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RAQUEL GUEDES FERNANDES
ESTUDO DA AÇÃO LOCAL DO ALENDRONATO SÓDICO, DA
HIDROXIAPATITA E DA ASSOCIAÇÃO ALENDRONATO SÓDICO
COM A HIDROXIAPATITA, NO REPARO ÓSSEO DE FÊMURES DE
RATOS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de DOUTOR, pelo Programa
de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL,
Área Biopatologia Bucal
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RAQUEL GUEDES FERNANDES
ESTUDO DA AÇÃO LOCAL DO ALENDRONATO SÓDICO, DA
HIDROXIAPATITA E DA ASSOCIAÇÃO ALENDRONATO SÓDICO
COM A HIDROXIAPATITA, NO REPARO ÓSSEO DE FÊMURES DE
RATOS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-Graduação em
Biopatologia Bucal, Área Biopatologia Bucal
Orientador: Prof. Adj. Horácio Faig Leite
São José dos Campos
2005
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Apresentação gráfica e normalização de acordo com:
BELLINI, A.B.; SILVA, E.A. Manual para elaboração de monografias:
estrutura do trabalho científico. São José dos Campos: FOSJC/UNESP,
2002. 82p.
FERNANDES, R.G. Estudo da ação local do alendronato sódico, da
hidroxiapatita e da associação alendronato sódico com a
hidroxiapatita, no reparo ósseo de fêmures de ratos. 2005. 127f. Tese
(Doutorado em Biopatologia Bucal, Área Biopatologia Bucal) - Faculdade
de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual
Paulista. São José dos Campos, 2005.
DEDICATÓRIA
Ao meu esposo Edson Parreiras Pires,
por todo seu amor e compreensão...
por perdoar os momentos ausentes e
sempre me incentivar.
Aos meus pais Darvem e Cleide,
meus maiores exemplos de vida...
A minha querida tia Dalva que
sempre esteve ao meu lado.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Agradeço neste momento, pelos dias que ainda virão,
ao meu Orientador
PROFESSOR ADJUNTO HORÁCIO FAIG LEITE
por ter me acolhido com carinho, paciência e
sabedoria.
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de São José dos Campos -
UNESP, representada na pessoa do Diretor Prof. Adj. Paulo Villela
Santos Júnior.
À Faculdade de Pindamonhangaba, representada na
pessoa do Prof. Dr. Luís Otávio Palhari, pela oportunidade profissional.
À Profa. Dra. Chung Man Chin do Departamento de
Fármacos e Medicamentos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Araraquara - UNESP, pelo carinho e pela gentileza com que me recebeu,
e por sua fundamental colaboração no estabelecimento da metodologia
deste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biopatologia
Bucal da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP,
representado pela Profa. Dra. Rosilene Fernandes da Rocha, pela
oportunidade da realização do curso.
À Profa. Adj. Yasmin Rodarte Carvalho, pelos
esclarecimentos prestados na descrição da análise histológica deste
trabalho, disponibilizando gentilmente seu tempo e atenção.
Ao Prof. Dr. Luiz Eduardo Blumer Rosa, por sua
amizade, ajuda e colaboração nos mais diversos momentos.
Ao funcionário Paulo Rogério Martins, da Disciplina de
Anatomia, pela sua disposição e auxílio durante a fase experimental deste
trabalho, bem como por sua amizade e compreensão.
À amiga Maria Rosa Rozim Luz, que tenho a grande
alegria de conviver, por toda sua atenção, carinho, ajuda e paciência.
Aos funcionários do Biotério, Lourival Jacob e Antônio
Domingos Sávio Barbosa Maia Vasconcelos, pela indispensável
colaboração durante a fase experimental.
À Profa. Dra. Simone Helena Gonçalves de Oliveira, da
Disciplina de Anatomia, por sua amizade e apoio.
À Bibliotecária Angela de Brito Bellini, pela cuidadosa
correção desta tese, e às demais funcionárias da biblioteca, pelos
esclarecimentos prestados.
Ao funcionário Walter Cruz, da Disciplina de Histologia,
pela confecção das lâminas histológicas, além da agradável convivência.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação,
Rosemary e Erena por toda atenção e orientação e às secretárias
Ivoneide e Sílvia pela colaboração durante todo este curso.
A todos os colegas do curso de Pós-Graduação, pela
alegria compartilhada em todos momentos.
Aos meus amigos e colegas de trabalho da Faculdade de
Pindamonhangaba e do PAMO Mourisco da Prefeitura Municipal de
Taubaté, por me ouvirem nos momentos difíceis e pelas palavras de
incentivo.
Aos animais que foram sacrificados, pela indispensável
contribuição na pesquisa.
Aos alunos, que mesmo sem saber,
expressam o real sentido deste
trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS......................................................................... 09
LISTA DE TABELAS....................................................................... 13
RESUMO........................................................................................ 16
1 INTRODUÇÃO............................................................................. 17
2 REVISÃO DA LITERATURA........................................................
2.1 Bisfosfonatos ...........................................................................
2.2 Hidroxiapatita............................................................................
2.3 Bisfosfonatos e hidroxiapatita...................................................
19
19
37
51
3 PROPOSIÇÃO............................................................................. 55
4 MATERIAL E MÉTODO...............................................................
4.1 Animais.....................................................................................
4.2 Divisão dos grupos...................................................................
4.3 Cálculo dos materiais................................................................
4.4 Procedimentos cirúrgicos .........................................................
4.5 Sacrifício...................................................................................
4.6 Análise dos resultados..............................................................
4.6.1 Análise histológica................................................................
56
56
56
59
60
62
64
64
4.6.2 Análise histomorfométrica......................................................
4.7 Análise estatística.....................................................................
64
65
5 RESULTADOS.............................................................................
5.1 Análise histológica....................................................................
5.1.1 Animais machos - sete dias...................................................
5.1.2 Animais fêmeas - sete dias....................................................
5.1.3 Animais machos - 21 dias......................................................
5.1.4 Animais fêmeas - 21 dias.......................................................
5.2 Análise histomorfométrica.........................................................
5.3 Análise estatística.....................................................................
66
66
67
71
75
79
84
93
6 DISCUSSÃO................................................................................ 100
7 CONCLUSÃO.............................................................................. 111
8 REFERÊNCIAS............................................................................ 112
Anexo..............................................................................................
...
126
ABSTRACT..................................................................................... 127
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Procedimentos cirúrgicos: a) incisão da pele; b)
divulsão dos tecidos moles; c) exposição da
superfície óssea do fêmur esquerdo; d) início da
confecção do defeito ósseo; e) defeito ósseo; f)
defeito ósseo preenchido por material.....................
63
FIGURA 2 - Animais machos, sete dias (vista panorâmica): a)
grupo controle: anastomoses das trabéculas
ósseas imaturas em direção do canal medular; b)
grupo amido: trabéculas ósseas se projetando ao
centro do canal medular; c) grupo alendronato
1mol: rede de fibrina no defeito e no canal
medular e tecido muscular sobre a superfície do
defeito (
S ). Neoformação óssea extra-cortical
(
Ä ); d) grupo alendronato 2moles: rede de
fibrina e neoformação óssea extra-cortical
(
Ä ); e) grupo hidroxiapatita 1mol: delicadas
trabéculas ósseas; f) grupo hidroxiapatita
2moles: trabéculas ósseas neoformadas a partir
do endósteo; g) grupo alendronato mais
hidroxiapatita: rede de fibrina no defeito e
neoformação óssea extra-cortical (
Ä ). Aumento
original 25x. HE.......................................................
68
FIGURA 3 - Animais machos, sete dias (centro do defeito): a)
grupo controle: trabéculas ósseas delimitando
espaços medulares; b) grupo amido: trabéculas
ósseas e tecido conjuntivo celularizado; c) grupo
alendronato 1mol: rede de fibrina; d) grupo
alendronato 2moles: rede de fibrina; e) grupo
hidroxiapatita 1mol: trabéculas ósseas imaturas
delimitando espaço medulares; f) grupo
hidroxiapatita 2moles: tecido conjuntivo
celularizado; g) grupo alendronato mais
hidroxiapatita: rede de fibrina e medula óssea.
Aumento original 100x. HE......................................
70
FIGURA 4 - Animais fêmeas, sete dias (vista panorâmica): a)
grupo controle: trabéculas ósseas neoformadas
e medula óssea no canal; b) grupo amido:
trabéculas ósseas neoformadas a partir do
endósteo e do periósteo; c) grupo alendronato
1mol: trabéculas ósseas neoformadas a partir
do endósteo e neoformação óssea extra-
cortical (
Ä ); d) grupo alendronato 2moles:
neoformação óssea extra-cortical ( Ä ); e) grupo
hidroxiapatita 1mol: trabéculas ósseas e medula
óssea no interior do canal; f) grupo
hidroxiapatita 2moles: trabéculas ósseas
neoformadas e quantidade variável de medula no
canal medular; g) grupo alendronato mais
hidroxiapatita: trabéculas ósseas e neoformação
óssea extra-cortical (
Ä ). Aumento original 25x.
HE............................................................................
72
FIGURA 5 - Animais fêmeas, sete dias (centro do defeito): a)
grupo controle: trabéculas ósseas delimitando
espaços medulares; b) grupo amido: espaços
medulares com tecido conjuntivo; c) grupo
alendronato 1mol: delicadas trabéculas ósseas e
tecido conjuntivo celularizado; d) grupo
alendronato 2moles: grandes espaços medulares
com tecido conjuntivo celularizado; e) grupo
hidroxiapatita 1mol: tecido conjuntivo
celularizado entre esparsas trabéculas ósseas; f)
grupo hidroxiapatita 2moles: delicadas
trabéculas ósseas e tecido conjuntivo rico em
células; g) grupo alendronato mais
hidroxiapatita: trabéculas ósseas imaturas e
tecido conjuntivo celularizado. Aumento original
100x. HE..................................................................
74
FIGURA 6 - Animais machos, 21 dias (vista panorâmica): a)
grupo controle: defeito ósseo fechado em
extensão; b) grupo amido: anastomose das
trabéculas ósseas na superfície externa do
defeito; c) grupo alendronato 1mol: trabéculas
ósseas no defeito e preenchendo todo o canal
medular (
Ê ). Neoformação óssea extra-cortical
( Ä ); d) grupo alendronato 2moles: evidente
neoformação óssea extra-cortical (
Ä ) e
trabéculas ósseas no defeito e no interior do canal
medular ocupando parcialmente ( Ê ); e) grupo
hidroxiapatita 1mol: trabéculas ósseas
neoformadas em direção ao centro do defeito; f)
grupo hidroxiapatita 2moles: trabéculas ósseas
anastomosadas no delimitando espaços
medulares; g) grupo alendronato mais
hidroxiapatita: trabéculas ósseas projetando-se
para a região externa do defeito e neoformação
extra-cortical (
Ä ). Aumento original 25x. HE......
76
FIGURA 7 - Animais machos, 21 dias (centro do defeito): a)
grupo controle: trabéculas ósseas maduras; b)
grupo amido: trabéculas ósseas e espaços
medulares com tecido conjuntivo frouxo; c) grupo
alendronato 1mol: trabéculas regularmente
anastomosadas; d) grupo alendronato 2moles:
trabéculas e espaços medulares com tecido
conjuntivo frouxo; e) grupo hidroxiapatita 1mol:
amplas trabéculas ósseas; f) grupo
hidroxiapatita 2moles: anastomose das
trabéculas ósseas na superfície externa; g) grupo
alendronato mais hidroxiapatita: delicadas
trabéculas e tecido conjuntivo celularizado.
Aumento original 100x. HE......................................
78
FIGURA 8 - Animais fêmeas, 21 dias (vista panorâmica): a)
grupo controle: trabéculas ósseas fechando o
defeito; b) grupo amido: anastomose das
trabéculas ósseas unindo as margens do defeito;
c) grupo alendronato 1mol: trabéculas e
neoformação óssea extra-cortical (
Ä ); d) grupo
alendronato 2moles: trabéculas no defeito e no
canal medular (
Ê ). Neoformação óssea extra-
cortical ( Ä ); e) grupo hidroxiapatita 1mol:
defeito ósseo preenchido por trabéculas; f) grupo
hidroxiapatita 2moles: trabéculas
anastomosadas fechando o defeito; g) grupo
alendronato mais hidroxiapatita: trabéculas
unindo as margens defeito e neoformação óssea
extra-cortical (
Ä ). Aumento original 25x. HE......
80
FIGURA 9 - Animais fêmeas, 21 dias (centro do defeito): a)
grupo controle: trabéculas ósseas maduras; b)
grupo amido: anastomose das trabéculas ósseas;
c) grupo alendronato 1mol: espaços medulares
com tecido conjuntivo frouxo; d) grupo
alendronato 2moles: trabéculas delimitando
reduzidos espaços medulares; e) grupo
hidroxiapatita 1mol: evidente anastomose das
trabéculas ósseas maduras; f) grupo
hidroxiapatita 2moles: anastomoses das
trabéculas; g) grupo alendronato mais
hidroxiapatita: espaços medulares com tecido
conjuntivo e trabéculas ósseas. Aumento original
100x. HE..................................................................
82
FIGURA 10 - Detalhes histológicos do defeito ósseo: a)
imagem negativa do grânulo de hidroxiapatita
envolvida por células gigantes multinucleadas
(
Ä ); b) trabécula óssea circundada por
osteoblastos ( Ä ) delimitando espaços
medulares ( ); c) osteócito volumoso no interior
da lacuna ( ¨ ) e osteoclasto presente no
espaço medular ( ¼ ); d) linhas reversas ( Ä ).
Aumento original 100x, 100x, 400x e 400x,
respectivamente. HE...............................................
83
FIGURA 11 - Gráfico ilustrativo das médias e DP dos
dados da neoformação óssea nos diferentes
grupos experimentais, aos sete e 21 dias, nos
animais machos e fêmeas.......................................
96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo controle no período de
sete dias, macho e fêmea.....................................
84
TABELA 2 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo amido no período de sete
dias, macho e fêmea.............................................
85
TABELA 3 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo alendronato - 1mol no
período de sete dias, macho e fêmea...................
86
TABELA 4 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo alendronato - 2moles no
período de sete dias, macho e fêmea...................
86
TABELA 5 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo hidroxiapatita - 1mol no
período de sete dias, macho e fêmea...................
87
TABELA 6 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo hidroxiapatita - 2moles
no período de sete dias, macho e fêmea..............
87
TABELA 7 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo alendronato +
hidroxiapatita - 2moles no período de sete dias,
macho e fêmea......................................................
88
TABELA 8 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo controle no período de
21 dias, macho e fêmea................................................
89
TABELA 9 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo amido no período de 21
dias, macho e fêmea.............................................
89
TABELA 10 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo alendronato - 1mol no
período de 21 dias, macho e fêmea......................
90
TABELA 11 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo alendronato - 2moles no
período de 21 dias, macho e fêmea.....................
90
TABELA 12 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo hidroxiapatita - 1mol no
período de 21 dias, macho e fêmea.....................
91
TABELA 13 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo hidroxiapatita - 2moles
no período de 21 dias, macho e fêmea................
91
TABELA 14 - Resultado da contagem total de pontos (P) de
intersecção do retículo sobre as trabéculas
ósseas neoformadas e seu valor em
porcentagem do grupo alendronato +
hidroxiapatita - 2moles no período de 21 dias,
macho e fêmea.....................................................
92
TABELA 15 - Resultado referente aos valores médios da
porcentagem da neoformação óssea, nos
períodos de sete e 21 dias, em animais machos
e fêmeas................................................................
92
TABELA 16 - Estatística descritiva referente aos grupos
experimentais, no período de sete dias, em
machos.................................................................
93
TABELA 17 - Estatística descritiva referente aos grupos
experimentais, no período de sete dias, em
fêmeas..................................................................
94
TABELA 18 - Estatística descritiva referente aos grupos
experimentais, no período de 21 dias, em
machos.................................................................
94
TABELA 19 - Estatística descritiva referente aos grupos
experimentais, no período de 21 dias, em
fêmeas..................................................................
95
TABELA 20 - Análise de variância a três fatores.......................
97
TABELA 21 - Teste de Tukey para comparação entre os
diferentes grupos experimentais e períodos de
observação estudados..........................................
98
FERNANDES, R.G. Estudo da ação local do alendronato sódico, da
hidroxiapatita e da associação alendronato sódico com a
hidroxiapatita, no reparo ósseo de fêmures de ratos. 2005. 127f. Tese
(Doutorado em Biopatologia Bucal, Área de Concentração em
Biopatologia Bucal) - Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista. São José dos Campos, 2005.
RESUMO
Esta pesquisa avaliou o efeito do uso local do alendronato sódico, da
hidroxiapatita e da associação alendronato mais hidroxiapatita em diferentes
concentrações molares, no processo de reparação de defeitos ósseos em
fêmures de ratos. Foi confeccionado no fêmur de 168 ratos (84 machos e 84
fêmeas) um defeito ósseo medindo 2,5mm de diâmetro. Estes animais foram
divididos em grupos: controle, amido, alendronato um mol, alendronato dois
moles, hidroxiapatita um mol, hidroxiapatita dois moles e alendronato mais
hidroxiapatita, de acordo com o material de preenchimento utilizado. Nos animais
do grupo controle o defeito ficou preenchido apenas pelo coágulo proveniente do
defeito. Os animais foram sacrificados aos sete e 21 dias, quando o fêmur era
removido, fixado e descalcificado, para a confecção de lâminas histológicas. Foi
realizada análise histológica e histomorfométrica, e os dados obtidos foram
submetidos à análise estatística ANOVA. Aos sete dias, observava-se trabéculas
ósseas imaturas, contendo grandes osteócitos. Notava-se neoformação óssea
em todos os grupos, exceto nos animais machos onde o alendronato se fazia
presente. Nos grupos que receberam a hidroxiapatita, visualizava-se as imagens
negativas dos grânulos da hidroxiapatita. Aos 21 dias, as trabéculas
praticamente fechavam o defeito da maioria dos espécimes estudados.
Estatisticamente, houve diferenças entre machos e fêmeas, entre os períodos de
observação e com relação ao uso do alendronato. Concluiu-se que a aplicação
local do alendronato sódico interferiu negativamente na reparação óssea, que a
hidroxiapatita e o alendronato mais a hidroxiapatita não interferiram na reparação
e que a reparação óssea foi maior nas fêmeas independentemente do período
estudado.
PALAVRAS-CHAVE: Regeneração óssea; osso; reparação; bisfosfonatos;
alendronato; hidroxiapatita; animal.
1 INTRODUÇÃO
Várias são as pesquisas que visam melhorar e acelerar o
processo de reparação óssea. Inicialmente, com o intuito de substituir
osso perdido, eram realizados enxertos de osso autógeno, provenientes
da costela, tíbia, crista ilíaca e também da região mentoniana. Apesar do
sucesso destes enxertos, ocorriam outras complicações nas áreas
doadoras como infecções, dores, nevralgias, prolongada recuperação etc.
(RANSFORD et al.
64
, 1998). Este fato gerou interesse por outras
pesquisas visando desenvolver materiais que pudessem substituir o osso
perdido, bem como drogas que de alguma maneira auxiliasse o processo
da reparação óssea.
Os materiais para implantes ósseos podem apresentar
três diferentes mecanismos de ação: a osteogênese, a osteoindução e a
osteocondução. Materiais osteogênicos são os capazes de formar osso
diretamente, a partir dos osteoblastos provenientes da área doadora. Os
osteoindutores induzem a transformação de células mesenquimais
indiferenciadas em osteoblastos e intensificam o crescimento ósseo,
mesmo onde ele não é esperado. Por fim, há os materiais
osteocondutores, que são aqueles que permitem aposição óssea a partir
de osso preexistente e necessitam da presença de tecido ósseo (MISCH
& DIETSH
58
, 1993).
Dentre os vários materiais aloplásticos, a hidroxiapatita
tem recebido grande atenção, devido à sua capacidade de integração ao
leito receptor, à sua biocompatibilidade (RUANO et al.
71
, 1996; BARBARA
et al.
4
, 1997; CARIA
11
, 1999; FERNANDES
22
, 2002; XIE et al.
88
, 2004) e
por sua reconhecida propriedade de osteocondução (KENT et al.
44
, 1982;
CHANG et al.
12
, 2000; ORLOVSKII et al.
61
, 2002).
18
Já em relação às drogas estudadas que apresentam a
propriedade de auxiliar o processo da reparação óssea, se destaca um
grupo de fármacos denominado bisfosfonatos. Estes fármacos
apresentam uma molécula bastante estável, além de apresentarem alta
afinidade pela hidroxiapatita do osso ficando retidos no tecido ósseo na
forma inativa, por um longo período, sendo liberados localmente durante
os processos de reabsorção óssea (BIKLE
6
, 1998; SPARIDANS et
al.
78
,1998).
Trabalhos encontrados na literatura relatam que o
alendronato sódico, sendo um aminobisfosfonato, liga-se fortemente aos
cristais de hidroxiapatita do osso, especialmente nos pontos de ativo
remodelamento ósseo (RANG et al.
63
, 2001; SHERMAN
74
, 2001) e
também apresenta a capacidade de inibir a reabsorção óssea, cujo
principal mecanismo de ação está relacionado à diminuição da atividade
osteoclástica (KULAK & BILEZIKIAN
46
, 2000; YAFFE et al.
92
(2000);
RANG et al.
63
, 2001). Assim, o alendronato sódico apresenta como uma
de suas propriedades químicas a redução da perda de tecido ósseo, fato
este que ocorre em doenças caracterizadas pela elevada ação dos
osteoclastos ou por um desequilíbrio na relação osteoblasto-osteoclasto,
como por exemplo na osteoporose, na osteólise induzida por tumores, na
hipercalcemia e na doença de Paget (BRUNSVOLD et al.
10
, 1992;
WEINREB et al.
85
, 1994; OWENS et al.
62
, 1997; YAFFE et al.
90
, 1997;
FOGELMAN et al.
27
, 2000; TORREGROSSSA et al.
82
, 2003).
Devido ao fato de existir na literatura inúmeros trabalhos
que descrevem a ligação entre os bisfosfonatos e os cristais de
hidroxiapatita, principalmente nos pontos de remodelamento ósseo ativo,
acreditamos ser importante continuarmos a estudar a ação dos
bisfosfonatos, em especial do alendronato sódico, associado
concomitantemente ao uso da hidroxiapatita (FERNANDES et al.
23
, 2004),
buscando obter desta associação resultados positivos no processo de
reparação de defeitos ósseos.
2 REVISÃO DA LITERATURA
A literatura será apresentada levando-se em consideração
as variantes que serão objetos de estudo no presente trabalho. Desta
forma, serão apresentados estudos e pesquisas sobre os bisfosfonatos de
uma forma geral com um enfoque específico no alendronato sódico, bem
como trabalhos realizados com a utilização da hidroxiapatita e com a
união desses dois elementos.
2.1 Bisfosfonatos
Os primeiros bisfosfonatos foram sintetizados há mais de
cem anos por Menschutkin, Von Baeyer e Hofmann. Por sua propriedade
de inibir a precipitação de sais de cálcio, a primeira aplicação dos
bisfosfonatos foi como agente anticorrosivo. Não foram descritos como
agentes potencialmente terapêuticos até 1968. Entretanto, desde então,
os bisfosfonatos têm sido pesquisados e desenvolvidos, de forma bem
sucedida, para o tratamento de muitas doenças ósseas (KULAK &
BILEZIKIAN
46
, 2000).
Os bisfosfonatos, também chamados de difosfonatos são
compostos sintéticos análogos ao pirofosfato presente no organismo. O
pirofosfato é constituído por um átomo de oxigênio que está ligado a dois
grupos de fosfato (P-O-P). Nos bisfosfonatos este átomo de oxigênio é
substituído por um átomo de carbono (P-C-P), sendo que o átomo de
carbono que liga os dois grupos de fosfato confere grande resistência à
molécula de bisfosfonato (BIKLE
6
, 1998). Segundo Fleisch
26
(1997),
20
alterações nos radicais (cadeias laterais) e esterificação dos grupos
fosfato resultaram no grande número de diferentes bisfosfonatos descritos
até hoje, onde cada um deles apresenta características físico-químicas e
biológicas próprias, mas todos eles possuem forte afinidade pelo fosfato
de cálcio e, portanto pelo tecido ósseo.
Marcus
53
(1996) citou que o primeiro bisfosfonato de uso
clínico foi o etidronato, mas que este era um potente inibidor da
mineralização, a ponto de desenvolver osteomalácia nos pacientes
tratados com este medicamento. Assim, foram criados outros
bisfosfonatos para diminuir esta ação, compondo os chamados
bisfosfonatos de segunda e terceira gerações. Os constituintes das duas
últimas gerações, além de parecer não inibir a calcificação, podem ser
administrados em esquemas cíclicos e de forma contínua produzindo um
aumento significativo na densidade óssea (FLEISCH
25
, 1991). Grynpas et
al.
37
(1992) afirmaram que estudos em animais têm demonstrado uma
melhora nas propriedades biomecânicas do osso.
Marcus
53
(1996) descreveu ainda que a utilidade clínica
dos bisfosfonatos reside na sua capacidade de inibir a reabsorção óssea.
O autor afirmou que possivelmente, o bisfosfonato se incorpore à matriz
óssea e seja assimilado pelo osteoclasto durante o processo de
reabsorção, inativando esta célula, diminuindo a reabsorção óssea. Os
bisfosfonatos mais recentes chegam a possuir uma potência anti-
reabsorção 10.000 vezes maior que os medicamentos da primeira
geração (KULAK & BILEZIKIAN
46
, 2000). Autores como Fleisch
26
(1997),
Kulak & Bilezikian
46
(2000) e Warner
84
(2000) explicaram que a inibição
da reabsorção óssea proporcionada pelos bisfosfonatos é mediada por
uma ação direta sobre os osteoclastos e em parte pelos osteoblastos, que
passam a produzir um inibidor do recrutamento de osteoclastos. A
supressão do processo de reabsorção óssea dos osteoclastos causada
pela ação destes compostos ainda é um mecanismo que não está bem
esclarecido (YAFFE
et al.
89
, 1995; BIKLE
6
, 1998). Apesar deste
21
mecanismo de ação geral dos bisfosfonatos, cada um dos bisfosfonatos
possui características biológicas e físico-químicas próprias, não sendo
possível, na maioria das vezes, extrapolar os resultados obtidos de um
composto para os demais (KULAK & BILEZIKIAN
46
, 2000).
Sparidans et al.
78
(1998) descreveram que os
bisfosfonatos apresentam alta afinidade pela hidroxiapatita ficando retidos
no osso na forma inativa e são liberados localmente durante os processos
de reabsorção óssea, agindo preferencialmente nos osteoclastos. Os
mecanismos envolvidos podem ser a inibição do recrutamento dos
osteoclastos, a diminuição da aderência dessas células na matriz
mineralizada, e a diminuição na diferenciação e no tempo de vida celular.
Conseqüentemente, ocorre uma diminuição do número de osteoclastos,
possivelmente por indução da apoptose celular. A inibição da atividade
osteoclástica pode ser por um efeito direto do medicamento sobre a
célula, verificado pelas alterações morfológicas celulares, como
modificações no citoesqueleto e na borda em escova. Essas alterações
ocorrem, in vitro, somente quando osteoclastos estão ativamente
reabsorvendo a matriz óssea. Além disso, os autores citaram a
possibilidade da existência de um efeito indireto dos bisfosfonatos
mediado pelos osteoblastos, que liberariam inibidores de atividade e do
recrutamento osteoclástico.
A distribuição tecidual dos bisfosfonatos no tecido não
calcificado em doses terapêuticas é mínima; por outro lado, ligam-se
avidamente a hidroxiapatita do osso (COMPSTON
14
, 1994).
O alendronato é o bisfosfonato mais amplamente utilizado
para o tratamento da osteoporose, elevando a densidade mineral óssea.
Fleisch
26
(1997) relatou que a concentração do alendronato nos
osteoclastos alcança valores bastante altos, induzindo mudanças reais na
morfologia celular, que passa a apresentar maior número de núcleos e
também alterações na borda em escova, que se mostra inativa. Baseado
em estudos, o autor concluiu que a dose mais favorável para o tratamento
22
da osteoporose seria de 10mg/dia. Esta quantidade foi determinada após
serem testadas diferentes doses do medicamento a fim de se estabelecer
a dose ideal. Após um ano de acompanhamento, as mulheres medicadas
com 10mg/dia foram as que apresentaram o maior aumento da densidade
óssea e um grande decréscimo na incidência de novas fraturas.
Visando minimizar alguns efeitos colaterais decorrentes
da ingestão diária do alendronato sódico, como úlceras esofágicas,
constipações ou diarréias, Alekna & Tamulaitiene
1
(2001) descreveram o
desenvolvimento do comprimido de alendronato sódico contendo 70mg
que deve ser ingerido semanalmente. Além de reduzir os efeitos
colaterais já citados, o comprimido semanal proporciona maior conforto ao
paciente e diminui a possibilidade de esquecimento de ingestão do
medicamento.
Os bisfosfonatos, de maneira geral, são fracamente
biodisponíveis, Kulak & Bilezikian
46
(2000) descreveram que somente
uma fração de uma dose oral alcança a circulação sistêmica. Após
administração por via oral do alendronato, sua biodisponibilidade é de
apenas 0,7%. Lin
50
(1996) citou que a absorção oral dos bisfosfonatos é
dose-dependente. O autor, baseado em estudos utilizando ratos,
demonstrou que após uma elevação da dose oral de alendronato de 2
mg/ kg para 40 mg/kg, havia um aumento da concentração da droga no
osso do animal e também um aumento da biodisponibilidade de 0,5%
para 5%. Observou ainda, que estes medicamentos são mais bem
absorvidos no estado de jejum que no pós-prandial, concluindo que a
presença do alimento diminui bastante a eficiência da absorção.
Lin et al.
51
(1991) avaliaram a absorção e a deposição do
alendronato em diferentes animais. Após administração intravenosa, o
alendronato foi rapidamente removido do plasma sendo capturado pelo
osso ou excretado pelos rins. Cerca de 30 a 40% da dose administrada foi
excretada decorridas 24 horas. Nos tecidos não calcificados, houve pouco
ou nenhum acúmulo da droga. Absorção do alendronato administrado por
23
via oral foi estimada em cerca de 0,9% para rato, 1,8% para cachorro e
1,7% para macacos. A meia vida do alendronato variou de duzentos dias
em ratos e, aproximadamente, mil dias em cães. Os autores detectaram
também que o alendronato é metabolicamente estável, pois não houve
evidência de metabólitos da droga na urina dos animais.
Brunsvold et al.
10
(1992) mensuraram os efeitos clínicos e
radiográficos do alendronato na periodontite desenvolvida em 27
macacos, que foram divididos em três grupos nos quais foram
administrados, solução salina (controle), e alendronato em duas diferentes
concentrações (0,05 mg/Kg e 0,25 mg/Kg) na veia safena duas vezes por
semana por um período de 16 semanas. Uma semana após o início do
tratamento nos molares e premolares mandibulares foi colocada uma
ligadura que foi inoculada com Porphyromonas gingivalis para a indução
da doença periodontal. Pela análise radiográfica, o alendronato na
concentração de 0,05 mg/Kg retardou a progressão da periodontite, já a
concentração mais elevada do alendronato não diferiu estatisticamente do
grupo controle. Os índices clínicos não foram afetados estatisticamente
pelas concentrações estudadas.
Weinreb et al.
85
(1994) estudaram a eficácia do
alendronato na redução óssea alveolar causada por periodontite
experimental em macacos. A periodontite foi iniciada em macacos adultos
por meio da colocação de ligaduras nos molares mandibulares até a
junção esmalte-cemento e por subseqüente inoculação de
Porphyromonas gingivalis. Os dentes da outra hemi-arcada não
receberam as ligaduras, sendo usados como controle. Os animais
receberam, por via intravenosa, solução salina (placebo) ou alendronato a
0,05mg/Kg e 0,25mg/Kg, duas vezes por semana, durante 16 semanas.
Os resultados mostraram que nos animais tratados com a solução salina,
a ligadura e a inoculação provocaram uma significativa perda óssea
desde a junção esmalte-cemento até a região da furca. Os animais que
foram tratados com o alendronato a 0,05mg/Kg apresentaram uma
24
redução da perda óssea associada à periodontite. Já a dose de
0,25mg/Kg não foi efetiva na redução da perda óssea na região esmalte-
cemento.
Liberman et al.
49
(1995) trataram 994 mulheres com
osteoporose pós-menopausa, durante um período de três anos. Os
pesquisadores dividiram as mulheres em dois grupos. No primeiro grupo,
as mulheres ingeriram placebo ou foram tratadas com 5mg de
alendronato sódico ou 10 mg de alendronato sódico diariamente, durante
os três anos de estudo. No segundo grupo, as mulheres foram tratadas
durante dois anos com alendronato sódico na dosagem de 20 mg e
durante o terceiro ano com 5 mg de alendronato. Os autores verificaram
que as mulheres tratadas com o alendronato apresentaram um aumento
progressivo e significante na densidade óssea em todo o esqueleto,
enquanto as que receberam o placebo exibiram um decréscimo da
densidade óssea. Deste modo, afirmaram que o tratamento diário com o
alendronato aumentou progressivamente a massa óssea corpórea e
reduziu a incidência de fraturas vertebrais, a progressão de deformidades
e perda de altura nas mulheres tratadas.
Reddy et al.
65
(1995) utilizaram o alendronato em cães
com doença periodontal, administrando dose de 3,0mg/kg,
semanalmente, por via oral, por um período de seis meses. Clinicamente,
notaram diminuição da mobilidade dentária e por meio de análise
histomorfométrica, observaram um aumento significante da densidade da
massa óssea dos animais medicados, comparado ao grupo controle (não
medicado).
Owens et al.
62
(1997) estudaram a ação do alendronato
durante o mecanismo de reabsorção óssea. Devido a sua localização nas
superfícies ósseas, os autores compararam a sensibilidade dos
componentes do processo de reabsorção. Observaram que a ativação
dos osteoclastos a partir de células estromais e/ou osteoblastos é
aparentemente o componente mais sensível do processo da reabsorção
25
óssea e que a habilidade do alendronato de suprimir a ativação
osteoclástica não depende da liberação do alendronato das superfícies
ósseas.
Yaffe et al.
90
(1997) demonstraram que cirurgias de
retalhos mucoperiosteais realizadas em ratos desencadeiam uma
reabsorção óssea alveolar similar às observadas clinicamente em
humanos. Os autores também demonstraram em trabalhos anteriores,
que um aminobisfosfonato que é usado na prevenção da reabsorção
óssea na osteoporose e em outras doenças ósseas reduzem a
reabsorção óssea alveolar em modelos de ratos quando administrado
sistemicamente. Assim, eles avaliaram o efeito da aplicação local do
aminobisfosfonato associado a retalhos mucoperiosteais realizados na
região dos premolares e molares da mandíbula de ratos aplicando este
medicamento sobre a superfície óssea exposta e posteriormente
recobrindo a região com o mesmo retalho. Os resultados mostraram que a
distribuição local do aminobisfosfonato reduziu significativamente a
reabsorção óssea alveolar ativada pelo retalho mucoperiosteal. Este
estudo sugeriu que a aplicação local deste medicamento pode ser
utilizada como uma terapia complementar na redução da perda óssea
pós-cirúrgica.
Giuliani et al.
32
(1998) afirmaram que estudos in vitro têm
mostrado que os bisfosfonatos além de atuarem como potentes inibidores
dos osteoclastos na reabsorção óssea, podem também apresentar
alguma ação direta sobre os osteoblastos. Por este motivo, os autores
estudaram os efeitos em curto prazo de dois bisfosfonatos na formação
de precursores de osteoblastos em culturas de medula óssea de ratas
jovens e senis. Os animais jovens foram tratados semanalmente com
injeções subcutâneas de etidronato (0,3mg/Kg, 3mg/Kg e 30mg/Kg) ou
alendronato (0,3µg/Kg, 3µg/Kg e 30µg/Kg). Os animais senis foram
tratados com as doses mais baixas de ambas as drogas. Os autores
descreveram que a escolha das concentrações dos bisfosfonatos foi
26
devido à melhora das propriedades morfológicas do osso de ratas
ovariectomizadas que foram tratadas com estas mesmas concentrações.
Decorrido um mês de tratamento, os animais jovens e
senis foram sacrificados e, de cada animal foram obtidas células da
medula óssea. Posteriormente, estas células foram utilizadas para a etapa
do estudo in vitro, no qual foram observadas as unidades formadoras de
colônias. Depois de um mês de tratamento, o etidronato (0,3mg/Kg e
3mg/Kg) e o alendronato (0,3µg/Kg e 3µg/Kg) aumentaram
significativamente o número de unidades formadoras de colônias na
medula óssea dos animais jovens e senis ao passo que as doses mais
elevadas de ambas as drogas não tiveram efeito nos animais. Os
resultados, somados a observações anteriores dos efeitos da formação
óssea na osteoporose, sugeriram que os bisfosfonatos podem possuir, in
vivo, uma influência potencialmente relevante nas células da linhagem
dos osteoblastos, distinta das suas ações inibitórias sobre os
osteoclastos. Além disso, os autores conjeturaram que a presença destas
drogas, em baixas concentrações no osso e na medula óssea, podem
estimular o processo de osteoblastogênese.
Giuliani et al.
33
(1998) realizaram um estudo in vitro, a fim
de investigar o potencial do etidronato e do alendronato sódico sobre os
osteoblastos na formação óssea. Foram avaliados o número de unidades
formadoras de colônias de fibroblastos e o número de nódulos
mineralizados em culturas de osso de rato e de osso humano. Os
resultados indicaram que nas culturas de medula óssea de ratos o
etidronato e o alendronato estimularam a formação de unidades
formadoras de colônia. Foi observado que os nódulos mineralizados
foram inibidos pelos bisfosfonatos em altas concentrações (>10
-6
M) e
foram estimulados em concentrações mais baixas (de 10
-7
M a 10
-9
M
para o etidronato e de 10
-7
M a 10
-10
M para o alendronato). Nas culturas
de medula óssea humana, os resultados foram similares. O alendronato
estimulou as unidades formadoras de colônias com um efeito máximo
27
obtido a uma concentração de 10
-10
M. Esta mesma concentração
também foi a que apresentou um melhor efeito em relação à formação
dos nódulos mineralizados. Assim, os autores concluíram que estes
bisfosfonatos afetaram diretamente os osteoblastos proporcionando um
efeito positivo na formação óssea, provavelmente pela estimulação de
fatores de crescimento destas células.
Gandolfi et al.
29
(1999) realizaram um estudo in vitro
utilizando culturas de osteoblastos, nas quais observaram os estágios
iniciais do crescimento osteoblástico na presença de dois diferentes
bisfosfonatos: o alendronato e o neridronato. A atividade osteoblástica foi
geralmente observada nas células em contato com o alendronato e com o
neridronato, exceto na concentração de 10
-4
do neridronato onde foi
observado bioquimicamente, um claro efeito tóxico nas células. Desta
maneira, pela detecção de marcadores osteoblásticos associados à
correta configuração ultra-estrutural da morfologia das organelas
citoplasmáticas dos osteoblastos sustentaram a hipótese dos
pesquisadores sobre a ação metabolicamente positiva das moléculas de
alendronato e de neridronato nos osteoblastos.
Yaffe et al.
91
(1999) investigaram a efetividade da
absorção do alendronato pelo osso aplicando topicamente este
medicamento em sítios cirúrgicos com o auxílio de uma esponja
gelatinosa encharcada por esta substância. Os resultados mostraram que
10% do total de alendronato contido na esponja foi absorvido pelo osso
localmente. Decorrentes disto, os pesquisadores afirmaram que a
distribuição local do alendronato e sua afinidade pelo osso podem se
tornar dados muito importantes no tratamento preventivo da reabsorção
óssea durante procedimentos ortopédicos e dentários.
Binderman et al.
7
(2000) explicaram que em alguns
procedimentos cirúrgicos onde são realizados retalhos mucoperiosteais, a
atividade osteoclástica é ativada, ocorrendo uma reabsorção óssea
nestes locais. Baseados nesta informação realizaram cirurgias com
28
elevação de um retalho mucoperiosteal próximo aos molares da
mandíbula de ratos. No primeiro grupo experimental, o alendronato foi
aplicado topicamente em diferentes concentrações, sendo elas: 1mg/ml,
5mg/ml, 20mg/ml, ou 40mg/ml. O medicamento foi aplicado com uma
esponja gelatinosa encharcada com esta substância sobre a superfície
óssea exposta do lado direito, por no mínimo duas horas. No segundo
grupo experimental, o alendronato foi aplicado nas doses de 50µg, 200µg
e 400µg e distribuído topicamente na região submucosa da bochecha do
lado esquerdo, dentro de um pequeno corte no qual a esponja gelatinosa
encharcada com a droga era posicionada. Os resultados demonstraram
que a aplicação tópica do alendronato nas concentrações de 200µg e
400µg foi significativamente efetiva na redução da perda óssea.
Geralmente a porcentagem da perda óssea moderada aumentou com
uma elevação da dose do alendronato, enquanto que a porcentagem de
reabsorção severa diminuía com o aumento da dose de alendronato.
D’Aoust et al.
15
(2000) estudaram a ação do etidronato em
relação à promoção da diferenciação de osteoblastos em feridas ósseas
na calvária de ratos. Os autores observaram que nos animais medicados,
houve um melhor fechamento da ferida óssea quando comparado aos
animais do grupo controle. Os pesquisadores relataram que houve uma
osteo-estimulação demonstrada por um aumento da formação de matriz
óssea e depois de cessado o tratamento com o bisfosfonato, houve um
aumento na mineralização desta matriz óssea neoformada.
Kaynak et al.
41
(2000) analisaram histologicamente a
efetividade da aplicação local do alendronato na prevenção da reabsorção
óssea alveolar associada a retalhos mucoperiosteais na mandíbula de
ratos. Os parâmetros analisados histopatologicamente foram: a presença
de infiltrado de células inflamatórias no tecido periodontal, o número e a
morfologia dos osteoclastos do osso alveolar e do septo interdental, os
componentes fibróticos (fibras colágenas), a existência de lacunas de
reabsorção e a existência de osteoblastos ativos. Não houve diferenças
29
estatisticamente significativas entre o grupo tratado com o alendronato e o
grupo controle no que diz respeito à presença do infiltrado de células
inflamatórias, ao número de osteoclastos e à atividade dos osteoblastos.
Já, em relação aos componentes fibróticos, à morfologia dos osteoclastos
e à existência de lacunas de reabsorção óssea houve diferenças
estatísticas. Os autores consideraram que a aplicação local do
alendronato pode ser usada como uma terapia coadjuvante na redução
da perda óssea desencadeada cirurgicamente, bem como em
procedimentos cirúrgicos odontológicos, onde materiais de enxerto ou de
implante forem necessários.
Manolagas
52
(2000) relatou que os bisfosfonatos são
potentes inibidores da reabsorção óssea e extremamente efetivos no
tratamento de osteoporose e doenças relacionadas à perda de osso. O
mecanismo principal destas drogas está relacionado à ocorrência da
diminuição de células progenitoras de osteoclastos, da diminuição do
recrutamento dos osteoclastos e da promoção de apoptose dos
osteoclastos maduros reduzindo desta forma a velocidade da reabsorção
e do remodelamento ósseo. Além disso, o tratamento a longo prazo com
essas drogas tem demonstrado uma elevação no número e na atividade
de osteoblastos aumentando a possibilidade de que os bisfosfonatos não
só reduzam a reabsorção óssea, mas também possam ter um efeito
positivo na formação de osso.
Reinholz et al.
66
(2000) estudaram a ação direta de vários
bisfosfonatos na proliferação celular, expressão genética e formação
óssea por meio de culturas de osteoblastos provenientes de fetos
humanos. Em culturas tratadas com pamidronato, ocorreu um aumento da
proteína celular total, da atividade de fosfatase alcalina, bem como a
secreção de colágeno tipo I a partir dos osteoblastos. De acordo com
estes fatos, a taxa de formação óssea também aumentou nesta cultura de
osteoblastos. A fraca ação do etidronato e o potente zoledronato também
foram comparados com a ação do pamidronato sobre a proliferação dos
30
osteoblastos humanos e sobre a taxa de formação óssea. O pamidronato
e o zoledronato diminuíram a proliferação celular com igual potência, ao
passo que o etidronato diminuiu esta proliferação somente em
concentrações muito altas. Quanto à formação óssea, o pamidronato e o
zoledronato aumentaram a formação óssea, porém nenhum aumento foi
observado pela ação do etidronato. Os autores finalizaram seu trabalho
afirmando que estes resultados sugerem fortemente que o tratamento
com pamidronato ou zoledronato aumenta a diferenciação e a atividades
formadoras de osso pelos osteoblastos.
Silva
75
(2000) avaliou a ação do alendronato sódico na
reparação óssea de ratas ovariectomizadas. Foram utilizadas 36 ratas
adultas, formando quatro grupos constituídos por nove ratas
ovariectomizadas e em cada animal foi realizada uma lesão na tíbia. O
grupo controle não recebeu medicamento, enquanto os outros três grupos
foram tratados com doses de 0,25mg/kg, 0,5mg/kg e 0,75mg/kg na água
de beber, diariamente. Foram sacrificadas três ratas de cada grupo nos
períodos de três, sete e 14 dias. A análise histológica das tíbias revelou
uma deposição óssea mais marcante nos grupos tratados com doses
mais elevadas de alendronato. O grupo de 14 dias, com dose de
0,5mg/kg, apresentou a deposição de trabéculas mais maduras e
organizadas, sugerindo um processo de remodelação já bem
desenvolvido, mostrando assim ser a ação do alendronato sódico dose-
dependente.
Yaffe et al.
92
(2000) realizaram retalhos mucoperiosteais
na face lingual e vestibular, próximo aos dentes molares em ambos os
lados da mandíbula de ratos. Por meio de uma esponjosa gelatinosa, os
bisfosfonatos foram aplicados a partir de uma solução de 20mg da
substância diluída em 1 ml de solução salina. Neste trabalho, foi
comparado o efeito do etidronato e do alendronato e de três outros
bisfosfonatos: VS-5, VS-6 e ISA-13 na diminuição da reabsorção óssea.
Os resultados indicaram que VS-5, VS-6 e ISA-13 reduziram a reabsorção
31
óssea de forma mais eficaz que o etidronato e menos eficaz que o
alendronato. Os autores concluíram que o alendronato aplicado
topicamente foi o bisfosfonato mais efetivo para a redução da perda
óssea.
Fayad
21
(2001) avaliou as ações de duas formulações de
bisfosfonatos no processo de reparação óssea em mandíbulas de ratos.
Foi confeccionado um defeito ósseo na mandíbula de 92 ratos e estes
foram divididos em cinco grupos, sendo: um controle; um medicado com
alendronato durante dez dias, iniciando o tratamento no dia da cirurgia;
um medicado com clodronato durante dez dias, iniciando o tratamento no
dia da cirurgia; um medicado com alendronato durante dez dias, iniciando
o tratamento cinco dias antes da cirurgia e um medicado com clodronato
durante dez dias, iniciando o tratamento cinco dias antes da cirurgia;
todos na dose de 1mg/kg/dia. Baseado nos resultados obtidos foi
concluído que o alendronato e o clodronato não estimularam a reparação
óssea neste modelo experimental e que a administração prévia à
confecção do defeito não apresentou ação benéfica no processo de
reparo.
Ringe et al.
67
(2001) trataram homens que apresentavam
osteoporose, utilizando o alendronato sódico, na posologia de 10mg/dia,
por via oral e, acompanharam estes pacientes por um período de dois
anos. Decorrido este período de tratamento com o alendronato sódico, os
autores verificaram um aumento de 10,1% na densidade mineral óssea
nas vértebras lombares, uma redução no índice de novas fraturas
vertebrais por volta de 7,4% e por fim, constataram que a terapia, além de
proporcionar efeitos que favoreceram melhoria na densidade mineral
óssea, foi também bem tolerada e promoveu uma estabilização da
osteoporose em todos os pacientes.
32
Sherman
74
(2001) descreveu que a terapia com
bisfosfonatos incluem drogas como o alendronato e o residronato, sendo
que ambas vêm sendo aprovadas na prevenção e no tratamento da
osteoporose pós-menopausa. O principal mecanismo de ação para o
potente efeito de inibir a reabsorção óssea está vinculado à ligação dos
bisfosfonatos aos cristais de hidroxiapatita do osso e subseqüente
inibição da produção e/ou atividade de osteoclastos. Foi demonstrado no
Fracture Intervention Trial, que o alendronato promoveu benefícios
substanciais ao esqueleto em mulheres pós-menopausa em duas
categorias: naquelas com pouca massa óssea e naquelas com pouca
massa óssea e com fraturas vertebrais. Em 2027 mulheres, com idade
variando dos 55 aos 81 anos, com pouca densidade de massa óssea e
com pelo menos uma fratura vertebral, 36 meses do uso do alendronato
aumentou significativamente a densidade óssea, comparando com o uso
de placebo, com valores em cerca de 6,2% na vértebra lombar, 4,7% no
quadril e 4,1% no fêmur. O tratamento com alendronato resultou numa
diminuição de 47% no risco de fraturas vertebrais em pacientes
acompanhadas radiograficamente. As fraturas no quadril e no punho,
também foram significantemente reduzidas em 50%, aproximadamente.
Estes efeitos foram observados com uma dose de alendronato de 5mg/dia
e aumentada para 10mg/dia, no terceiro ano experimental.
Jianhua et al.
40
(2002) avaliaram o efeito do alendronato
nas propriedades estruturais dos ossos trabeculares de cães. O grupo
tratado diariamente com uma dose de 0,5mg/Kg por um período de 12
semanas demonstrou um aumento no volume ósseo nas vértebras
lombares L1 e L2 em 9,5% e 7,7%, respectivamente. Os autores
concluíram que o alendronato induziu uma maior densidade mineral da
superfície óssea.
33
Michigami et al.
57
(2002) realizaram um estudo para
verificarem a ação do alendronato sódico
em relação aos osteoblastos.
Os autores relataram que o mecanismo de ação desta droga não está
bem estabelecido, mas que certamente, as moléculas de alendronato são
incorporadas ao tecido ósseo e atingem os osteoclastos, inativando estas
células e também desencadeando a apoptose das mesmas. Desta forma,
ocorre uma redução na reabsorção óssea. O objetivo do trabalho foi
verificar como este fármaco agia sobre os osteoblastos. Os resultados
apontaram que o alendronato sódico apresentou um mecanismo de ação
que ativa os osteoblastos, ou seja, ocorre um aumento no metabolismo
celular dos osteoblastos e desta maneira, os autores concluíram que esta
droga promove a neoformação óssea.
Solomon
77
(2002) afirmou que diversos bisfosfonatos,
como por exemplo o alendronato, exercem uma ação direta nos
osteoclastos para inibir a reabsorção óssea. Além disso, podem
apresentar uma ação nos osteoblastos, porém o mecanismo específico
pelo qual estas drogas agem e previnem as fraturas ósseas em mulheres
com osteoporose ainda foi esclarecido.
Tenenbaum et al.
80
(2002) escreveram um artigo
revisando a literatura científica resgatando as aplicações potenciais dos
bisfosfonatos na terapêutica da doença periodontal. Os autores
descreveram que foi demonstrada a direta formação de matriz óssea
durante o tratamento com etidronato em uma dosagem de 15mg/Kg, bem
como houve posterior mineralização desta matriz óssea neoformada após
a interrupção do tratamento com o alendronato. Devido a este fato
especulou-se que os bisfosfonatos e o etidronato, em particular, poderiam
não só ser úteis na prevenção da perda óssea mediada por osteoclastos,
mas também, em condições apropriadas, estimularem a formação óssea.
Os pesquisadores reforçam esta informação dizendo que de fato, em
estudos realizados por eles anteriormente, o etidronato pôde ser utilizado
34
para estimular a formação de matriz óssea no interior de sistemas de
implantes endósseos recobertos por titânio.
Biswas et al.
8
(2003) avaliaram, por questionários
enviados a médicos ingleses, os principais efeitos colaterais e as razões
para a interrupção no tratamento com alendronato sódico, em 11.916
pacientes com osteoporose pós-menopausa. As condições mais
encontradas foram náuseas e vômitos, dor abdominal, dispepsia,
esofagite e refluxo esofagiano. Reações adversas mais severas,
possivelmente relacionadas ao alendronato, foram os relatos únicos de
angioedema, eritema multiforme, hipercalcemia e hipocalcemia. Baseados
neste questionários, os autores concluíram que o alendronato é bem
tolerado na maioria dos pacientes. Entretanto, os efeitos gastrintestinais,
como esofagite e úlcera esofagiana, são freqüentes.
Gonnelli et al.
34
(2003) avaliaram o efeito do alendronato
por três anos no tratamento da osteoporose em homens. O tratamento
com alendronato aumentou significantemente a densidade mineral óssea
na coluna lombar em 4,2% após um ano, 6,3% após dois anos e 8,8%
após três anos. Em conclusão, o estudo confirmou que o alendronato
representa um avanço terapêutico importante no controle da osteoporose
masculina e a análise da densidade mineral óssea da coluna lombar
pareceu ser o melhor método para monitorar o efeito do medicamento na
massa óssea em osteoporose masculina.
Greenspan et al.
36
(2003) compararam tratamentos da
osteoporose pós-menopausa baseados na reposição hormonal ou no uso
de alendronato (10mg diário) e na combinação de ambos agentes. Os
autores concluíram que todas as terapias foram bem toleradas por três
anos e, após esse tempo de estudo, houve um maior aumento na
densidade mineral óssea, em vértebras e fêmures, na terapia combinada
que nas monoterapias. O aumento médio da massa óssea do quadril de
mulheres tratadas apenas com alendronato foi significantemente maior
que aquele obtido no grupo com reposição hormonal.
35
Kaynak et al.
42
(2003) estudaram o efeito da
administração sistêmica do alendronato a 0,5mg/Kg na prevenção da
reabsorção óssea alveolar desencadeado por cirurgias de retalho
mucoperiosteal. Foram aplicadas injeções subcutâneas uma semana
antes da cirurgia, imediatamente antes da cirurgia e uma semana após a
cirurgia. Os parâmetros determinados foram o infiltrado de células
inflamatórias adjacente ao tecido periodontal, formação de fibrose e de
fibras colágenas, número e morfologia dos osteoclastos do osso alveolar
e do septo interdental, lacunas de reabsorção e atividade osteoblástica.
Baseados nos resultados obtidos, os autores concluíram que a
administração sistêmica de 0,5 mg/Kg de alendronato foi efetiva na
prevenção da perda óssea alveolar e na modulação dos fatores
inflamatórios teciduais.
Masud & Giannini
54
(2003) descreveram que o resultado
clínico mais importante no tratamento da osteoporose é a redução de
fraturas. As terapias atuais com bisfosfonatos foram as mais estudadas,
principalmente, em relação aos etidronato, alendronato e residronato. Os
autores citaram que o alendronato e o residronato apresentaram as mais
fortes evidências de redução nas fraturas vertebrais e não-vertebrais.
Sambrook
72
(2003) demonstrou que o uso do
alendronato a longo prazo é um tratamento efetivo contra a osteoporose e
quando utilizado diariamente, geralmente, é bem tolerado, mas que em
alguns pacientes ocorreram sintomas gastrintestinais. O autor sugeriu que
a dose semanal é segura e parece ser tão eficaz quanto a administração
diária, promovendo uma melhor comodidade ao paciente.
Sambrook et al.
73
(2003) estudaram o efeito do
alendronato, do calcitriol e da vitamina D na prevenção e tratamento da
perda óssea induzida por glicocorticóides. 195 indivíduos foram divididos
em três grupos tratados, sendo estes com calcitriol, ou vitamina D mais
carbonato de cálcio, ou alendronato (10mg/dia) mais carbonato de cálcio.
Após dois anos, a média das alterações na densidade mineral dos ossos
36
lombares foi de 5,9% com alendronato, 0,5% com vitamina D e 0,7% com
calcitriol. Seis de 66 pacientes tratados com calcitriol, um dos 61 tratados
com vitamina D e nenhum dos 64 pacientes medicados com alendronato
apresentaram novas fraturas vertebrais. Os autores concluíram que o
tratamento com alendronato é o mais indicado para prevenir as perdas
ósseas induzidas por glicocorticóides.
Torregrosa et al.
82
(2003) estudaram o efeito do
alendronato em pacientes transplantados renais com osteoporose
induzida pelo uso de corticosteróides. Doze meses após o transplante, 14
pacientes foram medicados com alendronato sódico 10mg/dia acrescido
com vitamina D e cálcio e 12 pacientes controles foram tratados com
vitamina D e cálcio apenas. Após um ano de estudo, os pacientes
tratados com alendronato exibiram uma maior densidade mineral óssea.
As vértebras lombares do grupo medicado com o bisfosfonato
apresentaram aumento na densidade mineral de 4,3-6,1% contra 0,55-
5,30% do grupo controle.
Duarte et al.
19
(2004) avaliaram o impacto da terapia com
alendronato e da reposição hormonal (com 17β estradiol) sobre a
periodontite experimental em ratas ovariectomizadas. A ovariectomia
gerou um impacto direto sobre o osso alveolar, sem considerar o acúmulo
de placa e, aumentou, significantemente, a perda óssea da periodontite
induzida. A administração do alendronato, mas não a reposição hormonal,
reduziu significantemente o efeito da ovariectomia na perda óssea
relacionada com a periodontite.
Rocha et al.
68
(2004) investigaram o efeito do tratamento
com alendronato oral sobre as medidas radiológicas e clínicas da doença
periodontal estabelecida em quarenta mulheres na pós-menopausa. O
grupo controle e o grupo tratado com alendronato receberam tratamento
periodontal no início do tratamento. A doença periodontal melhorou em
ambos grupos, mas houve melhores resultados, em relação à
profundidade de sondagem de bolsa periodontal e densidade mineral
37
óssea do osso esponjoso, no grupo que recebeu alendronato (10mg/dia).
Os autores sugeriram que o tratamento com alendronato melhorou o
quadro clínico da doença periodontal, podendo ser útil no tratamento
periodontal de mulheres na pós-menopausa.
2.2 Hidroxiapatita
A hidroxiapatita é o principal componente mineral do
tecido ósseo, constituindo cerca de 75% do seu peso. No osso maduro, a
hidroxiapatita aparece em forma de cristais com 15Å a 30Å de espessura
e 100Å de comprimento. Estes cristais contêm cálcio, fósforo e íons
hidroxila. A distribuição dos cristais de hidroxiapatita no tecido ósseo
ocorre de forma regular, em intervalos de 600Å a 700Å ao longo dos
prolongamentos das fibras colágenas e também da interação com outras
proteínas não-colagenosas, o que proporciona a solidez e rigidez do osso
(WEISS & GREEP
86
, 1981).
Vários estudos experimentais foram realizados antes da
aplicação clínica da hidroxiapatita, mas devido as suas propriedades, a
hidroxiapatita vem sendo usada como um substituto do enxerto ósseo
autógeno em várias situações. Denissen & De Groot
16
(1979) a utilizaram
como aumento e manutenção do rebordo alveolar. Kenney et al.
43
(1985)
e Naaman Bou-Abboud et al.
59
(1994) fizeram aplicação em defeitos
periodontais; Frame
28
(1987) em cirurgias buco-maxilo-faciais; Wolford et
al.
87
(1987) em cirurgias ortognáticas e, atualmente, uma das suas
maiores aplicabilidades está sendo na área da implantodontia, associada
principalmente aos implantes de titânio.
A hidroxiapatita de cálcio é também denominada apatite
ou hidróxido de fósforo pentacálcico, cuja fórmula química é
Ca
10
(PO)
4
(OH)
2
. Ela apresenta grande biocompatibilidade, tanto em
38
tecidos duros como em tecidos moles e sua principal função é a
osteocondução, pois o fosfato de cálcio proporciona uma matriz para que
se deposite osso novo entre as partículas do implante e o osso
subjacente (KENT et al.
44
, 1982; CARIA
11
, 1999). Análises químicas
mostraram que as apatitas biológicas presentes no esmalte, na dentina e
no osso não são hidroxiapatitas puras, pois contêm outros íons incluindo
CO
3
, HPO
4
, F, Cl, Mg, Na, K e algum traço de Zn e Sr, o que determinaria
uma fórmula aproximada de (CaX)
10
(PO
4
HPO
4
CO
3
)
6
(OH Y)
2
, onde X são
cátions (Mg, Na, Sr) que podem substituir os íons cálcio e Y são ânions
(Cl e F) que podem substituir o grupo hidroxila (LEGEROS
47
, 2002).
Os biomateriais a base de fosfato de cálcio diferem
quanto à origem (natural ou sintéticos), quanto à composição
(hidroxiapatita, beta-tricálcio fosfato e fosfato de cálcio bifásico), em
relação à forma física de apresentação (partículas, blocos, cimentos,
coberturas de implantes metais, compósitos com polímeros) e também
segundo propriedades físico-químicas. Esses biomateriais têm outras
propriedades importantes como a similaridade com o mineral ósseo, a
bioatividade, que representa a habilidade de formar material semelhante à
apatita óssea na sua superfície, capacidade de promover funções
celulares que conduzem a formação de uma única e forte interface osso-
biomaterial, e a osteocondução, ou seja, habilidade de fornecer um
apropriado suporte ou molde para a formação óssea (LEGEROS
47
, 2002).
Bell & Beirne
5
(1988) avaliaram os efeitos da
hidroxiapatita e do trifosfato de cálcio usados isoladamente ou misturados
ao colágeno, no reparo de defeitos ósseos criados cirurgicamente, na
mandíbula de trinta ratos. Decorridas quatro e 12 semanas após os
implantes, os animais foram sacrificados e confeccionaram-se lâminas
com cortes histológicos da área do defeito ósseo, contendo os materiais
implantados, sendo os cortes histológicos observados por microscopia de
luz. Observou-se osso em contato direto com os materiais implantados,
que estavam na periferia do defeito, porém na porção central destes, os
39
implantes estavam circundados por tecido conjuntivo fibroso, contendo
macrófagos e algumas células gigantes multinucleadas. Tão pouco a
hidroxiapatita ou o trifosfato de cálcio induziram a reparação do defeito
ósseo e mais, o uso do colágeno também não interferiu positiva ou
negativamente no processo de reparação do defeito ósseo.
Eldeeb & Roszkowski
20
(1988) avaliaram o uso de uma
hidroxiapatita em grânulos e em blocos como material de enxerto para
resolução de deformidades ósseas cranianas em macacos. O
experimento foi realizado em 12 animais, que foram sacrificados aos três,
seis e 12 meses, após a cirurgia de implante. Uma avaliação clínica
revelou que a hidroxiapatita em grânulos começou a se estabilizar dentro
de três a quatro semanas, mas houve perda de altura, devido à
acomodação do material com o tecido subpericranial. A hidroxiapatita em
blocos manteve a altura do contorno craniano, mas 25% dos enxertos
exibiram mobilidade. Uma avaliação histológica revelou que não houve
evidência de inflamação ou reabsorção óssea em ambas as formas da
hidroxiapatita. Os grânulos de hidroxiapatita ficaram separados entre eles
e entre a interface óssea por uma camada de fibras colágenas, sendo que
a hidroxiapatita em bloco foi também circundada por uma cápsula fibrosa.
Não houve sinais de adesão entre os grânulos de hidroxiapatita. A
interface osso-hidroxiapatita estava separada por uma camada fibrosa
presente nos espécimes com a hidroxiapatita em grânulos, com exceção
de um espécime no grupo de um ano de avaliação, que mostrou evidente
formação óssea em parte desta interface. Os autores concluíram que o
uso da hidroxiapatita em grânulos como material de enxerto para correção
de deformidades ósseas cranianas em macacos é mais estável que a
hidroxiapatita em bloco. Entretanto, a hidroxiapatita em bloco manteve um
melhor contorno na forma estrutural.
Alper et al.
2
(1989) estudaram histologicamente,
bioquimicamente e radiograficamente o efeito da implantação de
hidroxiapatita de uma matriz óssea desmineralizada e da combinação
40
destes materiais, em defeitos ósseos realizados em ratos para verificar a
indução da formação óssea, baseados no fato de que estes materiais
vêem sendo estudados como agentes osteogênicos. Histologicamente, foi
demonstrado um decréscimo na neoformação óssea ocorrida com a
utilização da hidroxiapatita, comparada à neoformação óssea ocorrida no
grupo controle. Os cristais de hidroxiapatita foram encapsulados por
tecido conjuntivo fibroso. Pela análise bioquímica foi demonstrado um
decréscimo de 16% na formação óssea nos ratos que receberam implante
de matriz óssea desmineralizada, um decréscimo de 80% no grupo que
recebeu a hidroxiapatita e um decréscimo de 80% no grupo que recebeu
o implante de ambos os materiais associados. A análise radiográfica
correspondeu positivamente aos resultados histológicos e bioquímicos.
Os autores concluíram que a osteogênese em defeitos ósseos foi
aumentada com a implantação da matriz óssea desmineralizada,
enquanto que a hidroxiapatita interferiu negativamente na formação de
novo osso em ratos. Na presença de ambas as substâncias, a
hidroxiapatita pareceu impedir o aumento da neoformação óssea,
prejudicando qualquer efeito positivo observado com a matriz óssea
desmineralizada.
Cobb et al.
13
(1990) realizaram um trabalho experimental
visando avaliar por microscopia óptica, microscopia de transmissão e
microscopia de varredura, a regeneração óssea de defeitos ósseos
mandibulares realizados em macacos que, posteriormente, receberam
enxertos constituídos de uma mistura de hidroxiapatita e osso autógeno.
Utilizaram-se 15 animais, sendo que nestes foram realizados defeitos
ósseos no corpo da mandíbula no lado esquerdo e no lado direito. Em
todos os animais, o defeito ósseo do lado direito foi restaurado 100% com
osso autógeno, retirado da crista ilíaca. O defeito do lado esquerdo foi
restaurado da seguinte forma: três animais permaneceram com o defeito
vazio; três animais receberam implante na proporção de 25% de
hidroxiapatita e de 75% de osso autógeno; três animais receberam
41
implante na proporção de 50% de hidroxiapatita e osso autógeno; três
animais receberam implante na proporção de 75% de hidroxiapatita e de
25% de osso autógeno e três animais receberam implante constituído de
100% de hidroxiapatita. Neste estudo, as descrições das observações
microscópicas dos defeitos controles e dos defeitos que receberam
implantes foram realizados decorridos seis e 18 meses das cirurgias.
Os resultados confirmaram a biocompatibilidade da
hidroxiapatita, sendo que alguns espécimes exibiram diferentes graus de
regeneração óssea, que se relaciona com a composição porcentual da
hidroxiapatita. Aos 18 meses, 86% e 91% dos grânulos de hidroxiapatita
estavam completamente circundados por osso nos espécimes que
receberam implante constituído de 25% e 50% de hidroxiapatita,
respectivamente. Já nos espécimes que receberam implante de 75% e
100% de hidroxiapatita houve encapsulamento ósseo de 75% e 66% dos
grânulos, respectivamente. Baseado nestes resultados, os autores
indicaram o uso de grânulos de hidroxiapatita densa associada a osso
autógeno, na proporção de 3:1 a 1:1 (osso autógeno e hidroxiapatita),
para cirurgias ósseas reconstrutivas.
Lehtinen et al.
48
(1990) realizaram cinco cavidades
medindo três milímetros, em cada uma das tíbias de cinco coelhos. Uma
das cavidades permaneceu vazia, servindo de controle e as outras quatro
cavidades foram preenchidas cada uma com quatro diferentes
hidroxiapatitas, cujas partículas possuíam diferentes formas e o tamanho
de cada partícula variava de 0,42 a 1mm. Os coelhos foram sacrificados
nos períodos de quatro semanas, seis semanas, dois, quatro e seis
meses após a cirurgia. As tíbias foram fixadas, descalcificadas e
embebidas em parafina, sendo posteriormente seccionadas, coradas por
hematoxilina e eosina e estudadas por microscopia de luz. Foi observado
pelos autores que todas as partículas causaram uma moderada resposta
inflamatória, que desapareceu em dois meses. A linha entre o osso
original e o osso neoformado permaneceu visível até o período de seis
42
meses e não houve diferença no padrão de regeneração entre os vários
tipos de produtos utilizados. Desta forma, os pesquisadores afirmaram
que quando cavidades ósseas são preenchidas com partículas de
hidroxiapatita, a forma e o tamanho destas partículas não interferem no
processo de reparo.
Granjeiro et al.
35
(1992) avaliaram diferentes
hidroxiapatitas de uso clínico, nacionais e importadas, a fim de
descreverem suas características físico-químicas, utilizando microscopia
óptica e eletrônica de varredura, espectrometria de infravermelho, difração
e fluorescência de raios-X e determinação da concentração de cálcio e
fosfato. As hidroxiapatitas avaliadas foram: a) Biohidroxi-Inodon,
sintetizada no Departamento de Bioquímica da Faculdade de Odontologia
de Bauru-USP, através de uma técnica de precipitação branda de solução
de cloreto de cálcio e fosfato de sódio, sendo o precipitado filtrado e
secado a 100°C por 12 horas; b) Osteosynt, produzida pela Einco Ltda; c)
HA-40, produzida pela Homus-Ind. Com. Ltda, lote números 11802 e
12604; d) Osteogen, produzida por GBD marketing Group Inc.
(importada); e HA-padrão, Sigma Corporation, lote número H-0252. Os
autores explicaram que a obtenção de um material que fosse totalmente
biocompatível e reabsorvível os levou a analisar as diferentes marcas de
hidroxiapatitas disponíveis no mercado, seguindo parâmetros que
permitissem avaliar o grau de pureza, a forma, o tamanho das partículas,
a composição química e a capacidade de dissolução. Os resultados
encontrados pelas diferentes técnicas de análise levaram os autores a
concluírem que todos os materiais apresentavam características da
hidroxiapatita, com exceção da HA-40, que mostrou impureza quando
analisada pela espectrometria de transmissão de infravermelho e
fluorescência de raios-X. A Biohidroxi-Inodon foi o único material testado
cujas propriedades permitiram a sua reabsorção pelo mecanismo de
fagocitose.
43
Oliveira et al.
60
(1993) discutiram vários trabalhos que
vêem demonstrando a configuração, a forma e o processo de síntese das
partículas das hidroxiapatitas utilizadas com material de implante e
consideraram que estes afetam a biodegradação e/ou dissolução,
determinando uma resposta tecidual específica.
Yamamoto et al.
93
(1994) avaliaram histologicamente a
resposta tecidual óssea, frente à hidroxiapatita granular implantada em
defeitos criados na mandíbula de ratos. Foram utilizados trinta ratos
adultos machos (Rattus norvegicus albinus), nos quais foram criados
defeitos ósseos transcorticais por meio de uma broca esférica de 2,5mm
de diâmetro, no lado esquerdo e no lado direito, na região do ângulo da
mandíbula. No lado direito, o defeito foi preenchido com grânulos de
hidroxiapatita (HA-40, Homus Ind. Com. Ltda.) e o lado esquerdo
permaneceu sem a utilização do material, servindo como controle. Os
animais foram distribuídos em seis grupos de cinco ratos cada e
sacrificados em períodos de 24 horas, sete dias, 15 dias, um mês, três
meses e seis meses. Os pesquisadores concluíram que o processo
inflamatório agudo ocorreu de imediato à implantação da hidroxiapatita,
observado em 24 horas e a seguir, ocorreu processo inflamatório crônico
observado em sete dias, nos dois grupos experimentais; que houve uma
reação do tipo corpo estranho, devido à presença de células gigantes no
grupo com a hidroxiapatita, observada em 15 dias, que persistiu até o
período final do experimento, em seis meses. Limitada atividade
osteoblástica foi observada ao redor do defeito ósseo nos períodos finais
do experimento, em ambos os grupos. Os autores descreveram que a
neoformação óssea ficou restrita aos cotos ósseos, não preenchendo a
cavidade e explicaram que este achado provavelmente ocorreu devido à
presença da reação do tipo corpo estranho que se desenvolveu junto ao
material implantado. Por fim, apontaram que, apesar da hidroxiapatita ser
preconizada por vários autores como indutora de neoformação óssea,
44
neste trabalho não ocorreu promoção da reparação óssea pelo uso deste
material.
Rosa et al.
70
(1995) compararam pela análise
histomorfométrica o comportamento biológico de uma hidroxiapatita
microgranular (MIC), de uma hidroxiapatita em partículas (HA 40) e do
tricálcio fosfato (TCP) implantados em alvéolos dentários de ratos. Todos
os três materiais retardaram o reparo alveolar quando comparado ao
grupo controle, pois uma quantidade menor de osso neoformado foi
detectada durante o período de estudo. Os autores destacaram ainda que
nos grupos MIC e TCP o processo inflamatório desapareceu durante a
terceira semana de estudo, enquanto no grupo HA 40 a resposta
inflamatória persistiu. Os autores justificaram a melhor biocompatibilidade
de MIC e TCP pelo comportamento biológico desses materiais, pois estes
permaneceram na forma de partículas e foram envolvidos rapidamente
pelo tecido conjuntivo durante o processo de reparo.
Veeck et al.
83
(1995) realizaram um trabalho experimental
em fêmures de ratos e analisaram o comportamento do osso e da medula
óssea, frente a implantes de hidroxiapatita densa, hidroxiapatita em
grânulos (Calcitite) e lâminas de titânio puro. De acordo com a
metodologia estabelecida, os animais foram sacrificados nos períodos de
sete, 21, 45, sessenta e noventa dias, contados a partir da colocação dos
implantes. Ao exame histológico, em cortes corados pela hematoxilina e
eosina, visualizados em microscópio óptico, os autores verificaram a
formação e remodelação óssea ao redor dos dois tipos de implantes e
deduziram que ambos são biocompatíveis. Além disso, pela quantidade e
expansão da matriz e conseqüente mineralização, constataram a
osteocondutibilidade da hidroxiapatita.
Higashi & Okamoto
38
(1996) estudaram a influência do
tamanho das partículas de biomateriais na reação celular e na
proliferação celular. Duas hidroxiapatitas, uma densa e outra porosa,
obtidas por diferentes processos foram selecionadas e dois tamanhos de
45
partículas de 300µm e 40µm foram usados para examinar a reação
celular. Cada um dos quatro materiais foi colocado em cultura de
fibroblastos derivados da polpa dental, por um período de sete dias.
Decorrido este tempo, as partículas de hidroxiapatita densa de 300µm
estavam completamente recobertas por células que proliferaram sobre
sua superfície. Por outro lado, as partículas densas e porosas da
hidroxiapatita de 40µm foram capturadas ou envolvidas pelas células, que
pareceram não proliferar. As partículas de hidroxiapatita porosa de 300µm
ficaram circundadas por numerosos pedaços partidos da sua superfície e
as células proliferaram somente ao redor das partículas maiores. Baseado
nos resultados, as partículas de hidroxiapatita densa de 300µm foram
consideradas mais apropriadas como um biomaterial.
Ruano et al.
71
(1996) investigaram a biocompatibilidade
da hidroxiapatita in vitro, propondo estudar o crescimento e viabilidade de
fibroblastos crescidos sobre substrato contendo hidroxiapatita. Os autores
notaram que as células cresceram em íntimo contato com os cristais de
hidroxiapatita.
Barbara et al.
4
(1997) apresentaram uma revisão de
literatura sobre o emprego de implantes dentais com cobertura de
hidroxiapatita. Os autores destacaram que esses implantes apresentam
superfícies bioativas, com a presença de material biocompatível
aumentando ou estimulando a formação de novo tecido e, no caso
específico de implantes orais promovem a união do osso ao implante. O
uso de implantes cobertos por hidroxiapatita introduziu um novo tipo de
interface, onde se observa uma união química do osso e superfície do
implante, além da retenção mecânica obtida pela proximidade do osso
com o implante. Esses implantes são confeccionados através da
aplicação por plasma spray de uma camada de hidroxiapatita de 50 a
75µm de espessura, sobre o corpo metálico do implante. Essa
hidroxiapatita resulta em uma superfície altamente biocompatível e não-
reabsorvível. Os autores chamaram atenção para futuros estudos que
46
esclareçam a estabilidade a longo prazo da união destas superfícies com
o tecido ósseo.
Argento
3
(1998) analisou histologicamente a reparação do
tecido ósseo, a resposta inflamatória e a presença de hidroxiapatita, por
meio de estudo experimental em ratos, que receberam implantes de dois
diferentes tipos de hidroxiapatita, uma absorvível (Bioapatita
®
) e outra
não-absorvível (Interpore 200
®
), em defeitos ósseos criados
cirurgicamente nos fêmures dos ratos. O autor verificou que ambas as
hidroxiapatitas retardaram a reparação da cavidade óssea, sendo que a
hidroxiapatita absorvível provocou reação de corpo estranho. Com a
utilização da hidroxiapatita não-absorvível não foi observada a presença
de infiltrado inflamatório e ela manteve-se estável durante todo o período
experimental. O material absorvível utilizado neste estudo provocou um
retardo no processo de reparação, sem benefício adicional. Foi sugerido
que se o objetivo da terapêutica é apenas o preenchimento, o material
não-absorvível deve ser eleito.
Ito et al.
39
(1998) compararam o grau de osteointegração
de implantes dentais de titânio revestidos e não revestidos com
hidroxiapatita em defeitos ósseos criados cirurgicamente. O estudo foi
realizado em tíbias de coelhos e o período de observação foi de quatro
meses. Os espécimes foram preparados e analisados
histomorfometricamente. Os resultados demonstraram que os espécimes
que receberam os implantes de titânio revestidos com a hidroxiapatita
apresentaram uma maior quantidade de superfície osteointegrada.
Boeck et al.
9
(1999) estudaram histopatologicamente o
comportamento de uma hidroxiapatita particulada em alvéolo do incisivo
superior direito de ratos. Os resultados mostraram que a hidroxiapatita
produziu um atraso na cronologia do processo de reparo alveolar em
comparação aos animais controle, uma vez que menos tecido ósseo foi
formado ao longo de todos os períodos estudados. Além disso, o material
47
utilizado apresentou compatibilidade biológica, pois foi integrado ao tecido
ao longo do processo de reparo.
Caria
11
(1999) produziu uma falha óssea na pré-maxila de
ratos e implantou hidroxiapatita pura nestas falhas. A hidroxiapatita usada
neste estudo foi sintetizada pelo Instituto de Química da UNICAMP, pelo
método de precipitação, a partir de uma suspensão de hidróxido de cálcio
e uma solução de ácido fosfórico. Após a análise dos resultados, o autor
concluiu que a hidroxiapatita que vem sendo desenvolvida pelo Instituto
de Química da UNICAMP apresenta biocompatibilidade, oferecendo
estabilidade ao local operado, permitindo o crescimento ósseo para o
interior da falha produzida, tornando-se um possível substituto para
enxerto ósseo autógeno. O osso neoformado manteve contato direto com
a hidroxiapatita implantada, sem interposição de tecido conjuntivo.
Rogero et al.
69
(1999) relataram que os compostos de
cálcio e fósforo vêm sendo usados com biomateriais nas áreas médica e
odontológica para substituir tecido ósseo. Fosfato de cálcio, hidroxiapatita
sintética e hidroxiapatita natural de osso bovino são obtidos por vários e
diferentes processos. Os autores avaliaram o efeito tóxico destes
compostos, por meio de testes de citotoxicidade, pelo método quantitativo
de supressão de colônia, no qual a cultura de células ficou em contato
com extratos diluídos destes materiais biocerâmicos. Os resultados
mostraram que somente a hidroxiapatita natural proveniente do osso
bovino apresentou um efeito citotóxico. Por outro lado, a hidroxiapatita
sintética (obtida pelo método de precipitação) e o fosfato de cálcio (obtido
pela reação sólida) não são citotóxicos.
Chang et al.
12
(2000) realizaram um trabalho experimental
para avaliar a resposta histológica e o efeito de reforço do crescimento de
osso, no interior dos poros de implantes de seis diferentes hidroxiapatitas
porosas, dependendo da variação da forma geométrica dos poros e
também do tamanho destes. Após a implantação, os implantes mostraram
diferenças histológicas, dependendo da forma geométrica dos poros. Uma
48
ativa osteocondução foi verificada na hidroxiapatita de poros cilíndricos e
paralelos de 50 micras. Evidente remodelação óssea de osso neoformado
e de medula óssea no interior dos poros foi verificada nas hidroxiapatitas
de poros cilíndricos de 300 e 500 micras. As hidroxiapatitas de poros
irregulares e de poros transversais apresentaram maior resistência, após
oito semanas da implantação. Os autores concluíram que a hidroxiapatita
com poros cilíndricos mostrou-se útil como um material de enxerto devido
à sua resistência, facilidade com que o tamanho do poro pode ser
controlado, bem como o seu potencial osteocondutor.
Flautre et al.
24
(2001) relataram que as características
físicas das hidroxiapatitas, como o volume dos poros, sua forma, número
e tamanho das interconexões entre os poros influenciam no processo de
osteocondução e que para a criação de substitutos ósseos com boas
propriedades é necessário um controle perfeito destes parâmetros.
Orlovskii et al.
61
(2002) afirmaram que a hidroxiapatita
vem sendo apontada como o material com maior potencial como
substituto ósseo, pois apresenta comportamento osteocundutor, é
bioreabsorvível e não apresenta efeitos adversos ao organismo. Contudo,
os autores discutiram, que o comportamento da hidroxiapatita cerâmica
depende de muitos fatores, em particular, da sua composição química e
fase de composição, microestrutura, tamanho dos poros e volume destes
poros.
Specchia et al.
79
(2002) estudaram a relação entre o
tamanho dos poros de hidroxiapatita com o seu potencial de
osteocondução. A osteocondução, a adesão, a proliferação e a
diferenciação celular foram avaliadas de acordo com o crescimento
celular em culturas de células de osteoblastos com discos de
hidroxiapatita com diferentes porosidades (20%, 40% e 60% de
porosidade). Os autores verificaram neste estudo in vitro, que a
porosidade da hidroxiapatita afetou a proliferação e a diferenciação
49
celular, sendo que a maior porosidade foi associada a uma diminuição na
população celular.
Gerber et al.
31
(2003) estudaram dois tipos de fosfatos de
cálcio cerâmicos: a hidroxiapatita SiO
2
contendo cerâmica e a
hidroxiapatita β tricálcio-fosfato SiO
2
contendo cerâmica. Os materiais
foram confeccionados em forma de roscas com um milímetro de diâmetro.
As cerâmicas de fosfato de cálcio mencionadas estabelecem uma
interconexão da estrutura dos macroporos que são responsáveis pelo
crescimento do osso e pela substituição da cerâmica por osso.
Experimentos in vivo forma realizados e observados no período mínimo
de cinco semanas e por um período máximo de oito meses. Os resultados
após o menor período de observação mostraram os estágios precoces da
formação óssea e da dissolução do material. Aos seis meses,
aproximadamente cem por cento da cerâmica implantada estava
reabsorvida e novo osso ao redor do local da intervenção estava formado.
Singh et al.
76
(2004) descreveram um estudo sobre o
acompanhamento, por dez anos, de 33 pacientes com menos de
cinqüenta anos, que apresentavam desordens ósseas (como osteoartrite)
na articulação do quadril e que receberam próteses cobertas com
cerâmica de hidroxiapatita e encaixadas no interior do fêmur.
Radiograficamente, os autores detectaram, após um ano, o
desaparecimento da linha radiolúcida que delimitava o aparato, sugerindo
a formação óssea nesse espaço e a osteointegração do implante. Os
autores concluíram que o sistema prótese-hidroxiapatita apresentou
excelentes resultados clínicos e radiográficos em pacientes jovens, ativos
e com diferentes desordens ósseas no quadril.
Tieliewuhan et al.
81
(2004) desenvolveram um novo
biomaterial a base de CO
3
-apatita sintética misturada com gel de
colágeno, apresentado na forma de esponja, e envolvido por uma
estrutura constituída por hidroxiapatita. Estudos, em cultura de
osteoblastos, mostraram crescimento celular no interior da esponja e a
50
deposição de matriz tecidual na mesma. Estudos, in vivo, em ossos do
crânio de ratos, após implantação do material abaixo do periósteo,
demonstraram neoformação óssea a partir da superfície periosteal em
direção ao interior do biomaterial. Os autores sugerem o uso terapêutico
desse biomaterial como substituto ósseo.
Xie et al.
88
(2004) avaliaram o efeito da hidroxiapatita
sobre os osteoblastos, através da análise da expressão gênica dessas
células frente a discos de hidroxiapatita e discos-controle de plástico. A
hidroxiapatita aumentou a expressão gênica dos osteoblastos em relação
a dez genes e diminuiu a ativação de 15 regiões gênicas, dentro de um
período de 24h. Os autores detectaram alterações em genes de
osteoblastos relacionados com a aderência, proliferação e síntese de
matriz extracelular e sugerem que um grupo de genes responsivos para a
hidroxiapatita deve contribuir para a diferenciação de osteoblastos.
Kim et al.
45
(2005) desenvolveram uma hidroxiapatita
porosa coberta por partículas de hidroxiapatita e por antibiótico
(vancomicina). O antibiótico foi liberado mais regularmente quando estava
presente na cobertura da hidroxiapatita e rapidamente quando se
apresentava adsorvido ao material. A hidroxiapatita coberta mostrou
melhores resultados quanto à resistência a compressão, quando
comparada a hidroxiapatita sem cobertura, mas se apresentou com menor
porosidade. Os autores sugeriram a utilização desse material em casos
de reparação óssea pela facilidade da liberação do antibiótico.
51
2.3 Bisfosfonatos e hidroxiapatita
Poucos são os trabalhos encontrados na literatura que
estudaram e analisaram o uso concomitante dos bisfosfonatos e da
hidroxiapatita, em especial do alendronato sódico associado a
hidroxiapatita sintética.
Meraw et al.
56
(1999) com o objetivo de determinarem os
efeitos do alendronato sódico aplicado localmente na regeneração óssea
guiada ao redor de implantes dentários, realizaram um trabalho utilizando
seis cães adultos e implantaram nestes animais quatro diferentes tipos de
implante, sendo implante de hidroxiapatita revestido por alendronato, de
titânio revestido por alendronato, de hidroxiapatita e de titânio. A
implantação foi realizada nos alvéolos dos segundos, terceiros e quartos
premolares mandibulares, no lado esquerdo e direito, imediatamente após
a extração destes dentes. Os implantes foram protegidos por uma
membrana de colágeno reabsorvível. Após 28 dias os animais foram
sacrificados e a neoformação óssea foi mensurada por um microscópio
computadorizado digitalizado. Os resultados indicaram um efeito
significativo da aplicação local do alendronato com ambos os tipos de
implante (hidroxiapatita e titânio). Desta maneira, foi concluído que o
alendronato aumentou a velocidade da formação óssea ao redor dos
implantes e resultou em um maior contato osso/implante nos espécimes
de titânio.
Meraw & Reeve
55
(1999) realizaram um experimento,
seguindo a mesma metodologia descrita no trabalho acima, porém neste
estudo o objetivo foi analisar a influência do alendronato sódico aplicado
localmente na regeneração óssea precoce sob o ponto de vista da
qualidade do osso periférico aos implantes. Os autores observaram que o
alendronato causou um aumento significativo de osso na área periférica
ao redor dos implantes. Entretanto, o fator que mais influenciou na
52
quantidade de osso formado foram as características das superfícies dos
implantes.
Denissen et al.
18
(2000) incubaram implantes de
hidroxiapatita porosa em uma solução de bisfosfonato a 10
-2
M e em pH
de 3,49 e 7,32. Os implantes possuíam diâmetro de 2,1mm e altura de
2mm e adsorveram 115 microgramas de bisfosfonatos in vitro. Estes
implantes foram inseridos na tíbia de 35 ratos. Os resultados histológicos
mostraram que todos os implantes de hidroxiapatita/bisfosfonato estavam
completamente integrados ao tecido ósseo e demonstraram serem
efetivos como material de substituição deste tecido em tíbias de ratos.
Ainda exibiram poder de osteocondução para o osso da tíbia, que se
neoformou ao redor e no interior da estrutura porosa dos implantes.
Adicionalmente pode-se também observar grande quantidade de vasos
sangüíneos neste local.
Denissen et al.
17
(2000) utilizando o mesmo complexo de
hidroxiapatita e bisfosfonato descrito em seu trabalho supracitado,
implantaram este material em alvéolos de cabras. Em uma hemi-
mandíbula implantaram hidroxiapatita pura e no outro lado implantaram o
complexo hidroxiapatita/bisfosfonato. Comparando histologicamente os
dois implantes, os autores verificaram que a hidroxiapatita/bisfosfonato
demonstrou uma maior integração ao osso alveolar, demonstrando um
potencial de osteocondução elevado, quando comparado ao implante de
hidroxiapatita pura.
Yoshinari et al.
94
(2001) analisaram o efeito tóxico sobre
osteoblastos e o efeito inibitório na aderência de Porphyromonas
gingivalis de titânios cobertos por uma delgada camada de hidroxiapatita,
e tratados com bisfosfonatos (pamidronato) retidos na superfície do
implante. O bisfosfonato foi usado pela sua afinidade por fosfato de cálcio
e por inibir a reabsorção óssea. Os autores perceberam que esse tipo de
titânio não provocou efeito citotóxico em osteoblastos e ainda inibiu a
aderência bacteriana. O bloqueio da aderência bacteriana foi explicado
53
pela alteração na carga elétrica na superfície do titânio. Os autores
concluíram que a combinação hidroxiapatita e bisfosfonato sobre o titânio
pode ser útil em implantes dentários.
Ganguli et al.
30
(2002) mostraram a preocupação
existente com a perda asséptica de implantes devido a osteólise em
resposta à pressões estressantes ou à reação celular a detritos do
revestimento de implantes. Os autores discutiram se os bisfosfonatos por
serem inibidores da reabsorção óssea osteoclástica e por se ligarem
avidamente a hidroxiapatita poderiam minimizar a resposta osteolítica que
gera a perda do implante. Os efeitos do pamidronato, clodronato e
etidronato em solução e como cobertura da hidroxiapatita foram
investigados sobre os osteoblastos in vitro. O pamidronato inibiu a síntese
de colágeno quando em solução, mas não depois de ligado a
hidroxiapatita. Quando ligado a hidroxiapatita, pamidronato e clodronato
aumentaram a síntese de DNA e de colágeno por osteoblastos e
favoreceram a osteointegração de implantes. O etidronato alterou a
distribuição da actina do citoesqueleto celular. Os autores concluíram que
deve ser estudado se os efeitos inibitórios dos bisfosfonatos sobre
osteoclastos e macrófagos continuam mesmo depois de ligados a
hidroxiapatita.
Fernandes et al.
23
(2004) avaliaram a ação do alendronato
sódico e a sua associação com hidroxiapatita pura granular na reparação
de defeitos ósseos. Os autores utilizaram 27 coelhos adultos, nos quais
foi criado um defeito na cortical óssea externa do corpo da mandíbula,
medindo 4,25mm de diâmetro. Os animais foram divididos em três grupos:
controle, alendronato e alendronato mais hidroxiapatita. Nos animais do
grupo controle foi somente confeccionado o defeito ósseo, permanecendo
o defeito apenas preenchido pelo coágulo sangüíneo proveniente da
própria ferida. O grupo de animais do grupo alendronato, bem como os
animais do grupo alendronato mais hidroxiapatita, receberam 1mg/kg/dia
de alendronato sódico por via oral, durante dez dias consecutivos após a
54
cirurgia. Os animais do grupo alendronato mais hidroxiapatita, além de
serem medicados com o alendronato sódico, como citado acima, também
tiveram o defeito preenchido com a hidroxiapatita granular pura sintética.
Os animais foram sacrificados 14, 21 e 28 dias após a cirurgia, as
mandíbulas foram removidas descalcificadas e seguiram para o processo
histológico de rotina. Histologicamente, foram observadas diferenças
entre os grupos experimentais, porém estatisticamente, não houve
diferença entre os tratamentos, apenas entre os períodos de observação.
Os autores chamaram a atenção para o fato de que apesar de não terem
ocorrido diferenças estatísticas, a neoformação óssea ocorrida no grupo
alendronato comparada à neoformação óssea do grupo
alendronato/hidroxiapatita, apresentou uma maior maturação e
remodelação, independentemente do período de observação.
3 PROPOSIÇÃO
Estudar a reparação óssea, após a aplicação local do
alendronato sódico, da hidroxiapatita e da associação do alendronato
sódico com a hidroxiapatita em defeitos ósseos criados em fêmures de
ratos de ambos os sexos.
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Animais
Esta pesquisa foi realizada seguindo os princípios éticos
para a experimentação animal da Faculdade de Odontologia do Campus
de São José dos Campos - UNESP, adotados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal e submetida à aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa (Anexo A).
Neste estudo, foram utilizados 168 ratos (Rattus
norvegicus, albinus, Wistar) sendo 84 fêmeas e 84 machos, com
aproximadamente três meses de idade e pesando em média trezentos
gramas. Estes animais foram fornecidos pelo Biotério da Faculdade de
Odontologia do Campus de São José dos Campos - UNESP, onde
permaneceram durante toda a etapa experimental em gaiolas coletivas,
recebendo tratamento de rotina.
4.2 Divisão dos grupos
Os 168 animais foram divididos em sete grupos
constituídos por 24 animais, sendo 12 machos e 12 fêmeas. Os grupos
experimentais foram denominados por: grupo controle (C), grupo amido
(Am), grupo alendronato - 1mol (A1), grupo alendronato - 2moles (A2),
grupo hidroxiapatita - 1mol (HA1), hidroxiapatita - 2moles (HA2) e grupo
alendronato + hidroxiapatita - 2moles (A+HA) (Quadro 1).
57
Quadro 1 - Grupos experimentais, número e sexo dos animais por grupo
Grupo
experimental
N
o
de animais Sexo
Controle (C) 24 12♂ - 12♀
Amido (Am) 24 12♂ - 12♀
Alendronato - 1mol (A1) 24 12♂ - 12♀
Alendronato - 2moles (A2) 24 12♂ - 12♀
Hidroxiapatita - 1mol (HA1) 24 12♂ - 12♀
Hidroxiapatita - 2moles (HA2) 24 12♂ - 12♀
Alendronato + hidroxiapatita - 2moles
(A+HA)
24 12♂ - 12♀
Total 168 animais
Todos os animais foram submetidos a uma cirurgia para a
confecção de um defeito ósseo, sendo que somente no grupo C, o defeito
ósseo permaneceu sem preenchimento de material algum, ficando
apenas preenchido pelo coágulo sangüíneo proveniente da própria ferida
óssea. No Quadro 2, podemos observar os materiais utilizados para o
preenchimento do defeito ósseo e cada um dos grupos experimentais.
Quadro 2 - Grupos experimentais e materiais de preenchimento
Grupo
experimental
Material de
preenchimento
Controle (C) Ausente
Amido (Am) Amido
Alendronato - 1mol (A1) Alendronato + amido
Alendronato - 2moles (A2) Alendronato + amido
Hidroxiapatita - 1mol (HA1) Hidroxiapatita + amido
Hidroxiapatita - 2moles (HA2) Hidroxiapatita
Alendronato + hidroxiapatita - 2moles
(A+HA)
Alendronato + hidroxiapatita +
amido
58
O amido e o alendronato sódico utilizados foram cedidos
pela Farmácia Escola da Faculdade de Ciências Farmacêuticas do
Campus de Araraquara - UNESP. A hidroxiapatita utilizada foi a Gen-Phos
(Genius, Baumer S.A., Divisão de Biomateriais) que é uma hidroxiapatita
absorvível. A apresentação da hidroxiapatita Gen-Phos é de partículas
micro granulares (0,25µm a 1,0µm) em frascos esterelizados por radiação
gama.
Todos os grupos experimentais foram divididos em dois
subgrupos constituídos por seis animais de acordo com os períodos de
observação. Os animais de cada um dos subgrupos foram sacrificados
nos períodos de sete e 21 dias após a cirurgia (Quadro 3).
Quadro 3 - Divisão dos animais em grupo, tempo de sacrifício e relação
do número de animais sacrificados por período
Grupo experimental Tempo de sacrifício
N
o
de animais/
período
Controle (C) 7 dias 21 dias 6♂ - 6♀
Amido (Am) 7 dias 21 dias 6♂ - 6♀
Alendronato - 1mol (A1) 7 dias 21 dias 6♂ - 6♀
Alendronato - 2moles (A2) 7 dias 21 dias 6♂ - 6♀
Hidroxiapatita - 1mol (HA1) 7 dias 21 dias 6♂ - 6♀
Hidroxiapatita - 2moles (HA2) 7 dias 21 dias 6♂ - 6♀
Alendronato + hidroxiapatita -
2moles (A+HA)
7 dias 21 dias 6♂ - 6♀
59
4.3 Cálculo dos materiais
O cálculo das proporções porcentuais dos materiais foi
realizado de acordo com o peso molecular (PM) das substâncias
utilizadas. O PM da hidroxiapatita é 622g/mol e do alendronato sódico é
325g/mol. No grupo A+HA foi utilizado a proporção de 1:1 mol, isto é, um
mol de alendronato e um mol de hidroxiapatita, motivo este que
determinou a formação dos demais grupos experimentais de dois moles
de alendronato e dois moles de hidroxiapatita. Os cálculos das
quantidades em peso/mol das substâncias empregadas foram baseados a
partir da hidroxiapatita, uma vez que esta possui o maior PM. Desta
forma, para que as quantidades em peso das substâncias dos grupos
estudados fossem semelhantes, houve a necessidade de adicionarmos
um material como excipiente inerte q.s.p. A substância inerte ao
alendronato é o amido. Devido à utilização do excipiente, realizamos
também um grupo experimental utilizando apenas o amido para
assegurarmos que este não influenciou no processo de reparação óssea,
bem como não interferiu na ação do alendronato e da hidroxiapatita.
As quantidades em peso foram calculadas utilizando-se
0,01mol para mensurarmos quantias volumétricas apropriadas ao
tamanho do defeito ósseo. Desta maneira, as proporções porcentuais das
substâncias foram mantidas e estão expressas no Quadro 4.
60
Quadro 4 - Porcentagem e peso dos materiais utilizados
Material
% do material
peso em gramas
% de amido % total
HA2
100%
12,44g
0% 100%
HA1
50%
6,22g
50%
6,22g
100%
A2
52%
6,5g
48%
5,94g
100%
A1
26%
3,25g
74%
9,19g
100%
A + HA
76%
3,25g + 6,22g
24%
2,97g
100%
Após a determinação da quantidade em peso de cada
material, estes foram pesados em uma balança de precisão (AB 204 -
Metter Toledo), misturados por meio de uma vigorosa agitação em um
saco plástico e, posteriormente, foram armazenados em frascos plásticos.
4.4 Procedimentos cirúrgicos
Os procedimentos cirúrgicos foram realizados na sala cirúrgica,
no Biotério da Faculdade de Odontologia do Campus de São José dos
Campos - UNESP, cuidadosamente limpa e preparada para as cirurgias.
No momento da cirurgia, o operador e o auxiliar estavam devidamente
paramentados com avental, gorro, máscara e luvas de procedimento.
Todo o instrumental e campos cirúrgicos foram adequadamente
esterelizados.
61
Os ratos foram pesados para calcular a dosagem ideal de
anestésico a ser administrada para cada animal. Em todas as cirurgias,
utilizou-se para anestesia uma solução aquosa a 2% de cloridrato de 2-
(2,6-xilidino)-5,6-dihidro-4H-1,3-tiazina (Rompun - Bayer do Brasil),
substância sedativa analgésica e relaxante muscular e, ketamina base
(Dopalen - Agribrands do Brasil Ind. Com. Ltda.), anestésico geral,
respectivamente, na proporção de 1,0ml para 0,5ml. A dosagem da
solução injetada foi de 0,1ml/100g por via intramuscular, utilizando-se
uma agulha e uma seringa descartável de 1ml.
Após a indução anestésica dos animais, foi realizada a
depilação na região do fêmur esquerdo e assepsia da pele utilizando uma
solução aquosa de polividona, com 10% de iodo ativo (Hi-Odin - Halex
Istar Ltda.), por fricção com gaze estéril presa por uma pinça porta-
agulha. A incisão da pele, medindo aproximadamente 2,5cm, foi realizada
utilizando-se uma lâmina n
o
15 montada em bisturi do tipo Bard & Parker,
seguindo o sentido do longo eixo do osso. Posteriormente, a pele foi
afastada e os músculos da região do terço distal do fêmur esquerdo foram
divulsionados e afastados, a fim de expor o tecido ósseo para a
confecção do defeito ósseo.
O defeito ósseo foi realizado na região de maior extensão
látero-lateral da diáfise do fêmur esquerdo, na sua porção distal. O defeito
foi confeccionado utilizando uma broca trefina, medindo 2mm de diâmetro
interno e 2,50mm de diâmetro externo, montada em motor tipo chicote,
sob abundante irrigação com soro fisiológico (NaCl 0,9%). A broca foi
posicionada perpendicularmente ao longo eixo do fêmur e o osso
compacto da cortical óssea anterior do fêmur foi cortado de forma circular.
Posteriormente a esta etapa operatória, o defeito ósseo
foi lavado com soro fisiológico e seco com gase estéril e, em seguida, o
defeito ósseo foi preenchido de acordo com os materiais descritos no
Quadro 2.
62
Com a utilização de um porta-amálgama as substâncias
foram colocadas dentro do defeito e acomodadas com um condensador
de amálgama, permanecendo dentro do defeito ósseo e misturando-se ao
sangue proveniente da própria ferida cirúrgica (Figura 1).
Por fim, após a confecção dos defeitos ósseos em todos
os animais, os tecidos moles foram reposicionados e suturados com fio
reabsorvível Catgut n
o
4 (Cirumédica - Brasil). A pele foi suturada com
pontos simples utilizando fio de seda n
o
4 (Ethincon - Johnson & Johnson).
4.5 Sacrifício
Os animais foram sacrificados decorridos sete e 21 dias
da data da cirurgia. Para isto, foram anestesiados e decapitados em
guilhotina. O fêmur esquerdo foi retirado e o tecido mole excedente foi
cuidadosamente removido. As peças ósseas foram fixadas em uma
solução de formol a 10%, permanecendo armazenadas em frascos de
vidro, separadas de acordo com o grupo experimental, o tempo de
observação e o sexo dos animais.
63
64
4.6 Análise dos resultados
Os fêmures esquerdos, depois de fixados na solução de
formol a 10%, foram descalcificados em solução de Plank-Rychlo durante
aproximadamente noventa dias. As peças ósseas foram aparadas,
preparadas para a inclusão em parafina e submetidas à técnica
histológica de rotina. Foram realizados cortes transversais do defeito
ósseo, com aproximadamente 5µm de espessura. As secções foram
realizadas em toda a extensão do defeito ósseo de forma semi-seriada.
Assim, foram confeccionadas sete lâminas de cada peça óssea, que
posteriormente foram coradas com Hematoxilina e Eosina (HE - Merck &
Co., Inc.) e analisadas sob a microscopia de luz (Zeiss Axiophot 2 - Carl
Zeiss, Oberköchen, Alemanha).
4.6.1 Análise histológica
Foram realizadas avaliações histológicas com relação à
neoformação óssea, à presença de trabéculas ósseas imaturas, à
remodelação destas trabéculas, à remodelação óssea na superfície de
corte, à presença de espaços medulares, bem como à resposta tecidual
diante da implantação local do amido, do alendronato sódico, da
hidroxiapatita e da associação alendronato sódico mais hidroxiapatita, no
tecido ósseo dos fêmures dos ratos.
4.6.2 Análise histomorfométrica
A análise histomorfométrica foi realizada com a utilização
de um retículo quadriculado composto por cem pontos de intersecção
65
resultantes das intersecções entre dez linhas verticais e dez linhas
horizontais. Este retículo foi posicionado sobre o centro da imagem
histológica do defeito ósseo, com um aumento original de cem vezes para
a contagem. Foram considerados todos os pontos de intersecção que
estavam sobrepostos ao tecido ósseo neoformado. A contagem foi
realizada na região central do defeito ósseo a partir de fotografias
digitalizadas dos cortes histológicos, sendo que para cada animal, foram
analisados seis cortes. Desta forma, foram analisados seiscentos pontos
por animal. Para a planimetria por contagem de pontos foi utilizado o
programa Image J (versão 1,32 para Windows, de domínio público, do
Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, USA). Os valores numéricos
obtidos da neoformação óssea foram transformados em porcentagem e
submetidos à análise estatística.
4.7 Análise estatística
Todos os dados resultantes da análise histomorfométrica
foram submetidos à estatística descritiva e à análise de variância
(ANOVA), utilizando como nível de significância a margem de erro de 1%.
Foram analisados os sete diferentes grupos experimentais (C, Am, A1,
A2, HA1, HA2 e A+HA), os dois períodos de observação (sete e 21 dias) e
o sexo dos animais (machos e fêmeas). Os resultados estatisticamente
significativos submetidos ao teste de Tukey.
A análise de variância e teste de Tukey foram realizados
com a utilização do software STATISTICA for Windows versão 5.5 (2000 –
Analytical Software Co.).
5 RESULTADOS
5.1 Análise histológica
Todos os cortes histológicos são oriundos de fragmentos
de fêmures de ratos que foram seccionados transversalmente na região
onde foi confeccionado o defeito ósseo. Na análise histológica, se
observava toda a extensão do osso cortical do fêmur, o canal medular, o
local do defeito ósseo, bem como as superfícies de cortes do mesmo.
As características gerais do tecido ósseo do fêmur das
amostras estudadas são de um tecido ósseo compacto maduro, com
arranjo organizado demonstrado por lamelas ósseas concêntricas,
apresentando osteócitos pequenos, alojados no interior de lacunas
achatadas e regularmente distribuídas por toda a extensão do osso. Na
porção mais externa da compacta óssea, o osso compacto organizava-se
em camadas paralelas e sobrepostas.
Na grande maioria dos cortes, foi possível a visualização
de quantidade variável de tecido muscular remanescente ao redor do
tecido ósseo. A superfície externa do osso encontrava-se envolta por
periósteo que ora circundava toda a extensão periférica do osso, ora
encontrava-se interrompido no local do defeito ósseo.
A descrição histológica dos espécimes foi realizada
agrupando-se os diferentes períodos de observação e o sexo dos
animais. Isto foi feito para facilitar a descrição das características
semelhantes entre os cortes histológicos e possibilitar a comparação entre
os diferentes grupos experimentais dentro do mesmo sexo e em um
mesmo período de tempo. Desta maneira, os resultados foram descritos
67
obedecendo-se a seguinte ordem: animais machos - sete dias, animais
fêmeas - sete dias, animais machos - 21 dias e, por fim, animais fêmeas -
21 dias.
5.1.1 Animais machos - sete dias
Nos cortes histológicos dos animais machos, no período
de sete dias observava-se o canal medular preenchido por quantidade
variável de medula óssea e células inflamatórias mono e
polimorfonucleares. Estas células apresentavam-se em maior número nos
grupos A1, A2 e A+HA. Em todos os espécimes, o defeito ósseo era
bastante evidente, com as superfícies de corte nítidas (Figura 2).
Nos grupos A1, A2 e A+HA não foi observado
neoformação óssea no local do defeito, sendo que este foi preenchido por
uma rede de fibrina que também se estendia até o canal medular. Por
outro lado, nestes grupos houve neoformação óssea subperiosteal extra-
cortical. No grupo A1, a neoformação extra-cortical se localizava na região
oposta ao local do defeito ósseo e, nos grupos A2 e A+HA, ela estava
presente nas faces medial e lateral do osso (Figura 2c, 2d, 2g; Figura 3c,
3d, 3g).
No grupo A1 foi observado que o periósteo já havia se
regenerado sobre toda a superfície externa do defeito ósseo e havia
tecido muscular sobre a superfície do defeito, contudo sem promover o
rompimento do periósteo (Figura 2c).
Nos espécimes dos grupos C, Am, HA1 e HA2 notava-se
a presença de trabéculas ósseas neoformadas, sendo estas menos
numerosas nos dois últimos grupos (Figura 2a, 2b, 2e, 2f; Figura 3a, 3b,
3e, 3f). As trabéculas ósseas neoformadas se formaram a partir do
endósteo circunvizinho às superfícies de corte. Nos grupos C e Am as
68
69
trabéculas se projetavam em direção ao centro do canal medular. Nos
grupos HA1 e HA2, a neoformação se dava no sentido do centro do
defeito, tendendo a unir suas margens (Figura 2a, 2b, 2e e 2f).
As trabéculas ósseas mostravam-se imaturas e delicadas,
por vezes se anastomosavam, sendo circundadas por osteoblastos
grandes e volumosos. No interior das trabéculas, havia osteócitos
volumosos em grande quantidade, localizados dentro de amplas lacunas.
Alguns osteoclastos foram observados na periferia das trabéculas.
Entre as trabéculas, observava-se a presença de amplos
espaços medulares preenchidos por tecido conjuntivo frouxo ou por tecido
conjuntivo rico em células com aspecto osteogênico. Neste tecido
celularizado, por vezes notavam-se focos de tecido osteóide e pequenos
centros de ossificação.
Nos grupos HA1, HA2 e A+HA verificava-se a presença
de imagens negativas dos grânulos de hidroxiapatita, em quantidade
variável, por vezes eram envolvidas por células gigantes multinucleadas
(Figura 10a). Não foram encontradas células inflamatórias entre as
imagens negativas dos grânulos.
70
71
5.1.2 Animais fêmeas - sete dias
Aos sete dias nos animais fêmeas, histologicamente
notava-se a presença de diferentes quantidades de medula óssea e de
células inflamatórias no interior do canal medular. As células inflamatórias
apresentavam-se principalmente na região central do canal medular que
na região do defeito ósseo, cuja superfície de corte mostrava-se visível.
Em todos os espécimes havia a presença de trabéculas ósseas
neoformadas, sendo mais evidente nos grupos C e Am, seguidos pelos
grupos A+HA, HA2, HA1, A1 e A2 (Figura 4).
Nos espécimes dos grupos C e Am as trabéculas ósseas
neoformadas se anastomosavam ao longo do defeito ósseo, praticamente
unindo-o de um lado ao outro, porém sem fechá-lo em extensão. A
neoformação ocorreu a partir do endósteo e do periósteo. O periósteo
circundava toda a periferia do corte histológico, inclusive recobrindo o
local do defeito ósseo (Figura 4a, 4b).
A distribuição das trabéculas ósseas neoformadas dos
grupos C e Am era semelhante (Figura 5a, 5b). Em ambos os grupos, as
trabéculas estavam bem delimitadas, apresentavam aspecto imaturo, com
a presença de osteócitos volumosos situados no interior de amplas
lacunas. Os osteoblastos dispunham-se ordenadamente ao redor das
trabéculas ósseas e células com características osteogênicas distribuíam-
se entre os amplos espaços medulares delimitados por essas trabéculas
(Figura 10b).
Nos grupos A1, A2, HA1, HA2, e A+HA, as trabéculas
ósseas apresentavam uma neoformação mais evidente a partir do
endósteo e se projetavam discretamente em direção ao canal medular
(Figura 4c, 4d, 4e, 4f, 4g; Figura 5c, 5d, 5e, 5f, 5g).
72
73
Estas trabéculas mostravam aspecto mais imaturo que as dos grupos C e
Am, apresentando contornos menos evidentes e eram circundadas por
osteoblastos e tecido de aspecto osteóide que preenchia parcialmente os
espaços medulares.
Células inflamatórias foram notadas em maior quantidade
nos espécimes dos grupos A1 e A2, tanto no interior do canal medular
quanto nas áreas mais próximas ao defeito ósseo e entre as trabéculas
ósseas neoformadas.
Nos grupos A1 e A2, bem como no grupo A+HA,
observava-se neoformação óssea subperiosteal extra-cortical (4c, 4d, 4g).
Esta neoformação óssea dispunha-se nas faces medial e lateral do osso,
constituindo uma nova camada óssea, com trabéculas ósseas
neoformadas, regularmente distribuídas, delimitando espaços medulares
preenchidos por tecido conjuntivo frouxo.
Nos grupos HA1, HA2 e A+HA observava-se as imagens
negativas dos grânulos de hidroxiapatita e células gigantes
multinucleadas (Figura 10a).
74
75
5.1.3 Animais machos - 21 dias
O tecido ósseo formado na região do defeito apresentava
maior maturação no período de 21 dias, quando comparado ao observado
no período de sete dias. Ainda comparando estes dois diferentes
períodos, notava-se uma redução do número de células inflamatórias,
principalmente no local do defeito ósseo.
O grupo C apresentou o fechamento do defeito ósseo em
toda a sua extensão, com grande quantidade de trabéculas ósseas
anastomosadas, unindo as margens do defeito em extensão e
preenchendo toda a sua profundidade (Figura 6a; Figura 7a). Estas
trabéculas mostravam um aspecto mais maduro, exibindo em seu interior
osteócitos achatados localizados em pequenas lacunas e osteoblastos ao
seu redor.
Nos espécimes dos grupos Am, HA1 e HA2 os padrões
histológicos foram semelhantes, porém as anastomoses entre as
trabéculas ósseas foram mais evidentes na superfície externa do defeito
ósseo, sendo que na profundidade do defeito, as anastomoses eram mais
esparsas e havia espaços medulares mais amplos entre as trabéculas
(Figura 6b, 6e, 6f; Figura 7b, 7e, 7f).
Aos 21 dias, nos grupos HA1, HA2 e A+HA não se
observava as imagens negativas dos grânulos de hidroxiapatita que
podiam ser visualizadas nos mesmos grupos aos sete dias.
Comparando estes três grupos, notava-se que a
neoformação óssea no local do defeito foi menor no grupo A+HA, porém
neste grupo houve neoformação óssea subperiosteal extra-cortical na
superfície do osso compacto adjacente ao local do defeito ósseo,
semelhante ao observado aos sete dias (Figura 6g).
76
77
A neoformação óssea verificada nos grupos A1 e A2
apresentou um padrão histológico diferenciado em relação aos demais
grupos. Observava-se neoformação óssea subperiosteal extra-cortical
evidente (Figura 6c, 6d).
No local do defeito ósseo, era possível se visualizar as
superfícies de corte, a neoformação óssea principalmente a partir do
periósteo, com trabéculas ósseas que não só se anastomosavam e
fechavam o defeito ósseo em extensão, como também se proliferavam
intensamente para o interior do canal medular, delimitando espaços
medulares preenchidos por tecido conjuntivo frouxo (Figura 7c, 7d).
Em alguns espécimes foi observado o preenchimento de
todo o canal medular por trabéculas ósseas anastomosadas que
delimitavam espaços medulares preenchidos por quantidade variável de
tecido conjuntivo frouxo. Estas trabéculas ósseas apresentavam
osteócitos volumosos dentro de amplas lacunas, com osteoblastos e
osteoclastos na sua periferia (Figura 10c).
78
79
5.1.4 Animais fêmeas - 21 dias
De maneira geral, as características descritas para os
animais fêmeas no período de 21 dias foram semelhantes às
características observadas nos machos, neste mesmo período. Porém, a
neoformação óssea, na região do defeito parece ter sido mais exuberante
nas fêmeas que nos machos, independentemente do grupo experimental.
O defeito ósseo, de todos os espécimes, se encontrava
fechado aos 21 dias, sendo que na região mais superficial do defeito
notava-se uma ponte óssea mais contínua que a observada nos animais
machos. As trabéculas ósseas se anastomosavam umas as outras,
unindo as margens do defeito em extensão em todos os grupos
experimentais (Figura 8; Figura 9).
A superfície de corte, por vezes, se unia intimamente com
o osso neoformado, dificultando a observação dos seus limites (Figura 8).
As trabéculas demonstravam sinais de remodelação pela
presença de osteoclastos e de linhas reversas de aposição óssea e,
apresentavam osteócitos achatados no interior de lacunas (Figura 10d).
Os espaços medulares delimitados pelas trabéculas possuíam quantidade
variável de tecido conjuntivo frouxo (Figura 9).
Nas fêmeas, como ocorrido nos animais machos, não se
observava a imagem negativa dos grânulos de hidroxiapatita nos grupos
HA1, HA2 e A+HA.
Nos grupos A1, A2 e A+HA houve neoformação óssea
subperiosteal extra-cortical com características histologicamente
semelhantes às observadas nos animais machos e fêmeas anteriormente
descritos (Figura 8c, 8d, 8g).
80
81
No grupo A2, as trabéculas ósseas formadas no defeito se
anastomosavam e se proliferavam para o interior do canal medular,
preenchendo-o completamente (Figura 8d).
82
83
84
5.2 Análise histomorfométrica
A neoformação óssea, quantificada em números
absolutos e em porcentagem, ocorrida em cada animal avaliado está
apresentada segundo o grupo experimental, o período de observação e o
sexo do animal estudado. A Tabela 1 apresenta os dados obtidos no
grupo controle (C), aos sete dias, em machos e fêmeas.
Tabela 1 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo controle no período de sete dias,
macho e fêmea
Período (7 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
C 149 0,2483 171 0,285
C 52 0,0867 171 0,285
C 4 0,0067 80 0,1333
C 16 0,1933 144 0,24
C 136 0,2267 170 0,2833
C 88 0,1467 - -
*%=P/600
85
As Tabelas 2 a 7 apresentam os dados obtidos aos sete
dias, nos animais machos e fêmeas dos grupos amido (Am), alendronato -
1mol (A1), alendronato - 2moles (A2), hidroxiapatita - 1mol (HA1),
hidroxiapatita - 2moles (HA2) e alendronato + hidroxiapatita - 2moles
(A+HA), respectivamente.
Tabela 2 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo amido no período de sete dias,
macho e fêmea
Período (7 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
Am 138 0,23 170 0,2833
Am 180 0,3 161 0,2683
Am 134 0,2233 261 0,435
Am 82 0,1367 187 0,3117
Am 133 0,2217 136 0,2267
Am 134 0,2233 134 0,2233
*%=P/600
86
Tabela 3 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo alendronato - 1mol no período de
sete dias, macho e fêmea
Período (7 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
A1 0 0,0 6 0,01
A1
0
0,0
67 0,1117
A1
0
0,0
3 0,005
A1
0
0,0
0 0,0
A1
0
0,0
14 0,0233
A1
0
0,0
18 0,03
*%=P/600
Tabela 4 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo alendronato - 2moles no período
de sete dias, macho e fêmea
Período (7 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
A2
0 0,0 27 0,045
A2 0 0,0
14 0,0233
A2
0 0,0
77 0,1283
A2
0 0,0
50 0,0833
A2
0 0,0
40 0,0667
A2
0 0,0
41 0,0683
*%=P/600
87
Tabela 5 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo hidroxiapatita - 1mol no período
de sete dias, macho e fêmea
Período (7 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
HA1 106 0,1767 65 0,1083
HA1 121 0,2017 84 0,14
HA1 109 0,1817 91 0,1517
HA1 101 0,1683 169 0,2817
HA1 70 0,1167 59 0,0983
HA1 95 0,1583 93 0,155
*%=P/600
Tabela 6 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo hidroxiapatita - 2moles no período
de sete dias, macho e fêmea
Período (7 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
HA2 87 0,145 153 0,255
HA2 90 0,15 94 0,1567
HA2 99 0,165 93 0,155
HA2 78 0,13 70 0,1167
HA2 86 0,1433 83 0,1383
HA2 91 0,1517 109 0,1817
*%=P/600
88
Tabela 7 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo alendronato + hidroxiapatita -
2moles no período de sete dias, macho e fêmea
Período (7 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
A+HA 0 0,0 75 0,125
A+HA 0 0,0 85 0,1417
A+HA 0 0,0 47 0,0783
A+HA 0 0,0 85 0,1417
A+HA 0 0,0 96 0,16
A+HA 0 0,0 98 0,1633
*%=P/600
As Tabelas 8 a 14 apresentam os dados obtidos aos 21
dias, nos animais machos e fêmeas dos grupos controle (C), amido (Am),
alendronato - 1mol (A1), alendronato - 2moles (A2), hidroxiapatita - 1mol
(HA1), hidroxiapatita - 2moles (HA2) e alendronato + hidroxiapatita -
2moles (A+HA), respectivamente.
89
Tabela 8 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo controle no período de 21 dias,
macho e fêmea
Período (21 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
C 117 0,195 279 0,465
C 122 0,2033 233 0,3883
C 190 0,3167 254 0,4233
C 150 0,25 155 0,2583
C 108 0,18 240 0,4
C 98 0,1633 237 0,395
*%=P/600
Tabela 9 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo amido no período de 21 dias,
macho e fêmea
Período (21 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
Am 239 0,3983 309 0,515
Am 258 0,43 200 0,3333
Am 189 0,315 193 0,3217
Am 133 0,2217 151 0,2517
Am 134 0,2233 260 0,4333
Am 142 0,2367 262 0,4367
*%=P/600
90
Tabela 10 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo alendronato - 1mol no período
de 21 dias, macho e fêmea
Período (21 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
A1 7 0,0117 162 0,27
A1 124 0,2067 123 0,205
A1 118 0,1967 209 0,3483
A1 279 0,465 210 0,35
A1 242 0,4033 253 0,4217
A1 154 0,2567 - -
*%=P/600
Tabela 11 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo alendronato - 2moles no período
de 21 dias, macho e fêmea
Período (21 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
A2 207 0,345 138 0,23
A2 234 0,39 258 0,43
A2 169 0,2817 260 0,4333
A2 25 0,0417 244 0,4067
A2 287 0,4783 242 0,4033
A2 183 0,305 263 0,4383
*%=P/600
91
Tabela 12 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo hidroxiapatita - 1mol no período
de 21 dias, macho e fêmea
Período (21 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
HA1 174 0,29 301 0,5017
HA1 216 0,36 233 0,3883
HA1 216 0,36 293 0,4883
HA1 214 0,3567 267 0,445
HA1 225 0,375 304 0,5067
HA1 249 0,415 269 0,4483
*%=P/600
Tabela 13 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo hidroxiapatita - 2moles no
período de 21 dias, macho e fêmea
Período (21 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
HA2 199 0,3317 213 0,355
HA2 157 0,2617 232 0,3867
HA2 155 0,2583 271 0,4517
HA2 221 0,3683 277 0,4617
HA2 224 0,3733 272 0,4533
HA2 150 0,25 225 0,375
*%=P/600
92
Tabela 14 - Resultado da contagem total de pontos (P) de intersecção do
retículo sobre as trabéculas ósseas neoformadas e seu valor
em porcentagem* do grupo alendronato + hidroxiapatita -
2moles no período de 21 dias, macho e fêmea
Período (21 dias)
Grupo
Macho Fêmea
P % P %
A+HA 299 0,4983 291 0,485
A+HA 26 0,0433 289 0,4817
A+HA 18 0,3133 310 0,5167
A+HA 179 0,2983 244 0,4067
A+HA 246 0,41 295 0,4917
A+HA 144 0,24 259 0,4317
*%=P/600
A Tabela 15 apresenta os resultados dos valores médios
da porcentagem da neoformação óssea segundo cada grupo
experimental, nos animais machos e fêmeas, nos períodos estudados.
Tabela 15 - Resultado referente aos valores médios da porcentagem da
neoformação óssea, nos períodos de sete e 21 dias, em
animais machos e fêmeas
Grupo 7 dias / ♂ 7 dias / ♀ 21 dias / ♂ 21 dias / ♀
C 15,13% 24,53% 21,8% 38,83%
Am 22,24% 29,13% 30,41% 38,19%
A1 0% 2,9% 25,66% 31,89%
A2 0% 6,91% 30,69% 39,02%
HA1 16,71% 15,58% 35,94% 46,3%
HA2 14,74% 16,71% 30,71% 41,38%
A+HA 0% 13,49% 30,05% 46,88%
93
5.3 Análise estatística
Os dados obtidos a partir da análise histomorfométrica
foram submetidos à análise de variância (ANOVA) a três fatores, sendo
estes o tratamento realizado em cada grupo experimental (C, Am, A1, A2,
HA1, HA2 e A+HA), o período de observação (sete e 21 dias) e o sexo
(machos e fêmeas). Todos estes resultados estão apresentados nas
Tabelas 16 a 19.
Na Tabela 16 podemos encontrar os resultados
estatísticos obtidos com relação aos diferentes grupos experimentais, no
período de sete dias, nos animais machos.
Tabela 16 - Estatística descritiva referente aos grupos experimentais, no
período de sete dias, em machos
Grupo Período (dias) Sexo Média DP
C 7
♂
0,1514 0,0916
Am
7
♂
0,2225 0,0518
A1
7
♂
0,0 0,0
A2
7
♂
0,0 0,0
HA1
7
♂
0,1672 0,0287
HA2
7
♂
0,1475 0,0115
A+HA
7
♂
0,0 0,0
DP: desvio padrão
Na Tabela 17 podemos encontrar os resultados
estatísticos obtidos com relação aos diferentes grupos experimentais, no
período de sete dias, nas fêmeas.
94
Tabela 17 - Estatística descritiva referente aos grupos experimentais, no
período de sete dias, em fêmeas
Grupo Período (dias) Sexo Média DP
C 7
♀ 0,2453 0,0655
Am
7 ♀ 0,2914 0,078
A1
7
♀ 0,03 0,0416
A2
7
♀ 0,0692 0,0358
HA1
7
♀ 0,1558 0,0658
HA2
7
♀ 0,1672 0,0481
A+HA
7
♀ 0,135 0,0311
DP: desvio padrão
Na Tabela 18 podemos encontrar os resultados
estatísticos obtidos com relação aos diferentes grupos experimentais, no
período de 21 dias, nos animais machos.
Tabela 18 - Estatística descritiva referente aos grupos experimentais, no
período de 21 dias, em machos
Grupo Período (dias) Sexo Média DP
C 21
♂
0,2181 0,0565
Am
21
♂ 0,3042 0,0924
A1
21
♂ 0,2567 0,1619
A2
21
♂ 0,3069 0,1475
HA1
21
♂ 0,3594 0,0404
HA2
21
♂ 0,3072 0,0573
A+HA
21
♂ 0,3006 0,1556
DP: desvio padrão
95
Na Tabela 19 estão apresentados os resultados
estatísticos obtidos com relação aos diferentes grupos experimentais, no
período de 21 dias, nas fêmeas.
Tabela 19 - Estatística descritiva referente aos grupos experimentais, no
período de 21 dias, em fêmeas
Grupo Período (dias) Sexo Média DP
C 7
♀ 0,3883 0,0695
Am
7 ♀ 0,3819 0,0962
A1
7
♀ 0,319 0,0833
A2
7
♀ 0,3903 0,0798
HA1
7
♀ 0,4631 0,0451
HA2
7
♀ 0,4139 0,0469
A+HA
7
♀ 0,4689 0,0412
DP: desvio padrão
Na Figura 11, observa-se o gráfico referente aos valores
das médias e DP dos dados da neoformação óssea dos grupos C, Am,
A1, A2, HA1, HA2 e A+HA, aos sete e 21 dias, nos animais machos e
fêmeas.
96
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
tratamento
reparação óssea
macho 7 dias
fêmea 7 dias
macho 21 dias
fêmea 21 dias
C
A1
Am
A2 HA2HA1 A+HA
FIGURA 11 - Gráfico ilustrativo das médias e DP dos dados da
neoformação óssea nos diferentes grupos experimentais, aos
sete e 21 dias, nos animais machos e fêmeas.
A Figura 11 indica que houve um aumento dos valores
das médias em relação aos períodos de observação, mostrando que
provavelmente tenha ocorrido uma neoformação óssea progressiva,
independente do tratamento realizado e do sexo dos animais. Podemos
também observar que, em todos os grupo experimentais, a neoformação
óssea foi mais evidente nas fêmeas quando comparado aos machos.
97
Na Tabela 20 estão apresentados os resultados
estatísticos da ANOVA (nível de significância 1%) com relação aos fatores
estudados, bem como em relação à interação entre estes fatores.
Tabela 20 - Análise de variância a três fatores
Fatores
Soma dos
quadrados
Grau de
liberdade
Quadrado
médio
F Valor-P
Grupo
experimental
0,3891 6 0,0649 11,7
0,0000*
Período 2,0249 1 2,0249 365,39
0,0000*
Sexo 0,293 1 0,293 52,87
0,0000*
Interação
Grupo x Período
0,316 6 0,0527 9,5
0,0000*
Interação
Grupo x Sexo
0,0611 6 0,0102 1,84 0,0959
Interação
Período x Sexo
0,0285 1 0,0285 5,13 0,025
Interação
Grupo x Período
x Sexo
0,0146 6 0,0024 0,44 0,8508
Erro 0,7648 138 0,0055
Total 3,892 165
*P<0,01 = diferença estatisticamente significante
98
Considerando-se os dados descritos na Tabela 20
observamos que houve diferença estatisticamente significativa com
relação ao grupo experimental, ao tempo, ao sexo e na interação dos
grupos experimentais e períodos de observação.
Uma vez que a análise de variância a três fatores acusou
diferenças estatisticamente significantes em relação à interação do grupo
experimental e o período de observação, foi realizado o teste de
comparação múltipla de Tukey para comparação entre estes valores
(Tabela 21).
Tabela 21 - Teste de Tukey para comparação entre os diferentes grupos
experimentais e períodos de observação estudados
Grupo
experimental
Período de
observação
Média
Grupos
homogêneos*
A1 7 0,015
a
A2 7 0,0346
a
A+HA 7 0,0675
a b
HA2 7 0,1574
b c
HA1 7 0,1615
b c
C 7 0,1984
c d
Am 7 0,2569
c d e
A1 21 0,2878
d e f
C 21 0,3032
d e f g
Am 21 0,3431
e f g
A2 21 0,3486
e f g
HA2 21 0,3606
e f g
A+HA 21 0,3847
f g
HA1 21 0,4112
g
* médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente
99
Como podemos observar na Tabela 21, todos os animais
exibiram uma maior neoformação óssea aos 21 dias que aos sete dias,
independentemente do grupo experimental, representada pelas médias
mais elevadas aos 21 dias.
Aos sete dias, não houve diferenças estatísticas entre os
grupos C e Am, entre A1 e A2 e, entre HA1 e HA2. O grupo A+HA
também não apresentou diferenças estatísticas em relação aos grupo A1
e A2, tão pouco em relação aos grupos HA1 e HA2, diferindo apenas com
relação aos grupos C e Am, que apresentaram as médias de
neoformação óssea mais elevada neste período.
No período de 21 dias, diferenças estatísticas
significantes foram observadas apenas entre o grupo HA1 e o grupo A1. A
maior média da neoformação óssea foi apresentada pelo grupo HA1,
seguida pelos grupos A+HA e HA2.
6 DISCUSSÃO
O processo de reparação óssea é complexo e tem sido
amplamente estudado. Várias são as pesquisas que procuram explicar e
aprimorar este mecanismo. Com este objetivo, muitos autores têm usado
diferentes materiais, e experimentado substâncias farmacológicas, que
possam apresentar uma atuação neste processo. Devido à sua filia pela
hidroxiapatita do osso, os bisfosfonatos têm sido amplamente utilizados
(COMPSTON
14
, 1994; SHERMAN
74
, 2001).
De maneira geral, os bisfosfonatos são empregados onde
ocorre um desequilíbrio do mecanismo entre a formação e a reabsorção
óssea, bem como para o tratamento de muitas doenças ósseas,
principalmente daquelas ligadas ao metabolismo ósseo (MARCUS
53
,
1996; D’AOUST et al.
15
, 2000; KAYNAK et al.
41
, 2000; KULAK &
BILEZIKIAN
46
, 2000; BISWAS et al.
8
, 2003; SHERMAN
74
, 2001;
SAMBROOK
72
; 2003; GONNELLI et al.
34
, 2003; KAYNAK et al.
42
, 2003;
SAMBROOK et al.
73
, 2003; TORREGROSA et al.
82
, 2003; DUARTE et
al.
19
, 2004; ROCHA et al.
68
, 2004).
Autores como Fleisch
25
(1991), Reddy et al.
65
(1995),
Marcus
53
(1996), Ringe et al.
67
(2001), Sherman
74
(2001), Jianhua et al.
40
(2002), Greenspan et al.
36
(2003) e Torregrosa et al.
82
(2003) atribuem
também aos bisfosfonatos a capacidade de provocar um relativo aumento
da densidade óssea. Outros autores acreditam que estes fármacos atuem
melhorando as propriedades biomecânicas dos ossos, diminuindo
inclusive o risco de fraturas (GRYNPAS et al.
37
, 1992; FLEISCH
26
, 1997;
LIBERMAN et al.
49
, 1995, RINGE et al.
67
, 2001, SHERMAN
74
, 2001,
GREENSPAN et al.
36
, 2003; MASUD & GIANNINI
54
, 2003;
TORREGROSA et al.
82
, 2003).
101
Lin et al.
51
(1991), Lin
50
(1996), Silva
75
(2000) e Alekna &
Tamulaitiene
1
(2001) têm utilizado o alendronato e outros bisfosfonatos
por diferentes vias de administração, sendo a via oral a mais comum
delas.
Em trabalho anterior (FERNANDES et al.
23
, 2004),
utilizamos o alendronato por via oral, porém nossos resultados
demonstraram que por esta via de administração, o alendronato não
favoreceu a neoformação óssea, como também descreveu Fayad
21
(2001). Entretanto, autores como D’Aoust et al.
15
(2000) e Manolagas
52
(2000) afirmaram que o alendronato administrado por via oral, além de
promover um aumento da densidade mineral óssea, pode propiciar um
aumento da neoformação óssea.
Também autores como Giuliani et al.
33
(1998), Gandolfi et
al.
29
(1999), Reinholz et al.
66
(2000), Tenenbaum et al.
80
(2002) sugeriram
a possibilidade dos bisfosfonatos atuarem na formação óssea por uma
ação sobre os osteoblastos.
Todavia, a maioria dos autores descreve que o principal
mecanismo de ação dos bisfosfonatos reside na sua capacidade de inibir
a reabsorção óssea, por uma ação sobre os osteoclastos (YAFFE et al.
89
,
1995; MARCUS
53
, 1996; BIKLE
6
, 1998; WARNER
84
, 2000; SOLOMON
77
,
2002). Sendo assim, sabemos que esta ação pode ocorrer pela inibição
do recrutamento dos osteoclastos, pela diminuição da aderência dessas
células na matriz mineralizada, e também pela diminuição na
diferenciação e no tempo de vida celular (SPARIDANS et al.
78
, 1998).
Além disso, FLEISCH
26
(1997) descreveu que a inibição
osteoclástica pode ocorrer devido à atuação medicamentosa direta sobre
os osteoclastos, e que isto, provavelmente, desencadeia alterações na
morfologia celular, como modificações no citoesqueleto e na borda em
escova.
102
Considerando o que foi descrito e afirmado pelos autores
acima, resolvemos utilizar o alendronato diretamente no local do defeito
ósseo.
Com relação ao uso local do alendronato, Yaffe et al.
90
(1997) aplicando este fármaco sobre a superfície alveolar da mandíbula
de ratos, posteriormente recobertas por um retalho mucoperiosteal,
constataram que esta aplicação local provocou uma redução significante
sobre a reabsorção óssea alveolar.
Posteriormente, Yaffe et al.
91
(1999) aplicaram
diretamente sobre a superfície óssea uma esponja gelatinosa encharcada
por alendronato, objetivando analisar sua ação no osso. Os autores
concluíram que 10% do total de alendronato contido na esponja foi
absorvido pelo osso localmente, embora não expliquem no trabalho como
chegaram a tal percentual. Constataram como resultado, que o
alendronato aplicado localmente, pode ser utilizado no tratamento
preventivo da reabsorção óssea, durante procedimentos ortopédicos e
odontológicos.
Na mesma linha, Binderman et al.
7
(2000) também
utilizando uma esponja gelatinosa encharcada por alendronato em
diferentes concentrações, aplicada sob retalhos mucoperiosteais,
constataram que as concentrações mais altas propiciaram a redução da
perda óssea.
Neste estudo, diferentemente destes autores, não
utilizamos o alendronato sódico para verificação da redução da perda
óssea, mas sim visando à neoformação óssea.
Também contrariamente aos autores mencionados acima,
não trabalhamos com dosagens de alendronato, uma vez que o nosso
objetivo foi biodisponibilizar a molécula do alendronato no local do defeito
ósseo. Neste trabalho, optamos por trabalhar com o alendronato em
diferentes molaridades.
103
Usamos ainda o alendronato na forma de pó em
diferentes molaridades, porque desta maneira conseguíamos assegurar,
por constatação visual, que o fármaco permanecesse contido no interior
do defeito ósseo, após a sua aplicação.
Em parte, optamos por trabalhar com a via de
administração local do alendronato, acreditando serem verdadeiras as
afirmações de autores como Kulak & Bilezikian
46
(2000) que observaram
que apenas uma pequena fração do alendronato alcança a circulação
sistêmica, quando administrado por via oral.
Além disso, autores como Gandolfi et al.
29
(1999) e
Michigami et al.
57
(2002), relatam uma ação eficaz das moléculas de
alendronato sobre os osteoblastos, favorecendo conseqüentemente à
neoformação óssea.
Apesar das afirmações supracitadas, os resultados
obtidos nessa pesquisa mostraram que a aplicação local do alendronato,
na forma de concentração molar, não favoreceu o processo de
neoformação óssea no local do defeito ósseo.
Em contrapartida, um achado bastante interessante em
nosso trabalho foi a presença de uma neoformação óssea subperiosteal
extra-cortical em todos os animais dos grupos experimentais, tanto aos
sete como aos 21 dias, onde o alendronato sódico foi usado, ou seja, nos
grupos alendronato um mol e dois moles, bem como no grupo
alendronato mais hidroxiapatita.
Acreditamos que esta neoformação óssea possa ter sido
desencadeada, pela penetração do alendronato sob o periósteo, no
momento da inserção do material, no interior do defeito ósseo. Desta
maneira, o alendronato pode ter agido sobre a superfície do osso,
desencadeando a formação óssea.
Não encontramos, nos animais machos aos sete dias,
praticamente nenhuma formação óssea no local do defeito ósseo, sendo
que no referido local observávamos apenas uma rede de fibrinas.
104
Confirmando este achado, notamos que nos animais
machos aos sete dias, foram encontradas as menores médias de
neoformação óssea. Não temos como explicar esta falta de formação
óssea no local do defeito, nos machos aos sete dias, pois apenas nos
grupos onde o alendronato foi usado, tal característica se fazia presente.
Em relação às fêmeas aos sete dias, o alendronato em
ambas as concentrações também retardou a reparação óssea, quando
comparado aos grupos controle e amido.
Nos animais de ambos os sexos, aos 21 dias, verificamos
as trabéculas ósseas unindo as bordas do defeito em toda a sua
extensão. Além disso, estas trabéculas se direcionavam para a região
mais central do canal medular, sendo que, em alguns espécimes, esse
trabeculado ósseo preenchia praticamente, quase todo o canal medular.
Talvez esta formação trabecular ocorrida no canal
medular, encontre respaldo no trabalho de Giuliani et al.
32
(1998), que
estudando a ação do alendronato em culturas de medula óssea de ratas,
verificaram uma ação metabolicamente positiva deste fármaco sobre a
medula óssea, podendo estimular desta maneira o processo de
osteoblastogênese.
Aos 21 dias não houve diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos alendronato um mol, dois moles e
alendronato mais hidroxiapatita entre si; tampouco entre estes grupos e
os grupos controle e amido.
Entretanto, apesar de não haver diferenças estatísticas
entre os grupos, as maiores médias de neoformação óssea foram
verificadas nos grupos alendronato dois moles e alendronato mais
hidroxiapatita, indicando a possibilidade dessas substâncias favorecerem
a neoformação óssea.
Os resultados encontrados neste trabalho, com relação à
utilização do alendronato local em diferentes molaridades, bem como a
sua biodisponibilização local, não tem como serem comparados e
105
discutidos, uma vez que não encontramos na literatura pesquisada
nenhum trabalho que tenha utilizado metodologia semelhante.
Além de termos trabalhado isoladamente com o
alendronato sódico no local do defeito ósseo, utilizamos também a
hidroxiapatita nas concentrações de um e dois moles, seguindo a mesma
metodologia usada para o alendronato.
Sabemos que pelo fato da hidroxiapatita ser o principal
componente mineral do tecido ósseo e responsável pela solidez e rigidez
do osso (WEISS & GREEP
86
, 1981), ela é um dos biomateriais mais
usados. Segundo Caria
11
(1999), a hidroxiapatita é um possível substituto
para o enxerto autógeno.
Clinicamente, a hidroxiapatita vem sendo bastante
empregada, e são inúmeros os trabalhos que utilizaram este material
(DENISSEN & DE GROOT
16
, 1979; KENNEY et al.
43
, 1985; FRAME
28
,
1987; WOLFORD et al.
87
, 1987; NAAMAN BOU-ABBOUD et al.
59
, 1994;
ROGERO et al.
69
, 1999; SINGH et al.
76
, 2004).
Dentre as características físicas pesquisadas a respeito
da hidroxiapatita, destacam-se a sua forma de apresentação, bem como o
tamanho, a forma das partículas e a sua porosidade (ELDEEB &
ROSZKOWSKI
20
, 1988; LEHTINEN et al.
48
, 1990; GRANJEIRO et al.
35
,
1992; ROSA et al.
70
, 1995; VEECK et al.
83
, 1995; HIGASHI &
OKAMOTO
38
, 1996, CHANG et al.
12
, 2000; FLAUTRE et al.
24
, 2001;
LEGEROS
47
, 2002; SPECCHIA et al.
79
, 2002; GERBER et al.
31
, 2003; KIM
et al.
45
, 2005).
Outros autores estudaram a hidroxiapatita associada com
outros materiais ou fármacos (BELL & BEIRNE
5
, 1988; ALPER et al.
2
,
1989; COBB et al.
13
, 1990; ITO et al.
39
, 1998; TIELIEWUHAN et al.
81
,
2004).
A hidroxiapatita utilizada neste trabalho apresentava
partículas micro granulares, com dimensões variando entre 0,25µm a
1,0µm.
106
Autores como Oliveira et al.
60
(1993) e Orlovskii et al.
61
(2002), chamam a atenção para a importância do estudo das
características físicas da hidroxiapatita, uma vez que estas podem
influenciar diretamente na resposta biológica frente à sua implantação no
leito receptor.
Entretanto, Caria
11
(1999) e Fernandes et al.
23
(2004)
observaram que a hidroxiapatita por eles utilizada apresentou as
propriedades de osteocondutibilidade e biocompatibilidade. Os autores
fizeram tal afirmação, pois verificaram que ocorreu crescimento ósseo ao
redor dos grânulos de hidroxiapatita, sem a presença de tecido conjuntivo
interposto entre o osso e as partículas de hidroxiapatita.
A hidroxiapatita utilizada neste trabalho mostrou ser
reabsorvível, uma vez que, aos sete dias, encontrávamos no local do
defeito ósseo grande quantidade de imagens negativas dos grânulos de
hidroxiapatita; entretanto quando observávamos o local do defeito, aos 21
dias, esses grânulos não se faziam presentes. Tal característica também
foi observada por nós em trabalho anterior (FERNANDES et al.
23
, 2004).
Com relação à resposta inflamatória causada pela
hidroxiapatita, quando esta foi usada em processos de neoformação
óssea, autores como Yamamoto et al.
93
(1994), Argento
3
(1998) e Boeck
et al.
9
(1999) afirmaram que ela causou resposta inflamatória severa e,
em alguns casos, até reação do tipo corpo estranho.
Diferentemente dos autores mencionados acima, notamos
em nosso trabalho que a hidroxiapatita utilizada, não desencadeou uma
resposta inflamatória severa. O mesmo foi constatado por autores como
Eldeeb & Roszkowski
20
(1988), Caria
11
(1999), Orlovskii et al.
61
(2002), e
Fernandes et al.
23
(2004).
Apesar de termos comparado os nossos resultados com
os obtidos por estes autores, é importante chamar a atenção para o fato
de cada um deles ter usado uma hidroxiapatita com características físicas
107
diferentes, fato este que deve ser levado em conta, quando se comparam
os trabalhos entre si.
Finalmente, com relação à resposta inflamatória
encontrada com o uso da hidroxiapatita em diferentes molaridades,
constatamos que esta ocorreu independentemente do sexo do animal e
do período estudado.
Uma vez que constatamos pouca reação inflamatória com
a hidroxiapatita utilizada, somos levados a afirmar que, provavelmente,
esta hidroxiapatita seja biocompatível. A nossa observação está de
acordo com os achados de autores como Cobb et al.
13
(1990), Veeck et
al.
83
(1995), Ruano et al.
71
(1996), Caria
11
(1999), Legeros
47
(2002) e
Fernandes et al.
23
, (2004).
Baseada nos dados histomorfométricos, a análise
estatística mostrou que, aos sete dias de observação, os grupos
hidroxiapatita um mol e dois moles não diferiram entre si, em ambos os
sexos estudados.
Também não houve diferença estatisticamente
significante, quando comparamos o grupo hidroxiapatita um mol e dois
moles, com os grupos controle e amido, independentemente do sexo dos
animais.
Sendo assim, afirmamos que, aos sete dias de
observação, a presença da hidroxiapatita no defeito não interferiu no
processo de reparação óssea.
Nossos resultados coincidem com os de Bell & Beirne
5
(1988), que observaram que a hidroxiapatita não favoreceu, nem
tampouco prejudicou neoformação óssea. Por outro lado, diferem dos
resultados obtidos por Alper et al.
2
(1989), Rosa et al.
70
(1995), Argento
3
(1998) e Boeck et al.
9
(1999), que relataram que a hidroxiapatita interferiu
negativamente, retardando a neoformação óssea.
108
É importante frisar que, embora seja possível a
comparação dos resultados entre si, a utilização da hidroxiapatita nas
concentrações de um e dois moles não é descrita por nenhum outro
trabalho na literatura; por nós pesquisados.
Analisando qualitativamente nossos resultados,
observamos que, aos sete dias, comparando-se as médias de
neoformação óssea dos grupos hidroxiapatita um mol e dois moles, com
os valores das médias dos demais grupos, notamos que as maiores
médias de neoformação óssea ocorreram nos grupos controle e amido.
Com relação ao sexo, ainda aos sete dias, vemos que as
médias obtidas pelos grupos hidroxiapatita um mol e hidroxiapatita dois
moles foram semelhantes entre os machos e as fêmeas.
Já aos 21 dias, estatisticamente houve diferença apenas
entre o grupo hidroxiapatita um mol e o grupo alendronato um mol.
Entretanto, comparando-se as médias da neoformação
óssea de todos os grupos, constatamos que os maiores valores foram
encontrados nos grupos hidroxiapatita um mol, dois moles e alendronato
mais hidroxiapatita.
Quando comparamos os resultados obtidos com o uso da
hidroxiapatita nos diferentes períodos, vemos que os resultados aos 21
dias foram melhores. Acreditamos que tal fato se deva, em decorrência do
período de sete dias ser insuficiente para a ação da propriedade
osteocondutora da hidroxiapatita.
Analisando o sexo dos animais, aos 21 dias notamos que
a neoformação óssea foi mais evidente nas fêmeas que nos machos.
A utilização concomitante do alendronato mais a
hidroxiapatita é ainda pouco pesquisada. Isto se deve, provavelmente, à
dificuldade de se estabelecer uma metodologia adequada para a
associação destas duas substâncias.
109
Os trabalhos encontrados na literatura científica, além de
serem extremamente escassos, não descrevem de forma clara e
pormenorizada como foi feita a associação entre o alendronato e a
hidroxiapatita.
Nossos resultados mostraram que a neoformação óssea
observada, quando da ação concomitante do alendronato com a
hidroxiapatita, foi mais evidente nas fêmeas que nos machos, tanto aos
sete, quanto aos 21 dias.
Estatisticamente, não foram verificadas diferenças entre o
grupo alendronato mais hidroxiapatita e os grupos controle e amido, aos
21 dias.
Aos sete dias foram encontradas diferenças estatísticas,
apenas entre o grupo alendronato mais hidroxiapatita e o grupo amido;
aos 21 dias, entre o grupo alendronato mais hidroxiapatita e o grupo
alendronato um mol.
Concluímos que a utilização do alendronato mais a
hidroxiapatita, aplicado no defeito, não intensificou o processo de
reparação óssea.
Este resultado foi semelhante ao de Fernandes et al.
23
(2004) que, utilizando alendronato via oral e hidroxiapatita localmente, no
reparo de defeito ósseos em mandíbula de coelhos, não encontraram
diferenças estatisticamente significantes em relação ao grupo controle.
Contudo, nossos resultados, mesmo usando uma
metodologia diferente, são contrários aos obtidos por Meraw & Reeve
55
(1999), Meraw et al.
56
(1999), Denissen et al.
17-8
(2000) que, trabalhando
com blocos de hidroxiapatita revestidos por alendronato, implantados em
diferentes animais, afirmaram que esta associação potencializou a
formação óssea ao redor dos implantes.
110
Já, Yoshinari et al.
94
(2001) não mostrando claramente
seus resultados, afirmaram que a combinação hidroxiapatita e
bisfosfonato, aplicado sobre o titânio pode ser útil, em implantes
dentários.
Finalmente, Ganguli et al.
30
(2002), trabalhando in vitro,
verificaram que a hidroxiapatita associada a outros bisfosfonatos,
aumentou a síntese de DNA e de colágeno pelos osteoblastos,
favorecendo, desta maneira, à osteointegração.
Apesar de não termos verificado diferenças estatísticas
entre os diferentes grupos de materiais utilizados, ainda acreditamos que
com algumas variações e pequenos aprimoramentos na metodologia,
iremos, num futuro próximo, obter resultados mais expressivos, com
relação ao uso do alendronato aplicado localmente, bem como a sua
associação com outras substâncias, como a hidroxiapatita.
7 CONCLUSÃO
Baseados nos resultados obtidos neste trabalho,
podemos concluir que:
a) a aplicação local do alendronato sódico interferiu
negativamente na reparação óssea no modelo
experimental proposto;
b) a aplicação local da hidroxiapatita e do alendronato
mais a hidroxiapatita não interferiram na reparação
óssea;
c) a reparação óssea foi mais evidente nas fêmeas,
independentemente do período e do grupo estudados.
8 REFERÊNCIAS*
1 ALEKNA, V.; TAMULAITIENE, M. Sodium alendronate: once per day
or per week? Gerontol, v.2, n.2, p. 124-6, 2001. (Abstract).
Disponível em: <
http://www.gerontologia.It/em/2001nr2/7.htm>.
Acesso em: 06 nov. 2002.
2 ALPER, G. et al. Osteogenesis in bone defects in rats: the effects of
hydroxyapatite and desmineralized bone matrix. Am J Med Sci,
v.298, n.6, p.371-6, Dec. 1989.
3 ARGENTO, M.A. Análise histológica da reparação de defeitos
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Biopatologia Bucal) - Faculdade de Odontologia de São José dos
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ABSTRACT
This research evaluated the effect of the local use of sodium alendronate, of
hydroxyapatite and the association alendronate more hydroxyapatite in different
molars concentrations, in the repair of bone defects in femurs of mices. We made
in the femur of 168 mices (84 males and 84 females) a bone defect measuring
2,5mm of diameter. We divided these animals in groups: control, starch,
alendronate one mol, alendronate two mols, hydroxyapatite one mol,
hydroxyapatite two mols and alendronate more hydroxyapatite, in accordance
with the material of fulfilment used. In the animals of the control group, the defect
was just filled by the clot originating from defect. The animals were sacrificed at
seven and 21 days, when the femur was removed, fixed and decalcified, to
making histologics laminae. Histological and histomorphometric analyses were
performed and the results obtained were submitted to statistical analysis ANOVA.
At seven days, it was observed immature bone trabeculae with larges
osteocyties. It was noticed bone formation in all groups, exceptin the male
animals where the alendronate was present. In the group that received
hydroxyapatite, it was visualized negatives images of the hydroxyapatite’s
granules. At 21 days, the trabeculae practically closed the defect of most studied
specimens. Statistically, there were differences between males and females,
between the observation periods and with relationship of the alendronate use. It
was concluded that the local application of sodium alendronate interfered
negatively in bone repair, that the hydroxyapatite and alendronate more
hydroxyapatite didn’t interfere in the repair and that the bone repair was larger in
the females independently of studied period.
KEYWORDS: Bone regeneration; bone; repair; bisphosphonates; alendronate;
hydroxyapatite; animal.
126
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Odontologia de São José dos Campos - UNESP
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