os efeitos do estresse hídrico sobre o
fotossistema II podem ser ocasionados pela produção e acumulação de espécies
reativas de oxigênio (LAWLOR, 1995), levando à queda na atividade fotossintética
(SMIRNOFF, 1993). Uma maneira eficiente de monitorar danos foto-oxidativos
causados pelo estresse hídrico tem sido o uso de medidas da fluorescência da
clorofila a associada ao fotossistema II (NEWTON & McBEATH, 1996).
As plantas controle apresentaram perdas significativas de clorofila
total, bem como danos no aparelho fotossintético a partir do nono dia de estresse,
95
monitorados pela fluorescência da clorofila a. Parâmetros como F
o
mostraram
significativo aumento, o que indica que possa ter ocorrido algum dano no centro de
reação do fotossintema II, ou uma redução na transferência de energia de excitação
do sistema coletor de luz para o centro de reação (OUZOUNIDOU, 1993). Vários
tipos de estresse, tais como déficit hídrico, podem afetar direta ou indiretamente o
desempenho do fotossistema II (ÖQUIST, 1987). Desta maneira, a fluorescência da
clorofila a tem sido usada como uma ferramenta de seleção de genótipos tolerantes
a diversos tipos de estresse (STRAND E ÖQUIST, 1985; BELKHODJA et al., 1994;
FLAGELLA et al., 1994; FLAGELLA et al., 1995; ARAUS et al., 1998; KITAO et al.,
1998).
Plantas transgênicas mostraram ausência de mudanças na razão
F
v
/F
m
sob déficit hídrico, o que pode estar relacionado com a manutenção nos teores
de clorofila total. Essa sugestão baseia-se principalmente na ausência de diferenças
significativas na eficiência fotoquímica do fotossistema II (FIGURA 10A), sugerindo
que a síntese de ATP e de poder redutor (NADPH) não foi influenciada pela
deficiência hídrica.
O maior acúmulo de prolina nas plantas transgênicas provavelmente
ajudou em uma manutenção nas taxas de fotossíntese ao longo do período de
estresse hídrico, porém a magnitude desta manutenção não condiz com os dados
obtidos para fluorescência da clorofila a. Plantas submetidas a déficits hídricos
acentuados, as quais estão com os estômatos fechados, podem apresentar valores
significantes de Fv/Fm devido à reciclagem interna de CO
2
. Nesta condição, a
fluorescência fornece informações sobre o rendimento quântico e sobre o estado de
energia dos cloroplastos (WINTER & DEMMIG, 1987), mesmo que nenhuma fixação
de CO
2
ou liberação de O
2
ocorra. Neste caso, Fv/Fm está relacionado com a
estimativa da disponibilidade de dissipação de energia para o metabolismo de
carbono (BOLHÀR-NORDENKAMPF et al., 1989). Possivelmente, o maior potencial
da análise da fluorescência em condições de estresse hídrico é o seu uso com as
medidas de trocas gasosas. Esta combinação permite determinar in vivo a atividade
dos pontos chaves do processo fotossintético (BOLHÀR-NORDENKAMPF et al.,
1989).
96
A fotossíntese é o processo primário para o acúmulo de biomassa
em plantas. O aumento no ganho de biomassa pelo incremento da taxa de
fotossíntese pode ser refletido diretamente em ganho econômico, por exemplo,
açúcar na cultura da cana. Altas absorções de CO
2
da atmosfera podem ser
traduzidas em maiores ganhos de biomassa.
Neste estudo, o aumento dos níveis de prolina pode ter contribuído
no incremento de biomassa das plantas transgênicas. O fato de as plantas
transgênicas terem sentido menos o tratamento de estresse hídrico em termos de
teor de clorofila total, danos à membranas e eficiência fotoquímica do fotossintema II
e fotossíntese, permitiu que estas provavelmente dispusessem de maquinaria
metabólica para acumular biomassa tanto de parte aérea quanto raiz frente ao déficit
hídrico.
Quando o promotor AIPC foi usado para controlar a expressão do
gene P5CS, o acúmulo de prolina ocorreu somente quando as plantas estavam
estressadas (FIGURA 8). Desta forma, os baixos níveis de prolina não interferiram
no crescimento normal destas plantas.
Assim, os resultados apresentados neste trabalho sugerem mais a
participação da prolina na proteção do aparelho fotossintético em cana-de-açúcar do
que pelo ajustamento osmótico nas condições de estresse severo e doze dias de
déficit hídrico.
97
3.7 Conclusões
Diante das condições experimentais e pelos resultados obtidos durante o
trabalho pode-se concluir que:
O protocolo de regeneração e transformação foi eficiente para obtenção de
plantas de cana-de-açúcar variedade RB855156 transgênicas;
A introdução do gene P5CS de Vigna aconitifolia sob controle do promotor
estresse induzido AIPC resultou em aumento na biossíntese de prolina somente
quando as plantas foram submetidas ao déficit hídrico;
Os resultados sugerem a participação da prolina na proteção do aparelho
fotossintético através de sua capacidade de atuar como um removedor de espécies
reativas de oxigênio (ROS).Plantas transgênicas de cana-de-açúcar variedade
RB855156 nas condições experimentais testadas (estresse hídrico severo) não
apresentaram ajustamento osmótico pela prolina.
98
3.8 Referências
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