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ANDRESA COSTA PEREIRA
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE A PRESENÇA DE
POLIMORFISMO NO GENE DA METALOPROTEINASE-9 E O
DESENVOLVIMENTO DO CARCINOMA ESPINOCELULAR
QUIMICAMENTE INDUZIDO PELO DMBA NA PELE DE
CAMUNDONGOS HAIRLESS
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista, como
parte dos requisitos para a obtenção do
título de DOUTOR, pelo Programa de
Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA
BUCAL, Área Biopatologia Bucal
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ANDRESA COSTA PEREIRA
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE A PRESENÇA DE
POLIMORFISMO NO GENE DA METALOPROTEINASE-9 E O
DESENVOLVIMENTO DO CARCINOMA ESPINOCELULAR
QUIMICAMENTE INDUZIDO PELO DMBA NA PELE DE
CAMUNDONGOS HAIRLESS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos, Universidade Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de DOUTOR, pelo
Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL,
Área Biopatologia Bucal.
Orientador: Prof. Adj. Luiz Eduardo Blumer Rosa
São José dos Campos
2007
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Apresentação gráfica e normalização de acordo com:
Bellini AB. Manual para elaboração de monografias: estrutura do trabalho
científico. São José dos Campos: FOSJC/UNESP; 2006.
Pereira, Andresa Costa
Avaliação da associação entre a presença de polimorfismo no gene da
metaloproteinase-9 e o desenvolvimento do carcinoma espinocelular
quimicamente induzido pelo DMBA na pele de camundongos hairless /
Andresa Costa Pereira; orientador Luiz Eduardo Blumer Rosa.__ São
José dos Campos, 2007.
83p.IL.
Tese (Programa de Pós Graduação em Biopatologia Bucal, Área de
Concentração em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista; 2007.
1. Carcinoma de células escamosas – 2. Polimorfismo genético –
3. Metaloproteinase 9 da matriz.
AUTORIZAÇÃO
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por
qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.
São José dos Campos, 18 de Julho de 2007.
Assinatura :
E-mail: andresa-cp@uol.com.br
FOLHA DE APROVAÇÃO
Pereira AC. Avaliação da associação entre a presença de polimorfismo no
gene da metaloproteinase-9 e o desenvolvimento do carcinoma
espinocelular quimicamente induzido pelo DMBA na pele de
camundongos hairless [tese]. São José dos Campos: Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos, UNESP; 2007.
São José dos Campos, 18 de Julho de 2007.
Banca examinadora
1) Prof. Adj. Luiz Eduardo Blumer Rosa
Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP
2) Prof. Assoc. Fábio Daumas Nunes
Departamento de Estomatologia
Faculdade de Odontologia da USP
3) Prof. Titular Francisco Gorgônio da Nóbrega
Faculdade de Ciências da Saúde e Instituto de Pesquisa e
Desenvolvimento - UNIVAP
4) Profa. Dra. Adriana Aigotti Haberback Brandão
Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP
5) Profa. Adj. Yasmin Rodarte Carvalho
Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP
DEDICATÓRIA
Ao meu marido MARCO ANTONIO DIAS DA SILVA, presença
fundamental na minha vida, por me ajudar a realizar meus sonhos e
especialmente por ser parte deles.
Aos meus pais ANTONIO CARLOS PELOGGIA PEREIRA e
LIDIA COSTA PEREIRA, não apenas pelos princípios de respeito, ética e
perseverança, mas principalmente pelos ensinamentos de amor, que me
guiarão por essa vida e pelas próximas.
Aos meus irmãos ANDRÉ COSTA PEREIRA e ADRIANA
COSTA PEREIRA, meus grandes amigos, que amo tanto e que estarão
sempre presentes no meu coração.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador Professor Adjunto LUIZ EDUARDO BLUMER
ROSA, pela amizade e pelo imenso apoio na busca dos meus objetivos,
me ajudando a evoluir com a realização deste doutorado.
Ao meu supervisor no exterior Doutor SHU YE, por acreditar no
nosso projeto e me oferecer a oportunidade de aprender em seu
laboratório.
À minha amiga ELAINE DIAS DO CARMO, pelo
companheirismo, apoio e amizade. Pessoa indispensável neste período,
com quem pude aprender o significado de um verdadeiro trabalho em
equipe.
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de São José dos Campos –
UNESP e ao seu Diretor Professor Adjunto PAULO VILLELA SANTOS
JÚNIOR, por proporcionarem meu desenvolvimento acadêmico durante
estes últimos cinco anos.
À Chefe do Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal
Professora Adjunta ANA SUELI RODRIGUES CAVALCANTE e a todos os
professores e funcionários que estiveram presentes durante o curso.
À Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em
Biopatologia Bucal Professora Doutora CRISTIANE YUMI KOGA ITO,
pela competência e dedicação ao nosso curso.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior) pela bolsa concedida, pela experiência proporcionada e
pelo aprendizado único, fatores indispensáveis para a realização deste
trabalho.
Ao ROSS LAXTON pela presença diária durante um ano e pela
imensa paciência nesta etapa tão importante da minha vida profissional.
Ao Doutor JOHN HOLLOWAY e MATTHEW ROSE-ZERILLI
pelos ensinamentos indispensáveis na fase experimental desta tese.
À Doutora HELMTRUDY ISOLD ROACH, pelo apoio em
disponibilizar seu laboratório em Southampton.
Ao Professor Titular FRANCISCO GORGÔNIO DA NÓBREGA,
pela oportunidade de estagiar em seu renomado laboratório e por auxiliar
no meu ingresso ao mundo da biologia molecular.
À Professora Doutora ADRIANA AIGOTTI HABERBECK
BRANDÃO, pessoa que muito admiro, por saber conciliar sua imensa
competência à simplicidade de sempre estar pronta a ajudar.
À Professora Adjunta YASMIN RODARTE CARVALHO, por
estar sempre presente no engrandecimento do nosso curso de
Biopatologia.
À Professora Adjunta ROSILENE FERNANDES DA ROCHA,
por ter conduzido tão bem nossa pós-graduação, buscando sempre o
crescimento do curso.
Ao Professor Titular ANTONIO OLAVO CARDOSO JORGE, por
fazer parte do início, do desenvolvimento e da conclusão deste objetivo.
Ao Professor Doutor MIGUEL ANGEL CASTILLO SALGADO
pela presença sempre importante no meu desenvolvimento profissional.
Ao Professor IVAN BALDUCCI, pela colaboração na análise
estatística.
À Professora Doutora PAULA CRISTINA TREVILATTO pelas
dúvidas sanadas e pelas dicas tão importantes, sempre com muita
competência e alegria.
Aos meus colegas do Programa de Pós-Graduação que
entendem o esforço dispensado para a confecção de uma tese.
À SUSANA UNGARO AMADEI, VANESSA ÁVILA SARMENTO
SILVEIRA, GISELLE SEGNINI SENRA, RENATA FALCHETE DO PRADO
e ANGELA BOLANHO pela convivência constante, alegrando e
completando cada um dos meus dias em São José dos Campos.
Às alunas de iniciação científica ANA PAULA PEREIRA MASA,
MICHELINE BICA GUTTERRES e PAULA JULIANA TAVERNARO RUZA
por fazerem parte da nossa equipe com tanto empenho e dedicação.
À funcionária do laboratório de Patologia ANA LOURDES DA
SILVA MACHADO, não apenas pela imensa dedicação na confecção das
lâminas histológicas, mas também pela amizade que se fez surgir nestes
anos de convívio.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação, ROSEMARY
DE FÁTIMA SALGADO, ERENA MICHIE HASEGAWA, MARIA
APARECIDA CONSIGLIO DE SOUZA e LÍLIAN FARIA DAS GRAÇAS
pela paciência na solução das minhas dúvidas, em todos os momentos,
mesmo à distância.
Às secretárias do Departamento de Biociências e Diagnóstico
Bucal SÍLVIA SCARPEL e IVONEIDE RAMOS LEANDRO, pela dedicação
e atenção dispensada aos alunos.
Aos funcionários LOURIVAL JACOB e ANTONIO DOMINGOS
SÁVIO BARBOSA MAIA VASCONCELOS, pelo auxílio no tratamento dos
animais.
Às bibliotecárias ÂNGELA DE BRITO BELLINI e SILVANA
ALVAREZ, pela atenção e paciência na normatização desta tese e a
todas as funcionárias da biblioteca pelo auxilio a todos os alunos.
À LUCI MARIA SANT’ANA DUSSE e à sua família tão especial,
por participarem de uma fase tão adorável e inesquecível.
Aos meus avós, tios, tias, primos e primas, por sempre torcerem
por mim e por fazerem parte da família que tanto amo.
Aos mais novos membros da minha família, MARCO ANTONIO
FREIRE DA SILVA, SANDRA LÚCIA GONÇALVES DIAS DA SILVA E
JULIO LOURENÇO DIAS DA SILVA pelo carinho e pelo apoio em todos
os momentos, estando longe ou perto.
A todos os meus amigos que participam da minha vida e
fizeram imensa falta neste ano distante.
SUMÁRIO
RESUMO...............................................................................................
1 INTRODUÇÃO...................................................................................
11
12
2 REVISÃO DA LITERATURA..............................................................
2.1 Carcinogênese................................................................................
2.1.1 Carcinogênese química................................................................
2.1.2 Carcinogênese química experimental em pele............................
2.2 Câncer de pele................................................................................
2.2.1 Desenvolvimento do CEC............................................................
2.3 Metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs)..........................
2.3.1 MMP-9..........................................................................................
2.4 Polimorfismos genéticos.................................................................
2.4.1 Polimorfismos no gene da MMP-9...............................................
14
14
15
16
18
19
20
22
24
26
3 PROPOSIÇÃO...................................................................................
29
4 METODOLOGIA.................................................................................
4.1 Carcinogênese experimental...........................................................
4.2 Análise fenotípica............................................................................
4.2.1 Análise clínica..............................................................................
4.2.2 Análise histopatológica................................................................
4.3 Análise genotípica...........................................................................
4.3.1 Extração do DNA..........................................................................
30
30
31
32
32
33
34
4.3.2 Reação de PCR...........................................................................
4.3.3 Eletroforese..................................................................................
4.3.4 Análise das imagens....................................................................
4.3.5 Seqüenciamento..........................................................................
4.4 Análise estatística...........................................................................
5 RESULTADOS...................................................................................
5.1 Análise fenotípica............................................................................
5.1.1 Análise clínica..............................................................................
5.1.2 Análise histopatológica................................................................
5.2 Análise genotípica...........................................................................
5.3 Análises fenotípica x genotípica......................................................
5.3.1 Associação dos alelos com as características clinicopatológicas
5.3.2Associação dos genótipos com as características
clinicopatológicas..................................................................................
6 DISCUSSÃO......................................................................................
7 CONCLUSÃO.....................................................................................
8 REFERÊNCIAS..................................................................................
ANEXO..................................................................................................
34
36
38
40
40
42
42
42
44
48
51
51
53
56
65
66
82
ABSTRACT...........................................................................................
83
Pereira AC. Avaliação da associação entre a presença de polimorfismo no
gene da metaloproteinase-9 e o desenvolvimento do carcinoma
espinocelular quimicamente induzido pelo DMBA na pele de
camundongos hairless [tese]. São José dos Campos: Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista;
2007.
RESUMO
Para que ocorra a invasão das células epiteliais neoplásicas é necessário o rompimento
da membrana basal, sendo que este processo depende, em grande parte, da ação
enzimática realizada pela metaloproteinase-9 (MMP-9). O objetivo deste trabalho foi
testar a hipótese que variações no gene da MMP-9 influenciam as características clínicas
e histopatológicas do carcinoma espinocelular. Noventa e quatro camundongos hairless
foram submetidos à carcinogênese química (DMBA 0,5%) induzida em pele, durante 16
semanas. Na 17ª semana, os animais foram sacrificados e as lesões fotografadas e
avaliadas clinicamente (com relação ao tamanho e à presença de ulceração). As lesões
foram então biopsiadas e fixadas em formaldeído 10%, para posterior avaliação
histopatológica (padrão de invasão, estágio de invasão e diferenciação celular). No
momento da biópsia, foi retirado 0,5 cm da cauda de cada animal, para extração do DNA
e avaliação da presença de polimorfismos de repetição CA no promotor do gene da
MMP-9. Foi utilizado o teste qui-quadrado (p<0,05) para avaliar a associação dos alelos
e dos genótipos com as características clínicas e histopatológicas. Verificou-se uma
associação entre o alelo com 25 repetições e o grau moderado de diferenciação celular.
Concluiu-se que a presença de maior número de repetições CA no gene da MMP-9 pode
estar relacionada com a redução na diferenciação celular do carcinoma espinocelular
induzido quimicamente na pele de camundongos hairless.
PALAVRAS-CHAVE: carcinoma de células escamosas, polimorfismo genético,
metaloproteinase 9 da matriz
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma espinocelular (CEC) é uma neoplasia maligna dos
queratinócitos da epiderme
45
. Nesta patologia, as células neoplásicas
apresentam, não apenas a capacidade de invadir o tecido conjuntivo
subjacente
88
, como também a de produzir metástase
20
.
A indução de CEC em pele de camundongos já é bastante
conhecida na literatura
17,68,83,98,104
. Uma grande vantagem desta
metodologia, comparada aos estudos em humanos, é que no modelo
animal, muitas variáveis são controladas, principalmente devido à
utilização do mesmo carcinógeno, tempo e tipo de exposição. Porém,
apesar de existir este controle, os animais podem apresentar lesões com
características clínicas e histológicas distintas
3,68,98
Soma-se a isso o fato
de que, dentre as lesões classificadas como CEC, pode haver uma
variação no estágio de invasão da neoplasia
9
.
Tendo em vista que com os modelos animais consegue-se
minimizar as variáveis extrínsecas, acredita-se que a presença de
diferentes fenótipos possa ser justificada por alterações no genótipo
destes animais.
Desta forma, é interessante a investigação de regiões gênicas
responsáveis pela produção de enzimas importantes durante o
desenvolvimento da carcinogênese. A atividade de transcrição de um
gene é parcialmente regulada pela região promotora
82
e assim, a
presença de polimorfismos genéticos específicos nesta região pode
alterar a expressão da enzima.
A investigação da região promotora do gene da
metaloproteinase da matriz extracelular-9 (MMP-9) é apontada como fator
importante, visto que esta enzima apresenta função degradadora de
13
colágeno tipo IV
33,38,44,90
, o que gera a destruição da membrana basal,
que conseqüentemente permite os processos de invasão e metástase
90
.
A elevada expressão da enzima MMP-9 está relacionada a
casos de câncer bucal
38,42
, carcinoma gástrico
103
, carcinoma de cabeça e
pescoço
79
, carcinoma esofágico
33,47
, câncer de mama
51
, carcinoma de
endométrio
18
dentre outros. Sendo que, sua expressão aumentada pode
ser também relacionada com pobre diferenciação celular
33
, alto grau de
invasão
18,42,47,103
e/ou metástase
33,38,103
.
Em adição, esta metaloproteinase apresenta amplo papel no
desenvolvimento do câncer experimental, uma vez que camundongos que
apresentam deficiência na produção de MMP-9 possuem poucas lesões
neoplásicas, com baixa densidade vascular
40
, além de um reduzido
número de metástases
44
.
Na região promotora do gene da MMP-9, um polimorfismo do
tipo microssatélite é encontrado, devido à presença de uma seqüência de
repetições CA (Citosina-Adenina)
81,102
. A redução do número de
repetições CA está correlacionada com a diminuição da expressão do
gene da MMP-9 em humanos
81
e em camundongos
28
.
Assim, visto que a presença do polimorfismo genético pode
interferir na expressão da enzima MMP-9 nos tecidos e que, o nível desta
enzima está relacionado com diferenciação celular, invasão e metástase
de neoplasias, acredita-se que fatores intrínsecos ao hospedeiro
desempenham um papel importante no desenvolvimento do CEC.
Portanto, acredita-se que talvez seja possível identificar, com o auxílio da
biologia molecular, um padrão de indivíduos com maior propensão para o
CEC.
Desta maneira, o estudo de polimorfismos no gene da MMP-9 é
importante na busca de um potencial marcador, não apenas para a
susceptibilidade ao câncer, mas também auxiliando no plano de
tratamento, para um melhor prognóstico, ou até mesmo na prevenção da
doença.
2 REVISÃO DA LITERATURA
O câncer é um dos maiores problemas de saúde pública. No
Brasil, segundo estimativas do Instituto Nacional de Câncer (INCA), em
2006
7
, seriam contabilizados 472.050 novos casos de câncer, sendo
234.570 no sexo masculino e 237.480 no feminino. Essas foram
estimativas mínimas, visto que muitas lesões suspeitas são removidas
sem diagnóstico e há um sub-registro destes valores
7
.
Todos esses dados são extremamente elevados e impulsionam
numerosos estudos que visam o entendimento do processo de
carcinogênese, bem como a busca de tratamentos mais efetivos e
mecanismos preventivos para o câncer.
2.1 Carcinogênese
A carcinogênese é o processo de conversão de uma célula
normal em uma célula neoplásica maligna, sendo que os indutores desse
processo são denominados carcinógenos
55
.
Tais agentes cancerígenos provocam alterações genéticas no
ácido desoxirribonucléico (DNA) celular, as quais levam à quebra das
barreiras que governam a proliferação celular normal, fazendo com que as
células que estão no ciclo celular ou que são capazes de nele entrar
dêem origem a clones de células transformadas, favorecendo o
surgimento de células imortalizadas, ou seja, com capacidade de realizar
divisões infinitamente
8
.
15
A carcinogênese é um processo de múltiplas etapas, pois a
aplicação de um carcinógeno não leva ao imediato aparecimento do
câncer
29,55
. O processo da carcinogênese pode ser dividido basicamente
em três fases: iniciação, promoção e progressão
8
.
A iniciação é causada por uma alteração irreversível do DNA,
sendo que pode ser conseqüência de uma falha no mecanismo de
detoxificação do carcinógeno, reparo do DNA ou eliminação das células
que tenham DNA alterado
11,55
.
A promoção neoplásica pode ser produzida pelo próprio
carcinógeno ou por outras substâncias, chamadas agentes promotores,
as quais, isoladamente, não causam o aparecimento de neoplasias,
portanto, não são carcinogênicos em si, mas induzem a divisão celular
num tecido previamente iniciado
29
.
A progressão é a etapa caracterizada por sucessivas
modificações na expressão gênica das células neoplásicas, gerando a
transformação de uma lesão pré-maligna em maligna
8,55
.
Dentre os agentes capazes de induzir proliferação neoplásica,
podemos citar os carcinógenos químicos, físicos ou biológicos
76
.
2.1.1 Carcinogênese química
O primeiro relato de carcinogênese induzida por um agente
químico foi descrito por Percival Pott em 1775, o qual observou que
limpadores de chaminé apresentavam um risco aumentado de
desenvolver carcinoma de escroto, devido à exposição aos produtos do
carvão e da fuligem que se depositavam sobre a pele da região
6,8,55
.
Para que ocorra a carcinogênese, a substância química
utilizada deve ser efetiva e interagir com os constituintes celulares,
incluindo os ácidos nucléicos. Os compostos que realizam reações
diretamente com a célula são chamados de carcinógenos de ação direta,
16
enquanto aqueles que requerem uma ativação metabólica anterior à
atividade principal são de ação indireta
8,92
.
Dentre os principais carcinógenos químicos capazes de
desencadear neoplasias malignas estão os Hidrocarbonetos Policíclicos
Aromáticos (HPA)
8
. Estes compostos constituem uma família de
elementos caracterizados por possuírem dois ou mais anéis aromáticos
condensados. Estas substâncias, bem como seus derivados, têm ampla
distribuição e são encontrados como constituintes de misturas complexas
em quase todos os compartimentos ambientais
70
. Os organismos
expostos aos HPAs pela inalação, ingestão e contato de pele apresentam
um maior risco de câncer de pulmão, bexiga e pele
6
.
Um carcinógeno é considerado incompleto quando possui
apenas a ação iniciadora, enquanto um carcinógeno completo possui
atividades iniciadoras e promotoras simultâneas. Dentre os completos,
encontra-se o 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno (DMBA), um tipo de
HPA
34,35
. O DMBA é um dos carcinógenos mais utilizados no modelo de
carcinogênese química em animais
57
.
A carcinogênese química experimental em animais possibilita a
verificação de mudanças teciduais precoces, marcadores diagnósticos e
potencial de reversibilidade das lesões
16
, proporcionando não apenas o
estudo da biologia neoplásica, como também o desenvolvimento e a
avaliação de estratégias de prevenção do câncer
57
.
2.1.2 Carcinogênese química experimental em pele
Em 1915, Yamagiwa e Ichikawa
97
desenvolveram carcinomas
de pele em coelhos após aplicações de carvão mineral, dando início à
utilização de animais de laboratório para o estudo da carcinogênese
induzida quimicamente.
17
Atualmente, o processo de carcinogênese química em animais
é um dos principais meios para o estudo seqüencial da evolução do
processo do câncer, sendo um modelo confiável para o desenvolvimento
multifásico da neoplasia
9,17,83
.
Dentre os numerosos modelos de carcinogênese, um dos mais
bem caracterizados é o realizado em pele
68
. Este é tipicamente um
processo multiestágio constituído por iniciação, promoção e progressão
41
.
A pele tem sido muito utilizada, devido às facilidades de
manipulação e de observação
8,34,35
. Para este modelo experimental, uma
simples dose do agente iniciador é aplicada na pele do animal, seguida
por repetidas aplicações do agente promotor
68
.
Podem-se citar basicamente dois modelos mais amplamente
utilizados para a carcinogênese química em pele: o modelo composto por
duas fases e o modelo completo.
O modelo de carcinogênese composto por duas fases é
caracterizado pela iniciação do processo por uma dose subcarcinogênica
(i.e., DMBA) seguida por aplicações múltiplas por um longo período do
promotor, como por exemplo, o TPA (13-acetato-12-0-tetradecanoilforbol).
Este tipo de tratamento gera predominantemente a formação de
neoplasias benignas (papilomas) e também alguns carcinomas
104
. Em
contraste, o modelo de carcinogênese completa requer múltiplas
aplicações tópicas da substância, como o DMBA (iniciador e promotor), na
pele do camundongo, o qual conduz ao desenvolvimento de uma grande
proporção de carcinomas
9
.
Para a indução da carcinogênese em pele, a utilização dos
camundongos hairless tem obtido grande sucesso
9,17,83
. Apesar de outras
espécies serem utilizadas, como os SENCAR
84,95
, a grande vantagem da
utilização de camundongos sem pêlo, é a facilidade de manipulação, de
aplicação do carcinógeno e de avaliação dos resultados.
18
A mutação hairless (Hr
hr
) foi encontrada em um camundongo
encontrado em um aviário em Londres, em 1924, o qual foi então levado
ao The Jackson Laboratory, em 1956, pelo Dr. E. L. Green. Dr. Green
cruzou este animal com uma fêmea BALB/c e os descendentes foram
cruzados entre si. Em 1964, na geração F24, a espécie foi nomeada
HRS/J
87
.
Embora artificial, o modelo de carcinogênese em pele de
camundongos é um sistema ideal para o estudo quantitativo e qualitativo
das alterações que ocorrem durante os diferentes estágios da
carcinogênese química, permitindo a análise dos eventos de iniciação
promoção e progressão da lesão neoplásica
104
.
Neste modelo, os carcinomas produzidos pelos agentes
químicos são semelhantes às lesões neoplásicas de pele em humanos
3
e,
dessa maneira, os resultados obtidos apresentam grande relevância para
um entendimento mais profundo do câncer epitelial humano
61
.
2.2 Câncer de pele
O câncer de pele é o câncer mais comum em diversas
populações mundiais
72
. Este tipo de câncer pode ser classificado em
melanoma ou câncer de pele não melanoma (CPNM).
O melanoma se origina dos melanócitos presentes na epiderme
e é o câncer de pele mais agressivo, e que, portanto, apresenta grande
possibilidade de metastizar e causar morte
20
. Apesar de sua letalidade ser
elevada, sua incidência é baixa, sendo as estimativas, previstas para o
Brasil, no ano de 2006, de 2.710 casos novos em homens e 3.050 casos
novos em mulheres
7
.
19
Em contraste, os CPNM apresentam grande incidência na
população brasileira, sendo o número de casos novos estimados para
2006 de 55.480 em homens e de 61.160 em mulheres. Estes valores
correspondem a um risco de 61 casos novos a cada 100 mil homens e 65
para cada 100 mil mulheres
7
. O CPNM pode ser subdividido em
carcinoma basocelular e carcinoma espinocelular (CEC). Ambos se
originam dos queratinócitos da epiderme, sendo que o carcinoma
basocelular apresenta um crescimento lento, que raramente causa
metástase, porém pode gerar grande morbidade. Em contraste, o CEC
apresenta maior tendência a metastizar
20
.
2.2.1 Desenvolvimento do CEC
O desenvolvimento do CEC é um processo de múltiplas etapas,
que freqüentemente apresenta lesões iniciais proliferativas caracterizadas
por padrões histológicos distintos. Com o tempo, há freqüentemente
proliferação aumentada, acompanhada por alteração da morfologia. Estas
lesões, com a presença de atipias celulares, mas sem evidência de
invasão, por vezes chamadas carcinoma in situ, precedem o
desenvolvimento de um carcinoma verdadeiro, no qual detecta-se a
invasão
49
.
É atualmente aceito que a membrana basal, a qual separa o
epitélio das células mesenquimais, representa a primeira barreira para a
invasão das células epiteliais neoplásicas
88,101
. As células do CEC
atravessam a membrana basal e adentram no tecido conjuntivo,
objetivando invadir estruturas adjacentes, fenômeno que caracteriza o
processo de invasão neoplásica
30
.
Morfologicamente, a invasão tumoral está associada com a
alteração das bordas da lesão neoplásica, onde as células parecem
invadir a matriz extracelular (MEC) adjacente ao tumor primário
15
. Para
que esse fenômeno ocorra, são necessárias alterações nas interações
20
entre as células neoplásicas e a MEC, com aumento na secreção das
enzimas degradadoras da matriz
38,67,88
. Longe de ser uma barreira física,
o estroma participa ativamente do processo de invasão neoplásica
67,83,88
.
Uma das mais sérias conseqüências da invasão é a produção
de metástases. As células malignas, da mesma forma que são capazes
de romper a membrana basal e degradar o tecido intersticial, podem
invadir os vasos sangüíneos e linfáticos e serem levadas pela
circulação
63
. Estando na corrente sangüínea, necessitam ainda atravessar
as células endoteliais e a membrana basal em um local distante, e só
então emigrar do vaso para um tecido íntegro, no qual irão se proliferar e
caracterizar o processo de metástase
38
.
Dentre as enzimas degradadoras da MEC, destacam-se as
metaloproteinases da matriz (MMPs)
52,85,88,91
. Estas podem agir em um ou
mais componentes
93
, sendo que juntas, apresentam a capacidade de
degradar praticamente todos os elementos proteicos conhecidos da
MEC
45
.
2.3 Metaloproteinases da matriz (MMPs)
O grupo das MMPs é representado por mais de 20 enzimas
humanas
45,99
, as quais apresentam certas características em comum. A
primeira é a utilização da presença do zinco para realizarem suas
ações
93,94
; a segunda é a inibição da ação das MMPs por seus inibidores
teciduais (TIMP), com os quais formam complexos inativos e auxiliam o
controle da quantidade de enzima ativa
5,19,93
; e a terceira é a secreção da
enzima em uma forma latente, chamada zimógeno
27,89
.
Em condições fisiológicas normais, há uma rigorosa regulação
da secreção das MMPs, as quais são sintetizadas e secretadas como pré-
enzimas, os zimógenos, que posteriormente são ativados
22,36,65,78,93
.
21
Esta regulação ocorre apenas em momentos específicos, nos
quais existem processos multifásicos de ativação dos zimógenos,
podendo também ser influenciada por inibidores sangüíneos e teciduais,
os quais monitoram a ação da proteinase
93
.
Os níveis das MMPs nos tecidos saudáveis são baixos ou
praticamente indetectáveis
36,69
. Um desequilíbrio dos níveis de MMP e
TIMP pode resultar em patologias como a artrite reumatóide, osteoartrite e
crescimento neoplásico, com invasão e metástase
5
.
A expressão das MMPs é substancialmente aumentada na
maioria das neoplasias malignas
36
. Devido ao papel importante das MMPs
no desenvolvimento do câncer, diversos autores têm relacionado seus
níveis com carcinomas de esôfago
47
, oral
53,54
, de endométrio
1,18
, de
pele
30
, entre outros.
Em geral, existem dois aspectos importantes relacionados ao
papel das MMPs na progressão do câncer: a associação entre a
expressão das MMPs e o grau ou a agressividade da neoplasia e a
correlação da expressão e atividade das MMPs com relação ao risco de
recorrência ou metástase
90
.
Apesar de certos domínios das MMPs serem homólogos, estas
enzimas exibem considerável diversidade nos domínios estruturais e no
substrato protéico específico
89
. Desta maneira, as MMPs são
classificadas de acordo com seu domínio e organização estrutural, além
do substrato específico para degradação
52
. Apresentam diversas classes,
dentre elas, as colagenases, as matrilisinas, as estromelisinas, as
gelatinases e as MMPs ligadas à membrana (MT-MMP)
36,91,93
.
As colagenases 1, 2 e 3 são as MMPs-1, -8 e -13
respectivamente. Essas degradam as moléculas de colágeno intersticial
tipo I, II e III, além de digerirem outras moléculas da MEC
4,45
.
As matrilisinas 1 e 2 (MMP-7 e -26, respectivamente) digerem
diversos componentes da matriz, dentre os quais estão a fibronectina e o
colágeno tipo IV
4,45
.
22
As MT-MMPs são numeradas de 1 a 6: MT1-MMP, MT2-MMP,
MT3-MMP, MT4-MMP, MT5-MMP e MT6-MMP, correspondendo
respectivamente às MMPs-14, -15, -16, -17, -24 e -25. Além de
apresentarem papel importante na ativação das outras MMPs
43
, os
subtipos das MT-MMPs são responsáveis pela degradação de diferentes
componentes da MEC
45,64
.
E estromelisinas 1 e 2 (MMPs-3 e -10) podem degradar
fibronectina e proteoglicanas
4,64
, enquanto as gelatinases A e B (MMPs-2
e -9) degradam principalmente colágeno desnaturado (gelatinas) e
colágeno tipo IV
45,90,93
.
2.3.1 MMP-9
Da mesma forma que as outras MMPs, a MMP-9 é secretada
como zimógeno e permanece inativa até que seja ativada pela remoção
do domínio propeptideo, quando uma mudança conformacional ocorre e o
zinco se torna acessível para o substrato, resultando na ativação da
enzima. Diferentes proteases são conhecidas por ativar a MMP-9, como
por exemplo, as MMPs -2 e -3
75
.
A MMP-9 é produzida por diversos tipos de células, incluindo
queratinócitos, monócitos, macrófagos teciduais, leucócitos
polimorfonucleares e uma variedade de células neoplásicas malignas
75
.
Como membro da família das gelatinases, a MMP-9 degrada
gelatina (colágeno desnaturado) e colágeno tipo IV, o maior componente
da membrana basal
75
.
A determinação da capacidade de invasão de um CEC é
extremamente importante na conduta clínica, no tratamento e no
prognóstico
38
.
23
A facilidade das gelatinases em iniciar a destruição da
membrana basal e ainda degradar os componentes colágenos e não-
colágenos da MEC justifica suas importantes ações durante a invasão
neoplásica
88
.
Na literatura é relatado que altos níveis da MMP-9 estão
presentes em casos de grande potencial de invasão em carcinomas
oral
42
, gástrico
103
, esofágico
47
e de endométrio
18
. E desta maneira, pode-
se notar a relação entre os níveis de MMP-9 e o processo de invasão
tumoral
18,38,42,103
, apesar de poucos autores não terem verificado esta
associação
33,47,79
.
É ainda relatada a expressão aumentada de MMP-9 em casos
de neoplasias com reduzida diferenciação celular
1,33
, fato que estimula
ainda maiores pesquisa sobre o papel desta enzima no desenvolvimento
do carcinoma.
Como uma forma alternativa de terapia anti-câncer, diversos
autores têm buscado inibir as funções das MMPs, sintetizando alguns
inibidores
46,59,60,80,96
.
Apesar da detecção imunoistoquímica e zimográfica dos níveis
das MMPs e o tratamento com inibidores sintéticos terem tido relativo
sucesso nas pesquisas, estes procedimentos são aplicados após o
estabelecimento do CEC. Entretanto, atualmente, têm-se dado grande
importância às pesquisas que buscam a prevenção da lesão.
Para que a enzima seja expressa no tecido, e possa ser
detectada pela imunoistoquímica e zimografia, é necessário que a
informação seja trazida pelo ácido ribonucléico (RNA), após este ter
copiado a codificação genética presente no DNA
21
. Se existe alguma
alteração no gene, é possível existir uma modificação neste processo,
resultando em diferente expressão da proteína MMP no tecido. Assim, o
controle genético é particularmente importante nesta regulação e se
alterações, como um polimorfismo genético, são encontradas, elas podem
24
interferir na susceptibilidade
37,53,54
ou em um distinto desenvolvimento
clinicopatológico do câncer
31,100
.
2.4 Polimorfismos genéticos
Os polimorfismos ocorrem naturalmente como modificações da
seqüência de DNA encontradas em pelo menos 1% dos indivíduos
50,56,73
.
Considerando-se o tamanho do genoma humano (3x10
9
pares de base -
pb), espera-se encontrar mais de 10 milhões de pontos de variação no
DNA
21
.
Apesar da maioria dos polimorfismos de DNA ser
funcionalmente neutra, uma parte deles pode exercer efeitos na regulação
da expressão gênica ou na função da proteína codificada, evidenciando
assim, diferenças entre indivíduos em vários aspectos biológicos e na
susceptibilidade às doenças
99
.
Basicamente existem dois tipos de variações no DNA de
indivíduos normais: aquela que afeta um simples par de bases, chamado
polimorfismo de nucleotídeo simples (SNP), e a que envolve seqüências
repetidas, o polimorfismo das seqüências curtas repetidas em série
(STRP)
21
.
A categoria de seqüências repetidas em tandem (uma após a
outra) pode ser do tipo microssatélite. Estas incluem seqüências muito
pequenas contendo, geralmente, de 1 a 4 pb que aparecem distribuídas
repetidamente ao longo do genoma
21
. A maioria dos microssatélites
ocorre em seqüências repetidas de dinucleotídeos
99
, sendo que as
seqüências citosina/adenina (CA) e citosina/timina (CT) são mais
comuns
21
.
25
Pode-se notar no genoma humano cerca de 100.000 blocos de
repetições em série de nucleotídeos CA e o número destas repetições em
um determinado locus varia entre indivíduos. Desta maneira, as
diferenças no número de repetições podem ser usadas como marcadores
genéticos. Tais variações podem ser facilmente detectadas por reação em
cadeia da polimerase (PCR), facilitando o uso dos microssatélites como
marcadores
11
.
A presença de um polimorfismo nos genes das MMPs pode
estar relacionada com várias patologias caracterizadas pela degradação
da matriz extracelular
82,99
. Alguns trabalhos têm investigado esta relação
com diversos tipos de câncer como melanoma
100
, carcinoma oral
53,54
;
câncer gástrico
62
, coloretal
37
, câncer de pulmão
86
, de mama
31,32,74
, entre
outros.
Em relação às MMPs, existem diversos mecanismos de
regulação que influenciam sua ação final na degradação da matriz
extracelular
99
. Parece, entretanto, que para a maioria das MMPs, a etapa
chave é a regulação da transcrição
22
.
As regiões responsáveis pelo controle da transcrição do gene
são os promotores genéticos e recentemente, polimorfismos do DNA
foram encontrados na região promotora dos genes de diversas MMPs
82
. A
análise estrutural e funcional da região promotora de genes destas
enzimas tem promovido um melhor entendimento dos mecanismos que
regulam sua expressão
27
.
2.4.1 Polimorfismos no gene da MMP-9
Em humanos, especificamente em relação à investigação do
gene da MMP-9, dois polimorfismos que afetam a ação de transcrição
deste gene têm sido identificados na região promotora
99
. Um deles é um
SNP na posição -1562
102
e o outro consiste na seqüência de repetições
CA próxima à região -90
81
.
26
Devido ao fato das seqüências de microssatélites serem
comumente encontradas nos promotores genéticos humanos, a
habilidade em modular a transcrição pode ser significante em relação à
susceptibilidade e patogênese de numerosas doenças genéticas
complexas
71
. Dessa maneira, o polimorfismo com repetições CA na região
promotora do gene da MMP-9 tem sido avaliado em algumas patologias
como aneurisma intracranial
71
, esclerose múltipla
26,66
, nefropatia
diabética
58
, degeneração macular relacionada a idade
25
, aterosclerose
23,24
e melanoma
12
.
Em 1999, Peters et al.
71
avaliaram a relação entre a presença
de polimorfismos de repetição no gene da MMP-9 e a susceptibilidade do
indivíduo desenvolver aneurisma intracranial. Os autores verificaram que
a variação genética no promotor do gene da MMP-9 resulta em variação
na expressão no nível transcricional. Este fato pode gerar diferenças na
atividade da MMP-9, conduzindo ao aumento da susceptibilidade de
formação do aneurisma intracranial.
Em 2000, Nelissen et al.
66
não encontraram associação entre a
presença de polimorfismo no promotor da MMP-9 e a susceptibilidade à
esclerose múltipla. Entretanto, em 2004, Fiotti et al.
26
concluíram que a
presença de 22 ou mais repetições CA na região promotora deste gene
está associada ao aumento do risco à esta patologia.
No estudo em pacientes com nefropatia diabética
58
(caracterizada pelo acúmulo de proteínas da matriz extracelular no
glomérulo renal), os autores verificaram que, dentre nove alelos, as
amostras com 21 repetições CA apresentaram maior expressão de MMP-
9 e conseqüente proteção para o desenvolvimento e progressão da
doença.
Em 2005, Fiotti et al.
23
avaliaram se este polimorfismo de
repetição no gene da MMP-9 estava associado à degeneração macular
relacionada à idade. Eles verificaram que microssatélites maiores na
27
região promotora da MMP-9 estavam associados ao desenvolvimento da
doença.
No mesmo ano, o mesmo autor e seus colaboradores
25
,
verificaram que indivíduos portadores de mais de 20 repetições
mostraram crescimento mais rápido da espessura íntima-média das
artérias carótidas e mais rápida progressão da remodelação constritiva.
Poucos trabalhos foram realizados avaliando a relação da
presença de microssatélites e o câncer. Foi estabelecido que em células
de carcinoma esofágico, o promotor da MMP-9 compreendendo 14
repetições CA apresenta apenas 50% da atividade de transcrição de um
promotor contendo 21 repetições CA
81
.
Em culturas de células de adenocarcinoma de pulmão, Huang
et al.
39
testaram a ação de um agente anticâncer e verificaram que o
fármaco inibiu a expressão da MMP-9, devido a um encurtamento do
microssatélite do DNA. Com o uso do fármaco, o número de CA reduziu
de 24 para 18 e a expressão da enzima passou a ser apenas de 53%,
reforçando a hipótese da associação entre o polimorfismo e a ação da
MMP-9.
Sabe-se que o comprimento destas repetições CA interfere na
atividade promotora do gene MMP-9, fato verificado com a correlação
entre um menor comprimento de repetições CA e a diminuição da
expressão do gene da MMP-9 em cultura de células de carcinoma
esofágico
81
.
Devido à similaridade entre as regiões promotoras de humanos
e camundongos, evidências laboratoriais obtidas destes animais
promovem um modelo de confiança para o entendimento do efeito destes
polimorfismos em humanos
26
.
Fornoni et al.
28
verificaram que camundongos com
glomerulonecrose apresentaram 20 repetições CA enquanto que outra
linhagem, resistente a mesma doença, continha 24 repetições. O grupo
com glomerulonecrose, foi ainda associado à menor expressão e
28
atividade da MMP-9 e dessa maneira, os autores concluíram que
alterações no promotor do gene da MMP-9 podem representar
marcadores genéticos para o desenvolvimento da glomerulonecrose.
Em camundongos, pequenas diferenças no comprimento do
microssatélite (20–24 repetições) podem ser responsáveis por uma
diferença na expressão da MMP-9, e semelhantemente ao gene humano,
a região promotora do gene MMP-9 contendo menores repetições CA tem
sido associada com menor expressão e atividade da MMP-9
28
.
Na realidade, este polimorfismo não justifica a doença, porém,
facilita a expressão de MMP-9, podendo agir no desenvolvimento da
patologia
23
.
Apesar de ter sido relatado que uma redução no número de
repetições CA no gene da MMP-9 está associada a uma marcante
redução na expressão e na atividade enzimática da MMP-9, observa-se a
necessidade de pesquisas adicionais que investiguem a associação entre
este polimorfismo no gene da MMP-9 e as características
clinicopatológicas do carcinoma espinocelular.
3 PROPOSIÇÃO
O objetivo deste estudo foi testar a hipótese de que a presença
de polimorfismo do tipo microssatélite (repetições CA) na região
promotora do gene da MMP-9 pode influenciar as características clínicas
e histopatológicas do carcinoma espinocelular em pele de camundongos
hairless, submetidos a um modelo de carcinogênese experimental (0,5%
DMBA em acetona).
4 METODOLOGIA
Todos os procedimentos realizados neste trabalho seguiram os
Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), com a aprovação
fornecida pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos – UNESP (017/2005-PA/CEP)
(Anexo A).
4.1 Carcinogênese experimental
Noventa e quatro camundongos hairless (HRS/J - Jackson
Laboratory, Bar Harbor, ME), machos e fêmeas, com idade média de 3,5
meses, foram fornecidos pelo Biotério da Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos – UNESP, onde permaneceram em gaiolas com
temperatura ambiente, ração (Guabi – Nutrilabor) e água ad libitum
durante todo o período experimental.
O processo de carcinogênese química foi induzido em todos os
animais, por meio do tratamento tópico com a solução de DMBA (Sigma
Chemical, St. Louis, MI, USA), a 0,5% diluído em acetona, previamente
preparada em capela e estocada a 4ºC.
Para a realização de qualquer procedimento com a
manipulação do carcinógeno, os operadores utilizaram equipamento de
proteção individual composto por máscara com filtro especial para gazes
tóxicos, luvas de nitrilo, gorro, óculos de proteção e avental.
31
A aplicação da solução de DMBA foi realizada com o auxílio de
um pincel de pêlo de camelo número zero, com remoção do excesso de
solução. Os animais receberam três pinceladas do carcinógeno na região
ilíaca, dos lados direito e esquerdo, uma vez por semana, até a 16ª
semana (Figura 1).
FIGURA 1-
Local de aplicação da solução de DMBA na pele dos camundongos
hairless submetidos ao processo de carcinogênese.
Na 17ª semana, todos os animais foram anestesiados para a
avaliação clínica e a realização das biópsias, sendo posteriormente
realizada a eutanásia.
4.2 Análise fenotípica
Inicialmente realizou-se a avaliação clínica das lesões e
posteriormente o diagnóstico, por meio da análise histopatológica.
32
4.2.1 Análise clínica
Primeiramente, os animais foram anestesiados, via
intramuscular, com uma solução de cloridrato de 2-(2,6-xilidino)-5,6-
dihidro-4H-1,3-tiazina (Rompun®) e ketamina (Dopalen®), na proporção
de 1:0,5, na dose de 0,1ml/100g de peso. Os animais foram então
fotografados e as lesões caracterizadas clinicamente. Os três avaliadores
verificaram: a presença ou ausência de ulceração e o tamanho das
lesões.
Posteriormente, foi realizada biópsia excisional da maior lesão
presente no dorso do animal. O material foi então hemiseccionado e
imediatamente submerso em solução de formaldeído tamponado a 10%.
4.2.2 Análise histopatológica
Após um período de fixação de 48 horas, o material foi incluído
em blocos de parafina para realização de vinte cortes seriados (5 µm de
espessura) a partir da região central de cada lesão, colocados em quatro
lâminas de vidro. As lâminas 1 e 3 foram coradas com hematoxilina e
eosina (HE) e as lâminas 2 e 4 com ácido periódico de Schiff (PAS), para
posterior análise qualitativa, por meio da microscópia de luz (Axiophot –
Axioplan – Carl Zeiss, Oberküchen, Germany).
Os cortes corados pelo HE e PAS foram diagnosticados por três
observadores calibrados. A integridade da membrana basal foi verificada
nas lâminas coradas em PAS e as lesões nos cortes em HE foram
classificadas em relação ao estágio e ao padrão de invasão, além do grau
de diferenciação celular.
A classificação segundo o estágio e o padrão de invasão foi
baseada parcialmente no modelo proposto por Anneroth et al.
2
, sendo os
critérios adaptados para a pele e subdivididos em quatro graus.
33
O estágio de invasão grau 1 agrupou as lesões com invasão
questionável; já o grau 2, foi caracterizado pela invasão da derme; no
grau 3, a invasão atingiu a hipoderme; e no grau 4, a invasão foi extensa
e profunda, chegando à camada muscular.
Na avaliação do padrão de invasão, foi considerado grau 1,
quando as bordas de infiltração foram bem delimitadas; grau 2, quando a
infiltração ocorreu em cordão e/ou faixa; grau 3, na presença de grupos
de células com n>15; e grau 4, pela ampla disseminação de células em
pequenos grupos (n<15) e/ou células isoladas.
Em relação ao grau de diferenciação celular, as lesões foram
avaliadas em bem diferenciadas, moderadamente diferenciadas e pouco
diferenciadas.
Após toda a avaliação histopatológica, os dados foram
tabulados e submetidos à análise estatística.
4.3 Análise genotípica
No dia do sacrifício, além da biópsia da lesão, também foi
realizada a secção da cauda de cada animal, com tamanho aproximado
de 0,5cm. Este material foi imediatamente colocado para conservação em
solução de RNAlater® (Ambion Inc) e posteriormente estocado em freezer
-20ºC.
34
4.3.1 Extração do DNA
As caudas dos animais foram retiradas da solução de
RNAlater® e lavadas em água ultra pura. O DNA foi extraído com a
utilização do kit Wizard® SV Genomic DNA Purification System
(Promega).
A concentração do DNA genômico de cada amostra foi
quantificada com o auxílio de um espectrofotômetro (ND-1000
Spectrophotometer – Nano Drop Technologies), em comprimento de onda
de 260 nm e sua pureza determinada pela razão das densidades ópticas
260/280.
4.3.2 Reação de PCR
O objetivo da reação de PCR foi amplificar um fragmento (~128
pb) contendo as repetições de dinucleotídeos na região promotora do
gene da MMP-9 (Figura 2). Os primers utilizados
28
foram: 5′-
CTGCCTGACTTGGCAATG-3′ e 5′-TCCAGGCTTATGCTGACT-3′.
primerGGGGACTGTGGGCAGGGCATAAGGGAGGGGGTAGTGTAAACACACA…CGCTGprimer
FIGURA 2-
Fragmento da região promotora do gene da MMP-9 amplificado pela
técnica do PCR: nas estremidades estão as regiões de ligação com os
primers e sublinhada está a sequencia de repetições CA.
A reação de PCR das amostras foi realizada em um volume
total de 10 µl, contendo aproximadamente 10 ng de DNA genômico, 1 µl
10X PCR Buffer, 1 mM MgCl
2
, 0,2 mM de dNTP’s, 0,3 unidade de Taq
DNA polimerase, 8,04 µl de água ultra pura e 0,05 µl de cada primer (100
µM). A solução foi incubada durante 10 minutos a 95°C, seguida por trinta
ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 30 segundos a
72°C, com outros 6 minutos a 72°C após o ciclo final.
35
Para a avaliação posterior no programa Phoretix 1D Advanced
(Version 4.01, Non Linear Dynamics Ltd), foram escolhidos dois
marcadores, um maior e um menor que o fragmento da região da MMP-9.
Os fragmentos escolhidos apresentavam 107 pb e 169 pb e ambos foram
amplificados por PCR.
O fragmento contendo 107 pb é normalmente utilizado para
detecção de polimorfismo do tipo SNP no gene da Protocaderina 1. Para
a sua amplificação pela reação de PCR, foram utilizados os primers: 5’-
GTGCTTTCGGGAGGAATGTG-3’ e 5’-
ACCACCATACCAGGCCCTAGTAC-3’ e foi escolhido o DNA de uma
amostra conhecidamente homozigota. Foi utilizado um volume total de
250µl, contendo aproximadamente 200 ng de DNA, 25 µl 10X ABgene
PCR Buffer IV, 0,4 µM de cada primer, 1,5 mM MgCl
2
, 0,2 mM de dNTP’s
e 0,6 unidade de Taq DNA polimerase. A solução foi incubada durante 2
minutos a 95°C, seguida por quarenta ciclos de 30 segundos a 95°C e 1
minuto a 60°C, finalizando com um ciclo a 25°C durante 10 minutos.
A reação de PCR do fragmento contendo 169 pb, específico
para a região entre os genes da interleucina 4 e da interleucina 13, foi
realizada com os seguintes primers: 5’-
GGCTGATTTGTAAGTTGGTAAGCC-3’ e 5’-
CAAATTCCTGGGCTCAAGTG-3’. O DNA para esta reação foi o DNA
controle padrão da European Collection of Cell Cultures (ECACC), o
Human Random Control 1 (HRC 1), o qual foi previamente testado como
um bom marcador. A solução de PCR (250 µl) foi composta por 200 ng de
DNA, 25 µl de 10X ABgene PCR Buffer IV, 0,4 µM de cada primer, 2,5
mM MgCl
2
, 0,2 mM of dNTP’s e 0,3 unidades de Taq DNA polimerase. A
solução foi submetida a um ciclo de 95°C por 3 minutos, seguido por 35
ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 58°C e 30 segundos a
72°C, terminando com um ciclo de 10 minutos a 72°C.
36
4.3.3 Eletroforese
O gel utilizado para a eletroforese foi o MADGE (Microplate
Array Diagonal Gel Eletrophoresis), com formato modificado (Figura 3a),
disponíveis pela MadgeBio Ltd. (http://www.madgebio.freeserve.co.uk). O
volume total de 50 ml foi composto por: 9% Duracryl (40% acrilamida/BIS
19:1) e 7% Glicerol em 1xTAE (Tris-acetato-EDTA). Os catalizadores de
polimerização, TEMED (Tetrametilediamino) e 25% APS (persulfato de
amônia) foram adicionados (150 µl de cada) à mistura. Esta solução foi
então vertida na forma MADGE (Figura 3b) e logo em seguida uma placa
de vidro silanizada foi colocada sobre o gel (Figuras 3c e 3d). Após a
polimerização, o gel foi retirado da forma e imerso em solução tampão
1xTAE, contendo 5 mM KCl por uma hora, visando equalizar as condições
iônicas próximas ao ânodo e ao cátodo, para que não ocorresse o
desbalanço por meio das mobilidades desiguais, dos diferentes íons,
durante a corrida
48
.
FIGURA 3-
Utilização do sistema MADGE para a confecção do gel: a) Forma com os
poços para 96 amostras; b) Colocação da solução do gel sobre a forma
MADGE; c) e d) Colocação da placa de vidro sobre o gel.
a
b
c
d
37
Antes da eletroforese, foi preparada uma mistura de 70 µl de
tampão de amostra (98% formamida deionizada, 10 mM EDTA e xileno
cianol FF), 70 µl de 5xTAE, 35 µl do marcador com 107 pb e 70 µl do
marcador com 169 pb. Posteriormente, 2 µl desta mistura foram
adicionados a 1 µl do produto do PCR do fragmento do gene da MMP-9
de cada amostra e conseqüentemente, um total de 3 µl foi adicionado a
cada poço. Logo em seguida, deslizou-se uma placa de vidro sobre a
superfície do gel (Figuras 4a, 4b e 4c), a qual foi mantida em posição com
o auxílio de dois elásticos posicionados longitudinalmente e dois tubos de
silicone inseridos entre os vidros, de cada lado do gel, deixando as bordas
voltadas para o ânodo e o cátodo não seladas
10
(Figura 4d). A
eletroforese foi realizada a 200 V durante duas horas.
FIGURA 4-
Procedimentos finais na utilização do sistema MADGE, após a colocação
das amostras nos poços do gel: a), b) e c) Deslizamento da placa de vidro
sobre a superfície do gel; d) Fixação das placas de vidro com auxílio de
dois elásticos longitudinalmente e dois tubos de silicone inseridos entre os
vidros.
a
c
b
d
38
4.3.4 Análise das imagens
Os géis foram corados por uma solução de SYBR Gold: 100 µl
1xTBE (Tris-borato-EDTA) adicionados a 10 µl SYBR Gold (Invitrogen),
durante 15 minutos, em um agitador (Ika KS, 260 basic) com cem
rotações por minuto. Em seguida, os géis foram retirados da solução de
coloração e imersos em água, durante 10 minutos, também sob agitação
de cem rotações por minuto.
Após este período, os géis foram escaneados pelo aparelho
Typhoon Trio + (Amersham Biosciences). As imagens escaneadas foram
analisadas com o auxílio do programa Phoretix 1D Advanced (Version
4.01, Phoretix
TM
International, Non Linear Dynamics Ltda). Primeiramente,
foi colocado um retículo sobre a imagem para detecção da localização
dos poços (Figura 5a) e em seguida desenhadas as canaletas por onde o
gel correu (Figura 5b). Automaticamente, o sistema detectou as canaletas
do gel e as nomeou (Figura 5c), facilitando a posterior análise das
bandas.
FIGURA 5-
Análise das imagens pelo programa Phoretix 1D Advanced: a) Colocação
de um retículo sobre a imagem dos poços; b) Detecção das canaletas no
gel por onde as amostras correram; c) Nomeção das canaletas do gel.
a
b
c
39
A imagem de cada canaleta foi analisada separadamente e
todas as bandas presentes foram detectadas pelo programa, sendo que
as curvas representam a intensidade de cada uma (Figura 6). Em cada
imagem foram detectadas as bandas do marcador superior, do marcador
inferior e as bandas de interesse, e desta maneira, o sistema calculou a
distância (em pixels) de cada banda em relação ao poço e posteriormente
confeccionou uma tabela com todos esses valores.
FIGURA 6-
Análise da imagem de uma das canaletas () pelo programa Phoretix 1D
Advanced, com a detecção das bandas dos marcadores (bandas 1 e 4) e
das bandas de interesse (2 e 3). Na barra inferior ( ) nota-se a posição
em pixels das bandas.
Os valores da tabela foram então copiados para o Microsoft
Excel (Microsoft, Windows) e automaticamente o tamanho do fragmento
de interesse foi transformado de pixels para pb, de acordo com a seguinte
fórmula (Figura 7):
*
*
1
4
2
3
40
FIGURA 7-
Fórmula utilizada para o cálculo do tamanho, em pares de base, do
fragmento de interesse encontrado em pixels. Onde U é o tamanho do
fragmento desconhecido em pb, d’107 é a distância entre as bandas com
107 pb e 169 pb e d’U é a distância entre a banda do fragmento
desconhecido e a banda do fragmento com 169 pb.
4.3.5 Seqüenciamento
Baseando-se nos resultados da medição do tamanho dos
fragmentos, pôde-se verificar três diferentes alelos e conseqüentemente,
três amostras foram escolhidas para detectar o número de repetições em
cada alelo. O seqüenciamento foi realizado pelo Genome Centre, na
Queen Mary’s School of Medicine and Dentistry, University of London. O
protocolo utilizado foi o Big Dye version 3.1 DNA sequencing.
4.4 Análise estatística
A análise estatística dos dados obtidos foi aplicada com o
objetivo de relacionar as características clínicas (presença ou ausência de
ulceração e tamanho da lesão) e histopatológicas (estágio de invasão,
padrão de invasão e grau de diferenciação celular) das lesões
neoplásicas com os alelos e os genótipos da MMP-9 encontrados neste
estudo. Para todos os testes estatísticos, o nível de significância adotado
foi de 5%.
Para avaliar a associação das variáveis clínicopatológicas com
os alelos e os genótipos encontrados, utilizou-se o teste qui-quadrado e,
para conhecermos a intensidade desta associação, obtivemos uma
41
estimativa da razão de prevalência (odds ratio-OR), servindo-se da
técnica de Regressão Logística.
A análise estatística foi realizada com o auxílio dos programas
computacionais MINITAB for Windows (2004, version 14.12, USA, Minitab
Inc.) e BIOSTAT 4.0 (2005, versão 4.0, Brasil, Manuel Aires Júnior).
5 RESULTADOS
Os resultados fenotípicos e genotípicos obtidos serão
apresentados de forma abrangente nos itens 5.1 e 5.2 e, posteriormente,
a associação entre eles será abordada no item 5.3.
5.1 Análise fenotípica
5.1.1 Análise clínica
Na 17ª semana após o início da aplicação do carcinógeno,
todos os animais apresentaram alguma alteração na pele da região
dorsal. Enquanto algumas lesões possuíram tamanho reduzido, sem
ulceração (Figura 8a), outras apresentaram grandes dimensões e eram
freqüentemente ulceradas (Figura 8b).
FIGURA 8-
Variação das características clínicas das lesões encontradas após a
carcinogênese química induzida pelo tratamento com DMBA na pele de
camundongos hairless: a) Lesão de pequeno tamanho, sem presença de
ulceração; b) Lesão com grandes dimensões e presença de ulceração.
a
b
a
b
43
As lesões foram classificadas de acordo com a ausência (grupo
1) ou a presença de ulceração (grupo 2). O tamanho da lesão foi
calculado pelo diâmetro máximo, que variou entre 0,2 e 1,7 cm,
apresentando média de 0,63 cm (±0,27). Os dados também foram
separados em: grupo 1, com lesão <0,6 cm e grupo 2 ≥0,6 cm.
A distribuição dos 94 animais de acordo com a presença de
ulceração e o tamanho da lesão pode ser observada na Figura 9.
0
20
40
60
80
100
.
grupo 1
11 58
grupo 2
83 36
ulceração tamanho
FIGURA 9-
Distribuição em freqüência absoluta (n) e relativa (%) dos 94 animais (N),
de acordo com a ulceração (ausência=grupo 1 e presença=grupo 2) e
com o diâmetro máximo da lesão (<0,6 cm = grupo 1 e ≥0,6 cm = grupo
2).
Por meio da distribuição das freqüências das lesões, pôde-se
verificar uma alta prevalência de ulceração nas lesões (88,3%). Em
relação ao tamanho, verificou-se um predomínio (61,7%) das lesões com
diâmetro máximo <0,6 cm.
61,7%
88,3%
11,7%
38,3%
%
94
94
N
n = n =
n = n =
44
5.1.2 Análise histopatológica
A análise das características histopatológicas da neoplasia
demonstrou que, após os animais receberem 16 aplicações semanais da
solução de DMBA, todos os animais desenvolveram CEC, sendo que a
maioria das lesões formadas (85,1%) invadiu o tecido conjuntivo (estágio
de invasão graus 2, 3 e 4), e formou grupos de células (71,3%) (padrões
de invasão graus 3 e 4) (Figura 10).
0
20
40
60
80
.
grau 1
14 21
grau 2
63 6
grau 3
9 34
grau 4
8 33
estágio de invasão padrão de invasão
FIGURA 10-
Distribuição em freqüência absoluta (n) e relativa (%) dos 94 animais (N),
de acordo com os critérios histopatológicos de padrão e estágio de
invasão.
A invasão da derme em 67% das lesões, caracterizou o grau 2
de invasão (Figura 11), enquanto a invasão da hipoderme classificou o
grau 3 (Figura 12) e a invasão da camada muscular o grau 4 (Figura 13).
Notou-se também que o padrão de invasão destas lesões foi
predominantemente em grupos de células com n>15 (grau 3) (Figura 11)
e grupos com n<15 ou mesmo células isoladas (Figuras 12 e 13).
22,3%
94
N
94
6,4%
36,2%
35,1%
14,9%
67%
9,6%
8,5%
%
n = n =
n = n =
n =
n =
n =
n =
45
FIGURA 11-
Lesão com estágio de invasão grau 2: invasão envolvendo apenas
derme e padrão de invasão grau 3, com invasão por grupos de células
com n>15 (). (HE; aumento original: 200x).
FIGURA 12-
Lesão com invasão da hipoderme (estágio de invasão grau 3) e padrão
de invasão grau 4, com invasão de pequenos grupos de células () e
células isoladas (). (HE; aumento original 200x).
46
FIGURA 13-
Lesão estágio grau 4, com invasão extensa e profunda, chegando até
fibras musculares () e padrão de invasão grau 4, com fronte de invasão
largo com células sem coesão. (HE; aumento original 200x).
Os dados referentes à diferenciação celular encontram-se na
Figura 14.
0
20
40
60
80
.
alta
75
moderada
19
baixa
0
diferenciação celular
FIGURA 14-
Distribuição em freqüência absoluta (n) e relativa (%) dos 94 animais (N),
de acordo com o grau de diferenciação celular.
N
94
79,8%
%
n =
n =
n =
20,2%
0%
47
Em relação à diferenciação celular, foi evidente o predomínio da
formação de neoplasias bem diferenciadas quando comparadas às
moderadamente diferenciadas. Em adição, não foi constatada nenhuma
lesão pouco diferenciada (Figura 14).
Nas lesões bem diferenciadas, notou-se a conservação da
estratificação epitelial, do grau de queratinização normal e das
características epitelias. Nas lesões moderadamente diferenciadas, estas
características eram pouco evidenciadas, além de existir a presença de
pleomorfismo e a perda de coesão celular (Figura 15).
FIGURA 15-
Lesões com diferentes graus de diferenciação celular: a) Lesão bem
diferenciada, mantendo a estratificação epitelial e pouco pleomorfismo;
b) Lesão moderadamente diferenciada, evidenciando perda de coesão
celular e desestruturação da estratificação epitelial. (HE; aumento
original 200x).
a
b
48
Foi também observada em alguns espécimes a invasão de
células neoplásicas em vasos sanguíneos, esta foi notada em uma das
lesões moderadamente diferenciadas, com grau 4 de padrão e estágio de
invasão (Figura 16).
FIGURA 16-
Lesão moderadamente diferenciada, com estágio e padrão de invasão
grau 4 (HE; aumento original 100x). Destaque para a presença das
células neoplásicas: a) No interior de um vaso sanguíneo; b) Entre os
feixes musculares. (aumento original 400x).
5.2 Análise genotípica
Após a eletroforese, pôde-se detectar não apenas que havia
amostras homozigotas e heterozigotas, mas também que o tamanho dos
alelos variava entre as amostras (Figura 17). Com o auxílio do programa
Phoretix 1D Advanced (Version 4.01, Non Linear Dynamics Ltd), foi
possível realizar a mensuração do tamanho dos fragmentos com 119, 131
e 135 pb.
a
b
49
FIGURA 17-
Detecção das bandas dos marcadores, superior e inferior, e das bandas
de interesse: a) Amostra homozigota, com dois alelos apresentando 119
pb; b) Amostra heterozigota, com fragmentos de 119 e 131 pb; c)
Homozigose para o alelo com 131 pb; d) Heterozigoto com alelos de 131
e 135 pb.
Posteriormente, foi então escolhida uma amostra de cada alelo
encontrado e estas foram seqüenciadas (
forward
e
reverse
) na região de
interesse, para a detecção do número de repetições. Verificou-se que os
fragmentos mensurados com 119pb, 131pb e 135pb apresentavam
respectivamente 18, 23 e 25 repetições (Figura 18).
FIGURA 18-
Seqüenciamento da região com o polimorfismo de repetição, no promotor
do gene da MMP-9: a) Presença de 18 repetições; b) Presença de 23
repetições; c) Presença de 25 repetições.
Marcador com 169pb
Marcador com 107pb
119pb
131pb
135pb
131pb
a b c d
a
b
c
50
Os genótipos encontrados foram homozigotos com 18 ou 23
repetições CA, além de heterozigotos compostos pelas seguintes
combinações entre os alelos: 18/23 e 23/25 repetições. Não foram
encontrados homozigotos com fragmentos apresentando 25 repetições,
tampouco heterozigotos 18/25 repetições.
Anteriormente à avaliação da associação dos alelos e dos
genótipos com as características clinicopatológicas, foi avaliada a
distribuição destes dados. Em relação aos alelos, pôde-se notar que os
animais apresentando 23 repetições CA foram maioria, enquanto os com
18 e 25 repetições apresentaram 16 e 17 casos, respectivamente (Figura
19a). Já a distribuição dos genótipos mostrou que o 23/23 foi o mais
prevalente, estando presente em 64 animais (68,09%). Em seguida, o
23/25, observado em 17 casos, o 18/23 em 10 casos e o 18/18 em
apenas 3 casos (3,19%) (Figura 19b).
alelo 23
alelo 25
alelo 18
genótipo 23/23
genótipo 23/25
genótipo 18/23
genótipo 18/18
FIGURA 19-
Distribuição relativa (%) dos 94 camundongos (N) em relação aos três
diferentes alelos (a) e aos quatro diferentes genótipos (b) encontrados
neste estudo da MMP-9.
N=94
82,45%
9,04%
8,51%
N=94
68,09%
18,09%
10,63%
3,19%
a
b
51
O polimorfismo no gene da MMP-9 apresentou equilíbrio de
Hardy-Weinberg (p=0,4713), significando que as freqüências genotípicas
esperadas foram similares às observadas.
5.3 Análises fenotípica x genotípica
Os dados da análise genotípica foram então comparados com
os encontrados na análise fenotípica. Buscou-se avaliar a associação das
características clínicas e histopatológicas tanto com os alelos quanto com
os genótipos encontrados.
Todas as hipóteses de associação foram testadas por meio do
teste qui-quadrado, com nível de significância de 5%. Posteriormente, o
risco relativo foi calculado pela razão de chance (OR) e seu intervalo de
confiança (IC) de 95%.
5.3.1 Associação dos alelos com as características clinicopatológicas
Os dados clínicos e histopatológicos referentes a cada alelo e
os valores de p encontrados após a aplicação do teste qui-quadrado
encontram-se na Tabela 1.
52
Tabela 1 - Distribuição dos aspectos clínicos e histopatológicos das lesões em relação aos alelos.
Resultado do teste qui-quadrado de associação (p valor)
Alelo
18
23
25
n
(%)
n
(%)
n
(%)
p
Ausente
0
(0)
21
(95,45)
1
(4,55)
0,2030
Lesão
ulcerada
Presente
16
(9,64)
134
(80,72)
16
(9,64)
≤0,6cm
9
(7,76)
95
(81,90)
12
(10,34)
0,6769
Diâmetro
máximo
>0,6cm
7
(9,72)
60
(83,34)
5
(6,94)
grau 1
2
(7,14)
25
(89,29)
1
(3,57)
grau 2
12
(9,52)
103
(81,75)
11
(8,73)
0,8063
grau 3
1
(5,55)
14
(77,78)
3
(16,67)
Estágio de
invasão
grau 4
1
(6,25)
13
(81,25)
2
(12,50)
grau 1
3
(7,14)
37
(88,10)
2
(4,76)
grau 2
4
(33,33)
7
(58,34)
1
(8,33)
grau 3
4
(5,88)
56
(82,36)
8
(11,76)
Padrão de
invasão
grau 4
5
(7,58)
55
(83,33)
6
(9,09)
0,0659
alta
15
(10,00)
125
(83,33)
10
(6,67)
moderada
1
(3,33)
30
(73,34)
7
(23,33)
Diferenciação
celular
baixa
0
(0)
0
(0)
0
(0)
0,0362*
* p<0,05
53
Por meio do teste qui-quadrado, pôde-se notar que houve
associação entre os alelos e o grau de diferenciação celular (p=0,0362).
Após o cálculo do OR, verificou-se que os animais que carregam o alelo
25 apresentam 10,50 mais chances de desenvolver um carcinoma
moderadamente diferenciado quando comparados com os animais com o
alelo de 18 repetições (OR= 10,50; IC=1,11-98,92; p=0,040) e 2,92 mais
chances quando comparados com os animais com o alelo de 23
repetições (OR= 2,92; IC=1,03-8,29; p=0,045).
Quando os alelos 18 e 23 foram agrupados para comparação
com o alelo 25, notou-se que os animais que carregam o alelo 25
apresentam 3,16 mais chances de desenvolver um carcinoma
moderadamente diferenciado (OR= 3,16; IC=1,12-8,96; p=0,030).
5.3.2 Associação dos genótipos com as características clinicopatológicas
Os mesmos testes estatísticos e os mesmos critérios adotados
para análise da associação dos alelos com as características
clinicopatológicas foram aplicados aos genótipos e encontram-se na
Tabela 2.
54
Tabela 2 - Distribuição dos aspectos clínicos e histopatológicos das lesões em relação aos
genótipos. Resultado do teste qui-quadrado de associação (p valor)
Genótipo
18/18
23/23
18/23
23/25
n
(%)
n
(%)
n
(%)
n
(%)
p
Ausente
0
(0)
10
(90,91)
0
(0)
1
(9,09)
0,3570
Lesão
ulcerada
Presente
3
(3,61)
54
(65,06)
10
(12,05)
16
(19,28)
≤0,6cm
2
(3,45)
39
(67,24)
5
(8,62)
12
(20,69)
0,7543
Diâmetro
máximo
>0,6cm
1
(2,78)
25
(69,44)
5
(13,89)
5
(13,89)
grau 1
0
(0)
11
(78,57)
2
(14,29)
1
(7,14)
grau 2
3
(4,76)
43
(68,26)
6
(9,52)
11
(17,46)
grau 3
0
(0)
5
(55,56)
1
(11,11)
3
(33,33)
Estágio de
invasão
grau 4
0
(0)
5
(62,50)
1
(12,50)
2
(25,00)
0,8730
grau 1
0
(0)
16
(76,19)
3
(14,29)
2
(9,52)
grau 2
1
(16,67)
2
(33,33)
2
(33,33)
1
(16,67)
grau 3
1
(2,94)
23
(67,65)
2
(5,88)
8
(23,53)
Padrão de
Invasão
grau 4
1
(3,03)
23
(69,70)
3
(9,09)
6
(18,18)
0,2930
alta
3
(4)
53
(70,67)
9
(12)
10
(13,33)
moderada
0
(0)
11
(57,90)
1
(5,26)
7
(36,84)
Diferenciação
celular
baixa
0
(0)
0
(0)
0
(0)
0
(0)
0,0936
55
Com base nos resultados do teste qui-quadrado, notou-se que
os genótipos não apresentaram associação com as características
clínicopatológicas estudadas.
Posteriormente, fez-se o agrupamento dos genótipos,
resultando em 4 análises com objetivos distintos. Na análise A, foi
comparado o genótipo mais prevalente na população (23/23) versus os
outros genótipos encontrados (18/18+18/23+23/25). Com a análise B,
buscou-se verificar diferenças entre os genótipos que são homozigotos
(18/18+23/23) em relação aos heterozigotos (18/23 e 23/25). Já a análise
C agrupou os genótipos 18/18+18/23 versus 23/23+23/25, com o objetivo
de verificar se a presença de pelo menos um alelo com 18 repetições
poderia influenciar os resultados clínicos e histopatológicos. E finalmente
a análise D foi utilizada para confrontar o genótipo 23/25 com os outros
genótipos agrupados (18/18+18/23+23/23), buscando avaliar se a
presença de pelo menos um alelo 25 poderia interferir nas características
clinicopatológicas do CEC.
Após o teste qui-quadrado, foi encontrada uma associação na
análise D, que confirmou a hipótese de que a presença de pelo menos um
alelo 25 pode interferir no grau de diferenciação celular (p=0,0058), porém
não nos outros resultados clínicopatológicos (ulceração, p=0,6833;
tamanho, p=0,5774; estágio de invasão, p=0,4204; padrão de invasão,
p=0,6308).
Após a avaliação da chance relativa, notou-se que o genótipo
23/25 apresenta quase quatro vezes mais chances de desenvolver um
carcinoma espinocelular moderadamente diferenciado quando comparado
aos genótipos que não apresentam o alelo 25 (OR= 3,79; IC=1,21-11,92;
p=0,023) nesta população estudada.
6 DISCUSSÃO
A indução de carcinoma espinocelular em pele de
camundongos hairless foi recentemente implementada em nosso
laboratório
9
. Analisando os resultados obtidos durante esse período
pudemos observar que animais submetidos aos mesmos procedimentos,
durante períodos experimentais idênticos, apresentaram características
clínicas e histológicas distintas. Os animais que desenvolveram lesões
classificadas como CEC, apresentaram variação com relação ao estágio
de invasão da neoplasia, segundo o sistema proposto por Anneroth et al.
2
,
apresentando diferentes graus de malignidade.
Tendo em vista o fato da utilização de um modelo de estudo
onde as interferências externas são minimizadas, acreditamos que a
presença de diferentes fenótipos possa ser justificada por alterações no
genótipo destes animais.
Dentre as alterações genéticas, escolhemos estudar os
polimorfismos, os quais têm sido investigados nos genes das MMPs,
principalmente em patologias caracterizadas pela degradação da matriz
extracelular
82,99
, nas quais inclui-se o câncer.
A investigação de alterações especificamente no promotor do
gene é relevante devido a importante ação desta região no controle da
transcrição
82
, principal etapa de regulação das MMPs
22
.
A enzima MMP-9 foi escolhida devido ao seu destacado papel
na degradação de colágeno tipo IV
45,90,93
e conseqüente importância no
rompimento da membrana basal, atuando, dessa forma, no processo de
invasão do câncer
18,42,88,103
.
Na região promotora desta enzima é relatada a presença de um
polimorfismo de repetição CA
23,24,26,66,71
, onde o aumento no número de
repetições deste dinucleotídeo, leva a um crescimento na atividade
57
enzimática da MMP-9
28,39,71,81
. Acredita-se que apesar deste polimorfismo
não justificar a doença, ao interferir a expressão de MMP-9, ele possa agir
no desenvolvimento da patologia
23
.
Em humanos já foram encontrados diversos alelos,
apresentando de 13 a 27 repetições CA, variando suas prevalências de
acordo com a população estudada
23,24,25,26,66,71
. Em camundongos, uma
pesquisa em cultura de células encontrou alelos apresentando 20 e 24
repetições
28
. Porém, visto que os autores investigaram apenas dois tipos
de cultura de células, houve uma limitação dos seus achados, com a
observação de apenas dois alelos distintos.
Em contrapartida, nosso estudo investigou 94 camundongos e
demonstrou pela primeira vez três diferentes alelos (18, 23 e 25
repetições CA). Acreditamos que, talvez, se tivéssemos pesquisado um
número maior de animais, poderíamos ter encontrado a presença de uma
variação mais ampla de alelos, como a encontrada em
humanos
23,24,25,26,66,71
.
Outra diferença entre os estudos é que o polimorfismo relatado
por Fornoni et al.
28
foi em células de camundongos B6SJL e ROP, já o
presente trabalho identifica pela primeira vez a presença desta variação
gênica em camundongos da linhagem HSR/J.
Tendo detectado a presença deste polimorfismo, buscamos
associá-lo às características clínicas e histopatológicas do carcinoma
espinocelular desenvolvido na pele de camundongos hairless após
indução por carcinogênese química.
A gradação histológica do CEC representa uma importante
avaliação, de forma antecipada, do comportamento biológico da
neoplasia
14
. Apesar de alguns patologistas basearem a classificação do
CEC na diferenciação celular, classificando-os em bem, moderadamente
e pouco diferenciados
14
, outros critérios semi-quantitativos podem ser
adicionados à classificação, buscando não apenas a avaliação das
58
características das células neoplásicas, mas também da resposta do
hospedeiro frente à invasão
2
.
Como a MMP-9 exerce papel chave na degradação da
membrana basal e o polimorfismo de repetição CA na região promotora
desta proteína pode estar ligado ao aumento da sua expressão
28,39,81
,
acreditamos, a princípio, numa possível relação entre o grau de invasão
tumoral e a presença do polimorfismo na região promotora do gene.
Entretanto, ao comparar os resultados genéticos e
histopatológicos encontramos uma interessante associação entre a
redução da diferenciação celular dos CECs desenvolvidos pela
carcinogênese química e o aumento de repetições CA.
Interessantemente verificamos que animais com pelo menos
um alelo apresentando 25 repetições CA (o maior alelo encontrado neste
estudo) apresentam 3,16 mais chances de desenvolver carcinomas
moderadamente diferenciados quando comparados aos animais com os
alelos de 18 + 23 repetições. Em adição, observamos ainda que essa
relação é valida não apenas na avaliação dos alelos, mas também na
comparação entre o genótipo 23/25 e os genótipos 18/18+18/23+23/23
(OR=3,79).
A relação entre o aumento da expressão da MMP-9 e a perda
da diferenciação histológica é relatada em câncer de endométrio
1,18
e
carcinoma esofágico
33
. Sugerimos que este fato possa, em parte, justificar
a relação existente entre os carcinomas menos diferenciados e a alta
tendência à malignidade, onde a alta expressão de MMP-9 pode
determinar às células neoplásicas uma maior chance de invasão e
conseqüente metástase
33
. Com base nos nossos achados, sugerimos que
o mesmo fato possa ocorrer em carcinoma espinocelular de pele, visto
que, devido ao maior número de repetições estar relacionado com a maior
expressão da enzima
28,39,81
, acreditamos que o alelo com 25 repetições
poderia ser responsável pela maior expressão de MMP-9 e conseqüente
alteração nas características histopatológicas do CEC.
59
Vão de encontro a nossa teoria dois estudos. O primeiro, no
qual uma cultura de carcinoma esofágico, formada por células pouco
diferenciadas, apresenta menor número de repetições e menor produção
de MMP-9
81
. E o segundo, no qual a deficiência de MMP-9 em
camundongos transgênicos está ligada à perda de diferenciação
13
.
Desta forma entendemos que talvez a avaliação
imunoistoquímica em nosso material, elucidaria se existe, nesse caso, a
relação entre os animais com o alelo de 25 repetições e a presença de
uma maior quantidade de enzima.
A mesma discussão acerca da expressão imunoistoquímica e a
característica de invasão neoplásica está presente na literatura. Em
culturas de células de adenocarcinoma de pulmão, Huang et al.
39
verificaram que a redução no número de repetições CA no gene da MMP-
9 interferiu na capacidade de invasão das células neoplásicas. Com o
mesmo objetivo, nosso estudo buscou verificar se há uma influência do
número de repetições nas características de invasão da neoplasia;
entretanto, diferentemente de Huang et al.
39
, não foi encontrada
associação entre o polimorfismo e a invasão do carcinoma espinocelular
de pele.
Baseando-se na expressão imunoistoquímica da MMP-9, outros
autores concordam com os achados de Huang et al.
39
, em relação à
associação entre o aumento da expressão desta gelatinase e a maior
capacidade de invasão em carcinoma oral
42
, gástrico
103
e de endométrio
18
.
Entretanto, discordando destes achados, a invasão dos carcinomas de
cabeça e pescoço
79
e esofágico
33,47
não foram associadas à
imunomarcação desta enzima.
Buscando justificar a ausência de associação entre a MMP-9 e
a profundidade de invasão da neoplasia, Gu et al.
33
, basearam-se no fato
de que o principal substrato da MMP-9 é o colágeno tipo IV e não o tipo I.
Durante o processo de invasão da neoplasia, o primeiro tipo de colágeno
a ser rompido é o colágeno tipo IV da membrana basal, necessitando de
60
um papel fundamental da gelatinase, porém, o que interfere na
profundidade da invasão é a capacidade de degradação do colágeno tipo
I, o maior componente do tecido conjuntivo
33
.
Desta maneira, sabendo-se que a MMP-1 é responsável pela
degradação de colágeno tipo I
4,45
, polimorfismos no gene desta enzima
também são alvos e podem estar relacionados com a capacidade de
invasão do câncer de pele
100
. Assim, também é sugerido um conjunto das
ações enzimáticas de várias metaloproteinases.
Por outro lado, no presente estudo, acreditamos que outros
fatores possam ter interferido para a não detecção da associação entre o
polimorfismo e a invasão do CEC de pele, como por exemplo, o período
experimental escolhido. Estabelecemos um período de 16 semanas de
aplicação do carcinógeno, com base no estudo de Carmo
9
. Esta autora
verificou que 12 semanas eram suficientes para a indução de 45,5% de
casos de carcinoma epidermóide, porém, apesar de detectados vários
estágios de invasão, poucos casos apresentaram grau 3 e nenhum grau
4. Desta maneira, decidimos realizar a aplicação do DMBA durante 16
semanas para poder comparar todos os graus de invasão.
Contudo, acreditamos que se tivéssemos mantido as 12
semanas de carcinogênese, poderíamos observar o momento crítico de
ação da MMP-9, que é o rompimento da membrana basal. Assim,
poderíamos ter comparado a relação entre a presença do polimorfismo no
gene da MMP-9 e a susceptibilidade ao desenvolvimento do CEC
invasivo, agindo precocemente na detecção da doença.
O papel da MMP-9 na degradação da membrana basal interfere
não apenas na invasão do tecido conjuntivo, mas também na invasão
vascular, o que conseqüentemente pode gerar metástase. Há uma
relação entre a expressão de MMP-9 e o aumento da invasão
vascular
18,33
. Além disso, esta gelatinase também pode estar relacionada
com a angiogênese
13,15
. A deficiência de MMP-9 nas células do
hospedeiro inibe a formação dos vasos
40
e este é outro fator que pode ser
61
avaliado nos espécimes de nosso estudo, buscando verificar se o
aumento do número de repetições também pode ser relacionado com a
neoformação vascular, fato ainda não relatado na literatura.
No estudo de Koyama et al.
47
, a invasão neoplásica não foi
relacionada à MMP-9. Porém, os autores verificaram que nem toda célula
positiva imunoistoquimicamente apresentou atividade gelatinolítica,
sugerindo que a presença de MMP detectada pode não estar diretamente
relacionada com a invasão.
Frente ao relatado, nota-se que a maioria dos estudos detecta
os níveis de MMP-9 por meio da técnica de imunoistoquímica e esta
avaliação tem grande capacidade de apresentar a localização da
gelatinase no tecido tumoral
42
. Visto que, da mesma forma que as outras
MMPs, a MMP-9 é secretada como zimógeno e permanece inativa até
que seja ativada
75
, esta análise pode às vezes resultar em falso positivo.
Em adição, a zimografia demonstra a ação proteolítica e assim fornece
medidas semi-quantitativas das MMPs no tumor, além de distinguir a
MMP de forma ativa da pró-enzima
42
. Desta maneira, a avaliação
concomitante da zimografia e da imunoistoquímica mostra-se importante
na detecção das MMPs e a utilização conjunta destas técnicas poderia
complementar os resultados encontrados no presente estudo.
Ainda avaliando nossos resultados, não verificamos nenhuma
relação das características clínicas (presença de ulceração e aumento do
tamanho da lesão) com o polimorfismo de repetição no gene da MMP-9.
A constatação da inexistência de associação entre o tamanho
da lesão e o polimorfismo da MMP-9 corrobora com os achados de
Ruokolainen et al.
79
e Li et al.
51
, os quais não verificaram aumento da
expressão imunoistoquímica de MMP-9 nas maiores lesões de seus
pacientes. Em contrapartida Przybylowska et al.
74
encontraram um maior
nível de MMP-9 no grupo de pacientes com câncer de mama que
apresentaram lesões com maior tamanho. Acreditamos que um dos
fatores que dificultam a comparação dos resultados quanto ao tamanho
62
da lesão, pode ser o parâmetro de cada estudo para a divisão entre os
grupos de maior e menor dimensão. Nossos grupos foram subdivididos de
acordo com o valor médio encontrado (0,6 cm), diferentemente de outros
estudos em que esta divisão foi em três grupos: <2 cm, de 2 a 5 cm e >5
cm
51
ou ainda de 0,2 a 1,5 cm, de 1,6 a 2,5 cm e de 2,6 a 7,7 cm
74
.
Em relação à metodologia empregada para a detecção dos
diferentes genótipos, apesar da técnica MADGE ser relatada como uma
genotipagem acurada para repetição de dinucleotídeos
77
, pela avaliação
dos nossos resultados pôde-se verificar uma divergência entre os
resultados encontrados pelo programa Phoretix e pelo seqüenciamento
genético. De acordo com o número de pares de base da região do gene
da MMP-9 estudada, os fragmentos com 18, 23 e 25 repetições deveriam
apresentar 117, 127 e 131 pb, porém, após análise dos valores
encontrados pelo programa Phoretix, os fragmentos do nosso estudo
apresentaram 119, 131 e 135 pb. Contudo, entendemos que esta
variação não interferiu na análise dos resultados, visto que o padrão da
corrida foi mantido em todo o gel e, o valor conservado entre as amostras
com mesmo alelo.
De qualquer forma, é importante ressaltar que existem várias
vantagens para a utilização do sistema MADGE. O gel utilizado
apresentou formato modificado
10,77
, permitindo a corrida das 94 amostras
simultaneamente. Desta maneira, minimizou-se a possível variação
individual dos géis quando utilizadas diversas corridas eletroforéticas. Em
adição, houve a redução do custo financeiro, visto que a análise do gel
possibilitou a detecção de três diferentes alelos, o que tornou possível o
seqüenciamento de apenas três amostras, ao invés de 94.
Visto que o protocolo básico utilizado para a detecção de
repetições de dinucleotídeos pelo sistema MADGE
77
foi seguido em nosso
estudo, acreditamos que a mensuração do tamanho dos fragmentos não
tenha sido exata neste trabalho, talvez devido à escolha dos marcadores.
Enquanto Rodrigues et al.
77
utilizaram marcadores que apresentavam
63
apenas 30 pb de diferença entre eles, nós utilizamos marcadores com 62
pb de intervalo (107 e 169 pb). Este aumento da região de interesse do
gel pode ter reduzido a eficácia da medição exata pelo programa Phoretix,
aumentando em 2 pb o tamanho do menor fragmento e em 4 pb os dois
alelos maiores.
Diferentemente de outros trabalhos que verificaram o papel
deste polimorfismo comparando indivíduos controles e doentes, os quais
sofreram diferentes estímulos ambientais, a nossa metodologia pôde
verificar o papel deste polimorfismo quando os animais apresentam as
mesmas condições para o desenvolvimento da doença, podendo assim
verificar seu papel com menor interferência de agentes externos.
Neste estudo, buscamos minimizar as interferências ambientais,
escolhendo um modelo animal para esta investigação. Optou-se pelo
modelo de carcinogênese em pele de camundongos, principalmente pela
sua eficácia no desenvolvimento da progressão tumoral
3,68,83,104
e pelo
fato dos resultados obtidos apresentarem grande significado para o
câncer epitelial humano
61
. Em adição, previamente ao início da pesquisa,
buscamos verificar se o estudo em camundongos é um modelo seguro
para o entendimento do efeito de polimorfismos genéticos em humanos.
Segundo Fiotti et al.
26
, as regiões promotoras do gene da MMP-9 em
humanos e camundongos são semelhantes, e desta maneira, esta
metodologia é confiável.
Devido ao fato de ainda não se saber exatamente como o
comprimento da região promotora pode interferir no desenvolvimento das
patologias
28
, estudos adicionais são indicados para avaliar a expressão
imunoistoquímica e zimográfica relacionada a cada genótipo.
Apesar de não termos avaliado a expressão imunoistoquímica
tampouco a zimografia da MMP-9, acreditamos que nossos resultados
sejam justificados pela diferença na expressão da MMP-9 na presença de
maiores repetições CA na região promotora, semelhantemente a Fornoni
et al.
28
, Huang et al.
39
, Peters et al.
71
e Shimajiri et al.
81
.
64
O presente estudo é o primeiro a avaliar a associação do
polimorfismo de repetição CA na região promotora do gene da MMP-9
com as características clínicas e histopatológicas do carcinoma de pele.
Além disso, mostra-se importante devido ao fato dos resultados indicarem
que o aumento no número de repetições CA pode contribuir para a
redução da diferenciação celular de carcinomas espinocelulares induzidos
pelo DMBA na pele de camundongos hairless.
7 CONCLUSÃO
Concluiu-se que a presença de polimorfismo do tipo
microssatélite (repetições CA) na região promotora do gene da MMP-9
não está associada às características clínicas (tamanho e ulceração), nem
às características histopatológicas de padrão e estágio de invasão.
Entretanto, o aumento no número de repetições CA pode contribuir para a
redução da diferenciação celular de carcinomas espinocelulares induzidos
pelo DMBA na pele de camundongos hairless.
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Anexo A - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade
de Odontologia de São José dos Campos – UNESP
83
Pereira AC. Analysis of the association between the metalloproteinase-9
gene polymorphism and the development of squamous cell carcinoma
chemically induced by DMBA in hairless mice skin [thesis]. São José dos
Campos: School of Dentistry of São José dos Campos. UNESP – São
Paulo State University; 2007.
ABSTRACT
The metalloproteinase-9 (MMP-9) is an important enzyme during the basement
membrane degradation, an essential step for cancer invasion. The aim of this study was
to test the hypothesis that the CA repeat polymorphism in the MMP-9 gene promoter
interferes on clinical and histopathological features of the squamous cell carcinoma.
Ninety-four hairless mice were submitted to chemically induced skin carcinogenesis
(DMBA 0,5%), once a week, during 16 weeks. At 17
th
week, the animals were
photographed and the lesions were clinically evaluated (for size and ulceration presence).
Then, the lesions were biopsed and, after the routine laboratorial processing, the
histopathological evaluation (stage of invasion, pattern of invasion and differentiation
grade) was performed. At the biopsy, 0.5cm of each animal tail was collected for DNA
extraction and evaluation of the CA repeat polymorphism in the MMP-9 gene promoter.
The data was analyzed by chi-square test to evaluate whether the MMP-9 alleles or
genotypes were associated with clinical and histopathological features. There was an
association of the allele with 25 CA repeats with moderately differentiated lesions. The
data suggest that the MMP-9 gene polymorphism is related to the reduction on
histological differentiation in squamous cell carcinoma induced by DMBA in hairless mice
skin.
KEYWORDS: squamous cell carcinoma, polymorphism, matrix metalloproteinase 9
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