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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
A DESINFECÇÃO COMO BARREIRA SANITÁRIA NA PREVENÇÃO DE
DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS (DTA): SENSIBILIDADE DE
AMOSTRAS DE Staphylococcus aureus ISOLADAS EM ALIMENTOS NO IPB-
LACEN/RS, NOS ANOS DE 2002 a 2006, FRENTE AO HIPOCLORITO DE
SÓDIO.
Jane Mari Corrêa Both
PORTO ALEGRE
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
A DESINFECÇÃO COMO BARREIRA SANITÁRIA NA PREVENÇÃO DE
DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS (DTA): SENSIBILIDADE DE
AMOSTRAS DE Staphylococcus aureus ISOLADAS EM ALIMENTOS NO IPB-
LACEN/RS, NOS ANOS DE 2002 a 2006, FRENTE AO HIPOCLORITO DE
SÓDIO.
Jane Mari Corrêa Both
Dissertação de Mestrado apresentada como
requisito para obtenção do grau de Mestre
em Ciências Veterinárias, na especialidade
de Epidemiologia, Saneamento e Profilaxia.
Orientador: Prof. Dr. César A. M. Avancini
PORTO ALEGRE
2007
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Catalogação na fonte preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Veterinária da UFRGS
B749d Both, Jane Mari Corrêa
A desinfecção como barreira sanitária na prevenção
de doenças transmitidas por alimentos (DTA):
sensibilidade de amostras de Staphylococcus aureus
(coagulase positiva), isolados em alimentos no IPB-
LACEN/RS, nos anos de 2002 a 2006, frente ao hipoclorito
de sódio / Jane Mari Corrêa Both - Porto Alegre:UFRGS,
2007.
53 f.; il. – Dissertação (Mestrado) – Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Veterinária,
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,
Porto Alegre, BR-RS, 2006. César A . M. Avancini,
Orient.
1. Sthapylococcus aureus 2. Hipoclorito de sódio
3. Desinfecção 4. Antimicrobianos: resistência
5. Doenças transmitidas por alimentos (DTA)
I. Avancini, César A . M., Orient. II. Título
CDD 619.46
Jane Mari Corrêa Both
Dissertação “A desinfecção como barreira sanitária na prevenção de doenças
transmitidas por alimentos (DTA): sensibilidade de amostras de Staphylococcus aureus
isoladas em alimentos no IPB-LACEN/RS, nos anos de 2002 a 2006, frente ao
hipoclorito de sódio”, aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre
pelo Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul.
Aprovada em 10 de janeiro de 2007.
Comissão formada pelos professores:
Prof. Dr. César Augusto Marchionatti Avancini
Orientador e Presidente da Comissão
Prof. Dr. Claudiomar Soares Brod
Membro da Comissão
Prof. Dr. Eduardo César Tondo
Membro da Comissão
Prof. Dr. José Maria Wiest
Membro da Comissão
Aos meus filhos Eduardo e Daniel.
AGRADECIMENTOS
À amiga e companheira de trabalho Solange Longaray pelo apoio e colaboração.
Ao Prof. César Avancini, pela confiança e orientação acadêmica.
À Direção do IPB-LACEN/RS e aos colegas da Divisão de Análise de Produtos,
em especial aos colegas da Seção de Água e Alimentos, pelo esforço de colocar à minha
disposição a estrutura física necessária, além do apoio Técnico e do incentivo oferecidos
durante a realização deste trabalho.
RESUMO
As doenças transmitidas por alimentos provocam perdas humanas, sociais e
econômicas, sendo que, para a prevenção de suas ocorrências, a higienização (limpeza e
desinfecção) do ambiente de processamento e manipulação é procedimento de relevante
importância. Para promover a segurança microbiológica dos alimentos, os compostos
inorgânicos liberadores de cloro livre estão entre os desinfetantes químicos mais
utilizados. No entanto, as evidências indicam que não há agente químico antimicrobiano
frente aos quais os microrganismos não apresentem ou não possam ser selecionados por
algum grau de resistência. Para obter dados sobre a ação do cloro como barreira
sanitária, o objetivo deste trabalho foi o de verificar, frente ao hipoclorito de sódio, a
sensibilidade de 32 amostras de Staphylococcus aureus isoladas no IPB/LACEN/RS de
alimentos envolvidos em surtos de DTA entre os anos 2002 e 2006. Através do teste de
suspensão, simularam-se condições de uso: concentração de 200 ppm de cloro livre, na
ausência e na presença de matéria orgânica (1% de leite U.H.T. integral);
subconcentração de 100 ppm de cloro livre; e quatro tempos de contato (5, 10, 15 e 30
minutos). A 200 ppm, na ausência de matéria orgânica, as 32 amostras foram sensíveis,
sendo que, aos 10 minutos, 31 delas já estavam inativadas. A 200 ppm, na presença de
matéria orgânica, mesmo aos 30 minutos de contato, 27 foram resistentes. Com 100
ppm de cloro livre, foram necessários 30 minutos de contato para que 24 amostras
apresentassem sensibilidade. Concluiu-se que a sensibilidade das amostras foi
influenciada pela concentração, pela presença de matéria orgânica e pelo tempo de
contato. Considerando as condições do experimento quanto à efetividade do cloro como
barreira sanitária em DTA, frente ao Staphylococcus aureus, esses três fatores precisam
ser levados em consideração.
ABSTRACT
Foodborne diseases cause human, social and economic losses. Their ocurrence can be
avoided chiefly by cleaning and disinfection measures in processing and manipulation
premises. Inorganic chlorine compounds are among the most common chemical
disinfectants used to promote microbiological food safety. However, evidences indicate
that microorganisms are capable to present or develop some degree of resistance to
practically every known chemical agent. So, in order to obtain data regarding chlorine
compounds as a sanitary barrier, this work evaluated the sensitivity, to sodium
hypochlorite, of 32 samples of Staphylococcus aureus isolated at IPB-LACEN/RS from
food involved in foodborne diseases outbreaks occurred between 2002-2006. Through
the suspension test, usage conditions were simulated: a 200 ppm free chlorine solution
in the absence and presence of organic matter (1% UHT whole milk); a sub-
concentration of 100 ppm free chlorine solution; and four contact times (5, 10, 15 and
30 minutes). At the concentration of 200 ppm, in absence of organic matter, all the 32
samples were sensitive. After 10 minutes,31 of them were already inactivated. At 200
ppm, in presence of organic matter, 27 strains were resistant even after a contact of 30
minutes. At 100 ppm free chlorine concentration, simulating a sub concentration usage,
it was necessary a 30 minutes contact to 24 samples demonstrate some sensitivity. It
was concluded that the sensitivity of samples was influenced by concentration, presence
of organic matter and contact time. In view of the experimental conditions relative to
chlorine efficacy as a sanitary barrier, in foodborne diseases associated to
Staphylococcus aureus, these three factors must be considered.
LISTA DE TABELAS
Pag
TABELA 1- Sensibilidade e resistência das 32 amostras de Staphylococcus
aureus isoladas no IPB-LACEN/RS entre 2002 e 2006, de alimentos
envolvidos em surtos de DTA, frente ao hipoclorito de sódio em duas
concentrações, com e sem matéria orgânica, usando o teste de suspensão em
30 minutos de contato..........................................................................................
31
TABELA 2- Sensibilidade e resistência das 32 amostras de Staphylococcus
aureus isoladas no IPB-LACEN/RS entre 2002 e 2006, em alimentos isolados
em surtos de DTA, frente ao hipoclorito de sódio em duas concentrações, com
e sem matéria orgânica, usando o teste de suspensão e considerando o tempo
de contato.............................................................................................................
35
SUMÁRIO
Pág
RESUMO .............................................................................................................. 5
ABSTRACT............................................................................................................
6
LISTA DE TABELAS ......................................................................................... 7
1 INTRODUÇÃO................................................................................................
9
2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA........................................................................
12
2.1 Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) ............................................
12
2.2 Staphylococcus aureus...................................................................................
15
2.3 Fontes de Infecção por Staphylococcus aureus...........................................
16
2.4 Desinfecção: Controle de Microrganismos no Ambiente..........................
17
2.5 Desinfetantes: Sensibilidade e Resistência..................................................
19
2.6 O Cloro como Desinfetante ..........................................................................
22
2.7 Avaliação da Eficácia do Desinfetante e da Sensibilidade da Bactéria....
24
3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................
26
3.1 Amostras Bacterianas...................................................................................
26
3.2 Reativação das Amostras..............................................................................
26
3.3 Provas Bioquímicas.......................................................................................
27
3.4 Teste de Sensibilidade do Staphylococcus aureus ao Hipoclorito de
Sódio.....................................................................................................................
28
3.5 Análise Estatística.........................................................................................
30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................
31
4.1 Apresentação e Discussão dos Resultados ..................................................
31
4.2 Apresentação dos Resultados Estatísticos...................................................
37
5 CONCLUSÕES................................................................................................
39
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 40
APÊNDICES......................................................................................................... 46
ANEXOS ............................................................................................................. 48
9
1 INTRODUÇÃO
Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, no ano de 2000, 2,1 milhões
de pessoas no planeta morreram de doenças diarréicas, muitas delas atribuídas a
alimentos e água contaminados. Nos EUA, 76 milhões de casos de doenças
transmitidas por alimentos são relatados a cada ano, resultando em 325.000
hospitalizações e 5.000 mortes (WHO, 2002). No Brasil, de 1999 a 2005, foram
notificados 4.716 surtos de DTA, com 98.018 pessoas acometidas e registro de 39
óbitos segundo dados da Secretaria de Vigilância em Saúde (BRASIL, 2006).
No período de 1999 a 2005, o estado do Rio Grande do Sul notificou 1.275
surtos de DTA. Excluindo os casos e surtos sem informação, 59,5% ocorreram em
residências. Nestes, 44,4% foram identificados como fonte de contaminação ovos e
produtos à base de ovos e 18%, por alimentos de origem mista. Salmonella spp foi
detectada em 64,2% dos surtos (BRASIL, op. cit.). Em levantamento epidemiológico
de período anterior, também realizado nesta unidade federativa foi observado que, na
série histórica de surtos de DTA investigados de 1987 a 2000, o número de surtos foi de
1.298, e destes, 147 foram causados por Staphylococcus aureus, perfazendo 11% do
total de surtos no período (RIO GRANDE DO SUL, 2000).
Entre as causas mais freqüentes apontadas como favorecedoras da
contaminação dos alimentos são citadas: a falta de qualificação dos manipuladores no
que diz respeito às boas práticas de processamento, as precárias condições de manuseio
e conservação bem como a deficiente higienização do ambiente onde esses alimentos
são preparados (GERMANO & GERMANO, 2001).
A higiene é um elemento básico para a segurança e qualidade dos alimentos.
Segundo a ICMSF (1997), ela cria impactos tanto nos alimentos produzidos e
consumidos localmento, quanto no comércio alimentar internacional, e as práticas não
higiênicas, seja durante a produção, a colheita ou o processamento podem provocar a
deterioração do alimento ou mesmo promover a veiculação de doenças.
Com o objetivo de promover a proteção da saúde da população, no que se refere
ao controle sanitário na área de alimentos, o Regulamento Técnico de Boas Práticas
para Serviços de Alimentação – Resolução RDC nº 216 (BRASIL, 2004) estabelece
10
procedimentos para garantir as condições higiênico-sanitárias do alimento preparado.
Entre os procedimentos aplicáveis, o que diz respeito especificamente à higienização,
esta é definida como sendo operação que compreende duas etapas: a limpeza e a
desinfecção. Enquanto a limpeza refere-se à remoção de resíduos orgânicos e
inorgânicos, a desinfecção refere-se à operação de redução, por método físico ou agente
químico, do número de microrganismos no ambiente em nível que não comprometa a
qualidade do alimento.
Entre os desinfetantes químicos autorizados para serem usados em superfícies
de ambientes onde são manipulados alimentos (BRASIL, 1988), segundo Andrade e
Macêdo (1996), o cloro, sob a forma de hipoclorito de sódio, tem sido o composto mais
utilizado para garantir a qualidade microbiológica da água e dos alimentos, bem como
para aumentar a vida útil de produtos processados. Também esse composto químico é,
comparativo com outros desinfetantes, de baixo custo e de fácil acesso, estando
amplamente disponível no comércio.
No entanto, conforme alertam algumas pesquisas (MCDONNELL & RUSSEL,
1999; CHAPMANN, 1998) a experiência com resistência a antibióticos e a biocidas
indicam que não há agente químico antimicrobiano que não possa, eventualmente,
selecionar ou induzir resistência nos microrganismos. Especificamente frente ao cloro,
Dychdala (1991) informa que existem evidências de que vários microrganismos
apresentam diferentes graus de resistência a esse antimicrobiano.
No IPB-LACEN/RS (Instituto de Pesquisas Biológicas/Laboratório Central de
Saúde Pública/SES/RS), entre os anos de 2002 e 2006, foram isoladas 32 amostras de
Staphylococcus aureus em alimentos envolvidos em surtos de DTA. Tendo como tema
a desinfecção como barreira sanitária na prevenção ou controle de toxinfecções
alimentares, propos-se como problema de pesquisa perguntar sobre a sensibilidade
dessas amostras isoladas de alimentos frente ao hipoclorito de sódio. Como hipótese,
colocou-se a expectativa de que elas apresentassem diferentes graus de sensibilidade
(inativação), ou resistência, ao desinfetante, sendo a variação dependente de fatores
ambientais ou de manuseio.
Os objetivos gerais deste trabalho foram o de agregar informações sobre a
sensibilidade e possíveis resistências de microrganismos ao composto químico
desinfetante hipoclorito de sódio, ou por outro ângulo, a eficácia desse antimicrobiano
em cenários epidemiológicos concretos. Também geral foi o objetivo de
11
instrumentalizar agentes de vigilância sanitária com dados atuais sobre a utilização do
cloro na prevenção de DTA. Como objetivo específico foi proposto verificar a
sensibilidade de amostras de Staphylococcus aureus isoladas em alimentos no IPB-
LACEN/RS, nos anos de 2002 a 2006, frente ao antimicrobiano de ambiente
hipoclorito de sódio, simulando condições de uso em duas concentrações, diversos
tempos de contato e na presença de matéria orgânica.
12
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA)
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o alimento deve estar
disponível às pessoas em quantidade e qualidade nutricionalmente adequadas, além de
ser livre de contaminações que possam levar ao desenvolvimento de doenças de origem
alimentar. Alimentos contaminados são nocivos à saúde de quem os consomem,
provocando diversas enfermidades. Dados demonstram que os agentes etiológicos são,
na maioria das vezes, microrganismos, e a contaminação pode ocorrer em diversas
fases do processamento do alimento. Dessa forma, são necessárias medidas de controle
em todas as etapas do processamento: colheita, conservação, manipulação, transporte,
armazenamento, preparo e distribuição dos alimentos (LEMOS, 1999).
Silva Júnior (2002) ao ser servida uma refeição, ela pode estar boa,
aparentemente boa ou má. Uma refeição boa fornece ao corpo todos os nutrientes
necessários ao desenvolvimento da vida e também está livre de contaminação
potencialmente prejudicial. A refeição aparentemente boa é aquela que não apresenta
alteração das características sensoriais (aroma, sabor), mas está contaminada. E uma
refeição má apresenta suas propriedades organolépticas (sensoriais) alteradas, ou seja, a
aparência, o aroma e o sabor mostram que ela está estragada. Para haver uma
contaminação basta ocorrer uma falha na escolha de produtos, ou na técnica de
conservação, na técnica de preparo ou finalmente nas normas de higiene.
Riedel (1987 apud LEMOS, 1999) verificou que, geralmente, as pessoas sofrem
de perturbações nutricionais por falta, por excesso ou por seleção inadequada de seus
alimentos. Estas perturbações são agravadas quando as condições sanitárias dos
alimentos, através da manipulação e conservação, são inadequadas.
As enfermidades de origem alimentar ocorrem quando uma pessoa contrai uma
doença devido à ingestão de alimentos contaminados com microrganismos ou toxinas
indesejáveis. Essa condição é denominada como toxinfecção alimentar. Muitos casos de
enfermidades causadas por alimentos não são notificados, pois seus sintomas são
muitas vezes pouco expressivos e inespecíficos. Os sintomas mais comuns de doença
13
de origem alimentar incluem dor de estômago, náusea, vômito, diarréia e febre
(FORSYTHE, 2002).
O Ministério da Saúde, na RDC nº12/2001, define Doença Transmitida por
Alimentos (DTA) como uma síndrome originada pela ingestão de alimentos e/ou de
água que contenham agentes etiológicos (biológicos, toxinas, físicos ou substâncias
químicas) em quantidades tais que afetem a saúde do consumidor em nível individual
ou grupo de população (BRASIL, 2001).
Segundo Lemos (1999), as doenças de origem alimentar podem ser divididas em
três grupos:
A) Toxinfecções Alimentares - doenças veiculadas pelos microrganismos e
parasitas (bactérias, fungos, vírus, protozoários e helmintos) e seus produtos tóxicos.
B) Intoxicações Químicas - doenças advindas da ingestão de alimentos
contaminados por metais, agrotóxicos e substâncias raticidas e inseticidas colocadas
como proteção contra pragas.
C) Intoxicações Naturais - estas intoxicações são decorrentes da confusão na
escolha dos produtos semelhantes, porém com espécies tóxicas de plantas e cogumelos
ou contaminação natural de peixes, moluscos, mexilhões com substâncias tóxicas.
Para Leitão (1987 apud LEMOS, 1999) as doenças de origem alimentar podem
ser divididas em duas categorias: as infecções e as intoxicações. Para este autor as
infecções são causadas pela ingestão de células viáveis do microrganismo patogênico,
as quais, uma vez no interior do organismo, colonizam órgãos com a conseqüente
reação dos mesmos à sua presença, desenvolvimento, multiplicação ou toxinas
elaboradas. O autor ressalta ainda que as intoxicações são provocadas pela ingestão de
toxinas decorrentes da intensa proliferação do microrganismo patogênico no alimento.
São exemplos deste processo as intoxicações causadas por Clostridium botulinum,
Staphylococcus aureus e cepas de Bacillus cereus.
Atualmente, a transmissão de doenças infecciosas por alimentos constitui um
evento freqüente que, em algumas situações, pode apresentar elevada gravidade para
um grande número de pessoas no Brasil e no mundo (BRASIL, 2005).
As DTA não representam apenas um dano passageiro, sendo que 2 a 3% dos
casos desenvolvem problemas crônicos, causando impactos econômicos. As
conseqüências crônicas provocadas pela ingestão de alimentos contaminados por
bactérias podem manifestar-se através de diversas doenças como, por exemplo, as
doenças reumatóides provocadas por bactérias Gram-negativas ou ainda doenças auto-
14
imunes ou super-antigênicas provocadas pelos gêneros Staphylococcus, Streptococcus,
Yersinia e Clostridium, relacionadas com distúrbios auto-imunes, inclusive podendo
provocar diabete melittus insulino-dependente. A E. coli O157:H7 provoca a síndrome
urêmica hemolítica, levando à falência renal principalmente em crianças. Estas
bactérias têm distribuição mundial, então assim como se observa o aumento da
incidência de doenças bacterianas transmitidas por alimentos, pode-se esperar o
aumento das seqüelas crônicas (PINTO, 1999).
As toxinfecções alimentares de origem microbiana têm sido reconhecidas como o
problema de Saúde Pública mais abrangente no mundo atual e causa importante na
diminuição da produtividade, das perdas econômicas que afetam países, empresas ou
simplesmente consumidores. O impacto econômico negativo estabelecido por estas
enfermidades alcança níveis cada vez mais preocupantes, acarretando grandes perdas
econômicas para as indústrias, o turismo e a sociedade (NASCIMENTO, 2000).
Surtos de intoxicação alimentar são frequentemente relatados, sendo comuns os
causados por Staphylococcus aureus , pois havendo no alimento condições favoráveis à
multiplicação, em poucas horas certas linhagens produzem uma toxina termoestável
que é responsável pelo quadro clínico (RADDI et al., 1988). A toxina forma-se durante
a multiplicação dos microrganismos no alimento antes de ser ingerido, e não após a
ingestão. Os sintomas aparecem rapidamente, em geral após 4 a 6 horas. Os sintomas
caracterizam-se por vômitos intensos, diarréia, dor abdominal e, às vezes, seguida de
colapso. Os Staphylococcus aureus são fácil e rapidamente destruídos pelo calor,
mediante a pasteurização ou a simples cocção. A toxina é mais resistente ao calor e é
destruída durante a ebulição por 30 minutos (LEMOS, 1999).
Também Cunha Neto et al. (2002) indicaram que intoxicação alimentar
provocada por Staphylococcus aureus é devido à ingestão de enterotoxinas produzidas
e liberadas pela bactéria durante sua multiplicação no alimento, representando um risco
para saúde pública. A enterotoxina estafilocócica é termoestável, e está presente no
alimento mesmo após o cozimento, possibilitando desta forma a instalação de um
quadro de intoxicação de origem alimentar. Os autores informam ainda que esse agente
é o responsável por aproximadamente 45% das toxinfecções no mundo e vários
trabalhos apontam os manipuladores de alimentos como os maiores responsáveis pela
sua transmissão. O período de incubação e a severidade dos sintomas dependem da
quantidade de enterotoxina ingerida e da susceptibilidade do indivíduo. Níveis dessas
15
toxinas variando de 0,01 a 0,4µg por grama do alimento são suficientes para provocar a
intoxicação, afetando indivíduos mais sensíveis.
2.2 Staphylococcus aureus
Os estafilococos são bactérias Gram-positivas, imóveis, de forma esférica,
agrupadas em massa irregular em forma similar a de “cacho” de uva. Apresentam
metabolismo aeróbio e anaeróbio, atuando sobre carboidratos com produção de ácidos.
O Staphylococcus aureus é um dos agentes mais comuns, responsável por surtos de
intoxicação de origem alimentar (CUNHA NETO et al., 2002).
Segundo Trabulsi et al. (1999), os Staphylococcus são divididos em duas
categorias: coagulase positivas e coagulase negativas, e entre os coagulase positiva o
Staphylococcus aureus representa a espécie geralmente envolvida em infecções
humanas.
Segundo Tortora et al. (2000), o Staphylococcus aureus é o mais patogênico dos
Staphylococcus e quase todas as cepas patogênicas de S. aureus são coagulase
positivas, produzem toxinas estafilocócicas, as enterotoxinas, que afetam o trato
gastrintestinal.
Atualmente, órgãos internacionais como Organização Mundial da Saúde,
International Committee on Microbiological Specification for Foods (ICMSF) e a
American Public Health Association (APHA), recomendam padrões e métodos de
análise microbiológica tanto clínica como de alimentos para a rotina laboratorial, testes
bioquímicos mínimos para diferenciação na área clinica de S. aureus, S. epidermidis e
S. saprophyticus, e em análise de alimentos o S. aureus e S. epidermidis. No Brasil,
para a identificação de S. aureus, são recomendados os testes de produção de
coagulase, termonuclease, coloração de Gram e catalase, permitindo diferenciar o S.
aureus de S. intermedius e S. hyicus. Alguns autores relacionam testes bioquímicos,
como a produção de coagulase, termonuclease, hemólise e fermentação de manitol com
a capacidade das cepas de Staphylococcus spp. e S. aureus em produzirem
enterotoxinas. Estes são testes indiretos, úteis para detecção de cepas potencialmente
enterotoxigênicas, embora autores tenham verificado que características fisiológicas
16
podem ou não diferenciar cepas enterotoxigênicas das não enterotoxigênicas (CUNHA
NETO et al. 2002).
2.3 Fontes de Infecção por Staphylococcus aureus
Segundo Silva Júnior (2002), o homem pode contaminar-se diretamente de outra
pessoa, ou indiretamente através da água, do solo, ar, fômites e alimentos. Nesta cadeia
epidemiológica, o alimento é um carreador de contaminação, que por sua vez pode
receber uma contaminação diretamente das vias de eliminação do homem e dos
animais. A transmissão pode ser feita pelo próprio homem direta ou indiretamente, se
estiver doente ou se for portador são.
Os Staphylococcus são amplamente distribuídos na natureza e fazem parte da
microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves. O principal reservatório, no
homem, são as fossas nasais. A ocorrência neste sítio é tamanha, que parece ser
impossível sua eliminação. Os fatores que mais predispõem à contaminação do
alimento vêm da inadequada manipulação dos produtos, resultando em contaminação
cruzada na exposição dos produtos a temperaturas adequadas ao crescimento bacteriano
(MESQUITA et al. 2006).
Os microrganismos patógenos podem se manter em partículas de alimentos ou de
água sobre utensílios lavados inadequadamente. Do ponto de vista sanitário, o uso de
recipientes e utensílios contaminados representa um risco, particularmente quando se
refere a alimentos cozidos que não se destinam ao consumo imediato (SILVA JÚNIOR,
2002).
De acordo com Raddi et al. (1998), os manipuladores de alimentos que são
portadores nasais de S. aureus, tendo as mãos como veículo de trabalho, podem
perpetuar a cadeia epidemiológica de intoxicação alimentar. Estudos epidemiológicos
vêm sendo realizados na tentativa de estabelecer uma possível ligação entre portadores
de S. aureus, a disseminação do mesmo e perpetuação de cepas resistentes, que se
propagariam no ambiente familiar e de trabalho.
A detecção e controle de portadores de Staphylococcus aureus assumem
significativa importância quando se trata de profissionais da área de saúde e
17
manipuladores de alimentos, devido à existência de cepas produtoras de enterotoxinas
(ANDRADE & ZELANTE, 1989).
Um dos objetivos da contagem de S. aureus em alimentos está relacionado com o
controle da qualidade higiênico-sanitária dos processos de produção de alimentos,
condição em que serve como indicador de contaminação pós-processo ou das condições
sanitárias das superfícies destinadas ao contato com alimentos (SILVA et al., 1997).
Para Silva Junior (2002), a razão para limpar e “sanificar” (desinfetar) as
superfícies que entram em contato com os alimentos e o ambiente, deve-se ao fato
dessas operações auxiliarem o controle microbiológico, o que pode influir sobre a
estabilidade e inocuidade do alimento, pois alguns surtos estão diretamente
relacionados à falta de limpeza e desinfecção dos equipamentos e superfícies. Além
disso, a contaminação cruzada pode estar associada à falta de higiene de equipamentos
e utensílios de cozinha.
2.4 Desinfecção: Controle de Microrganismo no Ambiente
Rosembeerg (1977) ressalta que é importante ter-se bem claro que uma
enfermidade não se determina pela simples presença do agente causal. Mas em um
controle de enfermidades, os objetivos primordiais são o de impedir a transmissão do
agente causal a um novo hospedeiro, ou o de não deixar que o novo hospedeiro
desenvolva a infecção (prevenção da ocorrência ou interrupção da evolução da doença).
Segundo Gelman et al. (1978) a desinfecção e anti-sepsia, dentro dos níveis de
prevenção de doenças transmissíveis, localizam-se no período pré-patogênico, na
prevenção primária e insere-se na da categoria saneamento ambiental, como medida
preventiva. Isso significa a remoção do meio ambiente de agentes vivos que escaparam
de seus reservatórios humanos ou animais e estão aptos para sobreviver, por tempo
variável, no ambiente animado ou inanimado.
Os processos de desinfecção têm como objetivo a destruição ou inativação de
organismos patogênicos, capazes de produzir doenças, ou de outros organismos
indesejáveis. A desinfecção não implica, necessariamente, a destruição completa de
todas as formas vivas, embora muitas vezes o processo de desinfecção seja levado até o
ponto de esterilização (MEYER, 1994).
18
Reber (1973), Borneff (1977), Schliesser e Strauch (1981) (apud WIEST, 1984)
conceituam a desinfecção e anti-sepsia como o controle ou a eliminação dirigida de
microrganismos considerados indesejáveis em situações-problema específicas, pela
atuação em sua estrutura ou em seu metabolismo, independente de seu estado
funcional, visando prejudicar a transmissão desses microrganismos e/ou reduzir a sua
dose infectante.
Segundo a portaria RDC N° 216 (BRASIL, 2004), a desinfecção é a operação de
redução por método físico ou químico, do número de microrganismos em nível que não
comprometa a qualidade higiênico-sanitária do alimento.
Bier (1975) define como anti-séptico toda substância capaz de impedir a
proliferação de bactérias, seja inibindo-as (ação bacteriostática), seja destruindo-as
(ação bactericida, germicida). O termo anti-séptico deve restringir-se ao emprego em
tecidos vivos, e o termo desinfetante ao emprego sobre substâncias inanimadas.
Quanto ao momento da aplicação do desinfetante e anti-séptico na intervenção
em situações-problema de saúde diz-se que na prevenção da ocorrência usa-se a
desinfecção na suposta ausência, mas iminente presença de agente causal. A prevenção
da evolução é feita empregando-se a desinfecção em situações já presentes, em
desenvolvimento, nas quais nos defrontamos com os agentes causais (WIEST, 1984).
Para Laubush (1971 apud MEYER, 1994) alguns dos fatores que influenciam na
desinfecção e, portanto, no tipo de tratamento a ser empregado, podem ser resumidos
em:
• espécie e concentração do organismo a ser destruído;
• espécie e concentração do desinfetante;
• tempo de contato;
• características químicas e físicas.
A concentração de microrganismos é um fator importante, visto que uma
densidade elevada significa uma maior demanda de desinfetante. A aglomeração de
organismos pode criar uma barreira para a penetração do desinfetante. A morte de
organismos pela ação de um desinfetante, fixando-se os outros fatores, é proporcional à
concentração do desinfetante e ao tempo de reação. Deste modo, pode-se utilizar altas
concentrações e pouco tempo, ou baixas concentrações e um tempo elevado (MEYER,
1994).
O procedimento de higienização consiste fundamentalmente no uso de
detergentes e “sanificantes” (desinfetantes). Embora os detergentes diminuam a carga
19
bacteriana das superfícies, o objetivo principal do seu uso é a remoção de resíduos
orgânicos e minerais. A sanitização, que é a última etapa do procedimento de
higienização, visa reduzir microrganismos alteradores e eliminar patogênicos até níveis
seguros, de modo a obter um produto de boa qualidade higiênico-sanitária (MORAES
et al., 1997).
Wiestreich e Lechtman (1980) indicaram que há uma grande quantidade de
agentes químicos disponíveis para o controle dos microrganismos e, constantemente,
aparecem novas substâncias no mercado. Um problema comum enfrentado por todo
pessoal que utiliza desinfetantes e anti-séptico seria o de selecionar um deles para o
uso. Assim, seria necessária uma grande vigilância na escolha das substâncias utilizadas
para interromper o ciclo de doenças no ambiente, sob pena da eficácia ficar
prejudicada.
2.5 Desinfetantes: Sensibilidade e Resistência
Rosembeerg (1977) já observou que é preciso ter-se presente que qualquer
modificação em algum dos elementos do ecossistema (agente causal, hospedeiro e
ambiente), desencadeará uma série de adaptações dos demais.
Atualmente pode-se raciocinar que a resistência antimicrobiana é o resultado de
uma complexa interação entre agentes antimicrobianos, microrganismos e meio
ambiente. Contudo, a versatilidade microbiana de se adequar às condições impostas,
representa um formidável mecanismo de defesa. Isto na realidade não deveria
representar surpresa, tendo em vista que a história da evolução vem apontando que,
todo o organismo vivo busca sempre mecanismos de adequação às suas novas
realidades, e a resistência dos microrganismos aos antimicrobianos é uma condição
inevitável. A resistência bacteriana aos antimicrobianos não respeita fronteira: seu
aparecimento em localidades remotas pode resultar em impacto para o mundo, em curto
espaço de tempo, representando atualmente um dos maiores problemas de saúde, em
países desenvolvidos e emergentes, em todo mundo. Seu aumento tem ocorrido de
forma alarmante nos últimos anos, sendo estimado, que no futuro o uso destes fármacos
possa resultar em perda da efetividade (FIOCRUZ, 2005).
20
Segundo Sander et al. (2002) as bactérias desenvolvem resistência após uma
exposição prolongada aos desinfetantes, e estudos revelaram que bactérias do mesmo
gênero e espécie têm diferentes graus de sensibilidade a um mesmo desinfetante. Além
disso, desinfetantes com formulações químicas similares, porém não idênticas, têm
eficácia diferente contra as mesmas bactérias.
Concentrações residuais podem agir como um foco para a sobrevivência de
microrganismos ou para um gradual ou rápido desenvolvimento de bactérias resistentes
a biocidas. Isso reforça o argumento de que os efeitos de biocidas em células
bacterianas e, certamente, em outros tipos de microrganismos devem ser examinados
sob diferentes concentrações (RUSSEL, 2002).
Nos últimos anos, consideráveis avanços têm sido realizados no entendimento da
resposta de diferentes microrganismos aos agentes antimicrobianos. A resistência pode
ser uma característica própria do microrganismo (intrínseca) ou adquirida por mutação,
mediada por plasmídios ou transposons. A resistência intrínseca tem sido demonstrada
por bactérias Gram negativas, esporuladas, micobactérias e, sob certas circunstâncias,
Staphylococcus. A resistência adquirida ou mediada por plasmídios tem sido associada
aos compostos mercuriais e outros sais metálicos. Mais recentemente, resistência
adquirida a certos tipos de biocidas (desinfetantes) tem sido observada, notadamente
pelos Staphylococcus (McDONNELL & RUSSEL, 1999).
Segundo o manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI/NCCLS,
2003) o termo Sensível (S) significa que uma infecção por uma determinada cepa pode
ser tratada adequadamente com a dose de agente antimicrobiano recomendada para esse
tipo de infecção e espécie infectante, exceto quando contra-indicado. Resistente (R), as
cepas resistentes não são inibidas pelas concentrações sistêmicas dos agentes
antimicrobianos geralmente atingíveis nos regimes terapêuticos normais e/ou se
inserem na faixa de maior probabilidade de ocorrência de mecanismos específicos de
resistência microbiana (por exemplo, β-lactamases), além da eficácia clínica não ter
sido confiável nos estudos terapêuticos.
A resistência de algumas espécies de microrganismos a desinfetantes específicos
varia consideravelmente. Bactérias não-esporuladas são menos resistentes que as
formadoras de esporos e formas encistadas e vírus podem ser bastante resistentes
(ROSSIN, 1987 apud MEYER, 1994).
21
Guimarães et al. (2000), testaram 27 amostras bacterianas isoladas de situações
clínicas com o objetivo de avaliar a atividade bactericida de alguns desinfetantes. Os
resultados mostraram que todas as amostras testadas foram sensíveis ao hipoclorito de
sódio, ao glutaraldeído e à associação de quaternário de amônio-formaldeído-álcool
etílico. No entanto, a sensibilidade das amostras ao fenol e ao quaternário de amônio se
mostrou variável.
Silva et al. (2003), demonstraram, em um estudo a respeito de ocorrência de E.
coli O157: H7 em vegetais, a sensibilidade aos agentes de desinfecção de verduras, que
tanto o cloreto de benzalcônio quanto o hipoclorito e o dicloroisocianurato de sódio são
eficazes na destruição de E. coli O157:H7 em suspensão, nas concentrações de 100 e
200 ppm, após 30s de contato. Demonstraram ainda que tanto a E. coli O157:H7 ATCC
43890, quanto a E. coli ATCC 11229, apresentam sensibilidade similar a estes
desinfetantes.
Moraes et al. (1997), observaram que esporos de bactérias isolados de
equipamentos de abatedouro de aves apresentaram diferentes resistências aos
sanificantes hipoclorito de sódio, ácido peracético e dicloroisocianurato de sódio,
indicando a necessidade de uma seleção criteriosa de agentes químicos para
higienização. Comentam ser importante um rodízio entre o hipoclorito de sódio e o
ácido peracético, os mais eficientes entre os testados.
Odlaug e Pflug (1976 apud MORAES, 1997) mostraram que usando soluções
contendo 100 mg/L de cloro residual, em pH 8,0, a partir do hipoclorito de sódio,
obtiveram uma redução decimal na população de esporos de Bacillus subtilis em 60
minutos . Por outro lado, (ALVARENGA et al., 1991; ANDRADE e SERRANO,
1993, apud MORAES, 1997), utilizaram 105 mg/L de Cloro Residual Total (CRT), a
partir do hipoclorito de sódio, em pH 8,0, a 30°C. Para se obter 5 Reduções Decimais
(RD) na população dos esporos sob avaliação, um deles determinou o tempo de 5
minutos e o outro cerca de 4 minutos .
Chapmann (1998) alerta que a experiência com resistência a antibióticos e a
biocidas indica que não há agente químico antimicrobiano que não possa eventualmente
desenvolver resistência nos microrganismos. E que essa observação, acoplada com a do
decréscimo da taxa de oferecimento de novos grupos químicos biocidas ativos,
aumentam a necessidade de saber manejar o risco do desenvolvimento/seleção de
resistências bem como responder rapidamente à sua eventual ocorrência.
22
2.6 O Cloro como Desinfetante
O cloro e seus vários compostos, especialmente os sais de hipoclorito, é um dos
sanitizantes empregados com mais sucesso nas indústrias de alimento. São compostos
eficientes e de baixo custo, tendo larga aplicação como, por exemplo, na forma de
“spray”, para o controle bacteriológico em indústrias de frutas e hortaliças (KIM et al. ,
1999 apud BERBARI et al. ,2001).
Quanto à concentração de cloro, segundo Andrade e Macêdo (1996), na
“sanificação” (desinfecção) adotada na indústria de alimentos, a concentração de cloro
disponível nas soluções devem ser bem mais elevadas do que em outras aplicações dos
compostos clorados. Informam que, geralmente, é recomendada uma concentração de
100 mg/L de cloro residual livre quando a desinfecção é efetuada por imersão ou
circulação e 200 mg/L quando o processo é aspersão ou nebulização com tempo de
contato do cloro de até 15 ou 20 minutos. Também, que existe recomendação do
Departamento de Saúde e Bem-Estar dos Estados Unidos da América para que as
concentrações das soluções cloradas usadas em superfícies que entram em contato com
alimentos não ultrapassem 200 mg/L de cloro livre. No entanto, o uso de soluções mais
concentradas, dentro desses limites, se faz necessário, pois existe a possibilidade da
limpeza não ter removido completamente os resíduos orgânicos das superfícies, o que
inativa parte do cloro livre aplicado.
Segundo Gopal (apud BERBARI et al., 2001) a concentração de 100 mg/L de
cloro é a mais utilizada em indústrias de alimentos em países como a Austrália e Nova
Zelândia.
Dentre os diversos agentes químicos disponíveis para uso como sanificantes
(desinfetantes), encontram-se compostos à base de cloro, iodo, amônia quaternária,
ácido peracético, água oxigenada, extrato de semente de grape-fruit e clorhexidina.
Estes sanificantes (desinfetantes) apresentam uma comprovada eficiência sobre as
formas vegetativas bacterianas nas condições recomendadas para uso nas indústrias de
alimentos. Nessas condições, normalmente, obtêm-se 5 reduções decimais em 30
segundos de contato na população de células vegetativas de Sthaphyloccocus aureus
ATCC 6538, e de Escherichia coli ATCC 11229, quando submetidos ao teste de
suspensão (MORAES et al., 1997).
23
Os organismos diferem na sensibilidade ao cloro: as células bacterianas são as
mais sensíveis, esporos bacterianos e de fungos são os menos sensíveis, e alguns
parasitos são altamente resistentes (PIROVANI et al., 2006).
As soluções de hipoclorito de sódio disponíveis para comercialização se
apresentam em concentrações em torno de 5% (reagente químico) a 2% na forma de
água sanitária (ROMÃO, 1998).
A Portaria N° 89, de 25 de agosto de 1994 define como Água Sanitária soluções
aquosas a base de hipoclorito de sódio ou cálcio com o teor de cloro ativo entre 2,0%
p/p a 2,5% p/p, durante o prazo de validade (máximo de seis meses). O produto poderá
conter ainda apenas hidróxido de sódio ou cálcio, cloreto de sódio ou cálcio e carbonato
de sódio ou cálcio como estabilizante (BRASIL, 1994).
Soluções concentradas de hipoclorito (100.000 ppm de cloro ativo) são mais
estáveis do que as diluídas. Embora a atividade antimicrobiana seja favorecida em pH
mais baixo, a estabilidade simultaneamente decai. Para combinar estabilidade durante a
estocagem com boa atividade microbiocida quando em uso, as soluções de hipoclorito
devem ter quantidade adequada de hidróxido de sódio para manter o pH alto durante o
armazenamento e uma capacidade de tamponamento de forma que o pH decaia quando
diluídas para uso (ROMÃO op. cit.).
A ação bactericida dos compostos a base de cloro, com exceção do dióxido de
cloro, esta vinculada ao ácido hipocloroso (HClO). Várias teorias tentam explicar os
mecanismos de ação dos derivados clorados sobre as formas vegetativas de bactérias. A
hipótese mais aceita é a da oxidação de grupos sulfidrilas (-SH) de certas enzimas do
metabolismo de carboidratos e inibição de enzimas que participam da oxidação da
glicose. Neste caso o ácido hipocloroso (HClO) atravessa a membrana celular, oxida
grupos sulfidrilas de certas enzimas que participam da via glicolítica, eliminando a
célula. Outras hipóteses são ainda: de que ocorra a descarboxilação oxidativa de
aminoácidos, formando nitrilas e aldeídos, ou combinação com proteínas e formação de
compostos N-clorados tóxicos; indução da absorção de oxigênio e fosforilação
oxidativa conjugada com a quebra de macromoléculas; danos à membrana, dificultando
o transporte de carboidratos e aminoácidos e podendo levar ao extravasamento celular;
a destruição da síntese protéica; reações com ácido nucléicos, purinas e pirimidinas, ou
ainda desequilíbrio metabólico após destruição de enzimas essenciais (MACÊDO,
2004).
24
Atualmente, a relação benefício/custo da utilização dos derivados clorados como
desinfetante ainda é a maior, pois os outros processos disponíveis apesar de serem
eficientes ainda têm um custo alto para as condições econômicas do país (MACÊDO,
2004).
2.7 Avaliação da Eficácia do Desinfetante e da Sensibilidade da Bactéria
Segundo Leitão (1984), a avaliação do desempenho dos desinfetantes é bastante
complexa, principalmente em função dos inúmeros fatores que poderão afetá-los.
Assim, a natureza e tipo de superfícies tratadas, a concentração e natureza dos resíduos
a elas aderidos, o tipo de microbiota contaminante na superfície, a concentração e o
período de contato do desinfetante com a superfície, seriam apenas algumas das
variáveis que poderiam afetar, em maior ou menor grau, a eficácia do desinfetante.
Também para Wiest (1984), fatores como tempo de exposição, natureza e
concentração da carga bacteriana, presença de matéria orgânica e materiais (entre
outros) são de enorme influência na atividade germicida, o que pode ser melhor
avaliado pelo emprego do teste de suspensão. Assim, os resultados obtidos seriam
extrapoláveis para a prática dentro de maiores níveis de segurança.
Segundo Guerreiro (1984), o Staphylococcus aureus é importante no estudo e
combate às doenças infecciosas, pois é uma das bactérias mais resistentes e produz
resistência aos antimicrobianos, sendo utilizado como elemento principal de aferição de
eficiência.
Quanto aos testes para avaliação da atividade biológica de desinfetantes e anti-
sépticos, Reybrouck (1998) indica que existe um grande número deles, com a mesma
finalidade: colocar em contato uma solução biocida com o microrganismo com o
objetivo de mensurar a atividade antimicrobiana de substâncias ou preparações
químicas.
Segundo Holah et al. (1998), a adoção dos testes de suspensão para verificação
da atividade biológica dos biocidas tem inúmeras vantagens. Eles são relativamente
práticos, não requerem extrema especialização nem dispendiosos equipamentos de
25
laboratório sendo, assim, de baixo custo para realizá-los. Eles já estariam bem descritos
quanto a seus limites e possibilidades de avaliação de atividade microbiológica, sua
repetibilidade e reprodutibilidade.
26
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostras Bacterianas
As 32 amostras de Staphylcoccus aureus utilizadas no presente estudo foram
isoladas de alimentos envolvidos em surtos de DTA no Rio Grande do Sul, Brasil, no
período de 2002 a
2006 (Apêndice A, pag. 46 e Apêndice B, pag. 47). O isolamento foi
feito no Laboratório Central de Saúde Pública IPB-LACEN/RS, onde permaneceram
armazenadas mantidas congeladas (-20°C) em caldo de infusão cérebro e coração (BHI)
e glicerol (na concentração de duas partes de amostra e uma parte do glicerol).
3.2 Reativação das Amostras
Para reativação bacteriana, a quantia de 0,2 mL foi retirada, a partir das
amostras congeladas, semeada em 5 mL de caldo BHI ( MERCK
®
) e incubada a
35°C, por 24 horas. Alíquotas do caldo foram semeadas em Ágar Baird-Parker
(MERCK
®
), e incubadas 48 horas a 35°C. Foram selecionadas três colônias
características de Staphylococcus com coloração negra brilhante, forma arredondada,
convexa, com bordos regulares, circundadas por um halo branco e outro externo, maior
e transparente. As colônias foram então semeadas em caldo BHI, e incubadas 24 horas
a 35°C, e submetidas às provas bioquímicas para identificação do gênero
Staphylococcus.
27
3.3 Provas Bioquímicas
3.3.1 Teste de Catalase
A partir dos tubos de caldo BHI com crescimento, transferiu-se 1,0 mL para
tubos de ensaio e acrescentou-se 1,0 mL de Peróxido de Hidrogênio 3%. Observando-
se a ocorrência de borbulhamento imediato o teste era considerado positivo.
3.3.2 Prova de Coagulase em Tubo
A partir dos tubos de caldo BHI com crescimento pipetou-se 0,1mL para tubos
de ensaio contendo 0,5 mL de plasma de coelho (LABORCLIN
®
), incubando-os a 35°C
por um período máximo de 24h. Após incubação, as culturas com nítida formação de
coágulo são consideradas positivas.
3.3.3 Prova de Termonuclease – Tnase
A partir dos tubos de caldo BHI com crescimento, pipetou-se 1,0 mL para tubos
de ensaio que foram fervidos a 100°C, por 15 minutos sendo resfriados imediatamente
(choque térmico). Inoculou-se a cultura fervida em orifícios previamente preparados em
lâminas contendo Ágar Azul de Toluidina DNA. Incubou-se as lâminas a 35°C por 4 h
em câmara úmida. Após incubação, procedeu-se a leitura dos resultados, onde as
culturas com nítida formação de um halo róseo estendendo-se por cerca de 1 mm das
perfurações inoculadas foram consideradas positivas.
28
3.3.4 Teste de Hemólise
A partir dos tubos de caldo BHI com crescimento semeou-se uma placa de Ágar
Sangue de Carneiro (LABORCLIN
®
), posteriormente incubado por 24 h a 35°C, e
observou-se a formação de halo de hemólise ao redor das colônias (teste positivo).
3.3.5 Teste de Fermentação de Manitol e Maltose
A partir dos tubos de caldo BHI com crescimento semeou-se em Ágar Manitol e
Ágar Maltose (Anexo A, pág. 48), ambos incubados por 24 h a 35°C. A mudança do
indicador de púrpura para amarelo, evidenciando a mudança do pH, indicou a
fermentação dos referidos açúcares.
3.3.6 Controle de Qualidade das Provas de Identificação
Para todas as provas de identificação bioquímicas realizadas foi utilizado como
controle positivo de Staphylococcus aureus ATCC 25933. Todas as provas bioquímicas
foram realizadas conforme ABNT (1991) e Do Carmo (1998).
3.4 Teste de Sensibilidade do Staphylococcus aureus ao Hipoclorito de Sódio.
Confirmada a pureza das linhagens, como Staphylococcus aureus, onde 100%
apresentaram provas positiva de coagulase em tubo, catalase, prova de termonuclease,
teste de hemólise e fermentaram a maltose e o manitol, foram novamente semeadas em
Ágar Baird-Parker (DIFCO
®
), incubadas a 24/48 horas a 35°C. Uma colônia foi
retirada e colocada em 3mL de caldo BHI (DIFCO
®
), incubada por 24 horas a 35°C,
tornando-se a “cultura-teste”.
29
O hipoclorito de sódio foi obtido de um produto comercializado como água
sanitária. A composição apresentava teor de cloro ativo 2,38 %, e pH 11,89 no produto
puro e pH 10,09 no produto a 1%, como pode ser conferido no laudo químico (Anexo
B, pág. 49).
Para o experimento utilizou-se a concentração de 200 ppm (SILVA JÚNIOR,
2002). A diluição do composto foi feita em água destilada estéril, com o potencial
hidrogeniônico (pH) variando de 5 a 6, verificado com papel indicador universal
(MERCK
®
), com potenciômetro (Nova Técnica®, modelo NIpHM) apresentou valores
entre 7,58 e 7,70. Na solução final foi verificado o pH de 8 com papel indicador
universal, e com potenciômetro o pH de 9,47.
Simulando condições de uso em subconcentração, a quantidade de cloro livre
foi de 100 ppm. Para simular ambiente com deficiência na limpeza ambiental
precedente à desinfecção, foi usado como matéria orgânica o leite integral UHT,
esterilizado em autoclave e adicionado ao teste, na água de diluição do hipoclorito, na
quantidade de 1 %, segundo Brasil (1999).
Foi determinado o número de unidades formadoras de colônias da “cultura-
teste” através do seguinte procedimento (NEDER, 1992): da diluição 10
-1
UFC/mL (que
corresponde a diluição 1:10) tranferiu-se 0,1 mL para placa de Petri com Baird-Parker,
que foi devidamente espalhado na superfície da placa com alça de Drigalsky. Da
diluição 10
-2
UFC/mL (que corresponde a diluição 1:100) igualmente transferiu-se
0,1 mL para placa de Petri com Baird-Parker. E assim sucessivamente nas diluições
seguintes, que correspondem 1:1000, 1:10 000 até 1: 1000 000 000 . As placas foram
incubadas a 35°C por 24/48 horas. Do conjunto de placas, escolheu-se a diluição que
apresentou entre 30 e 300 UFC. O dado obtido na contagem corresponde ao número de
unidades formadoras da “cultura-teste” (10
9
UFC/mL).
O método de avaliação da atividade antibacteriana foi o de diluição, com teste
de suspensão, descrito pelo Ministério da Agricultura e Abastecimento (BRASIL,
1999), com modificações (no tempo de contato e dose infectante das culturas teste).
Tubos de ensaio contendo 10 mL do desinfetante na concentração 200 ppm sem e com
matéria orgânica e na simulação de subconcentração receberam 0,1 mL da “cultura-
teste”. Após os tempos de contato 5, 10, 15 e 30 minutos, através de alça bacteriológica
de platina com 10 µL uma alíquota foi retirada e colocada em tubos de ensaio contendo
3 mL do meio de cultura caldo BHI (DIFCO
®
). Esses tubos foram agitados, incubados
a 35°C e as observações feitas com 24, 48, 72 e 96 horas.
30
A leitura dos tubos de repique contendo BHI indicava os resultados: não-
turvação, considerado bactéria inativa (sensível); turvação, bactéria ativa (resistente).
3.5 Análise Estatística
Utilizou-se a técnica não-paramétrica Teste Q de Cochran, específico para
variável resposta binária com medidas repetidas ou com pareamento por lote. As
comparações múltiplas do Teste Q de Cochran foram também utilizadas. O programa
para a análise estatística foi o SPSS Versão 8.
31
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Apresentação e Discussão dos Resultados
Na Tabela 1 pode-se observar os resultados referentes ao número de amostras de
Staphylococcus aureus sensíveis e resistentes ao hipoclorito de sódio em diferentes
concentrações, na ausência e na presença de matéria orgânica.
Tabela 1 – Sensibilidade e resistência das 32 amostras de Staphylococcus aureus
isoladas no IPB-LACEN/RS entre 2002 e 2006, de alimentos envolvidos em surtos de
DTA, frente ao hipoclorito de sódio em duas concentrações, com e sem matéria
orgânica, em 30 minutos de contato, usando o teste de suspensão.
Como pode ser visto, quando confrontadas com hipoclorito de sódio na
concentração de 200 ppm de cloro livre sem a presença de matéria orgânica, 100% das
amostras foram sensíveis. Na mesma concentração, mas na presença de matéria
orgânica, 84,4% das amostras foram resistentes e 15,6% delas sensíveis. Na
concentração de 100 ppm (considerada subconcentração), 75% apresentaram
sensibilidade ou, de outro ângulo, 25% delas foram resistentes.
Também Rossoni (1997), avaliando a eficácia antimicrobiana do cloro sobre as
bactérias E. coli, Pseudomonas fluorescens e Staphylococcus aureus, aderidas à
superfícies, obteve como resultado que 100% das amostras foram sensíveis na
concentração de 200 ppm de cloro livre. No entanto, Galetti et al. (2005), se bem que
utilizando método de difusão em ágar (Técnica do poço), mas com a mesma
concentração de 200 ppm de cloro livre obtido do hipoclorito de sódio, não obteve
Concentração hipoclorito
de sódio
Sensíveis Resistentes
200 ppm
Sem matéria orgânica
32 0
200 ppm
Com matéria orgânica
5 27
100 ppm
(subconcentração)
24 8
32
atividade sobre as 25 amostras de S. aureus isoladas de ambientes de manipulação de
alimento.
Dos resultados aqui encontrados, para explicar a diferença entre o total de
amostras sensíveis na presença de 200 ppm e de 100 ppm de cloro livre, parece correto
pensar que uma maior concentração de cloro livre na solução deve corresponder
(mantendo outros fatores intervenientes constantes) a um aumento da atividade
bactericida (desenhos de experimentos realizados para demonstrar essa hipótese serão
apresentados mais adiante, no texto). No entanto, nota-se que existe divergência sobre o
assunto, como no trabalho apresentado por Rossoni (1997), indicando que na sub-
concentração (100 ppm) a ação biocida do hipoclorito de sódio foi a mesma que para a
dose recomendada de 200 ppm , divergindo dos resultados encontrados neste estudo.
Sobre a observada resistência do S. aureus na presença de matéria orgânica,
conforme informam Macêdo & Barra (2002), desinfetantes liberadores de cloro livre
têm sua ação reduzida porque o cloro oxida primeiramente a matéria orgânica,
reduzindo assim sua disponibilidade para ação antimicrobiana. Anteriormente Lasmanis
et al. (1953 apud DYCHDALA, 1991), usando solução de hipoclorito com amostras de
Staphylococcus (coagulase positiva e negativa), observaram que com 3% de leite
desnatado não foi obtida a completa morte dos organismos e que, pequenas quantidades
de leite exibiram progressivamente a diminuição no efeito da ação bactericida. No
entanto, existem opiniões divergentes sobre o fenômeno.
Tanto Mudge et al. (1935) quanto Johns (1948), os dois citados por Dychdala
(op. cit.), na presença de leite nos testes com solução de hipoclorito não encontraram
efeitos adversos na ação bactericida do cloro. O segundo autor, usando E. coli e S.
aureus como organismos teste, relatou não haver evidência na redução germicida na
presença de leite desnatado e integral, com solução de hipoclorito recém preparada. Em
outro estudo experimental, visando a comparação da eficácia da descontaminação
prévia de materiais médico-cirúrgicos pelo uso de desinfetantes químicos e pela
utilização de água, sabão e ação mecânica, e verificar a interferência da matéria
orgânica, Souza et al. (1998) constataram que o hipoclorito de sódio 1% exibiu baixa
interferência da matéria orgânica (10% de soro fetal bovino), em sua ação germicida
sobre Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella Choleraesuis.
Para reforçar o que foi observado aqui nesse experimento, também Spaulding
(apud PIANTA & WIEST, 1986) considerou a limpeza dos instrumentos e outros
materiais a serem desinfetados como atitude fundamental para melhor atuação de
33
diversos produtos químicos, pois matéria orgânica como sangue, plasma e fezes, entre
outras, tanto poderiam alterar as moléculas do desinfetante, tornando-o inativo, quanto
servirem de barreira mecânica de proteção aos microrganismos.
Em experimentos mais recentes, Bessems (1998) fez semelhante verificação
com compostos halogênicos. Adicionando 0,3% de albumina sérica bovina, a
concentração desses compostos e o tempo necessários para obter o mesmo efeito de
redução logarítmica do microrganismo em ausência de proteína foi de pelo menos o
dobro.
A presença da matéria orgânica pode explicar parte do fenômeno de resistência
observado. Esse raciocínio, no entanto, não pode ser estendido ao caso da sensibilidade
e resistência das amostras de S.aureus na concentração de 100 ppm de cloro livre, posto
que, ausente a matéria orgânica. Para dar conta da interpretação desse resultado
parecem pertinentes os argumentos de SANDER et al. (2002) quando informam que ao
testar-se a sensibilidade de um microrganismo frente a um desinfetante deve-se levar
em consideração todos os fatores que possam interferir na avaliação, principalmente a
situação problema específica, isto é, bactérias poderiam apresentar resistência após uma
exposição prolongada aos desinfetantes, e isolados bacterianos dentro de um mesmo
gênero e espécie têm diferentes graus de sensibilidade a um mesmo desinfetante. Ou
ainda, que o mesmo desinfetante com formulações similares, porém não idênticas,
apresenta eficácia diferente contra a mesma bactéria.
Com sentido semelhante, pode-se assumir a observação de Lee e Gilbert (1918,
apud WICKRAMANAYAKE e SPOUL, 1991) para quem a resistência aos
antimicrobianos de microrganismos aparentemente similares, pode ser diferente.
Elemento importante de ser anotado é sobre a influência do potencial
hidrogeniônico da solução com hipoclorito de sódio, já que o pH da solução trabalhada
neste experimento manteve-se no entorno de 9. Como referido por Romão (1998), a
forma ativa dos compostos liberadores de cloro é o ácido hipocloroso (HOCl), o qual é
formado com o pH da solução de 5 a 8. Os íons hipocloritos (OCl
-
) predominam em
soluções alcalinas, e constituem-se a forma antimicrobiana menos ativa. Ou seja, a
eficácia do cloro decresceria com o aumento do pH e vice-versa, paralelamente à
concentração da forma não dissociada do ácido hipocloroso. Também Andrade e
Macêdo (1996) chamam a atenção para a relação entre o pH da solução clorada e a
concentração de ácido hipocloroso, pois em pH 10 tem-se apenas 0,3 % desse elemento
livre, enquanto que em pH 5,0 esse valor atinge 99,7 %.
34
Fair et al. (1948) e Morris (1966), citados por Dychdala (1991) calcularam a
curva de relativa eficácia de desinfecção entre ácido hipocloroso e íon hipoclorito para
reduzir a carga de E. coli, em temperatura entre 2ºC e 5ºC, em diferentes níveis de pH,
e concluíram que o íon hipoclorito tem 1/80 da potência germicida do ácido
hipocloroso.
Dychdala (1991) também concorda que o ácido hipocloroso tem maior atividade
antimicrobiana, e que a sua presença depende do pH da solução. Mas argumenta que a
experiência mostra que em solução alcalina tanto o hipoclorito de sódio quanto de
cálcio, com pequena quantidade de ácido hipocloroso e grande do íon hipoclorito
definitivamente possui propriedades bactericidas, sugerindo que esse elemento também
deve exercer um papel importante na desinfecção.
No experimento apresentado neste trabalho, manteve-se constante a temperatura
com ambiente climatizado no entorno de 25 ºC. A temperatura do ambiente e da
solução também afeta a atividade antimicrobiana dos compostos liberadores de cloro.
Relato realizado por Andrade e Macedo (1996) sobre o inter-relacionamento entre a
concentração, o pH e a temperatura foi verificado quando soluções com 20 mg/L de
cloro residual livre, numa temperatura de 15ºC, reduziram 90 % o número de esporos
de Bacillus cuagulans em 13 minutos quando o pH foi 7,8. Quando o pH foi ajustado
para 6,8 e 4,5 esse tempo diminuiu para 9 e 4 minutos, respectivamente. Aumentando-
se a temperatura da solução clorada para 60ºC, os tempos reduziram os mesmos 90 %
do número de esporos, nos mesmos valores de pH, foram, respectivamente, 1 minuto,
15 segundos e 30 segundos.
Uma consideração sobre a técnica empregada. Em testes de avaliação da
atividade antibacteriana de desinfetantes e anti-sépticos, freqüentemente é indicado o
uso de inativadores, ou neutralizantes. Eles são substâncias químicas capazes de
neutralizar resíduos de antimicrobianos que possam ser carregados junto das
subculturas de bactérias suspensas, com a alça bacteriológica, no momento do replique
do tubo teste para o tubo contendo meio de cultura sólido usado na verificação da
viabilidade do microrganismo. Esses resíduos podem potencialmente interferir na
reativação dos organismos, mesmo em doses sub-letais (REYBROUCK, 1979;
LANGSRUD & SUNDHEIN, 1998). Essa interferência pode induzir resultados falso-
negativos.
Como neutralizador do cloro, a indicação é o tiossulfato de sódio a 0,6 %
(REYBROUCK, 1979). No entanto, Eguchi (1991) chama a atenção de que o
35
tiossulfato de sódio, nesta concentração pode provocar inibição microbiana,
principalmente em organismos do gênero Staphylococcus. Assim que optou-se realizar
a inativação do cloro livre pela técnica de diluição até níveis sub-inibitórios. Esse
procedimento foi realizado quando a alíquota retirada com a alça de platina (10 µL) do
tubo teste era inoculada em tubo de ensaio contendo 3 mL de meio líquido caldo BHI,
isso significou uma diluição de 300 vezes.
Entende-se que esse procedimento foi efetivo, posto que pode ser demonstrado
observando a Tabela 2, como por exemplo, quando mesmo na concentração mais
elevada de cloro livre, em tempo de contato de 5 minutos, houve crescimento da
bactéria. Esse procedimento já havia sido adotado por Avancini (2002), quando, na
falta de conhecimento de substâncias que pudessem inativar os princípios químicos
ativos do extrato bruto de Hypericum caprifoliatum, optou pela prática de “banhar” as
bactérias e diluir o extrato em meio líquido.
Também sobre a técnica descrita por Fernandes et al. (1999), informa que
alguns produtos químicos têm a capacidade de produzir lesões sub-letais em alguns
microrganismos, exercendo assim, ação bacteriostática e não bactericida. O
prolongamento do período de incubação e o uso de meios apropriados (livre de
inibidores) permitem a recuperação das células com lesão fisiológica reversível. Devido
a isso, a observação dos tubos de repique foi observado por período de 96 horas.
Na Tabela 2 podem ser observados os resultados referentes à confrontação das
amostras com hipoclorito de sódio em diferentes concentrações e presença de matéria
orgânica, levando em consideração os tempos de contato.
Tabela 2 – Sensibilidade e resistência das 32 amostras de Staphylococcus aureus
isoladas no IPB-LACEN/RS entre 2002 e 2006, em alimentos isolados em surtos de
DTA, frente ao hipoclorito de sódio em duas concentrações, com e sem matéria
orgânica, usando o teste de suspensão e considerando o tempo de contato.
Tempo de
Contato
200 ppm
sem matéria orgânica
200 ppm
com matéria orgânica
100 ppm
subconcentração
5 min S 25 0 7
R 7 32 25
10 min S 31 0 11
R 1 32 21
15 min S 31 3 15
R 1 29 17
30 min S 32 5 24
R 0 27 8
S= sensibilidade; R= resistência.
36
Observando os resultados obtidos na concentração de 200ppm de cloro livre
sem a presença de matéria orgânica, nos primeiros 5 minutos de contato 78,1%
amostras de Staphylococcus aureus foram sensíveis. Aos 10 minutos, e também aos 15
minutos, 96,9% das amostras foram inativadas. Quando o tempo de contato foi de 30
minutos, 100% das amostras foram sensíveis.
Quando as amostras de Staphylococcus aureus foram confrontadas com o
hipoclorito de sódio na concentração de 200 ppm de cloro livre na presença de matéria
orgânica, tanto aos 5 quanto aos 10 minutos de contato 100% delas permaneceram
ativas. Aos 15 minutos 9,4% das amostras foram sensíveis. Mesmo com 30 minutos de
contanto, quando presente a matéria orgânica, apenas 15,6% foram sensíveis ao
desinfetante ou, por outro lado, 84,4% apresentaram-se resistentes.
No confronto das amostras com a concentração de 100 ppm, simulando
subconcentração do desinfetante, aos 5 minutos de contato observa-se que 21,9% das
amostras foram sensíveis. Aos 10 minutos 34,4% das amostras foram sensíveis e aos 15
minutos 46,9% delas. Aos 30 minutos 75% das amostras estavam inativadas, mas, visto
de outro modo, 25 % das amostras de Staphylococcus aureus ainda estavam viáveis.
Pode-se perceber que quanto maior o tempo de contato, maior a sensibilidade
das amostras. Na melhor compreensão desse fenômeno recorre-se a Tortora et al.
(2000), quando explicam que a taxa de morte esta na dependência da carga
populacional, das características microbianas, mas também do tempo de exposição.
Essa reflexão igualmente coincide com a de Bessems (1998), segundo quem, a
influência do tempo de contato no efeito antimicrobiano de desinfetantes seria relatado
com freqüência na literatura. Em se usando uma concentração constante do
antimicrobiano no teste, seu efeito aumentaria com o acréscimo de tempo de contato, o
que coincide com o que foi encontrado neste experimento.
Verificando a sensibilidade das amostras por tempo de contato e as diferentes
concentrações de cloro, mesmo tendo o fenômeno maior tempo de contato maior
sensibilidade das amostras ocorrido tanto no módulo experimental com 200 ppm quanto
com 100 ppm, observou-se que com concentração de cloro livre maior, menor foi o
tempo de contato necessário para que as amostras fossem inativadas. A observação da
relação entre concentração e atividade antimicrobiana já havia sido anotada
anteriormente.
Mallman et al. (1932, apud DYCHDALA, 1991) em seu experimento com S.
aureus, demonstraram que o aumento do cloro livre na solução de hipoclorito em
37
potencial hidrogeniônico constante de 9 diminui o tempo no incremento da taxa
bactericida. Com 2 ppm de cloro livre produziu a morte do microrganismo em 5
minutos, à 1,2 ppm em 10 minutos enquanto que à 0,3 ppm não eliminou
completamente o organismo em 30 minutos. Rudolph et al. (1941, apud DYCHDALA,
1991) testaram uma solução de hipoclorito, em pH constante de 10 e temperatura de
20
o
C. Os tempos necessários para promover a morte de 99,9 % dos esporos de Bacillus
metiens foram: 31 minutos a 500 ppm, 63,5 minutos a 100 ppm e de 121 minutos a 25
ppm. Eles calcularam que quadruplicando a concentração da solução de hipoclorito
resulta em 50 % a redução do tempo de morte e, dobrando a concentração reduz em
30 % o tempo de morte.
4.2 Apresentação dos Resultados Estatísticos
A avaliação estatística (Anexo C, pág. 51) levou em consideração a relação
entre resultados sensível e resistente versus concentração de cloro livre versus
presença/ausência de matéria orgânica versus tempo de contato [R ou S, 200 ppm de
hipoclorito de sódio sem matéria orgânica (SM), 200 ppm de hipoclorito de sódio com
matéria orgânica (CM), 100 ppm (subconcentração - SB), nos tempos de 5, 10, 15 e 30
minutos de contato]. Deste modo, obteve-se a configuração de 12 níveis de tratamentos,
como exemplo: SM5, SM10, ....., SB15.
A análise estatística realizada através do Teste Não-Paramétrico (Q) de Cochran
para variáveis nominais dicotômicas avaliou a proporção de amostras resistentes e
sensíveis, com nível de significância (p) ≤ 0, 05, e concluiu que deve haver diferença
significativa (p< 0,0001) entre elas.
Para observar onde essas diferenças estavam, foram realizadas comparações
múltiplas através do Teste Não-Paramétrico de Cochran (Q), considerando apenas as
comparações entre tempos para um mesmo tratamento ou entre tratamentos com um
mesmo tempo.
Indicando pelo modo mais fácil de anotar, os níveis de tratamento onde não
foram encontradas diferenças significativas são os seguintes: SM5 e SB30; SM10 e
SM15; SM10 e SM30; SM15 e SM30; CM5 e CM10; CM5 e CM15; CM5 e CM30;
38
CM10 e CM15; CM10 e CM30; CM15 e CM30; CM15 e SB5; CM30 e SB5; SB5 e
SB10; SB10 e SB15.
Chama-se a atenção para o fato de que as relações exclusivamente matemáticas
podem não ser absolutas na interpretação dos resultados. Pode-se citar exemplos da
Tabela 2, onde SM5 versus SB30, ou SM10 e SM30 que estatisticamente não
apresentaram diferença significativa. No entanto, o sanitarista/higienista pode ter um
olhar diferente sobre o resultado. Mesmo que a diferença de uma amostra, para o “n” 32
usado neste trabalho não indique matematicamente diferença significativa, o higienista
deve pensar que uma única amostra resistente, tem grande importância pois, pode
colocar em risco a segurança do alimento e a conseqüente saúde de comensais.
39
5 CONCLUSÕES
As 32 amostras de Staphylococcus aureus isoladas em alimentos envolvidos em
surtos de toxinfecções alimentares foram sensíveis ao hipoclorito de sódio na
concentração de 200 ppm de cloro livre, na ausência de matéria orgânica. Cem por
cento delas foram inativadas com 30 minutos de contato.
A presença de matéria orgânica 1% de leite integral aumentou a resistência das
amostras de Staphylococcus aureus, ou diminuiu a atividade antimicrobiana do
hipoclorito de sódio. Com 30 minutos de contato frente às mesmas 200 ppm de cloro
livre, ainda 84,4% delas permaneceram ativas.
A sensibilidade das 32 amostras de Staphylococcus aureus foi menor na
concentração de 100 ppm de cloro livre do que na concentração de 200 ppm. Como
exemplo, com 30 minutos de contato enquanto na concentração de 200 ppm de cloro
livre 100% das amostras estavam inativadas, e frente 100 ppm no mesmo tempo de
contato ainda 25% delas permaneciam viáveis.
O número de amostras sensíveis de Staphylococcus aureus aumentou com o
também aumento do tempo de contato com o cloro livre. A influência do tempo de
contato sobre o número de amostras sensíveis foi maior na confrontação com 200 ppm
de cloro livre na presença de matéria orgânica 1% de leite integral e com 100 ppm, do
que frente a 200 ppm de cloro livre.
40
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animal. Porto Alegre : Sulina, 1984. p. 51-66.
45
WIESTREICH, L.; LECHTMAN, M. Microbiologia das doenças humanas. 2. ed.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1980.
WORLD HEALTH ORGANIZATION: Food Safety and foodborne ilhess. Jan. 2002.
(Fact sheet, 237). Disponível em: < http/www.who.int/mediacentre. Acesso em: 20 de
maio de 2005.
46
APÊNDICE A - Alimentos envolvidos em surtos de intoxicação no Rio Grande do Sul
de 2002 a 2006, de onde foram isolados as amostras de Staphylococcus aureus usadas
nesta pesquisa.
Nº. e ano da
Amostra
Data início
dos sintomas
Tipo
de alimento
Doentes(n)
1/02 18.08.02 bolo caseiro 6
2/02 29.08.02 polenta 2
3/02 29.08.02 torta folhada 2
4/02 29.08.02 creme de morango 2
5/02 06.09.02 queijo colonial 4
6/02 12.10.02 churrasco de gado galeto e porco 106
7/02 12.10.02 maionese 106
8/02 15.10.02 carne moída 5
9/02 20.10.02 bolo caseiro 48
10/03 27.12.02 maionese com batata 9
11/03 30.12.02 queijo 5
12/03 09.03.03 bolo 58
13/03 28.03.03 lasanha 2
14/03 22.05.03 arroz com carne 5
15/03 22.05.03 polenta com carne 5
16/03 14.07.03 leite integral 3
17/03 27.07.03 molho branco 3
18/03 27.07.03 filé à parmegiana 3
19/03 06.09.03 bolo 30
20/03 28.09.03 salada de fruta com creme de leite 2
21/03 05.10.03 carne moída 31
22/03 05.10.03 carne de churrasco 31
23/03 15.10.03 pão de queijo -
24/03 29.11.03 salada de maionese 75
25/03 28.11.03 maionese 47
26/03 04.12.03 bolo de chocolate 29
27/03 04.12.03 arroz 29
28/03 07.12.03 carne bovina 150
29/03 07.12.03 salada de maionese 150
30/03 08.12.03 queijo colonial 3
31/05 01.12.05 galinha desfiada 24
32/06 30.04.06 lasanha 4 queijos 2
(-) – sem dados do número de doentes.
47
APÊNDICE B – Alimentos envolvidos em surtos de intoxicação no Rio Grande do Sul
de 2002 a 2006, de onde foram isolados as amostras de Staphylococcus aureus usadas
nesta pesquisa, agrupados segundo Resolução RDC nº. 12/2001.
18
7
4
3
Pratos prontos p/
consumo
Produtos de confeitaria
Produtos lácteos
Produtos cárneos
48
ANEXO A – Meio de cultura utilizado para identificação bioquímica dos
Staphylococccus aureus.
Ágar FAM (Fermentação da Maltose ou Manitol)
Proteose de peptona- 10,0 g
Extrato de carne- 1,0g
NaCl- 5,0g
Púrpura de Bromocresol- 0,02g
Ágar- 15,0g
Açúcar- 20,0g
Adicionar: Sol de Maltose ou Manitol a 10% esterilizado por filtração conforme
abaixo:
Preparo do Meio:
Suspender os ingredientes em 1 litro de água destilada e aquecer até completa
dissolução. Ajustar o pH para 6,8+- 0,2 e distribuir 80,0 mL por frasco. Autoclavar a
121ºC por 15 minutos. Guardar o meio em geladeira. Quando usar, dissolver o ágar em
banho-maria e deixar esfriar até 45 ºC +/- 50 ºC. Em seguida, adicionar para cada 80mL
de meio fundido, 20mL da solução de açúcar esterilizada anteriormente por filtração.
Distribuir o ágar em placas de Petri (20 mL em cada placa).
Tempo de uso (validade): +/- 1 mês
49
ANEXO B – Laudo da Análise da Água Sanitária
50
ANEXO C – Análise Estatística
Utilizou-se a técnica não-paramétrica Teste Q de Cochran, específico para
variável resposta binária com medidas repetidas ou com pareamento por lote, como
neste caso. No entanto, o Teste Q de Cochran não testa os efeitos principais de cada
fator, pois o teste é delineado para apenas um fator. Deste modo, combinamos os 3
níveis do Tipo de Tratamento (SM, CM e SB) com os 4 níveis de Tempo, porém
considerando o pareamento por lote. Foram então comparados 12 níveis de
combinações dos tratamentos.
As comparações múltiplas do Teste Q de Cochran foram também utilizadas, no
entanto, as combinações de tratamento e tempo que não precisam ser comparadas
podem ser desconsideradas. Assim, por exemplo, não é necessário verificar a
comparação SM5 com CM10, isto é, devemos apenas considerar comparações entre
tempos para um mesmo tratamento ou entre tratamentos com o mesmo tempo.
TESTE NÃO-PARAMÉTRICO Q DE COCHRAN
Através do Teste Não-Paramétrico Q de Cochran para variáveis nominais
dicotômicas, podemos concluir que deve haver diferença significativa entre os 12
tratamentos (p < 0,0001), em relação à proporção de amostras resistentes.
Comparação Diferença Dms Conclusão
A vs B RmA-RmB
SM5 SM10 0.1875 0.1576
S
SM5 SM15 0.1875 0.1576
S
SM5 SM30 0.2188 0.1576
S
SM5 CM5 0.7813 0.1576
S
SM5 CM10 0.7813 0.1576
S
SM5 CM15 0.6875 0.1576
S
SM5 CM30 0.6250 0.1576
S
SM5 SB5 0.5625 0.1576
S
SM5 SB10 0.4375 0.1576
S
SM5 SB15 0.3125 0.1576
S
SM5 SB30 0.0313 0.1576
NS
SM10 SM15 0.0000 0.1576
NS
SM10 SM30 0.0313 0.1576
NS
51
SM10 CM5 0.9688 0.1576
S
SM10 CM10 0.9688 0.1576
S
SM10 CM15 0.8750 0.1576
S
SM10 CM30 0.8125 0.1576
S
SM10 SB5 0.7500 0.1576
S
SM10 SB10 0.6250 0.1576
S
SM10 SB15 0.5000 0.1576
S
SM10 SB30 0.2188 0.1576
S
SM15 SM30 0.0313 0.1576
NS
SM15 CM5 0.9688 0.1576
S
SM15 CM10 0.9688 0.1576
S
SM15 CM15 0.8750 0.1576
S
SM15 CM30 0.8125 0.1576
S
SM15 SB5 0.7500 0.1576
S
SM15 SB10 0.6250 0.1576
S
SM15 SB15 0.5000 0.1576
S
SM15 SB30 0.2188 0.1576
S
SM30 CM5 1.0000 0.1576
S
SM30 CM10 1.0000 0.1576
S
SM30 CM15 0.9063 0.1576
S
SM30 CM30 0.8438 0.1576
S
SM30 SB5 0.7813 0.1576
S
SM30 SB10 0.6563 0.1576
S
SM30 SB15 0.5313 0.1576
S
SM30 SB30 0.2500 0.1576
S
CM5 CM10 0.0000 0.1576
NS
CM5 CM15 0.0938 0.1576
NS
CM5 CM30 0.1563 0.1576
NS
CM5 SB5 0.2188 0.1576
S
CM5 SB10 0.3438 0.1576
S
CM5 SB15 0.4688 0.1576
S
CM5 SB30 0.7500 0.1576
S
CM10 CM15 0.0938 0.1576
NS
CM10 CM30 0.1563 0.1576
NS
CM10 SB5 0.2188 0.1576
S
CM10 SB10 0.3438 0.1576
S
CM10 SB15 0.4688 0.1576
S
CM10 SB30 0.7500 0.1576
S
CM15 CM30 0.0625 0.1576
NS
CM15 SB5 0.1250 0.1576
NS
CM15 SB10 0.2500 0.1576
S
CM15 SB15 0.3750 0.1576
S
CM15 SB30 0.6563 0.1576
S
52
CM30 SB5 0.0625 0.1576
NS
CM30 SB10 0.1875 0.1576
S
CM30 SB15 0.3125 0.1576
S
CM30 SB30 0.5938 0.1576
S
SB5 SB10 0.1250 0.1576
NS
SB5 SB15 0.2500 0.1576
S
SB5 SB30 0.5313 0.1576
S
SB10 SB15 0.1250 0.1576
NS
SB10 SB30 0.4063 0.1576
S
SB15 SB30 0.2813 0.1576
S
Através do teste de comparações múltiplas acima, ao nível de significância de
5%:
Podemos concluir que a proporção de amostras resistentes do tratamento Sem
Matéria Orgânica aos 5 minutos (SM5) deve diferir significativamente da proporção de
amostras resistentes do tratamento Com Matéria Orgânica aos 5 minutos (CM5) e do
tratamento Sub-Concentração aos 5 minutos (SB5).
Podemos concluir que a proporção de amostras resistentes do tratamento Sem
Matéria Orgânica aos 10 minutos (SM10) deve diferir significativamente da proporção
de amostras resistentes do tratamento Com Matéria Orgânica aos 10 minutos (CM10) e
do tratamento Sub-Concentração aos 10 minutos (SB10).
Podemos concluir que a proporção de amostras resistentes do tratamento Sem
Matéria Orgânica aos 15 minutos (SM15) deve diferir significativamente da proporção
de amostras resistentes do tratamento Com Matéria Orgânica aos 15 minutos (CM15) e
do tratamento Sub-Concentração aos 15 minutos (SB15).
Podemos concluir que a proporção de amostras resistentes do tratamento Sem
Matéria Orgânica aos 30 minutos (SM30) deve diferir significativamente da proporção
de amostras resistentes do tratamento Com Matéria Orgânica aos 30 minutos (CM30) e
do tratamento Sub-Concentração aos 30 minutos (SB30).
OBS1: O texto das comparações múltiplas acima é um exemplo de como interpretar as
comparações efetuadas, ou seja, foi escolhido para exemplo fixar o tempo e variar os
tratamentos. A decisão de o que se quer comparar fica a cargo do pesquisador.
OBS2: Os dois fatores Grupo (Sem Matéria Orgânica, ...) e Tempo (5 minutos, ...)
foram combinados num só fator com doze níveis (SM5, SM10,..., SB15). As
53
codificações utilizadas para Grupo foram SM (Sem Matéria Orgânica), CM (Com
Matéria Orgânica) e SB (Sub-Concentração).
O programa utilizado para a análise estatística foi o SPSS Versão 8.
A bibliografia indicada para o teste utilizado é “BIOSTATISTICAL ANALYSIS” do
autor JERROLD H. ZAR; PRENTICE-HALL, INC.
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