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Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP
Campus de Araraquara
ROBERTO ESTEVES PIRES CASTANHO
ESTUDO DO LIMIAR DE POSITIVIDADE DO MÉTODO
IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) PARA PESQUISA DE
COPROANTÍGENOS DE
Giardia lamblia
STILES,1915. SUA
UTILIZAÇÃO COMO EXAME DE CONTROLE DE CURA APÓS
TERAPÊUTICA
Araraquara - S.P.
2004
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Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP
Campus de Araraquara
ROBERTO ESTEVES PIRES CASTANHO
ESTUDO DO LIMIAR DE POSITIVIDADE DO MÉTODO
IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) PARA PESQUISA DE
COPROANTÍGENOS DE
Giardia lamblia
STILES, 1915. SUA
UTILIZAÇÃO COMO EXAME DE CONTROLE DE CURA APÓS
TERAPÊUTICA
Tese de Doutorado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação
em Análises Clínicas – Nível Doutorado
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP - Araraquara - SP.
Orientador : Prof. Dr. João Aristeu da Rosa
Araraquara - S.P.
2004
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SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
I. Introdução 01
II. Objetivos 23
III. Materiais e Métodos 25
IV. Resultados 38
V. Discussão 53
Conclusões 87
Referências Bibliográficas 91
Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP
Campus de Araraquara
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO : ANÁLISES CLÍNICAS
BANCA EXAMINADORA
PRESIDENTE: PROF. DR. JOÃO ARISTEU DA ROSA
MEMBROS :
Profa. Dra. Herminia Yohko Kanamura
Profa. Dra. Semiramis Guimarães Ferraz Viana
Profa. Dra. Vera Lucy de Santi Alvarenga
Profa. Dra. Vera Lúcia Pagliusi Castilho
À Maria Paula,
Ao Flávio e a Fernanda.
À Julieta e
Eduardo “in memorian”.
Ao Prof. Dr. João Aristeu da Rosa pela orientação, pela
amizade e pelo apoio.
À Profa. MSc. Luciamare Perinetti Alves Martins, pela
colaboração e pela amizade.
Ao Prof. Dr. Osni Lázaro Pinheiro e ao Prof. Dr. Agnaldo
Bruno Chies e a Profa. Dra. Ana Paula Ceolotto Guimarães do Amaral da
Faculdade de Medicina de Marília pela colaboração na finalização deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Valdeir Fagundes de Queiroz e ao Prof.
MSc. Cleber José Mazoni da Faculdade de Medicina de Marília pelas
sugestões e pela amizade.
À Professora Doutora Mara Cristina Pinto da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara por toda colaboração.
Aos técnicos do Serviço de Parasitologia da Faculdade de
Medicina de Marília, Sr. Mauricio Barbosa dos Santos e D. Maria Aparecida
Netto e Laboratorista Farmacêutica Andréia Aparecida Tonhon Bueno
Serapião, pela imensa ajuda e pela dedicação, o que tornou possível este
trabalho.
À Sra Maria Zenaide Tita Fernandes a colega MSc.
Isabel Martinez da disciplina de Parasitologia da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da UNESP de Araraquara, pelo apoio.
À Sra. Célia Regina Alves dos Santos Motroni, pela
digitação e toda a confecção final deste trabalho e pela dedicação, e ao Sr.
Carlos Motroni pela sua colaboração..
À Sra. Natalina Lambini Escremin, bibliotecária da
UNESP de Araraquara, por toda conferência das referências bibliográficas e
por toda orientação.
Às biliotecárias Regina Helena Gregório Menita e Helena
Maria da Costa Lima da Faculdade de Medicina de Marília pela colaboração
na busca e organização das referências.
Ao Sr. Carlos Fernandes dos Santos da Faculdade de
Medicina de Marília pela documentação fotográfica.
Ao Prof. Dr. Sebastião Marcos Ribeiro de Carvalho,
pelo auxílio nas análises estatísticas.
À Elza Guerra que pela amizade colaborou na revisão do
texto.
Aos médicos e funcionários das instituições que
colaboraram com este trabalho em especial a Enfermeira Edyna Maria
Yamada e ao Dr. Alcides Eugênio Pimentel Gianassi.
À BioBrás Diagnósticos pela doação de parte do material
utilizado.
Trabalho realizado no Serviço de Parasitologia
da Autarquia Faculdade de Medicina de
Marília – FAMEMA, Secretaria de Ciência
Tecnologia e Desenvolvimento do Estado de
São Paulo.
RESUMO
Devido à baixa sensibilidade do exame parasitológico de fezes (EPF) para o
diagnóstico laboratorial da giardíase, o método imunoenzimático (ELISA –
Enzyme – linked immunosorbent assay) para pesquisa de coproantígenos de
Giardia tem sido utilizado, mostrando alta sensibilidade e especificidade. Este
trabalho foi desenvolvido com o objetivo de se avaliar a eficácia do ELISA
ProSpecT Giardia (Alexon, Inc. BioBrás) anti-GSA65 (antígeno fecal específico
de Giardia - peso molecular 65.000 Da) como instrumento de controle de cura
da giardíase e o seu limiar de positividade. A contagem de cistos por grama de
fezes foi feita utilizando a câmara de Neubauer em amostras positivas para
G.lamblia de 100 pacientes. Os resultados mostraram eliminação de 3,6 x 10
6
cistos por grama de fezes em média. Em gráfico esses resultados desenharam
uma curva assimétrica positiva, sugerindo a ocorrência de falso-negativos.
Avaliou-se também a eficácia do ELISA anti-GSA65 e o método de Faust e
Cols (MFc) em detectar mínimas concentrações de cistos de G. lamblia em
amostras fecais. Fezes positivas foram diluídas em fezes negativas de modo a
se obter amostras com 100, 1.000 e 10.000 cistos por grama de fezes. O
ELISA anti-GSA65 mostrou uma positividade significativamente maior que o
MFc. Amostras contendo 10.000 cistos por grama de fezes apresentaram
84,7% de positividade pelo ELISA anti-GSA65 e 34,7% pelo MFc. A eficácia do
ELISA anti-GSA65, como instrumento de controle de cura após o tratamento
pelo metronidazol em 91 pacientes com giardíase, foi avaliada e mostrou que o
ELISA anti-GSA65 pode ser usado para monitorar a cura de pacientes
utilizando apenas uma amostra fecal, coletada entre o 4º e 7º dias após o
tratamento. Pelo MFc seriam necessárias a coleta de duas ou três amostras.
Foi avaliada também comparativamente a eficácia do ELISA anti-GSA65 e do
MFc em amostras fecais de 96 pacientes. Considerando 38 casos positivos
para Giardia e 58 negativos para Giardia, o ELISA anti-GSA65 mostrou 100%
de sensibilidade e especificidade, enquanto que o MFc mostrou 84,7% de
sensibilidade com o exame de uma amostra fecal (valor preditivo negativo,
90,6%) e 94,7% quando do exame de duas ou três amostras (valor preditivo
negativo, 96,6%). Essas diferenças no entanto, não foram estatisticamente
significativas. Os resultados permitem inferir a ocorrência de uma relação
entre a intensidade das reações pelo ELISA anti-GSA65 e a concentração de
cistos nas fezes. Também sugerem que na maioria dos exames falso-negativos
pelo MFc, as amostras contêm um pouco mais de 10.000 cistos por grama de
fezes. Embora o ELISA anti-GSA65 tenha mostrado uma ótima “performance”
tanto para o diagnóstico como para o controle de cura na giardíase, o EPF
ainda é um importante recurso, porque pode detectar outros parasitas
intestinais.
Palavras – Chave
:
Giardia; ELISA, controle de cura, coproantígenos
ABSTRACT
Due to the low sensitivity of the fecal examination (EPF) in detecting cysts of
Giardia lamblia, the imunoenzimatic assay (ELISA enzyme linked
immunosorbent assay) to detect G.lamblia coproantigens have been used and
have showed high sensibility and specificity. With the ain of evaluating the
efficacy of ELISA ProSpecT Giardia (Alexon, Inc. BioBrás) anti-GSA65 (Giardia
stool specific antigens - molecular weigh 65.000 Da) as monitoring of the cure
of giardiasis and its threshold of positivity it was developed this research. The
cysts count per grama of faeces was calculated using Neubauer camera in
positive fecal samples for Giardia in 100 patients. It was found a concentration
of 3.6 X 10
6
cyst per grama of faeces as average. In a graph the data draw an
assymmetrical positive curve, suggesting occurrence of false negative results. It
was evaluated the efficacy of ELISA anti-GSA65, and fecal examination by
Faust and colls. procedure (MFc), in detecting minimum concentrations of
Giardia cysts in fecal samples. To obtain samples with 100, 1.000 and 10.000
cysts per grama, positive samples were diluted in negative samples. ELISA
showed a positivity significative higher than MFc. Samples with 10.000 cystis
per grama showed 84,7% of positivity by ELISA anti GSA65 and 34,7% by MFc.
The efficacy of ELISA anti-GSA65 as cure monitoring after treatment with
metronidazole in 91 patients with giardiasis, was evalued and showed that
ELISA anti-GSA65 can be used to monitor the cure of patients, using only
single sample of each patients, collected between the 4
th
and 7
th
days after
treatment, whereas with MFc it would be necessary the exam of two or tree
samples. It was also evaluated the efficacy of ELISA-anti-GSA65 and MFc in
fecal samples of 96 patients. Considering 38 Giardia true positives and 58 true
negatives, the ELISA anti-GSA65 showed 100% of sensibility and specificity,
whereas the MFc showed 84,7% of sensibility with a single sample examination
(predictive negative value, 90,6%) and 94,7% when two or thee samples were
examined (predictive negative value, 96,6%). Those differences, however, were
not statistically significant. In a analysis of the all experiments, it was possible to
infer a relation between the intensity of reactions by ELISA anti-GSA65 and
fecal cysts concentration. The results also suggest that the majority of false
negatives MFc, has more than 10.000 cysts per gram of faeces. Although
ELISA anti-GSA65 showed to be an optimal method for diagnosis, as well as a
tool of cure control in giardiasis, the fecal examination by microscopy remains
as an important resource, because it can detect other intestinal parasites.
Key-Words: Giardia, ELISA, cure monitor, coproantigens.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
χ
2
- Qui-quadrado
Q
1
– Quartil
Q
3
– Quartil
CIE – Contra imunoeletroforese
ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay
EPF(s) – Exame(s) parasitológico(s) de fezes
FLAP – Federación Latino Americana de Parasitólogos
GSA-65 – Antígeno fecal específico de
Giardia
– peso molecular 65.000 Da
IFD – Immunofluorescência direta
MFc – Método de Faust e colaboradores
PBS – Tampão fosfato
I. INTRODUÇÃO
Giardia lamblia (Sinonímia: Giardia duodenalis, Giardia intestinalis) é um
protozoário flagelado, do subfilo Mastigophora, que tem como habitat as partes
altas do intestino delgado do homem, sendo bastante disseminado em nosso
meio. Atinge principalmente crianças, alcançando em algumas regiões do
Brasil, uma prevalência maior que 20% na população infantil (CAMPOS &
BRIQUES, 1988; CASTANHO et al. 1990). Indiscutivelmente é uma das
parasitoses mais freqüentes em países em desenvolvimento (MEYER, 1990a;
RIVERA et al. 2002). Particularmente, destaca-se a elevada prevalência em
creches e orfanatos, uma vez que nesses ambientes é comum a transmissão
direta de pessoa a pessoa por meios de mãos contaminadas (FRANCO, 1996).
Em que pese a sua elevada freqüência e o tempo passado da descrição
de G. lamblia, muitos parâmetros da biologia e da morfologia, assim como da
relação desse protozoário com o hospedeiro, necessitam de maiores estudos.
Aspectos relacionados à taxonomia, à transmissão e à patogenia também
merecem análises mais aprofundadas (FAUBERT, 1996; TORRES et al. 1997;
BOONE et al. 1999; THOMPSON et al. 2000; RIVERA et al. 2002)
Embora pairem dúvidas em relação à biologia de G. lamblia e à
transmissão e patogenia da giardíase, em relação ao diagnóstico, apesar dos
inúmeros trabalhos a respeito, também repousam grandes incertezas sobre
esta morbidade. E com isso entram aspectos biológicos e da relação parasito-
hospedeiro que devem ser levados em consideração.
Assim, faremos algumas observações sobre a biologia e morfologia do
protozoário que permitirão uma avaliação melhor a esse respeito.
Foram descritas mais de 40 espécies do gênero Giardia (ADAM, 2001),
a maioria definida em função do hospedeiro de origem. No entanto, estudos
desenvolvidos por NASH et al. (1985) demonstraram que o hospedeiro de
origem não constitui um critério válido, uma vez que, pela análise do DNA,
espécies de Giardia de diferentes hospedeiros apresentam-se idênticas,
enquanto que isolados de um mesmo hospedeiro podem ser marcadamente
diferentes. Apesar de dúvidas, muitos autores consideram a morfologia dos
corpos medianos como critério diferencial mais adequado. FILICE (1952)
publicou uma detalhada descrição morfológica de Giardia e propôs que o
gênero fosse dividido em três espécies: Giardia duodenalis, Giardia muris e
Giardia agilis. Giardia duodenalis (sinonímia de G. lamblia e G. intestinalis) é
parasita de mamíferos, inclusive o homem, enquanto que G. muris é
encontrada em roedores e possivelmente em répteis e aves e Giardia agilis em
anfíbios. (THOMPSON et al. 1993;THOMPSON et al. 2000; ADIS, 2001).
Mais recentemente, outras duas espécies foram reconhecidas:
G. psittaci (ERLANDSEN & BEMRICK, 1987), descrita no periquito
Melopsittacus undulatus e G. ardeae (ERLANDSEN et al. 1990) na garça Ardia
herodias (THOMPSON et al. 1993; THOMPSON et al. 2000).
Há muitas controvérsias em relação à nomenclatura utilizada para a
designação da espécie parasita do homem (MEYER, 1990b; THOMPSON et al.
1993;THOMPSON et al. 2000; ADIS, 2001). Atualmente, três denominações
deste parasita têm sido utilizadas em publicações: G. lamblia (BIENZ et al.,
2001; GUIMARÃES & SOGAYAR, 2002), G. duodenalis (HOMAN & MANK,
2001; GONÇALVES et al. 2002; GUIMARÃES et al. 2003) e G. intestinalis
(GARCIA et al. 2002; ABE et al. 2003).
A maioria dos autores brasileiros utiliza a denominação Giardia lamblia,
encontrada em vários livros de parasitologia (NEVES; 2000; CIMERMAN &
CIMERMAN, 2002; NEVES, 2003) embora alguns optem por outras
denominações: Giardia intestinalis (MORAES et al. 1988) e Giardia duodenalis
(REY, 2001).
Giardia lamblia também é a terminologia mais utilizada por autores em
várias partes do mundo (ZAMAN, 1988; LEVENTHAL & CHEADLE, 1997;
MARCKELL et al. 1999).
Em função desta discordância, e até que se chegue a um consenso,
optamos pela denominação de G. lamblia para os isolados procedentes do
homem, mesmo porque é a terminologia mais usada em nosso País e nos
parece a mais adequada para o momento, da mesma forma que o termo
“giardíase” utilizado neste trabalho refere-se a qualquer infecção por Giardia na
espécie humana. Aliás, para ADAM (2001), não são adequadas as razões para
o abandono da designação Giardia lamblia, visto esta ser aceita amplamente
na literatura médica e científica.
Giardia lamblia se apresenta sob duas formas: o trofozoíto e o cisto. O
trofozoíto mede cerca de 9 a 21µm de comprimento por 5 a 8µm de largura em
sua extremidade “anterior” (RIVERA et al. 2002). Tem a forma de uma pêra e
apresenta simetria bilateral, com uma extremidade mais larga que se vai
adelgaçando. A face dorsal é lisa e convexa, enquanto a ventral é côncava,
apresentando uma estrutura que funciona como uma ventosa, denominada
disco suctorial (THOMPSON et al. 1993).
O disco suctorial, por sua vez, tem a função de fazer a adesão dos
trofozoítas de Giardia à mucosa intestinal. Embora os mecanismos da adesão
ainda não estejam totalmente esclarecidos, sabe-se que a participação de
proteínas contráteis, presentes nos discos, exerce importante papel nesse
aspecto (THOMPSON et al. 1993; SOGAYAR & GUIMARÃES, 2000).
Dois núcleos vesiculosos com um grande cariossoma cada, ocupando
cerca de 2/3 dos mesmos, podem ser observados na porção anterior, na
matriz citoplasmática, aparentemente sobrepostos à projeção do disco suctorial
quando observadas em posição dorso ventral. Na parte mediana, podem ser
visualizadas duas estruturas em forma de “vírgula”, denominadas corpos
medianos. O corpo mediano contém microtúbulos e proteínas contráteis e sua
função não está esclarecida. Oito flagelos emergem de blefaroplastos situados
próximo ao núcleo, exteriorizando-se em dois anteriores, dois medianos, dois
posteriores e dois caudais (SOGAYAR & GUIMARÃES, 2000). Os movimentos
flagelares podem ser facilmente observados em preparações a fresco, onde se
nota uma movimentação bastante característica (AMATO NETO & CORRÊA,
1991).
A forma cística é oval ou elíptica, medindo cerca de 10 a 15µm de
comprimento por 5 a 8µm de largura (RIVERA et al. 2002). Nas preparações
coradas, é possível observar a parede cística destacada do citoplasma. Dois
ou quatro núcleos (geralmente quatro) e estruturas flagelares invaginadas
estão presentes. Corpos escuros em forma de meia-lua, presentes nos cistos,
foram por muitos anos confundidos com os corpos medianos presentes nos
trofozoítos. Esses corpos escuros presentes nos cistos, provavelmente, são
primórdios do disco suctorial (THOMPSON et al. 1993; SOGAYAR &
GUIMARÃES, 2000; RIVERA et al. 2002).
Quanto ao ciclo biológico é do tipo monoxeno, sendo a via normal de
infecção do homem a ingestão de cistos. O início do desencistamento ocorre
no estômago e completa-se no duodeno, onde o trofozoíto dá início ao
processo de colonização. O protozoário multiplica-se por um complexo sistema
de divisão binária, em que participam a divisão nuclear, a de organelas e a
citoplasmática. O processo de encistamento ocorre no íleo terminal e,
principalmente, no cólon, sendo que os fatores que favorecem esta modificação
estrutural ainda não estão bem elucidados (ADAM, 2001). Atualmente, existe a
possibilidade do cultivo de Giardia em meios artificiais, assim os processos de
encistamento e desencistamento podem ser induzidos “in vitro” (MEYER &
RADULESCU, 1979; THOMPSON et al. 1993; BOONE et al. 1999; ADAM,
2001).
De acordo com o conhecimento atual, o habitat de G. lamblia é o
intestino delgado, mais especificamente o duodeno (LEVINSON et al. 1978;
HARTONG et al. 1979). Tentativas de se demonstrar o parasita em outros
locais não têm sido conclusivas. SANAD et al. (1996) relatam o encontro de
trofozoítos no estômago e relacionam a sua presença com quadro de gastrite,
mas seus achados deixam muitas dúvidas, pois não afastam a possibilidade de
gastrite por outra causa e a presença de parasitas devido ao refluxo biliar.
Dessa forma, aderidos à mucosa duodenal, os protozoários se multiplicam,
colonizando a região, e ao se desprenderem, iniciam o processo de
encistamento. São os cistos, portanto, que normalmente são eliminados para o
meio exterior juntamente com as fezes. O encontro de trofozoítos nas
evacuações é raro, ocorrendo principalmente em fezes líquidas, em diarréias
de longa duração (HARTONG et al. 1979; THOMPSON et al. 1993).
Os cistos eliminados contaminam o ambiente e, por diferentes
mecanismos, vão infectar novos hospedeiros. Portanto na imensa maioria dos
casos, o diagnóstico da giardíase é feito pelo encontro de cistos por exame
parasitológico de fezes e, para tanto, métodos clássicos de concentração são
utilizados como o de Faust e cols. (centrífugo-flutuação, em solução de sulfato
de zinco), o de Ritchie (sedimentação por centrifugação em mistura éter-
formol), o de Hoffman, Pons e Janer ou, mais precisamente, método de Lutz,
pois Adolfo Lutz o descreveu em 1919 (LUTZ, 1919; HOFFMAN et al. 1934 ;
FAUST et al. 1938 e RITCHIE, 1948).
No entanto, são notórias as limitações do exame parasitológico de fezes
(EPF) quanto à eficiência diagnóstica nessa parasitose, principalmente porque
na infecção por Giardia a eliminação de cistos é intermitente. A prática clínica e
laboratorial tem observado tal fenômeno com bastante intensidade. Não são
poucos os casos em que o encontro de cistos nas fezes só ocorre após a
realização de vários exames, da mesma forma que muitos pacientes com
vários sintomas e com ausência de Giardia no EPF se beneficiam após o
tratamento específico. E, se a prática diária tem chamado a atenção para o
problema, alguns trabalhos têm confirmado tais observações. Para KAMATH &
MURUGASU (1974), o EPF não permite mais que 50% de resultados positivos,
ao exame de uma única amostra fecal. SCHEFFLER & VAN ETTA (1994)
consideram a sensibilidade do EPF em 74%, enquanto que para JELINEK et al.
(1996) a sensibilidade pode chegar em 80% e para ALDEEN et al. (1998), em
85%.
De fato, a eliminação de cistos nas fezes apresenta-se de maneira
bastante irregular. DANCIGER & LOPEZ (1975), ao acompanharem quinze
crianças parasitados por G. lamblia durante 1 a 3 meses, verificaram uma
eliminação variável de cistos, diariamente, dentro de padrões de baixo, médio e
elevado número de cistos nas fezes. Para estes autores, aqueles que
apresentam uma baixa eliminação de cistos possuem probabilidade maior de
terem um EPF negativo.
CASTANHO & FURTADO (1981), examinando um grupo de 14
pacientes, acompanhados por 30 dias, todos eles sabidamente portadores de
giardíase, nos quais foram realizados 130 exames, observaram uma variação
diária, porém irregular no número de cistos por grama de fezes, ou seja, não
observaram esses autores padrões regulares de eliminação de cistos ou
mesmo a ocorrência de curvas regulares quanto ao número de cistos e o
período de dias compreendido entre uma grande e uma pequena eliminação de
cistos. Referem ainda que a maioria dos pacientes teve a maior parte dos
exames positiva, enquanto que alguns tiveram a maior parte negativa. No
global, 30% dos exames foram falso-negativos, ou seja, uma positividade de
70%, mas não observaram qualquer correlação entre esta e o número de
cistos nas fezes, quando se considerou cada paciente individualmente.
Utilizando-se da contagem de cistos nas fezes em câmara de Neubauer, esses
autores observaram pacientes com cerca de 2 x 10
5
cistos por grama de fezes,
contrastando com pacientes eliminando mais de 9,8 x 10
6
cistos por grama de
fezes. Da mesma forma, alguns pacientes apresentaram uma variação
extremamente interessante, existindo casos de exames positivos com mais de
9 x 10
6
cistos por grama de fezes intercalados com vários exames negativos.
Por outro lado, CASTANHO et al. (1983) realizaram vários exames em
um grupo de pacientes, sabidamente parasitados por G. lamblia utilizando-se
do método de Ritchie, repetindo os exames três dias seguidos, no sétimo e no
14 dias, e chegaram à conclusão de que, na giardíase, a realização de três
exames com intervalo de sete dias, permitiu que se alcançasse 80% de
sensibilidade, valor maior que quando os exames foram realizados em três dias
seguidos. Para eles, não há uma explicação plausível para a melhor eficácia
desse período na repetição dos exames, pois os assim chamados ciclos de
eliminação de cistos não são regulares. A verdade é que a repetição com
intervalo de sete dias pareceu ser a melhor combinação nos exames, pelo
menos no que diz respeito ao método do formol-éter (Método de Ritchie).
Da mesma forma, SILVA et al. (1981), já haviam observado que a
prevalência de parasitoses em uma comunidade aumentou de 81% para 91%,
apenas com uma única repetição dos exames. PINTO et al. (1981) também já
haviam demonstrado que a porcentagem de positividade do EPF, de uma
forma geral, aumenta com a realização repetida dos exames.
Segundo MANK et al. (1997), a realização de um exame por microscopia
permite uma sensibilidade de 80%, que pode chegar a 96% com a realização
de dois exames, em um intervalo de 10 dias.
Esses dados mostram que há uma variação irregular na eliminação dos
cistos e ela parece ser, senão a responsável, uma das razões pelas elevadas
médias de falso-negativos para giardíase nos EPFs.
Estudos “in vitro” mostram que alguns fatores estão de certa forma
relacionados ao encistamento, como a presença de sais biliares e ácidos
graxos. Por outro lado, o encistamento é abolido na presença de colesterol. No
entanto, a importância desses fatores para indução do encistamento
permanece controversa (ADAM, 2001).
Não se conhece a razão da variação na detecção de cistos nas fezes.
Para CASTANHO (1996), a consistência das fezes seria um fator importante.
Fezes amolecidas apresentam-se mais diluídas, ocorrendo diminuição da
concentração de elementos parasitários. Por sua vez fezes baritadas, por
exemplo, são totalmente impróprias, ou melhor, são desaconselháveis para
qualquer exame parasitológico.
Também o uso de medicamentos poderia interferir na positividade dos
exames, e aí nesse caso poderia alterar a variação na eliminação de cistos,
pois teoricamente, alguns antibióticos diminuiriam a população de trofozoítos e,
conseqüentemente, a formação de cistos a serem eliminados. Se na prática
clínica e laboratorial é possível se observar uma baixa sensibilidade do EPF
para o diagnóstico da giardíase, esses trabalhos vêm confirmar tais suspeitas
e, de certa forma, até mensurá-las.
Pelo exposto, percebemos que o diagnóstico da giardíase por meio do
EPF deve ser sempre analisado com reservas. A grande vantagem é a
especificidade de 100%, isto em se tratando de um examinador experiente.
O exame do conteúdo duodenal é outro recurso utilizado quando a
suspeita da protozoose é grande e os exames coprológicos são negativos.
BEAL et al. (1970) preconizam o exame do “Enterotest”, que consiste na
deglutição pelo paciente de uma cápsula de gelatina, que permanece por cerca
de quatro horas no duodeno e depois é retirada. Para SUZUKI et al. (1994) o
aspirado duodenal não permite mais que 43% de diagnóstico positivo, quando
comparado ao EPF. Esses mesmos autores relatam que entre 21 pacientes,
apenas um caso foi positivo pelo exame do aspirado duodenal e negativo pela
microscopia das fezes.
Já GALLAND & LEE (1989) sugerem o exame do raspado de mucosa
retal com pesquisa de parasitas no muco por imunofluorescência direta.
Os resultados desses testes alternativos mostram que o exame do suco
duodenal, assim como biópsias e outros testes, podem ser considerados como
um recurso a mais no diagnóstico deste importante parasita, porém, não como
rotina, mas em casos específicos (SOGAYAR & GUIMARÃES, 2000).
Numa tentativa de se atingir melhores resultados, sem submeter o
paciente a vários exames, muitas vezes desagradáveis, ou a uma colheita
sistemática de fezes para a repetição de exames parasitológicos ou evitar
tratamentos não indicados, buscou-se a utilização de métodos imunológicos no
diagnóstico da giardíase.
A pesquisa de anticorpos circulantes anti-G. lamblia tem sido abordada
em vários estudos. RIDLEY & RIDLEY (1976) relataram a sua presença em
soro de pacientes humanos. Anticorpos circulantes foram também detectados
por imunofluorescência indireta (VISVESVARA et al. 1980; ROJAS et al., 1989)
e por ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay (SMITH et al. 1981;
HARALABIDIS, 1984; JANOFF et al. 1988). Segundo HARALABIDIS, (1984) o
ELISA para pesquisa de anticorpos no soro pode dar reações cruzadas com
Toxoplasma gondii, Sarcocystis, Leishmania donovani, tênias, entre outros,
embora essas reações possam diminuir com a purificação dos antígenos. Por
outro lado, não foram observadas reações cruzadas com antígenos de
Entamoeba histolytica/ Entamoeba dispar, Schistosoma mansoni e outros.
UNGAR & NASH (1987), CHAUDHURI et al. (1992), SOLIMAN et al.
(1998) observaram diferenças significativas entre os níveis de anticorpos em
pacientes infectados por G. lamblia, quando os mesmos se apresentavam
assintomáticos ou sintomáticos. Para SULLIVAN et al. (1991), a pesquisa de
anticorpos IgM indica infecção aguda, enquanto que IgG permanece circulante
por várias semanas ou meses após o término do parasitismo.
Para SOGAYAR & GUIMARÃES (2000), a sorologia não mostra bons
resultados, visto o grande número de falso-positivos, pois os anticorpos
permanecem no soro das pessoas já curadas da parasitose
.
GUIMARÃES & SOGAYAR (2002) compararam os resultados do exame
de três amostras de fezes com a pesquisa de anticorpos anti-Giardia por ELISA
e imunofluorescência indireta, utilizando sangue colhido de polpa digital em
papel de filtro, e puderam observar que a imunofluorescência indireta foi mais
sensível e mais específica que o ELISA. Para esses autores, esses testes não
mostraram uma concordância satisfatória com o exame de fezes, mas a
prevalência da soropositividade foi bastante alta por ambos os métodos.
Mais recentemente, RODRIGUEZ et. al. (2004) desenvolveram e
utilizaram técnica de ELISA para a detecção de anticorpos totais e específicos
de Giardia tipo IgA e testaram em saliva e sangue de vários pacientes
concluindo que os níveis de IgA específicos anti-Giardia em saliva poderiam
ser utilizados no diagnóstico de giardíase em crianças.
Métodos de pesquisa de coproantígenos de Giardia, como contra-
imunoeletroforese (CIE), imunofluorescência direta (IFD) e ensaios
imunoenzimáticos (ELISA) têm sido indicados, numa tentativa de se encontrar
um método prático, sensível e pouco agressivo ao paciente. Esses métodos
consistem na pesquisa de antígenos fecais por meio da utilização de anticorpos
específicos. ARGOMEDO et al. (1993), por exemplo, demonstraram 100% de
sensibilidade e especificidade quando da utilização da IFD no diagnóstico da
giardíase. Para ZIMMERMAN & NEEDHAM (1995), a sensibilidade da IFD
chega a 100%, enquanto a especificidade a 99,8%. Resultados semelhantes
foram obtidos por GARCIA & SHIMIZU (1997) na análise de diferentes “kits”
comerciais de IFD.
FEDORKO et al. (2000) também obtiveram bons resultados e
observaram que a sensibilidade de dois testes comerciais de IFD mantiveram-
se estáveis mesmo com a estocagem das fezes em diferentes conservantes.
ROSOFF & STIBBS (1986) caracterizaram o “antígeno fecal específico
de Giardia” (GSA 65 -peso molecular 65000 Da), que para esses autores é o
antígeno predominante em fezes de pacientes com giardíase e que representa
um antígeno ideal para o preparo de métodos utilizados no coprodiagnóstico
dessa parasitose. Atualmente esse parece ser o principal antígeno detectado
em diferentes “kits” comerciais de ELISA, embora existam algumas
controvérsias a respeito. Para BOONE et al. (1999) o antígeno detectado por
esses testes seria uma proteína da parede cística (CWP1), presente nas fezes
de pacientes com giardíase que começa a se formar durante o encistamento.
Vários estudos têm demonstrado a boa sensibilidade, especificidade e
praticidade do método de ELISA para pesquisa de coproantígenos, muitas
vezes, utilizando-se de diferentes metodologias quanto aos aspectos técnicos,
ou seja, variando as formas de produção dos anticorpos de captura ou dos
anticorpos do conjugado, tempos de incubação, entre outros aspectos.
Vários trabalhos foram realizados com ELISA, alguns com técnica
desenvolvida pelos próprios autores em seus laboratórios e outros utilizando-se
de “kits” disponíveis no comércio.
Os primeiros trabalhos foram realizados com ELISA desenvolvido e
preparado pelos próprios autores, na tentativa de se estabelecer parâmetros
práticos e confiáveis.
UNGAR et al. (1984) fizeram estudo detalhado com ELISA por eles
desenvolvido e obtiveram 92% de sensibilidade e 98% de especificidade,
sendo que para esses autores, o método detecta também produtos de
excreção e secreção dos parasitas, além do que os falso-negativos podem ser
explicados pela pequena quantidade de antígenos ou mesmo pelas
características das diferentes cepas. GREEN et al. (1985) observaram com
ELISA sensibilidade de 98,7% e 100% de especificidade.
NASH et al. (1987) relatam sensibilidade de 94,2% e especificidade de
98,0%. Esses autores relatam ainda uma relação entre a quantidade de cistos
de Giardia na microscopia e a intensidade da densidade ótica do ELISA. Para
eles, a presença de outros parasitas não resultou em resultados falso-positivos.
STIBBS (1989) utilizando-se de ELISA preparado com anticorpos
monoclonais puderam verificar sensibilidade de 82% em exames realizados em
amostras de fezes não fixadas e 97% quando de exames em amostras
formolizadas. Para esse mesmo autor, avaliações “in vitro” demonstraram ser
esse método mais específico para cistos do que para trofozoítos.
KNISLEY et al. (1989) demonstraram que na pesquisa de
coproantigenos, a utilização de fezes formolizadas pode alterar os resultados e
o congelamento/descongelamento das amostras são procedimentos que não
interferem nos resultados do ensaio imunoenzimático.
VINAYAK et al. (1991), utilizando dot-ELISA, obtiveram 91% de
sensibilidade. Quanto à especificidade, consideraram como 100%, embora
tivessem observado a ocorrência de casos que foram positivos pelo ELISA e
negativos na microscopia. Tais casos, segundo esses autores, tratavam-se de
pacientes clinicamente suspeitos de giardíase e com regressão dos sintomas
após a terapia. Consideraram assim esses casos como verdadeiros positivos
para Giardia.
Para GOLDIN et al. (1993), a sensibilidade é de 94,2% e a
especificidade de 98% e referem que a ocorrência de resultados falso-
negativos poderia ser decorrente da existência de pouco antígeno nas fezes ou
de antígenos de cepas diferentes.
TORRES et al. (1997) em Cuba utilizando-se de ELISA preparado em
seu próprio laboratório, obtiveram 94,8% da sensibilidade e 98,3% de
especificidade, sendo que para esses autores seriam necessários mais estudos
que pudessem esclarecer se os casos ELISA positivo/EPF negativo para
giardíase seriam de fato falso-positivos ou se seriam devido a uma
sensibilidade mais acurada do ELISA sobre os métodos tradicionais. Afirmam
também que os falso-negativos poderiam ocorrer devido à presença de poucos
cistos na amostra, ou mesmo diferenças antigênicas das cepas.
DUQUE-BELTRAN et al. (2002) na Colômbia, utilizando ELISA
preparado com anticorpos policlonais de coelho, que na opinião dos autores, é
mais fácil e prático, puderam obter 100% de sensibilidade e 95% de
especificidade. Para esses mesmos autores é importante que os anticorpos
obtidos sejam preparados com antígenos regionais para se atingir os melhores
resultados possíveis.
ROSENBLATT et al. (1993) avaliaram “kit” de ELISA comercial (LDM,
Seradyn) e obtiveram 97% e 96% de sensibilidade e especificidade,
respectivamente. Esses autores não observaram interferência nos resultados
ao empregarem amostras de fezes preservadas em formol e estocadas por
longos períodos. Nos casos de resultados falso-negativos, verificaram poucos
cistos nas fezes.
SCHEFFLER & VAN ETTA (1994) utilizando “kit” comercial de ELISA
anti-GSA 65 (ProSpecT Giardia Alexon) e comparando com EPF, obtiveram
95% de sensibilidade e 100% de especificidade. Empregando a mesma técnica
ALDEEN et al. (1995) observaram 91% e 98% de sensibilidade e
especificidade, respectivamente, enquanto que ZIMMERMAN & NIEDHAN
(1995), 97% de sensibilidade e 99,8% de especificidade. Resultados
satisfatórios também foram obtidos por JELINEK et al. (1996) com ELISA anti-
GSA 65 (sensibilidade de 95% e especificidade de 99,7%) não observando
reações cruzadas com outros parasitas.
ALDEEN et al. (1998) testaram várias marcas de “kits” de ELISA
disponíveis no mercado, variando a sensibilidade de 88,6% a 100% e a
especificidade de 99,3% a 100%. GARCIA & SHIMIZU (1997) também já
haviam experimentado vários “kits”, sugerindo que na escolha se deve também
levar em conta aspectos como o custo e a praticidade do método.
MANK et al. (1997) fizeram interessante estudo comparando duas
marcas de “kits” de Giardia, CELISA-Cellabs Diagnostics e ProSpecT Alexon
com resultados de um e dois exames parasitológicos de fezes, utilizando
técnica de concentração e centrifugação em formol-éter, e verificaram 87,3% e
92,7% de sensibilidade respectivamente. Quanto à especificidade ambos os
métodos atingiram 99,4%.
MARAHA & BUTING (2000) e AZIZ et al. (2001) testaram várias marcas
de “kits” comerciais e verificaram variações na sensibilidade conforme a marca
entre 91% e 100% e na especificidade, entre 89% e 100%.
ROCHA et al. (1999), no Brasil, também obtiveram bons resultados com
“kit” de ELISA comercial, ProSpecT Giardia (Alexon, Inc., Biobrás) mas
constataram maior sensibilidade quando utilizaram fezes frescas (100%) em
vez de fezes formolizadas (90%), observando o inverso quanto à especificidade
(95% e 98,3%).
FAUBERT (1996) já havia relatado que a alta sensibilidade do ELISA em
pacientes oriundos de diversas partes do mundo, sugere que o GSA 65 seria
um antígeno comum e presente em diferentes isolados de Giardia. VESY &
PETERSON (1999), em revisão sobre giardíase, já propunham o uso do
método de ELISA, especialmente em levantamentos epidemiológicos e controle
de surtos da parasitose.
A nosso ver, esses métodos abrem perspectivas de diagnósticos mais
confiáveis na giardíase, até então limitados à repetição sistemática de vários
EPFs, que, mesmo assim, não se mostram totalmente confiáveis, e a alguns
exames agressivos e pouco práticos. Dentre essas perspectivas, além da maior
segurança na confirmação de uma suspeita clínica, seria a utilização do ELISA
no controle de cura da parasitose, tanto na prática clínica do dia-a-dia como na
avaliação de novos fármacos ou novos esquemas terapêuticos realizados em
caráter de pesquisa.
O controle de cura na giardíase, conforme recomendação da
FEDERACION LATINO AMERICANA DE PARASITÓLOGOS - FLAP (2000),
deve ser realizado por três EPFs, entre o sétimo e o décimo dias após o final
do tratamento, só se considerando curados aqueles pacientes que
apresentarem todos os exames negativos. Existem também recomendações
para que esse controle seja realizado no sétimo, décimo quarto e vigésimo
primeiro dias após o tratamento (INSTITUTO DE PESQUISAS JOHNSON &
JOHNSON, 1973).
Poucos estudos foram realizados na tentativa de se avaliar o
comportamento do ELISA após a terapêutica específica contra a giardíase.
UNGAR et al. (1984), utilizarando o ELISA em 10 pacientes após o
tratamento, relataram que em um paciente o exame se tornou negativo após
dois dias do início da terapêutica, e sugerem que o método poderia ser
utilizado como controle de cura na giardíase.
GREEN et al. (1985) acompanharam um paciente tratado e observaram
que, após quatro dias, o ELISA se tornou negativo, tendo o EPF negativado no
sétimo dia.
NASH et al. (1987) infectaram e acompanharam um grupo de
voluntários desde o dia zero da inoculação, realizando vários exames de cada
paciente. Esses pacientes foram tratados no 15 dia da infecção e observaram
os autores que após seis dias do início da medicação, os exames se tornaram
negativos. Relataram ainda que, durante o período de tratamento, do 15 ao
19 dia, o ELISA revelou mais resultados positivos que o exame das fezes pela
microscopia.
KNISLEY et al. (1989), observando o comportamento do método em
dois pacientes, relatam a negativação três dias após o início da terapêutica.
GOLDIN et al. (1993) avaliaram o ELISA em um grupo de pacientes
após uso do metronidazol por cinco dias, tendo realizado vários exames em
cada paciente tratado. Referem que em um paciente houve a ocorrência de
vários exames negativos pela microscopia em contraste com exames positivos
pelo ELISA, o que para eles seria decorrente de uma falha terapêutica.
HASSAN et al. (1995) realizaram exames pré e pós-tratamento em um
grupo de pacientes e observaram acentuado decréscimo na concentração de
antígenos quinze dias após a medicação. Esses mesmos autores, contudo,
fizeram avaliação tomando por base a média de antígenos obtida por
densidade óptica nesse grupo, considerando antes e após o tratamento, não
referindo à porcentagem de positivos ou negativos e nem ao acompanhamento
com o EPF. Sugerem que esse método de ELISA poderia ser útil para
verificação de cura da giardíase .
Como visto anteriormente, esses dados referem-se ao comportamento
do ELISA em pacientes tratados, sem a preocupação de estabelecer critérios
ou parâmetros para serem utilizados como instrumento de controle de cura
pós-terapêutica da giardíase.
Assim sendo, pareceu-nos importante testar o método de ELISA, no
caso o anti-GSA 65 comercial, como instrumento de controle de cura na
giardíase, comparando com o EPF, a fim de verificar a viabilidade de tal
processo, sua confiabilidade, praticidade e, principalmente, qual o melhor
momento de realizá-lo após a terapêutica.
Por outro lado, como essa avaliação foi realizada com pacientes que
foram tratados, poderia-se inferir que, caso houvessem falhas terapêuticas, o
número de cistos eliminados poderia estar bastante reduzido e assim nos
pareceu importante estudar o limiar de positividade dos métodos utilizados, em
relação a concentração de cistos nas fezes.
Quanto ao comportamento do ELISA no sentido de detectar
determinadas quantidades de antígeno, algumas considerações devem ser
feitas. UNGAR et al. (1984) adicionaram em PBS cistos armazenados e
trofozoítas cultivados fazendo diversas diluições e observaram que o ELISA foi
positivo em diluições cujas concentrações indicavam conter entre 37 e 375
trofozoítos e entre 12,5 e 125 cistos. Fezes de pacientes com cistos de
Giardia, também foram diluídos em diversas proporções em PBS e observaram
também que o ELISA foi positivo em diluições que permitiam estimar entre 69 e
1.528 cistos.
TORRES et al. (1997) também trabalhando com parasitas obtidos de
culturas, e diluídas em tampão fosfato em diversas proporções, puderam
observar que o ELISA foi capaz de reagir em diluições que indicavam a
presença de 50 trofozoitos e 322 cistos.
Como foi visto, esses estudos não se referem à concentração de cistos
em uma amostra fecal, o que acreditamos importante também ser avaliado.
Assim, o propósito deste trabalho foi o de realizar uma avaliação mais
abrangente sobre o diagnóstico de giardíase e, principalmente, testar o método
de ELISA anti-GSA 65 como um instrumento de controle de cura, estabelecer
critérios e parâmetros, e a melhor forma de utilizá-lo para se obter resultados
confiáveis.
Foi estudado também o limiar de positividade, considerando a
concentração de cistos nas fezes, tanto para o ELISA anti-GSA 65 como
também para o método de Faust e cols. Da mesma forma, no sentido de se
avaliar esse limiar em função de uma população parasitada, procurou-se
avaliar a quantidade de eliminação de cistos por grama de fezes.
Com base no limiar de positividade, procurou-se propor a sua utilização
como uma metodologia viável para ser utilizada na aferição da sensibilidade de
métodos parasitológicos para o diagnóstico da giardíase.
II. OBJETIVOS
Avaliar comparativamente os métodos de ELISA anti-GSA65 e o de
Faust e cols (MFc) para o diagnóstico laboratorial e para o controle de cura da
giardíase.
Avaliar o limiar de positividade dos métodos de Faust e cols. (MFc) e
de ELISA anti-GSA65 para o diagnóstico laboratorial da giardíase, com base na
contagem de cistos por grama de fezes.
III. MATERIAL E MÉTODOS*
1
Este trabalho foi desenvolvido em duas etapas: Numa primeira, avaliou-
se o limiar de positividade do método de ELISA anti-GSA 65
*
e do método de
Faust e cols. (MFc) no diagnóstico de giardíase. Para tanto amostras fecais
oriundas da rotina laboratorial foram selecionadas e avaliadas, tomando-se por
base a contagem de cistos por grama de fezes. Em uma segunda etapa, um
grupo de crianças frequentadoras de creches, positivas para G. lamblia, foi
selecionado, tratado e acompanhado, onde se testou o ELISA, como
instrumento de controle de cura pós-tratamento, comparado-o com o MFc.
III.1. SELEÇÃO DE AMOSTRAS DA ROTINA
LABORATORIAL
Quantificação de cistos e limiar de positividade
Foram selecionadas inicialmente 100 amostras de fezes positivas para
cistos de G.lamblia, de material proveniente da rotina do Laboratório de
Parasitologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Marília. A
seleção foi aleatória, independente de sexo e idade dos pacientes, tendo sido
examinada pelo MFc uma amostra fecal por pacientes. Essas amostras foram
então submetidas a contagem de cistos por grama de fezes utilizando a
câmara de Neubauer, a fim de se avaliar a quantidade de cistos eliminados em
um grupo de amostras fecais positivas.
1
Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos da Faculdade de Medicina de Marília –
Protocolo nº 142/02-22/05/2002.
*
Todas denominações ELISA nesse item III referem-se ao ELISA anti-GSA 65, ProSpecT Microplate Assay (Alexon, Inc., Biobrás).
A partir daí, para se avaliar o limiar de positividade do método de ELISA
e do MFc em relação à concentração de cistos nas fezes, amostras com
quantidade conhecida de cistos por grama de fezes, por contagem em câmara
de Neubauer, foram misturadas a amostras sabidamente negativas, inclusive
ELISA negativo, as quais serviram de substrato, em proporções tais que se
pudessem obter amostras de fezes contendo diferentes concentrações de
cistos. As amostras obtidas foram submetidas ao método de ELISA e ao MFc
para estudo comparativo. Foram examinadas 14 amostras de fezes cerca de
100 cistos por grama de fezes, 24 com 1.000 cistos e 46 com 10.000 cistos por
grama de fezes.
III.2. SELEÇÃO DE PACIENTES
Para se avaliar o ELISA, e também o MFc, como instrumento de controle
de cura da giardíase, após a terapêutica e também quanto ao diagnóstico, foi
selecionado um grupo de crianças pertencentes a três creches dos municípios
de Oriente, Vera Cruz Paulista e Gália, cidades próximas ao município de
Marília, Estado de São Paulo. Eram todas crianças em idade pré-escolar, com
idade variando de seis meses a seis anos, de ambos os sexos.
Participaram do estudo sobre controle de cura, 94 crianças parasitadas
por G.lamblia, cujo diagnóstico laboratorial em uma amostra fecal foi positivo
tanto pelo ELISA como pelo MFc. A seleção desse grupo foi realizada da
seguinte forma, em dois momentos: Num primeiro momento, examinou-se por
meio do MFc 155 amostras fecais, sendo uma amostra por criança, e
selecionou-se um grupo de 62 pacientes que se apresentaram positivos para
G. lamblia, sendo que, essas mesmas amostras desses 62 pacientes foram
também positivas pelo ELISA (grupo A). Num segundo momento, foram
examinadas amostras de 96 crianças escolhidas aleatoriamente, utilizando-se
o método de ELISA e MFc, em esquema de duplo cego. Foram selecionadas
entre elas, 32 que se mostraram positivas por ambos os métodos (grupo B).
Dessa forma, 94 pacientes (62 do grupo A + 32 do grupo B) foram
encaminhados ao tratamento e acompanhadas para estudo de controle de
cura. Como três delas não realizaram nenhum controle, só foram consideradas
para fins de avaliação, 91 pacientes.
O grupo de 96 crianças referidas no segundo momento tiveram os
resultados de seus exames submetidos à avaliação para estudo comparativo
entre o método de ELISA e o MFc para o diagnóstico da giardíase, e como já
referido os exames foram realizados por ambos os métodos em esquema de
duplo cego. Das crianças, que apresentaram resultados discordantes entre o
ELISA e o MFc novas amostras foram colhidas entre dois a três dias após a
primeira coleta e novamente submetidas a exames. Mantendo-se a
discordância, nova amostra foi colhida com intervalo de mais três dias e outro
exame foi realizado.
Nenhuma dessas crianças, cujos exames foram repetidos, teve retardo
proposital em seu tratamento. Tão logo possível, os resultados foram
fornecidos aos médicos responsáveis e os exames subseqüentes só foram
realizados naquelas em que foi possível colher novas amostras antes que
tomassem a medicação.
III.2.1.
MATERIAL FECAL
Cuidados e Processamento dos Exames
Tanto nos exames laboratoriais pré como pós-tratamento, optou-se pela
utilização de fezes frescas, no máximo conservadas por 24 horas em geladeira,
sendo que uma pequena porção da amostra era retirada para a realização do
ELISA e outra para realização do MFc.
É importante ressaltar que todos os exames foram realizados dentro de
um esquema de duplo cego. Nenhum dos examinadores portanto tinha
conhecimento dos resultados prévios, seja de outro método para a mesma
amostra, seja das amostras anteriores para o mesmo paciente.
Como não existe para o diagnóstico da giardíase um método ouro (gold
standard), considerou-se para este trabalho, como utilizado por MANK et al.
(1997), um “optimal methods”. Assim, alguns parâmetros foram utilizados para
se definir os casos verdadeiramente positivos para
Giardia
: ( I ) presença de
cistos nos exames pelo MFc; (II) nos casos ELISA positivo e MFc negativo, a
ocorrência de duas amostras positivas pelo ELISA; (III) nos casos ELISA
positivo e MFc negativo onde não foi possível realizar o exame de duas
amostras pelo ELISA, considerou-se positivo aqueles pacientes que após o
tratamento passaram a apresentar o ELISA negativo associado a regressão da
sintomatologia.
Da mesma forma, considerou-se como casos verdadeiramente negativos
para giardíase os pacientes que não apresentaram qualquer exame positivo
para
G. lamblia.
III.2.2. TRATAMENTO
As crianças foram tratadas conforme prescrição dos médicos
responsáveis pelas instituições de origem. No caso, receberam metronidazol
em suspensão, na dosagem de 20 mg/kg de peso por dia divididos em duas ou
três tomadas, durante cinco a sete dias.
III.2.3. CONTROLE DE CURA
Após o término do tratamento foram realizadas três baterias de exames
para estudo de controle de cura nesses pacientes.
– Primeiro controle de cura: foi realizado pelo MFc e ELISA no quarto dia após
o final do tratamento em 91 pacientes, tendo sido utilizado sempre a mesma
amostra fecal de cada paciente.
– Segundo controle de cura: foi realizado em 84 pacientes no sétimo, oitavo ou
nono dias, após o final do tratamento, também pelo MFc e ELISA, utilizando-
se a mesma amostra fecal. Neste controle, sete pacientes que haviam feito o
primeiro controle, abandonaram o experimento.
– Terceiro controle de cura: foi realizado entre o 11º e 14º dias após o final do
tratamento, sendo que 60 pacientes participaram desse controle, no qual foi
considerado para fins de avaliação apenas a realização do MFc. Dos 13
casos já positivos nos controles anteriores, somente quatro participaram
efetivamente dessa avaliação, e isso por motivos éticos, pois as crianças
que se apresentaram ainda com a parasitose após o primeiro controle, foram
logo encaminhadas para nova avaliação clínica e os médicos responsáveis
pelas instituições resolveram instituir imediatamente um novo tratamento.
Dessa forma, só foi possível nos outros nove pacientes fazer apenas o
segundo controle, que foi no máximo no nono dia. Aliás, esse procedimento
já estava previsto, pois não seria ético atrasar condutas médicas para que se
pudesse realizar qualquer tipo de avaliação. De qualquer forma, os casos já
positivos nos primeiros controles foram considerados como participantes da
bateria completa de exames, pois uma vez detectada a falha terapêutica não
precisariam fazer novos exames.
As avaliações foram feitas, considerando-se a eficácia de um único teste
de ELISA, tomando-se por base a realização de dois ou três EPFs pelo MFc.
O segundo controle de cura pelo ELISA foi realizado para confirmação dos
resultados do primeiro.
Verificou-se a eficácia do metronidazol para o tratamento da giardíase e
a intensidade das reações pelo ELISA antes e depois do tratamento, assim
como a comparação entre o ELISA e o MFc para o diagnóstico da giardíase.
III.3. EXAMES LABORATORIAIS
III.3.1. MÉTODO DE ELISA ( ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)
Para a realização do método imunoenzimático ELISA, foi utilizado o “kit”
Giardia ProSpecT Alexon Microplate Assay (Alexon, Inc., Biobrás) que,
segundo o fabricante, detecta o antígeno específico de Giardia (GSA 65), cujos
exames podem ser realizados tanto em fezes frescas como conservadas em
formol. É um método que detecta antígenos por duplos anticorpos (sanduíche)
e sua leitura tanto pode ser feita por aparelho leitor de ELISA como
visualmente conforme tabela de cores fornecida pelo fabricante, que
estabelece os parâmetros positivos de 1+ a 4+ e negativos. Optamos pela
leitura visual e a intensidade de positividade foi avaliada por duas pessoas e,
em nenhum caso, houve dúvidas quanto à interpretação dos resultados. Para
realização desse método, observamos os seguintes procedimentos, conforme
preconizado pelo fabricante.
a) Revestir um Swab com a amostra fecal e agitar vigorosamente em um tubo
com 1 ml de tampão de diluição da amostra TDA (solução tamponada de
timerozal 0,02% e soro de coelho).
b) Transferir 0,2 ml para cada pocinho.
c) Adicionar 4 gotas do controle negativo em um pocinho.
d) Adicionar 4 gotas do controle positivo em um pocinho.
e) Cobrir a placa dos pocinhos e incubar durante 60 minutos à temperatura
ambiente.
f) Verter os conteúdos dos pocinhos e lavar com o tampão de lavagem
(solução tamponada 10x concentrada a timerozal 0,1% *) por três vezes,
dispensando bem o material após a última lavagem.
g)- Acrescentar 200 µl do conjugado enzimático (anticorpo monoclonal anti-
GSA 65 de camundongo marcado com peroxidase de rabanete diluído em
solução contendo timerosal 0,01% e soro bovino) no pocinho e incubar à
temperatura ambiente durante 30 minutos.
h) Decantar e lavar cada pocinho 5 vezes conforme realizado no item f.
i) Acrescentar 200 µl de Solução de Substrato em tampão (tetrametil
benzidina TMB) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
j) Acrescentar 1 gota (50 µl) da Solução Stop (ácido hidroclorídrico 0,5%).
Agitar levemente os pocinhos.
k) Fazer as leituras das reações conforme tabela de cores.
* A solução deve ser diluída na proporção de 1/10 em água destilada antes do
uso.
III.3.2. MÉTODO DE FAUST E COLABORADORES. (MFc)
O método de Faust e cols. (MFc) consiste em um processo de
centrífugo-flutuação em uma solução de sulfato de zinco aproximadamente
33% correspondendo a uma densidade de 1,180 g/ml, sendo ideal para a
pesquisa de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos; foi empregado
conforme descrito por AMATO NETO & CORRÊA (1991).
a) Em frasco apropriado (Borrel ou outro), efetuar suspensão de uma parte de
fezes para dez de água.
b) Coar a suspensão, fazendo-a passar através de tamis metálico de 80 a 100
malhas por cm
2
ou de gaze dobrada quatro vezes, utilizando um pequeno
funil; receber o material em tubo de Wassermann de 13 x 100 mm. No caso,
utilizou-se gaze dobrada.
c) Centrifugar, durante 45 a 60 segundos, a 2.500 r.p.m.; decantar o
sobrenadante, adicionar 2 a 3 ml de água ao sedimento e misturar bem,
juntando a seguir mais líquido, até a distância de meio centímetro mais ou
menos em relação ao orifício do tubo.
d) Efetuar novas centrifugações, decantações e lavagens do sedimento, como
acima foi descrito, sempre completando o volume inicial, até que o líquido
sobrenadante se apresente relativamente claro, o que indica terem sido
suficientes essas manobras.
e) Decantar o líquido sobrenadante da última lavagem do sedimento e colocar
no tubo 2 a 3 ml de solução de sulfato de zinco a uma densidade de 1.180;
misturar bem e adicionar mais solução, até ser atingido o nível já
mencionado, que deve ter sido adequadamente marcado.
f) Centrifugar a 2.500 r.p.m., durante 45 a 60 segundos.
g) Retirar da película superficial da solução de sulfato de zinco,
por meio de alça de platina, o material a ser examinado; nessa camada
estão contidos os cistos de protozoários e ovos e larvas de helmintos,
quando presentes, devendo a alça ser colocada três ou quatro vezes em
contato com a mencionada película, a fim de ser obtida maior quantidade
possível de elementos a examinar.
h) Juntar a solução de lugol, cobrir com lamínula e examinar.
III.3.3. CONTAGEM DE CISTOS
A contagem de cistos foi realizada em câmara de Neubauer conforme
preconizado por CASTANHO & FURTADO (1981).
De cada amostra positiva, foram colhidas 0,042g de fezes que foram
diluídas em uma solução contendo 0,6 ml de água destilada e 0,6 ml de lugol
(1,2 ml). A mistura foi agitada até a completa homogeneização do material,
sendo que um pequeno volume foi retirado e colocado, através de uma pipeta,
em uma câmara de Neubauer, tendo sido os cistos contados em todos os nove
quadrantes de cada lado da câmara, e o resultado avaliado pela média das
duas contagens.
Para padronizar a quantidade de fezes diluídas na solução água/lugol foi
utilizado o orifício da placa empregada do método quantitativo de Kato-Katz
que permite conter aproximadamente 0,042 g de fezes (CIMERMAN &
CIMERMAN, 2002).
Após a contagem, o número de cistos em cada amostra fecal foi
calculado fazendo-se as respectivas multiplicações e conversões para
determinação do número de cistos por grama de fezes.
número de cistos encontrados X 1,242 ml = nº cistos em 0,042 grama de fezes (a)
0,0009 ml
número de cistos em 0,042 g de fezes (a) X 1g = nº de cistos por grama de fezes
0,042 g
- 0,042 gramas = quantidade aproximada de fezes contida pelo orifício da placa do método de
Kato-Katz
- 1,242 ml = 0,06 ml de água + 0,06 ml de lugol + 0,042* gramas de fezes
- 0,0009 ml = volume da câmara de Neubauer
* Consideraram-se as fezes com o mesmo peso específico da solução de diluição utilizada.
No caso, a visualização de cada cisto nos 0,0009 ml da câmara
correspondeu a cerca de 32.857 cistos por grama de fezes.
Optou-se por essa diluição inicial de 0,042 gramas de fezes para 1,2 ml
de água e lugol, portanto 1,242 gramas, pois a mesma permitiu uma boa
visualização. Diluições menores, embora diminuíssem o fator de multiplicação,
tornariam o material bastante turvo, podendo interferir na contagem dos cistos.
Após a contagem de cistos eliminados pelo grupo de 100 pacientes, foi
feita análise estatística, com intuito de fazer uma quantificação do número de
cistos expelidos num dado momento.
III.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a realização da análise estatística adotou-se os seguintes
procedimentos (ARMITAGE & BERRY, 1997):
a) Quantificação de eliminação de cistos: análise descritiva por meio de
média, mediana, quartil 1 e quartil 3;
b) Para o estudo do limiar de positividade em função do número de cistos
por grama de fezes e intensidade das reações pelo ELISA foi utilizado o
teste exato de Fisher;
c) Na análise dos controles de cura assim como, no estudo da
intensidades da reações antes e após os tratamentos e na positividade
dos exames pós tratamento pelo ELISA e MFc, foi utilizado o teste exato
de Fisher;
d) No estudo comparativo entre a sensibilidade e especificidade do ELISA
e MFc foi utilizado o teste do Qui-quadrado.
Adotou-se para todos os testes o nível de significância de 5% de
probabilidade para a rejeição da hipótese de nulidade.
Foi utilizado o programa Microstat, versão 1984.
IV. RESULTADOS
IV.1. QUANTIFICAÇÃO DE CISTOS
Os resultados da contagem de cistos com as amostras selecionadas
estão expressos na Figura I, distribuídos em colunas e com intervalos de 10
6
cistos por grama de fezes.
Das cem amostras positivas, três apresentaram-se com menos que
100.000 cistos por grama de fezes, sendo que dessas, duas apresentaram
contagem inferior a 32.857, ou seja, embora tenham sido positivas pelo MFc,
nenhum cisto foi visualizado na câmara de Neubauer.
A média de cisto por grama de fezes foi de 3.691.000, e a mediana de
2.727.000. Para o cálculo da média, as duas amostras contendo menos que
32.857 cistos por grama de fezes foram consideradas como tendo 15.000
cistos por grama.
A análise descritiva dos dados mostrou um Quartil 1 (Q
1
) de 1.552.000
cistos e um Q
3
de 5.100.000 cistos por grama de fezes.
FIGURA 1
IV.2. LIMIAR DE POSITIVIDADE
Os resultados referentes ao limiar de positividade para o diagnóstico
laboratorial da G. lamblia, utilizando-se o Método ELISA anti-GSA 65
*
e MFc
estão contidos na Tabela 1 e com relação à intensidade de reação pelo ELISA,
os dados estão contidos na Tabela 2.
Tabela 1 –
Número e porcentagem de exames positivos segundo ELISA e MFc em
diferentes amostras preparadas artificialmente com cerca de 100, 1.000 e 10.000 cistos
por grama de fezes.
Número de
cistos por
grama de fezes
ELISA+ MFc+Número
de amostras
nº %
nº %
14 100 2 14,2
0 0
24 1.000 20 83,3
4 16,6
46 10.000* 39 84,7
16 34,7
MFc – Método de Faust e colaboradores
* Houve uma amostra que foi positiva pelo MFc e negativa pelo ELISA.
Tabela 2
– Intensidade das reações (1+ a 4+) pelo ELISA em exames positivos de
amostras preparadas artificialmente com cerca de 100, 1.000 e 10.000 cistos por grama
de fezes.
Cistos por grama
de fezes
Amostras
positivas
Intensidade da reação
1+ 2+ 3+ 4+
n. % n. % n. % n. %
100 2 2 100 - - - - - -
1.000 20 20 100 - - - - - -
10.000 39 23 59 3 8 2 5 11 28
n. = número de amostras
% = porcentagem
* Todas as denominações ELISA neste item IV referem-se ao ELISA anti-GSA65, ProSpecT Microplate Assay (Alexon,
Inc. Biobrás).
A análise desses resultados mostrou diferenças significativas na partição
100 x 1.000 para o ELISA (p=0,04) e 100 x 10.000 também para o ELISA
(p=0,03), avaliadas através do teste exato de Fisher.
A diferença na partição para 1.000 x 10.000 cistos para ELISA não foi
estatisticamente significante (p=0,44), assim como, a diferença entre 1.000 e
10.000 cistos pelo MFc também não se mostrou significativa (p=0,06) pelo
teste exato de Fisher.
Quando comparados os resultados para 10.000 cistos pelo ELISA e pelo
MFc, quanto à positividade, houve diferença estatiscamente significativa
(p=0,01). Das 46 amostras, 39 (84,7%) foram positivas pelo ELISA e 16
(34,7%) foram positivas pelo MFc. Nesse caso houve um exame que foi
positivo pelo MFc e negativo pelo ELISA. Todas as demais amostras que foram
positivas pelo MFc também foram positivas pelo ELISA.
Observou-se nesses casos, que as amostras com 10.000 cistos
apresentaram-se mais fortemente positivas no ELISA (Tabela 2), sendo que as
evidências dos dados mostraram uma diferença significante entre as
porcentagens de amostras positivas 1+ para, 100, 1.000, 10000 cistos por
grama, pelo teste exato de Fisher.
Das 14 amostras com 100 cistos por grama de fezes, apenas duas
foram positivas pelo ELISA e nenhuma pelo MFc, sendo que essas duas
amostras positivas apresentaram apenas 1+ de intensidade de positividade.
As amostras com 1.000 cistos por grama apresentaram-se positivas em
83,3% pelo ELISA, todas com reação de baixa intensidade (1+), e 16,6% pelo
MFc. Nesse padrão de quantidade de cistos, os quatro casos positivos pelo
MFc também o foram pelo ELISA.
IV.3. CONTROLE DE CURA
Os resultados referentes aos controles de cura encontram-se resumidos
no Quadro I e na Tabela 3:
Quadro I -
Resultados dos exames de controle de cura, realizados em 91 pacientes pelo
ELISA e MFc após tratamento específico para G. lamblia.
1º Controle* -
4
0
Dia
**
2º Controle*
7
0
-9
0
Dias**
3º Controle*
11
0
-14
0
Dias**
Pacientes
Tratados
ELISA MFc ELISA MFc ELISA MFc
1
p p p p p p
2
p p p p
3
p p p p
4
p p p n
5
p n p p p n
6
p n p p p p
7
p n p p
8
p n p p
9
p n p p
10
p n p p
11
p n p n p p
12
p n p n - -
13
p n p n - -
14-62
n n n n - n
63-84
n n n n - -
85-91
n n -
Obs: Os pacientes foram numerados e agrupados para confecção do quadro.
p - positivo
n - negativo
Total de exames pelo ELISA e MFc = 179 exame não realizado
Total ELISA = 179
Total MFc = 228
1 a 13 – Pacientes positivos, ou seja, falhas terapêuticas, considerados
como participantes dos três controles
14 a 62 - Pacientes que realizaram os três controles (2 ELISA e 3 MFc)
63 a 84 - Pacientes que realizaram dois controles (2 ELISA e 2 MFc)
85 a 91 - Pacientes que realizaram um controle (1 MFc e 1 ELISA)
*A mesma amostra fecal de cada paciente submetida ao ELISA e ao MFc.
** Após o final do tratamento.
Tabela 3
– Número de pacientes testados após tratamento, que apresentaram resultados
negativos e respectivas porcentagens de cura estimadas segundo os procedimentos realizados
pelo ELISA e MFc.
Métodos Número de resultados (-) e % de cura
1 Controle 1 + 2 Controle
1 +2 + 3 controle
p - %
cura
p
- %
cura
p - %
cura
ELISA 91 78 85,7 84 71 84,5
MFc 91 87 95,6 84 74 88,0
60
49
81,6
p número de pacientes tratados e avaliados em cada controle
- exame negativo
% cura. Porcentagem de cura estimada por cada método e em função do número de pacientes
avaliados em cada controle.
1
0
- Controle - 4
0
dia após o final do tratamento.
2
0
- Controle - 7
0
- 9
0
dias após o final do tratamento.
3
0
- Controle - 11
0
- 14
0
dias após o final do tratamento.
Nas 91 amostras examinadas no primeiro controle de cura, realizado no
quarto dia após o término da medicação, o ELISA detectou treze pacientes
positivos (falha terapêutica) e o MFc apenas quatro (Quadro I e Tabela 3).
No segundo controle de cura, realizado entre o sétimo e o nono dias
após o término da medicação, foram examinadas amostras de 84 pacientes,
tendo o ELISA detectado as mesmas 13 amostras positivas do controle
anterior. O MFc mostrou-se positivo em nove pacientes, seis novos e três dos
quatro já anteriormente detectados no primeiro controle. Um dos pacientes
positivo no primeiro controle revelou-se negativo nesse segundo pelo MFc
(paciente 4). Dessa forma, os dois controles detectaram 10 falhas terapêuticas
(Quadro 1 e Tabela 3).
Para o terceiro controle de cura, amostras de 50 pacientes negativos
pelo MFc nos primeiros controles foram coletadas e examinadas. Um desses, o
paciente 11 que já havia sido revelado falha terapêutica pelo ELISA mas não
pelo MFc, mostrou-se nesse terceiro controle positivo por ambos os métodos e
os pacientes 14 a 62 mantiveram-se negativos. Os pacientes 12 e 13 não
participaram desse controle. Como os dez pacientes já positivos pelo MFc em
qualquer um dos controles anteriores já haviam sido considerados como falhas
terapêuticas, não necessitando portanto fazer os demais exames, foram
coniderados como participantes dos três controles. Sendo assim, a soma dos
resultados dos três controles pelo MFc mostrou 11 falhas terapêuticas em 60
pacientes efetivamente avaliados.
Três outros pacientes antes já revelados como falhas terapêuticas
participaram também desse controle, tanto pelo ELISA como pelo MFc. Um
desses (paciente 5), antes já positivo pelo MFc revelou-se negativo (Quadro 1),
mas de qualquer forma foi considerado como falha terapêutica.
Computando-se assim o primeiro controle realizado apenas pelo ELISA,
observamos 13 falhas terapêuticas e 78 curas, em 91 pacientes tratados, ou
seja, uma eficácia do medicamento de 85,7%. Se considerarmos nesse caso,
os resultados do primeiro e segundo controle pelo ELISA, teríamos as mesmas
13 falhas terapêuticas mas 71 curas em um total de 84 pacientes, o que
mostraria uma eficácia de 84,5%, diferença essa não significativa. Quando
computamos as porcentagens de cura avaliadas apenas pelo MFc, temos: com
apenas um controle, quatro falhas terapêuticas e 87 curas foram verificadas
em 91 pacientes, ou seja, uma eficácia medicamentosa que seria avaliada em
95,1%; com apenas dois controles, 10 falhas terapêuticas e 74 curas em 84
pacientes, uma eficácia de 88% e com os três controles, 11 falhas terapêuticas
e 49 curas em 60 pacientes, ou seja, uma eficácia medicamentosa que seria
avaliada em 81,6%.
Esses 60 pacientes do terceiro controle, referem-se aos 49 pacientes
antes negativos nos dois controles anteriores (pacientes 14 a 62) e aos 11
pacientes que foram positivos em pelo menos um MFc nos três controles.
Portanto, os pacientes 12 e 13 e os de 63 a 91 não estão incluídos, pois não
realizaram os três controles.
Análises estatísticas mostraram pelo teste exato de Fisher não haver
diferenças significativas na partição um ELISA x dois e três controles pelo MFc
(p=0,56), sendo que na partição um controle pelo MFc x um controle pelo
ELISA, ou dois e três controles pelo MFc as diferenças foram significantes
(0=0,02).
IV.3.1. EFICÁCIA DO ELISA E DO MFc APÓS A TERAPÊUTICA
Amostras de 91 pacientes submetidos à terapêutica foram analisadas
pelos métodos de ELISA e MFc após o tratamento totalizando 179 exames e os
resultados estão expressos na Tabela 4.
Tabela 4 –
Eficácia do ELISA em exames realizados após a terapêutica comparando com o
MFc, em 30 amostras de 13 pacientes não curados e 149 amostras de 78 pacientes curados.
AMOSTRA DE FEZES
Positivas Negativas Total
ELISA
Positivos 30 0 30
Negativos 0 149 149
Total 30 149 179
Positividade 100%
MFc
Positivos 16 0 16
Negativos 14 149 163
Total 30 149 179
Positividade 53,3%
Dos 30 exames realizados nos 13 pacientes, nos quais houve falha
terapêutica, todos foram positivos pelo ELISA; dos 149 exames realizados nos
78 pacientes que se curaram, todos foram negativos pelo ELISA.
Com relação ao MFc, 16 exames foram positivos (53,3%) em 30
amostras referentes aos 13 pacientes que não se curaram e os demais,
inclusive os 149 exames dos 78 pacientes curados, foram negativos. Análises
estatísticas mostraram diferenças significantes entre essas porcentagens de
positividade (p=0,04).
Assim, em um total de 149 exames negativos pelo ELISA
correspondentes aos 78 pacientes curados, não encontrou-se nenhum
resultado positivo pelo MFc.
Considerou-se como indivíduos não curados, não somente o resultado
de comparação de exames, mas vários fatores envolvidos, os quais nos fazem
acreditar que tais exames positivos pelo ELISA são de fato de amostras fecais
que continham cistos de
G. lamblia
. Em primeiro lugar, porque eram de
pacientes que já apresentavam parasitose. Em segundo, todos os casos foram
confirmados por outro ELISA. Em terceiro, 11 desses pacientes foram
confirmados pelo MFc, não havendo confirmação apenas nos pacientes 12 e
13. Esses pacientes foram acompanhados e após uma segunda dose da
medicação apresentaram ELISA negativo e melhora das manifestações clínicas
que até então haviam persistido. Também ao se considerar indivíduos curados,
observou-se que nenhum caso mostrou-se positivo pelo MFc e negativo pelo
ELISA, e exceto os sete pacientes que fizeram somente o primeiro controle,
todos os demais fizeram pelo menos mais um exame pelo ELISA e pelo menos
mais um ou dois exames pelo MFc. Esses sete pacientes acima citados foram
considerados como curados dada a alta sensibilidade do ELISA observada nos
outros pacientes do experimento, mesmo porque o MFc também foi negativo.
IV.3.2. EFICÁCIA DO METRONIDAZOL
Nos 91 pacientes tratados com o metronidazol, observou-se que 78
pacientes se curaram e 13 apresentaram falha terapêutica, portanto, esse
medicamento mostrou uma eficácia de 85,7%. Esse porcentual foi calculado
com base nos resultados do primeiro controle de cura realizado pelo ELISA no
quarto dia após o fim da terapêutica (Tabela 3).
IV.3.4. INTENSIDADE DAS REAÇÕES DO ELISA
Os resultados quanto à intensidade das reações nos 91 exames
realizados pelo ELISA antes do tratamento e nos 30 pós-tratamento estão
expressos na Tabela 5.
Tabela 5 -
Intensidade das reações (1+ a 4+) pelo ELISA em 91 amostras positivas pré-
tratamento e 30 amostras positivas pós-tratamento.
Intensidade
Amostras Pré-tratamento Pós-Tratamento
1+ 2+ 3+ 4+ 1+ 2+ 3+ 4+
Número 4 13 15 59 7 4 7 12
Porcentagem 4,4 % 14,3% 16,5% 64,8% 23,3% 13,3% 23,3% 40,0%
As análises estatísticas pelo teste exato de Fisher mostraram diferenças
significantes em relação às porcentagens de exames que apresentaram reação
de 1+ (p=0,005) e de 4+ (p=0,02), quando se comparou sua realização antes e
após o tratamento.
IV.4. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE (ELISA e MFc) NO DIAGNÓSTICO
DA GIARDÍASE
Os resultados referentes à comparação entre o ELISA e o MFc estão
expressos na Tabela 6. Foram considerados para fins de avaliação 38 casos
verdadeiramente positivos para Giardia e 58 casos verdadeiramente negativos
para Giardia, conforme os critérios já especificados anteriormente.
Tabela 6 -
Resultado dos exames realizados pelo MFc em uma, duas ou três amostras
segundo os resultados de amostras testadas pelo ELISA em 96 pacientes, sendo 38
verdadeiramente positivos e 58 verdadeiramente negativos para giardíase.
1 exame* 1 exame* 2 exames 3 exames**
Pacientes ELISA MFc MFc MFc
+ - + - + - + -
+38 38 0 32 6 36 2 36 2
-58 0 58 0 58 0 58 0 58
Total 96 38 58 32 64 36 60 36 60
* O primeiro exame foi realizado na mesma amostra fecal de cada paciente pelos dois métodos
** Um paciente não realizou o terceiro exame
1 MFc – sensibilidade: 84,2%; valor preditivo negativo 90,6%
2 e 3 MFc – sensibilidade: 94,7%; valor preditivo negativo 96,6%
Valor preditivo negativo (vpn) foi calculado pela seguinte fórmula:
vpn = número de verdadeiros negativos x 100
número de negativos pelo MFc
Das 96 amostras examinadas, 38 foram positivas pelo ELISA e 32 pela
realização de um MFc.
As amostras das seis crianças ELISA+/MFc- foram colhidas novamente
e submetidas ao MFc, sendo que quatro delas mostraram cistos de
Giardia
,
aumentando para 36 o número de positivos pelo MFc com o exame de duas
amostras. Das duas crianças restantes, foi possível a colheita da amostra de
uma delas, tendo o EPF não revelado cistos, totalizando, então, 36 crianças
positivas para
G. lamblia
pelo MFc.
Essas duas crianças, uma a que apresentou 01ELISA+/03MFc- e a que
não realizou o terceiro exame na data prevista (01ELISA+/02 MFc-),
apresentavam sintomatologia compatível com giardíase. Foram tratadas com
metronidazol e apresentaram regressão dos sintomas. Um exame pelo ELISA
foi realizado em cada uma das crianças, uma no sexto e a outra no oitavo dia
após o final do tratamento, havendo negativação dos resultados.
Conseqüentemente, essas crianças foram consideradas como verdadeiras
positivas para Giardia.
Análises estatísticas, todavia não mostraram diferenças significantes na
partição um, dois e três MFc x total de positivos, conforme teste do Qui-
quadrado (χ
2
= 084; p=0,65).
Outras parasitoses também puderam ser detectadas quando da
realização do MFc, na triagem dos pacientes. Nos 94 pacientes positivos para
G. lamblia e que foram tratados e acompanhados, 23 mostraram-se positivos,
sendo 18 para Trichuris trichiura, nove para Ascaris lumbricoides, dois
ancilostomideos e um para Entamoeba hístolytica/E.díspar, sendo 16 mono-
parasitados e sete poliparasitados.
Nos 58 pacientes que haviam sido negativos pelo ELISA, 17
apresentaram-se positivos para outras parasitoses, sendo 11 pelo T.trichuira,
seis pelo A lumbricoides, um por E. vermicularis e um para Taenia sp e um
para E.histolytica/E.díspar, sendo 14 monoparasitados e três poliparasitados.
Nos seis pacientes desse grupo que haviam apresentado ELISA positivo
e o primeiro MFc negativo para Giardia, um paciente apresentava cistos de E.
histolytica/E.dispar, sendo que a giardiase somente apareceu no exame da
segunda amostra fecal. Um outro paciente apresentou Blastocystis hominis, e a
giardíase só foi diagnosticada pelo MFc no exame da segunda amostra fecal.
Os outros quatro pacientes foram negativos para outras parasitoses.
V. DISCUSSÃO
Embora os resultados desses experimentos devam ser inter-
relacionados, de início serão analisados separadamente. Ao todo foram
realizados 421 exames pelo ELISA anti-GSA 65, não considerando o uso dos
controles positivos e negativos e os exames realizados no acompanhamento
de alguns pacientes.
V.1. QUANTIFICAÇÃO DE CISTOS
Com relação a quantificação da eliminação dos cistos, procurou-se
averiguar, em termos de quantidades de cistos eliminados, como se
comportam os pacientes parasitados pela G. lamblia num dado momento, ou
seja, em um grupo de amostras que dão entrada em um laboratório para
exames, e assim, relacionar os resultados com a positividade dos exames
parasitológicos.
Optamos pela contagem de cistos em câmara de Neubauer com a
quantidade de fezes padronizadas pelo orifício da placa do método de Kato-
Katz, pois nos pareceu ser a melhor opção, dada a regularidade apresentada
por esse método conforme observaram CASTANHO & FURTADO (1981), pois,
para esses autores, a variação quando da realização de duas ou mais
contagens na mesma amostra é muito pequena, possibilitando resultados
confiáveis, pois não observaram diferenças significativas.
Tentativas de se fazer contagens em lâmina e lamínula com fezes
diluídas em determinada quantidade de água, semelhante ao método de Stoll
Hausheer, (AMATO NETO & CORRÊA, 1991) mostraram muitas variações nos
contratestes. Além disso, diferente de ovos de helmintos, os cistos de Giardia
são muito pequenos, e, para não se passar por algum sem que seja
visualizado, exige-se que a contagem seja feita em aumento de 400X. Na
referida câmara, a contagem realizada nos quadrantes, mesmo que seja
necessário o uso de grande aumento (400X), é bem prática e rápida.
Como observado nas 100 amostras positivas para Giardia, a eliminação
de cistos é bastante grande, tanto que a mediana desses números aponta para
2.727.000 cistos por grama de fezes, com uma média de 3.691.000 cistos
(Figura I). Números semelhantes obtiveram CASTANHO & FURTADO (1981),
utilizando-se da mesma técnica, porém em 130 exames de 14 pacientes, ao
traçarem um perfil de eliminação de cistos durante 30 dias.
Observou-se uma curva assimétrica positiva, com a mediana bem
mais à esquerda e um quartil 1 (Q1) muito mais próximo à mediana e um Q4
bem mais distante (Figura I), e como referimos, contagens abaixo de 100.000
cistos por grama de fezes só ocorreram em três casos. Esses dados nos
obrigam a analisar os resultados sob vários aspectos.
Em primeiro lugar é preciso lembrar que as amostras submetidas à
contagem, de início, já eram positivas, ou seja, mostram uma quantidade de
eliminação de cistos em amostras que já continham um número suficiente, para
permitir exame positivo pelo MFc. Representa portanto, uma quantificação que
espelha um conjunto de exames realizados num grupo de pacientes.
DANCIGER & LOPEZ (1975), observaram durante um a três meses, 15
crianças parasitadas por Giardia e referem a existência de três perfis de
eliminação de cistos, ou seja, alto, médio e baixo. Para CASTANHO &
FURTADO (1981), apesar de existir uma variação bastante acentuada na
eliminação de cistos em cada paciente, quando acompanhados por vários dias,
por tratar-se de uma variação irregular, não foi possível estabelecer padrões de
eliminação de cistos. Portanto, é perfeitamente possível que haja um certo
número de pacientes cujo exame não foi positivo por estar abaixo de um limiar
de positividade.
Acreditamos que seja possível até inferirmos sobre esse número. Como
sabemos, esses 100 casos registrados foram triados de nossa rotina, em que,
a partir de cada amostra de fezes, é realizada uma lâmina após a confecção
dos procedimentos do MFc. Se considerarmos a sensibilidade do MFc em
cerca de 85% (Tabela 6), podemos deduzir que esses 100 casos talvez
representem 85% de um total de 117 pacientes que seriam os realmente
positivos. Se fosse possível incluir mais 17 casos, que seriam os possíveis
falso-negativos no Gráfico da Figura 1, teríamos uma curva com perfil diferente.
Como, muito provavelmente, esses 17 casos seriam de amostras com
pequeno número de cistos, a maioria estaria distribuída na primeira coluna.
Teríamos, então, um gráfico mostrando um grande número de amostras com
pequenas quantidades de cistos, ficando a primeira coluna com
aproximadamente o dobro de casos e após, uma curva continuamente
decrescente.
É possível inferirmos também que a maior parte destes casos
“escondidos” apresentassem pouco mais que 10.000 cistos por grama de
fezes, o que poderemos ver após as análises dos resultados dos outros
experimentos.
A curva da Figura 1, na verdade, mostra o que ocorre entre os casos já
positivos, em um determinado momento, e não no universo de parasitados.
Esses são dados pressupostos e que podem mostrar algumas
variações, visto que outros fatores também podem levar a resultados falso-
negativos no EPF e, não somente a quantidades de cistos na amostra. Se
nessa curva, estão ocultos 17 casos, um pouco mais ou um pouco menos, não
é o mais relevante, mas esses casos devem ser levados em consideração.
V.2. LIMIAR DE POSITIVIDADE
Ao analisarmos os resultados relativos ao limiar de positividade, vemos
que, de fato, amostras com contagens de cistos muito pequenas podem levar a
resultados falso-negativos nos exames de fezes (Tabela 1). A ocorrência de
pacientes parasitados com contagem próxima ou inferior, pelo menos numa
determinada evacuação, a 10.000 cistos por grama de fezes, poderia ser uma
das explicações para esse representativo número de falso-negativos que
ocorrem na giardíase quando da realização do EPF, no caso o MFc.
Sendo assim, o ELISA anti-GSA 65 pode ser considerado um importante
recurso para o diagnóstico dessa parasitose, pois nessas contagens e em até
10 vezes menos, cerca de 85% de casos ainda poderiam ser detectados.
Amostras com 100 cistos por grama de fezes, alcançaram pouco mais
que 14% de positividade pelo ELISA anti-GSA 65 (Tabela 1). Embora o número
de amostras realizadas tenha sido pequeno, apenas 14, análises estatísticas
mostraram-se válidas, quando comparado a 24 amostras com 1.000 cistos e a
46 amostras com 10.000 cistos por grama de fezes. Por outro lado, visto o
pequeno número de positivos nessas 14 amostras, apenas duas, não vimos
mais motivos para aumentar a amostragem, dada à dificuldade em relação à
confecção de cada amostra de 100 cistos por grama e o alto custo implicado de
cada exame.
No entanto amostras com 1.000 e 10.000 cistos por grama de fezes
mostraram pelo ELISA anti-GSA 65 praticamente o mesmo índice de
positividade. Interessante notar que, pelo MFc, amostras com esses número
de cistos por grama, também não mostraram diferenças estatisticamente
significativas (Tabela 1).
Importante ressaltar, que embora o ELISA anti-GSA 65 também detecta
produtos de excreção e secreção dos parasitas e não apenas cistos íntegros,
parece que há de fato uma relação entre a quantidade de cistos e a
positividade desse ensaio imunoenzimático.
Nesse experimento, optamos por estabelecer as concentrações de
cistos nas amostras, por estimativa, pois a quantidade de cistos por grama de
fezes que desejávamos testar, estavam abaixo do limiar de contagem do
método por nós utilizado. Poderíamos ter tentado a análise em amostras de
20.000, mas resolvemos não optar por esse padrão. Na verdade, quando
comparamos amostras com 100, 1.000 e 10.000 estávamos trabalhando com
concentração de cistos 10 vezes maior, diminuindo assim as possíveis
margens de erro nos resultados.
Se introduzíssemos amostras com apenas duas vezes mais quantidade
de cistos, poderíamos incorrer em variações importantes. Por exemplo, entre
1.000 e 10.000 cistos, apesar de qualquer variação na contagem, ainda assim
manter-se-ia uma boa diferença entre as duas. Supondo, mesmo que
improvável, um erro de 30% para mais ou para menos, teríamos a
comparação de 1.300 com 7.000 cistos, diferença essa ainda bastante grande.
Já, ao confrontar amostras de 10.000 com 20.000 cistos, poderíamos nesses
padrões, estarmos comparando, aproximadamente, 13.000 com 14.000 cistos
por grama de fezes, e sem saber, colheríamos resultados que poderiam levar a
conclusões errôneas. De qualquer forma, embora havendo uma boa margem
de segurança, optamos por intervalos de pelo menos 10 vezes. Pelo mesmo
motivo não tentamos diluições que pudessem conter fezes com 500 e 5.000
cistos por grama de fezes.
Numa tentativa de se avaliar o limiar de positividade do método de
ELISA, UNGAR et al. (1984) diluindo cistos e trofozoítos de cultura em PBS,
puderam obter reações positivas em diluições que indicavam a presença de 37
a 375 trofozoítos e de 12,5 a 125 cistos. Utilizando-se de fezes com cistos de
Giardia em diferentes diluições em PBS, obtiveram reações que permitiam
indicar a presença de 69 a 1.528 cistos. TORRES et al. (1997), utilizando-se
de metodologia semelhante, conseguiram detectar, quando da realização do
ELISA, 50 trofozoítos e 322 cistos.
Nosso objetivo não foi avaliar as reações do ELISA relacionada ao
número absoluto de cistos, mas considerando que, ao fazermos o ELISA anti-
GSA65, cada “Swab” colheu, em média, 0,350 gramas de fezes, as quais foram
diluídas em 1 ml de tampão, como descrito na metodologia, e que foram
colocados dessa mistura 0,2 ml em cada pocinho, podemos estimar que, nas
fezes que continham 1.000 cistos por grama de fezes e cujas reações foram
positivas, foi possível detectar algo em torno de 70 cistos.
Embora tenha sido possível calcular aproximadamente a quantidade de
cistos que o método de ELISA anti-GSA65 por nós utilizado foi capaz de
detectar, nossa tentativa foi de se estabelecer um limiar, levando-se em
consideração a concentração de cistos, ou seja, o número de cistos por grama
de fezes. Ao se fazer uma mistura de fezes com fezes, outros elementos
poderão estar presentes tornando tal procedimento uma metodologia mais
próxima da realidade, sem que haja a necessidade de se colher formas
parasitárias em culturas, ou mesmo fazer seu isolamento de fezes positivas,
para posteriores diluições. Da mesma forma, essa metodologia permite por
estimativa, dentro de certos limites, obter amostras com diferentes
concentrações de cistos, podendo ser usada em diferentes tipos de pesquisas.
Normalmente, averiguações sobre a sensibilidade de novos métodos
são realizadas, tomando-se por base casos realmente positivos diagnosticados
por outros métodos. No caso da giardíase, como relatam MANK et al. (1997)
não existe um método ouro (gold standard), e assim pensamos ser possível
testar a sensibilidade de novos métodos não só em relação a casos
sabidamente positivos, mas também através do limiar de positividade.
Tomando-se por base esse experimento, vemos que o ELISA foi capaz
de detectar, perto de 85% das vezes, amostras com 1.000 cistos por grama.
Dessa forma, é possível propor que qualquer método parasitológico, direto ou
indireto, no mínimo, tenha que detectar amostras com essa quantidade de
cistos. Seria interessante, evidentemente, que procurássemos encontrar um
número de cistos por grama de fezes que permitisse um resultado mais
próximo possível dos 100% de positividade, mas que por razões já explicadas,
não nos foi possível realizar.
Por outro lado, parece que existe, dentro de certos limites, alguma
correlação entre o número de cistos por grama de fezes e a intensidade das
reações pelo ELISA, embora existam algumas controvérsias a respeito. Para
NASH et al. (1987) parece haver uma relação entre a quantidade de cistos e a
intensidade das reações pelo ELISA, avaliada pela densidade ótica. No
entanto, também sugerem que possam existir amostras fecais com presença
de cistos à microscopia, mas que poderiam ter antígenos insuficientes para
resultar positividade pelo ELISA. Ainda para esses autores, uma outra
explicação para esse fato seria a possibilidade de diferenças existentes entre
as cepas utilizadas no preparo dos anticorpos.
Para GREEN et al. (1985) existe uma baixa correlação entre a
quantidade de cistos e a intensidade das reações, enquanto que, para
HASSAN et al. (1995), maiores níveis de antígenos detectados por densidade
óptica puderam ser observados em fezes com maior quantidade de cistos.
Como pode ser observado, amostras com contagem de 1.000 cistos por grama
de fezes estão praticamente no limite de positividade, pois todos os positivos
apresentaram 1+ de intensidade de reação pelo ELISA anti GSA-65 (Tabela 2).
Fato que pode ser confirmado pelos resultados das amostras com 100 cistos
por grama de fezes, nos quais a maioria foi negativa. Amostras com 10.000
cistos, no entanto, já começam a apresentar uma porcentagem mais alta de
reações com maior intensidade apesar de que a maior parte apresentou ainda
1+ de intensidade (Tabela 2). Parece que o limiar de positividade do ELISA
anti-GSA 65 começaria com 10.000 e estaria entre 1.000 e 100 cistos por
grama de fezes. Diferença essa muito pequena que teria sido impossível
definir.
Da mesma forma, a maioria das amostras dos pacientes examinadas
antes do tratamento, apresentou intensidade de 4+, enquanto que, nas
amostras, positivas pelo ELISA, após o tratamento, houve em aumento
significativo daquelas com 1+ (Tabela 5). Esses pacientes positivos pós-
tratamento são aqueles que não se curaram da parasitose, e, provavelmente,
apresentavam eliminação de uma quantidade menor de cistos nas fezes, por
ação parcial da medicação. Conseqüentemente, apresentaram reações de
menor intensidade e uma quantidade maior de falso-negativos pelo MFc.
Podemos notar, portanto, que parece existir uma correlação entre a
quantidade de cistos e a intensidade das reações, que embora não seja direta
ou absoluta, pelo menos elas guardam entre si uma relação nos limites
mínimos e máximos da positividade do ELISA. É importante atinar-se para o
fato que a intensidade das reações pelo ELISA anti-GSA 65 na leitura visual,
não tem representação clínica, da mesma forma que a quantidade de cistos
encontradas no EPF. Uma ou quatro cruzes significa positivo e não
enfermidade com maior ou menor gravidade.
Essa relação poderia inclusive explicar a ocorrência de um caso ELISA- /
MFc+ nas amostras com 10.000 cistos por grama de fezes. (Tabela 1).
SCHEFFLER & VAN ETTA (1994) observaram em um exame ELISA-/EPF+
que, diminuindo pela metade a solução tampão de diluição das fezes, o
resultado tornou-se positivo embora com uma reação de intensidade fraca.
Este caso apresentava pequeno número de cistos na lâmina. Inclusive, para
vários outros autores, os resultados falso-negativos estão de modo geral
associados a amostras com pequeno número de cistos na lâmina (UNGAR et
al. 1984; ROSEMBLATT et al. 1994; TORRES et al. 1997; GARCIA &
SHIMIZU, 1997), mas discutem a possibilidade da interferência de outros
fatores como a cepa do parasita.
GOLDIN et al. (1993) também compartilham da opinião de que os falso-
negativos estão, na maioria das vezes, relacionados à pequena quantidade de
cistos nas fezes. Assim, não é de se estranhar que possa ter ocorrido um
resultado negativo pelo ELISA anti-GSA65 e o mesmo tenha sido positivo pelo
MFc, embora este tenha se mostrado menos sensível que o ELISA.
Como já referido, essas amostras testadas estavam próximas ou já no
limiar de positividade, tanto que cerca de 15% foram negativas nas amostras
com 10.000 cistos por grama de fezes, ou seja, nessas amostras já não haviam
antígenos suficientes para permitir reações positivas pelo ELISA. Assim, o
resultado positivo pelo MFc dentre os negativos pelo ELISA pode ter sido fruto
do encontro ocasional que pode ocorrer quando existem poucos cistos na
lâmina, porque nesses casos não há ausência de cistos, e sim um número tão
pequeno que seu encontro fica dificultado.
É possível que, nos exames negativos pelo MFc em amostras com
contagens de 1.000 a 10.000 cistos por grama de fezes, pudessem haver
cistos nas lâminas e que não foram encontradas pelo microscopista. Estes
poderiam ter ficado ocultos sob detritos, ou então em alguns intercampos,
quando de sua mudança, ou mesmo sob a borda da lâmina impedindo a sua
visualização. Não se trata de falha do observador ou falta de experiência, mas
contingências normais em qualquer exame, quando tais intercorrências
acontecem.
Na prática, há possibilidade de que isso aconteça até com certa
freqüência, principalmente, quando o microscopista tem de analisar dezenas de
lâminas por dia. Dessa maneira, amostras com quantidade muito pequena de
cistos não necessariamente darão resultados negativos pelo MFc. Tanto é que,
mais de 34% das amostras com 10.000 cistos por grama foram positivas, e
quase 17% o foram em amostras com 1.000 cistos por grama de fezes.
Alguns outros fatores poderiam interferir nos resultados dos exames pelo
ELISA, assim como na intensidade das reações e não apenas a quantidade de
cistos, mesmo porque esse ensaio não detecta apenas antígenos presentes
nos cistos mas também nos trofozoítos assim como, antígenos diluídos nas
fezes (UNGAR et al. 1984; GREEN et al. 1985; TORRES et al. 1997; BOONE
et al. 1999).
Da mesma forma, para alguns autores, a existência de diversidade
genética poderia influenciar nos resultados, como já referido anteriormente.
Essa diversidade genética entre várias cepas de Giardia de origem humana
tem sido relatada com base em diversos estudos no campo da biologia
molecular. É descrita a existência de dois grupos (Assemblages) A e B, sendo
que o grupo A consiste em espécimes que podem apresentar duas
“ramificações” (Cluster), A-I e A-II, sendo a A-I, oriunda de humanos e animais,
parecendo ter uma dispersão global e relacionada à maior parte dos relatos da
transmissão zoonótica da parasitose. O grupo A-II consiste inteiramente de
espécimes isolados do homem. Por seu lado, o grupo B compõe um grupo
geneticamente diverso de formas predominantemente isoladas do homem,
embora possam ser encontradas em alguns animais.(THOMPSON et al. 2000;
ALI & HILL 2003).
Diversos outros estudos, também com base em biologia molecular, têm
mostrado diferenças intra-específicas entre isolados de Giardia de pacientes e
de animais. (VAN KEULEN et al. 1995; HOMAN & MANK, 2001; VAN KEULEN
et al. 2002; ABE et al. 2003; JOHNSON et al. 2003). MONIS et al. (2003)
referem uma diversidade genética em diferentes espécimes e sua relação com
os hospedeiros de origem, sugerindo que a espécie G.intestinalis (sin. G.
lamblia, G. duodenalis) na verdade forma um complexo de espécies, enquanto
que ROCHA (2004) utilizando-se de parâmetros moleculares, imunológicos,
bioquímicos e biológicos, referem a ocorrência de diferenças entre isolados de
Giardia e grande heterogenicidade pode ser observada entre a cepa Portland-
1 em confronto com três isolados do Brasil.
NASH et al. (1987) já haviam observado que, infectando voluntários
humanos com Giardia de duas origens diferentes, com apenas uma delas a
infecção teve sucesso, mostrando assim diferenças entre as cepas.
Se a diversidade genética pode ter alguma influência nos resultados do
ELISA, é assunto ainda a ser pesquisado, mas dada à alta sensibilidade desse
método já demonstrada em vários experimentos e consagrada há vários anos,
não nos parece que a cepa ou variedade genética do parasita possa ter grande
influência, a não ser em raros casos e, também, na dependência de outros
fatores. De qualquer forma, esse aspecto não pode ser ignorado. Para UNGAR
& NASH (1987), embora as diferentes cepas possam apresentar antígenos
específicos, a alta positividade do ELISA estaria relacionada a antígenos
comuns, que as diferentes cepas poderiam apresentar. Para FAUBERT (1996),
o antígeno detectado por alguns “kits” de ELISA, no caso do GSA-65, seria um
antígeno comum, presente em diferentes cepas. Esse autor, baseia-se, no fato
de que, mesmo com isolados oriundos de várias partes do mundo, a
sensibilidade do ELISA é bastante alta. Para DUQUE-BELTRAN et al. (2000)
no entanto a preparação dos anticorpos policlonais de ELISA com antígenos
regionais se faz necessária, devido a diversidade das cepas.
V.3. CONTROLES DE CURA
Com relação a avaliação do ELISA como controle de cura na giardiase,
faremos inicialmente uma análise isolada, mas veremos que os outros
experimentos forneceram importantes dados para análise dos resultados como
um todo.
Conforme já referido anteriormente, o controle de cura pós-terapêutica
na giardíase se faz necessário, fundamentalmente, em duas situações: na
clínica do dia a dia, naquele paciente que recebeu tratamento, e, em pesquisa
de novos fármacos ou novos esquemas terapêuticos; fato a ser considerado
para qualquer parasitose intestinal, e para tanto existem normas. A FLAP
(2000) prescreve três exames por métodos adequados entre o sétimo e
décimo dias após o fim do tratamento, considerando-se curados apenas os
pacientes que apresentarem todos os exames negativos, e como já
mencionado, existe a recomendação de três exames com intervalo de sete dias
(INSTITUTO JOHNSON & JOHNSON, 1973). Esses procedimentos, em termos
individuais, para os pacientes da clínica, são praticamente inviáveis. No caso
de pesquisas sobre drogas, leva a uma grande quantidade de desistências dos
pacientes em avaliação, sendo muito difícil, em muitos casos, concluir um
estudo com um mínimo de pacientes que permita uma análise confiável.
Com relação aos estudos sobre controle de cura, alguns trabalhos já
haviam demonstrado o comportamento do ELISA na giardíase, no entanto,
limitaram-se a testar a negativação do método após o tratamento, sem
preocupação de apresentar uma casuística a respeito, estabelecer parâmetros
e fazer uma comparação com o que já é preconizado, ou seja o EPF.
UNGAR et al. (1984) observaram a negativação do ELISA em 10
pacientes tratados, verificando em um paciente que foi acompanhado, a
negativação do exame após dois dias do tratamento, enquanto que GREEN et
al. (1985) observaram a negativação do ELISA em um paciente quatro dias
após o término da terapêutica.
NASH et al. (1987), trabalhando com um grupo de voluntários,
observaram queda acentuada de coproantígenos após o tratamento e que, seis
dias após o início da medicação, os exames se tornaram negativos. Em suas
análises, esses autores trabalharam com um “pool” de resultados de vários
exames de cada paciente o que em parte dificulta a interpretação dos
resultados.
KNISLEY et al. (1989) relatam que, após três dias de terapêutica, ocorre
a negativação do ELISA, observação esta feita em apenas dois pacientes.
GOLDIN et al. (1993), avaliaram o ELISA em vários pacientes após o
tratamento pelo metronidazol, que foi aplicado por cinco dias. Realizaram
vários exames de cada paciente e puderam observar que em 419 exames,
nove, de um paciente foram positivos pelo ELISA e negativos pela microscopia,
sendo os outros 410 negativos por ambos os métodos. Para os autores, esses
exames positivos não seriam falso-positivos, mas estariam indicando falha
terapêutica desse paciente.
HASSAN et al. (1995) observaram em 45 pacientes queda acentuada de
antígenos, 15 dias após o tratamento. Esse espaço de tempo para controle de
cura seria muito longo, pois casos de reinfecção poderiam passar como falha
terapêutica e prejudicar resultados em caso de pesquisas. Porém, como
controle de cura pura e simples de um determinado paciente, poderia até ser
válido, mas é desaconselhável pois poderia retardar um novo tratamento. De
qualquer forma, nesse caso, tratar-se-ia o paciente novamente, já que o exame
foi positivo.
Observando nossos resultados, dos 91 pacientes considerados, 13
apresentaram-se positivos pelo ELISA anti-GSA65, logo no primeiro controle,
ao quarto dia após o final da terapêutica. Um segundo controle entre o sétimo e
o nono dias confirmou esses resultados. Por seu turno, considerando-se
apenas os controles pelo MFc, o primeiro controle diagnosticou, apenas quatro
falhas terapêuticas e o segundo controle, nove falhas, confirmando-se três do
primeiro controle e sendo negativo em um paciente que havia sido positivo no
primeiro controle (Paciente 4), totalizando portanto 10 falhas terapêuticas, em
84 pacientes que fizeram os dois controles. (Quadro I)
O terceiro controle revelou mais um novo caso positivo pelo MFc
(Paciente 11) totalizando assim 11 falhas terapêuticas nos três controles pelo
MFc, avaliados em 60 pacientes. Embora não houvesse necessidade, três
pacientes que já haviam sido positivos pelo MFc nos controles anteriores,
fizeram também um terceiro controle, e interessante notar que um desses
pacientes apresentou resultado negativo pelo MFc (Paciente 5), que no entanto
já havia sido considerado como falha terapêutica. Dos pacientes 14 a 62 todos
os exames foram negativos. (Quadro I)
Alguns pacientes já positivos pelo ELISA anti-GSA65 em controles
anteriores realizaram também este terceiro e os resultados serviram apenas
para confirmar a positividade do ELISA.
Tudo nos leva a crer, que esses 13 pacientes detectados no primeiro
controle pelo ELISA anti-GSA65, foram de fato falhas terapêuticas e não
resultados falso-positivos, já que esses resultados foram confirmados tanto no
segundo controle pelo ELISA anti-GSA 65 como pelo MFc no segundo ou no
terceiro controle. Dois pacientes (Pacientes 12 e 13), que só foram positivos
pelo ELISA anti-GSA 65, foram também considerados falhas terapêuticas, pois
além de apresentarem dois exames pelo ELISA positivos foram acompanhados
e apresentavam sintomatologia compatível com giardíase, a qual cessou após
a segunda dose da medicação, sendo que novo ELISA anti-GSA 65 revelou-se
negativo em cada um deles. (Quadro I)
Como vimos, GOLDIN et. al (1993) referem que os vários exames
positivos pelo ELISA de um paciente, negativos pela microscopia foram
devidos a falha terapêutica ocorrida e não falso-positivos.
Parece-nos pouco provável que algum caso positivo ocorrido no quarto
dia seja resquício de antígeno ainda em eliminação, o que poderia ocorrer
devido ao curto espaço de tempo entre o fim da terapêutica e o primeiro
controle. Caso isto houvesse ocorrido, o segundo controle teria resultado
negativo pelo ELISA, realizado após o sétimo dia, período esse recomendado
pela FLAP para o primeiro controle, embora pelo EPF.
GREEN et al. (1995) e UNGAR et al. (1984) já haviam observado
ausência de antígenos no quarto dia após a terapêutica, porém, analisaram um
número pequeno de pacientes. KNISLEY et al. (1989) observaram em dois
pacientes negativação do ELISA três dias após o tratamento. Esses resultados
estão de acordo com o que pudemos observar pois fizemos os primeiros
controles quatro dias após o final do tratamento.
Evidentemente, esses nossos achados podem alterar o que é
atualmente preconizado. Pelo menos em se tratando de uma droga como
metronidazol, que é aplicada, no mínimo por cinco dias, os resultados mostram
que não há necessidade de se esperar sete dias para o início dos controles de
cura, nem da realização de três controles.
Seria até aconselhável que em pesquisas sobre eficácia de drogas
contra giardíase fosse utilizado o método ELISA anti-GSA65 como controle de
cura no quarto dia após o fim do tratamento. Isso porque existem registros de
que o período pré-patente da giardíase possa ser inferior a nove dias, podendo
chegar a seis dias em alguns casos (RENDTORFF, 1954; NASH et al. 1987), e,
assim, a realização de exames nesse período, teoricamente, poderia falsear
algum resultado, caso houvesse alguma reinfecção, apesar de que nos
pareceu serem essas ocorrências raras. Em nossas avaliações, não houve
nenhum caso de reinfecção, mesmo acompanhando vários pacientes tratados
por períodos de 11 a 14 dias.
V. 3.1. EFICÁCIA DO ELISA E DO MFc APÓS A TERAPÊUTICA
Acreditamos na importância de fazer uma observação no que diz
respeito à positividade do ELISA anti-GSA65, após a terapêutica. Como pode
ser observado, o desempenho do método de ELISA nos controles de cura foi
bastante satisfatório, mesmo tratando-se de exames realizados após os
pacientes terem tomado a medicação, uma vez que os pacientes positivos, ou
seja, não curados, poderiam apresentar um pequeno número de cistos nas
fezes, em razão de uma atividade parcial da droga.
Embora infelizmente não tivéssemos feito a contagem de cistos nas
amostras dos pacientes que não se curaram, a baixa positividade do MFc nos
controles de cura, em especial no primeiro e a baixa intensidade das reações
pelo ELISA anti-GSA65 nas amostras dos pacientes não curados, indicam uma
diminuição na quantidade de cistos após a terapêutica, o que poderia
aumentar a probabilidade de falso-negativos nos controles. Essas observações
foram realizadas considerando todos os exames em que, numa mesma
amostra fecal de cada paciente, foram realizados os dois métodos, o ELISA
anti-GSA65 e o MFc, mesmo que vários exames tenham sido realizados de
cada paciente (Tabela 4).
Achamos perfeitamente válido a realização de vários exames de cada
paciente, visto que esse recurso proporciona a diminuição da margem de erro,
principalmente, quando sabemos quais os verdadeiros positivos e negativos
para giardíase. CASTANHO & FURTADO (1981) já haviam obtido uma
positividade de 70% com o EPF pelo método de Ritchie, utilizando-se dessa
estratégia. Da mesma forma, GOLDIN et al. (1993) realizaram suas avaliações
em mais de 2.100 exames, de 229 pacientes. NASH et al. (1987) utilizaram-se
de 13 pacientes com um total de 203 exames.
Ao todo foram realizados 179 exames pelos dois métodos nos pacientes
tratados. Os 30 exames realizados, pertencentes aos 13 pacientes que não se
curaram foram todos positivos pelo ELISA anti-GSA65 (100%) e somente 16
(53,3%) foram positivos pelo MFc. Essa baixa positividade do MFc,
principalmente às custas do primeiro controle, mostra que os pacientes
positivos, de fato, apresentavam pequeno número de cistos nas fezes, mas
mesmo assim, o ELISA anti-GSA65 foi positivo em todos os exames (Tabela
4).
Por outro lado, dos 149 exames realizados nos 78 pacientes que
apresentaram cura parasitológica, o ELISA anti-GSA65 foi negativo em todos,
sendo esses exames também negativos pelo MFc. Não houve ocorrência de
nenhum caso onde o MFc foi positivo e o ELISA anti-GSA65 negativo, como
também nenhum caso onde o ELISA anti-GSA65 foi positivo em um exame e
negativo em outro
Considerando assim esses resultados, podemos até inferir que o ELISA
anti-GSA 65 apresentou 100% de sensibilidade e especificidade pós-
terapêutica e o MFc uma sensibilidade de 53,3%.
Dessa forma, tudo indica que apenas os 13 pacientes detectados no
primeiro controle pelo ELISA anti-GSA65 apresentaram falha terapêutica,
tendo sido detectados 100% dos casos positivos, pois caso houvesse ocorrido
alguma falha desse exame no primeiro controle, muito provavelmente ela
apareceria em algum outro exame.
Podemos afirmar assim, que apenas um controle pelo método de ELISA
anti-GSA65, realizado no quarto dia após a terapêutica, é suficiente para um
eficaz controle de cura, detectando todas as falhas terapêuticas, sem falso-
positivos.
V.3.3. EFICÁCIA DO METRONIDAZOL
Com base nesses resultados, pudemos observar que a eficácia do
metronidazol foi de 85,7% (Tabela 3). Mesmo que não se considere os sete
pacientes que fizeram apenas um controle, pois pelo ELISA anti-GSA 65 só
realizaram um exame e somente se considere os que pelo ELISA fizeram pelo
menos dois controles, a eficácia seria avaliada em 84,5%, ou seja, 71
pacientes curados em 84 pacientes avaliados, diferença essa não significante.
A escolha do metronidazol, foi feita por parte dos médicos assistentes
das creches em que trabalhamos, sem nossa interferência. De qualquer forma,
essa porcentagem de cura está de acordo com a literatura, sendo uma droga já
consagrada no tratamento da giardíase (CIMERMAN et al. 1988; CARVALHO
et al. 1963; DUTTA et al. 1994).
Agora, quando consideramos os resultados com base apenas no MFc,
veremos duas situações possíveis. Se considerarmos três controles, veremos
que a eficácia da medicação seria avaliada em 81,2% ou seja, 49 curas em 60
pacientes, os que completaram a bateria de controles. Quando consideramos
dois controles, vemos que essa eficácia seria avaliada em 88,0%, ou seja, 74
curas em 84 pacientes, os que realizaram dois controles (Quadro I e Tabela 2).
A verdade é que com a exigência de três EPFs negativos para se atestar
a cura parasitológica, a investigação sobre a eficácia de novas drogas ou
novos esquemas terapêuticos contra giardíase fica trabalhosa e prejudicada.
Como não houve diferenças estatisticamente significativas entre esses
resultados, poderíamos até inferir que qualquer uma dessas opções seria
válida, mas a nosso ver, a realização de três controles é desnecessária, além
de aumentar o período de realização dos exames e o número da desistência
dos pacientes, no caso de pesquisa sobre medicamento. Sendo assim, de 94
pacientes, inicialmente selecionados, obtivemos uma casuística de 91 casos ao
se realizar um controle, enquanto que com dois controles, 84 e com três
controles só poderíamos considerar 60 casos que realmente completaram toda
a bateria de exames.
Em alguns trabalhos do qual participamos, (CIMERMAN et al. 1979;
CAMPOS et al. 1990) não especificamente com giardíase, para se chegar a
qualquer conclusão sobre a eficácia de drogas, chegamos a ter de recomeçá-
los várias vezes até atingir um número confiável de pacientes que fizeram os
três exames. Um número muito grande de pacientes acaba não realizando o
segundo, e menos ainda o terceiro controle. Esses pacientes não podem ser
computados e nova amostragem muitas vezes, tem que ser selecionada.
Dessa forma, as desistências de pacientes de um determinado grupo
praticamente não ocorreria, já que o procedimento, do primeiro exame, a
maioria acaba realizando. Com extrema confiabilidade, pesquisas nesse
sentido podem ser concluídas com muito mais facilidade.
Embora as análises estatísticas não mostrassem diferenças
significativas na realização de dois ou três controles pelo MFc, quando
comparados entre si e com a realização de um ELISA anti-GSA 65 no quarto
dia, que acreditamos ser a avaliação mais fidedigna, os resultados mostram
que, se analisados separadamente, poderiam acarretar interpretações as mais
diversas. Isoladamente, é diferente dizer que um determinado medicamento
possibilita 88% de cura numa situação ou 81% de cura em uma outra situação.
No caso do médico com seu paciente em particular, outros aspectos devem ser
considerados.
Temos observado que habitualmente, devido à pouca confiança no EPF
e na necessidade de se obter sucesso terapêutico com o paciente, a
prescrição da repetição da medicação depois de decorridos alguns dias da
primeira dose, quando não antes, o tratamento, sem prévio diagnóstico
etiológico.
Essa conduta poderia até ser válida, em função das dificuldades
encontradas nos atendimentos nas Unidades Básicas de Saúde, como nos
Ambulatórios Públicos às vezes distantes, mas, se consideramos que as
drogas atualmente disponíveis para giardíase alcançam bons níveis de cura,
(CIMERMAN & CIMERMAN, 2002) uma segunda dose, na maioria dos casos,
estaria sendo desnecessária. Se levarmos em conta que, em muitos casos, o
tratamento é realizado sem o diagnóstico etiológico prévio, a repetição do
tratamento chega a ser, em nossa opinião, quase que contra-indicada. Não
podemos nos esquecer de que nenhuma droga é totalmente isenta de efeitos
adversos, inclusive o metronidazol (ZHANG & BEGG, 1994).
Segundo dados da Secretaria Municipal de Higiene e Saúde do
Município de Marília-SP (informação pessoal), no ano de 2001, foram
atendidas nas Unidades Básicas de Saúde (UBSs) um total de 71.738 crianças
de 0 a 6 anos de idade. Nesse período, foram prescritos 7.916 frascos de
metronidazol solução, droga que para essa faixa etária é praticamente indicada
somente para giardíase. Por outro lado, o Laboratório de Parasitologia do
Hospital de Clínicas de Marília da Faculdade de Medicina de Marília, sob nossa
responsabilidade, que realiza os EPFs de maior parte da Rede Básica de
Saúde de Marília, realizou 6.652 exames do município com 365 diagnósticos
de giardíase. Assim sendo, muito provavelmente a maioria das crianças foi
tratada sem diagnóstico específico.
É evidente que o custo de cada exame pelo ELISA, até certo ponto
proibitivo, é fator a ser considerado, pelo menos por enquanto. Entramos,
portanto, numa discussão importante. Tratar o paciente com uma segunda
dose ou fazer um rigoroso controle de cura?
A questão da praticidade por parte do médico e do paciente, que tem de
colher material para fazer um novo exame deve ser considerada. Com certeza,
na clínica do dia a dia, realizar vários exames é utopia e a preferência acaba
sendo por ministrar uma segunda dose da medicação.
Não nos restam dúvidas de que uma segunda dose se faz necessária
naqueles pacientes que não obtiveram cura com a primeira medicação. Isso
nós observamos em nosso trabalho, acompanhando vários pacientes que só
vieram a se beneficiar do tratamento após a sua repetição.
Com relação aos pacientes sabidamente parasitados pela G. lamblia, e,
considerando-se uma eficácia de cerca de 85% com o metronidazol (que foram
os resultados obtidos neste trabalho), tratar com uma segunda dose seria
desnecessário em pelo menos 85% dos casos. Em referência a pacientes sem
comprovação do parasitismo pelo protozoário, a decisão a ser tomada
dependerá da prevalência da parasitose naquela localidade ou região. O último
grande levantamento sobre parasitoses intestinais no Brasil foi realizado por
CAMPOS & BRIGUES (1987). Verificaram os autores e seus demais
colaboradores, pois tratou-se de um trabalho multicêntrico, os seguintes
números entre outros quanto a prevalência para essa parasitose: Alagoas
10%; Bahia 14,9%, Pernambuco 22,9%.
Em São Paulo, a prevalência da giardíase foi de 22,8%, e, no Município
de Marília, de 14,4% (CASTANHO et al. 1990). Temos observado em nossa
cidade uma queda acentuada dos diagnósticos positivos para giardíase e
outras parasitoses em alguns levantamentos localizados e na nossa própria
rotina de laboratório (dados não publicados). Da mesma forma, FERREIRA et
al. (2000), observaram queda na prevalência da giardíase de 14,5% para 5,5%
na cidade de São Paulo-SP, nos últimos 10 anos. Esse fato deve ter ocorrido
em outras cidades do Estado e, em Marília provavelmente também, tanto que
para selecionarmos as crianças para este trabalho, precisamos nos deslocar às
cidades próximas, onde a falta de saneamento ainda é um grande problema.
Tomando-se por base esse recente levantamento de FERREIRA et al.
(2000), que mostrou ser a prevalência da giardíase em São Paulo em cerca de
5,5%, veremos que qualquer tratamento sem diagnóstico parasitológico,
principalmente os de rotina, em 94,5% das vezes não haveria necessidade da
droga. Tendo já relatado uma eficácia de 85%, concluiu-se que, de cada 100
pessoas tratadas, cinco atingiram a cura, e em apenas uma (1%) se justificaria
a segunda dose.
Mesmo que fizéssemos uma correção na prevalência com base na
sensibilidade do EPF e essa fosse de 7%, ou mesmo 8%, teríamos seis que
atingiriam a cura e, no máximo, em dois casos a segunda dose seria indicada.
Nas creches em que nós trabalhamos, ao selecionarmos os casos,
observamos uma prevalência de cerca de 40% de giardíase, evidentemente
elevada. Nesse caso, como é grande a possibilidade dessa parasitose nesses
locais, talvez se justifique o tratamento em massa sem diagnóstico prévio, mas
isso é discutível. Ainda assim, a utilização de uma segunda dose, em nossa
opinião, não estaria indicada.
De cada 100 crianças dessas creches, 60 tomariam a droga
desnecessariamente. Da mesma forma, 85% dos pacientes, ou seja, cerca de
34, atingiriam a cura, e apenas seis de fato necessitariam de uma outra dose.
Repetir o tratamento em todas é, no mínimo, administrar a 94% das pessoas
medicamentos sem necessidade.
Considerando esses resultados, este parece ser o primeiro trabalho que
pretende estabelecer parâmetros para a utilização do método ELISA no
controle de cura da giardíase, no caso ELISA anti-GSA65, procurando
comparar com o EPF conforme preconizado, e estudar o melhor momento para
sua realização, assim como as diversas variáveis possíveis a respeito.
V.4. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE (ELISA e MFc) NO DIAGNÓSTICO
DA GIARDÍASE
Quanto a comparação do ELISA anti-GSA65 e o MFc no diagnóstico da
giardíase procurou-se principalmente, avaliar a real necessidade da realização
de repetidos EPFs por microscopia, no caso o MFc. A condução desse
experimento mostrou que o ELISA anti-GSA65 foi 100% sensível. Dos 32
pacientes inicialmente positivos pelo MFc, o ELISA anti-GSA65 foi positivo em
todos eles. Aliás, os outros 62 pacientes, que, junto a esses 32, iniciaram o
experimento sobre controle de cura e que haviam apresentado MFc positivo
para Giardia, antes do tratamento, também o foram pelo ELISA anti-GSA65, ou
seja, a avaliação sobre a sensibilidade do ELISA anti-GSA 65 pode ser
avaliada em 94 pacientes, que foram positivos pelo MFc e confirmados pelo
método imunoenzimático.
Quanto à especificidade, entram várias questões a serem discutidas.
Numa análise inicial, poderíamos dizer que, em 96 crianças, houve 38 casos
positivos pelo ELISA anti-GSA65 e 32 pelo MFc, ou seja, seis casos ELISA+ /
MFc-, que poderiam ser considerados falso-positivos pelo ELISA. Ocorre que,
como já referido, com a repetição dos exames desses pacientes pelo MFc,
quatro novos casos foram diagnosticados e os dois restantes, apesar de, em
um deles o terceiro MFc ter sido também negativo e o outro não ter realizado
esse terceiro exame, apresentaram o ELISA anti-GSA65 negativo após
terapêutica específica e foram, portanto, considerados como verdadeiros
positivos para Giardia. Desta maneira, consideramos a especificidade do
ELISA anti-GSA65 em 100%, pois, essas duas crianças a nosso ver, realmente
apresentavam giardíase e curaram-se após a terapia, mesmo porque houve
total regressão dos sintomas que apresentavam. Esses recursos, para se
considerar os casos verdadeiros positivos e avaliar a especificidade, também
foram utilizados por vários outros autores e acreditamos serem perfeitamente
válidos.
Para VINAYAK et al. (1991), casos suspeitos de giardíase com
resultados ELISA+/EPF- devem ser considerados como parasitados pelo
protozoário, pois não se observam reações cruzadas com outros parasitas.
SCHEFFLER & VAN ETTA (1999) consideram os casos positivos por repetição
dos exames com microscopia e também pela sintomatologia.
ALDEEM et al. (1995) utilizaram diferentes critérios para estabelecer os
verdadeiros positivos, e analisar a especificidade, entre eles a positividade de
dois ou mais exames em amostras coletadas individualmente de um mesmo
paciente. No entanto para TORRES et al. (1997) ainda são necessários mais
estudos para avaliar melhor se os exames ELISA+/EPFs- são falso-positivos
ou se devido à maior sensibilidade do método imunológico.
Em nossa opinião, embora possam haver falso-positivos, essa
ocorrência não deve ser grande, pois praticamente não se observa com ELISA
reações cruzadas com outros parasitas (KNISLEY et al. 1989; GREEN et al.
1995; TORRES et al. 1997). Inclusive nos 96 pacientes, nos 58 casos
negativos em ELISA anti-GSA 65, pelo menos 17 crianças apresentavam
outras parasitoses, principalmente Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides,
inclusive um caso de Entamoeba histolytica/E. dispar.
Interessante que um caso ELISA+/MFc- para Giardia apresentava
também cistos de E. histolytica/E.dispar, além dos cistos de Giardia, sendo que
a giardíase somente apareceu no segundo exame pelo MFc, o que a princípio
nos fez pensar na possibilidade de reação cruzada. Foi possível acompanhar
um outro paciente ELISA+/MFc- para Giardia no primeiro exame, mas com
presença de B. hominis. Neste caso, também, pensamos em reação cruzada,
mas o segundo MFc foi positivo para Giardia, sendo que ao acompanharmos
esse paciente, verificamos a negativação do ELISA anti-GSA65 e do MFc para
Giardia após o tratamento, mas a persistência do B. hominis.
Quando confrontamos os resultados de um, dois e três exames (ou o
total de casos realmente positivos para Giardia), vemos que não houve
diferença estatisticamente significativa entre os resultados (Tabela 6). De
qualquer forma, considerando-se esses casos, o MFc revelou sensibilidade de
84,2% na realização de um exame, com um valor preditivo negativo de 90,6%
e uma sensibilidade de 94,7% com valor preditivo negativo de 96,6% quando
da realização de dois ou três exames.
Esses resultados são bastantes semelhantes aos de MANK et al. (1997),
para quem a sensibilidade de um EPF é de 80%, podendo chegar a 96,6% com
dois exames.
Em termos epidemiológicos ou coletivos, a necessidade da realização de
exames de duas ou mais amostras para se confirmar um diagnóstico pode ser
discutida. No caso de um levantamento epidemiológico, por exemplo, em que
houvesse uma prevalência real de 30% de giardíase, a realização de um EPF
mostraria uma prevalência de 25,5%, enquanto que a realização de dois EPFs,
28,4%. Considerar ou não essa diferença relevante, dentro de muitos outros
aspectos de uma enfermidade, é questão a ser melhor avaliada.
Acreditamos, todavia, que esta questão pode ser considerada sob outro
aspecto. Seria o caso de se propor, em levantamentos epidemiológicos, um
fator de correção com base na sensibilidade estimada do EPF que, ao que tudo
indica e considerando-se os vários trabalhos já realizados, está em torno de
80% a 85%.
Em termos de diagnóstico individuais, outros parâmetros devem ser
considerados, principalmente, a existência de manifestações clínicas, a
ocorrência de má absorção e, principalmente, a convivência do paciente
suspeito com outras pessoas com giardíase. Temos importante aspecto, em
que o ELISA anti-GSA65 estaria indicado para dirimir as dúvidas, ou a
repetição de vários EPFs por métodos adequados. O teste terapêutico é outro
recurso que, em nossa maneira de pensar, só deverá ser utilizado em último
caso.
V.5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em uma análise integrando os diferentes resultados deste trabalho
podemos observar alguns outros aspectos. Como vimos, a sensibilidade de
EPF pelo MFc é de 84,2% e do ELISA anti-GSA 65, 100% (Tabela 6). Por
outro lado, apenas 34,7% das amostras com 10.000 cistos por grama foram
positivas (Tabela 1) e 30,7% (4 em 13) das amostras do primeiro controle
foram positivas pelo MFc (Tabela 3). Por esses números é possível estimar
que, no quarto dia após o final do tratamento, os pacientes que não haviam se
curado, apresentavam algo mais que 10.000 cistos por grama de fezes, pois o
ELISA anti-GSA 65 foi positivo em todos os treze casos nesse controle, e em
amostras com 10.000 cistos o ELISA anti-GSA65 já não revelou 100% de
positividade (Tabela 1). Pela mesma razão, poderíamos dizer que a maioria
dos casos falso-negativos pelo MFc de uma forma geral, como aqueles que
estariam ocultos no Gráfico 1, apresentavam um pouco mais de 10.000 cistos
por grama de fezes.
No segundo controle, quando analisado isoladamente, ocorreram 69,2%
de positivos pelo MFc (9 em 13) (Quadro I). Como a sensibilidade do MFc foi
de 84,2% (Tabela 6), é possível inferir que, a partir do sétimo ao nono dias
após o final do tratamento, os pacientes já apresentavam uma carga parasitária
mais próxima a de pacientes não tratados.
Desse modo foi possível conferir vários aspectos que envolvem o
diagnóstico da giardíase, principalmente em se tratando do exame de fezes.
Assim sendo, neste trabalho, não somente testamos o método de ELISA anti-
GSA65, mas, com base nesse método, no MFc e em outros dados, também
fizemos uma análise global do diagnóstico da giardíase, em especial do
controle de cura.
Primeiramente, pudemos conferir uma boa eficácia do metronidazol no
tratamento da giardíase cujo percentual de cura foi de 85,7%.
Verificamos o limiar de positividade do método de ELISA anti-GSA65,
para o diagnóstico da giardíase, capaz de detectar amostras com reduzido
número de cistos, quando comparados à média de cistos por grama de fezes
eliminados habitualmente pela maioria dos pacientes parasitados, e que esse
limiar poderia ser útil no sentido de se aferir métodos parasitológicos.
Dentro de certos limites, parece-nos que os resultados falso-negativos
do EPF ocorrem, na maioria das vezes, quando a quantidade de cistos por
grama de fezes é pequena na amostra analisada. O mesmo acontece com os
possíveis resultados falso-negativos do ELISA anti-GSA 65, já que existe uma
relação entre a sua porcentagem de positividade e a quantidade de cistos nas
fezes.
Quanto à necessidade de realização de repetidos exames por
microscopia para se obter um diagnóstico confiável da giardíase, acreditamos
que a questão deva ser melhor discutida, mas de qualquer forma o EPF,
principalmente, quando realizado por vários métodos, ainda é um recurso
importante, uma vez que pode diagnosticar outras parasitoses.
Da mesma forma, para o controle de cura da giardíase, a realização de
um exame pelo método de ELISA anti-GSA 65, no quarto dia pós- terapêutica
ou dois EPFs pelo MFc, sendo o primeiro dia no quarto dia e o segundo entre o
sétimo e nono dias, nos permite resultados confiáveis. No entanto, quanto à
avaliação com apenas dois EPFs como controle de cura, acreditamos que mais
estudos necessitam ser realizados na prática, embora nossos resultados
tenham apontado a validade desse procedimento.
CONCLUSÕES
1. O método de ELISA anti-GSA 65 mostrou-se positivo em cerca de 84%
dos casos com 1.000 a 10.000 cistos por grama de fezes, enquanto que
o MFc mostrou-se positivo em apenas 16,6% em amostras com 1.000
cistos e 34,7% em amostras com 10.000 cistos por grama de fezes.
2. Neste trabalho foi observado uma relação entre a positividade do
ELISA anti-GSA 65 e a quantidade de cistos nas fezes. A positividade de
amostras com 100 cistos por grama de fezes é menor que aquela obtida
das amostras contendo 1.000 e 10.000 cistos por grama de fezes. Esses
resultados foram estatisticamente significantes.
3. Foi observado também uma relação entre a intensidade das reações
pelo ELISA anti-GSA 65 verificado por leitura visual e a quantidade de
cistos nas fezes.
4. O método de ELISA anti-GSA65 para o diagnóstico laboratorial da
Giardia lamblia, realizado em apenas uma amostra fecal pode ser
utilizado como controle de cura da giardíase com alto grau de
confiabilidade, já no quarto dia após o final do tratamento, ou mesmo no
sétimo dia.
5. A realização de dois controles pelo MFc, entre o quarto e o nono dias
após o término do tratamento, permite detectar o mesmo número de
falhas terapêuticas que a realização de três controles pelo MFc, pois não
foi observado diferenças estatísticas entre esses dois procedimentos.
6. 6.A utilização do método de ELISA anti-GSA65 com apenas uma
amostra fecal no quarto dia após a terapêutica, pode abreviar o tempo
demandado para a conclusão de pesquisas sobre novos fármacos na
giardíase.
7. Nos exames pós-terapêutica, a positividade do ELISA anti-GSA 65 foi
de 100%, enquanto que a do MFc nesses exames foi de 53,3%.
8. O metronidazol administrado na dosagem de 20 mg/kg por cinco a sete
dias, mostrou que pode curar 85,7% dos pacientes com giardíase.
9. O ELISA anti-GSA65 mostrou sensibilidade e especificidade de 100%,
quando se realizou um único exame, enquanto que o MFc mostrou
sensibilidade de 84,2% com um só exame e 94,7% para dois exames.
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