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unesp
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
Carolina Munari Rodrigues
Análise da resistência a cobre e zinco sobre o crescimento e
expressão gênica em Xylella fastidiosa em condições de
biofilme
Botucatu
Estado de São Paulo, Brasil
2007
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ii
unesp
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
Carolina Munari Rodrigues
Análise da resistência a cobre e zinco sobre o crescimento e
expressão gênica em Xylella fastidiosa em condições de
biofilme
Dissertação apresentada para obtenção
do Título de Mestre em Ciências
Biológicas, Área de Concentração em
Genética
Orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio Machado
Co-orientadora: Profa. Dra. Alessandra Alves de Souza
Botucatu
Estado de São Paulo, Brasil
2007
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Rodrigues, Carolina Munari.
Análise da resistência a cobre e zinco sobre o crescimento e expressão
gênica em Xylella fastidiosa em condições de biofilme / Carolina Munari
Rodrigues. – Botucatu : [s.n.], 2007.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências de Botucatu, 2007.
Orientador: Marcos Antonio Machado
Co-orientadora: Alexandra Alves de Souza
Assunto CAPES: 20202008
1. Genética 2. Drogas - Resistência em microorganismos
CDD 575.21
Palavras-chave: Compostos antimicrobianos; RT-qPCR e EPS
ii
Aos meus pais Clóvis e Heloisa,
Por todo amor, ensinamentos, apoio e incentivo
DEDICO
OFEREÇO
Aos meus irmãos Claúdia e Marcos, por estarem
sempre presentes em todos os momentos de
minha vida.
À Ellen pelo apoio e incentivo.
A minha querida sobrinha Gabriela
E para Alex, pelo amor, dedicação e paciência
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela vida.
Ao Dr. Marcos Antonio Machado pela orientação, oportunidade e apoio para a
realização desse trabalho.
Agradeço imensamente a Dra. Alessandra Alves de Souza pela orientação,
ensinamentos, amizade e dedicação.
Aos pesquisadores, Dr. Marco Aurélio Takita, Dr. Helvécio Della Coletta Filho
e Dra. Mariângela Cristofani, pelos ensinamentos, atenção e auxílio na realização
desse trabalho.
Ao departamento de Genética, IBB / Unesp – Botucatu, professores e
departamento de Pós-graduação que foram de essencial importância para a realização
do trabalho.
À Capes pela concessão da bolsa de estudo.
Ao Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC e a todos seus funcionários ....
As amigas Raquel Caserta, Mariana S. e Silva, Juliana Baptista, Eliane Locali,
Renata Luizon, Silvia Dorta e Marines Bastianel pelo companherismo, conselhos,
ajuda e amizade que são muito importantes para mim.
Aos colegas da pós-graduação, Fernanda, Rafael, Karen, Rodrigo, Thiago,
Flávia e Aparecido pela boa convivência e amizade.
À Jacqueline e Lígia pela colaboração na realização desse trabalho.
Aos companheiros, amigos e estagiários do Laboratório de Biotecnologia,
Kleber, Kely, Amélia, Chica, Luis, Adriana e Adriano.
Agradeço aos pesquisadores doutores, Maria Luiza, Sérgio, Valdenice,
Alexandre, Bergen, Andrea, Andreia, Juliana, Eduardo, Raquel, Carla pelo auxílio e
atenção.
E a todos que direta ou indiretamente colaboraram para a concretização desse
trabalho.
iv
ABREVIAÇÕES
PW Meio de cultura Periwinkle wilt
XDM2 Meio de cultura definido de Xylella fastidiosa
BCYE Meio de cultura buffered charcoal yeast extract
EPS Matriz extracelular de exopolissacarídeo
CuSO
4
Sulfato de cobre
ZnSO
4
Sulfato de zinco
pPW Células de X. fastidioda na condição planctônica cultivadas no meio de
cultura PW
bPW Células de X. fastidioda em biofilme cultivadas no meio de cultura PW
pXDM2 Células de X. fastidioda na condição planctônica cultivadas no meio de
cultura XDM2
bXDM2 Células de X. fastidioda em biofilme cultivadas no meio de cultura
XDM2
pBCYE Células de X. fastidioda na condição planctônica cultivadas no meio de
cultura BCYE
bBCYE Células de X. fastidioda em biofilme cultivadas no meio de cultura
BCYE
CVC Clorose variegada do citros
DO Densidade óptica
UFC Unidade formadora de colônia
MIC Concentração mínima inibitória
qPCR PCR quantitativo em tempo real
CE Controle endógeno
v
SUMÁRIO
Página
RESUMO.................................................................................................... viii
ABSTRACT................................................................................................
x
1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 1
2. HIPÓTESE DO TRABALHO................................................................ 2
3. OBJETIVO............................................................................................. 2
3.1. Geral..........................................................................................
3.2. Específicos.................................................................................
2
3
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................... 3
4.1. Clorose variegada dos citros (CVC)..........................................
4.2. A bactéria Xylella fastidiosa......................................................
4.3. Genoma funcional da Xylella fastidiosa....................................
4.4. A formação do biofilme e seu papel na patogenicidade e
adaptação da X. fastidiosa.................................................................
4.5. Família ABC-Transporte...........................................................
4.6. Família “P-Type ATPase”.........................................................
4.7. Família Resistência-Nodulação-Divisão celular (RND)............
4.8. Família Facilitadora de Difusão de Cátions
(CDF)................................................................................................
4.9. Outros genes envolvidos na resistência a metais.......................
3
6
11
13
19
21
23
25
27
CAPÍTULO 1. Curva de Crescimento de Xylella fastidiosa no meio
definido.......................................................................................................
29
RESUMO.................................................................................................... 29
ABSTRACT................................................................................................
30
1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 31
2. OBJETIVO............................................................................................. 32
vi
2.1. Geral..........................................................................................
2.2. Específicos................................................................................
32
32
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
32
4. RESULTADOS......................................................................................
33
5. DISCUSSÃO..........................................................................................
35
CAPÍTULO 2. Avaliação da resistência de Xylella fastidiosa a cobre e
zinco em condições de crescimento planctônico e em biofilme.................
38
RESUMO.................................................................................................... 38
ABSTRACT................................................................................................
39
1. INTRODUÇÃO......................................................................................
40
2. OBJETIVO.............................................................................................
41
2.1 Geral...........................................................................................
2.2 Específicos.................................................................................
41
41
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
41
3.1. Estirpe bacteriana e condições de cultivo.................................
3.2. Determinação da concentração mínima inibitória (MIC) das
células planctônicas..........................................................................
3.3. Determinação da MIC para as células em biofilme..................
3.4. Determinação de exopolissacarídeos (EPS)..............................
41
42
44
46
4. RESULTADOS......................................................................................
46
4.1. Determinação da concentração mínima inibitória (MIC) de
CuSO
4
das células planctônicas e em biofilme................................
4.2. Determinação da concentração mínima inibitória (MIC) de
ZnSO
4
das células planctônicas e em biofilme................................
4.3. Teor de EPS nas células planctônicas e em biofilme................
46
49
51
5. DISCUSSÃO..........................................................................................
53
CAPÍTULO 3. Análise da expressão gênica de Xylella fastidiosa na
condição de biofilme em diferentes concentrações de cobre e zinco.........
57
vii
RESUMO....................................................................................................
57
ABSTRACT................................................................................................
59
1. INTRODUÇÃO......................................................................................
61
2. OBJETIVO.............................................................................................
62
2.1 Geral...........................................................................................
2.2 Específicos.................................................................................
62
62
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
62
3.1. Extração de RNA total e síntese de cDNA...............................
3.2. Síntese e validação dos primers................................................
3.3. Eficiência de amplificação........................................................
3.4. Análise da expressão gênica.....................................................
62
63
65
65
4. RESULTADOS......................................................................................
67
4.1. RNA total e validação dos primers...........................................
4.2. Expressão relativa dos genes associados à resistência a cobre
e zinco no biofilme de X. fastidiosa.................................................
67
70
4.2.1. Expressão relativa dos genes associados à resistência a
cobre no biofilme.............................................................................
4.2.2. Expressão relativa dos genes associados à resistência a
zinco no biofilme.............................................................................
70
74
5. DISCUSSÃO..........................................................................................
77
6. CONCLUSÕES GERAIS.......................................................................
82
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................
83
viii
Análise da resistência a cobre e zinco sobre o crescimento e
expressão gênica em Xylella fastidiosa em condições de biofilme
RESUMO
Baseado nas informações geradas após o seqüenciamento do genoma, foi
desenvolvido uma série de meios de cultura de composição definida (XDM1, XDM2,
XDM3, XDM4 e XDM5). Portanto, um dos objetivos do presente trabalho foi
estabelecer a curva de crescimento da X. fastidiosa no meio definido XDM2. Foi
utilizada a estirpe 9a5c de X. fastidiosa mantida nesse mesmo meio de cultura. A
medida da taxa de crescimento bacteriano foi realizada através de leituras de
densidade óptica durante dezesseis dias com intervalos de 48 horas. A avaliação da
viabilidade celular foi realizada através da contagem de unidade formadora de
colônia (UFC) por diluição seriada. As duas avaliações apresentaram uma alta
correlação (R
2
= 0,91) verificada através de regressão exponencial. O início da fase
estacionária foi obtido após 10 dias de crescimento. De posse dos dados de UFC, foi
possível calcular o tempo de geração da X. fastidiosa no meio XDM2, de
aproximadamente 21 horas. Comparando o tempo de geração obtido na curva de
crescimento em meio PW (11,37h), foi comprovado que a bactéria apresenta um
crescimento mais rápido em meio PW do que no meio definido XDM2.
Outro aspecto interessante revelado no estudo do genoma funcional da X.
fastidiosa está relacionado à expressão de genes associados à patogenicidade. O
principal mecanismo de patogenicidade é a formação de biofilme no xilema da planta
hospedeira conduzindo ao bloqueio dos vasos do xilema. Análise da expressão
diferencial de genes desse fitopatógeno em condição de virulência e durante a
formação do biofilme revela padrões de genes associados à adaptação e
competitividade no ambiente do hospedeiro. Esses genes possivelmente são ativados
no biofilme maduro e são essenciais para sua manutenção na planta. Além disso,
sabe-se que bactérias que formam biofilme apresentam resistência crescente a
compostos antimicrobianos, tais como, antibióticos, metais pesados e toxinas, à
medida que o biofilme se estrutura. Baseado nessas informações esse trabalho
avaliou a resposta de resistência a cobre e zinco de X. fastidiosa com crescimento em
ix
biofilme comparado ao planctônico, e também a expressão de genes possivelmente
associados à resistência dessa bactéria submetidos a diferentes concentrações desses
metais. Os genes avaliados pertencem a famílias de RND (resistance-nodulation-
division), transportadores ABC (ATP-binding cassete), “P-type ATPase” e
facilitadora de difusão de cátions (CDF). Além desses, outros genes pertencentes ao
operon cut, que provavelmente estão envolvidos na homeostase de cobre, também
foram analisados. A expressão foi avaliada utilizando PCR quatitativo em tempo
real. Foram utilizados biofilmes tratados com diferentes concentrações de cobre e
zinco. Esses biofilmes foram formados em dois meios de cultura (definido e
indefinido) para cada metal avaliado. Esse procedimento foi adotado para verificar se
os níveis de expressão podem variar de acordo com o meio em que o biofilme é
formado.
Em relação à análise da resistência do biofilme comparada às células
planctônicas, os resultados demonstraram que a X. fastidiosa em biofilme apresenta
maior resistência ao cobre e zinco. Além dessa análise, também foi medida a
quantidade exopolissacarídeo (EPS) produzida pelas células de X. fastidiosa nas duas
condições de crescimento, e em diferentes meios de cultura. Como resultado foi
verificado que o biofilme de X. fastidiosa apresentou uma quantidade
significativamente maior (P≤0,05) de EPS em relação às células planctônicas,
indicando que essa substância possivelmente é de grande importância na resistência a
substâncias nocivas. Adicionalmente, após análise da expressão gênica, foi
verificado que os genes demonstraram uma indução significativa na presença de
cobre e zinco na maioria dos genes avaliados. Os maiores níveis de expressão foram
observados nos meio complexos, tanto para cobre (PW) quanto para zinco (BCYE).
Em XDM2, para ambos os compostos antimicrobianos testados, houve uma
diminuição na indução dos genes em relação aos meios indefinidos.
Provavelmente, a ação conjunta desses genes e mais a proteção física conferida
pelo EPS promovem a resistência de X. fastidiosa aos compostos antimicrobianos,
tendo um papel fundamental na sobrevivência das células e sugerindo que um
eventual controle dessa bactéria por algum componente bactericida possa ser ainda
mais difícil quando biofilmes são formados no interior do xilema.
Palavras-chave: compostos antimicrobianos, RT-qPCR, EPS.
x
Analysis of resistance to cooper and zinc ever the growth and gene
expression in Xylella fastidiosa in biofilm condition
ABSTRACT
Based on informations generated after the genome sequencing, a series of
culture media of defined composition were developed (XDM1, XDM2, XDM3,
XDM4 e XDM5). Therefore, one of the objectives of the present work was to
establish the growth curve of X. fastidiosa in the defined medium XDM2. For this,
we utilized the 9a5c strain of X. fastidiosa maintained in this medium. The
measurement of the bacterial growth rate was done by optical density analysis during
sixteen days with intervals of 48 hours. The evaluation of cellular viability was
carried out counting the colony units forming (CFU) by serial dilution. Both
evaluations presented a high correlation (R
2
= 0,91) verified by exponential
regression. The beginning of the stationary phase was observed after ten days of
growth. With the data of CFU, it was possible to calculate the generation time of X.
fastidiosa in XDM2 medium, estimated to be of approximated 21 hours. Comparing
the generation time obtained for the growth curve in PW medium (11,37 hours), we
proved that the bacteria grow faster in PW compared with the defined medium
XDM2.
Another interesting aspect reveled by the study of functional genome of X.
fastidiosa is related to the expression of genes associated with pathogenicity. The
main mechanism of its pathogenicity is the formation of a biofilm in the xylem of the
host plant, causing the blockage of the xylem vessels. Analysis of the differential
expression of genes of this phytophatogen in condition of virulence and during the
biofilm formation reveals standards associated to adaptation and competition in the
host environment. These genes are possibly activated in the mature biofilm and are
essential for its maintenance in the plant. Besides, it is known that bacteria that form
biofilm present elevated resistance to antimicrobial compounds while biofilm is
structured, like antibiotics, heavy metals, and toxins. Based on these information, in
this work we evaluated the resistance response of X. fastidiosa growing in biofilm to
cooper and zinc compared to planktonic growth. Moreover, we also analyzed the
xi
expression of genes possibly associated to resistance, when the bacteria are
submitted to different concentrations of these metals. The genes evaluated belong to
the RND family (resistance-nodulation-division), ABC transporters (ATP-binding
cassette), P-type ATPases, and Cations Diffusion Facilitators (CDF). Besides these
genes, others from the cut operon, which are probably involved in cooper
homeostasis, were also analyzed. The expression was evaluated using real time
quantitative PCR. Biofilms, treated with different concentrations of cooper and zinc,
were used for the analysis. These biofilms were formed in two culture media
(defined and undefined) for the evaluations. This procedure was adopted to verify
whether the levels of expression could vary according to the medium where the
biofilm is formed.
In relation to the analysis of resistance of biofilm compared to planktonic cells,
the results demonstrated that X. fastidiosa in biofilm presents higher resistance to
cooper and zinc. In addition, the amount of exopolissacaride (EPS) produced by X.
fastidiosa cells in both growth conditions and in the different culture media was
measured. We verified that the biofilm of X. fastidiosa presented an amount of EPS
significantly higher (P≤0.05) than the planktonic cells, indicating that this substance
is possibly important in the resistance to harmful substances. Furthermore, after
analysis of gene expression, it was verified that they show a significant induction in
presence of cooper and zinc in the majority of the evaluated genes. The higher levels
of expression were observed in the complex medium both for copper and zinc. In
XDM2, for both antimicrobial compounds tested, there was a reduction in the
induction of genes in comparison to the undefined media.
Probably, the action of these genes together and the physical protection
conferred by the EPS promote the resistance of X. fastidiosa to the antimicrobial
compounds, representing a fundamental role in the survival of the cells and
suggesting that an eventual control of this bacteria by some bactericide component
would be even more difficult when biofilms are formed inside of xylem vessels.
Key-words: antimicrobial compounds, RT-qPCR, EPS.
1
1. Introdução
Os citros são plantas nativas do sudeste do continente asiático de onde foram
distribuídos para várias partes do mundo. Nas Américas, provavelmente essas plantas
foram introduzidas a partir de 1493 através de sementes trazidas por Colombo
(Webber et al., 1967). No Brasil, os citros foram introduzidos por volta de 1530 com
o primeiro relato em Cananéia (SP), expandindo-se para outras partes do Brasil
rapidamente (Hasse, 1987). O Brasil entrou no século XXI com uma produção de
18,5 milhões de toneladas de citros, sendo o maior produtor e exportador de suco
concentrado e congelado (Amaro and Salva, 2001). No entanto, o setor do
agronegócio tem enfrentado problemas principalmente de ordem fitossanitária
devido ao grande número de pragas e doenças. Dentre essas a clorose variegada dos
citros (CVC) é, sem dúvida, uma das mais preocupantes.
A CVC é causada pela Xylella fastidiosa, uma bactéria Gram negativa, de
crescimento fastidioso e limitada ao xilema das plantas. Ela também é responsável
por outras doenças economicamente importantes, como mal de Pierce em videiras,
escaldadura da ameixeira, entre outras.
Devido à importância econômica da CVC, a X. fastidiosa foi o primeiro
patógeno a ter seu genoma completamente seqüenciado gerando um grande número
de informações (Simpson et al., 2000). Após o seqüenciamento, houve a necessidade
de estudos sobre genoma funcional que auxiliassem no entendimento das funções dos
genes putativamente identificados.
Um dos aspectos interessantes para serem pesquisados no genoma funcional da
X. fastidiosa está relacionado à expressão de genes associados a patogenicidade da
bactéria, junto com outros de adaptação e competitividade no ambiente do
hospedeiro. Dentre as hipóteses relacionadas à patogenicidade, a formação do
biofilme ao longo do processo de colonização da bactéria dentro dos vasos do xilema
é considerado um dos principais mecanismos de patogenicidade (Souza et al., 2003;
Osiro et al., 2004). O crescimento em biofilme favorece a resistência a compostos
antimicrobianos.
A principal estratégia de controle de bacterioses em vários patossistemas é a
aplicação de compostos antimicrobianos, como antibióticos e compostos cúpricos.
Entretanto, os estudos de respostas a estes compostos em bactérias que formam
2
biofilme como Pseudomonas aeruginosa e Staphyloccocus aureus (Brooun et al.,
2000; Teitzel and Parsek, 2003; Fux et al., 2004) têm mostrado que a dose necessária
para controle é geralmente muito maior do que a utilizada quando as células crescem
de forma planctônica, sugerindo dificuldades no controle ao se utilizar essa
estratégia. Alguns ensaios em meio sólido já foram realizados para determinar as
concentrações mínimas inibitórias (MICs) de X. fastidiosa a cobre e zinco (Caldana
et al., 2001). Contudo, apesar de X. fastidiosa crescer em biofilme, e este estar
envolvido com o mecanismo de patogenicidade, nenhum estudo visando o
entendimento de resistência a compostos antimicrobianos nestas condições de
crescimento foi até agora realizado. Portanto, o objetivo principal desse trabalho foi
o de avaliar a resposta da bactéria, tanto em crescimento em biofilme quanto
planctônico, a compostos antimicrobianos.
Com os resultados dos estudos biológicos e moleculares da resistência do
biofilme da X. fastidiosa pretende-se esclarecer prováveis mecanismos da resistência
a esses compostos estabelecendo assim possíveis estratégias para o controle da CVC.
2. Hipótese do trabalho
Células de X. fastidiosa em biofilme são menos sensíveis a compostos
antimicrobianos do que células que crescem de forma planctônica. Essa menor
sensibilidade estaria relacionada ao efeito sinergístico entre diferentes mecanismos
de resposta adaptativa da bactéria às condições de crescimento.
3. Objetivo
3.1. Geral:
- Avaliar a resposta de resistência de X. fastidiosa a cobre e zinco em
condições de crescimento em biofilme e planctônico;
- Avaliar a expressão de genes possivelmente associados à resistência do
biofilme de X. fastidiosa.
3
3.2. Específicos:
- Estabelecer a curva de crescimento para X. fastidiosa em meio definido;
- Determinar concentração mínima inibitória (MICs) de CuSO
4
e ZnSO
4
no
crescimento de X. fastidiosa nas condições de biofilme e planctônica;
- Avaliar por qPCR a expressão relativa dos genes metI, acrA, acrB, czcA,
mexE, czcD, copB, cutA, cutB, cutC sob diferentes concentrações de CuSO
4
e ZnSO
4
na condição de biofilme.
4. Revisão Bibliográfica
4.1. Clorose variegada dos citros (CVC).
Atualmente, o Brasil é o maior exportador de suco de laranja, responsável por
53% do suco produzido no mundo e por 80% das exportações (ANBA). Só no Estado
de São Paulo esta atividade responde por aproximadamente 400.000 empregos
diretos e indiretos, gerando 1,5 bilhões de dólares na exportação de suco concentrado
congelado, suco não concentrado e outros produtos, como pectina e pellets para
ração. Esses dados demonstram que o agronegócio citrícola tem contribuído nos
sucessivos superávits comerciais no Brasil, gerando divisas e ao mesmo tempo
empregos. Apesar das condições climáticas e de cultivo serem apropriadas, a
produtividade brasileira ainda é baixa quando comparada a outros países (duas caixas
de 40,8 kg/planta/ano no Brasil, contra seis na Flórida), o que pode ser atribuído a
fatores como pragas, doenças e ausência de irrigação (Amaro et al., 2001). Dentre
essas doenças que afetam essa produtividade, a clorose variegada dos citros (CVC),
causada pela bactéria X. fastidiosa, é sem dúvida uma das mais preocupantes,
afetando todas as variedades comerciais de laranjas doces no Brasil (Lee et al.,
1992).
Dados recentes demonstram que aproximadamente 40% dos pomares no
Estado de São Paulo e no sul do Triângulo Mineiro apresentam incidência da doença.
O levantamento amostral de CVC feito pelo Fundecitrus (Fundo de Defesa da
Citricultura) entre os meses de julho e agosto do ano de 2006, mostrou que ela se
mantém no mesmo nível nos últimos três anos. As estimativas dos danos econômicos
4
causados pela CVC são da ordem de 286 – 322 milhões de dólares na forma de
replantio, poda de plantas infectadas e controle químico do vetor (Fernandes-Jr,
2003).
Em 1987, foram observada pela primeira vez, laranjeiras com sintomas ainda
desconhecidos no sudoeste de Minas Gerais e no norte do Estado de São Paulo (De
Negri, 1990). Essa nova doença foi denominada “amarelino” ou clorose variegada
dos citros (CVC). Nessas plantas sintomáticas foi detectada a presença de bactérias
associadas ao xilema, e sua morfologia assemelhava-se à bactéria X. fastidiosa,
causadora do mal de Pierce em videiras. Em análise por microscopia eletrônica
dessas bactérias limitadas ao xilema, admitiu-se a hipótese da bactéria X. fastidiosa
ser o agente causal da CVC (Rossetti et al., 1990).
Os sintomas típicos da CVC incluem pequenas manchas internervais amarelas
na face superior da folha que inicialmente não são muito extensas. As cloroses na
face inferior da folha correspondem às manchas variando entre o vermelho e o
marrom. Quando a folhas ficam mais velhas, as áreas que apresentam essas lesões
podem coalescer e necrosarem (Rossetti and De Negri, 1990) (Figuras 1A, B e C).
Em plantas muito afetadas, ocorre atrofia da copa, desfolhas dos ramos mais altos,
morte dos ponteiros, encurtamento de internódios, podendo ocorrer a murcha dos
ramos (Figura 1D). As gemas dos ramos afetados tendem a brotar com mais
freqüência e vigor formando novos ramos doentes, portanto, debilitando ainda mais a
planta (Laranjeira, 1997).
Após os sintomas foliares, surgem os sintomas nos frutos que estão presentes
nos ramos sintomáticos, havendo uma tendência à frutificação em “pencas” (Rossetti
and De Negri, 1990; Laranjeira, 1997) (Figura 1E). Os frutos afetados apresentam
redução no tamanho, ficam endurecidos e com deficiência de potássio (Figura 1F).
Outras características dos frutos doentes são o amarelecimento precoce, surgimento
de lesões marrom-escuras (tipo queimadura) podendo estar relacionado ao fato dos
frutos apresentarem casca fina (Laranjeira, 1997). Essas características prejudicam a
produção de suco e até mesmo o consumo in natura.
5
Figura 1. Sintomas da clorose variegada do citros (CVC). A, B e C: sintomas
foliares; D: sintomas de desfolha de ramos. E: sintomas dos frutos em “penca”. F:
mostrando a diferença dos frutos sadios e doentes. (Fonte: H.D. Coletta Filho).
A transmissão da X. fastidiosa causadora da CVC é feita por cigarrinhas
(Hemíptera: Cicadellidae) que se alimentam da seiva do xilema das plantas
(Hoppkins, 1989). As espécies mais importantes em citros são: Dilobopterus
costalimai, Acrogonia terminales e Oncometopia faciales (Lopes et al., 1996;
6
Roberto et al., 1996). Entretanto, outras cigarrinhas da família Cicadelidae foram
comprovadas como sendo transmissoras em citros, constituindo onze espécies
vetoras (Lopes, 1999). Essas cigarrinhas ao se alimentarem da seiva do xilema de
plantas infectadas adquirem a bactéria, que também é capaz de se multiplicar no
aparelho bucal. Todas as fases de desenvolvimento das cigarrinhas podem transmitir
a bactéria, exceto a fase ninfa devido às ecdises (Purcell and Finlay, 1979; Purcell,
1994). Entretanto, a fase adulta é a mais eficiente na transmissão e uma vez adquirida
a bactéria, os insetos podem transmití-la pelo resto de suas vidas (Hill and Purcell,
1995). Embora as cigarrinhas atuem como vetores da X. fastidiosa, a eficiência de
aquisição e transmissão pode variar em função da espécie, da afinidade com a planta
hospedeira (Purcell and Hopkins, 1996; Marucci, 2003) e do local de alimentação
nas plantas (Lopes, 1996).
Outra forma de transmissão da X. fastidiosa se dá por enxertia de borbulhas
infectadas (Jacomino et al., 1993) podendo ser perpetuada da mesma forma (Rosseti
et al., 1995; Coletta-Filho et al., 2000). Também foi mostrada a transmissão da
bactéria por enxertia natural de raízes (He et al., 2000). Mais recentemente, foi
comprovada a presença da X. fastidiosa em sementes e frutos de laranja doce com
sintomas de CVC que poderiam ser passadas para as plântulas originárias dessas
sementes (Li et al., 2003). Não foi constatado a transmissão mecânica dessa bactéria
através de objetos cortantes.
4.2. A bactéria Xylella fastidiosa.
A X. fastidiosa foi relatada pela primeira vez em 1973 (Goheen et al., 1973;
Hopkins and Mollenhaver, 1973) inicialmente associada à doença de Pierce (PD) em
videira. Na época, devido à dificuldade de isolamento, ela foi classificada como
próxima a “rickettsiae” da família Rickettsiaceae por razões de semelhança ao
crescimento lento e necessidade de um vetor para transmissão (Gohen et al., 1973;
Hopkins and Mollenhaver, 1973). Em 1978, a X. fastidiosa associada à PD foi
isolada pela primeira vez em meio de cultivo da rickettsiaceae Rochalimaea quitana
(Davis et al., 1978). No entanto, estudos do DNA de X. fastidiosa revelaram uma
composição de G+C diferente do padrão do grupo das rickettsiaceas, indicando que
esse microrganismo não seria semelhante às bactérias desse grupo (Kamper et al.,
7
1985; Wells et al., 1987). Mais tarde, as bactérias limitadas ao xilema de difícil
isolamento passaram a ser chamadas de XLB, do inglês “xylem-limited bacteria”, e a
X. fastidiosa passou a pertencer a esse grupo (Hopkins, 1989).
Posteriormente, análises da região 16S, conteúdos de GC, tamanhos de genoma
e comparação de ácidos graxos entre isolados de bactérias limitadas ao xilema
indicaram similaridades entre esses microrganismos, que então foram agrupados
(Wells and Raju, 1984; Kamper et al., 1985). Em 1987, Wells e colaboradores
classificaram o gênero Xylella pertencente ao Filo Proteobacteria, sub-divisão Gama,
Ordem Lysobacteriales, Família Lysobactriaceae, representado pela espécie X.
fastidiosa que está relacionada geneticamente às bactérias do grupo Xanthomonas.
Em 1991, a identidade da X. fastidiosa associada à CVC foi confirmada por
Leite Junior and Leite. No entanto, só em 1993, os postulados de Koch foram
cumpridos (Chang et al., 1993) e confirmados posteriormente (Lee et al., 1993;
Hartung et al., 1994), determinando assim a X. fastidiosa como o agente causal da
CVC.
Recentemente, foi proposta a divisão da espécie X. fastidiosa em três
subespécies através da comparação das seqüências das regiões espaçadoras entre os
genes 16S e 23S (ITS). A primeira subespécie, piercei, incluiria cepas de videira,
alfavaca, duas amendoeiras e arce, com 85% de identidade entre elas. A segunda,
multiplex, com 84% de identidade, compreendiria as estirpes de pêssego, ulmeiro,
ameixa, videira “pigeon”; plátamo e amendoeira. E a terceira subespécie, pauca,
incluiria somente as estirpes de citros com 87% de identidade (Schaad et al., 2004).
A X. fastidiosa é uma bactéria Gram negativa, com formato de bastonete e de
tamanho variável, podendo chegar até 0,7 µm de diâmetro e 4 µm de comprimento.
Caracteriza-se pelo crescimento lento em meio de cultura, sendo suas colônias
circulares, discretas, medindo até 0,6 mm de diâmetro após 10 dias de incubação a
28ºC, podendo alcançar 1,5 mm depois de 30 dias, com variações decorrentes do
meio de cultura utilizado (Coletta-Filho, 2002). Essa bactéria não apresenta
motilidade devido à falta de flagelos, também não apresenta pigmentação e é
aeróbica. Seu crescimento se dá na condição de 26 e 28
º
C com pH ótimo entre 6,5 e
6,9, não hidrolisa gelatina, utiliza hipurato, não fermenta glicose, sendo negativa para
indol, H
2
S, lipase, amilase, fosfatase e b-galactosidase, mas positva para catalase e
hidrólise de amido (Lacava and Miranda, 2000). O conteúdo de guanina e citosina
8
(G+C) é de 52,7% (Simpson et al., 2000). Essa bactéria é sensível a polimixina,
clorafenicol, tetraciclina, netilmicina (Miranda and Lacava, 2000), gentamicina e
kanamicina (Ribeiro, 2002).
Ela é limitada ao xilema das plantas hospedeiras, sendo encontrada em raízes,
caules, folhas, frutos e sementes (Hopkins, 1989; Purcel and Hopkins, 1996; Beretta
et al., 1997; Li et al., 2003). Coloniza, ainda, o lúmen do canal alimentar de insetos
vetores (cigarrinhas) (Hopkins, 1995). Possui uma ampla gama de hospedeiros,
incluindo membros de pelo menos 28 famílias de plantas mono e dicotiledôneas
(Freitag, 1951; Raju and Wells, 1986; Wells et al., 1987; Hopkins, 1989; Purcell and
Hopkins, 1996).
X. fastidiosa é causadora de doenças em culturas de grande importância
econômica, dentre elas estão a alfafa, amendoeira, ameixeiras japonesas, amoreira,
cafeeiro, carvalho, citros, espirradeira, olmo, pecan, pessegueiro, pereira e videira
(Goheen et al., 1973; Hopkins and Mollenhauer, 1973; Kitajima et al., 1975;
Mircetich et al., 1976; Hearon et al., 1980; Rossetti et al.,1990; Leu and Su, 1993;
Paradela Filho et al., 1995; Purcel and Saunders, 1999; Sanderlin and Heyderich-
Alger, 2000).
A X. fastidiosa foi o primeiro patógeno de planta a ter seu genoma
completamente seqüenciado (Simpson et al., 2000). O isolado seqüenciado foi o
clone 9a5c obtido de laranja Valência. O genoma dessa bactéria é composto de um
cromossomo principal de 2.679.305 pares de base (pb) com um conteúdo de 52,7%
de G+C (guanina e citosina), e dois plasmídeos menores, um com 51.158 pb,
possuindo 49,6% de G+C e outro com 1.285 pb contendo 55,6% de G+C, onde estão
codificadas 2.448 proteínas, sendo 48% delas semelhantes a proteínas já descritas em
outros organismos (Simpson et al., 2000). Essas proteínas homólogas foram
categorizadas em diferentes grupos funcionais (www.aeg.lbi.unicamp.br/xf). Dentre
essas categorias, 147 proteínas foram associadas estando envolvidas na
patogenicidade, virulência e adaptação.
O genoma da X. fastidiosa apresenta cerca de 7% de seqüências homólogas a
de fagos, o que explicaria a grande diversidade entre as estirpes, admitindo-se que os
bacteriófagos são considerados mediadores da evolução e da transferência de fatores
de virulência sendo responsável pelo surgimento de novas espécies (Simpson et al.,
2000).
9
O sistema de transporte parece ser o componente central das interações
patógeno/hospedeiro. Em X. fastidiosa foram encontrados cerca de 140 genes
codificando proteínas relacionadas ao transporte, dos quais, 66 genes parecem estar
relacionados ao metabolismo de ferro. Esses genes aparentemente podem estar
associados à absorção de micronutrientes no xilema, contribuindo na redução de
ferro e outros íons de transição, o que poderia contribuir para os sintomas típicos da
doença nas folhas. (Simpson et al., 2000). Com o seqüenciamento genômico desse
fitopatógeno pode-se traçar as vias de síntese de aminoácidos, nucleotídeos, lipídeos
e o metabolismo energético, que possui como fonte principal o açúcar. A maquinaria
de transcrição e tradução da estirpe 9a5c é semelhante à de E. coli.
Curiosamente, não foram encontrados no genoma da X. fastidiosa os genes
responsáveis pela especificidade planta/patógeno que geralmente são encontrados em
bactérias fitopatogênicas. Esses genes de avirulência (avr) presentes nos patógenos
interagem com as proteínas de resistência do hospedeiro (R) (Baker et al., 1997).
Acreditava-se que esses genes poderiam estar entre os genes com função ainda não
determinada. No entanto, isso não seria possível já que os genes avr são dependentes
do sistema de secreção tipo III e são extremamente conservados, descartando assim
essa hipótese. A ausência de genes avr pode ser explicada pelo modo de vida dessa
bactéria e tipo de transmissão, que não necessitam de invasão e/ou lise das células
dos hospedeiros para a sua infecção e sobrevivência (Dow and Daniels, 2000;
Lambais et al., 2000; Simpson et al., 2000).
Antes do seqüenciamento do genoma, as informações sobre seu mecanismo de
patogenicidade não eram bem esclarecidas. Acreditava-se que a oclusão do xilema
pelas bactérias, tiloses e goma, além da produção de fitotoxinas e o desbalanço de
reguladores de crescimento, seriam responsáveis pela patogenicidade da X. fastidiosa
(Hopkins, 1989). No entanto, nenhum experimento conseguiu comprovar ou excluir
nenhuma dessas hipóteses. Com a publicação do genoma e baseado nos sintomas da
CVC, puderam-se esclarecer algumas hipóteses sobre os mecanismos envolvidos na
patogenicidade da X. fastidiosa.
Uma das hipóteses sobre os mecanismos está relacionada à produção de exo-
enzimas que degradam a parede celular, sendo três endo-1,4-β-glucanases e uma
celobiohidrolase. A ação dessas enzimas promove a movimentação da bactéria entre
os vasos através da degradação das membranas laterais do xilema. Foi demonstrado
10
que essa movimentação está associada à patogenicidade da X. fastidiosa causadora
da doença de “Pierce” e de CVC (Hopkins, 1985; Almeida et al., 2001).
A X. fastidiosa produz ainda uma grande quantidade de toxinas que
provavelmente estão relacionadas aos sintomas foliares. Entre essas toxinas, foram
encontradas cinco similares a hemolisinas, sendo quatro delas pertencentes à família
de toxinas RTX que são importantes fatores de virulência, com ampla disseminação
em bactérias Gram-negativas (Coote, 1992). Também foram encontrados no genoma
genes que codificam colicina V, um polipeptídio tóxico que age em bactérias
sensíveis. Além dessas toxinas, apesar de não possuir as vias completas, foi
verificado a presença de alguns policetídeos, uma importante classe de toxinas
(Simpson et al., 2000).
O genoma revelou, ainda, genes relacionados à resistência a estresse osmótico,
estresse oxidativo e um eficiente sistema de absorção de nutrientes, uma vez que o
xilema é um ambiente pobre em nutrientes. Além desses, houve a identificação de
alguns genes envolvidos com a resistência a compostos antimicrobianos, sugerindo
que essa bactéria possa apresentar um mecanismo de defesa contra toxinas ou
antibióticos produzidos por endofíticos encontrados no xilema. Esses genes podem
desempenhar um importante papel na interação da bactéria com o hospedeiro,
conferindo vantagens competitivas no ambiente colonizado que contribuam para a
sua adaptação (Simpson et al., 2000).
O mecanismo de patogenicidade mais sugerido e pesquisado está relacionado
ao bloqueio dos vasos xilemáticos através de agregados da bactéria, produção de
polissacarídeos e tiloses. Essa hipótese é sustentada devido aos hospedeiros
infectados apresentarem sintomas típicos de estresse hídrico. A X. fastidiosa deve
possuir um importante mecanismo de agregação entre as células e a parede dos vasos
colonizados, uma vez que habita micro-ambientes específicos, como o xilema e o
canal alimentar do vetor, que estão sujeitos a uma forte turbulência e pressão.
(Hopkins, 1989).
Em relação à hipótese envolvendo o bloqueio dos vasos do xilema, foram
detectados vários genes responsáveis pela adesão na superfície dos vasos do xilema
do hospedeiro e do cibário do vetor, inclusive genes que até o momento só haviam
sido detectados apenas no processo de adesão de patógenos de humanos (Simpson et
al., 2000). Através de micro-análises por raios-X dos agregados da X. fastidiosa in
11
planta e in vitro, admite-se que a adesão dessa bactéria ocorre por interações entre as
cargas negativas da parede do xilema e os grupos tiol (SR) da membrana externa da
bactéria. Esses grupos tiol também promovem a agregação das bactérias por meio da
formação de pontes de dissulfeto entre os grupos presentes nas membranas das
células vizinhas (Leite et al., 2002). A adesão e agregação das bactérias aos vasos do
xilema podem ser ainda mediadas por estruturas tipo fímbrias, que são visualizadas
por microscopia eletrônica da X. fastidiosa tanto na planta como no inseto vetor. No
genoma dessa bactéria foram detectados 26 genes relacionados à biossíntese e função
de filamentos de fímbrias (Simpson et al., 2000) Também foi descrita uma via
completa para a síntese de um exopolissacarídeo (EPS) denominado “goma
fastidiana” (da Silva et al., 2001). Esse EPS promove a proteção das células contra
fatores de defesa do hospedeiro, como toxinas e antibióticos, tendo um importante
papel na adaptação da bactéria (O’ Toole et al., 2000).
Contudo, estudos de genoma funcional são necessários para comprovar essas
hipóteses sobre a patogenicidade da X. fastidiosa.
4.3. Genoma funcional da Xylella fastidiosa.
Após o seqüenciamento do genoma da X. fastidiosa, foram iniciados os
trabalhos relacionados ao genoma funcional visando o entendimento das funções dos
genes identificados no genoma. Um dos focos desses estudos sempre esteve voltado
ao entendimento do mecanismo de patogenicidade dessa bactéria que, como já
mencionado, não apresenta genes específicos planta-patógeno que são comuns entre
as bactérias fitopatogênicas. Um importante fato relacionado à X. fastidiosa foi a
identificação de genes associados à adesão da bactéria em superfícies, sendo muitos
deles similares a genes que possuem esta função em bactéria patogênicas de
humanos (Simpson et al., 2000). Nessas bactérias, o principal mecanismo de
patogenicidade está relacionado à sua capacidade de formar biofilme na superfície
colonizada do hospedeiro. O termo biofilme descreve a habilidade das bactérias em
aderir superfícies e formar uma comunidade microbiana (Costerton et al., 1995).
Trabalhos publicados recentemente, demonstram que a X. fastidiosa possui a
habilidade de formar biofilme em diferentes superfícies e que a morfologia parece
variar de acordo com a estirpe e as condições ambientais analisadas (Marques et al.,
12
2002; Souza et al., 2004). Considerando o fato dos sintomas característicos da CVC
serem decorrentes do bloqueio dos vasos do xilema em conseqüência da colonização
bacteriana, a formação do biofilme é considerada o principal mecanismo de
patogenicidade desse fitopatógeno (Leite et al., 2002; Souza et al., 2003; Newman et
al., 2004; Osiro et al., 2004; Guilharbert and Kirkpatrick, 2005).
No entanto, além de trabalhos relacionados ao entendimento do mecanismo de
patogenicidade da X. fastidiosa, diversos trabalhos baseados no genoma funcional
dessa bactéria geraram um amplo conhecimento a respeito da sua biologia. Alguns
dos principais conhecimentos gerados foram a determinação de meio de cultivo
definido (Lemos et al., 2003; Almeida et al., 2004), análise global de proteínas
expressas (Smolka et al.,2003; Bellato et al., 2004), modulação da expressão gênica
(Coltri and Rosato, 2004; Coldri and Rosato, 2005; Pashalidis et al., 2005);
resistência a antibióticos (Ribeiro et al., 2005); análise de transportadores (Meidanis
et al., 2002) e muitos outros trabalhos importantes para o entendimento desse
microrganismo.
O seqüenciamento gera um grande número de informações que são depositadas
nos bancos de dados. Para a identificação da função dos genes após o
seqüenciamento, são realizados estudos de genoma funcional. Portanto, a função de
um gene pode ser determinada a partir do padrão de expressão gênica, ou da proteína
gerada ou até mesmo pelos metabólitos resultantes, quando medidos numa
determinada situação fisiológica da célula na sua condição de crescimento
experimental. O padrão de expressão é medido através do nível de RNA, onde este
estudo recebe o nome de transcriptoma, a nível de proteína que é denominado
proteoma e através de produtos metabólicos, metaboloma.
No presente trabalho, foi realizado o estudo do transcriptoma para a análise dos
genes. Diversas ferramentas podem ser usadas nos estudos pós-genômicos. Para o
estudo através do transcriptoma, que se baseia em análises de expressão gênica,
podem ser utilizadas as técnicas de macro ou micro arranjos de DNA sobre
membranas ou lâminas de vidro, mas que necessitam ser validados em experimentos
subseqüentes através de outras técnicas como o Northern bloting ou PCR
quantitativo em tempo real (qPCR), por exemplo. Além destas, pode ser feita uma
validação final da expressão através da mutagênese sítio dirigida. Para análises mais
globais do genoma de um determinado organismo, são utilizadas as técnicas de
13
macroarray e microarray, no entanto, para a avaliação específica é utilizada a
técnica de qPCR (Souza et al., 2006).
A técnica do qPCR pode ser utilizada na identificação de alelos em DNA
genômico, na análise de seqüências virais, bacterianas e de protozoários a partir de
várias fontes. Essa técnica permite a quantificação das amostras amplificadas, sendo
de grande relevância para diagnósticos de patógenos e doenças genéticas. Dentre as
vantagens desta técnica estão a PCR qualitativa, a facilidade na quantificação, maior
sensibilidade, maior precisão, reprodutibilidade e acurácia, velocidade na análise,
melhor controle na qualidade no processo e menor risco de contaminação (Novais et
al., 2004). Em relação à verificação da expressão gênica, o qPCR é utilizado na
análise de genes específicos, o que difere da técnica de microarray, que analisa de
uma forma global.
4.4. A formação do biofilme e seu papel na patogenicidade e adaptação da X.
fastidiosa.
A formação do biofilme é composta por diferentes estádios iniciando-se pela
adesão na superfície, proliferação bacteriana dentro de microcolônias e expansão
destas, formando estruturas altamente organizadas. Stoodley et al, (2002) dividiu a
formação do biofilme em cinco diferentes estádios (Figura 2). O estádio 1,
correspondente à adesão reversível das células na superfície; o estádio 2, referente à
adesão irreversível mediada principalmente pela produção de substâncias
exopoliméricas; no estádio 3 , onde inicia-se a primeira fase de maturação do
biofilme caracterizada pelo início do desenvolvimento da arquitetura do biofilme; a
segunda fase de maturação, estádio 4, corresponde ao biofilme totalmente maduro,
com alta densidade celular, e a arquitetura do biofilme apresenta-se de forma
complexa; o estádio 5 é referente à fase de dispersão das células do biofilme.
X. fastidiosa apresenta a formação do biofilme tal quais bactérias patógenas de
humanos, com pelo menos cinco fases distintas, no entanto com o tempo de
formação bem mais lento que outras bactérias, o que se explica por seu crescimento
fastidioso (Souza et al., 2004). Em um trabalho realizado para análise do biofilme de
X. fastidiosa nos diferentes dias de formação do biofilme in vitro, verificou-se que
após três dias de crescimento inicia-se a formação do biofilme, com 15 dias o
14
biofilme inicia sua maturação, após 20 dias ele se torna maduro, e após 30 dias
ocorre a fase de dispersão celular (Souza et al., 2003) (Figura 3).
No primeiro estádio de formação do biofilme da X. fastidiosa, onde as células
se aderem na superfície a ser colonizada, é necessária a expressão de genes
relacionados com adesão. Foi demonstrado que X. fastidiosa necessita da expressão
de genes de adesão para colonizar a planta (Souza et al., 2003, Guilharbert and
Kirkpatrick, 2005, Meng et al., 2005). Este processo é importante, uma vez que, a
bactéria coloniza o xilema, um ambiente sujeito a forte turbulência e pressão
negativa. Adesinas fimbriais pertencentes a fímbrias do tipo I e IV parecem ser
essenciais na etapa inicial de adesão na superfície, e posterior colonização do
hospedeiro. Souza et al (2003, 2004), através de microarray e RT-PCR, verificaram
maior expressão de fímbria do tipo IV nos estádios iniciais de colonização. Mutantes
para a X. fastidiosa causadora da doença de Pierce apresentam reduzida capacidade
de agregação celular (Feil et al., 2003) e diminuição do biofilme (Meng et al., 2005),
demonstrando que as fímbrias do tipo I são importantes no início da formação do
biofilme. Também foram obtidos mutantes para as fímbrias do tipo IV, e estes são
incapazes de se movimentarem tanto nas condições in planta quanto in vitro. Esses
resultados indicam que fímbrias do tipo IV seriam responsáveis pela movimentação
sistêmica, portanto, essenciais para a colonização da bactéria no interior do vaso
(Meng et al., 2005).
Além das fímbrias, adesinas afimbriais parecem também contribuir para o
processo de adesão célula-célula e formação da arquitetura do biofilme. Em X.
fastidiosa foram encontrados genes que codificam para adesinas afimbriais com
similaridade para uspA1 de Moraxella catarrhalis, dois hsf de Haemophilus
influenzae, sendo esses relacionados à adesão da bactéria às células epiteliais do trato
respiratório (St. Geme et al., 1996), e três pspA com alta similaridade a
hemaglutinina de Neisseria mengingitidis. Sugere-se que a atuação em conjunto
desses genes promove uma forte agregação bacteriana resultando na formação do
biofilme (Souza et al., 2006). Os genes uspA1 e hsf foram encontrados expressando
no início e no estádio intermediário da formação do biofilme, sugerindo que além do
papel no início dessa formação, esses genes podem estar envolvidos na formação da
arquitetura do biofilme (Souza et al., 2003, 2005). Um outro gene codificando para
uma adesina similar a uma hemaglutitina, foi expresso na fase madura do biofilme de
15
X. fastidiosa causadora da CVC. Este gene parece estar envolvido na adesão célula-
célula. Uma evidência disto é o fato de mutantes para este gene em X. fastidiosa PD
foram incapazes de promover esta adesão entre as células. Esses mutantes
apresentaram colonização muito mais rápida no hospedeiro que o tipo selvagem,
sugerindo que o processo de adesão célula-célula retarda a formação do biofilme
sendo considerado um fator de avirulência (Guilharbert & Kirkpatrick, 2005).
Um outro fato relacionado à formação do biofilme é a ausência da goma
fastidiana (exopolissacarídeo) no processo de adesão na superfície do hospedeiro e
entre as células de X. fastidiosa causadora da CVC, uma vez que, não foi observada a
presença dessa goma nos estádios iniciais da formação do biofilme. Essa observação
sugere que o início do processo de formação de biofilme independe da goma
fastidiana (Leite et al., 2002; Osiro et al., 2004). Baseado nessa verificação foi
proposto que o processo inicial de formação do biofilme é dependente da atração
eletrostática entre proteínas de superfícies carregadas positivamente de X. fastidiosa,
tais como adesinas fimbriais e afimbriais, e a superfície do hospedeiro. A
manutenção dessa adesão seria realizada por uma enzima denominada metionina
sulfóxido redutase (MsrA; EC 1.8.4.6) (Leite et al., 2002). O gene msrA que codifica
essa enzima, teve sua expressão aumentada em estirpes virulentas de X. fastidiosa
causadora da CVC, esse aumento da expressão foi associado tanto na manutenção do
estado adesivo das proteínas fimbriais e afimbriais na superfície do hospedeiro,
quanto na resposta de defesa ao estresse oxidativo (Souza et al., 2003).
Baseado no estudo funcional da X. fastidiosa causadora da CVC, foi proposto
um modelo da formação do biofilme dessa bactéria no xilema da planta (Figura 4)
(Souza et al., 2006). Quando as células bacterianas atingem o estádio de biofilme
maduro é ativado um sistema de sinalização denominado “quorum sensing”. Esta
sinalização permite que as bactérias regulem a expressão de genes específicos como
os associados a fatores de virulência, resistência a compostos antimicrobianos,
respostas de defesa do hospedeiro, condições de deficiência nutricional, produção de
antibióticos e transferência de plasmídeos por conjugação (De Kievit and Iglewski,
1999; Davery and O’Toole, 2000; Rahmati et al., 2002; Molin and Tolker-Nielsen,
2003). Estas características permitem que as células em biofilme apresentem grande
vantagem adaptativa e competitiva no hospedeiro (Davey and O’Toole, 2000). Tem
sido demonstrado, por exemplo, que células em biofilme são 500 vezes mais
16
resistentes a compostos antimicrobianos que em crescimento planctônico (Costerton
et al., 1995).
Apesar do elevado número de estudos envolvendo a expressão de genes
associados ao crescimento em biofilme, poucas são as informações sobre a expressão
de genes envolvidos no biofilme de patógenos de planta. Souza et al (2004),
verificaram através de microarranjos de DNA, que um grande número de genes
apresenta indução no biofilme da X. fastidiosa quando comparado ao crescimento
planctônico, sendo muitos deles associados à resistência a compostos
antimicrobianos. A expressão de genes majoritariamente expressos em condição de
biofilme e associados à resistência a antibióticos, metais pesados, competição com
endofíticos e outros fatores, sugere que as células, nessa condição, desenvolvem
através da síntese de proteínas de novo um mecanismo de auto-proteção, tornando-se
mais resistentes a uma ampla gama de agentes biocidas ou biostáticos. Além dos
genes identificados nesse trabalho, outros genes foram detectados no genoma da X.
fastidiosa como possivelmente envolvidos no mecanismo de resistência a metais, que
podem ser positivamente regulados na presença do composto.
Os genes detectados como possivelmente envolvidos na resistência a cobre e
zinco em X. fastidiosa pertencem a diferentes famílias, porém todas estas estão
agrupadas por possuírem atividade de transportadores de efluxo de compostos
antimicrobianos. Dentre essas famílias estão a RND (resistance-nodulation-division),
que funcionam associadas a proteínas da família de fatores de membrana externa (out
membrane factors-OMF) e MFP (periplasmatic membrane fusion protein)
(Zgurskaya and Nikaido, 2000), a família de transportadores ABC (ATP-binding
cassete) com proteínas relacionadas a um sistema de secreção (Andersen, 2003;
Lage, 2003), a “P-type ATPase”, que constitui uma superfamília de proteínas de
transporte que são dirigidas por hidrólise de ATP (Fagan et al., 1994) e os genes do
operon cut que provavelmente estão envolvidos na homeostase de cobre.
17
Figura 2. Modelo dos estádios de desenvolvimento de biofilme bacteriano. 1)
Estádio onde as células bacterianas aderem de forma reversível na superfície. 2)
Estádio que as células perdem sua motilidade e aderem na superfície de forma
irreversível, uma etapa mediada principalmente por substâncias exopoliméricas. 3)
Estádio correspondente ao início da maturação do biofilme, indicado pelo
desenvolvimento inicial da arquitetura do biofilme. 4) Estádio de total maturação do
biofilme, indicado por uma complexa arquitetura do biofilme. 5) Estádio de
dispersão, com o aparecimento de células móveis que deixam as microcolônias
(Stoodley et al, 2002).
18
Figura 3. Biofilme de Xylella fastidiosa. Crescimento celular em superfícies de vidro
visualizadas em microscopia óptica durante diferentes estádios da formação do
biofilme. 5 (a), 10 (b), 15 (c), 20 (d) e 30 (e) dias após inoculação (Souza et al.,
2003).
19
Figura 4. Modelo de interação e formação de biofilme das células de X. fastidiosa
com a superfície do hospedeiro. Feixe vascular contendo endofíticos e seiva do
xilema. 1. As células de X. fastidiosa são inoculadas pelo vetor. As células aderem à
superfície do xilema devido a atração eletrostática mediada pela carga positiva das
adesinas com a carga negativa dos vasos. 2. Multiplicação das células e início da
formação do biofilme. Aumento da expressão de genes associados a adesão célula-
célula e manutenção da adesão pela ação da enzima metionina sulfóxido redutase. 3.
Formação de biofilme maduro e ativação de genes que conferem vantagens
adaptativas e competitivas para a comunidade microbiana. 4. Aumento do biofilme
resultando no bloqueio do feixe vascular e movimento das células através da
degradação das pitmembranas. 5. Dispersão celulas, possivelmente mediada pela
sinalização por pequenas moléculas difusíveis (DSF), movimento dentro do vaso
através de fímbrias do tipo IV e início da formação de biofilme em outra região da
superfície do xilema.
4.5. Família ABC-Transporte.
A superfamília dos transportadores ABC (ATP-bindind cassete) está presente
em todas as formas de vida e usa a energia liberada pela hidrólise do ATP para
promover o transporte ativo de substâncias através da membrana citoplasmática. Os
transportadores ABC são compostos de duas cópias do domínio ABC com uma
seqüência conservada LSGG reconhecível entre os motifs “Walker” A e B do sítio
ATP-binding (Walker et al., 1982), e duas cópias do domínio transmembranar (TM),
geralmente consistindo de seis α hélices (Holland and Blight, 1999). Alguns
sistemas ABC transporte fazem a importação, enquanto outros a exportação, mas
nenhum sistema conhecido faz ambas as funções. Um típico sistema ABC para
importação de solutos é composto de três unidades que aparecem juntas como genes
em cluster: um receptor, um componente de membrana e um componente do ATP-
binding citoplasmático. Os receptores não são, geralmente, requeridos nos sistemas
20
de exportação dos ABC transportes. O melhor componente conservado deste sistema
é o ATP-binding. Esse motivo é completamente conservado em todos os organismos
(Meidanis et al., 2002).
Os transportadores ABC são agrupados em sete classes estruturais, ou
subfamílias, baseados na seqüência de aminoácidos e organização dos domínios
(Croop, 1998). Esses transportadores são coletivamente capazes de transportar uma
diversidade muito grande e incomum de substratos. Esta diversidade de funções é
manifestada a nível de família, mas também em membros individuais dela, como por
exemplo, aqueles associadas com resistência a multidrogas (MDR) (Sheps et al.,
2004).
As bactérias usam os transportadores ABC tanto para importar substâncias,
onde a função principal é de fornecer nutrientes essenciais às bactérias, quanto para
exportar substâncias nocivas e toxinas. Em contraste, os eucariontes só utilizam este
sistema para exportação (Saurin et al., 1999). Este tipo de proteína transportadora
está ligada na membrana interna de bactérias gram-negativas ou na única membrana
de gram-positivas ou células eucarióticas. No caso de bactérias gram-negativas, não
só é necessário proteger o citoplasma, mas também é necessário fazer o transporte de
substâncias nocivas das células através da membrana externa, para a proteção do
periplasma aos danos causados por essas substâncias. A família responsável por essa
proteção está relacionada ao sistema ABC (Paulsen et al, 1997; Poole, 2001), essa
função também foi identificada nos eucariontes, onde os sistemas ABC agem
aumentando a resistência a múltiplas drogas (Gros et al, 1986).
Em X. fastidiosa foram encontrados trinta e dois sistemas de tranporte ativo
primários, dentre eles estão os transportadores dirigidos por hidrólise de ATP.
Foram identificados vinte e três sistemas dessa superfamília no genoma da bactéria,
onde nove sistemas foram classificados como envolvidos na importação de diversos
substratos, e quatorze sistemas relacionados a exportação. O gene DR1357 de X.
fastidiosa codifica uma permease que possui um domínio AbcD, o qual está
envolvido no sistema de transporte de metais (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Esse
gene foi nomeado como metI segundo a nova classificação dos genes de X.
fastidiosa que está sendo feita pelo LNCC (Laboratório Nacional de computação
científica) (http://www.xylella.lncc.br). O domínio ABC também está envolvido no
sistema de transporte de íons de metais em muitos organismos, inclusive em
21
bactérias gram-negativas (Paulsen et al, 1997). Broeks et al (1996), obtiveram
mutantes de transportadores ABC em células excretoras de Caenorhabditis elegans.
Três mutantes apresentaram um fenótipo de hipersensibilidade a metais pesados
como cádmio e arsênico.
4.6. Família “P-Type ATPase”.
As “P-type ATPases” constituem uma superfamília de proteínas de transporte
que são dirigidas por hidrólise de ATP. Os transportadores “P-type ATPases“ podem
tanto importar cátions de fora ou do periplasma para dentro do citoplasma como
exportar do citoplasma para o periplasma ou meio extracelular (Fagan and Saier
1994). As proteínas dessa família estão envolvidas no transporte de substratos que
são carregados através de membranas biológicas (Axelsen and Palmgren, 1998). Em
X. fastidiosa apenas dois genes (copA e copB) envolvidos na homeostase de cobre
foram associados como membros dessa família.
Os substratos transportados pela família “P-Type ATPase” são cátions
inorgânicos como H
+
, Na
+
, K
+
, Mg
2+
, Ca
2+
, Cu
+
, Ag
+
, Zn
2+
e Cd
2+
(Saier, 1994). Na
homeostase de metais pesados, os transportadores “P-Type ATPases” podem tanto
importar como exportar esses substratos. Foi verificado que os sistemas de
importação de macromoléculas Mg
2+
também podem importar metais pesados
(Snavely et al., 1989). A exportação através do efluxo dos cátions de metais pesados
por essa família pode detoxificar as células (Nies, 2003).
Os membros da superfamília “P-Type ATPase” que transportam metais
pesados possuem um resíduo de prolina conservado, precedido e/ou seguido por um
resíduo de cisteína. Este domínio é essencial para a função dessa família (Fan and
Rosen, 2002). Devido a característica do domínio CPC ou CPH das ATPases de
metais pesados ser intramembranoso, foi sugerido que essas ATPases fossem
chamadas de “CPx-type ATPases” (Solioz and Vulp, 1996). O domínio CPx está
localizado no meio da sexta hélice da membrana, na estrutura central mais
conservada da enzima e aparentemente constitui parte do canal de íons através da
membrana. APTases de cobre têm sido surpreendentemente conservadas em
bactérias de humanos (Nies, 2003).
22
Dentro dessa superfamília existem vários membros que possuem diferentes
substratos. Uma família “CPx-Type ATPases” envolvida na exportação de Cu
+
e
Ag
2+
, foi nomeada como “Cu-CPx-type ATPases” (Rensing et al., 1999; Rensing and
Grass 2003). Esta família foi descrita em muitos organismos, como por exemplo, em
E. coli (Rensing et al., 2000), Enterococcus hirae (Bissig et al., 2001), na
cianobactéria Synechocystis (Tottey et al., 2001) e também em organismos
eucariotos como, Dictyostelium (Burlando et al., 2002), Candida albicans (Riggle
and Kumamoto, 2000) e em muitos outros organismos. Uma outra família, a “Zn-
CPx-type ATPases”, está relacionada ao transporte de Zn
2+
, Cd
2+
e Pb
2+
, também é
encontrada em Listeria monocytogenes (Bal et al., 2001), E. coli (Beard et al., 1997;
Mitra and Sharma, 2001) e S. cerevisiae (Shiraishi et al., 2000). No entanto, essa
família não parece ter uma distribuição muito ampla como a “Cu-CPx-type
ATPases” (Nies, 2003).
Na análise da topologia da membrana das “CPx-type ATPases”, foram
verificados oito segmentos transmembranares com o domínio CPC conservado
localizado na sexta posição desse segmento. Um domínio ATP-binding foi situado
em um largo domínio citoplasmático que segue esta transmembrana. O amino-
terminal com 109 aminoácidos carrega um domínio CXXC que também está presente
em muitos membros da CPx-type ATPases (Tsai et al., 2002). Embora cátions de
metais pesados serem capazes de se ligar ao domínio amino-terminal (DiDonato et
al., 2002), este não é essencial para o transporte (Mitra and Sharma, 2001).
O transporte realizado pelas “CPx-type ATPases” em bactérias, é
principalmente a exportação para fora do periplasma, mas a outra direção também
parece ocorrer. O primeiro exemplo de “Cu-CPx-type ATPases” foi na bactéria E.
hirae. Essa bactéria Gram-negativa possui o sistema de homeostase de cobre melhor
entendido entre os organismos. O operon que é responsável por essa homeostase é
constituído por quatro genes sendo eles, copY, copZ, copA e copB. Os produtos dos
genes copA e B são transportadores ATPases. copY codifica um repressor de
resposta a cobre e copZ codifica para uma chaperona, a qual serve para o transporte
intracelular do cobre (Ordematt et al., 1993; Ordenatt and Solioz, 1995). De acordo
com o modelo, o produto do gene copA é responsável pela importação do cobre,
enquanto que, o do gene copB expulsa o excesso de cobre, a CopY regula a
23
expressão do operon cop e CopZ transfere intracelularmente o cobre (Ordermatt et
al., 1994; Wunderliye and Solioz, 1999).
Uma distribuição putativa da família “CPx-type ATPases” no genoma dos
procariontes foi analisada e revelou dezesseis grupos de “Cu-CPx-type ATPases” e
doze grupos de “Zn-CPx-type ATPases”, que foram encontrados por múltiplos
alinhamentos. Em sessenta e quatro grupos de procariontes analisados, só oito
espécies não continham um gene para uma “P-type ATPase” putativa. Cinco espécies
continham no mínimo uma “P-Type ATPases”, mas nenhuma CPx-type. Vinte e
nove espécies possuíam “CPx-type ATPases” de ambas famílias, a “Cu-CPx-type
ATPases” e “Zn-CPx-type ATPases”. Os procariontes possuem somente um membro
dessas duas famílias, na sua maioria foram encontrados membros da “Cu-CPx-type
ATPases” (18 espécies) e somente quatro casos de “Zn-CPx-type APTases”.
Portanto, aproximadamente metade das espécies analisadas continha membros de
ambas as famílias, o que indica a importância na resistência mediada por essas
proteínas (Nies, 2003).
4.7. Família Resistência-Nodulação-Divisão celular (RND).
A resistência a metais é conferida principalmente por sistemas de transporte.
Um dos principais sistemas é composto por membros da família RND (resistance-
nodulation-division) responsável pela exportação de cátions e compostos orgânicos
para o citoplasma. Adjacente a um gene que codifica uma proteína RND está, em
muitos casos, um segundo gene que codifica uma proteína da família de membrana
de fusão (membrane fusion protein, MFP), também denominada de família de
proteínas de efluxo periplasmático. Além das MFPs, muitas proteínas RNDs
cooperam ainda com uma terceira proteína que pertence a família de fatores de
membrana externa (out membrane factors, OMF). Estas três proteínas formam um
complexo de proteínas de efluxo que podem exportar o substrato do citoplasma
diretamente para fora da célula (Nies, 2003). A posição do gene OMF varia de
operon para operon. Esse gene pode estar localizado na posição 5’
terminal de alguns
operons, ou na posição 3’ de outros. O gene OMF pode não fazer parte do operon,
como é o caso do tolC, que interage com vários sistemas de efluxo que são dirigidos
24
por proteínas RND e também com sistemas de transporte ABC (Anersen et al.,
2001).
Essa família é conhecida por transportar vários substratos, incluindo muitas
classes de antibióticos, biocidas, tintas, detergentes, inibidores metabólicos,
hidrocarbonatos aromáticos (solventes orgânicos), peptídeos antimicrobianos
catiônicos, ácidos tóxicos gordurosos e homoserina lactonas associadas ao “quorum
sensing” (Poole, 2001; Poole, 2002). Para realizar o transporte dessas moléculas, a
família RND-MFP-OMF utiliza a força motiva de prótons. Os transportadores
dependentes da força motiva de prótons são predominantes entre os mecanismos de
resistência, exceto a família dos transportadores ABC que utilizam ATP (Poole,
2002).
Sistemas de efluxo RND-MFP-OMF têm sido descritos na resistência de um
amplo número de bactérias Gram-negativas patogênicas e não patogênicas. Os
melhores sistemas caracterizados de efluxo RND-MFP-OMF são os encontrados em
E. coli (Nikaido and Zgurskaya, 2001), Pseudomonas aeruginosa (Poole, 2001) e
Neisseria gonorrhoeae (Shafer et al., 2001).
A resistência a antibióticos mediada por proteínas RND foi responsável por
metade da resistência a múltiplas drogas em estirpes de P. aeruginosa. Este patógeno
possui no mínimo treze sistemas de transporte RND. Um deles é o HME-RND que
exporta metais pesados e os outros doze são provavelmente proteínas HAE-RND. O
sistema melhor caracterizado entre essas proteínas são os MexB, MexD e MexF.
Juntos com seus respectivos MFPs (MexA, MexC, MexE) e OMFs (OprM, OprJ,
OprN), estes sistemas detoxificam uma variedade de substâncias (Nies, 2003).
A bactéria E. coli possui o sistema AcrAB-TolC que a protege contra uma
variedade de substâncias tóxicas especialmente durante o baixo crescimento (Rand et
al., 2002). Esse sistema demonstra claramente o complexo de efluxo das proteínas
RND-MFP-OMF.
Outros sistemas HAE-RND foram caracterizados, como AcrAB de
Haemophilus influenzae (Sánchez et al., 1998), AdeABC de Acinetobacter
baumannii (Magnet et al., 2001), SrpABC e TtgDEF de P. putita (Ramos et al.,
1998; Mosqueta and Ramos., 2000), MtrCDE de N. gonorrhoeae (Hagman et al.,
1997; Veal et al., 2002) e muitos outros em diversos organismos.
25
Em Ralstonia metallidurans, os genes que formam o operon czcCBA são
responsáveis por conferir resistência a metais catiônicos. Após seqüenciamento, foi
verificado que czcC pertence à família OMF, czcB à família MFP e czcA à RND.
Este operon é flanqueado por genes envolvidos na regulação da expressão de
czcCBA (Nies, 2003).
No genoma da X. fastidiosa foram encontrados oito genes que codificam para
RNDs, sendo cinco deles associados a bombas de efluxo de cátions e multidrogas,
dois codificando proteínas de membrana (translocase) e uma outra proteína que
possui como substrato drogas e antibióticos. Também foram identificados cinco
MFPs, sendo três delas associadas a membros RND e duas com ABC (Meidanis et
al., 2002). Resultados da expressão em X. fastidiosa crescendo em biofilme e genes
associados à patogenicidade (Souza et al., 2003; Souza et al., 2004; Souza et al.,
2005) demonstram a expressão de dois destes clusters relacionados à RND-MFP.
Em biofilme um dos genes expressos foi o czcA, associado a resistência a
metais e multidrogas, cujo domínio AcrB trabalha junto com MFP que é codificado
pelo gene mexE, que possui o domínio AcrA para exportar o substrato para o meio
externo. A jusante desses genes está um regulador de transcrição pertencente à
família AcrR . O gene acrF codifica uma proteína RND que possui o domínio ACR-
tran e o domínio AcrB. Esse gene coopera com o gene acrA, que apresenta o
domínio MFP de bombas de efluxo de cátions e multidrogas, similares a membros da
família RND. Neste trabalho, o gene acrF foi nomeado como acrB por possuir o
domínio AcrB. Esses possíveis operons apresentam similaridades com o sistema
RND, indicando que possivelmente estão associados à resistência a metais ou a
drogas. A expressão constitutiva destes genes no biofilme de X. fastidiosa sugere que
a regulação possa estar associada a esta condição de crescimento.
4.8. Família Facilitadora de Difusão de Cátions (CDF).
As proteínas CDF formam uma família de transportadores de metais (Paulsen
and Saier, 1997). O principal substrato dessa família é o Zn
2+
, no entanto, ela
também está envolvida no transporte de Co
2+
, Ni
2+
, Cd
2+
e Fe
2+
. Os transportadores
CDF são dirigidos por gradiente de concentração, podendo ser, um gradiente
26
quimiosmótico ∆Ψ, ∆pH ou por gradiente de potássio (Bloss et al., 2002; Guffanti et
al., 2002).
Até o momento, todas as proteínas descritas dessa família em bactérias estão
envolvidas na resistência a Zn
2+
e outros metais pesados. R. metallidurans foi o
primeiro organismo a ser descrito apresentando um regulador de expressão do
sistema de resistência CzcABC, o qual é responsável pelo efluxo de metais (Nies,
1992). No entanto, CzcD também é capaz de mediar um pequeno grau na resistência
a Zn
2+
/Co
2+
/Cd
2+
na ausência do sistema CzcABC. A presença do CzcD diminui a
concentração desses metais no citoplasma (Anton et al., 1999). Na expressão
heteróloga em E. coli, o gene czcD apresentou efluxo para Zn
2+
e Cd
2+
, mas não para
Ni
2+
e Co
2+
(Nies, 2003).
Genes codificando para CDF foram encontrados em muitos organismos
seqüenciados, entretanto, poucos têm sido caracterizados. Em Bacillus subtilis, o
gene czcD está em um operon junto com o gene que codifica uma desidrogenase
Trka (Sturr et al., 1997), e estudos com mutantes mostraram o envolvimento desse
gene na resistência a cobalto (Wang et al., 2000).
Em E.coli, duas proteínas CDF foram caracterizadas, a Zitb, que é codificada
pelo gene ybgR, o qual atua no sistema de resistência a zinco (Grass et al., 2001).
Essa proteína diminuiu a acumulação de Zn
2+
e é dirigida por gradiente de potássio
em adição a força motiva de próton (Lee et al., 2002). O outro gene yiiP, é putativo
para uma proteína CDF. A expressão dessa proteína foi induzida por zinco,
entretanto, a deleção e a super-expressão desse gene não apresentaram efeito (Grass
et al., 2001). A função dessa proteína ainda é desconhecida.
Os eucariontes também possuem proteínas CDF. S. cerevisiae contém cinco
genes que codificam para CDF (Paulsen et al., 1998). ZRC1 foi nomeada como
CzcD por muitos anos e está relacionado à resistência a zinco e cadmio (Kamizomo
et al., 1989). Essa família foi encontrada em muitos outros organismos, inclusive em
animais. No entanto, experimentos indicam que essas proteínas também podem estar
envolvidas na importação dos substratos para a célula (Nies, 2003).
A primeira proteína CDF descrita em plantas foi a ZAT. A super-expressão
desse gene em Arabidopsis thaliana apresentou um aumento na resistência a Zn
2+
e
uma alta diminuição de Zn
2+
na raiz sob alta exposição a Zn
2+
(van der Zall et al.,
1999). A proteína ZAT foi purificada e funcionou como um sistema de “uptake” de
27
zinco em vários sistemas modelos de bactérias (Bloss and Nies, 2002). Assim como
nos animais, uma variedade de proteínas CDF pode ser responsável pela homeostase
de zinco (Nies, 2003).
Em X. fastidiosa foi encontrado um gene que codifica uma proteína CDF com
domínio CzcD similar ao de E. coli (Meidanis et al., 2002). Provavelmente, o gene
czcD de X. fastidiosa seja responsável pela homeostase de zinco assim como em
outros organismos que foram descritos acima.
4.9. Outros genes envolvidos na resistência a metais.
Alguns genes têm sido relacionados a resistência a cobre em muitos
organismos. Em E. coli, o sistema de resistência cutABCDEF foi identificado como,
possivelmente, envolvido na absorção e efluxo de cobre. Contudo, esses genes não
foram diretamente ligados ao metabolismo, transporte ou regulação de cobre (Rouch
et al., 1989). Além disso, o cutR, um gene regulador desse operon cut, foi
identificado (Brown et al., 1994). O locus cutA consiste em dois operons, um
contendo o gene cutA1, que codifica uma proteína citoplasmática, e o outro
consistindo de dois genes, cutA2 e cutA3, codificando proteínas de membrana
interna. O gene cutA2, que é um alelo do gene dipZ (Fong et al., 1995), que codifica
uma proteína dissulfeto isomerase necessária para biogênese do citocromo tipo C
(Crooke and Cole, 1995). As funções de cutA1 e cutA3 ainda não são muito claras
(Fong et al., 1995).
O gene cutE é um alelo de lnt, que codifica uma “apolipoproteina N-
aciltransferase” (Gupta et al., 1993), e a proteína CutE é composta de 512 resíduos de
aminoácidos que possuem a seqüência, H-F-Q-M-A-R-M, a qual é homóloga a um
domínio putativo que está presente em proteínas que conferem resistência a cobre em
P. syringae e E. coli (Kohara et al., 1987; Rogers et al., 1991; Brow et al., 1994).
Mutantes para os genes cutC e cutF de E. coli foram sensíveis a cobre, e a
temperatura sendo condicionalmente dependente de cobre, respectivamente. Ambos
os mutantes acumularam cobre (Rouch et al., 1989). Análises da seqüência do gene
clonado cutC sugerem que CutC é uma proteína citoplasmática ligada a cobre.
Evidências mostraram que os mutantes cutC e cutF apresentaram fenótipo de
sensibilidade a cobre (Gupta et al., 1995). O gene cutC foi postulado como
28
codificando uma proteína de efluxo que remove o excesso de cobre do citoplasma de
E. coli (Rouch et al., 1989). O N-terminal do CutC contém a sequência M-1–
PRMEKIM-8, similar a motivo putativo ligado a cobre presente na ATPase CopB de
E. hirae. A similaridade desse gene com o copB de E. hirae, é um forte indício da
sua relação com a resistência a cobre, visto que, esse microrganismo é o mais bem
caracterizado no efluxo de cobre. O gene cutF (NlpE) contém uma sequencia M-
124–TPMTLRGMYFYM-136 que é similar a um motivo M-X-X-X-X-MX-X-M
putativo ligado a cobre presente no N terminal da CopB ATPase de E. hirae
(Ordematt et al., 1993)
Os genes pertencentes ao sistema cut, têm sido relacionados à resistência a
cobre em outros organismos. Em um trabalho realizado com Salmonella typhimurium
três clones diferentes da biblioteca genômica foram identificados contendo fenotipo
de sensibilidade a cobre semelhante aos mutantes dos genes cutF de E. coli. Um
desses clones, o pCUTFS2, também diminuiu a tolerância a cobre para os mutantes
dos genes cutA, cutC, e cutE de E. coli. As seqüências analisadas desses fragmentos
revelaram quatro frames (ORF120, ORF627, ORF207, e ORF168) que foram
organizados em dois operons. Um operon consistindo em um único gene, scsA
(ORF120), e os outros operons contendo os genes scsB (ORF627), scsC (ORF207), e
scsD (ORF168). A comparação das seqüências de aminoácidos indicou que os
produtos desses genes, ScsB, ScsC, e ScsD possuem significativa homologia com
proteínas “thiol-disulfide interchange” (CutA2, DipZ, CycZ, e DsbD) de E. coli e
Haemophilus influenzae, com uma proteína de membrana externa (Com1) de
Coxiella burnetii, e com proteínas “thioredoxin” e “thioredoxin-like”,
respectivamente. Os dois operons subclonados nos plasmídeos compatíveis, e
análises de complementação indicaram que as quatros proteínas foram requeridas
para a diminuição da tolerância de cobre em mutantes de E. coli (Gupta et al., 1997).
Em X. fastidiosa foram identificados três genes do sistema cut, cutA e dsdB
que estão em cluster e possuem similaridade com os genes de E. coli. Por este
motivo, neste trabalho esses genes foram nomeados como cutA1 (cutA) e cutA2
(dsdB), além de apresentarem o domínio CutA. O terceiro gene identificado foi o
cutC, este não está em cluster com os outros genes. Os genes cut parecem estar
distribuídos randomicamente no cromossomo da E. coli, e provavelmente, eles
funcionam de maneira coordenada (Gupta et al., 1997).
29
Capítulo 1. Curva de Crescimento de Xylella fastidiosa no meio
definido.
Resumo
A Xylella fastidiosa é uma bactéria de crescimento lento e difícil isolamento,
necessitando de meios de cultura ricos em nutrientes. O meio Periwinkle wilt (PW) é
o mais utilizado para o cultivo de todas as estirpes de X. fastidiosa, entretanto é um
meio de composição complexa e não definida. Por este motivo, baseado nas
informações geradas após o seqüenciamento do genoma completo, alguns meios de
cultura de composição definida foram desenvolvidos (XDM1, XDM2, XDM3,
XDM4 e XDM5). Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer a curva de
crescimento da X. fastidiosa no meio de cultura definido XDM2, uma vez que, nesse
meio a bactéria apresentou maior quantidade de proteínas totais e densidade óptica
em relação aos outros meios XDMs anteriormente desenvolvidos. Contudo, nenhuma
curva de crescimento celular, associada à viabilidade das células e o tempo de
geração, havia sido desenvolvida com esse meio de cultura. Para a realização da
curva de crescimento foi utilizada a estirpe 9a5c. A medida da taxa de crescimento
bacteriano foi realizada através de leituras de densidade óptica durante dezesseis dias
com intervalos de 48 horas. A avaliação da viabilidade celular foi realizada através
da contagem de UFC (unidade formadora de colônia) por diluição seriada. As duas
avaliações apresentaram uma alta correlação (R
2
= 0,91) verificada através de
regressão exponencial. Como resultado foi determinado que a fase estacionária, que
representa a maior densidade celular, foi obtida após 10 dias de crescimento. Esses
resultados são similares aos da curva de quantidade de proteína e densidade óptica já
publicada utilizando o meio XDM2, que atingiu maior crescimento após 12 dias. De
posse dos dados de UFC gerados após a realização da curva de crescimento, foi
possível calcular o tempo de geração da X. fastidiosa no meio XDM2, que foi de
aproximadamente 21 horas. Comparando o tempo de geração obtido na curva de
crescimento em meio PW (11,37h), foi possível comprovar que a bactéria apresenta
um crescimento mais rápido em meio PW do que no meio definido XDM2.
Palavras-chave: XDM2, densidade óptica, unidade formadora de colônia.
30
Chapter 1. Grownth curve of Xylella fastidiosa in the defined
medium.
Abstract
Xylella fastidiosa is a bacterium that grows slow and is difficult to isolate,
needing nutrient rich culture medium. The Periwinkle wilt (PW) medium is the most
used for cultivation of all strains of X. fastidiosa. However, this is an undefined
medium of complex composition. Because of that, based on information generated
after the complete genome sequencing of this bacterium, some culture media of
defined composition were developed (XDM1, XDM2, XDM3, XDM4 e XDM5).
The goal of the present work was to establish the growth curve of X. fastidiosa in the
defined medium XDM2 since in this medium the bacteria presented higher amounts
of total protein and optical density compared to the other XDM media previously
developed. Nevertheless, no growth curve associated with viability of the cells and
generation time had been done with this culture medium. We used the 9a5c strain for
this growth curve experiment. The measurement of the bacterial growth rate was
done through optical density analysis for sixteen days with intervals of 48 hours. The
evaluation of cellular viability was carried out counting the colony forming units
(CFU) in serial dilution. Both evaluations presented a high correlation (R
2
= 0.91)
verified by exponential regression. In this analysis, it was determined that the
stationary phase, wich represents the highest cellular density, was obtained after ten
days of growth. These results are similar to those obtained for the curve of protein
and optical density already published using the XDM2 medium that was
approximately twelve days. The UFC data allowed us to estimate the generation time
of X. fastidiosa in the XDM2 medium to be approximated 21 hours. Comparing with
the generation time observed in PW medium (11,37 hours), it was proved that this
bacterium grows faster in PW than in the defined medium XDM2.
Key-words: XDM2, optical density, colony forming units.
31
1. Introdução
A Xylella fastidiosa é uma bactéria de crescimento lento e difícil isolamento,
necessitando de meios de cultura ricos em nutrientes (Chagas et al., 1992). Conforme
o meio de cultura utilizado, ocorrem variações de crescimento (Hopkins, 1989). O
meio complexo Periwinkle wilt (PW) (Davis et al., 1981) é o mais utilizado para o
isolamento e cultivo de todas as estirpes conhecidas de X. fastidiosa (Fry et al.,
1990). Além desse meio, outro meio complexo utilizado para cultura da X. fastidiosa
responsável pela CVC é o buffered charcoal yeast extract (BCYE) (Wells et al.,
1981). Esses meios de cultura incluem peptona, triptona, extrato de levedura, cloreto
de hemina ou pirofosfato férrico como fonte de ferro, aminoácidos, sais inorgânicos,
citrato e succinato, amido, soro de albumina bovina ou carvão ativado. No entanto,
componentes indefinidos desse meio não proporcionam informações para estudos
sobre os requerimentos nutricionais para o crescimento normal da bactéria.
Com o seqüenciamento e anotação do genoma da X. fastidiosa estirpe 9a5c
(Simpson et al., 2000), foi mostrado que essa bactéria pode ser eficiente na produção
de energia usando uma variedade de fontes de carbono. Ela também possui vias
metabólicas completas para aminoácidos, vias relacionadas à síntese de muitas
purinas, pirimidinas, ácido fólico, tiamina, glutamina e muitas outras.
Adicionalmente, o seqüenciamento revelou genes que codificam todas as vias
metabólicas essenciais para o crescimento, usando muitos substratos simples como
carboidratos, aminoácidos e sais inorgânicos. Portanto, baseado no genoma da X.
fastidiosa, foi desenvolvido uma série de meios de culturas definidos (XDM1,
XDM2, XDM3, XDM3 e XDM5) para a estirpe da CVC (Lemos et al., 2003).
Meios quimicamente definidos são necessários para conhecer compostos
essenciais e bases nutricionais para o crescimento bacteriano. As informações
nutricionais podem auxiliar na revelação de aspectos do crescimento e como a
bactéria interage com a parede do xilema, além de fornecer informações sobre a
expressão de genes requeridos para as vias metabólicas e promover informações
sobre o processo de crescimento da X. fastidiosa na planta.
Dentre os meios XDM, o XDM2 apresentou maior quantidade de proteínas
totais e densidade óptica (DO) indicando ser o mais adequado para o crescimento de
X. fastidiosa. Contudo, nenhuma curva de crescimento celular, associada à
32
viabilidade das células, assim como, o tempo de geração havia ainda sido
desenvolvido para este meio.
2. Objetivo
2.1. Geral
- Estabelecer a curva de crescimento de células viáveis de X. fastidiosa no meio
de cultura definido e determinar o tempo de geração celular.
2.2. Específicos
- Determinar a curva de crescimento de X. fastidiosa no meio XDM2 através da
determinação das unidades formadoras de colônia (UFC) e densidade óptica (DO);
- Calcular o tempo de geração das células crescidas em XDM2 e comparar com
as crescidas em PW.
3. Material e Métodos
Para a obtenção da curva de crescimento da bactéria X. fastidiosa no meio
definido XDM2, foi utilizada a estirpe 9a5c mantida sob cultivo nesse mesmo meio
de cultura. Devido ao não crescimento da bactéria em isolamento primário de plantas
com CVC no meio XDM2, foi necessário adaptação para esse meio de cultura. Para
essa adaptação o crescimento da X. fastidiosa foi primeiramente estabelecido em
meio PW e então transferido para o meio XDM2.
Para a avaliação da multiplicação bacteriana, primeiramente foi produzido um
pré-inóculo líquido, composto de bactéria crescida em 50 mL de meio XDM2 líquido
por cinco dias a 28ºC e 130rpm. Em cada tubo Falcon contendo 9 mL do meio
XDM2, foi adicionado 10% do pré-inóculo. Foram utilizadas três repetições
biológicas para cada ponto avaliado. Os frascos contendo as culturas foram
33
incubados sob agitação a 28ºC a 130rpm. Após essa etapa, a cada 48 horas, foi
retirada uma alíquota para avaliação da UFC e DO
600 nm.
Para a realização da curva de crescimento da X. fastidiosa avaliada por UFC,
foram utilizadas alíquotas de 100 µL retiradas de cada tubo correspondente às horas
avaliadas e submetidas a diluições seriadas. Estas foram realizadas adicionando esses
100 µL de cada ponto avaliado em tubos contendo 900 µL de PBS (1:10 ou 10
-1
).
Desta diluição foram retiradas 100 µL e transferidos para um novo tubo contendo
900 µL (10
-2
) e assim sucessivamente até a diluição de 10
-9
. Para cada ponto
analisado foram utilizadas três repetições. Foram plaqueados 100 µL dessas diluições
em placas com meio PW sólido e incubadas em BOD a 28ºC para a contagem do
número de colônias.
A avaliação do crescimento das células da X. fastidiosa também foi realizada
através da densidade óptica a 600nm. Para esta análise, as leituras foram realizadas
utilizando uma alíquota de 1 mL de cada ponto analisado em intervalos de 48 horas.
A relação entre os valores da DO
600nm
e UFC nos diferentes tempos de
avaliação foi descrita por uma equação do tipo exponencial (Y=3191421 x 592
X
)
onde Y= UFC e X = DO. Para essa análise foi utilizado o Programa ASSISTAT
versão 7.3 beta (2006) (http://assistat.sites.uol.com.br).
A partir das informações obtidas após a curva de crescimento avaliada pela
UFC, calculou-se o tempo de geração (G) da X. fastidiosa utilizando a fórmula
padrão de crescimento exponencial G=T/N, sendo que o T é o tempo transcorrido
entre o início e o final do experimento e N é o número de gerações calculado pela
fórmula N=Log (X/Y)/Log 2, onde Y é o número de UFC obtidas no final do período
analisado e X é o número de UFC obtidas no início (Lamanna et al., 1973).
Como controle foi realizada a curva de crescimento da X. fastidiosa no meio de
cultura PW utilizando as mesmas condições da curva realizada com o meio XDM2.
4. Resultados
O crescimento da X. fastidiosa no meio definido XDM2 foi avaliado por
densidade óptica durante dezesseis dias. Como resultado, entre 48 a 240 horas, que
correspondem ao segundo e décimo dia, respectivamente, foi obtida a fase de
crescimento exponencial da bactéria. O início da fase estacionária foi verificado a
34
partir de 240 horas (10 dias). Este período corresponde à fase de maior densidade
celular. (Fig. 1A).
Curva XDM2
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
48 96 144 192 240 288 336 384
Horas
D.O.
(A)
Curva XDM2
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
1,00E+11
48 96 144 192 240 288 336 384
Horas
LOG - No. cells
(B)
Figura 1. Curva de crescimento da bactéria X. fastidiosa no meio XDM2 medida (A)
como A
600 nm
e (B) unidades formadoras de colônias.
O estabelecimento do crescimento da X. fastidiosa no meio definido XDM2
avaliado por UFC apresentou resultados similares ao da curva analisada através de
DO. Também foi observada a fase exponencial entre 48 e 240 horas. Não foi possível
detectar a fase inicial nas duas curvas de crescimento, provavelmente devido à alta
quantidade de pré-inóculo adicionada nos tubos. O início da fase estacionária foi
igual ao da curva avaliada por DO, correspondendo a 240 horas, e também à fase de
maior densidade celular. A partir desse dia, houve uma diminuição do crescimento,
porém este se manteve estável, o que é característico da fase estacionária (Fig. 1B).
35
A partir dos dados gerados após a realização das curvas de crescimento da X.
fastidiosa no meio XDM2, a relação entre os valores da DO e UFC nos diferentes
tempos de avaliação foi descrita por uma equação do tipo exponencial (Y=3191421 x
592
X
) onde Y= UFC e X = DO. O alto valor do coeficiente de correlação simples
obtido (R
2
= 0,91) indica que os valores das duas variáveis estão proximamente
relacionados e tendem a variar no mesmo sentido.
De posse das informações obtidas após a curva de crescimento avaliada pela
UFC, calculou-se o tempo de geração (G) da X. fastidiosa no meio de cultura XDM2
utilizando a fórmula padrão de crescimento exponencial G=T/N. O tempo de geração
da X. fastidiosa nesse meio de cultura definido foi de 21,30 horas. Entretanto, o
tempo de geração no meio PW foi de 11, 37 horas. Esses resultados demonstram que
a X. fastidiosa cultivada no meio PW se multiplica muito mais rápido do que quando
cultivada no meio XDM2.
5. Discussão
A X. fastidiosa é uma bactéria que apresenta crescimento lento em meio de
cultura. Suas células encontram-se embebidas em uma matriz densa composta por
exopolissacarídeos (Chagas et al., 1992), o que implica na formação de agregados,
dificultando a mensuração da multiplicação celular. Essa característica torna ainda
mais difícil estabelecer curvas de crescimento mais precisas. Portanto, são poucos os
trabalhos que reproduzem os padrões de crescimento bacteriano e tempo e geração.
O crescimento bacteriano é dividido em quatro fases. A primeira é a inicial ou Lag,
que corresponde à fase de adaptação ao meio e as células encontram-se latentes. No
entanto, é a fase de maior atividade celular, ocorrendo à síntese de DNA, novas
proteínas e enzimas, que são um pré-requisito para divisão. A outra fase é a
exponencial, nesta fase, as células estão se dividindo a uma taxa geométrica
constante até atingir um máximo de crescimento. A fase de crescimento exponencial
normalmente chega ao final devido à depleção de nutrientes essenciais, diminuição
de oxigênio em cultura aeróbia ou acúmulo de produtos tóxicos. A terceira fase é a
estacionária, onde há rápido decréscimo na taxa de divisão celular. Nessa fase o
número total de células em divisão é igual ao número de células mortas, e isto ocorre
devido à redução de nutrientes no meio e ao acúmulo de metabólitos tóxicos,
36
resultando na verdadeira população celular estacionária. E finalmente a fase de morte
ou declínio, quando as condições se tornam fortemente impróprias para o
crescimento, a multiplicação celular é mais lenta e as células mortas aumentam em
números elevados.
Neste trabalho, foi possível determinar a fase exponencial da curva de
crescimento de X. fastidiosa, assim como, determinar o tempo de geração desta
bactéria nos meios XDM2 e PW. Na determinação da curva de crescimento da X.
fastidiosa no meio XDM2 avaliada por densidade óptica e UFC, não foi possível
observar a fase inicial ou Lag, possivelmente devido a grande quantidade de inóculo
que foi adicionado para estabelecimento da curva de crescimento. A fase exponencial
foi obtida entre 48 e 240 horas correspondendo ao segundo e décimo dias,
respectivamente. O início da fase estacionária, que corresponde a maior densidade
celular, foi obtida com 240 horas (10 dias). Esses resultados foram similares à curva
de aumento da quantidade de proteínas e densidade óptica publicada por Lemos et al.
(2003), onde após 12 dias foi observada maior quantidade de proteínas e valores de
DO
600 nm
. A diferença do tempo de obtenção de maior densidade celular, entre esse
trabalho e o de Lemos et al. (2003), provavelmente ocorreu devido a diferenças entre
as condições experimentais.
Ainda, não foi possível determinar com precisão a fase de declínio.
Observando-se a curva de crescimento por DO, sugere-se que o declínio da
população se inicia após 336 horas (14 dias). Contudo, um número maior de
avaliações seria necessário para confirmar esta sugestão, uma vez que, o número de
células viáveis, determinada por UFC, se manteve aproximadamente constante entre
288 a 384 horas. E é importante salientar que nas avaliações por DO também são
medidas células mortas.
Através do número de UFC obtido na curva de crescimento da X. fastidiosa
cultivada no meio XDM2 a taxa de multiplicação celular foi de 21,30 horas. Em
meio PW o tempo estimado foi de 11,37 horas. Esses resultados são semelhantes
àqueles obtidos por Caldana (2002) em meio PW de 13,5 horas. Comparando com
outra bactéria de crescimento lento, como por exemplo, Leifsonia xyli que coloniza o
xilema de plantas de cana-de-açúcar, e cujo tempo de geração é de 6,9 horas (Rosa,
2006), considera-se que o tempo de geração da X. fastidiosa em ambos meios de
cultura é muito alto, o que certamente é associado ao caráter fastidioso desta bactéria.
37
As células crescidas no meio XDM2 apresentam uma certa turbidez no meio
líquido que não é observado no meio PW. Contudo, como verificado na curva de
crescimento por UFC e cálculo de tempo de geração, essa maior trubidez não está
relacionada a um maior número de células viáveis. Possivelmente essa característica
esteja relacionada a uma maior quantidade de EPS produzido por X. fastidiosa nesse
meio de cultura (demonstrado no capítulo 2).
Comparando-se o crescimento dessa bactéria nos meios PW e XDM2, é
observado que, neste último, o tempo de geração foi mais alto. É importante
mencionar que para obter crescimento da X. fastidiosa em meio XDM2 deve-se
primeiramente fazer uma adaptação das células ao meio. Visto que não é possível
obter crescimento bacteriano de células recém-isoladas de plantas com sintomas de
CVC, sendo necessário a estabilização do crescimento primeiramente em outro meio
de cultura.
De posse dessas informações, foi possível inferir que a X. fastidiosa apresenta
um crescimento mais rápido quando cultivada no meio PW. Provavelmente, essa
diferença no crescimento entre os dois meios avaliados se deve ao fato do meio PW
ser complexo e possuir mais nutrientes, o que auxilia na obtenção de um crescimento
mais rápido. Contudo, o meio definido XDM2, apesar da taxa de multiplicação
necessitar de um tempo maior, apresenta um bom crescimento celular e pode ser
usado em experimentos utilizando a bactéria X. fastidiosa causadora de CVC.
Entretanto, outros meios são necessários quando se tem por finalidade o isolamento
desta bactéria das plantas hospedeiras.
38
Capítulo 2. Avaliação da resistência de Xylella fastidiosa a cobre e
zinco em condições de crescimento planctônico e em biofilme.
Resumo
O principal mecanismo de patogenicidade da Xylella fastidiosa está associado à
formação de biofilme no xilema da planta hospedeira conduzindo ao bloqueio no
transporte de água e nutrientes. Uma das características de crescimento bacteriano
em biofilme é o aumento da resistência a compostos antimicrobianos, maior que em
crescimento planctônico. Apesar da X. fastidiosa apresentar crescimento em
biofilme, nenhum estudo foi ainda realizado para testar a resistência do biofilme a
compostos antimicrobianos. Assim, esse trabalho objetivou avaliar o nível de
resistência de X. fastidiosa a cobre e zinco em crescimento planctônico comparado
ao biofilme. O efeito do cobre foi avaliado nos meios PW e XDM2, e do zinco nos
meios BCYE e XDM2. Para condição planctônica, as células foram mantidas nesses
três meios de cultura até início da fase estacionária. Foram adicionados os sais em
concentrações crescentes até a obtenção da concentração mínima inibitória (MIC).
Para crescimento em biofilme foram utilizadas células recém-isoladas de laranja
doce com sintomas de CVC. Após quinze dias do biofilme formado na interface
líquido-ar, foram adicionados CuSO
4
e ZnSO
4
em concentrações a partir das MICs
da condição planctônica. Após 24 h o efeito foi avaliado. Além dessa análise,
também foi quantificada a formação de EPS. As MICs demonstram que células na
condição de biofilme apresentam de duas a três vezes mais resistência a metais que
células planctônicas. O biofilme de X. fastidiosa apresentou uma quantidade
significativamente maior de EPS (P≤0,05) em relação às células planctônicas,
sugerindo que a proteção física conferida pelo EPS pode ter um importante papel na
sobrevivência das células em presença desses metais.
Palavras-chave: concentração mínima inibitória, patogenicidade, CuSO
4
, ZnSO
4.
39
Chapter 2. Avaliation of resistence of Xylella fastidiosa to cooper and
zinc conditions of planctonic grownth and in biofilm.
Abstract
The main pathogenicity mechanism of Xylella fastidiosa is associated with
formation of a biofilm in the xylem of the host plant leading to the interruption in the
transport of water and nutrients. One characteristic of the bacterial growth in biofilm
is the increase of the resistance to antimicrobial compounds, higher than in
planktonic growth. X. fastidiosa presents growth in biofilm, but no study was done so
far to test the resistance of its biofilm to antimicrobial compounds. Thus, the
objective of this work was to evaluate the level of the resistance of X. fastidiosa to
cooper and zinc in planktonic growth comparing it with the biofilm. The effects of
cooper and zinc were evaluated in PW and XDM2, and BCYE and XDM2,
respectively. For the planktonic conditions, the cells were kept in these three culture
media until the beginning of the stationary phase. The salts were added in crescent
concentrations until twe obtained of the minimum inhibitory concentration (MIC).
For the biofilm, cells freshly isolated from sweet orange trees with symptoms of
CVC were utilized. Fifteen days after the biofilm had formed in the liquid-air
interface, CuSO
4
and ZnSO
4
were added in concentrations starting from the MICs
identified for the planktonic conditions. After 24 hours, the effect was evaluated.
Furthermore, the formation of EPS was quantified. The analysis of the MICs
demonstrated that cells in biofilm condition are two to three times more resistant to
metals than planktonic cells. The biofilm of X. fastidiosa presented an amount of
EPS significantly higher (P≤0,05) than planktonic cells, suggesting that the physical
protection conferred by the EPS may play an important role in the survival of the
cells in the presence of these metals.
Key-words: minimum inhibitory concentration, pathogenicity, CuSO
4
, ZnSO
4.
40
1. Introdução
Xylella fastidiosa é a bactéria responsável pela clorose variegada do citros
(CVC), doença que afeta todas as variedades de laranja doce, causando grandes
problemas de ordem fitossanitária para citricultura brasileira. As estimativas dos
danos econômicos causados pela CVC são de 286 – 322 milhões de dólares
(Fernandes-Jr, 2003), na forma de replantio, poda de plantas infectadas e controle
químico do vetor. Os sintomas da CVC estão também associados ao bloqueio dos
vasos condutores das plantas, causado pela colonização e multiplicação bacteriana,
conduzindo ao aumento de estresse hídrico e deficiência de nutrientes (Machado et
al., 1994; McElrone et al., 2001; Machado et al., 2001; Medina, 2002).
Um dos aspectos interessantes para serem pesquisados no genoma funcional
dessa bactéria relaciona-se com o mecanismo de patogenicidade que difere de outras
bactérias por não apresentar genes de avirulência (avr) (Baker et al., 1997). Devido à
ausência desses genes no genoma da X. fastidiosa, existe uma hipótese de que a
formação do biofilme, conhecido como a habilidade das bactérias em aderir a
superfícies e estabelecer uma comunidade microbiana (De kievit and Iglewski,
1999), é essencial para a bactéria colonizar o xilema da planta ou cibário do inseto
vetor, sendo considerado um dos principais mecanismos de patogenicidade desse
microrganismo (Souza et al., 2003; Osiro et al., 2004). As células em biofilme
apresentam maior vantagem adaptativa em relação às células planctônicas. Tem sido
demonstrado, por exemplo, que células em biofilme podem ser 500 vezes mais
resistentes a compostos antimicrobianos que células em crescimento planctônico
(Costerton et al., 1995).
A principal estratégia de controle de bacterioses em vários patossistemas é a
aplicação de compostos antimicrobianos, como antibióticos e compostos cúpricos.
Sabe-se que bactérias que formam biofilme apresentam resistência crescente a
compostos antimicrobianos à medida que o biofilme se desenvolve. Entretanto, os
estudos de respostas a estes compostos em bactérias que formam biofilme como
Pseudomonas aeruginosa e Staphyloccocus aureus (Brooun et al., 2000; Teitzel and
Parsek, 2003; Fux et al., 2004) demonstram que as doses necessárias para controle
são geralmente muito maiores do que as utilizadas quando as células crescem de
forma planctônica. Apesar da X. fastidiosa também crescer em biofilme, e este estar
41
envolvido em sua patogenicidade, nenhum estudo visando verificar o nível de
resistência a compostos antimicrobianos nestas condições de crescimento foi até
agora realizado. Desse modo, esse trabalho teve como objetivo avaliar o nível de
resistência a cobre e zinco de X. fastidiosa crescendo em biofilme e de forma
planctônica.
2. Objetivo
2.1. Geral
- Avaliar o nível de resistência de X. fastidiosa a cobre e zinco, quando nas
condições de crescimento em biofilme e planctônica;
2.2. Específicos
- Determinar concentração mínima inibitória (MICs) de cobre e zinco no
crescimento de X. fastidiosa nas condições de biofilme e planctônica;
- Determinar a quantidade de EPS produzido pelas células de X. fastidiosa em
ambas as condições.
3. Material e Métodos
3.1. Estirpe bacteriana e condições de cultivo.
Para a realização deste estudo foi utilizada a estirpe 9a5c de X. fastidiosa re-
isolada de plantas de laranja ‘Pêra’ com sintomas de CVC e mantidas em condições
de casa de vegetação. Para o isolamento da bactéria, o pecíolo e a nervura central de
cada amostra foliar foram destacados, desinfestados (2 min em hipoclorito de sódio
2%, 2 min em álcool 70%, água esterilizada), maceradas em PBS (Na
2
HPO
4
.7H
2
O;
NaH
2
PO
4
.2H
2
O e NaCL) e plaqueadas em meio PW (Davis et al.,1981). Após 10 a
15 dias em BOD a 28ºC as primeiras colônias foram inoculadas em meio PW-
líquido. Para obtenção das células em crescimento planctônico, as colônias
bacterianas foram repicadas semanalmente em meio PW sólido por
42
aproximadamente 46 vezes. Em repicagem sucessiva a bactéria reduz sua capacidade
de adesão a superfícies. Essas células foram inoculadas em Erlenmeyer com 50 mL
de PW-líquido e mantidas sob agitação 130rpm a 28ºC para formar o pré-inóculo. As
células em biofilme foram obtidas a partir de várias colônias resultantes do
isolamento bacteriano e inoculadas em meio PW-líquido. As bactérias foram
mantidas nas mesmas condições das células planctônicas, no entanto, somente até a
oitava repicagem.
3.2. Determinação da concentração mínima inibitória (MIC) das células
planctônicas.
Para a determinação da MIC na condição planctônica, foram adicionados 10%
do pré-inóculo, formado de células bacterianas não aderidas, em Erlenmeyer com 50
mL de meio PW-líquido, meio definido XDM2 e meio indefinido BCYE. Os
inóculos foram mantidos sob agitação a 130rpm a 28°C. Após 10 dias de
crescimento (maior densidade celular medida por A
600
e UFC), foi aliquotado 1 mL
dessas culturas em placas “Nunclon delta SI Multidish 24 wells” (Nunc A/S,
Roskilde, Denmark). O tratamento com cobre foi conduzido nos meios PW e XDM2
enquanto que com o zinco, nos meios BCYE e XDM2 (Fig. 1). A concentração
inicial utilizada de CuSO
4
foi de 0,15mM para o meio PW e 1mM para o meio
XDM2. A de ZnSO
4
foi de 1mM para ambos os meios, sendo aumentada
gradativamente até obtenção da MIC (Tab. 1). Após vinte e quatro horas, 100 µL das
culturas tratadas foram plaqueados em meio PW. Isso foi feito para a avaliação da
redução do crescimento bacteriano comparado ao controle (inóculo sem o composto
antimicrobiano). Para cada concentração avaliada foram utilizadas três repetições
biológicas e três placas por repetição. A MIC para a condição planctônica foi
definida quando no máximo uma colônia estivesse presente nas três placas
inoculadas com a cultura não diluída (Brooun et al., 2000).
43
Figura 1. Ensaio de resistência de X. fastidiosa a cobre em crescimento planctônico.
Tabela 1. Determinação da MIC na condição de crescimento planctônica da X.
fastidiosa. Diferentes concentrações de CuSO
4
e ZnSO
4
nos diferentes meios de
cultura utilizados nos experimentos.
Planctônico
PW BCYE XDM2
CuSO
4
(mM) ZnSO
4
(mM) CuSO
4
(mM) ZnSO
4
(mM)
0,15 1,0 1,0 1,0
0,20 2,0 2,0 2,0
0,25 3,0 3,0 3,0
0,30 4,0 4,0 4,0
0,35 5,0 5,0 5,0
0,45 6,0 6,0 6,0
0,50 8,0 8,0 8,0
0,60 10,0 10,0 10,0
0,70 - 15,0 15,0
0,80 - 20,0 20,0
1,0 - 30,0 30,0
3,0 -
- -
3,5 -
- -
4,0 -
- -
5,0 -
- -
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
44
3.3. Determinação da MIC para as células em biofilme.
Para determinar qual a fase de formação do biofilme seria mais resistente a
compostos antimicrobianos, foi feita uma avaliação preliminar com diferentes
concentrações de cobre e zinco. Para tal, foram utilizados biofilmes com 10, 15, 20 e
25 dias após inoculação (estádios de maior densidade celular) para os meio PW e
XDM2 tratados com cobre, e BCYE e XDM2 tratados com zinco. Foi obtido
crescimento celular semelhante sempre entre15 e 20 dias, sendo que desta forma os
experimentos foram conduzidos após 15 dias de formação do biofilme.
Para o crescimento em biofilme foram utilizadas células recém-isoladas de
plantas sintomáticas e que formaram biofilme na interface líquido-ar do meio de
cultura. Para o pré-inóculo as células foram inoculadas em Erlenmeyers com 50 mL
de meio PW. Após cinco dias de crescimento, o biofilme aderido na interface
líquido-ar foi homogeneizado ao meio de cultura do próprio recipiente e as células
foram distribuídas (10%) em outros Erlenmeyers com 50 mL de meio PW, para as
avaliações do efeito do CuSO
4
, no meio BCYE para os experimentos utilizando
ZnSO
4
e XDM2 para avaliação de ambos os metais, e deixados crescer sob agitação
a 130rpm a 28ºC. Após 15 dias de crescimento, foram adicionados os sais de cobre e
zinco (Fig. 2A, B e C). Concentrações iguais e crescentes acima da concentração que
determinou a MIC para condição planctônica foram utilizadas para iniciar os
experimentos na condição de biofilme (Tab. 2). Após vinte e quatro horas foi
avaliado o efeito bactericida, conforme descrito acima, para o experimento
planctônico. O controle da viabilidade celular (inóculo sem o composto
antimicrobiano) também foi incluído em todas as avaliações.
45
Figura 2. Ensaio para a avaliação da resistência do biofilme de X. fastidiosa a
compostos antimicrobianos. Biofilme da X. fastidiosa com 15 dias de crescimento.
Meios: A - PW, B - XDM2, C - BCYE.
Tabela 2. Determinação da MIC na condição de crescimento em biofilme de X.
fastidiosa.
Biofilme
PW BCYE XDM2
CuSO
4
(mM) ZnSO
4
(mM) CuSO
4
(mM) ZnSO
4
(mM)
3,5 5,0 5,0 5,0
4,0 6,0 6,0 6,0
5,0 8,0 7,0 8,0
6,0 10,0 10,0 10,0
7,0 15,0 - 15,0
8,0 20,0 - 20,0
9,0 25,0 - 25,0
10,0 30,0 - 30,0
15,0 40,0 - -
20,0 - - -
25,0 - - -
30,0 - - -
PW
A
Biofilme
XDM2
B
BCYE
C
Biofilme
Biofilme
PW
A
Biofilme Biofilme
XDM2
B
BCYE
C
Biofilme Biofilme
Biofilme Biofilme
46
3.4. Determinação de exopolissacarídeos (EPS).
Para a análise da quantidade de EPS foi seguido o protocolo descrito por
Dubois et al. (1956), onde inicialmente foi realizada uma curva padrão com glicose
(1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 50, 70, 100 e 150 mg/L). As células em biofilme e com
crescimento planctônico foram crescidas até 15 e 10 dias, respectivamente, em 50
mL de meio PW, BCYE e XDM2. Todos os biofilmes e células planctônicas foram
coletados nos mesmos dias. As culturas foram centrifugadas por 10 min a 5900xg.
Após esta etapa, a massa celular de todas as amostras foi padronizada para 0,025 g e
então ressuspendidas em 1 mL de PBS. Para determinar o EPS nas duas condições de
crescimento para o meio PW, o restante das células planctônicas e em biofilme foi
padronizado para 0,1g. Para quantificar o EPS foram adicionados 200 µL de fenol
5% em 200 µL da suspensão bacteriana de cada amostra, em seguida, foi adicionado
1 mL de ácido sulfúrico 95-97%. O mesmo procedimento foi realizado com tampão
PBS, utilizado como branco nas análises. A absorbância das amostras foi medida a
490
nm
. O experimento foi realizado com três repetições biológicas e seis repetições
internas para cada amostra avaliada. Foram realizados testes estatísticos no programa
ASSISTAT utilizando o teste t com 5% de probabilidade (Silva and Azevedo, 2006).
4. Resultados
4.1. Determinação da concentração mínima inibitória (MIC) de CuSO
4
das
células planctônicas e em biofilme.
As células planctônicas cultivadas no meio PW (pPW) foram tratadas com
concentrações a partir de 0,15 a 5mM de CuSO
4
, A inibição inicial do crescimento,
comparada ao controle (células sem CuSO
4
), foi observada somente com
concentrações a partir de 0,30 mM. Essa inibição foi gradativa até a concentração de
3,5 mM, considerada a MIC (Fig. 3A). Adicionalmente, os biofilmes da X. fastidiosa
formados no meio PW (bPW) apresentaram alta resistência ao cobre comparada às
pPW. A concentração que determinou a MIC das células na condição planctônica
(3,5mM), não apresentou nenhuma inibição no crescimento nos bPW. Para essas
células a inibição do crescimento iniciou-se na concentração de 4 mM. A completa
47
erradicação dos bPW foi observada na concentração de 7mM de CuSO
4
(MIC), o
dobro da concentração que determinou a MIC das pPW (Fig. 3A).
As células planctônicas de X. fastidiosa cultivadas no meio XDM2 (pXDM2)
apresentaram inibição do crescimento a partir da concentração de 2mM de CuSO
4
(Fig. 3B). Contudo, a completa erradicação celular das pXDM2 foi obtida com 5mM
de CuSO
4
. Para os biofilmes formados no meio XDM2 (bXDM2) foi observada uma
redução de aproximadamente 50% na população bacteriana na concentração de 5mM
de CuSO
4
, a MIC para as células planctônicas. No entanto, a completa erradicação
das células em biofilme foi obtida na concentração de 7mM de CuSO
4
(Fig. 3B).
Similar as bPW, foram necessárias maiores concentrações de CuSO
4
para completa
inibição do crescimento das células em biofilme cultivadas em XDM2 comparado ao
crescimento planctônico.
48
Figura 3. Porcentagem das células viáveis da X. fastidiosa em relação a diferentes
concentrações de sulfato de cobre nas condições de crescimento planctônico e em
biofilme da bactéria. A: porcentagem de células viáveis na condição planctônica
(preto) e em biofilme (cinza) no meio PW com diferentes concentrações de CuSO
4
.
B: porcentagem de células viáveis na condição planctônica (preto) e em biofilme
(cinza) no meio XDM2 com diferentes concentrações de CuSO
4
.
CuSO
4
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,15mM 0,3mM 0,5mM 0,8mM 1mM 3,5mM 4mM 5mM 6mM 7mM
CuSO
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7
1mM 2mM 3mM 4mM 5mM 6mM 7mM
CuSO
4
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,15mM 0,3mM 0,5mM 0,8mM 1mM 3,5mM 4mM 5mM 6mM 7mM
CuSO
4
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,15mM 0,3mM 0,5mM 0,8mM 1mM 3,5mM 4mM 5mM 6mM 7mM
CuSO
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7
CuSO
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7
1mM 2mM 3mM 4mM 5mM 6mM 7mM
B
49
4.2. Determinação da concentração mínima inibitória (MIC) de ZnSO
4
das
células planctônicas e em biofilme.
As células em crescimento planctônico no meio BCYE (pBCYE) e tratadas
com diferentes concentrações de ZnSO
4,
apresentaram uma inibição inicial do
crescimento a partir de 3mM, que foi de 50% em relação ao controle (células sem
ZnSO
4
). No entanto, a completa erradicação das células ocorreu com 5mM de ZnSO
4
(MIC) (Fig. 4A). Para as pXDM2, o início da inibição do crescimento foi similar ao
observado nas pBCYE, entretanto, na concentração de 4mM o nível de inibição foi
menor nas pXDM2 em relação as pBCYE. A concentração que determinou a MIC
para as pXDM2 (6mM) foi um pouco maior do que a necessária para erradicar as
células pBCYE (5mM) (Fig. 4B).
Em relação às células em biofilme foi observada alta resistência ao ZnSO
4
comparada às células planctônicas, em ambos meios de cultura (Fig. 4A e B). Para os
biofilmes formados no meio BCYE (bBCYE), a concentração que determinou a MIC
para condição planctônica (5mM) apresentou uma inibição de 60% no crescimento
das células do biofilme (Fig. 4A). Essa inibição foi gradativa até 15mM de ZnSO
4,
concentração que determinou a completa erradicação celular. Essa concentração foi
três vezes a concentração necessária para determinar a MIC para as pBCYE (Fig.
4A). Resultados similares foram observados para os pXDM2, tanto para o início da
inibição, quanto para a concentração que determinou a MIC (15mM), que foi igual
ao bBCYE (Fig. 4A e B).
Esses resultados demonstraram que as células em biofilme são menos
suscetíveis ao ZnSO
4
do que as células planctônicas em ambos os meios de cultura,
entretanto, os níveis de resistência foram diferentes dependendo do meio de cultura.
50
Figura 4. Porcentagem das células viáveis da X. fastidiosa em relação a diferentes
concentrações de sulfato de zinco nas condições de crescimento planctônico e em
biofilme da bactéria. A: porcentagem de células viáveis na condição planctônica
(preto) e em biofilme (cinza) no meio BCYE com diferentes concentrações de
ZnSO
4
. B: porcentagem de células viáveis na condição planctônica e em biofilme no
meio XDM2 com diferentes concentrações de ZnSO
4
.
ZnSO
4
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1mM 2mM 3 mM 4mM 5mM 6mM 8mM 10mM 15mM
ZnSO
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
1mM 2mM 3 mM 4mM 5mM 6mM 8mM 10mM 15mM
ZnSO
4
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1mM 2mM 3 mM 4mM 5mM 6mM 8mM 10mM 15mM
ZnSO
4
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1mM 2mM 3 mM 4mM 5mM 6mM 8mM 10mM 15mM
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1mM 2mM 3 mM 4mM 5mM 6mM 8mM 10mM 15mM
ZnSO
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
1mM 2mM 3 mM 4mM 5mM 6mM 8mM 10mM 15mM
ZnSO
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
1mM 2mM 3 mM 4mM 5mM 6mM 8mM 10mM 15mM
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% células viáveis
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
1mM 2mM 3 mM 4mM 5mM 6mM 8mM 10mM 15mM
51
4.3. Teor de EPS nas células planctônicas e em biofilme.
Células bacterianas com crescimento planctônico, independente do meio de
cultura utilizado, apresentaram valor de densidade óptica menor que as células em
biofilme (Tabela 3). Entretanto, não foi possível quantificar o EPS nas pPW e
pBCYE, e nos bBCYE devido à baixa massa celular utilizada nas análises (Tabela 3).
A quantidade de EPS produzido no bXDM2 foi significativamente maior que na
condição planctônica (Fig. 5A). Também foi observada uma diferença na quantidade
de EPS entre as células em biofilme do PW e XDM2, sendo que no bXDM2 a
quantidade foi significativamente maior (Fig. 5B).
Demonstra-se que, assim como no meio XDM2, as células em biofilme no
meio PW apresentaram significativamente mais EPS que as células planctônicas
(Fig.5C).
Tabela 3. Teor de EPS das células planctônicas e em biofilme nos diferentes meios
de cultura.
Meio
PW BCYE XDM2
Planctônico
Biofilme
Planctônico
Biofilme
Planctônico
Biofilme
A
490
0,028
0,129
0,000
0,017
0,184
0,278
mg/L
ND
3,48
ND
ND
6,34
11,2
52
Figura 5. Teor de EPS das células de X. fastidiosa em diferentes meios de cultura e
nas duas condições de crescimento. Letras distintas indicam diferença significativa a
nível de 5% de probabilidade (teste t). A: crescimento planctônico e em biofilme no
meio XDM2. B: crescimento em biofilme nos meios de cultura PW e XDM2. C:
crescimento em biofilme e planctônico no meio de cultura PW.
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
planctônico biofilm e
a
b
A
planctônico
biofilme
b
a
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
1 2
PW
B
XDM2
0
1
2
3
4
5
EPS mg/L
Planctônico Biofilm e
a
b
C
biofilme
planctônico
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
planctônico biofilm e
a
b
A
planctônico
biofilme
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
planctônico biofilm e
a
b
A
planctônico
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
planctônico biofilm e
a
b
A
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
planctônico biofilm e
a
b
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
planctônico biofilm e
a
b
A
planctônico
biofilme
b
a
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
1 2
PW
B
XDM2
b
a
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
1 2
PW
B
XDM2
a
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
1 2
PW
B
XDM2
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
1 2
PW
B
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
1 2
PW
0
2
4
6
8
10
12
EPS mg/L
1 2
PW
B
XDM2
0
1
2
3
4
5
EPS mg/L
Planctônico Biofilm e
a
b
C
biofilme
planctônico
0
1
2
3
4
5
EPS mg/L
Planctônico Biofilm e
a
b
C
0
1
2
3
4
5
EPS mg/L
Planctônico Biofilm e
a
b
0
1
2
3
4
5
EPS mg/L
Planctônico Biofilm e
a
b
C
biofilme
planctônico
53
5. Discussão
Desde que biofilmes foram associados a importantes doenças em humanos,
esforços significativos têm sido direcionados para o entendimento dos mecanismos
de resistência a compostos antimicrobianos de células nessa condição de crescimento
(Brooun et al., 2000; Mah and O´Toole, 2001, Yang et al., 2006). O mecanismo de
patogenicidade da X. fastidiosa também está associado à formação de biofilme. No
entanto, nenhum estudo foi ainda realizado nesse sentido. Devido ao cobre ser um
composto antimicrobiano comumente utilizado no campo contra bactérias
fitopatogênicas, nesse estudo foi verificada a resistência da X. fastidiosa a cobre e
também a zinco, tanto em crescimento planctônico quanto em biofilme.
O outro interesse do presente trabalho, foi investigar se a composição do meio
de cultura poderia afetar o nível de resistência das células de X. fastidiosa. Para tanto
foram avaliados os meios PW (composição indefinida) e XDM2 (definido). Para
zinco não foi possível utilizar o meio PW devido a problemas de precipitação do
zinco como fosfatos. Para tanto foi utilizado o meio BCYE modificado (sem adição
do carvão ativado).
Foi verificado que as células planctônicas em todos os meios de cultura foram
mais suscetíveis ao cobre e ao zinco do que aquelas crescidas como biofilme.
Entretanto, as pXDM2 foram menos suscetíveis ao cobre em relação àquelas com
crescimento em meio PW. Este último é um meio de cultura complexo que possui
diferentes componentes indefinidos e tem sido utilizado para cultura de todas as
estirpes de X. fastidiosa (Fry et al., 1990). XDM2 é um meio de cultura definido que
foi elaborado baseado na anotação do genoma X. fastidiosa, é composto por glicose,
vitaminas e aminoácidos, compostos normalmente presentes na seiva do xilema
(Lemos et al., 2003). Resultados similares foram observados para as células tratadas
com zinco, sendo as de crescimento planctônico mais suscetíveis a esse metal do que
as células em biofilme. Além disso, os níveis de resistência apresentados pelas
células planctônicas cultivadas nos meios BCYE (complexo) e XDM2 também
foram diferentes. As pXDM2 apresentaram maior resistência ao zinco do que as
pBCYE.
É possível que a menor susceptibilidade aos metais das células planctônicas
cultivadas em XDM2 comparada aos meios PW e BCYE esteja relacionada à maior
54
produção de EPS quando as células são cultivadas em XDM2. Sabe-se que a matriz
EPS pode adsorver cátions de metais, reduzindo sua atividade biológica (Harrison et
al., 2006).
Os resultados demonstram que, assim como bactérias patogênicas de humanos,
X. fastidiosa em biofilme apresenta maior resistência a compostos antimicrobianos
do que em crescimento planctônico. Foi observado que em biofilme, independente do
meio de cultura utilizado, ocorre de duas a três vezes maior resistência a cobre e
zinco. Bactérias como Pseudomonas aeruginosa podem apresentar de duas a
seiscentas vezes maior resistência a cobre quando em crescimento em biofilme
(Teizel and Parsek, 2003). Uma das possibilidades para explicar o aumento da
resistência do biofilme estaria relacionada à sua arquitetura, que no estádio maduro,
apresenta as células fisicamente mais protegidas contra a ação de substâncias
nocivas. Essa barreira física é formada por uma matriz extracelular de
exopolissacarídeo (EPS) composta por polissacarídeos e proteínas que são
produzidas pelas células em biofilme (Whitfield, 1988; Platt, et al., 1985; Flemming
and Wingende, 2001, Whitchurch, et al., 2002;).
Nesse estudo, a quantidade de EPS no biofilme foi significativamente maior
em relação às células planctônicas, sugerindo que o EPS produzido pela X. fastidiosa
é responsável, em parte, pela maior resistência a metais na condição de biofilme.
Estes resultados estão de acordo com diversos trabalhos que demonstraram que o
EPS é capaz de complexar ou seqüestrar cátions de metais bivalentes. Uma evidência
disto, é que polissacarídeos isolados de EPS foram reportados ligados a metais, em
particular ao cobre (Chistensen et al., 1985; Mittelman and Geesey, 1985; Kazy et
al., 2002), o que pode ser demonstrado inclusive por microscopia eletrônica de P.
aeruginosa (Langley and Beveridge, 1999). As interações entre o biofilme e metais
pesados resultam da adsorção destes no biofilme. Entretanto, os níveis dessa
adsorção dentro dos biofilmes diminuíram com o aumento da concentração dos
metais pesados (Jang et al., 2001). Muitos estudos mostraram que a adsorção é
resultado de interações dos metais pesados com proteínas, lipídeos, lipoproteínas,
que formam a matriz do biofilme.
Curiosamente, apesar da quantidade de EPS produzida pelas células em
biofilme da X. fastidiosa no meio definido XDM2 ser maior em relação às células
cultivadas em PW e BCYE, não houve diferença na resistência ao sulfato de cobre e
55
zinco entre os biofilmes nos diferentes meios de cultura. Isto sugere que não só a
proteção física confere resistência às células, mas que outros mecanismos podem
estar envolvidos.
A sinalização celular, denominada de “quorum sensing”, é um outro
mecanismo que pode explicar uma possível ativação de mecanismos de resistência.
Essa sinalização celular permite que as bactérias regulem a expressão de genes
específicos como os associados a fatores de virulência, resistência a compostos
antimicrobianos, respostas de defesa do hospedeiro, condições de deficiência
nutricional, produção de antibióticos e transferência de plasmídeos por conjugação
(De Kievit and Iglewski, 1999; Davery and O’Toole, 2000; Molin and Tolker-
Nielsen, 2003). Estas características permitem que as células em biofilme apresentem
grande vantagem adaptativa e competitiva no hospedeiro (Davey and O’Toole,
2000).
Tanto as células planctônicas quanto as células em biofilme apresentaram um
aumento na resistência na fase estacionária da curva de crescimento. O máximo da
resistência em ambas as culturas ocorreu também nessa fase, onde as células em
biofilme foram quinze vezes mais resistente que as células planctônicas. Esses
resultados sugerem que a alta densidade celular deve ser um importante fator na
resistência das células bacterianas (Desai et al., 1998). Nesse estudo foram utilizados
biofilmes formados até 15 dias. Em um trabalho realizado por Souza et al (2004) o
biofilme de X. fastidiosa encontrou-se possivelmente na fase correspondente ao
início da maturidade aos 15 dias, sendo o biofilme maduro observado aos 20 dias.
Contudo, no presente trabalho testes utilizando doses de sulfato de cobre e zinco em
biofilmes formados com 10, 15 e 20 dias após inóculo, não foi observado diferença
na resistência a esses metais entre 15 e 20 dias, entretanto, menor resistência foi
observada aos 10 dias (dados não apresentados).
Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que as células de X. fastidiosa em
biofilme apresentam menor susceptibilidade a cobre e zinco conferido possivelmente
pela agregação do biofilme, onde a comunidade bacteriana apresenta maior
quantidade de EPS dificultando a difusão desses metais. Esses fatores proporcionam
uma importante estratégia de sobrevivência celular da bactéria em crescimento como
biofilme. Outros estudos sugerem que diferentes mecanismos contribuem para a
resistência bacteriana a diversos compostos antimicrobianos. Por exemplo, a baixa
56
taxa de crescimento do biofilme de P. aeruginosa parece estar relacionada à
resistência a tetraciclina, entretanto, não afeta a resistência a tobromicina, indicando
que o crescimento lento possivelmente se relaciona à resistência, sugerindo que as
células podem estar latentes nessa condição enquanto expulsam o excesso das
substâncias nocivas (Brooun et al., 2000).
É importante entender o nível de resistência das bactérias, uma vez que, a
principal estratégia tem sido a aplicação de compostos antimicrobianos como os
cúpricos, bastante utilizados na agricultura como agentes bactericidas. Estudos como
o que foi realizado com a X. fastidiosa, demonstram que as doses necessárias para
um eventual controle da bactéria deverão ser significativamente maiores quando as
células crescem em biofilme, o que dificultaria as estratégias de controle. Nesse
sentido, qualquer estratégia de controle com cobre ou zinco deve considerar o
crescimento da bactéria antes que o biofilme esteja estruturado.
57
Capítulo 3. Análise da expressão gênica de Xylella fastidiosa na
condição de biofilme em diferentes concentrações de cobre e zinco.
Resumo
A Xylella fastidiosa é um fitopatógeno que causa doenças em diferentes
espécies de plantas. No Brasil é responsável pela clorose variegada do citros (CVC)
que afeta toda a produção de laranja doce resultando em significativas perdas. Os
sintomas da CVC estão associados à obstrução dos vasos do xilema causado pela
formação do biofilme bacteriano. Recentemente foi demonstrado que há um aumento
na expressão de alguns genes no biofilme de X. fastidiosa comparada às células
planctônicas. Alguns desses genes codificam proteínas associadas com bombas de
efluxo de cátions e multidrogas, que estão relacionadas aos mecanismos de
resistência. Como verificado no capítulo 2, as células em biofilme apresentam menor
sensibilidade a compostos antimicrobianos em relação às células planctônicas.
Contudo, além da proteção física conferida pelo EPS, fatores genéticos também
poderiam estar associados a essa resistência. Nesse estudo, foi avaliada, através do
qPCR e em dois meios distintos, a expressão de genes associados a diferentes
mecanismos de resistência a cobre e zinco no biofilme de X. fastidiosa. Os seguintes
genes tiveram suas expressões avaliadas por qPCR: acrA, acrB, mexE, czcA, czcD,
metI, copB, cutA, cutB e cutC.
Após análise da expressão gênica, foi verificado que a maioria dos genes
demonstrou uma indução significativa na presença de cobre e zinco. Os maiores
níveis de indução foram observados nos meio complexos, tanto para cobre (PW)
quanto para zinco (BCYE). Em XDM2 houve redução na expressão comparada com
aos meios complexos. Os genes avaliados provavelmente estão envolvidos na
resistência do biofilme de X. fastidiosa através da secreção ativa de metais para fora
das células utilizando bombas de efluxo, além da provável ação dos genes cuts na
homeostase de cobre. Também foi possível verificar que a expressão gênica é
influenciada pelo meio. Contudo, é possível inferir que a ação conjunta de genes
associados a diferentes mecanismos de resistência no biofilme de X. fastidiosa pode
ter um importante papel na sobrevivência das células em presença desses metais.
58
Esses mecanismos são importantes para a bactéria que vive em constantes condições
de estresse no hospedeiro.
Palavras-chave: qPCR, mecanismos de resistência, bombas de efluxo de
multidrogas.
59
Chapter 3. Gene expression analysis of Xylella fastidiosa in biofilm
condition in different concentrations of cooper and zinc.
Abstract
Xylella fastidiosa is a phytopathogen that causes disease in different plant
species. In Brazil it is responsible for the Citrus Variegated Chlorosis (CVC) that
affects all the varieties of sweet orange, resulting in significant losses. The symptoms
of CVC are related to the obstruction of the xylem vessels caused by the formation of
a bacterial biofilm. It was recently demonstrated that there is an increase in the
expression of some genes in the biofilm of X. fastidiosa compared to the planktonic
cells. Some of these genes encode proteins associated to cation and multidrug efflux
pumps related to resistance mechanisms. As it was verified in Chapter 2, biofilm
cells presented a lower sensitivity to antimicrobial compounds compared to
planktonic cells. Besides the physical protection conferred by the EPS, genetics
factors could also be associated to this resistance. In this study, the expression of
genes associated to different mechanisms of resistance to cooper and zinc in the
biofilm of X. fastidiosa in two distinct media was evaluated by qPCR. The following
genes had their expressions evaluated by qPCR: acrA, acrB, mexE, czcA, czcD,
metI, copB, cutA, cutB, and cutC.
The gene expression analysis revealed that the majority of the evaluated genes
presented a significant induction in the presence of cooper and zinc. The highest
inductions were observed in the complex media, both for cooper (PW) and zinc
(BCYE). In XDM2 there was a reduction in the expression compared to the complex
media. The evaluated genes are probably involved in the resistance of biofilm of X.
fastidiosa by the active secretion of metals to the outside of the cells using efflux
pumps, besides the probable action of cut genes in the homeostasis of cooper. It was
also possible to verify that the gene expression is influenced by the medium.
Nevertheless, we could also infer that the joint action of genes associated to
different resistance mechanisms in the biofilm of X. fastidiosa may have an
important role in the survival of the cells in presence of these metals. These
60
mechanisms are important for bacteria that live constantly under stress conditions in
the host.
Key-words: qPCR, resistance mechanisms, multidrug efflux pumps.
61
1. Introdução
Devido à importância econômica da CVC, a X. fastidiosa foi o primeiro
patógeno a ter seu genoma completamente seqüenciado (Simpson et al., 2000). Após
o seqüenciamento, houve a necessidade de estudos que auxiliassem no entendimento
das funções dos genes identificados.
Foi verificado, através de microarranjos de DNA, que um grande número de
genes é induzido em X. fastidiosa crescendo em biofilme quando comparado ao
crescimento planctônico, sendo muitos deles associados à resistência a compostos
antimicrobianos (Souza et al., 2004). O fato dos compostos antimicrobianos não
terem sido adicionados sugere que as células em biofilme possam estar expressando
constitutivamente genes associados à resistência que poderiam estar relacionados à
adaptação. Além disso, genes possivelmente envolvidos no mecanismo de resistência
a metais, foram detectados no genoma da X. fastidiosa. Contudo ainda não foi
verificado se estes são positivamente regulados na presença do composto.
Os genes detectados como possivelmente envolvidos na resistência a cobre e
zinco em X. fastidiosa pertencem a diferentes famílias, porém quase todas estas
famílias estão agrupadas por possuírem atividade de transportadores de efluxo de
compostos antimicrobianos. Dentre essas famílias estão a RND (resistance-
nodulation-division), que funciona associada a proteínas da família de fatores de
membrana externa (out membrane factors-OMF) e MFP (periplasmatic membrane
fusion protein) (Zgurskaya et al., 2000), a família de transportadores ABC (ATP-
binding cassete) com proteínas relacionadas a um sistema de secreção (Andersen,
2003; Lage, 2003), “P-type ATPase”, que constitui uma superfamília de proteínas de
transporte que são dirigidas por hidrólise de ATP (Fagan et al., 1994) e a família
CDF (cation diffusion facilitator). Além desses, outros genes pertencentes ao operon
cut, que provavelmente estão envolvidos na homeostase de cobre em E. coli, também
foram identificados no genoma da X. fastidiosa.
Com os resultados dos estudos biológicos e moleculares da resistência do
biofilme da X. fastidiosa pretende-se esclarecer possíveis mecanismos de resistência
a esses compostos estabelecendo assim possíveis estratégias para o controle da CVC.
62
2. Objetivo
2.1. Geral
- Avaliar a expressão de genes possivelmente associados à resistência de cobre
e zinco em X. fastidiosa em condições de biofilme.
2.2. Específicos
- Avaliar por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) a expressão relativa dos
genes metI, acrA, acrB, czcA, mexE, copB, cutA, cutB, cutC no biofilme de X.
fastidiosa submetido a diferentes concentrações de CuSO
4
e em diferentes meios de
cultura (definido e indefinido);
- Avaliar por qPCR a expressão relativa dos genes metI, acrA, acrB, czcA,
mexE, czcD no biofilme de X. fastidiosa submetido a diferentes concentrações de
ZnSO
4
e em diferentes meios de cultura (definido e indefinido).
3. Material e Métodos
3.1. Extração de RNA total e síntese de cDNA.
Para análise de expressão gênica foram utilizadas células em biofilme tratadas
com concentrações subinibitórias e inibitórias de CuSO
4
e ZnSO
4
nos meios PW,
BCYE e XDM2, assim como o controle (sem adição dos compostos). Após 24 horas
de exposição aos metais, os biofilmes foram coletados por centrifugação a 5900xg
por 6 min a 4ºC em água tratada com DEPC (Dietil-Pirocarbonato). Após esta etapa,
as células bacterianas foram armazenadas a -80
o
C para posterior extração do RNA
total, extraído com RNeasy Mini Kit (Qiagen), tratados com DNase utilizando o
sistema de coluna da Qiagen (Rnase-Free Dnase Set).
A concentração e a integridade dos RNAs foram analisadas no “RNA Nano
Labchips” através do aparelho Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) utilizando o
RNA Nano Labchips kit. Para síntese de cDNA foi utilizado 1 µg/µl do RNA total e
adicionado 3µg de random primer (Invitrogen). A mistura foi acondicionado a 65ºC
63
por 15 min. Após esta etapa, foram adicionados os seguintes reagentes: tampão da
SuperScript II (Invitrogen), 2µL do 0,1M DTT (dithiothreitol), 1µg de random
primers (Invitrogen), 2µL dNTP 10mM, 1µL do inibidor da RNase (Invitrogen) e
1µL de SuperScript II reverse transcriptase (200U/µL Invitrogen). A síntese do
cDNA foi conduzida a 42ºC por 60 min. Os RNAs foram utilizados como molde para
a PCR utilizando os primers do controle endógeno (CE) (tabela 1). Tal procedimento
foi usado para detectar alguma possível contaminação de DNA nas amostras.
3.2. Síntese e validação dos primers.
Os primers para amplificação dos genes associados com resistência a cobre e
zinco foram desenhados utilizando o programa PrimerExpress (Applied Biosystems).
Os primers foram desenhados para os genes acrA (XF2093), acrB (XF2094), mexE
(XF2084), czcA (XF2083), metI (XF0874), copB (XF0133), czcD (XF0866), cutA1
(XF0619), cutA2 (XF0620) e cutC (XF1341). Como controle endógeno foi utilizado
o gene petC (XF0910), que codifica para ubiquinol cytochrome C oxidoreductase
(tabela 1). Os primers foram utilizados para PCR usando DNA da X. fastidiosa como
molde. O amplicon do tamanho correspondente aos fragmentos dos genes avaliados
foi verificado por corrida eletroforética em gel de agarose 1%. Os fragmentos foram
purificados de acordo com o protocolo do kit GFXTM PCR DNA and Gel Band
Purification (Amersham Biosciences), e posteriormente seqüenciados. O
seqüenciamento foi feito de acordo com as instruções da ABI para o “DNA
Sequencing Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction”, v 3.0 e o
seqüenciador utilizado foi o ABI 3730 – Applied Biosystems. A seqüência de
nucleotídeos foi utilizada para pesquisa por similaridade no banco de dados de X.
fastidiosa (http://aeg.unicamp.xf.br), utilizando a ferramenta BlastN e BlastX.
64
Tabela 1. Genes avaliados e sequências dos nucleotídeos dos primers usados para o
qPCR.
Número ORF
Nome do Sequência do Primer
Tamanho do
fragmento
gene (em pares de base)
XF2093 acrA F- 5' TGGCCAACAGCGAGTTACTG 3' 151
R- 5' ACTTCCCTGGTGCTGTGCTT 3'
XF2094 acrB F- 5' TGATTCCGGTCGCCTTACTC 3' 151
R- 5' GTCATGATGCGCTCGACATT 3'
XF2084
mexE
F- 5' CGCTTGCCCTAACAGCATGT 3' 151
R- 5' AAGCCAAGGTCGCTTTGAAC 3'
XF2083 czcA F- 5' GAATCGGTACGCCAACAGATG 3' 151
R- 5' TGTTGAGCGCAGCAAAGATG 3'
XF0874 metI F- 5' GAGCAACCACCTGGCAACTC 3' 151
R- 5' TAGGCGACGTCACCCAATC 3'
XF0133 copB F- 5' TCAGCGGTTGATCCTGCAA 3' 151
R- 5' GCGCTCCCAACCCACATAC 3'
XF0619 cutA1 F- 5'TTCTCGCGTATTGGTACAGGAA 3' 141
R- 5' TTCACATGCACAGCGTTGGT 3'
XF0620
cutA2 F- 5' TTTGGAAAATCACCCGTCGTA 3' 151
R- 5' ACGGCTCTCACCGCTTTTAG 3'
XF1341
cutC F- 5' GGAGTGTTGCGTGCGTCTT 3' 151
R- 5' ATCCGCACTGACATCAATCG 3'
XF0866 czcD F- 5' ACCGACGTGTTCGCGTTAAT 3' 151
R- 5' AACGCCTCTAACCGTGCATAA 3'
XF0910 petC (CE) F- 5' TCCAGCCAGGTCAGCAGAAC 3’ 151
R- 5' ACCAAAAAAGTCAACAACACTAGGAA 3’
1
http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf/
65
3.3. Eficiência de amplificação.
A avaliação da eficiência de amplificação das seqüências foi feita a partir da
amplificação com quatro conhecidas diluições do cDNA. Essa eficiência é verificada
através da relação linear entre o ciclo em que a fluorescência foi detectada (Ct) e o
log da concentração de cDNA. Conforme diminui a concentração do cDNA, aumenta
o número de ciclos necessários para a detecção da fluorescência (Ct). Através do valor
da inclinação (slope) da curva foram calculadas as eficiências da amplificação
usando a fórmula:
E
(eficiência de amplificação)
= 10
(-1/slope)
-1
Para verificar se todos os primers para os genes alvo apresentavam a mesma
eficiência de amplificação que o controle endógeno, o cDNA de uma determinada
condição foi utilizado para comparação. As amostras em triplicatas foram então
submetidas ao qPCR utilizando a seguinte reação: 1µL de cDNA, 1µM de cada
primer (direto e reverso) e 12,5 µL do “SYBR green PCR master mix” (Applied
Biosystems), o volume final foi ajustado para 25 µL com água Milli-Q. As reações
foram incubadas a 50ºC por 2 min, 10 mim a 95ºC e 40 ciclos de 15s a 95ºC e 1 mim
a 60ºC. As amplificações foram checadas no ABI PRISM 7000 SDS versão 1.1
durante a amplificação. Uma boa eficiência foi considerada entre 95-100% (+ ou –
10%).
3.4. Análise da expressão gênica.
Para a realização das análises de expressão gênica através do qPCR, foi
utilizado RNA total extraído de biofilmes tratados com diferentes concentrações de
CuSO
4
e ZnSO
4
e do biofilme sem adição dos compostos (calibrador e controle).
Para cada gene avaliado foram feitas três repetições biológicas. As concentrações dos
metais nos diferentes meios de cultura estão listadas na tabela 2. Os genes alvos
avaliados para os biofilmes tratados com CuSO
4
foram: acrA, acrB, mexE, czcA,
metI, copB, cutA1, cutA2 e cutC e com ZnSO
4
foram: acrA, acrB, mexE, czcA e
czcD. As reações foram feitas em triplicatas utilizando sempre controle sem cDNA
66
para detectar possíveis contaminações. Cada reação foi realizada conforme descrito
no item 3.3.
As avaliações foram realizadas no ABI PRISM 7000 SDS versão 1.1 usando
análises de quantificação relativa (Applied Biosystems). A detecção dos produtos de
PCR foi medida por monitoramento do aumento da fluorescência emitida pelo
marcador SYBR green que está intercalado na fita dupla de DNA. O CE (petC) foi
utilizado para normalizar as amostras das possíveis diferenças de concentrações de
cDNA. Os resultados foram normalizados usando o valor do Ct obtido do CE. Ct é
definido como o primeiro ciclo de amplificação na qual a fluorescência do produto
de PCR é detectada acima do limite mínimo (threshold). Este é um valor numérico
designado para cada corrida, onde o nível de fluorescência da reação é detectada
durante a fase exponencial. Para a normalização, foi utilizada a equação ∆Ct = Ct
(gene alvo) – Ct (controle endógeno). O aumento dos níveis de expressão do gene
alvo para cada condição foi calculado através da equação: ∆∆Ct = ∆Ct (amostra) -
∆Ct (calibrador). O calibrador é o valor obtido para uma amostra específica. O
aumento nos níveis de expressão é sempre obtido em relação ao calibrador específico
utilizado. Neste caso, foi utilizado o valor obtido do biofilme sem adição dos metais.
A quantificação foi obtida por 2
-∆∆Ct
(Livak and Schmittgen, 2001). Para todas as
reações feitas no qPCR foi realizada uma curva de dissociação através do aparelho
ABI7000 para a verificação de amplificações inespecíficas decorrentes de possíveis
contaminações.
As análises estatísticas dos valores da expressão relativa (RQ) dos genes
associados à resistência a cobre e zinco foram avaliadas pela ANOVA e as médias de
três repetições biológicas foram comparadas aplicando o teste t (P ≤ 0.05) através do
programa Assistat 7.3 beta (http://assistat.sites.uol.com.br).
67
Tabela 2. Concentrações dos metais nos diferentes meios utilizadas nas análises de
qPCR.
Biofilme
PW BCYE XDM2
CuSO
4
(mM) ZnSO
4
(mM) CuSO
4
(mM) ZnSO
4
(mM)
3,0 10,0 3,0 10,0
4,0 15,0 5,0 15,0
5,0 20,0 7,0 20,0
6,0 30,0 - 30,0
7,0 - - -
4. Resultados
4.1. RNA total e validação dos primers.
Após a extração do RNA total, a concentração e a integridade foram avaliadas
utilizando “RNA Nano Labchips” no aparelho Bioanalyzer 2100 (Agilent
Technologies). Um exemplo de uma corrida com alguns RNAs avaliados pode ser
observado na figura 1. Os RNAs contaminados e/ou degradados foram descartados.
As concentrações dos RNAs selecionados foram padronizadas em 1 µg/µl para
síntese dos cDNAs.
68
Figura 1. Concentração e integridade dos RNAs avaliados em “RNA Nano
Labchips” no aparelho Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). (A). Imagem do
gel gerado pelo aparelho, cada poço é referente a uma amostra. (B). Gráfico
representando os picos de RNA ribossomal.
As amostras de RNA total de X. fastidiosa, utilizadas para verificar possíveis
contaminações de DNA através da PCR, utilizando primers do petC (CE), não
apresentaram produtos amplificados (dados não mostrados). Os primers utilizados
para PCR usando DNA da X. fastidiosa como molde apresentaram um único
amplicon do tamanho correspondente aos genes alvo e petC (CE) como verificado
por corrida eletroforética em gel de agarose 1% (Fig. 2). Adicionalmente, após o
seqüenciamento e pesquisa por similaridade no banco de dados de X. fastidiosa, foi
verificado que todos os fragmentos apresentaram 100% de identidade com o genoma
da X. fastidiosa. Nas análises da curva de dissociação, cada par de primers
apresentou um único pico confirmando a existência de apenas um amplicon (Fig. 2).
Esses resultados demonstraram que o valor de expressão gênica de todos os genes
avaliados foi realmente devido às suas expressões na presença de cobre e zinco, e
não devido a artefatos provenientes de amplificações inespecíficas ou
contaminações.
A
B
A
B
A
B
69
Figura 2. Validação dos primers utilizados na qPCR. Genes A. acrA; B. acrB; C.
mexE; D. czcA; E. metI; F. copB; G. cutA1; H. cutA2; I. cutC; J. czcD e K. petC
(controle endógeno). Linhas: L = ladder 1Kb-plus (Invitrogen); linhas 1, 2, 3, 4 e 5 =
amplificação do cDNA das células em biofilme incubadas durante 24h com 3, 4, 5, 6
ou 7mM de CuSO
4
, respectivamente, exceto para J, onde as linhas 1, 2, 3 e 4 =
amplificação do cDNA das células em biofilme incubadas durante 24h com 10, 15,
20 ou 30mM de ZnSO
4
, respectivamente.
L 1 2 3 4 5
acrA
151pb
A
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
63
6
4
66
68
70
71
73
7
5
77
78
80
82
8
3
8
5
87
89
90
temperatura (ºC)
Fluorescência
L 1 2 3 4 5
151pb
acrB
B
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
63
64
66
6
8
7
0
71
73
75
77
7
8
80
82
83
85
87
8
9
90
temperatura (ºC)
Fluorescênci a
mexE
L 1 2 3 4 5
151pb
C
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
6
3
64
66
68
70
7
1
73
75
77
78
80
8
2
83
85
87
89
90
tempera tura (ºC)
Fluorescência
151pb
czcA
L 1 2 3 4 5
D
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
63
64
66
68
7
0
71
73
75
77
7
8
8
0
82
83
85
87
8
9
90
temperatura (ºC)
Fluorescênci a
metI
151pb
L 1 2 3 4 5
E
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
6
3
6
4
6
6
6
8
70
7
1
7
3
7
5
7
7
78
80
8
2
8
3
8
5
8
7
89
9
0
temperatura
Fluorescênci a (ºC)
151pb
L 1 2 3 4 5
copB
F
0
0,05
0,1
0,15
0,2
6
3
64
66
68
70
71
7
3
75
77
78
80
8
2
8
3
85
87
89
90
temperatura (ºC)
Fluorescência
141pb
cutA1
L 1 2 3 4 5
G
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
62.6
0
64.5
66.2
68.0
69.7
71.4
73.1
74
.8
76.6
78.3
80.0
81.8
83.5
85.2
86.8
88.6
90.3
temperatura (ºC)
Fluorescênci a
L 1 2 3 4 5
cutA2
151pb
H
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
62.6
0
64.5
66.
2
68.0
69.7
71.4
73.1
74.8
76.6
78.3
80.0
81.8
83.5
85
.2
86.8
88.6
90.3
temperatura (ºC)
Fluorescênci a
151pb
cutC
L 1 2 3 5
I
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
62
.60
64.5
66.2
68.0
69.7
71.4
73.
1
74.8
76.6
78.3
80.0
81
.8
83.5
85.2
86.8
88.6
90.3
temperatura (ºC)
Fluorescência
L 1 2 3 4 5
petC
151pb
K
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
6
3
6
4
66
6
8
7
0
7
1
7
3
75
77
7
8
8
0
8
2
8
3
85
8
7
8
9
9
0
temperatura (ºC)
Fluorescência
L 1 2 3 4
151pb
czcD
J
0
0,05
0,1
0,15
0,2
63
6
4
6
6
6
8
70
7
1
7
3
7
5
7
7
7
8
8
0
8
2
8
3
85
8
7
8
9
9
0
L 1 2 3 4 5
acrA
151pb
A
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
63
6
4
66
68
70
71
73
7
5
77
78
80
82
8
3
8
5
87
89
90
temperatura (ºC)
Fluorescência
L 1 2 3 4 5
acrA
151pb
L 1 2 3 4 5
acrA
151pb
L 1 2 3 4 5
acrA
151pb
acrA
151pb
A
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
63
6
4
66
68
70
71
73
7
5
77
78
80
82
8
3
8
5
87
89
90
temperatura (ºC)
Fluorescência
A
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
63
6
4
66
68
70
71
73
7
5
77
78
80
82
8
3
8
5
87
89
90
temperatura (ºC)
Fluorescência
L 1 2 3 4 5
151pb
acrB
B
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
63
64
66
6
8
7
0
71
73
75
77
7
8
80
82
83
85
87
8
9
90
temperatura (ºC)
Fluorescênci a
L 1 2 3 4 5
151pb
acrB
L 1 2 3 4 5
151pb151pb
acrB
B
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
63
64
66
6
8
7
0
71
73
75
77
7
8
80
82
83
85
87
8
9
90
temperatura (ºC)
Fluorescênci a
B
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
63
64
66
6
8
7
0
71
73
75
77
7
8
80
82
83
85
87
8
9
90
temperatura (ºC)
Fluorescênci a
mexE
L 1 2 3 4 5
151pb
C
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
6
3
64
66
68
70
7
1
73
75
77
78
80
8
2
83
85
87
89
90
tempera tura (ºC)
Fluorescência
mexE
L 1 2 3 4 5
151pb
mexE
L 1 2 3 4 5
151pb151pb
C
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
6
3
64
66
68
70
7
1
73
75
77
78
80
8
2
83
85
87
89
90
tempera tura (ºC)
Fluorescência
C
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
6
3
64
66
68
70
7
1
73
75
77
78
80
8
2
83
85
87
89
90
tempera tura (ºC)
Fluorescência
151pb
czcA
L 1 2 3 4 5
D
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
63
64
66
68
7
0
71
73
75
77
7
8
8
0
82
83
85
87
8
9
90
temperatura (ºC)
Fluorescênci a
151pb
czcA
L 1 2 3 4 5
151pb151pb
czcA
L 1 2 3 4 5
D
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
63
64
66
68
7
0
71
73
75
77
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Fluorescênci a
metI
151pb
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metI
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L 1 2 3 4 5
metI
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Fluorescênci a (ºC)
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Fluorescênci a (ºC)
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151pb
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F
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Fluorescência
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Fluorescênci a
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141pb
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Fluorescênci a
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temperatura (ºC)
Fluorescênci a
L 1 2 3 4 5
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151pb
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Fluorescênci a
L 1 2 3 4 5
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L 1 2 3 4 5
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Fluorescênci a
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0,15
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temperatura (ºC)
Fluorescênci a
151pb
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temperatura (ºC)
Fluorescência
151pb
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L 1 2 3 5
151pb
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85.2
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temperatura (ºC)
Fluorescência
L 1 2 3 4 5
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151pb
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L 1 2 3 4 5
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L 1 2 3 4 5
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temperatura (ºC)
Fluorescência
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temperatura (ºC)
Fluorescência
L 1 2 3 4
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L 1 2 3 4
151pb
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151pb151pb151pb
czcD
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3
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8
7
8
9
9
0
70
4.2. Expressão relativa dos genes associados à resistência a cobre e zinco no
biofilme de X. fastidiosa.
Os possíveis mecanismos envolvidos na resistência a cobre e zinco do biofilme
de X. fastidiosa podem incluir bombas de efluxo como ABC-transporte, membros da
família resistência-nodulação e divisão celular (RND), família “P-type-ATPase”, a
família facilitadora de difusão de cátions (CDF) e outras envolvidas com a
resistência a cobre em outros organismos (Ordermatt et al., 1994; Paulsen and Saier,
1997; Brooun et al., 2000; Nies, 2003). Por esta razão, foram avaliados alguns genes
na qPCR que possivelmente estão relacionados a esses mecanismos de resistência.
Para a verificação da expressão desses genes, foram utilizados biofilmes de X.
fastidiosa submetidos a concentrações subinibitórias, inibitórias e acima das
concentrações que determinaram a completa inibição do crescimento bacteriano na
presença dos metais.
4.2.1. Expressão relativa dos genes associados à resistência a cobre no biofilme.
Para a avaliação da expressão das células em biofilme cultivadas no meio PW
(indefinido) na presença de cobre, foi realizada a comparação com a expressão em
meio definido (XDM2), tendo sido analisada a expressão em três concentrações de
CuSO
4
(baixa, média e alta).
No crescimento em biofilme no meio PW (bPW) a maioria dos genes
apresentou um aumento significativo (P ≤ 0.05) nos níveis de expressão quando o
cobre foi adicionado. Isso foi observado em quase todas as concentrações avaliadas
(Fig. 3). Para os biofilmes crescidos em XDM2 (bXDM2) houve uma diminuição na
indução da expressão gênica comparada com bPW para a maioria dos genes
avaliados (Fig. 4).
Os genes acrA e acrB, bem como mexE e czcA, estão em operon,
respectivamente, e pertencem à família RND. Os genes acrA e acrB apresentaram
alta indução em quase todas as concentrações subinibitórias avaliadas no bPW (Fig.
3A e 3B; 4A). No entanto, para bXDM2, regulação positiva foi observada apenas
para o gene acrA na concentração de 3mM de CuSO
4
(Fig. 4A).
71
Os genes mexE e czcA apresentaram indução significativa no bPW para todas
as concentrações avaliadas. Os níveis de expressão mais altos foram observados em
baixas concentrações de CuSO
4
(Fig. 3B e 3C). Em bXDM2 não foi observada
indução significativa para czcA, entretanto, foi observado um aumento significativo
na expressão do gene mexE em todas as concentrações avaliadas (Fig. 4C).
Similar ao mexE e czcA em bPW, metI apresentou alta indução em
concentrações subinibitórias (Fig. 3E). Padrão semelhante foi observado em XDM2
(Fig. 4D). O gene metI de X. fastidiosa codifica uma proteína permease, membro dos
transportadores ABC, o qual apresenta um domínio AbcD pertencente ao sistema de
transporte de íons de metal tipo transporte ABC.
O gene copB pertencente a superfamília de proteínas transportadoras (P-type-
ATPase), apresentou um aumento significativo nos níveis de expressão em todas as
concentrações de cobre avaliadas no bPW (Fig. 3F). A maior indução foi observada
em 5mM comparada com 3, 4, 6 e 7mM de CuSO
4
, que apresentaram expressões
similares (Fig. 3F). Esse gene foi também significativamente induzido em bXDM2
em todas as concentrações avaliadas (Fig. 4F).
Os outros genes possivelmente associados com a resistência a cobre, cutA1,
cutA2 (ou dsbD) e cutC, também foram avaliados. As análises mostraram aumentos
significativos nos níveis de expressão em quase todas as concentrações avaliadas no
bPW na presença do cobre. No entanto, a indução de cutA1 foi menor que cutA2 e
cutC, embora, similar em todas as concentrações. Por outro lado, cutA2 e cutC
apresentaram picos de indução nas concentrações de 4 e 5mM de CuSO
4
(Fig. 3G, H
e I). Em bXDM2 a indução significativa foi observada somente para cutA2 em 5mM
de CuSO
4
e cutC com 3 e 5mM de CuSO
4
(Fig. 4G, H e I).
72
Figura 3. Quantificação relativa dos genes associados à resistência ao cobre através
do PCR quantitativo em tempo real. cDNAs foram preparados de células em biofilme
cultivadas no meio indefinido PW e incubadas durante 24h com 3, 4, 5, 6 e 7mM ou
sem de CuSO
4
(controle). Médias de três repetições biológicas. a. acrA; b. acrB; c.
mexE; d. czcA; e. metI; f. copB; g. cutA1; h. cutA2; i. cutC. (*) Indica diferença
significativa (P ≥ 0.05) entre as médias dos valores obtidos para cada gene
comparado ao controle. As barras indicam o desvio padrão entre as médias.
73
Figura 4. Quantificação relativa dos genes associados à resistência ao cobre através
do PCR quantitativo em tempo real. cDNAs foram preparados de células em
biofilme cultivadas no meio definido XDM2 e incubadas durante 24h com 3, 5 e
7mM ou sem (controle) de CuSO
4
. Médias de três repetições biológicas. a. acrA; b.
acrB; c. mexE; d. czcA; e. metI; f. copB; g. cutA1; h. cutA2; i. cutC. (*) Indica
diferença significativa (P ≥ 0.05) entre as médias dos valores obtidos para cada gene
comparado ao controle. As barras indicam o desvio padrão entre as médias.
74
4.2.2. Expressão relativa dos genes associados à resistência a zinco no biofilme.
Biofilmes de X. fastidiosa formados nos meios BCYE (definido) e XDM2
(indefinido) com diferentes concentrações de ZnSO
4
foram utilizados para a
avaliação da expressão gênica dos genes acrA, acrB, mexE, czcA, metI e czcD.
As células do biofilme crescidas no meio BCYE (bBCYE), apresentaram
níveis maiores de expressão do que os observados nos biofilmes formados em
XDM2 (bXDM2) após adição do zinco (Fig. 5 e 6). Em bBCYE, os genes acrA e
acrB apresentaram altos níveis de indução em relação ao controle. Em todas as
concentrações avaliadas, tanto as concentrações subinibitórias quanto inibitórias,
foram significativamente expressos, exceto 20mM de ZnSO
4
para o gene acrB (Fig.
5A e B). Entretanto, em bXDM2, esses mesmos genes não mostraram aumentos
significativos em nenhuma concentração avaliada (Fig. 6A e B).
Os genes mexE e czcA foram significativamente induzidos somente nas
concentrações de 10mM (subinibitória) e 15mM de ZnSO
4
(MIC) quando avaliados
em BCYE (Fig. 5C e D). Em bXDM2, assim como observado para acrA e acrB, não
houve indução da expressão de mexE e czcA, exceto para mexE na concentração de
10mM de ZnSO
4
(Fig. 6C e D).
A expressão do gene metI foi similar a dos genes mexE e czcA, demonstrando
níveis significativos nas concentrações subinibitórias e inibitória (MIC) em bBCYE
(Fig. 5E). Em bXDM2, o padrão de expressão apresentado por esse gene foi similar
ao obtido para bBCYE (Fig. 6E).
Adicionalmente, a maior indução observada para o gene czcD, o qual possui
um domínio CzcD envolvido no efluxo de zinco, cádmio e cobalto, foi na
concentração de 20mM de ZnSO
4
em bBCYE (Fig. 5F). Em bXDM2, foram
observadas induções significativas nas concentrações 10, 15 e 20mM de ZnSO
4
(Fig.
6F).
75
Figura 5. Quantificação relativa dos genes associados à resistência ao zinco através
do PCR quantitativo em tempo real. cDNAs foram preparados de células em
biofilme cultivadas no meio indefinido BCYE e incubadas durante 24h com 10, 15,
20 e 30mM ou sem (controle) de ZnSO
4
. Médias de três repetições biológicas. A.
acrA; B. acrB; C. mexE; D. czcA; E. metI; F. czcD. (*) Indica diferença significativa
(P ≥ 0.05) entre as médias dos valores obtidos para cada gene comparado ao controle.
As barras indicam o desvio padrão entre as médias.
B
*
*
*
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B
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76
Figura 6. Quantificação relativa dos genes associados à resistência ao zinco através
do PCR quantitativo em tempo real. cDNAs foram preparados de células em biofilme
cultivadas no meio definido XDM2 e incubadas durante 24h com 10, 15, 20 e 30mM
ou sem (controle) de ZnSO
4
. Médias de três repetições biológicas. a. acrA; b. acrB;
c. mexE; d. czcA; e. metI; f. czcD. (*) Indica diferença significativa (P ≥ 0.05) entre as
médias dos valores obtidos para cada gene comparado ao controle. As barras indicam
o desvio padrão entre as médias.
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5. Discussão
Estudos têm revelado que não somente a estrutura complexa das células em
biofilme é barreira para compostos antimicrobianos, mas que outros mecanismos
distintos de resistência a agentes antimicrobianos são ativados por bactérias nesta
condição de crescimento (Mah et al., 2003; Mukherjee et al., 2003). Esses
mecanismos incluem efluxo de cátions e multidrogas para fora das células (Brooun et
al., 2000; Poole K, 2001; Poole K, 2002; Nies, 2003).
A genética e a bioquímica dos mecanismos de resistência a metais têm sido
cuidadosamente estudadas em organismos de vida livre (Teitzel and Parsek, 2003).
Entretanto, não são concentrados muitos estudos relacionando a participação de
mecanismos de resistência nas células em biofilme. No genoma da X. fastidiosa
foram encontrados genes relacionados a quatro sistemas de efluxo, ABC transportes,
família RND, “P-type-ATPases”, CDF e outros genes possivelmente envolvidos na
resistência a cobre, como os homólogos a cutA1, cutA2 e cutC de E. coli (Rouch et
al., 1989). Esses genes foram selecionados para análise no qPCR não somente por
desempenharem possíveis funções de resistência a cobre e zinco, mas também
devido a expressão de alguns deles no biofilme de X. fastidiosa cultivadas em meio
PW (Souza et al., 2003; Souza et al., 2004).
Foram avaliadas a expressão de quatro genes pertencentes à família RND
(acrA, acrB, mexE e czcA), composta de três proteínas, RND-MFP-OMF que são
conhecidas por transportarem diversas moléculas não relacionadas para fora das
células. Foi verificado recentemente que TolC, uma proteína de membrana externa
componente da RND, é funcional e necessária para a patogenicidade e,
provavelmente, para a sobrevivência da X. fastidiosa em videira (Reddy et al., 2007).
Além disso, compostos fenólicos também induzem a expressão de homólogo a acrB
de Erwinia chrysanthemi. Em X. fastidiosa os genes acrA e mexE possuem o
domínio conservado de AcrA (acriflavin resistance protein A), uma proteína de
membrana de fusão (MFP). Adicionalmente, os genes acrB e czcA apresentam um
domínio conservado AcrB (acriflavin resistance protein B). AcrB coopera com uma
MFP (AcrA) e uma proteína que forma um canal de membrana externa (TolC), para
expulsar as moléculas alvo. O presente trabalho mostrou que a presença de cobre
induz a expressão em bPW principalmente em mexE e czcA. Para bXDM2, somente
78
mexE foi significativamente induzido por cobre, no entanto, uma tendência similar
foi observada para czcA.
O outro gene avaliado foi o metI, o qual codifica uma proteína pertencente a
família de transportadores ABC (ATP-bindind cassete). Essa proteína possui um
domínio conservado AbcD, o qual está relacionado ao transporte de íons de metais
(COG2011). Os transportadores ABC, relacionados com o efluxo de compostos
antimicrobianos, têm sido identificados em diversos organismos (Pattery et al.,
1999). No entanto, a função desses transportadores na resistência a compostos
antimicrobianos do biofilme foi somente investigada recentemente em Candida
albicans. Células em biofilme apresentaram a regulação de ABC transportes na
presença do antifúngico fluconazol (Ramage et al., 2002). Em X. fastidiosa metI foi
expresso em todas as concentrações avaliadas de cobre, com maior indução nas
concentrações mais baixas.
A família “P-type-ATPase” é a mais comum entre os mecanismos de bombas
de efluxo de íons de metal para fora das células (Dameron and Harrison, 1998). Em
X. fastidiosa foi avaliado a expressão do gene copB, o qual codifica uma proteína
pertencente a essa família. Neste estudo, foi verificado que esse gene apresentou a
maior indução em 5mM de CuSO
4
no bPW. A expressão de copB em X. fastidiosa é
somente observada no biofilme na presença de cobre, sugerindo que, como em outros
organismos, esse gene está envolvido com a homeostase e poderia ser regulado
positivamente em células do biofilme. O aumento da expressão desse gene é similar
ao Enterocococcus hirae, onde copB foi funcional para expelir o excesso de cobre
(Ordermatt et al., 1994).
Em E. coli outros genes possivelmente envolvidos na homeostase,
armazenamento intracelular, distribuição, e efluxo de cobre são os cutABCDEF. A
associação desses genes na homeostase de cobre é baseada em resultados obtidos na
caracterização de mutantes sensíveis a cobre. No entanto, pouco desses genes tem
sido diretamente ligado ao metabolismo de cobre, transporte, ou regulação e a
maioria dos genes cuts está provavelmente envolvido indiretamente na homeostase
de cobre (Rouch et al., 1989). O locus cutA consiste em dois operons, um contendo o
gene cutA1, que codifica uma proteína citoplasmática, e o outro consistindo de dois
genes, cutA2 e cutA3, codificando proteínas de membrana interna. Entre os genes
cuts similares ao de E. coli, somente cutA1, cutA2 e cutC foram encontrados no
79
genoma de X. fastidiosa. A indução de cutA1 foi mais baixa em relação aos outros
cuts em bPW e nenhuma expressão significativa foi observada em bXDM2. Por
outro lado, cutA2 e cutC apresentaram indução em ambas condições dos biofilmes.
Outros mecanismos que conferem resistência a cobre em E. coli são os sistemas
CuoO e Cus, entretanto estes não foram encontrados no genoma de X. fastidiosa.
Também foram avaliadas as expressões dos genes pertencentes à família RND
nas células em biofilme na presença do zinco. Além desses genes, foi verificada a
expressão do metI (ABC transporte) e o gene czcD, que possui um domínio
relacionado ao efluxo de zinco.
Foi verificado, que assim como para cobre em bPW, o nível de expressão dos
genes avaliado foi maior quando os biofilmes foram formados em bBCYE do que em
bXDM2.
Os genes acrA, acrB, mexE e czcA apresentaram níveis significativos de
expressão em bBCYE. Isto não foi observado em bXDM2. Esses resultados foram
similares aos obtidos na avaliação desses genes em bPW e bXDM2 na presença de
cobre, onde as maiores expressões foram observadas no meio complexo. Além dessa
observação, as células de X. fastidiosa apresentaram a menor quantidade de EPS
quando cultivadas no meio BCYE em relação aos outros meios (capítulo 2).
Portanto, mais uma vez, a menor indução da expressão gênica dos biofilmes
formados em XDM2, poderia ser explicada pela quantidade de EPS, que
provavelmente diminui a concentração de cátions livres para o interior da célula,
apresentada pelas células bacterianas quando são cultivadas nesse meio de cultura.
A expressão de metI na presença de zinco foi similar nos biofilmes formados
nos dois meios de cultura (BCYE e XDM2). Os níveis significativos de indução
foram observados nas concentrações mais baixas, similar ao observado em bPW e
bXDM2 na presença do cobre. Os resultados sugerem que esse gene possui um
importante papel no início do processo de expulsão dos metais, visto que, o padrão
de expressão observado para esse gene em todos os meio avaliados e tratados com
cobre e zinco foram muito similares.
O gene czcD, possui um domínio conservado com similaridade ao CzcD, o
qual é componente do sistema de efluxo envolvido no transporte e metabolismo de
zinco e outros metais (COG1230). Esse gene também possui similaridade com um
outro domínio conservado de efluxo de cátions (pfam01545) que está relacionado ao
80
transporte de metais bivalentes. Os membros dessa família são proteínas de
membrana relacionadas ao aumento da tolerância de metais bivalentes, incluindo o
zinco. Em X. fastidiosa, foi verificado que esse gene apresentou a maior indução em
20mM de ZnSO
4
quando avaliado em bBCYE. Entretanto, em bXDM2, além da
concentração observada em bBCYE, as concentrações abaixo de 20mM de ZnSO
4
também foram significativamente induzidas. Esses resultados indicam que esse gene
provavelmente está envolvido na homeostase de zinco e apresenta regulação positiva
em células em biofilme. Em Ralstonia sp. estirpe CH34, a mutação desse gene levou
a expressão constitutiva dos genes pertencentes ao operon czc, indicando que CzcD
está envolvida na regulação do sistema Czc (Anton et al., 1999).
Baixos níveis de indução na expressão gênica observados em bXDM2
comparado ao bPW e bBCYE poderiam ser explicados pela presença de grande
quantidade de EPS produzido pela X. fastidiosa quando cultivada nesse meio
(capítulo 2). A adsorção de cátions de metais pelos EPS poderia reduzir a quantidade
de cobre e zinco que penetra nas células e, portanto, diminuiria a necessidade de
ativar as bombas para eliminar esses compostos da célula. Outra possibilidade seria
que alguns desses genes são expressos em células em biofilme quando cultivadas em
XDM2 mesmo na ausência de cobre ou zinco. E por esta razão, a quantificação
relativa (tratamento em relação ao controle) é baixa.
A principal característica associada à biofilmes microbianos é o aumento da
resistência a compostos antimicrobianos. No entanto, pouco se sabe sobre as
mudanças fenotípicas que ocorrem durante a transição de células planctônicas para o
crescimento em biofilme de bactérias fitopatogênicas. Esses biofilmes foram
resistentes aos metais, independentemente do meio de cultura utilizado. Contudo, os
níveis de expressão podem variar de acordo com o meio onde os biofilmes foram
formados. No presente trabalho, foi demonstrado que a resistência do biofilme de X.
fastidiosa parece estar associada a um conjunto de mecanismos diferentes. Dentre
esses mecanismos estariam a produção de EPS, expulsão dos metais para fora das
células através de bombas de efluxo, e a provável ação dos genes cuts. As análises de
expressão gênica demonstraram que a resistência do biofilme de X. fastidiosa aos
metais é um fenômeno complexo que não pode ser explicado por um único
mecanismo, e sim por multifatores que podem envolver diferentes mecanismos de
resistência.
81
Outra observação interessante foi que nas concentrações que determinaram a
inibição do crescimento bacteriano em biofilme para cobre (7mM) e zinco (15mM),
ainda foi obtido RNA de boa qualidade e foi possível verificar a expressão de genes
associados com a resistência desses metais em todas as repetições avaliadas. Esses
resultados sugerem que o cobre e zinco podem penetrar, mas não matar
completamente as células. Algumas hipóteses para explicar esses resultados podem
ser especuladas. Uma delas seria que as células poderiam estar em um estado
fisiológico de resistência ou então estaria ocorrendo morte celular programada
bacteriana, um mecanismo recentemente descrito em bactérias relacionado com
sobrevivência em estresse ambiental (Engelberg-Kulka et al., 2006). Por essa razão
há uma drástica redução na população e, por causa do caráter fastidioso do
crescimento da X. fastidiosa, as células que permanecem vivas não são suficientes
para continuar o crescimento no meio de cultura. Entretanto, na planta hospedeira,
após a ação do composto antimicrobiano, as células vivas poderiam ainda se
recuperar e recolonizar o ambiente. Isto pode representar uma importante estratégia
para a sobrevivência da população e também o controle pode ser muito difícil quando
os biofilmes são formados. Contudo, essas hipóteses necessitam ser investigadas.
82
6. Conclusões Gerais
Os principais resultados obtidos no presente trabalho foram:
X. fastidiosa, quando cultivada no meio definido XDM2, apresenta menor
taxa de crescimento do que no meio PW, de composição indefinida.
Independentemente do meio de cultura, X. fastidiosa em condição de
crescimento em biofilme é menos sensível a compostos antimicrobianos do
quando em crescimento planctônico.
Independentemente do meio de cultura, a quantidade de EPS produzida pela
bactéria em biofilme foi significativamente maior que a produzida na
condição planctônica. No entanto, a quantidade produzida tanto pelas células
planctônicas quanto para as células em biofilme nos diferentes meios de
cultura foi da ordem de XDM2>PW>BCYE (P≤0,05).
Os genes possivelmente envolvidos na resistência a cobre e zinco
apresentaram regulação positiva nas células em biofilme, sugerindo o
envolvimento no mecanismo de resistência aos metais avaliados.
X. fastidiosa em biofilme demonstra ser mais resistente a cobre e zinco que
em condições planctônicas. Essa maior resistência é provavelmente associada
à proteção física conferida pelo EPS e por mecanismos bioquímicos
associados à resistência. Esse efeito sinergístico pode ter um importante papel
na sobrevivência das células em presença de cobre e zinco, conferindo
importante estratégia de sobrevivência quando biofilmes são formados.
83
7. Referência Bibliográfica
ALMEIDA R.P.P.; MANN R.; PURCELL A.H. Xylella fastidiosa cultivation on a
minimal solid defined medium. Curr Microbiol., v.48, p.368-72, 2004.
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