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DÁRCIO KITAKAWA
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DA PROTEÍNA INIBIDORA
DE APOPTOSE, SURVIVINA, NO PROCESSO DE
CARCINOGÊNESE QUIMICAMENTE INDUZIDA PELA 4NQO
(4-NITROQUINOLINA 1-ÓXIDO) EM MUCOSA LINGUAL DE
RATOS WISTAR
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos para a obtenção
do título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-
Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área
Biopatologia Bucal.
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DÁRCIO KITAKAWA
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DA PROTEÍNA INIBIDORA
DE APOPTOSE, SURVIVINA, NO PROCESSO DE
CARCINOGÊNESE QUIMICAMENTE INDUZIDA PELA 4NQO
(4-NITROQUINOLINA 1-ÓXIDO) EM MUCOSA LINGUAL DE
RATOS WISTAR
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos, Universidade Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de DOUTOR, pelo
Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL,
Área de Concentração em Biopatologia Bucal.
Orientador Prof. Adj. Luiz Antonio Guimarães Cabral
Co-orientador Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro
SÃO JOSÉ DOS CAMPOS
2006
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1
Apresentação gráfica e normalização de acordo com :
BELLINI, A.B.; SILVA, E.A. Manual para elaboração de
monografias: estruturas do trabalho científico. São José dos
Campos: FOSJC/UNESP, 2002. 82p.
KITAKAWA, D. Estudo imunoistoquímico da proteína inibidora de
apoptose, survivina, no processo de carcinogênese quimicamente
induzida pela 4NQO (4-nitroquinolina 1-óxido) em mucosa lingual de
ratos Wistar. 2006, 80f. Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal, Área de
Concentração em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista. São José dos
Campos, 2006.
2
DEDICATÓRIA
A minha mãe LYDIA SUEKO YOKOYAMA KITAKAWA e
especialmente ao meu pai CHIOZO KITAKAWA, exemplos
de vida para mim. Toda a gratidão, orgulho e amor que tenho
por vocês não podem ser expresso em palavras.
A minha esposa, LIA MIYASAWA KITAKAWA, mulher da
minha vida, sou extremamente feliz ao seu lado. Todo este
trabalho só foi possível graças ao seu irrestrito apoio,
principalmente nas horas em que quase tudo parecia perdido..
Aos meus irmãos DALTON E DALBER KITAKAWA, sou
eternamente grato pelo privilégio de ter uma família tão unida
e amiga.
3
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador, PROF. ADJ. LUIZ ANTONIO
GUIMARÃES CABRAL, sábio Mestre, sou eternamente
grato ao convívio e ensinamentos proporcionados durante estes
5 anos de amizade. Sua filosofia e ensinamentos serão
multiplicados por mim pelo resto de minha vida.
Ao meu co-orientador, PROF. DR. DANIEL ARAKI
RIBEIRO, pesquisador ímpar, idealizador e grande
responsável pela realização deste trabalho, sou um admirador
da sua ânsia e incessante busca do saber.
4
AGRADECIMENTOS
Ao diretor PROF ADJ PAULO VILLELA SANTOS
JÚNIOR, em nome da Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos UNESP, pela oportunidade de realização do
curso;
Aos professores do PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM BIOPATOLOGIA BUCAL, pela oportunidade de
engrandecimento pessoal e profissional;
A PROFA. DRA. JANETE DIAS ALMEIDA, professora-
amiga, que proporcionou e continua proporcionando um
convívio fraternal o qual guardo com muito carinho;
Aos professores da disciplina de Propedêutica Estomatológica,
ANA SUELI e WALTER, pela amistosa convivência;
Aos professores do TOXICAN – Departamento de Patologia
da F.M. Botucatu - UNESP: MARIANGELA ESTHER
ALENCAR e DAISY MARIA FÁVERO SALVADORI,
pela gentileza em permitir o uso das dependências do
departamento que possibilitou a realização deste trabalho;
5
A professora MARIA APARECIDA CUSTÓDIO
DOMINGUE
pela
gentileza na cessão dos anticorpos da
survivina ;
À bibliotecária ÂNGELA BELLINI, pela prestatividade e
árduo trabalho de revisão bibliográfica;
Às secretárias da Pós-graduação, ROSE, ERENA e
CIDINHA, por todo apoio durante estes 5 anos de São José
dos Campos;
Aos amigos do curso de Pós-graduação em Biopatologia Bucal,
em especial, FERNANDO, ELAINE, PATRÍCIA e LUCIA,
pelos momentos de convivência;
Aos meus sogros, ALICE e MITSUO MIYASAWA, minha
segunda família;
Aos ANIMAIS, cujas vidas propiciam o progresso do conhecer;
À CAPES pelo financiamento parcial deste projeto.
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.................................................................................... 07
LISTA DE TABELAS.................................................................................... 08
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS....................................................... 09
RESUMO..................................................................................................... 11
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 12
2 REVISÃO DA LITERATURA..................................................................... 14
2.1 Carcinoma epidermóide......................................................................... 14
2.2 Carcinogênese....................................................................................... 16
2.3 Carcinogênese química......................................................................... 21
2.4 Modelos animais.................................................................................... 25
2.5 Apoptose................................................................................................ 28
2.6 Survivina................................................................................................ 31
3 PROPOSIÇÃO.......................................................................................... 37
4 MATERIAL E MÉTODO............................................................................ 38
4.1 Análise histopatológica.......................................................................... 39
4.2 Imunoistoquímica................................................................................... 39
4.3 Análise imunoistoquímica...................................................................... 42
5 RESULTADOS.......................................................................................... 43
5.1 Análise histopatológica.......................................................................... 43
5.2 Análise imunoistoquímica...................................................................... 45
6 DISCUSSÃO............................................................................................. 49
7 CONCLUSÕES......................................................................................... 56
8 REFERÊNCIAS......................................................................................... 57
ANEXOS...................................................................................................... 77
ABSTRACT.................................................................................................. 79
7
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Fotomicrografia mostrando mucosa bucal normal da
região posterior da língua do grupo controle. Note o
epitélio dorsal (ED), lâmina própria (seta), músculo
(Ms) e abaixo glândulas mucosas (M) e serosas (S).
Barra=110µm....................................................
45
FIGURA 2
A
nálise histopatológica durante a evolução da
carcinogênese (H.E.): a) mucosa lingual do dorso da
língua normal; b) hiperplasia e hiperqueratose sem
atipia; c) hiperplasia e hiperqueratose com atipia
discreta; d) hiperplasia e hiperqueratose com atipia
moderada; e) hiperplasia e hiperqueratose com
atipia grave; f) carcinoma in situ; g) carcinoma
epidermóide microinvasivo; h) Carcinoma
epidermóide bem diferenciado...................................
47
FIGURA 3
A
nálise imunoistoquímica durante a evolução da
carcinogênese (survivina) X 400: a) controle
negativo com ausência de marcação; b) 4 semanas
pós-tratamento com a 4NQO, demonstrando
marcação citoplasmática nas camadas superficiais
do epitélio; c) 12 semanas de tratamento com a
4NQO, demonstrando marcação nas camadas
superficiais do epitélio de uma lesão classificada
histopatologicamente como hiperplasia com atipia;
d) 20 semanas de tratamento com a 4NQO,
demonstrando marcação em áreas de disqueratose
numa lesão classificada como carcinoma
epidermóide bem diferenciado...................................
48
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Incidência dos quadros histopatológicos do modelo de
carcinogênese bucal induzidos pela (4NQO)
a
, em
mucosa de língua de ratos
96
.........................................
44
Tabela 2 - Número de casos com expressão da survivina de
acordo com o quadro histopatológico, seguindo a
administração da 4NQO na dose de 50 ppm................
46
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT = Associação Brasileira de Normas Técnicas
AHH = aril-hidrocarboneto hidroxilase
BIR = do inglês “Baculoviral IAP repeat”, traduzido como repetições IAP
do baculovírus
cDNA = DNA complementar
CE = carcinoma epidermóide
c-onc = c-oncogenes
d.C. = Depois de Cristo
DMBA = 9,10-dimetil-1,2- benzantraceno ou 7,12-dimetilbenzantraceno
DAB = diaminobenzidina
DNA = do inglês “Desoxyribonucleic acid”, traduzido como ácido
desoxirribonucléico
FOSJC = Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
H
2
O
2
= peróxido de hidrogênio
H.E. = Hematoxilina e Eosina
HPV = do inglês “Human Papilloma Virus”, traduzido como Papilomavírus
Humano
IAP = do inglês “Inhibitor of apoptosis protein”, traduzido como proteína
inibidora de apoptose
Ig G = imunoglobulina G
INCa = Instituto Nacional do Câncer
Kb = kilobases
mL = mililitro
M = molar
OMS = Organização Mundial da Saúde
PAHs = do inglês “Polycyclic Aromatic Hydrocarbons”, traduzido como
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
PBS = solução tampão fosfato
10
PCNA = do inglês “Proliferating Cell Nuclear Antigen”, traduzido como
antígeno nuclear de proliferação celular
ppm = partes por milhão
4NQO = 4 nitroquinolina 1-óxido
RNA = do inglês “Ribonucleic Acid”, traduzido como ácido ribonucléico
RNAm = RNA mensageiro
3,4 BP = 3,4 benzopireno
UICC = União Internacional de Combate ao Câncer
UNESP = Universidade Estadual Paulista
USA = do inglês “United States of América”, traduzido como Estados
Unidos da América
20 MC = 20 metilcolantreno
v-onc = v-oncogenes
W = watts
% = porcentagem
µm = micrômetro
o
C = graus Celsius
11
KITAKAWA, D. Estudo imunoistoquímico da proteína inibidora de
apoptose, survivina, no processo de carcinogênese quimicamente
induzida pela 4NQO (4-nitroquinolina 1-óxido) em mucosa lingual de
ratos Wistar 2006, 80f. Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal, Área de
Concentração em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista. São José dos
Campos, 2006.
RESUMO
A carcinogênese em mucosa lingual de rato induzida pela 4-nitroquinolina 1-óxido
(4NQO) é um modelo interessante para o estudo da evolução do carcinoma epidermóide
fase por fase. Considerando-se que a apoptose tem um papel importante na
carcinogênese, o objetivo deste trabalho foi investigar a expressão da survivina, membro
da família das proteínas inibidoras de apoptose, através da imunoistoquímica, durante o
ensaio de carcinogênese lingual induzida pela 4NQO. Ratos Wistar do sexo masculino
foram divididos em três grupos de 10 animais cada e tratados com 50 ppm de 4NQO na
água de beber durante quatro, 12 e 20 semanas. Um total de 10 animais foi utilizado
como controle negativo. Embora não tenha sido observada alteração histopatológica
após 4 semanas de exposição ao carcinógeno, detectou-se survivina no citoplasma das
células das camadas granulares e superficiais do epitélio. Nas lesões com atipias após
12 semanas de exposição ao carcinógeno, observou-se survivina citoplasmática apenas
na camada superficial do epitélio. Nos carcinomas epidermóides bem diferenciados
induzidos após 20 semanas de tratamento com a 4NQO, detectou-se a expressão de
survivina citoplasmática nas células adjacentes as pérolas córneas. Não houve
imunorreatividade no grupo controle negativo. Diante destes achados, os resultados
sugerem que a expressão da survivina citoplasmática é um evento inicial durante a
carcinogênese lingual de ratos induzida pela 4NQO, e pode ser uma ferramenta
interessante para a identificação de lesões com grande risco de progredir para
carcinoma epidermóide das estruturas de revestimento bucal.
PALAVRAS-CHAVE: 4-nitroquinolina 1-óxido; survivina; carcinoma de células
escamosas; animais; estudo comparativo.
12
1 INTRODUÇÃO
De 90 a 96% de todas as neoplasias malignas de boca
são representadas pelos carcinomas epidermóides (PINTO & CAVALARI
87
, 2002). Assim, o carcinoma epidermóide (CE) tem papel importante
dentre as doenças que acometem o complexo maxilo-mandibular, uma
vez que, se não realizado um diagnóstico precoce, é grande a
probabilidade de culminar com a morte do paciente.
Desde o trabalho de Salley
100
(1954), primeiro a
desenvolver um modelo animal de carcinogênese intrabucal, muitos
outros trabalhos têm sido desenvolvidos para um melhor entendimento,
tanto dos mecanismos da carcinogênese, como também dos fatores
etiológicos, prognósticos e de tratamento das neoplasias malignas das
estruturas de revestimento da boca (MOGNETTI et al.
75
, 2006).
Dentre os animais de laboratório, os ratos têm sido
amplamente utilizados como modelos de carcinogênese experimental
intrabucal, sendo o carcinógeno administrado a 4-nitroquinolina 1-óxido
(4NQO), agente alquilante que funciona como carcinógeno completo, isto
é, induz a iniciação e a progressão neoplásica (VERED et al.
121
, 2004).
A agressividade do CE no complexo maxilo-mandibular
reflete-se na sua capacidade proliferativa, na sua capacidade de invasão
de outros tecidos e na sua capacidade de gerar metástases. Os exames
histopatológicos de rotina costumam ser bastante subjetivos quanto à
definição do grau de malignidade dessas lesões, muitas vezes
dificultando a avaliação do prognóstico e de sobrevida do paciente.
Técnicas de histoquímica e imunoistoquímica vêm sendo
empregadas como marcadores das atividades proliferativas e apoptóticas
do CE. A utilização destes marcadores tem sido importante no
entendimento das alterações celulares, e tem possibilitado diferenciar
13
estágios de atividade e graus de malignidade de várias doenças, tornando
os exames mais precisos (JORDAN et al.
45
, 2002).
A survivina é uma proteína pertencente a família das
proteínas inibidoras de apoptose (IAP – do inglês Inhibitor of Apoptosis
Protein), e o aumento da sua expressão nas neoplasias tem sido
relacionada à resistência apoptótica (GROSSMAN et al.
37
, 2001), além de
estar vinculada com um pior prognóstico, diminuição da resposta
terapêutica da neoplasia aos tratamentos radio e quimioterápicos, e maior
agressividade da lesão (REED
94
, 2001).
Diante do exposto e da escassez de estudos
imunoistoquímicos na carcinogênese experimental em mucosa bucal de
ratos Wistar, torna-se válido avaliar as marcações imunoistoquímicas,
fazendo uso dos anticorpos contra a survivina, proteína inibidora de
apoptose (IAP), no modelo de carcinogênese experimental em mucosa
bucal de ratos Wistar, utilizando-se a 4NQO dissolvida na água de beber,
como carcinógeno.
14
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Carcinoma epidermóide
O carcinoma epidermóide (CE) que acomete as estruturas
de revestimento da boca é a sexta neoplasia maligna mais prevalente.
(PARKIN et al.
86
, 2005). Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer
(INCa), no Brasil a boca é a sexta localidade mais atingida por neoplasias
malignas entre os homens, e a oitava, entre as mulheres. Observa-se
uma estimativa de aproximadamente 13.470 novos casos em nosso país
para o ano de 2006 (BRASIL
15
, 2006).
Cerca de 90% de todas as neoplasias malignas do
complexo maxilo-mandibular é constituída pelos CE (DÖBROSSY
27
,
2005). O CE cujo epitélio neoplásico assemelha-se ao da epiderme,
também é denominado carcinoma espino-celular e carcinoma de células
escamosas (NEVILLE et al.
80
, 1998; TOMMASI
120
, 2002).
Certas substâncias contidas no tabaco, fumado ou não,
estão relacionadas a várias doenças, entre as quais o câncer bucal, os
quais poderiam ser prevenidos com a restrição da exposição a estas
substâncias (JEFFERIES & FOULKES
42
, 2001; AMERICAN SOCIETY OF
ONCOLOGY
8
, 2003). Além do tabaco, outro fator ambiental muito
importante na etiologia do CE é o álcool, funcionando de maneira
sinérgica ao tabaco (CLOOS et al.
18
, 1996; JEFFERIES & FOULKES
42
,
2001; DÖBROSSY
27
, 2005; STEWART & COATES
113
, 2005).
O CE que acomete a boca apresenta altos índices de
recorrência e metástases, fatores estes que possuem influência direta na
sobrevida, bem como na qualidade da vida dos pacientes que não foram
a óbito. Destarte, o diagnóstico precoce é de fundamental importância,
15
uma vez que pode direcionar o destino do paciente para a cura desta
enfermidade (KANOJIA & VAIDYA
46
, 2006).
Dentre as estratégias para o combate do aumento da
incidência do CE, pode-se destacar a prevenção primária, através da
mudança no estilo de vida dos pacientes, como os tratamentos para o
vício do cigarro e do álcool (CLOOS et al.
18
, 1996; DÖBROSSY
27
, 2005),
e a quimioprevenção, relacionada com o emprego de substâncias
capazes de retardar, ou mesmo inibir o processo de carcinogênese (SUN
et al.
114
, 2004; LIPPMAN et al.
60
, 2005).
Parâmetros como o tamanho da lesão, comprometimento
de linfonodos regionais e metástases à distância são fatores
determinantes a serem considerados quando o clínico se depara com um
paciente acometido por uma neoplasia maligna. A quantificação e a
qualificação destes fatores recebe o nome de estadiamento clínico. A
utilização do estadiamento preconizado pela União Internacional de
Combate ao Câncer (UICC), órgão da Organização Mundial de Saúde
(OMS) é consagrada na literatura mundial. Este sistema conhecido
internacionalmente como TNM, avalia clinicamente o tamanho da lesão e
a presença ou não de invasão às estruturas adjacentes (T), envolvimento
ou não de linfonodos regionais (N) e a presença ou não de metástase (M).
A somatória destes itens determina o estágio da neoplasia (SOBIN et
al.
110
, 1997).
O CE que acomete as estruturas de revestimento bucal é
um processo que envolve várias etapas, resultando em alterações
genéticas, epigenéticas e metabólicas, conseqüentes à exposição aos
carcinógenos ambientais (LIPPMAN et al.
60
, 2005).
16
2.2 Carcinogênese
Para uma adequada conceituação e compreensão das
neoplasias malignas é primordial o conhecimento atualizado dos
mecanismos celulares relacionados com o ciclo celular normal, uma vez
que a perda da homeostasia pode gerar o desenvolvimento do processo
da carcinogênese.
Chama-se carcinogênese o processo de conversão de
uma célula normal em uma célula maligna, sendo que os agentes
indutores desse processo são denominados carcinógenos (WILLIAMS
131
,
2001; LOUREIRO et al.
65
, 2002).
Em espécies multicelulares, o ciclo de divisão celular é
fundamental, sendo essencial tanto à proliferação e diferenciação celular,
quanto à substituição de células danificadas, as quais se tornaram
deficientes funcionalmente, ou que foram perdidas pelo processo de
apoptose. Embora o processo de renovação e a morte celular pareçam
ser opostos e contraditórios, os dois processos possuem alguma relação,
isto é, muitas proteínas promotoras da proliferação celular possuem
também atividades pró-apoptóticas (EVAN & LITTLEWOOD
29
, 2001).
A replicação do DNA e a posterior segregação dos
cromossomos em duas células filhas são as fases mais importantes do
processo de divisão celular. Ocorrendo falhas nestas fases,
provavelmente as células oriundas desta divisão poderão apresentar
alterações no seu conteúdo genético, que podem ser perpetuadas pelas
gerações de células futuras (OMELYANCHUK et al.
85
, 2004).
Dois períodos que se repetem constantemente no ciclo
celular, sendo eles a interfase e a mitose (fase M), constituem o processo
básico de divisão celular. O período que se caracteriza por uma intensa
atividade biossintética, sendo o mais longo do ciclo, é denominado
interfase; que foi subdividida pelos pesquisadores em três fases: G1, S e
17
G2. A fase G1 (G = do inglês gap: intervalo) corresponde ao intervalo
entre o término da mitose e o início da síntese de DNA, ocorrendo a
síntese de RNA e de proteínas, com recuperação do volume normal da
célula, que foi reduzido à metade na mitose. Na fase S ocorre a síntese
de DNA e a duplicação dos centríolos. E na fase G2 as células acumulam
energia para ser utilizada durante a mitose e sintetizam tubulina para
formar os microtúbulos do fuso mitótico. Já as células do tecido que não
se renovarão saem do ciclo celular e passam para a fase G-zero
(TESSEMA et al.
116
, 2004).
A mitose propriamente dita ou fase M é o período mais
curto do ciclo celular, ocorrendo a condensação dos cromossomos e o
seu alinhamento no fuso mitótico, terminando com a separação das
cromátides irmãs, recebendo cada célula filha um jogo cromossômico
igual ao da célula mãe (OMELYANCHUK et al.
85
, 2004).
O ciclo celular é dependente tanto do ambiente
extracelular quanto do intracelular, respondendo a sinais transmitidos por
fatores de crescimento, hormônios, fatores de adesão celular, entre outras
proteínas (GOODGER et al.
35
, 1997; MICHALIDES
73
, 1999); proteínas as
quais regulam a atividade de outras, ativando-as ou inibindo-as,
proporcionando o desenvolvimento do ciclo celular (ALBERTS et al.
3
,
1994; SHEER
108
, 1996).
Intracelularmente, interrupções em pontos de controle
estratégicos denominados pontos de checagem (do inglês checkpoints),
que acontecem entre as fases G1 e S, G2 e M, têm a finalidade de
impedir a perpetuação de algum dano genético (OMELYANCHUK et al.
85
,
2004). Os pontos de checagem são sinais internos da célula que
asseguram que os estágios do ciclo celular tenham sido corretamente
completados antes do próximo estágio de divisão iniciar (ALBERTS et al.
3
,
1994; GOODGER et al.
35
, 1997; MICHALIDES
73
, 1999). O
desenvolvimento da maioria das neoplasias está relacionado com a
18
mutação do gene p 53, que é responsável pelo ponto de checagem entre
as fases G1 e S (OMELYANCHUK et al.
85
, 2004).
Normalmente, as células proliferam somente quando
novas células são necessárias. Contudo as células neoplásicas proliferam
independentemente da necessidade de renovação celular; isso denota
que mutações importantes aconteceram em genes que codificam
proteínas reguladoras do ciclo celular (LOURO
67
, 2002).
Vários são os genes que, quando alterados, participam de
processos carcinogenéticos. Em condições normais esses genes
desempenham importantes papéis em vias relacionadas à ativação ou à
proliferação celular (SABBAGA
99
, 2000; NAGPAL & DAS
79
, 2003).
Durante a carcinogênese, existem três classes de genes
principalmente envolvidos com o desenvolvimento da neoplasia: proto-
oncogenes e genes supressores de neoplasia (PITOT
88
, 1993; TESSEMA
et al.
116
, 2004), somando-se os genes reguladores da apoptose e os
genes de reparo do DNA(WEISS
130
, 2000).
Os proto-oncogenes promovem a proliferação celular
ordenada (TODD et al.
119
, 1997). Nas células normais, a expressão
desses genes é rigorosamente regulada. Numa célula maligna, esta
progressão ordenada (ciclo celular, mitose e diferenciação) é parcialmente
alterada ou perdida, quando um ou mais proto-oncogenes é mutado para
oncogene (NAGPAL & DAS
79
, 2003).
Oncogenes podem resultar de mutações ou deleções
ocorridas em proto-oncogenes, sendo denominado c-oncogenes (c-onc);
ou podem ser decorrentes de transduções virais, sendo então
denominados v-oncogenes (v-onc). Na presença de danos graves e
irreparáveis no DNA, a preponderância dos oncogenes em relação aos
proto-oncogenes podem inibir a apoptose (LOURO
66
, 2002).
Enquanto os proto-oncogenes promovem a proliferação
celular ordenada, a atuação dos genes supressores de neoplasia mantém
essa proliferação sob controle, restringindo o crescimento celular,
19
funcionando assim como um antagonista direto ou indireto da função dos
proto-oncogenes (TESSEMA et al.
116
, 2004).
Diversos genes supressores de neoplasias participam dos
pontos de verificação, e a inativação ou deleção deles parecem ser uma
das principais causas da perda da estabilidade genética, as quais
permitem o acúmulo de erros, sem a indução de sistemas de reparo, sem
interrupção do ciclo ou apoptose (THOMPSON
117
, 1995). Estes genes
podem ser inativados por diversos mecanismos, dentre os quais,
mutações pontuais, deleções, ligações com proteínas virais ou celulares
(NAGPAL & DAS
79
, 2003).
O entendimento da carcinogênese baseia-se na
compreensão dos eventos que acontecem num aspecto temporal e
podem ser divididos em três estágios: iniciação, promoção e progressão
(WEINBERG
128
, 1989; MORI et al.
77
; 1999; SUN et al.
114
, 2004).
A iniciação é causada por uma alteração irreversível do
DNA, podendo ser proporcionada pela reação desta molécula com
substâncias carcinogênicas (PITOT
88
, 1993; LOUREIRO et al.
65
, 2002).
Além dessa alteração do DNA, é necessário que haja a proliferação
celular, de modo que a mutação inicial seja perpetuada (WILLIAMS
131
,
2001).
Mutação é a alteração do material genético que resulta
em erros na duplicação, no reparo e na recombinação do DNA (BOSSO &
FROES
13
, 2002). As mutações podem ocorrer espontaneamente,
originando-se como resultado do próprio metabolismo celular, ou por meio
das interações com o meio ambiente pela ação de agentes físicos,
químicos e/ou biológicos (WEISBURGER
129
, 1994). Nos organismos
multicelulares, a mutação em células somáticas pode provocar danos
irreparáveis em genes que regulam a proliferação celular, proporcionando
o desenvolvimento de neoplasias malignas (EVAN & LITTLEWOOD
29
,
2001).
20
Em homeostasia as células lançam mão de mecanismos
fisiológicos de defesa, como detoxificação dos carcinógenos, reparo do
DNA e da ação deletéria que as células em mutação, ou já mutadas,
poderiam exercer; perfazendo assim uma linha orgânica de defesa
importante contra a iniciação das neoplasias (WEINBERG
128
, 1989;
HARTWELL & KASTAN
40
, 1994; SCHWARTZ et al.
104
, 2000).
As variações dos processos acima descritos podem ser
observadas em indivíduos diferentes, desempenhando um papel crucial
na carcinogênese ambiental, demonstrando a variabilidade da resposta
entre indivíduos (ROSSIT & FROES
98
, 2002).
O segundo estágio é conhecido como promoção, e nessa
fase o estímulo da divisão celular parece ser um componente importante
(PITOT
88
, 1993). A promoção envolve a seleção e expansão das células
iniciadas; nesta etapa, o material genético alterado da célula iniciada
modifica a expressão dos genes que regulam a diferenciação e o
crescimento celular. Essa fase pode ser reversível através da atuação de
uma gama de mecanismos, entre eles, a apoptose, também conhecida
como morte celular programada e a ação da defesa imunológica, além da
quimioprevenção (SUN et al.
114
, 2004).
Na seqüência, o processo pode caminhar para o estágio
final que é chamado progressão, que possui caráter irreversível e se
caracteriza pela instabilidade cariotípica (anaploidia) e o desenvolvimento
da neoplasia maligna instalada. Ocorre uma perda no controle do
crescimento celular, invasão de tecidos adjacentes e o desprendimento
de células neoplásicas propiciando as metástases (PITOT
88
, 1993).
Hanahan & Weinberg
39
(2000) sugeriram que o genótipo
de uma célula neoplásica se relaciona com seis alterações essenciais na
fisiologia celular, as quais em conjunto levam ao desenvolvimento da
neoplasia, sendo elas: auto-suficiência nos sinais de crescimento com
insensibilidade aos sinais inibitórios do crescimento; fuga da apoptose;
21
potencial de replicação ilimitado; angiogênese sustentada; invasão
tecidual e, por último, metástase.
Os carcinógenos são geralmente substâncias eletrofílicas,
desta forma, são atraídos por sítios moleculares de alta densidade
eletrônica, como as bases nitrogenadas que fazem parte do DNA, e assim
formando adutos (WILLIAMS
131
, 2001). Esses por sua vez, são capazes
de promover a mutação dos genes supressores de neoplasias e dos
proto-oncogenes em oncogenes, iniciando o processo de carcinogênese
(LOUREIRO et al.
65
, 2002).
2.3 Carcinogênese química
Na carcinogênese devem ser considerados fatores físicos
e biológicos, os quais podem agir de maneira isolada ou conjunta
(PITOT
88
, 1993).
Entre os agentes físicos existem formas de energia que
possuem propriedades carcinogênicas, das quais se destacam as
radiações eletromagnéticas, e dentre elas as mais importantes são a
radiação ultravioleta e a radiações ionizantes (raios x, gama) e, assim
sendo, são os mais conhecidos e estudados (BOSSO & FROES
13
, 2002).
O entendimento da carcinogênese biológica está bem
estabelecido em casos de câncer do cérvix uterino, na qual existe relação
causa/efeito da ação do vírus do papiloma humano (human papilloma
vírus – HPV) (BOSH et al
12
. 2002).
Para uma determinada substância ser considerada
carcinogênica deve ser capaz de interagir com os componentes celulares,
como as proteínas, lipídios e, principalmente, com o material genético
representado pelos ácidos nucléicos, DNA e RNA (WEISBURGER
129
,
1994).
22
Além dos fatores anteriores, as substâncias químicas
capazes de induzir o genoma celular às alterações que culminam com a
carcinogênese, são classificadas como carcinógenos ou substâncias
carcinogênicas (LOUREIRO et al.
65
, 2002).
Existem três tipos de carcinógenos químicos, aqueles
cujas estruturas moleculares permitem ação direta com o material
genético, conhecidos como carcinógenos de ação direta; os
caracterizados por substâncias que dependem da ativação metabólica
prévia, denominados carcinógenos de ação indireta, e, finalmente, os
carcinógenos epigenéticos ou não genotóxicos, os quais parecem não
reagir com o material genético das células (WILLIAMS
131
, 2001).
Poucos são os carcinógenos que têm ação direta, estes
possuem um potencial de reatividade elevado, o que faz com que sejam
bastante instáveis. Exemplos destes compostos são: metil-metano
sulfonato, ciclofosfamida, etc. Essas substâncias levam a alquilação de
macromoléculas celulares, sempre na posição sete da guanina nos ácidos
nucleicos, sem a necessidade de ativação metabólica. A maioria dos
carcinógenos de ação direta não representa risco expressivo para a
população em geral, uma vez que a reatividade elevada destes
compostos pode fazer com que os mesmos sejam neutralizados pela
reação com água ou sejam metabolizados antes de reagirem com
receptores celulares importantes (WEISBURGER
129
, 1994). Apesar do
exposto, estas substâncias têm sido muito estudadas, principalmente
devido às propriedades terapêuticas que as mesmas vêm demonstrando
tanto no tratamento quimioterápico das neoplasias, quanto no tratamento
de algumas doenças imunológicas – por exemplo, artrite reumatóide e
granulomatose de Wegener (KUMAR et al.
55
, 2005).
Já os carcinógenos de ação indireta são mais estáveis no
meio ambiente que os anteriores, isso faz com que haja um maior contato
com a população em geral. Estes agentes também são chamados de pró
ou pré-carcinógenos, e requerem uma ativação metabólica prévia à
23
interação com macromoléculas celulares. Como a ação destes dependerá
de ativações prévias existem diferenças nas ações em relação à espécie,
sexo, idade, dieta, presença ou ausência de enzimas indutoras ou
inibidoras, estado imunológico, entre outros fatores. Por exemplo, os
homens e mulheres podem ter respostas diferentes aos carcinógenos,
fenômeno que pode estar relacionado com uma maior ou menor
quantidade de enzimas indutoras nos homens, o que diferiria a resposta
frente a uma determinada substância nas mulheres. Recém-nascidos
geralmente são mais sensíveis aos carcinógenos porque geralmente
possuem níveis mais baixos de enzimas que detoxificam os mesmos
(WEISBURGER
129
, 1994).
A reação metabólica inicial dos carcinógenos faz com que
haja produtos de detoxificação, ou formas próximas do composto ativado,
ou ainda a forma reativa do carcinógeno. O sistema enzimático
responsável pela maioria das reações metabólicas é o sistema P-450
(KUMAR et al.
55
, 2005).
Os carcinógenos genotóxicos reagem diretamente com o
material genético celular, ou são convertidos pelo metabolismo em
reagentes intermediários que posteriormente formam adutos com o
material genético. Sendo os carcinógenos de ação direta e indireta
pertencentes a esta classe (WILLIAMS
131
, 2001).
Já os carcinógenos não genotóxicos ou epigenéticos
parecem não reagir com o DNA, embora possam formar adutos com
outros constituintes celulares. Um exemplo desses compostos é o ácido
tricloroacético (WEISBURGER
129
, 1994). Certos genes supressores de
neoplasia podem ser inativados não pelas alterações estruturais, mas
pela hipermetilação ocasionada por seqüências promotoras sem
modificações na seqüência do DNA, o que caracteriza modificações
epigenéticas (YAKUSHIJI et al.
134
, 2003).
Dentre as substâncias químicas que possuem ação
carcinogênica, um grupo recebe destaque especial, os hidrocarbonetos
24
aromáticos policíclicos (polycyclic aromatic hydrocarbons – PAHs), os
quais são encontrados em abundância no ambiente ocupacional e
doméstico (DIGIOVANNI
26
, 1994).
Resumidamente, o metabolismo dos PAHs é mediado
pela aril-hidrocarboneto hidroxilase (AHH) – uma das muitas
monoxigenases de função mista – que participam das reações de
ativação metabólica da fase I do metabolismo celular. Uma vez em
contato com o organismo, esses compostos são oxidados a epóxidos
(metabólitos primários), que são efetivamente inativados pela formação de
conjugados, com pouca ou nenhuma oportunidade de reagirem com o
DNA. No entanto, se esse epóxido for hidratado a diidrodiol em um evento
metabólico secundário, o mesmo composto sofre nova oxidação (terceiro
passo metabólico), dando origem ao diidrodiol epóxido, forma genotóxica
final altamente reativa e, portanto, com grande facilidade de reação com o
DNA (BOSSO & FROES
13
, 2002).
No que se refere à ligação dos PAHs ao DNA mais de
90% se dá por alquilação causada pela forma genotóxica final originada
no metabolismo da maioria dos PAHs, ocorrendo no grupo amino
exocíclico da guanina (COLON et al.
19
, 1999).
Um carcinógeno bastante empregado na carcinogênese
experimental quimicamente induzida é a 4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO),
agente alquilante, com a capacidade de induzir estresse oxidativo,
contribuindo para a morte ou mutagênese da célula a qual teve contato. É
classificado como carcinógeno indireto, pois é necessária uma ativação
metabólica prévia para derivar a 4-hidroxiaminoquinolina 1-óxido, a qual
seguida por uma acetilação, resulta em composto com afinidade pelo
DNA, formando monoadutos quinolina-purina estáveis nas posições
exocíclicas N-2 da guanina e N-6 da adenina (RAMOTAR et al.
90
, 1998).
Assim como outros carcinógenos presentes no tabaco, os produtos
metabólicos da 4NQO ligam-se ao DNA predominantemente na região de
guanina (KANOJIA & VAIDYA
46
, 2006).
25
2.4 Modelos animais
As tentativas iniciais para a produção de carcinogênese
experimental intrabucal fracassaram, sendo a mucosa bucal considerada
mais resistente à ação de carcinógenos químicos, comparando-se com a
pele, local este que se obtinha, com certa facilidade, carcinomas,
pincelando a área com alcatrão de carvão (EVESON
30
, 1981).
Salley
100
(1954) foi o pioneiro na indução de carcinomas
experimentais intrabucais, quando investigava os efeitos dos
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos na mucosa da bolsa jugal de
hamsteres. O autor utilizou o 9-10 dimetil 1,2 benzantraceno (DMBA), o
20 metil-colantreno (20MC) e o 3,4 benzopireno (3,4 BP) dissolvidos em
acetona ou benzeno. Estes agentes foram pincelados na bolsa de
bochecha três vezes por semana, durante dezesseis semanas e
posteriormente os animais foram observados por mais nove semanas. O
DMBA dissolvido em acetona mostrou-se o mais efetivo, e o primeiro
carcinoma apareceu após sete semanas de aplicação.
Num trabalho posterior, Salley
101
(1957) descreveu
mudanças iniciais ocorridas na mesma mucosa de bolsa jugal de
hamsteres, após o pincelamento de DMBA. Histologicamente, a mucosa
bucal passou por quatro estágios antes da transformação maligna, sendo
eles: inflamação, degeneração caracterizada pela necrose, regeneração e
hiperplasia. Observou macroscopicamente a formação de placas brancas
semelhantes a leucoplasia bucal em humanos, as quais se
desenvolveram após oito ou nove aplicações de DMBA.
A mucosa bucal dos hamsteres como um todo tem uma
resistência maior à ação dos carcinógenos químicos em relação à mucosa
da bolsa jugal. Salley
100
(1954) encontrou carcinomas ocasionalmente na
região de palato, língua, esôfago e estômago, provavelmente resultado de
um derramamento do carcinógeno nestas áreas, quando da aplicação. O
26
modelo de maior sucesso na indução de carcinogênese lingual em
hamsteres foi desenvolvido por Fujita et al.
32
(1973), autores que
aplicaram DMBA em bordo lingual, posterior a uma raspagem e ulceração
da área com broca utilizada em endodontia. Todos os animais
desenvolveram CE num período que variou entre 13 e 25 semanas.
Sucedendo os trabalhos de Salley
100
(1954) e Fujita et
al.
32
(1975), muitos outros autores utilizaram os hamsteres como modelos
experimentais, utilizando principalmente o DMBA como carcinógeno, e
fazendo a indução em mucosa da bolsa de bochecha e de bordo lingual
(MORRIS
78
, 1961; AL-ANI & SHKLAR
2
, 1966; DACHI
21
, 1967; MAREFAT
& SHKLAR
71
, 1977; MAREFAT
70
, 1985; KITAKAWA
52
, 2003;
MAGALHÃES
68
, 2004; MONTEIRO
76
, 2004)
Além dos hamsteres, outros animais têm sido utilizados:
como os camundongos (LEVY, 1958
57
; GOLDHABER
34
, 1957; PROTZEL
et al.
89
, 1964; STEIDLER & READE
111-2
, 1984 e 1986) e os ratos, animais
muito utilizados na atualidade, pela semelhança do processo de
carcinogênese com os seres humanos (WALLENIUS,
125
1966; GIUNTA &
SHKLAR
33
, 1972; WALLENIUS & LEKHOLM
126-7
, 1973; YAMAMURA et
al.
136
, 1975; WONG & WILSON
133
, 1983; OHNE et al.
84
, 1985; WILSON et
al.
132
, 1995; KAPLAN et al.
47
, 2001; RIBEIRO et al.
97
, 2004; RIBEIRO
95
,
2005; RIBEIRO et al.
96
, 2005; VERED et al.
121
, 2005).
Com relação aos ratos, as tentativas iniciais para a
indução de carcinomas também encontraram bastante dificuldade.
Wallenius
125
(1966) mostrou que somente 30% dos ratos desenvolveram
CE após o pincelamento de DMBA durante um período de 16 meses.
Porém, o desenvolvimento de uma metodologia confiável
para a indução carcinomatosa em ratos foi estabelecido no trabalho de
Wallenius & Lekholm
127
(1973), fazendo uso do carcinógeno 4NQO, que é
hidrossolúvel, obtendo-se carcinomas experimentais em todos os ratos
num período de sete meses. Setenta e cinco por cento dos animais
27
desenvolveram carcinomas no dorso da língua, e 20% na gengiva ou
estômago (WALLENIUS & LEKHOLM
126
, 1973).
Yamamura et al.
136
(1975), na tentativa de prolongar a
ação dos carcinógenos químicos, implantaram os mesmos em bolsa na
mucosa de lábio de ratos criada cirurgicamente. Os carcinógenos
utilizados foram o DMBA, o 20MC cristalino e o N-metil-n-nitrosoguanidina
cristalino. Estes agentes induziram uma variedade de neoplasias
incluindo: papilomas, carcinomas, neurofibromas, linfangiomas,
hemangiomas e hemangiossarcomas, sendo assim um modelo de valor
limitado para o estudo de CE.
Ribeiro et al.
97
(2004) utilizando teste do cometa no
modelo de carcinogênese bucal em ratos, observaram que após quatro
semanas de administração da 4NQO, já existiam danos primários no DNA
na mucosa bucal aparentemente normal, e esses danos aumentavam de
acordo com a gravidade das lesões histopatológicas observadas.
Ribeiro
95
(2005) utilizando ratos Wistar e 4NQO dissolvido
na água como carcinógeno, concluiu que esta substância foi efetiva na
carcinogênese, sendo padronizada neste modelo vinte semanas para o
desenvolvimento de carcinoma, quando da utilização de solução aquosa a
50 ppm de 4NQO como água de beber.
O modelo de indução através da 4NQO em ratos
possibilita a coleta de dados num aspecto temporal do processo de
carcinogênese, possibilitando assim o desenvolvimento de estudos para o
desenvolvimento de biomarcadores e agentes quimiopreventivos no
estudo de carcinogênese bucal (KANOJIA & VAIDYA
46
, 2006).
28
2.5 Apoptose
A multiplicação mitótica para o crescimento e renovação
dos tecidos é um processo essencial nos organismos vivos. Porém, o
processo de morte celular programada, ou apoptose, que é rápido e não
deixa vestígios, também tem grande importância para as funções normais
do organismo (THOMPSON
117
, 1995; CUMMINGS et al.
20
, 1997).
A apoptose é um dos eventos celulares intimamente
relacionados com os processos de desenvolvimento, resposta celular
frente ao estresse, envelhecimento, e doenças nos eucariotos
multicelulares, eliminando células que não possuem mais utilidade
(ASHKENAZI & DIXIT
10
, 1998; ARAVIND et al.
9
, 2001; LORO et al.
64
,
2003). Num ser humano adulto cerca de 50 a 70 bilhões de células
entram em apoptose por dia (DELHALLE et al.
24
, 2003).
A apoptose foi descrita pela primeira vez por Kerr et al.
49
(1972), e o seu aspecto morfológico é caracterizado pela condensação e
fragmentação da cromatina (picnose), invaginação da membrana
plasmática, retração da célula, com posterior fragmentação da mesma,
resultando na formação de corpos apoptóticos os quais são fagocitados
sem gerar resposta inflamatória, todo este processo se completa em 30 a
60 minutos (THORNBERRY & LAZEBNIK
118
, 1998, REED
93
, 1999).
A descoberta de genes específicos da morte celular
programada, que têm a função tanto de inibir, quanto promover a
apoptose foi decifrado pela primeira vez no neumatóide Caenorhanditis
elegans (C.elegans) (ASHKENAZI & DIXIT
10
, 1998; DELHALLE et al.
24
,
2003). Sendo no homem mais de 200 genes, ou cerca de 0,6% do
genoma humano, relacionados com a regulação da apoptose (ARAVIND
et al.
9
, 2001).
29
O controle da execução da apoptose envolve eventos
moleculares em cascata que podem ser iniciados de diferentes maneiras,
culminando na ativação das proteínas da família das cisteinilproteases,
também chamadas de caspases – onde a letra “c”, refere se à protease
cisteína, uma enzima com cisteína no sítio ativo, e “aspase”, à preferência
por clivagem adjacente a resíduos aspartato (KUMAR et al.
55
, 2005). Já
foram descritas até o momento pelo menos 14 tipos de caspases, em
células humanas e de camundongos, sendo que a ativação destas leva,
direta ou indiretamente, a apoptose. Elas podem ser divididas
funcionalmente em dois grupos: iniciadores e executores (KASIBHATLA &
TSENG
48
, 2003).
Existem duas vias principais de sinalização para iniciação
da apoptose nas células dos mamíferos: a extrínseca, mediada por
receptores de membrana celular, e a intrínseca, mediada pelos ativadores
de apoptose mitocondriais (MALAGUARNERA
69
, 2004).
Uma variedade de eventos chaves da apoptose estão
focados na mitocôndria, incluindo a liberação de ativadores da caspase e
as participações das proteínas pró e anti-apoptóticas, com exemplo a
família Bcl-2 (GREEN & REED
36
, 1998). A presença de sinais
extracelulares para a morte podem ser reconhecida pelos receptores
celulares de morte, e assim, ativar imediatamente o maquinário celular
intrínseco da apoptose (ASHKENAZI & DIXIT
10
, 1998).
Disfunções nos mecanismos apoptóticos podem levar ao
desenvolvimento de inúmeras doenças, as quais podem ser divididas em
dois grandes grupos: aquelas doenças associadas com aumento de
apoptose, e conseqüente excessiva morte celular, onde se enquadram as
doenças neurodegenerativas, e aquelas associadas com apoptose
deficiente, que permitem células anormais viáveis, dentre as quais se
inserem as neoplasias malignas e as doenças auto-imunes
(THOMPSON
117
, 1995; ASHKENAZI & DIXIT
10
, 1998).
30
Conforme os eventos descritos acima, a apoptose tem
papel significativo como defensor do organismo no caso do
desenvolvimento das neoplasias malignas. Uma vez que qualquer célula
pode ativar seu programa de autodestruição quando acontecem
modificações no seu conteúdo genético. Por estas razões, para acontecer
o desenvolvimento da neoplasia maligna, a célula iniciada tem que
vencer, entre outros obstáculos, os mecanismos apoptóticos (RAVI et al.
91
, 2001; YU & ZHANG
138
, 2003).
Falhas na apoptose contribuem decisivamente para o
processo de carcinogênese, criando um ambiente permissivo de
instabilidade genética com acúmulo de mutações, promovendo maior
resistência da célula contra o sistema imunológico, inibindo a realização
dos pontos de checagem no ciclo celular que levariam a apoptose,
reduzindo a dependência celular do oxigênio e nutrientes, facilitando a
sobrevida das células de maneira independente dos fatores de
crescimento e hormônios, promovendo uma certa independência as
células neoplásicas, e também conferindo resistência das neoplasias em
relação a radiação e as drogas antineoplásicas citotóxicas. Haja vista que
o tratamento com drogas quimioterápicas antineoplásicas tradicionais
objetivam efeitos citotóxicos que podem culminar com os fenômenos
relacionados à apoptose; por este motivo, células neoplásicas que
possuem modificações no controle da apoptose, podem apresentar uma
certa resistência a esta modalidade terapêutica (REED
92-3
, 1997 e 1999;
SCHOELCH et al.
103
, 1999; SHANGARY & JOHNSON, 2003;
MALAGUARNERA
69
, 2004).
31
2.6 Survivina
A família das proteínas inibidoras de apoptose (IAP – do
inglês inhibitor of apoptosis protein) é composta por proteínas com
atividade antiapoptótica que se ligam e inibem as caspases 3, 7 e/ou 9,
mas não 8. Existem evidências que as IAP modulam também a divisão
celular, a progressão do ciclo celular e a via de trandução de sinais
(SCHIMMER
102
, 2004). Estas proteínas foram descobertas inicialmente
nas baculoviroses, nas quais estavam envolvidas na supressão da
resposta de morte celular do hospedeiro contra a infecção viral
(DEVERAUX & REED
25
, 1999), e se caracterizam pela presença de uma
ou até três cópias do domínio de aproximadamente setenta aminoácidos,
chamado repetições IAP do baculovírus (BIR – do inglês baculoviral IAP
repeat), que são essenciais para interação com as caspases, e assim
exercerem funções antiapoptóticas (SCHIMMER
102
, 2004).
Dentre as proteínas IAP de classe 3, encontra-se a
survivina, que contém um único domínio BIR (SCHIMMER
102
, 2004),
sendo assim a menor das IAPs (LI & ALTIERI
58
, 1999). A survivina é uma
proteína com dupla função, inibe a apoptose e regula a divisão celular
(AMBROSINI et al.
6
, 1997). Enquanto tecidos embrionários contém
survivina em grandes quantidades, os tecidos maduros diferenciados não
a possuem, com exceção do timo, células epiteliais da camada basal e
células endoteliais (GROSSMAN et al.
37
, 2001; REED
94
, 2001; LO MUZIO
et al.
62
, 2003; BOWEN et al.
14
, 2004; JOHNSON & HOWERTH
44
, 2004;
SCHIMMER
10
, 2004; ZAFFARONI et al.
139
, 2005).
Survivina foi descoberta em 1997, quando se estava
analisando a biblioteca do genoma humano através do uso de cDNA
(DNA complementar) do EPR-1 (do inglês effector cell protease receptor-
1) (AMBROSINI et al.
6
, 1997). O gene da survivina humana possui 15 kb,
e está localizada no cromossomo 17, banda q25 (AMBROSINI et al.
7
,
32
1998; CHIOU et al.
17
, 2003). Este gene codifica a proteína survivina com
16,5 kD e 142 aminoácidos (VETTER et al.
122
, 2005; ZAFFARONI et al.
139
,
2005). Já o gene da survivina de camundongos localiza-se na região
telomérica do cromossomo 11, banda E2 (YAMAMOTO & TANIGAWA
135
,
2001).
Apesar da maior parte das células mutadas serem
inativadas no ponto de checagem entre as fases G1 e S, a survivina
demonstra esta atividade entre as fases G2 e M (OMELYANCHUK, et
al.
85
, 2004). No início da mitose, a survivina associa-se aos microtúbulos
do fuso mitótico, e a disfunção dessa interação resulta na perda da função
anti-apoptótica da survivina, e aumento da atividade da caspase 3. O
aumento da expressão da survivina no câncer pode transpor o ponto de
checagem apoptótico entre as fases G2 e M, em favor da progressão das
células transformadas durante a mitose (LI et al.
59
, 1998).
Yang et al.
137
(2004) encontraram que a survivina pode
ser essencial para a proliferação das células humanas normais,
contribuindo para segregação das cromátides irmãs adequadas e
formação e estabilização dos microtúbulos na mitose tardia. Entretanto,
esta proteína não é essencial para a sobrevivência das células normais.
No desenvolvimento dos neurônios do sistema nervoso central de
camundongos, a presença de survivina é crítica para o desenvolvimento
normal deste sistema sem que haja perda de neurônios, o que poderia
comprometer as funções normais do sistema (JIANG et al.
43
, 2005).
Grande parte dos estudos relacionados a survivina se dá
principalmente nas neoplasias malignas, porém para um melhor
entendimento das funções e mecanismos de ação desta proteína, o
estudo em tecidos normais é de grande valia. A análise de camundongos
em que o gene da survivina foi deletado das células tímicas, mostrou que
a mesma não é essencial para a apoptose das células T, porém é crucial
para a proliferação e maturação destas células, e assim ela é importante
para a manutenção da homeostasia no processo de desenvolvimento das
33
células T (XING et al.
124
, 1999). Num estudo também utilizando
camundongos, foi observado que a survivina é importante na maturação
das células precursoras dos eritrócitos e dos megacariócitos, porém tendo
efeitos antagônicos nessas duas células, sendo que o aumento da
expressão da survivina, antagonizou com o crescimento, maturação e
poliploidização dos megacariócitos, e não teve efeito no desenvolvimento
dos eritrócitos. Ao contrário, a redução da expressão da survivina,
interferiu no desenvolvimento dos eritrócitos, mas não dos megacariócitos
(GURBUXANI et al.
38
, 2005).
Uma variedade de neoplasias malignas apresenta
aumento da expressão da survivina, sugerindo a reativação deste gene
nos cânceres. Atualmente a expressão da proteína survivina nas
neoplasias está relacionada com um comportamento mais agressivo,
diminuição da resposta ao tratamento rádio e quimioterápico, além de
menor sobrevida quando comparados com os casos que não expressam
esta proteína (AMBROSINI et al.
7
, 1998; ALTIERI
5
, 2001; REED
94
,
2001;LO MUZIO et al.
62
, 2003; JOHNSON & HOWERTH
44
, 2004;
ZAFFARONI et al.
139
, 2005; XIANG et al.
123
, 2006). Segundo Mesri et al.
72
(2001) e Blanc-Brude et al.
11
(2003) a atuação sobre a survivina em nível
molecular pode resultar em atividades terapêuticas antineoplásicas em
duas vias: induzindo a apoptose nas células neoplásicas e suprimindo a
angiogênese.
Existem evidências que a survivina também tem um papel
importante na angiogênese, evento muito importante na progressão das
neoplasias malignas. O’Connor et al.
83
(2000) encontraram que a
expressão gênica da survivina pode induzir crescimento das células
endoteliais protegendo estas da apoptose durante a angiogênese. E
ainda, a manipulação de moléculas antagonistas dessa via, é uma
promissora fonte de estudo para a terapêutica do câncer.
Dentre as neoplasias que apresentam um aumento da
expressão da survivina, já foi observado nos casos de linfomas não
34
Hodgkin de alto grau, carcinoma de células escamosas do pulmão,
adenocarcinoma de pâncreas, cólon, mama e próstata, tanto pelas
técnicas de imunoistoquímica como pela hibridização in situ. Este
aumento per se nas neoplasias pode não ser um marcador de
transformação maligna, porém reflete uma resposta celular mais
complexa (AMBROSINI et al.
6
, 1997). Dohi et al.
28
(2004) observaram que
a survivina mitocondrial tem a propriedade de inibir a apoptose e assim,
promover a carcinogênese. Encontram-se frações de survivina
mitocondrial em várias neoplasias malignas, em oposição, não se
observou nos tecidos normais.
Nos casos de carcinomas gástricos, a expressão de
RNAm da survivina inicia-se em estágios iniciais da carcinogênese. E um
aumento da expressão do RNAm desta proteína pode estar relacionado
com um potencial de metástase para linfonodos em câncer gástrico
(MIYACHI et al.
74
, 2003).
No estudo da carcinogênese quimicamente induzida em
pele de camundongos transgênicos com expressão cutânea da survivina,
observou-se que apesar do paradoxal efeito negativo da survivina na
indução carcinogênica, uma vez que nos animais transgênicos houve uma
menor indução de CE quando comparados com animais normais; a
expressão da survivina preveniu a regressão dos papilomas e promoveu a
transformação desta para CE (ALLEN et al.
4
, 2003)
Diferenças na expressão da survivina entre os tecidos
normais e neoplásicos pode dar direcionamentos importantes no campo
da terapêutica em oncologia, principalmente com o avanço da terapia
gênica. Além disso, a survivina pode ser utilizada como um marcador
precoce das malignidades (SCHIMMER
102
, 2004), ou mesmo no caso de
marcador diagnóstico para a presença de neoplasias ocultas, como nos
estudos os quais encontraram-se níveis de survivina na urina
significativamente maiores nos pacientes com carcinoma de bexiga,
quando comparado com pacientes saudáveis (SMITH et al.
109
, 2001;
35
SHARIAT et al.
106-7
, 2004 e 2005). Entretanto, Davies et al.
22
(2005)
contestam a utilidade da survivina como um bom marcador na urina para
o diagnóstico de carcinoma de bexiga, afirmando que este marcador tem
um alto índice de falso-positivo na população sadia.
Nos CE que acometem as estruturas bucais, a survivina
ainda tem sido pouco estudada. O estudo pioneiro utilizando survivina nos
CE de boca foi conduzido por Lo Muzio et al.
61
(2001), os quais estudaram
a expressão da survivina em CE cutâneo e de boca, comparando com
tecidos sem lesão. Eles observaram que os tecidos normais não
expressaram este anticorpo, ao contrário dos casos de CE de pele (64%
dos casos) e CE de boca (56% dos casos), e observaram que a
positividade estava relacionada com neoplasias indiferenciadas, de
tamanho maior que 1,5 cm e associação com metástases para linfonodos.
Autores do mesmo grupo do trabalho anterior, estudando
agora as lesões cancerizáveis, observaram a expressão da survivina em
33% dos casos de lesões brancas que no acompanhamento não
evoluíram para o CE. Já naquelas que se transformaram em CE, houve
expressão em 94% dos casos. Assim eles concluíram que a expressão da
survivina é um evento inicial durante a carcinogênese bucal, e assim pode
ser usada como biomarcador para a identificação de lesões cancerizáveis
com alto risco para progressão em direção ao CE (LO MUZIO et al.
62
,
2003).
Tanaka et al.
115
(2003) investigaram a distribuição da
survivina nos casos de CE e lesões cancerizáveis, observando 58% das
neoplasias e 37% das lesões cancerizáveis foram positivas para a
survivina, e nenhuma marcação foi observada nos tecidos normais
correspondentes. Além disso, verificaram que a expressão gênica da
survivina pode ser regulada por mecanismos epigenéticos, pois não foi
observado metilação nos espécimes neoplásicos, ao contrário do tecido
normal, nos quais foi observado metilação desse gene.
36
Lo Muzio et al.
63
(2005) estudaram 78 casos de CE,
através da marcação imunoistoquímica da survivina, e concluíram que
este marcador pode identificar os casos de CE com fenótipo mais
agressivo e invasivo, podendo assim influenciar na decisão da terapia a
ser instituída no momento do diagnóstico.
Kim et al.
51
(2005) investigaram a expressão da survivina
nos linfonodos cervicais como indicador prognóstico nos pacientes
portadores do CE, encontraram que a marcação pela survivina nos
linfonodos destes pacientes, estava relacionada com uma menor
sobrevida do paciente. Além disso, a utilização da técnica molecular de
identificação do RNAm da survivina, pode identificar micrometástases
impossíveis de serem identificadas nos exames histopatológicos de rotina,
direcionando assim para uma terapêutica mais adequada para cada caso.
Chen et al.
16
(2005) estudaram a expressão da survivina
na carcinogênese química induzida pelo DMBA em bolsa de bochecha de
hamsteres. Encontraram imunorreatividade desta proteína e RNAm em
todos os casos tratados com o DMBA, entretanto os casos não tratados
ou naqueles onde houve a aplicação de óleo mineral, não se observou a
marcação. Também foi observado neste estudo que os casos tratados
com o DMBA não apresentaram metilação do gene survivina, ao contrário
dos casos não tratados, ou tratados com óleo mineral. Eles concluíram
assim que a survivina pode ter um importante papel nos carcinomas
induzidos pelo DMBA em bolsa de bochecha, e a sua expressão gênica
pode ser modulada por meio de mecanismos epigenéticos.
37
3 PROPOSIÇÃO
Embasados nos trabalhos vigentes na literatura, propomo-
nos avaliar, empregando a técnica imunoistoquímica com anticorpos anti-
survivina, a correlação desta proteína relacionada a apoptose com
diferentes fases da carcinogênese induzida pela 4NQO em mucosa de
dorso lingual de ratos Wistar.
38
4 MATERIAL E MÉTODO
Este estudo foi realizado em parceria com o Núcleo de
Avaliação Toxicogenética e Cancerígena (TOXICAN) do Departamento de
Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, utilizando-se
do material emblocado em parafina, resultante dos trabalhos prévios
conduzidos por Ribeiro et al.
97
(2004) e Ribeiro et al.
96
(2005).
Todos os procedimentos realizados nos trabalhos
supracitados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, em reunião de 22 de
novembro de 2002 (protocolo n
o
252).
Os animais, ratos Wistar machos, foram distribuídos em
quatro grupos de dez, três dos grupos qualificados como de estudo e um
como de controle negativo, o qual teve o seu sacrifício realizado no
período inicial, isto é, sem nenhum tratamento. Para os grupos estudo foi
utilizado como carcinógeno a solução de 4NQO (Sigma, USA) 50 ppm,
dissolvida na água para beber. Após quatro semanas do experimento
procedeu-se o sacrifício dos animais do primeiro grupo de estudo,
sacrifícios repetidos na 12
a
semana com o segundo grupo, e na 20
a
semana com o terceiro grupo.
Após o sacrifício, os espécimes tiveram as línguas
recortadas em plano sagital mediano e fixadas em formalina tamponada a
10% por 24 horas para posterior processamento histológico. As lâminas
com cortes semi-seriados de 5µm de espessura foram coradas com H.E.
(hematoxilina e eosina) para análise histopatológica.
39
4.1 Análise histopatológica
A avaliação histopatológica, em cortes corados pelo
método tintorial da H.E., foi realizada em microscopia de luz, aumento de
100 X, sendo considerados os seguintes diagnósticos: epitélio normal,
hiperplasia, atipia epitelial e carcinoma. Os diagnósticos foram
correlacionados com os respectivos tempos de exposição ao carcinógeno.
4.2 Imunoistoquímica
O estudo imunoistoquímico seguiu a seguinte
metodologia:
a) os blocos cortados em espessuras de 4µm foram
desparafinizados em xilol e reidratados em série
descendente de etanóis, a partir de três passagens em
etanol absoluto, seguidos por etanol 95%, 85% e 80%,
durante 5 minutos cada;
b) após lavagem em água corrente e água destilada, as
lâminas receberam os tratamentos de recuperação
antigênica por meio de solução tampão citrato a 0,01M
(pH = 6), em três ciclos de 5 minutos cada em forno de
microondas (850 W). A cada ciclo foi completada a
solução tampão, de modo que as lâminas ficassem
sempre cobertas pela solução. Estes procedimentos
visaram restabelecer os sítios antigênicos e romper as
ligações cruzadas com o formol;
40
c) após os 15 minutos, as lâminas foram deixadas no
forno desligado durante 20 minutos. Depois,
transferidas das cubas para as bandejas;
d) o material foi posteriormente pré-incubado numa
solução de 0,3% de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) em
PBS (solução tampão fosfato) durante 5 minutos para
inativação da peroxidase endógena e, após,
bloqueada com solução de albumina sérica à 5% em
PBS durante 10 minutos;
e) após isto, foi pingado PBS, seu excesso removido com
bomba a vácuo e, em seguida, pingou-se os
anticorpos anti-survivina (clone A-19), concentração
1:50 (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) ;
f) as bandejas foram vedadas com fita adesiva e
colocadas na geladeira por uma noite à 4º C;
g) após este período, as lâminas foram lavadas em PBS,
e, em seguida, tratadas com anticorpos secundários
biotinilados tipo IgG (Vector Laboratories, Burlingame,
CA, USA);
h) após os primeiros 30 minutos, foram preparadas as
soluções de ABC (Vector Laboratories, Burlingame,
CA, USA) – (cálculo para quarenta lâminas), que
seguiu o próximo passo;
- 5mL de PBS;
- avidina: uma gota;
- biotina: uma gota.
Foi agitado e deixado descansar durante 30 minutos.
As lâminas foram lavadas com PBS, e em seguida,
pingada a solução de ABC (já preparada) deixando
durante 45 minutos.
41
Quando faltavam 5 minutos para findar o tempo do
ABC, era preparada a DAB (diaminobenzidina) –
(cálculo para quarenta lâminas), seguindo:
- 10mL de Trizma para DAB;
- 10mg de DAB;
- 0,2mL de H
2
O
2
(0,1mL de H
2
O
2
30 volumes e 0,9
mL de PBS).
Deixando o Trizma, o H
2
O
2
e a DAB em tubos de
ensaio separados; a mistura foi realizada na hora do
uso, na seguinte ordem:
- colocar o Trizma na DAB e misturar com ponteira;
- colocar o H
2
O
2
e misturar com ponteira.
i) as lâminas foram lavadas com PBS, removido o
excesso, pingou-se a DAB deixando agir por 5
minutos;
j) após esta etapa as lâminas foram lavadas em água
corrente, escorrido o excesso, pingou-se sobre os
cortes a Hematoxilina de Harris, contra-corante,
durante um minuto. Foram lavados em água corrente
novamente, seguidos por banho de água amoniacal,
antes da desidratação;
k) as lâminas foram retiradas da bandeja e colocadas em
berços para desidratação (cinco cubas de álcool
absoluto e três cubas de xilol) e foram montadas com
resina sintética (Permount);
l) Para o controle negativo da reação, algumas lâminas
foram processadas do mesmo modo como descrito,
porém se omitindo o anticorpo primário.
42
4.3 Análise imunoistoquímica
A avaliação imunoistoquímica das lâminas marcadas
pelos anticorpos anti-survivina foi realizada em microscópio óptico
comum, em aumento de 400 X, por três examinadores, D.A. R., M.E.A.M.
e D.K.. Sendo realizada análise qualitativa do material, isto é, positividade
ou não da marcação e sua respectiva localização no epitélio,
correlacionando-se com o tempo de exposição a 4NQO, e com o
diagnóstico histopatológico.
43
5 RESULTADOS
5.1 Análise histopatológica
A análise histopatológica das lesões foi realizada por dois
patologistas especialistas (D.A.R. e M.E.A.M.) com o acompanhamento
do aluno de doutorado (D.K.), sendo baseado nas instruções de Fassoni
31
(1993), como segue: mucosa normal; hiperplasia, atipia epitelial e
carcinoma. Os aspectos microscópicos do grupo controle apresentavam-
se com um epitélio pavimentoso estratificado ortoqueratinizado (mucosa
bucal do tipo especializada) em contato com a lâmina própria formada por
tecido conjuntivo frouxo pouco celularizado. Nos planos profundos,
observaram-se tecido muscular estriado esquelético, células adiposas,
bem como ácinos e ductos de glândulas salivares menores linguais
serosas e mucosas na porção mais posterior (FIGURA 1). Estes relatos
correspondem ao aspecto de normalidade. No grupo experimental tratado
com a 4NQO, as alterações histopatológicas puderam ser evidenciadas
somente a partir de 12 semanas. Tais alterações foram descritas como
hiperplasia e hiperqueratose com ou sem atipia. Em vinte semanas, o
grau de severidade de atipia aumentou, sendo que a maioria dos casos
de atipia mostrou atipia severa. Carcinomas microinvasivo e invasivo
puderam ser observados neste período. Os carcinomas 4NQO-induzidos,
em geral, são bem diferenciados, pois, apesar da atipia celular traduzida
pelo pleomorfismo e hipercromatismo exuberantes e pelas mitoses
freqüentes, são abundantes a disqueratose e as pérolas córneas. A
organização tecidual, a relação intercelular e o modelo de invasividade
são condizentes com uma diferenciação celular ainda presente. Os
padrões morfológicos bem diferenciados dos carcinomas 4NQO-induzidos
provavelmente explicam o baixo índice de metástases encontrado neste
44
modelo experimental. A histopatologia da evolução da carcinogênese
lingual murina está apresentada na FIGURA 2. Também permite inferir
que as lesões detectáveis do ponto de vista macroscópico ou clínico são
correlatas aos achados microscópicos. Os resultados das lesões
histopatológicas obtidas nos espécimes estão descritos na Tabela 1.
Tabela 1 – Incidência dos quadros histopatológicos do modelo de
carcinogênese bucal induzidos pela (4NQO)
a
, em mucosa
de língua de ratos
96
Diagnósticos histopatológicos
Grupos
(semanas)
N
o
de
animais
Normal Hiperplasia Atipia Carcinoma
0
(Controle)
10 10 0 0 0
4
10 10 0 0 0
12
10 0 7 3 0
20
10 0 0 3 7
a
4NQO – 50 ppm na água de beber
45
ED
Ms
M
S
FIGURA 1 – Fotomicrografia mostrando mucosa bucal normal da região
posterior da língua do grupo controle. Note o epitélio dorsal
(ED), lâmina própria (seta), músculo (Ms) e abaixo
glândulas mucosas (M) e serosas (S). Barra = 110µm
5.2 Análise imunoistoquímica
Os resultados da análise imunoistoquímica para o
anticorpo anti-survivina obtidas nos espécimes estão descritos na Tabela
2 e podem ser visualizados na FIGURA 3. Realizou-se análise qualitativa
do material, isto é, observou-se imunorreatividade ou não do material.
Toda marcação da survivina deu-se de maneira fraca, sendo
predominantemente citoplasmática, e o epitélio não tratado com a 4NQO,
não apresentou em momento algum do estudo, positividade na reação –
grupo controle: negativo para a expressão da survivina.
Á partir de 4 semanas de tratamento com a 4NQO,
verificou-se expressão da survivina citoplasmática na região de camada
granulosa e córnea do epitélio tratado em sete dos dez animais. Após 12
semanas de administração da 4NQO, houve marcação na camada córnea
46
dos espécimes de dois animais classificados histopatologicamente como
hiperplasia, e três, classificados como atipia.
Os casos de CE foram observados após vinte semanas
de tratamento com a 4NQO. Nestes, observou-se expressão da survivina
em cinco dos sete animais, nas proximidades das regiões queratinizadas,
tanto em região superficial, quanto em regiões próximas as pérolas
córneas. Ainda nos animais deste grupo, observou-se positividade da
survivina em todos animais classificados histopatologicamente como
atipia.
Tabela 2 – Número de casos com expressão da survivina de acordo com
o quadro histopatológico, seguindo a administração da 4NQO
na dose de 50 ppm
Grupos
(semanas)
Alterações no epitélio
1
Normal Hiperplasia Atipia Carcinoma Total
Controle
(zero)
0 0 0 0 00
4
7 0 0 0 07
12
0 2 3 0 05
20
0 0 3 5 08
1
Valores são expressos por animal.
47
h
g
f
e
cd
ab
FIGURA 2 – Análise histopatológica durante a evolução da carcinogênese
(H.E.): a) mucosa lingual do dorso da língua normal; b)
hiperplasia e hiperqueratose sem atipia; c) hiperplasia e
hiperqueratose com atipia discreta; d) hiperplasia e
hiperqueratose com atipia moderada; e) hiperplasia e
hiperqueratose com atipia grave; f) carcinoma in situ; g)
carcinoma epidermóide microinvasivo; h) carcinoma
epidermóide bem diferenciado.
48
c
a
d
b
FIGURA 3 – Análise imunoistoquímica durante a evolução da
carcinogênese (survivina) X 400. (a) controle negativo
com ausência de marcação. (b) 4 semanas pós-
tratamento com a 4NQO, demonstrando marcação
citoplasmática nas camadas superficiais do epitélio. (c)
12 semanas de tratamento com a 4NQO, demonstrando
marcação nas camadas superficiais do epitélio de uma
lesão classificada histopatologicamente como
hiperplasia com atipia. (d) 20 semanas de tratamento
com a 4NQO, demonstrando marcação em áreas de
disqueratose numa lesão classificada como carcinoma
epidermóide bem diferenciado.
49
6 DISCUSSÃO
Atualmente o objetivo principal na área de saúde é a
prevenção da doença. Quando a prevenção não é mais possível e resta
somente o tratamento como última opção, o desenvolvimento de novas
técnicas de diagnóstico e aplicações terapêuticas, podem ser testadas e
estudadas em animais de laboratório (MOGNETTI et al.
75
, 2006).
Vários fatores influenciam nos ensaios de carcinogênese
de média duração, como espécie animal, tipo de carcinógeno aplicado,
tempo de administração, escolha do solvente, sítio de aplicação da droga,
freqüência e modo de aplicação, além da execução ou não de trauma
prévio na região (KOLAS
53
, 1955; KRESHOVER & SALLEY
54
, 1957;
EVESON
30
, 1981). Tem-se também aqueles inerentes a cada animal,
como fator genético predisponente, idade do animal, fatores nutricionais e
distúrbios das funções endócrinas (EVESON
30
, 1981; KITAKAWA
52
, 2003;
RIBEIRO
95
, 2005).
Particularmente, a região intrabucal dos animais possui
vários obstáculos para os ensaios de carcinogênese quimicamente
induzida. Dentre estes, vários fatores foram relacionados, como o efeito
protetor que a saliva exerce sobre os tecidos bucais (KOLAS
53
, 1955;
GOLDHABER
34
, 1957; FUJITA et al.
32
, 1973; WALLENIUS &
LEKHOLM
126-7
, 1973; DAYAN et al.
23
, 1997; KAPLAN et al.
47
, 2001); a
ação mecânica da língua interrompendo ou diminuindo a ação do
carcinógeno na mucosa bucal (KRESHOVER & SALLEY
54
, 1957); e em
particular a falta de uma via de entrada natural, como os folículos pilosos
e as glândulas sudoríparas, que favorecem a penetração dos
carcinógenos (SALLEY
100
, 1954; GOLDHABER
34
, 1957; LEVY
57
, 1958).
Várias espécies animais têm sido utilizadas para o estudo
da carcinogênese intrabucal, porém, os mais utilizados são hamsteres e
50
ratos, observando-se diferenças importantes na metodologia de indução
carcinogênica e no carcinógeno utilizado.
Salley
100
(1954) foi o pioneiro na obtenção de 100% de
sucesso na indução de CE em região de bolsa jugal de hamsteres.
Posteriormente, Fujita et al.
32
(1973) desenvolveram um modelo de
carcinogênese química em bordo lingual de hamsteres, que passou a ser
amplamente utilizado por outros pesquisadores (MAREFAT & SHKLAR
71
,
1977; EVESON
30
, 1981; MAREFAT
70
, 1985; KITAKAWA
52
, 2003;
MAGALHÃES
68
, 2004; MONTEIRO
76
, 2004). Apesar do DMBA ser o
carcinógeno de escolha no tratamento de hamsteres, uma grande gama
de substâncias já foi utilizada, como o alcatrão de carvão, 3, 4BP, 20MC e
4NQO (SALLEY
100-1
, 1954 e 1957; KOLAS
53
, 1955; GOLDHABER
34
,
1957; KRESHOVER & SALLEY
54
, 1957; LEVY
57
, 1958; MORRIS
78
, 1961;
AL-ANI & SHKLAR
2
, 1966; DACHI
21
, 1967; GIUNTA & SHKLAR
33
, 1972;
FUJITA et al.
32
, 1973; MAREFAT & SHKLAR
71
, 1977; EVESON
30
, 1981;
MAREFAT
70
, 1985; FASSONI et al.
31
, 1993; COLON et al.
19
, 1999;
SCHWARTZ et al.
104
, 2000; KAPLAN et al.
47
, 2001; KITAKAWA
52
, 2003;
MAGALHÃES
68
, 2004; MONTEIRO
76
, 2004).
Com relação aos ratos, obtiveram-se melhores resultados,
principalmente após o trabalho de Wallenius & Lekholm
126-7
(1973), que
induziram carcinomas em todos os animais na região de palato, utilizando
o carcinógeno 4NQO, após um período de aplicação de sete meses.
Assim nos ratos, o carcinógeno escolhido tem sido a 4NQO (YAMAMURA
et al.
136
, 1975; WONG & WILSON
133
, 1983; STEIDLER & READE
111-2
,
1984 e 1986; OHNE et al.
84
, 1985; WILSON et al.
132
, 1995; RAMOTAR et
al.
90
, 1998; KAPLAN et al.
47
, 2001; VERED et al.
121
, 2004; RIBEIRO et
al.
97
, 2004, RIBEIRO
95
, 2005; RIBEIRO et al.
96
, 2005).
Os ensaios de carcinogênese quimicamente induzida em
ratos ou hamsteres possibilitam um estudo fase por fase de todo o
processo de transformação maligna. Dessa forma é possível a utilização
de marcadores biológicos para um entendimento cada vez maior desse
51
processo. Além disso, neste tipo de estudo também é possível a utilização
de substâncias e verificação de suas respectivas atividades
quimiopreventivas (KANOJIA & VAIDYA
40
, 2006).
Neste estudo, utilizaram-se os ratos, uma vez que existem
semelhanças anatômicas com os humanos, assim como, são de fácil
manipulação em biotério. Além disso, o processo de carcinogênese bucal
é mais simples quando comparado com a metodologia aplicada em
hamsteres (RIBEIRO
95
, 2005), uma vez que a 4NQO é dissolvida na água
de beber dos animais, não sendo necessária a aplicação do carcinógeno
individualmente em cada animal. Para o experimento clássico em
hamsteres (SALLEY et al.
100
, 1954) são necessárias pelo menos 48
etapas manipulando cada animal até a indução carcinogênica, sendo,
portanto, mais trabalhoso e com maior risco no que tange a
biossegurança (MOGNETTI et al.
75
, 2006).
As linhagens animais podem ser divididas em isogênicas
e não isogênicas. Escolheu-se para este estudo os animais não-
isogênicos, que são geneticamente heterogêneos, já que alguns autores
verificaram que as linhagens geneticamente idênticas, possuem menor
validade, uma vez que não demonstra a variabilidade genética que existe
entre a nossa população (ABRAMOVICI & WOLMAN
1
, 1987; MOGNETTI
et al.
75
, 2006).
Neste estudo as regiões acometidas pelo CE intrabucal
foram o palato e a mucosa de dorso de língua. A mucosa de língua é uma
das regiões mais acometidas pelo CE no ser humano (NEVILLE et al.
80
,
1998; PINTO & CAVALLARI
87
, 2002), por isso preferiu-se utilizar esta
região topográfica a despeito da região de palato.
De uma maneira geral, em nosso experimento pode-se
observar que a administração crônica da 4NQO induziu lesões brancas
detectáveis macroscopicamente na maior parte dos espécimes expostos,
visto que estes achados concordam com outros estudos (OHNE et al.
84
,
1985; NISHIMURA
81
, 1999; NIWA et al.
82
, 2001). Tais lesões
52
assemelham-se a leucoplasias em seres humanos, principais lesões
cancerizáveis na mucosa bucal clinicamente detectáveis na prática
estomatológica (NEVILLE et al.
80
, 1998).
Já os CE 4NQO-induzidos, em geral, são bem
diferenciados, pois, apesar da observação de atipia celular traduzida pelo
pleomorfismo e hipercromatismo exuberantes e pelas mitoses freqüentes,
são abundantes a disqueratose e as pérolas córneas. A organização
tecidual, a relação intercelular e o modelo de invasividade são
condizentes com uma diferenciação celular ainda presente. Esses
achados corroboram com a literatura (NISHIMURA
81
, 1999). Os padrões
morfológicos bem diferenciados dos carcinomas 4NQO-induzidos
provavelmente explicam o baixo índice de metástases encontrado neste
modelo experimental (OHNE et al.
84
, 1985). A histopatologia da evolução
da carcinogênese lingual murina está apresentada na FIGURA 2. Nossos
achados estão em consonância com a maioria dos autores que fizeram
uso deste modelo em ratos (NISHIMURA
81
, 1999; NIWA et al.
82
, 2001;
RIBEIRO et al.
97
, 2004). Também permite inferir que as lesões
detectáveis do ponto de vista macroscópico ou clínico são correlatas aos
achados microscópicos. Os resultados das lesões histopatológicas
obtidas nos espécimes estão descritos na Tabela 1.
Neste estudo optou-se pela utilização da técnica da
imunoistoquímica para a survivina, que apresenta a grande vantagem de
ser relativamente simples, e não requerer aparatos sofisticados, como os
utilizados em biologia molecular.
A survivina faz parte da família das IAP, família de
proteínas capazes de bloquear a apoptose. Ela tem sido encontrada em
malignidades hematológicas e sólidas, sendo sua expressividade ausente
na maioria dos tecidos adultos diferenciados (AMBROSINI et al.
6
, 1997;
JOHNSON & HOWERTH
44
, 2004). Desde a sua descoberta em 1997
(AMBROSINI et al.
6
, 1997), tem-se sugerido que esta proteína é um
importante marcador neoplásico, e também um indicador prognóstico e de
53
terapia no câncer. (YAMAMOTO & TANIGAWA
135
, 2001). O bloqueio da
apoptose parece ser um evento importante na transformação maligna das
células da mucosa bucal de ratos, como demonstrado por alguns autores
(NISHIMURA
81
, 1999; RIBEIRO et al.
96
, 2005).
Por esta razão, aliado à escassez de estudos utilizando-
se deste biomarcador na carcinogênese bucal, decidimos estudar a
expressão da survivina na carcinogênese quimicamente induzida pela
4NQO em mucosa bucal de ratos Wistar.
No grupo controle negativo, nenhuma expressividade foi
evidenciada na mucosa lingual, assim como em estudos anteriores
(AMBROSINI et al.
6
, 1997; CHEN et al.
16
, 2005). Em tecidos adultos,
geralmente só existe a expressão da survivina em determinados tipos
celulares, como células do timo e células endoteliais, isto é, células com
potencial mitogênico, diferente dos tecidos embrionários em que a maioria
desses expressa a survivina (AMBROSINI et al.
6
, 1997; GROSSMAN et
al.
37
, 2001; REED
94
, 2001; LO MUZIO et al.
62
, 2003; JOHNSON &
HOWERTH
44
, 2004; SCHIMMER
102
, 2004; YANG et al.
137
, 2004;
ZAFFARONI et al.
139
, 2005). Acredita-se que a survivina seja importante
no período de reprodução das células, porém ela não é essencial para a
sobrevida celular (YANG et al.
137
, 2004). A análise de camundongos em
que o gene da survivina foi deletado das células tímicas, mostrou que a
mesma é crucial para a proliferação bem como para a maturação, sendo
importante para a manutenção da homeostasia no processo de
desenvolvimento das células T (XING et al.
124
, 2004).
Após quatro semanas de administração da 4NQO, nas
camadas granulosa e córnea do epitélio, encontrou-se a expressão da
survivina nos casos sem quaisquer alterações, tanto em nível macro,
como microscópico. Tais resultados sugerem a importância da atividade
desta proteína perante a apoptose nos períodos iniciais da carcinogênese
de mucosa bucal de ratos Wistar, sugerindo-se assim um bloqueio do
maquinário celular apoptótico nos períodos inicias do estudo, o que
54
favoreceria o acúmulo de mutações, contribuindo para carcinogênese
(ALTIERI
5
, 2001; ZAFFARONI et al.
139
, 2005). Baseado nestes achados,
parece evidente que a expressão da survivina está associada com um
aumento no risco para o desenvolvimento do CE induzido pela 4NQO em
mucosa bucal de ratos.
Estudos conduzidos por Tanaka et al
115
. (2003) e Chen et
al.
16
(2005), demonstraram que esse gene estava hipometilado nos casos
de CE, sugerindo assim que a expressão gênica da survivina é regulada
por mecanismos epigenéticos. Estes fatores decorrem de alterações na
expressão do gene, sem que haja mutação. A hipometilação do gene da
survivina promoveria a sua ativação, havendo, portanto, inibição da
apoptose, e favorecimento do acúmulo de mutações e o desenvolvimento
da carcinogênese. Tais estudos foram realizados em hamsteres, região
de bolsa de bochecha (CHEN et al.
16
, 2005) e em espécimes de
humanos (TANAKA et al.
115
, 2003).
Foi possível também observar a expressão da survivina
nos casos classificados histopatologicamente como hiperplasia, mesmo
sem a presença de atipias. Embora a survivina não esteja diretamente
relacionada com a proliferação celular, ela poderia estar contribuindo
indiretamente para o aumento de células epiteliais através do bloqueio da
apoptose.
Nos casos classificados como atipia, observou-se a
marcação nas camadas superficiais do epitélio em todos os casos (seis
dos seis casos classificados como atipia), e nos casos de CE bem
diferenciados, após vinte semanas de estudo, observou-se marcação em
cinco dos sete casos classificados como carcinoma, nas células próximas
as regiões queratinizadas. Nossos achados corroboram com os
resultados encontrados nas neoplasias de outras localidades, como o
carcinoma nasofaringenano (XIANG et al.
123
, 2006), adenocarcinoma
pancreático (AMBROSINI et al.
6
, 1997; LEE et al.
56
, 2005), linfomas não
Hodgkin de alto grau, carcinoma de células escamosas de pulmão,
55
adenocarcinoma de mama, colorretal e próstata (AMBROSINI et al.
6
,
1997; KIM et al.
50
, 2003; IDENOUE et al.
41
, 2005), câncer gástrico
(MIYACHI et al.
74
, 2003), CE experimental cutâneo (ALLEN et al.
4
, 2003),
também nos CE das estruturas de revestimento bucal (LO MUZIO et al.
61-
3
, 2001, 2003 e 2005; TANAKA et al.
115
, 2003), e nos casos de
metástases linfonodais do CE de boca (KIM et al.
51
, 2005). É importante
frisar que todos os casos de CE foram classificados como bem
diferenciados, característica deste modelo de carcinogênese, e a
expressão da survivina se deu justamente nas proximidades das áreas
queratinizadas.
A expressão da survivina principalmente nos períodos
iniciais e intermediários deste experimento permite incluí-la como
ferramenta adicional no diagnóstico de alterações presentes na mucosa
bucal de ratos. Entretanto, novos estudos na área são interessantes para
validar esse biomarcador na carcinogênese bucal, pois abrirão horizontes
para a localização de lesões cancerizáveis na mucosa bucal com real
potencial de malignização, proporcionando, assim, uma objetividade maior
no tratamento, além de estar prevenindo o desenvolvimento do CE.
56
7 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos da análise histológica e
imunoistoquímica, pôde-se concluir que:
a) a survivina participa da fase inicial do processo de
carcinogênese quimicamente induzida pela 4NQO em
mucosa lingual de ratos Wistar;
b) a inibição da apoptose mostrou-se um evento precoce
na carcinogênese induzida pela 4NQO, observando-se
a expressão da survivina a partir da quarta semana do
experimento, estando o epitélio dentro dos padrões
histológicos da normalidade;
c) a survivina expressou-se nos casos classificados
histopatologicamente como normais, com hiperplasia
epitelial, com atipias celulares e nos carcinomas
epidermóides induzidos pela 4NQO em mucosa de
dorso de língua de ratos Wistar, e;
d) a técnica de imunoistoquímica da survivina mostrou-se
como biomarcador para a detecção precoce de
alterações celulares relacionadas com o
desenvolvimento de carcinoma quimicamente induzido
em língua de rato.
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Anexo A – Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa
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Anexo B – Autorização do Departamento de Patologia FMB – UNESP
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KITAKAWA, D. Immunohistochemical analysis of inhibitor of apoptosis
protein, survivin, in rat tongue mucosa induced by 4-nitroquinoline 1-oxide
2006. 80f. Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal – Área de
concentração em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista, São José dos
Campos, 2006.
ABSTRACT
4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO)-induced rat tongue carcinogenesis is a useful model for
studying the development of squamous cell carcinoma phase by phase. Taking into
consideration apoptosis plays an important role in tumorigenesis, the aim of this study
was to investigate the expressivity of survivin, a member of the inhibitor apoptotic protein
family, during tongue carcinogenesis induced by 4NQO through immunohistochemistry.
Male Wistar rats were distributed into three groups of 10 animals each and treated with
50 ppm 4NQO by drinking water for four, 12 or 20 weeks. A total of ten animals were
used as negative control. Although no histological changes were induced in the
epithelium after 4 weeds of carcinogen exposure, survivin was detected in the cytoplasm
within granular and superficial layers. In dysplastic lesions with 12 weeks of carcinogen
exposure, cytoplasmic survivin was evidenced in the superficial layer of epithelium only.
In well-differetiated squamous cell carcinoma induced after 20 weeks of treatment with
4NQO, cytoplasmic survivin was expressed in some cells adjacent to keratin pearls. No
immunoreativity was detected in the negative control group. Taken together, our results
suggest that expression of cytoplasmic/nuclear survivin is an early event during 4NQO-
induced rat tongue carcinogenesis and may provide a useful toll for the identification of
lesions at higher risk of progression into oral squamous cell carcinoma.
KEYWORDS: 4-nitroquinoline 1-oxide; survivin; squamous cell carcinoma; animals;
comparative study
80
Autorizo a reprodução xerográfica deste trabalho.
MESTRE DÁRCIO KITAKAWA
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