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Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Faculdade de Biociências
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Estudo das Alterações Mitocondriais Provocadas na Sepse por
Espectroscopia de Infravermelho pela Transformada de Fourier e
Refletância Total Atenuada
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Biologia Celular e Molecular como
requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre.
Paula Elisa Tischler Heinen
Orientador: Dr. André Arigony Souto
Co-orientador: Dr. Jarbas Oliveira
Porto Alegre
Outubro de 2006
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2
AGRADECIMENTOS
Ao Laboratório de Química de Produtos Naturais da Faculdade de Química e ao Laboratório
de Biofísica da Faculdade de Biociências da PUCRS.
Em especial, ao meu orientador, André Arigony Souto, pela paciência e compreensão, pelas
risadas e lições que vou levar para a vida.
Ao professor Jarbas Oliveira pelo estímulo e pela confiança no trabalho que estava sendo
feito.
A diretora da Faculdade de Farmácia Flávia Valladão Thiesen pela oportunidade de estagiar
ao seu lado e pelo apoio profissional.
Aos demais professores e funcionários da Faculdade de Química e do Instituto de Biociências
da PUCRS.
Aos meus pais queridos, Oscar e Regina; irmãos, Luiza e Carlos; avós, Isolde, Noé e Lahir;
tios, Gladys, Paulo, Ana, Eduardo, Leco, Henrique e cônjuges; e primos, Lucas, Gabriele, Fernando,
Fabi, Flavia, Mariana, Bruno e Fred, que torcem por mim, o meu muito obrigado por tudo. Vocês são
meu alicerce. Amo muito todos vocês.
Ao meu amigo, Leonardo Marchiori, pois sem sua ajuda e incentivo não teria como realizar
este sonho.
Aos meus amigos, Carolina Bastos e Paulo Ramos, que me ajudaram na concretização desse
projeto, incluindo as tardes de sábado no laboratório e que não me deixaram desanimar. Meus mais
sinceros agradecimentos, pois mais que colegas de trabalho, são meus amigos.
A todos aqueles que me ajudaram nas pequenas coisas, seja com palavras amigas ou no
momento em que precisei de uma mãozinha: Siomara , Paulão, Matias Frizzo, Ju - a Fredo, Márcia
Kober e Fabio – vocês são demais – Ju Torres, Josiane Bortoloto, Adroaldo Lunardeli, Márcia
Pimentinha, Zé Mateus, Carlos, Cati, Rodrigo (Toco), Vasyl, Bento, Mel, Fernanda, Eduardo, Luciana.
Aos meus novos amigos, Michele, Mauro e Giancarlo pelas risadas. A todos aqueles que se fizeram
presentes em minha vida.
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3
ÍNDICE
RELAÇÃO DE FIGURAS...................................................................................................................... 04
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................................................. 05
RESUMO............................................................................................................................................... 06
APRESENTAÇÃO DO TEMA............................................................................................................... 07
INTRODUÇÃO......................................................................................................................................................................... 07
PRINCÍPIOS DO INFRAVERMELHO .......................................................................................................................... 07
SISTEMAS BIOLÓGICOS ........................................................................................................................................... 10
DIAGNÓSTICO CLÍNICO................................................................................................................................ 11
MODELOS EXPERIMENTAIS......................................................................................................................... 12
SEPSE..................................................................................................................................................................................... 14
INFRAVERMELHO E MITOCÔNDRIA..................................................................................................................................... 16
OBJETIVOS .......................................................................................................................................... 19
GERAL ........................................................................................................................................................................ 19
ESPECÍFICO............................................................................................................................................................... 19
ARTIGO CIENTÍFICO ........................................................................................................................... 20
SUMMARY .............................................................................................................................................................................. 21
INTRODUCTION...................................................................................................................................................................... 22
MATERIALS AND METHODS.................................................................................................................................................. 23
EXPERIMENTAL MODEL ........................................................................................................................................... 23
ISOLATION MITOCHONDRIA..................................................................................................................................... 23
INFRARED SPECTROSCOPY.................................................................................................................................... 24
NITRIC OXIDE ............................................................................................................................................................ 24
STATISTICAL ANALYSIS........................................................................................................................................................ 25
RESULTS ................................................................................................................................................................................ 25
DISCUSSION........................................................................................................................................................................... 26
ACKNOWLEDGMENTS........................................................................................................................................................... 28
REFERENCES ........................................................................................................................................................................ 29
FIGURE 1 ................................................................................................................................................................................ 32
FIGURE 2 ................................................................................................................................................................................ 34
FIGURE 3 ................................................................................................................................................................................ 36
FIGURE 4 ................................................................................................................................................................................ 38
FIGURE 5 ................................................................................................................................................................................ 40
CONCLUSÃO ....................................................................................................................................... 42
PERSPECTIVAS................................................................................................................................... 43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................... 44
NORMAS PARA PUBLICAÇÃO .......................................................................................................... 48
4
RELAÇÃO DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
FIGURA 1 – Interferômetro de Michelson ............................................................................................. 08
FIGURA 2 – Esquematização de Refletância Total Atenuada ............................................................. 09
FIGURA 3 – Espectro de Infravermelho de Material Biológico ............................................................. 10
FIGURA 4 – Espectro de Infravermelho de Linfócitos Separados por Clusters ................................... 11
FIGURA 5 – Espectro de Células Epiteliais Normais e Alteradas ........................................................ 13
ARTIGO
FIGURA 1 – Infrared Spectroscopy of the Mitochondrias ..................................................................... 32
FIGURA 2 – Comparison Between the Average Amide I / Amide II .................................................... 34
FIGURA 3 – Infrared Spectrum and Their Inverted Derived Seconds .................................................. 36
FIGURA 4 – Average Concentration of Total Protein ........................................................................... 38
FIGURA 5 – Concentration of NO in the Different Groups.................................................................... 40
5
LISTA DE ABREVIATURAS
ADP Adenosina Difosfato
ATP Adenosina Trifosfato
ATR Attenuated Total Refletance
CK Creatina Quinase
CKMB Creatina Quinase fração MB
ERO Espécie Reativa de Oxigênio
FTIR Fourier Transformed Infrared
IRF Índice de Refração
IV Infravermelho
LLC Leucemia Linfocítica Crônica
LPS Lipopolissacarídeo
NO Óxido Nítrico
P-gp Glicoproteína P
SIRS Síndrome da Reação Inflamatória Sistêmica
TOM Translocase Outer Membrane
UTI Unidade de Tratamento Intensivo
ZnSe Selenito de Zinco
BaF
2
Fluoreto de Bário
CaF
2
Fluoreto de Cálcio
KBr Brometo de Potássio
KCl Cloreto de Potássio
6
RESUMO
A espectroscopia de infravermelho (IV) permite caracterizar molecularmente tecidos e fluídos,
uma vez que seus espectros são característicos e atuam como uma impressão digital. O rápido
desenvolvimento da técnica de infravermelho na última década tem aberto novas portas para o
prognóstico e diagnóstico de patologias facilitando a procura de melhores tratamentos. Atualmente, o
infravermelho (IV) vem sendo utilizado nos mais diversos modelos experimentais de sistemas
biológicos. A sepse provoca mudanças no ambiente celular e em suas trocas iônicas, afetando o
funcionamento da mitocôndria e aumentando a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). O
óxido nítrico (NO) é considerado um marcador da formação de radicais livres produzidos,
enzimaticamente ou não, nos tecidos. O aumento dos radicais livres promove a oxidação de resíduos
de aminoácidos, aumentando a formação de grupos carbonílicos (CO) protéicos que atuam como
biomarcadores do estresse oxidativo. Devido a esses fatores, entre outros, as mitocôndrias e seus
complexos vêm sendo avaliados pela espectroscopia de infravermelho nas regiões das bandas de
amidas I (espectro entre 1615 cm -¹ e 1700 cm -¹, referente a ligações C=O) e II (espectro entre 1500
cm -¹ e 1600 cm -¹, referente a ligações C-H), característico de proteínas, com o objetivo de observar
alterações que possam ocorrer nestas organelas.
No presente trabalho de mestrado, nosso objetivo principal foi analisar as alterações em
mitocôndrias hepáticas causadas pela sepse induzida por CLP em ratos (Rattus novergicus – var.
Wistar) através do FTIR-ATR. O experimento foi contemplado pela extração das mitocôndrias
hepáticas através de diferentes gradientes de centrifugação em meios contendo sacarose, heppes e
EGTA. A dosagem de NO sérico foi feita através da metodologia de Griess. Nossos resultados
apresentaram diferenças significativas nas bandas de amida I do espectro de infravermelho do grupo
séptico em relação ao controle, controle anestesia e sham. As mesmas diferenças foram percebidas
para a dosagem de NO sérico.
7
APRESENTAÇÃO DO TEMA
Introdução
O infravermelho tem sido utilizado nas últimas décadas em diversas áreas do conhecimento.
Atualmente, sua utilização está direcionada para o uso prognóstico e diagnóstico de patologias e em
modelos experimentais de sistemas biológicos (LIU KZ, SHI MH, MANTSCH HH 2005; NAUMANN D
2000; SHAW RA, MANTSCH HH 2000).
A sepse, inflamação sistêmica em conseqüência de uma infecção, tem sido alvo de muitos
estudos, pois é responsável por um grande número de óbitos nas UTIs hospitalares. É caracterizada
por diversas alterações metabólicas e teciduais, afetando a estrutura da membrana mitocondrial e,
conseqüentemente, a permeabilidade e o fluxo de íons (NUNES FB et al 2003; CHEN HW et al 2004;
KIM JS et al 2004).
A seguir, apresentaremos os fundamentos da espectroscopia de infravermelho e suas
aplicações em sistemas biológicos. Também será abordado o processo de sepse, suas alterações em
mitocôndrias hepáticas e estudos correlacionando o infravermelho, a mitocôndria e seus complexos.
Princípios do infravermelho
O infravermelho encontra-se na faixa do espectro não visível (entre 780 nm/12820 cm-¹ e 1
nm/10cm-¹) e é dividido em próximo, médio e distante (SHAW A 2000). A espectroscopia de
infravermelho (IV) mede a freqüência e a intensidade na qual uma dada amostra absorve a radiação
infravermelha. Assim, o espectro de infravermelho representa através de picos de absorção, a
freqüência de vibração dos átomos constituintes do material, identificando os componentes químicos
da amostra. A intensidade de absorção da amostra relaciona-se com a concentração de um
respectivo componente, possibilitando uma análise quantitativa.
Basicamente, as vibrações moleculares são classificadas em dois tipos: vibrações de
deformação axial (stretching) e de deformação angular (bending). As deformações axiais, ou
estiramento são oscilações radiais das distâncias entre os núcleos, enquanto as deformações
angulares envolvem mudanças dos ângulos entre as ligações ou, como no modo de deformação
assimétrica fora do plano, alterações do ângulo entre o plano que contém as ligações e um plano de
referência (FREEMAN EC, PAUL W 1978).
Os grupamentos funcionais de compostos orgânicos absorvem em freqüências características
no infravermelho. Assim, em um gráfico de intensidade de radiação versus freqüência, o
espectrograma de infravermelho permite caracterizar os grupos funcionais de um padrão ou de um
material desconhecido. As posições das bandas no espectro de infravermelho são apresentadas em
números de ondas, cuja unidade é o centímetro inverso (cm
–1
) e as intensidades das bandas são
vistas como absorbância (SILVERSTEIN RM 1994).
8
No Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), a radiação, contendo todos os
comprimentos de onda, depois de colimada por um espelho, é introduzida em um interferômetro de
Michelson (dispositivo formado por um divisor de feixe) e separada em dois feixes, um deles
percorrendo uma distância fixa e o outro, uma distância variável (espelho móvel) (Figura 1). No divisor
de feixe, os dois raios são combinados opticamente, podendo gerar uma interferência construtiva (se
estiverem em fase) ou destrutiva (se estiverem fora de fase). Quando este feixe combinado de luz
atravessa a amostra, é absorvido seletivamente e, dependendo das absorções apresentadas pela
amostra, gera um interferograma. Este interferograma pode ser tratado por meio de um processo
matemático, denominado transformada de Fourier, originando um espectro ou padrão de absorção da
amostra, ou seja, seu espectro no infravermelho, que pode ser tanto de transmitância quanto de
absorbância (WARTEWIG S, REINHARD HH, NEUBERT T 2005). Essa técnica permite a aquisição
de centenas de espectros de infravermelho em apenas alguns minutos. Os espectros isolados são
combinados no computador, originando um espectro no qual os ruídos de fundo do equipamento
podem ser bastante reduzidos, produzindo, portanto, um espectro limpo.
Figura 1: Interferômetro de Michelson. Representação esquemática adaptada de Wartewig et al2005
O uso de Atenuação de Refletância (ATR) em espectroscopia baseia-se no fato de que,
embora ocorra completa reflexão interna na interface cristal/amostra, a radiação penetra de fato uma
pequena distância dentro da amostra. Esta penetração é chamada de onda evanescente. A amostra
interage com a onda evanescente, resultando na absorção da radiação pela amostra, que
corresponde ao espectro de transmissão dessa mesma amostra, conforme a representação
esquemática da refletância total exibida na Figura 2 (WARTEWIG S, REINHARD HH, NEUBERT T
2005; LUCASSEN GW, VEEN GNA, JANSEN JAJ 1998).
9
Figura 2: Refletância total atenuada. Esquema adaptado de Wartewig et al 2005
O espectro depende de diversos parâmetros, incluindo ângulo de incidência da radiação na
amostra, comprimento de onda da radiação, índices de refração da amostra e do cristal (cristais de
ZnSe, BaF2, CaF2, KBr, KCl) do equipamento (WARTEWIG S, REINHARD HH, NEUBERT T 2005).
A profundidade da penetração, d
p
, da onda evanescente, definida como a distância requerida para a
amplitude do campo elétrico caia para 1/℮ de seu valor na interface é dada por:
Onde:
λ= comprimento de onda da radiação incidente
n
1 =
índice de refração do cristal (IRF)
n
2 =
IRF da amostra
θ = ângulo de incidência
Ou seja, a profundidade de penetração depende do comprimento de onda da radiação
(WARTEWIG S, REINHARD HH, NEUBERT T 2005; LUCASSEN GW, VEEN GNA, JANSEN JAJ
1998).
As vantagens em utilizar a técnica de infravermelho estão na facilidade do manuseio, a não
utilização de reagentes e a determinação de diferentes analitos em um único espectro (LILY MN et al
1999; SHAW A et al 2000). O material a ser analisado pode ser líquido, gás, filme seco, em pó e in
natura. Sendo assim, é possível analisar alterações teciduais no organismo intacto, o que torna a
espectroscopia de infravermelho uma técnica não invasiva, dependendo do órgão ou material a ser
analisado (LILY MN et al 1999).
10
Sistemas Biológicos
Em 1911, W.W. Coblentz foi o primeiro cientista a propor que poderia se obter informação de
materiais biológicos através da espectroscopia de infravermelho. Essa técnica foi utilizada para
diferenciar e identificar bactérias nas décadas de 1950 e 1960. Novos resultados publicados em 1959
definiram que o infravermelho não poderia ser utilizado em um esquema prático, pois naquela época
as especificações da técnica, como a sensibilidade, o tempo e a reprodutibilidade, eram limitadas.
(RIDDLE et al 1956; NORRIS 1959; MURRAY et al 1999). Este panorama foi modificado nas décadas
de 80 e 90 pela superação destes problemas técnicos.
Desde então, o infravermelho vem sendo utilizado para análise vibracional de moléculas de
complexos biológicos (JACKSON M, MANTSCH HH 1996), apresentando resultados
significativamente correlacionados quando comparados a técnicas padrão já existentes. Nas células e
fluídos, a maior absorção espectral está situada nas bandas referentes às ligações N-H, C=O, C-O,
C-H e P=O encontradas em proteínas, lipídeos, ácidos nucléicos, carboidratos e açúcares (Figura 3).
Figura 3: Espectro adaptado e representativo do infravermelho de material biológico no intervalo de
1000 cm-¹ a 4000 cm-¹ (LIU KZ, SHI MH, MANTSCH HH 2005).
11
Diagnóstico Clínico
Na área da hematologia, o IV pode auxiliar no prognóstico e no diagnóstico de leucemias e
da ß - talassemia, possibilitando identificar, através de diferenças em seus espectros, se há
sensibilidade ou resistência aos quimioterápicos, além de avaliar o processo de apoptose nas células
sangüíneas (LIU KZ, SHI MH, MANTSCH HH 2005).
SCHULTZ et al mostram em seus estudos, a heterogeneidade dos espectros de
infravermelho de células normais e leucêmicas. A banda representada pelo número 1, originada de
ligações C–C/C–O, envolve características de desoxirribose e grupos fosfato de parte do DNA. As
bandas representadas pelos números 2 (1087 cm-¹) e 3 (1240 cm-¹) são originadas, respectivamente,
de ligações simétricas e assimétricas do estiramento das vibrações de íons dos grupos fosfato (PO
2-
)
que fazem parte do DNA. A análise estatística, baseada em clusters hierárquicos separou as células
leucocitárias normais das células de Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) (Figura 4). As células
normais foram classificadas em dois subgrupos e as células de LLC foram divididas em três
subgrupos (SCHULTZ CP, LIU KZ, JOHNSTON JB et al 1996). Claramente, o espectro de
infravermelho contém informação suficiente para diferenciar as células, podendo ser utilizado no
prognóstico e no diagnóstico.
Figura 4: Representação de espectros de infravermelho de linfócitos normais (A e B) e células de LLC
(C,D e E) separados por clusters (SCHULTZ CP, LIU KZ, JOHNSTON JB et al 1996)
12
A resistência a múltiplas drogas ocorre freqüentemente nos tratamentos antineoplásicos
devido a superexpressão de proteínas de membrana, chamadas glicoproteínas p (P-gp) e outras
mudanças moleculares nas frações lipídicas e de ácidos nucléicos das células. Na última década, o
infravermelho vem sendo empregado no entendimento das modificações bioquímicas que ocorrem na
resistência a múltiplas drogas e tem se caracterizado pelas diferenças nas bandas de amida I e II,
sendo capaz de diferenciar as linhagens de células leucêmicas sensíveis das resistentes. Além
dessas alterações nas bandas referentes às proteínas, o infravermelho captou o decréscimo nas
faixas espectrais dos lipídeos e dos ácidos nucléicos (LIU KZ, SHI MH, MANTSCH HH 2005).
A talassemia compreende um grupo de desordens genéticas caracterizadas por alteração na
síntese de hemoglobina, causada por mutações que diminuem ou eliminam a síntese de α ou β
globina que fazem parte da hemoglobina. Esses grupos mutados podem ser diferenciados da
hemoglobina normal pela espectroscopia de infravermelho. Uma surpreendente mudança foi
observada na banda de ligação assimétrica de PO
2
-. A banda em 1260 cm-¹ foi observada na
membrana de eritrócitos normais com uma banda adicional em 1230 cm-¹, possivelmente pela
presença de grupos esteróis. Ao contrário, a banda de ligações PO
2
- dos eritrócitos alterados aparece
em 1230 cm-¹ com a ausência da banda de 1260 cm-¹, mostrando que a oxidação dos grupos
esteróis das hemácias modifica a posição das bandas no espectro de infravermelho (LIU KZ, SHI MH,
MANTSCH HH 2005; LIU KZ, TSANG KS, LI CK et al 2003).
A apoptose, um processo ativo que envolve mudanças bioquímicas em três componentes
celulares essenciais: DNA, proteína e lipídeo (LIU KZ, MANTSCH HH et al, 2001), esses vêm sendo
estudados com o objetivo de classificar o estágio em que se encontra determinada doença. Células
humanas leucêmicas HL60 (GASPARRI F, MUZIO M 2003) foram incubadas com captotecina, uma
droga citotóxica, sendo monitorados os tempos em que essas células entravam em apoptose. Fortes
mudanças no espectro de infravermelho foram detectadas durante o processo, sugerindo que no
futuro o ATR-FTIR poderá ser utilizado no monitoramento e na distinção de células apoptóticas,
podendo analisar o efeito de drogas anticancerígenas e da radioterapia no combate às doenças
malignas.
A xerose senil (pele seca) é muito comum em pessoas idosas, causando desconforto e
desordens dermatológicas. Nosso grupo desenvolveu, em dissertação de mestrado (MILAN 2006) e
tese de doutorado (CORTE 2006), o uso de emulsões cosméticas para prevenir e tratar a pele seca,
sendo analisada a hidratação da pele pela espectroscopia de infravermelho nas bandas de amida I e
II, mostrando mais uma vez a ampla utilidade dessa técnica.
Modelos Experimentais
A citologia convencional envolve colorações de células e observação ao microscópio,
procurando diferenciar células alteradas de células normais e dependendo do conhecimento e da
13
interpretação do observador, podendo resultar em diagnósticos equivocados. Além disso, essa
técnica não é capaz de determinar modificações celulares antes que sua morfologia e seu aspecto
estejam alterados. Baseados nessa premissa, pesquisadores induziram câncer em células epiteliais
de camundongos e compararam o método citopatológico convencional com os resultados obtidos
pelo infravermelho do DNA dessas células (Figura 5). Eles chegaram à conclusão de que é possível
distinguir alterações nessas células antes mesmo de o tumor ser detectado visualmente pela análise
histológica ou se tornar palpável (MALINS DC et al 2004, MORDECHAI S et al 2004, MOURANT JR
et al 2003).
Figura 5: Espectro do DNA de células epiteliais no intervalo de 1750 a 760 cm-¹ (A), mostrando
diferenças significativas (valores de p< 0,05 em B e D) entre o grupo controle e o grupo no qual foi
induzido o câncer com MCA (3-metilclorantreno). Em C ampliação da faixa espectral de 1700 a 1625
cm-¹ (MALINS DC et al 2004)
A vantagem do FTIR está em facilitar e examinar as regiões restritas de tecidos e culturas de
células. Ensaios feitos com essa tecnologia foram sensíveis e efetivos para a detecção de células
infectadas por membros das famílias dos herpes vírus e dos retrovírus. Diferenças detectáveis e
significativas no espectro entre células normais e infectadas foram evidentes em estágios iniciais da
infecção. Mudanças significativas nos parâmetros espectroscópicos foram observadas entre as
células infectadas e as não infectadas, estando diretamente correlacionadas com as mudanças no
comportamento específico do vírus infectante (ERUKHIMOVITCH et al 2005). Em outro estudo,
estruturas do tecido nervoso de hamsters infectados por prions foram analisadas pela
microespectroscopia de infravermelho convencional juntamente com a luz de sincrotron. Células
neurais foram separados da raiz do gânglio dorsal e escaneados, sendo possível analisar in situ, no
interior das células isoladas, as diferenças estruturais das proteínas dos hamsters infectados e dos
não infectados. Essas células exibiram áreas aumentadas contendo estruturas folha β-pregueada, as
quais foram co-localizadas constantemente com acúmulo de proteínas priônicas
(PrP
Sc
). Dados
espectrais foram obtidos por purificação de PrP
Sc
isolados de tecidos nervosos de hamsters
14
infectados para elucidar similaridades/dissimilaridades entre as estruturas in situ e ex vivo (KNEIPP J
et al 2002; KNEIPP J, MILLER LM, SPASSOV S et al 2004; NAUMANN D et al 2002; BRIAN JB,
VALERIE D 2002).
Sepse
A inflamação é uma resposta orgânica local ou sistêmica, de magnitude variável,
desencadeada por diversos fatores, com o objetivo de proteger-nos contra qualquer agressão,
regulando e mantendo o equilíbrio das funções corporais. No entanto, essa resposta muitas vezes é
direcionada de forma destrutiva, rompendo a harmonia e o equilíbrio químico do organismo.
Essa resposta natural orgânica geralmente é percebida através das alterações
cardiovasculares (taquicardia, aumento da contratilidade e débito cardíaco), respiratórias (taquipnéia),
neuro-endócrinas (catecolaminas, cortisol, hormônio antidiurético, hormônio do crescimento, glucagon
e insulina), imunológicas (fator de necrose tumoral, interleucinas, interferon, polimorfonucleares),
entre outras (KIRKEBOEN KA, STRAND AO 1999). Há, também, a ativação dos leucócitos, aumento
de sua agregação na microcirculação, maior infiltração celular numa verdadeira explosão respiratória
para a produção de substrato energético e o conseqüente aumento no consumo de oxigênio. Bone
(1992) descreve a Síndrome da Reação Inflamatória Sistêmica (SIRS) em três estágios: I) resposta
inflamatória local; II) resposta inflamatória sistêmica controlada - nessas duas primeiras fases temos
as reações protetoras e promotoras que evoluem até a reparação da lesão, o combate da infecção e
a recuperação da homeostase; e III) situação em que a homeostase não se recupera, há uma reação
sistêmica maciça onde os efeitos dos mediadores são predominantemente destrutivos. Reações
catastróficas são desencadeadas pela ativação do sistema retículo-endotelial, onde há perda da
integridade das membranas separadoras dos compartimentos corporais, com a lesão de vários
órgãos. Há também uma vasodilatação descontrolada e sistêmica, e a conseqüente diminuição da
resistência periférica, necessária para a demanda funcional do sistema cardiovascular e o
direcionamento para a economia energética (BALK RA, BONE RC 1989; BONE RC et al 1992;
CASEY L, BALK RA, BONE RC 1993), podendo levar à falência da microcirculação e à disfunção
múltipla de órgãos (fígado, rim, pulmão e coração).
O termo sepse (do grego sêpsis) significa "putrefação". Responsável por um grande número
de falecimentos (20 a 60%) nas Unidades de Tratamento Intensivo (UTIs), em decorrência de uma
inflamação sistêmica como resposta à infecção, pode evoluir de um simples contágio à severidade, e
desta ao choque séptico (BREALEY D et al 2002).
Sabe-se que bactérias gram negativas são as principais causadoras desta síndrome e que
elas, assim como seus produtos bacterianos, os lipopolissacarídeos (LPS), induzem forte resposta
imunológica (LI J, BILLIAR TR 1999).
15
Clinicamente, a sepse causa diversas alterações metabólicas e teciduais (NUNES FB et al
2003; CHEN HW et al 2004), entre elas, uma das mais importantes é a despolarização da membrana
da mitocôndria, tornando a fosforilação oxidativa incompleta e conseqüente queda da síntese de ATP.
Esses eventos alteram a estrutura da membrana mitocondrial, sua permeabilidade e o fluxo de íons,
provocando o swelling (FERRI D et al 2005; WILSON JD, BIGELOW CE, CALKINS DJ 2005;
JOHNSON LJ et al 2002; BARNARD PJ et al 2004). Alguns poros da membrana mitocondrial estão
abertos à difusão de metabólitos, porém não de proteínas, como a citocromo C. A saída de citocromo
C e de outras moléculas pró - apoptóticas para o citosol só ocorre com o aumento massivo do
swelling e a conseqüente ruptura da membrana mitocondrial levando à morte celular por necrose e/ou
apoptose (MASUBUCHI Y, SUDA C, HORIE T 2005, KIM JS et al 2004, BRUSTOVETSKY N 2002).
Quando há alteração nas funções das mitocôndrias, ocorre a interrupção da respiração
aeróbica, o acúmulo de ácido lático e corpos cetônicos, interferindo na síntese de ATP e aumentando
a concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) (CHEN HW et al 2004; VENDITTI P, ROSA
RD, MEO SD 2004; KIM JS et al 2004), como por exemplo, o aumento excessivo de óxido nítrico
(NO), produzido no estado de sepse.
O NO é sintetizado pelas enzimas óxido nítrico sintetases (NOS), que catalisam a oxidação
de um nitrogênio guanidínico da L-arginina para formar óxido nítrico e citrulina. É uma molécula
envolvida em várias funções fisiológicas, podendo exercer efeitos deletérios quando produzida em
excesso (NISOLI E et al 2004).
Foram identificados quatro tipos de NO sintetases. As constitutivas, presentes em células
endoteliais, células do tecido nervoso (eNOS e nNOS, respectivamente) e, recentemente descoberta,
a mitocondrial (mtNOS) que é uma isoforma da nNOS, presente em muitos outros tecidos. A indutível
(iNOS), presente nas respostas citotóxicas, é a única independente de cálcio, podendo resultar no
aumento de distúrbios na sepse (PERSICHINI T et al 2005; ELFERING SL, SARKELA TM, GIULIVI C
2002; CARRERAS MC et al 2004).
Duas EROs, O
2
e NO, são as primeiras a serem produzidas e continuamente formadas na
mitocôndria. Outras espécies reativas como H
2
O
2
, ONOO°, HO°, ROO
°
, e O
2
-°
, são derivadas da
primeira produção de O
2
e NO. O
2
é produto da transferência de elétrons da cadeia respiratória,
através da autoxidação de ubisemiquinona. Aqui, o NO é o produto da ação enzimática da mtNOS,
que requer NADPH, arginina, O
2
e Ca
2
/calmodulina.
Essas espécies reativas de oxigênio reagem com uma variedade de componentes celulares,
entre eles a L-tirosina, que pode ser convertida parcialmente a 3-nitro-L-tirosina quando exposta a
radicais NO (VAN DER VLIET A et al 1995), estando essa nitrotirosina correlacionada a várias
patologias (GOLE MD et al 2000; HENSLEY K et al 1998; ISCHIROPOULOS H et al 1998; SASAKI S
et al 2000; SMITH MA et al 1997). Esses caminhos envolvem também a nitração pelo peroxinitrito
(BECKMAN JS 1994) ou a ação catalítica de heme-peroxidases usando peróxido de hidrogênio e
nitrito (BRENNAN ML et al 2002, EISERICH JP et al 1998).
16
A interação direta entre NO e citocromo c oxidase, causa inibição da cadeia respiratória. O
NO oxida ubiquinol na cadeia respiratória, reage com superóxido para formar peroxinitrito, o qual
inibe o complexo I (CARRERAS MC et al 2004), podendo inibir também o complexo II/III, citocromo
oxidase (complexo IV) (NISOLI E et al 2004), ATP sintase, creatina quinase e provavelmente outras
enzimas (BROWN GC, BORUTAITE V 2002). O NO também estimula a guanilil ciclase que aumenta
GMPc e GMPc – dependente, na inibição da permeabilidade de poros mitocondriais (KIRKEBOEN
KA, STRAND OA 1999; LI J, BILLIAR TR 1999). Um dos mecanismos da citotoxicidade do NO está
no dano causado nos centros de Fe-S (um dos quatro complexos enzimáticos da cadeia respiratória)
inibindo irreversivelmente a respiração mitocondrial. O ataque de resíduos de prolina, lisina e arginina
pelas espécies reativas de oxigênio na presença de ferro reduzido (Fe
2+
), resulta na carbonilação de
sítios dessas proteínas (DONNEA ID et al 2003; KANTROW et al 1997).
Infravermelho e Mitocôndrias
As mitocôndrias e seus complexos como, proteínas Translocásicas da Membrana Externa
(TOM – Translocase Outer Membrane), Creatina Quinase Mitocondrial (mtCK), Citocromo c oxidase e
transportador de ADP/ATP, têm sido analisados por infravermelho através de vibrações moleculares
representadas em sua região média (400 – 4000 cm-¹), principalmente nas regiões das bandas de
amidas I (1615 –1700 cm-¹) e II (1500 -1600 cm-¹) referentes aos grupamentos C=O e N-H,
respectivamente, constituintes também das proteínas (OBERG KA, FINK AL 1998; VERMETTE P et
al 2003; ZANDOMENEGHI G et al 2004).
Estruturas TOM da mitocôndria têm sido determinadas por infravermelho, juntamente com
outras tecnicas. As estruturas secundárias de TOM40 (fração do complexo protéico TOM) foram
determinadas por FTIR por conter aproximadamente 31% de folha β-pregueada, 22% α-hélices e
47% de outras estruturas. Estruturas de α-hélices estão localizadas em 1650 cm-¹, entre 1645 cm-¹ -
1640 cm-¹ estão estruturas ao acaso e entre 1630 -1625 cm-¹ estruturas folha β-pregueada. Em 1695
cm-¹ temos estruturas caracterizadas por folha β-pregueadas antiparalelas (AHTING U et al 2001).
As isoenzimas Creatinas Quinases (CK) catalisam reversivelmente a transferência dos grupos
fosfato da fosfocreatina para o ADP, regenerando ATP. Estudos mostram que alterações na fluidez
da membrana mitocondrial podem ser induzidas pela CK mitocondrial (mtCK), influenciando na
função da mitocôndria. Resultados de estudos feitos com lipossomos através da espectroscopia de
infravermelho, juntamente com outras técnicas, mostraram que a diminuição na fluidez das
membranas pode estar relacionada ao acoplamento funcional entre a fosforilação oxidativa, adenina
nucleotídeo translocase, porinas e mtCK. O aumento na rigidez de microdomínios fosfolipídicos da
membrana mitocondrial pode perturbar as enzimas inseridas nessas membranas, afetando suas
funções. Além disso, mudanças na fluidez da membrana da mitocôndria podem contribuir para
explicar o envolvimento da mtCK na formação e na função da permeabilidade dos poros dessa
organela, envolvidos no processo de apoptose, abrindo novas perspectivas na função fisiológica
17
desta enzima na célula. Alterações na região de amida I estiveram presentes entre 1630-1660 cm-¹.
O aumento do pico na região de 1616 cm-¹ foi concomitante com a diminuição das estruturas α-
hélices e β-folhas representadas pela diminuição dos picos em 1651 e 1636 cm-¹ (GRANJON T et al
2001).
Citocromo c oxidase (CcO), enzima responsável pela oxi-redução na cadeia respiratória da
mitocôndria, como também em muitas bactérias, catalisa eficientemente a conversão do oxigênio em
água. Nesse processo, o movimento de cargas contribui para o gradiente eletroquímico através da
membrana. Averiguar a transferência de elétrons, a bomba de prótons e a química do oxigênio, é
essencial para entendermos essa máquina molecular. Mudanças vibracionais em resíduos individuais
da CcO, em diversas condições, têm sido investigadas por infravermelho. Três regiões foram
distinguidas: a de 1690 cm-¹ -1620 cm-¹, a de 1560 cm-¹ -1520 cm-¹ e a região entre 1100 cm-¹ - 1000
cm-¹. As bandas com picos positivos na região de amida I incluem sinais predominantes das
estruturas de α- hélices em 1650 cm-¹. Os sinais em 1698 e 1636 indicaram reorganizações de
estruturas de β- folhas e os sinais em 1658 cm-¹ representam mudanças em estruturas de α- hélices
(RITTER et al 2003; NYQUISTA RM et al 2001; TSUBAKI M, YOSHIKAWA S 1993).
O transportador de ADP/ATP está localizado no interior da membrana mitocondrial, formando
ATP a partir do ADP citosólico. Estudos feitos por FTIR, a partir da análise de amidas I e II presentes
nesse transportador tem auxiliado para um maior conhecimento destes compostos protéicos e suas
funções (FONFRÍA VAL et al 2003). O carboxiatractilosídeo, um inibidor do funcionamento do
transportador, de ATP/ADP mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae, mostra que 60-70 % dos
aminoácidos analisados são de α-hélices e estruturas desorientadas, sendo coerente com seis
modelos de hélices transmembrânicas. Comparações entre diferentes amostras indicam que tanto os
lipídeos podem induzir mudanças em proteínas (diminuição em β-folhas e aumento de estruturas
desordenadas), como proteínas podem induzir mudanças em lipídeos (fortes ligações de hidrogênio
de grupos C=O dos lipídeos) (LORENZ VA et al 2001).
Ricchelli et al (2001), suspenderam mitocôndrias hepáticas de ratos em diferentes meios,
selando os poros das organelas com diferentes compostos, impedindo o trânsito de substâncias do
meio através da membrana. A análise feita por infravermelho das amidas I e II da membrana das
mitocôndrias, mostrou diferença significativa entre os espectros das seladas em comparação às não
seladas nos diferentes meios de suspensão. A análise feita pela espectroscopia de infravermelho da
amida I da membrana da mitocôndria em meio contendo sacarose mostrou diferenças relevantes,
sendo mais proeminentes os picos localizados em 1658 cm-¹ (estruturas de α-hélices) e 1637 cm-¹
(estruturas β-folha) em comparação aos outros meios. Sendo assim, os pesquisadores concluíram
que as interações entre os poros da membrana mitocondrial e os diferentes meios de suspensão
podem modificar a estrutura conformacional desses poros (RICCHELLI F et al 2001; RICCHELLI F et
al 2003).
Baseado nos dados acima concluiu -se que a espectroscopia de infravermelho possibilita
analisar as mais diversas matérias orgânicas e caracterizar individualmente os espectros para cada
18
uma delas. Sendo assim, as pesquisas realizadas anteriormente somente com substâncias químicas
passaram a ser ampliadas aos modelos biológicos, facilitando e aperfeiçoando as técnicas de
diagnóstico e prognóstico de doenças.
19
OBJETIVOS
Geral
Estudar as alterações em mitocôndrias hepáticas causadas pela sepse induzida em ratos
(Rattus novergicus – var. Wistar) através do FTIR-ATR.
Específicos
• Avaliar modificações moleculares nos espectros de infravermelho das mitocôndrias hepáticas
e comparar os resultados entre os ratos do grupo séptico e os demais grupos (controle,
controle anestesia e sham);
• Determinar as concentrações de proteínas totais das mitocôndrias hepáticas para averiguar
variação significativa ou não em suas concentrações que possam interferir nos espectros;
• Determinar as concentrações séricas de óxido nítrico para averiguar possíveis variações no
estresse oxidativo.
20
ARTIGO CIENTÍFICO
A Ser Submetido a Biochimica et Biophysica Acta
INVESTIGATIONS OF MOUSE HEPATIC MITOCHONDRIA IN SEPSIS USING FTIR-ATR
Paula E. T. Heinen¹, Jarbas Oliveira², Paulo M. C. Ramos², Carolina Bastos² and André A. Souto¹
¹ Laboratório de Química de Produtos Naturais, Faculdade de Química , Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
² Laboratório de Biofísica Celular e Inflamação, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
Running title: Infrared and Mitochondria in Sepsis
* Corresponding author: Dr. André Arigony Souto, Laboratory of Chemistry of Naturals Products,
Institute of Chemistry - PUCRS, Av. Ipiranga 6681, Building 12 Room 224 – PO Box 1429. 90.619-900
Porto Alegre, RS. Brazil. Phone: +55 51 3320 3500/x4433, Email: arigon[email protected]
21
Summary
Infrared spectroscopies characterize tissues and fluids at a molecular level, and the spectra obtained
are characteristic, representing a fingerprint. In recent decades, infrared has been used in several
areas of knowledge. Currently, it is employed in the prognosis and diagnosis of diseases, in
experimental models and biological systems. Sepsis, a systemic inflammation in reaction to infection,
is responsible for a great number of deaths in Intensive Care Units (ICUs). It provokes numerous
alterations in the cellular metabolism and the concentration of free radicals surpasses that of anti-free
radicals, which may lead to cellular apoptosis or death through necrosis. Nitric Oxide (NO) is a marker
of free radical formation and may cause serious damage to the mitochondria, impeding their
functioning.
In our study, we analyzed hepatic mitochondria alterations in a model of oxidative stress (sepsis) by
FTIR-ATR. Amide I e II bands were analyzed together with the action of free radicals on the organelle.
The increase in the amide I peak and increase of levels NO in serum of septic groups in relation to
others groups (control, control anaesthesia, sham) was correlated. This significant increase in amide I
in septic group represent an increase in C=O groups characteristics proteins α and β unsaturated.
Thus being, infrared was capable to differentiate alterations in spectrum of all groups.
22
INTRODUCTION
The main components of biological membranes named, proteins, lipids, nucleic acids and
sugar, show their highest infrared spectral absorption in the bands that refer to the bonds N-H, C=O,
C-H and P=O, in the intermediate region, including the interval from 400 – 4000 cm-¹ [1, 2, 3].
Attenuated Total Reflectance - Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR) is a well-
established standard method that enables the identification and characterisation of these samples [4,
5].
Sepsis, a systemic inflammation in response to infection, has been the target of many studies,
as it is responsible for a great number of deaths in ICUs. This syndrome provokes
numerous/uncountable alterations in cellular metabolism mainly in the mitochondria, organelles
responsible for most of the cellular energy supply [6, 7, 8]. Thus, alterations occur in the mitochondrial
membrane, to its permeability and fluidity, as well as ions transport [9, 10, 11, 12, 13]. This situation
favours the generation of reactive species that oxidise amino acid residue, causing carbonylation of
these proteins [7, 14].
The purpose of the present study is to analyse alterations in hepatic mitochondria as a result
of sepsis in rats [Rattus novergicus – var. Wistar), based on molecular modifications in the infrared
spectra in the amide I and II regions, corresponding to links C=O and N-H, respectively, present
organelle’s proteins.
23
MATERIALS AND METHODS
Experimental Model
Ethical principles regarding manipulation of animals as determined by the Research Ethics
Committee of Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS) were respected.
Animals were fed with commercial chow (Nuvilab - CR1) for up to twelve hours and water for six hours
prior to the experiment, and the light/dark cycle was respected.
Forty-six male rats (Rattus novergicus – var. Wistar), from the Biotherium of the Faculty of
Biosciences of the PUCRS, aged between 60 and 90 days, weighing approximately 220g (+/- 20g)
were used for the experience. Their livers (5-10g) were immediately removed, their blood collected
and the serum was separated.
Animals were divided into four groups: Control (n= 16), rats submitted to neither the surgical
process nor anaesthesia; Control Anaesthesia (n=12), only received anaesthesia; Sham (n=9), rats
submitted to anaesthesia and opening of the peritoneal cavity; and Septic (n=10), submitted to
anaesthesia and opening of the peritoneal cavity with the induction of sepsis. The anaesthesia,
administered via intraperitoneal (i.p.) at a dose of 2mg/g weight of Ketamine Chlorohydrate 5% /
Xylazine Chlorohydrate 2.3g (3:1).
Sepsis was induced by means of Cecal Ligation and Puncture (CLP), in which two cuts were
made at different points of the colon, permitting faeces to leak out [15, 16]. All animals were sacrificed
twelve hours after the initiation of surgical procedures and administration of anaesthesia.
Mitochondria were extracted following procedures previously described [17, 18, 19], with some
modifications as follow.
Isolation mitochondria
A differential centrifugation speed was used to isolate mitochondria. After animal scarification,
livers (5-10g) were immediately removed and chopped in 20mL of medium containing 250mM
sucrose, 1,0mM EGTA and 10mM HEPES-KOH, pH 7.4, homogenized three times for 15 seconds at
an interval of 1 minute in a Potter-Elvehjem. The homogenized product was centrifuged at 2500rpm at
4°C for 10 minutes, and the supernatant was re-centrifuged at 10,500rpm for 10 minutes at 4°C. Pellet
was suspended in 10mL of medium containing 250mM sucrose, 0,3mM EGTA and 10mM HEPES-
KOH, pH 7.4, and later centrifuged at 6000rpm for 15 minutes at 4°C. Pellet was suspended in 10mL
of medium containing 250mM of sucrose and 10mM of HEPES-KOH, pH 7.4. Mitochondrial protein
content was identified by biuret reaction [20].
24
Infrared Spectroscopy
For the background plate 1,0mL of medium containing 250mM sucrose and 10mM of HEPES-
KOH, pH 7.4, was used to analyse only the mitochondria and be able to discount the medium in which
they were found as a blank control
Within four hours of removal, 1,0mL of suspension containing the hepatic mitochondria was
placed on a ZnSe optical plate and analysed using infrared spectroscopy. The entire spectrum (4000 –
400 cm-1) was obtained by means of the ATR technique, using a Perkin-Elmer Spectrum One
spectrometer (Perkin Elmer, Uberlingen,Germany) with a horizontal ATR device (with angle 45°). Four
scans were performed with a resolution of 4cm-¹. Scans were interpolated in the area of interest. In
order to better analyse amide I and II peaks, correction programmes supplied with the equipment
system were used (Absorbance, Interactive smooth, auto- X, auto- Y). All spectra were analysed in
Absorbance and with attenuation of 52. A comparison was made of the maximum peak values of
amides I and II (p.m. amide I / p.m. amide II) [21].
Nitric Oxide
Spectrophotometric detection of serum Nitrate: levels of nitrate (NO3) were determined using
a copper covered cadmium reagent (cadmium/copper). The reagent was prepared by previously
washing 2-3g of 100 mesh granulated cadmium with 50mL of water milliQ (nanopure) in a 250mL
Erlenmeyer, supernatant was discarded, and cadmium washed twice with 50mL of HCl 0,5N. Soon,
cadmium was washed with 50mL of water and after with 50mL of 5% copper acetate, in order to cover
the cadmium with copper. Cadmium was washed with copper acetate two or three times, the blue
solution remaining in contact with cadmium for 60 seconds, saturating cadmium with copper. During
this period, cadmium must not turn reddish or black, if this occurs it should be discarded. The excess
of copper was quickly removed by four washes with 25mL water. Cadmium covered with copper was
washed twice with 30mL of HCl 0,1N and stored in this solution at temperature between 2-8°C. After
this process the product is stable for six months [22].
In order to determine total nitrate and nitrite, Griess acid reaction was used for the
development of colour after reduction of nitrate by cadmium/copper reagent and proteinisation. In this
process, 100µl of serum was added to a microtube containing approximately 0.1mL of
cadmium/copper (pre-washed in the same carbonate/bicarbonate buffer and dried with filter paper)
and 0.4mL of carbonate/bicarbonate buffer (pH 9,0). After, it was vortexed and incubated at room
temperature for 1 hour. Reaction was interrupted with addition of 0.1mL of sodium hydroxide 0.35M,
and standing for 10 minutes. It was then centrifuged at 4000g for 10 minutes. 500µl of cleaned
supernatant was transferred to another tube, were added 250ul of sulphanilamide 1% (prepared in
HCl 3N) and 250ul of N-naftylethylenodiamine (prepared in water) and mixed. After 10 minutes,
reaction tubes were read at 540nm against a background containing only reagents [23].
25
Statistical Analysis
Turkey and Bonferroni statistical tests were used for statistical analysis, by means of One -
Way ANOVA with the help of SPSS software version 11.5, with a p < 0.05 is considered significant
and p < 0.001 is considered a lot significant.
RESULTS
Spectra of hepatic mitochondria show the amide I peaks, regarding bonds C=O (1615 –1700
cm-¹), and amide II, regarding the bonds N-H (1500 -1600 cm-¹). An increase in the amide I peak was
observed in the septic group (red line) in comparison with other groups: control, anaesthetised and
sham (black lines) in Figure 1.
The visible difference represented by infrared spectrum in the amide I region, of the septic
group (red line), is confirmed though the comparison between the average amide I peaks / average
amide II peaks, as shown in Figure 2. Average for the control group was 0.905 ± 0.037, for the
control anaesthesia group was 0.914 ± 0.051, for the sham group, 0.884 ± 0.044 and for the septic
group, 1.007 ± 0.089. This comparison of averages showed a significant difference between septic
group p < 0.001(**) and the others: control, control anaesthesia and sham; but none between control,
control anaesthesia and sham.
Figure 3 shows normalised spectra (black curves) and their inverted derived seconds (red
curve) obtained from mitochondria from the control (A), control anaesthesia (B), sham (C) and septic
groups (D), respectively. In the deconvoluted spectra, at the peak of amide I, some “minor peaks”
arose while others disappeared. In the control group, four peaks were formed, located at: 1660 cm-¹,
1650 cm-¹, 1639 cm-¹, 1625 cm-¹. In the anaesthetic and sham groups, two peaks disappeared (1660
cm-¹ and 1639 cm-¹), with one remaining at 1650 cm-¹ and another at 1625 cm-¹. In the spectrum of
the septic group, the peak located at 1660 cm-¹ disappeared, followed by the presence of those at
1650 cm-¹, 1639 cm-¹ and1625 cm-¹.
As Figure 4 show, there was no significant difference in the total protein concentration of the
hepatic mitochondria between groups. Values were 3.969 ± 0.217 for control group, 3.433 ± 0.104 for
control anaesthesia group, 3.389 ± 0.265 for sham group and 3.69 ± 0.164 for septic group.
Serum levels of NO, a free radical formation marker, were 15.294 ± 3.262 for control group,
14.367± 4.238 for control anaesthesia group, 17.011 ± 4.853 for sham group and 24.19 ± 6.479 for
septic group, demonstrating a significant difference with p < 0.05 (*) between septic and sham groups,
and of p < 0,001 (**) between septic group and control and control anaesthesia groups (Figure 5).
These results show evidences of an increase in the induction of NO in animals 12 hours after sepsis,
26
as the levels of NO were found to be significantly elevated in this group when compared to the control,
control anaesthetized and sham groups.
DISCUSSION
In our study, we used Fourier Transform Infrared Spectroscopy in a model of oxidative
stress (sepsis) in hepatic mitochondria in order to analyse the amide I and II bands, the action
of free radicals on the membrane of this organelle and its correlation with the increase in the
amide I peak and the serum levels of nitric oxide. Amide bands I and II refer to the molecular
vibrations of the groups C=O and N-H, respectively [24, 25].
Sepsis is brought about by a complex series of cellular and biochemical events,
including liberation of inflammatory cytokines, increasing oxidative stress and induction of
nitric oxide synthesis (iNOS) [26]. We found evidence of an increase in the induction of NO in
animals 12 hours after sepsis (Figure 5). This is in line with previously reported studies using
the same experimental animal model, though at 16 hours following the induction of sepsis [27].
Nitric Oxide Synthase (NOS) is present in many cells, though the iNOS isoform is the only one
that is independent of calcium and dependent on TNF-α and can result in cytotoxicity in sepsis.
The objective in evaluate NO into the serum was to estimate whether the different groups were
at different stages of oxidative stress.
NO is a free radical formation marker, enzymatically formed, or not, in the tissues [8].
This molecule is involved in several physiological functions, and may cause damage when in
excess [28]. It is formed by the NOS, which catalyzes the oxidation of a guanidine hydrogen of
L-arginine to from nitric oxide and citruline.
Reactive species of oxygen react with a variety of cellular components, among them L-
tyrosine that can be partially converted to 3-nitro-L-tyrosine when exposed to NO radicals [29],
and this nitrotyrosine is correlated in a number of pathologies [30, 31, 32, 33, 34]. These paths
also involve nitration also by peroxynitrite [35] or the catalytic action of heme peroxidase using
hydrogen peroxide and nitrite [36, 37].
One of the mechanisms of cytotoxicity of NO is the damage caused in the Fe-S centers,
which irreversibly inhibits mitochondrial respiration, preventing the organelle from correctly
generate the energy necessary for the cell, and so favouring anaerobiosis. This favours an
increase in cell membrane permeability. The attack of the reactive oxygen species on the
proline residues, lysine and arginine in the presence of reduced iron (Fe2+), results in
carbonylation of these proteins [27, 38].
In the last decade, many papers were published that reported increased levels of these
carbonylated proteins in numerous pathologies and the evolution of diseases. Proteins
containing CO groups are elevated in situations of oxidative stress, as occurs in sepsis,
27
neurological diseases, chronic juvenile arthritis, in patients with chronic kidney failure or
haemodialysis, and in so many other pathologies [39, 40].
In previous studies, in the same sepsis induction model (CLP), increases in the
concentration of carbonylated proteins from hepatic mitochondria were found [27]. We
monitored, at an interval of 1000 - 1400 cm-¹ of the infrared, the most relevant differences found
in these samples, which were found in the amide I region (1700–1600 cm-¹) referring to the
carbonylic groups (C=O) also present in the proteins of mitochondria.
In our experiment, we analyzed the levels of total mitochondrial protein (Figure 4) by
means of the Biureto method [20, 41], and no significant difference in its concentration was
found between different groups (p > 0,05). Being thus, the increase in C=O groups in the septic
group is thought to be the result of the formation of these groups and no distinctions in the
concentration of total proteins in the septic group.
Analysis of these proteins with CO groups as biomarkers of oxidative stress offers
advantages, in comparison to certain oxidative products, since CO groups are formed early
and are chemically stable, and as such are useful for detection and storage. Moreover, these
carbonylated proteins take hours or days to be degraded and eliminated by the organism,
while lipid peroxidation products take only a few minutes. The stability of the stored
carbonylated proteins stored at - 80 °C is approximately 3 months [39, 40].
Clinically, sepsis causes several metabolic and tissue alterations [6, 7], altering the
structure of the mitochondrial membrane and, consequently, the permeability, the transport of
ions and organelle function. This process of alterations in mitochondrial permeability and its
consequences is known as swelling [11, 12, 13].
Ricchelli et al, in a model of swelling, suspended hepatic mitochondria from rats in
different media sealing the pores of the organelles with different compounds and analyzing
infrared amide I and II bands. The second derivatives from their spectra showed that there was
a significant difference between the sealed organelles and non-sealed in the different
suspension media [24, 25].
In Figure 3 the normal and deconvoluted spectra, peaks were perceived in the control
(A), control anaesthesia (B), sham (C) and septic groups (D). Thus, evaluating the spectra, we
were able to distinguish spectral patterns for the different groups of mitochondria, which
allowed us to outline a profile of mitochondrial normality and evaluate which are altered and
correlate them with the severeness of the disease, or, further, identify which alteration the
anaesthesia could provoke.
In conclusion, the infrared showed, by the increase in the amide I peak, the significant
increase in the formation of the C=O groups of carbonylated proteins, in the membrane of the
hepatic mitochondria from the septic group in relation to the other groups. This was evaluated
28
by means of the comparison between the averages of the maximum peaks in the amide I over
the amide II bands. Furthermore, the dosage of NO makes it possible to evaluate significant
differences in its concentrations in the sepsis.
The fact that no studies were found that correlated alterations in the hepatic
mitochondria in this model of sepsis with the aid of FTIR, gives the present study an
innovatory character in the analysis of these organelles in experimental models of oxidative
stress.
Acknowledgements
We are grateful to the Chemistry of Natural Products Laboratory of the Faculty of
Chemistry and the Biophysics Laboratory of the Faculty of Biosciences of PUCRS.
29
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32
33
Figure 1: Infrared Spectroscopy of mitochondria, showing amides I and II peaks and the increase in
the amide I peak in septic group (in red).
34
** ** **
35
Figure 2: Comparison between averages of amide I /amide II peaks, showing a significant difference
of septic group compared to other groups: control, control anaesthesia and sham (p < 0.001).
Difference when comparing groups control, control anaesthesia and sham was not significant (p >
0.05).
36
37
Figure 3: Infrared Spectrum (black curves) and their inverted derived seconds (red curve) in
absorbance obtained from mitochondria of control (A), control anaesthesia (B), sham (C) and septic
groups (D).
38
39
Figure 4: Average concentration of total protein, showing there was no significant difference among
groups.
40
** ** *
41
Figure 5: Concentration of NO in different groups: control, control anaesthesia, sham and septic,
showing a significant difference when comparing septic and other groups.
42
CONCLUSÃO
Em nosso trabalho pôde-se perceber o aumento significativo na banda de amida I relacionado
ao aumento na formação de grupos C=O no grupo séptico comparando este com os demais
grupos (anestesia, sham e controle). Sendo assim, a sepse alterou a relação entre as bandas de
amida I / amida II. Além disso, a técnica de IV foi capaz de diferenciar alterações espectrais nos
diferentes grupos.
O aumento significativo de NO sérico no grupo séptico em comparação aos demais grupos
nos permitiu verificar diferença significativa no estresse oxidativo entre os grupos, sendo possível
correlacionar estes níveis de NO com o aumento da banda de amida I das mitocôndrias hepáticas
característicos de grupamentos C=O de proteínas α e β insaturadas.
43
PERSPECTIVAS
Apesar de não ter sido encontrado na literatura o uso da Microscopia Eletrônica de Varredura
(MEV) em mitocôndrias, esta foi feita para posterior comparação com a Microscopia Eletrônica de
Transmissão (MET), para que sejam analisadas as alterações possíveis na membrana externa desta
organela, em seu diâmetro e em suas estruturas internas.
Além de nossas pretensões em fazer a MET destas organelas, também almejamos dosar
aldeídos nas mitocôndrias hepáticas por HPLC, pois esses são produtos da lipoperoxidação da
membrana dessa organela devido ao ataque de radicais livres na sepse.
Pretende-se também, criar um índice através da relação amida I / amida II, para avaliar a
gravidade da sepse.
Foto por MEV de mitocôndrias hepáticas
44
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charge. There are no page charges. An offprint
order form, price list and copyright transfer
form are sent upon receipt of the manuscript at
the Publisher so that extra offprints may be
ordered. It is also essential that copyright be
transferred at this stage.
Information concerning your accepted article can
be obtained by using the "Track a Paper" feature
of Elsevier's Author Gateway.
This will provide you with:
general production status (in preparation, in
proof, in issue)
date of publication and offprints dispatch date
volume, issue and page numbers
Through this site you can also set up e-mail
alerts informing you of changes to your
manuscript's status.
Authors are required to submit electronic
manuscripts. Typesetting from computer files has
several advantages, not the least of which is
the avoidance of re-keying errors in the
56
article.
Acceptable file types. Most word-processing
packages are acceptable; however, we prefer that
authors use a recent version of Microsoft Word
or Corel WordPerfect. Manuscripts saved with
formatting intact are preferred. Rich-text
format (.rtf extension) is acceptable, but plain
text (.txt extension) files are discouraged.
Submit each figure as a separate TIFF or EPS
file.
Once a paper is accepted, BBA cannot use PDF or
PostScript files because they do not allow
editing of the text. Files created in layout
programs such as Adobe FrameMaker or PageMaker,
QuarkXPress, and Corel Ventura are unacceptable.
Artwork should not be embedded within the
manuscript. It must be supplied in electronic
files separate from the manuscript file.
BBA publishes English-language papers only.
Papers may be written in either American or
British English, provided that the preferred
spelling is used consistently throughout.
Many readers of the journal are not native
speakers of English. It is therefore important
to write succinctly and clearly, using short,
simple sentences and avoiding long adjectival
57
phrases and laboratory jargon. The following
types of paper are published:
Regular papers
A Regular paper is the normal medium of
publication. Although there is no fixed length,
Regular papers should be as concise as possible,
while providing sufficient information for the
work to be repeated and for the claims of the
authors to be judged by the readers.
Rapid reports
Rapid reports should meet the following
conditions:
(1) encompass a complete piece of work of
special significance and timeliness;
(2) be concise and not normally exceeding 4
printed pages (i.e., up to 12 pages of double
spaced typescript, including tables and figures
up to a total number of 4);
(3) comprise no separate sections, except for a
summary and the reference list.
Authors should note that:
(a) Submission of a Rapid report should be
accompanied by a letter briefly describing why
58
the author believes his paper to be deserving of
rapid publication. Failure to provide this
information can lead to delays in the manuscript
handling. (
b) An e-mail address or fax number must be given
to enable turnaround of corrected proofs in 48
h.
(c) Rapid reports will be added to the beginning
of issues currently in production.
(d) An accepted Rapid report will generally be
published within 8 weeks of the date of receipt
at the Publisher's office, depending on issue
scheduling.
Short functional sequence-/Promoter papers
These are mainly published in the "Gene
Structure and Expression" section, and conform
in style and format to BBA Rapid reports. Short
functional sequence-papers should provide
information on the function of the gene and
include a comparison of related sequences, a
description of salient features of the sequence
and significant experimental data on function
and expression of the genes described. Papers
presenting sequences presumably coding for a
protein must be accompanied by sufficient
59
evidence, e.g. expression data, that the gene
indeed codes for such a protein. If the paper
only confirms in one organism what is already
known for several other species, or describes
sequences without information on the function,
it will not be considered eligible for
publication in BBA. If the cDNA sequence has
been published before, BBA will not consider
manuscripts describing the sequence of the gene
unless accompanied by functional studies on the
promoter, as in Promoter papers, or other
functional data related to the genomic
organization and expression. Promoter papers
include data on promoter or enhancer sequences
or other regulatory regions required for gene
expression. In addition to the sequence itself,
these papers should include novel information on
the transcription start site and functional
studies, e.g., using reporter genes. Such
studies could entail a deletion analysis or
otherwise establish functional regions in the
promoter that act either positively or
negatively. In addition, information on the
recognition of these functional regions by
transcription factors could be included,e.g.,
using band shifts or footprints.
Manuscripts should be marked "Short functional
sequence-/Promoter paper" and the accompanying
submission letter should state explicitly that a
60
Short functional sequence-/Promoter paper is
being submitted.
Sequences should be deposited in one of the
usual data banks before submission. Accession
numbers should be mentioned in the submission
letter and in a footnote to the Short functional
sequence-/Promoter paper. In general accession
numbers suffice. Only in exceptional cases
should the sequence be presented as a figure.
Reviews
BBA reviews are published in the independent
section Reviews on Cancer and in all other
sections of the journal. They are contributed by
scientists who are leading specialists in their
field of expertise, normally at the invitation
of the Executive Editors. Authors wishing to
contribute a review paper are advised first to
contact one of the responsible Executive Editors
(listed in the issues ofBBA) to avoid overlap
with Reviews already commissioned.
Authors should consult a recent issue of the
journal to make themselves familiar with the
conventions and layout of articles.
The entire text, including figure and table
legends and the reference list, should be
61
double-spaced, leaving a left margin of approx.
3 cm. All pages should be numbered
consecutively, starting with the title page of
the manuscript. Every new paragraph should be
clearly indented. Expressions of Latin origin,
for example, in vivo, in vitro, et al., per se
should be typed in normal typeface. They should
be neither italicized nor underlined.
Equations should be numbered in the right margin
as follows:
A+B C+D(1)
Title page
The title should be concise, descriptive and
informative. The names of the authors should be
followed by their addresses and indicated by
corresponding letters. Changes in address should
be indicated by footnotes. The author(s) to whom
correspondence and proofs should be sent should
be indicated, giving a full address (including
fax number and e-mail address).
Authors are requested to select a maximum of six
key words and to present them on the title page.
These key words will be used in the compilation
of the annual cumulative index. They should
cover precisely the contents of the submitted
62
paper and should give readers sufficient
information as to the relevance of the paper to
his/her particular field.
Summary
The second page should be reserved for the
Summary. This should be self-explanatory and
intelligible without reference to the body of
the paper.
A Regular paper should have a Summary of 100–200
words; Rapid reports and Short functional
sequence-papers should have summaries of
approximately 50 words.
Since summaries are increasingly used by
abstracting services which will cut off after a
fixed number of words, it is important not to
exceed the maximum number of words and to avoid
bibliographic references and non-standard
abbreviations.
Regular papers
After the Summary, Regular papers are usually
divided into the sections Introduction,
Materials and methods, Results, Discussion and
Acknowledgments.
63
Introduction
This is a short section in which the authors
should state the reasons for performing the
work, with brief reference to relevant previous
work.
Materials and methods, Results, Discussion The
section Materials and methods should be detailed
enough for readers to reproduce the experiments.
Authors should always refer to other work on the
same subject, indicating whether or not their
experimental results are in agreement with
previous work. Conclusions drawn from
experiments described in the tables or figures
can often appear most conveniently in the
Results section. The overall conclusions based
on the work reported should be given in the
Discussion. In shorter papers the Results and
Discussion sections may be combined.
Acknowledgments
Acknowledgments should be presented at the end
of the main text in a separate section.
Rapid reports, Short functional sequence- and
Promoter papers
These types of paper are not divided into
64
sections after the summary, except for the
reference list. The first paragraph serves as an
introduction; acknowledgments are added as a
final paragraph before the reference list.
References and citations
The numerical system of references should be
used. References in the text should be cited by
numbers in square brackets in the order of their
citation.
References are listed together in their order of
appearance in a separate section at the end of
the text under the heading References. All
references should be numbered consecutively.
References to journals should contain initials
and names of all authors, article title,
abbreviation of the name of the journal
according to the List of Serial Title World
Abbreviations (International Series Data System,
20, rue Bachaumont, 75002 Paris, France. ISBN
2-904938-02-8), volume number, year of
publication (between brackets), and page
numbers. References to books should also include
the title (of series and volumes), initials and
names of the editor(s), the publisher and place
of publication.
Examples
65
[1]M. Wikstrom, J.E. Morgan, M.I. Verkhovsky,
Proton and electrical charge translocation by
cytochrome-c oxidase, Biochim. Biophys. Acta
1318 (1997) 299-306.
[2]E.C. Slater, Biochimica et Biophysica Acta:
The Story of a Biochemical Journal, Elsevier
Publishers, Amsterdam, 1986
[3]D.E. Vance, Glycerolipid biosynthesis in
eukaryotes, in: D.E. Vance, J.E. Vance (Eds.),
New Comprehensive Biochemistry, vol. 31,
Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and
Membranes, Elsevier B.V., Amsterdam, 1996, pp.
153-181.
Reference to a paper as "in press" implies that
it has been accepted for publication. Evidence
(e.g., a photocopy of the note of acceptance
from the journal concerned) should accompany the
submitted typescript. Papers that are "in press"
should be included as a number in the text.
Other papers submitted before or simultaneously
with the paper in question should be included as
a number in the text and in the References
section, stating the name of the journal. Copies
of papers that are submitted elsewhere should be
provided for inspection by the Editors. Omission
of this information will delay publication and
may lead to redating of a submitted manuscript.
Papers presented at scientific meetings that are
66
not available in published form should not be
cited as references in the References section.
Unpublished results should not be listed in the
References section. In the text they are
mentioned as follows: "(Tervoort, M.V. and
Glimcher, J., unpublished data)". When
unpublished results are cited, the data should
be provided for the Editors' information when
essential for proper evaluation, or if
requested.
A personal communication should be mentionedin
the text as follows: "(Tervoort, M.V., personal
communication)". Authors should not make
unauthorized use of personal communications.
Personal communications are not to be included
in the References section.
Tables
Tables should be used sparingly; they should be
used only when the data cannot be presented
clearly in the text. Authors are requested to
consult recent issues of BBA for the proper
table layout.
Each table, including its legend, should be
included on a separate page. The heading of the
table should make its general meaning
67
understandable without reference to the text.
Figures and illustrations
Figures should be used to illustrate
experimental results clearly. As figures are
often reduced to a one-column width, authors
should bear in mind the size of BBA's printed
page and they should ensure that symbols,
lettering and lines are sufficiently large and
clear to be legible after reduction. (Column
width is 8.4 cm, preferred figure size is
approximately double this).
Legends should be collated and typed with double
or triple spacing on a separate sheet. A legend
should consist of an opening sentence
constituting a brief title (without extra
capitalization), followed by a brief description
of the figure.
BBA encourages the submission of illustrations
(grayscale as well as colour) as ppt or xls
files. The resolution of the illustrations
should be 300 dpi or higher. If, together with
your accepted article, you submit usable colour
figures then Elsevier will ensure, at no
additional charge, that these figures will
appear in colour on the web (e.g., ScienceDirect
and other sites) regardless of whether or not
68
these illustrations are reproduced in colour in
the printed version. For colour reproduction in
print, you will receive information regarding
the costs from Elsevier after receipt of your
accepted article. For further information on the
preparation of electronic artwork and for a
complete list of acceptable file formats, please
see http://authors.elsevier.com/artwork.
Please note: Because of technical complications
which can arise by converting colour figures to
'grey scale' (for the printed version should you
not opt for colour in print) please submit in
addition, usable black and white prints
corresponding to all the colour illustrations.
When essential to the understanding of a paper,
figures may be reproduced in colour, at the
author's own expense. The price of single
printed full-colour page is EUR340,- exclusive
of sales tax. Two, three or four full-colour
pages in combination will cost EUR227,- per
additional page excluding sales tax.
US National Institutes of Health (NIH) voluntary
posting (" Public Access") policy
Elsevier facilitates author response to the NIH
voluntary posting request (referred to as the
NIH "Public Access Policy"; see
69
http://www.nih.gov/about/publicaccess/index.htm)
by posting the peer-reviewed author's manuscript
directly to PubMed Central on request from the
author, 12 months after formal publication. Upon
notification from Elsevier of acceptance, we
will ask you to confirm via e-mail (by e-mailing
us atNIHauthorrequest@elsevier.com) that your
work has received NIH funding and that you
intend to respond to the NIH policy request,
along with your NIH award number to facilitate
processing. Upon such confirmation, Elsevier
will submit to PubMed Central on your behalf a
version of your manuscript that will include
peer-review comments, for posting 12 months
after formal publication. This will ensure that
you will have responded fully to the NIH request
policy. There will be no need for you to post
your manuscript directly with PubMed Central,
and any such posting is prohibited.
Preparation of supplementary data. Elsevier now
accepts electronic supplementary material to
support and enhance your scientific research.
Supplementary files offer the author additional
possibilities to publish supporting
applications, movies, animation sequences,
high-resolution images, background datasets,
sound clips and more. Supplementary files
supplied will be published online alongside the
electronic version of your article in Elsevier
70
web products, including ScienceDirect:
http://www.sciencedirect.com. In order to ensure
that your submitted material is directly usable,
please ensure that data is provided in one of
our recommended file formats. Authors should
submit the material in electronic format
together with the article and supply a concise
and descriptive caption for each file. For more
detailed instructions please visit our Author
Gateway at http://authors.elsevier.com.
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