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MÔNICA DAL PIAN NOBRE
AÇÃO LOCAL DO ALENDRONATO SÓDICO NO PROCESSO DE
REPARAÇÃO ÓSSEA DE FÊMURES DE RATOS
ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR)
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista, como
parte dos requisitos para a obtenção do
título de MESTRE, pelo Programa de
Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA
BUCAL, Área Biopatologia Bucal.
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MÔNICA DAL PIAN NOBRE
AÇÃO LOCAL DO ALENDRONATO SÓDICO NO PROCESSO DE
REPARAÇÃO ÓSSEA DE FÊMURES DE RATOS
ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR)
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para
a obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de Pós-Graduação em
BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Biopatologia Bucal.
Orientador: Prof. Titular Horácio Faig Leite
São José dos Campos
2006
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Apresentação gráfica e normalização de acordo com:
BELLINI, A. B.; SILVA, E. A. Manual para elaboração de monografias:
estrutura do trabalho científico. São José dos Campos: FOSJC/UNESP,
2002. 82p.
NOBRE, M.D.P. Ação local do alendronato sódico no processo de
reparação óssea de fêmures de ratos espontaneamente hipertensos
(SHR). 2006. 116f. Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal, Área
Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista. São José dos Campos, 2006.
DEDICATÓRIA
À minha família, em especial à minha mãe MARIA CRISTINA DAL PIAN e
ao meu irmão LUIZ FERNANDO DAL PIAN NOBRE,
pelo amor maior.
Em memória da minha irmã MARIA ANGÉLICA DAL PIAN NOBRE e do
meu avô ARDUINO LUIZ DAL PIAN, meus fiéis anjos da guarda.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Meu agradecimento especial ao Professor Titular HORÁCIO FAIG LEITE
por representar um exemplo de competência. Obrigada pela orientação
segura desta dissertação e pela contribuição preciosa para a
concretização deste sonho.
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de São José dos Campos –
UNESP, na pessoa do seu Diretor Prof. Adj. PAULO VILLELA SANTOS
JÚNIOR, pela oportunidade de estudar nesta Escola.
Ao Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal,
representado na pessoa da Profa. Adj. ANA SUELI RODRIGUES
CAVALCANTE e a todos os professores e funcionários que tornaram
possível a realização deste trabalho.
À Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em
Biopatologia Bucal Profa. Adj. ROSILENE FERNANDES DA ROCHA, pela
forma como conduz o curso, tornando-o uma referência no cenário
nacional.
Ao Prof. Adj. LUIZ EDUARDO BLUMER ROSA, pela
forma atenciosa com que me recebeu nesta Escola, pela oportunidade de
conviver e aprender.
À Profa. Adj. YASMIN RODARTE CARVALHO pelo
incentivo à pesquisa científica e por mostrar-se sempre disponível.
À Profa. Dra. ADRIANA AIGOTTI HABERBECK
BRANDÃO pelos ensinamentos de grande importância para a minha
formação.
Ao Prof. Dr. JOSÉ BENEDITO OLIVEIRA AMORIM, pelo
auxílio indispensável na obtenção dos animais.
À Profa. Dra. RAQUEL GUEDES FERNANDES, por
mostrar-se sempre disponível em me auxiliar, pelos seus ensinamentos e
pela amizade e convivência.
Aos Professores de Patologia Bucal da Faculdade de
Odontologia da UFRN, em especial à Profa. Dra LÉLIA BATISTA DE
SOUZA, que se tornaram meu grande exemplo.
À Profa. Titular SUZANA ORSINI MACHADO DE SOUSA
e a todos os funcionários da Disciplina de Patologia Bucal da Faculdade
de Odontologia da USP, por cederem espaço e condições para a
realização do processo de descalcificação das peças no Laboratório de
Patologia Cirúrgica desta Escola, meus sinceros agradecimentos.
À amiga Profa. Dra. ANA LIA ANBINDER, pela paciência
em me transmitir todos os seus conhecimentos, pelo incentivo constante,
por todos os conselhos e principalmente pela amizade sincera e
companheirismo.
À Profa. Dra. JANETE DIAS ALMEIDA pela
disponibilidade e pela grande contribuição na discussão deste trabalho.
À Divisão de Odontologia do GIA/SJ, em nome de seu
Chefe Ten. Cel. JOSÉ FERNANDO REGATO PEREIRA e a todos os
colegas de trabalho, pela confiança a mim atribuída e pelo suporte
oferecido durante o decorrer do curso.
Ao Ten. Cel. JOSÉ NELSON RUECKER pelo apoio e
incentivo constantes.
Ao Prof. Dr. CAMILO DALELES RENNÓ pela grande
colaboração na análise estatística.
Ao funcionário PAULO ROGÉRIO MARTINS, da
Disciplina de Anatomia, pela disponibilidade em ajudar e a tornar o
trabalho mais fácil.
Aos funcionários do Biotério ANTÔNIO DOMINGOS
SÁVIO BARBOSA MAIA VASCONCELOS e LOURIVAL JACOB, pela
paciência e colaboração indispensáveis no tratamento dos animais.
Ao funcionário do Laboratório de Apoio à Pesquisa
WALTER CRUZ, pela dedicação na confecção das lâminas histológicas.
À secretária do Departamento de Biociências e
Diagnóstico Bucal, SÍLVIA SCARPEL pela disposição em ajudar sempre
que preciso.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação
ROSEMARY DE FÁTIMA SALGADO, ERENA MICHIE HASEGAWA e
MARIA APARECIDA CONSIGLIO DE SOUZA por sua atenção no
decorrer do curso.
Aos meus grandes amigos MARCELA FERRAZ
CATRAMBY, RENATO MIQUELETO e DENNIA PEREZ pelo auxílio
imprescindível nas etapas experimentais deste trabalho, pelo apoio e
companheirismo incontestáveis.
Ao RICARDO TRAJANO SANDOVAL PEIXOTO, pela
doçura de sua companhia e pelo carinho de todos os momentos.
Ao colega de Pós-Graduação ANTÔNIO CARLOS
VICTOR CANETTIERI pela contribuição na execução desta pesquisa e
pelo companheirismo.
Aos meus amigos de Pós-Graduação GISELLE,
RODRIGO, PIETRO, FLÁVIA, FERNANDO e GRAZIELA pelo espírito de
humanidade com que nos tratamos diariamente.
Por fim, mas não menos importante, o meu
agradecimento aos amigos de todas as horas e que supriram, muitas
vezes, a saudade da família distante.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A1 Grupo alendronato 1mol
A2 Grupo alendronato 2mol
Am Grupo amido
Ang II Angiotensina II
ANOVA Análise de variância
AVC Acidente vascular cerebral
BMP-2 Proteína morfogenética óssea 2
C Grupo controle
CFU-F Unidade formadora de colônia para fibroblastos
CFU-OB Unidade formadora de colônia para osteoblastos
DMO Densidade mineral óssea
DNA Ácido desoxiribonucleico
DP Desvio padrão
DXA Dupla emissão de raios X
ECA Enzima conversora da angiotensina
FAO Fosfatase alcalina óssea
g Grama
HAS Hipertensão arterial sistêmica
HE Hematoxilina e eosina
hPTH(1,32) PTH humano sintético
HVE Hipertrofia ventricular esquerda
IL-1 Interleucina 1
Kg Quilograma
mg Miligrama
ml Mililitro
mmHg Milímetros de mercúrio
mol Mol
NIH National Institute of Health
PA Pressão arterial
PS Pressão sangüínea
PTH Hormônio paratireóideo
SD Sprague-Dawley
SHR Ratos espontaneamente hipetensos
SNS Sistema nervoso simpático
SRA Sistema renina angiotensina
TNF-α Fator de crescimento transformante α
TRAP Fosfatase ácida tartarato resistente
WKY Wistar Kyoto
µg Microgramas
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 -
Procedimentos cirúrgicos para a confecção do defeito
ósseo no fêmur esquerdo dos ratos: a) incisão
longitudinal na pele, após depilação e antissepsia; b)
divulsão da camada muscular e afastamento dos
tecidos moles; c) exposição do tecido ósseo após
descolamento do periósteo; d) confecção do defeito
ósseo de 2,5mm; e) preenchimento do defeito ósseo;
f) sutura e antissepsia final........................................... 56
FIGURA 2 -
SHR machos, sete dias (vista panorâmica): a) grupo
C: foco de hemorragia na área do defeito; b) grupo
Am: hemorragia na área do defeito; c) grupo A1:
rede de fibrina no conjuntivo preenchendo o defeito;
d) grupo A2: rede de fibrina no defeito ósseo e
tecido ósseo extra-cortical subperiosteal neoformado
(→) HE. Aumento original de 25x.................................
62
FIGURA 3 -
SHR machos, sete dias (centro do defeito): a) grupo
C: tecido conjuntivo frouxo com foco de hemorragia
na área do defeito (♦); b) grupo Am: áreas de
hemorragia na área do defeito (♦) e deposição de
matriz osteóide (→); c) grupo A1: rede de fibrina e
degeneração hidrópica no tecido conjuntivo
preenchendo o defeito; d) grupo A2: rede de fibrina
na área do defeito ósseo (+). HE. Aumento original
de 100x.........................................................................
64
FIGURA 4 -
SHR fêmeas, sete dias (vista panorâmica): a) grupo
C: foco de hemorragia na área do defeito; b) grupo
Am: ausência de hemorragia e presença de tecido
conjuntivo na área do defeito; c) grupo A1: rede de
fibrina no conjuntivo preenchendo o defeito e
formação óssea extra-cortical subperiosteal (→) d)
grupo A2: rede de fibrina na área do defeito ósseo e
detalhe da formação óssea extra-cortical
subperiosteal (→). HE. Aumento original de 25x.........
66
FIGURA 5 -
SHR fêmeas, sete dias (centro do defeito): a) grupo
C: foco de hemorragia na área do defeito (→); b)
grupo Am: tecido conjuntivo frouxo com deposição
de fibras colágenas; c) grupo A1: rede de fibrina no
conjuntivo preenchendo o defeito (♦); d) grupo A2:
rede de fibrina (♦) e matriz osteóide na área do
defeito ósseo (→). HE. Aumento original de 100x....... 68
FIGURA 6 -
SHR machos, 21 dias (vista panorâmica): a) grupo
C: defeito ósseo fechado em extensão; b) grupo
Am: anastomoses das trabéculas na superfície
externa do defeito; c) grupo A1: trabéculas ósseas
partindo do canal medular em direção ao defeito
ósseo (♦); d) grupo A2: rede de fibrina na área do
defeito ósseo e neoformação óssea extra-cortical
(→). HE. Aumento original de 25x................................ 70
FIGURA 7 -
SHR machos, 21 dias (centro do defeito): a) grupo
C: trabéculas ósseas anastomosadas limitando
espaços medulares com tecido conjuntivo frouxo b)
grupo Am: tecido ósseo neoformado recoberto por
periósteo na área do defeito ósseo (→); c) grupo A1:
trabéculas ósseas imaturas e superfície externa da
área do defeito ósseo recoberta por tecido conjuntivo
fibroso; d) grupo A2: tecido conjuntivo, com áreas de
hemorragia, deposição de fibras colágenas e tecido
osteóide (→). HE. Aumento original de 100x............... 72
FIGURA 8 -
SHR fêmeas, 21 dias (vista panorâmica): a) grupo C:
defeito ósseo fechado em extensão; b) grupo Am:
trabéculas ósseas anastomosadas fechando todo o
defeito; c) grupo A1: tecido conjuntivo na área do
defeito e neoformação óssea extra-cortical
subperiosteal (→); d) grupo A2: tecido conjuntivo na
área do defeito e neoformação óssea extra-cortical
subperiosteal (→). HE. Aumento original de 25x......... 74
FIGURA 9 -
SHR fêmeas, 21 dias (centro do defeito): a) grupo C:
trabéculas ósseas anastomosadas delimitando
espaços medulares; b) grupo Am: defeito ósseo
fechado por tecido ósseo neoformado, recoberto por
tecido conjuntivo fibroso (→); c) grupo A1: tecido
conjuntivo na área do defeito; d) grupo A2: defeito
preenchido por tecido conjuntivo frouxo. HE.
Aumento original de 100x............................................. 76
FIGURA 10 -
Detalhes da neoformação óssea: a) formação de
tecido ósseo extra-cortical subperiosteal aos sete
dias nos grupos tratados com alendronato. Observar
as trabéculas ósseas recobertas por periósteo (→) e
em contato direto com a cortical óssea externa (♦); b)
tecido ósseo extra-cortical subperiosteal aos 21 dias
nos grupos tratados com alendronato. Tecido ósseo
recoberto pelo periósteo (→) e em contato com a
cortical óssea externa (♦); c) trabéculas ósseas
imaturas, delimitando espaços medulares, observar
os osteoblastos se incorporando ao tecido ósseo (►)
e osteócitos volumosos (→); d) tecido ósseo mais
maduro e com arranjo lamelar, apresentando
osteócitos menos volumosos (→) e osteoblastos
achatados recobrindo a superfície óssea (►). HE.
Aumento original de 100x............................................. 77
FIGURA 11 -
Gráfico ilustrativo das médias e DP dos dados da
neoformação óssea nos diferentes grupos
experimentais, aos sete e 21 dias, nos SHR machos
e fêmeas .................................................................... 85
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor
em média porcentual do grupo C no período de
sete dias, macho e fêmea......................................... 78
TABELA 2 -
Resultado da contagem total de pontos (P) e valor
em média porcentual do grupo Am no período de
sete dias, macho e fêmea.........................................
79
TABELA 3 -
Resultado da contagem total de pontos (P) e valor
em média porcentual do grupo A1 no período de
sete dias, macho e fêmea.........................................
79
TABELA 4 -
Resultado da contagem total de pontos (P) e valor
em média porcentual do grupo A2 no período de
sete dias, macho e fêmea.........................................
80
TABELA 5 -
Resultado da contagem total de pontos (P) e valor
em média porcentual do grupo C no período de 21
dias, macho e fêmea.................................................
80
TABELA 6 -
Resultado da contagem total de pontos (P) e valor
em média porcentual do grupo Am no período de
21 dias, macho e fêmea............................................
81
TABELA 7 -
Resultado da contagem total de pontos (P) e valor
em média porcentual do grupo A1 no período de 21
dias, macho e fêmea.................................................
81
TABELA 8 -
Resultado da contagem total de pontos (P) e valor
em média porcentual do grupo C no período de 21
dias, macho e fêmea.................................................
82
TABELA 9 -
Estatística descritiva referente aos grupos
experimentais, no período de sete dias, SHR
machos......................................................................
83
TABELA 10 - Estatística descritiva referente aos grupos
experimentais, no período sete dias, SHR fêmeas... 83
TABELA 11 -
Estatística descritiva referente aos grupos
experimentais, no período 21 dias, SHR machos..... 84
TABELA 12 -
Estatística descritiva referente aos grupos
experimentais, no período 21 dias, SHR fêmeas...... 84
TABELA 13 -
Análise de variância a três fatores............................
86
TABELA 14 -
Formação de grupos homogêneos após o Teste de
Tukey (5%) para as variáveis grupos experimentais,
períodos de observação e sexo dos animais, em
relação à média de neoformação óssea................... 87
NOBRE, M.D.P. Ação local do alendronato sódico no processo de
reparação óssea de fêmures de ratos espontaneamente hipertensos
(SHR). 2006. 116f. Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal, Área
Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista. São José dos Campos, 2006.
RESUMO
Este trabalho analisou a ação local do alendronato sódico no processo de reparação
óssea em fêmures de ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Foram utilizados
quarenta ratos machos e quarenta fêmeas, para a confecção de um defeito ósseo de
2,5mm de diâmetro. De acordo com o material utilizado, criaram-se quatro grupos:
controle (C), amido (Am), alendronato 1mol (A1) e alendronato 2mol (A2). Os animais do
grupo C não tiveram seus defeitos ósseos preenchidos. Após o período de sete e 21
dias, os animais foram sacrificados. Foi realizada a análise histológica e
histomorfométrica e os dados submetidos à análise estatística ANOVA. Aos sete dias,
encontrava-se tecido conjuntivo com hemorragia e infiltrado inflamatório ocupando a
área do defeito em todos os grupos experimentais e, em alguns grupos, focos de matriz
osteóide. Os animais dos grupos A1 e A2 apresentavam uma rede de fibrina no tecido
conjuntivo. Aos 21 dias, as trabéculas ósseas fechavam praticamente toda a extensão
do defeito nos grupos C e Am. No grupo A1 de animais machos, observavam-se
trabéculas que se irradiavam do interior da medula óssea até a área do defeito. Nos
demais grupos A1 e A2 constatava-se apenas a presença de tecido conjuntivo, com
deposição de fibras colágenas e mínima deposição de matriz osteóide. Um achado
histológico marcante foi a formação de tecido ósseo extra-cortical subperiosteal nos
animais dos grupos A1 e A2. O estudo concluiu que, neste modelo experimental, a
administração local do alendronato sódico não contribuiu para o processo de reparação
óssea nas concentrações molares utilizadas.
PALAVRAS-CHAVE: Alendronato; ratos endogâmicos SHR; hipertensão; regeneração
óssea.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS..............................................
8
LISTA DE FIGURAS............................................................................
10
LISTA DE TABELAS...........................................................................
13
RESUMO.............................................................................................
15
1 INTRODUÇÃO.................................................................................
18
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................ 21
2.1 Hipertensão arterial sistêmica....................................................... 21
2.1.1 Ratos espontaneamente hipertensos......................................... 27
2.2 Bisfosfonatos e o tecido ósseo...................................................... 32
2.2.1 Alendronato sódico e a reparação tecidual................................
39
3 PROPOSIÇÃO.................................................................................
48
4 MATERIAL E MÉTODO................................................................... 49
4.1 Animais.......................................................................................... 49
4.2 Divisão dos grupos........................................................................ 50
4.3 Fármaco........................................................................................ 51
4.4 Procedimentos cirúrgicos.............................................................. 53
4.5 Sacrifício........................................................................................ 57
4.6 Análise do defeito ósseo............................................................... 57
4.6.1 Análise histomorfológica............................................................. 58
4.6.2 Análise histomorfométrica.......................................................... 58
4.6.3 Análise estatística.......................................................................
59
5 RESULTADOS................................................................................. 60
5.1 Análise histomorfológica................................................................ 60
5.1.1 Animais machos - sete dias........................................................ 61
5.1.2 Animais fêmeas - sete dias........................................................ 65
5.1.3 Animais machos - 21 dias ......................................................... 69
5.1.4 Animais fêmeas - 21 dias........................................................... 73
5.2 Análise histomorfométrica............................................................. 78
5.3 Análise estatística..........................................................................
82
6 DISCUSSÃO....................................................................................
89
7 CONCLUSÃO...................................................................................
101
8 REFERÊNCIAS................................................................................
102
ANEXO................................................................................................
115
ABSTRACT......................................................................................... 116
1 INTRODUÇÃO
O processo de reparação óssea permanece um desafio
na busca da restauração anatômica e funcional do tecido perdido como
resultado de doença ou trauma. Embora o osso apresente grande
capacidade de regeneração, muitos defeitos ósseos cicatrizam com a
formação de tecido fibroso, freqüentemente acompanhado de grandes
reabsorções ósseas (LINDHE
37
, 2005).
Sabe-se que algumas doenças sistêmicas podem
interferir diretamente no processo de reparação óssea. A hipertensão
arterial sistêmica (HAS) consiste numa desordem de grande prevalência
na população mundial, que pode causar alterações na densidade mineral
óssea dos indivíduos.
Os ratos espontaneamente hipertensos (SHR) podem ser
utilizados como modelo de estudo da hipertensão arterial, uma vez que
estes desenvolvem a doença de forma similar àquela encontrada em
humanos, com as mesmas alterações no metabolismo do cálcio, como a
hipercalciúria, aumento dos níveis de paratormônio (PTH) e perda de
cálcio ósseo (IZAWA et al.
28
, 1985; INOUE et al.
26
, 1995).
Em 2004, Pereira
51
realizou um estudo que relacionou a
hipertensão ao processo de reparação óssea em ratos tipo SHR. Seu
estudo mostrou que a reparação óssea em fêmures de SHR, após sete e
21 dias, apresentava-se mais avançada quando comparada com aquela
observada nos animais normotensos.
O alendronato sódico é um bisfosfonato amplamente
empregado no tratamento de doenças caracterizadas pela reabsorção
óssea, como a osteoporose, doença de Paget, osteólise induzida por
19
tumores e hipercalcemia maligna (FLEISCH
19
, 1997; REINHOLZ et al.
56
,
2000; ALENCAR et al.
1
, 2002). Na Odontologia, tem se estudado sua
aplicação na prevenção de reabsorções ósseas após cirurgias de retalho
total, como coadjuvante no tratamento da doença periodontal e associado
a implantes dentários (YAFFE et al.
81
, 1997; MERAW et al.
42
, 1999;
ROCHA et al.
57
, 2001; TAKAISHI et al.
67
, 2001; TENENBAUM et al.
69
,
2002). No entanto, pouco se conhece a respeito de sua administração
local como material de preenchimento ósseo (FERNANDES
17
, 2005;
JAIME et al.
29
, 2005).
O alendronato sódico é um fármaco que tem a
capacidade de se ligar fortemente aos cristais de hidroxiapatita do osso,
principalmente nas áreas de remodelação óssea ativa (KULAK &
BILEZIKIAN
35
, 2000; TENENBAUM et al.
69
, 2002). Apesar de seu
mecanismo de ação ainda não estar bem esclarecido, sabe-se que o
alendronato age diminuindo a reabsorção óssea através da inibição direta
dos osteoclastos, além de estimular os osteoblastos a produzirem um
fator inibidor de recrutamento dos osteoclastos, contribuindo para um
aumento da densidade mineral óssea (REDDY et al.
55
, 1995; FLEISCH
19
,
1997; FISHER et al.
18
, 1999).
Estudos recentes realizados in vitro demonstram que,
além de inibir a reabsorção óssea, o alendronato sódico também atua
estimulando a proliferação e a maturação dos osteoblastos, o que sugere
uma ação relevante na formação óssea (REINHOLZ et al.
56
, 2000; IM et
al.
25
, 2004).
A ação do alendronato sódico na reparação óssea tem
sido avaliada por vários trabalhos (MERAW et al.
42
, 1999; SILVA
64
, 2000;
FAYAD
14
, 2001; FERNANDES
16
, 2002). No entanto, os resultados ainda
são conflitantes e a maioria dos estudos demonstra que a administração
do medicamento de forma sistêmica não interfere no processo de
reparação óssea (SILVA
64
, 2000; FERNANDES
16
, 2002).
20
A ação sistêmica dos bisfosfonatos é limitada nesses
casos, pois apresentam baixa absorção no trato gastrintestinal e no
plasma sangüíneo desaparecem rapidamente, depositando-se no osso de
forma não homogênea (LIN
36
, 1996). De acordo com a literatura, a ação
local desses medicamentos parece ser mais efetiva (MERAW et al.
42
,
1999; YAFFE et al.
82
, 2000; SHIBATA et al.
63
, 2004), no entanto, ainda
não se identificou a melhor forma de biodisponibilizar o fármaco
localmente para que haja uma ação positiva no reparo ósseo
(FERNANDES
17
, 2005; JAIME et al.
29
, 2005). Alguns autores sugerem
que esse medicamento apresenta uma resposta bifásica e que diferentes
concentrações podem resultar em efeitos distintos.
De acordo com o que foi relatado, acreditamos ser
pertinente estudar, neste modelo experimental, a ação local do
alendronato sódico no processo de reparo do tecido ósseo de ratos
hipertensos (SHR).
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Hipertensão arterial sistêmica
As doenças do aparelho circulatório constituem a principal
causa de morte no Brasil, em ambos os sexos, com tendência claramente
ascendente na mortalidade proporcional a partir da quarta década de vida
(ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DE SAÚDE
48
, 2002). Neste quadro,
a hipertensão arterial sistêmica (HAS) se destaca como fator de risco.
A HAS é considerada uma condição crônica, com efeitos
prolongados, que se caracteriza pela pressão sangüínea com valor igual
ou acima de 140/90mmHg, em pelo menos duas aferições realizadas no
mesmo momento (BRASIL
6
, 2001). No entanto, o conceito real da HAS
compreende um contexto sindrômico, englobando várias alterações
hemodinâmicas, tróficas e metabólicas importantes (NOBRE & LIMA
47
,
2000).
Estima-se que a hipertensão, em todo o mundo, atinja em
torno de um bilhão de indivíduos e aproximadamente 7,1 milhões de
mortes por ano podem ser atribuídas a esta doença (NATIONAL
INSTITUTES OF HEALTH
44
, 2004).
Considerando os níveis da pressão arterial (PA) maior
que 140/90mmHg como indicadores de hipertensão, levantamentos
populacionais realizados em algumas cidades brasileiras demonstraram
que as taxas de prevalência da doença na população urbana adulta têm
variado entre 22,3% a 43,9%. Essa prevalência aumenta, sobretudo,
entre as mulheres, os negros e os idosos. Constatou-se que mais de 50%
22
dos indivíduos entre sessenta e 69 anos e aproximadamente três quartos
da população acima dos setenta anos são afetados (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO
62
, 2002).
A HAS representa uma causa importante de mortalidade
cardiovascular, pois tem como conseqüências a doença cerebrovascular,
a doença arterial coronária, insuficiência renal crônica e doença vascular
de extremidades. Dados do Ministério da Saúde demonstram que, no
Brasil, a hipertensão causa 40% das mortes por acidente vascular
cerebral e 25% daquelas por doença coronária (BRASIL
6
, 2001).
Embora ainda não seja totalmente conhecido, o
desenvolvimento da HAS depende da interação entre predisposição
genética e fatores ambientais. Sabe-se, no entanto, que a hipertensão é
acompanhada por alterações funcionais renais, do sistema nervoso
simpático (SNS), do sistema renina-angiotensina (SRA), além de
alterações em outros mecanismos humorais e de disfunção endotelial.
Assim a hipertensão resulta de várias alterações estruturais do sistema
cardiovascular que tanto amplificam o estímulo hipertensivo, quanto
causam dano cardiovascular (WORLD HEALTH ORGANIZATION
77
,
2003).
O SRA está envolvido no controle fisiológico da pressão
arterial e no controle do sódio. Tem importantes implicações no
desenvolvimento da hipertensão renal e parece estar envolvido na
patogênese da hipertensão arterial essencial (DOUGLAS
13
, 2002).
Tortora & Grabowski
70
(2002) citaram que a ativação
deste sistema ocorre quando as células renais liberam quantidade
aumentada da enzima renina na corrente sangüínea, a qual junto com a
enzima conversora da angiotensina (ECA), atua sobre seus substratos
produzindo o hormônio ativo angiotensina II (Ang II), largamente
conhecido como um potente agente vasoconstritor.
23
A Ang II é um octapeptídeo que exerce papel importante
na manutenção do volume de fluido extracelular e da pressão sangüínea.
No entanto, sua função não está somente limitada à ação direta sobre o
músculo liso dos vasos sanguíneos. A Ang II aumenta a atividade do
sistema nervoso simpático (WOLF & WENZEL
78
, 2004) e estimula a
liberação das catecolaminas pela glândula adrenal, amplificando a
resposta cardiovascular. Também regula a concentração de sódio e o
volume sanguíneo através da secreção de aldosterona pelo córtex da
adrenal e de hormônio pituitário antidiurético (PACKER
50
, 2006).
Além do seu papel bem elucidado na homeostase
circulatória, é relatada a ação da Ang II numa variedade de processos,
como nas respostas imune e inflamatória, estimulando a ação das
citocinas no desenvolvimento embrionário, nos processos de injúria e
reparação tecidual no adulto (PACKER
50
, 2006). Influi ainda no aumento
da susceptibilidade à trombose, nos processos de fibrose, na
remodelação dos tecidos, na modulação do crescimento celular e
estimulando a produção de outros fatores hormonais (BURNIER &
BRUNNER
9
, 2000).
Dependendo do tipo celular, do subtipo de receptores
para Ang II e da presença de outros fatores de crescimento e citocinas, a
Ang II pode estimular o crescimento celular por meio da proliferação ou
hipertrofia, ou, alternativamente, agir como supressora desse
crescimento, através da apoptose ou induzindo a diferenciação celular
(WOLF & WENZEL
78
, 2004).
Apesar da etiologia da hipertensão primária ainda ser
desconhecida, existem indicadores de que ela tenha sua patogenia
semelhante em humanos e em ratos espontaneamente hipertensos
(SHR), estando associada a alterações no metabolismo do cálcio (IZAWA
et al.
28
, 1985; BARBAGALLO et al.
3
, 1991; OSHIMA & YOUNG
49
, 1995).
24
Nos humanos, níveis reduzidos de íons cálcio sérico,
níveis aumentados de cálcio e AMP cíclico na urina e níveis séricos
aumentados de 1,25-diidroxicolecalciferol (vitamina D
3
) e de paratormônio
(PTH) têm sido associados com a hipertensão (McCARRON et al.
41
, 1981;
BRICKMAN et al.
7
1990; JORDE et al.
32
, 2000). Tais alterações no
metabolismo do cálcio podem determinar o índice de massa óssea nesse
grupo de pacientes.
Nos quadros de HAS, os baixos níveis de íons cálcio no
soro, principalmente devido à presença de hipercalciúria, podem estimular
um aumento compensatório na produção do PTH. Este é o principal
hormônio relacionado com o controle do nível plasmático de cálcio no
organismo, ou seja, quando o nível de cálcio sérico encontra-se abaixo do
normal, as paratireóides aumentam a secreção do hormônio. Desta forma,
níveis elevados de PTH tendem a contribuir para o processo de
remodelação óssea, pois estimulam a atividade osteoclástica e mobilizam
o cálcio presente no esqueleto, podendo levar a uma diminuição da
densidade mineral óssea (JESPERSEN
30
, 1997). Além da sua ação sobre
o tecido ósseo, o PTH também estimula a absorção intestinal do cálcio e
reduz sua excreção renal.
Alguns estudos têm demonstrado a relação entre os
níveis séricos do PTH e a pressão sanguínea (PS) dos indivíduos. Além
disso, experimentos in vitro e in vivo comprovam o efeito anabólico do
hormônio sobre o metabolismo ósseo.
Brickman et al.
7
(1990) observaram que os indivíduos com
hipertensão essencial apresentavam níveis significantemente maiores de
cálcio intracelular, de PTH e de vitamina D
3,
além de uma menor
quantidade de cálcio sérico.
Uzawa et al.
74
(1995) compararam os efeitos do PTH
humano sintético (hPTH(1,32)) sobre o tecido ósseo de ratos, quando
administrado por injeção intermitente ou contínua, durante quatro
semanas. Os resultados demonstraram que o tratamento com infusão
25
contínua de hPTH(1,32) tanto acelerou a formação óssea quanto a sua
reabsorção havendo, portanto, maior remodelação do tecido. Já sob o
tratamento com infusão intermitente do hormônio, houve uma
predominância da aposição óssea sobre a reabsorção.
Ishizuya et al.
27
(1997) realizou estudo in vitro, tratando
células osteoblásticas isoladas de calvária de ratos recém-nascidos com
PTH e concluíram que o hormônio tem diversos efeitos, dependendo da
forma de administração. Observaram que a exposição contínua ao PTH
resultou na inibição da diferenciação osteoblástica, enquanto a exposição
intermitente levou a um efeito anabólico sobre a diferenciação das
células.
Jilka et al.
31
(1999) observou que a infusão diária de PTH
em ratos resultou em maior formação óssea, sem influenciar na formação
e diferenciação de novos osteoblastos, mas aumentando sua meia-vida
através da inibição do processo de apoptose.
Em 2000, Jorde et al.
32
observaram que os pacientes que
ingeriam pouco cálcio na dieta apresentavam níveis séricos aumentados
de PTH, com redução moderada do conteúdo mineral ósseo e da
densidade mineral óssea (DMO) da coluna vertebral lombar. Nas
mulheres, o aumento do PTH sérico também esteve associado à
presença de pressão sanguínea marcadamente elevada.
A relação entre os níveis de PS e a DMO dos indivíduos
foi estudada por alguns autores (CAPPUCCIO et al.
10
, 1999; TSUDA et
al.
72
, 2001; MUSSOLINO et al.
43
, 2003; NICHOLS et al.
46
, 2003; PÉREZ-
CASTRILLÓN et al.
52
, 2003).
Cappuccio et al.
10
(1999) estudaram a relação entre a PS
e a perda óssea mineral em mulheres brancas idosas, ao longo do tempo.
Em um primeiro momento, os autores avaliaram a PS e a densidade
mineral óssea (DMO) do colo do fêmur e, após 3,5 anos, repetiram a
densitometria óssea por meio do sistema de dupla emissão de raios X
(DXA). Os autores concluíram que a PS elevada em mulheres brancas
26
idosas está associada com o aumento da perda óssea no colo do fêmur, o
que pode contribuir para o risco de fraturas.
Estudo comparativo da DMO da coluna lombar de
mulheres japonesas foi realizado por Tsuda et al.
72
(2001). O estudo
verificou que as mulheres hipertensas apresentavam uma maior
proporção de cálcio/sódio presente na urina, quando comparadas às
mulheres normotensas. Os autores observaram que quanto mais alta
essa proporção, mais baixa a DMO, sugerindo que a HAS pode estar
associada com a diminuição da DMO.
Pérez-Castrillón et al.
52
(2003) avaliaram a massa óssea
de mulheres hipertensas, pós-menopausa, e a influência da hipertensão
sobre a homeostase do cálcio e os marcadores de remodelação óssea.
Observaram que as mulheres hipertensas e osteoporóticas apresentaram
índices de massa corporal, calciúria e razão cálcio/creatinina
significativamente maiores, quando comparadas àquelas mulheres
hipertensas que não apresentavam osteoporose. Apesar dos níveis de
osteocalcina estarem diminuídos nas mulheres hipertensas, não foi
encontrada relação direta entre as pressões arteriais sistólica e diastólica
com os índices de massa óssea. Nas normotensas, notaram que apenas
a calciúria foi menor. Os autores acreditam que o aumento da
remodelação óssea provavelmente esteja ligado à hipercalciúria,
desordem freqüente nos indivíduos hipertensos, estando associada com a
diminuição da DMO, apesar de outros fatores poderem estar envolvidos.
A relação entre a DMO e o polimorfismo genético da ECA
foi estudada por Pérez-Castrillón et al.
53
(2003) em mulheres hipertensas
pós-menopausa. Nos casos de deleção e inserção nos genes da ECA,
houve uma redução da DMO, verificando que é possível a existência de
uma relação do SRA com os processos de remodelação do tecido ósseo.
Mussolino et al.
43
(2003) realizaram um estudo
longitudinal, relacionando a DMO com a incidência e mortalidade por
acidente vascular cerebral (AVC). Os autores utilizaram dados
27
epidemiológicos para relacionar a DMO das falanges da mão esquerda
com a incidência de AVC, no período de vinte anos. A amostra incluiu um
número de 3402 indivíduos, brancos e negros, com faixa etária entre 45 a
74 anos de idade. Os resultados demonstraram que não houve
associação significativa da DMO com o desenvolvimento de AVC nos
indivíduos em ambas as raças, com o passar do tempo.
Segundo Nichols et al.
46
(2003), em homens e mulheres
hipertensos, a associação entre PS e DMO pode ser resultado da menor
freqüência na realização de atividade física observada nos indivíduos com
pressão arterial elevada.
Todo esse quadro sinaliza que a hipertensão arterial
sistêmica pode provocar alterações ósseas importantes, podendo
interferir nos processos de reparo ósseo.
2.1.1 Ratos espontaneamente hipertensos (SHR)
Os ratos tipo SHR consistem num modelo experimental
de estudo da hipertensão amplamente utilizado em pesquisa médica, pois
desenvolvem a doença com características similares a do homem
(McCARRON et al.
41
, 1981; BARBAGALLO et al.
3
, 1991; WANG et al.
75
,
1993; INOUE et al.
26
, 1995; WRIGHT & DeMOSS
79
, 2000;
TRIANTAFYLLIDI et al.
71
, 2004). Estes animais desenvolvem
geneticamente a hipertensão primária, sendo esta observada em 90% dos
casos encontrados em humanos hipertensos (UDENFRIEND et al.
73
,
1976).
Os SHR foram criados no centro de animais Wistar na
Universidade de Kyoto em 1966, por Okamoto e Aoki, os quais
examinaram a PS de centenas de ratos e escolheram o macho e a fêmea
que apresentavam os maiores valores. Após o cruzamento sucessivo dos
28
ratos, nasceram animais que apresentaram, uniformemente, um valor de
PS maior que 180mmHg, quando com vinte semanas de idade. Dessa
forma, alcançaram 100% de hipertensão na população dos SHR
(UDENFRIEND et al.
73
, 1976). Contudo a etiologia da doença nesses
animais continua incerta.
Várias diferenças relacionadas à pressão arterial têm sido
relatadas entre os SHR e os ratos normotensos Wistar Kyoto. Uma
diferença importante está na atividade do SNS, a qual parece estar mais
elevada nos SHR. Estes animais apresentam disfunção no mecanismo
adrenérgico central, originando um aumento na liberação de
noradrenalina e subseqüente hipertensão (GAVRAS et al.
22
, 2001;
TRIANTAFYLLIDI et al.
71
, 2004).
Os receptores adrenérgicos do SNS são divididos em
duas grandes categorias, alfa
1
e alfa
2,
sendo que cada um deles se divide
em subgrupos. O estímulo dos receptores do subgrupo alfa
2A
leva à
supressão do SNS e provoca hipotensão. Já os receptores do subgrupo
alfa
2B
, quando ativados, estimulam o SNS provocando uma resposta
hipertensiva (TRIANTAFYLLIDI et al.
71
, 2004).
Triantafyllidi et al.
71
(2004) revelaram que o
desenvolvimento da hipertensão nos ratos tipo SHR não parece estar
apenas relacionado com a variação genética dos receptores adrenérgicos
alfa
2B
, uma vez que os resultados da análise do genoma desses animais
foram idênticos quando comparados aos dos ratos normotensos. Os
autores sugerem que a hipertensão arterial nos SHR pode ser decorrente
de alterações funcionais que atuam num estágio tardio de transcrição do
DNA, no citoplasma ou na membrana celular, ou mesmo devido à
presença de diferenças quantitativas na proporção de subtipos de
receptores em vários sítios do cérebro.
Além de apresentarem a hipertensão arterial semelhante
a dos humanos, está comprovado que os SHR também apresentam
alterações no metabolismo do cálcio devido à elevada PS que podem
29
interferir na composição do esqueleto ósseo desses animais. Por
exemplo, baixa absorção duodenal de cálcio, e DMO e conteúdo de cálcio
ósseo reduzidos são características que têm sido evidenciadas nos SHR
quando comparados com os ratos normotensos (McCARRON et al.
41
,
1981; LUCAS et al.
39
, 1986; WRIGHT & DeMOSS
79
, 2000).
Estudos realizados em ratos tipo SHR demonstram que,
com o passar do tempo, a hipercalciúria e a ativação secundária das
glândulas paratireóides levam a um menor crescimento do tecido ósseo e
a uma diminuição da massa mineral óssea total (McCARRON et al.
41
,
1981; IZAWA et al.
28
, 1985), culminando em desordens ósseas.
Izawa et al.
28
(1985) realizaram um estudo comparativo do
tecido ósseo de ratos machos SHR e Wistar Kyoto (WKY) normotensos,
através de análise bioquímica e histológica. Os resultados demonstraram
níveis do cálcio sérico semelhantes nos dois grupos, apesar dos níveis de
fósforo sérico terem sido significantemente menores nos hipertensos. Os
autores também observaram que os SHR apresentavam fêmures mais
curtos, bem como uma redução da espessura cortical, do crescimento
ósseo longitudinal e da porcentagem de área cortical da tíbia.
Barbagallo et al.
3
(1991) relataram que além da
diminuição da densidade óssea, os SHR também apresentam alterações
no mecanismo de remodelação óssea e sugeriram que estes animais são
osteopênicos. Os autores compararam ratos SHR e WKY machos,
avaliando a histomorfometria da porção proximal da tíbia, a densidade
mineral dos fêmures pela DXA e as medidas do conteúdo cálcico do
fêmur. A DMO e o conteúdo de cálcio ósseo foram maiores nos animais
normotensos, enquanto nenhuma diferença significante foi encontrada
nos valores do fósforo. Os autores evidenciaram ainda, que os ratos
hipertensos apresentaram maiores taxas de reabsorção e de
neoformação óssea, com aumento significante na área da superfície de
reabsorção, na área da superfície do tecido osteóide e no volume do
tecido osteóide.
30
Yamori et al.
83
(1991) realizaram um estudo comparativo
para avaliar o conteúdo cálcico e a DMO do fêmur, tíbia e primeira
vértebra lombar de dez ratos SHR e dez ratos WKY. As análises
sorológicas indicaram que pode existir uma ativação do PTH nos animais
tipo SHR, em que, tanto as concentrações de cálcio ionizado e total
estavam elevadas. Uma diminuição do osso trabecular foi evidenciada
nesses animais, como resultado dos estudos de microradiografia e
histomorfometria óssea, além de mostrar-se mais frágil em resposta aos
testes mecânicos de torção e resistência. Os autores sugerem que esses
animais desempenham papel importante como modelo animal para o
estudo do desenvolvimento da osteoporose.
A presença de osso medular deficiente no esqueleto dos
SHR, com uma atividade osteoclástica mais proeminente que a
osteoblástica foi evidenciada por Wang et al.
75
(1993). Os autores
estudaram as mudanças histomorfométricas da porção proximal da tíbia
de ratos tipo SHR e ratos normotensos WKY, com 26 semanas e
observaram que os SHR apresentaram menores valores do peso
corporal, com uma diminuição do volume do osso trabecular, menor
número e espessura das trabéculas ósseas, menor quantidade de
osteoblastos e células osteoprogenitoras. Já o número de osteoclastos,
núcleo de osteoclastos por milímetro e razão osteoclastos/osteoblastos
estavam significantemente aumentados. Concluíram que a diminuição do
volume trabecular pode estar associada principalmente aos níveis
elevados do PTH, bem como aos níveis reduzidos de vitamina D
3
, baixa
absorção de cálcio, baixo peso corporal, diminuindo as cargas mecânicas
sobe o tecido, entre outros fatores ainda a serem elucidados.
Inoue et al.
26
(1995) estudaram ratos normotensos do tipo
Sprague-Dawley (SD) e SHR de ambos os sexos, e observaram que o
peso corpóreo do rato, comprimento, volume e peso seco da tíbia
apresentaram maiores valores nos SD machos e menores nas SHR
fêmeas. Ao avaliarem parâmetros bioquímicos séricos, entre eles: cálcio
31
ionizado, cálcio total, PTH, fosfatase alcalina óssea (FAO) e fosfatase
ácida tartarato resistente (TRAP), os autores constataram que os valores
foram semelhantes e que todos mostraram a mesma tendência em ambos
os sexos dos dois grupos, exceto a FAO que, em ambos os grupos,
apresentou nível sérico com maiores valores nos machos que nas
fêmeas. Na análise morfométrica, os autores notaram que a taxa de
aposição mineral, volume do osso trabecular e espessura trabecular
foram semelhantes entre os mesmos sexos de ambos os grupos. Quanto
à DMO, na área proximal da tíbia, os autores verificaram que ambos os
sexos dos SHR apresentaram menores valores quando comparados aos
SD. Estes achados sugerem que o osso trabecular dos SHR apresenta
menor condição mineral do que nos ratos normotensos.
Estudo realizado por Wright & DeMoss
79
(2000) comparou
a reabsorção óssea do esqueleto de ratos machos e fêmeas SHR, WKY e
SD. Nos animais com oito semanas de idade, a taxa de reabsorção nos
SHR de ambos os sexos foi significantemente maior que a encontrada
nos normotensos, apesar dessa tendência mostrar-se reduzida nas
fêmeas quando comparadas aos machos. Grande diferença entre os
sexos foi observada na 24
a
semana, com uma elevada taxa de
reabsorção nas fêmeas hipertensas. Os autores puderam observar uma
alteração no processo de remodelação óssea, notando que a atividade de
reabsorção foi significantemente maior nos SHR, quando comparada com
controles normotensos, principalmente nas fêmeas.
Apesar de vários estudos comprovarem a ação da HAS
nos mecanismos de remodelação óssea, até então nenhum trabalho
havia verificado o processo de reparação óssea em ratos hipertensos.
Em 2004, Pereira
51
realizou um estudo comparando o
processo de reparação óssea em ratos normotensos WKY e ratos tipo
SHR. Foi realizado um defeito ósseo no fêmur esquerdo dos animais de
ambos os sexos e, após sete e 21 dias, os mesmos foram sacrificados.
Foram então realizadas as análises histológica e histomorfométrica da
32
área do defeito ósseo. Os resultados demonstraram que os animais
hipertensos apresentaram uma reparação óssea mais avançada quando
comparados aos normotensos, sendo a reparação maior no período de 21
dias em todos os animais, sem diferença entre os sexos.
Desde modo, há indicação suficiente para utilizar ratos
SHR como um modelo para a investigação do reparo ósseo, já que os
mesmos apresentam inúmeras alterações estruturais e metabólicas
devido à doença hipertensiva, com grande semelhança ao que ocorre nos
humanos.
2.2 Bisfosfonatos e o tecido ósseo
O osso é um tecido conjuntivo especializado composto
por fases minerais e orgânicas, perfeitamente organizado para
desempenhar suas funções. Ele é formado por uma combinação de osso
compacto denso e osso esponjoso (trabecular). O osso compacto contém,
em média, cerca de 30% de matriz orgânica e 70% de sais. (DOUGLAS
13
,
2002). Contudo, o osso recém-formado pode conter uma porcentagem
consideravelmente maior de matriz em relação aos sais.
A matriz orgânica do osso é constituída de 90 a 95% de
fibras colágenas tipo I, sendo o restante de substância fundamental e
proteínas não-colagenosas. As fibras colágenas estendem-se
principalmente em torno das linhas de força tensional, proporcionando ao
osso sua força elástica. Além do colágeno, encontramos também as
proteínas não-colagenosas, tais como osteonectina, osteocalcina,
proteína morfogenética óssea e sialoproteína óssea. A substância
fundamental é composta de líquido extracelular, glicoproteínas e
proteoglicanos, principalmente o sulfato de condrointina e ácido
hialurônico. A matriz orgânica, quando o osso se apresenta
33
descalcificado, cora-se com os corantes específicos do colágeno (TEN
CATE
68
, 2001; JUNQUEIRA & CARNEIRO
33
, 2004).
O tecido ósseo é distinguido dos outros tecidos pela
presença de fosfato e cálcio mineral ao longo das fibras colágenas, como
a hidroxiapatita [Ca
10
(PO
4
)
6
OH
2
], que incorpora em sua estrutura outros
íons e sais, sendo o principal componente mineral constituinte do osso e o
elemento essencial responsável pela função de apoio mecânico
(DOUGLAS
13
, 2002).
Devido à sua dinâmica, o tecido ósseo está
constantemente sofrendo remodelação, um processo complexo que
envolve a reabsorção do osso numa superfície em particular, seguida por
uma fase de formação óssea. Em adultos normais, há um equilíbrio entre
a quantidade de osso reabsorvido pelos osteoclastos e a quantidade de
osso formado pelos osteoblastos (FROST
20
, 1964). No entanto, algumas
doenças como a osteoporose, doença de Paget e hipercalcemia da
malignidade são caracterizadas pela prevalência da reabsorção óssea.
Os bisfosfonatos são compostos químicos conhecidos
pela sua afinidade pela hidroxiapatita e constituem uma classe única de
drogas caracterizadas farmacologicamente por sua capacidade de inibir a
reabsorção óssea (LIN
36
, 1996).
São considerados análogos sintéticos da substância
endógena denominada pirofosfato (P-O-P), o qual se encontra
naturalmente presente no soro e na urina, atuando como um regulador
fisiológico da calcificação e da reabsorção óssea. A ação dos
bisfosfonatos deve-se à semelhança estrutural com esse grupo de
compostos. No entanto, a sua estrutura se caracteriza pela ligação P-C-P,
contendo o átomo de carbono substituindo o átomo central de oxigênio.
Esta modificação torna os bisfosfonatos mais resistentes à degradação
enzimática no organismo, com uma meia-vida biológica maior suficiente
para influenciar o metabolismo ósseo (FLEISCH
19
, 1997; CASTRO et
al.
11
, 2004).
34
A possibilidade de configurações variadas da molécula
dos bisfosfonatos, através de alterações nas suas cadeias laterais,
oferece uma grande adaptabilidade química a esses compostos,
resultando em diferenças farmacológicas importantes (KULAK &
BILEZIKIAN
35
, 2000).
Para Geddes et al.
24
(1994) os bisfosfonatos se
caracterizam pela presença de dois grupos fosfonatos ligados a um átomo
de carbono geminal único (P-C-P), que possui duas cadeias laterais com
estruturas variáveis R1 e R2. Os dois grupos fosfonatos e a cadeia lateral
R1 são os principais determinantes da afinidade pelo mineral ósseo, com
um grupo hidroxila ressaltando essa característica, que pode variar de um
composto para outro. A cadeia R2 determina a potência anti-reabsortiva,
com os grupos amino ou pirinidil, contendo nitrogênio.
Já na metade do século XIX, um dos primeiros
bisfosfonatos a ser sintetizado foi o ácido etano-1-hidroxi-1,1-bisfosfônico
(etidronato), cujo principal objetivo era ser utilizado como aditivo para
detergentes (BIOMEN
5
, 1995). Mas logo foram observados seus efeitos
fisiológicos, como a capacidade de inibir a reabsorção óssea (LOVDAHL
& PIETRZYK
38
, 1999). A partir desta observação, iniciaram-se pesquisas
para a síntese de diversos outros bisfosfonatos e para a avaliação de
seus efeitos fisiológicos.
De acordo com sua composição química e potência, os
bisfosfonatos podem ser agrupados em fármacos de primeira, segunda e
terceira geração. Os bisfosfonatos que contêm um átomo de nitrogênio
primário em uma cadeia alquílica (pamidronato e alendronato) podem ser
10 a 100 vezes mais potentes que o etidronato e o clodronato. Entre os
mais potentes estão aqueles contendo o átomo de nitrogênio em um anel
heterocíclico (risedronato, ibandronato e zoledronato) (GEDDES et al.
24
,
1994; RUSSEL et al.
60
, 1999).
35
Os bisfosfonatos são fármacos que apresentam baixa
absorção intestinal em humanos, com biodisponibilidade de cerca de
0,7% para o alendronato, 0,3% para o pamidronato, 3 a 7% para
etidronato e 1 a 2% para clodronato (LIN
36
, 1996). Sua baixa absorção
ocorre devido à sua baixa lipofilicidade, o que dificulta o transporte
através do epitélio. Além do mais, são moléculas relativamente grandes,
negativamente carregadas no pH intestinal, formando complexos com o
cálcio, o que dificulta sua absorção (KULAK & BILEZIKIAN
35
, 2000).
A excreção renal é a única forma de eliminação dos
bisfosfonatos. Após a administração intravenosa, desaparecem do plasma
rapidamente, com uma meia-vida de uma a duas horas. Por outro lado,
quando incorporada ao osso, a droga só é liberada quando este sofre
reabsorção. Os bisfosfonatos ligam-se preferencialmente ao tecido ósseo
que apresenta altas taxas de remodelação, devido à grande exposição da
hidroxiapatita nesses sítios (LIN
36
, 1996).
Os bisfosfonatos apresentam poucos efeitos adversos. O
etidronato pode causar inibição da mineralização normal dos ossos,
originando fraturas (FERNANDES
15
, 2005). Alguns bisfosfonatos podem,
ainda, provocar efeitos inflamatórios indesejáveis, como febre em 10 a
50% dos pacientes, bem como estimulando a produção de citocinas pró-
inflamatórias (IL-1 e TNF-α) em humanos e em animais (SUGAWARA et
al.
65
, 1998; YAMAGUCHI et al.
80
, 2000). Quando administrados por via
oral, podem provocar distúrbios gastrintestinais.
A sua utilização clínica tornou-se uma alternativa para o
tratamento de uma variedade de patologias caracterizadas pela
reabsorção óssea, como a doença de Paget, hipercalcemia associada à
malignidade e na prevenção e no tratamento da osteoporose (FLEISCH
19
,
1997; KULAK & BILEZIKIAN
35
, 2000). Também têm sido empregados nos
procedimentos cirúrgicos odontológicos e no tratamento da doença
periodontal, com o objetivo de diminuir as perdas de tecido ósseo
(MERAW et al.
42
, 1999; TENENBAUM et al.
69
, 2002).
36
O tratamento com os bisfosfonatos leva a um aumento da
densidade mineral do tecido ósseo, que tem sido atribuído a uma
diminuição da remodelação óssea. No entanto, seus verdadeiros
mecanismos de ação são ainda pouco conhecidos (WEINREB et al.
76
,
1994; LIN
36
, 1996; ALENCAR et al.
1
, 2002).
Todos os bisfosfonatos se ligam ao osso através da sua
estrutura P-C-P, que colabora para a incorporação rápida ao tecido e para
sua ação seletiva no esqueleto. Inicialmente, acreditava-se que após a
adsorção óssea, apenas um mecanismo físico-químico fosse suficiente
para sua ação. Devido à grande afinidade pelos cristais de cálcio, há a
formação de complexos com a hidroxiapatita do osso, acarretando em
modificações na sua estrutura cristalina e inibindo seu crescimento,
agregação e dissolução (RODAN & FLEISH
58
, 1997; CASTRO et al.
11
,
2004). Nos últimos quinze anos se tornou importante o estudo dos
fenômenos celulares que também estão envolvidos no mecanismo de
ação desses fármacos.
Sabe-se que a inibição da reabsorção óssea
proporcionada pelos bisfosfonatos é mediada por uma ação direta sobre
os osteoclastos. O fármaco presente nas lacunas de reabsorção é
assimilado por essas células, podendo afetar o seu metabolismo
intracelular e induzir a apoptose (SATO et al.
61
, 1991; ROGERS et al.
59
,
1999; NEVES et al.
45
, 2002).
Evidências sugerem que os bisfosfonatos inibem a
reabsorção óssea por meio de alterações nas bordas “em escova” dos
osteoclastos e por meio do aumento de sua permeabilidade ao cálcio e a
outros íons, afetando a atividade celular e sua sobrevivência (SATO et
al.
61
, 1991). Através de uma ação indireta, os bisfosfonatos também
inibem a diferenciação e o recrutamento dos osteoclastos para a
superfície óssea. Essa ação é, em parte, mediada pelos osteoblastos, que
passam a produzir um fator inibidor de recrutamento dos osteoclastos
(FLEISCH
19
, 1997).
37
Outros estudos sugerem, ainda, a ação dos bisfosfonatos
sobre a proliferação dos osteoblastos, com importante ação na formação
óssea (GIULIANI et al.
23
, 1998; REINHOLZ et al.
56
, 2000; IM et al.
25
,
2004). Segundo os autores, os efeitos observados até então, parecem
depender da droga, concentração empregada e forma de administração.
García-Moreno et al.
21
(1998) analisaram o efeito direto do
alendronato, nas concentrações de 10
-1
a 10
-12
mol/L, sobre a viabilidade
celular, a síntese de colágeno e a capacidade de mineralização de
osteoblastos normais humanos em cultura. As concentrações entre 10
-5
e
10
-12
mol/L não exerceram efeito na capacidade proliferativa celular, no
entanto, em concentração igual ou maior que 10
-4
mol/L, a viabilidade das
células osteoblásticas foi afetada. A síntese de colágeno diminuiu após a
incubação com alendronato, mas nenhum efeito da droga foi observado
sobre o depósito de cálcio por osteoblastos na concentração igual ou
menor que 10
-5
mol/L.
Giuliani et al.
23
(1998) realizaram estudo in vitro,
investigando a ação do etidronato e do alendronato sobre cultura de
células da medula óssea de ratos e de humanos, mensurando a
quantidade de unidade formadora de colônias para fibroblastos (CFU-F) e
de unidade formadora de colônias para osteoblastos (CFU-OB). Os
resultados demonstraram que nas culturas de medula óssea de ratos, o
etidronato estimulou, significativamente, a formação de CFU-F, com efeito
máximo numa concentração de 10
–5
mol/L, enquanto o alendronato
apresentou um efeito bifásico, estimulando quando a concentrações
menores que 10
-7
mol/L e sendo inibidor em concentrações maiores. A
formação de CFU-OB na medula óssea de ratos também foi inibida por
ambas as drogas nas suas maiores concentrações, mas foi
significativamente estimulada quando estas foram mais baixas. No caso
das culturas de células de medula óssea humana, o alendronato
aumentou a formação de CFU-F e de CFU-OB, havendo o efeito máximo
do fármaco na concentração de 10
-10
mol/L.
38
A partir do estudo in vivo realizado em ratas, Giuliani et
al.
23
(1998) observaram a ação dos bisfosfonatos na formação de
precursores dos osteoblastos na cultura de células da medula óssea
desses animais. Um primeiro grupo de ratas jovens recebeu,
semanalmente, injeções subcutâneas de etidronato (0,3mg/kg, 3mg/kg, e
30mg/kg) ou alendronato (0,3µg/kg, 3µg/kg, e 30µg/kg). O segundo grupo
era composto de ratas mais velhas, que receberam injeções de ambos os
bisfosfonatos, nas suas dosagens mais baixas. Após um mês de
experimento, o etidronato (0,3 mg/kg e 3mg/kg) e o alendronato (0,3µg/kg
e 3µg/kg) causaram um aumento significativo no número de CFU-F na
cultura de células da medula óssea de ambos os grupos de animais. Os
autores sugerem que os bisfosfonatos podem ter influência relevante
sobre as células da linhagem osteoblástica, diferente de sua ação
inibitória sobre os osteoclastos.
Reinholz et al.
56
(2000) estudaram a ação direta de vários
bisfosfonatos sobre cultura de células osteoblásticas de fetos humanos,
avaliando a proliferação celular, a expressão gênica e a formação óssea.
O pamidronato e o zoledronato estimularam a diferenciação dos
osteoblastos e aumentaram a formação óssea. No entanto, no caso do
pamidronato, os efeitos diminuíram com o aumento da dose. O
pamidronato não induziu a proliferação das células osteoblásticas, mas
aumentou sua citodiferenciação, com produção de grande quantidade da
proteína celular total, da FAO e de colágeno tipo I, ou seja, havendo a
maturação dessas células para uma fase de deposição de matriz óssea.
Im et al.
25
(2004) estudaram os efeitos do alendronato e
do risedronato sobre cultura de células osteoblásticas e observaram que
ambos os bisfosfonatos aumentaram significativamente o número de
células quando comparados ao grupo controle, atingindo maiores níveis
de proliferação na concentração de 10
-8
mol. Observaram ainda ação
aumentada da FAO, bem como um aumento da expressão gênica da
proteína morfogenética óssea-2 (BMP-2), colágeno tipo I e da
39
osteocalcina. Os autores concluíram que os bisfosfonatos, além de
apresentarem importante papel na inibição da reabsorção óssea pelos
osteoclastos, são promotores da proliferação e maturação dos
osteoblastos.
2.2.1 Alendronato sódico e a reparação tecidual
Dentre os bisfosfonatos, o alendronato de sódio é um dos
mais potentes aminobisfosfonatos. É um sal monosódico trihidratado,
derivado do ácido alendrônico, caracterizado como um pó branco
cristalino, solúvel em água e com pH de quatro a cinco (SWEETMAN
66
,
2002).
De acordo com Budavari et al.
8
(1996) o fármaco é
quimicamente descrito como 4-amino-1-hidroxibutilideno-1, 1-
bisfosfonato, com fórmula estrutural C
4
H
13
NNaO
7
P
2
.3H
2
0 de peso
molecular 325,10g. Sua composição, formada com quatro carbonos e
uma cadeia lateral do grupo amina, inibe a reabsorção óssea causada
pelos osteoclastos.
O alendronato de sódio, um bisfosfonato de segunda
geração, foi o primeiro largamente utilizado que apresentou dados
convincentes sobre sua eficácia na redução de fraturas em pacientes com
osteoporose. É também um potente inibidor da reabsorção óssea in vitro,
em experimentos animais e em pacientes com doença de Paget (REDDY
et al.
55
, 1995; FLEISCH
19
, 1997; KULAK & BILEZIKIAN
35
, 2000).
O primeiro medicamento contendo alendronato de sódio
foi lançado pela Merck Sharp & Dohme (Fosamax® - comprimidos de 10 e
70mg) e recebeu a aprovação do FDA para comercialização e uso em
1995. No Brasil, o fármaco encontra-se disponível para administração
oral, em comprimidos de alendronato monossódico, na forma triidratada
40
ou não, apresentando doses de 5, 10 e 70mg de ácido alendrônico por
comprimido. Em fevereiro de 2004 foi registrado, no país, o primeiro
medicamento genérico fabricado pela empresa Biossintética (comprimidos
de alendronato de sódio 10mg) (FERNANDES
15
, 2005).
Sabe-se que o alendronato atua sobre as células ósseas,
porém seu mecanismo de ação ainda não é bem definido. Estudos
demonstram que o fármaco se incorpora ao osso nas lacunas de
reabsorção e só será liberado localmente durante o processo de
reabsorção óssea devido à acidificação do meio, aumentando sua
concentração abaixo dos osteoclastos. Isso interfere no processo de
reabsorção óssea e na formação das “bordas em escova” dos
osteoclastos (SATO et al.
61
1991). O mecanismo responsável, pela ação
direta sobre os osteoclastos e seus precursores, parece estar relacionado
com a inibição da via do mevalonato (FISHER et al.
18
, 1999).
Apesar de comprovada a sua ação sobre os processos de
reabsorção óssea, poucos são os estudos que demonstram uma atividade
relevante na reparação tecidual, inclusive no reparo ósseo.
Weinreb et al.
76
(1994) testaram em macacos a eficácia
do alendronato na redução da reabsorção óssea provocada por doença
periodontal induzida. Vinte e sete animais foram divididos em três grupos,
os quais receberam por via endovenosa solução salina (placebo), solução
de alendronato 0,05mg/kg ou 0,25mg/kg respectivamente, a cada duas
semanas, durante 16 semanas. Os resultados das análises radiográficas
e histomorfométricas demonstraram que apenas o grupo tratado com
alendronato 0,05mg/kg obteve redução significativa da reabsorção óssea
alveolar induzida pela periodontite experimental, e que não se percebeu
efeito da medicação usada na concentração de 0,25mg/kg. Os autores
sugerem que o alendronato, bem como os hormônios e fatores de
crescimento, apresentam uma resposta bifásica, ou seja, que diferentes
concentrações de alendronato podem dar diferentes resultados, daí a
41
necessidade de mais estudos para se determinar a relação dose-efeito
desse fármaco.
Reddy et al.
55
(1995) utilizaram o alendronato em cães
com doença periodontal, administrado por via oral na concentração de
3mg/Kg, semanalmente por um período de seis meses. Em seus
resultados, puderam observar a diminuição da mobilidade dentária e,
através de análise histomorfométrica, concluíram que esse bisfosfonato
reduziu a perda óssea relativa à progressão da doença periodontal, com
um aumento significante da densidade óssea dos animais medicados,
comparados aos animais do grupo não medicado.
Através de estudo realizado em ratos, Yaffe et al.
81
(1997)
demonstraram pela primeira vez a ação local positiva do alendronato
sobre a reabsorção alveolar provocada após a confecção de retalhos
mucoperiosteais em cirurgia periodontal. A cirurgia foi realizada na região
de pré-molar e molar mandibulares, com a exposição do osso alveolar e
colocação de uma membrana embebida em 0,025ml de alendronato
sobre o mesmo. A solução foi preparada dissolvendo 20mg de
alendronato em 1ml de solução salina. Os autores observaram que houve
uma redução significativa da reabsorção óssea ao final do experimento,
com manutenção de 90% do osso, comparado ao grupo controle.
Meraw et al.
42
(1999) avaliaram, em cães, o efeito da
aplicação local do alendronato na regeneração óssea guiada ao redor de
implantes dentários. Foram colocados quatro tipos de implantes, todos
protegidos por uma membrana de colágeno reabsorvível: implante de
hidroxiapatita revestido por alendronato, implante de titânio revestido por
alendronato, implante de hidroxiapatita e implante de titânio. Os
resultados observados após 28 dias comprovaram que o alendronato
contribuiu para a osseointegração em ambos os tipos de implante
(hidroxiapatita e titânio).
42
Binderman et al.
4
(2000) realizaram um estudo em ratos
para observar a efetividade da aplicação local de alendronato na redução
da reabsorção óssea alveolar após a realização de cirurgia periodontal
nesses animais. Num primeiro experimento, foi confeccionado retalho
mucoperiosteal e os autores aplicaram, sobre o osso alveolar exposto,
uma membrana embebida em diferentes concentrações de alendronato
(0, 10, 50, 200 ou 400µg/ml). Num segundo experimento, a membrana
com alendronato (0, 50, 200 ou 400µg/ml) foi colocada numa região à
distância do sítio cirúrgico, na região esquerda da submucosa
mentoniana. Foi realizada análise radiográfica dos processos alveolares e
os resultados demonstraram que a aplicação tópica de 200 e 400µg/ml de
alendronato foi significativamente efetiva na redução da perda óssea
alveolar. A aplicação à distância de 400µg/ml de alendronato também
diminuiu a reabsorção alveolar, sugerindo uma ação sistêmica do
fármaco.
Silva
64
(2000) estudou a ação do alendronato na
reparação óssea de ratas ovarectomizadas. A amostra incluía quatro
grupos constituídos por nove ratas ovarectomizadas adultas e em cada
animal foi realizada uma lesão na tíbia. O grupo controle não foi
medicado, enquanto os outros três receberam na água de beber doses
diárias de 0,25mg/Kg, 0,50mg/Kg, 0,75mg/Kg de alendronato. Após os
períodos de três, sete e 14 dias de experimento, as ratas foram
sacrificadas. Os resultados histológicos revelaram maior formação óssea
nos grupos medicados com doses mais elevadas de alendronato. O grupo
de 14 dias, com dose de 0,50mg/Kg, apresentou trabéculas mais maduras
e organizadas, sugerindo um processo de remodelação óssea mais
desenvolvido, demonstrando a ação dose-dependente do alendronato
sódico.
Fayad
14
(2001) avaliou as ações de duas formulações de
bisfosfonatos no processo de reparação óssea em defeitos realizados em
mandíbula de ratos. Esses animais foram divididos em cinco grupos,
43
sendo: um controle, um medicado com alendronato durante dez dias,
iniciando o tratamento no dia da cirurgia; um medicado com clodronato
durante dez dias, iniciando o tratamento no dia da cirurgia; um medicado
com alendronato durante dez dias, iniciando o tratamento cinco dias antes
da cirurgia e um medicado com clodronato durante dez dias, iniciando o
tratamento cinco dias antes da cirurgia; todos na dose de 1mg/Kg/dia. O
autor concluiu que o alendronato e o clodronato não estimularam a
reparação óssea neste modelo experimental e que a administração prévia
à confecção do defeito não apresentou ação benéfica no processo de
reparo.
Fernandes
16
(2002) avaliou a ação do alendronato sódico
e sua associação com hidroxiapatita pura granular na reparação de
defeitos ósseos na mandíbula de coelhos. Foram utilizados 27 animais,
divididos em três grupos: grupo controle, grupo medicado com
alendronato sódico e grupo medicado associado com preenchimento do
defeito com a hidroxiapatita. O alendronato foi administrado via oral numa
dose de 1mg/Kg nos grupos medicados. Após os períodos de 14, 21 e 28
dias, os animais foram sacrificados e os resultados demonstraram que
não houve diferença entre os tratamentos, apenas entre os períodos de
observação. Concluiu-se que o uso do alendronato sódico e sua
associação com a hidroxiapatita não interferiram na reparação óssea
nesse modelo experimental.
Matsura
40
(2003) avaliou a ação do gel de alendronato de
sódio na reparação de defeitos infra-ósseos periodontais em humanos.
Posteriormente aos procedimentos básicos de orientação de higiene
bucal, raspagem e aplanamento corono-radicular, foi realizado o
tratamento cirúrgico de 28 defeitos periodontais infra-ósseos de duas a
três paredes em dentes unirradiculares, com bolsas periodontais maiores
ou iguais a 4mm. Os grupos controle e teste apresentaram retração
gengival e redução da profundidade clínica de sondagem noventa dias
após os procedimentos cirúrgicos. Houve, no grupo controle, ganho
44
clínico de inserção médio de 0,85mm, o que não ocorreu no grupo teste.
O autor não verificou alteração estatisticamente significante no tecido
ósseo em nenhum dos grupos
Kawata et al.
34
(2004) analisaram o efeito do alendronato
sódico numa concentração de 10
-4
mol dissolvido em solução salina, sobre
a reabsorção de enxerto ósseo inserido no subcutâneo de camundongos.
Os autores notaram que no grupo não medicado (controle), o enxerto
desapareceu após cinco semanas. Já no grupo experimental, no qual o
enxerto ósseo foi embebido na solução de alendronato, houve uma
reabsorção óssea de somente 20 a 40% no mesmo período. O grupo
experimental também foi subdivido em dois grupos que receberam ou não
injeção intraperitoneal de alendronato após cinco semanas da realização
do enxerto. O grupo medicado demonstrou redução significativa no
número de osteoclastos após nove semanas da cirurgia. Os autores
puderam concluir que o alendronato na concentração de 10
-4
mol inibiu a
reabsorção óssea do enxerto ósseo ectópico.
Reddy et al.
54
(2004) formularam um gel com alendronato
e avaliaram sua ação por seis meses, no tratamento de lesões ósseas
decorrentes de periodontite em humanos. Os resultados revelaram uma
melhora significativa nos parâmetros clínicos estudados (índice gengival,
profundidade de bolsa periodontal e nível de inserção clinica), além de
demonstrarem um potente efeito inibitório sobre a reabsorção óssea e um
aumento na formação óssea local.
Altundal & Güvener
2
(2004) estudaram o efeito do
alendronato na inibição da reabsorção óssea alveolar após extração
dentária de ratos WKY machos. Os animais foram divididos em três
grupos: um grupo controle, um grupo tratado com solução salina
diariamente e um grupo tratado com alendronato subcutâneo,
administrado diariamente a 0,25mg/Kg. Os resultados demonstraram que
a reabsorção óssea alveolar vestíbulo-lingual foi significativamente menor
que aquela encontrada nos outros grupos. Os autores também
45
encontraram uma redução significativa dos níveis de cálcio sérico e
urinário, além de um menor número de osteoclastos presentes na região,
revelando a supressão da reabsorção óssea alveolar no grupo tratado
com alendronato.
Shibata et al.
63
(2004) avaliaram o efeito do tratamento
local prévio com alendronato em raízes de molares para reimplante
dentário, avaliando a função de suporte do ligamento periodontal
cicatrizado após sete, 14 e 21 dias. Os autores concluíram que o
tratamento prévio com alendronato, quando comparado ao grupo controle
tratado apenas com solução salina, inibiu a formação de tecido
mineralizado no periodonto e a inibiu a anquilose, restaurando a função
de suporte do ligamento periodontal.
Correia
12
(2005) avaliou a citotoxidade in vitro do
alendronato de sódio sobre fibroblastos do ligamento periodontal de
humanos em cultura celular. O grupo controle G1 não recebeu medicação
e os grupos G2, G3 e G4 receberam alendronato nas concentrações de
10
-5
, 10
-6
e 10
-7
mol respectivamente, em diferentes tempos experimentais.
Os resultados mostraram que as culturas tratadas com a maior
concentração da droga (G2), apresentaram porcentagens de viabilidade
celular significantemente menores, que as dos outros grupos (G1, G3 e
G4) nos tempos de 12 e 24 horas. O grupo G2 apresentou crescimento
significantemente menor que dos demais grupos. A autora concluiu que o
alendronato de sódio, em contato direto com os fibroblastos do ligamento
periodontal em cultura, é citotóxico em concentrações mais elevadas (10
-5
e 10
-6
mol).
Jaime et al.
29
(2005) estudaram a influência da
administração local de alendronato sódico no reparo ósseo em ratas
ovarectomizadas. Foram utilizadas 24 ratas, que sofreram ovarectomia ou
falsa-ovarectomia aos três meses de idade, e após o período de um mês,
foram submetidas à cirurgia de confecção do defeito de 8mm de diâmetro
na região da calvária. Os animais do grupo teste tiveram o defeito ósseo
46
preenchido com esponja de colágeno reabsorvível embebida em solução
de alendronato sódico na concentração de 20mg/ml e os do grupo
controle em solução fisiológica. Após trinta dias da cirurgia, as ratas foram
sacrificadas e os resultados demonstraram que não houve diferença
estatisticamente significante em relação à formação óssea entre os
grupos, após a análise histomorfométrica. Histologicamente, todos os
grupos apresentaram-se muito semelhantes, com pouca formação óssea
nas bordas da lesão, que estava preenchida por tecido conjuntivo fibroso.
Os autores concluíram que a ovarectomia e/ou aplicação tópica de
alendronato não influenciaram no reparo ósseo na calvária de ratas.
Fernandes
17
(2005) estudou a ação local do alendronato
sódico, da hidroxiapatita e da associação do alendronato com a
hidroxiapatita, no reparo ósseo de fêmures de ratos. Um defeito ósseo
medindo 2,5mm de diâmetro foi confeccionado no fêmur de 168 ratos, os
quais foram divididos em sete grupos de acordo com o material de
preenchimento utilizado: controle (sem preenchimento), amido,
alendronato 1mol, alendronato 2mol, hidroxiapatita 1mol, hidroxiapatita
2mol e alendronato mais hidroxiapatita. O exame histomorfológico
demonstrou que, nos grupos sacrificados após sete dias, observou-se
neoformação óssea com trabéculas imaturas em todos os grupos, exceto
nos animais machos nos quais o alendronato foi utilizado. Aos 21 dias, as
trabéculas praticamente fechavam o defeito na maioria dos espécimes
estudados. O autor concluiu que a reparação óssea foi maior nas fêmeas
do que nos machos, independente do período estudado. No entanto, os
resultados demonstraram que o alendronato sódico, associado ou não à
hidroxiapatita, interferiu negativamente no processo de reparação óssea
neste modelo experimental.
Alguns estudos demonstram uma resposta tecidual
bifásica ao uso do alendronato de sódio, ou seja, a droga pode inibir ou
estimular a formação óssea dependendo da dose empregada e da forma
de administração (WEINREB et al.
76
, 1994; SILVA
64
, 2000; BINDERMAN
47
et al.
4
, 2000; CORREIA
12
, 2005). Uma vez que a sua administração pode
contribuir para a neoformação óssea, investiga-se a ação local de
diferentes concentrações de alendronato sódico no processo de reparo
ósseo.
3 PROPOSIÇÃO
Estudar a ação local do alendronato sódico na reparação
de defeitos ósseos em fêmures de ratos hipertensos (SHR) de ambos os
sexos, em diferentes períodos experimentais.
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Animais
Esta pesquisa foi realizada seguindo os princípios éticos
para a experimentação animal da Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos – UNESP, preconizados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(Anexo A).
Foram utilizados oitenta ratos espontaneamente
hipertensos (SHR), sendo quarenta machos e quarenta fêmeas, com
aproximadamente seis meses de idade, pesando em torno de 300g. Os
animais foram fornecidos pelo Biotério Central do Instituto de Ciências
Biomédicas – USP e permaneceram durante o período experimental nas
dependências do Biotério da Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos – UNESP.
Os ratos ficaram acondicionados, durante todo o
experimento, em gaiolas coletivas à temperatura ambiente, recebendo
ração (Guabi – Nutrilabor) e água ad libitum.
50
4.2 Divisão dos grupos
Os oitenta animais foram divididos em quatro grupos
experimentais constituídos por vinte animais (Quadro 1): C (controle), Am
(amido), A1 (alendronato 1mol) e A2 (alendronato 2moles). Todos os
animais foram submetidos à cirurgia para confecção de um defeito ósseo.
No grupo controle (C) os ratos foram submetidos apenas à cirurgia, não
recebendo qualquer preenchimento do defeito. Os animais do grupo
amido (Am), após serem submetidos ao ato cirúrgico, receberam
preenchimento do defeito ósseo apenas com o amido, excipiente utilizado
no experimento. Os animais do grupo (A1) receberam 1mol de
alendronato sódico, associado ao amido, para completo preenchimento
do defeito ósseo. Finalmente, o grupo (A2) teve o defeito cirúrgico
totalmente preenchido por 2mol de alendronato sódico, também
associado ao amido.
Quadro 1 – Divisão dos animais por grupos experimentais, número e sexo
n = número de animais
Grupos experimentais Machos Fêmeas
Controle (C) n = 10 n = 10
Amido (Am) n = 10 n = 10
Alendronato 1mol (A1) n = 10 n = 10
Alendronato 2mol (A2) n = 10 n = 10
51
4.3 Fármaco
O fármaco utilizado para preenchimento ósseo em nosso
estudo foi um bisfosfonato de segunda geração, o alendronato sódico na
sua apresentação pura. O amido desempenhou papel de excipiente por
ser inerte ao alendronato. Para avaliar se ele influenciou ou não no
processo de reparo, realizamos também um grupo experimental utilizando
apenas o amido.
O alendronato sódico e o amido empregados nesta
pesquisa foram cedidos pela Farmácia Escola da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas do Campus de Araraquara - UNESP.
Seguindo o protocolo desenvolvido por Fernandes
17
(2005) em sua pesquisa, foi realizada a administração local de
alendronato sódico na quantidade de 1mol (A1) e 2mol (A2) para o
preenchimento dos defeitos ósseos.
As proporções dos materiais foram calculadas de acordo
com o peso molecular (PM) do alendronato sódico, que equivale a
325g/mol. O cálculo das quantidades em peso foi realizada utilizando-se
0,01mol, para mensurarmos quantias volumétricas apropriadas ao
tamanho do defeito ósseo, isto é, utilizamos 3,25g no grupo experimental
A1 e 6,5g no grupo experimental A2. Deste modo, foi possível
acompanhar as definições já estabelecidas por Fernandes
17
(2005), como
pode ser visto no Quadro 2. Com esta quantidade de material,
preenchemos 26% do defeito com alendronato sódico no grupo A1 e 52%
no grupo A2, sendo o restante dos defeitos ósseos preenchidos com 74%
e 48% de amido, respectivamente.
52
Quadro 2 - Porcentagem e peso dos materiais utilizados (FERNANDES
17
,
2005)
Material
% do material
peso em gramas
% de amido % total
Hidroxiapatita
(HA2)
100%
12,44g
0% 100%
Hidroxiapatita
(HA1)
50%
6,22g
50%
6,22g
100%
Alendronato
(A2)
52%
6,5g
48%
5,94g
100%
Alendronato
(A1)
26%
3,25g
74%
9,19g
100%
Alendronato
+
Hidroxiapatita
(A + HA)
76%
3,25g + 6,22g
24%
2,97g
100%
Como se pode notar neste quadro, o autor tomou por
referência a hidroxiapatita (HA), por apresentar o maior PM, para calcular
as proporções porcentuais das substâncias para o preenchimento de
100% do defeito ósseo, nos diversos grupos experimentais.
Visto serem poucos os relatos na literatura que
padronizam a administração local e a dose do alendronato sódico no
processo de reparo ósseo, a opção pelas proporções mencionadas no
Quadro 2 permitirá comparar os nossos resultados com os obtidos por
Fernandes
17
(2005). Seguindo a mesma linha de pesquisa desenvolvida
por este autor, estabelecemos então, bases adequadas para comparação
dos resultados em relação à reparação óssea.
53
Os materiais foram pesados em balança de precisão (AB
204 - Metter Toledo) e misturados através de agitação, conforme
recomendações de manipulação, tendo sido posteriormente armazenados
em frascos de vidro.
4.4 Procedimentos cirúrgicos
As cirurgias foram realizadas na sala cirúrgica do Biotério
da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – UNESP, a qual
recebeu adequada limpeza e desinfecção das suas superfícies, anterior à
utilização de campos cirúrgicos estéreis. No momento da cirurgia, o
operador e o auxiliar estavam devidamente paramentados com
equipamento de proteção individual (avental, gorro, máscara, luvas e
óculos de proteção). Todo o instrumental cirúrgico estava adequadamente
esterilizado para o uso.
Foi realizado um procedimento cirúrgico para a confecção
de um defeito ósseo de 2,5mm de diâmetro no fêmur esquerdo de todos
os animais envolvidos no experimento.
Uma vez realizada a pesagem prévia dos animais, estes
receberam indução anestésica, empregando-se uma mistura de solução
aquosa de cloridrato de xilasina a 2% (Rompun – Bayer do Brasil),
medicamento sedativo e relaxante muscular, e de ketamina base
(Dopalen - Agribrands do Brasil), anestésico geral, na proporção de 1:0,5
respectivamente. A dosagem da solução injetada foi de 0,1ml/100g,
utilizando-se uma seringa descartável de 1ml por via intramuscular.
Após a anestesia, foi realizada a depilação da região do
fêmur esquerdo e a antissepsia da pele com solução aquosa de
polividona, com 10% de iodo ativo, por fricção com gaze estéril.
Posteriormente, com uma lâmina de bisturi n
o
15 montada em cabo Bard &
54
Parker, realizou-se uma incisão longitudinal ao fêmur de
aproximadamente 2,5cm de extensão, na pele e na fáscia muscular da
região do terço distal do fêmur esquerdo (Figura 1a).
A divulsão da musculatura foi realizada utilizando-se
tesoura reta de ponta romba (Figura 1b), para posterior incisão e
descolamento do periósteo até a completa exposição do tecido ósseo
(Figura 1c).
A confecção do defeito ósseo foi realizada utilizando-se
uma broca trefina de 2,5mm de diâmetro externo, no local de maior
extensão lateromedial da região distal da diáfise do fêmur, até o
rompimento da cortical óssea externa (Figura 1d). Todo procedimento
recebeu abundante irrigação com solução de cloreto de sódio estéril a
0,9%.
Os materiais foram levados para o interior do defeito
através da utilização de um porta-amálgama, e acomodados com o auxílio
de um condensador, misturando-se ao sangue proveniente da própria
ferida cirúrgica (Figura 1e). O preenchimento dos defeitos ósseos seguiu
a especificação do material correspondente a cada grupo:
a) Grupo Controle (C): não foi realizado o preenchimento
do defeito;
b) Grupo Amido (Am): o defeito foi completamente
preenchido com amido (excipiente);
c) Grupo 1mol de alendronato (A1): o defeito foi
completamente preenchido com 3,25g de alendronato
sódico e 9,19g de amido;
d) Grupo 2mol de alendronato (A2): o defeito foi
completamente preenchido com 6,50g de alendronato
sódico e 5,94g de amido.
55
Posteriormente, foi realizada a irrigação da musculatura e
pele com soro fisiológico e os tecidos foram delicadamente
reposiocionados por meio de sutura da camada muscular com fio
absorvível (Cirumédica n° 4) e da pele com fio seda (Ethicon – Johnson &
Johnson n° 4). Após a sutura, nova antissepsia da pele foi efetuada com
solução aquosa de polividona (Figura 1f).
Em seguida, os animais foram colocados em gaiolas,
levando em média trinta minutos para retornarem do estado de analgesia,
quando se verificava a retomada dos reflexos normais, através da
resposta ao estímulo do membro inferior.
57
4.5 Sacrifício
O sacrifício dos animais foi executado por meio de
anestesia e decapitação em guilhotina, decorridos sete e 21 dias da data
da cirurgia (Quadro 3).
Quadro 3 – Divisão dos animais em grupos e período de sacrifício
n = número de animais
4.6 Análise do defeito ósseo
Os fêmures esquerdos dos animais foram removidos e
fixados em solução de formaldeído a 10% durante o período mínimo de
48 horas. Após a fixação dos tecidos, as peças foram descalcificadas em
solução de ácido fórmico a 20%, durante aproximadamente dez dias, no
Laboratório de Patologia Cirúrgica da Disciplina de Patologia Bucal da
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo - USP. As
peças foram, posteriormente, processadas e incluídas em blocos de
Tempo de Sacrifício
Grupos
7 dias 21 dias
Macho n = 5 n = 5
Controle (C)
Fêmea n = 5 n = 5
Macho n = 5 n = 5
Amido (Am)
Fêmea n = 5 n = 5
Macho n = 5 n = 5 Alendronato
1mol (A1)
Fêmea n = 5 n = 5
Macho n = 5 n = 5 Alendronato
2mol (A2)
Fêmea n = 5 n = 5
58
parafina para que fossem confeccionados cortes transversais da área do
defeito, com aproximadamente 5µm de espessura. As secções foram
realizadas em toda extensão do defeito, de forma semi-seriada e as
lâminas coradas com hematoxilina-eosina (HE).
4.6.1 Análise histomorfológica
Foram realizadas as avaliações histológicas com relação
ao tecido ósseo neoformado em toda extensão do defeito, sendo
observadas as características das trabéculas ósseas imaturas e
remodelação das mesmas, dos espaços medulares e da remodelação
óssea na superfície de corte. A morfologia das células ósseas
encontradas também foi analisada e descrita.
4.6.2 Análise histomorfométrica
Todas as lâminas foram fotografadas na região central do
defeito com um aumento original de cem vezes, através da câmara digital
Cyber Shott modelo DSC-585 (Sony Corporation) acoplada ao
microscópio de luz Zeiss Axiophot 2 (Carl Zeiss, Oberköchen, Alemanha).
As imagens foram visualizadas em um monitor de TV e, depois de
digitalizadas, foram transferidas para um microcomputador e submetidas
à análise histométrica da neoformação óssea. Para isso, foi empregado o
método da planimetria por contagem de pontos, utilizando o programa
Image-J (Versão 1,32 para Windows), de domínio público, do Instituto
Nacional de Saúde (NIH), Bethesda, EUA.
Utilizou-se um retículo quadriculado composto por dez
linhas verticais e dez horizontais, formando cem pontos de intersecção. O
retículo posicionado sobre a região central da imagem histológica do
defeito ósseo foi empregado para a conferência do número de pontos de
intersecção sobrepostos ao tecido ósseo neoformado. A partir de uma
59
amostragem sistemática, foram selecionados para análise dois cortes
histológicos das lâminas número um, três e cinco de cada animal. Desta
forma foram avaliados seis cortes por espécime, totalizando seiscentos
pontos analisados por animal. Os valores encontrados, então
transformados em porcentagem, foram submetidos à análise estatística.
4.6.3. Análise estatística
Os resultados obtidos da análise histomorfométrica foram
submetidos à análise estatística descritiva e à análise de variância
(ANOVA), utilizando como nível de significância a margem de erro de 5%.
Foram analisados os tratamentos dos quatro grupos de animais (C, Am,
A1, A2), os dois períodos de observação (sete e 21 dias) e o sexo dos
animais (macho e fêmea). Quando necessário, foi aplicado o teste de
comparação múltipla de Tukey (5%).
Para a realização da análise estatística e a confecção do
gráfico, utilizou-se o software Statistica 6.0 e Excel 2003.
5 RESULTADOS
5.1 Análise histomorfológica
Os cortes histológicos analisados referem-se aos fêmures
de ratos SHR, que foram seccionados transversalmente na região do
defeito ósseo.
Os animais apresentaram características histológicas
distintas de acordo com o grupo experimental, o sexo e o período de
observação. Dessa forma, a descrição histomorfológica dos espécimes foi
realizada separando os grupos por sexo e período de observação, para
facilitar a comparação da neoformação óssea evidenciada nos diferentes
grupos experimentais.
Numa primeira vista panorâmica dos cortes, pôde-se
observar a cortical óssea do fêmur, o canal medular, a área do defeito
ósseo e os tecidos moles adjacentes, como o tecido muscular
remanescente.
Os detalhes do processo de neoformação óssea foram
descritos numa maior aproximação, sendo possível evidenciar as
características do tecido osteóide, das trabéculas ósseas e das células
osteogênicas.
61
5.1.1 Animais machos - sete dias
Na análise histológica dos espécimes, observava-se o
corte transversal do fêmur na área do defeito ósseo. Este apresentava
suas bordas nítidas e evidentes (Figura 2).
Ocupando a área do defeito ósseo, foi encontrado um
tecido conjuntivo frouxo, bastante celularizado, com focos de hemorragia
(Figura 3a, 3b) e infiltrado inflamatório em todos os grupos experimentais.
O interior do canal medular caracterizava-se pela presença de quantidade
variável de tecido medular (Figura 2a, 2b, 2c, 2d).
Alguns espécimes dos grupos controle (C) e amido (Am),
ainda apresentavam focos de tecido osteóide imaturo em meio ao tecido
conjuntivo frouxo (Figura 3b).
Contudo, nos animais machos aos sete dias, não foi
observada a presença de trabéculas ósseas organizadas na área do
defeito ósseo (Figura 2; Figura 3).
Todos os espécimes referentes aos grupos alendronato
1mol (A1) e alendronato 2mol (A2) apresentavam uma rede de fibrina em
meio ao tecido conjuntivo na área do defeito ósseo, com ausência de
formação óssea. (Figura 3c e 3d) Alguns espécimes dos grupos tratados
com alendronato sódico também apresentavam degeneração hidrópica
(Figura 3c) no tecido conjuntivo.
Nesta fase, não se observava a presença do periósteo
sobre a área do defeito ósseo. Em alguns espécimes, pôde-se observar o
tecido muscular recobrindo parcialmente a superfície do defeito ósseo
(Figura 3c).
Uma característica histológica marcante observada nos
animais dos grupos A1 e A2, em particular neste último, foi a presença de
formações ósseas extra-corticais subperiosteais na região oposta ao
defeito ósseo, nas faces medial e lateral do osso (Figura 2d).
FIGURA 2 - SHR machos, sete dias (vista panorâmica): a) grupo C: foco
de hemorragia na área do defeito; b) grupo Am: hemorragia
na área do defeito; c) grupo A1: rede de fibrina no
conjuntivo preenchendo o defeito; d) grupo A2: rede de
fibrina no defeito ósseo e tecido ósseo extra-cortical
subperiosteal neoformado (→) HE. Aumento original de 25x.
62
63
O tecido ósseo extra-cortical subperiosteal neoformado
mostrava características de tecido ósseo imaturo, com poucas trabéculas
limitando amplos espaços medulares contendo tecido conjuntivo frouxo. O
periósteo e o tecido muscular recobriam o tecido ósseo extra-cortical.
FIGURA 3 - SHR machos, sete dias (centro do defeito): a) grupo C:
tecido conjuntivo frouxo com foco de hemorragia na área
do defeito (♦); b) grupo Am: áreas de hemorragia na área
do defeito (♦) e deposição de matriz osteóide (→); c)
grupo A1: rede de fibrina e degeneração hidrópica no
tecido conjuntivo preenchendo o defeito; d) grupo A2:
rede de fibrina na área do defeito ósseo (+). HE. Aumento
original de 100x.
64
65
Animais fêmeas - sete dias
As características gerais visualizadas no grupo de animais
fêmeas, aos sete dias, foram semelhantes àquelas observadas no grupo
anterior, dos animais machos, do mesmo período de observação.
Numa vista panorâmica, observava-se o fêmur num corte
transversal, com as bordas do defeito ósseo visíveis nos espécimes de
todos os grupos estudados. O tecido muscular encontrava-se recobrindo
parcialmente o fêmur dos animais (Figura 4).
Da mesma forma como foi constatado nos animais
machos, os defeitos ósseos das fêmeas também mostravam áreas de
hemorragia no interior do tecido conjuntivo, principalmente nos espécimes
do grupo C (Figura 4a; Figura 5a). Outras vezes, a hemorragia já se
mostrava substituída por um tecido conjuntivo bastante celularizado e
vascularizado (Figura 4b; Figura 5b).
Os espécimes dos grupos A1 e A2 apresentavam uma
rede de fibrina que se tornava evidente na área do defeito ósseo e, muitas
vezes, invadia o canal medular (Figura 4c; 4d; Figura 5c; 5d).
A presença de focos de tecido osteóide no tecido
conjuntivo frouxo foi um achado histológico encontrado em alguns
espécimes grupos C, Am e A2 (Figura 5d). Tal formação de matriz
osteóide não foi encontrada nos animais do grupo A1. Já nos animais
machos aos sete dias, nenhum grupo tratado com alendronato sódico
apresentava esse achado histológico.
A formação óssea extra-cortical subperiosteal nas fêmeas
também foi constatada nos animais tratados com alendronato sódico
(Figura 4c, 4d). Essa formação óssea já se mostrava maior e mais
evidente nos animais fêmeas quando comparado ao grupo de animais
machos.
Figura 4 - SHR fêmeas, sete dias (vista panorâmica): a) grupo C: foco de
hemorragia na área do defeito; b) grupo Am: ausência de
hemorragia e presença de tecido conjuntivo na área do
defeito; c) grupo A1: rede de fibrina no conjuntivo
preenchendo o defeito e formação óssea extra-cortical
subperiosteal (→) d) grupo A2: rede de fibrina na área do
defeito ósseo e detalhe da formação óssea extra-cortical
subperiosteal (→). HE. Aumento original de 25x.
66
67
Aos sete dias, o tecido ósseo extra-cortical subperiosteal
neoformado mostrava-se composto por trabéculas ósseas delgadas, que
se anastomosavam e limitavam amplos espaços medulares contendo
tecido conjuntivo frouxo. O tecido neoformado continha osteócitos
volumosos em grande quantidade, que se encontravam abrigados em
amplas lacunas. O periósteo e o tecido muscular recobriam o tecido
ósseo extra-cortical (Figura 10a).
Figura 5 - SHR fêmeas, sete dias (centro do defeito): a) grupo C: foco de
hemorragia na área do defeito (→); b) grupo Am: tecido
conjuntivo frouxo com deposição de fibras colágenas; c)
grupo A1: rede de fibrina no conjuntivo preenchendo o defeito
(♦); d) grupo A2: rede de fibrina (♦) e matriz osteóide na área
do defeito ósseo (→). HE. Aumento original de 100x.
68
69
5.1.3 Animais machos - 21 dias
A avaliação histomorfológica realizada nos grupos C e
Am, aos 21 dias, apresentava o fechamento do defeito ósseo em toda a
sua extensão, com a presença de um tecido ósseo neoformado que se
continuava com o tecido cortical adjacente ao defeito (Figura 6a, 6b).
Nesses espécimes, observava-se a presença de trabéculas ósseas, que
se anastomosavam e limitavam espaços ocupados por tecido medular
(Figura 7a, 7b).
Em alguns espécimes dos grupos C e Am, foi observada
a presença de um tecido conjuntivo fibroso recobrindo o tecido ósseo
neoformado, com o periósteo bem definido, (Figura 7a, 7b).
Nos espécimes do grupo A1, também se observava a
presença de trabéculas ósseas neoformadas, porém estas se mostravam
mais delgadas e com aspecto imaturo (Figura 7c). O osso trabecular
continha osteócitos volumosos em grande quantidade, no interior de
amplas lacunas. Entre as trabéculas, observava-se a presença de
grandes espaços medulares preenchidos com tecido conjuntivo frouxo,
ricamente celularizado e vascularizado (Figura 7c, Figura 10c).
No entanto, o tecido ósseo neoformado não fechava
totalmente a extensão do defeito nos espécimes do grupo A1.
Caracterizava-se por assumir um padrão histológico distinto, no qual as
trabéculas ósseas, ao nosso ver, se projetavam do canal medular em
direção à área do defeito (Figura 6c). Tudo indica que as trabéculas
ósseas se formaram a partir do endósteo adjacente à superfície de corte.
Essa característica não foi observada em nenhum outro grupo de animais.
Nos defeitos ósseos dos animais do grupo A2, somente
foi constatada a presença de um tecido conjuntivo frouxo, com pequena
deposição de tecido osteóide no seu interior (Figura 7d). Alguns casos
também mostravam áreas de hemorragia presentes na área do defeito
ósseo (Figura 6d; Figura 7d). Nos animais do deste grupo, não se
Figura 6 - SHR machos, 21 dias (vista panorâmica): a) grupo C: defeito
ósseo fechado em extensão; b) grupo Am: anastomoses das
trabéculas na superfície externa do defeito; c) grupo A1:
trabéculas ósseas partindo do canal medular em direção ao
defeito ósseo (♦); d) grupo A2: rede de fibrina na área do
defeito ósseo e neoformação óssea extra-cortical (→). HE.
Aumento original de 25x.
70
71
evidenciava a formação de trabéculas ósseas maduras fechando o defeito
ósseo em toda sua extensão (Figura 6d; Figura 7d).
No grupo A1 e, principalmente, no grupo A2 observava-se
uma neoformação óssea extra-cortical subperiosteal, nas faces medial e
lateral do osso (Figura 6d). Aos 21 dias, o osso extra-cortical
caracterizava-se pela presença de trabéculas ósseas mais maduras,
regularmente distribuídas, que delimitavam espaços medulares
preenchidos por tecido conjuntivo frouxo.
Figura 7 - SHR machos, 21 dias (centro do defeito): a) grupo C:
trabéculas ósseas anastomosadas limitando espaços
medulares com tecido conjuntivo frouxo b) grupo Am:
tecido ósseo neoformado recoberto por periósteo na área do
defeito ósseo (→); c) grupo A1: trabéculas ósseas imaturas
e superfície externa da área do defeito ósseo recoberta por
tecido conjuntivo fibroso; d) grupo A2: tecido conjuntivo,
com áreas de hemorragia, deposição de fibras colágenas e
tecido osteóide (→). HE. Aumento original de 100x.
72
73
5.1.4 Animais fêmeas - 21 dias
Os achados histológicos do tecido ósseo nos grupos C e
Am foram semelhantes aos encontrados nos machos ao 21 dias, havendo
o fechamento de toda a extensão do defeito ósseo na maioria dos
espécimes analisados (Figura 8a, 8b).
A porção mais externa do defeito ósseo aparecia formada
por um tecido ósseo mais maduro e compacto (Figura 9a, 9b), recoberto
por um tecido conjuntivo fibroso (Figura 9b). Em algumas regiões
observavam-se áreas de remodelamento ósseo, evidenciando assim um
arranjo semelhante ao lamelar (Figura 10d).
O periósteo mostrava-se bem definido nos animais dos
grupos C e Am. Este se constituía por uma camada superficial de tecido
conjuntivo fibroso e uma camada profunda formada por osteoblastos
achatados (Figura 10d).
O tecido ósseo neoformado, observado aos 21 dias,
mostrava-se formado por osso lamelar com lacunas contendo osteócitos
menos volumosos e achatados (Figura 10d). Os osteoblastos de formato
achatado margeavam as trabéculas ósseas.
No entanto, nos grupos A1 e A2 não se observava a
organização de trabéculas ósseas na área do defeito (Figura 8c, 8d).
Constatava-se apenas a presença de tecido conjuntivo frouxo (Figura 9c e
9d), com deposição de feixes de fibras colágenas dispostas
aleatoriamente, bem como a presença de mínima deposição de matriz
osteóide em alguns casos.
As formações ósseas subperiosteais na região oposta ao
defeito ósseo estavam presentes em todos os grupos tratados com
alendronato 1mol (A1) e 2mol (A2) e mostravam-se mais expressivas nos
animais fêmeas quando comparado aos animais machos, aos 21 dias
(Figura 8c, 8d; Figura 10b). O tecido neoformado encontrava-se recoberto
pelo periósteo e tecido muscular (Figura 10b). Continha osteócitos em
Figura 8 - SHR fêmeas, 21 dias (vista panorâmica): a) grupo C: defeito
ósseo fechado em extensão; b) grupo Am: trabéculas ósseas
anastomosadas fechando todo o defeito; c) grupo A1: tecido
conjuntivo na área do defeito e neoformação óssea extra-
cortical subperiosteal (→); d) grupo A2: tecido conjuntivo na
área do defeito e neoformação óssea extra-cortical
subperiosteal (→). HE. Aumento original de 25x.
74
75
grande quantidade, que se encontravam abrigados em lacunas de
menores proporções quando comparado aos animais dos grupos de sete
dias. Os espaços medulares contendo tecido conjuntivo frouxo e vasos
sangüíneos também se mostravam reduzidos O osso apresentava maior
maturação, com características evidentes de remodelação óssea, devido
à presença das linhas reversas basofílicas (Figura 10b).
FIGURA 9 - SHR fêmeas, 21 dias (centro do defeito): a) grupo C:
trabéculas ósseas anastomosadas delimitando espaços
medulares; b) grupo Am: defeito ósseo fechado por tecido
ósseo neoformado, recoberto por tecido conjuntivo fibroso
(→); c) grupo A1: tecido conjuntivo na área do defeito; d)
grupo A2: defeito preenchido por tecido conjuntivo frouxo.
HE. Aumento original de 100x.
76
77
78
5.2 Análise histomorfométrica
A análise quantitativa da neoformação óssea foi realizada
por contagem total de pontos de intersecção do retículo sobre as
trabéculas ósseas neoformadas (P), correspondendo à análise de seis
cortes para cada animal estudado. Os resultados foram relatados em
números absolutos (P) e em média porcentual (P/600). A análise
histomorfométrica será apresentada por grupos de acordo com o sexo
dos animais e os períodos de observação.
A Tabela 1 apresenta os dados obtidos no grupo controle
(C), aos sete dias, em machos e fêmeas.
Tabela 1 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor em média
porcentual* do grupo C no período de sete dias, macho e fêmea
Período 7 dias
Macho Fêmea
Grupo
P Média P Média
C 35 0,0583 1 0,0017
C 10 0,0167 0 0,0
C 110 0,1833 15 0,0250
C 16 0,0267 65 0,0184
C 4 0,0067 9 0,0150
*média porcentual=P/600
79
As Tabelas 2 a 4 apresentam os dados obtidos aos sete
dias, nos animais machos e fêmeas, dos grupo amido (Am), alendronato
1mol (A2) e alendronato 2mol (A2), respectivamente.
Tabela 2 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor em média
porcentual* do grupo Am no período de sete dias, macho e fêmea
Período 7 dias
Macho Fêmea
Grupo
P Média P Média
Am 8 0,0133 13 0,0216
Am 10 0,0167 0,0 0,0
Am 12 0,0200 10 0,0167
Am 0,0 0,0 0,0 0,0
Am 61 0,1017 3 0,005
*média porcentual=P/600
Tabela 3 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor em média
porcentual* do grupo A1 no período de sete dias, macho e fêmea
Período 7 dias
Macho Fêmea
Grupo
P Média P Média
A1 0,0 0,0 0,0 0,0
A1 0,0 0,0 0,0 0,0
A1 0,0 0,0 0,0 0,0
A1 0,0 0,0 0,0 0,0
A1 0,0 0,0 0,0 0,0
*média porcentual=P/600
80
Tabela 4 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor em média
porcentual* do grupo A2 no período de sete dias, macho e fêmea
Período 7 dias
Macho Fêmea
Grupo
P Média P Média
A2 0,0 0,0 0,0 0,0
A2 0,0 0,0 0,0 0,0
A2 0,0 0,0 3 0,0075
A2 0,0 0,0 10 0,0167
A2 0,0 0,0 18 0,0300
*média porcentual=P/600
As Tabelas 5 a 8 apresentam os dados obtidos aos 21
dias, nos animais machos e fêmeas, dos grupos controle (C), amido (Am),
alendronato 1mol (A1) e alendronato 2mol (A2), respectivamente.
Tabela 5 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor em média
porcentual* do grupo C no período de 21 dias, macho e fêmea
Período 21 dias
Macho Fêmea
Grupo
P Média P Média
C 126 0,21 104 0,1733
C 151 0,2516 133 0,2217
C 164 0,2733 158 0,2633
C 183 0,305 159 0,265
C 162 0,27 243 0,405
*média porcentual=P/600
81
Tabela 6 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor em média
porcentual* do grupo Am no período de 21 dias, macho e fêmea
Período 21 dias
Macho Fêmea
Grupo
P Média P Média
Am 79 0,1320 189 0,315
Am 104 0,1733 252 0,420
Am 84 0,1400 250 0,4167
Am 172 0,2867 250 0,4167
Am 158 0,2633 240 0,40
*média porcentual=P/600
Tabela 7 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor em média
porcentual* do grupo A1 no período de 21 dias, macho e fêmea
Período 21 dias
Macho Fêmea
Grupo
P Média P Média
A1 10 0,0167 0,0 0,0
A1 133 0,2217 11 0,0183
A1 94 0,1567 14 0,0233
A1 57 0,0950 11 0,0183
A1 120 0,20 3 0,0050
*média porcentual=P/600
82
Tabela 8 - Resultado da contagem total de pontos (P) e valor em média
porcentual* do grupo C no período de 21 dias, macho e fêmea
Período (21 dias)
Macho Fêmea
Grupo
P % P %
A2 2 0,0033 67 0,1117
A2 0 0 36 0,06
A2 16 0,0267 29 0,0483
A2 0 0,0 36 0,06
A2 15 0,025 0 0,0
*média porcentual=P/600
5.3 Análise estatística
Os dados obtidos a partir da análise histomorfométrica
foram submetidos à análise estatística descritiva, destacando o valor
porcentual médio de neoformação óssea e o desvio padrão para cada
grupo experimental. Três fatores foram considerados na análise de
variância (ANOVA): o tratamento realizado em cada grupo experimental
(C, Am, A1 e A2), o sexo dos animais (macho e fêmea) e o período de
observação (sete e 21 dias).
Na Tabela 9 estão apresentados os resultados da
estatística descritiva, obtidos com relação aos diferentes grupos
experimentais, no período de sete dias, nos SHR machos.
83
Tabela 9 - Estatística descritiva referente aos grupos experimentais, no período
de sete dias, SHR machos
Período 7 dias (machos)
Grupo
Média DP
C 0,0583 0,0725
Am 0,0303 0,0406
A1 0,0 0,0
A2 0,0 0,0
DP: desvio padrão
Na Tabela 10, encontram-se relatados os resultados da
estatística descritiva realizada em todos os grupos experimentais, no
período de sete dias, nos SHR fêmeas
Tabela 10 - Estatística descritiva referente aos grupos experimentais, no
período sete dias, SHR fêmeas
Período 7 dias (fêmeas)
Grupo
Média DP
C 0,03 0,045
Am 0,0087 0,01
A1 0,0 0,0
A2 0,0108 0,0127
DP: desvio padrão
Nas Tabela 11 e 12 encontram-se os resultados da
estatística descritiva realizada em todos os grupos experimentais, no
período de 21 dias, nos SHR machos e fêmeas, respectivamente.
84
Tabela 11 - Estatística descritiva referente aos grupos experimentais, no
período 21 dias, SHR machos
Período 21 dias (machos)
Grupo
Média DP
C 0,2620 0,0348
Am 0,1992 0,0717
A1 0,138 0,0833
A2 0,011 0,0136
DP: desvio padrão
Tabela 12 -
Estatística descritiva referente aos grupos experimentais, no
período 21 dias, SHR fêmeas
Período 21 dias (fêmeas)
Grupo
Média DP
C 0,2655 0,0864
Am 0,3937 0,0447
A1 0,013 0,0099
A2 0,056 0,0398
DP: desvio padrão
85
O gráfico ilustrado na Figura 11 refere-se aos valores das
médias percentuais e DP dos dados da neoformação óssea nos
diferentes grupos experimentais (C, Am, A1 e A2), aos sete e 21 dias, nos
SHR machos e fêmeas.
Figura 11 - Gráfico ilustrativo das médias e DP dos dados da neoformação
óssea nos diferentes grupos experimentais, aos sete e 21 dias, nos
SHR machos e fêmeas
De acordo com a Figura 11, constatou-se que os valores
das médias de neoformação óssea foram maiores nos grupos de 21 dias
de observação. Nos grupos C, Am e A2 observou-se que as fêmeas
apresentaram médias de neoformação óssea maiores que os machos,
que somente superaram as fêmeas no grupo A1.
Na Tabela 13 estão apresentados os resultados
estatísticos da ANOVA (nível de significância 5%) com relação aos fatores
estudados, bem como em relação à interação entre estes fatores.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
CAmA1A2
Tratamento
Neoformação óssea
fêmeas 7 dias machos 7 dias fêmeas 21 dias machos 21 dias
86
Tabela 13 - Análise de variância a três fatores
Fatores
Soma dos
quadrados
Grau de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Grupo
experimental
0,3278 3 0,1093 51,71
0,000*
Período
0,4501 1 0,4501 212,9
0,000*
Sexo
0,0019 1 0,0019 0,92 0,341
Interação
grupo x período
0,2068 3 0,0689 32,62
0,000*
Interação
grupo x sexo
0,0596 3 0,0198 9,4
0,000*
Interação
período x sexo
0,0077 1 0,0077 3,64 0,061
Interação
grupo x período
x sexo
0,0729 3 0,0243 11,5
0,000*
Resíduo
0,1352 64 0,0021
Total
1,2623 79
* P<0,05 = diferença estatisticamente significante
Analisando os dados obtidos na Tabela 13, observamos
que houve diferença estatisticamente significante com relação aos
seguintes fatores estudados: grupos experimentais; períodos de
observação; interação grupos experimentais e períodos de observação;
interação grupos experimentais e sexo dos animais; interação grupos
experimentais, períodos de observação e sexo dos animais.
87
Esses resultados tornaram necessária a aplicação do
teste de comparação múltipla de Tukey para a comparação entre os
valores encontrados.
Tabela 14 - Formação de grupos homogêneos após o Teste de Tukey (5%)
para as variáveis grupos experimentais, períodos de observação e
sexo dos animais, em relação à média de neoformação óssea
Grupo
experimental
Período de
observação
Sexo Média
Grupos
homogêneos
A1 7 dias Machos 0,00 a
A2 7 dias Machos 0,00 a
A1 7 dias Fêmeas 0,00 a
Am 7 dias Fêmeas 0,0086 a
A2 7 dias Fêmeas 0,0108 a
A2 21 dias Machos 0,011 a
A1 21 dias Fêmeas 0,0129 a
C 7 dias Fêmeas 0,03 a
Am 7 dias Machos 0,0303 a
A2 21 dias Fêmeas 0,056 a b
C 7 dias Machos 0,0582 a b
A1 21dias Machos 0,138 b c
Am 21dias Machos 0,1992 c d
C 21dias Machos 0,262 d
C 21dias Fêmeas 0,2654 d
Am 21dias Fêmeas 0,3936 e
* grupos com letras iguais não diferem estatisticamente a 5%
88
De maneira geral, os resultados dispostos na Tabela 14
demonstraram que os animais dos grupos C e Am exibiram maior
formação óssea aos 21 dias.
Aos sete dias, apenas o grupo C de animais machos
apresentou maior formação óssea. Entre os demais grupos, não houve
diferença estatística.
Nos animais machos aos 21 dias, as médias de
neoformação óssea mostraram-se mais baixas, com diferença
estatisticamente significante, no grupo tratado com 2mol de alendronato
sódico (A2). O grupo A1 de animais machos, aos 21 dias, foi o único
grupo que demonstrou maior formação óssea com resultado mais próximo
aos grupos C e Am, no mesmo período de observação.
Já nos animais fêmeas, aos 21 dias, ambos os grupos A1
e A2 mostraram menor neoformação óssea, com os valores das médias
diferindo estatisticamente dos grupos C e Am.
6 DISCUSSÃO
A HAS consiste numa doença relacionada a alterações
ósseas importantes, que pode originar principalmente a diminuição da
densidade mineral óssea (IZAWA et al.
28
, 1985; INOUE et al.
26
, 1995;
CAPPUCCIO et al.
10
, 1999; NICHOLS et al.
46
, 2003; PÉREZ-
CASTRILLÓN et al.
52
, 2003). Alguns autores sugerem que existe uma
relação entre as alterações dos fatores de regulação do cálcio e a
tendência à perda óssea nos indivíduos hipertensos (JORDE et al.
32
,
2000; TSUDA et al.
72
, 2001; MUSSOLINO et al.
43
, 2003).
As principais alterações no metabolismo do cálcio
evidenciadas na HAS consistem na elevação dos níveis do PTH sérico,
no aumento do cálcio sérico ionizado, na diminuição do conteúdo de
cálcio ósseo e no aumento da excreção urinária do cálcio (McCARRON et
al.
41
, 1981; BRICKMAN et al.
7
1990; JORDE et al.
32
, 2000).
O metabolismo do tecido ósseo de indivíduos hipertensos
tem como importante fator o PTH, uma vez que estes apresentam níveis
mais elevados do hormônio circulando no sangue. O PTH estimula a
atividade osteoclástica e mobiliza o cálcio presente no esqueleto,
podendo levar a uma diminuição da densidade mineral óssea
(JESPERSEN
30
, 1997).
Apesar dos estudos demonstrarem que a HAS origina
alterações evidentes no tecido ósseo dos indivíduos, influenciando na
evolução de diversas patologias, pouco se conhece a respeito da
influência dessa doença nos processos de reparação óssea. Em 2004, o
estudo de Pereira
51
constatou que os ratos tipo SHR apresentavam uma
90
neoformação óssea mais avançada, com diferença estatisticamente
significante em relação aos normotensos.
Os ratos tipo SHR consistem num bom modelo de estudo
da hipertensão experimental, uma vez que reproduzem a doença com
muita similaridade com aquela apresentada por humanos (McCARRON et
al.
41
, 1981; BARBAGALLO et al.
3
, 1991; WANG et al.
75
, 1993). As
pesquisas comprovam que a hipertensão arterial presente nesses animais
também está relacionada a anormalidades no metabolismo do cálcio, o
que resulta em modificações importantes no tecido ósseo (YAMORI et
al.
83
, 1991; WANG et al.
75
, 1993; WRIGHT & DeMOSS
79
, 2000). São
considerados animais osteopênicos, por apresentarem alta taxa de
remodelação do esqueleto (BARBAGALLO et al.
3
, 1991; WRIGHT &
DeMOSS
79
, 2000).
Sabe-se que o mecanismo de redução da massa óssea
nos ratos tipo SHR ocorre devido ao desequilíbrio da relação existente
entre as atividades osteoclástica e osteoblástica, caracterizando-se por
um aumento da reabsorção e na diminuição da massa óssea (WANG et
al.
75
, 1993).
Os SHR caracterizam-se por apresentarem menor peso
corpóreo quando comparados aos ratos normotensos, com relatos de
menor comprimento e volume de osso (IZAWA et al.
28
, 1985, INOUE et
al.
26
1995). Izawa et al.
28
(1985) verificaram que o tecido ósseo dos SHR
apresentou menor área cortical quando comparado ao osso dos ratos
normotensos. Quanto ao osso esponjoso, autores como Yamori et al.
83
(1991) e Wang et al.
75
(1993) relatam que esses animais apresentam uma
diminuição do volume e da espessura do osso trabecular.
Inoue et al.
26
(1995) através de análise histométrica,
observaram que o volume e a espessura do osso trabecular foram
semelhantes entre os ratos SHR e SD. No entanto, observaram que a
DMO dos SHR demonstrou ser reduzida, sugerindo uma menor
quantidade mineral no tecido ósseo dos ratos SHR.
91
A DMO alterada também foi evidenciada por Barbagallo et
al.
3
(1991) que encontraram valores diminuídos nos SHR, sendo este fato
também observado em humanos por Cappuccio et al.
10
(1999) e Tsuda et
al.
72
(2001).
Barbagallo et al.
3
(1991) demonstraram que os ratos tipo
SHR, além de apresentarem DMO reduzida, apresentavam baixos níveis
de cálcio ósseo. No entanto, Wright & DeMoss
79
(2000) não observaram
alteração no conteúdo desse elemento no esqueleto.
Níveis séricos elevados do PTH têm sido observados nos
ratos tipo SHR, caracterizando o predomínio do processo de reabsorção
óssea sobre a formação óssea nesses animais. A presença do PTH
mobiliza o cálcio presente no tecido ósseo, levando à elevação das taxas
de cálcio sérico, além de resultar num quadro de hipercalciúria (YAMORI
et al.
83
, 1991). Wang et al.
75
(1993) justificam a diminuição do volume
trabecular nos SHR devido aos altos níveis de PTH no soro.
Neste estudo observamos que os SHR mostraram
reparação óssea mais retardada quando comparado ao estudo de
Pereira
51
(2005) realizado em ratos SHR e ao estudo de Fernandes
17
(2005) com ratos normotensos WKY.
A análise histológica deste trabalho mostrou resultados
que diferiram daquele encontrado por Pereira
51
(2004). O autor observou
que aos sete dias, os ratos tipo SHR apresentavam a formação de
trabéculas ósseas imaturas na maioria dos espécimes estudados.
Neste estudo, no período de sete dias, a maioria dos
grupos experimentais ainda apresentava um tecido conjuntivo frouxo com
focos de hemorragia na área do defeito ósseo, sugerindo que a fase de
substituição do hematoma por tecido de granulação ainda não havia se
completado. Ainda no período de sete dias, alguns espécimes dos grupos
C e Am apresentavam tecido osteóide em meio ao tecido conjuntivo,
caracterizando a formação óssea imatura presente na primeira semana
do experimento.
92
A avaliação histomorfológica realizada nos grupos C e
Am, aos 21 dias, mostrou o fechamento de toda a extensão do defeito
ósseo na maioria dos espécimes, com a presença de um tecido ósseo
neoformado que se continuava com o tecido cortical adjacente. Nesses
espécimes, observou-se a presença de trabéculas ósseas dispostas
irregularmente em meio a um tecido conjuntivo frouxo e bastante
celularizado. Observou-se em alguns casos, a presença de linhas
reversas basofílicas, que sugere a ocorrência de um processo de
remodelação óssea.
Ainda no período de 21 dias, pudemos constatar que as
trabéculas ósseas se anastomosavam e encontravam-se circundadas por
osteoblastos achatados, semelhante ao que foi encontrado por Pereira
51
(2004) em seu estudo.
Alguns autores relatam características ósseas distintas
entre os animais tipo SHR machos e fêmeas. Os estudos mostram que os
SHR fêmeas apresentam peso corpóreo, comprimento e volume ósseos
reduzidos (INOUE et al.
26
, 1995) e taxas de reabsorções ósseas mais
elevadas (WRIGHT & DeMOSS
79
, 2000). No entanto, Pereira
51
(2004)
observou que o processo de reparo ósseo nos ratos normotensos e
hipertensos não apresentou diferenças entre os sexos.
Neste estudo não se observou diferença estatística entre
os sexos dos animais, mas apenas quando se avaliou a interação do sexo
com os outros fatores estudados.
Uma vez que se reconhecem as alterações ósseas
presentes em indivíduos com hipertensão arterial, utilizou-se neste estudo
o alendronato sódico como medicamento no local do defeito ósseo, a fim
de observar seus efeitos na reparação óssea em ratos tipo SHR.
Por apresentar grande afinidade pela matriz óssea e
capacidade de inibir sua reabsorção, o alendronato sódico é amplamente
utilizado no tratamento de desordens relacionadas ao tecido ósseo, como
é o caso da osteoporose (FLEISCH
19
, 1997; CASTRO et al.
11
, 2004).
93
O mecanismo molecular pelo qual os bisfosfonatos inibem
a reabsorção óssea ainda não é completamente entendido. Sabe-se que
está relacionado com a inibição dos osteoclastos nas lacunas de
reabsorção. Uma vez que essas células produzem endocitose, os
bisfosfonatos presentes no local penetram nos osteoclastos, afetando seu
metabolismo intracelular e induzindo a apoptose. Através de uma ação
indireta, os bisfosfonatos também atuam estimulando os osteoblastos a
produzirem mediadores químicos que inibem o recrutamento dos
osteoclastos. Tudo isso contribui para um aumento da densidade mineral
óssea (SATO et al.
61
, 1991; ROGERS et al.
59
, 1999; NEVES et al.
45
,
2002).
Os bisfosfonatos apresentam baixa absorção intestinal em
humanos, uma vez que estes fármacos são pouco lipofílicos, dificultando
o transporte através da barreira epitelial. Quando administrados por via
endovenosa, desaparecem do plasma rapidamente com uma meia-vida
de uma a duas horas. Por outro lado, sabe-se que uma vez ligados ao
osso, os bisfosfonatos só são liberados quando o tecido sofre reabsorção
(FLEISCH
19
, 1997; KULAK & BILEZIKIAN
35
, 2000).
Nos últimos dez anos, têm-se estudado o uso do
alendronato sódico com o objetivo de inibir os processos de reabsorção
óssea decorrentes de procedimentos cirúrgicos e melhorar a reparação
tecidual, com destaque para a reparação do tecido ósseo.
Sua utilização sistêmica foi bastante estudada em
processos de reabsorção óssea decorrentes de doença periodontal e de
procedimentos cirúrgicos. Autores como Weinreb et al.
76
(1994), Reddy et
al.
55
(1995) e Altundal & Güvener
2
(2004) observaram que a
administração do alendronato sódico resultou em menor reabsorção
óssea alveolar nos animais tratados, mostrado em alguns casos uma
redução significativa dos níveis de cálcio sérico e urinário, além de um
menor número de osteoclastos no tecido ósseo.
94
Vários estudos também empregaram os bisfosfonatos por
via sistêmica para avaliar os processos de reparação óssea. Em 2000,
Silva
64
administrou o alendronato sódico por via oral, na água de beber e
avaliou a sua ação no reparo de tíbias de ratas ovarectomizadas. A
análise histológica demonstrou maior formação óssea nos animais
tratados com as maiores doses do medicamento. O grupo de 14 dias, sob
a dose de 0,5mg/kg, apresentou a formação de osso trabecular mais
maduro e organizado. O autor sugere que a ação do alendronato sódico
possa ser dose-dependente.
Já Fayad
14
(2001) demonstrou em sua pesquisa que
nenhum dos bisfosfonatos, dentre eles o alendronato sódico, contribuiu
para a reparação óssea em defeitos confeccionados na mandíbula de
ratos. Os medicamentos foram administrados por via oral antes e após a
cirurgia, todos na dose de 1mg/kg. Fernandes
16
(2002) estudou a
reparação óssea em coelhos e utilizou o alendronato sódico por via oral,
também na dose de 1mg/Kg. Seus resultados mostraram que o uso do
alendronato sódico e sua associação com a hidroxiapatita não interferiram
na reparação óssea nesse modelo experimental.
Considerando as suas propriedades farmacocinéticas, a
administração local dos bisfosfonatos parece ser mais efetiva (MERAW et
al.
42
, 1999; YAFFE et al.
82
, 2000; SHIBATA et al.
63
, 2004). No entanto, a
forma de administração e a dose dos fármacos ainda são fatores
importantes a serem elucidados, uma vez que existem muitas
controvérsias a respeito de seu mecanismo de ação, principalmente nos
processos de reparação óssea.
O primeiro estudo que revelou a ação local positiva do
alendronato sódico sobre a reabsorção do tecido ósseo foi realizado por
Yaffe et al.
81
(1997). Os autores utilizaram uma membrana embebida em
0,025ml de alendronato sódico sobre o tecido ósseo de ratos exposto
após a confecção de retalhos mucoperiosteais em cirurgia periodontal. Os
resultados demonstraram uma redução significativa da perda óssea
95
alveolar em comparação ao grupo controle. Uma ação positiva também foi
observada por Binderman et al.
4
(2000), em estudo semelhante ao
anterior, no qual utilizaram uma membrana embebida em diferentes doses
de alendronato sódico. Neste caso, a redução da reabsorção óssea
alveolar foi evidenciada após o emprego das concentrações mais altas do
fármaco (200 e 400µg).
Um segundo experimento realizado por Binderman et al.
4
(2000) demonstrou que a aplicação à distância do sítio cirúrgico de
400µg/ml de alendronato também diminuiu a reabsorção alveolar,
sugerindo uma ação sistêmica favorável do fármaco.
Kawata et al.
34
(2004) demonstraram redução significativa
da reabsorção do tecido ósseo nas formas de administração local e
sistêmica de solução de alendronato sódico na concentração de 10
-4
mol.
Os autores observaram que a ação local do medicamento diminuiu a
reabsorção de enxertos ósseos inseridos no subcutâneo de
camundongos. Também observaram que a injeção intraperitonial do
medicamento reduziu o número de osteoclastos após nove semanas da
cirurgia.
Em 1999, o estudo de Meraw et al.
42
demonstrou a
contribuição positiva do alendronato sódico para a regeneração do tecido
ósseo após a realização de implantes osseointegráveis.
A aplicação local do alendronato sódico na forma de gel
tem sido estudado recentemente, principalmente na cicatrização dos
tecidos do periodonto. Matsura
40
(2003) utilizou gel de alendronato sódico
no tratamento de defeitos periodontais infra-ósseos de humanos observou
que o tratamento não contribuiu para o ganho de inserção clínica dos
tecidos periodontais, tampouco provocou alterações significativas no
tecido ósseo. Já, Reddy et al.
54
(2004), em estudo semelhante,
observaram que o gel de alendronato sódico contribuiu para uma melhora
significativa nos parâmetros clínicos periodontais, bem como para a
96
formação óssea local, com redução das perdas ósseas relacionadas à
doença.
Além de contribuir para a reparação dos tecidos
periodontais, o alendronato sódico também pode diminuir a formação de
tecido mineralizado no periodonto (Shibata et al.
63
, 2004), mantendo as
propriedades biológicas do ligamento periodontal.
São poucos os estudos que empregam localmente o
alendronato sódico para avaliar os processos de reparação óssea. Jaime
et al.
29
(2005) demonstraram que o medicamento não contribuiu para a
reparação óssea, quando administrado localmente no defeito ósseo da
calvária de ratas ovarectomizadas.
Fernandes
17
(2005) também não observou ação positiva
do medicamento na reparação óssea em fêmures de ratos. O autor
estudou a ação local do alendronato sódico, da hidroxiapatita e da
associação do alendronato com a hidroxiapatita, no reparo ósseo de
defeitos medindo 2,5mm de diâmetro. O sal de alendronato sódico foi
administrado localmente sobre duas concentrações diferentes (1mol e
2mol). Os resultados demonstraram que os todos os grupos sacrificados
após sete dias do procedimento cirúrgico, apresentaram formação óssea
com trabéculas imaturas, exceto nos animais machos nos quais o
alendronato foi utilizado. Aos 21 dias, o tecido ósseo neoformado fechava
o defeito na maioria dos espécimes estudados. Depois de realizada a
análise histomorfométrica, o autor concluiu que a reparação óssea foi
maior nas fêmeas do que nos machos, independente do período
estudado. Entretanto, observou-se que a aplicação local do alendronato
sódico, associado ou não à hidroxiapatita, administrado na forma de
concentração molar, não contribuiu para a reparação óssea nesse modelo
experimental.
Neste estudo, observamos que o grupo experimental
tratado com alendronato 2mol (A2) mostrou menor formação óssea ao
final dos 21 dias, quando comparado ao grupo tratado com alendronato
97
1mol (A1), com diferença estatisticamente significante nos SHR machos.
Esse dado pode ser explicado pelo fato do alendronato sódico apresentar
efeitos citotóxicos quando administrado em concentrações mais elevadas.
Além disso, nossos resultados demonstram que os
animais de ambos os grupos A1 e A2 apresentaram menor neoformação
óssea quando comparados àqueles dos grupos C e Am, independente do
sexo ou período de observação. Dados semelhantes foram observados
por Fernandes
17
(2005), que mostrou a influência do alendronato sódico
retardando o processo de reparação óssea.
Nos grupos A1 aos 21 dias, a análise histológica
demonstrou a presença de trabéculas ósseas imaturas, interpostas por
tecido conjuntivo frouxo nos animais machos, que se irradiavam do
interior do canal medular do fêmur até a área do defeito. Este achado não
foi observado nas fêmeas, que apresentavam na área do defeito ósseo
apenas a presença de tecido conjuntivo denso, com deposição de feixes
de fibras colágenas e, em alguns casos, a deposição de matriz osteóide.
Apesar de poucos ensaios clínicos comprovarem a ação
anabólica do alendronato sódico sobre o tecido ósseo, estudos realizados
in vitro demonstram sua atividade estimulando a neoformação óssea.
Giuliani et al.
23
(1998) observaram que o alendronato
sódico estimulou a formação de CFU-F e de CFU-OB da medula óssea de
ratos, quando administrado em baixas concentrações e inibiu o processo
em concentrações maiores. No caso das culturas de células da medula
óssea humana, o alendronato aumentou a formação de CFU-F e de CFU-
OB, havendo o efeito máximo do fármaco na concentração de 10
-10
mol/L.
Im et al.
27
(2004) demonstraram que o emprego do alendronato sobre a
cultura de células osteoblásticas, estimulou a proliferação celular, com
níveis máximos na concentração de 10
-8
mol.
Os estudos têm demonstrado que os bisfosfonatos
apresentam uma ação bifásica, estimulando a proliferação celular e
formação de tecido osteóide nas concentrações mais baixas e inibindo
98
esse processo em maiores concentrações. (WEINREB et al.
76
, 1994;
GIULIANI et al.
23
, 1999; REINHOLZ et al.
56
, 2000; IM et al.
25
, 2004;
CORREIA
12
, 2005). As concentrações mais elevadas do fármaco parecem
influenciar na viabilidade das células, prejudicando suas funções
metabólicas.
García-Moreno et al.
21
(1998) comprovaram em estudo in
vitro que as concentrações mais elevadas de alendronato sódico (igual ou
maior que 10
-4
mol/L) interferiram na viabilidade das células
osteoblásticas, prejudicando a sua capacidade proliferativa. Correia
(2005) demonstrou ação semelhante do medicamento sobre fibroblastos
do ligamento periodontal de humanos em cultura celular. O autor
observou que as maiores concentrações da droga (10
-5
e 10
-6
mol)
afetaram a viabilidade celular, sendo o alendronato sódico considerado
citotóxico nesses casos.
Acreditamos que a concentração molar empregada possa
ter afetado a viabilidade das células osteoblásticas e, por isso, ter
desempenhado uma ação tecidual citotóxica, que interferiu na reparação
óssea nos grupos A1 e A2. As análises histológicas comprovaram essa
ação, pois ficou evidente a presença de um tecido conjuntivo com
infiltrado inflamatório, associado freqüentemente a uma rede de fibrina
nas áreas do defeito ósseo dos grupos A1 e A2, aos sete dias. No período
de 21 dias, não se observava neoformação óssea com o fechamento do
defeito ósseo. Esta quando presente mostrava-se com trabéculas ósseas
imaturas, diferente do que foi observado nos grupos C e Am.
No entanto, a análise histomorfológica nos levou a um
achado interessante que foi a formação de tecido ósseo extra-cortical
subperiosteal, em todos os grupos experimentais tratados com
alendronato 1mol e 2mol. Este fato foi mais marcante nos animais SHR
fêmeas do grupo A2, aos 21 dias do experimento.
99
O tecido ósseo extra-cortical presente sob o periósteo,
encontrava-se no lado oposto ao defeito ósseo e apresentava
características de um tecido maduro remodelado, com presença de linhas
reversas basofílicas, espaços medulares aumentados, quando comparado
a cortical óssea adjacente e com a presença de inúmeras lacunas
ocupadas por osteócitos volumosos.
Essa característica também foi evidenciada por
Fernandes
17
(2005) em ratos normotensos, em todos os grupos tratados
com alendronato sódico. O autor acredita que este fenômeno possa ter
sido desencadeado pela penetração do medicamento sob o periósteo, no
momento da inserção do material. Além dessa ação local do
medicamento, acreditamos que o alendronato, através da sua inserção no
interior da medula óssea no momento da cirurgia, possa ter sido
incorporado pelo tecido ósseo.
Mesmo tendo sido utilizado na sua forma pura, na
apresentação de pó, o alendronato sódico não possui a natureza de um
material de preenchimento, que desempenhe papel osteocondutor na
reparação óssea. Suas propriedades físico-químicas demonstram que
este medicamento é rapidamente reabsorvido quando não se deposita no
tecido ósseo, fixando-se aos cristais de hidroxiapatita. No entanto, quando
incorporado ao osso, este é liberado lentamente com o passar do tempo.
Isso poderia estimular as células mesenquimais indiferenciadas presentes
na medula óssea e as células quiescentes do endósteo e periósteo a
produzirem tecido ósseo.
Com base nessa teoria, também tentamos justificar o
padrão de formação óssea encontrado no grupo A1, de ratos machos ao
final de 21 dias. Observava-se que a área do defeito ósseo não se
encontrava totalmente fechada por tecido ósseo. Nesses animais, a
formação do osso partia do interior da medula óssea, com trabéculas
ósseas imaturas que se irradiavam da medula óssea à região do defeito
100
ósseo. Acreditamos que o alendronato sódico possa ter estimulado as
células da medula e do endósteo, contribuindo para esse fenômeno.
Apesar dos resultados demonstrarem que a aplicação
local do alendronato sódico não contribuiu para o processo de reparação
óssea, sabe-se que variações na metodologia, como novas formas de
administração e diferentes concentrações molares, podem dar resultados
positivos. Portanto, acreditamos que se tornam necessários estudos mais
aprofundados para avaliar a ação local do alendronato sódico sobre o
processo de formação óssea.
7 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho,
podemos concluir que:
a) a aplicação local do alendronato sódico não contribuiu
para reparação óssea nos SHR;
b) a reparação óssea entre os grupos experimentais foi
maior no período de 21 dias quando comparada ao de
sete dias, exceto no grupo A1 de animais fêmeas e
nos grupos A2 de animais de ambos os sexos;
c) com relação ao sexo dos animais não houve diferença
estatisticamente significante;
d) possivelmente, o alendronato sódico contribuiu para a
formação do tecido ósseo extra-cortical subperiosteal
encontrado.
8 REFERÊNCIAS
1 ALENCAR, V.B.M. et al. Disodium clodronate prevents bone
resorption in experimental periodontitis in rats. J Periodontol, v.73,
n.3, p.251-256, Mar. 2002.
2 ALTUNDAL, H.; GÜVENER, Ö. The effect of alendronate on
resorption of the alveolar bone following tooth extraction. Int J Oral
Maxillofac Surg, v.33, n.3, p.286-293, Apr. 2004.
3 BARBAGALLO, M. et al. Histological evidence of increased
turnover in bone from spontaneously hypertensive rats.
Cardioscience, v.2, n.1, p.15-17, Mar. 1991.
4 BINDERMAN, I.; ADUT, M.; YAFFE, A. Effectiveness of local
delivery of alendronate in reducing alveolar bone loss following
periodontal surgery in rats. J Periodontol, v.71, n.8, p.1236-1240,
Aug. 2000.
5 BIOMEN, L.J.M.J. History of bisphosphonates: Bisphosphonate
on bone. Amsterdan: Elsevier, 1995, p.11-124.
6 BRASIL. Ministério da Saúde. Hipertensão arterial sistêmica
(HAS) e Diabetes mellitus (DM): protocolo. Brasília, 2001. 96p.
(Caderno de atenção básica, 7).
103
7 BRICKMAN, A.S. et al. Calcitropic hormones, platelet calcium, and
blood pressure in essential hypertension. Hypertension, v.16, n.5,
p.515-522, Nov. 1990.
8 BUDAVARI, S. et al. The Merck index: an encyclopedia of
chemicals, drugs & biologicals. Merck research laboratories. 12.ed.
New Jersey: Whitehouse station, 1996, 2535p.
9 BURNIER, M.; BRUNNER, H.R. Angiotensin II receptor
antagonists. Lancet, v.355, n.9204, p.637-645, Feb. 2000.
10 CAPPUCCIO, F.P. et al. High blood pressure and bone-mineral
loss in elderly white women: a prospective study. Study of
Osteoporotic Fractures Research Group. Lancet, v.354, n.9183,
p.971-975, Sep. 1999. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com. Acesso em: 15 mar. 2005.
11 CASTRO, L.F; SILVA, A.T.A.; CHUNG, M. Bisfosfonatos (BFs)
como transportadores osteotrópicos no planejamento de fármacos
dirigidos. Quim Nova, v.27, n.3, p.456-460, 2004.
12 CORREIA, V.F.P. Avaliação in vitro da citotoxidade do
alendronato de sódio sobre fobroblastos de ligamento
periodontal de humanos em cultura celular. 2005. 115f.
Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Faculdade de
Odontologia de São Paulo, Universidade de São Paulo. São Paulo,
2005.
13 DOUGLAS, C.R. Fisiologia dos princípios hemodinâmicos e da
pressão arterial. In:_. Tratado de fisiologia aplicado à saúde. 5.
ed. São Paulo: Robe editorial, 2002. Cap.41, p.713-735.
104
14 FAYAD, M.V.L. Reparação óssea sob ação de duas
formulações de bisfosfonatos: estudo comparativo
radiográfico e histológico. 2001. 102f. Dissertação (Mestrado em
Odontologia, Área de Concentração em Biopatologia Bucal) –
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade
Estadual Paulista. São José dos Campos, 2001.
15 FERNANDES, C.; LEITE, R.S.; LANÇAS, F.M. Bisfosfonatos:
síntese, análises químicas e aplicações farmacológicas. Quim
Nova, v.28, n.2, p.274-280, 2005.
16 FERNANDES, R.G. Estudo da reparação óssea na mandíbula
de coelhos sob a ação do alendronato sódico e de sua
associação com a hidroxiapatita. 2002. 112f. Dissertação
(Mestrado em Odontologia, Área de Concentração em Biopatologia
Bucal) – Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista. São José dos Campos, 2002.
17 FERNANDES, R.G. Estudo da ação local do alendronato
sódico, da hidroxiapatita e da associação do alendronato
sódico com a hidroxiapatita, no reparo ósseo de fêmures de
ratos. 2005. 127f. Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal, Área
de Concentração em Biopatologia Bucal) – Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual
Paulista. São José dos Campos, 2005.
18 FISHER, J. E. et al. Alendronate mechanism of action:
geranylgeraniol, an intermediate in the mevalonate pathway,
prevents inhibition of osteoclast formation, bone resorption, and
kinase activation in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, v.96, n.1,
p.133-138, Jan. 1999.
105
19 FLEISCH, H. A. Bisphosphonates: preclinical aspects and use in
osteoporosis. Ann Med, v.29, n.1, p.55-62, Feb. 1997.
20 FROST, H. M. Dynamics of bone remodeling. In:_. Bone
biodynamics. Boston: Ed. Little Brown, 1964. p.315-333.
21 GARCIA-MORENO, C. et al. Effect of alendronate on cultured
normal human osteoblasts. Bone, v.22, n.3, p.233-239, Mar. 1998.
22 GAVRAS, I.; MANOLIS A.J.; GAVRAS, H. The alpha-adrenergic
receptors in hypertension and heart failure: experimental and
clinical studies. J Hypertension, v.19, p.2115-2124, Dec. 2001.
23 GIULIANI, N. et al. Bisphosphonates stimulate formation of
osteoblast precursors and mineralized nodules in murine and
human bone marrow cultures in vitro and promote early
osteoblastogenesis in young and aged mice in vivo. Bone, v.22,
n.5, p.455-461, May 1998.
24 GEDDES, A.D., et al. Bisphosphonates: structure-activity
relationships and therapeutic implications. Bone Miner Res, v.8,
p.265-306, 1994.
25 IM, G. I. et al. Osteoblast proliferation and maturation by
bisphosphonates. Biomaterials, v.25, n.18, p.4105-4115, Aug.
2004. Disponível em: http://www.sciencedirect.com. Acesso em: 4
maio 2005.
26 INOUE, T. et al. What is the difference of bone growth in SHR and
SD rats? Clin Exp Pharmacol Physiol Suppl, v.22, n.1, Suppl.1,
p.242-243, Dec. 1995.
106
27 ISHIZUYA, T. et al. Parathyroid hormone exerts disparate effects
on osteoblast differentiation depending on exposure time in rat
osteoblastic cells. J Clin Invest, v.99, n.12, p.2961-2970, June
1997.
28 IZAWA, Y. et al. Bone disorders in spontaneously hypertensive rat.
Calcif Tissue Int, v.37, n.6, p.605-607, Dec. 1985.
29 JAIME, A.P.G. et al. Influência da administração local de
alendronato sódico no reparo ósseo em calvária de ratas
ovariectomizadas. Cienc Odontol Bras, v.8, n.2, p.70-79, Abr./Jun.
2005.
30 JESPERSEN, B. Effects of PTH (1-34) on blood pressure, renal
function, and hormones in essential hypertension. The altered
pattern of reactivity may counteract raised blood pressure. Am J
Hypertens, v.10, n.12, Pt.1, p.1356-1367, Dec. 1997.
31 JILKA, R.L. et al. Increased bone formation by prevention of
osteoblast apoptosis with parathyroid hormone. J Clin Invest,
v.104, n.4, p.439-446, Aug. 1999.
32 JORDE, R. et al. Relation between low calcium intake, parathyroid
hormone, and blood pressure. Hypertension, v.35, n.5, p.1154-
1159, May 2000. Disponível em: http://www.hypertensionaha.org.
Acesso em: 21 jan 2006.
33 JUNQUEIRA, L.C; CARNEIRO, J. Tecido ósseo. In:_. Histologia
básica. 10.ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2004. Cap.8,
p.136-53.
107
34 KAWATA, T. et al. Effect of alendronate on osteoclast
differentiation and bone volume in transplanted bone. Exp Anim,
v.53, n.1, p.47-51, Jan. 2004.
35 KULAK, C.; BILEZIKIAN, J. Bisfosfonatos: Características e
utilização na osteoporose. In: BANDEIRA, F. Osteoporose. Belo
Horizonte: Ed. Medsi, p.351-366; 2000.
36 LIN, J.H. Bisphosphonates: a rewiew of their pharmacokinetic
properties. Bone, v.18, n.2, p.75-85, Feb. 1996.
37 LINDHE, J. Tratado de periodontia clínica e implantologia oral.
4ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005.
38 LOVDAHL, M.J.; PIETRZYK, D.J. Anion-exchange separation and
determination of bisphosphonates and related analytes by post-
column indirect fluorescence detection. J Chromatogr A, v.850,
n.1, p.143-152, July 1999.
39 LUCAS, P.A. et al. Abnormal vitamin D metabolism, intestinal
calcium transport, and bone calcium status in the spontaneously
hypertensive rat compared with its genetic control. J Clin Invest,
v.78, n.1, p. 221-227. July 1986.
40 MATSURA, E. Análise clínica do efeito do gel de alendronato
de sódio na reparação de defeitos infra-ósseos periodontais,
em humanos. 2003. 59f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) –
Faculdade de Odontologia de São Paulo, Universidade de São
Paulo. São Paulo, 2003.
108
41 McCARRON, D.A. et al. Disturbances of calcium metabolism in the
spontaneously hypertensive rat. Hypertension, v.3, n.3, Pt. 2, p.
162-167, May-June 1981.
42 MERAW, E.J.; REEVE, C.M.; WOLLAN, P.C. Use of alendronate in
peri-implant defect regeneration. J Periodontol, v.70, n.2, p.151-
158, Feb. 1999.
43 MUSSOLINO, M.E.; MADANS, J.H.; GILLUM R.F. Bone mineral
density and stroke. Stroke, v.34, n.5, p.e20-e22, May 2003.
Disponível em: http://www.strokeaha.org. Acesso em: 11 nov 2004.
44 NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, The seventh report of the
joint national committee on prevention, detection, evaluation,
and treatment of high blood pressure, NIH Publication, Aug.
2004, 104f. Disponível em: http://www.nhlbi.nih.gov/. Acesso em:
21 mar 2005.
45 NEVES, M. et al. Synthesis, characterization and biodistribution of
bisphosphonates Sm-153 complexes: correlation with molecular
modeling interaction studies. Nucl Med Biol, v.29, n.3, p.329-338,
Apr. 2002.
46 NICHOLS, D.L. et al. Is there an association between high blood
pressure and bone mineral density. Med Sci Sports Exerc, v.35,
n.5, p. S78, May 2003.
47 NOBRE, F; LIMA, N.K.C. Hipertensão arterial: Conceito,
classificação e critérios diagnósticos. In:_ Manual de Cardiologia
SOCESP. São Paulo: Atheneu, 2000. Cap. 70; p. 303.
109
48 ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DE SAÚDE. Rede
interagencial de informações para a saúde. Indicadores básicos
para a saúde no Brasil: conceitos e aplicações / Rede
interagencial de informações para a saúde, Ripsa. Brasília:
Organização Pan-Americana da Saúde, 2002, p.299. Disponível
em: http://www.datasus.gov.br. Acesso em: 7 abr 2005.
49 OSHIMA, T.; YOUNG, E. W. Systemic and cellular calcium
metabolism and hypertension. Semin Nephrol, v.15, n.6, p.496-
503, Nov. 1995.
50 PACKER, C.S. Angiotensin II as a multifunctional hormone: a
regulator of haemodynamics and metabolism with potential roles in
the etiologies of hypertension and the metabolic syndrome. J
Hypertens, v.24, n.1, p.37-38, Jan. 2006.
51 PEREIRA, A.C. Estudo comparativo do processo de reparação
óssea em ratos normotensos e hipertensos (SHR). 2004. 90f.
Dissertação (Mestrado em Odontologia, Área de Concentração em
Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista. São José dos Campos,
2004.
52 PÉREZ-CASTRILLÓN, J.L. et al. Bone mass and bone modeling
markers in hypertensive postmenopausal women. J Hum
Hypertens, v.17, n.2, p.107-110, Feb. 2003. Disponível em:
http://www.nature.com/jhh/index.html. Acesso em: 15 mar 2005.
110
53 PÉREZ-CASTRILLÓN, J.L. et al. Relationship between bone
mineral density and angiotensin converting enzyme polymorphism
in hypertensive postmenopausal women. Am J Hypertens, v.16,
n.3, p.233-235, Mar. 2003.
54 REDDY, G.I.; KUMAR, T.M; VEENA, K.M. Formulation and
evaluation of alendronate sodium gel for the treatment of bone
resorptive lesions in periodontitis. Drug Deliv, v.12, n.4, p.217-222,
July-Aug. 2005.
55 REDDY, M.S. et al. Alendronate treatment of naturally-occurring
periodontitis in beagle dogs. J Periodontol, v.66, n.3, p.211-217,
Mar. 1995.
56 REINHOLZ, G.G. et al. Bisphosphonates directly regulate cell
proliferation, differentiation, and gene expression in human
osteoblasts. Cancer Res, v.60, n.21, p.6001-6007, Nov. 2000.
57 ROCHA, M. et al. Clinical and radiological improvement of
periodontal disease in patients with type 2 diabetes mellitus treated
with alendronate: a randomized placebo-controlled trial. J
Periodontol, v.72, n.2, p.204-209, Feb. 2001.
58 RODAN, G.A.; FLEISCH, H.A. Bisphosphonates: mechanisms of
action. J Clin Invest, v.97, n.12, p.2692-2696, Jun. 1996
59 ROGERS, M.J. et al. Molecular mechanisms of action of
bisphosphonates. Bone, v.24, Suppl.5, p.73S-79S, May 1999.
111
60 RUSSEL, R.G.G.; CROUCHER, P.I.; ROGER, M.J.
Bisphosphonates: pharmacology mechanisms of action and clinical
uses. Osteoporos Int, v.9, n.8, p.342-349, 1999
61 SATO, M. et al. Bisphosphonate action: alendronate localization in
rat bone and effects on osteoclast ultrastructure. J Clin Invest,
v.88, n.6, p.2095-2105, Dec. 1991.
62 SBH, SBC, SBN. Hipertensão arterial: a importância do problema.
In:_. Diretrizes brasileiras de hipertensão arterial 4ª, 2002, cap.
1, p. 1-2.
63 SHIBATA, T. et al. Effects of alendronate on restoration of
biomechanical properties of periodontium in replanted rat molars. J
Periodont Res, v.39, n.6, p.405-414, Dec. 2004.
64 SILVA, C.M.O.M. Avaliação do alendronato sódico sobre a
reparação óssea na ausência dos hormônios ovarianos. 2000.
102f. Dissertação (Mestrado em Odontologia, Área de
Concentração em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia
de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista. São
José dos Campos.
65 SUGAWARA, S. et al. Contrasting effects of an
aminobisphosphonate, a potente inhibitor of bone resorption, on
lipopolysaccharide-induced production of interleukin-1 and tumor
necrosis factor alpha in mice. Br J Pharmacol, v.125, n.4, p.735-
740, Oct. 1998. Disponível em: http//www.stockton-press.co.uk/bip.
Acesso em: 11 abr 2005.
112
66 SWEETMAN, S. Martindale: the complete drug reference. 34ª.ed.
London: Pharmaceutical Press. 2004, 2768p.
67 TAKAISHI, Y. et al. Clinical effect of etidronate on alveolar pyorrhea
associated with chronic marginal periodontitis: report of four cases.
J Int Med Res, v.29, n.4, p.355-365, July- Aug. 2001.
68 TEN CATE, R.T. Osso. In:_. Histologia bucal: desenvolvimento,
estrutura e função. 5.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
Cap.7, p.101-123.
69 TENENBAUM, H. C. et al. Bisphosphonates and periodontics:
potential applications for regulation of bone mass in the
periodontium and other therapeutic/diagnostic uses. J Periodontol,
v.73, n.7, p.813-822, July 2002.
70 TORTORA, G.J.; GRABOWSKI, S.R. O sistema cardiovascular: os
vasos sanguíneos e a hemodinâmica. In: _. Princípios de
anatomia e fisiologia. 9.ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan,
2002. Cap.21, p.611-74.
71 TRIANTAFYLLIDI, E. et al. Study of hypertension in spontaneous
hypertensive rats by sequencing the genomic DNA of alpha
2B
receptors. Hellenic J Cardiol, v.45, p.64-70, 2004.
72 TSUDA, K.; NISHIO, I; MASUYAMA, Y. Bone mineral density in
women with essential hypertension. Am J Hypertens, v.14, n.7, Pt
1, p.704-707, July 2001. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com
. Acesso em: 22 nov 2004.
113
73 UDENFRIEND, S. et al. Spontaneously hypertensive (SHR) rats:
guidelines for breeding, care and use. ILAR News, v.19, n.3, p.G3-
20, 1976.
74 UZAWA, T. et al. Comparision of the effects of intermittent and
continuous administration of human parathyroid hormone (1,34) on
rat bone. Bone, v.16, n.4, p.477-484, Apr. 1995.
75 WANG, T. M. et al. Evidence for reduced cancellous bone mass in
the spontaneously hypertensive rat. Bone Miner, v.20, n.3, p.251-
264, Mar. 1993.
76 WEINREB, M. et al. Histophorfometrical analysis of the effects of
the bisphosphonate alendronate on bone loss caused by
experimental periodontitis in monkeys. J Periodontal Res, v.29,
n.1, p.34-40, Jan. 1994.
77 WORLD HEALTH ORGANIZATION, International society of
hypertension writing group. J Hypertens, v.21, n.11, p.1983-1992,
2003.
78 WOLF, G.; WENZEL, U. O. Angiotensin II and cell cycle regulation.
Hypertension, v.43, p.693-698, 2004. Disponível em:
www.hypertensionaha.org. Acesso em: 23 jan 2006.
79 WRIGHT, G.L.; DeMOSS, D. Evidence for dramatically increased
bone turnover in spontaneously hypertensive rats. Metabolism,
v.49, n.9, p.1130-1133, Sep. 2000.
114
80 YAMAGUCHI, K. et al. Involvement of interleukin-1 in the
inflammatory actions of aminobisphosphonates in mice. Br J
Pharmacol, v.130, n.7, p.1646-1654, Aug. 2000. Disponível em:
http://www.nature.com/bjp. Acesso em: 19 set 2005.
81 YAFFE, A. et al. Local delivery of an amino bisphosphonate
prevents the resorptive phase of alveolar bone following
mucoperiosteal flap surgery in rats. J Periodontol, v.68, n.9, p.884-
889, Sep. 1997.
82 YAFFE, A. et al. The effect of topical delivery of novel
bisacylphosphonates in reducing alveolar bone loss in the rat
model. J Periodontol, v.71, p.1607-1612, Oct. 2000
83 YAMORI, Y. et al. Stroke-prone SHR (SHRSP) as a model for
osteoporosis. Clin Exp Hypertens, v.13, n.5, p.755-762, 1991.
115
ANEXO A - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos - UNESP
116
NOBRE, M.D.P. Local action of alendronate sodium on bone repair of
spontaneously hypertensive rat (SHR) femurs. 2006. 116f. Dissertação
(Mestrado em Biopatologia Bucal, Área Biopatologia Bucal) – Faculdade
de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual
Paulista. São José dos Campos, 2006.
ABSTRACT
This study evaluated the local action of alendronate sodium on bone repair in
spontaneously hypertensive rats (SHR). A bone defect of diameter 2,5mm was created in
forty males and forty females. Four groups were created according to the treatment
received: control (C), amido (Am), alendronate 1mol (A1) and alendronate 2mol (A2). The
C group did not have their defect filled in with any material. The animals were sacrificed
seven and 21 days after the surgical procedure. Histological and histomorfometric
analyses were performed and the results submitted to ANOVA statistical analysis. On the
seventh day, all groups presented a connective tissue with hemorrhage and inflammatory
cells in the bone defect. In some groups osteoid matrix was observed. In A1 and A2
groups, the animals also presented a fibrin deposition. After 21 days, a formation of bone
trabeculae was observed closing the superficial extension of the bone defect in C and Am
groups. On male rats of group A1, the trabeculae formation projected from inside the
bone medulla to the defect site, without completely closing it. In the others animals of
groups A1 and A2, bone trabeculae were not observed in the defect site. It was only
observed a deposition of dense collagen fibers and minimal osteoid matrix. An important
histological feature found in this study was the formation of extra-cortical subperiosteal
bone in the animals of A1 and A2 groups. The study concluded that the local
administration of alendronate sodium did not contribute for the bone repair, in this
experimental model.
KEYWORDS: Alendronate; rats, inbred SHR; hypertension; bone regeneration
Autorizo a reprodução xerográfica deste documento
São José dos Campos, 25 de Julho de 2006
________________________
Mônica Dal Pian Nobre
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