( PDF ) Avaliação da resposta imune in vitro induzaida por antígenos de Schistosoma Mansoni em indivíduos asmáticos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM IMUNOLOGIA

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE IN VITRO

INDUZIDA POR ANTÍGENOS DE SCHISTOSOMA

MANSONI EM INDIVÍDUOS ASMÁTICOS

LUCIANA SANTOS CARDOSO

Salvador – BA

2005

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Luciana Santos Cardoso

Avaliação da Resposta Imune in vitro Induzida por

Antígenos de Schistosoma mansoni em

Indivíduos Asmáticos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós graduação

em Imunologia, Instituto de Ciências da Saúde,

Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em Imunologia.

Professora Orientadora: Maria Ilma Andrade Santos Araujo

Salvador – Bahia

2005

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Ficha catalográfica

Universidade Federal da Bahia - Faculdade de Medicina - Biblioteca

Cardoso, Luciana Santos.

C268 Avaliação da resposta imune in vitro induzida por antígeno de

Schistosoma mansoni em indivíduos asmáticos. / Luciana Santos

Cardoso. − Salvador, 2006.

118 f. : il.

Orientadora: Profª. Maria Ilma Andrade Santos Araújo.

Dissertação (Mestre em Imunologia) − Instituto de Ciências

da Saúde da Universidade Federal da Bahia.

1. Schistosoma mansoni

. 2. Asma. 3. IL-10. 4. Antígenos.

Universidade Federal da Bahia II. Título.

CDU: 616.995.122:616.248(043.3)

iii

Dedico este trabalho a minha família pelo apoio e

compreensão ilimitados

E em particular a Professora Maria Ilma Araujo,

exemplo maior de simplicidade, serenidade

e sabedoria

AGRADECIMENTOS

A Deus,

A Profa. Maria Ilma Araujo, orientadora do meu trabalho, pela dedicação,

paciência e pelos ensinamentos a mim transmitidos,

Ao Dr. Edgar Carvalho pela sabedoria e exemplo com que conduz o grupo,

Ao Dr. Sérgio Costa Oliveira e Dr. Alfredo Miranda Góes pelo apoio tão

importantes no desenvolvimento deste trabalho,

A todos os participantes do nosso Grupo de Helmintíases e Alergia,

principalmente Ricardo, Profa. Leda, Cecília, Régis, Carol, Eduardo e a Charlton

Cley Barros Castro, pelo auxílio direto na realização deste trabalho,

Ao Grupo do Serviço de Imunologia, especialmente Olívia, Márcia, Andréa,

Silvane, Albert, Glória, Elbe, Lúcia e Dilma, pela disponibilidade e carinho com

que sempre me receberam,

Ao Grupo do Dr. Sérgio Oliveira da UFMG, Cristina, Fernanda, Lucimara, Michele

e especialmente Lucila, por terem me recebido tão bem e me ajudado bastante,

Aos professores e colegas Curso de Pós-Graduação em Imunologia pelo

crescimento ao longo desta caminhada,

A Dilcéia, pela paciência e disponibilidade, sempre tão presentes,

A Bibliotecária Delba Barros Rosa, pela elaboração da Ficha Catalográfica,

Aos Indivíduos participantes das pesquisas,

A minha família, pela energia e confiança a mim transmitidas.

“Só o conhecimento traz o poder.”

Freud

ÍNDICE

Lista de figuras .............................................................................................................. ix

Lista de tabelas ............................................................................................................ xii

Lista de siglas, abreviaturas e símbolos................................................................... xiii

Resumo.........................................................................................................................xiv

Abstract .........................................................................................................................xvi

1. Introdução....................................................................................................................1

2. Revisão de literatura...................................................................................................5

2.1 Resposta imune na atopia e na asma ................................................................5

2.2 Resposta imune na infecção pelo Schistosoma mansoni ..............................10

2.3 Antígenos candidatos à vacina para esquistossomose..................................13

2.4 A infecção por helmintos e alergia....................................................................17

2.5 Participação da IL-10 na resposta imune nas infecções por helmintos e na

alergia.........................................................................................................................19

3. Objetivos....................................................................................................................23

3.1 Objetivo geral ......................................................................................................23

3.2 Objetivos específicos..........................................................................................23

4. Metodologia...............................................................................................................24

4.1 Seleção dos indivíduos ......................................................................................24

4.2 Desenho do estudo e cálculo amostral.............................................................25

4.3 Critérios de inclusão ...........................................................................................26

vii

4.4 Critérios de exclusão ..........................................................................................27

4.5 Antígenos de S. mansoni usados no estudo....................................................28

4.5.1 Produção do antígeno purificado PIII a partir do SWAP..........................28

4.5.2 Expressão e purificação da proteína recombinente Sm22.6...................28

4.5.3 Expressão e purificação da proteína recombinente Sm14......................30

4.5.4 Expressão e purificação da proteína recombinante P24.........................31

4.5.5 Expressão e purificação da proteína recombinante Sm29......................32

4.5.6 Obtenção do Antígeno Solúvel do Verme Adulto (SWAP) e do Antígeno

Solúvel do Ovo (SEA) ...........................................................................................34

4.6 Avaliação laboratorial e clínica dos indivíduos recrutados nos grupos.........35

4.6.1 Exame parasitológico de fezes...................................................................35

4.6.2 Avaliação da resposta imune celular .........................................................35

4.7 Análise dos dados...............................................................................................37

5. Considerações éticas ...............................................................................................38

6. Resultados.................................................................................................................39

6.1 Concentracões de LPS encontradas nos antígenos de Schistososma

mansoni avliados no estudo.....................................................................................40

6.2 Produção de IL-10 por CMSP de indivíduos asmáticos infectados e não

infectados pelo S. mansoni e infectados não asmáticos estimuladas pelo LPS 41

6.3 Neutralização dos efeitos do LPS nas culturas estimuladas com os

antígenos recombinantes pelo uso da Polimixina B ..............................................42

6.2 Produção de Interleucina-10 por CMSP de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni ......................................................................................47

viii

6.3 Produção de interleucina-10 por CMSP de indivíduos asmáticos

cronicamente infectados pelo S. mansoni ..............................................................50

6.4 Produção de interleucina 10 por CMSP de asmáticos não infectados pelo S.

mansoni......................................................................................................................53

6.5 Cinética da produção de IL-10 por CMSP nos grupos estudados.................56

6.6 Produção de Interferon-γ, Interleucina-5 e Interleucina-13 por CMSP

estimuladas com os antígenos de S. mansoni.......................................................58

6.7 Efeito da adição de antígenos de S. mansoni sobre a produção de IL-10

induzida pelo Der p1 .................................................................................................61

7. Discussão ..................................................................................................................63

8. Sumário dos resultados............................................................................................71

9. Conclusões................................................................................................................71

10. Perspectivas de estudo ..........................................................................................72

11. Referências bibliográficas ......................................................................................73

12. Anexos .....................................................................................................................90

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Concentrações de IL-10 produzidas por CMSP de indivíduos asmáticos

infectados e não infectados pelo S. mansoni e infectados não asmáticos,

estimuladas pelo LPS em culturas de 48 horas. Teste de Kruskal-Wallis). ....41

Figura 2A. Efeito da adição de Sulfato de Polimixina B (PMB) (30µg/mL) em

CMSP de indivíduos cronicamente infectados pelo S. mansoni na produção

de TNF induzida pela estimulação com o LPS (0,15 ng/mL)............................43

Figura 2B. Efeito da adição de PMB (30µg/mL) em CMSP de indivíduos

cronicamente infectados pelo S. mansoni na produção de IL-10 induzida pela

estimulação com o LPS (0,15 ng/mL). ................................................................43

Figura 3A. Produção de TNF e IL-10 em CMSP de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com o antígeno recombinante

de S. mansoni Sm22.6 (10 µg/mL). Os dados referem-se a produção desta

citocina na ausência ou presença de Sulfato de Polimixina B (30 µg/mL) em

culturas de 6, 12, 24 e 48 horas. .........................................................................45

Figura 3B. Produção de TNF e IL-10 em CMSP de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com o antígeno recombinante

de S. mansoni Sm14 (10 µg/mL). Os dados referem-se a produção desta

citocina na ausência ou presença de Sulfato de Polimixina B (30 µg/mL) em

culturas de 6, 12, 24 e 48 horas. .........................................................................45

Figura 3C. Produção de TNF e IL-10 em CMSP de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com o antígeno recombinante

de S. mansoni P24 (10 µg/mL). Os dados referem-se a produção desta

citocina na ausência ou presença de Sulfato de Polimixina B (30 µg/mL) em

culturas de 6, 12, 24 e 48 horas. .........................................................................46

Figuras 4A, B e C. Níveis de IL-10 produzidos por células mononucleares de

sangue periférico de indivíduos cronicamente infectados pelo S. mansoni

estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni em culturas de 24, 48 e

72 horas, respectivamente (A IL-10 foi dosada em sobrenadante de culturas

utilizando-se a técnica de ELISA sanduíche). As concentrações são

expressas em pg/mL e os resultados em médias ± desvio padrão. ................49

Figuras 5A, B e C. Níveis de IL-10 produzidos por células mononucleares de

sangue periférico de indivíduos asmáticos cronicamente infectados pelo S.

mansoni estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni em culturas de

24, 48 e 72 horas, repectivamente. .....................................................................52

Figuras 6A, B e C. Níveis de IL-10 produzidos por células mononucleares de

sangue periférico de indivíduos asmáticos não infectados pelo S. mansoni

estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni em culturas de 24 horas

.................................................................................................................................55

Figura 7A. Cinética de produção de IL-10 por células de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com os antígenos de S.

mansoni avaliados neste estudo..........................................................................56

Figura 7B. Cinética de produção de IL-10 por células de indivíduos asmáticos

cronicamente infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com os

antígenos de S. mansoni avaliados neste estudo..............................................57

Figura 7C. Cinética de produção de IL-10 por células de indivíduos asmáticos não

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com os antígenos de S.

mansoni avaliados neste estudo..........................................................................57

Figura 8A, B e C. Níveis de IFN-γ (pg/mL) produzidos por CMSP de indivíduos

cronicamente infectados pelo S. mansoni, asmáticos ou não e asmáticos não

infectados, respectivamente, estimuladas in vitro com os antígenos de S.

mansoni em culturas de 72 horas (n=9). ............................................................59

Figura 9. Níveis de IL-13 (pg/mL) produzidos por CMSP de indivíduos asmáticos

não infectados pelo S. mansoni estimuladas in vitro com os antígenos PIII,

Sm22.6 e P24 de S. mansoni em culturas de 72 horas (n=7; Teste de

Kruskal-Wallis).......................................................................................................60

Figura 10A, B e C. Níveis de IL-10 em culturas de CMSP de asmáticos não

infectados estimuladas com Der p1 na presença ou ausência dos antígenos

PIII, Sm22.6 e P24, respectivamente. Culturas de 48 horas, n=7; p<0,05;

Teste pareado de Wilcoxon..................................................................................62

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Características demográficas e intensidade de infecção dos indivíduos

infectados com S. mansoni e asmáticos não infectados. .........................................39

Tabela 2. Concentrações de LPS nos antígenos recombinantes P24, Sm14,

Sm22.6, Sm29 e na proteína PIII do S. mansoni. A tabela mostra as

concentrações de LPS, em Unidades de Endotoxina/mL (EU/mL) e os valores

correspondentes em nanogramas/mL (ng/mL)..........................................................40

xiii

LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

BSA Fração V de albumina bovina

CD Molécula de superfície celular (“clusters of differentiation”)

CD14 Marcador de superfície de monócitos/macrófagos

CMSP Células mononucleares do sangue periférico

Der p 1 Alérgeno 1 de Dermatophagoides pteronyssinus

ELISA Do inglês “Enzime Like Immunosorbent Assay”

FPLC Do inglês “Fast Protein Liquid Cromatography”

IFN-γ Interferon-gama

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

IPTG Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo

LPS Lipopolissacarídeos

LB Lúria-Bertani

LBP Proteína Ligadora de LPS

MyD Marcador de Diferenciação Mielóide

PAMPs Padrão Molecular Associado aos Patógenos

PBS Tampão fosfato-salina

PMB Polimixina B

SEA Antígeno Solúvel do Ovo do S. mansoni

SWAP Antígeno Solúvel do Verme Adulto do S. mansoni

Th T auxiliador (“helper”)

TLR Do inglês “Toll-like receptor”

TNF Fator de Necrose Tumoral

VLA Do inglês “very late antigen”

xiv

RESUMO

Estudos vêm demonstrando diminuição da reatividade aos testes cutâneos para

alérgenos e menor gravidade da asma em indivíduos infectados por helmintos,

principalmente Schistosoma mansoni. A inibição da resposta inflamatória na asma

em indivíduos infectados pelo S. mansoni parece ser mediada pela IL-10, desde

que tem sido observada maior produção desta citocina por células de asmáticos

infectados pelo S. mansoni estimuladas com o antígeno 1 do Dermatophagoides

pteronyssinus (Der p1) quando comparado a asmáticos não infectados. A IL-10 é

capaz de inibir a produção de citocinas do tipo Th2 e a degranulação de

mastócitos e liberação de mediadores inflamatórios, fatores envolvidos na

patogênese das doenças alérgicas. O principal objetivo deste estudo foi avaliar a

capacidade dos antígenos de S. mansoni Sm22.6, Sm14, PIII, P24 e Sm29 de

estimular a produção de IL-10 in vitro, por células mononucleares de sangue

periférico de asmáticos infectados e não infectados pelo S. mansoni. Foram

também avaliadas as produções de IL-5, IL-13 e IFN-γ. Foi adicionado Sulfato de

Polimixina B às culturas estimuladas com os antígenos recombinantes para

bloquear a ação da endotoxina em induzir a síntese de citocinas, desde que as

proteínas recombinantes foram clonadas em Escherichia coli. As concentrações

das citocinas foram medidas nos sobrenadantes das culturas de células

utilizando-se a técnica ELISA sanduiche. Foi demonstrado que todos os antígenos

de S. mansoni avaliados neste estudo induziram a produção de IL-10 por células

de indivíduos infectados e de asmáticos não infectados. Nas culturas de 24 horas

de células de asmáticos não infectados, os antígenos P24 e Sm 29 induziram as

mais altas concentrações de IL-10 (828 ± 415 pg/mL e 891 ± 213 pg/mL,

respectivamente). Em todos os grupos avaliados e para todos os antígenos

usados, foi baixa a produção de IFN-γ (valores em torno de 100 pg/mL) e os

níveis de IL-5 foram abaixo do limite de detecção (15,6 pg/mL). A produção de IL-

13 induzida pelos antígenos Sm22.6, P24 e PIII foi avaliada no grupo de

asmáticos não infectados, e foram observadas concentrações de 68 ± 60 pg/mL,

55 ± 49 pg/mL e 81 ± 67 pg/mL, para os respectivos antígenos. A adição dos

antígenos de S. mansoni Sm22.6, P24 e PIII às culturas de asmáticos não

infectados estimuladas com o Der p1 resultou em aumento na produção de IL-10.

O fato dos antígenos de S. mansoni avaliados neste estudo terem induzido a

produção de IL-10 e baixas concentrações de IL-5, IL-13 e IFN-γ por células de

asmáticos não infectados sugere que os mesmos pode ser futuramente utilizados

como vacina para prevenir doenças alérgicas.

Palavras-chave: Asma, IL-10, PIII, P24, S. mansoni, Sm14, Sm22.6, Sm29.

xvi

ABSTRACT

Studies have shown an inhibition of skin prick test reaction to allergens and less

severe asthma in asthmatics infected with helminths, mainly Schistosoma

mansoni. The inhibition of the inflammatory response in asthma in individuals

infected with S. mansoni seems to be mediated by IL-10, since it has been

observed higher production of Dermatophagoides pteronyssinus antigen 1 (Der p1)

driven IL-10 by cells from asthmatics infected with S. mansoni when compared to

uninfected asthmatics. IL-10 is capable of inhibiting the production of Th2

cytokines and the release of inflammatory mediators by mast cells, factors involved

in the pathogenesis of allergic diseases. The main objective of this study was to

evaluate the capacity of the S. mansoni antigens rSm22.6, PIII, rP24, rSm14 and

rSm29 to stimulate IL-10 production in vitro by peripheral bloods mononuclear cells

of asthmatics infected or not with S. mansoni. The production of IL-5, IL-13 and

IFN-γ was also evaluated. The antigens used in this study are recombinant cloned

in E. coli, therefore Polimixin B was used in the cell cultures to block the endotoxin-

stimulated cytokine production. Cytokines were measured in the supernatants of

cultures using ELISA sanduich method. It was demonstrated that all of the S.

mansoni antigens used in this study induced IL-10 production in cells of infected

individuals and in uninfected asthmatics. In 24 hours cell cultures of uninfected

asthmatics the antigens P24 and Sm29 induced the highest levels of IL-10 (828 ±

415 pg/mL and 891 ± 213 pg/mL, respectively). In all groups evaluated and for all

antigens the production of IFN-γ (values around 100 pg/mL) and the levels of IL-5

were below the detection limit (15,6 pg/mL). The production of IL-13 induced by

Sm22.6, P24 and PIII were respectively, 68 ± 60 pg/mL, 55 ± 49 pg/mL and 81 ±

xvii

67 pg/mL. The addition of S. mansoni antigens Sm 22.6, P24 and PIII to the cell

culture of uninfected asthmatics stimulated with Der p1 resulted in an increase in

the levels of IL-10. The fact that S. mansoni antigens evaluated in this study

induced the production of IL-10 and low levels of IL-5, IL-13 and IFN-γ by cells of

uninfected asthmatic individuals suggests that these antigens can be used in the

future as a vaccine to prevent allergic diseases.

Key words: Asthma, IL-10, PIII, P24, S. mansoni, Sm14, Sm22.6, Sm29.

1. INTRODUÇÃO

Atualmente mais de 130 milhões de pessoas no mundo sofrem de asma e

este número vem aumentando, principalmente nos países desenvolvidos (Sears

1997; Sears 1998). A asma é uma inflamação crônica das vias aéreas, cuja

etiologia decorre da interação de fatores genéticos e ambientais. A patogênese da

asma está relacionada com a produção de citocinas do tipo T auxiliador (“helper”)

2 (Th2) a exemplo da Interleucina (IL) -4, IL-5 e IL-13 que, dentre outras funções,

são responsáveis pelo aumento na produção de IgE, eosinófilos, mastócitos e

basófilos. A seqüência fisiopatológica da asma é iniciada pela ativação dos

mastócitos em resposta a ligação do antígeno alergênico a IgE específica

presente na superície destas células. As citocinas produzidas pelos mastócitos

induzem o recrutamento de basófilos, eosinófilos e células Th2, resultando em

liberação de mediadores pró-inflamatórios, a exemplo das prostaglandinas,

leucotrienos, fator de ativação das plaquetas (PAF) e histamina por estas células

e consequente broncoconstricção com limitação do fluxo aéreo, edema e

produção de muco, podendo ainda levar a um infiltrado de células inflamatórias e

posteriormente ao dano tecidual, seguido de remodelamento das vias aéreas

(Davies e cols. 2003).

Em recém nascidos a população de linfócitos T do cordão umbilical tem

fenótipo Th2, semelhante ao observado em adultos atópicos. Nos primeiros

meses de vida há uma mudança para o fenótipo Th1, semelhante ao de adultos

não atópicos (Prescott e cols. 1998; Holt e cols. 1999). Supõe-se que haveria uma

predisposição natural para o desenvolvimento de doenças alérgicas no homem.

Estudos mostram que infecções pelo vírus A da hepatite, Toxoplasma gondii e

Helicobacter pylori reduzem em 60% o risco de atopia (Matricardi e cols. 2000),

sugerindo que estímulos ambientais como infecções virais e bacterianas seriam

responsáveis pelo equilíbrio imunológico, desviando o tipo de resposta para o

pólo Th1 e prevenindo as doenças atópicas. Esta é a chamada “Hipótese da

Higiene”, que sugere que o aumento da incidência de asma em países em

desenvolvimento teria como causa a melhora das condições de saneamento, a

redução das parasitoses, a diminuição da exposição a alérgenos e campanhas de

vacinação em massa (Strachan 1989; Strachan 2000; Yazdanbakhsh e cols.

2002).

Uma vez que respostas polarizadas do tipo Th1 e Th2 relacionam-se com a

patogênese de doenças de base imunológica, a prevenção destas doenças

poderia advir de mecanismos regulatórios da resposta imune que promovessem o

equilíbrio entre estas respostas.

Baseando-se no princípio de que a ausência de estímulo antigênico para o

padrão de resposta Th1 resultaria na polarização da resposta para o tipo Th2 e

conseqüente aumento na prevalência das doenças alérgicas, seria esperado que

em países desenvolvidos onde é elevada a prevalência de alergia, houvesse uma

baixa prevalência de doenças auto-imunes mediadas pela resposta do tipo Th1.

Entretanto, estudos mostram que tem havido nestes países aumento na

prevalência não apenas de doenças alérgicas, mas de doenças auto-imunes a

exemplo da esclerose múltipla (Rosati e cols. 1988; Poser e cols. 1989), Diabetes

melitus tipo I ( EURODIAB ACE 2000) e a doença de Crohn (Elliott e cols. 2000).

Estes dados de que doenças do “tipo Th1” podem ocorrer concomitantemente

com as do “tipo Th2” vão de encontro à hipótese de que uma contra-regulação da

resposta imune, dirigindo-a para um dos pólos Th1 ou Th2, seja responsável pelo

aumento da freqüência destas doenças.

Estudos recentes sugerem que o equilíbrio da resposta imune e prevenção

das doenças de base imunológica decorre da indução de mecanismos

regulatórios, a exemplo da geração de células T regulatórias, cuja modulação se

processa diretamente, ou via produção de citocinas regulatórias como a IL-10

(Asano e cols. 1996; Francis e cols. 2003).

A exposição crônica a antígenos parasitários, particularmente do

Schistosoma, pode levar ao desenvolvimento de mecanismos regulatórios e

prevenção de doenças alérgicas (van den Biggelaar e cols. 2000; Araujo e cols.

2004; Yazdanbakhsh e cols. 2001) e auto-imunes (Fiorentino e cols. 1989; Del

Prete e cols. 1993; Cooke e cols. 1999; La Flamme e cols. 2003).

Desta forma, a nossa hipótese é de que mecanismos reguladores,

desenvolvidos durante a infecção crônica pelo S. mansoni, a exemplo da

produção da IL-10, sejam capazes de modular a resposta a aeroalérgenos,

prevenindo a reação de hipersensibilidade imediata e melhorando o curso clínico

da asma.

O papel modulador da IL-10 é predominantemente enfatizado na resposta

Th1, mas hoje sabe-se que esta citocina possui também a capacidade de modular

a resposta do tipo Th2 (Fiorentino e cols. 1989; Del Prete e cols. 1993; Oh e cols.

2002; Araujo e cols. 2004) podendo, portanto, representar um dos mecanismos de

modulação da resposta nas doenças alérgicas.

A hipótese de que indivíduos infectados por S. mansoni desenvolvem

mecanismos regulatórios de resposta, no sentido de minimizar o dano tecidual

provocado pelo parasita, merece ser avaliada pela possibilidade da identificação

de antígenos do parasita capazes de exercer esta modulação (Yazdanbaksh e

cols. 2002).

Neste trabalho avaliamos as proteínas recombinantes do S. mansoni,

Sm22.6, Sm14, P24, Sm29 e o antígeno PIII do verme adulto, quanto à

capacidade de indução da síntese de IL-10 em asmáticos não infectados por

helmintos.

A identificação de antígenos de S. mansoni com capacidade para modular a

resposta imune inflamatória observada nas alergias poderá resultar no

desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas destas doenças.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Resposta imune na atopia e na asma

A atopia é o termo utilizado para descrever uma condição hereditária que

predispõe o indivíduo a doenças alérgicas, a exemplo da asma, rinite e dermatite

atópica (Sears e cols. 1997; Strachan e cols. 2000). O diagnóstico é feito pela

positividade a pelo menos um alérgeno no teste cutâneo de hipersensibilidade

imediata e pela presença, no soro ou plasma, de IgE específica (Kay 2000).

Dentre as doenças atópicas a asma é a que causa maior morbi-mortalidade

(Pearce e cols. 2000). Ela é definida como uma doença inflamatória crônica

caracterizada por hiperresponsividade (HR) brônquica e por limitação variável do

fluxo aéreo, reversível espontaneamente ou com tratamento, manifestando-se

clinicamente por episódios recorrentes de sibilância, dispnéia, aperto no peito e

tosse (III Consenso Brasileiro no Manejo da Asma 2002).

A prevalência mundial desta doença varia de 2,1% na Indonésia a 32,2%, na

Inglaterra (ISAAC, 1998). No Brasil a prevalência de asma é de 23,3% e na

cidade de Salvador é de 27%, onde é considerada a terceira causa de

hospitalização pelo Sistema único de Saúde (III Consenso Brasileiro no Manejo

da Asma 2002).

A asma resulta da interação entre predisposição genética e fatores

ambientais como a exposição a antígenos da poeira domiciliar, a exemplo de

ácaros, fungos e baratas, além da exposição a poluentes, mudanças climáticas

(frio), fumos, exercício físico e estresse emocional (Busse e cols. 2001; Kumar

2001).

A imunopatologia das doenças atópicas, incluindo a asma, está ligada a uma

exacerbação da resposta do tipo Th2, com produção principamente de IL-4, IL-5 e

IL-13. A IL-4 promove a diferenciação de células T para o subtipo Th2 (Mosmann

& Coffman 1989). A IL-4 e a IL-13 induzem e mantêm a troca de classe de

imunoglobulina no linfócito B para o isotipo IgE. A IL-4 promove a expressão do

receptor de alta afinidade para IgE (FcεRI), na superfície dos mastócitos e

basófilos, e de baixa afinidade (FcεRIIb) na superfície das células B ativadas,

monócitos e macrófagos (Yssel e cols. 1993). A IL-4 induz a expressão de

moléculas de adesão vascular nos eosinófilos e basófilos, além da produção de

quimiocinas. Isto facilita a migração de células inflamatórias da circulação para a

lâmina própria, o epitélio e lúmen das vias aéreas (Zhu e cols. 1999). A IL-5, junto

a IL-3 e ao GM-CSF, promovem a diferenciação de eosinófilos, a partir de

precussores mielóides, além de atuar na ativação desta célula. O eosinófilo

ativado expressa moléculas na superfície, como a E-selectina e o VLA-4, que

estimulam a quimiotaxia destas células pela ligação a receptores no endotélio

vascular. (Foster e cols. 1996; Holt e cols. 1999). A IL-4, que é também produzida

por mastócitos ativados, é um fator de diferenciação para células Th2,

perpetuando o processo inflamatório (Yssel e cols. 1993).

Ao primeiro contato com o alérgeno a resposta imune é desviada para o tipo

Th2, com produção de IgE específica. Esta imunoglobulina liga-se a receptores de

alta afinidade nos mastócitos. Contatos posteriores com o alérgeno resultam em

interação do mesmo com as moléculas de IgE ligadas aos mastócitos, ocorrendo

degranulação destas células e liberação dos mediadores inflamatórios como a

histamina, prostaglandinas e leucotrienos (Platts-Mills e cols. 1996). Esta fase se

caracteriza pela ativação de terminações nervosas vagais com produção de

neurotransmissores (acetilcolina, substância P, neurocinina A) que vão resultar

em broncoconstricção, vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, com

exsudação de plasma, hipersecreção de muco e inflamação. Há uma produção de

citocinas do tipo 2 também por mastócitos, eosinófilos e basófilos, e de

quimiocinas como a eotaxina, que irão recrutar mais células, perpetuando o

processo inflamatório. Estes eventos iniciais da fase aguda da asma iniciam-se

aproximadamente 10 minutos após o contato com o alérgeno e duram cerca de 2

horas.

A fase tardia inicia-se 2 a 4 horas após o contato com o alérgeno e tem uma

duração média de 24 horas. Esta fase se caracteriza pela quimiotaxia de

neutrófilos, monócitos e linfócitos, aumentanto da liberação de mediadores

inflamatórios, como o TNF (Ferreira 2004). Segue-se a degeneração celular, com

ruptura do epitélio ciliado, descamação para o lúmem, juntamente com o muco,

seguido de remodelamento brônquico e fibrose subepitelial, com depósito

intersticial de colágeno na lâmina reticular por células endoteliais e

miofibroblastos. Com o tempo este processo pode levar a um aumento do

trabalho respiratório e limitação do fluxo aéreo, causando a fadiga e a falência

respiratória progressiva podendo levar ao óbito por asma (III Consenso Brasileiro

no Manejo da Asma 2002).

Mesmo a patogênese da asma sendo relacionada ao aumento da resposta

do tipo Th2, citocinas do tipo Th1 também podem estar envolvidas, resultando em

agravamento do quadro (Smart e cols. 2002; Cho e cols. 2005). Em modelo

murino de asma alérgica, a administração de células Th1 produtoras de IFN-γ

causa uma intensa inflamação neutrofílica das vias aéreas, reforçando a idéia de

que a regulação do sistema imune nas doenças inflamatórias não resulta de um

simples desequilíbrio entre as subpopulações de células Th1 e Th2 (Hansen e

cols. 1999; Randolph e cols. 1999).

Como a patogenia da asma está principalmente associada a uma falta de

regulação da resposta imune, a indução de mecanismos modulatórios da resposta

exacerbada poderão conter ou minimizar a patogenicidade associada a esta

doença (Kay 2000).

As medidas de controle da asma baseiam-se no uso de medicamentos com

propriedades broncodilatadoras, a exemplo dos β2 adrenérgicos e

antiinflamatórias, como os corticosteróides. É também necessário o

acompanhamento periódico do paciente para adequação da posologia e

dosagens, uma vez que os episódios de asma são na sua maioria intercorrentes e

o uso constante, nos casos menos graves, não é recomendável, além dos

encargos financeiros e dificuldades de acesso da maioria da população aos

serviços de saúde.

Outra opção seria a realização da imunoterapia específica para o alérgeno,

pela técnica da dessensibilização, onde são administrados por via subcutânea

extratos de alérgenos purificados e padronizados, com o objetivo de modificar a

resposta imune ao futuro contato com o alérgeno, reduzindo os sintomas. Este

procedimento proporciona melhora ao longo prazo dos sintomas. É indicado na

asma atópica, demonstrada por IgE específica aumentada ou testes cutâneos de

hipersensibilidade imediata positivos. Este procedimento parece não beneficiar

pacientes com sensibilização múltipla e não está indicado em pacientes com

asma leve e que respondem bem a terapia farmacológica. A qualidade e

confiabilidade dos extratos disponíveis são críticas para a eficácia desta

terapêutica.

Medidas profiláticas, como forrar colchões e travesseiros com plásticos

impermeáveis aos ácaros, retirar tapetes, carpetes e cortinas de pano dos

quartos, não criar animais e evitar o fumo, embora sejam importantes, por si só

não controlam a exacerbação da doença.

A necessidade de desenvolver vacinas com potencial imunomodulatório

capazes de conter a exacerbação do processo inflamatório envolvido na

patogênese da asma e que não interferissem na co-morbidade de outras

patologias, justificaria pesquisas que visassem à identificação e caracterização de

antígenos com propriedades regulatórias da resposta imune.

2.2 Resposta imune na infecção pelo Schistosoma mansoni

A infecção pelo Schistosoma mansoni ocorre pela penetração das cercárias

na pele. As cercárias então perdem a cauda neste processo, transformam-se em

esquistossômulos e estes ganham a circulação, realizando o ciclo pulmonar. Em

seguida, migram para o sistema porta, transformando-se neste trajeto em vermes

adultos, machos e fêmeas. Os vermes adultos vivem no sistema porto-

mesentérico, põem os ovos nos capilares intestinais e estes aparecem nas fezes

após passar pelos tecidos da mucosa intestinal, principalmente na região

colônica. Estes ovos podem ainda ganhar a circulação porto-hepática e

alcançarem os espaços porta, levando à formação de um granuloma, que é

caracterizado pela reação inflamatória a antígenos do ovo, seguida da produção

de colágeno, podendo evoluir para um quadro de fibrose hepática. A depender do

grau da fibrose pode haver hipertensão portal, varizes esofagianas e sangramento

intestinal, quadro observado na forma hepato-esplênica da doença (Wynn e cols.

1995).

Seis a oito semanas após a primeira exposição inicia-se a fase aguda da

doença, conhecida como síndrome toxêmica (Lambertucci 1993; Rabello e cols.

1997; De Jesus e cols. 2002). Esta fase é caracterizada principalmente por febre,

astenia, acentuada perda de peso, associadas a elevação dos níveis de citocinas

pró inflamatórias (TNF, IL-1, IL-6). Dispnéia e dor torácicas em decorrência da

pneumonite e pericardite, relacionadas com níveis elevados de complexos imunes

circulantes e reação de hipersensibilidade tipo III (Galvao-Castro e cols. 1981),

têm sido descritas. Adicionalmente, dor abdominal e diarréia são freqüentes nesta

fase e coincidem com o início da postura dos ovos, causando destruições focais

na mucosa e sub-mucosa intestinais. A despeito da elevação dos níveis de IgE

nesta fase, não há evidência de broncoespasmo e não há associação dos níveis

de IgE com manifestações respiratórias. Esta fase aguda é raramente encontrada

em pessoas residentes em áreas endêmicas, sendo mais comum em indivíduos

expostos pela primeira vez à infecção. Este achado sugere que a modulação da

resposta imune que ocorre após a fase aguda previne o aparecimento destas

manifestações nos indivíduos previamente infectados (Lambertucci 1993; Rabello

1995; Wynn e cols. 1998).

A resposta imune na fase aguda da esquistossomose é do tipo Th1, com

produção de IFN-γ e também de citocinas pró-inflamatórias, a exemplo do TNF,

IL-6 e IL-1 (Wynn e cols. 1998; Montenegro e cols. 1999; De Jesus e cols. 2002).

Na fase crônica ocorre uma modulação da resposta inflamatória e um desvio da

resposta para o tipo Th2, caracterizada pela produção de IL-4, IL-5 e IL-10, com

baixos níveis de IFN-γ (Gazzinelli e cols. 1992; Williams e cols. 1994; Araujo e

cols. 1996; Finkelman e cols. 1997; Mwatha e cols. 1998). Esta mudança no

padrão de resposta tem sido relacionada à produção de IL-10 induzida por

antígenos do ovo, desde que coincide com a oviposição (Montenegro e cols.

1999; Silveira e cols. 2004).

A modulação da resposta imune que ocorre na fase crônica parece ser

responsável pela limitação das manifestações clínicas da forma aguda, desde que

a melhora ocorre mesmo na ausência de tratamento da parasitose (Pearce 2005).

Na fase crônica da esquistossomose são descritas três formas clínicas bem

caracterizadas: as formas mais brandas da doença, chamadas intestinal e hepato-

intestinal, e a forma mais grave ou hepato-esplênica, observada em 9,8% dos

casos (Bina e cols. 2003).

Alguns fatores parecem estar envolvidos na patogênese da esquistossomose

e evolução para as formas graves da doença, a exemplo do tipo de HLA (Secor e

cols. 1996), pertencer a raça branca (Prata 1988; Tavares-Neto e cols. 1990) , a

alta carga parasitária (Sleigh e cols. 1985) e a resposta imune do hospedeiro

(Wynn e cols. 1995).

Estudos têm sido realizados para elucidar a resposta imune envolvida na

formação do granuloma e da fibrose hepática, tanto em modelo experimental,

como em modelo de modulação do granuloma in vitro e com biópsias de tecido

(Wynn e cols. 1995; Falcao e cols. 1998; Gustavson e cols. 2002). Estes estudos

vêm demonstrando o envolvimento da IL-4, IL-5 e IL-13 na formação do

granuloma e evolução para fibrose hepática (Chiaramonte e cols. 1999; de Jesus

e cols. 2000; Chiaramonte e cols. 2001; De Jesus e cols. 2004). As quimiocinas

também parecem participar da patogênese da esquistossomose. A MIP-1α,

RANTES e a eotaxina estão diretamente relacionadas com o recrutamento de

eosinófilos para o infiltrado inflamatório. Em modelo de modulação do granuloma

in vitro, Falcão e colaboradores observaram uma correlação positiva entre

gravidade da doença com níveis elevados de MIP-1α (Falcao e cols. 2002).

A resposta do tipo Th2, que, como descrito acima, pode estar envolvida com

a patogenia da esquistossomose, tem sido também relacionada com proteção.

Tem sido demonstrado que níveis elevados de IgE correlacionam-se com

proteção contra a re-infecção (Jarrett e cols. 1982; Rihet e cols. 1991; Dunne e

cols. 1992; Hussain e cols. 1992). Em modelo experimental, a resposta do tipo

Th1 com produção de IFN-γ também tem sido associada a proteção contra a

infecção, sendo uma resposta equilibrada do tipo Th1 e Th2 sugerida como

protetora (Brito e cols. 2000).

2.3 Antígenos candidatos à vacina para esquistossomose

A infecção pelo S. mansoni atinge 200 milhões de pessoas na África,

América do Sul e Ásia (Iarotski e cols. 1981; Chitsulo e cols. 2004). A gravidade

da doença em muitos casos está ligada à intensidade de infecção. O tratamento

da esquistossomose controla em parte a morbidade da doença, entretanto a

transmissão permanece inalterada (Dunne e cols. 1992; Butterworth e cols. 1994;

Dunne e cols. 1995; Bina 1997). A interrupção da transmissão da

esquistossomose a longo prazo poderá advir com o desenvolvimento de uma

vacina protetora que seja capaz de controlar a reinfecção e reduzir a prevalência

da doença (Bergquist e cols. 1998; Capron e cols. 1987).

Em modelo experimental, a imunidade parcial pode ser induzida por

vacinação com cercária irradiada ou antígenos específicos (James 1987;

Bergquist 1990; Capron e cols. 1995; De Jesus e cols. 2000). Têm sido

documentados casos de resistência natural a reinfecção em indivíduos vivendo

em áreas endêmicas (Capron e cols. 1987; Hagan e cols. 1991; Dessein e cols.

1992). A produção de IgE, IgG1 e IFN-γ têm sido associados com a resistência a

reinfecção (Hagan e cols. 1991; Rihet e cols. 1991) , sugerindo a participação de

mecanismos humorais e celulares no processo (De Jesus e cols. 2000).

Dentre os antígenos que vem sendo utilizados na tentativa de controlar a

infecção pelo Schistosoma encontram-se a Glutationa-S Transferase (P28/GST),

Paramiosina (Sm97), Triose Fosfato Isomerase (TPI), Sm23 e IrV-5, que induzem

proteção parcial contra a reinfecção (Bergquist 1998; Al-Sherbiny e cols. 2003).

Outros antígenos vacinais descritos na literatura, a exemplo do Sm22.6,

Sm14, P24 e PIII, possuem a propriedade de induzirem a produção de IL-10,

citocina com propriedade antiinflamatória na asma (Akdis e cols., 1998; Akdis e

cols. 2001).

O antígeno PIII é obtido a partir do antígeno solúvel do verme adulto (SWAP)

por cromatografia de troca iônica em coluna de Q-sepharose - Sistema de FPLC

(Hirsch e cols. 1996). Estudos demonstraram modulação do granuloma em

camundongos imunizados com PIII e em modelo de indução da formação do

granuloma in vitro (Hirsch e cols. 1996; Hirsch e cols. 1997; Gustavson e cols.

1998; Gustavson e cols. 2002; Zouain e cols. 2004). Avaliando-se a produção de

citocinas e outras moléculas por células mononucleares de sangue periférico de

indivíduos com esquistossomose crônica, observou-se a produção de IL-10 e NO

em culturas estimuladas pelo PIII (Oliveira e cols. 1999). Os mecanismos

provavelmente envolvidos na modulação do granuloma esquistossomótico por

este antígeno são: diminuição da proliferação celular in vitro, estimulação da

produção de IL-10, bem como a diminuição da percentagem de células CD4

expressando CD28 e aumento de células com o fenótipo CD8

expressando

CTLA-4. Também foi observado um aumento da percentagem de células CD33

expressando CD86 (B7.2) (Zouain e cols. 2004).

O antígeno P24 nativo é uma fração do PIII. A forma aqui descrita é a

recombinante. Os estudos acerca destes antígenos, P24 e PIII demonstraram

redução do tamanho do granuloma em camundongos e habilidade para induzir a

produção de IL-10 (Zouain e cols. 2000; Zouain e cols. 2002), enquanto não

induzem a produção de IL-5 (Zouain e cols. 2002; Gustavson e cols. 2002).

A proteína Sm22.6 é uma proteína solúvel do tegumento, presente em todos

os estágios do ciclo do S. mansoni, exceto o ovo (Jeffs e cols. 1991). Estudos

com esta proteína mostram uma considerável homologia entre os antígenos de

22.6 kDa do S. mansoni, S. haematobuim e S. japonicum (Fitzsimmons e cols.,

2004). É considerada a principal alvo da resposta de IgE em modelos

experimental e humano de infecção pelo S. mansoni (Santiago e cols., 1998; Li e

cols. 2000; Fitzsimmons e cols. 2004). Esta produção de IgE específica para o

Sm22.6 estaria relacionada a proteção contra a re-infecção pelo Schistosoma

(Dunne e cols. 1992; Webster e cols. 1997). Estudos recentes em modelo

experimental de imunização com a rSm22.6 mostram um perfil de resposta celular

mista Th1/Th2, com indução de IFN-γ e IL-4, como também a produção de IL-10

(Pacifico 2005).

A proteína Sm14 está presente no esquistossômulo, no verme adulto e no

ovo. É uma proteína com homologia com membros das proteínas ligadoras de

lipídeos (Brito e cols. 2002). Ela tem papel central na captação, transporte e

compartimentalização de lipídeos (Moser e cols. 1991). Tendler e colaboradores

mostraram que existe 91% de homologia entre a Sm14 do S. japonicum e S.

mansoni (Tendler e cols. 1996).

Estudos em modelo experimental mostraram que a vacinação de

camundongos com Sm14 protege parcialmente contra a infecção pelo S. mansoni

e Fasciola hepatica. A antigenicidade está relacionada a epítopos descontínuos

na região c-terminal. Devido a grande homologia entre a Sm14 e Fh15 de

Fasciola hepatica, esta proteína vem sendo estudada para o possível uso como

vacina, tanto na proteção contra a infecção pelo S. mansoni com pela F. hepatica

(Tendler e cols. 1996).

A Sm14 induz a produção de IFN-γ e TNF in vitro em indivíduos resistentes

naturais, residentes em áreas endêmicas, e estimula a síntese de IL-10 em

indivíduos infectados pelo S. mansoni (Brito e cols. 2000; Al-Sherbiny e cols.

2003).

A proteína Sm29 do S. mansoni foi uma proteína recentemente identificada

por pesquisadores do Projeto Rede Genoma de Minas Gerais. Sabe-se que a

forma nativa é uma glicoproteína de membrana do S. mansoni, presente no

esquitossômulo e no verme adulto (dado não publicado). Os estudos sobre a

resposta imune desenvolvida por esta proteína, tanto em modelos experimentais

quanto em indivíduos infectados pelo S. mansoni, estão em andamento.

O estudo dos mecanismos envolvidos na estimulação do sistema imune do

hospedeiro pelas proteínas Sm22.6, Sm 14, PIII, P24 e Sm29, além de propiciar o

desenvolvimento de vacinas contra a infecção pelo S. mansoni, pode permitir o

uso destas proteínas como vacinas contra doenças alérgicas, a exemplo da

asma, uma vez que são potencialmente indutores de IL-10.

2.4 A infecção por helmintos e alergia

A prevalência de doenças alérgicas tem aumentado nas últimas duas

décadas. O “International Study for Asthma and Allergy in Childhood” (ISAAC) e o

“European Community Health Respiratory Survey” (ECHRS) mostraram um

aumento na prevalência de asma e rinite em países ocidentais industrializados,

quando comparados com países em desenvolvimento (ISAAC 1998; Pearce e

cols. 2000).

Fatores ambientais, a exemplo de precárias condições sanitárias e de

higiene, resultam em alta prevalência de infecções na infância e isso tem sido

implicado na proteção contra o desenvolvimento de doenças alérgicas. Esta é a

chamada “Hipótese da Higiene”, onde agentes infecciosos são capazes de

modular a resposta imune, prevenindo o desenvolvimento de alergias (Strachan

1989; Yazdanbakhsh e cols. 2002).

Muitos trabalhos têm documentado uma associação inversa entre

alergia/atopia e infecção por helmintos. Lynch e colaboradores (1993), estudando

crianças de uma área endêmica em ascaridíase, observaram que estas

apresentavam uma menor resposta aos testes cutâneos de hipersensibilidade

imediata para aeroalérgenos e que o tratamento com anti-helmínticos resultou em

aumento da positividade aos testes de alergia, com elevação dos níveis de IgE

específica para antígenos da poeira domiciliar (Lynch e cols. 1993).

Em Caatinga do Moura, no Estado da Bahia, área endêmica em

esquistossomose, foi observada a existência de uma associação inversa entre a

resposta aos testes cutâneos de leitura imediata com aeroalérgenos e carga

parasitária de S. mansoni (Araujo e cols. 2000). Medeiros e colaboradores (2003),

estudando asmáticos infectados pelo S. mansoni, residentes em área endêmica

em esquistossomose, comparando com asmáticos não infectados, observaram

menor gravidade da asma no grupo de indivíduos infectados (Medeiros e cols.

2003).

Vários fatores podem explicar a menor freqüência de positividade aos testes

cutâneos de hipersensibilidade imediata com aeroalérgenos em indivíduos

infectados por helmintos, tais como: a grande produção de IgE policlonal, altas

concentrações de IgG4 antígeno-específica, redução de IgE específica para o

alérgeno e aumento na produção de células e moléculas regulatórias da resposta

imune (Hussain e cols. 1992; Araujo e cols. 1996; Malaquias e cols. 1997; Lynch e

cols. 1998; Weiss 2000). A avaliação prospectiva de indivíduos asmáticos

residentes em três diferentes áreas no Estado da Bahia, uma delas endêmica em

S. mansoni (Caatinga do Moura), não mostrou diferenças estatisticamente

significantes nos níveis de IgE total e específica para aeroalérgenos (Medeiros e

cols. 2003). A possibilidade de que uma grande produção de IgE devido à

ativação policlonal bloqueasse os receptores de IgE presentes em mastócitos não

encontrou suporte em estudos que mostraram que basófilos de pacientes

asmáticos infectados pelo S. mansoni degranulam quando estimulados com o

antígeno 1 do ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Der p1) in vitro (Medeiros

e cols. 2003).

Diante desses dados, a hipótese mais aceita recentemente é a indução de

mecanismos modulatórios da resposta imune envolvendo células regulatórias, a

exemplo das células Tr1 e células CD4

CD25

, e citocinas produzidas por estas

células, como a IL-10 (Yazdanbakhsh e cols. 2001; van den Biggelaar e cols.

2001).

2.5 Participação da IL-10 na resposta imune nas infecções por helmintos e

na alergia

Inicialmente classificada como uma citocina do tipo Th2, a Interleucina-10 foi

descrita por Fiorentino e colaboradores (Fiorentino e cols. 1989), sendo

posteriormente considerada a principal citocina regulatória da resposta

inflamatória (Akdis e cols. 2001). A IL-10 é produzida por uma variedade de

células da resposta imune como macrófagos, linfócitos TCD4

, TCD8

TCD4

CD25

, linfócitos B, células dendríticas e células NK. As principais funções

promovidas por esta citocina estão relacionadas a sua atividade inibitória sobre a

ativação da célula T, a produção de IgE, o recrutamento de eosinófilos e a

ativação de macrófagos. Agindo nos macrófagos, modula sua atividade

antimicrobiana, inibe a atividade co-estimulatória e a produção de citocinas pró-

inflamatórias. A IL-10 também inibe a diferenciação de células dendríticas e

suprime a produção de quimiocinas inflamatórias e citocinas do tipo Th1 e Th2 em

alguns modelos (Sher e cols. 1991; Del Prete e cols. 1993; Araujo e cols, 2003).

Dados recentes mostram o papel desta citocina na inibição da liberação de

histamina pelos mastócitos (Royer e cols. 2001).

Em virtude de antígenos de S. mansoni serem capazes de induzir a

produção de IL-10 (Araujo e cols. 1996) in vitro, grande interesse têm surgido em

avaliar a capacidade da infecção pelo S. mansoni em atenuar as doenças auto-

imunes, doenças inflamatórias crônicas e doenças alérgicas em modelos

experimentais. A prevenção do diabetes tipo I em camundongos não obesos foi

observada na infecção pelo S. mansoni ou pela injeção dos ovos do helminto. A

prevenção da doença pode ser resultado da interação de moléculas derivadas do

parasita com mecanismos do sistema imune inato do hospedeiro (Zaccone e cols.

2003).

Estudos mostraram ainda que a infecção pelo S. mansoni pode interferir na

resposta imune para outros antígenos não relacionados, como visto no trabalho

de SABIN e colaboradores (1996), onde indivíduos infectados pelo S. mansoni

produzem níveis elevados de IL-4 e baixos de IFN-γ em resposta a vacinação pelo

toxóide tetânico, ao passo que nos indivíduos não infectados, há produção

principalmente de IFN-γ em resposta à vacinação (Sabin e cols. 1996).

Os mecanismos responsáveis por esse fenômeno ainda não estão bem

elucidados, contudo sabe-se que este efeito modulador não depende do parasita

vivo, haja visto que antígenos oriundos desses patógenos possuem essa mesma

propriedade moduladora. Porém, até o momento, apenas extratos antigênicos

foram descritos com essa característica, tornando-se imperativo a identificação

dessas moléculas (Deehan e cols. 1997; Faquim-Mauro e cols. 1998; Macedo e

cols. 1998). O efeito imunossupresor das infecções por helmintos pode ser

transferido ao feto, in utero, sendo demonstrado que crianças nascidas de mães

infectadas com filariose ou esquistossomose respondem pobremente à vacinação

com BCG (Malhotra e cols. 1999). Existe na literatura a documentação de que

antígenos de S. mansoni são capazes de induzir a produção de IL-10 (Velupillai e

cols. 2000).

A resposta imune nas alergias assemelha-se a àquela envolvida na

patogênese das helmintíases, sendo também do tipo Th2. A diferença básica

entre estas respostas é que nas infecções por helmintos, particularmente S.

mansoni, a IL-10 é produzida em altos níveis (Araujo e cols. 1996) enquanto que

na asma esta citocina não é produzida, ou está presente em pequenas

concentrações (Borish e cols. 1996; Lim e cols. 2004).

Células mononucleares de sangue periférico de asmáticos produzem menos

IL-10 em resposta a endotoxina quando comparadas a controles normais (Borish

e cols. 1996). Têm sido encontrados polimorfismos na região do promotor de IL-

10 em indivíduos asmáticos, sendo que o haplótipo GCC, associado com baixa

produção de IL-10, é encontrado em pacientes com asma grave (Lim e cols.

1998).

A IL-10 inibe a ativação da célula T (Akdis e cols. 2001; Akdis e cols. 2001),

a produção de IgE (Royer e cols. 2001), o recrutamento de eosinófilos (Zuany-

Amorim e cols. 1996) e outros aspectos da inflamação alérgica, a exemplo da

inibição da liberação de histamina pelos mastócitos (Royer e cols. 2001). A IL-10

também inibe a produção de citocinas inflamatórias pelos macrófagos alveolares

(Lim e cols. 2004).

Altos níveis de IL-10 foram encontrados em indivíduos que respondem ao

tratamento com imunoterapia específica utilizando alérgenos, reforçando o papel

protetor desta citocina nas alergias respiratórias (Akdis e cols. 1998).

Em asmáticos infectados pelo S. mansoni foi demonstrado uma menor

produção de IL-4 e IL-5, e mais alta produção de IL-10 quando comparado a

asmáticos não infectados, o que sugere a infecção pelo S. mansoni modula a

resposta inflamatória do tipo Th2 na asma. Esta modulação parece ser, pelo

menos em parte, mediada pela IL-10, desde que a adição desta citocina às

culturas de células de asmáticos não infectados resultou em diminuição da

produção de IL-5 (Araujo e cols. 2004).

Deste modo, a hipótese a ser testada neste estudo é a de que os antígenos

de S. mansoni Sm22.6, Sm14, PIII, P24 e Sm29 são capazes de induzir a

produção de IL-10 por células de asmáticos, constituindo portanto possíveis

imunomoduladores a serem utilizados na imunoterapia das doenças alérgicas,

particularmente da asma.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar a capacidade de antígenos do Schistosoma mansoni em induzirem a

produção de IL-10 in vitro por células mononucleares de sangue periférico de

indivíduos asmáticos.

3.2 Objetivos específicos

1) Avaliar a capacidade dos antígenos de S. mansoni Sm22.6, Sm14, PIII,

P24 e Sm29 de induzirem a produção de IL-10 in vitro por células de indivíduos

asmáticos não infectados e comparar com indivíduos infectados, asmáticos e não

asmáticos;

2) Avaliar as concentrações de citocinas do tipo Th2 (IL-5 e IL13) e Th1

(IFN-) em culturas estimuladas com os referidos antígenos de S. mansoni em

asmáticos e em indivíduos infectados pelo S. mansoni;

3) Avaliar a capacidade dos referidos antígenos de S. mansoni em induzirem

a produção de IL-10 por células de asmáticos não infectados estimuladas com o

antígeno 1 do Dermatophagoides pteronyssinus (Der p1).

4. METODOLOGIA

4.1 Seleção dos indivíduos

Neste estudo foram avaliados indivíduos infectados pelo S. mansoni e por

outros helmintos, residentes no município do Conde, Bahia, localizado ao norte, a

300 km de Salvador. Esta localidade compreende cinco comunidades, totalizando

cerca de 1.500 habitantes. As condições sanitárias da região são precárias,

estando os moradores sob alto risco de infecções parasitárias. A principal fonte de

renda da população é a pesca e a água dos rios é também utilizada para banho,

lavagem de roupas e utensílios, além do lazer. O acesso da população a Serviços

de Saúde, até o início deste estudo, era difícil e não havia relatos de tratamentos

prévios com anti-helmínticos.

Em 2001 foram avaliados 1064 indivíduos residentes nesta região quanto à

presença de asma, rinite e parasitose intestinal. A prevalência de infecção por

Schistosoma mansoni foi de 90,2%. As prevalências de outros helmintos a

exemplo de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Ancilostoma duodenale

foram de 79,7%, 77,2% e 35%, respectivamente. Protozoários intestinais como

Giardia lamblia, Entamoeba coli e Entamoeba histolytica foram encontrados em

torno de 50% da população.

Atualmente, em 2005, após a população ser tratada por duas vezes com

Praziquantel, a prevalência da infecção pelo S. mansoni encontrada no Conde é

de 51%. A prevalência de asma e rinite foi avaliada através do questionário

utilizado internacionalmente em estudos de prevalência de doenças alérgicas

“International Study for Asthma and Allergy in Childhood” (ISAAC, 1998), tendo

sido 14% e 20%, respectivamente (Araujo e cols. 2004) (ANEXO I).

Os asmáticos identificados na região foram considerados portadores de

asma leve, baseados nos critério estabelecidos no III Consenso Brasileiro no

Manejo da Asma, onde os sintomas como falta de ar, aperto no peito, chiado e

tosse aparecem menos de uma vez por semana, as crises são ocasionais e leves,

controladas com broncodilatadores, sem a necessidade de atendimento

emergencial e uso de broncodilatador é requerido menos de uma vez por

semana. Este diagnóstico é realizado após avaliação clínica e realização de

exames físicos por dois médicos alergistas.

Foram selecionados indivíduos de ambos os gêneros, infectados pelo S.

mansoni, asmáticos (n=20) e não asmáticos (n=21), com idade entre 6 e 40 anos,

residentes no Conde. A seleção ocorreu de acordo com a ordem de

comparecimento da população à convocação para participar deste estudo.

Indivíduos com diagnóstico de asma leve (n=13) entre 6 e 40 anos de idade,

de ambos os gêneros, provenientes do Ambulatório de Alergia do Hospital

Universitário Professor Edgard Santos, Universidade Federal da Bahia, Salvador-

BA, não infectados com helmintos e com baixas condições sócio-econômicas,

formaram o grupo dos asmáticos não infectados.

4.2 Desenho do estudo e cálculo amostral

Trata-se de um estudo seccional, onde por ocasião da inclusão todos os

indivíduos foram submetidos a avaliações laboratoriais (exame parasitológico de

fezes) e avaliação da resposta imune para os antígenos de S. mansoni.

O tamanho amostral foi escolhido por conveniência do número de pacientes

consecutivos que compareceram para participarem do estudo no período de 12

meses. Adicionalmente contribuíram para tal escolha a limitação de recursos e os

critérios de seleção dos grupos, especialmente o da área endêmica.

4.3 Critérios de inclusão

1. Idade entre 6 e 40 anos;

2. Ambos os gêneros;

3. Infecção pelo S. mansoni (forma intestinal ou hepato-intestinal,

caracterizado pelo exame físico) para compor o Grupo I (infectados não

asmáticos);

4. Infecção pelo S. mansoni e responderem positivamente ao quesito relativo

à história pessoal atual de asma brônquica com sibilância nos últimos 12

meses do questionário ISAAC, para compor o grupo II (asmáticos

infectados);

5. Diagnóstico de asma leve para compor o grupo III (asmáticos não

infectados).

Crianças menores de seis anos não foram incluídas no estudo pela dificuldade

no diagnóstico de asma brônquica e da realização da espirometria, e adultos

acima de 40 anos não participaram devido ao risco aumentado de apresentarem

doença pulmonar obstrutiva crônica de outras etiologias que não fosse alérgica.

4.4 Critérios de exclusão

Não foram admitidos no estudo indivíduos:

1. Com idade inferior a 6 anos e superior a 40 anos;

2. Com asma grave;

3. Com a forma hepato-esplênica da esquistossomose;

4. Em uso de drogas imunossupressoras;

5. Mulheres gestantes;

6. Indivíduos que apresentem alguma condição que não permitisse a

participação no estudo, ou por incapacidade física e/ou mental,

impossibilitando a realização dos exames, ou por doenças que modifiquem

a resposta imune do indivíduo, a exemplo das imunodeficiências, outras

doenças crônicas, infecções virais e bacterianas.

Existe uma alteração da resposta imune em indivíduos com a forma hepato-

esplênica da esquistossomose com baixa produção de IL-10 (Correa-Oliveira e

cols. 1998).

4.5 Antígenos de S. mansoni usados no estudo

Os antígenos recombinantes de S. mansoni (Sm22.6, Sm14, P24, Sm29),

além do PIII, SWAP e do SEA foram usados neste estudo. Estes antígenos foram

gentilmente doados pelo Dr. Sérgio Costa e Dr. Alfredo Góes do Laboratório de

Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas/ICB - Universidade

Federal de Minas Gerais (UFMG). Para produzir essas biomoléculas as seguintes

metodologias foram empregadas:

4.5.1 Produção do antígeno purificado PIII a partir do SWAP

O antígeno PIII é uma fração solúvel do antígeno do verme adulto

denominado SWAP obtido por FPLC (“Fast Protein Liquid Cromatography”)

(Pharmacia, Uppsala, Suécia) através de cromatografia de troca aniônica

utilizando uma resina de Q-Sefarose (5 mm x 90 mm; Pharmacia, Suécia) como

descrito anteriormente por Hirsch e Goes (Hirsch e cols. 1996). O antígeno PIII foi

eluído do sistema na concentração de 28% ou 0.28M do tampão de eluição. Em

seguida o antígeno PIII foi esterilizado por filtração, liofilizado e estocado a -70 ºC

para posterior uso.

4.5.2 Expressão e purificação da proteína recombinente Sm22.6

O gene que codifica a proteína rSm22.6, foi encontrado na biblioteca de

cDNA de esquistossômulo de fase pulmonar de S. mansoni. Esse gene foi

subclonado no vetor de expressão em bactérias, pMAL-c2, que expressa

proteínas em fusão com a proteína de ligação à manose (MBP). A expressão

utilizando o pMAL-c2 é realizada segundo as instruções do fabricante (New

England Biolabs, Beverly, Mass.). Com o objetivo de se determinar a cinética da

expressão da proteína de fusão, foi realizado primeiramente um experimento

piloto com apenas 10 mL de cultura para discriminar o melhor tempo de indução,

que foi de 3 horas. O pré-inóculo saturado de clones contendo o gene Sm22.6

foram preparados em meio LB suplementado com ampicilina, os quais foram

incubados durante 16 horas a 37ºC ou por uma noite sob agitação constante (200

rpm). Após o crescimento da cultura, um litro de meio LB contendo 100 µg/mL de

ampicilina e glicose a 0,1% foram inoculados com 10 mL do pré-inóculo saturado

de células, contendo o plasmídeo recombinante. As células foram incubadas a

37ºC sob agitação constante de 200 rpm até atingirem uma densidade ótica (DO)

em comprimento de onda de 600 nm (DO

600

) de aproximadamente 0,6. Em

seguida foi adicionado IPTG, para uma concentração final de 0,6 mM. Após 3

horas de indução as células foram centrifugadas a 7.000 rpm por 40 min. O

sedimento contendo as células foi então ressuspenso em 100 mL de PBS 0,15 M

pH 8,4 contendo 25 mg de lisozima. As bactérias foram lisadas através de três

ciclos de congelamento (-70ºC) e descongelamento (banho-maria à 42ºC) e

depois sonicadas três vezes com pulsos de 30 segundos, potência de 30 % em

sonicador (Fisher Scientific), intercalados por 30 segundos no gelo, para liberação

total das proteínas. As frações de proteínas solúveis e insolúveis do lisado foram

separadas após centrifugação a 7.000 rpm por 40min a 4C, no sobrenadante e

no sedimento, respectivamente e ambos foram submetidos a eletroforese em gel

de poliacrilamida a 12 % para confirmar a presença da proteína recombinante

Sm22.6-MBP no sobrenadante, com o tamanho molecular de 22.6 kDa. A

proteína foi purificada por cromatografia de afinidade com resina de amilose, que

se liga à maltose do MBP e é eluída por competição com maltose livre.

4.5.3 Expressão e purificação da proteína recombinente Sm14

O gene que codifica a proteína Sm14 do S. mansoni já se encontra clonado

no vetor de expressão pMAL-c2 em cepas de E. coli DH5α. A expressão

utilizando o pMAL-c2 foi realizada segundo as instruções do fabricante (New

England Biolabs, Beverly, Mass.), com algumas modificações descritas por Brito e

colaboradores (Brito e cols. 2002). Com o objetivo de determinar a cinética da

expressão da proteína de fusão, foi realizado primeiramente um experimento

piloto com apenas 100 mL de cultura. O pré-inóculo saturado de clones contendo

os genes Sm14 foi preparado em meio LB suplementado com ampicilina, o qual

foi incubado durante 16 horas a 37ºC ou por uma noite, sob agitação constante

(200 rpm). Após o crescimento da cultura, 100 mL de meio LB contendo 0,1 % de

glicose e 100 µg/mL de ampicilina foram inoculados com 1 mL do pré-inóculo

saturado de células, contendo o plasmídeo recombinante. As células foram

incubadas a 37ºC sob agitação constante de 200 rpm até atingirem,

aproximadamente 2 x 10

células/mL (DO

600

de aproximadamente 0,5). Neste

momento, uma alíquota de 10 mL de cultura foi coletada e em seguida adicionado

IPTG, para uma concentração final de 0,4 mM e coletadas alíquotas de 10 mL de

cultura 1, 2, 3 e 4 horas após a indução da expressão com IPTG. Em seguida as

células foram recuperadas por centrifugação a 10.000 rpm por 20 min. O

sedimento contendo as células foi então ressuspendido em 1 mL de PBS 0,15 M

pH 8,4 contendo 25 mg de lisozima. As bactérias foram lisadas através de três

ciclos de congelamento (gelo seco-metanol) e descongelamento (banho-maria à

37ºC) e depois sonicadas três vezes com pulsos de 30 segundos, potência de 70

% em sonicador (Fisher Scientific), intercalados por 30 segundos no gelo, para

liberação total das proteínas. As frações de proteínas solúveis e insolúveis do

lisado foram separadas após centrifugação a 9.000 rpm por 30 min a 4ºC, no

sobrenadante e no sedimento, respectivamente e ambos foram submetidos a

eletroforese em gel de poliacrilamida 10 % para confirmar a presença da proteína

recombinante Sm14-MBP. As proteínas foram purificadas por cromatografia de

afinidade com resina de amilose, que se liga à maltose do MBP e é eluída por

competição com maltose livre.

4.5.4 Expressão e purificação da proteína recombinante P24

O gene que codifica a proteína P24 do S. mansoni já se encontra clonado no

vetor de expressão pET21 em cepas de E. coli BL21 (DE3). A expressão

utilizando o pET21a foi realizada segundo as instruções do fabricante (New

England Biolabs, Beverly, Mass.). O pré-inóculo saturado de clones contendo os

genes P24 foram preparados em meio LB suplementado com ampicilina, os quais

foram incubados durante 16 horas a 37ºC ou por uma noite, sob agitação

constante (200 rpm). Após o crescimento da cultura, 100 mL de meio LB contendo

0,2 % de glicose e 100 µg/mL de ampicilina foram inoculados com 1 mL do pré-

inóculo saturado de células, contendo o plasmídeo recombinante. As células

foram incubadas a 37ºC sob agitação constante de 200 rpm até atingirem,

aproximadamente 2 x 10

células/mL (DO

600

de aproximadamente 0,5). Neste

momento, uma alíquota de 5 mL de cultura foi coletada e em seguida adicionado

IPTG para uma concentração final de 0,6 mM. Posteriormente, as células

voltaram a ser incubadas a 37ºC sob agitação e foram coletadas alíquotas de 5

mL de cultura 1, 2, 3 e 4 horas após a indução da expressão com IPTG. Em

seguida as células foram recuperadas por centrifugação a 10.000 rpm por 20 min.

O sedimento contendo as células foi então ressuspendido em 1 mL de PBS 0,15

M pH 8,4 contendo 25 mg de lisozima. As bactérias foram lisadas através de três

ciclos de congelamento (gelo seco-metanol) e descongelamento (banho-maria à

37ºC) e depois sonicadas três vezes com pulsos de 30 segundos, potência de 70

% em sonicador (Fisher Scientific), intercalados por 30 segundos no gelo, para

liberação total das proteínas. As frações de proteínas solúveis e insolúveis do

lisado foram separadas após centrifugação a 9.000 rpm por 30 min a 4ºC, no

sobrenadante e no sedimento, respectivamente e ambos foram submetidos a

eletroforese em gel de poliacrilamida 10 % para confirmar a presença da proteína

recombinante P24-6xHis. A proteína foi purificada por cromatografia de afinidade

com resina de níquel, que se liga aos resíduos de histidina e foi eluída por

competição com o ácido imidoacético.

4.5.5 Expressão e purificação da proteína recombinante Sm29

O gene que codifica a proteína Sm29 do S. mansoni já se encontra

subclonado no vetor de expressão pET21 em cepas de E. coli BL21 (DE3). A

expressão utilizando o pET21a foi realizada segundo o manual do fabricante

(Novagen, Madison, WI). Foi realizado um experimento piloto com apenas 100 mL

de cultura, para determinar a cinética da proteína de fusão, que foi de 5 horas. O

pré-inóculo saturado de clones contendo os genes Sm29 foram preparados em

meio LB suplementado com ampicilina, os quais foram incubados durante 16

horas a 37ºC ou por uma noite, sob agitação constante (200 rpm). Após o

crescimento da cultura, 100 mL de meio LB contendo 0,2 % de glicose e 100

µg/mL de ampicilina foram inoculados com 1 mL do pré-inóculo saturado de

células, contendo o plasmídeo recombinante. As células foram incubadas a 37ºC

sob agitação constante de 200 rpm até atingirem, aproximadamente 2 x 10

células/mL (DO

600

de aproximadamente 0,5). Neste momento, uma alíquota de 5

mL de cultura foi coletada e em seguida adicionado IPTG para uma concentração

final de 1 mM. Após incubação adicional de 5 horas, as células foram recuperadas

por centrifugação a 10.000 rpm por 20 min. O sedimento contendo as células foi

então ressuspendido em 1 mL de PBS 0,15 M pH 8,4 contendo 25 mg de

lisozima. As bactérias foram lisadas através de três ciclos de congelamento (gelo

seco-metanol) e descongelamento (banho-maria à 37ºC) e depois sonicadas três

vezes com pulsos de 30 segundos, potência de 30 % em sonicador (Fisher

Scientific), intercalados por 30 segundos no gelo, para liberação total das

proteínas. As frações de proteínas solúveis e insolúveis do lisado foram

separadas após centrifugação a 7.000 rpm por 20 min a 4ºC, no sobrenadante e

no sedimento, respectivamente e ambos foram submetidos a eletroforese em gel

de poliacrilamida 10 % para confirmar a presença da proteína recombinante

Sm29-6xHis. A proteína foi purificada por cromatografia de afinidade com resina

de níquel (Amersham, Biosciences, São Paulo), que se liga aos resíduos de

histidina e foi eluída por competição com o ácido imidoacético.

4.5.6 Obtenção do Antígeno Solúvel do Verme Adulto (SWAP) e do Antígeno

Solúvel do Ovo (SEA)

Preparações antigências foram obtidas do ovo (SEA), do verme adulto

(SWAP) preparadas como sobrenadante solúvel em tampão salina, de acordo

com medotologia descrita por Hirsch e colaboradores em 1996 (Hirsch e cols.

1996; Hirsch e cols. 1997).

Os antígenos SEA e SWAP foram utilizados como controles da resposta

imune nos grupos estudados.

4.6 Avaliação laboratorial e clínica dos indivíduos recrutados nos grupos

4.6.1 Exame parasitológico de fezes

Os indivíduos selecionados para inclusão no estudo tiveram examinadas

amostras de fezes (3 amostras), através da técnica da sedimentação espontânea

de Hoffmann-Pons-Janer para a determinação de infecção parasitária e pela

técnica de Kato-Katz para avaliação da carga parasitária (Katz e cols. 1970).

4.6.2 Avaliação da resposta imune celular

a) Obtenção de células mononucleares de sangue periférico

Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) foram obtidas mediante

separação por gradiente de Ficoll-Hypaque e ajustadas para concentração de 3 x

células/ml em RPMI 1640, contendo 10% de soro AB

humano normal

inativado, penicilina 100U/mL, estreptomicina 100 µl/mL, L-glutamina 2mM, 30mM

HEPES (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).

As células (3 x 10

células/ml) foram estimuladas com os antígenos de S.

mansoni PIII, rSm22.6, rSm14, rP24, rSm29, SWAP e SEA (10 µg/mL), LPS (0.14

ng/mL), antígeno 1 do ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Der p1) (IPI;

ASAC) na concentração de 25µg/mL ou com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA)

(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) na diluição final de 1:100. As células foram

cultivadas em placas de 24 poços, por 6, 12, 24, 48 e 72h à 37

C e 5% de CO

Após a incubação, os sobrenadantes das culturas foram coletados e mantidos a –

20°C para posterior dosagem de citocinas.

b) Adição de Sulfato de Polimixina B às culturas para bloqueio da produção de

citocinas pelo LPS

As CMSP dos indivíduos foram pré-incubadas com 10 µg/mL de Sulfato de

Polimixina B (PMB) (CALBIOCHEM, Alemanha) por 30 minutos a 37

C, 5% CO

distribuídas em placas de culturas na concentração de 3x10

células/mL,

conforme metodologia sugerida por Gao e colaboradores (Gao e cols. 2003a; Gao

e cols. 2003b). Em seguida adicionaram-se as proteínas recombinantes nos

poços contendo PMB e as proteínas não recombinantes nos demais poços,

segundo esquema de placas pré-estabelecido. As concentrações das proteínas

foram de 10 µg/mL e foram incubadas a 37

C, 5% CO

por 12, 24 e 48 e 72 horas.

Polimixina B (10 µg/mL) foi novamente adicionada a cada 12h de cultura.

A concentração final de 30 µg/mL de PMB é suficiente para bloquear até 50

ng/mL de LPS (Vabulas e cols., 2001).

A avaliação da viabilidade das células foi realizada em 24, 48 e 72 horas,

contando-se o número de células viáveis, após diluição 1:1 com corante de Turck.

c) Avaliação da produção de citocinas

Os níveis de IL-10, IFN-γ, IL-5, IL-13 e TNF foram determinados pela técnica

de ELISA sanduíche utilizando-se Kit comercialmente disponíveis (R&D Systems).

Uma curva padrão foi usada para expressar os resultados em pg/mL.

4.7 Análise dos dados

Os dados foram analisados através do software Statistical Package for Social

Science (SPSS®) versão 9. Os dados referentes à amostra da população

estudada foram apresentados através de médias aritméticas e seus respectivos

desvios padrões, ou através de porcentagens.

Testes não paramétricos foram utilizados para avaliar as diferenças nos

níveis de citocinas. Tal escolha deveu-se ao pequeno tamanho da amostra.

Foram usados o teste de Mann Whitney na comparação de níveis de citocinas

entre os grupos e o teste pareado de Wilcoxon para comparar os níveis de IL-10

em cultura de CMSP na presença ou ausência de Sulfato de Polimixina B.

Todos os testes estatísticos de hipóteses foram bi-caudais, sendo

considerados estatisticamente significantes valores de p inferiores ao nível de

significância pré-estabelecidos em 5%.

A Representação gráfica foi realizada utilizando-se o programa Prism,

versão 3.03.

5. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da Maternidade

Climério de Oliveira, sob Parecer/Resolução número 71/2004 (ANEXO II), e os

seus participantes foram todos voluntários que, após esclarecimentos sobre o

objetivo desta pesquisa, assinaram termo de consentimento informado (ANEXO

III). No caso de menores, o consentimento foi assinado por um dos responsáveis.

Os voluntários que participaram deste estudo doaram 20 mL de sangue para

avaliação imunológica e colheram amostras de fezes para realização de exames

parasitológicos.

A coleta de sangue foi realizada por profissionais da área de saúde

habilitados para tal. Os materiais utilizados na coleta de sangue foram

descartáveis. A coleta de sangue não oferece riscos, a não ser a possibilidade de

sangramento e formação de hematoma, o que é raro e pode ser contornado com

compressão do local. Todos os indivíduos portadores de parasitoses intestinais

foram tratados gratuitamente. Aqueles que apresentaram queixas de alergia

foram devidamente orientados com relação a medidas de controle ambiental

intradomiciliar, bem como com referência ao tratamento com drogas.

6. RESULTADOS

A tabela 1 mostra as características demográficas e intensidade de infecção

dos indivíduos incluídos no estudo. Não houve diferença significativa em relação à

idade e gênero entre os grupos avaliados.

Tabela 1. Características demográficas e intensidade de infecção dos indivíduos

infectados com S. mansoni e asmáticos não infectados.

Variáveis Avaliadas Grupo 1

(n=20)

Grupo2

(n=21)

Sm+Asma

Grupo3

(n=13)

Asma

Valor

de p

Idade

(mediana/faixa

etária em anos)

(6-40)

(7-41)

>0,05

Gênero (% masc)

58,0% 46,1% 55,0% >0,05

S. mansoni (ovos/ g

de fezes)

330 ± 298 52 ± 54 0 <0,05

ANOVA não paramétrica (Teste de Kruskall-Wallis)

Teste exato de Fisher

Grupo 1: Não Asmáticos Infectados pelo S. mansoni, residentes em área

endêmica;

Grupo 2: Asmáticos Infectados pelo S. mansoni, residentes em área endêmica;

Grupo 3: Asmáticos de área não endêmica.

6.1 Concentracões de LPS encontradas nos antígenos de Schistososma

mansoni avliados no estudo

Os antígenos utilizados neste estudo foram, na sua maioria, recombinantes,

clonados em cepas de E. coli e portanto, susceptíveis a contaminação pela

endotoxina presente na parede celular destas bactérias.

Inicialmente, as concentrações de LPS foram dosadas (LAL Kit-Cambrex)

nos antígenos recombinantes Sm22.6, Sm14, P24, Sm29 e no antígeno não

recombinante PIII. As concentrações de LPS, presente como contaminante no

processo de purificação destas proteínas, estão representados na Tabela 2. A

média das concentrações obtidas nas dosagens de LPS nos antígenos

recombinantes foi de 0,15 ng/mL.

Tabela 2. Concentrações de LPS nos antígenos recombinantes P24, Sm14,

Sm22.6, Sm29 e na proteína PIII do S. mansoni. A tabela mostra as

concentrações de LPS, em Unidades de Endotoxina/mL (EU/mL) e os valores

correspondentes em nanogramas/mL (ng/mL).

LPS Antígenos

Recombinantes

(EU/mL)

(ng/mL)

P24 1,35 0,135

Sm14 2,10 0,210

Sm22.6 1,32 0,132

Sm29 1,26 0,126

PIII

0,02 0,002

O antígeno PIII não é recombinante

6.2 Produção de IL-10 por CMSP de indivíduos asmáticos infectados e não

infectados pelo S. mansoni e infectados não asmáticos estimuladas pelo

LPS

A figura 1 mostra os níveis de IL-10 produzidos por CMSP de indivíduos

infectados pelo S. mansoni asmáticos e não asmáticos e por asmáticos não

infectados estimulados com 0,15 ng/mL de LPS em culturas de 24 horas. As

células dos asmáticos não infectados produziram baixos níveis de IL-10 (31 ± 23

pg/mL) quando comparadas aos demais grupos (p<0,05) (Firgura 1).

Figura 1. Concentrações de IL-10 produzidas por CMSP de indivíduos asmáticos

infectados e não infectados pelo S. mansoni e infectados não asmáticos,

estimuladas pelo LPS em culturas de 48 horas. Teste de Kruskal-Wallis).

500

1000

Schisto

Asma+Schisto

Asma

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

500

1000

Schisto

Asma+Schisto

Asma

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

* p<0,05

6.3 Neutralização dos efeitos do LPS nas culturas estimuladas com os

antígenos recombinantes pelo uso da Polimixina B

Antes de proceder ao estudo utilizando os antígenos recombinantes de S.

mansoni, foi avaliada a produção de TNF e IL-10 em culturas de indivíduos

cronicamente infectados pelo S. mansoni estimuladas com o LPS e o efeito da

adição de PMB sobra a produção destas citocinas pelas células destes indivíduos.

A produção de TNF e IL-10 em 6, 12, 24 e 48 horas de culturas estimuladas

com LPS na presença ou ausência da PMB está mostrada nas Figuras 2A e 2B,

respectivamente. Comparados com culturas sem PMB, houve uma redução nos

níveis de TNF pela adição deste antibiótico às culturas em todos os tempos

avaliados. A média dos níveis de TNF diminuiu de 758 ± 815 pg/mL para 15,6 ±

9,0 pg/mL após 6 horas de cultura (97,9% de redução, p=0,03) e de 1481 ± 1489

pg/mL para 108 ± 175 pg/mL (92,7% de redução, p=0,03), 2124 ± 966 pg/mL para

35 ± 48 pg/mL (98,3% de redução, p=0,06) e 1253 ± 1145 pg/mL para 60 ±104

pg/mL (95,2% de redução, p=0,03) em 12, 24 e 48 horas de cultura,

respectivamente (Figura 2A). Adição de PMB também resultou em modulação da

produção de IL-10 (Figura 2B). Os níveis médios de IL-10 em culturas sem PMB

foram 301 ± 314 pg/mL, 503 ± 333 pg/mL e 308 ± 410 pg/mL em 12, 24 e 48

horas de cultura, e após a adição de PMB os níveis diminuíram para 15,6 ± 9,5

pg/mL (p=0,06), 26 ± 39 pg/mL (p=0,03) e 16 ± 1,0 pg/mL (p=0,03). As reduções

na produção de IL-10 em culturas de 12, 24 e 48 horas representaram

respectivamente 95%, 94,8 e 94,9%.

Figura 2A. Efeito da adição de Sulfato de Polimixina B (PMB) (30µg/mL) em

CMSP de indivíduos cronicamente infectados pelo S. mansoni na produção de

TNF induzida pela estimulação com o LPS (0,15 ng/mL).

Figura 2B. Efeito da adição de PMB (30µg/mL) em CMSP de indivíduos

cronicamente infectados pelo S. mansoni na produção de IL-10 induzida pela

estimulação com o LPS (0,15 ng/mL).

250

500

750

1000

LPS

LPS + PMB

6h 12h 24h 48h

Tempo de cultura

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

LPS

LPS + PMB

6h 12h 24h 48h

Tempo de cultura

IL-10 (pg/mL)

1500

3000

5000

LPS

LPS + PMB

6 h 12 h 24 h 48 h

Tempo de cultura

TNF (pg/mL)

1500

3000

5000

LPS

LPS + PMB

6 h 12 h 24 h 48 h

Tempo de cultura

TNF (pg/mL)

Diante da modulação da produção de TNF e IL-10 induzida pelo LPS pela

adição de PMB às culturas, este antibiótico foi utilizado nas culturas estimuladas

com os antígenos recombinantes de S. mansoni.

A produção de TNF e IL-10 induzidas pelos antígenos recombinanantes de

S. mansoni na presença ou ausência de PMB estão mostradas nas figuras 3A, 3B

e 3C. Todas as proteínas recombinantes usadas neste estudo induziram altos

níveis de TNF, como também induziram a produção de IL-10. A figura 3A mostra

os níveis de produção de TNF e IL-10 em 6, 12, 24 e 48 horas de culturas

estimuladas com a proteína recombinante Sm22.6, enquanto que as Figuras 3B e

3C mostram os níveis destas citocinas em culturas estimuladas com os antígenos

Sm14 e P24, respectivamente. Foi observada redução variável nos níveis de TNF

de e IL-10 em todos os períodos avaliados, para todas as proteínas

recombinantes utilizadas, entretanto não houve bloqueio completo da produção

destas citocinas como observado quando o LPS foi utilizado.

0 12 24 36 48 60

500

1000

IL-10 sem PMB

IL-10 com PMB

TNF sem PMB

TNF com PMB

1000

2000

3000

4000

Tempo (h)

pg/mL

Figura 3A. Produção de TNF e IL-10 em CMSP de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com o antígeno recombinante de

S. mansoni Sm22.6 (10 µg/mL). Os dados referem-se a produção desta citocina

na ausência ou presença de Sulfato de Polimixina B (30 µg/mL) em culturas de 6,

12, 24 e 48 horas.

0 12 24 36 48 60

500

1000

IL-10 sem PMB

IL-10 com PMB

TNF sem PMB

TNF com PMB

1000

2000

3000

4000

Tempo (h)

pg/mL

Figura 3B. Produção de TNF e IL-10 em CMSP de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com o antígeno recombinante de

S. mansoni Sm14 (10 µg/mL). Os dados referem-se a produção desta citocina na

ausência ou presença de Sulfato de Polimixina B (30 µg/mL) em culturas de 6, 12,

24 e 48 horas.

0 12 24 36 48 60

500

1000

IL-10 sem PMB

IL-10 com PMB

TNF sem PMB

TNF com PMB

1000

2000

3000

4000

Tempo (h)

pg/mL

Figura 3C. Produção de TNF e IL-10 em CMSP de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com o antígeno recombinante de

S. mansoni P24 (10 µg/mL). Os dados referem-se a produção desta citocina na

ausência ou presença de Sulfato de Polimixina B (30 µg/mL) em culturas de 6, 12,

24 e 48 horas.

Os níveis de TNF e IL-10 foram abaixo do limite de detecção, que foi de 15,6

pg/mL em culturas não estimuladas e nas estimuladas apenas com PMB ou com

MBP. Quando as células foram estimuladas com fitohemaglutinina (PHA) houve

sempre produção de citocinas com concentrações variando de 1500 pg/mL a

4000 pg/mL para todas as citocinas avaliadas. A adição de PMB às culturas

estimuladas com PHA não bloqueou a produção de citocinas por este antígeno

(dados não mostrados).

A viabilidade das células não foi alterada pela adição de PMB, sendo de 98%

nas culturas com e sem adição de PMB.

Foi adicionado PMB às culturas com os antígenos recombinantes a partir

deste ponto do estudo em todos os experimentos.

6.2 Produção de Interleucina-10 por CMSP de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni

As figuras 4A, 4B e 4C mostram os níveis de IL-10 produzidos por células

mononucleares de sangue periférico de indivíduos cronicamente infectados pelo

S. mansoni, estimulados in vitro com os antígenos Sm22.6, Sm14, PIII, P24 e

Sm29 de S. mansoni, além dos antígenos solúveis do verme adulto (SWAP) e do

ovo (SEA), em culturas de 24 horas de incubação.

Foi observado que todos os antígenos avaliados neste trabalho induziram a

produção de IL-10. Os antígenos PIII e P24 induziram os mais altos níveis desta

citocina (541 ± 328 pg/mL; mediana= 590 pg/mL e 518 ± 343 pg/mL; mediana=

359 pg/mL, respectivamente) (Figura 4A).

A produção de IL-10 por células não estimuladas e estimuladas pelo SWAP

e SEA na cultura de 24 horas foi baixa (48 ± 79 pg/mL, 72 ± 172 pg/mL e 63 ± 129

pg/mL, respectivamente) (Figura 4A).

A produção de IL-10 nas culturas de indivíduos infectados pelo S. mansoni

em culturas de 48 horas é mostrada na Figura 4B.

Comparando-se a produção de IL-10 nas culturas de 24 e 48 horas,

observou-se que enquanto para o antígeno Sm22.6 os níveis foram

aproximadamente 3 vezes maiores na cultura de 24 horas (158 ± 156 pg/mL;

mediana= 122 pg/mL para 24 horas e 408 ± 514 pg/mL; mediana= 273 pg/mL

para 48 horas), não houve diferença significativa na produção de IL-10 induzida

pelos antígenos Sm14, PIII, P24 e Sm29 (p>0,05; Teste de Kruskal-Wallis).

Os níveis de IL-10 em culturas de 48 horas não estimuladas, estimuladas

com SWAP e com o SEA foram respectivamente 58 ± 118 pg/mL, 140 ± 291

pg/mL e 28 ± 34 pg/mL (Figura 4B).

A Figura 4C mostra a produção de IL-10 por CMSP estimuladas com os

antígenos de S. mansoni avaliados neste trabalho em culturas de 72 horas. Todos

os antígenos induziram a produção de IL-10, sendo os níveis desta citocina

induzidos pelos antígenos Sm22.6 e PIII semelhantes aos observados nas

culturas de 48 horas (304 ± 240 pg/mL; mediana= 167 pg/mL e 503 ± 304 pg/mL;

mediana= 621 pg/mL, respectivamente; p>0,05). Houve um aumento na produção

de IL-10 nas culturas de 72 horas em relação às de 48 horas quando se utilizou

os antígenos Sm14 (722 ± 353 pg/mL; mediana= 774 pg/mLpara 72 horas e 401 ±

383 pg/mL; mediana= 203 pg/mLpara 48 horas) e Sm29 (794 ± 206 pg/mL;

mediana= 764 pg/mL e 371 ± 327 pg/mL; mediana= 284 pg/mLpara 48 horas).

Observou-se uma redução nos níveis de IL-10 em culturas estimuladas pelo P24,

porém sem significância estatística (p>0,05) (580 ± 468 pg/mL; mediana= 427

pg/mL em 48 horas para 474 ± 305 pg/mL; mediana= 590 pg/mL em 72 horas).

Em culturas estimuladas com o SWAP e SEA observou-se produção de IL-

10 por CMSP de alguns indivíduos, sendo os níveis médios de 130 ± 159 pg/mL e

158 ± 206 pg/mL, respectivamente.

Figuras 4A, B e C. Níveis de IL-10 produzidos por células mononucleares de

sangue periférico de indivíduos cronicamente infectados pelo S. mansoni

estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni em culturas de 24, 48 e 72

horas, respectivamente (A IL-10 foi dosada em sobrenadante de culturas

utilizando-se a técnica de ELISA sanduíche). As concentrações são expressas em

pg/mL e os resultados em médias ± desvio padrão.

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

Figura 4A

S. mansoni – 24 horas

Figura 4C

S. mansoni – 72 horas

Figura 4B

S. mansoni – 48 horas

6.3 Produção de interleucina-10 por CMSP de indivíduos asmáticos

cronicamente infectados pelo S. mansoni

As Figuras 5A, 5B e 5C mostram os níveis de IL-10 produzidos por células

mononucleares de sangue periférico de indivíduos asmáticos cronicamente

infectados pelo S. mansoni, estimulados in vitro pelos antígenos Sm22.6, Sm14,

PIII, P24 e Sm29 de S. mansoni, além do SWAP e do SEA, em diferentes tempos

de culturas (24, 48 e 72 horas).

Os níveis de IL-10 induzidos pelos antígenos avaliados em culturas de 24

horas foram mais elevados para os antígenos Sm14 (461 ± 449 pg/mL; mediana=

342 pg/mL), P24 (737 ± 463 pg/mL; mediana= 721 pg/mL) e o Sm29 (522 ± 416

pg/mL; mediana= 387 pg/ml).

Em culturas estimuladas com o SWAP, SEA e não estimuladas foram

observados níveis médios de produção de IL-10 inferiores a 100 pg/mL (Figura

5A).

A Figura 5B mostra a produção de IL-10 por CMSP estimuladas com os

antígenos de S. mansoni em culturas de 48 horas. Todos os antígenos avaliados

(Sm22.6, Sm14, PIII, P24 e Sm29) induziram a produção de IL-10 em asmáticos

infectados pelo S. mansoni, sendo a produção mais elevada em culturas

estimuladas com os antígenos P24 e Sm29 (737 ± 463 pg/mL; mediana= 727

pg/mL e 522 ± 416 pg/mL; mediana= 387 pg/mL, respectivamente).

Os níveis de IL-10 não diferiram significativamente com relação às culturas

de 24 horas (p>0,05; Teste pareado de Wilcoxon).

Os níveis de IL-10 em culturas estimuladas com SWAP (32 ± 62 pg/mL;

mediana 15,6 pg/mL), SEA (17 ± 3 pg/mL; mediana 15,6 pg/mL) e sem estímulo

(24 ± 40 pg/mL; mediana 15,6 pg/mL) ficaram próximos ao limite inferior de

detecção (15,6 pg/mL).

A produção de IL-10 nas culturas de indivíduos asmáticos infectados pelo S.

mansoni em culturas de 72 horas é mostrada na figura 5C. Os níveis desta

citocina foram semelhantes para todos os antígenos avaliados, sendo o mais alto

observado nas culturas estimuladas com o Sm14 (529 ± 134 pg/mL; mediana=

489 pg/mL) e mais baixo para o Sm22.6 (340 ± 179 pg/mL; mediana= 329 pg/mL).

Figuras 5A, B e C. Níveis de IL-10 produzidos por células mononucleares de

sangue periférico de indivíduos asmáticos cronicamente infectados pelo S.

mansoni estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni em culturas de 24,

48 e 72 horas, repectivamente.

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

Il-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

Il-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

Il-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

Il-10 (pg/mL)

Figura 5A

S. mansoni + Asma – 24 horas

Figura 5B

S. mansoni + Asma – 48 horas

Figura 5C

S. mansoni + Asma – 72 horas

6.4 Produção de interleucina 10 por CMSP de asmáticos não infectados pelo

S. mansoni

As figuras 6A, 6B e 6C mostram os níveis de IL-10 produzidos por células

mononucleares de sangue periférico de indivíduos asmáticos não infectados pelo

S. mansoni, estimulados in vitro pelos antígenos Sm22.6, Sm14, PIII, P24 e Sm29

de S. mansoni, além do SWAP e do SEA. Todos os antígenos induziram altos

níveis de IL-10, sendo que o P24 e o Sm29 induziram os maiores níveis desta

citocina (828 ± 415 pg/mL; mediana= 730 pg/mL e 891 ± 213 pg/mL; mediana=

925 pg/mL). A produção de IL-10 induzida pelo SEA e pelo SWAP e sem estímulo

foram baixas, sendo as medianas 15,6 pg/mL para todas as três condições.

A figura 6B mostra a produção de IL-10 estimulada pelos antígenos de S.

mansoni em 48 horas. A produção de IL-10 para todos os antígenos pesquisados

foi semelhante neste período. Os níveis de IL-10 para os antígenos P24 e Sm29

foram respectivamente 32% e 23% mais baixos que os observados em 24 horas.

Apenas a produção de IL-10 estimulada pelo antígeno PIII aumentou em

relação a 24 horas, passando de 483 ± 263pg/mL; mediana= 578 pg/mL para 572

± 277 pg/mL;mediana= 633, sendo este aumento considerado não significativo

estatisticamente (p>0,05; Teste pareado de Wilcoxon).

Nas culturas de 72 horas foi observado que os níveis de IL-10 reduziram em

relação aos tempos de 24 horas para todos os antígenos avaliados, a exceção do

Sm29 que, em média, manteve-se constante (891 ± 213 pg/mL em 24 horas, 681

± 501 pg/mL em 48 horas e 618 ± 191 pg/mL em 72 horas).

A produção de IL-10 induzida pelas culturas não estimuladas e estimuladas

pelo SWAP e pelo SEA mantiveram-se baixas em todos os períodos avaliados

(medianas 15,6 pg/mL para todos os períodos) (Figura 6C).

PHA foi utilizada nas culturas de todos os antígenos e nos tempos avaliados,

tendo sido observado alta produção de IL-10 (concentrações médias acima de

1500 pg/mL) em todos os grupos (dados não mostrados).

Figuras 6A, B e C. Níveis de IL-10 produzidos por células mononucleares de

sangue periférico de indivíduos asmáticos não infectados pelo S. mansoni

estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni em culturas de 24 horas

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

Sem estímulo

SWAP

SEA

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

250

500

750

1000

1500

IL-10 (pg/mL)

Figura 6A

Asma – 24 horas

Figura 6B

Asma – 48 horas

Figura 6C

Asma – 72 horas

6.5 Cinética da produção de IL-10 por CMSP nos grupos estudados

As Figuras 7A, 7B e 7C mostram, em resumo as cinéticas de produção de IL-

10 por CMSP de indivíduos cronicamente infectados pelo S. mansoni, não

asmáticos e asmáticos e por indivíduos asmáticos não infectados,

respectivamente. Os pontos representam as médias das concentrações de IL-10

(pg/mL). Enquanto que os níveis de IL-10 permaneceram estáveis ou

aumentaram com o tempo em cultura nos indivíduos infectados pelo S. mansoni

(Figura 7A), nos indivíduos asmáticos não infectados houve uma diminuição da

produção desta citocina nas culturas de 48 e 72 horas (figura 7C). Em asmáticos

infectados os níveis de IL-10 diminuíram após 48 horas de cultura, voltando a se

elevar após 72 horas (Figura 7B).

0 24 48 72

250

500

750

1000

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

Tempo (h)

IL-10 (pg/mL)

Figura 7A. Cinética de produção de IL-10 por células de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com os antígenos de S. mansoni

avaliados neste estudo

0 24 48 72

250

500

750

1000

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

Tempo (h)

IL-10 (pg/mL)

Figura 7B. Cinética de produção de IL-10 por células de indivíduos asmáticos

cronicamente infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com os antígenos

de S. mansoni avaliados neste estudo

0 24 48 72

250

500

750

1000

Sm22.6

Sm14

PIII

P24

Sm29

Tempo (h)

IL-10 (pg/mL)

Figura 7C. Cinética de produção de IL-10 por células de indivíduos asmáticos não

infectados pelo S. mansoni estimulados in vitro com os antígenos de S. mansoni

avaliados neste estudo

6.6 Produção de Interferon-γ

γγ

γ, Interleucina-5 e Interleucina-13 por CMSP

estimuladas com os antígenos de S. mansoni

Foram avaliadas as produções de IFN-γ e IL-5 por CMSP de indivíduos

asmáticos infectados ou não pelo S. mansoni.

As figuras 8A, 8B e 8C mostram a produção de IFN-γ nos três grupos

avaliados. A produção desta citocina foi, de um modo geral, baixa em todos os

grupos e com todos os antígenos avaliados, sendo que os antígenos P24 e Sm29

foram os que induziram níveis mais elevados de IFN-γ.

Figura 8A, B e C. Níveis de IFN-γ (pg/mL) produzidos por CMSP de indivíduos

cronicamente infectados pelo S. mansoni, asmáticos ou não e asmáticos não

infectados, respectivamente, estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni

em culturas de 72 horas (n=9).

Figura 8A

S. mansoni

Figura 8B

S. mansoni + Asma

Figura 8C

Asma

100

150

200

Meio

SWAP

SEA

Sm22

Sm14

PIII

P24

Sm29

200

500

IFN-

(pg/mL)

100

150

200

500

IFN-

(pg/mL)

100

150

200

500

IFN-

(pg/mL)

Os níveis de IL-5 ficaram abaixo do limite de detecção (15,6 pg/mL) em

culturas de células de indivíduos asmáticos estimuladas por todos os antígenos

(não mostrado). Nas culturas estimuladas com Der p1 a concentração desta

citocina foi 198 ± 319 pg/mL.

A produção de IL-13 também foi avaliada em células de asmáticos não

infectados estimuladas pelos antígenos PIII, Sm22.6 e P24 (Figura 9). As

concentrações desta citocina foram 81 ± 67 pg/mL, 68 ± 60 pg/mL e 55 ± 49

pg/mL, para os três antígenos respectivamente. Em culturas estimuladas com o

Der p1 observou-se mais elevada concentração de IL-13 (114 ± 67 pg/mL), porém

sem significância estatística (p>0,05). Quando comparado com a cultura não

estimulada, a concentração de IL-13 foi significantemente maior apenas na cultura

estimulada com Der p1 (p<0,05).

* P<0,05

Figura 9. Níveis de IL-13 (pg/mL) produzidos por CMSP de indivíduos asmáticos

não infectados pelo S. mansoni estimuladas in vitro com os antígenos PIII,

Sm22.6 e P24 de S. mansoni em culturas de 72 horas (n=7; Teste de Kruskal-

Wallis).

100

150

200

250

Sem estímulo

Sm22.6

PIII

P24

Derp 1

IL-13 (pg/mL)

100

150

200

250

Sem estímulo

Sm22.6

PIII

P24

Derp 1

IL-13 (pg/mL)

100

150

200

250

Sem estímulo

Sm22.6

PIII

P24

Derp 1

IL-13 (pg/mL)

100

150

200

250

Sem estímulo

Sm22.6

PIII

P24

Derp 1

IL-13 (pg/mL)

100

150

200

250

Sem estímulo

Sm22.6

PIII

P24

Derp 1

IL-13 (pg/mL)

100

150

200

250

Sem estímulo

Sm22.6

PIII

P24

Derp 1

IL-13 (pg/mL)

6.7 Efeito da adição de antígenos de S. mansoni sobre a produção de IL-10

induzida pelo Der p1

As Figuras 10A, 10B e 10C mostram o efeito da adição dos antígenos PIII,

P24 e Sm22.6 do S. mansoni na produção de IL-10 por CMSP de asmáticos não

infectados (n=7) estimulados com o antígeno 1 de Dermatophagoides

pteronissinus (Der p1).

Foi observado que a adição dos antígenos PIII, rP24 e rSm22.6 resultou no

aumento da produção de IL-10 por células de asmáticos não infectados (Figuras

10A, B e C, respectivamente).

10001500

Der p1

IL-10 (pg/mL)

Figura 10A, B e C. Níveis de IL-10 em culturas de CMSP de asmáticos não

infectados estimuladas com Der p1 na presença ou ausência dos antígenos PIII,

Sm22.6 e P24, respectivamente. Culturas de 48 horas, n=7; p<0,05; Teste

pareado de Wilcoxon.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

500

1000

1500

Der p1 PIII + Der p1

IL-10 (pg/mL)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

500

1000

1500

Der p1 Sm22.6 + Der p1

IL-10 (pg/mL)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

500

1000

1500

Der p1 Der p1 + P24

IL-10 (pg/mL)

Figura 10A

PIII

Figura 10B

Sm22.6

Figura 10C

P24

7. DISCUSSÃO

Estudos vêm demonstrando que a infecção pelo Schistosoma mansoni

previne a atopia (Araujo e cols. 2000; van den Biggelaar e cols. 2001; Medeiros e

cols. 2003) e o desenvolvimento de doenças auto-imunes (Cooke e cols. 1999; La

Flamme e cols. 2003). Estes estudos sugerem que a IL-10 possa estar envolvida

no processo de modulação da resposta imune exacerbada observada nestas

doenças. No presente estudo, os antígenos de S. mansoni Sm14, Sm22.6, Sm29,

P24 e PIII induziram a produção de IL-10 por células de indivíduos infectados pelo

S. mansoni e também por células de asmáticos não infectados.

Células de indivíduos asmáticos produzem baixos níveis de IL-10 quando

estimuladas com o Derp p1 (Araujo e cols. 2004), e no presente estudo foi

demonstrado que células destes indivíduos também produzem baixos níveis de IL-

10 quando estimuladas com o LPS, concordando com os achados de Borish e

colaboradores (Borish e cols. 1996). Entretanto foi observada produção desta

citocina quando células de asmáticos foram estimuldas in vitro com os antígenos

de S. mansoni.

Antígenos de S. mansoni induzem a produção de IL-10 (Gazzinelli e cols.

1992; Williams e cols. 1994; Araujo e cols. 1996; Finkelman e cols. 1997; Mwatha

e cols. 1998) e existem evidências de que a IL-10 modula a resposta imune

envolvida na patogênese das doenças alérgicas (Royer e cols. 2001; Araujo e

cols. 2004). Outros estudos também demonstram que a IL-10 tem papel protetor

na asma, sendo produzida em pacientes que se beneficiam com o uso da

imunoterapia com alérgenos (Akdis e cols. 1998) e com corticosteróides

inalatórios (John e cols. 1998). Estes achados justificariam a busca da

identificação de antígenos de S. mansoni capazes de induzir a produção de IL-10

por células de asmáticos, na tentativa de futuro desenvolvimento de uma vacina

capaz de prevenir a asma. Os medicamentos disponíveis para o controle da asma

levam a efeitos colaterais muitas vezes importantes e o tratamento tardio está

associado com o maior grau de irreversibilidade das vias aéreas (Seiroos e cols.

1995), embora não haja comprovação de que o tratamento farmacológico, mesmo

introduzido precocemente, seja capaz de impedir o declínio da função pulmonar.

A escolha dos antígenos de S. mansoni Sm22.6, Sm14, PIII, P24 e Sm29

para serem utilizados neste estudo decorreu do fato de todos eles serem

localizados na membrana e/ou tegumento do verme adulto. Proteínas secretadas

ou localizadas na superfície de Schistosoma sp, que estão em íntimo contato com

os tecidos do hospedeiro são mais eficazes em desencadear processos

imunorregulatórios, possivelmente como mecanismo de escape do sistema imune

(Simpson e cols. 1990). A maioria dos antígenos associados à membrana

presentes no tegumento do S. mansoni não apresenta reatividade cruzada com

antígenos do ovo, os quais estão envolvidos na imunopatologia associada a esta

doença (Simpson e cols. 1990). Adicionalmente, contribuiu para a escolha destes

antígenos a capacidade dos mesmos em induzirem a produção de IL-10 por

células de indivíduos cronicamente infectados pelo S. mansoni (Brito e cols. 2000;

Al-Sherbiny e cols. 2003; Pacifico e cols. 2005).

Quatro dos antígenos utilizados neste trabalho são proteínas recombinantes.

Sabe-se que o uso das proteínas recombinantes em imunologia representa uma

importante ferramenta na pesquisa. Essas proteínas têm sido utilizadas para

compreensão dos mecanismos de resistência e susceptibilidade do hospedeiro

para doenças parasitárias e possuem o potencial para serem usadas como

vacinas.

A produção da maioria das proteínas recombinantes é feita através da

clonagem em vetores de Escherichia coli contendo o cDNA com o plasmídio para

a proteína desejada. Uma limitação comum deste processo é a contaminação da

proteína recombinante com endotoxina (Salek-Ardakani e cols. 2002). A presença

do LPS, mesmo em pequenas concentrações, é capaz de induzir a produção de

TNF e IL-10 (Gao e cols. 2003a; Gao e cols. 2003b). A IL-10 é uma importante

citocina reguladora da resposta inflamatória que deve surgir neste caso para

modular os efeitos do  TNF (Gerard e cols. 1993).

Muitos trabalhos publicados até o momento utilizando proteínas

recombinantes clonadas em E. coli não chamam atenção para o fato de que a

indução da resposta imune por estas proteinas pode ser, em grande parte, devido

à contaminação com o LPS.

Existem alguns métodos de purificação de proteínas contaminadas com o

LPS, mas com limitada eficácia (Salek-Ardakani e cols. 2002). O peptídeo natural

Polimixina B é um potente antibiótico que liga e neutraliza o LPS, prevenindo

desta forma o choque séptico (Corrigan e cols. 1971; Corrigan e cols. 1979). A

adição de PMB às culturas de macrófagos murinos mostrou ser capaz de bloquear

a produção de TNF pelos macrófagos estimulados pelo LPS presente como

contaminante em proteínas recombinantes (Gao e cols. 2003a; Gao e cols.

2003b).

Inicialmente foi avaliado neste estudo o efeito da PMB em modular a

produção de TNF e IL-10 em culturas de células de indivíduos cronicamente

infectados pelo S. mansoni estimuladas pelo LPS. Foi escolhida a concentração

de 0,15 ng/mL de LPS para estimular as células in vitro pois esta foi a média das

concentrações de LPS encontradas nas proteínas recombinantes avaliadas e, a

concentração de 30µg/mL de PMB para o bloqueio da ação do LPS, com base em

estudo que demonstrou que esta concentração foi suficiente para bloquear a ação

de até 50 ng de LPS (Vabulas e cols. 2001).

O uso de PMB em culturas estimuladas com o LPS aboliu completamente a

produção tanto do TNF quanto da IL-10. Nas culturas estimuladas com os

antígenos Sm22.6, Sm14 e P24 mesmo com a adição de PMB não se observou

bloqueio total da produção destas citocinas, sugerindo serem estes antígenos

capazes de induzir a produção de IL-10 e TNF por células de indivíduos

cronicamente infectados pelo S. mansoni. A partir destes achados todos os

ensaios com proteínas recombinantes foram realizados na presença de PMB.

Os antígenos de S. mansoni, Sm22.6, Sm14, PIII, P24 e Sm29 estimularam a

produção de IL-10 não apenas por células de indivíduos cronicamente infectados

pelo S. mansoni, mas de asmáticos não infectados. Enquanto que os antígenos

SWAP e SEA só induziram a produção de IL-10 nos indivíduos infectados pelo S.

mansoni.

Foram observadas baixas produções de IL-5, IL-13 e IFN-γ nas culturas de

células destes indivíduos estimuladas pelos antígenos de S. mansoni, o que é

uma vantagem, considerando que estas citocinas estão relacionadas à patogenia

da asma.

Avaliando-se a cinética de produção de IL-10, obsevou-se que, nos grupos

de indivíduos infectados pelo S. mansoni a produção desta citocina foi maior na

cultura de 72 horas, quando comparada com a de 24 horas, quando foram

utilizados os antígenos Sm22.6, Sm14 e Sm29. As concentrações de IL-10 foram

semelhantes nestes dois tempos de cultura quando as células foram estimuladas

com os antígenos PIII e P24. Embora em menores proporções, os antígenos

Sm22.6 e Sm14, além do PIII, também induziram maior produção de IL-10 no

tempo de 72 horas de cultura de células de asmáticos infectados pelo S. mansoni,

enquanto que para o Sm29 não houve mudança no padrão de indução de IL-10 e

para o P24 houve uma diminuição de produção desta citocina na cultura de 72

horas.

Diferente do observado para as culturas de células de indivíduos infectados

houve uma maior produção de IL-10 em culturas de 24 horas, quando

comparadas com as de 72 horas, em culturas de células de asmáticos não

infectados, para todos os antígenos avaliados neste estudo. Isso sugere que a IL-

10 deve ter sido produzida por células da resposta imune inata ou células

regulatórias nestes indivíduos.

Sabe-se que na infecção pelo S. mansoni a IL-10 é produzida tanto por

células da resposta imune inata, quanto por células T específicas e células

regulatórias (Hesse e cols. 2004), o que poderia justificar a ausência de

uniformidade nos tempos de indução desta citocina pelos diferentes antígenos do

parasita no grupo de infectados.

Algumas das recém descritas células regulatórias, as células TCD4+CD25+ e

T regulatória 1 (Tr1), são produtoras de altas concentrações de IL-10 (Asano e

cols. 1996; Francis e cols. 2003). Em modelo experimental de asma, foi observado

que tanto para o desenvolvimento quanto para a função das células T regulatórias

é necessário a presença de IL-10 e da co-estimulação envolvendo ICOS, um

membro da família CD28 (Akbari e cols. 2002). Além disso, células T regulatórias

induzidas pela exposição das células dendríticas a alérgenos produzem IL-10 e

expressam altos níveis de ICOS ligante que, potencialmente, inibem o

desenvolvimento de inflamação das vias aéreas e a hiperreatividade brônquica em

modelo experimental de asma (Akbari e cols. 2002).

Enquanto que existem vários estudos avaliando as funções das células

regulatórias nas alergias, pouco se conhece sobre as funções destas células nas

infecções por helmintos. Na esquistossomose experimental, células T regulatórias

produtoras de IL-10 reduzem a morbidade da doença e prolongam a sobrevivência

do parasita (Hesse e cols. 2004; McKee e cols. 2004). Certamente estas células

devem participar da modulação da resposta imune no sentido de permitir a

sobrevida do hospedeiro e perpetuação do parasita.

Em 1989 Charles Janeway demonstrou que o sistema imune inato pode

reconhecer padrões moleculares (PAMPs) conservados em múltiplos patógenos

(Janeway 1989). Este trabalho encontrou apoio no estudo que identificou

glicolipídeos (GLS) e lisofosfatidilserina (lyso PS) como moléculas capazes de

ativar células do sistema imune inato pela ligação de PAMPs aos receptores “Toll-

like” 2 (TLR-2) (van der Kleij e cols. 2002). O papel de PAMPs derivados do S.

haematobium tem sido avaliados em indivíduos não primados e em indivíduos

cronicamente infectados pelo parasita. Nos indivíduos infectados observou-se

uma resposta a estes antígenos com baixa produção de citocinas, ao passo que

naqueles não infectados houve uma alta produção de citocinas em resposta a

estimulação antigênica (Yazdanbakhsh e cols. 2001). Estes resultados indicam

que a exposição crônica aos helmintos pode afetar a responsividade celular aos

PAMPs derivados destes parasitas (van der Kleij e cols. 2004).

Outros estudos demonstraram que o TLR-4 é necessário para o

desenvolvimento da resposta imune do tipo Th2. Células TCD4

de camundongos

cujas células dendríticas são deficientes em TLR-4 produzem baixos níveis de IL-4

e IL-5 após estimulação, e diminuem a inflamação in vitro quando administradas

no pulmão de camundongos. Isto deveu-se a inabilidade destas células em

maturar e induzir a resposta Th2 (Dabbagh e cols. 2002; Dabbagh e cols. 2003).

O antígeno LNFPIII, um carboidrato encontrado no SEA, promove a resposta

Th2 in vivo e, conjugado a um adjuvante como a albumina humana (HSA),

promove o recrutamento de macrófagos moduladores (Okano e cols. 2001). O

antígeno LNFPIII-Dex, definido como um PAMP, dirige in vitro a diferenciação de

células dendríticas não primadas para o tipo 2 (CD2), por uma via dependente de

TLR-4 e independente da sinalização pelo MyD88, mecanismo diferente do

induzido pelo LPS (Thomas e cols. 2003). Mecanismos semelhantes talvez

possam explicar o fato de células de asmáticos não infectados terem produzido IL-

10 em resposta aos antígenos de S. mansoni e não em resposta ao LPS. Não se

pode, entretanto afastar a hipótese de que as células destes indivíduos estariam

reconhecendo antígenos do S. mansoni através de reações cruzadas com outros

antígenos presentes no lúmem intestinal, o que levaria ao desenvolvimento de

células regulatórias.

Em apoio aos achados deste trabalho que observou produção de IL-10 por

células de asmáticos não infectados, foi demonstrado que o antígeno de S.

mansoni, fosfatidilserina (PS), mas não o antígeno solúvel do ovo, SEA estimulou

o TLR-2 em indivíduos não primados (van der Kleij e cols. 2002), o que refoça a

suposição de que a IL-10 produzida em resposta à estimulação dos antígenos de

S. mansoni no presente estudo pode ter decorrido via estimulação de TLR-2.

Existem poucos dados na literatura avaliando o papel dos receptores “Toll-

like” no reconhecimento de proteínas. Vabulas e colaboradores, em 2001,

demonstraram que a proteina HSP60 é reconhecido pelo TLR-2 (Vabulas e cols.

2001).

Existe grande homologia entre epítopos de alguns antígenos nas diferentes

espécies de Schistosoma e até entre outros parasitas, a exemplo do Sm14 do S.

mansoni com o Fh15 da F. hepatica. Estas homologias poderiam representar uma

forma de “padrões” para o reconhecimento pelo sistema imune inato do

hospedeiro de proteínas destes parasitas.

Estudos como o realizado neste trabalho que avaliam o potencial de

antígenos parasitários em induzir mecanismos modulatórios da resposta

inflamatória alérgica, fornecerão subsídios para o desenvolvimento de novas

estratégias para o tratamento de doenças que cursam com a ativação excessiva

ou inapropriada da resposta imune (Goodridge e cols. 2005).

8. SUMÁRIO DOS RESULTADOS

1) Os antígenos de S. mansoni avaliados neste estudo (PIII, rSm22.6, rP24,

rSm14 e rSm29) induziram a produção da Interleucina-10 in vitro por

células mononucleares de sangue periférico de asmáticos não infectados

pelo Schistosoma mansoni, sendo o P24 e o Sm29 os maiores indutores

da produção de IL-10 por células destes indivíduos;

2) A indução de IL-10 foi observada também por células de indivíduos

infectados pelo S. mansoni, asmáticos ou não;

3) Não foi observada a produção de IL-10 quando as células de asmáticos

não infectados foram estimuladas com o SWAP, SEA e com o LPS;

4) Os antígenos avaliados não induziram a produção de IL-5 e induziram

baixos níveis de IL-13 e IFN-γ por células de asmáticos não infectados;

5) A adição dos antígenos PIII, Sm22.6 e P24 às culturas de células de

asmáticos não infectados estimuladas pelo Der p1 resultou em aumento

nos níveis IL-10.

9. CONCLUSÕES

Os antígenos Sm22.6, Sm14, PIII, P24 e Sm29 de S. mansoni avaliados induzem

IL-10 e baixas produções de IL-5, IL-13 e IFN-γ por células de asmáticos, podendo

ser utilizados futuramente na prevenção e tratamento de doenças alérgicas.

10. PERSPECTIVAS DE ESTUDO

1. Caracterizar a resposta imunológica específica para os antígenos

recombinantes de S. mansoni indutores de IL-10 (Sm22.6, P24 e PIII) in

vitro por células de indivíduos asmáticos, através da avaliação da produção

de citocinas do tipo Th1 (IFN-γ), Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) e anti-inflamatórias

(TGF-β e IL-10);

2. Avaliar a capacidade dos antígenos de S. mansoni PIII, Sm22.6 e P24 em

modularem a resposta imune in vitro, específica para aeroalérgeno (a

produção de IL-4, IL-5 e IL-13) em indivíduos asmáticos não infectados

pelo S. mansoni;

3. Identificar os fenótipos das células produtoras de IL-10 em culturas

estimuladas com os antígenos de S. mansoni nos asmáticos não

infectados;

4. Testar os antígenos recombinantes do S. mansoni Sm22.6, P24 e o PIII

com relação a capacidade de modular a hiperreatividade brônquica em

camundongos sensibilizados e desafiados com ovalbumina.

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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generation, and CD4+ T lymphocyte and eosinophil infiltration into the

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12. ANEXOS

ANEXO I – QUESTIONÁRIO ISAAC

SERVIÇO DE IMUNOLOGIA

HOSPITAL UNIVERSITÁRIO PROF. EDGARD SANTOS

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

NOME:__________________________________________________________________

Endereço:__________________________________________________________

Número de Inclusão : ___________________DATA : ____/_____/____

IDADE: ________DATA DE NASCIMENTO: ___/___/___ ( ) MASC ( ) FEM.

NÍVEL SÓCIO-ECONÔMICO : (RENDA FAMILIAR)

( ) ATÉ UM SALÁRIO MÍNIMO ( ) ENTRE 5 E 10 SALÁRIOS MÍNIMOS

( ) ENTRE 1 E 2 SALÁRIOS MÍNIMOS ( ) MAIS DE 10 SALÁRIOS MÍNIMOS

( ) ENTRE 2 E 5 SALÁRIOS MÍNIMOS

Quantos habitantes na casa: ___________________________________________________

Tabagismo

Outros tabagistas na casa

Sim ( ) Não ( )

Quantidade: _____cigarros / Tempo:___ ( )meses ( )anos

Sim ( ) Não ( ) Quantos:_____

Fogão à lenha: Sim ( ) Não ( )

Diesel

Sim ( ) Não ( )

Grãos

Sim ( ) Não ( )

Polens

Sim ( ) Não ( )

Outros poluentes Sim ( ) Não ( )

Quais:______________________________________________

QUESTIONÁRIO I

1. Alguma vez na vida teve chiado no peito ou falta de ar (cansaço) ?

( ) Sim ( ) Não

caso a resposta seja NÃO, passe para a pergunta numero 6.

2. Nos últimos 12 (doze) meses, você teve chiado no peito ou falta de ar (cansaço) ?

( ) Sim ( ) Não

3. Nos últimos 12 (doze) meses, você teve quantas crises de chiado no peito ou de falta de ar ?

( ) nenhuma crise

( ) 1 a 3 crises

( ) 4 a 12 crises

( ) mais de 12 crises

4. Nos últimos 12 (doze) meses, você acordou a noite com chiado no peito ou com falta de ar?

( ) nenhuma

( ) menos de uma noite por semana

( ) uma ou mais noites por semana

5. Nos últimos 12 (doze) meses, seu chiado no peito ou falta de ar, foi tão forte, a ponto de

impedir que você falasse normalmente ?

( ) Sim ( ) Não

6. Nos últimos 12 (doze) meses, você teve chiado no peito ou falta de ar, após exercícios físicos?

( ) Sim ( ) Não

7. Nos últimos 12 (doze) meses, você tem tido crises de tosse seca, à noite, sem estar gripado ou

com infecção respiratória ?

( ) Sim ( ) Não

QUESTIONÁRIO II

1. Qual a freqüência de suas gripes ou resfriado ?

( ) uma ou duas por ano.

( ) uma vez por mês.

( ) mais de uma vez por mês

2. Alguma vez na vida você teve problema de espirros, coriza (corrimento nasal), coceira ou

obstrução nasal, quando não estava resfriado ou gripado ?

( ) Sim ( ) Não

3. Em qual dos últimos 12 (doe) meses este problema ocorreu ?

( ) Janeiro ( ) Maio ( ) Setembro

( ) Fevereiro ( ) Junho ( ) Outubro

( ) Março ( ) Julho ( ) Novembro

( ) Abril ( ) Agosto ( ) Dezembro

4. Nos últimos 12 (doze) meses, quantas vezes suas atividades diárias foram atrapalhadas por

esses sintomas nasais (espirros, coriza, coceira ou entupimento) ?

( ) nenhuma

( ) pouco (alguns minutos ou poucas horas do dia)

( ) moderado (uma parte do dia – manha, tarde ou noite)

( ) muito (sintomas diários e constantes)

5. Quando você tem contato com poeira, mofo ou cheiro forte, você tem coceira, espirros ou

coriza ?

( ) Sim ( ) Não

6. Quando isso acontece você tem coceira nos olhos ou coceira na garganta ?

( ) Sim ( ) Não

QUESTIONÁRIO III

1. Alguma vez na vida você teve irritações ou coceira na pele (eczema), que apareciam e

desapareciam por pelo menos, mais de uma vez por ano ?

( ) Sim ( ) Não

2. Alguma vez essas manchas com coceira (eczema) afetaram algum desses seguintes locais :

dobras dos cotovelos, atrás do joelho, na frente dos tornozelos, abaixo das nádegas ou em volta

do pescoço, orelhas ou olhos ?

( ) Sim ( ) Não

3. Quando bebê, você apresentava brotoejas ou assaduras de difícil controle em pescoço,

bochechas, atrás das orelhas, ou na área das fraldas?

( ) Sim (....) Não

QUESTIONÁRIO IV

1. Alergia a medicamentos, bebidas ou alimentos ?

( ) Sim ( ) Não Qual: ____________________________________

2. Algum familiar direto ( PAI, MÃE, IRMÃO, FILHOS, AVÓS OU TIOS ) apresenta alguma

manifestação alérgica ( ASMA, RINITE, URTICÁRIA OU DERMATITE ) ?

( ) Sim ( ) Não Qual: _________________________________

3. Nos últimos 15 dias fez uso de algum tipo de medicamento para a sua doença ?

( ) Sim ( ) Não Qual: ____________________________________

4. Você tem alguma outra doença que necessita uso de medicamentos ?

( ) Sim ( ) Não Qual: _____________________________

OBSERVAÇÕES A CRITÉRIO DO MÉDICO :

ANEXO II – SUBMISSÃO E APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA

ANEXO III – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

100

SERVIÇO DE IMUNOLOGIA

HOSPITAL UNIVERSITÁRIO PROF. EDGARD SANTOS – UFBA

Rua Augusto Viana, s/n – Canela – CEP 40140.000 – Salvador-BA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

O presente estudo tem a finalidade de avaliar a associação entre a asma e a infecção por

helmintos e você está sendo selecionado para participar deste estudo, na condição de voluntário.

Esta participação, implica na sua concordância em submeter-se, periodicamente, durante um

ano, aproximadamente, a exames para determinar a presença de alergia e parasitoses, que

consistem em: responder a um questionário com perguntas sobre alergias, submeter-se a exames

clínicos, além da coleta de amostras de sangue e de amostras de fezes.

Serão colhidas amostras de 20mL de sangue venoso, com o auxílio de seringas e agulhas

descartáveis. Pretendemos dosar no sangue a presença de algumas proteínas que podem se elevar

ou não nas doenças alérgicas e parasitárias após estimulação com as proteínas do S. mansoni a

serem testadas. Quando da marcação do dia do exame, o voluntário receberá os frascos coletores de

fezes, que deverão ser devolvidos, para que possamos realizar os exames parasitológicos.

As pessoas que se submeterem aos exames receberão, se desejarem, os resultados

dos mesmos. No caso de detectarmos a presença de parasitas intestinais, você será tratado

gratuitamente e, no caso de observarmos a presença de doença alérgica, você receberá

instruções para o tratamento da mesma.

Qualquer dúvida que você tenha sobre o que está escrito neste consentimento ou sobre os

procedimentos que constam desse projeto de pesquisa, poderá entrar em contato com Dra. Maria

Ilma Araujo, coordenadora do projeto, médica do Serviço de Imunologia do HUPES-UFBA, Rua

Augusto Viana, s/n – Canela, telefone (071)237-7353, ou com o Comitê de Ética em Pesquisa do

Ambulatório Magalhães Neto, na pessoa do Dr. Antônio Barata, no endereço Rua Padre Feijó, 240

- Canela. Caso você decida deixar de participar do estudo em qualquer momento, mesmo depois de

assinar este consentimento, você continuará, sem prejuízos, sendo acompanhado pelo Serviço de

Imunologia.

Afirmo que compreendi o que está escrito acima e concordo em participar deste projeto de

pesquisa, voluntariamente. _________________________, _____/_____/_____.

Assinatura: __________________________________________ Ficha n.º: __________

ome:______________________________________________________________

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