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AMANDA FELIPPE PADOVEZE
Cinética plasmática e biodistribuição de colesterol livre e
colesterol esterificado de uma nanoemulsão (LDE) que se liga aos
receptores de LDL em animais controle e com indução de
aterosclerose
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências
São Paulo
2007
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AMANDA FELIPPE PADOVEZE
Cinética plasmática e biodistribuição de colesterol livre e
colesterol esterificado de uma nanoemulsão (LDE) que se liga aos
receptores de LDL em animais controle e com indução de
aterosclerose
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Cardiologia
Orientador: Prof. Dr. Raul Cavalcante Maranhão
São Paulo
2007
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FOLHA DE APROVAÇÃO
Amanda Felippe Padoveze
Cinética plasmática e biodistribuição de colesterol livre e colesterol esterificado de
uma nanoemulsão (LDE) que se liga aos receptores de LDL em animais controle e
com indução de aterosclerose.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Cardiologia
Orientador: Prof. Dr. Raul Cavalcante Maranhão
Aprovado em:
Banca examinadora
Prof (a). Dr (a)._______________________________________________________
Instituição_____________________________Assinatura______________________
Prof (a). Dr (a)._______________________________________________________
Instituição_____________________________Assinatura______________________
Prof (a). Dr (a)._______________________________________________________
Instituição_____________________________Assinatura______________________
Prof (a). Dr (a)._______________________________________________________
Instituição_____________________________Assinatura______________________
Prof (a). Dr (a)._______________________________________________________
Instituição_____________________________Assinatura______________________
Aos meus pais, Clóvis e Cida, exemplos
de persistência e dedicação, pelo amor,
apoio e pela compreensão em todos os
momentos de minha vida.
Aos meus irmãos, Amílcar e Ariane, pelo
carinho e pelas alegrias proporcionados
durante esta caminhada.
Aos meus avós e à minha tia Edna, pelo
afeto, amor, atenção e belas recordações.
Aos melhores amigos, Fernanda Maniero e
Ricardo Manzato Aranha, pela motivação,
pelo acolhimento e sorrisos nos momentos
de desânimo, pelo auxílio, carinho e pela
amizade nos momentos de alegrias.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Raul Cavalcante Maranhão, pela orientação, atenção, incentivo e
pelos ensinamentos repassados ao longo deste trabalho.
A todos os funcionários da Divisão de Experimentação do InCor-HC-FMUSP, pela
colaboração e pelo espaço concedido imprescindíveis para realização deste
trabalho e, especialmente, ao Pedro, Anderson, Henrique, Vicente, Nelson,
Richard, Nelsinho e Leandro, pelo auxílio e momentos de descontração.
Ao Prof. Dr. Francisco Rafael Martins Laurindo e à Prof. Dra. Liliete Canes Souza,
pela colaboração e disponibilidade.
Aos amigos Renato Barboza, Débora Deus e Camila Góes Puk, pelo apoio, pela
motivação, paciência e longas discussões e, mais importante, pela amizade e
pelos momentos de introspecção.
Aos colegas Ricardo David Couto, Emerson Silva Lima, Maria Rita Rodrigues,
Elisabeth Maróstica, Carmen Guilherme Christiano de Matos Vinagre, pelo
acolhimento, ensinamentos, incentivo e auxílio durante a elaboração desta tese.
Às pós-graduandas Tatiane Vanessa de Oliveira, Tatiana Solano Vitorio, Maria
Elisabeth Fernandes Oliveira, pelo empenho e auxílio e, principalmente, pela
amizade e momentos de risos e desabafos.
Às amigas Vanessa, Ana Cristina, Talita, Sheila, Carol, Lisa, Aleksandra, Juliana
Vinagre, Cristina, Fabíola e Ana Carolina, pelas inúmeras ajudas, pelo incentivo,
pela companhia e, sobretudo, pela amizade.
Á Profa. Dra. Maria Rita Marques de Oliveira e ao Prof. Dr. Wolney Lisboa Conde,
pela oportunidade e confiança, pelo respeito e valiosos ensinamentos.
Aos colegas e funcionários do Laboratório de Metabolismo de Lípides do InCor-
HC-FMUSP pelo apoio e pela hospitalidade.
Aos parentes e amigos, pelo incentivo, carinho e pela credibilidade durante todo o
meu percurso.
Á Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela
concessão da bolsa de estudos, fundamental para o bom andamento e conclusão
deste trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
SUMMARY
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................1
1.1. Colesterol e suas formas.................................................................................1
1.2. Metabolismo e transporte lipídico....................................................................4
1.3. Captação, transporte e efluxo intracelular de colesterol.................................7
1.4. Estabilização do colesterol e inibição da esterificação pelo tratamento com
diazepam..............................................................................................................10
1.5. Aterosclerose................................................................................................14
1.6. Lipoproteínas artificiais..................................................................................17
2. JUSTIFICATIVA....................................................................................................20
3. OBJETIVO............................................................................................................23
4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................25
4.1. Materiais utilizados.........................................................................................26
4.2. Preparo da nanoemulsão artificial LDE..........................................................26
4.3. Modelos experimentais..................................................................................27
4.4. Cinética plasmática e captação tecidual do
3
H - colesterol livre e do
14
C –
colesterol esterificado da LDE em coelhos submetidos à indução de
aterosclerose por dieta rica em colesterol...........................................................28
4.4.1. Animais..................................................................................................28
4.4.2. Preparo da dieta rica em colesterol.......................................................29
4.4.3. Avaliação do peso corporal dos animais e consumo de ração..............29
4.4.4. Determinação do perfil lipídico...............................................................30
4.4.5. Determinação da cinética plasmática da LDE.......................................30
4.4.6. Análise compartimental da curva de decaimento plasmático dos lípides
radioativos........................................................................................................31
4.4.7. Determinação da captação tecidual do
3
H - colesterol livre e do
14
C –
colesterol esterificado da LDE.........................................................................32
4.4.8. Determinação da percentagem de lesão aterosclerótica nos segmentos
arteriais............................................................................................................33
4.5. Estudo in vitro da captação do
3
H - colesterol livre e
14
C – colesterol
esterificado da LDE por células endoteliais aórticas de coelhos.........................34
4.6. Captação tecidual do
3
H - colesterol livre e
14
C – colesterol esterificado da
LDE em ratos após tratamento com diazepam....................................................35
4.6.1. Animais..................................................................................................35
4.6.2. Determinação da captação tecidual do
3
H - colesterol livre e
14
C –
colesterol esterificado da LDE.........................................................................36
4.7. Análise estatística.........................................................................................36
5. RESULTADOS......................................................................................................38
5.1. Cinética plasmática e captação da LDE em coelhos submetidos à indução
de aterosclerose por dieta rica em colesterol......................................................39
5.1.1. Peso corporal e consumo de ração.......................................................39
5.1.2. Perfil lipídico...........................................................................................40
5.1.3. Estudos cinéticos da LDE......................................................................41
5.1.4. Captação da LDE..................................................................................43
5.1.5. Lesão aterosclerótica.............................................................................49
5.2. Captação da LDE in vitro por RAEC.............................................................51
5.3. Captação da LDE em ratos após tratamento com diazepam.......................52
6. DISCUSSÃO.........................................................................................................54
7. CONCLUSÕES.....................................................................................................62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................64
LISTA DE ABREVIATURAS
ABCA-1 “ATP-binding cassete transporters A1”
ACAT acil-colesterol-acil transferase
Apo apolipoproteína, como apo A1, apo B100, apo E
CE colesterol esterificado
CETP proteína de transferência do éster de colesterol
CL colesterol livre
CT colesterol total
DAC doença arterial coronária
FL fosfolípides
HDL lipoproteína de densidade alta
HMG-CoA 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzimaA
IAM-1 “intercellular adhesion molecule-1”
IDL lipoproteína de densidade intermediária
K taxas fracionais de transferência
LCAT lecitina-colesterol-acil transferase
LDE nanoemulsão artificial rica em colesterol
LDL lipoproteína de densidade baixa
LDL-r receptor de LDL
LH lipase hepática
LLP lipase lipoprotéica
LOX-1 “Lectinlike Ox-LDL receptor-1”
LRP “LDL receptor related protein”
NCEH “neutral cholesterol ester hydrolase”
NCP1 “Niemann-Pick Type C protein”
PLTP proteína transferidora de fosfolípides
Qm quilomícron
SR-B1 “scavenger receptor B1”
StAR “steroidogenic acute regulatory protein”
TFR taxa fracional de remoção
TG triglicérides
VCAM-1 “vascular cell adhesion molecule-1”
VLDL lipoproteína de densidade muito baixa
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Perfil lipídico (mg/dL) de coelhos submetidos à indução de
aterosclerose, antes e após o consumo da dieta rica em colesterol a
1% (n=13)..............................................................................................41
Tabela 2- Correlação entre a taxa fracional de remoção do
3
H – colesterol livre e
do
14
C
– colesterol esterificado e perfil lipídico......................................43
Tabela 3- Captação tecidual de
3
H – colesterol livre e
14
C – colesterol esterificado
em órgãos e segmentos arteriais de coelhos normais e de coelhos
submetidos à indução de aterosclerose 24h após a injeção de LDE
marcada................................................................................................45
Tabela 4- Correlação entre percetagem de captação tecidual e taxa fracional de
remoção do
3
H – colesterol livre e do
14
C
– colesterol
esterificado............................................................................................46
Tabela 5- Teste de comparação múltipla de Dunns, após teste de Kruskal-Wallis,
entre as médias de captação de
3
H - colesterol livre e
14
C – colesterol
esterificado nos órgãos e segmentos arteriais do grupo controle e do
grupo submetido à indução de aterosclerose.......................................48
Tabela 6- Morfometria microscópica dos segmentos arteriais de coelhos
submetidos à indução de aterosclerose após 8 semanas de consumo da
dieta rica em colesterol a 1%.....................................................................51
Tabela 7- Influência da massa de LDE na captação do
3
H - colesterol livre e do
14
C – colesterol esterificado por células endoteliais aórticas de
coelhos..................................................................................................52
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Peso corporal (kg) de coelhos submetidos à indução de aterosclerose
durante 8 semanas de consumo da dieta rica em colesterol a 1% (n
=13), (média ± DP)................................................................................39
Figura 2- Consumo de ração (g/dia) por coelhos submetidos à indução de
aterosclerose durante 8 semanas (n =13), (média ± DP).....................40
Figura 3- Curvas de decaimento plasmático do
3
H – colesterol livre (CL) e
14
C
–
colesterol esterificado (CE) da LDE em coelhos no período de 24h. A:
grupo controle (n=8), B: grupo submetido à indução de aterosclerose
por dieta rica em colesterol a 1% durante 8 semanas (n=6). Resultados
expressos em média ± DP....................................................................42
Figura 4- Fotomicrografia dos segmentos arteriais obtidos de coelhos normais (A)
e de coelhos submetidos à indução de aterosclerose por dieta rica em
colesterol a 1% durante 8 semanas (B): 1 – arco aórtico, 2 – aorta
torácica e 3 – aorta abdominal (50X).......................................................50
Figura 5- Percentagem de
3
H-colesterol livre e de
14
C - colesterol esterificado em
relação a radioatividade total captada pelo baço, fígado e aorta de ratos
24 h após a injeção da LDE. A: grupo controle, tratado com salina
(0,5mL/kg/dia) (n=9); B: grupo tratado com diazepam (0,5mg/kg/dia)
(n=9). Resultados expressos em média ± DP. * p<0,01; comparado ao
14
C – colesterol esterificado, teste de Mann-Whitney...........................53
RESUMO
RESUMO
PADOVEZE, A.F. Cinética plasmática e biodistribuição de colesterol livre e
colesterol esterificado de uma nanoemulsão (LDE) que se liga aos receptores
de LDL em animais controle e com indução de aterosclerose. São Paulo, 2007.
76p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina. Universidade de São Paulo.
Estudos anteriores em nosso laboratório demonstraram que pacientes portadores de
DAC apresentam diferenças no metabolismo do CL e CE de uma nanoemulsão
artificial rica em colesterol (LDE), nos quais o CL apresentou maior remoção
plasmática e depósito arterial. Dando continuidade a esta linha de pesquisa, neste
trabalho foram avaliadas a cinética plasmática, representada pela taxa fracional de
remoção (TFR), e a captação do
3
H-colesterol livre (
3
H - CL) e
14
C - colesterol
esterificado (
14
C - CE) da LDE por segmentos arteriais e por órgãos de coelhos
normais (n=17) e coelhos submetidos à indução de aterosclerose por dieta rica em
colesterol (1%) (n=13). Além disso, avaliou-se a captação “in vitro” do
3
H – CL e do
14
C – CE da LDE por células endoteliais aórticas de coelhos. Por último, foi avaliada
a influência da inibição da enzima lecitina-colesterol aciltransferase (LCAT), e
indiretamente, a esterificação do CL em ratos normais (n=9) e tratados com
diazepam (n=9). Em coelhos que receberam dieta normal, não houve diferença entre
a remoção plasmática do
3
H - CL e do
14
C - CE. Em coelhos que desenvolveram
hiperlipidemia e aterosclerose através de dieta rica em colesterol, o
3
H - CL foi
removido mais rapidamente da circulação do que o
14
C - CE (p<0,05), entretanto
houve maior captação de
14
C - CE do que de
3
H - CL no arco aórtico (p<0,05). Em
ambos os grupos, os principais órgãos captadores de colesterol da LDE foram
fígado, pulmão, adrenais e baço (p<0,05). Tanto a TRF quanto a captação hepática
de
3
H - CL e
14
C - CE foram menores no grupo que recebeu a dieta rica em
colesterol. Em células endoteliais aórticas de coelhos, a captação de
3
H - CL foi
maior que a de
14
C – CE independente da massa de LDE incubada (p<0,01). Em
ratos, não houve diferença entre a captação das duas formas de colesterol da LDE
pela aorta no grupo controle, entretanto, quando a atividade da LCAT foi diminuída
pelo tratamento com diazepam, a captação arterial de
3
H - CL foi maior do que a de
14
C - CE (p< 0,01). A hiperlipidemia e distúrbios no processo de estabilização do
colesterol, favorecem a dissociação entre o CL e o CE das lipoproteínas, e podem
elevar o risco de desenvolvimento da aterosclerose, assim como agravar o processo
de aterogênese.
Palavras-chave: Colesterol, Emulsões, Lipoproteínas LDL, Aterosclerose, Modelos
animais, Cinética.
SUMMARY
SUMMARY
PADOVEZE, A.F. Plasma kinetics and biodistribution of free cholesterol and
cholesterol ester of a nanoemulsion that binds to LDL receptors in animals
without and with atherosclerosis. São Paulo, 2007. 76p. Tese (Doutorado) -
Faculdade de Medicina. Universidade de São Paulo.
In previously studies, it was shown that free cholesterol (FC) and cholesterol ester
(CE) of a cholesterol-rich nanoemulsion (LDE) behaves differently in patients with
coronary artery disease (CAD). The FC plasma clearance and arterial deposition is
greater than CE. In the present study we evaluate the plasma kinetics, estimated by
the fractional clearance rate (FCR), and the tissue uptake of
3
H-free cholesterol (
3
H –
FC) and of
14
C – cholesterol ester (
14
C - CE) of LDE by arterial segments and organs
of rabbits with (n=13) and without atherosclerosis (n=17). Furthermore, it was
evaluated the “in vitro” uptake of
3
H – FC and
14
C - CE by rabbit aortic endothelial
cells. Finally, it was evaluated the inhibition of the enzyme lecithin-cholesterol
acyltransferase (LCAT), and indirectly, the FC esterification in rats non-treated (n=9)
and treated with diazepam (n=9). In rabbits without atherosclerosis that received an
standard diet there was no difference between the plasma clearance of
3
H – FC and
14
C – CE. In rabbits with hyperlipidemia and atherosclerosis induced by the
cholesterol-rich diet the
3
H - FC was removed faster than
14
C - CE (p<0.05), however
the arch aortic uptake of
14
C – CE was greater than of
3
H - FC (0p<0.05). In both
groups, liver, lungs, adrenals and spleen were the principal sites of LDE cholesterol
uptake. The FCR and tissue uptake were smaller in rabbits with than those without
atherosclerosis. In rabbit aortic endothelial cells the
3
H - FC uptake was greater than
14
C – CE independently of incubated LDE mass (p<0.01). In control rats there was no
difference on the arterial uptake of both cholesterol forms of LDE, but when the LCAT
activity was diminished by the diazepam treatment, the arterial uptake of
3
H – FC
were greater than
14
C – CE (p< 0.01). The hyperlipidemia and cholesterol stability
alterations may lead to dissociation between lipoproteins FC and CE. This
dissociation may increase the risk for atherosclerosis and likewise enhance the
severity of atherosclerosis.
Keywords: Cholesterol, Emulsions, LDL lipoproteins, Atherosclerosis, Animal models,
Kinetics.
1. INTRODUÇÃO
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. Colesterol e suas formas
O colesterol é uma molécula anfipática constituída por uma porção polar,
formada por um grupo hidroxila, e uma porção apolar, formada por uma cadeia de
hidrocarbonetos e quatro anéis cíclicos derivados do ciclopentanoperidrofenantreno
(DEVLIN, 2002; MURRAY et al., 2002).
Por ser um dos principais componentes estruturais das membranas
biológicas, o colesterol é o esteróide mais abundante encontrado nos animais. É o
precursor na biossíntese de ácidos biliares, vitamina D e esteróides biologicamente
ativos secretados pelas gônadas, córtex adrenal e placenta (VOET; VOET, 1995).
A biossíntese do colesterol decorre em quatro fases: 1) condensação de três
unidades de acetato, formando-se um intermediário com seis carbonos, o
mevalonato; 2) conversão do mevalonato a unidades de isopreno ativadas; 3)
polimerização de seis unidades isoprênicas com cinco carbonos, formando-se
esqualeno, uma molécula linear com trinta carbonos; 4) ciclização do esqualeno,
formando os quatro anéis do núcleo esteróide, com uma série de alterações
adicionais (oxidação, remoção ou migração de grupos metil) e, conseqüente
produção de colesterol. A conversão de 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzimaA (HMG-
CoA) a mevalonato, reação catalisada pela enzima HMG-CoA redutase, é o passo
que exerce maior controle na síntese e via metabólica do colesterol (MURRAY et al.,
2002).
3
Todas as células do organismo são capazes de sintetizar o colesterol.
Entretanto, o catabolismo do colesterol é limitado e ocorre principalmente no fígado
e nos órgãos esteroidogênicos. Portanto, para ser metabolizado, o colesterol precisa
ser removido dos demais tecidos e transportado para os tecidos especializados
(YOKOYAMA, 2000).
O transporte de colesterol na circulação ocorre pelas lipoproteínas que são as
unidades funcionais de transporte de lipídios na corrente sangüínea. As
lipoproteínas são formadas por uma porção externa hidrofílica, constituída por
fosfolípides (FL), colesterol livre (CL) e proteínas, envolvendo um núcleo hidrofóbico
contendo triglicérides (TG) e colesterol esterificado (CE) (BIGGERSTAFF;
WOOTEN, 2004). As apolipoproteínas (Apos), componentes protéicos das
lipoproteínas, promovem sua estabilização estrutural e solubilização de seus lípides,
mediam a captação celular das lipoproteínas por receptores específicos e atuam
como ativadores ou inibidores enzimáticos no metabolismo lipídico (MORENO et al.,
2006).
A forma livre do colesterol é mais instável na estrutura da lipoproteína do que
a forma esterificada, e, portanto, pode se dissociar facilmente das lipoproteínas e se
difundir no meio aquoso plasmático, onde a sua baixa solubilidade resulta em
precipitação e depósito na parede arterial. Já o CE depende das chamadas
proteínas de transferência, como a proteína de transferência do éster de colesterol
(CETP), para deslocar-se de uma lipoproteína para outra (GARRET; GRISHAM,
1995). Dessa forma, seja na partícula da lipoproteína ou dentro da célula, o
colesterol é preferencialmente mantido na forma mais estável, a esterificada.
Na circulação sanguínea, a esterificação do CL ocorre pela ação da enzima
lecitina colesterol aciltransferase (LCAT), que ativada pela apo-AI transfere um ácido
4
graxo da lecitina para a posição 3-β-hidroxi do colesterol, formando o CE. Essa
reação ocorre principalmente nas lipoproteínas de alta densidade (HDL), importante
sítio de esterificação do colesterol, responsável pela estabilização do colesterol no
plasma (DOBIÁSOVÁ; FROHLICH, 1998). Quando no interior das células, o CL é
esterificado pela ação da enzima acil-CoA colesterol aciltransferase (ACAT), que o
estabiliza e permite seu armazenamento intracelular, eliminando possíveis efeitos
tóxicos do acúmulo de colesterol em sua forma livre (WARNER et al., 1995;
KELLNER-WEIVBEL et al., 1998; CHANG et al., 2006).
1.2. Metabolismo e transporte lipídico
O transporte de lípides na circulação sanguínea pode ser conceitualmente
subdivido em dois sistemas: o transporte exógeno de lípides provenientes da
alimentação e o transporte endógeno de lípides sintetizados no fígado.
A maior parte dos lípides advindos da dieta é representada pelos TG e
colesterol. No duodeno, os lípides da dieta são emulsificados pela ação dos ácidos
biliares da bile, formando as micelas de sais biliares que aumentam a superfície de
contato das moléculas lipídicas à ação das lipases pancreáticas. As lipases
convertem os TG em monoglicérides e diglicérides, ácidos graxos livres e glicerol,
que se difundem para a mucosa intestinal. Os lípides absorvidos no interior das
células são reconvertidos em TG, e, junto com o colesterol da dieta, são acrescidos
de proteínas sintetizadas nas células da parede, para então formar a lipoproteína
quilomícron (Qm) (DVELIN, 2002). Parte do colesterol da dieta encontra-se em sua
5
forma esterificada e é hidrolisado pela ação da colesteril esterase presente no suco
pancreático, liberando ácido graxo e CL. Englobado nas micelas mistas, o colesterol
livre difunde-se para as células epiteliais da mucosa, sendo reconvertido a CE e
sendo incorporado às moléculas de Qm (HUSSAIN et al., 2000).
Os Qm, compostos de TG, FL, colesterol e proteínas (apoA-I, apoA-IV, apoB-
48), são transportados na via linfática, e liberados na corrente sangüínea pelo ducto
torácico. Na circulação, ao interagirem com as partículas de HDL, os Qm adquirem
apoC-II, C-III, E e colesterol. A apoC-II ativa a enzima lipase lipoprotéica (LLP)
localizada nas células endoteliais, que hidrolisa os TG dos Qm e libera ácidos
graxos livres que serão armazenados no tecido adiposo ou utilizados como fonte
energética pelo tecido muscular (GOLDMAN; BRAUNWALD, 2000; HUSSAIN et al.,
2000; DEVLIN, 2002).
Após este processo de hidrólise, as partículas apresentam-se em menor
tamanho, com quantidade relativamente maiores de CE e enriquecidas de apoE,
chamadas de remanescentes de Qm (GOLDMAN & BRAUNWALD, 2000).
A remoção da circulação dos remanescentes de Qm ocorre pela interação
entre a apoE e o receptor celular específico localizado principalmente nas células
hepáticas, o “LDL-receptor related protein” (LRP) (GOLDMAN; BRAUNWALD, 2000;
HUSSAIN et al., 2000).
O transporte endógeno de lípides tem início com a formação das lipoproteínas
de densidade muito baixa (VLDL) nos hepatócitos, as quais contêm principalmente
TG e as apoB100, E e C. Nos capilares as VLDL sofrem ação da LLP originando
partículas remanescentes, denominadas remanescentes de VLDL ou lipoproteínas
de densidade intermediária (IDL). Grande parte das IDL é captada no fígado pelos
receptores B/E ou receptores de LDL (LDLr). O restante das partículas de IDL sofre
6
ação da enzima lipase hepática (LH), que hidrolisa TG e FL, e resulta em partículas
de menor densidade e maior conteúdo de colesterol, as lipoproteínas de baixa
densidade (LDL). Estas, assim como as IDL, são retiradas da circulação pelos
receptores celulares B/E existentes em vários órgãos e tecidos corpóreos,
principalmente no fígado. A LDL corresponde a 50% do total das lipoproteínas
plasmáticas, sendo que a maior parte de seu colesterol encontra-se na forma
esterificada, que perfaz 50% da partícula (BACHORICK et al., 1999).
A LDL ao se ligar aos receptores de LDL é internalizada e conduzida aos
lisossomos para degradação. Os receptores retornam para a superfície celular para
se ligarem a outras partículas de LDL. O colesterol liberado da LDL exerce ações
regulatórias como aumento da atividade da ACAT para esterificação do colesterol;
diminuição da atividade da HMGCoA redutase, responsável pela biossíntese de
colesterol endógeno; e diminuição da síntese de receptores células para LDL,
aumentando assim a sua concentração plasmática (BROWN; GOLDSTEIN, 1986).
As HDL são sintetizadas no fígado, no intestino e a partir de componentes
das lipoproteínas ricas em TG. A ação da LLP sobre os TG dos Qm e VLDL acarreta
em formação de partícula de menor diâmetro e em perda dos componentes de
superfície em excesso (CL, FL e apoC), que são transferidos para as HDL
(GOLDMAN; BRAUNWALD, 2000). A HDL também adquire quantidades extras de
CL pela remoção do colesterol dos tecidos via dependente de receptor ou difusão
passiva (BARTER et al., 2003). O CL agregado à superfície da HDL é
imediatamente esterificado pela LCAT e transferido para lipoproteínas de menor
densidade por um processo mediado pela CETP (GOLDMAN; BRAUNWALD, 2000).
7
1.3. Captação, transporte e efluxo intracelular de colesterol
A captação celular das duas formas de colesterol, o CL e o CE, pode ocorrer
por diversas vias. A maior parte do colesterol exógeno é captado pelas células por
receptores específicos presentes na superfície celular. As lipoproteínas,
principalmente a LDL, ligam-se aos seus receptores destinados a endocitose, os
receptores de LDL, em regiões especializadas da membrana denominadas
cavidades revestidas. Sob a superfície destas cavidades, há um revestimento da
proteína chamada clatrina, que facilita a formação de vesículas endocíticas, fundidas
aos endossomos (FIELDING; FIELDING, 1997; SIMONS; IOKNEN, 2000; SCHOER
et. al., 2000).
Os receptores retornam para a superfície celular para se ligarem a outras
partículas de LDL, enquanto o endossomo contendo as lipoproteínas liga-se ao
lisossomo. As vesículas liberam a maioria do CL da LDL no citoplasma na forma de
pequenas vesículas, enquanto o CE entra na via lisossomal, pela fusão entre os
remanescentes das vesículas e o lisossomo, que hidrolisam o CE na matriz
lisossomal, produzindo, colesterol e ácidos graxos (MAXFIELD; MENON, 2006). O
colesterol pode ser então transferido para outras organelas, utilizado para síntese de
membranas ou ser reesterificado no retículo endoplasmático pela ACAT (SIMONS;
IOKNEN, 2000; SCHOER et al., 2000). O CE será então armazenado juntamente
com TG no núcleo de gotículas lipídicas citosólicas (SOCCIO; BRESLOW, 2004). A
enzima responsável pela hidrólise de CE nas gotículas lipídicas é denominada
“neutral cholesterol ester hydrolase” (nCEH), e assim como a ACAT exerce papel
importante na formação de células espumosas e aterosclerose.
8
O transporte de colesterol no interior da célula pode ser mediado através de
vesículas ou por proteínas carreadoras que possuem cavidades hidrofóbicas que se
ligam ao colesterol, a proteína StAR (“steroidogenic acute regulatory protein”), a
caveolina e a proteína NCP1 (“Niemann-Pick type C protein”). A proteína StAR
estimula a conversão mitocondrial de colesterol a esteróides, enquanto a proteína
NCP1 remove o colesterol de compartimentos endossomais, o que facilita o
transporte de esteróis para o complexo de Golgi ou outras carreadoras vesiculares
(SIMONS; IOKNEN, 2000).
Outra forma de transporte não vesicular envolve a desorção espontânea de
colesterol de uma membrana a outra membrana justaposta que podem estar ligadas
por proteínas especializadas (SIMONS; IOKNEN, 2000; SOCCIO; BRESLOW,
2004). As membranas podem ter diferentes afinidades e capacidades de receber
colesterol. Membranas ricas em esfingolípides e fosfolípides saturados possuem alta
afinidade pelo colesterol.
A taxa de transferência de CL para fora do compartimento lisossomal não
limita a captação de CE das lipoproteínas via LDL-r. O tempo de meia vida em que
ocorre todo esse processo é de 42 a 60 minutos, sendo que a transferência do
colesterol da matriz lisossomal até a sua apresentação na superfície celular ocorre
em torno de 2 minutos em células intactas especializadas (SCHOER et. al., 2000;
SOCCIO; BRESLOW, 2004). Sugere-se que a rapidez com que os esteróis são
transferidos do lisossomo para o citoplasma seja decorrente da difusão passiva e
espontânea (SCHROEDER et. al., 2000).
O colesterol no interior da célula é continuamente removido da membrana
plasmática para a circulação por duas vias principais que envolvem o transporte
reverso de colesterol: difusão aquosa ou ligação das partículas de HDL e suas
9
apolipoproteínas aos receptores de membrana nos tecidos periféricos (YOKOYAMA,
2000; SIMONS; IKONEN, 2002; YANCEY et al., 2003). A primeira via do efluxo de
colesterol envolve a desorção espontânea de colesterol das membranas
plasmáticas, estimulada pela superfície fosfolipídica das partículas de HDL, e sua
difusão através da fase aquosa ao redor da célula (YOKOYAMA, 2000; YANCEY et
al., 2003). Este modelo prevê um papel passivo da HDL e ocorre através de um
gradiente de concentração de colesterol entre célula e membranas lipoprotéicas
(ORAM; YOKOYAMA, 1996; MENDEZ, 1997; YANCEY et al., 2003). Já a segunda
via de efluxo de colesterol propõe que a HDL e partículas contendo apoAI pobres em
lípides removam colesterol das células através da interação entre aceptores (apoAI,
apoAII, ApoIV, apoE) e sítios de ligação da superfície celular, como os receptores
“scavenger receptor B1” (SR-B1) e os transportadores “ATP-binding cassete
transporters A1” (ABCA1) que requerem a presença, respectivamente, de FL e
apoAI nos aceptores (ORAM; YOKOYAMA, 1996; YANCEY et al., 2003; RHAINDS;
BRISSETTE 2004; CAVELIER et al., 2006).
A apoAI e a solubilização da membrana mediada pela ABCA1 estimulam a
mobilização dos estoques de colesterol, que são esterificados pela ACAT no retículo
endoplasmático, e evitam o acúmulo intracelular de colesterol, mesmo em
macrófagos, células espumosas e placas ateroscleróticas (TAILLEUX et al., 2002).
Na circulação sanguínea, o CL removido pelas partículas da HDL dos tecidos
periféricos e agregado à superfície da partícula, é imediatamente esterificado pela
LCAT através da interação entre esta enzima e a apoAI presente na HDL, e dessa
forma, incorporado ao núcleo da partícula. O CE pode então ser transferido para
outras lipoproteínas de menor densidade, VLDL e LDL, por ação da CETP em troca
de triglicérides. A proteína transferidora de fosfolípides (PLTP) também contribui
10
para o fluxo de CE da HDL para outras lipoproteínas (DURRINGTON, 2002). O
colesterol, transportado para o fígado proveniente dos tecidos, pode ser
reaproveitado, participando de outras vias metabólicas, ou excretado na bile, com
reabsorção de cerca de dois terços do mesmo (GOLDMAN; BRAUNWALD, 2000).
1.4. Estabilização do colesterol e inibição da esterificação pelo tratamento com
diazepam
A esterificação do CL mediada pela ACAT, assim como a hidrólise do CE pela
nCEH, são processos fundamentais que promovem a homeostase do colesterol
intracelular. O acúmulo da forma livre do colesterol pode ser citotóxico e,
conseqüentemente, o colesterol é armazenado preferencialmente em sua forma
mais estável, o CE, como gotículas lipídicas no interior das células (WARNER et al.,
1995; KELLNER-WEIBEL et al., 1998).
Nos estágios iniciais da aterosclerose, a disfunção endotelial aumenta a
permeabilidade do endotélio e permite o acúmulo subendotelial de lipoproteínas
aterogênicas como a LDL oxidada. Estas lipoproteínas modificadas estimulam os
monócitos circulantes a migrarem aos sítios de lesão e a penetrarem na íntima
arterial. No espaço subendotelial, os monócitos se diferenciam em macrófagos e
agem como células de varredura, removendo substâncias tóxicas por meio dos
receptores “scavenger”. A fagocitose crônica de lipoproteínas aterogênicas pelos
macrófagos promove, continuamente, a esterificação do colesterol pela ação da
ACAT. Este mecanismo de fagocitose não possui retroalimentação negativa, assim
11
os macrófagos tornam-se repletos de CE e convertem-se em células espumosas,
caracterizando a placa aterosclerótica inicial (CHANG et al., 2006).
A inibição da esterificação de CL pela ACAT ou a diminuição da captação
intracelular de colesterol promovem a hidrólise do CE e a liberação do CL, que
rapidamente é transportado à membrana plasmática tornando-se disponível para
efluxo celular (CHANG et al., 2006). Os inibidores de ACAT têm sido apontados
como compostos químicos capazes de produzir efeitos antiaterogênicos sem afetar
as concentrações plasmáticas de colesterol (BOCAN et al., 1991; KUSONOKI et al.,
2001). Entretanto, estudos em camundongos “knockout” para o gene ACAT1 e
apoE, ou ACAT1 e LDL-r, demonstraram que a deficiência total da ACAT leva a
extensa deposição de CL na pele, no cérebro e na parede arterial desses animais,
sugerindo que sua inibição pode promover o desenvolvimento de lesões
ateroscleróticas (ACCAD et al., 2000; YAGYU et al., 2000; FAZIO et al., 2001).
No plasma, o processo de esterificação mediado pela enzima LCAT ativada
pela apoAI presente principalmente nas partículas HDL é a maior fonte de formação
de CE e desempenha papel importante no remodelamento das lipoproteínas
plasmáticas, no transporte reverso de colesterol e na estabilização do “pool”
plasmático de colesterol (DOBIÁSOVÁ; FROHLICH, 1998). Ao promover a
esterificação do colesterol recebido das outras classes de lipoproteínas ou das
membranas celulares, a HDL transforma o CL em uma forma química mais apolar.
As moléculas de colesterol passam da superfície para o centro das partículas de
lipoproteínas (WANG; BRIGGS, 2004). Desta maneira, o colesterol é seqüestrado
para o “pool” mais estável, evitando sua difusão e seu depósito na parede arterial.
A inibição da LCAT pode bloquear a transferência de CL da LDL para HDL,
entretanto, o aumento da sua atividade não resulta necessariamente na
12
transferência celular de CL, assim como a deficiência total de LCAT não evita o
efluxo celular de CL (DOBIÁSOVÁ; FROHLICH, 1998).
Doenças, como a deficiência de LCAT, resultam em aumento acentuado na
incidência de doença arterial coronária precoce (GJONE, 1983; FROHLICH;
MCLEOD, 1986). Solajic´-Bozicevic´ et al. (1991) observaram que a atividade da
LCAT estava diminuída em pacientes portadores de doença arterial coronária (DAC),
com aumento significativo da razão de CL/CE plasmático, comparados a indivíduos-
controle sadios. Pode-se supor, portanto, que mesmo fora dessas doenças
hereditárias muito raras, haja situações onde mecanismos de menor eficiência na
esterificação de colesterol resultem em maior predisposição para DAC (SANTOS et
al., 2003).
Estudos demonstraram que o diazepam tem ação sobre a inibição “in vitro” da
síntese e esterificação do colesterol, assim como, possível mecanismo
hipocolesterolêmico e de prevenção na formação da lesão aterosclerótica em
diferentes espécies animais (WONG et al., 1980; PATEL et al., 1982; BELL, 1985;
WONG et al., 1992).
O diazepam, classificado quimicamente como benzodiazepínico, é uma
susbtância cristalina, heterocíclica e altamente lipossolúvel, usualmente utilizada
como ansiolítico-tranquilizante, anticonvulsivante e relaxante muscular. Os efeitos
farmacodinâmicos do diazepam são mediados por sua interação com sítios
localizados próximos aos receptores do ácido -aminobutírico no sistema nervoso
central. A interação do diazepam com estes sítios potencializa a ação do ácido -
aminobutírico e promove a inibição do sistema nervoso central (RANG et al., 2001).
O diazepam também pode interagir com os receptores periféricos de
benzodiazepínicos localizados em tecidos periféricos, tais como fígado, pulmões,
13
rins e testículos. A ativação dos receptores periféricos de benzodiazepínicos
desencadeia o transporte do colesterol intracelular à membrana mitocondrial. Em
tecidos não-esteroidogênicos o papel desse receptor ainda é desconhecido e é
possível que esse transporte constitua um processo essencial na construção da
membrana interna das organelas (GORENSTEIN; POMPÉIA, 1999).
A partir do estudo norte-americano Lipid Reserach Clinics Prevalence (LRC
Program Prevalence Study), Hunninghake et al. (1981) verificaram que homens e
mulheres caucasianos, entre 20-69 anos, que faziam uso de benzodiazepínicos,
apresentavam concentrações plasmáticas diminuídas de HDL-c e concentrações
elevadas de TG e VLDL-c quando comparados a indivíduos-controle sadios que não
faziam uso desses fármacos. Além disso, Cuparencu et al. (1978) observaram
aumento nas concentrações de TG e diminuição nas concentrações de CT em ratos
normolipidêmicos tratados com 5mg/kg de peso de diazepam.
Alguns estudos demonstraram que o diazepam poderia reduzir a incidência e
gravidade da aterosclerose induzida experimentalmente em animais como coelhos e
galos (WONG et al., 1980; PATEL et al., 1982; MÄNTTÄRI et al., 1982). Tais
estudos levaram a hipótese de que, sob o efeito do diazepam, ocorram alterações
nas atividades plasmática da LCAT e arterial da ACAT que teriam papel importante
na deposição arterial de colesterol e, dessa forma, no processo aterosclerótico. Bell
(1984) observou que o diazepam era um potente inibidor “in vitro” da esterificação do
colesterol pela ACAT em aorta de ratos normais e em coelhos com aterosclerose
induzida por dieta rica em colesterol. Além disso, em diferentes espécies animais,
principalmente em coelhos, o diazepam promoveu inibição da atividade da LCAT, “in
vitro”, dependente da concentração (WONG et al., 1992). Entretanto, ainda não
foram realizados estudos que demonstram as conseqüências da inibição da
14
esterificação do colesterol, pelo tratamento com diazepam, na captação das duas
formas de colesterol e sua relação com o processo da aterogênese.
1.5. Aterosclerose
A arteriosclerose significa literalmente endurecimento das artérias, mais
corretamente, entretanto, trata-se de um termo genérico para designar três padrões
de doenças vasculares, a aterosclerose, a esclerose calcificada de Mönckeberg e a
arteriolosclerose, que possuem em comum o espessamento e a perda da
elasticidade das paredes das artérias (KUMAR et al., 2005).
A aterosclerose é o padrão dominante da arteriosclerose, que se caracteriza
por uma reposta inflamatória crônica às lesões no endotélio, decorrentes da entrada
e oxidação de lípides na camada íntima, aumento da síntese da matriz extracelular,
infiltrado celular, e conseqüente formação do ateroma nas artérias (YLÄ-
HERTTUALA et al, 1996).
Embora a aterosclerose geralmente se torne clinicamente evidente a partir da
meia idade ou mais tarde, trata-se de uma doença lentamente progressiva que
começa na infância e evolui no decorrer de várias décadas (COTRAN et al., 2000).
Os processos básicos da aterosclerose consistem no espessamento e
acúmulo de lípides na camada íntima das artérias, principalmente as de calibre
médio e grande, produzindo placas ateromatosas (YLÄ-HERTTUALA et al, 1996).
Estas, também denominadas fibrogordurosas, são formadas de uma placa focal
elevada no interior da íntima, com centro lipídico, principalmente colesterol e ésteres
15
de colesterol, e uma placa, que se projetam na luz das artérias (COTRAN et al.,
2000; ZIPES et al., 2005).
Diversos fatores, como hipertensão arterial, diabetes melito, tabagismo e
hipercolesterolemia, podem desencadear lesões no endotélio vascular iniciando o
processo aterogênico (EATON, 2005). A disfunção endotelial provoca aumento da
permeabilidade vascular e facilita a penetração no espaço subendotelial de
lipoproteínas, como LDL pequenas e densas, remanescentes de VLDL (HOMMA,
2004). Estas lipoproteínas quando elevadas na circulação se ligam a proteoglicanos,
aumentam seu tempo de retenção na íntima arterial e são capazes de sofrer
oxidação por radicais livres produzidos por células endoteliais adjacentes, células
musculares lisas ou macrófagos isolados (CHOY et al., 2004; ZIPES et al., 2005).
A LDL oxidada, altamente aterogênica, compromete o relaxamento do
endotélio-dependente mediado por óxido nítrico, estimula a secreção de citocinas
(interleucina-1, interleucina-6 e fator de necrose tumoral alfa) pelas células
endoteliais e exerce potente ação quimiotática a monócitos (BERLINER et al., 1990;
CHOY et al., 2004; LIBBY; THEROUX, 2005). Os monócitos penetram na íntima e
no espaço subendotelial, se transformam em macrófagos ativados que fagocitam a
LDL oxidada, formando assim as células espumosas (YLÄ-HERTTUALA et al., 1989;
WU et al., 1992; GLASS; WITZTUM, 2001; STOCKER; KEANEY, 2004).
Em adição, a lesão endotelial pode aumentar o recrutamento de macrófagos
pela secreção de “monocyte chemoattractant protein-1” (MCP-1) e expressão de
receptores celulares de superfície como E-selectina, P-selectina, “vascular cell
adhesion molecule-1” (VCAM-1) e “intercellular adhesion molecule-1” (IAM-1)
(ROSS, 1993; NOLL, 1998; LIBBY; THEROUX, 2005). Os macrófagos expressam
em sua superfície receptores específicos que captam a LDL oxidada, os receptores
16
“scavenger”, que permitem o acúmulo excessivo de CE no interior dessas células e
são os principais responsáveis pelo conteúdo de colesterol da placa de ateroma
(WU et al., 1992; HILTUNEN et al., 1998
A
).
As células musculares lisas migram e se acumulam na íntima, onde
proliferam. A proliferação dessas células é devida provavelmente à presença de
LDL-r nestas células (IKEDA et al., 1994) e receptores para LDL oxidada (“lectinlike
Ox-LDL receptor 1”, LOX-1) nas células endoteliais da camada íntima (KATAOKA et
al., 1999; RICCIARELLI el al., 2000). Algumas células da musculatura lisa também
são capazes de acumular lípides, principalmente colesterol na forma esterificada,
ocorrendo, assim, a formação de mais células espumosas (COTRAN et al., 2000).
Enquanto persistir a hipercolesterolemia, haverá adesão de monócitos,
migração subendotelial de células musculares lisas e acúmulo de lípides no interior
dos macrófagos e das células musculares lisas, produzindo finalmente agregados de
células espumosas na íntima, que aparecem macroscopicamente como estrias
gordurosas (GLASS; WITZTUM, 2001; STOCKER; KEANEY, 2004).
A profileração de células musculares lisas e a deposição de matriz
extracelular são processos que se crônicos, transformarão a estria gordurosa em
ateroma fibrogorduroso, pela deposição adicional de colágeno e proteoglicanos,
além da formação da cápsula fibrosa pelo tecido conjuntivo proeminente na face da
íntima. A profileração celular adicional sobre os ateromas produzirá assim as placas
fibrosas (COTRAN et al., 2000; PLUTZKY, 2003).
As placas fibrosas são denominadas lesões avançadas de aterosclerose, e
quando se tornam comprometidas por trombose, hemorragia, e/ou calcificação,
freqüentemente, são chamadas de lesões complicadas (ABRAMS et al., 1996;
17
COTRAN et al., 2000), e desencadeiam eventos clínicos agudos decorrentes da
oclusão arterial, como isquemia cardíaca e enfarto do miocárdio.
1.6. Lipoproteínas artificiais
A partir dos estudos das características físico-químicas das lipoproteínas
plasmáticas, foram desenvolvidos modelos de nanoemulsões, semelhantes tanto
aos Qm quanto a LDL, que são utilizadas no estudo do metabolismo das
lipoproteínas (GISBURG et al., 1982; MILLER; SMALL,
1983
A
.;
MILLER; SMALL,
1983
B
).
Em 1987 iniciaram-se os estudos que visam reproduzir o metabolismo da
LDL com a utilização de uma nanoemulsão artificial rica em colesterol (LDE), mas
sem a parte protéica da lipoproteína (MARANHÃO et al., 1993). O objetivo
principal desses estudos é o uso da LDE na investigação das dislipidemias.
A LDE não tem proteína, mas ao ser injetada na circulação plasmática, em
contato com as lipoproteínas naturais, adquire apo E, que permite que ela seja
reconhecida pelo receptor da LDL. A apo E serve então de ponte para a LDE ligar-
se ao receptor, sendo assim captada pela célula (MARANHÃO et al., 1993). É
importante ressaltar que a LDL natural não possui apo E, ligando-se ao receptor
através da sua única proteína, a apo B-100. Estudos de competição em linfócitos
mostraram que a LDL natural compete com LDE pela captação celular,
comprovando que a remoção de ambas se dá pelo mesmo receptor específico
(MARANHÃO et al., 1997). No entanto, por paradoxal que isto possa parecer, a
18
partícula artificial LDE tem mais afinidade pelos receptores de LDL do que a
própria LDL natural (HIRATA et al., 1999). Isto acontece porque o meio ligante ao
receptor utilizado pela LDE é a apo E, que tem mais afinidade pelo receptor do que
a apo B-100 da LDL natural.
Em outras experiências, a LDE foi injetada em indivíduos normolipidêmicos e
em portadores de hipercolesterolemia (MARANHÃO et al., 1997). Nesta situação, o
defeito básico consiste em receptores B/E defeituosos, o que resulta em captação
deficiente da LDL e seu acúmulo no plasma (RIDKER et al., 2001). Nesses
pacientes a LDE foi removida muito lentamente da circulação, confirmando o
comportamento esperado. Por outro lado, em pacientes com leucemia mielocítica
aguda, onde a expressão dos receptores de LDL está muito aumentada (HO et al.,
1978), a remoção da LDE também está aumentada (MARANHÃO et al., 1994). Além
disso, foi observado que a remoção da LDE é inversamente proporcional à idade
dos indivíduos (PINTO et al., 2001). Isto explica perfeitamente o mecanismo do
aumento da concentração do colesterol que acompanha o processo de
envelhecimento: com a progressão da idade, a capacidade de remover a LDL da
circulação diminui, em função da redução da expressão dos receptores de LDL
(ERICKSSON et al., 1991).
Santos et al. (2003) demonstraram que pacientes normolipidêmicos
portadores de DAC não apresentavam diferenças na remoção plasmática dos
ésteres de colesterol da LDE quando comparados a indivíduos-controle sadios. No
entanto, a forma livre do colesterol era removida do plasma mais rapidamente nos
pacientes com DAC do que nos controles. Na seqüência desses experimentos
(COUTO et al., 2007) injetou-se a LDE marcada com CL e CE radioativos em
pacientes com DAC sendo submetidos à cirurgia de revascularização. Observou-se
19
que o CL da LDE era removido mais rapidamente da circulação que o CE, assim
como uma maior deposição do CL em fragmentos de vasos descartados durante a
cirurgia comparando-se à do CE.
Desta maneira o comportamento da LDE mostrou servir de ferramenta para
avaliarmos o metabolismo da LDL. Quando comparada a LDL natural, a LDE oferece
facilidades operacionais que tornam muito mais fácil a avaliação deste circuito
metabólico. A LDE permite a avaliação de um número grande de indivíduos com a
mesma preparação. No caso da LDL natural, a lipoproteína deve ser isolada de um
indivíduo, marcada e reinjetada no mesmo indivíduo, devido ao risco de doenças
infecto-contagiosas como a hepatite, síndrome da imunodeficiência adquirida e
outras. Outra característica importante das nanoemulsões é que se pode variar a
sua composição (MARANHÃO et al., 1986) e, desta forma, estudar outros aspectos
do metabolismo lipídico como a esterificação do CL, a atividade de proteínas de
transferência, o efeito de drogas hipolipemiantes e os mecanismos de captação
vascular.
20
2. JUSTIFICATIVA
21
2. JUSTIFICATIVA
Resultados iniciais do nosso laboratório de experiências realizadas em
coelhos (PADOVEZE et al., dados não publicados) indicam que a captação da LDE
– e por extensão da LDL – pelo tecido arterial seja grande, embora bastante inferior
à do fígado, principal órgão de captação da lipoproteína natural e da LDE. Os
animais que estudamos até aqui eram coelhos-controle, em dieta normal e sem
indução de aterogênese, e neles não observamos a predominância de captação
arterial do colesterol livre em relação ao colesterol esterificado, como aconteceu nos
pacientes com DAC submetidos a revascularização (COUTO et al., 2007).
O conjunto desses resultados nos dá indícios de que poderemos estar diante
de fenômenos e mecanismos de geração de aterosclerose ainda inexplorados. Abre-
se a possibilidade de eventuais problemas ligados à esterificação e estabilidade do
colesterol livre no interior da partícula da LDL e na deposição do colesterol livre na
parede arterial que possam resultar em processos aterogênicos. Com a precipitação
do colesterol na parede arterial, o conteúdo de colesterol livre na bicamada da
membrana plasmática seria enriquecido. Isto levaria a perturbação das funções da
membrana plasmática, resultando em alteração da função endotelial que poderiam
desencadear lesões iniciais da aterogênese. Em caminho paralelo, pode-se imaginar
também que haja depósito de colesterol livre na matriz e que o depósito de
colesterol livre deflagre processos de natureza inflamatória que, ao lado do depósito
lipídico, constituem-se as vertentes principais dos processos de geração da
aterosclerose (ROSS, 1999). Tanto o enriquecimento das membranas plasmáticas
22
quanto o depósito da forma livre de colesterol na matriz já foram observados, em
experiências de indução de aterosclerose por dieta rica em colesterol.
Portanto, face ao exposto acima, consideramos fundamental, além de
completar a observação do depósito arterial das duas formas de colesterol da LDE
em coelhos normais, observar este processo de depósito de colesterol livre e
esterificado em coelhos portadores de aterosclerose induzida por manipulação
dietética. Essa estratégia visa verificar a existência de um possível desbalanço nas
duas formas do colesterol e caso isso for confirmado, estabelecer as bases
experimentais para a exploração desse processo em futuros estudos clínicos.
Outra medida que pode fornecer chaves para a interpretação dos resultados
de captação arterial do colesterol é a determinação do efeito da atividade de
esterificação mediada pela LCAT e ACAT. Estudos demonstraram ação do
diazepam sobre a inibição da síntese e esterificação do colesterol in vitro, e o seu
possível mecanismo hipocolesterolêmico e de prevenção na formação da lesão
aterosclerótica em diferentes espécies animais (WONG et al., 1980; PATEL et al.,
1982; BELL, 1985; WONG et al., 1992). Diante disso, o tratamento com diazepam
em ratos pode ser utilizado como modelo experimental para inibição da esterificação
e desestabilização do colesterol. Tais efeitos poderiam causar um desbalanço na
captação arterial das duas formas de colesterol levando ao aumento do depósito
arterial de colesterol livre.
23
3. OBJETIVOS
24
3. OBJETIVOS
- Avaliar a cinética plasmática e captação do colesterol livre e do colesterol
esterificado da LDE por segmentos arteriais e por outros tecidos do organismo de
coelhos normais e coelhos submetidos à indução de aterosclerose por dieta rica em
colesterol.
- Determinar a captação in vitro da LDE por células endoteliais aórticas de
coelhos (RAEC).
- Avaliar a influência da inibição da esterificação do colesterol na captação
das formas de colesterol da LDE pelo fígado, baço e aorta de ratos tratados com
diazepam.
25
4. MATERIAL E MÉTODOS
26
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Materiais utilizados
Os isótopos radioativos [1-
14
C] oleato de colesterol e [7(n)-
3
H] colesterol foram
obtidos da Amersham International (Little Chalfont, Inglaterra). Os lipídeos trioleína,
oleato de colesterol, colesterol e fosfatidilcolina, utilizados para a o preparo da
emulsão foram adquiridos da Sigma Chem. Co. (St. Louis, USA). O colesterol
utilizado para o preparo da dieta rica em colesterol foi obtido da Dolder AG (Basel,
Suiça). Os kits para determinação enzimática de triglicérides, colesterol total e de
HDL foram obtidos da Labtest Diagnostica S. A. (Minas gerais, Brasil). A ração
comercial usual para coelhos e ratos foi adquirida da Purina Inc.
4.2 Preparo da nanoemulsão artificial LDE
A LDE foi preparada segundo a técnica descrita por Ginsburg et al. (1982).
Em um frasco foram pipetados 40 mg de fosfatidilcolina, 20 mg de oleato de
coesterol, 1 mg de trioleína e 0,5 mg de colesterol, diluídos em clorofórmio:metanol
(2:1). Posteriormente, foram adicionados à mistura de lípides 1500 dpm dos isótopos
3
H - colesterol livre (
3
H –CL) e
14
C – colesterol esterificado (
14
C – CE). Os solventes
residuais foram então evaporados da mistura sob fluxo de nitrogênio e dessecação a
vácuo, por 16 horas, a 4ºC. Após a adição de 10 ml de tampão tris-HCl 0,01M, pH 8,
a mistura de lípides foi emulsificada por irradiação ultra-sônica, utilizando-se
27
equipamento Branson, modelo 450A (Arruda Ultra-Som, São Paulo, Brasil) potência
125 watts, durante 3 horas, sob atmosfera de nitrogênio, com temperatura variando
entre 51 a 55ºC. Para obtenção da LDE na faixa de diâmetro e tamanho desejados,
a solução lipídica foi purificada em duas etapas de ultracentrifugação
(ultracentrífuga, rotor Beckman SW –41). Na primeira etapa, o material da parte
superior do tubo, resultante da centrifugação a 200.000 x g por 30 minutos, a 4ºC, foi
removido por aspiração (1 ml) e desprezado. Ao restante do material foi adicionado
brometo de potássio (KBr) ajustando a densidade para 1,21g/ml. Após a segunda
centrifugação (200.000 x g por 2 horas a 4ºC), a LDE foi recuperada no topo do tubo
por aspiração. O excesso de KBr foi removido por diálise, contra 2 trocas de 1000
volumes tampão tris HCl 0,01 M, pH 8. Finalmente, a emulsão foi esterilizada por
filtração em membrana Milipore (0,22µ de porosidade) sob fluxo laminar e
armazenada a 4ºC por até trinta dias.
4.3. Modelos experimentais
- Coelhos “New Zealand” machos, pesando 2,6 ± 0,2 kg (média ± desvio
padrão), mantidos em gaiolas climatizadas (20-22ºC), com ciclo claro: escuro
12:12h, no Biotério da Divisão Experimental do Instituto do Coração do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (InCor-HC-
FMUSP). O consumo das dietas (ração comercial usual e dieta rica em colesterol) foi
restrito a 150g/dia, enquanto a água foi mantida ad libitum.
28
- Ratos Wistar machos adultos, pesando 280 ± 26 g (média ± desvio padrão),
provenientes do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP. Os
animais foram mantidos em gaiolas de plástico coletivas, 4-5 animais por gaiola, à
termperatura controlada de 22-23ºC, com ciclo claro: escuro 12:12h, no Biotério da
Divisão Experimental do InCor-HC-FMUSP. A ração comercial usual (Purina Inc.) e
água foram fornecidos ad libitum.
4.4. Cinética plasmática e captação tecidual do
3
H - colesterol livre e do
14
C –
colesterol esterificado da LDE em coelhos submetidos à indução de
aterosclerose por dieta rica em colesterol
4.4.1. Animais
Foram utilizados 30 coelhos New Zealand machos que inicialmente
consumiram ração comercial usual (Purina Inc.) constituída de 16% de proteínas,
7% de lipídeos, 14% de fibra bruta, 7% de cinzas e 50% de extrato não-nitrogenado
por uma semana para adaptação às condições ambientais do biotério.
Após, os coelhos foram divididos em 2 grupos:
- Grupo controle, constituído de 17 animais, foi mantido sob ração comercial
usual durante 8 semanas.
29
- Grupo submetido à indução de aterosclerose por dieta rica em colesterol,
constituído de 13 animais, consumiu a ração comercial usual com
acréscimo de 1% de colesterol (peso/peso) durante o mesmo período.
4.4.2. Preparo da dieta rica em colesterol
A dieta rica em colesterol foi preparada pela vaporização de uma solução de
colesterol, éter etílico e etanol a 70% sobre a ração comercial usual, na proporção
de 1 g de colesterol para 100g de ração.
O colesterol foi dissolvido adicionando-se 50 ml de éter etílico e 100 ml de
álcool a 70%/g de colesterol, a 40ºC sob agitação. Após adicionado a solução, a
ração permaneceu em repouso por 24 horas em capela para evaporação completa
dos solventes. A dieta rica em colesterol foi pesada e separada em porções
individuais de 150g em saco plástico lacrado e armazenada a -20ºC.
4.4.3. Avaliação do peso corporal dos animais e consumo de ração
Os animais foram pesados a cada 8 dias para avaliação do peso corporal. O
consumo de ração foi avaliado a cada 4 dias, pesando-se o resíduo de ração.
30
4.4.4. Determinação do perfil lipídico
O perfil lipídico sérico dos coelhos foi determinado antes e após o consumo
da dieta. As amostras de sangue venoso foram coletadas após jejum de 12h e
centrifugadas a 2500 rpm por 10 minutos a 4ºC para separação do soro.
Os triglicérides e colesterol total foram determinados pelo método enzimático
Triglicérides GPO-ANA e Colesterol Liquiform Labtest, respectivamente, e pelo
sistema de medida colorimétrica (Life Science UV/Vis Spectrophotometer , DU
530,
Beckman). O colesterol de HDL foi determinado pelo mesmo metódo utilizado para o
colesterol total, após precipitação das VLDL e LDL segundo Burnstein et al. (1970).
Para determinação do colesterol total no grupo de animais submetidos à
indução da aterosclerose, diluiu-se o soro com solução de NaCl 150 mmol/L na
proporção de 1:9. Os dados obtidos foram ajustados para mg/dL.
Para controle interno de qualidade, foi utilizada a preparação estabilizada
Qualitrol 1 da Labtest Diagnostica S. A.
4.4.5. Determinação da cinética plasmática da LDE
O estudo do comportamento cinético da LDE foi realizado nos animais após
jejum de 12 horas. Foram injetados cerca de 100µL de LDE marcada com
3
H - CL e
14
C – CE na veia auricular dos coelhos. As amostras de sangue foram colhidas em
intervalos pré-determinados, 5 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 horas, da veia auricular
contralateral desses animais. Após a coleta, o plasma foi separado por centrifugação
31
e alíquotas de 200µL foram pipetadas em tubos de cintilação. Foram acrescentados
a esses tubos, 5 ml de solução cintiladora (Ultima Gold XR, PerkinElmer). A
radioatividade foi medida em contador Beta (Liquid Scintillation Analyzer, 1600
TR
Tri-
Carb, PACKARD), sob utilização do software SpeedSTAR Plus Vers. 5.01 da
Diamond Computers, para determinação das contagens de
3
H - CL e
14
C – CE das
amostras.
4.4.6. Análise compartimental da curva de decaimento plasmático dos
lípides radioativos
Determinada a radioatividade presente nas amostras de plasma nos tempos
de coleta, foram traçadas as curvas de decaimento plasmático e realizado o cálculo
dos parâmetros cinéticos dos componentes lipídicos radioativos da nanoemulsão,
por meio de um programa computacional de análise de cinética de emulsões
artificiais (MESQUITA, 1994).
A curva de decaimento plasmático da LDE apresenta um perfil biexponencial
com um rápido decaimento inicial seguido de um decaimento mais lento. Esse perfil
levou a adoção de um modelo com dois compartimentos a partir do qual foram
calculados os parâmetros cinéticos (k).
Os compartimentos e os parâmetros cinéticos (k) desse modelo são definidos
do seguinte modo:
- compartimento 1: representa a nanoemulsão , no caso a LDE , introduzida
no espaço intravascular;
32
- compartimento 2: LDE sendo removida por receptores presentes no
endotélio vascular e/ou espaços extravasculares;
- k1,0: representa a fração da nanoemulsão que é injetada no
compartimento plasmático;
- k 1,2: representa a fração da nanoemulsão removida do compartimento
plasmático para espaço intravascular;
- k 2,0: representa a fração de remanescente de LDE que é removida do
compartimento plasmático para espaço extravascular.
Para representar a remoção das partículas de lípides marcados foram
utilizados os parâmetros denominados taxas fracionais de remoção (TFR), em h
-1
,
estimados segundo Matthews (1957) utilizando-se as respectivas taxas fracionais de
transferência (k) :
TFR = {(k1,0 + k1,2) .k2,0} / (k1,2 + k2,0)
4.4.7. Determinação da captação tecidual do
3
H - colesterol livre e do
14
C
– colesterol esterificado da LDE
Os coelhos foram sacrificados com injeção intravenosa de pentobarbital
sódico a 5% 24 horas após a injeção da LDE marcada com lipídes radioativos.
Os órgãos e tecidos (fígado, pulmão, coração, baço, rim, pâncreas, gônadas,
adrenais, vesícula biliar, tecido adiposo, músculo e pele), e os fragmentos arteriais
(arco aórtico, aorta abdominal e torácica) foram removidos, limpos e acondicionados
em solução fisiológica gelada. Em seguida, os tecidos foram pesados (250mg) e
33
macerados deixando-os com aspecto pastoso. Após, as amostras foram colocadas
em tubos de extração adicionando-se 21 ml clorofórmio: metanol (2:1) e deixadas
em repouso “overnight” para extração do colesterol livre e esterificado segundo o
método de Folch (1957).
Após as amostras serem filtradas em papel de filtro por gravidade, adicionou-
se 5ml de água:metanol (1:1) aos tubos, mantendo-os em repouso, “overnight” a
4ºC . Após o repouso, a fase sobrenadante foi aspirada a vácuo e então descartada.
Todo infranadante foi transferido para tubos de cintilização e secado à vácuo.
As amostras foram ressuspendidas adicionando-se 5 ml solução cintiladora
PPO/POPOP/ Triton X-100/ tolueno (5,0 g/ 0,5g/ 333 mL/667 mL). A radioatividade
foi medida em contador Beta (Liquid Scintillation Analyzer, 1600
TR
Tri-Carb,
PACKARD), sob utilização do software SpeedSTAR Plus Vers. 5.01 da Diamond
Computers, para determinação das contagens de
3
H - CL e
14
C – CE das amostras.
4.4.8. Determinação da % de lesão aterosclerótica nos segmentos
arteriais
Os segmentos arteriais – arco aórtico, aorta torácica e abdominal – foram
dissecados, limpos, lavados com salina e fixados em formaldeído a 4%. Após a
fixação, os segmentos foram embebidos em parafina e os cortes histológicos de
cada segmento corados com solução de hematoxilina/eosina. A percentagem de
lesão aterosclerótica (% área de lesão aterosclerótica/área da íntima-média) foi
medida por planimetria pelo programa computacional Image Analysis System
Quantiment500+ (Leica Cambridge Ltd., Cambridge, UK).
34
4.5. Estudo in vitro da captação do
3
H - colesterol livre e
14
C – colesterol
esterificado da LDE por células endoteliais aórticas de coelhos
As células endoteliais aórticas de coelhos foram gentilmente cedidas pelo
Prof. Dr. Francisco Laurindo, do laboratório de Biologia Vascular do Instituto do
Coração da FMUSP. Esta é uma linhagem celular estabelecida e imortalizada por
seleção pelo Prof. V. Buonassisi, da Universidade Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina.
As células foram mantidas em placas de cultura contendo meio completo F-12
Coon’s com penicilina/streptomicina, suplementado com 10% (v/v) de soro fetal
bovino (SFB) (Gibco BRL-Life Technologies Grand Island, NY, USA) e foram
mantidas em estufa a 37ºC com 5% de CO2. Os experimentos foram realizados
quando as células atingiram confluência de 90%.
A captação celular de LDE foi determinada pela incubação de 5x10
5
células
com quantidades crescentes de LDE marcada com
3
H – CL e
14
C – CE. As células
foram plaqueadas em placas de Petri de 60mm. Após 24 horas, o meio de cultura foi
substituído por outro contendo 10% de SFB deslipidado (LPDS). Após 72 horas,
foram adicionadas quantidades crescentes de LDE (2,5; 5; 10; 20; 40 e 80µL, que
corresponde a 0,075 a 2,4mg de LDE) às placas e incubadas por 4 horas a 37ºC. As
células foram lavadas três vezes com PBS, raspadas e centrifugadas a 14000 rpm
por 15 minutos. Foram adicionados 500µL de NaOH 0.5M, sob agitação, ao pelet
para disruptura celular. Foram pipetadas 450µL das amostras em tubos de cintilação
com solução cintiladora e a radioatividade medida em contador Beta. Nos 50µL
35
restantes foi determinada a concentração de proteínas das amostras pelo método de
Bradford (1976).
4.6. Captação tecidual do
3
H - colesterol livre e
14
C – colesterol esterificado da
LDE em ratos após tratamento com diazepam
4.6.1. Animais
Foram utilizados 18 ratos Wistar machos adultos, pesando 280 ± 26 g (média
± desvio padrão).
Os animais foram divididos em 2 grupos:
- Grupo controle: injeção via intraperitonial de 0,5mL/ kg de peso/dia de
soro fisiológico durante 4 dias;
- Grupo tratado com diazepam: injeção via intraperitonial de 0,5 mg/ kg de
peso/dia de diazepam durante 4 dias.
36
4.6.2. Determinação da captação tecidual do
3
H - colesterol livre e
14
C –
colesterol esterificado da LDE
A LDE marcada com
3
H - CL e
14
C – CE foi injetada intraperitonealmente nos
animais. Após 24 horas, os animais foram sacrificados em uma câmara fechada com
éter etílico.
O fígado, o baço e a aorta foram removidos, limpos e acondicionados em
solução fisiológica gelada. Em seguida, foram pesados 250mg de tecido de fígado e
baço, e 100mg de tecido da aorta, e macerados deixando-os com aspecto pastoso.
As amostras foram processadas conforme descrito no item 4.4.7.
4.7. Análise estatística
Os dados foram tabelados como média ± desvio padrão (M ± DP). As
diferenças entre os dados de captação entre os grupos foram avaliadas pelo teste de
Mann-Whitney bicaudal. As difrenças entre as concentrações de TG, CT e HDL-c antes
e após o consumo da ração rica em colesterol foram avaliados pelo teste de Wilcoxon
bicaudal (teste não-paramétrico pareado). A análise de variância pelo teste de Kruskal-
Wallis seguida do teste de comparações múltiplas de Dunns foi utilizada para
comparar a diferença entre as médias e desvios da captação de
3
H - CL e
14
C - CE
dos grupos estudados, e da variação do peso corporal e consumo de ração durante
o período de experimentação.
37
O coeficiente de correlação linear de Spearman foi aplicado para avaliar a
correlação entre % de lesão aterosclerótica e captação da LDE nos segmentos
arteriais; % de lesão aterosclerótica e consumo de ração (g/dia); TFR
3
H – CL e
14
C -
CE e perfil lipíco; TFR
3
H - CL e
14
C - CE e consumo de ração (g/dia), e quantidade
de LDE incubada e captação da LDE no estudo in vitro com células endoteliais.
A probabilidade de significância considerada foi de p < 0,05 em todas as
comparações efetuadas.
38
5. RESULTADOS
39
5. RESULTADOS
5.1. Cinética plasmática e captação da LDE em coelhos submetidos à indução
de aterosclerose por dieta rica em colesterol
5.1.1. Peso corporal e consumo de ração
A figura 1 mostra a variação do peso corporal dos coelhos submetidos à
indução de aterosclerose durante 8 semanas. Nota-se que houve aumento de 15±1%
no peso corporal dos animais a partir do 34º dia após o início do consumo da dieta rica
em colesterol a 1% (p<0,01).
2,0
2,4
2,8
3,2
3,6
0 8 16 24 32 40 48 56
Tempo (dias)
Peso corporal (Kg)
Figura 1 – Peso corporal (kg) de coelhos submetidos à indução de aterosclerose durante 8 semanas
de consumo da dieta rica em colesterol a 1% (n =13), (média ± DP).
40
A figura 2 mostra o consumo de ração dos coelhos submetidos à indução de
aterosclerose. O consumo médio diário de ração foi de 107 ± 40g. Não houve
alterações no consumo da dieta rica em colesterol a 1% durante este período (p=0,14).
0
50
100
150
200
0 8 16 24 32 40 48 56
Tempo (dias)
Consumo de ração (g)
Figura 2 – Consumo de ração (g/dia) por coelhos submetidos à indução de aterosclerose durante 8
semanas (n =13), (média ± DP).
5.1.2. Perfil lipídico
A tabela 1 mostra os dados de concentração sérica de CT, HDL-c e TG
(mg/dL) determinados nos coelhos submetidos à indução de aterosclerose, antes e
após o consumo da dieta rica em colesterol a 1%. Não houve alteração nas
concentrações séricas de HDL-c. Houve aumento de 2 e 44 vezes, respectivamente,
nas concentrações séricas de TG e CT após o consumo da dieta.
41
Tabela 1. Perfil lipídico (mg/dL) de coelhos submetidos à indução
de aterosclerose, antes e após o consumo da dieta rica em
colesterol a 1% (n=13).
Perfil lipídico Início Final
Colesterol
Total
51 ± 14 2267± 562*
HDL
19 ± 7 29 ± 16
Triglicérides
88 ± 36 214 ± 159*
Abreviaturas: HDL – lipoproteína de alta densidade. Resultados
expressos em média ± DP.
* p < 0,01, comparado ao início, teste de Wilcoxon.
5.1.3. Estudos cinéticos da LDE.
A figura 3 mostra as curvas de decaimento plasmático do
3
H - CL e
14
C - CE
da LDE no grupo controle e no grupo submetido à indução de aterosclerose. No
grupo controle não houve diferenças entre a TFR do
3
H - CL e do
14
C CE
(0,170±0,038 e 0,234±0,056 h
-1
, respectivamente, p=0,06). No entanto, no grupo
submetido à indução de aterosclerose foi observada uma maior TFR do
3
H - CL em
relação ao do
14
C - CE (0,089±0,033 e 0,046±0,010 h
-1
, respectivamente, p=0,03). A
remoção plasmática, tanto de
3
H - CL quanto de
14
C - CE, foi maior no grupo
controle do que no grupo que recebeu a dieta (2 e 5 vezes maior respectivamente,
p<0,01).
42
A
B
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (h)
% radioatividade
CL
CE
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (h)
% radioatividade
CL
CE
A
B
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (h)
% radioatividade
CL
CE
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (h)
% radioatividade
CL
CE
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (h)
% radioatividade
CL
CE
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (h)
% radioatividade
CL
CE
Figura 3 – Curvas de decaimento plasmático do
3
H – colesterol livre (CL) e
14
C
– colesterol
esterificado (CE) da LDE em coelhos no período de 24h. A: grupo controle (n=8), B: grupo submetido
à indução de aterosclerose por dieta rica em colesterol a 1% durante 8 semanas (n=6). Resultados
expressos em média ± DP.
43
A tabela 2 mostra o estudo de correlação entre as TFR do
3
H - CL e do
14
C -
CE e o perfil lipídico dos animais.
Embora a TFR e o consumo de ração (g/dia) dos animais que receberam uma
dieta rica em colesterol a 1% não se correlacionarem (dados não mostrados),
observou-se que as TFR, tanto de
3
H - CL quanto de
14
C – CE, e as concentrações
séricas de CT e TG apresentaram correlação linear negativa. Em relação a
concentração sérica de HDL-c, houve correlação linear negativa somente com a
TFR do
14
C – CE.
Tabela 2. Correlação entre a taxa fracional de remoção do
3
H – colesterol livre e do
14
C
– colesterol
esterificado e perfil lipídico*.
CT HDL-c TG
TFR
r p r p r p
3
H – CL
-0,63 0,0323 -0,14 ns -0,86 0,0006
14
C – CE
0,-82 0,0019 -0,68 0,0251 -0,90 0,0002
Abreviaturas: CT – colesterol total; HDL – lipoproteína de alta densidade; HDL-c –colesterol de HDL; TG
– triglicérides; ns – não significativo.*Teste de correlação linear de Spearman.
5.1.4. Captação da LDE
A tabela 3 mostra a captação tecidual do
3
H – CL e
14
C - CE em coelhos
normais e coelhos submetidos à indução de aterosclerose por dieta avaliada 24
horas após a injeção de LDE. Os resultados estão expressos em % de
radioatividade injetada por grama de tecido.
No grupo controle a captação média de
3
H - CL foi maior do que a de
14
C - CE
pelo pulmão, coração e baço (p<0,05). No grupo submetido à indução de
44
aterosclerose a captação média de
3
H - CL foi maior que a de
14
C -CE pelo fígado e
pelo rim (p<0,05), ocorrendo o inverso no arco aórtico (p<0,01).
O grupo submetido à indução de aterosclerose apresentou menor captação
de
3
H -CL e de
14
C- CE pelo fígado, pulmão, baço, rim e aorta abdominal em
comparação com o grupo controle (p<0,05). Já o coração, as adrenais, o músculo e
a aorta torácica, do grupo submetido à indução de aterosclerose, mostraram menor
captação somente de
3
H-CL (p<0,05).
No grupo controle, comparando-se os 3 segmentos arteriais, não se observou
diferenças na captação tanto de
3
H - CL quanto de
14
C- CE entre o arco aórtico,
aorta torácica e abdominal (p=0,34 e p=0,20, respectivamente). Entretanto, no grupo
submetido à indução de aterosclerose, a captação de
3
H -CL e de
14
C – CE foi maior
pelo arco aórtico do que pelas aortas torácica e abdominal (p<0,05).
45
Tabela 3. Captação tecidual de
3
H – colesterol livre e
14
C –colesterol esterificado em órgãos e
segmentos arteriais de coelhos normais e de coelhos submetidos à indução de aterosclerose 24h
após a injeção de LDE marcada.
Grupo controle
(n=17)
Grupo submetido à indução de
aterosclerose
(n=13)
Órgãos/tecidos
3
H – CL
14
C - CE
3
H – CL
14
C - CE
Fígado
0,102±0,066 0,096±0,071 0,040±0,014† ‡ 0,027±0,009§
Pulmão
0,113±0,068* 0,092±0,199 0,023±0,016‡ 0,013±0,007§
Coração
0,066±0,060* 0,022±0,026 0,016±0,018‡ 0,012±0,014
Baço
0,133±0,073* 0,051±0,038 0,020±0,015‡ 0,017±0,011§
Rim
0,050±0,033 0,038±0,031 0,013±0,007† ‡ 0,006±0,003§
Pâncreas
0,002±0,001 0,003±0,002 0,003±0,003 0,008±0,007
Gônadas
0,011±0,006 0,006±0,001 0,003±0,001 0,003±0,001
Adrenais
0,296±0,098 0,148±0,074 0,016±0,004‡ 0,022±0,023
Vesícula Biliar
0,116±0,070 0,029±0,008 0,020±0,003 0,021±0,002
Tecido Adiposo
0,003±0,002 0,004±0,002 0,006±0,005 0,001±0,000
Músculo
0,025±0,024 0,017±0,018 0,006±0,005‡ 0,008±0,007
Pele
0,006±0,001 0,004±0,001 0,002±0,001 0,003±0,001
Arco Aórtico
0,029±0,026 0,023±0,020 0,015±0,005† 0,032±0,011
Aorta Torácica
0,046±0,036 0,032±0,042 0,009±0,003‡ 0,013±0,009
Aorta Abdominal
0,033±0,021 0,062±0,068 0,009±0,004‡ 0,013±0,011§
Abreviaturas:
3
H – CL:
:3
H – colesterol livre;
14
C – CE:
14
C - colesterol esterificado. Resultados
expressos em % de radioatividade injetada por grama de tecido, média ± DP.
* p<0,05, comparado ao
14
C-CE no grupo controle; † p<0,05, comparado ao
14
C-CE no grupo submetido
à indução de aterosclerose; ‡ p<0,05, comparado ao
3
H-CL do grupo controle; § p<0.05, comparado ao
14
C-CE do grupo controle, teste de Mann-Whitney.
46
A tabela 4 mostra o estudo de correlação entre TFR e % de captação dos
lípides marcados radioativamente da LDE. Verificou-se que a captação de
3
H -CL e
de
14
C - CE pelas adrenais se correlacionou com as suas respectivas TFR.
Entretanto, ao se avaliar a captação pelo músculo, pele e vesícula biliar, somente a
TFR do
14
C - CE apresentou correlação.
Tabela 4. Correlação entre percentagem de captação tecidual e taxa fracional
de remoção do
3
H – colesterol livre e do
14
C
– colesterol esterificado*.
TFR
3
H – CL
14
C – CE
% captação
tecidual
r p r p
Adrenais 0,82 0,034 0,93 0,007
Músculo 0,24 ns 0,86 0,024
Pele 0,43 ns 0,79 0,049
Vesícula Biliar 0,18 ns 0,86 0,024
Abreviaturas: TFR: taxa fracional de remoção;
3
H – CL:
:3
H – colesterol livre;
14
C – CE:
14
C – colesterol esterificado
; ns – não significativo.*Teste de
correlação linear de Spearman.
47
A tabela 5 mostra os resultados da comparação múltipla de Dunns entre os
dados de captação de
3
H - CL e
14
C - CE em ambos os grupos.
A análise de variância mostrou diferenças na % de captação de
3
H – CL e
14
C
– CE entre órgãos e fragmentos arteriais no grupo controle e no grupo submetido à
indução de aterosclerose (p<0,01).
Em geral, no grupo controle, o fígado e as adrenais apresentaram maior
captação de
3
H - CL e
14
C - CE em relação aos outros órgãos. O baço e o pulmão
apresentaram comportamento semelhante entre si, ou seja, captaram mais
3
H - CL
em relação aos outros órgãos. O mesmo perfil não foi observado para o
14
C - CE.
Nos animais submetidos à indução de aterosclerose, o fígado foi o principal
órgão captador de
3
H - CL, porém não de
14
C - CE.
48
Tabela 5. Teste de comparação múltipla de Dunns, após teste de Kruskal-Wallis, entre as médias de
captação de
3
H-colesterol livre e
14
C-colesterol esterificado nos órgãos e segmentos arteriais do
grupo controle e do grupo submetido à indução de aterosclerose.
Grupo controle
(n=17)
Grupo submetido à indução de
aterosclerose
(n=13)
3
H –CL
14
C – CE
3
H –CL
14
C – CE
Fígado vs. Músculo * * *** ns
Fígado vs. Pâncreas ** ** ** ns
Fígado vs. Gônadas ns ns ** ns
Fígado vs. Tecido adiposo * * ns ns
Fígado vs. Pele * ** ** ns
Baço vs. Músculo ** ns ns ns
Baço vs. Pâncreas *** ns ns ns
Baço vs. Gônadas * ns ns ns
Baço vs. Tecido adiposo ** ns ns ns
Baço vs. Pele ** ns ns ns
Baço vs. Arco aórtico * ns ns ns
Pulmão vs. Músculo * ns ns ns
Pulmão vs. Pâncreas ** ns ns ns
Pulmão vs. Tecido adiposo * ns ns ns
Pulmão vs. Pele * ns ns ns
Adrenais vs. Músculo ** ns ns ns
Adrenais vs. Pâncreas *** ** ns ns
Adrenais vs. Gônadas * ns ns ns
Adrenais vs. Tecido adiposo ** * ns ns
Adrenais vs. Pele ** * ns ns
Adrenais vs. Arco aórtico * ns ns ns
Abreviaturas:
3
H – CL:
:3
H – colesterol livre;
14
C – CE:
14
C - colesterol esterificado
; ns – não
significativo.
* p< 0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; Teste de comparação múltipla de Dunns, após teste de Kruskal-
Wallis.
49
5.1.5. Lesão aterosclerótica
A figura 4 mostra a fotomicrografia do arco aórtico, aorta abdominal eaorta
torácica de coelhos normais e de coelhos submetidos à indução de aterosclerose.
Nota-se que coelhos que receberam a dieta rica em colesterol apresentaram aumento
na espessura da íntima e formação de lesão aterosclerótica.
A tabela 6 mostra a morfometria microscópica dos 3 segmentos arteriais de
coelhos submetidos à indução de aterosclerose determinada pela análise histológica
seguida de planimetria. Não foi observado diferenças na % de lesão aterosclerótica
entre os 3 segmentos arteriais analisados (p=0,66). A análise de variância mostrou
diferenças entre o arco áortico e a aorta abdominal nas áreas da íntima-média, média e
lesão aterosclerótica (p<0,05).
Observou-se correlação linear positiva entre o consumo de ração rica em
colesterol a 1% (g/dia) e a % de lesão aterosclerótica somente no arco aórtico (r=0,82;
p=0,01). Já em relação à % de captação de
3
H – CL e de
14
C - CE e % da lesão
aterosclerótica, não se observou correlação linear em nenhum dos segmentos arteriais
estudados (dados não mostrados).
50
Figura 4. Fotomicrografia dos segmentos arteriais obtidos de coelhos normais (A) e de coelhos
submetidos à indução de aterosclerose por dieta rica em colesterol a 1% durante 8 semanas (B): 1 –
arco aórtico, 2 – aorta torácica e 3 – aorta abdominal (50X).
1A 1B
2A
3A
2B
3B
51
Tabela 6. Morfometria microscópica dos segmentos arteriais de coelhos submetidos à indução de
aterosclerose após 8 semanas de consumo da dieta rica em colesterol a 1%.
Arco aórtico
(n=9)
Aorta torácica
(n=9)
Aorta abdominal
(n=9)
Área da íntima-média (µm
2
) 2,36±1,09 2,45±2,57 1,14±0,60*
Área da média (µm
2
) 1,72±0,81 1,65±1,64 0,86±0,36*
Área da lesão aterosclerótica-
íntima (µm
2
)
0,66±0,29 0,51±0,61 0,20±0,21*
% lesão aterosclerótica
26,20±5,81 23,13±20,62 17,06±15,73
*p<0,05, comparado ao arco aórtico, teste de comparação múltipla de Dunns, após teste de Kruskal-
Wallis.
5.2. Captação da LDE
in vitro
por RAEC
A tabela 7 mostra a influência da massa de LDE na captação de
3
H - CL e
14
C -
CE por células endoteliais aórticas de coelhos. Nota-se que a captação de
3
H - CL
por RAEC foi maior que a de
14
C - CE, independente da massa de LDE incubada
(p<0,01).
Observa-se correlação positiva entre a massa de LDE incubada, na faixa
estudada (0,075 a 2,4mg) e a captação de
14
C - CE (r=1,0; p=0,003). Entretanto,
este mesmo fenômeno não ocorreu em relação ao
3
H - CL (r=0,77; p=0,10).
52
Tabela 7. Influência da massa de LDE na captação do
3
H -
colesterol livre e do
14
C - colesterol esterificado por células
endoteliais aórticas de coelhos.
Radioatividade (cpm/µg de proteína)
LDE
(mg)
3
H-CL
(n=14)
14
C-CE
(n=14)
0,075 1134±656* 197±89
0,150 1581±646* 276±94
0,300 2779±768* 523±279
0,600 5644±1815* 883±581
1,200 5418±2692* 907±398
2,400 4949±589* 1061±176
Abreviaturas:
3
H – CL:
:3
H – colesterol livre;
14
C – CE:
14
C - colesterol
esterificado.
* p< 0,01, comparado ao
14
C – CE, teste de Mann-Whitney.
5.3. Captação da LDE em ratos após tratamento com diazepam
A figura 5 mostra a proporção de
3
H – CL e
14
C - CE em relação ao colesterol
total marcado radioativamente que foi captado pelos tecidos no grupo controle e no
grupo tratado com diazepam. No grupo controle, observou-se maior % de
3
H - CL
captado do que de
14
C - CE no baço (p=0,02).
No grupo tratado com diazepam, nota-se maior captação de
3
H - CL do que
de
14
C - CE no plasma, baço, fígado e aorta (p<0,01). Nota-se ainda que a % de
captação de
3
H - CL foi maior na aorta do grupo tratado com diazepam comparado
ao grupo controle, enquanto a de
14
C - CE foi menor (p <0,05).
53
Figura 5. Percentagem de
3
H-colesterol livre e de
14
C-colesterol esterificado em relação a
radioatividade total captada pelo baço, fígado e aorta de ratos 24 h após a injeção da LDE. A: grupo
controle, tratado com salina (0,5mL/kg/dia) (n=9); B: grupo tratado com diazepam (0,5mg/kg/dia)
(n=9). Resultados expressos em média ± DP. * p<0,01; comparado ao
14
C-CE, teste de Mann-
Whitney.
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Plasma Baço Fígado
Aorta
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Plasma Baço Fígado
Aorta
%
%
Colesterol Livre
Colesterol esterificado
B
54
6. DISCUSSÃO
55
6. DISCUSSÃO
Para elucidar os processos envolvidos na aterogênese e metabolismo
lipídico, coelhos alimentados com uma dieta rica em colesterol ou semi-sintética
composta de caseína têm sido utilizados como modelo experimental da
aterosclerose. Estas dietas, conforme a percentagem de colesterol acrescido,
elevam a concentração sérica de colesterol, predominantemente pela maior
produção hepática de VLDL, provocando a formação de placas ateroscleróticas, que
variam sua constituição desde pré-lesões formadas por células espumosas e estrias
gordurosas até placas fibromusculares sujeitas à calcificação e eventos
tromboembolíticos (BOCAN et al., 1993; KOLODGIE et al., 1996).
A dieta rica em colesterol a 1% administrada por dois meses em coelhos tem
como característica principal a formação de células espumosas e o depósito lipídico,
com pequena migração e proliferação de células musculares na íntima arterial
(BOCAN et al., 1993; FINKING; HANKE, 1997). No presente estudo, a dieta rica em
colesterol a 1% administrada por 8 semanas foi suficiente para produzir
hiperlipidemia e, consequentemente, formação de lesão aterosclerótica nos 3
segmentos arteriais analisados. A dieta não foi tóxica aos animais durante o período
experimental uma vez que estes não apresentaram perda ponderal.
Estudos relatam que o arco aórtico é o segmento arterial que desenvolve
espontânea e predominantemente lesões ateroscleróticas (FINKING; HANKE, 1997;
MOGHADASIAN, 2002), entretanto, em nosso estudo, não observamos diferenças na
percentagem de lesão aterosclerótica entre o arco aórtico, a aorta torácica e a aorta
56
abdominal avaliados microscopicamente. Por outro lado, a correlação positiva entre o
consumo de ração rica em colesterol e a percentagem de lesão aterosclerótica
somente no arco aórtico sugere maior susceptibilidade deste segmento à indução de
aterosclerose.
Alguns estudos têm relacionado as diferenças entre as duas formas de
colesterol, a livre e a esterificada, e suas implicações quanto ao depósito e/ou
captação destes lípides na parede arterial (REDGRAVE; WEST, 1972; STENDER et
al., 1978; STENDER et al., 1979; STENDER, 1982; KRUTH, 1985; ARAGANE et al,
2001). O CE, localizado no núcleo da estrutura da partícula de lipoproteína, reflete a
captação da lipoproteína e, portanto, foi utilizado como marcador da remoção da
LDE pelos receptores de LDL das membranas celulares.
Em nosso estudo a cinética plasmática, tanto do CL quanto do CE da LDE, é
mais lenta em coelhos que consumiram a dieta rica em colesterol. Nestes animais, a
dieta induz a produção hepática de lipoproteínas anormais ricas em colesterol e com
densidade semelhante às partículas de VLDL, as -VLDL e, consequentemente,
provoca alterações nas lipoproteínas plasmáticas que se elevam na circulação
(GUDMUNDESEN et al., 1993). Somado a isto, os coelhos são animais
naturalmente deficientes em LH e a hipercolesterolemia, induzida por dieta, promove
a saturação da atividade da LH com prejuízo na remoção plasmática das
lipoproteínas (CHANG; BORENSZTAJN, 1993). Estes estudos sugerem que os
nossos resultados sejam decorrentes tanto da competição da LDE com as
lipoproteínas naturais, que estão aumentadas neste grupo, quanto de prejuízos na
sua remoção plasmática. No entanto, a correlação negativa entre as concentrações
séricas de CT e TG e a TFR da LDE encontrada no grupo submetido à indução de
57
aterosclerose, reforça a hipótese de que a remoção lenta da LDE seja resultado da
competição entre a LDE e as lipoproteínas naturais.
Meijer et al. (1993) demostraram que coelhos com hipercolesterolemia
moderada ou severa induzida por dieta rica em colesterol tendem a aumentar a
atividade da PLTP, favorecendo a transferência de colesterol entre as lipoproteínas.
O CL pode se dissociar da LDL e se depositar nas células ou ser transferido para
outras lipoproteínas por colisão, difusão passiva e por estímulo da PLTP e ser
captado pelos hepatócitos (O’BRIEN et al., 2003). Já o CE, por sua característica
hidrofóbica, necessita obrigatoriamente de proteínas de transferência especializadas
para se deslocar entre as lipoproteínas (GARRET; GRISHAM, 1995). No presente
estudo, encontramos maior TFR e captação hepática do CL quando comparado ao
CE no grupo submetido à indução de aterosclerose. Isso sugere que o CL da LDE
está se dissociando da partícula e se deslocando para outras lipoproteínas.
Enquanto o CE, localizado somente na LDE, e o CL localizado nas lipoproteínas
naturais e na LDE, são captados pelos receptores de LDL, parte do CL pode se
dissociar e também ser captado por difusão passiva pelas células hepáticas.
Neste estudo verificamos que a captação hepática da LDE diminuiu após o
consumo da dieta rica em colesterol. Nenseter et al. (1988) estudaram a captação
das partículas de LDL pelos hepatócitos e verificaram que o consumo da dieta rica
em colesterol reduz a captação hepática da LDL dependente de receptores B/E. Em
coelhos, a dieta rica em colesterol promove uma diminuição em torno de 50% da
capacidade das partículas de β-VLDL se ligarem aos receptores de LDL da
membrana dos hepatócitos (LOOSE-MITCHELL et al., 1991), e por conseguinte,
menor captação do colesterol dessas lipoproteínas pelo fígado (CHANG;
BORENSZTAJN, 1993). Com isso a diminuição da expressão hepática dos
58
receptores de LDL e/ou sua saturação, somado a competição da LDE com as
lipoproteínas naturais e saturação da atividade da LH, poderiam explicar a menor
TFR e captação de CL e CE que observamos nos animais submetidos à indução de
aterosclerose.
No presente estudo, a captação de CE da LDE pelo arco aórtico foi maior do
que a de CL no grupo submetido à indução de aterosclerose. Em coelhos, também
foi observado acúmulo de CE em áreas com lesões ateroscleróticas, mesmo quando
induzidas mecanicamente (BONDJERS; BJÖRKERUD,1973). Ao contrário, alguns
estudos relatam maior concentração de CL do que de CE em aorta de coelhos
submetidos à indução de aterosclerose (STENDER et al., 1978; KRUTH, 1985). No
entanto, este excesso de CL presente na aorta pode ser explicado pelo aumento da
hidrólise de CE que foi captado como parte da lipoproteína (STENDER et al., 1979 ;
STENDER, 1982).
Como citado anteriormente, em coelhos, o arco aórtico é o segmento arterial
que desenvolve inicial e predominantemente lesões ateroscleróticas. No grupo
submetido à indução de aterosclerose, verificamos que a captação tanto de CL
quanto de CE é maior pelo arco aórtico do que pelas aortas torácica e abdominal.
Esses mesmos resultados foram observados por Aragane et al. (2001).
As lipoproteínas, como LDL, LDL pequenas e densas e remanescentes de
VLDL, quando elevadas na circulação podem provocar lesões no endotélio vascular
que facilitam a penetração dessas partículas na íntima arterial. No espaço endotelial,
as lipoproteínas podem sofrer oxidação por radicais livres e daí serem fagocitadas
pelos macrófagos (CHOY et al., 2004; ZIPES et al., 2005). Em coelhos, no estágio
inicial da aterogênese induzida por dieta rica em colesterol, as células endoteliais já
expressam em sua superfície moléculas de adesão, como a P-selectina e a VCAM-
59
1, responsáveis pelo recrutamento de monócitos e linfócitosT (SAKAI et al., 1997; LI
et al., 1993). Os monócitos migram para os sítios de lesão endotelial, penetram na
íntima e se diferenciam em macrófagos. Estes fagocitam as lipoproteínas
modificadas pelos receptores “scavenger” e formam as células espumosas (CHOY et
al., 2004). Em lesões ateroscleróticas de coelhos, há aumento na expressão dos
receptores “scavenger”, assim como dos receptores de VLDL, enquanto os
receptores de LDL, regulados pelo colesterol intracelular disponível, têm sua
expressão diminuída (HILTUNEN et al., 1998
B
). Em nosso estudo, como citado
anteriormente, a captação da LDE pelo fígado diminuiu com a administração da
dieta rica em colesterol provavelmente pela redução na expressão de receptores
B/E. Contudo, não encontramos diferenças na captação da LDE pelo arco aórtico
quando comparamos o grupo controle com o grupo submetido à indução de
aterosclerose. Neste caso podemos sugerir que a cinética plasmática da LDE mais
lenta no grupo submetido à indução de aterosclerose aumenta a susceptibilidade da
LDE a sofrer modificações, o que facilitaria a captação da LDE pelos receptores
“scavenger”.
Assim como o fígado, no grupo controle, as adrenais apresentaram maior
captação de CL e CE em relação a maioria dos órgãos analisados.
Preferencialmente, o colesterol esterificado da HDL é captado pelas células através
de um receptor específico, o SR-BI, localizados em diversos tecidos, principalmente,
os esteroidogênicos, como gônadas e adrenais (AZHAR et al., 2003; CONNELY;
WILLIAMS, 2003). Estes órgãos utilizam o colesterol como substrato para síntese
de hormônios esteróides e, portanto, precisam captar, de modo contínuo, o
colesterol. Este fato pode explicar a correlação positiva encontrada entre a TFR da
LDE e sua captação pelas adrenais.
60
Outro órgão importante na captação do colesterol foi o pulmão. Neste órgão
os lípides provenientes das lipoproteínas são utilizados para produção da substância
surfactante, que tem como função revestir o alvéolo e manter a função pulmonar
normal (POELMA et al., 2003). No grupo controle, a captação pulmonar de CL foi
maior quando comparado ao CE, provavelmente pelo CL ser fonte para formação de
ésteres de colesterol na síntese da substância surfactante (GUTHMANN et al.,
1997).
No estudo “in vitro” da captação da LDE por células endoteliais aórticas de
coelhos, observamos que quanto maior a massa de LDE incubada maior a captação
de CE pelas células, indicando que as partículas de LDE sejam removidas pelos
receptores de LDL presentes nestas células. Entretanto, este mesmo fenômeno não
foi observado em relação a captação do CL da LDE pelas células. Contudo, quando
comparamos a captação das duas formas de colesterol por estas células,
verificamos que a captação de CL foi maior do que a de CE independente da massa
de LDE incubada. Isso indica que o CL é captado pelos mesmos receptores que
captaram o CE e, além disso, esteja se dissociando da LDE e se depositado nestas
células por uma via independente, que pode ser por difusão passiva e/ou por
interação entre a LDE e as membranas celulares.
No estudo realizado em ratos, não verificamos diferenças entre a captação
das duas formas de colesterol da LDE pela aorta no grupo controle. Entretanto,
quando os ratos foram tratados com diazepam, houve maior captação arterial de CL
do que de CE da LDE. Em diferentes espécies animais, o diazepam foi capaz de
inibir a atividade da LCAT (WONG et al., 1992), e a atividade da ACAT, “in vitro”
(BELL, 1984). Aragane et al. (2001) observaram que o tratamento com F-1394, outro
inibidor da ACAT, levou a diminuição da concentração de CE no arco aórtico de
61
coelhos submetidos à indução de aterosclerose. Em macrófagos peritoneais de
camundongos, a incubação do inibidor de ACAT, U18666A, provocou o acúmulo de
CL e a formação de cristais de colesterol (KELLNER-WEIBEL et al., 1998). Dessa
forma, talvez a diferença na captação entre o CL e CE no grupo tratado com
diazepam seja efeito da diminuição da atividade da LCAT e ACAT. Como
conseqüência da diminuição da esterificação do colesterol, o colesterol se encontra
em sua forma mais instável, a livre, que pode se dissociar facilmente das
lipoproteínas e se depositar na parede arterial.
Em estudos anteriores em nosso laboratório, foi observado que pacientes
portadores de DAC apresentam distúrbio no metabolismo do CL e CE da LDE, nos
quais o CL foi removido mais rapidamente da circulação sangüínea (SANTOS et al.,
2003; COUTO et al.; 2007). Esses resultados somados aos achados do presente
estudo sugerem que o aumento nas concentrações de lipoproteínas aterogênicas,
como a LDL, ou distúrbios no processo de estabilização do colesterol, favorecem a
dissociação entre o CL e o CE dessas partículas, e podem elevar o risco de
desenvolvimento da aterosclerose, assim como agravar o processo de aterogênese.
62
7. CONCLUSÕES
63
7. CONCLUSÕES
- Em coelhos, a hiperlipidemia e a aterosclerose promoveram alteração no
metabolismo do colesterol da LDE. A remoção mais lenta da LDE pode tornar as
partículas mais susceptíveis a modificações, assim como, facilitar a dissociação do
CL da partícula.
- Em estudo “in vitro” com células endoteliais aórticas de coelhos, o CL
também apresentou comportamento diferente do CE da LDE, sendo mais facilmente
captado por estas células.
- A inibição da esterificação do colesterol, mediada pela inibição da LCAT e
ACAT pelo tratamento com diazepam, acarretou no aumento da captação de CL
pelos tecidos.
A hiperlipidemia ou distúrbios no processo de estabilização do colesterol,
pode favorecer a dissociação entre o CL e o CE dessas partículas, e elevar o risco
de desenvolvimento da aterosclerose, assim como agravar o processo de
aterogênese.
64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
65
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