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CRISTIANA LIBARDI MIRANDA
EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES EM CÉLULAS FOLICULARES DE
SUÍNOS
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa, como
parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Genética e
Melhoramento, para obtenção do título
de Magister Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
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“O Temor do Senhor é o
princípio da ciência...”
(Pv. 1:7)
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu bom Deus, por seu amor incondicional, pelas grandiosas
bênçãos, por sempre estar atento a voz do meu clamor e por mais esta vitória
que Ele me proporcionou, pois neste momento, só Ele é digno de toda honra e
toda glória. Senhor tu és Maravilhoso!
“Eu te louvarei, porque de um modo terrível e tão maravilhoso fui
formado; maravilhosas são as tuas obras, e a minha alma o sabe
muito bem” (Sl. 139: 14).
À minha amada mãe, Ana, por seu exemplo de mulher batalhadora, de mãe
dedicada, por fazer tudo pela minha felicidade, pelo seu grande amor e por
sempre estar pertinho de mim. Mãe, te Amo!
Ao meu pai, Wilson, por seu amor, por todo apoio, por todo esforço na minha
realização profissional e por sempre confiar em mim. Amo você, pai!
À Universidade Federal de Viçosa pela oportunidade de realização do curso.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.
A minha orientadora, Simone Eliza Facione Guimarães, pelo apoio, pelo
incentivo, pela paciência e pelo rico convívio.
Aos meus conselheiros, Marta Martins Fonseca Guimarães e Paulo Sávio
Lopes, pelas grandiosas contribuições práticas e teóricas essenciais para este
mestrado.
4
Ao professor José Domingos Guimarães, pela grandiosa ajuda referente ao
tema reprodução.
À pesquisadora Lílian Tamy Iguma, pelas valiosas sugestões.
Ao professor Aldrin Vieira Pires, pela amizade e pela confiança em mim
depositada. Obrigada por tudo, Aldrin!
A todos os colegas do LABTEC (Laboratório de Biotecnologia Animal), em
especial à Priscila, Débora, Isabela, Kleibe e Nicola, pela amizade, pela rica
convivência e por sempre me ajudarem em tudo.
Ao técnico do laboratório, Mário, pela amizade e pela ENORME paciência.
Aos funcionários da Granja de Melhoramento de Suínos da UFV, em especial
ao Zé Geraldo e a quase funcionária, Renata, pela amizade por sempre
estarem dispostos a me ajudar.
Ao meu querido amigo Gilvan, pelas orações, por toda dedicação e disposição,
por sempre estar ao meu lado e por tudo que eu aprendi com esta convivência.
Você foi essencial para que este momento se concretizasse e, através do seu
exemplo, tive vontade de crescer e de buscar valiosas experiências. Adoro
você!
Às minhas mais que amigas, irmãs, Letícia, Liliane, Jaqueline e Alessandra,
pela amizade que me proporcionou muito aprendizado e pelas valiosas
orações. Sem vocês teria sido muito mais difícil. Aqui, amo vocês!
Aos meus amigos e irmãos, Samuel, Téssio, Lucas, Daniel e Winder, pela
amizade, por todo apoio e dedicação e pelas orações preciosíssimas. Sem
vocês eu não teria conseguido!
A todos os colegas conquistados durante o mestrado e a todos os professores
que indiretamente contribuíram para essa realização.
Ao Pr. Augusto Kohls Filho, meu pai de coração, pelas orações, por todo apoio,
confiança e carinho por mim demonstrado.
A todos os irmãos da Igreja Cristã Maratana de Viçosa e de Maracanã III, pela
amizade e pelas orações, pois sem elas eu não teria chegado até aqui.
A todos, que de alguma forma contribuíram para o sucesso deste trabalho, o
meu MUITO OBRIGADA!!
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BIOGRAFIA
Cristiana Libardi Miranda, filha de Wilson Ignácio Miranda e Ana Maria
Libardi, natural de Cariacica, Estado do Espírito Santo, Brasil, nasceu em 28 de
novembro de 1980.
Em fevereiro de 2000, ingressou no curso de Ciências Biológicas, pela
Faculdade de Saúde e Meio Ambiente - FAESA, em Vitória, Espírito Santo.
Em julho de 2004, graduou-se em Ciências Biológicas, pela Faculdade
de Saúde e Meio Ambiente.
Em agosto de 2005, iniciou o Mestrado pelo Programa de Pós-
Graduação em Genética e Melhoramento na Universidade Federal de Viçosa.
Em 13 de julho de 2007, submeteu-se ao exame final de defesa de
tese para obtenção do título Magister Scientiae em Genética e Melhoramento.
6
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................... vii
ABSTRACT..................................................................................................
ix
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................... 4
2.1. Características reprodutivas............................................................. 4
2.2. Fisiologia ovariana e as células foliculares...................................... 6
2.3. Ovulação e gestação........................................................................
8
2.4. QTLs e genes identificados para características reprodutivas em
suínos...............................................................................................
9
2.5. PRC quantitativo em tempo real.......................................................
13
2.6. Genes selecionados para análise................................................... 15
3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 18
3.1. Coleta de Material............................................................................ 18
3.2. Dados fenotípicos............................................................................ 19
3.3. Quantificação das células.................................................................
21
3.4. Extração do RNA total...................................................................... 22
3.5. Síntese do cDNA.............................................................................. 23
3.6. Confecção dos Sistemas de PCR em Tempo Real..........................
23
3.7. Análise de RT-PCR em Tempo Real................................................
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................
27
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS.....................................................................
37
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 38
7
RESUMO
MIRANDA, Cristiana Libardi; M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, julho de
2007. Expressão diferencial de genes em células foliculares de suínos.
Orientadora: Simone Eliza Facioni Guimarães. Co-orientadores: Marta
Martins Fonseca Guimarães e Paulo Sávio Lopes.
Dentre as características produtivas, o número de leitões é fundamental
para o sucesso na produção de suínos. A taxa de ovulação é um dos principais
fatores que determinam o tamanho da leitegada. Deste modo, o estudo da
expressão gênica nos folículos ovarianos, mais precisamente nas células
foliculares, pode causar grande avanço no entendimento desta característica.
Portanto o presente trabalho foi realizado com o objetivo de identificar a
expressão diferencial dos genes STAR (Proteína esteroidogênica regulatória
aguda), GATA (Proteína de ligação GATA-4), PGF
2α
(Prostaglandina F
2α
), P4R
(Receptor de progesterona 4), FSHR (Receptor do hormônio folículo
estimulante) e CYP19 (Citocromo aromatase P450) em células foliculares,
coletadas durante a fase folicular do ciclo estral de três fêmeas suínas de alta e
três de baixa prolificidade, provenientes de um tricross das raças Landrace,
Large White e Pietrain, por meio da metodologia de PCR quantitativo em tempo
real (qPCR). Nas fêmeas com alta prolificidade, utilizadas neste estudo, a
8
média do número de leitões por leitegada foi 8,51 enquanto para as fêmeas
com baixa prolificidade foi de 12,03. Para examinar se algum dos genes
relacionados acima afetava as taxas de prolicifidade nos animais deste estudo,
o RNA total do líquido folicular foi extraído e, em seguida, fez-se dois pools
com o RNA total, sendo um do grupo de fêmeas com alta prolificidade e o outro
do grupo com baixa prolificidade. O RNA total de cada um dos pools foi usado
na confecção da primeira fita de cDNA. As reações de qPCR foram realizadas
usando-se o gene β-Actina como controle endógeno. Os primers foram gerados
a partir de seqüências obtidas nos bancos de ESTs de suínos. A maior
diferença de expressão foi observada para o gene P4R, que foi expresso 7,73
vezes a mais nos animais com baixa prolificidade. O gene PGF
2α
apresentou
expressão diferencial de 2,84 vezes a mais nas fêmeas hipoprolíficas. A
expressão do gene STAR, que codifica para uma proteína reguladora da
síntese de hormônios esteróides, foi 2,32 vezes maior nos animais com baixa
prolificidade. A expressão do gene GATA foi 2,31 vezes maior nas fêmeas
hipoprolíficas. Esse gene codifica para a proteína de ligação GATA-4,
pertencente a um grupo de fatores de transcrição responsáveis pela expressão
de vários genes e a diferenciação de diversos tipos celulares. A expressão do
CYP19 leva à produção de uma enzima chave na biossíntese de estrogênio, a
Citocromo aromatase P450 (P450
aro
), sendo que, para este gene, foi observada
uma expressão relativa de 2,30 vezes a mais nas fêmeas de baixa
prolificidade. O gene FSHR não atingiu o limiar de diferença de expressão,
estabelecido neste estudo (1,5 vezes). A expressão dos genes STAR, GATA,
PGF2α, FSHR, P4R e CYP19 nas células foliculares possibilitou a identificação
de diferenças de expressão entre as fêmeas com alta e baixa prolificidade,
sendo que a maior diferença de expressão para os genes estudados foi
verificada nos animais de baixa prolificidade, exceto para o gene FSHR, que
não foi considerado diferencialmente expresso nesse trabalho. Com vistas ao
melhor entendimento dos fenótipos reprodutivos em suínos, é necessário que
estudos sejam conduzifos no sentido de examinar a expressão desses e de
outros genes relacionados, durante todo do ciclo reprodutivo das fêmeas, pois,
a expressão de um gene depende, dentre outros fatores, do estádio do
desenvolvimento do tecido e da idade do animal.
9
ABSTRACT
MIRANDA, Cristiana Libardi; M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, july, 2007.
Gene expression diferentialy in follicular cells in swine. Adviser: Simone
Eliza Facioni Guimarães. Co-adviseres: Marta Martins Fonseca Guimarães
and Paulo Sávio Lopes.
Among the productive traits, the number of the piglets is essential for success in
swine production. The ovulation rate is one of the key factors that determine the
litter size in pigs and the study of gene expression in the ovary follicles, more
precisely in the follicular cells, might cause a big advance in the comprehension
of this characteristic. Thus, the objective in this work was to identify the
differential expression of the STAR (Steroidogenic Acute Regulator-STAR),
GATA (GATA binding protein 4), PGF
2α
(Prostaglandin F
2α
), P4R (Progesterone
Receptor), FSHR (Follicle Stimulating Hormone Receptor) and CYP19
(Cytochrome Aromatase P450) genes in follicular cells, colleted during the
follicular phase in the estrous cycle of three sows with high and three sows with
low litter size which comes from a tricross of the Landrace, Large White and
Pietrain breeds, throughout the semi quantitative real time PCR (qPCR). In the
10
hyperprolific sows, analyzed in this study, the average of the number of the
piglets were 8,51 and for the hypoprolific sows the average was 12,03. For
examination if any one related genes above were affecting the ovulation rate in
the prolificity rate in the animals studied, the total RNA of the follicular liquid was
extracted and than was made two pools with the total RNA of the hypo and
hyperprolific sows groups. The total RNA of each pool was used for the first
strand cDNA synthesis. The PCR reactions were accomplished using as an
endogenous control the β-Actina gene. The primers were generated by
sequences in the Pig ESTs data base. The major expression difference was
observed for P4R gene, who express 7,73 turns mostly in the animals with low
prolificity. The PGF
2α
gene displayed differential expression of 2,84 times as a
large in the hypoprolific animals. The STAR gene expression, that codes for the
protein regulating hormone steroids synthesis, was 2.32 turns mostly in the
animals with low prolificity sows. The GATA gene expression was 2.31 times as
a large in the hypoprolific sows. This gene codes for the GATA binding protein 4
belonging a transcription group factors that are responsible for too many gene
expression and diverse cell differentiation types. The CYP19 gene expression
taken the enzyme production that is the key factor in the estrogens
biosynthesis, the Cytochrome Aromatase P450 (P450
aro
), for this gene was
observed the relative expression of the 2.30 turns mostly in the sows with low
prolificity. The FSHR gene expression hasn’t achieved the threshold difference
established in this study (1.5 times).The STAR, GATA, PGF2α, FSHR, P4R and
CYP19 gene expression in the follicular cells has enabled identify difference of
expression between sows with low and high prolificity, where the largest
difference of expression in relation to the studied genes was verify in the
hypoprolific sows, except for the FSHR gene that wasn’t considerate
differentially express in this work. With views the best agreement about the
reproductive phenotypes in swine, it’s necessary yet, studies to examine the
expression in these and other genes related to female reproductive cycle, in as
much as gene expression is dependent, in the midst of another factors, the
stage of development of the tissue and the animal age.
11
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, a suinocultura vem crescendo significativamente em volume
de produção e obtendo melhores índices produtivos, devido aos progressos
genéticos alcançados quanto ao conhecimento do genoma suíno, ocorrido
principalmente no final dos anos noventa e início da década atual. Esta
atividade representa um importante setor entre as atividades pecuárias, em que
o Brasil ocupa posição de destaque, encontrando-se entre os cinco maiores
produtores do mundo (Abipecs, 2007).
De acordo com dados da FAO/Abipecs (Abipecs, 2007), em 2006, a
produção mundial de carne suína atingiu 104.990 toneladas e o consumo per
capita foi de 15,9 kg/hab/ano. Esses resultados colocam a carne suína em
posição de destaque, sendo a mais consumida no mundo. Em detrimento de
um mercado em expansão, esta atividade vem se tornando cada vez mais
eficiente e, assim, várias metodologias vêm sendo empregadas no sentido de
aumentar a produtividade, proporcionando maiores retornos para os criadores
e indústrias,além de maior satisfação do consumidor com o produto final.
Para aumentar os índices produtivos da suinocultura, torna-se
necessária a produção de machos e fêmeas com alto potencial genético no
plantel, o que tem sido facilitado pelos avanços nas diferentes áreas de
produção animal. Aliado a esses fatores, nos últimos anos, observa-se um
12
significativo progresso em pesquisas na área do melhoramento tradicional e da
genômica dos suínos, pois, além de possuir um grande interesse econômico,
esta espécie é considerada um modelo para se trabalhar nesta, em razão do
grande número de leitões por leitegada, curto período gestacional e reduzido
intervalo de gerações.
Na suinocultura, a partir do melhoramento genético dos rebanhos, tem
sido possível obter animais com alto potencial produtivo, visto que o progresso
genético alcançado em programas de melhoramento são permanentes e
cumulativos, sendo transferidos de uma geração para outra. Assim, um
incremento na característica, mesmo mínimo, é representativo e proporciona
grande retorno econômico aos produtores.
Os programas de melhoramento genético de suínos visam melhorias
nas características relacionadas à produção e à resistência a doenças. Dentre
as características produtivas, a performance reprodutiva, em especial o número
de leitões por leitegada, é fundamental para o sucesso na produção de suínos
(Pires et al., 2000). No entanto, em suínos, características de reprodução
possuem baixas estimativas de herdabilidade e, devido a este fato, tem sido
observada pouca inclusão de tais características nos programas de
melhoramento.
Mesmo com um baixo ganho por seleção, proporcionando pouco
progresso genético, ainda é compensador incluir características reprodutivas,
como o tamanho da leitegada, no processo de seleção, pois, o número de
leitões reflete-se diretamente no número de animais abatidos no processo final
de produção. Assim, pesquisas com a finalidade de determinar a base genética
deste fenótipo vêm sendo intensificadas, possibilitando elucidar o controle
genético de características quantitativas economicamente importântes.
À medida que identificam genes ou QTL (do inglês, Quantitative Trait
Loci) para tamanho de leitegada, as tecnologias moleculares são ferramentas
fundamentais para o melhoramento genético das características reprodutivas,
quando associadas aos métodos clássicos de seleção, proporcionando maiores
ganhos genéticos.
A expressão de um gene em um tecido pode variar, consideravelmente,
dependendo do estádio de desenvolvimento de cada tecido. Isto pode ser
observado na dinâmica dos ovários, que podem sofrer sérias mudanças em um
13
período curto da vida do animal, sendo um complexo processo dependente de
uma cascata de eventos, que culminam na desintegração do folículo ovariano
para liberação do oócito fértil (Caetano et al., 2003).
Como a taxa de ovulação é um dos principais fatores que determinam o
tamanho da leitegada em suínos e considerando que esta característica tem
grande valor econômico, o estudo da expressão gênica nos folículos ovarianos,
mais precisamente nas células que o recobrem, pode causar grande impacto
na indústria suinícola. Devido a importância desta característica no sucesso
reprodutivo dos suínos, no presente trabalho objetivou-se identificar genes de
expressão diferencial em células foliculares de fêmeas suínas com alta e baixa
prolificidade, por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real.
14
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Características reprodutivas
Os suínos são animais altamente prolíficos, apresentando uma
produtividade superior a 20 leitões/matriz/ano (Jhonson et al., 1999; Pereira,
2001). Nas últimas décadas, têm sido observados incrementos reprodutivos e,
segundo Irgang (1998), o número de leitões nascidos por leitegada passou de
7 a 8 para 10 a 12. Esse aumento no número de leitões leva a um menor custo
de produção por leitão desmamado e maior retorno econômico.
A eficiência reprodutiva dos suínos, baseada no número de leitões
desmamados por porca/ano, depende da redução da idade das leitoas a
primeira concepção ou ao primeiro parto (precocidade sexual), do intervalo de
partos, da duração do período de aleitamento e do intervalo de desmame-
descarte das porcas, bem como do aumento da taxa de concepção, do
tamanho da leitegada ao nascer e da porcentagem de sobrevivência dos
leitões (Irgang, 1985).
Em suínos, as características reprodutivas, são consideradas como
inerentes às fêmeas, sendo limitadas pelo sexo, sendo que sua importância
está relacionada ao aumento da eficiência do sistema, pois, quanto melhor o
15
desempenho reprodutivo do rebanho, menor será o custo de manutenção por
matriz (Torres-Filho et al., 2005). A performance reprodutiva, em especial o
tamanho da leitegada, é essencial para o sucesso da criação de suínos (Pires
et al., 2000; Pereira, 2001). No entanto, as características reprodutivas ainda
são pouco incluídas nos programas de melhoramento, devido à sua baixa
herdabilidade e à sua expressão ser limitada a animais adultos (Lopes et al.,
1998).
As estimativas de herdabilidade das características reprodutivas nos
animais são, normalmente, baixas e a variabilidade existente em tais
características é atribuída, principalmente, a fatores não genéticos e efeitos
genéticos não aditivos (Torres-Filho et al., 2005). As estimativas de
herdabilidade para o número de leitões por leitegada encontram-se em torno de
0,10 (Pereira, 2001; Chen et al., 2003). Pires et al. (2000), utilizando dados
provenientes de animais das raças Duroc, Landrace e Large White, registraram
estimativas em torno de 0,16 a 0,22. Torres-Filho et al. (2005) encontraram,
para uma linhagem em desenvolvimento da raça Large White, estimativas de
herdabilidade para número total de leitões nascidos e nascidos vivos de 0,22 e
0,19, respectivamente.
Apesar da importância econômica desta característica, pouco ou
nenhum progresso genético é observado por intermédio da seleção, devido,
principalmente, ao efeito genético aditivo dos genes, implicando grande
dificuldade na utilização dessas características nos programas de
melhoramento genético (Pires, 1999; Chen et al., 2003). Para aumentar o
progresso genético por geração, Cristenson (1993) propõe a subdivisão da
característica de tamanho de leitegada em taxa de ovulação, espaço uterino,
taxa de fertilização e sobrevivência embrionária, a fim de para melhorar os
ganhos genéticos nos processos de seleção.
Quanto ao tamanho da leitegada, dois fatores intimamente ligados são a
taxa de ovulação e a sobrevivência ou a mortalidade embrionária. A taxa de
ovulação refere-se ao número de oócitos liberados no período do estro, sendo
o mais importante componente da prolificidade (Pereira, 2001; Caetano et al.,
2003). De acordo com Pereira (2001), uma elevada taxa de ovulação, cuja
estimativa é de herdabilidade de 0,40, implica alta mortalidade embrionária,
16
com herdabilidade estimada em 0,15, mostrando uma forte correlação genética
negativa entre taxa de ovulação e sobrevivência pré-natal.
A complexidade em prover progresso genético com a seleção direta ou
indireta para tamanho da leitegada é grande, sendo que uma alternativa
consiste em explorar a variabilidade genética existente entre as raças. Assim,
os cruzamentos constituem um mecanismo eficaz para a melhoria na
performance reprodutiva das porcas, levando-se em consideração a heterose
obtida, geralmente, beneficia as características de baixa herdabilidade (Pereira,
2001).
2.2. Fisiologia ovariana e as células foliculares
A principal função do ovário é o desenvolvimento dos oócitos. A
oogênese inicia-se durante a vida fetal, sendo altamente influenciada,
posteriormente, durante o período reprodutivo, pelo desenvolvimento folicular.
No início da puberdade, 10 a 25 folículos desenvolvem-se para o processo
ovulatório e liberam oócitos em cada período estral. O número total de
ovulações é denominado como taxa de ovulação, sendo um importante
parâmetro na eficiência reprodutiva de suínos (Cárdenas & Pope, 2002).
Os folículos ovarianos são revestidos, internamente, por uma lâmina
basal sem suprimento sanguíneo (camada da teca) e uma camada de células
cubóides, que constituem as células da granulosa (Hafez & Hafez, 2004). O
crescimento, a maturação, a ovulação e a luteinização dos folículos de graaf
dependem de uma série de hormônios, produzidos pelo hipotálamo, pela
pituitária anterior e pelo ovário (Caetano et al., 2003; Hafez & Hafez, 2004).
Os eventos, que ocorrem durante o ciclo estral, são controlados
principalmente pela interação dos hormônios gonadotróficos, FSH (hormônio
folículo estimulante) e LH (hormônio luteinizante), bem como pelos esteróides
estrogênio e progesterona. O FSH e o LH são secretados pela hipófise anterior,
sendo esta controlada pelo hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e
pelos esteroides gonadais (Hafez & Hafez, 2004).
Os esteróides são produzidos pelas gônadas e possuem importante
papel no crescimento e diferenciação dos tecidos reprodutivos e na
17
manuntenção da fertilidade (Drummond, 2006). Os principais hormônios
esteróides são o estrogênio e a progesterona, que são produzidos pelos
folículos ovarianos e pelo corpo lúteo, respectivamente (Hafez & Hafez, 2004).
Estes hormônios não interagem com receptores da membrana plasmática, mas
com receptores intracelulares que são trans-ativadores transcricionais. O
complexo hormônio-receptor atua, ligando-se às seqüências de DNA altamente
específicas, denominadas elementos de resposta hormonal (HREs, do inglês
Hormone Response Elements) e alteram a expressão gênica, aumentando ou
suprimindo a expressão de genes adjacentes (Nelson & Cox, 2002).
O estrogênio possui importantes funções no ciclo reprodutivo, sendo
responsável pela manifestação do cio, além de atuar no útero, aumentando a
amplitude e freqüência de contrações, potencializando os efeitos da ocitocina e
da PGF
2α
. Em porcas, eles auxiliam na manutenção dos corpos lúteos, que em
suínos são essenciais à manutenção da prenhez até o parto (Hafez & Hafez,
2004).
Segundo Vanderhyden et al. (1992), a proliferação das células da
granulosa é estimulada por estrógenos e pelo hormônio folículo estimulante
(FSH), os quais atuam sinergicamente na promoção deste evento. Estas
células são ricas em receptores do hormônio FSH e, consequentemente vários
genes nelas presentes são regulados pela ação deste hormônio. Portanto, elas
têm um papel fundamental na entrada na fase estral e, assim, apresentam um
uso potencial na identificação de expressão diferencial de genes relacionados à
prolificidade (Bonnet et al., 2006; Vanderhyden et al., 1992).
No final da maturação folicular, as células da teca e da granulosa
sintetizam e secretam significativas quantidades de esteróides, hormônios
peptídeos e prostaglandinas (PGF2α) dentre outras substâncias. Esses
hormônios são importantes, pois, participam ativamente do desenvolvimento
folicular, sendo que muitos levam sinais que coordenam as funções dos eixos
hipotalâmico - hipofisário - ovariano (Cárdenas & Pope, 2002).
Nos mamíferos, menos de 1% dos folículos ovarianos desenvolve-se até
a fase de ovulação, a grande marioria entra em atresia em vários estádios do
desenvolvimento folicular (Tilly, 1996). Este processo é importante para manter
o ciclo reprodutivo normalizado e depende do balanço entre os folículos que se
desenvolvem e aqueles que entram em atresia. Este estado folicular é causado
18
pela apoptose das células da granulosa, sendo que um elevado número de
folículos nesse estádio pode resultar em perda de fertilidade (Johnson, 2003).
2.3. Ovulação e gestação
A ovulação ocorre como resultado de uma série de eventos fisiológicos,
bioquímicos e biofísicos (Hafez & Hafez, 2004). Na porca, o estro inicia-se
entre o 5º a 6º dia após o fim da fase lútea. Como a fase folicular se inicia antes
da fase luteínica, a ovulação ocorre cedo no ciclo estral. Assim, se o óvulo não
for fecundado, o corpo lúteo regride e ocorre um novo recrutamento de folículos
ovarianos, que iniciam um novo período de pró-estro. A liberação da PGF
2α
inicia a regressão do corpo lúteo, em espécies de animais domésticos. Em
suínos, o corpo lúteo é diferente daqueles de outras espécies de animais
domésticos, pois, não sofre regressão em resposta a pequenas doses de
PGF
2α
até depois do 12º dia do ciclo estral (Marques et al., 2004).
A ovulação ocorre durante o estro, sendo que a maioria dos oócitos são
liberados entre 35 a 45 horas após o início do cio. A taxa de ovulação consiste
no número de oócitos liberados durante o ciclo estral e varia,
consideravelmente, sendo que cerca de 10 a 20 oócitos são liberados. Os
fatores que interferem neste número são o parto, a idade, o nível nutricional, a
estação do ano e a raça. A porca mais jovem tem baixa taxa de ovulação, em
comparação com aquelas mais maduras, pois, o número de oócitos liberados
aumenta a cada ciclo estral, com um aumento médio de dois oócitos a cada
ciclo estral. A consangüinidade reduz a taxa de ovulação, enquanto os
cruzamentos aumentam o número de ovulações. Em linhagens consangüíneas,
observa-se observar um aumento médio de 1,1 oócito do primeiro para o
terceiro cio, mas a partir do quarto cio é observado pouco ou nenhum aumento
(Hafez & Hafez, 2004).
A elevação da taxa de ovulação tem um alto potencial no aumento da
eficiência reprodutiva dos suínos. Resultados experimentais mostram que o
hormônio FSH e muitos outros fatores ovarianos, como os receptores
hormonais, fatores de crescimento, hormônios esteróides e atividade
19
enzimática, controlam o desenvolvimento folicular, a taxa de ovulação e,
conseqüentemente, o número de fetos (Cárdenas & Pope, 2002).
O período gestacional dos suínos (111 a 117 dias) é relativamente
constante, com média de 114 dias. As variações no tamanho da leitegada,
número de fetos que regridem até parto, idade da fêmea ou as condições
ambientais têm pouca influência no período gestacional. O principal fator
atuante durante este período são as diferenças genéticas; no entanto, essas
diferenças ocorrem no intervalo de 3 dias, dependendo da raça (Hafez & Hafez,
2004).
2.4. QTL e genes candidatos para características reprodutivas em suínos
Com a criação do projeto de mapeamento genético europeu PiGMap, a
partir dos anos 1990, vários esforços foram iniciados no sentido de conhecer o
genoma dos suínos. Desde então, novos marcadores vêm sendo identificados
e mapeados, sendo que algumas integrações dos mapas continuam sendo
realizadas com a finalidade de elucidar do controle genético das características
complexas (NAGPR, 2007).
De acordo com o Brief Summary of the Pig Genome Coordination
Program for 2005 (NAGPR, 2007), novas publicações sobre mapeamento
genético em larga escala têm sido disponibilizadas, sendo que, até o momento,
nos bancos de dados de suínos existem cerca de 1.588 genes e 2.493
marcadores. O mapeamento físico do genoma suíno vem crescendo
rapidamente e, até momento, há 6.000 seqüências mapeadas (incluindo genes
e marcadores anônimos), graças aos painéis de células híbridas e de células
irradiadas.
O primeiro passo na identificação de genes e de polimorfismos causais
para características de importância na agricultura e na medicina é a
identificação de QTL (do inglês, Quantitative Trait Loci) afetando tais
características (Seaton et al., 2002). Estudos de QTL em suínos têm alcançado
grande avanço na identificação de mutações, que afetam características de
importância na suinocultura. De acordo com o PigQTLdb, há 1.675 QTL
identificados até o momento, obtidos de 110 publicações, representando 246
20
características (http://www.animalgenome.org/QTLdb/pig.html, acessado em
12/04/07). No entanto, poucos desses QTL têm sido estudados para
identificação de mutações causais. Segundo Rothschild et al. (2007), há 67
QTL identificados para características reprodutivas em suínos, dentre os quais,
27 estão relacionados, especificamente, ao tamanho da leitegada.
De acordo com Hu et al. (2005), no PigQTLdb, foram reportados dois
QTL para taxa de ovulação, localizados no cromossomo 15 (SSC 15) por
diferentes grupos de pesquisa. O primeiro QTL foi identificado por Rathje et al.
(1997), por meio de varredura genômica. Os autores identificaram quatro
regiões de possíveis QTL para taxa de ovulação. Além do SSC 15, eles
relataram a presença de QTL nos SSC 4, 8 e 13. O segundo QTL para taxa de
ovulação, citado no SSC 15, foi evidenciado por Rohrer et al. (1999).
Analisando o genoma completo, esses autores verificaram associação com
características reprodutivas em seis cromossomos e, além do SSC15, foram
relatados QTL nos SSC 1, 3, 8, 9, 10. Nessas análises, os SSC 8 e SSC 10
apresentaram múltiplas associações em diferentes regiões. Nos SSC 3, 8, 9,
10 e 15 foram verificadas associações com o componente taxa de ovulação.
Nos SSC 1 e 10, foram observadas associações com idade à puberdade e, no
cromossomo 8, com capacidade uterina e peso do ovário.
A segunda metodologia de análise genômica é o estudo de genes
candidatos. Genes candidatos são genes seqüenciados, cuja ação biológica é
conhecida e estão envolvidos com o desenvolvimento ou fisiologia da
característica, podendo ser estruturais ou regulatórios (Rothschild & Soller,
1999). A partir de estudos de genes candidatos e da genômica comparativa, é
possível identificar vários genes com efeito fenotípico significativo, que podem
ser utilizados em programas de melhoramento genético.
Para características reprodutivas em suínos, foram identificados vários
genes controlando o tamanho da leitegada. Dentre esses, encontra-se o
receptor de estrógeno (ESR), localizado no SSC1 na posição p25-p24, que
possui importante papel no ciclo reprodutivo de fêmeas (Rothschild & Soller,
1999; Drogemuller et al., 2001). O estrógeno está envolvido no reconhecimento
materno da prenhez (Geisert et al., 1990). Segundo Rothschild y Soller (1999),
entretanto, a expressão do gene ESR depende do “background” genético, ou
seja, o efeito dos alelos pode diferir entre raças e, ou populações.
21
Outros dois genes, o receptor de ácido retinóico (vitamina A) (RARG –
Retinoic Acid Receptor Gamma) localizado no cromossomo 5 (SSC5) e o gene
que codifica para a proteína 4 de ligação ao retinol (RBP4 – Retinol-Binding
Protein 4), localizado no SSC 14, são expressos durante o alongamento da
vesícula embrionária, um crítico período da gestação em suínos, sendo que
ambos genes possuem importante papel no aumento do tamanho da leitegada
(Rothschild & Soller, 1999). Rothschild et a (2000) ressaltaram o efeito do gene
RBP4 em 2.555 leitegadas de uma linhagem comercial de suínos, com efeito
genético aditivo de 0,23 leitões/leitegada Entretanto, nenhum efeito relacionado
o gene RARG foi verificado para o tamanho da leitegada.
O gene do receptor de prolactina (PRLR – Prolactin Receptor Gene)
(SSC16) tem sido identificado em vários tecidos, sendo considerado um
candidato para tamanho da leitegada, devido seu papel na rota da Prolactina
(PRL) (Rothschild & Soller, 1999). A prolactina afeta a produção de
progesterona, que é um hormônio produzido pelo corpo lúteo. o fator
epidérmico de crescimento (EGF – Epidermal Growth Factor) foi estudado
como candidato, baseando-se em sua função na fisiologia reprodutiva (Linville
et al., 2001), estimulando o crescimento e a proliferação de muitos epitélios
(Hadley, 1996).
A prostaglandina-endoperóxido sintetase 2 (PTGS2 – Prostaglandin-
Endoperoxidase Synthase 2), geralmente conhecida como ciclo-oxigenase 2
(COX 2), é uma enzima responsável pela produção de prostaglandinas (Lages,
1998) e possui importante papel no estabelecimento da gravidez, em suínos
(Drogemuller et al., 2001). Outro gene candidato para tamanho da leitegada em
suínos é o hormônio folículo estimulante beta (FSHβ - Follicle-stimulating
Hormone Beta) cuja posição cromossômica no SSC 2 é p16-p12. Este
hormônio atua no crescimento dos pequenos e médios folículos ovarianos
(Mannaertz et al., 1994). Embora não encontrando efeito genético aditivo no
tamanho da leitegada associado a um marcador dentro da região genômica de
FSHβ, Linville et al. (2001) consideram este gene como candidato em estudos
de prolificidade.
Além da análise de QTL e genes candidatos, a análise de seqüências
transcritas também tem sido empregada na identificação e caracterização de
genes desconhecidos, em que há possibilidade de determinar a expressão dos
22
genes em diferentes tecidos e em diferentes estádios do desenvolvimento
(Adams et al., 1991). Esta análise tem sido uma importante ferramenta para a
seleção e identificação de genes candidatos (Fahrenkrug et al., 2002). Com
relação aos tecidos reprodutivos, encontram-se descritas 21.499 seqüências
expressas estudadas em parcerias por vários grupos de pesquisa (PigESTs,
2007).
Bonnet et al (2006), utilizando hibridização subtrativa, identificaram a
expressão diferencial de genes em células da granulosa de suínas, tratadas
com FSH, em comparação com células isoladas de folículos ovarianos
imaturos. Duas bibliotecas foram geradas e 501 clones foram obtidos
inicialmente, sendo que 76 foram seqüenciados. Nesses genes. foram
observadas correspondências com 55 genes diferentes. Os autores verificaram
cinco genes, que geralmente são regulados pelo hormônio FSH: HP1-BP74,
cox-2, CCT3, SCARB1 e GPX3, dentre outros genes que não foram
identificados, podendo tratar-se de novos genes, sendo, portanto, necessários
futuros estudos para sua identificação.
Outro estudo envolvendo folículos ovarianos de suínos foi realizado por
Caetano et al (2003), que analisaram seqüências diferencialmente expressas
em duas bibliotecas normalizadas de cDNA de fêmeas com alta e baixa taxa de
ovulação. Foram avaliados folículos sem nenhum tratamento e folículos
submetidos à ação do hormônio PGF2α (após os seis primeiros dias da injeção
hormonal). Os autores obtiveram 5.231 seqüências provenientes da biblioteca
de cDNA. Dentre essas seqüências, 3.479 eram clusters e 2.661 seqüências
únicas. Por meio da análise BLASTN (NCBI, 2007) dos 3.479 clusters, 1.037
(29,8%) seqüências não apresentaram homologia com nenhuma seqüência
depositada no GenBank (NCBI, 2007). No entanto, a maioria das ESTs
observadas apresentou homologia com outras ESTs depositadas no banco de
dados. Observou-se um total de 59 proteínas ribossomais ao longo dos clones
seqüenciados, indicando significativa amostra das mensagens expressas nos
folículos ovarianos.
Faherenkrug et al. (2002), visando maximizar a coleção de seqüências
únicas e a diversidade de genes em suínos, analisaram duas bibliotecas
normalizadas de cDNA, derivadas de tecidos embrionário (MARC 1PGI) e
reprodutivo (MARC 2PGI) e obtiveram um total de 66.245 clones depositados
23
no GenBank. A partir desse resultado, foi obtido em total de 15.616 tentativas
de seqüências consenso e 31.466 seqüências únicas. Com a clusterização das
análises, observou-se um baixo número de seqüências redundantes na
biblioteca subtrativa. No seqüenciamento da biblioteca MARC 1PGI, dois genes
foram identificados em maior freqüência: APEH (N-Acylaminoacil-Peptide
Hydrolase) e EF1α, enquanto na biblioteca MARC 1PGI foram encontrados, em
maior freqüência, os genes COL3A1 (Collagen Type III Alpha 1) e NUMA 1
(Nuclear Mitotic Apparatus Protein 1).
2.5. PCR quantitativo em tempo real
A análise das seqüências transcritas de um tecido tem sido empregada
na caracterização de genes desconhecidos, possibilitando a determinação de
sua expressão em diferentes tecidos e diferentes estádios do desenvolvimento
(Adams et al., 1991; Hatey et al., 1998). Estudos de expressão gênica vêm
sendo empregados em vários organismos. como humanos, ratos, suínos,
bovinos e outras espécies. A maioria dos estudos em suínos e bovinos tem a
finalidade de identificar e caracterizar genes relacionados a características
economicamente importântes, como no caso das reprodutivas e aquelas
relacionadas à resistência a doenças, sendo esta uma importante ferramenta
para a seleção e avaliação de genes candidatos (Faherenkrug et al., 2002).
Como a prolificidade em suínos é uma característica complexa, muitos
genes estão envolvidos em sua expressão. Dentre as metodologias disponíveis
para a identificação e expressão de determinados genes, encontra-se a análise
genômica funcional, que possibilita caracterizar os padrões de expressão de
mRNA e proteína e tem demonstrado ser uma estratégia muito informativa. O
produto inicial da expressão gênica em um organismo é denominado
transcriptoma e refere-se ao conjunto de RNA mensageiro, cuja informação é
requerida pela célula em um determinado momento (Binneck, 2004). Portanto o
a quantidade de mRNA é um indicativo da expressão de um determinado gene
(Hocquette, 2005).
Dentre as técnicas que possibilitam estudar os transcriptomas, a análise
de PCR quantitativa em tempo real (qPCR), tem se mostrado uma poderosa
24
ferramenta na quantificação da expressão gênica (Livak & Schmittgen, 2001;
Wong & Medrano, 2005). Esta técnica monitora a reação de PCR ciclo a ciclo;
assim, os dados são coletados desde o início até o fim do processo de
amplificação. Desta forma, a análise em tempo real combina amplificação,
detecção e quantificação em um único passo (Wong & Medrano, 2005).
Esta técnica associa a amplificação do gene alvo em cada ciclo com a
emissão de fluorescência. Assim, a quantidade gerada de produto gênico é
proporcional à quantidade de fluorescência emitida (Bustin & Nolan, 2004;
Wong & Medrano, 2005). Várias metodologias para amplificação em qPCR vêm
sendo desenvolvidas e variam quanto à especificidade do alvo de amplificação,
custo e precisão. Dentre elas, pode ser citado o sistema SYBR Green que é um
fluoróforo com sistema de detecção não específico, que se liga em qualquer
dupla fita de DNA gerada durante a reação de PCR, emitindo fluorescência
(Bustin & Nolan, 2004; Bustin, 2002).
A análise comparativa da expressão do mRNA de genes de interesse
em diferentes células ou tecidos, requer métodos de normalização acurados.
Para tanto, são necessários genes de caráter constitutivo, os quais mantêm as
funções celulares básicas com mRNA expresso em todos os tipos celulares e
estádio de desenvolvimento (Bas et al., 2004). Estes genes são denominados
como genes referência, ou controle endógeno, em que as mensurações no final
da reação de PCR são estimadas a partir dele, evitando-se, assim, erros
comumente associados a tais sistemas de amplificação. Vários são os genes
referência utilizados, sendo os mais comuns: β-actina, gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase (GAPDH), hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HPRT)
e o RNA ribossomal (rRNA) 18S (Huggett et al., 2005).
Independente da metodologia utilizada, as reações de PCR são
caracterizadas por um ponto no ciclo, no qual a amplificação é primariamente
detectada, durante a fase exponencial da amplificação. Este ponto,
denominado “ciclo limiar” (Threshold Cycle - Ct), é aquele em que a intensidade
de fluorescência da amostra é maior que o background de fluorescência, sendo
este valor inversamente proporcional à quantidade de material inicial para
amplificação (Bustin & Nolan, 2004).
Em função do Ct obtido em cada amostra, duas estratégias de
quantificação podem ser empregadas: a quantificação absoluta ou a
25
quantificação relativa. A quantificação absoluta do número de cópias de mRNA
é determinada pela construção de uma curva padrão. A quantificação relativa,
ou método comparativo, é baseada na comparação da expressão do gene alvo
com a referência interna por meio dos Cts de cada amostra (Pfaffl et al., 2002).
A alta sensibilidade desta técnica elimina a necessidade de qualquer
passo após a amplificação, reduzindo as chances de contaminação e o
aparecimento de resultados falso-positivos (Wacker & Godard, 2005; Wong &
Medrano, 2005), podendo ser utilizada para determinar a presença ou ausência
de um determinado transcrito, comparar níveis de mRNA em diferentes
amostras, para caracterizar padrões de expressão de mRNAs e para
discriminação entre mRNAs bem relacionados (Corrêa & Lima, 2005). A técnica
de qPCR ainda pode ser utilizada na detecção de mutações e variantes alélicas
em diagnósticos moleculares (Bustin, 2000)
2.6. Genes selecionados para análise
A metodologia de qPCR requer conhecimento prévio dos genes que
afetam a característica a ser avaliada. Dentre os genes disponíveis no
GenBank para características reprodutivas em suínos, os genes PGF
2α
(prostaglandina F
2α
), FSHR (receptor do hormônio folículo estimulante), STAR
(proteína esteroidogênica regulatória aguda
)
, P4R (receptor de progesterona
4), CYP19 (citocromo aromatase P450) e GATA (proteína de ligação GATA 4)
estão envolvidos em um grande número de processos fisiológicos reprodutivos.
A PGF
2α
é um forte agente luteolítico em um grande número de
espécies, tem sido implicada como moduladora da pressão intra-ocular e pode
ser importante na contração da musculatura lisa do útero e de outros tecidos.
Não há informação quanto à localização cromossômica deste gene em suínos.
Em humanos, o gene PGF
2α
foi mapeado na posição 9 q34.2-q34.3 e, em
bovinos, no cromossomo 11 (NCBI, 2007). A ação da PGF
2α
na célula, como
no caso do processo de regressão do corpo lúteo, é primariamente, se não
exclusivamente, mediada pela associação com o receptor de prostaglandina
F
2α
(FPr), que é uma proteína G-ligada contendo sete domínios transmembrana
26
e parece ser codificada por um único gene. (Anderson et al., 2001;
Boonyaprakob et al., 2003).
Outro gene relevante é o que codifica para o receptor do hormônio FSH,
que participa no controle da síntese ovariana de estrógenos. O FSHR foi
mapeado no SSC 3 na posição q2.2-q2.3, por Remy et al. (1995). O hormônio
FSH é um heterodímero pertencente à família das glicoproteínas e possui duas
subunidades, alfa e beta, cada uma codificada por distintos genes, sendo que a
subunidade beta oferece especificidade (Linville et al., 2001). Este é
considerado, em suínos, como melhor indutor da taxa de ovulação devido sua
atuação na maturação dos pequenos e médios folículos ovarianos e por inibir a
apoptose das células da granulosa (Cárdenas & Pope, 2002). Em suínos, o
FSH regula positivamente a transcrição para a produção do mRNA do FSHR e,
negativamente, a expressão de seu receptor (Sites et al., 2007).
Na avaliação das características reprodutivas, outro gene importante é o
P4R, cuja localização se dá no SSC 9p13-p11 (NCBI, 2007). O receptor de
progesterona é uma proteína intracelular, que medeia os efeitos da
progesterona (Ying et al., 2000). Este hormônio possui papel-chave no
estabelecimento e na manutenção da prenhez, coordenando uma série de
passos interativos, iniciando com a pré-implantação, a implantação e a
manutenção do embrião no útero materno (YING et al., 2000). Sua secreção é,
primariamente, estimulada pelo LH e atua sinergicamente com o estrogênio, na
manifestação do cio. No entanto, em níveis elevados, a progesterona provoca a
inibição do cio e do pico pré-ovulatório de LH, possuindo, assim, um importante
papel na regulação hormonal do ciclo estral, além de inibir a mortalidade
embrionária (Hafez & Hafez, 2004). A expressão do gene que codifica para
P4R é regulada, positivamente, pelo estrogênio (up-regulation) e
negativamente pela progesterona (down-regulation) na maioria dos tecidos
(Bouchard, 1999).
O gene GATA-4 codifica uma proteína, que é membro de um grupo de
fatores de transcrição, estruturalmente, relacionados com o controle da
expressão gênica e a diferenciação de vários tipos celulares. Em humanos,
este gene encontra-se localizado na posição cromossômica 8p23.1-p22 (NCBI,
2007). Membros desta família de proteínas de ligação ao DNA (DNA-binding
proteins) reconhecem a seqüência consenso conhecida como GATA, que é um
27
elemento cis essencial, localizado nos promotores e enhancers de uma gama
de genes (ARCECI et al., 1993). Um exemplo é o gene STAR, cuja expressão
é mediada por vários fatores de transcrição, dentre os quais se encontra o
GATA 4 (Lavoie et al., 2004).
A proteína codificada pelo gene STAR possui papel-chave na regulação
da síntese dos hormônios esteróides pelo aumento da conversão do colesterol
em pregnenolona. Esta proteína permite a clivagem do colesterol em
pregnenolona, mediando o transporte do colesterol da membrana mitocondrial
externa para a membrana mitocondrial interna. Em suínos, não há descrição
quanto à localização cromossômica deste gene. No entanto, o gene STAR foi
mapeado no cromossomo 8p11.2 de humanos e no cromossomo 27 de bovinos
(NCBI, 2007).
No ovário, a mensagem e a proteína STAR são reguladas,
positivamente, durante a luteinização pós-ovulação das células foliculares no
corpo lúteo, período em que ocorre aumento na síntese de progesterona.
(Lavoie et al., 2004).
Outro gene importante para o desenvolvimento folicular é o CYP19, cuja
expressão codifica para a enzima chave na biossíntese de estrogênio, a
Citocromo Aromatase P450 (P450
aro
). As reações de hidroxilação e oxigenação
na biossíntese dos hormônios esteróides são catalisadas por oxidases de
função mista, que empregam NADPH, O
2
e citocromo mitocondrial P450
(Nelson & Cox, 2002). A aromatase catalisa a aromatização da androstediona e
testosterona em estrona e estradiol, respectivamente. As células da granulosa
são ricas em receptores para FSH, o qual tem papel chave no controle da
atividade da P450
aro
(Robel, 1993).
O gene CYP19 foi descrito, primeiramente, em humanos (localizado no
cromossomo 15 na posição q21.1). Em bovinos, é expresso em diferentes
concentrações e por diferentes promotores em células da granulosa e no corpo
lúteo gravídico desses animais (Vanselow et al., 2004). Em suínos o gene
CYP19 encontra-se localizado no SSC 1 (NCBI, 2007), sendo sua expressão
regulada, positivamente, pelo estrogênio (Komar et al., 2001).
28
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta de material
Foram coletadas amostras do líquido folicular de fêmeas de linhagem
comercial, proveniente de um tricross das raças Large White, Landrace e
Pietrain, alocadas na Granja de Melhoramento de Suínos do Departamento de
Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa (UFV). Esses animais foram
abatidos durante a fase folicular do ciclo estral no segundo semestre de 2006,
Foram utilizadas três fêmeas hiperprolíficas (H) com média de a 12,03 leitões
por leitegada e três fêmeas classificadas como hipoprolíficas (L), que
apresentaram 8,51 leitões por leitegada. Os dados relativos ao número de
parições dos animais e ao número de leitões nascidos e nascidos vivos em
cada parto, estão apresentados na Tabela 1.
Foram coletadas células foliculares por punção e aspiração folicular dos
ovários das fêmeas L e fêmeas H por meio de seringa descartável de 5 mL
Foram aspirados folículos com diâmetro entre 5 e 10 milímetros. Após
aspiração, as células foliculares foram peletizadas por centrifugação do líquido
folicular a 5200 g durante 6 minutos. Foram adicionados 500 µL de tampão
fosfato salino 1X (PBS 1X - Phosphate Buffered Saline) ao pelete, para
lavagem e, posteriormente, o material foi novamente centrifigado a 5200 g
29
durante 6 minutos. Este procedimento se repetiu por duas ou três vezes,
dependendo do estado das células peletizadas. Após a lavagem, as células
foram ressuspendidas no tampão RLT, contendo β-mercaptoetanol (Kit RNeasy
Mini Kit - Qiagen) para imediata extração do RNA total.
3.2. Dados fenotípicos
Na Tabela 1, são apresentados o número de partos de cada fêmea e,
consequentemente, o número de leitões nascidos e o número de leitões
nascidos vivos em cada parição.
20
Tabela 1 - Número de parições de cada fêmea avaliada e o número de leitões nascidos e nascidos vivos
referente a cada parto.
1º Parto 2º Parto 3º Parto 4º Parto 5º Parto 6º Parto 7º Parto Fêmea
NLN
NLNV
NLN
NLNV
NLN
NLN
NLNV
NLNV
NLN
NLNV
NLN
NLNV
NLN
NLNV
H
1 (200)
14 14 6 5 17 15 16 15 13 12
H
2 (694)
11 9 15 12 13 13 17 17 14 11
H
3 (1593)
12 11 12 11 12 12 14 13 15 13 10 9
L
1 (674)
9 7 10 10 3 2 9 9 9 7 13 12 11 11
L
2 (743)
9 9 7 7
L
3 (1207)
9 9 13 10 10 8 10 10
NLN - Número de Leitões Nascidos; NLNV - Número de Leitões Nascidos Vivos.
21
As médias dos dados fenotípicos dos animais, referentes ao número de
leitões nascidos (NLN) e número de leitões nascidos vivos (NLNV), bem como
e o número de células foliculares (NCF) presentes no líquido folicular de cada
fêmea são apresentados na Tabela 2. O cálculo da diferença entre as médias
baseou-se no Teste T de Student.
Tabela 2 - Médias dos dados fenotípicos das porcas analisadas
Fêmeas NLN NLNV NCF/mL
H
1 (200)
13,2 12,2 4,8 x 10
6
H
2 (694)
14,0 12,4 3,6 x 10
6
H
3 (1593)
12,5 11,5 2,8 x 10
6
L
1 (674)
9,24 8,29 1,4 x 10
6
L
2 (743)
8,0 8,0 3,8 x 10
6
L
3 (1207)
9,25 9,25 4,2 x 10
6
NLN - Número de Leitões Nascidos; NLNV - Número de Leitões Nascidos Vivos; NCF -
Número de Células da Foliculares por mL de solução.
3.3. Quantificação das células
Após a lavagem, com o material em suspensão no tampão PBS 1X, o
número de células foliculares presentes na solução foi estimado para extração
do RNA total por meio de Câmara de Neubauer. Foi coletada uma alíquota das
células em suspensão, a qual foi diluída na proporção de 1:20 no tampão PBS
1X. Esse material foi utilizado para preencher os dois compartimentos de
contagem da câmara. Como a suspensão inicial foi diluída, o número de
células contadas em toda câmara de contagem foi igual à média do número de
células presentes nos dois compartimentos da câmara multiplicada pelo fator
de diluição. Para obter o número de células por mL de solução, o valor
encontrado para as células foi multiplicado por 1.000, pois, 1 mL equivale a
1.000 mm
3
e, posteriormente, foi multiplicado por 10, pois, na câmara é obtido
22
o número de células por 0,1 milímetro cúbico (mm
3
), assim o valor foi
multiplicado por 10.000 (Ferreira-Neto et al., 1997). Portanto, tem-se
Nº de Células/mL = nº total de células x 20 x 10.000
2
3.4. Extração do RNA total
O RNA total das amostras de células foi extraído, utilizando-se o Kit
RNeasy Mini Kit (Qiagen) e seguindo as recomendações do fabricante.
Resumidamente, as células em suspensão foram peletizadas e ressuspendidas
em tampão RLT mais β-mercaptoetanol (98%) para lise celular, sendo que, em
cada 1 mL de tampão, foram adicionadoa 10 µL β-mercaptoetanol. Ao lisado,
adiocionou-se álcool etílico 70% e todo volume foi adicionado à coluna Rneasy,
onde o RNA ligou-se ao suporte por afinidade (fase estacionária). Foi realizado
um tratamento com DNase liofilizada, a qual foi diluída em 550 µL de água livre
de RNase. À coluna, foram adicionados 80 µL da solução, contendo 10 µL de
DNase mais 70 µL de tampão RDD, fornecidos pelo Kit RNase-Free DNase set
(Qiagen).
A coluna foi lavada com o tampão RPE por duas vezes e o RNA ligado à
coluna foi eluído em 30 µL de água livre de RNase por centrifugação a 5000 g,
durante três minutos. Foram adicionados mais 30 µL de água livre de RNase à
coluna para uma nova eluição, obtendo-se um total de 60 µL de solução final.
O RNA total obtido foi quantificado por espectrofotometria, sendo a relação
OD
260
/OD
280
utilizada para avaliação da qualidade, pois, devido às baixas
concentrações do material, não foi possível visualiza-lo e avaliar a qualidade
em gel. O RNA foi armazenado a –70ºC até o momento de seu uso.
23
3.5. Síntese do cDNA
Para a síntese do DNA complementar (cDNA), foi feito um pool das
amostras, que consiste na junção do RNA total dos animais da mesma classe.
Assim, foi obtida uma amostra com material das fêmeas L e outra com material
das fêmeas H, diluídos na mesma concentração.
Tendo como molde o RNA total, a primeira fita foi sintetizada, utilizando-
se o Kit SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen), sendo que
onde em 6 µl de RNA total foram adicionados 1µL oligo(dT)
20
(50 µM) e 1 µL de
Anneling Buffer, correspondendo a um volume total de 8 µL. A reação foi
incubada a 65ºC durante 5 minutos e, posteriormente, incubada em gelo por 1
minuto.
Em seguida, foram adicionados 10 µL de 2X First-Strand Reaction Mix e
2 µL de SuperScript III/RNaseOUT Enzyme Mix (Invitrogen). A reação foi
incubada à temperatura de 50ºC durante 50 minutos e a 85ºC por 5 minutos
para inativação enzimática, sendo, então, resfriada no gelo.
As concentrações médias do cDNA das amostras foram analisadas por
espectofotometria, e correponderam a 769,07 ng/µL para as fêmeas
hiperprolíficas e 908,23 ng/µL para as fêmeas hipoprolíficas. O cDNA fita
simples foi estocado a –20ºC até o uso na reação de qPCR.
3.6. Confecção dos sistemas de PCR em tempo real.
A análise da expressão dos genes STAR, CYP19, GATA, P4R, FSHR e
PGF
2α
foi realizada, aplicando-se a metodologia de qPCR. Para a confecção
dos primers visando a amplificação dos genes estudados e do controle
endógeno (gene β-actina), utilizou-se o programa PrimerQuest (Primer Quest,
2007) fornecido pela Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA). Todos
os primers foram gerados a partir de seqüências, obtidas nos bancos de ESTs
de suínos, sendo apresentados na Tabela 3.
24
Tabela 3 –
Conjuntos de primers empregados para cada gene analisado nas
reações de PCR em tempo real.
STAR – Proteína Esteroidogênica Regulatória Aguda; CYP19 – Citocromo P450; GATA –
Proteína de Ligação 4; PGF2α – Prostaglandina F2α; FSHR – Receptor do Hormônio Folículo
Estimulante; P4R – Receptor de Prostaglandina .
3.7. Análise de RT-PCR em tempo real
As reações de qPCR foram feitas utilizando-se o termociclador SDS ABI
PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, C.A., USA). Foi escolhido o
método da quantificação relativa, sendo utilizado como controle endógeno, o
gene da β-actina e como detecção o sistema SYBR® Green (Bio-Rad, CA). As
reações de qPCR foram feitas em replicata para o controle endógeno e para os
genes alvo.
Antes da quantificação em tempo real, foram testadas as concentrações
de primer e de DNA, que permitiram a melhor eficiência de reação tanto para
Gene
Numero de
acesso
(GenBank
Primer
Tamanho dos
fragmentos
(pb)
β-
Actina
AJ 312193
F - TCATGAAGATCCTCACGGAGCG
R – CGTAGCAGAGCTTCTCCTTGATGT
89
STAR NM_213755
F - TGTTCATCCAGCCAGGAGCTTCA
R - AACCAGAGTGGATGTTGCTGCAC
138
CYP19 S80148
F - TGAGGCAACAGGAGTCCTAAATG
R - ATCTTGTGTTGCTTGATCTCAGGG
114
GATA Nm_214293
F - CAAATCGAAGACGTCAGCAGGTC
R - TCTGTCTTGATGGGACGCATCTCT
124
P4R S49016
F - AGCTCACAGCGTTTCTACCAGCTT
R – GGAAATTCAACACTCAGTGCCCG
123
FSHR Nm_214386
F - AGAACTTCCGCAGGGATGTCTTCA
R -TTGGATGAATGTTGTGGGCAGTGG
111
PGF
2α
Ab115763
F - TGACTACAAGAACTACGCCCTGCT
R – AGACAATGCCGTCCTCTGTGAAG
168
25
os genes alvo quanto para o gene da β-actina. Foram testadas quatro diluições
de cDNA (200, 100, 10 e 1 ng) e três diluições de primer (400, 200 e 100 nM).
A concentração de cDNA para a amplificação foi otimizada em 200 ng para o
gene PGF2α (Prostaglandina F2α) e 100 ng para os demais genes. Na Tabela
4, apresenta-se a concentração de primer, a temperatura de dissociação (TD) e
o valor do coeficiente de determinação (R
2
) da análise de regressão para cada
gene, incluindo o controle endógeno.
A técnica de qPCR requer que a eficiência da reação, tanto para os
genes alvo quanto para o controle endógeno, seja similar e alta. A eficiência da
reação foi calculada de acordo com Livak & Schmittgen (2001), sendo é
construída uma curva-padrão, gerada a partir da diluição serial do cDNA.
Os componentes para cada reação foram 12,5 µL de 2X SYBR® Green
Supermix (tampão, dNTPs, MgCl2, SYBR® Green e Taq DNA polimerase),
100, 200 ou 400 nM de cada primer, e 100 ou 200 ng de cDNA em um volume
final de 25 µL (Tabela 3), para cosntrução da curva de dissociação.
Para a análise de quantificação relativa de cada gene, foram feitas
reações em tubos individuais, sendo assim, não foram realizadas reações
multiplex, pois, como fluoróforo, foi utilizado o SYBER GREEN. As condições
de amplificação para todos os sistemas foram: 95ºC durante 3 minutos para
ativação da Taq polimerase; 40 ciclos de desnaturação a 95 ºC durante 15
segundos; e anelamento e extensão a 60ºC durante 60 segundos. Após 40
ciclos de amplificação todas as amostras foram submetidas à análise da curva
de dissociação, a fim de validar a ausência de produtos não específicos e
dímeros de primers. As amostras foram aquecidas com incremento de 1ºC
durante 30 segundos, partindo de 60ºC até atingir o limite de 94ºC.
Os resultados, obtidos com a análise de expressão do alvo e da
referência endógena, foram comparados diretamente. A normalização da
expressão gênica foi feita por do meio método 2
-∆Ct
(Livak & Schmittgen, 2001),
em que
26
∆C
T
= C
T
(alvo) - C
T
(referência)
Onde: Alvo – Gene Analisado
Referência – Controle Endógen (β-Actina)
O valor obtido foi, então, multiplicado por 1.000 para efeito de escala.
Foram amplificadas duas repetições de cada pool para cada gene e foram
calculados o desvio-padrão e o coeficiente de variação entre as duas
repetições. As amostras cujo coeficiente de variação excedia 5% foram
refeitas, tanto para o gene alvo quanto para o controle endógeno. Diferenças
de expressão iguais ou superiores a 1,5 vezes entre as fêmeas de alta e de
baixa prolificidade foram consideradas como diferencialmente expressas.
Tabela 4 –
Concentração de primer, temperatura de dissociação (TD) e
coeficiente de determinação (R
2
) para cada gene analisado.
Gene
Primer (nM)
TD (ºC) R
2
Concentração de
cDNA (ng)
β-Actina
200 85,6 0,91 100
STAR 200 80,4 0,78 100
CYP19 200 80,0 0,84 100
GATA 400 87,3 0,86 100
P4R 400 80,2 0,95 100
FSHR 200 80,5 0,96 100
PGF2α
400 80,5 0,68 200
STAR – Proteína Esteroidogênica Regulatória Aguda; CYP19 – Citocromo P450; GATA –
Proteína de Ligação 4; PGF2α – Prostaglandina F2α; FSHR – Receptor do Hormônio Folículo
Estimulante; P4R – Receptor de Prostaglandina.
27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As médias do NLN e do NLNV para o grupo L foram respectivamente 9,21
e 8,51, enquanto para o grupo H as médias foram 13,23 e 12,03 respectivamente.
Quando comparadas pelo teste T de Student, as médias de NLN e de NLNV se
mostraram significativamente diferentes entre os grupos L e H (P<0,01).
Após a constituição do pool gênico H e L, foi realizada a análise da
expressão relativa de cada gene. Os valores da média, do desvio padrão e do
coeficiente de variação (CV), baseados nos valores do “ciclo limiar” (Cycle
Threshold – Ct) dos genes β-Actina, STAR, CYP19, GATA, PGF
2α
, FSHR e P4R
nas células foliculares das amostras L e H são apresentados nas tabela 5 e 6,
respectivamente.
28
Tabela 5 –
Médias, desvio padrão e coeficiente de variação dos genes β-
Actina, STAR, GATA, PGF
2α
, P4R, FSHR e CYP19 baseados
nos valores de Ct das porcas de baixa prolificidade.
Genes C
t
XC
t
Desvio padrão
CV (%)
∆Ct
2
-∆Ct
x1000
β-Actina 24,95 25,03 0,11
0,45
25,11
STAR 24,35 23,68 0,95
4,00
-1,35
2,55 2549,12
23,01
CYP19 24,51 24,82 0,44
1,77
-0,21
1,16 1156,69
25,13
GATA 28,05 27,65 0,57
2,05
2,62
0,16 162,67
27,25
P4R 28,6 28,425
0,25
0,87
2,25
0,21 210,95
28,25
FSHR 29,79 29,44 0,49
1,68
4,41
0,05 47,04
29,09
PGF
2α
31,15 30,79 0,52
1,68
5,76
0,02 18,52
30,42
STAR – Proteína Esteroidogênica Regulatória Aguda; CYP19 – Citocromo P450; GATA –
Proteína de Ligação 4; PGF
2α
– Prostaglandina F
2α
; FSHR – Receptor do Hormônio Folículo
Estimulante; P4R – Receptor de Prostaglandina;
C
t
– Cycle Threshold (Ciclo Limiar);
XC
t
– Média dos Cts;
∆C
T
= C
T
(alvo) - C
T
(referência)
2
-∆C
t
– Unidades arbitrárias
29
Tabela 6 –
Médias, desvio padrão e coeficiente de variação dos genes β-
Actina, STAR, GATA, PGF
2α
, P4R, FSHR e CYP19 baseados
nos valores de Ct das porcas de alta prolificidade.
Genes C
t
XC
t
Desvio Padrão
CV (%)
∆Ct
2
-∆Ct
x1000
β-Actina
26,28
26,18 0,14
0,54
26,08
STAR 26,23
26,05 0,26
1,00
-0,14
1,10
1098,09
25,86
CYP19 27,19
27,17 0,03
0,10
0,99
0,50
503,48
27,15
GATA 30,19
30,01 0,26
0,87
3,83
0,07
70,56
29,82
P4R 28,6 28,43 0,25
0,87
2,25
0,21
210,95
28,25
FSHR 30,69
30,02 0,96
3,16
3,84
0,07
69,83
29,35
PGF
2α
33,33
33,44 0,16
0,47
7,26
0,01
6,52
33,55
STAR – Proteína Esteroidogênica Regulatória Aguda; CYP19 – Citocromo P450; GATA –
Proteína de Ligação GATA 4; PGF2α – Prostaglandina F2α; FSHR – Receptor do Hormônio
Folículo Estimulante; P4R – Receptor de Prostaglandina;
Ct – Cycle Threshold (Ciclo Limiar);
XCt – Média dos Cts;
∆CT= CT (alvo) - CT (referência)
2-∆Ct – Unidades arbitrárias
A maioria das amostras apresentou coeficiente de variação
relativamente baixo (<5%), sugerindo boa qualidade para a análise de
expressão, sendo a maior variação registrada para o gene STAR no pool das
fêmeas com baixa prolificidade (4%).
Na literatura disponível, não foram observados relatos de outros estudos
de expressão dos genes, aqui descritos, em suínos. Os genes STAR, GATA,
PGF
2α
, P4R, FSHR e CYP19 foram escolhidos, a partir de dados obtidos nos
bancos de ESTs de suínos, enquanto as diferenças da expressão de cada
gene, representadas pelo valor relativo de 2
-∆Ct
(unidades arbitrárias), está
30
apresentada em medidas relativas, pelo número de vezes que cada gene se
expressa mais no pool L do que no pool H (Tabela 6).
Tabela 6 – Diferença relativa da expressão dos genes STAR,
GATA, PGF2α, P4R, FSHR e CYP19.
Diferença Relativa
Genes
L/H
STAR 2,32
CYP19 2,30
GATA 2,31
P4R 7,73
FSHR 0,67
PGF
2α
2,84
STAR – Proteína Esteroidogênica Regulatória Aguda; CYP19 – Citocromo
P450; GATA – Proteína de Ligação GATA 4; PGF2α – Prostaglandina F2α;
FSHR – Receptor do Hormônio Folículo Estimulante; P4R – Receptor de
Prostaglandina.
O ciclo estral é coordenado por uma série de passos e interações
hormonais, que iniciam o crescimento folicular e culminam na ovulação do
oócito fértil. Devido à importância hormonal na taxa de ovulação, os genes
selecionados para análise são codificadores de hormônios, de receptores
hormonais, de proteínas e de enzimas, que participam na biossíntese de
alguns esteróides, bem como de genes que participam na regulação da
expressão de outros genes.
Dentre os genes analisados, a maior diferença de expressão foi
verificada para o gene P4R, que foi expresso 7,73 vezes a mais nos animais
com baixa prolificidade do que naqueles com alta. O P4R medeia os efeitos
fisiológicos da progesterona, que é o principal hormônio produzido pelo corpo
lúteo, sendo responsável pela implantação e manutenção da prenhez em
31
mamíferos, em que possui papel-chave numa série de passos coordenados,
que estendem-se do início ao fim da implantação do embrião no útero materno
(Ying et al., 2000).
Peralta et al (2005) analisaram a expressão dos receptores de
progesterona no oviduto de fêmeas suínas durante a fase folicular e a fase
luteal do ciclo estral. Os autores afirmam que os maiores moduladores
fisiológicos da concentração do P4R são os hormônios ovarianos estrogênio
(up-regulation) e progesterona (down-regulation). Os animais com baixa
prolificidade apresentaram maior expressão do gene P4R do que os animais
com alta prolificidade e, caso todo mRNA seja traduzido a proteína, esses
animais podem possuir baixas concentrações de progesterona, pois, este
hormônio controla, negativamente, o nível do seu receptor e, como este
hormônio é essencial à manutenção da prenhez, isto pode estar afetando a
taxa de concepção desses animais.
Posterior ao gene P4R, a maior diferença de expressão foi encontrada
para o gene PGF
2α
, que expressou 2,84 vezes a mais nas fêmeas
hipoprolificas. A prostaglandina F
2α
(PGF
2α
) é o principal hormônio responsável
pela luteólise ou regressão do corpo lúteo e conseqüente entrada na fase
folicular, quando os níveis de PGF
2α
começam a reduzir. Este comportamento
hormonal é essencial à manifestação do cio na maioria dos mamíferos
(McCracken et al., 1999).
A liberação da PGF
2α
é induzida pela ocitocina luteal (Hafez & Hafez,
2004), sendo sua ação mediada pela ligação ao receptor de membrana, que é
uma proteína G-ligadora denominada FPr. No final da fase luteolítica, é
observado um aumento no número de FPr no corpo lúteo e uma reduzida
concentração do hormônio PGF
2α
(McCracken et al., 1999). No entanto, a
quantidade de PGF
2α
não pode ser somente explicada pelo número de
receptores, mas, também pela expressão de outros mediadores.
A PGF
2α
é, particularmente, potente na interrupção da prenhez em fase
inicial (Hafez & Hafez, 2004) sendo que este fato pode estar influenciando o
tamanho da leitegada dos animais hipoprolíficos. Outro fato, evidenciando que
altas concentrações de Prostaglandina F
2α
podem estar afetando a
manutenção da prenhez, nas porcas de baixa prolificidade, é que em suínos o
32
corpo lúteo é importante na manutenção da gestação, sendo que sua remoção
resulta na terminação deste período, o que não é observado em outras
espécies em que, somente, a placenta mantém esse evento (Pillon et al., 1997)
e como este hormônio atua na luteólise, isto pode estar prejudicando
diretamente esses animais.
O gene STAR expressou 2,32 vezes a mais nos animais com baixa
prolificidade. Este gene codifica para uma proteína, que regula positivamente a
síntese de hormônios esteróides (esteroidogênese) durante a luteinização,
antes da entrada no cio. Os tecidos envolvidos na esteroidogênese são o corpo
lúteo e a placenta (Pilon et al., 1997).
A proteína STAR participa deste evento facilitando o transporte de
colesterol na membrana mitocondrial, aumentando, assim, a conversão de
colesterol em pregnenolona (Lavoie et al.,, 2004). A pregnenolona é um
precursor de outros hormônios, dando origem à progesterona e esta, por sua
vez, aos estrógenos e aos andrógenos. A esteroidogênse, nos folículos
ovarianos, ocorre tanto nas células da teca, onde há conversão do colesterol
em progesterona e, em seguida, testosterona, quanto nas células da granulosa,
as quais importam os andrógenos das células da teca para a síntese de
estrógenos (Robel, 1993).
A transcrição do gene e a tradução do mRNA de STAR, em suínos, são
reguladas positivamente, durante a luteinização pós-ovulatória das células
foliculares no corpo lúteo, período diretamente relacionado ao aumento da
síntese de progesterona. Estudos indicam que a expressão do STAR é
regulada, positivamente, pelas gonadotrofinas, FSH e LH, sendo que a
estimulação mais prolongada da mensagem para o STAR ocorre pelo LH. O
controle negativo se dá pela prostaglandina F
2α
que aparece, suprimindo a
expressão do mRNA para o gene STAR (Lavoie et al.,, 2004). Neste caso, era
esperado que o gene STAR se expressasse mais nos animais com alta
prolificidade, pois, esses animais apresentaram menor expressão do gene que
codifica para PGF
2α
,
comparação com os animais que apresentam baixa
prolificidade.
Levando-se em consideração que a expressão do gene STAR leva a
produção de enzima, que participa na biossíntese de esteróides e, conforme os
resultados de expressão do P4R, os animais com baixa prolificidade
33
apresentariam menores concentrações do mRNA para o hormônio
progesterona, este resultado se contrapõe aos demais resultados de
expressão. No entanto, como a análise em tempo real faz uso do mRNA, pode-
se afirmar que a mensagem está sendo expressa, mas o mesmo não pode ser
dito quanto à tradução da proteína ou quanto ao seu processamento, devido
aos controles pós-transcricionais, que modulam o produto gênico gerado. Outro
fato relevante é que as proteínas animais encontram-se em uma estado
dinâmico, sendo constantemente sintetizadas e degradadas. Caso esteja
ocorrendo a tradução à proteína, esta pode possuir uma meia-vida curta o que
impossibilita sua atuação na esteroidogênese, ou ainda, esta proteína poderia
não estar agindo com eficácia no transporte do colesterol, ou estaria ocorrendo
algum problema no restante da rota metabólica, não levando à produção de
esteróides necessários à manutenção dos processos reprodutivos.
Outro gene que têm papel-chave na esteroidogênese é o CYP19, cuja
expressão relativa foi 2,30 vezes a mais nas fêmeas hipoprolíficas. A
expressão deste gene leva à produção da enzima Citocromo Aromatase P450
(P450
aro
), que é responsável pela biossíntese de estrógeno (Robel, 1993).
Baseado em estudos de expressão do CYP19 em células da granulosa de
bovinos, Vanselow et al. (2005) afirmam que a expressão deste gene está
associada a mecanismos epigenéticos, principalmente metilação no DNA.
Vários estudos evidenciaram diferentes polimorfismos no gene CYP19,
proporcionando diferenças étnicas em populações humanas (Kvitko et al.,
2004).
A expressão do gene CYP19 é regulada, positivamente, pelo estrogênio,
sendo observados maiores níveis de expressão durante a fase folicular do ciclo
estral, pois, os níveis deste hormônio foram aumentados para possibilitar a
entrada no cio. Posteriormente, após a elevação do hormônio luteinizante (LH),
observou-se que o nível de estrogênio decresceu, assim como a expressão
deste gene nos folículos pré-ovulatórios de bovinos (Komar et al., 2001).
O resultado de expressão deste gene indica que os animais com baixa
prolificidade podem estar apresentando maiores concentrações de estrógenos,
pois, o produto por ele codificado participa na conversão dos andrógenos em
estrógenos. Pode-se aventar, ainda, que os animais com baixa prolificidade
devem possuir maiores quantidades de estrogênio, responsável pela
34
manifestação do cio, pois sua expressão é controlada positivamente por este
hormônio. No entanto, deve-se ainda verificar o “background” genético de cada
indivíduo, devido aos polimorfismos identificados nesse gene levando a
mecanismos epigenéticos de expressão (Kvitko et al., 2004).
A expressão do gene GATA foi 2,31 vezes maior nas fêmeas
hipoprolíficas. Este gene codifica para a proteína de ligação GATA-4
pertencente a um grupo de fatores de transcrição responsáveis pela expressão
de vários genes e a diferenciação de diversos tipos celulares. Membros dessa
família de ligação ao DNA reconhecem a seqüência consenso, conhecida como
motivo GATA-4, que é um elemento cis essencial, localizado nos promotores e
enhancers de uma gama de genes (Arceci et al., 1993). A expressão do mRNA
GATA-4, segundo Arceci et al. (1993), é induzida pelo acido retinóico e é
tecido-específica, sendo observada no coração, no epitélio intestinal, no
endoderma primitivo e nas gônadas, possuindo assim papel chave na
expressão gênica nesses tecidos. O GATA-4 é expresso antes da
diferenciação das células gonadais (Lavoie et al., 2004), sendo extremamente
importante para este evento.
O gene STAR possui a expressão mediada por vários fatores de
transcrição, dentre os quais se encontra o GATA-4 (Lavoie et al., 2004). O
gene STAR apresentou maior expressão nos animais com baixa prolificidade,
assim como gene GATA. No entanto, para ambos os genes, esperava-se que
uma maior expressão fosse observada nos animais com alta prolificidade, pois,
o gene GATA promove a expressão do gene STAR, o qual possui papel
fundamental na biossíntese dos hormônios esteróides, importantes para a
manutenção da prenhez em mamíferos.
Em contrapartida, na literatura disponível, não foram encontrados dados
referentes à atuação do GATA-4 na regulação da expressão dos demais
genes. Assim, como a maioria dos genes foram mais expressos nos animais
combaixa prolificidade, este gene pode também estar regulando,
positivamente, a expressão dos genes P4R, PGF
2α
e CYP19, sendo necessário
investigar sua atuação no controle transcricional destes genes.
O gene FSHR expressou 1,48 vezes a mais nos animais de alta
prolificidade, aproximando-se do limiar estabelecido neste estudo para
expressão diferencial que foi de 1,5. O hormônio folículo estimulante (FSH)
35
possui, como principal função, o crescimento dos pequenos e médios folículos
ovarianos (Mannaertz et al., 1994; Hafez & Hafez, 2004). Este hormônio é um
indutor do recrutamento folicular em suínos e inibidor da apoptose das células
da granulosa, o que o colocaria como o principal regulador do desenvolvimento
folicular e da taxa de ovulação em suínos, de acordo com Cárdenas & Pope
(2002).
Em análise de genes candidatos para o tamanho da leitegada em suínos
de raças chinesas, Li et al. (2000), consideraram o gene FSHβ como major
gene para esta característica, verificando efeitos positivos para o alelo
favorável B com efeito estimado, em todos os partos em torno de um leitão,
podendo ser aplicado na seleção assistida por marcador molecular para o
melhoramento dessa característica.
A quantidade de mRNA para o FSHR é relativamente alta durante a fase
inicial do desenvolvimento folicular. No entanto, esta concentração diminui
consideravelmente, quando os folículos crescem e aproxima-se a ovulação.
Cárdenas & Pope (2002) sugeriram pouca influência deste hormônio nos
folículos pré-ovulatórios, em que a atuação central é do hormônio LH. Sites et
al. (1994), em estudos com culturas de células da granulosa de suínos,
afirmam que o gene que codifica para a proteína FSHR é regulado,
negativamente, pelo FSH, ao passo que a síntese do mRNA para o FSHR e a
biossíntese de progesterona são estimuladas positivamente.
Provavelmente, os níveis de mensagens para o FSHR encontravam-se
baixos, devido ao estádio avançado de desenvolvimento dos folículos
analisados (em média 5 a 10 mm), não evidenciando diferença significativa de
expressão entre os pools, de acordo com o presente estudo. A condução de
estudos do desenvolvimento folicular, em fases anteriores, poderia avaliar
melhor a atividade deste gene em fêmeas hipo e hiperprolíficas.
É provável que a expressão dos genes tenha sido influenciada pela fase
do ciclo reprodutivo, em que os animais foram analisados, a fase folicular do
ciclo estral. Deve-se levar em consideração, ainda, que estudos que utilizam a
metodologia de qPCR fazem uso do cDNA para quantificação da expressão
gênica. Portanto, torna-se necessário que futuros estudos sejam conduzidos
em nível de proteínas e de discriminação alélica, para reafirmação dos
resultados apresentados.
36
Ainda deve-se levar em consideração, em estudos de tamanho da
leitegada, que outros fatores inerentes à fêmea atuam, influenciando essa
característica, como capacidade uterina, idade da fêmea, número de partos e
morte ou sobrevivência embrionária. Além disso, devido à baixa herdabilidade,
a maior variação fenotípica é atribuída aos fatores ambientais.
A expressão de um gene afetando uma característica quantitativa, como
os fenótipos reprodutivos, deve ser analisada, durante todo o ciclo reprodutivo,
pois, esta depende dos estádios de desenvolvimento do tecido em estudo e da
vida do animal.
37
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A expressão dos genes STAR, GATA, PGF2α, P4R e CYP19 em células
da granulosa de fêmeas suínas, durante a fase folicular do ciclo estral
possibilitou identificar diferenças de expressão entre animais com diferentes
fenótipos reprodutivos.
As maiores expressões relativas dos genes STAR, GATA, PGF2α, P4R
e CYP19 foram verificadas, em os animais com menor número de leitões por
leitegada (hipoprolíficas).
O gene FSHR não atingiu o limiar de diferença de expressão
estabelecido no presente trabalho.
Não se pode afirmar se os genes estudados estão expressando somente
a mensagem, ou se estão expressando o mRNA e a proteína.
Estudos proteômicos e de discriminação alélica tornam-se necessários,
para confirmação dos resultados apresentados.
Há necessidade, ainda, de se verificar diferenças de expressão desses e
de outros genes relacionados, durante as demais fases do ciclo reprodutivo das
fêmeas com vistas ao melhor entendimento dos fenótipos produtivos em
suínos.
38
6. REFERÊNCIAS
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