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Fernanda Nunes Santos
Imunoterapia contra a leishmaniose visceral
experimental canina com a vacina
Leishmune® enriquecida de saponina
Dissertação de Mestrado apresentada ao
programa de pós-graduação em Ciências
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia
“Prof. Paulo de Góes” da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte de
requisitos necessários à obtenção do título
de Mestre em Ciências (microbiologia).
Orientadora: Prof
a.
Clarisa B. Palatnik
de Sousa.
Rio de Janeiro
2007
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Ficha Catalográfica
Santos, F
ernanda
N
unes
Imunoterapia contra a l
eishmaniose visceral experimental canina com a vacina Leishmune®
enriquecida de saponina/ Fernanda Nunes Santos. – Rio de Janeiro: UFRJ/IMPPG, 2007.
xii, 181 fl Il.; 31 cm.
Orientadora: Clarisa B. Palatnik de Sousa
Dissertação (mestrado) – UFRJ/IMPPG/2007
Referências Bibliográficas: F. 61-79
1-Imunoterapia 2- Leishmaniose Visceral Canina 3- Vacina FML
I. Palatnik de Sousa, CB. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia
“Prof. Paulo de Góes”. III. Título
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Trabalho realizado no Laboratório de
Biologia e Bioquímica de Leishmania,
Departamento de Microbiologia Geral do
Instituto de Microbiologia “Prof. Paulo de
Góes” da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, sob a orientação da Prof
a.
Clarisa B.
Palatnik de Sousa.
Dedico este trabalho aos meus pais
e familiares
Agradecimentos
A Deus pelo dom da vida e pela presença em todos os momentos durante esta
caminhada.
Aos meus pais Graça e André, pelo apoio incondicional em todos os momentos da
minha vida. Por ter me dado a oportunidade de poder escolher meus próprios
caminhos. Pelos exemplos de caráter, honestidade compreensão e amor.
Ao meu irmão André e a minha avó Alda, pelos momentos de descontração
durante as madrugadas de estudo.
Ao meu noivo Antonio, pelo respeito e principalmente pelo apoio, durante todos os
anos em que estamos juntos.
Aos meus familiares, por entender todos os momentos de ausência
À Professora Clarisa, pela oportunidade, incentivo, confiança e pela orientação em
todos os trabalhos realizados durante o período de aperfeiçoamento e durante o
período de tese.
À Dirlei, por estar sempre comigo, desde o início. Por ter se tornado a amiga, que
pude contar em todos os momentos.
À Gulnara, por sempre ter sido compreensiva e por ter dividido comigo seus
conhecimentos e experiências. Pelos momentos de diversão durante as noites de
trabalho no laboratório e durante as viagens.
À Luciere, pela ajuda em todos os momentos de dificuldade, pela amizade, pelos
conselhos e pelos momentos divertidos.
À Luciana, pela amizade, respeito e companheirismo.
À Flavia, pela amizade e atenção.
Ao Sr Luiz, Sr Nivaldo e Carlos, pela atenção, ajuda e compreensão.
A todas as pessoas que passaram pelo laboratório e a todos os amigos que
ainda estão, que tive o prazer de conhecer. Vocês sem dúvida fazem parte da
minha vida e agradeço por termos sido mais que colegas de trabalho.
A todos os laboratórios do CCS, colegas e funcionários pela ajuda sempre que
necessário.
Ao Instituto de Microbiologia “Prof. Paulo de Góes” da UFRJ, na pessoa de sua
Diretora professora Agnes Marie de Sá Figueiredo.
Aos professores do curso de pós-graduação, na pessoa da coordenadora
professora Thaís Souto-Padrón.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), a
Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao programa
RHAE-CNPQ (Programa de Recursos humanos em áreas Estratégicas), ao
programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) e ao Programa Cientista do
Nosso Estado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo
auxílio à pesquisa e pelas bolsas dispensadas durante a realização deste trabalho.
Resumo
A fim de avaliar o potencial imunoterapêutico na leishmaniose visceral canina com a
vacina Leishmune®, formulada com um aumento na concentração de adjuvante (1 mg de
saponina ao invés de 0,5 mg), 24 cães sem raça definida foram infectados com Leishmania
(L.) chagasi. A vacina Leishmune® enriquecida foi injetada no mês 6, 7 e 8 após a
infecção, quando os animais eram soropositivos e assintomáticos. O grupo controle recebeu
somente solução salina. Os cães tratados com Leishmune® mostraram um aumento
significativo dos níveis de anticorpos IgG anti-FML (ANOVA; p<0.0001), respostas altas e
estáveis de IgG2 e diminuição de IgG1, mostrando uma resposta imune celular mediada por
TH1. A vacina demonstrou os seguintes efeitos: reações mais positivas de intradermoreação
contra o lisado de Leishmania nos cães vacinados (75%) que nos animais controles (50%),
uma diminuição da média de linfócitos Leishmania-específicos in vitro no grupo tratado
com salina (32,13), mostrando que a média de linfócitos CD4 + dos animais vacinados
(46,87%) cai fora do intervalo de confiança de 95% dos animais tratados com salina (IC
95% 21,53-42,73) e um aumento na média dos escores clínicos no grupo tratado com salina
em relação aos vacinados (17,83%) que cai fora do intervalo de confiança de 95% dos
animais tratados com Leishmune® (IC 95% 13,97-17,53). Todos os animais que receberam
vacina apresentaram-se agrupados e mostraram um baixo escore clínico e proporções
normais de CD4+, enquanto 42% dos animais tratados somente com salina demonstraram
proporções de CD4+ diminuídas e escores clínicos altos. O aumento nos sinais clínicos nos
animais tratados com salina apresentou correlação com aumento de anticorpos anti-FML
(p<0.0001), evidências parasitológicas (p=0,038) e diminuição das proporções de linfócitos
CD4+ Leishmania específicos (p=0,035). Estes resultados confirmam o potencial
imunoterapêutico da vacina Leishmune® enriquecida. A vacina reduziu os sinais clínicos,
evidências parasitológicas, modulando o resultado da infecção e o potencial infectivo para
os flebótomos. A vacina Leishmune® enriquecida foi submetida à análise de segurança,
sendo demonstrado tolerabilidade e segurança.
Summary
In order to assess the immunotherapeutic potential on canine visceral leishmaniasis of the
Leishmune®-vaccine, formulated with an increased adjuvant concentration (1mg of
saponin rather than 0.5mg), 24 mongrel dogs were infected with Leishmania (L.) chagasi.
The enriched-Leishmune® vaccine was injected on month 6, 7 and 8 after infection, when
animals were seropositive and asymptomatic. The control group were injected with a saline
solution. Leishmune®–treated dogs showed significantly higher levels of anti-FML IgG
antibodies (ANOVA; p<0.0001), a higher and stable IgG2 and a decreasing IgG1 response,
pointing to a TH1 T cell mediated response. The vaccine had the following effects: it led to
more positive delayed type hypersensitivity reactions against Leishmania lysate in
vaccinated dogs (75%) than in controls (50%), to a decreased average of CD4+ in vitro
Leishmania-specific lymphocytes in saline controls (32.13%), showed that the average of
CD4+ vaccinees dogs (46,87%) falls outside the 95% confidence interval for the saline
controls (CI 95% 21.53-42.73) and an increased average of the clinical scores from the
saline controls (17.83) that falls outside the 95% confidence interval for the Leishmune®
immunotherapy-treated dogs (CI 95% 13.97-17.53). All dogs that received the vaccine
were clustered, and showed lower clinical scores and normal CD4+ counts, whereas 42% of
the untreated dogs showed very diminished CD4+ and higher clinical score. The increase in
clinical signs of the saline treated group was correlated with an increase in anti-FML
antibodies (p<0.0001), the parasitological evidence (p= 0.038) and a decrease in
Leishmania-specific CD4+ lymphocyte proportions (p=0.035). These results confirm the
immunotherapeutic potential of the enriched-Leishmune® vaccine. The vaccine reduced
the clinical symptoms and evidence of parasite, modulating the outcome of the infection
and the dog’s potential infecciosity to phlebotomines. The enriched Leishmune® vaccine
was subjected to a safety analysis and found to be well tolerated and safe.
Lista de abreviaturas
APC - células apresentadoras de antígeno
BCG – bacilo Calmette-Guérin
BSA – albumina de soro bovina
BHI – infusão de cérebro e coração
CCZ – Centro de controle de zoonoses
DNA – ácido desoxirribonucléico
ELISA - ensaio imunoenzimático
Ev – endovenosa
Fab – fragmento fab de imunoglobulina
FITC – isotiocianato de fluresceína
FDSA – Fort Dodge Saúde Animal
FML – ligante de fucose e manose
Ic – intra-cardíaca
Id – intra-dérmica
IDR –intradermorreação
Ig - imunoglobulina
IFN-γ – interferon γ
IL – interleucina
kDa- quilodalton
LACK – proteína homóloga ao receptor de cinase C
LD1S – Leishmania donovani cepa 1S-Sudão
LdNH – Leishmania donovani nucleosídeo hidrolase
LV – Leishmaniose visceral
LVC - leishmaniose visceral canina
MHC – complexo maior de histocompatibilidade
NH – nucleosídeo hidrolase
OPD - Orto fenileno diamina
PBS – solução tampão de fosfato
PCR – reação de polimerase em cadeia
QuilA – saponinas de Quillaja saponaria molina
QS – Quillaja saponaria
RIFI - imunofluorescência indireta
Sc – subcutânea
SRD - sem raça definida
TH1 - linfócito T helper1
TH2 – linfócito t helper 2
TNFα - fator de necrose tumoral α
ÍNDICE
Página
Agradecimentos iv
Resumo vi
Summary vii
Lista de Abreviaturas viii
1-Introdução 1
1.1- Histórico das leishmanioses 1
1.2- Leishmaniose visceral 1
1.3- Ciclo do parasita 2
1.4- Epidemiologia das Leishmanioses 3
1.5- Clínica leishmaniose visceral canina 4
1.6- Imunologia da leishmaniose visceral canina 6
1.7- Controle da leishmaniose visceral 10
1.8- Vacinação contra as leishmanioses 13
1.8.1- Antígeno FML 17
1.8.2- A vacina FML contra a leishmaniose visceral canina 19
1.8.3- Vacinação imunoterápica contra as leishmanioses 22
2- Objetivos 26
3- Material e Métodos 27
3.1- Imunoterapia contra a leishmaniose visceral experimental canina com a vacina
Leishmune® enriquecida de saponina. 27
3.2- Análise de segurança da vacina Leishmune® enriquecida de saponina 28
3.3- Obtenção do antígeno FML de L.(L.) donovani (LD1S) 29
3.3.1- Manutenção de amostras de L. (L. )donovani (LD1S) in vitro 29
3.3.2- Obtenção de massa de células para extração do FML 29
3.3.3- Extração e purificação do complexo glicoprotéico FML de promastigotas de L. (L.)
donovani 30
3.4- Ensaio de FML-ELISA 30
3.5- Obtenção de amastigotas de L. (L.) chagasi 31
3.6- Resposta Intradermorreação (IDR) contra o lisado de promastigotas 32
3.7- Citometria de fluxo em células mononuclerares de sangue periférico 32
3.8- Avaliação da presença de parasitos 34
3.8.1- Cultura in vitro em meio NNN bifásico 34
3.8.2- Cultura in vivo em hamsters CB 34
3.8.3- Pesquisa de parasitos nos linfonodos, baço e fígado de cães 35
3.8.4- Reação de Polimerase em cadeia (PCR) para DNA de Leishmania 35
3.9- Análise estatística 35
4- Resultados 37
4.1- Avaliação de Anticorpos anti-FML 37
4.2- Avaliação da Resposta imune celular 38
4.3- Avaliação dos Sinais Clínicos 39
4.4- Avaliação das Evidências Parasitológicas 41
4.5- Análise de segurança da vacina Leishmune® enriquecida com 1mg de saponina 42
5- Discussão 51
6- Conclusões 61
7- Referências Bibliográficas 62
8- Anexos 81
1- Introdução
1.1- Histórico das Leishmanioses
As leishmanias foram observados primeiramente por David D. Cuningham em 1885
e Peter Borovsky em 1898 (revisado por Martiny & Vannier-Santos, 2005), sendo a
descrição do gênero feita por Ross, na Índia em 1903, através de biópsias de baço
realizadas por Donovan e Leishman, em pacientes humanos que apresentavam quadros
clínicos semelhantes a malária. Os parasitos apresentavam porém, dois corpúsculos de
DNA corados pelo corante de Giemsa, o que permitiu que o novo gênero fosse descrito.
(Ross, 1903). Em 1908 foi documentada por primeira vez, na Tunísia, por Nicolle e Comte,
a leishmaniose visceral canina (LVC) (Moreira Jr et al., 2004).
1.2- Leishmaniose visceral
A leishmaniose visceral humana conhecida na Índia como calazar (peste negra), é
causada por protozoários intracelulares da ordem Kinetoplastida, família
Trypanosomatidae, gênero Leishmania. É uma doença importante, disseminada por áreas
tropicais e subtropicais do mundo (Almeida et al., 2003).
A sintomatologia humana é variável, podendo ocorrer desde casos assintomáticos
até o calazar clássico que se caracteriza por emagrecimento progressivo, caquexia, febre
intermitente, mal estar, anemia, hepatoesplenomegalia, linfoadenopatia generalizada,
anasarca, hipergamaglobulinemia e progressiva imunossupressão celular (Handman, 2001).
O calazar na Índia apresenta características de antropozoonose, atacando adultos e
provocando a forma visceral e a leishmaniose dérmica pós-calazar. Na Europa e nas
Américas, a doença tem características zoonóticas, provocando a forma visceral em
crianças (Murray et al., 2000; Neves, 2002).
No velho mundo (Ásia, Europa, África), a leishmaniose visceral humana é causada
por L. (L.) donovani (Índia e África) e por L. (L.) infantum (Mediterrâneo, Oriente Médio e
África); enquanto no novo mundo (Américas) é causada por L. (L.) chagasi, que
recentemente, foi considerada idêntica a L. (L.) infantum (Awasthi et al., 2004; Gomes et
al., 2006).
1.3- Ciclo do parasito
O parasito pode apresentar-se de duas formas diferentes durante o seu ciclo de vida:
a promastigota ou forma extracelular, flagelada presente no vetor invertebrado e a
amastigota, a forma intracelular sem flagelo livre, presente em células do sistema fagocítico
mononuclear do hospedeiro vertebrado (Almeida et al., 2003). O ciclo biológico tem início
quando o vetor invertebrado se infecta durante a alimentação em indivíduo ou reservatório
infectado. Junto ao sangue, ingere macrófagos infectados com os amastigotas, que serão
liberados no estômago do vetor, onde se aderem se multiplicando até se transformarem em
promastigotas, que migram pelo trato digestivo do inseto, multiplicando-se por divisão
binária, tornando-se formas infectivas de 8 a 20 dias após o repasto (Desjeux, 2004). As
formas metacíclicas migram para região anterior do inseto e quando ocorrer a alimentação,
serão transferidas juntamente com a saliva, que protege o parasito do sistema imunológico
do hospedeiro. No hospedeiro vertebrado, os promastigotas, invadem os macrófagos e se
transformam em amastigotas, multiplicando-se e rompendo essas células para invadir
outras, espalhando-se assim pelo organismo do hospedeiro vertebrado (Awasthi et al.,
2004).
A Leishmaniose visceral (LV) é transmitida através da picada da fêmea do vetor das
espécies Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia evansi, nas Américas e do gênero Phlebotomus
das espécies P. perniciosus, P. ariasi, P. neglectus no velho mundo (Almeida et al., 2003;
Gomes et al., 2006). Diversos podem ser os hospedeiros vertebrados da leishmaniose
visceral. Na Índia e no Sudão, a doença, que é causada pela L. (L.) donovani é uma
antropozoonose, transmitida de humano para humano, sendo estes especialmente infectivos
em decorrência do calazar pós-dérmico, que normalmente ocorre após a cura da doença
pelo tratamento, os parasitas podem ser normalmente encontrados na pele dos pacientes, o
que sugere a infecciosidade para o vetor (Zijlstra & El-Hassan, 2001; Desjeux, 2004;
Rotureau, 2006). No Mediterrâneo e nas Américas, a doença que é causada pela L. (L.)
infantum / L. (L.) chagasi é uma zoonose de canídeos (leishmaniose visceral zoonótica).
Nos ambientes domésticos o cão apresenta-se como reservatório, já nos ambientes
silvestres, canídeos silvestres como raposas e chacais servem de reservatório (Gramiccia &
Gradoni, 2005).
Ocasionalmente pode ocorrer a transmissão da LV por meios que não envolvam o
vetor artrópode, diretamente por meio de transfusão sanguínea (Palatnik de Sousa et al.,
1996), transplantes ou por via transplacentária (Moreira Jr et al., 2004). Em cães já está
provada a transmissão via transfusão, prática cada vez mais freqüente na clínica veterinária,
principalmente pela falta de monitoramento de doadores (Freitas et al., 2006).
1.4- Epidemiologia das leishmanioses
As leishmanioses são endêmicas em 88 países, existindo 350 milhões de pessoas em
risco de contaminação. São estimados 2 milhões de casos novos ao ano e 12 milhões de
pessoas infectadas (WHO, 2006). Desses 2 milhões, 0,5 milhões de casos novos anuais
correspondem à leishmaniose visceral. A LV causa no mundo 59.000 mortes ao ano, o que
somente é superado, entre as doenças parasitárias, pelas estatísticas da malária (Alvar et al.,
2006). Atinge regiões da África, Índia, Américas (Central e Sul), Europa e Oriente Médio
(Handman, 2001). Em regiões mais pobres, países em desenvolvimento, como Bangladesh,
Afeganistão, Iran, Argélia, Arábia Saudita, Sudão, Bihar, Brasil e Peru, estão concentrados
90% dos casos registrados no mundo. Dentro desse contexto Bihar, na Índia, apresenta a
maioria dos casos (Alvar et al., 2006). A mortalidade em casos humanos não tratados é de
98% (Tesh, 1995) e a mortalidade em casos tratados pode atingir até 10% (Schmunis &
López Antuñano, 1997).
No Brasil, a doença apresentava caráter rural. Em 1995, dos 3.783 casos de
leishmaniose visceral registrados no Brasil, 3.417 foram notificados no Nordeste (NE), o
que representou 90% da notificação nacional (MS-SINAN, 2003). Nos últimos dez anos,
com a urbanização crescente, construção de estradas e migração da população, a doença
vem mudando seu perfil para o de caráter urbano e peri-urbano. Em 2003, registram-se
3.279 casos, 64% deles na região Nordeste, 14,1% na região Norte, 8,2% na região Centro-
Oeste e 13,6% na região Sudeste estando destacados os estados de Minas Gerais, São
Paulo, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, considerados novas áreas endêmicas e
epidêmicas (MS-SINAN, 2003). Dados de 2005 (MS-SINAN, 2007) revelam 3.727 casos
humanos no Brasil.
A LV é o melhor exemplo de doença natural focalizada (revisado por Rotureau,
2006), pois o ciclo entre raposas e canídeos silvestres é mantido por flebotomíneos
silvestres de forma equilibrada. As raposas são muito importantes na disseminação da
doença para ambientes domésticos e peri-domésticos, por serem animais de comportamento
migratório constante. Devido a sua necessidade de conseguir alimento chegam até as
proximidades dos ambientes domésticos, onde acabam por servir de fonte de infecção para
os flebótomos que transmitirão os parasitos para os cães. Os cães por sua vez, servirão de
reservatório doméstico, infectando o homem (Neves, 2002).
Essa adaptação e passagem de doença rural para urbana, associados a fatores de
risco como: status imunológico (doenças imunossupressoras, alimentação inadequada) e
tratamentos ineficientes, causando resistência dos parasitos (Dujardin, 2005), tornam a LV
uma doença de caráter emergente e um problema constante de saúde pública. Essa mudança
ocorreu devido à variabilidade genética de vetores e hospedeiros envolvidos. Algumas
espécies de flebotomíneos, não específicos para LV, porém muito presentes nas Américas,
L. (L.) shannoni e L. (L.) youngi, podem se infectar e transmitir o parasito, quando existe a
disponibilidade de reservatórios infectados, transformando áreas não afetadas em
endêmicas (Travi et al., 2002; Gramiccia & Gradoni, 2005).
1.5- Clínica da leishmaniose visceral canina
Os cães infectados podem apresentar diversas sintomatologias desde mais leves até
mais graves, como podem apresentar também ausência de sintomas (revisado por Lima et
al., 2004). Desta forma os cães infectados podem ser classificados como: assintomáticos
(ausência de sintomas), oligossintomáticos (os cães apresentam de 1 a 2 sintomas) e
sintomáticos (apresentam acima de 3 sintomas) (Abranches et al., 1991). Recentemente os
cães sintomáticos tem sido confirmados como os mais infecciosos para flebótomos (Travi
et al., 2001; Courtenay et al., 2002). Cães infectados com L. (L.) infantum, que apresentam
quadro assintomático, resistem por longos períodos ou desenvolvem poucos sintomas
podendo se curar espontaneamente (Scalone et al., 2002), entretanto os casos de cães
sintomáticos ou assintomáticos podem culminar na morte dos cães afetados (Reis et al.,
2006a). O período de incubação da doença canina é muito variável, podendo ocorrer de
meses até anos após a infecção (revisado por Baneth & Aroch, 2007). Recentemente
estimou-se que a soroconversão ocorre em media após 94 dias de infecção (Courtenay et
al., 2002) deixando um período latente entre infecção e infecciosidade de 199 dias
(Quinnell et al., 1997).
Os principais sinais presentes em cães doentes podem ser inespecíficos como febre
por longos períodos, ou sinais clássicos e graves como a progressiva perda de peso até a
caquexia. Lesões dermatológicas são as mais comuns manifestações descritas e incluem
desde perda de pêlos localizada até generalizada e presença de úlceras de pele. Podem ser
detectadas também: onicogrifose; lesões oculares como conjuntivite, ceratites e blefarites;
glomerulonefrite devido ao depósito de complexos imunes; hepatite crônica devido à
multiplicação de amastigotas em macrófagos com aumento do órgão, formação de
granulomas em fígado e baço (Almeida et al., 2005b; Barrourim-Melo et al., 2006);
linfoadenomegalia generalizada, observada clinicamente em linfonodos cervicais, poplíteos
e esplenomegalia (Lima et al., 2004).
As alterações hematológicas e bioquímicas incluem, anemia normocítica e
normocrômica, aumento de proteínas totais no soro com hipergamaglobulinemia e
hipoalbuminemia e diminuição da taxa albumina / globulina (Almeida et al., 2005b;
revisado por Reis et al., 2006a). As alterações observadas em urianálise e bioquímica, estão
diretamente relacionadas a anormalidades de rins e fígado (Ikeda-Garcia et al., 2006).
Formas atípicas de LVC são descritas como de difícil diagnóstico, principalmente
quando ocorrem em áreas não endêmicas, estas manifestações incluem: poliartrites,
osteoartrites com presença de granuloma na musculatura; mucosa da região oral
apresentando úlceras e nódulos, principalmente na área da língua; lesões de pele com
aspecto fibrótico, todas as lesões descritas apresentam parasitos (amastigotas) em seu
interior; lesões em sistema cardiovascular como fibroses, pericardites, trombolembolia;
danos renais isolados (sem sintomatologia clássica anterior); lesões digestivas inflamatórias
ou hemorrágicas, diarréias geralmente com pancreatite associadas; sinais respiratórios,
como rinites, pneumonia intersticial e lesões neurológicas, com degeneração neuronal
(Blavier et al., 2001).
As co-infecções estão presentes em muitos casos (babesiose, erlichiose, parasitos
intestinais, dirofilariose, leptospirose) sendo relatadas como comuns, agravando ainda mais
o estado clínico do cão (Barrourim-Melo et al., 2006).
Lesões clínicas ocorrem principalmente em órgãos ricos em células do sistema
fagocítico mononuclear como fígado, rins, linfonodos, medula óssea, pele e trato
gastrintestinal, geralmente com inflamação crônica (Lima et al., 2004).
O status clínico parece, para alguns autores, não está correlacionado diretamente
com a infecciosidade (Alvar et al., 1994; Barrourim-Melo et al., 2006), porém um número
crescente de publicações defende uma correlação positiva entre o aumento de sinais
clínicos e de infecciosidade para o vetor (Santos et al., 2003; Nogueira et al., 2005;
Gamboa–León et al., 2006; da Costa-Val et al., 2007).
1.6- Imunologia da leishmaniose visceral canina
O cão é um excelente modelo experimental para a LV, pois além de ser reservatório
da doença em áreas endêmicas, apresenta um quadro de sintomas semelhante ao homem.
As interações parasito-hospedeiro e a resposta imune devem ser investigadas, para que se
possa entender melhor os mecanismos relacionados ao desenvolvimento da doença canina
visando a prevenção da doença humana (revisado por Moreno & Alvar, 2002).
Cães infectados, apresentam níveis aumentados de anticorpos, principalmente da
subclasse IgG, embora o aumento de imunoglobulinas, não esteja correlacionado a proteção
(Pinelli et al., 1994) e sim a sintomatologia (Courtenay et al., 2002; Nogueira et al., 2005).
Níveis altos de anticorpos IgG1 apresentam-se significativamente aumentados em cães
infectados, estando correlacionado com a gravidade da doença, enquanto a IgG2 pode ser
detectada em cães normais naturalmente resistentes a infecção, assintomáticos ou vacinados
(Deplazes et al., 1995; Nieto et al., 1999; Solano-Gallego et al., 2001; Mendes et al.,
2003). Também foi descrito, por Quinnell et al., (2003a), usando anticorpos monoclonais
específicos, que as taxas de IgG1 em cães infectados, estão muito aumentadas em relação a
IgG4, IgG3 e que a subclasse de IgG2 apresenta níveis menores. A resposta IgA, foi
encontrada em altos níveis em cães que sofrem da doença de forma aguda. A produção
dessa subclasse está relacionada ao intenso parasitismo nos diferentes tecidos, pois é
produzida quando o parasito se espalha por diferentes partes do corpo, inclusive mucosa. A
resposta de IgM, ocorreu de forma mais tardia, após aparecimento da resposta IgG,
demonstrando não ser bom marcador de fase aguda (Rodríguez-Cortés et al., 2007). A
gravidade da infecção por Leishmania evidenciada pela presença de DNA no sangue, está
correlacionada com o aumento de sinais clínicos e com os aumentados títulos de IgA e IgM
(Rodríguez-Cortés et al., 2007), IgG, IgG1, IgG2 (Rodríguez-Cortés et al., 2007; Nogueira
et al., 2005; Courtenay et al., 2002). Mais recentemente foi demonstrado presença de
resposta IgE em cães sintomáticos demonstrando a possível utilização como marcador ativo
da doença (Almeida et al., 2005 a; Iniesta et al., 2005).
Quando a resposta imune mediada por células está presente, o animal controla a
infecção ficando assintomático. A progressão da doença é determinada pela falta de desta
resposta (revisado por Moreno & Alvar, 2002). A resposta celular ativa é encontrada
também em animais vacinados (Borja-Cabrera et al., 2002). Em cães sintomáticos, essa
resposta celular é falha e está correlacionada a depressão de linfócitos CD4+, aumento dos
níveis de anticorpos, e deficiência de resposta co-estimulatória para ativação de célula T e
taxas diminuídas de IFN-γ (Pinelli. et al., 1999), tornando o cão infectivo e aumentando o
risco epidemiológico com a progressão da doença (revisado por Rosypal et al., 2005). De
acordo com Rodríguez-Córtes et al., (2007), a infecção está correlacionada com a presença
de linfócitos T-específicos não responsivos e resposta humoral não protetora que permitem
a disseminação dos parasitos. Em geral, uma diminuição da população de linfócitos CD4+
totais e/ou Leishmania–específicos é esperada na leishmaniose visceral canina avançada
(Bourdoiseau et al., 1997; Moreno et al., 1999; Guarga et al., 2000; Guarga et al., 2002;
Borja-Cabrera et al., 2004).
De forma semelhante ao observado em outros modelos experimentais, em cães
infectados, a resistência ou suscetibilidade apresentam-se criticamente dependentes da
resposta imune celular associada a TH1 e TH2, respectivamente (Pinelli et al., 1994). Cães
infectados, durante a doença ativa tendem a demonstrar dicotomia de TH1 e TH2, que
ainda não está clara (Chamizo et al., 2005).
Em cães assintomáticos ou resistentes, existe resposta ao antígeno de Leishmania na
proliferação de linfócitos e na IDR (intradermorreação), sem detecção de anticorpos. Em
contraste, animais sintomáticos mostraram altos títulos de anticorpos e ausência de resposta
proliferativa ou IDR. Níveis maiores de IL-2 e TNF-α foram detectados nos animais
assintomáticos (Pinelli et al., 1994). O mesmo grupo obteve clones de células T que
apresentavam mecanismos de lise de macrófagos infectados. Estas células eram em sua
maioria linfócitos CD8+ específicos, sendo também em alguns animais, esta função
realizada por linfócitos CD4+ (Pinelli et al, 1995). Outro mecanismo efetor envolvido na
resposta protetora contra LVC, é a ativação dos macrófagos por IFN-γ e TNF-α. Estes
macrófagos são capazes de matar amastigotas intracelulares através da via L-arginina óxido
nítrico (Vouldoukis et al., 1996). Pinelli et al., (2000) demonstraram in vitro a atividade
leishmanicida de sobrenadantes de célula T derivada de cão vacinado com antígeno solúvel
de Leishmania, contendo IFN-γ, TNF-α e IL-2, sobre macrófagos infectados. O efeito
leishmanicida ocorreu através do aumento da produção de óxido nítrico. Confirmando estes
resultados, Panaro et al., (2001) vacinaram cães com promastigotas de L. (L.) infantum
mortas e como resultado, 1 mês após vacinação, encontraram aumento na atividade
fagocítica, da produção de óxido nítrico e da capacidade de lisar células infectadas, que
persistiu até 5 meses pós-vacinação. Chamizo et al., (2005) demonstraram que cães
assintomáticos apresentam respostas mistas de células TH1 e TH2 com predomínio de
resposta protetora TH1, mediada por IL-12, IFN e IL-18. Essas citocinas são capazes de
ativar macrófagos e matar os parasitos, mantendo a infecção sob controle e evitando a
progressão da doença.
O estado clínico dos cães pode estar também correlacionado com a carga parasitária
na medula óssea (Reis et al., 2006b) que por sua vez está correlacionada com mudanças
fenotípicas dos leucócitos de sangue periféricos. Em cães com baixa carga parasitária e sem
sintomas, encontra-se um aumento periférico de linfócitos CD8+, as moléculas MHC-II e
os receptores CD45RA e CD45RB também apresentam-se aumentados em linfócitos
periféricos (Reis et al., 2006b). Esta é uma característica descrita em cães (Cobbold &
Metcalfe, 1994; Rabanal et al., 1995). Rabanal et al., (1995) descreveram utilizando
anticorpos monoclonais anti-MHC II, que estas moléculas são detectáveis em linfócitos T,
B, macrófagos, fibroblastos e células APC (apresentadoras de antígenos) e que os cães
podem expressar constitutivamente MHC II em linfócitos circulantes, o que se traduz numa
resposta imune mais vigorosa. Por outro lado cães sintomáticos demonstraram presença de
níveis diminuídos de expressão de MHC-II em linfócitos, o que torna o animal mais
vulnerável a doença (Reis et al., 2006 b).
Em cães sintomáticos, a suscetibilidade a doença parece estar envolvida com
resposta Th2 (Pinelli et al., 1994), o papel desta resposta na suscetibilidade e o
envolvimento das citocinas IL-4 e IL-10 ainda é controverso na progressão da doença
(Barbieri, 2006). A produção de IL-10 em cães foi detectada por Pinelli et al., (2000) em
células mononucleares de cães sintomáticos estimulados com Con A, porém estava ausente
na maioria dos animais testados por Santos Gomes et al., (2002). Conflitantemente, os
resultados de Chamizo et al., (2005) ainda relacionam a secreção de IL-10 e IL-4, com cães
assintomáticos. Por outro lado, de Lima et al., (2007) constataram um aumento na produção
de IL-6 em cães sintomáticos com doença ativa, não havendo correlação entre a produção
de IL-6 e produção de anticorpos anti-Leishmania, o que indica que a
hipergamaglobulinemia presente na doença ativa está associada à secreção de outras
citocinas.
Em cães sintomáticos a ocorrência da baixa frequência de células B e monócitos
circulantes é um importante marcador da doença severa e está associada a baixa taxa de
linfócitos CD8+, presença de parasitos na medula e status clínico (Reis et al., 2006 b).
Martinez-Moreno et al., (1995), descreveram hiperplasia de tecidos linfóides como
linfonodos, placas de Peyer e baço com aumento de plasmócitos, demonstrando a
ocorrência desse fenômeno em áreas de proliferação de células B, associado ao aumento de
anticorpos determinado por testes sorológicos. Reis et al., (2006 b) descreveram que a
migração das células B ocorre durante a doença ativa, e que a diferenciação dessas células
em plasmócitos ocorre devido a ativação policlonal, com grande produção de anticorpos
anti-Leishmania, ocorrendo com isso uma redução de células B CD21+ circulantes, que se
correlaciona com a migração dessa população celular para órgãos linfóides (Reis et al.,
2006b). A baixa taxa de monócitos circulantes é encontrada em animais sintomáticos com
alto grau de parasitismo, é evidenciada pela diminuição na taxa de CD14+ em cães nesta
condição, sugerindo que durante a doença aguda ocorre recrutamento dos monócitos por
órgãos linfóides para apresentação de antígenos e remoção de parasitos (Reis et al., 2006b).
A susceptibilidade da doença canina parece estar relacionada a polimorfismo de
fatores genéticos. Solano-Gallego et al., (2000) demonstraram que cães da raça Ibizian
Hound, que vivem em áreas endêmicas, apresentam resistência natural a LVC e raramente
apresentam a doença clínica. Recentemente foi caracterizada a presença do gene NRAMP1
em cães. Este gene codifica para síntese de proteína transportadora de íons importante no
controle da replicação intra-fagolisossomal de vários agentes etiológicos, entre eles a
Leishmania. Mutações neste gene caracterizam a suscetibilidade ou resistência à doença.
Foi detectada em cães que a presença de mutações nesses genes, culminam na
suscetibilidade a doença (Atlet et al., 2002). Quinnell et al., (2003b), descreveram a relação
entre os alelos DLA (DRB1, DQA1, DQB1) de MHC-II e o curso da infecção,
demonstrando que a presença do genótipo DLA-DRB1 em cães está associado a níveis
aumentados de IgG e presença de parasitos no PCR, confirmando o papel desse locus na
suscetibilidade da doença canina (Quinnell et al., 2003b).
1.7- Controle da leishmaniose visceral
O Brasil é o único país endêmico para leishmaniose visceral que desenvolve um
programa sistemático de controle epidemiológico e profilático desde 1980 (Palatnik de
Sousa et al., 2001). Os métodos de controle utilizados no Brasil são: tratamento de casos
humanos; eliminação de cães soropositivos; e controle de vetor em ambientes domésticos e
peri-domésticos, com a utilização de inseticidas de efeito residual (Tesh, 1995). O sacrifício
de cães infectados não é aceito na Europa (Dye, 1996), sendo uma técnica de eficácia
também discutida no Brasil (revisado por Palatnik de Sousa et al., 2001), tanto por razões
éticas, sociais, como pelo baixo impacto na redução da transmissão (Dye, 1996, Courtenay
et al., 2002, Gramiccia & Gradoni, 2005). O sacrifício de cães soropositivos é utilizado
ainda, devido ao fato da quimioterapia para cães não ser recomendada pela OMS, pelo
crescente número de casos de resistência aos quimioterápicos observados em humanos
(OMS, 1990).
A falta de eficácia do controle preconizado no Brasil se deve em parte à baixa
sensibilidade do teste diagnóstico por RIFI (Imunofluorescência indireta) realizada através
de eluatos que são coletados a partir de sangue periférico dos cães embebidos em papel de
filtro. É reconhecida a maior sensibilidade dos testes diagnósticos de ELISA sobre os de
RIFI (Ashford et al., 1998; Machado-Braga et al., 1998; Borja-Cabrera et al., 1999;
Scalone et al., 2002; Moreira et al., 2007) e do uso de soros em lugar de eluatos de sangue
(revisado por Palatnik de Sousa et al., 2001; Palatnik de Sousa et al., 2004b). As normas do
Ministério da Saúde no Brasil encontram-se em mudanças e recentemente, o método de
ELISA é utilizado como diagnóstico de triagem e a RIFI como diagnóstico confirmatório,
optando-se ainda, pelo uso de soros toda vez que a sua colheita e transporte for possível
(MS-SINAN, 2003).
O tempo prolongado entre o diagnóstico e a remoção do cão infectado, a dificuldade
de coleta do maior número possível de amostras caninas (Palatnik de Sousa et al., 2001;
Courtenay et al., 2002; Moreira Jr et al., 2004; Palatnik de Sousa et al., 2004b) e a recusa
dos donos dos cães na hora da remoção (Tesh, 1995), são dificuldades constantes no
controle da doença no Brasil. Por todas as razões descritas, novas estratégias são
necessárias para um controle efetivo e a mais importante delas, seria o desenvolvimento de
vacinas protetoras preventivas para erradicação da doença (WHO, 2006).
Como alternativa para o sacrifício de cães infectados, a quimioterapia é uma
ferramenta muito utilizada na Europa e mais recentemente no Brasil (revisado por Palatnik-
de-Sousa et al., 2001). As drogas mais frequentemente utilizadas na terapia da LVC são: os
Antimoniais Pentavalentes (Glucantime®), Allopurinol (Zyloric®), Anfotericina B,
Aminosidinas e Pentamidinas. (Baneth & Shaw, 2002, Quellette et al., 2004).
Na Europa, o sucesso no tratamento da LVC pode ser interpretado de diversas
formas. Para clínicos e proprietários dos cães doentes, o sucesso deverá estar na completa
remissão do quadro clínico (Baneth & Shaw, 2002). Porém do ponto de vista
epidemiológico, isto somente é válido quando os cães tratados são transportados para áreas
não endêmicas com ausência de vetores e da doença. O tratamento e cura clínica apenas
não são aceitos quando se trata de áreas endêmicas com disponibilidade de vetor e
reservatórios infectados. Para os parasitologistas, epidemiólogos e profissionais de saúde
pública o sucesso do tratamento está na completa ausência de parasitos, tornando o cão não
infectivo para o vetor interrompendo a transmissão. Os fatores genéticos relacionados a
predisposição para a infecção e ocorrência de doença também devem ser levados em
consideração, durante a avaliação da resposta terapêutica (Baneth & Shaw, 2002). O Brasil,
sendo um dos 4 países que concentram 90% dos casos humanos de LV, proíbe o tratamento
quimioterápico de cães infectados e recomenda o seu sacrifício (MS SINAN, 2003).
O tratamento da LVC é importante para remissão dos sintomas e melhora clínica do
animal, embora a falha na terapia pode acarretar implicações epidemiológicas importantes,
como a completa recuperação da infecciosidade, com presença de transmissão, mesmo que
os animais permaneçam assintomáticos (Alvar et al., 1994). O retorno ao quadro clínico
com exposição de parasitos na pele (Ikeda-Garcia et al., 2007) tornam o cão infectivo para
o vetor mesmo após o tratamento (Alvar et al., 1994, Guarga et al., 2002).
Por outro lado, coleiras impregnadas com inseticida (deltametrina e permetrina), em
cães, vem sendo utilizadas como repelente para o vetor em áreas endêmicas, demonstrando
ótimos resultados. Na Europa, de acordo com Manzillo et al., (2006) a proteção obtida foi
de 50,8%, demonstrando também efeito na clínica, o número de sintomas em animais sem
coleira foi maior (90%) do que nos animais com coleira (36%). A coleira evita novas
picadas, diminuindo a quantidade de vetores infectados no ambiente. No Brasil, Reithinger
et al., (2004), demonstraram 50% de eficácia durante 5 meses de uso, indicando que o uso
da coleira pode ser uma estratégia efetiva no controle. Entretanto, em um ensaio vacinal
profilático com Leishmune® em SP, Brasil, não foram detectadas diferenças significativas
na proteção entre vacinados com Leishmune® e controles não tratados, no que diz respeito
ao uso da coleira. Os resultados de PCR de linfonodo, sangue e imunohistoquímica foram
significativamente elevados no grupo controle, apesar do uso da coleira (Nogueira et al.,
2005).
1.8- Vacinação contra as leishmanioses
Devido à baixa efetividade dos métodos de controle e terapêuticos para LVC, o
desenvolvimento de uma vacina para cães é muito desejável já que a leishmaniose é uma
das mais importantes doenças parasitárias emergentes no mundo, que afeta humanos e cães
(Lemesre et al., 2005). O estudo sobre vacinação contra leishmaniose é muito antigo.
Historicamente a leishmaniose cutânea foi foco de tentativas de vacinação, provavelmente
por ser mais conhecida desde a antiguidade. Existem relatos do professor Saul Adler, sobre
mães no Líbano que expunham seus bebês às picadas de mosquitos para evitar a doença
grave posterior por L. (L.) major (Gavron, 1997). Posteriormente, a técnica de
leishmanização foi muito utilizada com finalidade de produzir lesões limitantes. Retirava-se
material de lesões ativas de leishmaniose cutânea para a inoculação em indivíduos não
infectados. Em 1908, o estabelecimento de condições de crescimento de formas
promastigotas em cultura, por Nicole e Manceau foi o ponto inicial para o desenvolvimento
das primeiras vacinas vivas de Leishmania (Modabber, 1990; revisado por Handman,
2001). A evolução continua até os dias de hoje, em que vacinas modernas atreladas a
engenharia genética estão sendo desenvolvidas e testadas (revisado por Handman, 2001).
Para o desenvolvimento de vacinas humanas e veterinárias a OMS estabelece fases
(I a IV) que devem ser seguidas para fins de teste e futura obtenção de registro (WHO,
1997). Na fase I se testa imunogenicidade e segurança, os indivíduos são imunizados não
sendo submetidos ao desafio da infecção. Na fase IIa além dos elementos testados na fase
anterior, inclui o desafio através da infecção experimental para que seja analisada a eficácia
vacinal. A fase I e IIa devem ser realizadas em modelo experimental apropriado, numa
pequena escala da população (dezenas). A fase III deve ser feita no campo, para análise da
eficácia vacinal frente ao desafio natural. Utiliza-se neste caso uma maior escala (centenas
a milhares). Obtendo-se bom resultado nesta fase, pode se solicitar licenciamento às
agências regulatórias. A vacina deverá ser produzida com as mesmas características e
especificações em que foi testada. O teste de fase IV é realizado após o registro. Devem ser
feitos em grande escala (dezenas de milhares a centenas de milhares) sendo os indivíduos
vacinados expostos à infecção natural no campo, sem grupo controle, devido a razões
éticas. Neste caso, a eficiência da vacina a ser testada é medida por comparação da taxa de
incidência da doença antes e após a vacinação (WHO, 1997).
O histórico das vacinas contra as leishmanioses envolve várias gerações de
formulações. Segundo Modabber (1995), a primeira geração de vacinas contra a
leishmaniose é composta por parasitos mortos com ou sem presença de adjuvantes.
Experimentos realizados por Dunan et al., (1989) utilizando uma preparação semi-
purificada e liofilizada de L (L.) infantum, apresentaram efetividade quando testada em
modelo murino, entretanto não demonstraram proteção em cães vacinados após um ano,
sendo paradoxalmente encontrado um aumento significante na taxa de infecção dos
vacinados sobre a dos controles. Mayrink et al., (1996) num ensaio de fase I e II em cães
utilizando lisado de L. (L.) braziliensis adicionado de BCG (bacilo Calmette Guérin),
encontraram 90% de proteção contra LVC (9/10 cães). Genaro et al., (1996) porém, num
ensaio de vacinação canina de fase III utilizando o mesmo tipo de vacina (lisado de L. (L.)
braziliensis com merthiolate adicionada de BCG), não obteve diferenças significativas
entre vacinados e controles após 18 meses. Mohebali et al., (2004), vacinaram cães no Iran
com uma vacina composta por L. (L.) major precipitada em hidróxido de alumínio
adicionada a BCG, demonstrando boa tolerabilidade, diminuição da taxa de incidência da
doença e 69,3% de eficácia vacinal.
As vacinas de segunda geração contra a leishmaniose estão divididas em três
categorias de acordo com a composição (Modabber, 1995): vacinas vivas (Cruz et al.,
1991; Souza et al., 1994; Titus et al., 1995), de subunidades recombinantes ou sintéticas
definidas (Russo et al., 1991; Skeiky et al., 1995; Gurunathan et al., 1997) e de
subunidades nativas parcialmente purificadas (Jaffe et al., 1990; Jardim et al., 1991;
Palatnik de Sousa et al., 1994a; Palatnik de Sousa et al., 1994b; Santos et al., 1997; Santos
et al., 1999; Santos et al., 2002). Em cães, o número de estudos é menor com vacinas de
segunda geração e limita-se a ensaios de FASE IIa. Lemesre et al., (2005), descreveram um
ensaio de vacinação canina utilizando sobrenadante concentrado da cultura (LiESAp,
proteína excretada de 54kDa) de L. (L.) infantum adicionado de muramil dipeptídeo. Os
cães utilizados neste ensaio foram vacinados com 50 µg, 100 µg ou 200 µg de proteína do
antígeno. Houve um aumento significante de IgG2 nos animais vacinados, com maior
proliferação de células mononucleares contra o antígeno em vacinados do que controles
tratados com salina. A carga parasitária foi apenas analisada em cultura in vitro de medula
óssea, revelando ausência de parasitos nos animais vacinados com 100 µg e 200 µg (n=0/3),
enquanto que os animais controles se mostravam infectados (n=3/3). Assim mesmo,
enquanto não houve nenhum sinal clínico nos vacinados, os controles (4/6) mostraram
sinais clínicos leves (febre, conjuntivite e úlceras de pele). Apesar da descrição de proteção,
o número de cães foi insuficiente para qualquer análise estatística e de eficácia vacinal.
Apesar do inoculo ter sido forte (10
8
promastigotas metacíclicos de L. (L.) infantum, a
descrição da parasitemia apenas através de cultura in vitro de medula óssea indica que a
infecção foi muito branda e não reproduz a doença conforme ocorre na natureza. Este fato
provavelmente esteja correlacionado com a cepa de L. (L.) infantum obtida a partir de baços
de camundongos Balb/c infectados. Camundongos Balb/c são considerados moderadamente
resistentes a leishmaniose visceral (Bradley & Kirkley, 1977). Uma boa infecção
experimental é obtida utilizando parasitos derivados diretamente de cães infectados, ou
então de cães ou humanos mantidos através de passagens sucessivas em hamsters (Bradley
& Kirkley, 1977; Blackwell, 1996; Nico et al., 2007).
Recentemente um ensaio randômico-duplo cego foi realizado utilizando LiESAp +
muramil dipeptídeo em cães naturalmente expostos do Sul da França. Conversão na RIFI
foi observada majoritariamente nos cães controles. Em cada cão sintomático ou
soropositivo a infecção foi confirmada pela presença de parasitas na medula óssea,
cultivada em meio NNN e análise por PCR. Após dois anos a incidência da infecção foi
0,61% (1/165) em cães vacinados e 6,86% (12/175) nos controles (92% de eficácia
vacinal). Aumentos de IgG2 e da atividade leishmanicida mediada por óxido nítrico de
macrófagos em resposta ao IFN-γ produzido por células T, foram observados
principalmente em cães vacinados (Lemesre et al., 2007). Não houve óbitos nem casos de
calazar severo em dois anos de exposição indicando que a força infectante do local era
baixa. Os autores consideram uma eficácia vacinal de 92% baseados apenas em resultados
de métodos extremamente sensíveis como PCR ou cultura que são conforme descrito pela
WHO, metas de eficácia primária que avaliam apenas infecção e não doença (WHO, 1997).
O antígeno FML (ligante de fucose e manose) de L. (L.) donovani, um complexo
glicoprotéico isolado de promastigotas, também foi intensivamente usado em testes de
vacinação murina de Fase I-IIa (camundongos e hamsters) (Palatnik et al., 1994a; Palatnik
de Sousa et al., 1994b; Santos et al., 1997; Santos et al., 1999) e canina contra a
leishmaniose visceral (Borja-Cabrera, 2000). O efeito de proteção contra o calazar canino
foi pesquisado em cães SRD (sem raça definida) vacinados com o antígeno FML de L. (L.)
donovani e saponina QuilA e experimentalmente infectados com 10
8
amastigotas. A
resposta humoral foi significativamente maior nos grupos vacinados que no controle
(p<0,001) até os 540 dias após a infecção. A resposta IDR foi maior no grupo vacinado
com 1mg de QuilA do que no controle (p<0,01), enquanto os animais tratados com salina
mostraram IDR positiva entre 90-120 dias após a infecção perdendo a resposta 210 dias
após a infecção. As contagens de plaquetas foram significativamente maiores em ambos
grupos vacinados do que nos controles (p<0,01). O número de sinais clínicos foi
significativamente menor nos grupos vacinados do que nos controles (p<0,001). Um cão do
grupo de salina e dois do grupo FML+1mg QuilA morreram de calazar confirmado por
métodos parasitológicos aos 297, 376 e 503 dias após a infecção respectivamente. Esses
animais pertenciam à mesma família polissintomática, não houve óbitos nas outras famílias.
Nossos resultados mostraram que a vacina FML + QuilA (1mg) induz proteção significante
contra o calazar canino experimental (Borja-Cabrera, 2000).
Gradoni et al., (2005), vacinaram cães com o antígeno quimérico MML, composto
por três antígenos recombinantes de L. (L.) major e os adjuvantes MPL-SE® ou
Adjuprime®. Os cães ficaram expostos em canil não telado de área endêmica na Itália. Ao
final de dois anos 14/14 cães tratados com salina, 13/15 cães tratados com MPL-SE (50µg)
e 10/10 cães tratados com Adjuprime® revelaram estar infectados através do teste “Nested-
PCR” de medula óssea, indicando não haver proteção nem na prevenção da infecção, nem a
progressão da doença.
As vacinas de terceira geração apresentam em sua composição genes de antígenos
de interesse clonados em vetor de promotor eucariótico (Aguilar-Be et al., 2005; Gamboa-
León et al., 2006). Em ensaios com cães como modelo experimental, Ramiro et al., (2003)
utilizou uma vacina de DNA contendo o plasmídeo de proteína LACK de L. (L.) infantum
seguido da inoculação de vírus Vaccinia contendo o mesmo gene, demonstraram na
contagem de parasitos em fígado e baço, que 3/5 animais do grupo vacinado apresentaram
ausência de parasitos, enquanto que 5/5 controles estavam infectados. Por outro lado, Rafati
et al., (2005) utilizando vacina de DNA e proteína recombinante CPS (cisteína proteinase
tipo I e II) de L. (L.) infantum, vacinaram e posteriormente desafiaram cães
experimentalmente com 5x10
6
promastigotas de cultura de L. (L.) infantum. Este trabalho
tem ainda menos animais: 1 cão no grupo controle não tratado, 2 cães que receberam PBS,
2 cães receberam o plasmídeo vazio e 10 cães receberam as vacinas, chamando a atenção o
número muito diferente de vacinados e controles. A infecção branda foi detectada apenas
por métodos muito sensíveis. A proteção foi evidenciada através de positividade de PCR de
sangue, em 2/4 animais do grupo controle (tratados com salina e vetor vazio) e 2/10
animais vacinados, embora as diferenças entre esses dois grupos não sejam significantes. O
método de PCR de medula se mostrou positivo em 1/10 cães vacinados e 3/4 cães controles
e a cultura de medula óssea se mostrou positiva em 0/10 vacinados e 3/4 controles. Nenhum
destes estudos com vacinas de terceira geração reúne as características de um ensaio de
Fase IIa, principalmente pela desigualdade do número de indivíduos entre vacinado e
controles e pelo número reduzido de cães testados.
1.8.1- Antígeno FML
O antígeno FML (ligante de fucose e manose) é um complexo glicoprotéico, isolado
a partir do extrato aquoso obtido através da extração de células de fase estacionária de
cultura de promastigotas de L. (L.) donovani, que inibe a infecção de macrófagos
peritoneais in vitro de camundongos por promastigotas (Palatnik et al., 1989) e
amastigotas, sendo um potente imunógeno (Palatnik de Sousa et al., 1993) que atua de
maneira espécie específica (Palatnik et al., 1990). O FML se apresenta tanto na superfície
de promastigotas como na de amastigotas (Palatnik de Sousa et al., 1993). O FML foi
utilizado no diagnóstico de calazar humano em pacientes infectados por L. (L.) chagasi,
demonstrando 100% de sensibilidade e 96% de especificidade (Palatnik de Sousa et al.,
1995), em ensaios sorológicos realizados em cães infectados naturalmente foi demonstrado
100% de sensibilidade e 100% de especificidade no diagnóstico do calazar canino (Borja-
Cabrera et al., 1999). Na análise bioquímica do complexo glicoprotéico, a estrutura do
FML demonstrou composição de 26% de açúcar neutro, 54% de proteína, 11% de fosfato e
traços de hexosaminas. Na análise dos açúcares o FML demonstrou presença de 16,8% de
ribose, 5,3% de fucose, 12,6% de xilose, 38,5% de manose, 3,3% de galactose, 13,7% de
glicose, 7,4% de N-acetil glicosamina e 0,2% de ácido neuramínico (Bernardo, 1998)
Na fração protéica do FML foi demonstrada a presença de proteínas de peso
molecular com variação de 9 a 95kDa, as glicoproteínas presentes tem peso molecular
variando de 36 a 55kDa. A glicoproteína de 36kDa, (gp36), pertencente ao complexo FML,
foi reconhecida em soros de pacientes com calazar (Palatnik de Sousa et al., 1996). A gp36
é considerada o maior componente imunoprotetor do complexo FML se comportando como
marcador específico para o diagnóstico do calazar em humanos e um forte imunógeno em
vacinas de 2ª geração (Paraguai de Souza et al., 2001). Com o intuito da obtenção da
proteína recombinante da gp36, foi feita clonagem e expressão da NH (nucleosídeo
hidrolase) de L. (L.) donovani, a Ld NH analisada contra soros caninos infectados com
L.(L.) chagasi, demonstrando uma forte reatividade com IgG1, e correlação com aumento
de sinais clínicos (Santana et al., 2002). Mais tarde, Aguilar-Be et al., (2005) compararam a
proteção induzida pela vacina FML, a recombinante NH36 (ambas adicionadas de
saponina) e vacina de DNA NH36 no modelo experimental murino contra L. (L.) chagasi e
L. (L.) mexicana, resultando numa resposta protetora forte e específica da vacina de DNA
NH36 contra L. (L.) chagasi e resposta mais branda, porém protetora contra L. (L.)
mexicana. Foi evidenciada a redução da carga parasitária por L. (L.) chagasi no fígado de
animais tratados com a vacina FML-saponina e recombinante NH36 (79%; p<0,01) e por
L.(L.) mexicana nos animais vacinados com FML-saponina apenas (27%, p<0,05). A
proteção mais potente foi desenvolvida por camundongos imunizados com VR1012-NH36
(88%, p<0,01, contra L. (L.) chagasi e 47%, p<0,05, contra L. (L.) mexicana). A análise por
FACS revelou um aumento de 2-3 vezes da secreção de IFNγ-pelas células CD4+,
característico de uma resposta imunoprotetora do tipo Th1. Nossos resultados com a vacina
de 3
a
geração VR1012-NH36 indicam a possibilidade do seu uso como vacina bivalente
contra ambas: a leishmaniose visceral e a leishmaniose tegumentar que se superpõem em
várias regiões do Mundo (Aguilar-Be et al., 2005). A proteção da vacina FML-saponina
contra a infecção murina por L. (L.) amazonensis esta sendo atualmente evidenciada (Souza
& Palatnik de Sousa, 2007)
1.8.2- A vacina FML contra a leishmaniose visceral canina
A formulação vacinal composta de FML e saponina Riedel de Haen foi testada
primeiramente em vacinação profilática no modelo de camundongo Balb/c (Palatnik de
Sousa et al., 1994a) e de hamster (Palatnik de Sousa et al., 1994b), demonstrando seu poder
como imunógeno de baixa toxicidade e protetor em fase I e IIa. Diferentes adjuvantes
(Alumina, saponina, adjuvantes de Freund) foram comparados em modelo murino,
demonstrando que na constituição FML-Saponina, houve redução especifica de 85% na
carga parasitária, aumento de IgG total, IgG2a e IgG2b, revelando ser o melhor adjuvante
estudado (Santos et al., 1999). Recentemente, o antígeno FML foi testado em formulações
vacinais com saponinas purificadas de Quillaja saponaria Molina (QS21 e saponinas
deaciladas) (Palatnik de Sousa et al., 2004a; Oliveira-Freitas et al., 2006) e de Calliandra
pulcherrima Benth (Nico et al., 2007) com altos índices de proteção (86-95%),
evidenciados através de estudos de sobrevivência e contagem de parasitos em fígado. Foi
também descrito que a saponina Riedel de Haen usada na vacina FML e Leishmune® é
uma mistura de saponinas de Quillaja saponaria Molina (Palatnik de Sousa et al., 2004a;
Oliveira-Freitas et al., 2006).
Testes de fase III foram realizados também em cães na área endêmica de São
Gonçalo do Amaranto, RN. Fizeram parte do primeiro estudo da Silva et al., (2001) 117
cães sadios de área endêmica e soronegativos para FML-ELISA. Foi calculado que com um
poder de 95% para detectar uma eficácia vacinal de 85% (Orenstein et al., 1985) e com um
erro de 5%, usando um teste bicaudal, o estudo necessitaria de 54 animais por grupo.
Cinqüenta e oito cães receberam FML (1,5 mg) e saponina Riedel de Haen (0,5mg),
enquanto que 59 animais foram tratados com salina (da Silva et al., 2001), a vacina foi
administrada em três doses por via subcutânea, na região do dorso. A incidência prévia de
calazar canino na região era 2% (Borja-Cabrera et al., 1999). Foram obtidos 33% de casos
de calazar clínico ou fatal entre os placebos e 8% de casos oligossintomáticos sem óbitos
no grupo vacinado. Entre os controles de salina houve 4 óbitos por calazar confirmados por
métodos parasitológicos, clínicos e sorológicos, e 6 sintomáticos confirmados por PCR de
sangue, fazendo um total de 10 casos de calazar em 30 cães que foram os acompanhados
ate o final do experimento com segurança (33%). Por outro lado, no grupo vacinado não
houve óbitos por calazar e a infecção foi confirmada em apenas três cães
oligossintomáticos, dois anos após a vacinação. Portanto apenas 3 oligossintomáticos em
36 cães efetivamente acompanhados até o final do experimento, fazendo um total de 8.33%.
Este trabalho demonstrou 92% de proteção entre os cães do grupo vacinado, com eficácia
vacinal de 76% (da Silva et al., 2001). O cálculo da eficácia vacinal baseia-se portanto, em
critérios robustos de doença e sintomatologia confirmada e não apenas em critérios
parasitológicos de confirmação de infecção subclínica.
No segundo teste de fase III (Borja-Cabrera et al., 2002) utilizou-se a vacina FML
(1,5mg) e QuilA (1mg). Foi calculado que com um poder de 85% para detectar uma
eficácia vacinal de 85% com um erro de 5%, usando um teste bicaudal o estudo
necessitaria de 41 animais por grupo. Um grupo de 179 cães domiciliares em boas
condições foi selecionado para o ensaio, trinta e quatro deles foram excluídos por serem
soropositivos e os 145 restantes soronegativos no FML-ELISA e RIFI, portanto
considerados candidatos. Desse grupo foi possível vacinar 85 cães. Sessenta não estavam
disponíveis. Foram divididos em 44 vacinados e 41 controles injetados com salina (Borja-
Cabrera et al., 2002). Não foi possível trabalhar com mais cães porque demandaria anexar
outros bairros de menor incidência de calazar canino e humano, a vacina foi administrada
em três doses por via subcutânea, na região do dorso. No final de dois anos 8/32 casos
fatais de calazar se registraram entre os controles (25%) e apenas 1/20 óbitos entre os
vacinados (5%) traduzindo-se em 95% de proteção no grupo vacinado e 80% de eficácia
vacinal. Em ambos estudos (da Silva et al., 2001; Borja-Cabrera et al., 2002) 96-100% de
sorologia anti-FML e IDR positiva foram registrados com 7 meses após a vacinação. A
formulação vacinal FML-QuilA induziu proteção por até 3,5 anos após a vacinação, os cães
vacinados neste período, apresentaram alta soropositividade e IDR positiva, não sendo
detectado DNA de Leishmania por PCR de sangue ou medula, nem presença de parasitos
em punção de medula. Alternativamente os cães controles de salina, mostraram PCR
positivos para DNA de Leishmania, amastigotas em punção de medula e sorologia para
FML com IDR negativa. A vacina FML-QuilA induziu proteção significante, com ação
duradoura e forte efeito protetor contra o calazar em cães sadios e soronegativos, no campo
(Borja-Cabrera et al., 2002).
A formulação FML-saponina (Riedel de Haen) foi licenciada para comercialização
no Brasil com o nome de Leishmune® (Patente INPI número: PI1100173-9, 18/07/1997-
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil). Recentemente, a vacinação profilática com
Leishmune ®, em 600 cães soronegativos para FML-ELISA de área endêmica, demonstrou
97% de proteção após 22 meses de aplicação (Borja-Cabrera et al., 2005).
Recentemente, foram realizados testes com a vacina industrial Leishmune® no
intuito da investigar o possível poder de bloqueador da doença, interferindo na transmissão
de parasitos dos cães infectados para o vetor em área endêmica. Nogueira et al., (2005),
vacinaram cães normais soronegativos para FML-ELISA com Leishmune ® (n=32). Após
11 meses de vacinação, os controles não tratados (n=40) demonstraram 25% de casos
sintomáticos, 50% de soropositividade no FML-ELISA, 25% de positividade na análise
imunohistoquímica de pele, 56,7% de PCR positivo em amostras de linfonodo e 15,7% em
amostras de sangue, enquanto os animais vacinados demonstraram 100% de positividade no
FML-ELISA, completa ausência de parasitos na pele, e em PCR de amostras de linfonodos
e sangue (p<0,01), a ausência de evidências de DNA de Leishmania e sintomas, indicam a
não infecciosidade dos animais vacinados com Leishmune ® sugerindo o efeito bloqueador
de transmissão da vacina industrial no campo.
A habilidade do FML de inibir a ligação in vitro de promastigotas de L. (L.)
donovani e L. (L.) chagasi com intestinos de Lutzomyia longipalpis obtidas em colônia foi
testada por Saraiva et al., (2006). Intestinos dissecados foram incubados com diferentes
concentrações de antígeno FML e das frações Fab de anticorpos IgG de cães vacinados com
Leishmune® 12 meses antes. Com o FML foi observada uma inibição de 80% dose-
dependente mais pronunciada contra L. (L.) donovani do que contra L. (L.) chagasi
(p<0,001). A fração Fab-IgG de soros de animais vacinados com Leishmune ® foi capaz de
inibir também por efeito dose-resposta (p<0,001) a ligação de L. (L.) donovani e
L.(L.)chagasi de forma indistinta (p=0,061). A propriedade bloqueadora de transmissão foi
também confirmada em ensaios in vivo, onde os flebótomos foram alimentados com
1,5x10
7
de
amastigotas em solução salina adicionado de sangue humano e de soros de
animais vacinados com Leishmune ® ou soro de animais infectados ou normais. Valores
maiores de taxa de infecção (p<0.025) e intensidade da infecção (p<0.05) foram
encontrados nos insetos controles. Os alimentados com soro vacinal mostraram um índice
de infecção muito reduzido (20,7%). Os resultados encontrados demonstram que os
anticorpos gerados pela Leishmune ® tem propriedade de bloquear a infecção efetiva
induzindo uma proteção de 79,3% (Saraiva et al., 2006). Soros de animais infectados
mostraram uma porcentagem de infecção semelhante à dos soros de animais normais,
porém um número muito mais elevado de parasitos fazendo um índice de infecção muito
maior. Foi comprovado que o soro de animais infectados não protege, ao contrário exacerba
a infecção em 408%, a respeito de soro normal (Palatnik de Sousa et al., resultados não
publicados).
Parra et al., (2007), analisaram a segurança e toxicidade da vacina industrial
Leishmune® nos 600 cães que foram vacinados em área endêmica com 3 doses de
Leishmune®, demonstrando 40,87% de dor no local da injeção, 15,90% de aumento no
local da injeção, 20,48% de anorexia, 24,17% de apatia, 2,4% de vômitos e 1,5% de
diarréia, com significante declínio dos efeitos analisados da primeira para terceira dose
(p<0,0001). As reações adversas mais encontradas foram as de dor no local da injeção 73%,
anorexia 79% e aumento no local da injeção, não sendo encontradas diferenças entre cães
filhotes ou adultos, embora 94,5% dos cães adultos desenvolveram reações menores de
aumento local, demonstrando uma maior resistência no processo inflamatório causado pela
saponina. Não houve mortes ou reações anafiláticas, somente 0,1% dos cães apresentaram
reações alérgicas. Alopécia transitória foi observada em 0,28% dos animais, não havendo
necessidade de tratamento para resolução do quadro. Todos os efeitos adversos causados
pelo uso da vacina foram transitórios confirmando a tolerabilidade da formulação industrial
Leishmune ® (Parra et al., 2007).
1.8.3- Vacinação imunoterápica contra as leishmanioses:
Convit et al., (1987) na Venezuela, compararam o uso de vacina de lisado de L. (L.)
mexicana adicionada de BCG versus a quimioterapia com glucantime, no tratamento de
pacientes humanos com leishmaniose cutânea localizada confirmada, demonstrando 94%
de taxa de cura nos grupos tratados. No Brasil, Mayrink et al., (1992) testando vacina
contendo mistura de cinco cepas de Leishmania, alcançaram 76% de cura em indivíduos
com leishmaniose cutânea. Handman et al., (2000) utilizando modelo murino infectado
com L. (L.) major, demonstraram que os animais vacinados com DNA contendo genes de
antígeno de superfície do parasito (PSA-2), apresentaram diminuição das lesões na duas
linhagens testadas C3H/He (linhagem resistente) e Balb/c (linhagem susceptível), o efeito
terapêutico foi demonstrado ainda pelo aumento de IFN-γ. Machado-Pinto et al., (2002)
utilizaram pacientes humanos de Minas Gerais, para testar a imunoquimioterapia com
vacina composta por formas promastigotas mortas de L. (L.) amazonensis associada ao
tratamento com meglumine antimoniato (glucantime®) utilizado na metade da dose
normal. Após quatro séries completas do tratamento proposto, 100% (47/47) dos pacientes
que receberam imumoquimioterapia apresentaram-se curados com as lesões cicatrizadas,
enquanto o grupo controle, que havia recebido somente glucantime®, 16,3% (8/49)
apresentaram cura clínica (p< 0,0001). Mayrink et al., (2006) utilizaram vacina de
promastigotas mortas de L. (L.) amazonensis, em ensaio imunoquimioterápico utilizando
542 pacientes humanos de área endêmica para leishmaniose tegumentar em Minas Gerais.
Demonstraram que os pacientes tratados com imunoquimioterapia (n=38) (associação da
vacina com tratamento padrão com glucantime®) e os tratados com quimioterapia (n=245)
(somente glucantime®), apresentaram o mesmo índice de cura, 100%. Foi encontrada ainda
redução no volume do sal do fármaco usado (17,9%) e diminuição no tempo do tratamento,
que durava em média 94,6 dias em pacientes tratados somente com quimioterapia para 64,7
dias, em pacientes tratados com imunoquimioterapia. Com isso houve uma redução nos
efeitos colaterais causados pelo fármaco no tratamento imunoquimioterápico.
Recentemente, Gamboa-León et al., (2006), testaram o poder imunoterápico da
VR1012-NH36 em modelo murino infectado experimentalmente com L. (L.) chagasi,
vacinando camundongos por via intra-muscular com 100µg, 20 µg de VR1012-NH36 e 20
µg de VR1012-NH36 associado a extrato de alho. Foi demonstrando uma efetiva resposta
terapêutica, com diminuição de 91% da carga parasitária em fígado no tratamento de
100µg, 77% em 20µg e 76% em 20 µg associada a extrato de alho. A taxa de sobrevivência
foi de 100% nos tratados com 100 µg de vacina, 83% nos animais tratados com 20 µg e
67% nos animais tratados com 20 µg associado a alho, quando comparados com grupo
tratado com salina que demonstrou 33% de sobrevivência. Os animais tratados somente
com extrato de alho não demonstraram diminuição na carga parasitária (p>0,05) embora
tenha sido demonstrada um aumento na taxa de sobrevivência de 100%, que pode ser
associado a uma proteção inespecífica associada ao aumento de IFN-γ.
A eficácia da imunoterapia com a vacina FML-saponina foi primeiro demonstrada
por Santos et al., (2003), em ensaios de vacinação em camundongos Balb/c infectados com
L. (L.) donovani, onde foi demonstrado um aumento específico de anticorpos IgG1, IgG2a
e IgG2b, resposta de IDR, resposta proliferativa in vitro contra o antígeno FML, diminuição
dos níveis de IL-10 e 94% de diminuição da carga parasitária no fígado.
Borja-Cabrera et al., (2004) utilizaram a vacina FML com concentração aumentada
de adjuvante fabricada no nosso laboratório, onde 5 cães infectados artificialmente com L.
(L.) donovani, apresentando sorologia positiva no FML-ELISA com presença de
sintomatologia, foram vacinados com FML-Quil-A, os sinais clínicos desapareceram após a
completa vacinação, 3/5 animais permaneceram assintomáticos com IDR positiva e livres
de parasitos um ano após a infecção. Alternativamente 21 cães de área endêmica infectados
naturalmente com L. (L.) chagasi, apresentando sorologia positiva para FML-ELISA, não
demonstravam ainda sintomatologia para calazar canino foram vacinados com FML-Riedel,
demonstrando-se 22 meses depois da vacinação, a ausência óbitos por LVC. Noventa por
cento dos cães permaneceram assintomáticos. As taxas de linfócitos CD4+ e CD21+
analisadas por citometria de fluxo, apresentaram proporções normais, indicando a condição
não infecciosa dos cães. Níveis elevados de linfócitos CD8+ foram detectados nos animais
vacinados assim como ausência de parasitos, indicando que a vacina demonstrou ser efetiva
também na imunoterapia contra a leishmaniose visceral em cães naturalmente infectados e
assintomáticos. Os cães se encontram sadios após cinco anos após início da imunoterapia
(resultados não publicados).
Após o registro da vacina Leishmune® comercial e a perspectiva do seu amplo uso
em áreas endêmicas era necessário avaliar o seu possível potencial imunoterápico, uma vez
que cães infectados e assintomáticos poderiam ser eventualmente vacinados. Em
experimento preliminar foi observado que entre 600 cães assintomáticos vacinados com
Leishmune® em área endêmica (Borja-Cabrera et al., 2005) 50 eram já soropositivos
indicando infecção recente. Dois anos após a vacinação 97% dos cães soronegativos se
mostravam protegidos enquanto que os 50 cães soropositivos desenvolveram calazar. O
efeito imunoterápico da Leishmune® formulada com 0.5mg de saponina foi apenas
evidente no retardo do desenvolvimento dos sintomas (resultados não publicados)
indicando que esta concentração de adjuvante não era suficiente para uso em imunoterapia.
Visando também fornecer uma alternativa ao sacrifico de cães que já estivessem infectados,
iniciamos um experimento de fase IIa, para o teste da vacina Leishmune®
imunoterapêutica industrial fabricada pela Fort Dodge Saúde Animal (Campinas) contendo
1mg de saponina. A vacina foi aplicada em cães SRD e cães controles previamente
infectados com L. (L.) chagasi (Santos et al., 2007).
2- Objetivos:
2.1-Geral: Testar o potencial imunoterapêutico da vacina Leishmune® enriquecida de
saponina contra a leishmaniose visceral canina experimental
2.2-Específicos:
1. Avaliação da resposta imune humoral em animais infectados e vacinados ou não
com Leishmune®, através de ensaio de FML-ELISA para anticorpos IgG total,
IgG1 e IgG2.
2. Avaliação da resposta imune celular através da analise da intradermorreação ao
antígeno de Leishmania e da quantificação das proporções de linfócitos totais de
sangue periférico ex-vivo e de linfócitos Leishmania-especificos in vitro, por
citometria de fluxo.
3. Avaliação das evidências parasitológicas e presença de sintomas característicos da
LVC em animais vacinados e controles.
4. Análise da segurança e toxicidade do tratamento com a vacina Leishmune®
enriquecida de saponina .
3- Material e Métodos:
3.1- Imunoterapia contra leishmaniose visceral experimental canina com a vacina
Leishmune ® enriquecida de saponina
Foram utilizados vinte e quatro cães SRD com aproximadamente cinco meses de
idade provenientes de seis diferentes ninhadas, previamente vacinados contra raiva (Rai-
vac I), cinomose, Adenovírus tipo dois, Coronavirus, Parainfluenza, Parvovírus e
Leptospira (Duramune DA2PP+CvK/Lci, Fort Dodge saúde animal, IW, USA) e
devidamente vermifugados (Drontal Plus, Bayer). Todos os cães apresentaram-se
devidamente saudáveis e soronegativos para antígenos de Leishmania no ensaio de FML-
ELISA (Borja-Cabrera et al., 1999), no início do experimento. Após isso foram infectados
por via endovenosa (ev) através da veia cefálica com 2x10
8
amastigotas obtidas de L. (L.)
chagasi MHOM/BR/1972/BH46 provenientes de baço de hamsters infectados (Bradley &
Kirkley, 1977). Quando a infecção tornou-se aparente, após todos os cães apresentarem-se
soropositivos no ensaio de FML-ELISA, estes foram randomizados e divididos em dois
diferentes grupos de forma que metade de cada ninhada foi distribuída no grupo vacinal e
metade no controle. O grupo de cães tratados somente com salina foi composto: pelos cães
1,2 e 3 da família A; 7,8,9 e 10 da família B; 15 e 17 da família C; 20 e 21 da família D e o
cão 25 da família E. O grupo de cães tratados com vacina foi composto: pelos cães 4,5 e 6
da família A; 11,12 e 13 da família B; 14 e 16 da família C; 19 e 22 da família D; e o cão
24 da família E. O grupo controle foi tratado somente com salina estéril (0,9% NaCl-
VETEC, RJ-Brasil), enquanto o grupo de imunoterapia recebeu a vacina Leishmune®
fabricada pela Fort Dodge Saúde Animal (Campinas, SP) contendo 1,5mg de antígeno
FML e 1 mg de saponina Riedel de Haen / dose, em 3 diferentes aplicações por via
subcutânea (sc) no dorso na região do pescoço, com intervalo de 20-30 dias. A formulação
a ser testada no grupo de imunoterapia (1,0mg de saponina) difere na concentração de
adjuvante da formulação utilizada na vacina Leishmune® profilática (0,5mg de saponina),
já industrializada e registrada no Brasil como vacina preventiva contra leishmaniose
visceral canina (Patente: INPI: PI1100173-9; 18.03.97 da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Brasil). Os cães foram avaliados ao longo de 15 meses, através de diversos
parâmetros: níveis de anticorpos IgG anti-FML (Borja-Cabrera et al., 1999), IDR contra
lisado de promastigotas de LD1S, fenotipagem de células mononucleares de sangue
periférico e presença de sinais clínicos. Os animais foram mensalmente avaliados para:
alopecia, onicogrifose, caquexia, anorexia, isolamento, apatia, lesões de pele, perda de peso
e aumento de linfonodos cervicais e poplíteos. Um escore de sinais clínicos foi utilizado
considerando medidas em diâmetro para a avaliação de linfonodos: pequeno (até 1 cm);
médio (1-1,5 cm) e grande (2cm). A perda de peso foi considerada como branda (0-2 Kg)
ou severa (2-5 Kg). Para a detecção de alopecia, onicogrifose, caquexia, anorexia,
isolamento, apatia ou lesões de pele, foi atribuído escore =1. Para avaliação de linfonodos o
escore utilizado foi: 0 para normal não detectável, 1 para pequeno, 2 para médio e 3 para
linfonodos grandes. Para perda de peso ficou atribuído escore= 2 quando esta for branda, e
escore=3 quando for severa. A inspeção geral do animal para detecção de alterações em
cavidades, ou órgãos em decorrência da doença, foi realizada também durante a necropsia
(Santos et al., 2007).
A presença de parasitos foi avaliada através de cultura in vivo (hamsters) de
amostras de sangue e medula óssea, análise de PCR para DNA de Leishmania em amostras
de sangue e medula óssea e pesquisa do parasito material de linfonodos. Após 15 meses de
infecção os cães foram eutanasiados com 3 a 10 ml de T-61 (Intervet, SP, Brasil), por via
ev. Após o sacrifício foi realizada a necropsia e retirados fragmentos de órgãos alvo, como
baço, fígado e linfonodos (Santos et al., 2007). Todos os animais neste estudo foram
tratados de acordo com guia para experimentação animal do National Institute of Health,
USA; sendo os procedimentos realizados de acordo a minimizar o sofrimento animal. Esta
investigação contou com a aprovação do CAUAP (Projeto 044, Comitê de Ética para Uso
de Animais em Pesquisa, do IBCCfo-UFRJ).
3.2- Análise de segurança da vacina Leishmune® enriquecida de saponina
A análise dos efeitos adversos foram realizadas através de detecção da presença ou
ausência de: dor e aumento no local da injeção, anorexia, apatia, vômitos e diarréia. As
reações foram observadas no período de 1,2,4, e 9 dias após cada dose de vacina. As
reações de dor foram observadas ao tocar o local da injeção. Foram consideradas desde
reações leves como contrações no local da injeção até tentativas do cão morder a mão do
observador durante a análise. O aumento local após a injeção foi avaliado através de
palpação no local da injeção. Anorexia foi considerada quando os cães se alimentam menos
ou rejeitam o alimento. Quando o animal não se levantou ou se aproximou do observador,
foi considerado apático.
3.3- Obtenção do antígeno FML de L.(L.) donovani (LD1S) para o FML-ELISA
3.3.1- Manutenção de amostras de L.(L.)donovani (LD1S) in vitro
A amostra de L. (L.) donovani (LD 1S/MHOM/SD/00-strain 1S), é oriunda do
laboratório do Dr. D. M. Dwyer do National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA
e foi mantida através de repiques semanais de culturas de promastigotas em tubos de 13cm
com tampa de rosca, contendo 5ml de meio de cultura BHI completo composto de 37g/l de
infusão de cérebro e coração (BHI-Difco, Brasil), 20 mg/ml de ácido fólico (Sigma, Co,
USA), 10 mg/ml de hemina (Sigma, Co, USA), complementado com 10% de soro fetal
bovino (Nutricell, RJ, Brasil). As culturas foram mantidas em estufa (TE-421, Tecnal) à
temperatura de 28C por 7 dias.
3.3.2- Obtenção de massa de células para extração do FML
Com a finalidade de obtenção de massa celular, 5ml de culturas de promastigotas na
fase logarítmica de crescimento foram transferidas para frascos Erlenmeyer de 1L contendo
200ml de meio BHI completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, incubados sob
agitação a 150 rpm a 28
0
C por períodos de 3-4 dias. As culturas foram ampliadas para
frascos Erlenmeyer de 3 L contendo 1 L de meio BHI completo suplementado com 5% de
soro fetal bovino e incubados nas mesmas condições até atingir a fase estacionária. Em
seguida, as células foram centrifugadas a 7000 rpm por 10 min. lavadas 3 vezes em solução
salina (NaCl a 0,9%) e conservadas a -20C até a extração (Palatnik et al., 1989).
3.3.3- Extração e purificação do complexo glicoprotéico FML de promastigotas de
L.(L.) donovani
As células foram rapidamente descongeladas e extraídas duas vezes com água
destilada Milli Q em banho de gelo sob forte agitação Os extratos foram centrifugados a
7000 rpm por 15 min. (Beckman-J2-21), logo após o sobrenadante foi removido e
posteriormente aquecido até 100C. O material desnaturado foi separado por centrifugação
a 20000 rpm por 10 min. e descartado. O extrato aquoso obtido foi liofilizado e
posteriormente fracionado por cromatografia de gel filtração em coluna de BioGel P-10
(120 cm x 2 cm; 100-200 “mesh”. Bio Rad, Richmond, Calif, USA). Após isso foi
realizada a leitura da absorbância do material a 220 ηm em espectrofotômetro Ultrospec
2.000 (Pharmacia, Biotech, USA). A fração correspondente ao volume de exclusão,
contendo o FML, foi separada, concentrada, liofilizada e analisada quanto à sua
composição de proteínas, assim como em relação ao seu perfil eletroforético em gel de
poliacrilamida (Palatnik et al., 1989).
3.4- Ensaio de FML-ELISA
As amostras de sangue periférico (veia cefálica) foram coletadas mensalmente,
através de punção ev em tubos de vidro sem anticoagulante para obtenção do soro. O
sangue foi incubado em estufa (Incubator shaker 25 New Brunswick scientific co. inc,
USA) a 37
◦
C por 1 hora e “overnight” a 4
◦
C. Os soros foram recolhidos e centrifugados a
1500 rpm por 5 min., sendo conservados em glicerol na proporção de 1:1 a -20
0
C. As
amostras coletadas foram avaliadas para presença total de anticorpos anti-Leishmania por
FML-ELISA (Borja-Cabrera et al., 2004), utilizando placas de 96 poços de fundo chato
(Corning 25805-96, cat número 430480, alta absorbância) que já apresentavam-se
previamente sensibilizadas com 50 µl do antígeno FML a 40 µg/ml solubilizado em tampão
carbonato/bicarbonato (20% de Na
2
CO
3
0,06M e 80% de NaHCO
3
0,06M pH 9,6- Vetec-
RJ- Brasil) e incubadas a 37
◦
C por 1 hora e “overnight” a 4
◦
C. Posteriormente as placas
foram lavadas cinco vezes em PBS* (0,018M PBS pH 7,2, leite em pó desnatado Molico
1% e Tween 20 a 0,05%), adicionadas de soro canino diluído a 1:100 em PBS* em
triplicatas e incubadas a 37
◦
C por 1 hora. Novamente as placas foram lavadas cinco vezes
com PBS* e adicionadas de 50 µl/poço de conjugado de peroxidase-proteína A (Kirkegaard
& Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, EEUU) na diluição de 1:16000 em PBS*,
com incubação a 37
◦
C por 1 hora. Posteriormente, as placas foram lavadas cinco vezes em
PBS*, reveladas com 50 µl/poço de tampão OPD (Na
2
HPO
4
0,83M, ácido cítrico 0,33 M,
pH 4,9-5,2 - Vetec-RJ- Brasil, Orto fenileno diamina 0,05M, água oxigenada 7,5%-Reagen-
RJ - Brasil) e incubadas durante 30 minutos no escuro a temperatura ambiente. A reação foi
interrompida com 10 µl/poço de H
2
SO
4
1N. A leitura foi realizada em leitor de ELISA a
492 ηm (Bio-Rad, microplate reader). O cut-off do ensaio foi determinado pelo teste de
Youden (Palatnik de Sousa et al., 1995): 0,450 (média dos valores das absorbâncias de
soros normais adicionadas a dois desvios padrões). Ao longo do experimento foi também
realizada análise de pool de soros caninos para presença de anticorpos de cabra anti-IgG1
de cão (1:1000) e anticorpo de carneiro anti-IgG2 de cão (1:8000) (Bethyl Laboratories,
Inc., Montgomery, TX, USA) conjugados a peroxidase.
3.5- Obtenção de amastigotas de L.(L.) chagasi
Foram utilizados hamsters CB provenientes do Biotério Central do Instituto de
Microbiologia "Professor Paulo de Góes" CCS-UFRJ, ou da ANILAB (Campinas, SP)
previamente infectados com amastigotas de L. (L.) chagasi MHOM/BR/1972/BH46, que
foram sacrificados por eterização. Esta cepa de Leishmania origina-se de um caso humano
de calazar de Minas Gerais de 1972, tendo sido mantida em hamsters desde essa época e
gentilmente cedida pela Prof
a
Marilene Michalik do ICB-UFMG. Baços de hamsters
infectados 2-3 meses antes foram removidos assepticamente. Um pequeno fragmento do
órgão foi destinado a realização de “imprinting”, sendo após corado pelo método de
Giemsa. Durante todo o processo, órgão em questão foi estocado em recipiente contendo
solução salina (NaCl 0,9%) permanentemente em banho de gelo. As lâminas coradas foram
avaliadas microscopicamente para identificação da carga parasitária. Os baços foram
macerados com homogeneizador de Dounce contendo solução salina. A suspensão foi
centrifugada a 1.500 rpm, por 5 min. a 4C. O sobrenadante foi centrifugado quantas vezes
foi necessário até que não se detectou resíduos de hemácias, sendo o precipitado
desprezado. O sobrenadante final foi centrifugado de 2800 a 3000 rpm por 20 min. a 4C.
Após isso o sobrenadante foi finalmente desprezado e o “pellet” contendo os amastigotas
foi lavado por centrifugação em solução salina e posteriormente ressuspendido em 1ml de
solução salina gelada. Uma alíquota foi separada e diluída a 1:500 em solução de cristal
violeta. A contagem para determinar a quantidade de parasito foi realizada em câmara de
Neubauer, em quadrante de hemácias, com aumento de (x 40).
3.6- Resposta Intradermorreação (IDR) contra o lisado de promastigotas
O lisado de promastigotas foi obtido a partir de L.(L.) donovani LD1S, após o
crescimento por 7 dias a 28
◦
C de cultura em tubo 13 cm com de tampa de rosca contendo 5
ml de meio BHI completo (item 3.1) suplementado com 10% de soro fetal bovino. A
cultura em fase logarítmica de crescimento foi transferidas para frascos de Erlenmeyer de 1
L, contendo 200 ml de meio BHI completo suplementado com 10% de soro fetal bovino,
que foram mantidos sob agitação em estufa a 28
◦
C durante 3 dias até atingirem a fase
estacionária. As células foram centrifugadas a 4C em 7000 rpm por 15 min., após isso
foram feitas 3 lavagens com solução salina (NaCl 0,9%). A suspensão celular foi submetida
ao congelamento no nitrogênio líquido e descongelamento em água corrente por cinco
vezes consecutivas. Todos procedimentos foram realizados em condições de esterilidade. A
seguir foi realizada dosagem protéica pelo método de (Lowry et al., 1951). Cada cão
recebeu 0,1 ml de salina contendo 200g de proteína de lisado de promastigotas de L. (L.)
donovani (10
8
promastigotas em fase estacionária/ml) na face interna da coxa direita via
intradérmica (id), enquanto que 0,1ml de solução salina de (NaCl 0.9%) foram inoculados
na coxa esquerda como controle negativo. A medida do diâmetro da reação foi efetuada
com uma régua 24, 48 e 72h após a inoculação. Para cada medida, o valor do seu respectivo
controle de salina foi subtraído. Valores superiores ou iguais a 5mm foram considerados
como intradermorreação positiva ao antígeno (da Silva et al., 2001, Borja-Cabrera et al.,
2002, Borja-Cabrera et al., 2004).
3.7- Citometria de fluxo em células mononucleares de sangue periférico
As células mononucleares foram obtidas a partir da coleta de sangue, através de veia
cefálica, em tubos contendo EDTA. Para técnica ex vivo, 30 µl de sangue foram incubados
durante 30 min. a temperatura ambiente no escuro, com 30 µl de anticorpo monoclonal
diluído em solução FACS dil (tampão PBS filtrado com 10% SFB): anti-Thy-1 (Rat-
IgG2b-clone YKIX 337.217) (1:800), anti-CD5 (Rat-IgG2a-clone YKIX 322.3) (1:800)
anti-CD4 (Rat-IgG2a-clone YKIX302.9) (1:12500), anti-CD8 (Rat-IgG1-clone
YCATE55,9) (1:100) (Serotec, Oxford, UK). PBS foi utilizado como controle negativo.
Após esse período, o material foi lavado com 2 ml de PBS wash (Tampão PBS com 0,5%
de soro albumina bovina e 0,1% azida sódica–Sigma, Co, USA) a 1300 rpm em
temperatura ambiente por 10 min. O sobrenadante foi aspirado com bomba de vácuo e logo
após misturado a 60 µl de conjugado anti-rato FITC (Serotec, UK) (1:200). O conjugado
anti-rato FITC não foi adicionado no controle de PBS nem nas amostras com marcação
referente ao anticorpo monoclonal anti-humano CD21 (Mouse–IgG1-clone IOB1a)
(Immunotech Co. Marseille, France), que foi utilizado num volume de 4 µl diretamente
sobre “pellet”. Após isso, as amostras foram incubadas no escuro durante 30 min. a
temperatura ambiente. As amostras foram tratadas com 2 ml de solução de lise (1:10 –
FACS Lysing solution
TM
, Becton & Dickinson, USA) durante a homogeneização no vortex
e incubadas por 10 min. a temperatura ambiente no escuro, com posterior centrifugação. Os
sobrenadantes foram descartados vertendo os tubos e o líquido restante dos tubos foi seco
por meio de papel absorvente. Após isso foi feita lavagem com PBS, seguida de
centrifugação e posterior fixação com 300µl de PBS-formol a 2,8%.
Paralelamente, foi realizada a análise das células mononucleares de Leishmania-
específicos, após proliferação in vitro com antígenos de Leishmania. Para isso, 1 ml de
sangue proveniente de punção da veia cefálica foi coletado em tubos estéreis contendo
heparina. O material foi diluído em 1 ml de meio RPMI-1640 (Sigma, Co, USA), e
derramado sobre um tubo contendo 2 ml de Histopaque 1077 (Sigma, Co, USA) seguido de
centrifugação a 2400 rpm por 20 min. a temperatura ambiente, para separação das células
mononucleares. O anel contendo as células foi coletado por aspiração, através da camada
de plasma e lavado 3 vezes com 1 ml de meio RPMI a 1800 rpm por 10 min. a 4
◦
C. As
células foram contadas em câmara de Neubauer, sendo logo após transferidas para placas
de 24 poços (Nunc Nunclon, Denmark) na concentração de 2x10
6
células/ml em RPMI
adicionado a 10% soro fetal bovino. As placas foram incubadas 5 dias a 37
◦
C e 5% de CO
2
,
na presença de lisado de 10
6
promastigotas de L. (L.) chagasi (L579 IOC – Fio Cruz). As
células foram coletadas e lavadas com 1 ml de PBS a 1500 rpm por 10 min. (duas vezes) e
posteriormente ressuspendidas em 150 µl de PBS. Trinta microlitros de suspensão celular
foram incubados com 30 µl de anticorpo monoclonal anti-CD (conforme descrito
anteriormente), durante 30 min. de incubação a temperatura ambiente no escuro.
Posteriormente, as células foram lavadas em PBS, e marcadas com conjugado, durante 30
min. a temperatura ambiente, no escuro. As células foram lavadas mais uma vez e fixadas
com PBS–formol a 2,8%. As amostras obtidas foram estocadas ao abrigo da luz, a 4
◦
C até o
momento da leitura no FACScalibur (Becton & Dickinson) do Departamento de
Imnunologia do IMPPG-UFRJ. A análise foi feita utilizando programa WinMDI (Windows
Multiple Document Interface Flow Cytometry Application) versão 2,8.
3.8- Avaliação da presença de parasitos
3.8.1- Cultura in vitro em meio NNN bifásico
Amostras de sangue ou medula óssea foram obtidas de forma estéril em tubos
contendo EDTA. 0,5ml das amostras foram colocadas em tubos com tampa de rosca que
contém meio bifásico (NNN). A fase sólida é composta de 37g/l de BHI (Difco), 2% de
ágar (Difco) e 5% de sangue desfibrinado de carneiro (Bio Campo). A fase líquida
contém 0,5ml de BHI completo. As culturas foram mantidas em estufa a temperatura de
28C e realizadas análises semanais durante o período de três semanas para visualização
das formas promastigotas.
3.8.2- Cultura in vivo em hamsters CB
Amostras de sangue periférico e medula óssea dos cães foram obtidas de forma
estéril em tubos contendo EDTA. A punção de medula foi realizada na região do manúbrio
esternal, com os animais previamente anestesiados. Foram utilizados 0,1 ml das amostras
para infecção de hamsters CB, após eterização, por punção intracardíaca (ic). A
sobrevivência e sinais clínicos dos hamsters foram avaliados periodicamente. Após 90 dias
de infecção os animais foram sacrificados por eterização e necropsiados para retirada do
baço e fígado e realização de “imprinting”. As lâminas foram secas ao ar, fixadas com
CH
3
OH por 5min. e coradas com corante de Giemsa em tampão de Sorensen (Na
2
HPO
4
a
0,05M e NaH
2
PO
4
a 0,017M) pH 7,2 por 15-20min. Após o processo de coloração, as
lâminas secas foram avaliadas microscopicamente (x100), para detecção de amastigotas.
3.8.3- Pesquisa de parasitos nos linfonodos, baço e fígado de cães
Linfonodos poplíteos ou cervicais foram puncionados com seringa e agulha fina. O
material recolhido foi analisado através de microscopia ótica, por meio de esfregaços em
lâminas, corados pelo método de Giemsa para detecção de formas amastigotas. Após a
eutanásia dos cães, foi realizada a necropsia, e retirados fragmentos de órgãos como baço,
fígado, e linfonodos para realização de “imprinting” corados com corante de Giemsa, para
detecção de formas amastigotas por microscopia ótica.
3.8.4- Reação de Polimerase em cadeia (PCR) para DNA de Leishmania
Para análise de PCR, foram coletados em tubos com EDTA respectivamente 1 ml de
sangue e aspirado de medula óssea e congelados a -20C. Para extração de DNA, foram
utilizados 0,7 ml das respectivas amostras, que foram lavadas com 0,5ml de tampão TE
(10mM Tris e 1mM EDTA) centrifugadas a 14000 rpm e tratadas com tampão de lise (10%
sódio dodecil sulfato-SDS em 0,2M acetato de sódio e 20µg/ml proteinase K) a 56C por 1
hora. O lisado foi tratado com 400µl de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico, sendo o
DNA precipitado em etanol, seco e ressuspendido em 50 µl de tampão TE. A análise de
PCR foi feita utilizando primers 13A (5’ GTG GGG GAG GGG CGT TCT 3’) e 13B (5’
ATT TTA CAC CAA CCC CCA GTT 3’) que amplificam a região conservada do
cinetoplasto (120bp) (Rodgers et al., 1990). O ensaio de PCR é capaz de detectar no
mínimo 25 parasitos. A análise da amplificação foi realizada em gel de agarose a 2%
contendo 0,5µg/ml de brometo de etídio (Sigma Co. USA), usando como padrão o “100bp
DNA ladder” (Invitrogen
TM
). Os géis foram visualizados por meio de luz UV no
transiluminador.
3.9- Análise estatística
As médias foram comparadas por análise de variância (ANOVA) análise de fatorial
simples e por ANOVA “one way”, método da diferença honestamente significante de
Tukey’s (DHS) usando SPSS-Windows. Para avaliar as diferenças entre as médias de dois
grupos foi utilizado também o intervalo de confiança de 95%. As proporções foram
comparadas por teste χ
2
. A análise do coeficiente de correlação foi realizada através do
teste de Pearson bivariado, prova bicaudal de significância (SPSS).
4- Resultados
4.1- Avaliação de Anticorpos anti-FML
A fim de avaliar o potencial imunoterapêutico da vacina Leishmune® formulada
com aumento de concentração de adjuvante (de 0,5 mg para 1mg de saponina), 24 cães
foram infectados com 2x10
8
amastigotas de L. (L.) chagasi BH 46 obtidas de baço de
hamster. Os animais foram monitorados mensalmente para detecção de anticorpos do tipo
IgG (Figura 1A e 1B). Até o mês 5 após a infecção, não foram detectados anticorpos. Entre
o mês 5-6 (150-180 dias após infecção), todos os animais começaram a apresentar
resultados positivos no FML-ELISA (cut-off Abs 492ηm= 0,450) no mês 6 os primeiros
sinais clínicos foram notados. Neste ponto, a vacina Leishmune® enriquecida de saponina
foi administrada no grupo de imunoterapia em três doses (mês 6, 7 e 8), enquanto o grupo
controle recebeu somente salina. No mês 7 após a primeira dose, foi notado um rápido
aumento de anticorpos IgG anti-FML no grupo dos animais vacinados, enquanto os animais
tratados com salina demonstram títulos baixos e estáveis (Figura 1A). A análise de
variância demonstrou diferenças significativas entre os tempos e tratamentos (p<0,0001).
As diferenças começaram no mês 5 (“Student-Newman-Keuls”, SPSS-Windows). Na
Figura 1B se observa a evolução individual das absorbâncias de anticorpos IgG anti-FML
nos animais tratados somente com salina. Quatro animais deste grupo (1,2,3 e 10),
tornaram-se soronegativos no mês 7, indicando o controle e resolução espontânea da
infecção. Foi também determinado o subtipo dos anticorpos produzidos contra o antígeno
FML, nos dois grupos estudados. A Figura 1C mostra as absorbâncias de anticorpos IgG2
anti-FML (resposta imune celular do tipo TH1) e IgG1 anti-FML (resposta imune celular
tipo TH2). Os animais vacinados com Leishmune® enriquecida de saponina, que
demonstraram altos níveis de anticorpos IgG específicos (Figura 1A) mostraram ainda, um
aumento da resposta IgG1 e IgG2 em relação ao grupo tratado com salina. Ambos os
grupos demonstraram os mesmos níveis de anticorpos no mês da infecção experimental
(mês 0) porém, enquanto a imunoterapia induziu níveis altos e estáveis de IgG2 (resposta
imune tipo TH1), a resposta IgG2 declina nos animais tratados com salina com a
progressão da infecção. Em contrapartida, os níveis de IgG1 diminuíram após a vacinação
no grupo vacinado, demonstrando uma tendência ao aumento nos animais tratados somente
com salina (resposta imune tipo TH2) (Figura 1C).
4.2- Avaliação da Resposta imune celular
A resposta imune celular foi avaliada primeiramente, pela análise da IDR em
resposta ao lisado de L. (L.) donovani. Os resultados individuais das reações de IDR, foram
monitorados no mês 9 e 11 e representadas na (Figura 2). O tratamento imunoterapêutico
está ligado a um efeito protetor mostrando mais reações positivas nos cães vacinados que
nos cães tratados com salina. No mês 9, após a completa vacinação, 75% dos animais
vacinados (9/12) e somente 50% dos tratados com salina (6/12) demonstraram respostas
positivas na IDR (acima de 5 mm de diâmetro) (Figura 2A). No mês 11, as reações
positivas foram de 84% nos vacinados (10/12) e 75% nos controles tratados com salina
(9/12) (Figura 2B). Não houve diferença significante entre os tratamentos no que diz
respeito às porcentagens das reações positivas (teste de χ
2
) ou nos tamanhos das reações
(ANOVA; p=0,778 para diferenças entre tratamentos e p=0.09 para diferença entre
tempos), isto provavelmente devido as medidas heterogêneas das reações (5-15mm de
diâmetro). Os cães controles tratados com salina 1,2 e 3 que espontaneamente perderam a
resposta de anticorpos (Figura 1B), demonstraram altos valores de IDR (12mm de
diâmetro), confirmando a sua condição de resistência à doença e proteção natural.
A resposta imune celular também foi analisada através da avaliação das proporções
relativas de linfócitos provenientes de células mononucleares de sangue periférico, no mês
12, após a infecção. A imunossupressão de células T e redução de linfócitos CD4+ e
CD21+ ocorrem em casos de calazar severo e está relacionada ao status infectivo do cão
para o vetor (Guarga et al., 2000). A média das proporções individuais de linfócitos T,
avaliados pela contagem de células THY-1+ e CD5+ tanto pela análise ex-vivo como pela
análise the in vitro, apresentou níveis normais (62-79% e 77-83%) (resultados não
mostrados) tanto para os cães tratados com salina, quanto para os tratados com vacina
indicando que a resposta imune celular foi mantida para ambos os grupos e que o impacto
da doença não foi severo, sugerindo assim a baixa virulência da cepa utilizada para a
infecção experimental. A análise ex-vivo das populações de linfócitos CD4+, CD8+ e
CD21+ (Tabela 1), não demonstrou alteração nos dois grupos estudados. A análise in vitro
após a incubação com antígeno de Leishmania porém, sendo uma técnica mais sensível,
demonstrou nos animais tratados com salina, uma significativa diminuição na proporção de
linfócitos CD4+ Leishmania específicos. A média de linfócitos CD4+, na análise in vitro,
dos animais vacinados (46,87%) cai fora do intervalo de confiança de 95% para os
controles tratados com salina (IC 95%, 21,53-42,73). Oito de doze animais tratados com
salina demonstraram valores abaixo da normalidade de linfócitos CD4+ Leishmania-
específicos, enquanto nos animais vacinados com Leishmune® enriquecida somente dois
de doze animais, apresentaram valores diminuídos de CD4+, reproduzindo a
imunossupressão que normalmente ocorre no calazar canino, confirmando o potencial
imunoprotetor do tratamento imunoterapêutico (Tabela 1). A média dos linfócitos CD4+
dos cães vacinados (46,87%) que proliferaram após contato com o antígeno de Leishmania
in vitro, também estão aumentados a respeito dos de animais controles (IC 95%, 39,89-
45,87) e vacinados (IC 95%, 39,38-43,86) analizados ex vivo confirmando a proliferação
imuno-específica a proteção gerada pela vacina.
4.3- Avaliação dos Sinais Clínicos
O aumento de sinais clínicos está correlacionado com o aumento de anticorpos IgG
anti-FML no grupo tratado com salina (p<0,0001, teste de Pearson bivariado, prova
bicaudal de significância), indicando que a infecção experimental reproduz o que ocorre na
doença natural. Os cães eram assintomáticos do começo do ensaio até o mês 6 após
infecção, quando o tratamento imunoterapêutico teve início (Tabela 2). Apesar do número
de sinais clínicos ter aumentado em ambos os grupos ao longo do experimento, a diferença
no número de sinais clínicos foi altamente significante entre os tratamentos (ANOVA,
p<0,0001) e entre os tempos (ANOVA, p<0,0001). O número de sinais clínicos foi mais
alto nos animais tratados com salina. A diferença no número de sinais clínicos entre os
tratamentos iniciaram no mês 8 (Tabela 2), após a finalização do tratamento
imunoterapêutico (p<0,05, teste de “Student-Newman-Keuls” e método da diferença
honestamente significante de Tukey’s, SPSS-Windows). Embora uma pequena diferença
tenha sido vista nos escores de tratados e não tratados após vacinação imunoterapêutica
(mês 6, 7 e 8), as diferenças cresceram no mês 11 e 15 (42 e 60 para os controles tratados
com salina e 30 e 45 para os vacinados, respectivamente)
A evolução dos sinais clínicos foi também avaliada por meio de escore, que
quantificou o número de sinais clínicos discriminando ainda a gravidade dos sinais
analisados, dos mais leves aos mais severos (Tabela 2). Quatro níveis de escore
relacionados ao aumento de linfonodos foram considerados: 0 para não detecção, 1 para
linfonodo pequeno (LP; até 1cm de diâmetro), 2 para linfonodo médio (LM, 1-1,5cm de
diâmetro), 3 para linfonodo grande (LG, 2cm de diâmetro). Para perda de peso foram
considerados dois níveis de escore: 2 para perda de peso leve (PPL, perda de 0-2 Kg) e 3
para perda de peso severa (PPS, perda de 2-5 Kg). Para detecção de alopécia (A),
onicogrifose (O), lesões de pele (P) e edema (E) foi considerado nível de escore 1.
Não houve morte ou casos de calazar severo no período de estudo analisado.
Somente o cão 7 do grupo controle tratado com salina, morreu no final do experimento
(mês 15). Sua morte deveu-se a um acidente não relacionado com a doença. A média dos
escores dos sinais clínicos totais que expressa o número e severidade dos sintomas
característicos da LVC, nos animais que receberam tratamento somente com salina foi de
17,83. Este valor apresenta-se fora do intervalo de confiança de 95% dos animais tratados
com Leishmune® enriquecida (IC 95%, 17,53-13,967) confirmando a proteção induzida
pelo tratamento imunoterapêutico, que reduz o número e severidade dos sintomas. O
número de sinais clínicos está correlacionado com o declínio da proporção de linfócitos
CD4+ Leishmania específicos (p=0.035, teste de Pearson bivariado, prova bicaudal de
significância), o que indica imunossupressão característica da LVC.
A Figura 3 mostra um gráfico bivariado, que correlaciona os escores de sinais
clínicos com proporção de linfócitos CD4+ de todos os animais. Todos os cães vacinados
com Leishmune® apresentaram-se agrupados na região de baixos escores de sinais clínicos
e taxas normais de linfócitos CD4+ enquanto que os cães controles tratados com salina, 7,
8, 10, 15 e 25 demonstraram taxas diminuídas de linfócitos CD4+ e escores de sinais
clínicos aumentados. Esses animais imunossuprimidos e sintomáticos representam 42% dos
controles de salina. Por outro lado, os controles de salina 1, 2 e 3, que espontaneamente
perderam a resposta de anticorpos (Figura 1) e que mostraram forte resposta de IDR,
indicativa de cura espontânea, apresentaram taxas normais de linfócitos CD4+ e baixos
escores de sinais clínicos (Tabela 2 e Figura 3). Vale a pena salientar que enquanto os cães
tratados com salina 7, 8 e 10 da família B, 15 da família C e 25 da família E apresentaram
quadro de imunossupressão, os cães vacinados 11, 12 e 13 da família B, 14 e 16 da família
C e 24 da família E, apresentaram resposta altamente protetora, apesar da sua origem
genética-familiar comum (Figura 3). O que significa que, a proteção gerada pela vacina
nesses animais não está correlacionada com a resistência genética, mas sim com o
tratamento com Leishmune®.
4.4- Avaliação das Evidências Parasitológicas
Na tabela 3, demonstramos os resultados das evidências parasitológicas de
cada cão nos meses 6, 9 e 11 após infecção e os resultados da detecção dos parasitos no
fígado, baço e linfonodos obtidos no mês 15 após necropsia. Nenhum resultado positivo foi
detectado até o mês 6, na análise da cultura in vitro de amostras de sangue e de medula
óssea (resultados não mostrados). Em contrapartida, a amplificação in vivo de parasitas de
amostras de sangue e medula óssea em hamsters, “imprinting” de material proveniente de
linfonodo (mês 6 e 11) e PCR de amostra de medula de cães (mês 9), demonstraram alta
sensibilidade (Tabela 2). Foram considerados positivos, os hamsters infectados com
amostras de sangue e medula óssea provenientes dos cães, que desenvolveram a doença
(análise de “imprinting” baço e fígado) ou morreram até 90 dias após a inoculação.
Levando em consideração a proporção de resultados positivos no total de avaliações, os
cães tratados com salina demonstraram maior porcentagem de evidências parasitológicas
(35/93; 37,6%), que os animais tratados com Leishmune ® enriquecida (28/96; 29,2%)
(Tabela 3), indicando que neles a doença estava progredindo enquanto que nos vacinados
havia controle da parasitemia e provavelmente do seu potencial infeccioso para o inseto,
Estas diferenças entretanto não eram estatisticamente significantes. Os cães 1, 2 e 3 do
grupo tratado com salina e os cães 4 e 5 tratados com Leishmune® enriquecida que não
demonstraram nenhuma evidência parasitológica, pertencem a mesma ninhada o que sugere
a possível resistência genética nesta família.
A partir do mês 9, logo após a finalização da vacinação, uma correlação
positiva estatísticamente significante foi encontrada entre a evolução do número de sinais
clínicos e número de evidências parasitológicas ao longo do tempo (p=0,038). Isto
confirma o potencial protetor do tratamento com Leishmune® enriquecida de saponina, que
reduziu os sinais clínicos e as evidências parasitológicas e infecciosidade nos cães
vacinados, modulando a infecção.
4.5- Análise de segurança da vacina Leishmune® enriquecida com 1 mg de saponina
A segurança e reatogenicidade da vacina Leishmune® enriquecida com 1 mg
de saponina, foram avaliadas. A incidência dos efeitos adversos nos cães vacinados com
Leishmune®-1 mg foi quantificado como a porcentagem de animais vacinados entre o total
de 12, que demonstraram qualquer sinal de dor, aumento no local da injeção, presença de
apatia, anorexia, diarréia ou vômito (Tabela 4), após uma ou mais doses de vacina. O
número de cães que demonstraram dor (25%) aumentou significativamente da primeira
para a terceira dose (p<0.001, ANOVA). A dor após cada dose de vacina durou por apenas
48 horas (p=0,006). O aumento no local da injeção foi o efeito adverso mais encontrado
(63,3%), embora o número de cães reativos estava aparentemente aumentado após a
primeira dose (Tabela 4), não foram encontradas diferenças significativas entre as
diferentes doses de vacina. Em 92% dos cães o aumento no local da injeção foi transitório,
declinando 24 horas após cada dose de vacina e desaparecendo completamente no quarto
dia após aplicação (Tabela 4). A reações de apatia nos cães analisados (11%), diminuíram
significativamente (p=0,039), após as primeiras 24 horas após cada dose de vacina (p<0.05,
método da diferença honestamente significante de Tukey´s, SPSS-windows). Não foram
encontradas reações de anorexia, vômitos, diarréia, alergia, anafilaxia ou mortes, indicando
que os efeitos adversos foram leves e que a vacina foi bem tolerada.
Figura 1: Evolução dos anticorpos anti-FML, medidos em absorbância ao longo do tempo, em
cães infectados experimentalmente com L. (L.) chagasi tratados com salina (quadrado em
branco) ou com Leishmune® enriquecida (esfera em preto). (A) Todos os animais infectados
apresentaram-se soropositivos entre o mês 5 e 6 (cutt off= Ab 492 ηm=0,450), e após foram
tratados nos meses 6, 7 e 8 (setas em preto) com três doses subcutâneas de Leishmune® enriquecida
(n=12) ou salina (n=12). Os resultados foram expressados por meio de média±SD (desvio padrão)
das triplicatas dos soros individuais. *indica diferenças significantes entre os tempos e ao longo dos
tratamentos analisados (ANOVA, p<0.0001). (B) Evolução individual dos anticorpos anti-FML dos
animais tratados com salina, os animais (1, 2, 3 e 10 linhas escuras) ficaram soronegativos no mês 7
indicando resolução espontânea da infecção. (C) Evolução dos anticorpos específicos IgG2 anti-
FML (linhas superiores) e IgG1 anti-FML (linhas inferiores) determinados por pool de soros dos
cães tratados com salina e tratados com Leishmune® enriquecida ao longo do tempo. As setas em
preto demonstram as três doses de tratamento imunoterapêutico com Leishmune® enriquecida.
0
0,5
1
1,5
2
Mês 0 Mês 9 Mês 11 Mês 15
Abs 492nm
IgG2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Meses
Abs 492nm
sal
1mg Leish
↓
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Abs 492nm
↓
↓
A
B
C
IgG1
Meses
Meses
IgG2
Figura 2: Intradermoreação ao lisado de L. (L.) donovani nos cães infectados com L.
(L.) chagasi, tratados com salina (quadrado em branco) ou após imunoterapia com
Leishmune® enriquecida (esfera em preto). As figuras acima, representam os valores
individuais de intradermoreação medidas em milímetros no mês 9 (A), e no mês 11 (B)
após infecção. As reações de IDR foram determinadas 48 horas após a injeção de 0,1 ml de
lisado de promastigotas de L. (L.) donovani (10
8
promastigotas em fase estacionária/ml),
por via intradérmica na pata direita, utilizando na pata esquerda 0,1 ml de salina, como
controle negativo. As medidas obtidas da leitura da pata injetada com salina foram
subtraídas das medidas obtidas da pata com antígeno de Leishmania. As reações 5mm são
consideradas positivas. A linha horizontal é considerada o cut off do método.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15
sal
1mg Leish
A
B
IDR
(mm)
IDR
(mm)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
5
10
15
sal
1mg Leish
Tabela 1: Fenotipagem de células T Leishmania-específicas em células mononucleares
de sangue periférico dos cães infectados com L. (L.) chagasi submetidos ao tratamento
com Leishmune® enriquecida ou somente com salina.
Salina 1mg –Leishmune®
Tratamento
Número
dos cães
CD4(%) CD8(%) CD21(%)
Número
dos cães
CD4(%) CD8(%) CD21(%)
1
44,58 30,3 11,87
4
42,46 28,17 9,71
2
36,13 24,85 15,9
5
36,24 23,91 12,22
3
41,57 32,96 11,66
6
37,67 31,45 9,43
7
38,19 24,37 18,09
11
45,98 30,94 4,57
8
38,93 32,69 16,38
12
44,19 27,1 9,09
9
41,85 17,24 15,68
13
46,29 20,84 3,59
10
54,35 23,88 7,96
14
42,45 17,38 15,48
15
44,6 28,54 10,06
16
40,58 22,12 9,21
17
37,08 27,97 11,58
19
46,91 31,9 5,89
20
45,39 26,06 19,23
22
40,36 17,77 29,69
21
46,31 23,36 16,23
23
40,47 25,5 24,07
25
45,67 30,78 11,66
24
35,89 18,19 28,96
ex vivo
Fenotipagem de
células
mononucleares
de sangue total
Média
IC (95%)
42,88
(39,89-45,87)
26,97
(24,23-29,59)
13,86
(11,81-15,91)
Média
IC (95%)
41,62
(39,38-43,86)
24,60
(21,40-27,79)
13,49
(8,07-18,00)
1
45,74 18,41 8,38
4
42,07 29,67 19,7
2 39,95 16,53 6,72 5 37,45 22,78 7,65
3
50,42 34,75 8,49
6
43,17 35,62 14,5
7
7,71 33,82 38,32
11
52,09 38,22 19,04
8 16,32 36,09 15,49 12 43,87 33,01 14,32
9
42,91 33,04 11,98
13
46,05 23,64 16,54
10
27,65 41,18 29,55
14
46,66 25,41 26,41
15 6,5 38,85 13,16 16 48,86 37,3 18,86
17
50,45 38,35 23,11
19
53,61 37,29 17,76
20
39,29 21,62 8,48
22
45,05 37,5 8,76
21 50,61 23,16 23,58 23 49,77 21,59 10,01
25
8,04 36,28 19,55
24
53,84 20,07 27,69
in vitro
Fenotipagem de
Linfócitos
Leishmania-
específicos
Média
IC (95%)
32,13
(21,53-42,73)
31,01
(25,92-36,10)
17,23
(11,41-23,05)
Média
IC (95%)
46,87
(43,93-49,80)
30,17
(25,98-34,36)
16,77
(13,05-20,49)
A proporção de células T foi obtida através de células mononucleares periféricas a partir de
sangue periférico dos animais tratados com salina e com Leishmune®, após análise ex-vivo
de sangue total e in vitro após incubação com lisado de promastigotas de Leishmania (L.)
chagasi, no mês 12 após infecção.
Tabela 2. Correlação entre o declínio da proporção de linfócitos CD4 + e o aumento
de escore de sinais clínicos.
Salina
CD4+
(%)
Meses
0-5 6 7 8 9 11 15
Escore (*)
1 45,74
-
PPL PPL PPL - PPL O, PPL, LP
2 2 2 0 2 1,2,1 12
2 39,95
-
PPL PPL PPL - O, PPL O, LP
2 2 2 0 1,2 1,1
11
3 50,42
-
O, PPL O, PPL O, PPL - PPS, O O, PPS, LP
1,2 1,2 1,2 0 3,1 1,3,1
18
7 7,71
-
O, PPL O, PPL O, PPL O, PPL PPS, O PPS, O
1,2 1,2 1,2 1,2 3,1 3,1
20
8 16,32
-
O, PPL O, PPL O, PPL PPL PPS, O A,P,O,PPS,LG
1,2 1,2 1,2 2 3,1 1,1,1,3,3
24
9 42,91
-
O,PPL O, PPL O, PPL - PPL, O PPL, O, LP
1,2 1,2 1,2 0 2,1 2,1,1,
16
10 27,65
-
O, PPL O, PPL O, PPL O PPS, O O, PPS, LM
1,2 1,2 1,2 1 3,1 1,3,2
20
15 6,5 - O, PPL O, PPL O, PPL O PPS,O,E O, LM
1,2 1,2 1,2 1 2,1,1 1,2
17
17 50,45
-
O,A,P O,A,LP O,A,,LP O PPL, O PPL, O, LP
1,1,1 1,1,1 1,1,1 1 2,1 2,1,1
17
20 39,29
-
O, PPL O, PPL O, PPL O O, PPL O, PPL, LG
1,2 1,2 1,2 1 2,1 1,2,3
19
21 50,61
-
PPL, O PPL, O PPL, O PPL PPS,O O,PPS, LM
1,2 1,2 1,2 1 3,1 1,3,2
20
25 8,04
-
PPL, O PPL, O PPL, O - PPS,O PPS, O, LG
1,2 1,2 1,2 0 3,1 3,1,3
20
Total
Escores
34 34 34 10 42 60
214
Média
IC 95%
17,83
(19,96-15,69)
Tabela 2 continuação:
Vacinados
CD4+
(%)
Meses
0-5 6 7 8 9 11 15
Escore (*)
4 42,07
-
PPL,O PPL,O PPL,O PPL O O,LP
14
1,2 1,2 1,2 2 1 1,1
5 37,45
-
PPL,O PPL,O PPL,O - O O,PPL,LP
14
1,2 1,2 1,2 0 1 1,2,1
6 43,17
-
PPL,O PPL,O PPL,O - PPL,O PPS,LP
16
1,2 1,2 1,2 0 1,2 3,1
11 52,09
-
PPL,O PPL,O PPL,O PPL,O PPS,O PPS,O,LM
22
1,2 1,2 1,2 1,2 3,1 3,1,2
12 43,87 - PPL,O PPL,O PPL,O PPL,O PPS,O O,PPL,LP
20
1,2 1,2 1,2 1,2 3,1 1,2,1
13 46,05
-
PPL PPL PPL PPL,O PPL,O O,LG
16
2 2 2 1,2 1,2 1,3
14 46,66
-
PPL PPL PPL - PPL,O O,LP
11
2 2 2 0 1,2 1,1
16 48,86
-
PPL,O PPL,O PPL,O O,A O O.PPL,LP
16
1,2 1,2 1,2 1,1 1 1,2,1
19 53,61
-
PPL PPL PPL O PPL,O O,PPL,LP
14
2 2 2 1 1,2 1,2,1
22 45,05
-
O,PPL PLL,O PPL,O - O O,PPL,LP
14
1,2 1,2 1,2 0 1 1,2,1
23 49,77
-
O,PPL PPL,O PPL,O O PPL,O O,PPL,LM
18
1,2 1,2 1,2 1 1,2 1,2,2
24 53,84
-
O,PPL PPL,O PPL,O - PPL,O O,LP
14
1,2 1,2 1,2 0 1,2 1,1
Total
Escores
33 33 33 15 30 45
189
Média
IC 95%
15,75
(17,53-13,967)
Cães infectados tratados com salina ou com Leishmune® enriquecida de saponina foram
mensalmente avaliados para: alopécia (A), onicogrifose (O), lesões de pele (P), edema (E),
aumento de linfonodos e perda de peso. Três níveis de aumento de linfonodos foram
considerados: escore igual a 0 para não detecção, escore igual a 1 para linfonodo pequeno
(LP; até 1 cm), escore igual a 2 para linfonodo médio (LM; 1-1,5cm) e escore igual a 3 para
linfonodo grande (LG; 2cm). A perda de peso foi classificada como: escore igual 2 para
leve (PPL; perda de 0-2kg) e escore igual a 3 para severa (PPS; perda de 2-5kg). Para
detecção de alopécia, onicogrifose, lesões de pele e edema, foi considerado escore igual a 1.
Figura 3: Correlação entre o aumento de escore de sinais clínicos e diminuição de
linfócitos CD4+ Leishmania específico. A figura representa um gráfico bivariável de
correlação entre os sinais clínicos individuais dos animais tratados somente com salina
(quadrado em branco) e com Leishmune® enriquecida (esfera em preto) e a proporção de
linfócitos CD4+ Leishmania específicos. Enquanto todos os animais tratados com
leishmune® enriquecida apresentaram-se agrupados demonstrando baixos escores de sinais
clínicos e taxas normais de CD4+, os cães do grupo controle 7, 8, 10, 15 e 25 mostram
níveis diminuídos de CD4+ e altos escores de sinais clínicos, típicos da leishmaniose
visceral canina.
15
23
17
2
1
14
22
4
5
24
19
13
6
9
16
3
21
11
12
20
10
8
25
7
0
10
20
30
40
50
60
10
15
20
25
Escore de sinais clínicos
CD4+ (%)
Salina
Leishmune®
Tabela 3. Evidências parasitológicas ao longo do tempo, nos animais tratados com
salina e com Leishmune® enriquecida.
6m 9m 11m
15m 6m 9m 11m 15m
S
MO
h
MO
PCR
MO
h
Sg
h
Ln
F B Ln
L
MO
h
MO
PCR
MO
h
Sg
h
Ln
F B Ln
1
- - - - - - - -
4
- - - - - - - -
2
- - - - - - - -
5
- - - - - - - -
3
- - - + - - - -
6
M - - - - - - -
7
- + + M + Nd Nd Nd
11
- + + - + - + +
8
+ + + - + - + +
12
- - - - - - - -
9
+ + - M - - - -
13
+ + + - - - - -
10
- - + - - - - -
14
- - + + - - - -
15
- + + + + - + -
16
+ - M M - - - -
17
M - M - - - - -
19
M - + - + - + +
20
- - M + + - + +
22
- - - + - - - +
21
+ - M M + - + +
23
+ + + - + + + +
25
- - - - - + - +
24
- - - - - - - -
Sinais
4 4 7 6 5 1 4 4
5 3 6 3 3 1 3 4
Total
12 12 12 12 12 11 11 11
12 12 12 12 12 12 12 12
A infecção por Leishmania foi confirmada nos animais tratados com salina (S) e nos
tratados com Leishmune® enriquecida (L) analisada por cultura in vivo em hamster de
amostras de medula óssea (MO h) e sangue (Sg h), “imprinting” de linfonodos corados por
Giemsa (Ln) coletadas por punção e análise de PCR de DNA de Leishmania em amostras
de medula óssea (MO PCR). A presença de amastigotas de Leishmania foi confirmada após
a necrópsia dos cães por análise de material proveniente de baço (B), fígado (F) e linfonodo
(Ln) na análise microscópica de lâminas coradas por Giemsa, no Mês 15. Hamsters mortos
(M) com evidências clínicas ou parasitológicas de leishmaniose visceral canina. (Nd)
refere-se a resultados não determinados.
Tabela 4. Porcentagem de cães que demonstraram dor, aumento local, apatia,
anorexia, diarréia ou vômito após vacinação com Leishmune ® enriquecida de 1 mg
de saponina e o declínio dos efeitos adversos ao longo do tempo.
Número de cães com efeitos adversos ao longo do tempo
Efeitos adversos
Cães
Reativos
(%)*
1ª dose 2ª dose 3ª dose
Dia1 Dia 2 Dia 4 Dia 1 Dia 2 Dia 4 Dia 1 Dia 2 Dia 4
Dor
25
1 0 0 2 1 0 5 1 0
Aumento local
63,3
6 0 0 8 4 1 8 2 1
Apatia
11
2 0 0 1 0 0 0 0 0
Anorexia
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Diarréia
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Vômitos
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
*Refere-se à porcentagem dos cães da amostra de vacinados (n=12) que demonstraram
algum efeito adverso ao longo do tempo após vacinação.
5- Discussão:
Os ensaios de vacinas em fase IIa são designados para checar se a vacina induz
proteção contra o desafio experimental. Embora estes sejam necessários para padronizar a
dosagem vacinal, a rota e o planejamento antes do teste de campo, mostram uma limitação
principal: a questionável representatividade dos desafios artificiais (WHO, 1997).
Certamente, os resultados obtidos com desafios utilizando cepas de laboratório adaptadas,
diferem dos induzidos pelo parasito na natureza. Este efeito é particularmente notável no
caso de uma doença transmitida por inseto como a LV.
A infecção experimental canina por Leishmania apresenta um grande problema, que
é a variabilidade da resposta dos animais frente à inoculação dos parasitos. Embora muitos
pesquisadores considerem esta variabilidade, um espelho do que ocorre na natureza, ela ao
mesmo tempo impede a fácil reprodutibilidade dos experimentos e dificulta a obtenção de
diferenças significativas entre os grupos (Moreno & Alvar, 2002). Tentando evitar este
efeito alguns autores optam pelos testes em animais da mesma raça ou de baixa
suscetibilidade (Ramiro et al., 2003, Lemesre et al., 2005). Alguns fatores como: a via de
inoculação, concentração do inóculo, estágio do parasito, e o número de cães utilizados, são
essenciais para o sucesso da infecção e reprodutibilidade da resposta. A via intravenosa é
sem dúvida a melhor via de inoculação para a obtenção de animais infectados e
sintomáticos. A inoculação de formas amastigotas parece ser a mais efetiva em induzir a
infecção e sinais clínicos, quando comparada a inoculação de formas promastigotas que
tendem a perder a virulência em cultivos contínuos (Moreno & Alvar, 2002). A
concentração do inóculo também tem papel importante na infecção experimental. Uma
grande concentração de parasitas (10
8
-10
9
) são necessários para uma resposta homogênea,
embora na natureza a infecção pareça ocorrer devido a um baixo número de parasitas,
mesmo não sabendo ao certo o número de picadas do vetor para induzir a doença (Moreno
& Alvar, 2002). Com este intuito por exemplo, foi iniciado em nosso laboratório o teste
com a vacina de DNA-NH36 em cães SRD, utilizando um inoculo de 7 x 10
8
amastigotas
de cepa recentemente isolada de cão (Borja-Cabrera et al., 2007). Evidências recentes sobre
o efeito imunossupressor da saliva de artrópodos que é co-injetada com o parasita na
infecção natural, explicam a necessidade de aumentar a carga e a virulência parasitária na
infecção experimental, para obtenção de um modelo robusto de teste de vacinas protetoras
(Titus et al., 2006, Norsworhty et al., 2004).
Embora a cepa de L. (L.) chagasi utilizada neste trabalho seja isolada de um caso de
calazar humano e previamente utilizada no desafio de dois estudos realizados em canil
experimental com 10
6
promastigotas (Mayrink et al., 1996; Fujiwara et al., 2005), não
induziu mortes ou casos severos da doença nos cães utilizados como controle tratados com
salina (Santos et al., 2007). Lemesre et al., (2005) também demonstraram ausência de
sinais clínicos severos característicos de calazar canino, em cães experimentalmente
desafiados com 10
8
promastigotas de L. (L.) infantum no mês 8 e 10 pós-vacinação com
antígenos purificados provenientes de sobrenadante de cultura de promastigotas de L. (L.)
infantum (LiESAp). Mesmo utilizando um inóculo mais potente (2x10
8
amastigotas),
considerado dois milhões de vezes mais alto que na natureza (Ramiro et al., 2003; Quinnell
et al., 2003a), somente três animais do grupo controle tratados com salina (cães 1,2 e 3) e
três do grupo vacinado (cães 4,5 e 6) desenvolveram infecção branda. A heterogeneidade
da infecção na LVC e sua espontânea remissão são fatores descritos na literatura quando os
cães apresentam-se assintomáticos ou espontaneamente curados como ocorreu em ambos os
grupos (Alvar et al., 1994; Courtenay et al., 2002; Atlet et al., 2002). Os resultados dos
cães 1, 2, 3, 4, 5 e 6 pertencentes a mesma ninhada, sugerem que a causa da infecção
branda é devida a uma possível condição de resistência genética, recentemente provada em
cães (Atlet et al., 2002; Quinnell et al., 2003b), mais do que à baixa infectividade da cepa
de Leishmania. Estando ciente de que o fato pudesse ocorrer, os animais foram
propositadamente randomizados de forma estratificada de acordo com a origem familiar,
distribuídos de forma que metade de cada ninhada pertenceria ao grupo vacinado e a outra
metade pertenceria ao grupo de salina. A determinação de qual cão seria destinado a cada
grupo foi feita por sorteio aleatório (Santos et al., 2007). A resistência natural de alguns
cães não impediu porém o significante aumento de sintomatologia e a diminuição da
proporção de linfócitos CD4+ Leishmania-específicos nos animais tratados com salina. Em
efeito as médias respectivas do grupo vacinado cairam fora do intervalo de confiança de
95% dos animais do grupo controle (Santos et al., 2007).
Ramiro et al., (2003) justifica o uso de um inóculo forte para assegurar que a falta
de infecção nos animais protegidos seja por meio de resposta imune causada pela vacinação
e não devido a resistência natural à doença. A ausência de sinais clínicos severos e morte,
tanto no presente trabalho como no de Ramiro et al., (2003); e a presença de animais
resistentes à infecção, prova que por mais que o inóculo seja forte não garante a
suscetibilidade. A suscetibilidade deve estar associada com a inoculação natural através da
picada do flebótomo (Norsworthy et al., 2004) ou com a variação genética dos cães
associada com a presença do gene NRAMP1 (Atlet et al., 2002) e/ou alelos de MHC de
classe II DLA-DRB1, que estão significativamente associados com níveis de anticorpos
anti-Leishmania IgG e presença de parasitos analisados por PCR (Quinnell et al., 2003b).
O estudo do efeito imunoterapêutico da vacina anti-Leishmania em camundongo
(Handman et al., 2000; Santos et al., 2003) e em cães é preliminar (Borja-Cabrera et al.,
2004). O desenvolvimento de uma ferramenta imunoterapêutica contra LV é muito
importante no Brasil, onde a campanha de controle contra a LV humana é baseada na
remoção e sacrifício de cães infectados e o tratamento quimioterápico canino não é
recomendado por não ser completamente eficaz e manter reservatórios (Tesh, 1995; Dye,
1996; Palatnik de Sousa et al., 2001). O efeito potencial da vacina FML na imunoterapia da
LVC foi demonstrada primeiramente em 21 cães infectados naturalmente por L. (L.)
chagasi, que eram soropositivos no ensaio de FML-ELISA, mas completamente
assintomáticos no início do ensaio de vacinação (Borja-Cabrera et al., 2004). Embora 37%
dos animais não tratados morreram, 90% dos vacinados permaneceram assintomáticos,
saudáveis com proporções normais de linfócitos CD4+ e CD21, até o mês 22 após
vacinação (Borja-Cabrera et al., 2004). Esses cães receberam reforços anuais com a
preparação da vacina FML enriquecida com saponina 1 mg e permaneceram saudáveis e
assintomáticos por 5 anos (resultados não publicados). O aumento da concentração de
saponina, no presente trabalho, foi realizado então, baseado em resultados prévios efetivos
na imunoterapia em modelo murino (Santos et al., 2003) e canino (Borja-Cabrera et al.,
2004).
Diferente dos resultados obtidos previamente na infecção experimental com L. (L.)
donovani e infecção natural com L. (L.) chagasi, onde os anticorpos ficam evidentes entre
90-120 dias (Mayrink et al., 1996; Quinnell et al., 1997; Borja-Cabrera, 2000; Borja-
Cabrera et al., 2004), os anticorpos anti-Leishmania nesta investigação somente começaram
a ficar evidentes entre 150 a 180 dias. A literatura estima que a soroconversão na natureza
ocorra em média aos 94 dias após a infecção e demora mais 105 dias para o cão se tornar
sintomático e infeccioso para o vetor com período latente entre infecção e infeccosidade
para o vetor de 199 dias (Courtenay et al., 2002). Nossos resultados indicam a baixa
virulência de cepa de L.(L.) chagasi que induziu uma demora no período de soroconversão
(Quinnell et al., 1997). Correlações significativas entre o aumento de anticorpos anti-FML
e o aumento de sinais clínicos, por sua vez correlacionado com o aumento de evidências
parasitológicas e o decréscimo nas proporções de linfócitos CD4+, foram encontradas para
os controles tratados com salina. As duas últimas variáveis altamente associadas a
infecciosidade para os flebótomos (Courtenay et al., 2002; Guarga et al., 2000). Isto
significa que apesar do uso de uma cepa que demonstra uma demora na soroconversão, a
infecção dos cães, simulou o que ocorre na infecção natural no campo. Por outro lado, após
a vacinação, um rápido e significante aumento nos anticorpos anti-FML foi observado nos
animais tratados com a vacina imunoterapêutica, característica esta, descrita pela primeira
vez em uma vacina imunoprofilática (da Silva et al., 2001; Borja-Cabrera et al., 2002) o
que é perfeitamente esperado devido ao uso de uma vacina composta de saponina da Quil-
A (Marciani, 2003) e um antígeno glicoprotéico (Paraguai de Souza et al., 2001; Santos et
al., 2002).
A alta resposta de anticorpos IgG2 anti-FML detectada em cães tratados com
Leishmune® enriquecida de saponina juntamente com a redução dos anticorpos IgG1,
sugere a indução da resposta TH1 protetora e curativa (Deplazes et al., 1995; Courtenay et
al., 2002, Mendes et al., 2003; Ramiro et al., 2003; Borja-Cabrera et al., 2004). A
diminuição da resposta de anticorpos IgG2 anti-FML, e um pequeno aumento da resposta
de anticorpos IgG1 anti-FML (resposta TH2), presente nos animais tratados somente com
salina, caracteriza a evolução da doença canina, já que anticorpos anti-IgG1 presentes em
cães infectados estão diretamente correlacionados ao avanço da doença (Deplazes et al.,
1995; Moreno et al., 1999; Nieto et al., 1999; Borja-Cabrera et al., 2002; Quinell et al.,
2003a; Mendes et al., 2003; Borja-Cabrera et al., 2004). A resposta induzida pelo
tratamento com Leishmune® enriquecida foi similar à obtida em cães naturalmente
infectados após imunoterapia com a vacina FML-saponina (Borja-Cabrera et al., 2004)
parecendo ser mais forte que a reportada por Ramiro et al., (2003) que vacinaram cães com
formulações contendo plasmídeo de proteína LACK de L. (L.) infantum. Os autores
demonstraram taxas elevadas de IgG2/IgG1 apenas entre os dias 28-42, após vacinação
(Ramiro et al., 2003), diferente dos resultados obtidos neste ensaio, em que a resposta
máxima predominante a IgG2 foi sustentada do mês 9 ao mês 15. Ma et al., (1995) ao
utilizar uma vacina canina contendo proteínas recombinantes de superfície de Borrelia
burgdorferi, utilizando QS21 como adjuvante, mostraram um aumento de oito vezes na
resposta de anticorpos IgG2 e um aumento de quatro vezes na resposta de anticorpos IgG1.
A produção de IgG2 demonstrou estar significativamente correlacionado com a atividade
anti-Borrelia in vitro (Ma et al., 1995). A vacina viva atenuada de Salmonella typhimurium
construída contendo seqüências da proteína antigênica EgDF1 de Echinococcus granulosus,
foi utilizada por via oral em cães, induzindo altos níveis de IgG e mostrando, nos cães
vacinados, níveis predominantes de IgG2 e níveis indetectáveis de IgG1 (Chabalgoity et al.,
2001). Estes resultados mostram que em outras doenças caninas, assim como na LVC, o
predomínio de anticorpos anti-IgG2 permite acompanhar a resposta protetora vacinal.
Respostas imunológicas significantes e proteção clínica foram demonstradas nesta
investigação. Uma correlação positiva foi encontrada entre a evolução do número de
sintomas e o número de evidências parasitológicas com o tempo, enquanto uma correlação
negativa foi encontrada entre o aumento de sinais clínicos e diminuição das proporções de
linfócitos CD4+, mostrando o potencial curativo da vacina Leishmune® enriquecida de
saponina. Embora a cura clínica não seja completa nos cães vacinados, os escores de
sintomas acumulados foram mais altos nos cães tratados com salina que nos vacinados. Na
verdade, os escores de animais tratados com salina aumentaram no mês 11, enquanto os
vacinados apresentavam escores estáveis até o mês 15, sugerindo que o efeito protetor
perdurou durante o período de estudo.
A resposta imune celular foi avaliada através do acompanhamento da IDR e da
proporção de linfócitos CD4+, CD8+ e CD21+ Leishmania-específicos. Enquanto os
animais não tratados apresentam uma significativa diminuição nos níveis de linfócitos
CD4+ Leishmania-específicos, esperada na imunossupressão causada pelo calazar canino, o
aumento na resposta de IDR e a resposta sustentada de linfócitos CD4+ Leishmania-
específicos, nos animais vacinados, demonstra o potencial imunoterapêutico da formulação
de Leishmune® enriquecida com saponina, revelando resposta imune mediada por TH1.
Diferente dos resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo que mostraram aumento de
linfócitos CD8+ (Borja-Cabrera et al., 2004) e embora seja esperado um aumento na
imunidade contra protozoários (Carvalho et al., 2002; Marciani, 2003) em animais tratados
com saponinas Quillaja saponaria, mediada por CD8+ (Marciani, 2003), não foi observado
um aumento significante na população de linfócitos CD8+ dos animais vacinados com
Leishmune® enriquecida. Neste ensaio, os níveis de CD8+ se mantiveram dentro da
normalidade (IC 95% 24,30-31,50) (Borja–Cabrera et al., 2004). Esta diferença de
resultados esta provavelmente relacionada com o método de elaboração da formulação
vacinal. No ensaio anterior (Borja-Cabrera et al., 2004), o antígeno FML e a saponina
foram hidratados e misturados no momento da aplicação no intuito de evitar a hidrólise
espontânea da saponina e a perda da sua cadeia acilada em C28. Foi descrito que em
solução ou condições fracamente alcalinas, a saponina QS21 perde a cadeia de
normonoterpenos acilada e com isso a sua atividade tóxica e estimuladora de linfócitos
CD8+ (revisado por Marciani, 2003). A vacina usada no presente trabalho foi fabricada em
condições industriais pela Fort Dodge Saúde Animal, envolvendo a hidratação da saponina
e a sua manutenção em solução por 5 horas prévias a liofilização, para efeitos de mistura e
formulação com o antígeno FML.
Em trabalhos anteriores, os cães vacinados de forma profilática com a vacina
Leishmune® (0,5 mg de saponina) demonstraram ausência de parasitos através da
correlação da ausência de reações de PCR de linfonodos, imunohistoquímica de pele, PCR
de sangue e ausência de sinais clínicos compatíveis com a doença (Nogueira et al., 2005).
Neste ensaio, uma significativa redução no número de sinais clínicos correlacionado com a
diminuição dos sinais parasitológicos, proporções normais de linfócitos CD4+ Leishmania-
específicos e aumento nos níveis de anticorpos IgG e IgG2 anti-FML confirmam o
potencial imunoterapêutico desta formulação no tratamento da LVC. Nossos resultados
sugerem que tanto a formulação imunoprofilática (Nogueira et al., 2005) como a
imunoterapêutica (Santos et al., 2007) provocam uma redução da infecciosidade nos
animais vacinados. Resultados muito similares foram obtidos no primeiro ensaio
imunoterapêutico com a formulação composta pela vacina FML enriquecida em cães
assintomáticos naturalmente infectados de áreas endêmicas do Brasil (Borja-Cabrera et al.,
2004) que permanecem saudáveis até o presente, cinco anos após o início do tratamento
vacinal. Por outro lado, neste ensaio, o aumento da sintomatologia nos animais tratados
com salina estão correlacionados com o aumento de anticorpos IgG anti-FML, evidências
parasitológicas e diminuição na proporção de linfócitos CD4+ Leishmania-específicos, que
é confirmado pela literatura recente (Moreno et al., 1999; Travi et al., 2001; Borja-Cabrera,
2000; Courtenay et al., 2002; Nogueira et al., 2005) indicando, apesar da infecção fraca, o
aumento da infecciosidade para o vetor.
A formulação profilática de Leishmune® é uma vacina bloqueadora de transmissão.
Os anticorpos presentes no soro dos cães, 12 meses após vacinação, inibem 79,3% da
infecção de flebótomos (Saraiva et al., 2006). A propriedade bloqueadora da transmissão da
Leishmune® enriquecida pode ter sido ainda aumentada neste ensaio, devido à formulação
imunoterapêutica utilizada com aumento da concentração de saponina. A ausência da
infecciosidade nos animais tratados com Leishmune® enriquecida para o vetor é sugerida
pelos níveis normais de linfócitos CD4+ Leishmania-específicos (Guarga et al., 2000; Travi
et al., 2001), a baixa proporção de evidências parasitológicas e a forte e consistente
resposta de anticorpos IgG2 anti-FML que pode levar ao declínio ou interrupção da
epidemia na natureza (Saraiva et al., 2006)
Dois estudos reportados na literatura utilizam vacinas profiláticas contra a infecção
experimental por L. (L.) infantum. Ramiro et al., (2003) utilizaram uma vacina composta de
DNA de plasmídeo e um vírus Vaccinia recombinante expressando um antígeno LACK
(rVV-LACK) de L. (L.) infantum, em cães desafiados com L. (L.) infantum. Resposta de
anticorpos IgG e sinais clínicos foram encontrados em 5/5 animais controles não tratados,
4/5 animais tratados apenas com LACK-DNA e 2/5 animais tratados com LACK-DNA +
rVVLACK. A formulação LACKDNA-rVVLACK foi a que melhor foi capaz de reduzir a
carga parasitária no fígado e baço e aumentar a proliferação contra o antígeno LACK,
produzindo picos de IFNγ e IL4, que desapareceram 1 mês após infecção (Ramiro et al.,
2003). A análise de significância estatística deste resultado não foi utilizada, provavelmente
devido ao pequeno número de cães pertencentes a cada grupo. Rafati et al., (2005)
utilizaram vacina composta de DNA e cisteína proteinase a e b (uma protease recombinante
de L. (L.) infantum) em combinação com Montanide 720 e CPG e desafiaram dez cães com
L. (L.) infantum. O grupo de animais vacinados demonstraram presença de anticorpos IgG,
IgG1 e IgG2, presença de proliferação de linfócitos, secreção de IFNγ/IL10 e resposta de
IDR mais aumentados que os controles não tratados, com menos resultados positivos na
cultura do parasito e na análise de DNA de Leishmania por PCR. Não foram reportados
sinais clínicos em nenhum dos grupos, provavelmente devido ao desafio com poucos
parasitos (5x10
6
promastigotas) (Rafati et al., 2005). A contribuição principal deste estudo é
na análise da imunogenicidade da vacina e não na eficácia vacinal. O potencial inunogênico
nesta formulação é esperado pelo uso de Montanide 720 e seqüência de CpG. Sabendo do
grau altamente heterogêneo da infecção observada na LVC (Atlet et al., 2002; Quinnell et
al., 2003b), nenhuma conclusão significativa pôde ser obtida neste estudo que utilizou 10
animais vacinados e somente 2 animais controles tratados com salina.
A concentração dobrada do adjuvante saponina na formulação terapêutica de
Leishmune® (1mg) (Santos et al., 2007), foi bem tolerada e efetiva, em ensaios
imunoterapêuticos prévios (Borja-Cabrera et al., 2004). Cada dose de Leishmune®
profilática (0.5mg de saponina) contém cerca de 90 µg de QS21, o principal componente
adjuvante ativo (Oliveira-Freitas et al., 2006). A formulação terapêutica contém então
180µg de QS21 em cada dose. O uso de 100 µg de QS21 mostrou perfeita tolerabilidade
em camundongos vacinados com a vacina FML-saponina (Palatnik de Sousa et al., 1994a;
Santos et al., 1999; Santos et al., 2002; Palatnik de Sousa et al., 2004a). Além disso, doses
contendo 100µg são bem toleradas e recomendadas para imunoterapia de melanoma em
tratamentos humanos (Slovin et al., 2005). A vacina para babesiose doença canina causada
Babesia canis é composta de antígeno do parasito e 1 mg de QuilA contendo cerca de 400
µg de QS21 saponina de Quillaja saponaria (Schetters et al., 1992). A vacina contra a
babesiose canina, contém portanto 2,2 vezes de concentração de QS21, que a formulação
imunoterapêutica de Leishmune®, e leva a 100% de dor local, 20% de anorexia, 33% de
apatia e 93% de aumento local, sendo utilizada desde 1992 (Schetters et al., 1992).
A vacina Leishmune® profilática contendo 0,5 mg de saponina induz em cães
reações transitórias como, dor local (40.87%), anorexia (20.48%), apatia (24.17%),
aumento local (15.90%), vômitos (2.4%) e diarréia (1.5%). Não foram relatados casos de
morte ou anafilaxia, somente dois cães demonstraram reações alérgicas (edema facial e
prurido) (Parra et al., 2007). Alopécias transitórias no local da injeção ocorrem em somente
(0,28%) dos casos com total regressão sem necessidade de tratamento. Todos os leves
efeitos adversos causados em resposta a vacina Leishmune® profilática, são transitórias e
desaparecem antes da aplicação da dose seguinte (Parra et al., 2007). Apesar do dobro da
concentração de adjuvante usado neste trabalho, o número de cães que demonstraram dor
(25%) e apatia (11%) foram baixos. Não foi encontrada morte, anafilaxia, anorexia, alergia,
vômito ou diarréia, demonstrando que a reatogenicidade não aumenta devido ao efeito
dose-resposta. A diferença na reatogenicidade entre a vacina de 0,5 mg e de 1 mg pode
estar relacionada aos diferentes protocolos de avaliação. Enquanto a formulação de 0,5 mg
foi diariamente avaliada após cada injeção durante 14 dias pelos proprietários dos cães
vacinados (Parra et al., 2007), a formulação imunoterapêutica foi avaliada no canil
experimental por veterinários no dia 1, 2, 4 e 9 após cada dose, Além disso na vacinação
utilizando a formulação de 0,5 mg foram utilizadas diferentes locais para injeção e a
injeção subcutânea na região do pescoço foi a escolhida, pois induziu menos reação (Parra
et al., 2007). No presente estudo, o local da vacinação foi na região do pescoço, isto pode
explicar o menor número de reações adversas encontradas. Em ambos estudos a maioria
dos efeitos adversos foram leves e desapareceram dentro de 5 dias após cada dose. O único
efeito adverso que aumentou na formulação imunoterapêutica foi o aumento no local da
injeção (de 15.9% no ensaio de 0.5mg para 63% no ensaio com 1 mg) (Parra et al., 2007;
Santos et al., 2007), característica esperada devido a reação inflamatória no local da injeção
causada pela Quillaja saponaria (Schetters et al., 1992; Santos et al., 2002; Palatnik de
Sousa et al., 2004a). Que na maioria dos casos reverteu 4 dias após a injeção.
Estudos recentes do nosso laboratório indicam que apesar da resposta inflamatória
local ser considerada efeito indesejado pelos veterinários, parte da resposta protetora TH1
induzida pela vacina está mediada pelo sucesso da resposta inflamatória, podendo a
inflamação gerada pela QS21 ser benéfica. A L (L.) chagasi e os seus PAMPS (“pathogen
associated microbial patterns”) interagem com os receptores PRR, liberando-se em
macrófagos e mastócitos as citocinas que estimulam a liberação de plasma dos vasos. O
plasma contém bradicininogênio que é clivado pela cisteína protease de L. (L.) chagasi
liberando bradicinina que estimula através do receptor BR2 no endotélio mais liberação de
plasma (Scharfstein, 2006). A reação se amplifica até que a bradicinina estimula o receptor
BR2 nas células dendríticas imaturas para produzir resposta TH1 protetora (Scharfstein,
2006). Ou seja, a inflamação gera uma resposta protetora. Se este for o caso, se a QS21 age
através deste sistema, a inibição desta via diminuiria a proteção gerada pela QS21. Foi o
que aconteceu, os camundongos Balb/c vacinados com FML e saponina que reduzem a
carga parasitária entretanto, aqueles tratados com a vacina e antagonista dos receptores de
bradicinina B2 ou B1, que é outro receptor análogo, não protegem nem sustentam os
linfócitos CD4+ como os vacinados com FML e saponina, porém ainda secretam IFN-γ e
até diminuem a IL-10 (Nico et al., 2007). Concluímos que parte da proteção gerada por
QS21 é devida a este sistema e que o fato da inflamação gerada após a vacina, formação de
nódulo, é benéfica.
A análise de segurança da vacina profilática industrial Leishmune®, foi a primeira
que descreve a reatogenicidade de uma vacina contendo Quillaja saponaria (Leishmune®)
em mais de 600 cães (Parra et al., 2007). A vacina foi considerada bem tolerada e não
tóxica (Parra et al., 2007). Não existem outros estudos sobre vacinas que reportem tais
informações. Diferente do trabalho realizado por (Parra et al., 2007), o trabalho atual relata
a análise de uma nova vacina experimental. A respeito da análise do custo-benefício, deve-
se considerar que, apesar de alguns efeitos indesejáveis, a vacina Leishmune® enriquecida
de saponina é imunoterapêutica para uma zoonose fatal em humanos e caninos, que
aumenta nas áreas endêmicas, cujo controle epidemiológico envolve o sacrifício de cães
infectados.
6- Conclusões
Nesta investigação foi analisado o efeito do aumento da concentração do adjuvante
na vacina Leishmune® enriquecida (contendo 1 mg de saponina), para utilização na
imunoterapia de cães infectados experimentalmente com L. (L.) chagasi. A análise do
potencial imunoterapêutico nos animais vacinados demonstrou um aumento na resposta de
anticorpos IgG2 anti-FML, da resposta de intradermoreação, da proporção de linfócitos
CD4+ Leishmania-específicos, juntamente com a diminuição nos sinais clínicos e
parasitológicos e a boa tolerabilidade e segurança. Esses resultados revelam o potencial
imunoterapêutico da Leishmune® enriquecida, possivelmente mediado por resposta imune
celular do tipo TH1 e a sua potencial utilização como nova ferramenta no controle da
leishmaniose visceral canina.
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8- Anexos
Comunicações aceitas para publicação:
Borja-Cabrera, G. P., Santos, F. N., Miyashiro, L. M., Menz I, Palatnik-de-Sousa, C. B.
Nucleoside hydrolase DNA vaccine against canine visceral leishmaniasis. Abstract do The
Vaccine Congress. Celebrating 25 years of publication. Oxford: Elsevier. 2007; v. 1. p:
001-001.
Santos, F. N., Borja-Cabrera, G. P. B., Miyashiro, L. M., Menz I., Palatnik-de-Sousa, C. B.
Immunotherapy against canine visceral leishmanaisis with the saponin enriched
Leishmune(R) vaccine. Abstracts do The Vaccine Congress. celebrating 25 years of
publication. Oxford: Elsevier. 2007; v. 1. p: 004-004.
Comunicações publicadas em congressos:
Oliveira-Freitas E, Casas CP, Borja-Cabrera GP, Santos FN, Nico D, Souza LOP, Tinoco
LW, Palatnik M, Parente JP, Palatnik-de-Sousa CB. Acylated and deacylated saponins of
Quillaja saponaria mixture as adjuvants for the FML-vaccine against visceral
leishmaniasis. Resumos da XXXII Reunião Anual de pesquisa Básica em Doença de
Chagas, Caxambu, MG. 2006. pp:158.
Gamboa-León R, Paraguai de Souza
E, Borja-Cabrera GP, Santos FN, Grechi J, Pinheiro
RO, Dumonteil E, Palatnik-de-Sousa CB. Immunotherapy against visceral leishmaniasis
with the nucleoside hydrolase-DNA vaccine of Leishmania donovani. Resumos da XXXII
Reunião Anual de pesquisa Básica em Doença de Chagas, Caxambu, MG. 2006. pp:160.
Elvira M Saraiva, André de Figueiredo Barbosa, Fernanda Nunes Santos, Gulnara Patrícia
Borja-Cabrera
,
Dirlei Nico, Lucieri Olegário Pereira Souza, Carolina de Oliveira Mendes-
Aguiar, Edilma Paraguai de Souza, Patrícia Fampa, Clarisa Beatriz Palatnik-de-Sousa. The
FML-vaccine (Leishmune
(R)
) against canine visceral leishmaniasis: a transmission blocking
vaccine. Resumos da XXXII Reunião Anual de pesquisa Básica em Doença de Chagas,
Caxambu, MG. Selecionado para comunicação oral. 2006. pp:160.
Nico D, Santos FN, Borja-Cabrera GP, Grecchi J, Myashiro LM, Palatnik M, Palatnik de
Sousa CB. Assessment of the monoterpene, glycidic and triterpene-moieties´ contributions
to the adjuvant function of the CP05-saponin of Calliandra pulcherrima Benth. Resumos
da XXXII Reunião Anual de pesquisa Básica em Doença de Chagas, Caxambu, MG. 2006.
pp:179.
Nico D, Santos FN, Borja-Cabrera G, Palatnik M, Silva BP, Parente JP, Palatnik de Sousa
CB. Structure-function studies of the novel CP05 saponin of Calliandra pulcherrima Benth
adjuvant: assessment of monoterpene, glycidic fractions and triterpene in adjuvant function.
Aceito para apresentação oral no MVADS2006 (Modern vaccine Adjuvants and Delivery
Systyems), The Royal Society de Londres, Reino Unido, 12-14 de Setembro de 2006
Oliveira-Freitas E, Borja Cabrera GP, Santos FN, Paraguai de Souza
E, Souza
LOP,Pinheiro RO, CB Palatnik de Sousa. Protection against visceral leishmaniasis after
intranasal immunization with the FML saponin vaccine. Inst. Resumos da XXXII
Reunião Anual de pesquisa Básica em Doença de Chagas, Caxambu, MG. 2005. pp:130.
Chame-Barreto F, Oliveira-Freitas E, Borja Cabrera GP, Santos FN, Paraguai de Souza
E,
Souza LOP, Nico D, Silva BP, Parente JP, Palatnik de Sousa CB. Comparative Adjuvant
potential of the QS21 and CP05 purified saponins in the FML vaccine against murine
visceral leishmaniasis. Resumos da XXXI Reunião Anual de pesquisa Básica em Doença
de Chagas, Caxambu, MG. 2005. pp:131.
GP Borja Cabrera , FN Santos, E Paraguai de Souza, LM Parra, I Menz, Z Xu, HJ Chu, CB
Palatnik de Sousa. Phase I safety and immunogenicity trial of Leishmune ® in dogs of
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Italy, 10-15 April 2005, pp:116. Selecionado para apresentação em Mesa Redonda
FS Nogueira, MAB Moreira ,
GP Borja Cabrera, FN Santos, I Menz, LE Parra, Z Xu, HJ
Chu, CB Palatnik-de-Sousa, MCR Luvizotto. Leishmune ® vaccine blocks the transmission
of canine visceral leishmaniasis. Absence of Leishmania parasites in blood, skin and lymph
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infected dogs of an immunotherapy assay with Leishmune vaccine. Resumos da XXXI
Reunião Anual de pesquisa Básica em Doença de Chagas, Caxambu, MG. 2004. pp:162.
Borja Cabrera GP, Paraguai de Souza E, Mendes CO, Casas CP, Santos FN, Okada LYH,
Trivellato FAA, Palatnik de Sousa CB. Phase I safety and immunogenicity trial of
Leishmune ® in dogs of an endemic area. Resumos da XXXI Reunião Anual de pesquisa
Básica em Doenca de Chagas, Caxambu, MG. 2004. .pp:162.
Santos FN, Borja Cabrera GP, Reis A, Paraguai de Souza E, Palatnik de Sousa CB.
Immunotherapy against experimental canine visceral leishmaniasis with the Leishmune
vaccine. Resumos da XXXI Reunião Anual de pesquisa Básica em Doença de Chagas,
Caxambu, MG. 2004. pp:182.
Palatnik de Sousa, C.B.; Paraguai de Souza, E; Borja-Cabrera, G.P.; Santos F.N.; Okada,
L.Y.H.; Trivellato, F.A.A.; Reis, A.; Tinoco, L.W.; Silva, B.P.; Palatnik, M.; Parra, L.M.;
Menz, I. Immunotherapy against canine visceral Leishmaniasis with the FML-vaccine.
Modern Vaccine Adjuvant Formulations CD MVAF-Praga-2004. Selecionado para
comunicação oral.
Artigos publicados:
1. FN Santos, GP Borja-Cabrera, LM Miyashiro, J Grechi J, AB Reis, Moreira MAB, OA
Martins Filho, MCR Luvizotto, Palatnik M, CB Palatnik-de-Sousa. 2007. Immunotherapy
against experimental canine visceral leishmaniasis with the saponin enriched-Leishmune®
vaccine. Vaccine. 2007; 14,-25 (33):6176-6190.
2. Parra LE, Borja-Cabrera GP, Santos FN, Souza LO, Palatnik-de-Sousa CB, Menz I.
Safety trial using the Leishmune vaccine against canine visceral leishmaniasis in Brazil.
Vaccine. 2007 Mar 8;25(12):2180-6.
3. Nico D, Santos FN, Borja-Cabrera GP, Palatnik M, Palatnik de Sousa CB. Assessment of
the monoterpene, glycidic and triterpene-moieties contributions to the adjuvant function of
the CP05 saponin of Calliandra pulcherrima Benth during vaccination against
experimental visceral leishmaniasis. Vaccine. 2007 Jan 8;25(4):649-58.
4. Oliveira-Freitas E, Casas CP, Borja-Cabrera GP, Santos FN, Nico D, Souza LO, Tinoco
LW, da Silva BP, Palatnik M, Parente JP, Palatnik-de-Sousa CB. Acylated and deacylated
saponins of Quillaja saponaria mixture as adjuvants for the FML-vaccine against visceral
leishmaniasis. Vaccine. 2006 May 1;24(18):3909.
5. Gamboa-Leon R, Paraguai de Souza E, Borja-Cabrera GP, Santos FN, Myashiro LM,
Pinheiro RO, Dumonteil E, Palatnik-de-Sousa CB. Immunotherapy against visceral
leishmaniasis with the nucleoside hydrolase-DNA vaccine of Leishmania donovani.
Vaccine. 2006 May 29;24(22):4863-73.
6. Saraiva EM, de Figueiredo Barbosa A, Santos FN, Borja-Cabrera GP, Nico D, Souza
LO, de Oliveira Mendes-Aguiar C, de Souza EP, Fampa P, Parra LE, Menz I, Dias JG Jr,
de Oliveira SM, Palatnik-de-Sousa CB. The FML-vaccine (Leishmune) against canine
visceral leishmaniasis: a transmission blocking vaccine. Vaccine. 2006 Mar
20;24(13):2423-31.
7. Nogueira FS, Moreira MA, Borja-Cabrera GP, Santos FN, Menz I, Parra LE, Xu Z, Chu
HJ, Palatnik-de-Sousa CB, Luvizotto MC.Leishmune vaccine blocks the transmission of
canine visceral leishmaniasis: absence of Leishmania parasites in blood, skin and lymph
nodes of vaccinate. Vaccine. 2005. 23: 4805-4810.
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